DÉCISION DE LA COMMISSION du 14 avril 1993 arrêtant les méthodes à utiliser pour la recherche de résidus de substances à effet hormonal et de substances à effet thyréostatique

(93/256/CEE)LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu la directive 85/358/CEE du Conseil, du 16 juillet 1985, complétant la directive 81/602/CEE concernant l'interdiction de certaines substances à effet hormonal et des substances à effet thyréostatique (1), modifiée en dernier lieu par la directive 88/146/CEE (2), et notamment son article 5 paragraphe 2,

considérant que, selon l'article 8 paragraphe 1 de la directive 64/433/CEE du Conseil, du 26 juin 1964, relative à des problèmes sanitaires en matière d'échanges intracommunautaires de viandes fraîches (3), modifiée en dernier lieu par la directive 92/5/CEE (4), et l'article 11 paragraphe 4 deuxième alinéa de la directive 85/397/CEE du Conseil, du 5 août 1985, concernant les problèmes sanitaires et de police sanitaire lors d'échanges intracommunautaires de lait traité thermiquement (5), modifiée en dernier lieu par la directive 89/662/CEE (6), les examens des résidus doivent être effectués suivant des méthodes éprouvées scientifiquement reconnues, notamment suivant celles qui sont définies dans des directives communautaires ou dans d'autres normes internationales;

considérant que la détermination de méthodes d'analyse des échantillons comprend la définition des procédés d'analyse à utiliser, des règles à suivre pour l'échantillonnage et des critères relatifs à la mise en oeuvre des analyses;

considérant que les procédés d'analyse retenus doivent être suffisamment sensibles pour détecter la présence de résidus de substances à effet hormonal et de substances à effet thyréostatique;

considérant que l'échantillonnage constitue une partie essentielle de la méthode d'analyse; qu'il convient donc d'arrêter des règles relatives à la collecte des échantillons;

considérant que, aux fins de la présente décision, il convient de tenir compte des critères prévus au point 1 de l'annexe de la directive 85/591/CEE du Conseil, du 20 décembre 1985, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle des denrées destinées à l'alimentation humaine (7);

considérant que, pour plus de clarté, et afin de tenir compte de l'évolution des connaissances scientifiques et techniques, il convient d'abroger la décision 87/410/CEE de la Commission (8);

considérant que les mesures prévues par la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:

Article premier

Les procédés d'analyse de routine des échantillons agréés pour la recherche de résidus de substances à effet hormonal et de substances à effet thyréostatique sont les suivants:

- immuno-essai,

- chromatographie en couche mince,

- chromatographie liquide,

- chromatographie en phase gazeuse,

- spectrométrie de masse,

- spectrométrie,

ainsi que toute autre méthode répondant à des critères comparables aux critères fixés pour les méthodes en question dans l'annexe.

Article 2

La collecte des échantillons doit s'effectuer selon les règles suivantes:

1) la taille des échantillons doit être représentative et suffisante pour permettre une analyse appropriée et pour permettre de répéter cette analyse et toute analyse de confirmation;

2) les échantillons doivent être marqués de manière telle que leur identification soit possible à tout instant de l'examen;

3) les méthodes d'échantillonnage, de conditionnement, de conservation, de transport et de stockage des échantillons doivent préserver l'intégrité de ceux-ci et ne pas nuire au résultat de l'examen. Il y a lieu d'empêcher tout accès non autorisé aux échantillons.

Article 3

Les critères applicables aux méthodes d'analyse de routine des résidus de substances à effet hormonal et de substances à effet thyréostatique sont indiqués dans l'annexe.

Article 4

La présente décision sera réexaminée avant le 1er janvier 1996 afin de tenir compte de l'évolution des connaissances scientifiques et techniques.

Article 5

La décision 87/410/CEE est abrogée.

Article 6

Les États membres sont destinataires de la présente décision.

Fait à Bruxelles, le 14 avril 1993.

Par la Commission

René STEICHEN

Membre de la Commission

(1) JO no L 191 du 23. 7. 1985, p. 46.

(2) JO no L 70 du 16. 3. 1988, p. 16.

(3) JO no 121 du 29. 7. 1964, p. 2012/64.

(4) JO no L 57 du 2. 3. 1992, p. 1.

(5) JO no L 226 du 24. 8. 1985, p. 13.

(6) JO no L 395 du 30. 12. 1989, p. 13.

(7) JO no L 372 du 31. 12. 1985, p. 50.

(8) JO no L 223 du 11. 8. 1987, p. 18.

ANNEXE

1. DÉFINITIONS ET EXIGENCES GÉNÉRALES

1.1. Définitions

1.1.1. Méthodes d'analyse de routine

Les méthodes d'analyse de routine sont les méthodes d'analyse utilisées par les États membres en vue de la mise en oeuvre des plans nationaux de contrôle des résidus chez les animaux de boucherie et dans les produits obtenus à partir de ces animaux, conformément aux dispositions de la directive 86/469/CEE du Conseil (1). Les méthodes de routine doivent avoir été validées par des laboratoires en activité et répondre aux critères fixés dans la présente annexe. Elles peuvent être utilisées à des fins de dépistage et/ou de confirmation.

- Les méthodes utilisées à des fins de dépistage (méthodes de dépistage) visent à la détection de la présence d'un analyte ou d'une classe d'analytes au niveau considéré. Elles présentent une grande capacité de traitement d'échantillons, elles sont appliquées pour passer au crible de nombreux échantillons en vue de détecter ceux qui pourraient s'avérer positifs. Elles visent à éviter les faux résultats négatifs.

- Les méthodes utilisées à des fins de confirmation (méthodes de confirmation) sont les méthodes qui doivent permettre l'identification univoque de l'analyte au niveau considéré. Ces méthodes visent à éviter les faux résultats positifs et à ne comporter qu'une faible probabilité tolérable de donner des faux résultats négatifs.

1.1.2. Analyte

L'analyte est le composant d'un échantillon à analyser, qui doit être détecté, identifié et/ou quantifié. Le terme « analyte » inclut, le cas échéant, les dérivés formés à partir de l'analyte au cours de l'analyse.

La mesure quantitative de l'analyte peut être exprimée par:

- une quantité, sous la forme d'une quantité pondérale (par exemple mg, ng)

ou

- par une teneur, sous la forme d'une fraction pondérale (par exemple mg kg 1, ng kg 1), d'une concentration pondérale (par exemple mg l 1) ou d'une concentration (par exemple mol l 1).

1.1.3. Échantillons

1.1.3.1. Échantillon de laboratoire

C'est un échantillon préparé en vue de son expédition au laboratoire et destiné à être examiné ou analysé.

1.1.3.2. Échantillon de test

C'est un échantillon préparé à partir de l'échantillon de laboratoire et à partir duquel des fractions à analyser doivent être prélevées.

1.1.3.3. Fraction à analyser

C'est la quantité de matériel prélevée de l'échantillon test (ou de l'échantillon de laboratoire si celui-ci coïncide avec l'échantillon test) et qui fait effectivement l'objet de l'analyse ou de l'examen.

1.1.4. Analyte étalon

C'est une substance bien définie, d'une teneur en analyte déclarée, d'un degré de pureté aussi élevé que possible, à utiliser comme substance de référence pour l'analyse.

1.1.5. Matériel de référence

Il s'agit d'un matériel dont une ou plusieurs propriétés ont été déterminées à l'aide d'une méthode validée, et qui peut donc être utilisé pour calibrer un appareil ou vérifier une méthode de mesure.

1.1.6. Essais à blanc

1.1.6.1. Analyse de l'échantillon à blanc

Il s'agit de l'ensemble du procédé d'analyse appliqué à une fraction à analyser prélevée sur un échantillon ne contenant pas l'analyte.

1.1.6.2. Essai d'un réactif à blanc

Il s'agit de l'ensemble du procédé d'analyse appliqué en l'absence de la fraction à analyser ou moyennant l'utilisation d'une quantité équivalente de solvant approprié en remplacement de la fraction à analyser.

1.1.7. Spécificité

La spécificité est la capacité de la méthode à discerner l'analyte à mesurer d'autres substances. Cette caractéristique est essentiellement une caractéristique du principe de mesure utilisé, mais elle peut varier selon la classe du composé ou de la matrice.

Les informations concernant la spécificité doivent au moins faire état de toute substance susceptible de donner un signal lorsque le principe de mesure décrit est utilisé (par exemple: homologues, analogues, métabolites du résidu en cause). Les informations concernant la spécificité doivent permettre de déterminer quantitativement dans quelle mesure la méthode permet de distinguer l'analyte des autres substances dans les conditions expérimentales.

1.1.8. Exactitude

Dans la présente décision, l'exactitude est celle de la moyenne. La définition utilisée ici est celle de la norme ISO 3534-1977 au point 2.83 (exactitude de la moyenne: le degré de concordance entre la valeur réelle et la valeur moyenne obtenue en répétant le procédé expérimental un grand nombre de fois).

Les principales causes d'inexactitude sont:

a) les erreurs accidentelles;

b) les erreurs systématiques.

Pour un très grand nombre d'essais, l'exactitude de la moyenne est proche de l'erreur systématique. Pour une évaluation documentaire d'une méthode, le nombre d'essais doit être spécifié.

La valeur de l'exactitude est la différence entre la valeur moyenne mesurée pour le matériel de référence et sa valeur réelle, exprimée en pourcentage de la valeur réelle. En l'absence de matériel de référence, les différents paramètres peuvent être évalués par l'analyse d'échantillon supplémenté.

En l'absence tant de méthode parfaitement codifiée que de matériel de référence certifié, la teneur d'un échantillon en analyte peut être déterminée à l'aide d'une méthode présentant un degré élevé de spécificité, d'exactitude et de précision.

1.1.9. Précision

Il s'agit du degré de concordance entre les résultats obtenus par application répétée du procédé expérimental dans les conditions prescrites [norme ISO 3534-1977 (2), point 2.84]; la précision englobe la répétabilité et la reproductibilité.

Répétabilité:

Degré de concordance entre les résultats d'analyses indépendantes, obtenus dans les conditions de répétabilité, c'est-à-dire selon la même méthode, avec une fraction à analyser identique, dans le même laboratoire, par le même opérateur, avec le même équipement et à des intervalles de temps courts.

Reproductibilité:

Degré de concordance entre les résultats de tests indépendants, obtenus dans les conditions de reproductibilité, c'est-à-dire selon la même méthode, avec une fraction à analyser identique, dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents et avec des équipements différents. Conformément à l'annexe de la directive 85/591/CEE du Conseil (3), les valeurs caractérisant les méthodes d'analyse dont l'adoption doit être envisagée conformément aux dispositions de cette directive résulteront d'un essai collectif conduit de préférence selon la norme ISO 5725-1986 (4). À cette fin, les termes « répétabilité » et « reproductibilité » sont ceux définis par la norme ISO 5725-1986. Pour la réalisation de tels essais, il conviendra d'utiliser des matériels d'échantillonnage dont la teneur connue en analyte avoisine la limite maximale de résidus à appliquer.

Dans l'attente de l'établissement, par un essai collectif, de la reproductibilié d'une méthode, il suffit, en vue de la présélection des méthodes par analyse documentaire, de disposer des données sur la répétabilité.

La valeur utilisée pour la mesure de la répétabilité et de la reproductibilité est le coefficient de variation défini dans la norme ISO 3534-1977, point 2.35 (coefficient de variation: rapport entre l'écart type et la valeur absolue de la moyenne arithmétique).

1.1.10. Limite de détection

C'est la teneur minimale mesurée à partir de laquelle il est possible de déduire la présence de l'analyte avec une certitude statistique raisonnable (au moins 95 % pour les substances non autorisées - voir 1.2.6.1). La limite détection peut être calculée de différentes façons:

a) Il est possible de mesurer la teneur d'au moins 20 blancs représentatifs, la limite de détection étant alors la valeur apparente de la moyenne mesurée majorée de trois fois l'écart type des essais à blanc.

Note 1: Il convient de spécifier la quantité de fractions à analyser utilisée dans l'analyse.

Note 2: Dans l'hypothèse où il est prévu que des facteurs tels que l'espèce, le sexe, l'âge, l'alimentation ou d'autres facteurs à caractère environnemental peuvent avoir une influence sur les résultats d'une méthode, 20 blancs au moins sont requis pour tester chaque population homogène pour laquelle la méthode doit être appliquée.

b) En cas de mesures par spectrométrie et lorsque des essais représentatifs à blanc ne donnent qu'un bruit de fond, la limite de détection consiste dans la teneur apparente correspondant à trois fois la hauteur du bruit de fond entre pics.

1.1.11. Limite de détermination

C'est la plus petite concentration d'analyte pour laquelle la méthode a été validée avec une exactitude et une précision spécifiées.

1.1.12. Sensibilité

C'est la mesure de l'aptitude d'une méthode à discerner des différences de concentration entre analytes. Dans la présente décision, la sensibilité est définie comme étant la pente de la courbe d'étalonnage au niveau considéré.

1.1.13. Praticabilité

C'est une caractéristique d'une méthode d'analyse qui est fonction de l'objectif de la méthode et qui est déterminée par des exigences telles que le débit d'analyses et les coûts.

1.1.14. Applicabilité

C'est la liste des types d'échantillons et/ou d'analytes auxquels la méthode peut s'appliquer telle quelle ou moyennant certaines modifications mineures.

1.1.15. Interprétation des résultats

1.1.15.1. Résultats positifs

La présence de l'analyte dans l'échantillon est prouvée conformément à la procédure d'analyse lorsque les critères généraux et les critères particuliers fixés pour la méthode de détection utilisée sont remplis.

a) Pour les substances ayant une tolérance nulle, le résultat de l'analyse est positif si l'analyte contenu dans l'échantillon est identifié sans aucune ambiguïté.

b) Pour les substances à limite maximale de résidus établie, le résultat de l'analyse est positif lorsque la quantité de l'analyte contenu dans l'échantillon, déterminée expérimentalement (après application des corrections éventuellement requises pour la récupération), est supérieure à la limite maximale de résidus établie, compte tenu de la probabilité acceptable de voir apparaître de faux résultats positifs ou négatifs.

1.1.15.2. Résultat négatif

Le résultat de l'analyse est considéré comme négatif selon la procédure d'analyse si les critères généraux et les critères particuliers fixés pour la méthode de détection utilisée sont respectés dans le cas de matériaux de référence appropriés et de détermination à blanc et:

a) dans le cas des substances ayant une tolérance nulle, si l'identité de l'analyte n'a pas été prouvée sans ambiguïté,

ou

b) dans le cas des substances à limite maximale de résidus établie, si la quantité mesurée de l'analyte contenu dans l'échantillon est inférieure à la limite spécifiée au point 1.1.15.1 b) ci-dessus. Note: Dans le cas a), un résultat négatif ne prouve pas que l'échantillon ne contient pas l'analyte et, dans le cas b), un résultat négatif ne prouve pas que la teneur réelle de l'analyte est inférieure à la limite maximale fixée pour les résidus.

1.1.16. Cochromatographie

Suivant cette méthode, la solution purifiée à tester avant la ou les étapes chromatographiques est divisée en deux fractions:

a) une fraction fait l'objet d'une chromatographie en l'état,

et

b) l'analyte étalon étant ajouté à l'autre fraction, le mélange d'analyte étalon et de solution à tester est alors chromatographié. La quantité d'analyte étalon ajoutée doit être similaire à la quantité estimée de l'analyte contenue dans la solution à tester.

1.1.17. Immunogramme

Dans la présente décision, il faut entendre par « immunogramme » la représentation graphique de la réponse immunochimique eu égard au temps de rétention ou au volume d'élution, résultant de la séparation chromatographique avec détection immunochimique (généralement indépendante) des composants de l'extrait d'échantillon.

1.2. Exigences générales

1.2.1. Critères

Conformément à l'annexe de la directive 85/591/CEE, les critères ci-dessous s'appliquent à l'examen des méthodes d'analyse.

1.2.2. Méthodes de dépistage

Il n'est pas possible de fixer des exigences pour les méthodes de dépistage. Leur principale qualité réside dans le fait que l'incidence des faux résultats négatifs doit être la plus faible possible.

1.2.2.1. La spécificité doit être définie.

1.2.2.2. Exactitude et précision:

Il se peut que la quantification ne soit pas nécessaire. Selon que l'usage d'une substance est interdit ou autorisé, la méthode de dépistage peut être qualitative ou quantitative. Les faux résultats positifs peuvent être acceptés mais les faux résultats négatifs doivent être réduits au minimum au niveau recherché.

1.2.2.3. Limite de détection:

La limite de détection est fonction de l'objectif à atteindre. Pour les substances pour lesquelles il existe une limite maximale de résidus, elle doit être suffisamment basse pour que les résidus puissent être détectés à ce niveau. Pour les substances d'usage interdit pour les animaux de boucherie, la limite de détection doit être aussi basse que possible.

1.2.2.4. Praticabilité:

Il est souhaitable que la méthode permette l'analyse d'un grand nombre d'échantillons et que les coûts soient limités.

1.2.3. Méthodes de confirmation

1.2.3.1. Spécificité:

Dans toute la mesure du possible, les méthodes de confirmation doivent fournir des indications non ambiguës sur la structure chimique de l'analyte. Si plusieurs composants donnent la même réponse, la méthode ne permet pas d'établir une distinction entre ces composants.

D'une manière générale, les méthodes basées uniquement sur l'analyse chromatographique et ne prévoyant pas l'utilisation de la détection spectrométrique moléculaire ne conviennent pas comme méthodes de confirmation.

Si une technique déterminée ne présente pas une spécificité suffisante, la spécificité requise peut être obtenue à l'aide de procédés d'analyse consistant dans des combinaisons appropriées de purification, de séparation(s) chromatographique(s) et de détection spectrométrique ou immunochimique; par exemple: CG-SM, CL-SM, IAC/CG-SM, CG-IR, CL-IR, CL/IMG.

1.2.3.2. Exactitude

En cas d'analyse répétée du matériel de référence, l'écart entre la moyenne déterminée expérimentalement et la valeur réelle (après application éventuelle des corrections requises pour la récupération) doit se situer dans les limites suivantes:

En cas d'analyse répétée du matériel de référence dans les conditions de reproductibilité, les valeurs types du coefficient de variation (CV) interlaboratoire, calculées suivant l'équation de Horwitz [(CV(%) = 2(5) 0,5 logC)], dans laquelle C représente la teneur exprimée en puissances de 10, sont les suivantes:

interlaboratoire doit généralement osciller entre la moitié et les deux tiers des valeurs ci-dessus. 1.2.3.4. Limite de détection:

À fixer en fonction de l'objectif poursuivi (cf. 1.2.6.1).

1.2.3.5. Limite de détermination:

À fixer en fonction de l'objectif poursuivi (cf. 1.2.6.2).

1.2.3.6. Sensibilité:

À fixer en fonction de l'objectif poursuivi.

1.2.3.7. Praticabilité:

La vitesse et les coûts sont moins importants que pour ce qui est des méthodes de dépistage.

Pour les méthodes de confirmation, la plupart des aspects de la praticabilité sont peu importants par rapport aux autres critères définis dans la présente décision. Il suffit généralement que les réactifs et l'équipement nécessaires soient disponibles.

1.2.4. Courbes d'étalonnage

Si la méthode à utiliser dépend d'une courbe d'étalonnage, il convient de fournir les informations suivantes:

- le modèle mathématique qui décrit la courbe d'étalonnage,

- les intervalles admissibles à l'intérieur desquels les paramètres de la courbe d'étalonnage peuvent varier d'un jour à l'autre,

- la zone de travail de la courbe d'étalonnage.

Dans toute la mesure du possible, des étalons internes et des matériels de références appropriés seront utilisés pour le contrôle de qualité des courbes d'étalonnage des méthodes de confirmation, et des informations seront données sur la variance des variables applicable au moins à la zone de travail de la courbe d'étalonnage.

1.2.5. Sensibilité aux perturbations

1.2.5.1. Pour toutes les conditions expérimentales qui, dans la pratique, sont sujettes à des variations (par exemple: stabilité des réactifs, composition de l'échantillon, pH, température), on indiquera toutes les variations pouvant influencer le résultat de l'analyse. Dans la description de la méthode figureront les moyens de remédier à tout problème de perturbation. D'autres principes de détection applicables à la confirmation seront décrits le cas échéant.

1.2.5.2. En cochromatographie, un seul pic devrait être obtenu, la hauteur (ou zone) intensifiée du pic correspondant au montant de l'analyte ajouté. En cas de CG ou de CL, la largeur du pic à la moitié de la hauteur maximale devrait se situer entre 90 % et 110 % de la largeur initiale, et les temps de rétention devraient être identiques avec une marge de 5 %. Pour ce qui est des méthodes de CCM, la tache de l'analyte devrait être simplement intensifiée; on ne devrait pas voir apparaître de nouvelle tache et son aspect ne devrait pas changer

1.2.5.3. Il est essentiel que toute perturbation pouvant être provoquée par des composants de la matrice soit étudiée.

1.2.6. Rapport entre les taux maximaux de résidus et les limites analytiques par analyse

1.2.6.1. Pour ce qui est des substances dont l'administration aux animaux de boucherie est interdite, la limite de détection de la méthode d'analyse doit être suffisamment basse pour que les taux de résidus auxquels on pourrait s'attendre après utilisation d'une substance illégale soient détectés avec une probabilité d'au moins 95 %.

1.2.6.2. Pour ce qui est des substances à limite maximale de résidus, la limite de détermination de la méthode majorée de trois fois l'écart type que la méthode indique pour un échantillon correspondant au taux maximal de résidus ne doit pas dépasser celui-ci.

1.2.6.3. Pour ce qui est des substances à limite maximale de résidus, la méthode doit être validée pour le taux limite ainsi que pour la moitié et pour le double de ce taux.

2. CRITÈRES D'IDENTIFICATION ET DE QUANTIFICATION DE RÉSIDUS

2.1. Exigences générales

Les laboratoires qui effectuent des analyses en vue de la confirmation finale de la présence de résidus de substances organiques à faible poids moléculaire veillent à ce que les critères d'interprétation des résultats soient remplis conformément aux exigences indiquées dans la présente partie. Les critères sont destinés à l'identification de l'analyte et doivent permettre d'éviter de faux résultats positifs. Pour obtenir des résultats concluants, il est nécessaire que les critères applicables au procédé d'analyse en cause soient respectés.

2.2. Remarques générales concernant la méthode d'analyse

2.2.1. Préparation de l'échantillon

L'échantillon doit être obtenu, manipulé et traité de manière telle que, si l'analyte est présent, les possibilités de le détecter soient maximales.

2.2.2. Sensibilité aux perturbations

Les informations indiquées au point 1.2.5 (sensibilité aux perturbations) doivent être fournies.

2.2.3. Critères généraux concernant le procédé

2.2.3.1. La spécificité (1.1.7) et les limites de détection (1.1.10) et de détermination (1.1.11) de la méthode applicable pour l'analyte contenu dans l'échantillon examiné doivent être connues.

Note: Cette information peut être tirée de données expérimentales et/ou de considérations théoriques.

2.2.3.2. Pour qu'un résultat positif puisse être obtenu, le comportement physique et chimique de l'analyte pendant l'analyse ne doit pas être différent de celui de l'analyte étalon placé dans l'échantillon approprié.

2.2.3.3. Le résultat positif ou négatif de l'analyse ne peut se situer que dans les limites de spécificité, de détection et de détermination de la méthode applicable pour l'analyte et l'échantillon analysés.

2.2.3.4. Du matériel de référence ou supplémenté contenant des quantités connues d'analyte doit de préférence être analysé en même temps que chaque lot d'échantillons analysé en suivant l'ensemble de la méthode. Un étalon interne peut aussi être ajouté aux échantillons analysés.

2.2.4. Critères relatifs à la préconcentration, à la purification et à l'extraction physiques et/ou chimiques indépendantes

2.2.4.1. L'analyte doit se trouver dans la fraction caractéristique de l'analyte étalon correspondant placé dans un échantillon approprié, et suivant les mêmes conditions expérimentales.

2.2.4.2. Les données relatives au temps de rétention caractéristiques de l'analyte étalon, des échantillons de contrôle et des fractions à analyser doivent être indiquées conjointement avec le résultat final, positif ou négatif.

2.2.5. Critères de mesure quantitative

2.2.5.1. La récupération doit être mesurée et précisée pour toutes les mesures quantitatives.

2.2.5.2. La variabilité de la récupération intralaboratoire doit être aussi faible que possible.

2.2.5.3. Il convient d'indiquer clairement si les résultats finaux ont été ou non corrigés en fonction de la récupération. Dans l'affirmative, la méthode de correction utilisée doit être décrite.

2.3. Critères applicables aux méthodes d'analyse qui ne peuvent être utilisées à des fins de confirmation que combinées avec d'autres méthodes

2.3.1. Exigences de qualité applicables à la détermination d'un analyte par IA

2.3.1.1. Il y a lieu de spécifier la zone de travail de la courbe d'étalonnage, qui doit, en général, couvrir un intervalle de concentration d'au moins 10 unités décimales.

2.3.1.2. Il convient de disposer d'au moins six points d'étalonnage, distribués de manière adéquate le long de la courbe d'étalonnage.

2.3.1.3. Les paramètres adéquats de contrôle de la qualité doivent correspondre à ceux des essais précédents; par exemple: NSB et paramètres de la courbe d'étalonnage.

2.3.1.4. Des échantillons de contrôle doivent être inclus dans chaque essai. Niveau de concentration: nulle, faible, moyenne et supérieure de la zone utile. Les résultats concernant ceux-ci doivent concorder avec les résultats des essais précédents.

Toutes les données brutes concernant les échantillons de contrôle et les fractions à analyser doivent être transmises conjointement avec le résultat final, positif ou négatif.

2.3.2. Critère de détermination d'un analyte par CG ou CL avec détection non spécifique

2.3.2.1. L'analyte doit éluer au temps de rétention caractéristique de l'analyte étalon correspondant, dans les mêmes conditions expérimentales.

2.3.2.2. Le maximum du pic le plus proche dans le chromatogramme doit être séparé du pic de l'analyte d'une distance au moins égale à la largeur totale à 10 % de la hauteur maximale.

2.3.2.3. Pour recueillir des informations supplémentaires, on peut utiliser la cochromatographie et recourir à deux colonnes aux moins de polarités différentes.

2.3.3. Critères de détermination d'un analyte par CCM

2.3.3.1. La (ou les) valeur(s) Rf de l'analyte doit(doivent) correspondre à la (ou aux) valeur(s) Rf caractéristiques de l'analyte étalon. Cette exigence est remplie lorsque la ou les valeur(s) Rf de l'analyte se trouve(nt) dans une limite de ± 3 % de la (ou des) valeur(s) Rf de l'analyte étalon dans les mêmes conditions expérimentales.

2.3.3.2. L'aspect de l'analyte ne doit pas pouvoir être distingué de celui de l'analyte étalon.

2.3.3.3. Le centre du point le plus proche de celui imputable à l'analyte doit être séparé de celui-ci par une distance correspondant au moins à la moitié de la somme des diamètres des taches.

2.3.3.4. Une cochromatographie et/ou une CCM à deux dimensions peut (peuvent) être utilisée(s) pour l'obtention d'informations supplémentaires.

2.4. Critères applicables aux méthodes d'analyse pouvant être utilisées à des fins de confirmation

2.4.1. Critères de détermination d'un analyte par CL/IA ou CL/Img

2.4.1.1. Pour ce qui est de la méthode CL/Img, le pic de l'analyte dans l'Img devrait être constitué d'au moins 5 fractions de CL.

2.4.1.2. Les critères visés aux points 2.2.4.1 et 2.2.4.2 doivent être respectés.

2.4.1.3. Réactifs

L'origine et les caractéristiques de l'anticorps et des autres réactifs doivent être spécifiées.

2.4.1.4. Courbe d'étalonnage

La méthode dépendant de courbes d'étalonnage, l'information visée au point 1.2.4 (courbes d'étalonnage) doit être donnée.

Les exigences de qualité relatives à l'IA (2.3.1.1 à 2.3.1.4) doivent être remplies.

2.4.1.5. Aux fins de confirmation, si la méthode n'est pas utilisée en combinaison avec d'autres méthodes, deux séparations CL différentes ou deux immunogrammes utilisant des anticorps ayant des spécificités différentes doivent être effectués.

2.4.2. Critères de détermination d'un analyte par CL-SP

2.4.2.1. Les critères 2.3.2.1 et 2.3.2.2 doivent être respectés.

2.4.2.2. La longueur d'onde d'absorption maximale de l'analyte dans le spectre doit être identique à celle de l'analyte étalon avec une marge déterminée par la résolution du système de détection. Pour la détection par barrette de diodes, cette valeur se situe typiquement dans un intervalle de ± 2 nm.

2.4.2.3. Le spectre de l'analyte au-dessus de 220 nm ne doit pas être visuellement différent du spectre de l'analyte étalon pour les parties des deux spectres caractérisés par une absorbance relative supérieure ou égale à 10 %. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et qu'à aucun point observé la différence des deux spectres n'est supérieure à 10 % de l'absorbance caractéristique de l'analyte étalon.

2.4.2.4. Aux fins de confirmation, si la méthode n'est pas utilisée en combinaison avec d'autres méthodes, la cochromatographie est obligatoire dans la phase CL. Voir le point 1.2.5.2 pour les exigences à respecter en ce qui concerne la cochromatographie.

2.4.3. Critères de détermination d'un analyte par CCM-SP

2.4.3.1. La méthode doit répondre aux critères fixés pour la CCM (points 2.3.3.1 à 2.3.3.3).

2.4.3.2 La longueur d'onde d'absorption maximale de l'analyte dans le spectre doit être identique à celle de l'analyte étalon, à l'intérieur d'une marge déterminée par la résolution du système de détection.

2.4.3.3. Le spectre de l'analyte ne doit pas être visuellement différent de celui de l'analyte étalon.

2.4.3.4. Aux fins de confirmation, si la méthode n'est pas utilisée en combinaison avec d'autres méthodes, la cochromatographie est obligatoire dans la phase de CCM. Voir le point 1.2.5.2 pour les exigences à remplir en cas de cochromatographie.

2.4.4. Critères de détermination d'un analyte par CG-SM

2.4.4.1. Critères applicables à la CG

2.4.4.1.1. Les critères en question aux points 2.3.2.1 et 2.3.2.2 doivent être respectés.

2.4.4.1.2. Un étalon interne doit être utilisé si le matériel approprié est disponible. Il doit s'agir de préférence de l'analyte marqué d'un isotope stable ou, à défaut, d'un étalon apparenté ayant un temps de rétention proche de celui de l'analyte.

2.4.4.1.3. Le rapport entre le temps de rétention de l'analyte soumis à une CG et celui de l'étalon interne, c'est-à-dire le temps de rétention relatif de l'analyte, doit être égal à celui de l'analyte étalon dans la matrice appropriée, à ± 0,5 % près.

2.4.4.1.4. Si la méthode est utilisée à des fins de confirmation et si aucun étalon interne n'est utilisé, l'identification de l'analyte doit être confirmée par cochromatographie.

2.4.4.2. Critères applicables à la méthode SMFR

2.4.4.2.1. Aux fins du dépistage, il faut mesurer au moins l'intensité de l'ion diagnostique le plus abondant.

2.4.4.2.2. Aux fins de confirmation, il est préférable que l'intensité d'au moins quatre ions diagnostiques soit mesurée. Lorsque l'analyte ne donne pas 4 ions diagnostiques par la méthode utilisée, son identification s'effectue sur la base des résultats d'au moins deux méthodes CG-LFMR indépendantes, basées sur des dérivés différents et/ou des techniques d'ionisation dont chacune donne deux ou trois ions diagnostiques.

L'ion moléculaire doit être de préférence l'un des ions diagnostiques sélectionnés.

2.4.4.2.3. Les abondances relatives de tous les ions diagnostiques provenant de l'analyte doivent être équivalentes à celles de l'analyte étalon, de préférence à ± 10 % près (mode IE) ou ± 20 % près (mode IC).

Critères d'identification de l'analyte par IR

2.4.5.1. Définition des pics adéquats

Les pics adéquats sont des maxima d'absorption dans le spectre infrarouge d'un analyte étalon remplissant les conditions suivantes.

2.4.5.1.1. Le maximum d'absorption se situe dans le nombre d'onde allant de 1 800 à 500 cm 1.

2.4.5.1.2. L'intensité d'absorption n'est pas inférieure:

a) à une absorbance molaire spécifique de 40 par rapport à une absorbance nulle et à une absorbance molaire spécifique de 20 par rapport à la ligne de base du pic,

ou

b) à une absorbance relative de 12,5 % de l'absorbance du pic le plus intense dans la zone 1 800 - 500 cm 1, lorsque les deux sont mesurées par rapport à l'absorbance nulle, et à une absorbance relative de 5 % de l'absorbance du pic le plus intense dans la zone de 1 800 - 500 cm 1 lorsque les deux sont mesurées par rapport à la ligne de base de leur pic.

Note: Quoique des pics appropriés déterminés conformément au point a) puissent être préférés en théorie, les pics prévus au point b) sont plus faciles à déterminer dans la pratique.

2.4.5.2. Le nombre de pics dans le spectre infrarouge de l'analyte dont les fréquences correspondent à un pic adéquat dans le spectre de l'analyte étalon, à ± 1 cm 1 près, est indiqué.

2.4.5.3. Critères applicables à la méthode IR

2.4.5.3.1. L'absorption doit être présente dans toutes les zones du spectre de l'analyte qui correspondent à un pic adéquat du spectre de référence de l'analyte étalon.

2.4.5.3.2. Un minimum de 6 pics adéquats est exigé dans le spectre infrarouge de l'analyte étalon. S'il existe moins de 6 pics adéquats, le spectre infrarouge en cause ne doit pas être utilisé comme spectre de référence.

2.4.5.3.3. Le « résultat », c'est-à-dire le pourcentage de pics adéquats de l'analyse étalon trouvé dans le spectre infrarouge doit être d'au moins 50.

2.4.5.3.4. Lorsqu'il n'existe pas de correspondance exacte avec un pic adéquat, la région appropriée du spectre de l'analyte doit correspondre à la présence d'un pic de même niveau.

2.4.5.3.5. La procédure n'est applicable qu'aux pics d'absorption dans le spectre de l'échantillon ayant une intensité d'au moins trois fois la hauteur du bruit de fond.

2.5. Autres méthodes d'analyse

Des méthodes d'analyse ou des combinaisons de méthode d'analyse autres que celles en question aux points 2.3 et 2.4 (par exemple: CL - SM, SM - SM, CG - IR) peuvent être utilisées à des fins de dépistage ou de confirmation, pour autant qu'elles répondent à des critères comparables permettant une identification de l'analyte dénuée de toute ambiguïté au niveau recherché.

APPENDICE

Liste d'abréviations et de symboles IC = ionisation chimique

IE = ionisation par impact électronique

g = gramme(s)

CG = chromatographie en phase gazeuse

IA = dosage immunologique

IAC = immuno affinité chromatographie

IMG = immunogramme

IR = spectrométrie infrarouge

kg = kilogramme(s) (103 g)

l = litre(s)

CL = chromatographie liquide

SMFR = spectrométrique de masse à faible résolution

mg = milligramme(s) (10 3 g)

SM = spectrométrie de masse

ng = nanogramme(s) (10 9 g)

NSB = liaison non spécifique

Rf = distance de migration par rapport au front du solvant

SP = spectrométrie, par exemple système à diodes

CCM = chromatographie en couche mince

mg = microgramme(s) (10 6 g)

/ = techniques associées indépendantes

- = techniques couplées en ligne

par exemple CL/CG - SM = CL indépendante suivie par CG avec SM en ligne

(1) JO no L 275 du 26. 9. 1986, p. 36.

(2) Organisation internationale de standardisation: statistiques - vocabulaire et symboles.

(3) JO no L 372 du 31. 12. 1985, p. 50.

(4) Organisation internationale de standardisation: précision des méthodes d'essai - Détermination de la répétabilité et de la reproductibilité pour une méthode d'essai standard à l'aide de tests interlaboratoires.