ANNEXE I

Système de tests à effectuer conformément aux articles 3, 4, 5, 7 et 8

1. PRINCIPES GÉNÉRAUX CONCERNANT LA PRÉSENCE DE L’ORGANISME NUISIBLE SPÉCIFIÉ

1.1. La présence de l’organisme nuisible spécifié est soupçonnée en cas de résultat positif lors du premier test de détection effectué sur le végétal spécifié. Pour le matériel végétal symptomatique, le premier test de détection peut être un isolement sélectif.

1.2. La présence de l’organisme nuisible spécifié est confirmée sur des échantillons symptomatiques des végétaux spécifiés dans les cas suivants: a) lorsque le premier test de détection est un isolement sélectif donnant lieu à des colonies qui présentent une morphologie caractéristique: deux tests d’identification donnent des résultats positifs; b) lorsque le premier test de détection est un test autre qu’un isolement sélectif: i) deux tests d’identification donnent des résultats positifs après que l’échantillon a été soumis à un isolement sélectif; ii) un deuxième test de détection autre qu’un isolement sélectif donne des résultats positifs.

1.3. La présence de l’organisme nuisible spécifié est confirmée sur des échantillons asymptomatiques des végétaux spécifiés dans les cas suivants: a) lorsqu’un résultat positif est obtenu lors du deuxième test de détection, à condition que le premier ou le deuxième test soit un test moléculaire (fondé sur l’ADN) (PCR en temps réel TaqMan® ou PCR classique); b) pour les échantillons prélevés dans un État membre ou dans une zone d’un État membre où la présence de l’organisme nuisible spécifié n’est pas connue et pour les échantillons provenant d’un autre État membre: lorsqu’un résultat positif est obtenu lors du deuxième test de détection effectué conformément au point a) et que des résultats positifs sont obtenus lors de deux tests d’identification effectués après que l’échantillon a été soumis à un isolement sélectif.

2. TESTS

2.1. Tests de détection

Les tests de détection permettent de détecter systématiquement au moins 104cellules/ml d’extrait concentré remis en suspension.

Le deuxième test de détection est fondé sur des principes biologiques différents ou sur des régions de nucléotides différentes par rapport au premier test de détection.

Les tests de détection sont les suivants:

a) tests d’immunofluorescence, tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales;

b) test FISH [van Beuningen et al. (1995)] (1), tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales;

c) tests d’isolement, tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales. L’une des deux options suivantes est appliquée: i) isolement direct sur des milieux de croissance semi-sélectifs (ou non sélectifs), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; ii) après enrichissement par le test biologique, isolement tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

d) test PCR classique à l’aide d’amorces de Pastrik (2000) (2), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

e) tests PCR en temps réel TaqMan® à l’aide d’amorces et de sondes de: i) Schaad et al. (1999) (3), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) («test NYtor»), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; iii) Gudmestad et al. (2009) tel qu’adapté par Vreeburg et al. (2018)4, tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales; iv) Massart et al. (2014) (5), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

2.2. Tests d’identification

Les tests d’identification sont les suivants:

a) test d’immunofluorescence, tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

b) test PCR classique [Pastrik (2000)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

c) tests PCR en temps réel TaqMan® à l’aide d’amorces et de sondes de: i) Schaad et al. (1999), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; ii) Vreeburg et al. (2018) («test NYtor»), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; iii) Gudmestad et al. (2009) tel qu’adapté par Vreeburg et al. (2018), tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales; iv) Massart et al. (2014), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

d) codification de l’ADN en codes-barres, tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

e) SM MALDI-TOF [Zaluga et al. (2011) (6)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

3. DIAGRAMMES DES PROCÉDURES

Diagramme no 1: Procédure de diagnostic de la présence de l’organisme nuisible spécifié dans des échantillons symptomatiques du végétal spécifié

a L’isolement peut être utilisé comme premier ou deuxième test de détection. Si la présence de l’organisme nuisible spécifié est soupçonnée sur le milieu de croissance, les colonies sont purifiées pour obtenir des cultures pures sur lesquelles deux tests d’identification sont effectués. Des résultats positifs aux deux tests d’identification sont nécessaires pour confirmer la présence de l’organisme nuisible.

b Le troisième test de détection est fondé sur des principes biologiques différents ou sur des régions de nucléotides différentes.

Diagramme no 2: Procédure de diagnostic de la présence de l’organisme nuisible spécifié dans des échantillons asymptomatiques du végétal spécifié

a L’isolement n’est pas utilisé.

b Le troisième test de détection est fondé sur des principes biologiques différents ou sur des régions de nucléotides différentes. L’isolement n’est pas utilisé.

c Pour les échantillons visés au paragraphe 1.3, point b), la confirmation de la présence de l’organisme nuisible spécifié après le deuxième test de détection positif nécessite l’isolement de l’organisme nuisible spécifié par rapport à l’échantillon, suivi de deux tests d’identification positifs.

4. PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON

4.1. Échantillons de tubercules asymptomatiques

L’échantillon standard compte 200 tubercules par test. La procédure de laboratoire appropriée pour traiter les noyaux de talons en vue d’obtenir l’extrait destiné à la détection de l’organisme nuisible spécifié est décrite dans les normes de diagnostic internationales.

4.2. Échantillons de matériel végétal asymptomatique, à l’exclusion des tubercules

La détection des infections latentes est effectuée sur des échantillons composites de segments de tiges. La procédure peut être appliquée à un maximum de 200 parties de tiges issues de différents végétaux dans un seul échantillon. La procédure de laboratoire appropriée pour désinfecter et traiter les segments de tiges afin d’obtenir l’extrait destiné à la détection de l’organisme nuisible spécifié est décrite dans les normes de diagnostic internationales.

4.3. Échantillons du végétal spécifié symptomatique

Des fragments de tissus sont retirés dans des conditions d’asepsie de l’anneau vasculaire d’un tubercule ou des vaisseaux de la tige de végétaux spécifiés présentant des symptômes de flétrissement. La procédure de laboratoire appropriée pour traiter ces tissus afin d’obtenir l’extrait destiné à la détection de l’organisme nuisible spécifié est décrite de façon détaillée dans les normes de diagnostic internationales.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. Bulletin OEPP 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.