N0L337/18 JournalofficieldesCommunautés européennes 21.11.92
II
(Actesdontlapublicationn'estpasuneconditiondeleurapplicabilité)
COMMISSION
DÉCISIONDELACOMMISSION
du19novembre 1992
fixantlesplansd'échantillonnage etlesméthodesdediagnosticpourla
détectionetlaconfirmationdelaprésencedecertainesmaladiesdespoissons
(92/532/CEE)
LACOMMISSION DESCOMMUNAUTÉS EUROPÉENNES ,
vuletraitéinstituantlaCommunautééconomiqueeuro­
péenne,
vuladirective91/67/CEEduConseil,du28janvier1991,
relativeauxconditionsdepolicesanitairerégissantla
misesurlemarchéd'animauxetdeproduitsd'aquacul­
ture('),etnotammentsonarticle15,
considérantque,selonl'article15deladitedirective,il
convientdefixerlesplansd'échantillonnage etles
méthodesdediagnosticàutiliserpourladétectionetla
confirmationdelaprésencedemaladiesdepoissons;
considérantquelecomitéscientifiquevétérinaireinstitué
parladécision81/651/CEEdelaCommission (2)aété
consulté;
considérantquelesmesuresprévuesàlaprésentedécision
sontconformesàl'avisducomitévétérinairepermanent,AARRÊTÉLAPRÉSENTEDÉCISION :
Articlepremier
Lesplansd'échantillonnage etlesméthodesdediagnostic
pourladétectionetlaconfirmationdelaprésencedela
nécrosehématopoïétique infectieuse(NHI)etdelasepti­
cémiehémorragiquevirale(SHV)sontfixésenannexe.
Article2
LesÉtatsmembressontdestinatairesdelaprésentedéci­
sion.
FaitàBruxelles,le19novembre1992.
ParlaCommission
RayMACSHARRY
MembredelaCommission
(•)JOn0L46du19.2.1991,p.1.
iÂJOn0L233du19.8.1981,p.32.

21.11.92 JournalofficieldesCommunautés européennes N0L337/19
ANNEXE
PREMIÈREPARTIE
PROCÉDURES D'ÉCHANTILLONNAGE ETDEDIAGNOSTIC POURLASURVEILLANCE
DELASHVETDELANHI
LÉchantillonnage
1.Périodedel'échantillonnage
Lesexploitationsfontl'objetd'uneinspectioncliniqueaumoinsdeuxfoisparanaucoursdelapériode
octobre-juinouàn'importequelmomentoùlatempératuredel'eauestinférieureà14°C.Lesintervalles
entrelesinspectionsdoiventêtred'aumoinsquatremois.Touteslesunitésdeproduction(étangs,cuves,
aquariums,cages,etc.)sontsoumisesàuneinspectiondestinéeàétablirlaprésencedepoissonsmorts,
faiblesouaucomportement anormal.Uneattentionparticulièredoitêtreaccordéeaupointd'évacuation
deseaux(sicelaestfaisable)oùlespoissonsfaiblesonttendanceàs'accumulerenraisonducourant.
2.Sélectionetcollectedeséchantillons
Ilestcollectéauxfinsd'examen,enliaisonaveclesinspectionsviséesautableau1A,deséchantillons
composésde30à150poissonset/ouliquidesovariens.Sidestruitesarc-en-cielsontprésentes,lespois­
sonsdecetteespècedevraiententrerdanslacompositiondel'échantillon .Siteln'estpaslecas,l'échan­
tillondoitcontenirdespoissonsdetouteslesautresespècesprésentesdanslamesureoùcesespècessont
sensiblesàlaSHVet/ouàlaNHI(définiesàl'annexeAdeladirective91/67/CEEconcernantlescondi­
tionsdesantéanimalerégissantlamisesurlemarchédesanimauxetdesproduitsdel'aquaculture).Les
espècesdoiventêtrereprésentéesdemanièreégaledansl'échantillon.Aucoursdelapériodedecontrôle
initialedequatreansquiprécèdel'agrément,l'échantillonestcomposéde150unités,demanièreà
garantirunedétectionayantunefiabilitéde95%desvirusdontlaprévalenceestde2%.Aucoursdes
annéesultérieures(maintiendel'agrément),latailledel'échantillonpeutêtreramenéeà30unitéspour
garantirunedétectionayantuntauxdefiabilitéde95%desvirusdontlaprévalenceestde10%(tableau
1B).
Danslesexploitationsquipeuventprouverqu'ellessontdepuislongtempsindemnesdeSHVetdeNHI
(surlabased'unprogrammerégulierd'inspectionssanitairesofficielles),l'échantillonàtailleréduitepeut
êtreutiliséégalementaucoursdelapériodeinitialedecontrôledequatreans.
Sionutilise,pourlaproductiondupoisson,plusd'unesourced'eau,lespoissonsreprésentanttoutesles
sourcesd'eaupeuventêtreinclusdansl'échantilloncontenant150ou30poissons.Sidespoissonsfaibles,
aucomportement anormalouquiviennentdemourir(pasencoredécomposés)sontprésents,ilsdoivent
êtreinclusenpremierlieudansl'échantillon.Sicespoissonsnesontpasprésents,l'échantillondoitêtre
composédepoissonsenbonnesanté,àl'aspectnormal,collectésdetellemanièrequetouteslespartiesde
l'exploitationainsiquetouteslesclassesd'âgeparannéesoientreprésentéesdansl'échantillon.
3.Préparationetenvoideséchantillonsdepoissons
Avantd'êtreenvoyésoutransférésverslelaboratoire,lesmorceauxd'organesàexaminersontprélevéssur
lepoissonàl'aidedeciseauxoud'autresinstrumentsstérilesetplacésdanslestubesenplastiqueconte­
nantlemilieudetransport,c'est-à-diredumilieudeculturecellulairecontenant10%desérumdeveau
etd'antibiotiques .Lacombinaisonde200UIdepénicilline,200|xgdestreptomycineet200\igdekana­
mycineparmlpeutêtrerecommandée maisd'autresantibiotiquesàl'efficacitééprouvéepeuventégale­
mentêtreutilisés.Lestissusàexaminersontlarate,lereinantérieur,l'encéphaleet,danscertainscas,le
liquideovarien(tableaux1Aet1B).
Desmorceauxd'organesde5à10poissons(tableaux1Aet1B)peuventêtreréunisdansuntube,repré­
sentantunéchantillonglobal.Lestissusdechaqueéchantillondoiventpeseraumoins1g,demanière
queladilutionfinalesoitd'environ1/10.
Lestubessontplacésdansdesrécipientsisolés(parexempledesboîtesenpolystyrèneàparoisépaisses)
avecunequantitésuffisantedeglaceoude«blocscongelés»pourgarantirunetempératuredeséchantil­
lonscompriseentre0et5°Cpendantletransportverslelaboratoire.Éviterlegeldeséchantillons.
L'examenvirologiquedoitcommencerdèsquepossible,auplustard48heuresaprèslacollectedes
échantillons.Silespoissonsàexaminermesurentmoinsde6cmdelongueur,ilspeuventêtreenvoyés
entiersverslelaboratoiredansdessachetsenplastiqueréfrigéréscommeindiquéci-dessus.

N0L337/20 21.11.92 JournalofficieldesCommunautés européennes
4.Collectedematérieldiagnosticsupplémentaire
Conformément àl'accordconcluaveclelaboratoiredediagnosticencause,d'autrestissusdepoissons
peuventêtrecollectéségalementetpréparésenvued'examenssupplémentaires .
II.Préparationdeséchantillonsenvuedel'examenvirologique
1.Homogénéisation desorganes
Aulaboratoire,lestissuscontenusdanslestubesdoiventêtrecomplètement homogénéisés (soitàl'aide
d'unbroyeurstomacher,d'unmixeuroud'unensemblepilon-mortier )etplacésensuiteensuspension
danslemilieudetransportoriginal.Siunéchantillonestconstituédepoissonsentiers,c'est-à-direde
poissonsdemoinsde6cm,ceux-cisontréduitsenfinesparticulesàl'aidedeciseauxstérilesaprèsélimi­
nationdelapartieducorpssesituantàl'arrièredel'ouvertureventrale,homogénéisésconformément àla
méthodedécriteci-dessusetmisensuspensiondanslemilieudetransportselonlaproportionde1/10.
2.Centrifugation del'homogénat
L'homogénatestcentrifugédansunecentrifugeuseréfrigéréeà20C-50Cà2000-4000xgpendant15
minutesetleliquidesurnageantestcollectéauxfinsd'examen.
Sil'envoidel'échantillons'estfaitdansunmilieudetransport(c'est-à-diresousantibiotiques),leliquide
surnageantnedoitplusêtretraitéauxantibiotiques .
Sil'échantillonaétéenvoyésousformedepoissonsentiers,l'homogénatobtenuaprèscentrifugationdoit
êtretraitéauxantibiotiquesdanslemilieudetransportutilisépoursaremiseensuspensionsoitpendant
quatreheuresàlatempératureambiantesoitpendantunenuità4°C.
Letraitementauxantibiotiquesviseamaîtriserlacontamination bactériennedeséchantillonsetrend
superfluetoutefiltrationàtraversdesfiltresàmembranes .
Immédiatement aprèslacentrifugation ,mélangerunvolumedeliquidesurnageantavecdespartségales
d'unantisérumdivalentcontrelevirusNPI(souchesderéférenceSpetAb),diluédefaçonappropriée,et
incuberainsipendantauminimumuneheureà15°Couaumaximumpendant18heuresà4°C.Le
titredel'antisérumdoitêtred'aumoins1/2000dansuntestdeneutralisationsurplaqueà50%.
Letraitementdetouslesinoculaàl'antisérumcontrelevirusNPI(virusqui,danscertainesrégionsd'Eu­
rope,estprésentdans50%deséchantillonsdepoissons)viseàempêcherledéveloppement ,dansdes
culturescellulairesinoculées,deECPrésultantduvirusNPI.Celaréduiraladuréedesexamensvirologi­
quesainsiquelenombredescasdanslesquelsl'apparitiondeECPdevraitêtreconsidéréecommeune
indicationpotentielledeSHVoudeNHI.
Lorsquedeséchantillonsproviennentd'unitésdeproductionconsidéréescommeindemnesdeNPI,le
traitementdesinoculaàl'antisérumcontrelevirusNPIpeutêtreomis.
III.Examenvirologique
1.Culturescellulairesetmilieux
DescellulesBF-2et,soitEPC,soitFHMsontcultivéesàdestempératuresde20à250Cdansunmilieu
Eaglé'sMEM(oudesversionsmodifiées),additionnéde10%desérumdefoetusdebovinetd'antibioti­
quesàdesconcentrations standard.
Lorsquelescellulessontcultivéesdansdesfiolesfermées,tamponnerlemilieuàl'aidedebicarbonate .Le
milieuutilisépourlaculturedecellulesenunitésouvertesdoitêtretamponnéàl'aidedeTris-HCl(23
mM)etdebicarbonatedesoude(6mM)àunpHaussiprochequepossiblede7,6,valeuroptimalepourla
multiplication virale.
Lesculturesdecellulesàutiliserpourl'inoculationavecdumatérieltissulairedevraientêtrejeunes(de4à
48heures)etenphasedecroissanceactive(nonconfluentes)aumomentdel'inoculation .
2.Inoculation desculturescellulaires
Inoculerunesuspensiond'organestraitéeauxantibiotiquesdansdesculturescellulairesendeuxdilu­
tions:lapremièreet,enoutre,unedilutiondecelle-cià1/100(demanièreàéviterdesinterférencespar
homologie).Deuxlignesdecellulesaumoinsdoiventêtreinoculées(cf.III.l).Lerapportentrelataillede
l'inoculumetlevolumedumilieudeculturecellulairedevraitêtred'environ1/10.
Pourchaquedilutionetchaquelignedecellules,ilyalieud'utiliserunminimumd'environ2cm2de
cellules,cequicorrespondàunecupuledansunplateaudeculturecellulaireà24cupules.L'utilisationde
plateauxdeculturecellulaireestrecommandéemaisd'autressupportsprésentantunesurfacedecrois­
sancesimilaireousupérieurepeuventégalementconvenir.

21.11.92 JournalofficieldesCommunautés européennes N0L337/21
3.Incubationdesculturescellulaires
Incuberlesculturescellulairesinoculéesà15°Cpendantseptjours.Silacouleurdumilieudeculture
cellulaireviredurougeaujaune,indiquantuneacidificationdumilieu,ajusterlepHàl'aided'unesolu­
tionstériledebicarbonateouàl'aidedesubstanceséquivalentespourgarantirlasensibilitédelacelluleà
l'infectionvirale.
EffectuertouslessixmoisletitragedesstockscongelésdevirusSHVetNHIafindevérifierlasensibilité
desculturescellulairesàl'infection.
4.Microscopie
InspecterchaquejourlesculturescellulairesinoculéesafindedécelerlaformationdeECPàungrossisse­
mentd'environ40fois.Sionobservenettementl'apparitiondeECP,engagerimmédiatement lesprocé­
duresd'identification duvirusconformément àlasectionIV.
Enmêmetemps,prendrelesmesuresappropriéespoursuspendrel'agrémentdel'unitédeproduction
d'oùprovientl'échantillonpositifauvirusetdetouteunitédeproductionsituéeenaval.
Maintenirlasuspensiondel'agrémentjusqu'àcequelestestsdelaboratoireaientconfirméquelevirus
encausen'estpaslevirusdeSHVoudeNHI.Ledélaiautorisépourl'identificationduvirusestdequatre
semainesaumaximum,ycomprisletempsnécessairepourprocéderàl'analysedansleslaboratoiresde
référence.
5.Sous-culture
S'ilnes'estpasdéveloppédeECPaprèsuneincubationdeseptjours,procéderàunesous-cultureportant
surdesculturescellulairesfraîchesenutilisantunesuperficiecellulairesimilaireàcelledelaculture
primaire.
Despartiesaliquotesdumilieuprovenantdetouteslescultures/cupulesconstituantlacultureprimaire
sontgroupéesselonlasouchecellulaireàlasuited'uncycledecongélationetdedécongélation des
cultureset0,5mldumilieuestmélangéàdespartségalesd'antisérumcontrelaNPIcommedécritàla
sectionII.2etlemélangeestincubéà15°Cpendant60minutes.Lemélangeestensuiteinoculédans
desculturescellulaireshomologuesàdesdilutionsde1/1etde1/100conformément àlasectionIII.2.
L'inoculationpeutêtreprécédéed'unepréincubationdetouteslesdilutionsavecdel'antisérumdivalent
contrelevirusNPIàunedilutionappropriée.
Incuberensuitelesculturesinoculéespendantseptjoursà150Ccomptetenudesdispositionsdela
sectionIII.4.
IV.Identification duvirus
1.Neutralisation
Si,dansuneculturecellulaire,laformationdeECPaétéconstatée,lemilieuestcollecté,lescellulessont
éliminéesparcentrifugation àfaiblevitesseouparfiltrationsurfiltreàmembrane(0,45|xm)puisle
milieuestdiluéà1/100et1/10000dansunmilieudeculturecellulaire.
Mélangerdespartiesaliquotesdesdilutionsetlesincuberséparémentpendant60minutesà150Cavec
despartieségalésdesreactifssuivants:
—anticorpsspécifiquecontrelevirusdelaSHV(virusd'Egtved)
—anticorpsspécifiquecontrelesinfectionsduvirusdelanécrosehématopoïétique (NHI)
—antisérumdivalentcontrelevirusdelanécrosepancréatiqueinfectieuse(NPI)(souchesde
référenceSpetAb
—milieudeculture1/50*
1/50*
1/50*
1/1
*oucommepréciséparlelaboratoirederéférenceencequiconcerne 1éventuellecytotoxicitédesantisé­
rums.
Lesréactifsutilisésdoiventêtredequalitéderéférenceencequiconcerneletitreetlaspécificité.
Inoculeraumoinsdeuxculturescellulairesavec50|ilchacunedemélangedevirusetdesérumet
incuberà15°C.Contrôlerledéveloppement deECPconformément àlasectionIII.4.
Siletestn'apaspermisd'identifieraveccertitudelevirusenl'espaced'unesemaine,procéderàunedes
opérationssuivantes:
a)transférerlevirusversunlaboratoirederéférencenationalspécialisédanslesvirusdespoissonsàdes
finsd'identificationimmédiate;
b)appliquerlestechniquesIFAT(sectionIV.2),ELISA(sectionIV.3)oud'autrestechniquesd'identifica­
tiondesvirusàl'aidederéactifsdequalitéderéférence.

N0L337/22 JournalofficieldesCommunautés européennes 21.11.92
2.Immunofluorescence (IFAT)
Pourchaqueisolâtdevirusàidentifier,ensemenceraumoinshuitcouvre-objetsoul'équivalentàl'aidede
cellulesECPàunedensitéengendrantuneconfluenced'environ60à90%après24heuresdeculture.
ChoisirlescellulesECPàcettefinàcausedeleurforteadhérenceauxsurfacesdeverre.
Lorsquelescellulessontdéposéessurlasurfaceduverre(environ1heureaprèsl'ensemencement )ou
lorsquelesculturesontétéincubéespendant24heuresaumaximum,inoculerlevirusàidentifier.
Inoculerquatreculturessuivantlerapportdevolumeàvolumede1/10etquatreculturessuivantle
rapportde1/100.
Entre20et30heuresaprèsl'inoculation,rincerlesculturesdeuxfoisàl'aideduproduitEagle'sMEM
sanssérum,fixeràl'acétoneetteinterparIFATàdeuxcouches.Lapremièrecouchederéactifconsisteen
unantisérumagréé(commedanslasectionIV.1).Lasecondecouchederéactifestunantisérumconjugué
avecFITCcontrel'immunoglobuline utiliséedanslapremièrecouche.Pourchacundesantisérumstestés,
teinteraumoinsunecultureinoculéeàdoseélevéeetunecultreinoculéeàfaibledose.Incluredansle
testdestémoinsnégatifsetpositifsappropriés.
Monterlesculturesteintéesenutilisantunesolutionglycérol-eausalée.Examinerauxultravioletsinci­
dents.Utiliserdesoculaires10xou12xetdeslentillesd'objectifx25oux40dotéesd'ouvertures
numériques>0,7et>1,3respectivement .Lesdilutionsdel'antisérumprimaireetdel'immunoglobu­
lineconjugéeauFITCdépendrontdusystèmedemicroscopie,choisioudisponible.
CertainessouchesduvirusEgtvedréagissentfortementavecl'antisérumcontrelasouchederéférenceFI
àl'IFATbienqueneréagissantpasdansdestestsdeneutralisation .
3.TestELISA
Recouvrirlescupulesdesplaquesmicrotitres(parexemple,immunoplaques Nunc,Maxisorp,Nunc,
Danemark)pendantunenuitaveclesdilutionsrecommandées defractionsd'immunoglobuline purifiéeà
laprotéineAdesantisérumsmentionnésàlasectionIV.1.
Aprèsrinçagedescupulesàl'aided'untamponPBS-Tween-20 ,introduirelevirusàidentifierdansles
cupulesendeuxouquatredilutionsetlaisseropérerlaréactionavecl'anticorpsdecouverturependant60
minutesà37°C.Aprèsrinçageàl'aidedutamponPBS-Tween-20 ,ajouterlesanticorpstraitésaubioti­
nyle,d'unespécificitécorrespondant àcelledesanticorpsdecouvertureetlaisseragirpendant60minutes
àunetempératurede200C.Aprèsunnouveaurinçagecommeci-dessus,ajouterdelastreptavidine
conjugéeavecHRPetlaisserréagirpendant1heureà20°C.Aprèsundernierrinçage,l'enzymeliéeest
visualiséeàl'aidedesubstratsELISAappropriés(OPD,TMBouautres).
LavarianteELISAci-dessus,baséesurlabiotineetl'avidine,estdonnéeàtitred'exemple.D'autres
variantesELISAd'uneefficacitééprouvéepeuventêtreutiliséesàlaplace.
Tableau1A
Obtentiondel'agrement
NombreannuelNombredepoissons Nombredepoissons
d'inspections dontlesorganes dontleliquide
cliniques sontexaminés ovarienestexaminé
Zonescontinentales
a)Exploitationscomptantdesgéni-2120(lresérie) 30(lresérie)
teurs 150(2esérie) 0
b)Exploitationsnecomptantque20 150(1reou2esérie)
desgéniteurs
c)Exploitationsnecomptantpasde2150(1'*et2eséries)0
géniteurs
Zonescôtières
a)Exploitationsnecomptantpasde230(1Ket2eséries)0
géniteurs
b)Exploitationscomptantdesgéni-2120(lresérie) 30(lresérie)
teurs 150(2esérie) 0
Nombremaximaldepoissonsparbassin:5

21.11.92 JournalofficieldesCommunautés européennes N0L337/23
Tableau1B
Maintiendustatut
Nombre Nombredepoissons Nombredepoissons
d'inspections soumisàunexamen soumisàunexamen
cliniquesparandesorganes duliquideovarien
Zonescontinentales
î)Exploitationscomptantdesgéni-215(lreou2esérie)15(lreou2esérie)
teurs
b)Exploitationsnecomptantque20 30(lreou2esérie)
desgéniteurs
c)Exploitationsnecomptantpasde230(lreou2esérie)0
géniteurs
Zonescôtières
i)Exploitationsnecomptantpasde 130(')(lreou2esérie)0
géniteurs
b)Exploitationscomptantdesgéni-20 30(1reou2esérie)
teurs
Nombremaximaldepoissonspargroupe:10
(')Leséchantillonsdoiventêtrecollectésaucoursdesmois2à6aprèsletransfertdes)poissonsde1eaudoucevers1eau
salée.
DEUXIÈMEPARTIE
PROCÉDURES DEDIAGNOSTIC PERMETTANT DECONFIRMER LANHIETLASHVEN
CASDESUSPICION
LediagnosticdelaNHIetdelaSHVpeutêtreréaliséparl'unedestechniquessuivantes:
—A.Isolationconventionnelle duvirussuivied'uneidentificationsérologiqueduvirus,
—B.Isolationduvirusavecidentificationsérologiquesimultanéeduvirus,
—C.Techniquesdediagnosticrapide(IFAT,ELISA).
LepremierdiagnosticdelaNHIetdelaSHVdanslesexploitationssituéesdansleszonesagrééesnedoit
pasêtrebasésurlaméthodeCseule.SoitlaméthodeA,soitlaméthodeBdoitégalementêtreappliquée.
Letissudestinéàl'examenvirologiquepeutdanscertainscasêtreaccompagnédematérielsupplémentaire
envued'unexamenbactériologique ,parasitologique ,histologiqueouautreafindepermettreundiagnostic
différentiel.Cematérieldevraitêtrecollectéconformément auxprocéduresdéfiniesparl'OIE.
A.Isolationconventionnelle duvirussuivied'uneidentification sérologiqueduvirus
A.I.I.Sélectiondeséchantillons
Ilyalieudesélectionnerauxfinsd'examenaumoins10poissonsprésentantdessignestypiques
deNHIoudeSHV.
A.I.2.Préparationetenvoideséchantillonsdepoissons
Avantd'êtreenvoyésoutransférésverslelaboratoire,lesmorceauxd'organesàexaminersont
prélevéssurlepoissonàl'aidedeciseauxoud'autresinstrumentsstérilesetplacésdanslestubes
enplastiquecontenantlemilieudetransport,c'est-à-diredumilieudeculturecellulaireconte­
nant10%desérumdeveauetd'antibiotiques .Lacombinaisonde200UIdepénicilline,200ja.g
destreptomycineet200(Xgdekanamycineparmlpeutêtrerecommandée ,maisd'autresantibio­
tiquesàl'efficacitééprouvéepeuventégalementêtreutilisés.Lestissusàexaminersontlarate,le
reinantérieuretl'encéphale.
Desmorceauxd'organesde5à10poissonspeuventêtreréunisdansuntube,représentantun
échantillonglobal.Lestissusdechaqueéchantillondevraientpeseraumoins1g,demanièreque
ladilutionfinalesoitd'environ1/10.
Lestubessontplacésdansdesrécipientsisolés(parexemple,desboîtesenpolystyrèneàparois
épaisses)avecunequantitésuffisantedeglaceoude«blocscongelés»pourgarantirunetempéra­
turedeséchantillonscompriseentre0et5°Cpendantletransportverslelaboratoire.Éviterle
geldeséchantillons .
L'examenvirologiquedoitcommencerdèsquepossible,auplustard48heuresaprèslacollecte
deséchantillons .Silespoissonsàexaminermesurentmoinsde6cmdelongueur,ilspeuventêtre
envoyésentiersverslelaboratoiredansdessachetsenplastiqueréfrigéréscommeindiquéci-des­
sus.

N°L337/24 JournalofficieldesCommunautés européennes 21.11.92
A.I.3.Collectedematérieldiagnosticsupplémentaire
Conformément àl'accordconcluaveclelaboratoiredediagnosticencause,d'autrestissusdepois­
sonspeuventêtrecollectéségalementetpréparésenvued'examenssupplémentaires .
A.II.1.Homogénéisation desorganes
Aulaboratoire,lestissuscontenusdanslestubesdoiventêtrecomplètement homogénéisés
(broyeurstomacher,mixeurouensemblepilon-mortier )etplacésensuiteensuspensiondansle
milieudetransportoriginal.Siunéchantillonestconstituédepoissonsentiers,c'est-à-direde
poissonsdemoinsde6cm,ceux-cisontréduitsenfinesparticulesàl'aidedeciseauxstériles
aprèséliminationdelapartieducorpssesituantàl'arrièredel'ouvertureventrale,homogénisés
conformément àlaméthodedécriteci-dessusetmisensuspensiondanslemilieudetransport
selonlaproportionde1/10.
A.II.2.Centrifugation del'homogénat
L'homogénatestcentrifugédansunecentrifugeuseréfrigéréeà2-5°Cà2000-4000xgpendant
15minutesetleliquidesurnageantestcollectéàdesfinsd'examen.
Sil'envoidel'échantillons'estfaitdansunmilieudetransport(c'est-à-diresousantibiotiques),le
liquidesurnageantnedoitplusêtretraitéauxantibiotiques .
Sil'échantillonaétéenvoyésousformedepoissonsentiers,l'homogénatobtenuaprèscentrifuga­
tiondoitêtretraitéauxantibiotiquesdanslemilieudetransportutilisépoursaremiseensuspen­
sion,soitpendant4heuresàlatempératureambiante,soitpendantunenuità4°C.
Letraitementauxantibiotiquesviseàmaîtriserlacontamination bactériennedeséchantillonset
rendsuperfluetoutefiltrationàtraversdesfiltresàmembranes.
Immédiatement aprèslacentrifugation ,mélangerunvolumedeliquidesurnageantavecdesparts
égalesd'unantisérumdivalentcontrelevirusNPI(souchesderéférenceSpetAb)diluédefaçon
appropriéeetincuberainsipendantauminimum 1heureà15°Couaumaximumpendant18
heuresà4°C.Letitredefantisérumdoitêtred'aumoins1/2000dansuntestdeneutralisation
surplaqueà50%.
Letraitementdetouslesinoculaàl'antisérumcontrelevirusNPI(virusqui,danscertaines
régionsd'Europe,estprésentdans50%deséchantillonsdepoissons)viseàempêcherledévelop­
pement,dansdesculturescellulairesinoculées,deECPrésultantduvirusNPI.Celaréduirala
duréedesexamensvirologiquesainsiquelenombredescasdanslesquelsl'apparitiondeECP
devraitêtreconsidéréecommeuneindicationpotentielledeSHVoudeNHI.
Lorsquedeséchantillonsproviennentd'unitésdeproductionconsidéréescommeindemnesde
NPI,letraitementdesinoculaàl'antisérumcontrelevirusNPIpeutêtreomis.
A.III.1.Culturescellulairesetmilieux
DescellulesBF-2et,soitEPC,soitFHMsontcultivéesàdestempératuresde20à250Cdansun
milieuEagle'sMEM(oudesversionsmodifiées),additionnéesde10%desérumdefœtusde
bovinsetd'antibiotiques àdesconcentrations standard.
Lorsquelescellulessontcultivéesdansdesfiolesfermées,tamponnerlemilieuàl'aidedebicar­
bonate.Lemilieuutilisépourlaculturedecellulesenunitésouvertesdoitêtretamponnéàl'aide
deTris-HCl(23mM)etdebicarbonatedesoude(6mM)àunpHaussiprochequepossiblede
7,6,valeuroptimalepourlamultiplication virale.
Lesculturesdecellulesàutiliserpourl'inoculationavecdumatérieltissulairedevraientêtre
jeunes(de4à48heures)etenphasedecroissanceactive(nonconfluentes)aumomentdel'inocu­
lation.
A.III.2.Inoculation desculturescellulaires
Inoculerunesuspensiond'organestraitéeauxantibiotiquesdansdesculturescellulairesendeux
dilutions:lapremièreet,enoutre,unedilutiondecelle-cià1/100(demanièreàprévenirtoute
interférenceparhomologie).Deuxlignesdecellulesaumoinsdoiventêtreinoculées(çf.AAW.l).
Lerapportentrelatailledel'inoculumetlevolumedumilieudeculturecellulairedevraitêtre
d'environ1/10.
Pourchaquedilutionetchaquelignedecellules,ilyalieud'utiliserunminimumd'environ2
cm2decellules,cequicorrespondàunecupuledansunplateaudeculturecellulaireà24cupules.
L'utilisationdeplateauxdeculturecellulaireestrecommandée ,maisd'autressupportsprésentant
unesurfacedecroissancesimilaireousupérieurepeuventégalementconvenir.

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A.III.3.Incubationdesculturescellulaires
Incuberlesculturescellulairesinoculéesà15°Cpendantseptjours.Silacouleurdumilieude
culturecellulaireviredurougeaujaune,indiquantuneacidificationdumilieu,ajusterlepHà
l'aided'unesolutionstériledebicarbonateouàl'aidedesubstanceséquivalentes,pourgarantirla
sensibilitédelacelluleàl'infectionvirale.
EffectuertouslessixmoisletitragedesstockscongelésdevirusSHVetNHIafindevérifierla
sensibilitédesculturescellulairesàl'infection.
A.III.4.Microscopie
InspecterchaquejourlesculturescellulairesinoculeesafindedécelerlaformationdeECPàun
grossissementd'environ40fois.Sionobservenettementl'apparitiondeECP,engagerimmédiate­
mentlesprocéduresd'identificationduvirusconformément àlasectionA.IV.
Enmêmetemps,prendrelesmesuresappropriéespoursuspendrel'agrémentdel'unitéde
productiond'oùprovientl'échantillonpositifdesvirusetdetouteunitédeproductionsituéeen
aval.
Maintenirlasuspensiondel'agrémentjusqu'àcequelestestsdelaboratoireaientconfirméquele
virusencausen'estpaslevirusdeSHVoudeNHI.Ledélaiautorisépourl'identificationduvirus
estdequatresemainesaumaximum,ycomprisletempsnécessairepourprocéderàl'analysedans
leslaboratoires deréférence.
A.III.5.Sous-culture
SilnesestpasdéveloppédeECPaprèsuneincubationdeseptjours,procéderàunesous-culture
portantsurdesculturescellulairesfraîchesenutilisantunesuperficiecellulairesimilaireàcellede
lacultureprimaire.
Despartiesaliquotesdumilieuprovenantdetouteslescultures/cupulesconstituantlaculture
primairesontgroupéesselonlasouchecellulaireàlasuited'uncycledecongélationetdedécon­
gélationdescultureset0,5mldumilieuestmélangéàdespartségalesd'antisérumcontrelaNPI,
commedécritàlasectionA.II.2etlemélangeestincubéà15°Cpendant60minutes.Le
mélangeestensuiteinoculédansdesculturescellulairesàdesdilutionsde1/1etde1/100confor­
mémentàlasectionA.III.2.L'inoculationpeutêtreprécédéed'unepré-incubation detoutesles
dilutions ,avecdel'antisérumdivalentcontrelevirusNPIàunedilutionappropriée.
Incuberensuitelesculturesinoculéespendantseptjoursà15°Ccomptetenudesdispositionsde
lasectionA.III.4.
A.IV.1.Neutralisation
Si,dansuneculturecellulaire,laformationdeECPaétéconstatée,lemilieuestcollecté,les
cellulessontéliminéesparcentrifugation àfaiblevitesseouparfiltrationsurfiltreàmembrane
(0,45|Xm)puislemilieuestdiluéà1/100et1/10000dansunmilieudeculturecellulaire.
Mélangerdespartiesaliquotesdesdilutionsetlesincuberséparémentpendant60minutesà
15°Cavecdespartieségalesdesréactifssuivants:
—anticorpsspécifiquecontrelevirusdelaSHV(virusd'Egtved) 1/50*
—anticorpsspécifiquecontrelesinfectionsduvirusdelanécrosehématopoïétique
infectieuse(NHI) 1/50*
—antisérumdivalentcontrelevirusdelanécrosepancréatiqueinfectieuse(NPI)
(souchesderéférenceSpetAb) 1/50*
—milieudeculture 1/1
*oucommepréciséparlelaboratoirederéférenceencequiconcernel'éventuellecytotoxicité
desantisérums .
Lesréactifsutilisésdoiventêtredequalitéderéférenceencequiconcerneletitreetlaspécificité.
Inoculeraumoinsdeuxculturescellulairesavec50|J,1chacunedemélangedevirusetdesérumet
incuberà15°C.Contrôlerledéveloppement deECPconformément àlasectionA.III.4.
Siletestn'apaspermisd'identifieraveccertitudelevirusenl'espaced'unesemaine,procéderà
unedesopérationssuivantes:
a)transférerlevirusversunlaboratoirederéférencenationalespécialisédanslesvirusdespois­
sonsàdesfinsd'identificationimmédiate;
b)appliquerlestechniquesIFAT(sectionA.IV.2),ELISA(sectionA.IV.3)oud'autrestechniques
d'identificationdesvirusàl'aidederéactifsdequalitéde.référence.

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A.IV.2.Immunofluorescence (IFAT)
Pourchaqueisolâtdevirusàidentifier,ensemenceraumoinshuitcouvre-objetsoul'équivalentà
l'aidedecellulesECPàunedensitéengendrantuneconfluenced'environ60à90%après24
heuresdeculture.ChoisirlescellulesECPàcettefinàcausedeleurforteadhérenceauxsurfaces
deverre.
Lorsquelescellulessontdéposéessurlasurfaceduverre(environ1heureaprèsl'ensemencement )
oulorsquelesculturesontétéincubéespendant24heuresaumaximum,inoculerlevirusàiden­
tifier.Inoculerquatreculturessuivantlerapportdevolumeàvolumede1/10etquatrecultures
suivantlerapportde1/100.
Entre20et30heuresaprèsl'inoculation,rincerlesculturesdeuxfoisàl'aideduproduitEagle's
MEMsanssérum,fixeràl'acétoneetteinterparIFATàdeuxcouches.Lapremièrecouchede
réactifconsisteenunantisérumagréé(commedanslasectionIV.1).Lasecondecouchederéactif
estunantisérumconjuguéavecFITCcontrel'immunoglobuline utiliséedanslapremièrecouche.
Pourchacundesantisérumstestés,teinteraumoinsunecultureinoculéeàdoseélevéeetune
cultureinoculéeàfaibledose.Incluredansletestdestémoinsnégatifsetpositifsappropriés .
Monterlesculturesteintéesenutilisantunesolutionglycérol-eausalée.Examinerauxrayons
ultravioletsincidents.Utiliserdesoculaires10xou12xetdeslentillesd'objectifx25ou
x40ayantdesouverturesnumériquessupérieuresà0,7età1,3respectivement .Lesdilutionsde
l'antisérumprimaireetdel'immunoglobuline conjuguéeauFITCdépendrontdusystèmede
microscopiechoisioudisponible .
CertainessouchesduvirusEgtvedréagissentfortementavecl'antisérumcontrelasouchederéfé­
renceF1àl'IFAT,bienqueneréagissantpasdansdestestsdeneutralisation .
A.IV.3.TestELISA
Recouvrirlescupulesdesplaquesmicrotitres(parexempleimmunoplaques Nunc,Maxisorp,
Nunc,Danemark)pendantunenuitaveclesdilutionsrecommandées defractionsd'immunoglo­
bulinepurifiéeàlaprotéineAdesantisérumsmentionnésàlasectionA.IV.1.
Aprèsrinçagedescupulesàl'aided'untamponPBS-Tween-20 ,introduirelevirusàidentifier
danslescupulesendeuxouquatredilutionsetlaisseropérerlaréactionavecl'anticorpsde
couverturependant60minutesà37°C.Aprèsrinçageàl'aidedutamponPBS-Tween-20 ,ajouter
lesanticorpstraitésaubiotinyle,d'unespécificitécorrespondant àcelledesanticorpsdecouver­
tureetlaisseragirpendant60minutesà20°C.Aprèsunnouveaurinçagecommeci-dessus,
ajouterdelastreptavidineconjuguéeavecHRPetlaisserréagirpendant1heureà20°C.Aprèsun
dernierrinçage,l'enzymeliéeestvisualiséeàl'aidedesubstratsELISAappropriés(OPD,TMBou
autres).
LavarianteELISAci-dessus,baséesurl'emploidebiotineetd'avidine,estdonnéeàtitre
d'exemple.D'autresvariantesELISA,d'uneefficacitééprouvée,peuventêtreutiliséesàlaplace.
B.Isolationduvirusavecidentification sérologiquesimultanéeduvirus
B.I.1.Sélectiondeséchantillons
VoirA.1.1.
B.I.2.Préparationetexpéditiondeséchantillonsdepoisson
VoirA.I.2.
B.II.1.Homogénéisation desorganes
VoirA.II.1.
B.II.2.Centrifugation del'homogénat
VoirA.II.2.
B.II.3.Traitementduliquidesurnageantàl'aidedesantisérumsdediagnostic
Lasuspensioncomportantl'organetraitécontrelaNPIetl'antibiotiqueestdiluéà1/10età
1/10000dansunmilieudeculturecellulaireetdespartiesaliquotessontmélangéesetincubées
pendant60minutesà15°CavecdespartieségalesdesréactifsénumérésàlasectionA.IV.1.
B.III.1.Culturescellulairesetmilieux
VoirA.III.1.

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B.III.2.Inoculation desculturescellulaires
Àpartirdechaquemélangevirus-sérum(préparéconformément àB.II.3.),inoculeraumoinsdeux
culturescellulairesparlignedecellulesavec50jilchacune.
B.III.3.Incubationdesculturescellulaires
VoirA.III.3.
B.III.4.Microscopie
Inspecterquotidiennement lesculturesdecellulesinoculéesafindedécelerlaformationdeECP
àungrossissementd'environ40fois.SilaformationdeECPestempêchéeparundesantisérums
utilisés,leviruspeutêtreconsidérécommeayantétéidentifiéenconséquence .
SilaformationdeECPn'estpasempêchéeparcesantisérums,ilyalieudemettreenœuvreles
procéduresd'identificationduvirusconformément àA.IV.
B.III.5.Sous-culture
SionneconstatepasdeformationdeECPaprèsseptjours,unesous-culturedoitêtremiseen
œuvreàpartirdesculturesinoculéesavecleliquidesurnageantpluslemilieu(B.II.3).
C.Techniquesdediagnosticrapide(IFAT,ELISA)
LeliquidesurnageantpréparécommeindiquésousA.II.2estsoumisàIFATouàELISAconformément à
A.IV.2ouA.IV.3respectivement .Cestechniquesrapidesdoiventêtrecomplétéesavecunexamenvirologique
conformément àAouBmoinsde48heuresaprèsl'échantillonage si:
a)unrésultatnégatifaétéobtenu
ou.
b)unrésultatpositifaétéobtenuavecdeséchantillonsreprésentantlepremiercasdeNHIouSHVdans
unezoneagréée.