DÉCISION DE LA COMMISSION du 29 juillet 1991 concernant les conditions sanitaires et la certification vétérinaire applicable à l'importation de sperme surgelé de bovins en provenance des États-Unis d'Amérique (91/479/CEE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu la directive 88/407/CEE du Conseil, du 14 juin 1988, fixant les exigences de police sanitaire applicables aux échanges intracommunautaires et aux importations de sperme surgelé d'animaux de l'espèce bovine (1), modifiée en dernier lieu par la directive 90/425/CEE (2), et notamment ses articles 10 et 11,

considérant que les États-Unis d'Amérique figurent à la liste, établie par la décision 90/14/CEE de la Commission (3), des pays tiers en provenance desquels les États membres autorisent l'importation du sperme d'animaux domestiques de l'espèce bovine;

considérant qu'il apparaît que la situation sanitaire des États-Unis d'Amérique est bonne et contrôlée par des services vétérinaires bien structurés et organisés en ce qui concerne les maladies transmissibles par le sperme;

considérant que les autorités vétérinaires compétentes des États-Unis d'Amérique ont confirmé que leur pays était indemne depuis au moins douze mois de peste bovine, de fièvre aphteuse et de péripneumonie contagieuse bovine et qu'aucune vaccination contre ces maladies n'a été effectuée pendant cette période;

considérant que lesdites autorités se sont engagées à notifier à la Commission et aux États membres, par télex ou télécopie et dans un délai de vingt-quatre heures, la confirmation de la déclaration de l'une des maladies précitées ou de la fièvre catarrhale ou de la maladie hémorragique épizootique, ou toute modification de la politique de vaccination concernant l'une de ces maladies ou, dans un délai approprié, toute proposition de modification des règles d'importation appliquées par les États-Unis d'Amérique aux animaux domestiques ou au sperme ou embryons de ces animaux;

considérant que lesdites autorités ont donné les garanties sanitaires en ce qui concerne la tuberculose bovine et la brucellose qui sont équivalentes à celles qui s'appliquent dans la Communauté;

considérant que lesdites autorités se sont engagées à contrôler officiellement la délivrance des certificats en application de la présente décision et à veiller à ce que tous les certificats, dérogations et constatations de laboratoires pertinents sur lesquels peut avoit été fondée la certification soient conservés dans un dossier officiel pendant au moins douze mois après l'expédition du sperme auquel il se réfère;

considérant que lesdites autorités se sont engagées à agréer officiellement les centres de collecte du sperme pour l'exportation de sperme de bovins vers la Communauté économique européenne conformément à l'article 9 de la directive 88/407/CEE;

considérant que lesdites autorités se sont engagées à déterminer et à communiquer immédiatement à la Commission des Communautés européennes la date à laquelle, pour chaque centre de collecte de sperme agréé, cesse toute activité des espèces de culicoúdes susceptibles de transmettre la fièvre catarrhale ou la maladie hémorragique épizootique et la date à laquelle l'activité de ces espèces de culicoúdes reprend;

considérant que les conditions sanitaires et la certification vétérinaire doivent être adaptées au statut sanitaire du pays tiers en cause;

considérant que les mesures prévues par la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:

Article premier

1. Jusqu'au 31 décembre 1992, les États membres peuvent autoriser l'importation en provenance des États-Unis d'Amérique de sperme bovin collecté auprès des taureaux qui ont donné un résultat autre que négatif à l'épreuve pour le dépistage de la fièvre catarrhale ou l'épreuve pour le dépistage de la maladie hémorragique épizootique prescrit à l'annexe I A, mais ils doivent le faire selon les dispositions des annexes II A et II B et ils doivent s'assurer que ledit sperme n'entre pas dans les échanges intracommunautaires. La Commission réexaminera les dispositions de ce paragraphe avant la date indiquée ci-dessus.

2. Les États membres autorisent l'importation en provenance des États-Unis d'Amérique de sperme bovin remplissant les conditions fixées dans le certificat figurant à l'annexe I A et, le cas échéant, dans le certificat figurant à l'annexe I B.

Article 2

Les États membres sont destinataires de la présente décision.

Fait à Bruxelles, le 29 juillet 1991.

Par la Commission Ray MAC SHARRY Membre de la Commission

(1) JO n° L 194 du 22. 7. 1988, p. 10.

(2) JO n° L 224 du 18. 8. 1990, p. 29.

(3) JO n° L 8 du 11. 1. 1990, p. 71.

ANNEXE I A

CERTIFICAT SANITAIRE relatif à l'importation de sperme de bovins en provenance des États-Unis d'Amérique

Certificat n°: .

Pays de collecte: États-Unis d'Amérique Autorité compétente: Département américain de l'agriculture - APHIS

I. Identification du sperme

>TABLE>

II. Origine du sperme

>TABLE>

III. Destination du sperme

>TABLE>

IV. Renseignements sanitaires

Je soussigné, vétérinaire officiel, certifie que:

1. Les États-Unis d'Amérique ont été indemnes de peste bovine pendant une période commençant au moins douze mois avant la première collecte de sperme décrit ci-dessus et finissant trente jours après la dernière collecte;

2. Le centre agréé de collecte de sperme dans lequel a été collecté le sperme décrit ci-dessus:

a) a été agréé, comme répondant à toutes les exigences du présent paragraphe, par l'autorité vétérinaire fédérale des États-Unis d'Amérique pour l'exportation de sperme vers la Communauté européenne;

b) est situé au centre d'un cercle de 50 km de rayon dans lequel, pendant la période commençant au moins trois mois avant la première collecte de sperme décrit ci-dessus et finissant trente jours après la dernière collecte, il n'y a eu aucun cas de fièvre aphteuse, de pleuropneumonie contagieuse bovine ou de stomatite vésiculeuse;

c) a été indemne, pendant une période commençant au moins trois mois avant la première collecte de sperme décrit ci-dessus et finissant trente jours après la dernière collecte, de fièvre aphteuse et de brucellose;

d) a été indemne, pendant une période commençant au moins trente jours avant la première collecte de sperme décrit ci-dessus et finissant trente jours après la dernière collecte de rage, de fièvre charbonneuse, de tuberculose, de leucose bovine enzootique ou de tout signe d'infection par Trichomonas foetus, Campylobacter foetus, Leptospira canicola, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo ou Leptospira icterohaemorrhagica;

e) est inspecté par un vétérinaire fédéral au moins deux fois par an et que, lors de ces inspections, tous les problèmes relatifs aux dispositions indiquées dans le présent certificat sont analysés et vérifiés;

f) se trouve sous la surveillance permanente d'un vétérinaire du centre de telle sorte que:

i) les animaux ne sont admis qu'avec l'autorisation expresse du vétérinaire du centre, tous les mouvements d'entrée ou de sortie d'animaux étant enregistrés;

ii) la race, la date de naissance, l'identification et l'évolution de l'état sanitaire de chaque bovin présent dans le centre de toutes les épreuves diagnostiques et leurs résultats et tous les soins et les vaccinations effectués sur les animaux présents sont enregistrés;

iii) l'accès de personnes non autorisées est interdit et que les visiteurs autorisés sont obligés de se conformer aux dispositions fixées par le vétérinaire du centre;

iv) seul du personnel techniquement compétent, convenablement formé aux techniques de désinfection et aux techniques d'hygiène relatives à la lutte contre la propagation de la maladie est employé;

g) contient exclusivement des animaux de l'espèce bovine, à cette réserve près que d'autres animaux domestiques strictement nécessaires au fonctionnement normal du centre peuvent être admis pour autant qu'ils ne présentent aucun risque d'infection pour l'espèce bovine et qu'ils remplissent les conditions fixées par le vétérinaire du centre;

h) est construit de telle manière:

i) que les locaux de stabulation des animaux sont matériellement séparés des locaux de préparation et de stockage du sperme, locaux eux-mêmes matériellement séparés;

ii) qu'il dispose d'un local d'isolement pour les animaux malades;

iii) qu'il dispose d'une station de collecte de sperme dotée d'un local séparé pour le nettoyage et la désinfection ou la stérilisation de l'équipement;

iv) qu'il dispose d'un local de préparation et d'un local de stockage du sperme (qui ne sont pas nécessairement situés au même endroit);

v) que le contact avec du bétail extérieur est rendu impossible;

vi) que tout le centre peut être immédiatement nettoyé et désinfecté;

pourvu que, si les conditions ci-dessus sont remplies, un centre agréé de collecte de sperme puisse partager un site avec un ou plusieurs autres centres de collecte de sperme.

3. Les taureaux se trouvant dans le centre agréé de collecte de sperme pendant la période de collecte et de stockage du sperme décrit ci-dessus:

a) se trouvaient dans le centre agréé de collecte de sperme, et ce de façon permanente depuis le 1er janvier 1990 et ont, depuis leur arrivée, été soumis à toutes les épreuves décrites, avec les résultats indiqués, au point d) ci-dessous ou b) ont été transférés d'un centre agréé de collecte de sperme sans entrer en contact avec des animaux d'un statut sanitaire inférieur et, le cas échéant, à l'aide d'un moyen de transport soigneusement nettoyé et désinfecté avant utilisation ou c) ont été admis sous l'autorité du vétérinaire du centre et ne présentaient aucun signe clinique de maladie:

i) étant originaires de troupeaux reconnus indemnes de tuberculose par l'autorité vétérinaire fédérale ou qui se trouvaient dans des zones reconnues indemnes de tuberculose, définies par l'autorité vétérinaire fédérale, et n'ayant jamais été élevés dans des troupeaux de statut inférieur;

ii) étant originaires de troupeaux qui étaient certifiés indemnes de brucellose par l'autorité vétérinaire fédérale ou qui étaient situés dans des zones totalement indemnes de brucellose ou dans des zones de classe A, définies par l'autorité vétérinaire fédérale, et n'ayant jamais été élevés dans des troupeaux de statut inférieur;

iii) - étant originaires de troupeaux n'ayant présenté, pendant au moins trois ans, aucun signe de leucose bovine enzootique ou - ayant été engendrés par des vaches qui ont été soumises, dans les trente jours précédant l'entrée de leur descendance mâle dans la station d'isolement, à une épreuve sérologique de dépistage de la leucose bovine enzootique donnant un résultat négatif, conformément à la procédure établie à l'annexe G de la directive du Conseil 64/432/CEE ou - ayant été soumis, dans les trente jours précédant l'entrée dans la station d'isolement officiellement agréée, si l'animal était alors âgé de deux ans ou après avoir atteint l'âge de deux ans, à une épreuve sérologique de dépistage de la leucose bovine enzootique donnant un résultat négatif conformément à la procédure établie à l'annexe G de la directive 64/432/CEE du Conseil;

iv) ayant été soumis dans les trente jours précédant l'entrée dans la station d'isolement agréée, aux épreuves suivantes ayant toutes donné un résultat négatif:

- une épreuve à la tuberculine dans le pli caudal prévue par le Département américain de l'agriculture (USDA),

- une épreuve à éprouvette type de dépistage de la brucellose prescrite par l'USDA, donnant un résultat négatif à un titre inférieur à 30 Ul d'agglutination par ml et une épreuve de fixation du complément indiquant un titre brucellique inférieur à 20 unités CEE par ml (20 unités EFC),

- une épreuve sérologique de dépistage de la leucose bovine enzootique effectuée conformément à la procédure fixée à l'annexe G de la directive 64/432/CEE,

- une épreuve de séroneutralisation ou une épreuve Elisa de dépistage de la rhinotrachéite bovine infectieuse/vulvovaginite pustuleuse infectieuse,

- une épreuve d'isolation du virus pour le dépistage de la diarrhée virale des bovins à l'aide d'échantillons de sang dans des cultures cellulaires sensibles, soumises ensuite à une épreuve à l'anticorps fluorescent ou à une épreuve d'immunoperoxydase à condition que si, au moment de son entrée, le taureau était âgé de moins de six mois, l'épreuve ait été retardée jusqu'à ce que l'animal ait atteint cet âge,

et aux épreuves suivantes avec un résultat négatif dans chaque cas sauf si le présent certificat s'applique au sperme collecté et consigné avant le 1er janvier 1993 et dans le cas où l'État membre importateur a indiqué par écrit que les termes du paragraphe 1 de l'article 1er de la décision 91/479/CEE de la Commission sont appliqués:

- une épreuve ELISA bloquante pour le dépistage de la fièvre catarrhale à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique de groupe conformément à la procédure fixée à l'annexe IV A de la décision 91/479/CEE de la Commission,

- une épreuve d'immunodiffusion sur gel d'agar pour le dépistage de tous les sérotypes de la maladie hémorragique épizootique découverts aux États-Unis d'Amérique, conformément à la procédure fixée à l'annexe IV B de la décision 91/479/CEE de la Commission,

étant admis que toutes ou une quelconque des épreuves ci-avant peut avoir été effectuée pendant que les animaux étaient dans une station d'isolement officiellement agréée à condition que, si le résultat d'une quelconque épreuve, pour laquelle le présent certificat exige un résultat négatif, n'était pas négatif, la période d'isolement de trente jours pour les autres taureaux se trouvant dans la station d'isolement fût considérée comme n'ayant pas commencé avant le retrait de l'animal en cause de la station et, le cas échéant, que le statut à l'égard de la tuberculose ou de la brucellose ait été rétabli;

v) ayant, après l'achèvement des épreuves de pré-isolement indiquées au point iv) ci-dessus, passé une période de trente jours au moins dans une station d'isolement officiellement agréée qui, à la date de leur arrivée, se trouvait au centre d'un cercle de 10 km de rayon, dans lequel ne s'était produit aucun cas de fièvre aphteuse, de peste bovine, de péripneumonie contagieuse bovine ou de stomatite vésiculeuse et était indemne, pendant trois mois au moins, de fièvre aphteuse et de brucellose et pendant trente jours au moins de rage, de fièvre charbonneuse, de tuberculose et de leucose bovine enzootique et où ils ont été soumis aux épreuves suivantes, chacune donnant un résultat négatif:

- une épreuve à éprouvette type de dépistage de la brucellose prescrite par l'USDA, ayant donné un résultat négatif à un titre inférieur à 30 Ul d'agglutination par ml et une épreuve de fixation du complément indiquant un titre brucellique inférieur à 20 unités CEE par ml (20 unités EFC),

- une épreuve à l'anticorps immunofluorescent ou une épreuve de culture pour le dépistage de Campylobacter foetus sur un échantillon de matériel du prépuce ou de lavage de vagin artificiel,

- un examen microscopique et un essai de culture pour le dépistage de l'infection du foetus par Trichomonas sur un échantillon de matériel de prépuce ou de lavage de vagin artificiel,

- une épreuve de séroneutralisation ou une épreuve Elisa pour le dépistage de la rhinotrachéite bovine infectieuse/vulvovaginite pustuleuse infectieuse,

pourvu que, si le résultat d'une quelconque épreuve n'était pas négatif, la période d'isolement de trente jours pour les animaux restants ne fût considérée comme ayant commencé qu'après le retrait de l'animal en cause de la station, et le cas échéant, après que le statut de la station à l'égard de la brucellose ait été rétabli,

et ont été traités contre la leptospirose par l'injection à deux reprises à intervalle de quatorze jours, de streptomycine ou de dihydrostreptomycine, ou un mélange de ces deux produits, à raison de 25 mg par kg de poids corporel;

d) ont été soumis au moins une fois par an aux épreuves suivantes ayant toutes donné un résultat négatif:

i)une épreuve à la tuberculine dans le pli caudal, prescrite par l'USDA;

ii) une épreuve à éprouvette type de dépistage de la brucellose, prescrite par l'USDA, négative à moins de 30 Ul d'agglutination par ml et une épreuve de fixation du complément indiquant un titre brucellique inférieur à 20 unités CEE par ml (20 unités EFC);

iii) une épreuve sérologique de dépistage de la leucose bovine enzootique, effectuée conformément à la procédure fixée à l'annexe G de la directive 64/432/CEE;

iv) une épreuve de séroneutralisation ou épreuve Elisa pour le dépistage de la rhinotrachéite bovine infectieuse vulvovaginite pustuleuse infectieuse, à condition que, pour le sperme collecté ayant le 31 décembre 1992 et si l'autorité compétente de l'État membre importateur l'a prescrit par écrit, le sperme de taureaux positifs à une quelconque de ces épreuves puisse être accepté si une isolation du virus ou une épreuve d'inoculation à un animal concernant le complexe de maladies ci-dessus a été effectuée sur du sperme et a donné un résultat négatif, dans ce dernier cas, le test ayant été effectué le ....... ou au laboratoire de .......;

v) une épreuve à l'anticorps immunofluorescent ou une épreuve de culture pour le dépistage de Campylobacter foetus sur un échantillon de matériel de prépuce ou de lavage de vagin artificiel, mais aucune épreuve à ce titre n'est demandée dans le cas d'animaux non utilisés pour la production de sperme pourvu qu'une telle épreuve soit effectuée avant la reprise de production de sperme;

vi) une épreuve sérologique de dépistage des sérotypes canicola, pomona, grippothyphosa, hardjo et icterohaemorrhagica de leptospires,

et au moins deux fois par an aux épreuves suivantes avec un résultat négatif en chaque cas sauf si le présent certificat s'applique au sperme collecté et consigné avant le 1er janvier 1993 et si l'État membre importateur a indiqué par écrit que les termes du paragraphe 1 de l'article 1er de la décision 91/479/CEE de la Commission sont respectés:

i) une épreuve Elisa bloquante pour le dépistage de la fièvre catarrhale à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique de groupe conformément à la procédure fixée à l'annexe IV A de la décision 91/479/CEE de la Commission;

ii) une épreuve d'immunodiffusion sur gel d'agar pour le dépistage de tous les sérotypes de la maladie hémorragique épizootique découverts aux États-Unis d'Amérique conformément à la procédure fixée à l'annexe IV B de la décision 91/479/CEE de la Commission.

Toutes les épreuves ci-dessus (à l'exception de l'épreuve à la tuberculine) étant effectuées dans un laboratoire agréé à cet effet par les autorités vétérinaires fédérales des États-Unis d'Amérique.

4. Le sperme décrit ci-dessus:

- est classé indemne de la fièvre catarrhale conformément à la définition contenue à l'annexe II A de la décision 91/479/CEE de la Commission, et notamment son paragraphe 5 (*),

ou - est classé testé pour la fièvre catarrhale conformément à la définition contenue à l'annexe II B de la décision 91/479/CEE de la Commission, et notamment son paragraphe 2, et est le sujet d'une indication écrite par l'autorité vétérinaire de l'État membre importateur que les termes du paragraphe 1 de l'article 1er de la décision 91/479/CEE de la Commission sont respectés (*).

(*) Biffer la mention inutile.

et a été:

a) collecté sans recours à des techniques d'électro-éjaculation ou d'électrostimulation, sur des taureaux d'un centre de collecte de sperme agréé:

i) qui se sont trouvés en permanence sur le territoire des États-Unis d'Amérique pendant une période commençant au moins six mois avant la première collecte de ce sperme et finissant à la date de son expédition;

ii) qui, autrement que comme prévu dans une dérogation écrite conformément au point 3 paragraphe d) iv) ci-dessus ou à l'article 1er paragraphe 1 de la décision 91/479/CEE de la Commission, n'ont donné de résultat positif à aucune des épreuves mentionnées dans le présent certificat;

iii) qui n'ont pas été utilisés pour la monte naturelle pendant leur séjour dans un centre agréé de collecte de sperme;

iv) qui ont été élevés en permanence dans un centre agréé de collecte de sperme pendant une période d'au moins trente jours précédant immédiatement la collecte du sperme;

v) qui n'ont montré aucun signe clinique de maladie à cette époque;

b) préparé dans un centre agréé de collecte du sperme:

i) dans lequel, pendant la collecte du sperme décrite ci-dessus, il n'a pas été préparé d'autre sperme que du sperme provenant de taureaux se trouvant dans des centres agréés ou du sperme provenant de taureaux ayant le même statut sanitaire que les taureaux se trouvant dans les centres agréés, à condition que, dans le dernier cas, cette préparation ait eu lieu avec un équipement séparé et à des moments différents de ceux auxquels a été préparé du sperme provenant de centres agréés et que l'installation de préparation ait été soigneusement nettoyée et désinfectée avant d'être réutilisée pour la préparation de sperme de taureaux se trouvant dans des centres agréés;

ii) dans des conditions d'hygiène les plus strictes, l'équipement entrant en contact avec les taureaux donneurs ou avec le sperme ayant été soigneusement désinfecté ou stérilisé, selon le cas, avant utilisation;

iii) moyennant l'utilisation d'additifs, de diluants ou d'agents d'allongement dans lesquels tout produit d'origine animale était obtenu d'une source qui ne présentait aucun risque pour la santé animale ou qui était traité avant son utilisation de manière à éviter un tel risque;

c) protégé par adddition des antibiotiques suivants selon les quantités nécessaires pour produire les concentrations indiquées dans les dilutions finales de sperme:

pas moins de:

- 500 Ul/ml de streptomycine,

- 500 Ul/ml de pénicilline,

- 150 ìg/ml de lincomycine,

- 300 ìg/ml de spectinomycine,

et immédiatement après maintenu à une température non inférieure à 5 °C (41 °F) pendant une période de 45 minutes au moins ou pas moins de:

- 50 ìg/ml de tylosine,

- 250 ìg/ml de gentamycine,

- 150 ìg/ml de lincomycine,

- 300 ìg/ml de spectinomycine,

le contact entre l'antibiotique et le sperme non dilué étant maintenu pendant au moins 3 minutes à la température à laquelle ils ont été mélangés et la fraction non glycérolée du diluant étant maintenue à une température non inférieure à 5 °C (41 °F) pendant au moins 2 heures;

d) mis dans des conteneurs individuels (paillettes), chacun d'eux portant la date de la collecte, la race et l'identité du taureau donneur ainsi que l'identité du centre de collecte agréé, ces informations ou tout élément de ces informations pouvant être inscrits en code si une traduction complète de ce code a été remise à l'autorité compétente de l'État membre importateur et pour autant qu'il existe une correspondance claire entre le marquage de chaque paillette et l'identification indiquée sur ce certificat;

e) entreposé dans des conteneurs qui ont été soigneusement nettoyés et désinfectés ou stérilisés, selon le cas, avant utilisation, moyennant utilisation d'agents cryogéniques n'ayant pas été utilisés antérieurement pour un quelconque produit d'origine animale, dans un centre agréé de collecte de sperme sous la surveillance du vétérinaire du centre pendant une période de trente jours au moins avant son expédition;

f) n'a pas été exporté après la date d'une épreuve positive effectuée sur tout taureau présent dans le centre, autre qu'une épreuve pour la dépistage de la fièvre catarrhale ou de la maladie hémorragique épizootique comme prévu dans le paragraphe 1 de l'article 1er de la décision 91/479/CEE de la Commission, ou une épreuve pour le dépistage de la rhinotrachéite bovine infectieuse/vulvovaginite pustuleuse infectieuse dans des conditions prévues par une dérogation écrite conformément au point 3 point a) iv) ci-dessus et avant que le statut sanitaire du centre ait été rétabli;

g) expédié en flacons qui ont été soigneusement nettoyés et désinfectés ou stérilisés, selon le cas, avant utilisation moyennant l'emploi d'agents cryogéniques n'ayant pas été utilisés antérieurement pour un quelconque produit d'origine animale et qui ont été scellés sous le contrôle du vétérinaire officiel avant d'être expédiés du centre agréé de collecte du sperme.

>TABLE>

ANNEXE II A

Procédure de classement dans la catégorie «indemne de fièvre catarrhale» de sperme de bovins destiné à l'exportation des États-Unis d'Amérique vers la Communauté économique européenne

1. Tous les animaux de l'espèce bovine se trouvant dans un centre agréé de collecte de sperme sont soumis, avant leur entrée et à intervalles de six mois par la suite, à une épreuve Elisa bloquante de dépistage des anticorps du virus de la fièvre catarrhale et à une épreuve d'immunodiffusion sur un gel d'agar de dépistage des anticorps de toutes les souches du virus de la maladie hémorragique épizootique connues aux États-Unis d'Amérique conformément aux protocoles décrits à l'annexe IV.

2. Un taureau qui a présenté un résultat négatif à la dernière des épreuves visées au paragraphe 1 est défini, au sens de la présente décision, comme séronégatif pour la fièvre catarrhale sauf ou jusqu'à ce que le sang ou le sperme de ce taureau présente un résultat positif à une quelconque des épreuves visées à la présente annexe ou à l'annexe III.

3. La saison sans vecteurs est, pour ce qui concerne un centre agréé de collecte de sperme, définie au sens de la présente décision comme une période commençant vingt et un jours après la date fixée par le département américain de l'agriculture et communiquée au centre agréé de collecte de sperme en cause et à la Commission des Communautés européennes, pendant laquelle toute activité des espèces de culicoúdes susceptibles de transmettre le virus de la fièvre catarrhale ou de la maladie hémorragique épizootique cesse dans la région où se trouve le centre et finissant vingt et un jours avant la date, également déterminée et communiquée, à laquelle l'activité de ces culicoúdes reprend.

4. Une période de collecte de sperme, pour ce qui concerne la collecte de sperme destiné à l'exportation vers la Communauté, est définie aux fins de la présente décision comme une période de trois semaines au maximum durant laquelle ce sperme est collecté. Si la période réelle de collecte de sperme dépasse trois semaines, celle-ci est divisée en deux ou plusieurs périodes de collecte, aucune d'entre elles ne dépassant trois semaines et chacune d'elles étant considérée comme une période de collecte distincte dans la mesure où il s'agit de l'application des épreuves et procédures relatives à la fièvre catarrhale et à la maladie hémorragique épizootique visées dans la présente décision.

5. Le sperme relevant des deux catégories décrites ci-dessous est classé comme indemne de fièvre catarrhale aux fins de son exportation vers la Communauté européenne:

a) sperme collecté pendant la saison exempte de vecteurs sur un taureau ayant présenté un résultat séronégatif à l'épreuve de dépistage de la fièvre catarrhale lorsqu'un échantillon de sang de ce taureau, prélevé vingt et un jours après la fin de la période de collecte de sperme, a été soumis à une épreuve Elisa de dépistage des anticorps du virus de la fièvre catarrhale et a présenté un résultat négatif à cette épreuve ainsi qu'à une épreuve d'immunodiffusion sur gel d'agar de dépistage des anticorps de tous les sérotypes du virus de la maladie hémorragique épizootique dont la présence est connue aux États-Unis d'Amérique conformément aux protocoles décrits à l'annexe IV;

b) sperme prélevé en dehors de la saison indemne de vecteurs sur un taureau ayant présenté un résultat négatif à une épreuve sérologique de dépistage de la fièvre catarrhale lorsqu'un échantillon de sang de ce taureau, prélevé vingt et un jours après la fin de la période de collecte de sperme, a été soumis à une épreuve Elisa de dépistage des anticorps du virus de la fièvre catarrhale et a donné un résultat négatif à cette épreuve ainsi qu'à une épreuve d'immunodiffusion sur gel d'agar de dépistage des anticorps de tous les sérotypes de la maladie hémorragique épizootique dont la présence est connue aux États-Unis d'Amérique conformément aux protocoles décrits à l'annexe IV et lorsque des échantillons de sang prélevés sur le taureau aux dates de collecte du sperme destiné à l'exportation ont été soumis à la procédure d'isolement du virus décrite à l'annexe III en donnant un résultat négatif.

ANNEXE III

Procédure d'isolement du virus pour la détection du virus de la fièvre catarrhale dans le sang en vue de l'exportation de sperme de bovins des États-Unis d'Amérique vers la Communauté économique européenne

1. Un échantillon de sang est prélevé sur le taureau le jour de chaque collecte de sperme destiné à l'exportation (normalement deux fois par semaine) et inoculé par voie sous-cutanée et intradermique à un ovin, chez lequel il a été constaté par une épreuve Elisa bloquante avant la première de ces inoculations qu'il était séronégatif, dans les quarante-huit heures de la collecte.

2. Un échantillon de sang destiné à l'isolement du virus est prélevé deux fois par semaine sur un ovin pendant une période de trois semaines commençant le jour de la première inoculation visée au paragraphe 1.

3. Du sang de taureau et d'ovin est inoculé dans les quarante-huit heures suivant la collecte à au moins six oeufs de poule contenant des embryons de onze jours.

4. S'il n'y a pas de mort d'embryons ou si la mort survient dans les deux jours de l'inoculation sans présenter de lésion spécifique, le test est considéré comme négatif après sept jours.

5. Du matériel de tout embryon mort entre le deuxième et le septième jour est transféré à des oeufs de poule contenant des embryons de onze jours, et ce à raison d'au moins six oeufs par embryon mort.

6. Si le passage du matériel de l'embryon mort provoque une mortalité embryonnaire de 50 % ou plus, le test est considéré comme positif. Après adaptation à la culture cellulaire, le ou les virus sont sérotypés en vue de confirmer la présence du virus de la fièvre catarrhale.

7. Un échantillon de sérum est prélevé deux fois par semaine sur le taureau et une fois par semaine sur l'ovin pendant une période de trois semaines et soumis à l'épreuve Elisa bloquante décrite à l'annexe IV A, une épreuve de séroneutralisation en vue du dépistage des anticorps du virus de la fièvre catarrhale, l'épreuve d'immunodiffusion sur gel d'agar décrite à l'annexe IV B et une épreuve de séroneutralisation en vue du dépistage des anticorps du virus de la maladie hémorragique épizootique.

8. L'ovin est de nouveau soumis à une épreuve Elisa bloquante vingt et un jours après la dernière inoculation de sang du taureau.

9. Une séroconversion ou une augmentation au moins quadruple du titre d'anticorps dans le taureau ou l'ovin révèle une infection en cours ou récente et l'épreuve est considérée comme positive.

10. L'épreuve sérologique est effectuée sur l'ensemble des échantillons à la fin de la période de collecte.

11. Le sperme n'est pas autorisé à l'exportation avant que toutes les épreuves réalisées se soient soldées par des résultats négatifs.

ANNEXE IV A

Protocole relatif à une épreuve de dosage par immuno-absorption à liaison enzymatique, bloquante ou concurrente à l'aide d'un groupe d'anticorps monoclonaux spécifique à un groupe pour la recherche des anticorps du virus de la fièvre catarrhale

ÉPREUVE ELISA CONCURRENTE DE RECHERCHE DE LA FIÈVRE CATARRHALE À L'AIDE DE L'ANTICORPS MONOCLONAL 3-17-A3 L'épreuve Elisa concurrente avec l'anticorps monoclonal 3-17-A3 permet de détecter les anticorps de tous les sérotypes connus du virus de la fièvre catarrhale (VFC).

Le principe de l'épreuve consiste dans l'interruption de la réaction entre l'antigène du VFC et un anticorps monoclonal spécifique au groupe (3-17-A3) par l'addition de dilutions du sérum à tester. Les anticorps du VFC présents dans le sérum à tester bloquent la réactivité de l'anticorps monoclonal (AMC) et entraînent une réduction du développement escompté de la couleur à l'addition du substrat enzymatique.

Matériels et réactifs 1. Plaques microtitres à fond plat.

2. Antigène: préparé selon la procédure décrite ci-dessous.

3. Tampon bloquant: 5 % (p/v) de poudre de lait séché «Marvel», 0,1 % (v/v) de Tween-20 (fourni sous forme de sirop de polyoxyéthylène sorbiton monolaurate) dans du PBS.

4. Anticorps monoclonal (AMC): 3-17-A3 (fourni sous forme de surnageant de culture tissulaire hybridome) stocké à 20 °C ou lyophylisé, dilué à 1/50 avec un tampon bloquant avant utilisation, dirigé contre le polypeptide p7 spécifique au groupe.

5. Conjugué: globuline de lapin antisouris (absorbé et élué), conjugué à la peroxydase de raifort et conservé à l'obscurité à 4 °C.

6. Substrat et chromogène: 0,2 g d'orthophénylène (OPD) dissoute dans un tampon composé de 2,553 g d'acide citrique et 4,574 g de di-sodium hydrogénorthophosphate porté à 500 ml de l'eau distillée, divisé en aliquotes de 25 ml et conservé à l'obscurité à 20 °C, additionné de 12 ìl/25 ml de peroxyde d'hydrogène (30 % d/v) immédiatement avant utilisation.

Manipuler l'OPD avec précaution - Porter des gants en caoutchouc - produit suspect d'être mutagène.

7. Acide sulfurique à 1 mole: 26,6 ml d'acide ajouté à 473,4 ml d'eau distillée.

Attention: toujours ajouter l'acide à l'eau, jamais l'eau à l'acide.

8. Agitateur orbital.

9. Lecteur de plaque Elisa (l'épreuve peut être lue visuellement).

Schéma de l'épreuve >TABLE>

Protocole d'essai Contrôle à blanc La ligne 1, de A à H, est un contrôle à blanc comprenant l'antigène du VFC et un conjugé. Il peut être utilisé pour étalonner le lecteur Elisa.

Contrôle de l'AMC La ligne 2, de A à H, est le contrôle à blanc de l'anticorps monoclonal et comprend l'antigène du VFC, l'anticorps monoclonal et le conjugué. Il s'agit d'un contrôle négatif. La moyenne des valeurs de la densité optique de cette ligne de contrôle représente la valeur d'inhibition de 0 %.

Contrôle positif La ligne 3, de A à H, est le contrôle positif. Il comprend l'antigène du VFC, des dilutions d'antisérum positif du VSC, d'AMC et le conjugé. Il est inclus pour indiquer que l'épreuve se déroule normalement et que des niveaux similaires d'inhibition devraient être obtenus d'une épreuve à une autre.

Sérums à tester Dans le schéma de l'épreuve indiquée ci-dessus, 18 sérums peuvent être testés dans des dilutions de 1/2, 1/4, 1/8 et 1/16. Il en ressortira des informations sur le titre de l'anticorps contenu dans les sérums à tester. La gamme de dilutions pourrait être élargie encore pour obtenir des titres finaux de dilutions du sérum. À l'inverse, pour des études sérologiques à grande échelle, le sérum pourrait être testé à une dilution unique (1/4) ou à deux dilutions (1/2 et 1/4) en tant qu'épreuve de contrôle rapide.

Mode opératoire 1. Diluer l'antigène du VFC à la concentration prétitrée dans du PBS. Agiter brièvement (par agitateur à ultrasons) pour disperser les agrégats de virus (à défaut de cet appareil, agiter vigoureusement à la pipette) et en ajouter 50 ìl dans toutes les loges de la plaque Elisa. Tapoter les bords de la plaque pour disperser l'antigène.

2. Incuber à 37 °C pendant 60 minutes à l'aide d'un agitateur orbital. Laver les plaques trois fois par rinçage et vider les loges avec du PBS non stérile et sécher à l'aide de papier buvard.

3. Ajouter 50 ìl par loge de tampon bloquant. Ajouter des sérums à tester et un sérum positif dans les loges en cause et diluer le contenu de la plaque à l'aide d'une pipette à canaux multiples. Ne pas ajouter de sérum au contrôle à blanc ou au contrôle le l'AMC.

4. Immédiatement après l'addition des sérums à tester, diluer l'AMC dans un tampon bloquant (à une dilution prétitrée) et ajouter 50 ìl à toutes les loges de la plaque, sauf le contrôle à blanc.

5. Incuber à 37 °C pendant 60 minutes dans un agitateur orbital. Laver trois fois avec du PBS et sécher à l'aide de papier buvard.

6. Diluer le concentré de lapin antisouris à 1/5 000 dans un tampon bloquant et ajouter 50 ìl dans toutes les loges de la plaque.

7. Incuber à 37 °C pendant 60 minutes sur un agitateur orbital. Laver trois fois avec du PBS et sécher à l'aide de papier buvard.

8. Décongeler l'OPD et, immédiatement avant utilisation, ajouter 12 ìl de peroxyde d'hydrogène à 30 % à chaque quantité de 25 ml d'OPD. Ajouter 50 ìl dans toutes les loges de la plaque. Attendre le développement de la couleur pendant environ 10 minutes et arrêter la réaction à l'aide de l'acide sulfurique à IM (50 ìl par loge). La couleur devrait se développer dans les loges de contrôle AMC et dans les loges contenant des sérums sans anticorps du VFC.

9. Examiner et enregistrer les plaques soit visuellement, soit à l'aide d'un lecteur spectrophotométrique.

Analyse des résultats Calculer la valeur moyenne de DO à partir des contrôles AMC. Cela représente la valeur d'inhibition 0 %. Les valeurs de densité optique des sérums à tester sont exprimées en pourcentage des valeurs d'inhibition à l'aide de la formule suivante:

Pourcentage de la valeur d'inhibition = 100 - DO en présence du sérum à tester DO en l'absence de sérum à tester × 100.

Les valeurs d'inhibition supérieures à 40 % à une dilution du sérum de 1/4 sont considérées comme positives. La lecture visuelle est possible étant donné qu'une inhibition de 40 % est la valeur la plus faible bien visible.

Préparation de l'antigène VFC pour la technique Elisa 1. Laver trois fois 10 roux de cellules BHK-21 confluentes à l'aide d'un milieu Eagle exempt de sérum et infecter au moyen du sérotype 1 du virus de la fièvre catarrhale dans un milieu Eagle exempt de sérum.

2. Incuber à 37 °C et examiner l'effet cytopathique (ecp) chaque jour.

3. Lorsque l'ecp devient évident dans 80 à 90 % de la plaque de cellules de chaque roux, récolter le virus par agitation pour détacher les cellules adhérant à la paroi.

4. Centrifuger à 2 ou 3 000 tours/minute pour réduire les cellules en granulés.

5. Jeter la fraction supernageante et remettre en suspension les cellules dans environ 30 ml de PBS contenant 1 % de «sarkosyl» et 2 ml de fluorure de phénométhylsulphonyl (tampon lyse). Cela peut provoquer une gélification des cellules; auquel cas, il faut ajouter davantage de tampon lyse pour réduire cet effet.

NB: le fluorure de phénylméthylsulphonyl est dangereux; le manipuler avec une extrême prudence.

6. Dissocier les cellules pendant 60 secondes à l'aide d'une sonde ultrasonique fonctionnant à une amplitude de 30 microns.

7. Centrifuger à 10 000 tours/minute pendant dix minutes.

8. Stocker la fraction surnageante à +4 °C et remettre en suspension le granulé de cellules restant dans 10 à 20 ml de tampon lyse.

9. Agiter à l'aide d'un appareil à ultrasons et clarifier, stocker la fraction surnageante à chaque stade, trois fois au total.

10. Réunir les fractions surnageantes et centrifuger à 24 000 tours/minute pendant 120 minutes à une température de +4 °C sur un coussin de 5 ml de sucrose à 40 % (p/v dans PBS) en utilisant des tubes de centrifugation Beckmann de 30 ml et un rotor SW 28.

11. Jeter la fraction surnageante, laisser s'égoutter les tubes soigneusement et remettre en suspension le granulé dans du PBS par ultrasons. Stocker l'antigène dans des aliquotes à 70 °C.

Titrage de l'antigène VFC pour la technique Elisa L'antigène de la fièvre catarrhale pour la technique Elisa est titré par la technique Elisa indirecte. Titre des doubles dilutions d'antigène à l'aide d'une dilution constante (1/50) d'anticorps monoclonal 3-17-A3. Le protocole est le suivant:

Mode opératoire:

1. Diluer l'antigène VFC dans PBS à travers une plaque microtitre dans une série de dilutions doubles (50 ìl/loge) en utilisant une pipette multiple.

2. Incuber pendant une heure à 37 °C à l'aide d'un agitateur orbital.

3. Laver trois fois les plaques avec du PBS.

4. Ajouter 50 ìl d'anticorps monoclonal 3-17-A3 (dilué à 1/50) dans chaque loge de la plaque microtitre.

5. Incuber pendant une heure à 37 °C à l'aide d'un agitateur orbital.

6. Laver trois fois les plaques à l'aide de PBS.

7. Mettre 50 ìl de globuline de lapin antisouris conjugué à de la peroxidase de raifort, diluée à une concentration prétitrée optimale dans chaque loge de la plaque microtitre.

8. Incuber pendant une heure à 37 °C à l'aide d'un agitateur orbital.

9. Ajouter un substrat et un chromogène comme ci-dessus. Arrêter la réaction après dix minutes par addition d'acide sulfurique à 1 M (50 ìl/loge).

Dans l'essai concurrent, l'anticorps monoclonal doit se trouver en excédent; c'est pourquoi il est choisi une dilution d'antigène qui se trouve sur la courbe de titrage (non dans la zone de plateau) qui donne approximativement une DO de 0,8 après dix minutes.