DEUXIÈME DIRECTIVE DE LA COMMISSION du 18 novembre 1971 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (71/393/CEE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (1), et notamment son article 2,

considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux pour constater si les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;

considérant que la directive nº 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971(2), a déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires ; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une seconde série de méthodes;

considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux en ce qui concerne leurs teneurs en humidité, bases azotées volatiles, phosphore total et matières grasses brutes sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe de la présente directive.

Les dispositions générales figurant à la partie 1 de l'annexe (introduction) de la première directive nº 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe de la présente directive.

Article 2

Les États membres mettent en vigueur, le 1er janvier 1973 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.

Article 3

Les États membres sont destinataires de la présente directive.

Fait à Bruxelles, le 18 novembre 1971.

Par la Commission

Le président

Franco M. MALFATTI (1)JO nº L 170 du 3.8.1970, p. 2. (2)JO nº L 155 du 12.7.1971, p. 13.

ANNEXE

1. DOSAGE DE L'HUMIDITÉ

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité des aliments des animaux. Elle ne concerne pas l'analyse des produits laitiers en tant qu'aliments simples des animaux, l'analyse des substances minérales et des mélanges essentiellement composés de substances minérales, ainsi que l'analyse des graines et fruits oléagineux définis dans le règlement (CEE) nº 136/66 du Conseil, du 22 septembre 1966, portant établissement d'une organisation commune des marchés dans le secteur des matières grasses (1).

La détermination de la teneur en humidité des graines et fruits oléagineux fait l'objet de l'annexe III du règlement (CEE) nº 1470/68 de la Commission, du 23 septembre 1968, relatif à la prise et réduction des échantillons ainsi qu'à la détermination de la teneur en huile, en impuretés et en humidité des graines oléagineuses (2).

2. Principe

La prise d'essai est soumise à la dessication dans des conditions définies, variant en fonction de la nature de l'aliment. La perte de masse est déterminée par pesée. Il est nécessaire de procéder à une prédessication lorsqu'il s'agit d'aliments solides, ayant une teneur élevée en humidité.

3. Appareillage 3.1. Broyeur construit en matériau n'absorbant pas l'humidité, facile à nettoyer, permettant un broyage rapide et uniforme sans provoquer d'échauffement sensible, évitant au maximum le contact avec l'air extérieur, et répondant aux exigences indiquées en 4.1.1 et 4.1.2 (par ex., micro-broyeurs à marteaux ou à refroidissement à eau, moulins à cônes démontables, broyeurs à mouvement lent ou à disques dentés).

3.2. Balance analytique, précision 0,5 mg.

3.3. Récipients secs en métal inoxydable ou en verre, munis d'un couvercle assurant une fermeture étanche à l'air ; surface utile permettant d'obtenir une répartition de la prise d'essai de l'ordre de 0,3 g par cm2.

3.4. Étuve isotherme (± 1 ºC) à chauffage électrique, assurant une régulation rapide de la température et convenablement ventilée (3).

3.5. Étuve à vide, à chauffage électrique réglable, munie d'une pompe à huile et soit d'un dispositif à introduction d'air chaud déshydraté, soit d'un déshydratant (par ex., oxyde de calcium).

3.6. Dessicateur à plaque en métal ou en porcelaine, épaisse, perforée, contenant un déshydratant efficace.

4. Mode opératoire

NB : Les opérations décrites dans ce chapitre doivent être effectuées immédiatement après l'ouverture des emballages contenant les échantillons. Les analyses doivent être effectuées au moins en double. (1)JO nº 172 du 30.9.1966, p. 3025/66. (2)JO nº L 239 du 28.9.1968, p. 2. (3)Pour la dessication des céréales ainsi que des farines, gruaux et semoules, l'étuve doit avoir une capacité calorifique telle que, réglée préalablement à une température de 13 ºC, elle puisse atteindre à nouveau cette température moins de 45 minutes après la mise en place du nombre maximal de prises d'essai à sécher simultanément. Elle devrait avoir une ventilation telle que, en séchant pendant deux heures, toutes les prises d'essais de froment tendre qu'elle peut contenir, les résultats présentent une différence inférieure à 0,15 % par rapport aux résultats obtenus après quatre heures de séchage. 4.1. Préparation 4.1.1. Aliments à l'exception de ceux mentionnés en 4.1.2 et 4.1.3

Prélever au moins 50 g de l'échantillon. Si nécessaire, broyer ou diviser de façon appropriée pour éviter toute variation de la teneur en humidité (voir 6).

4.1.2. Céréales et gruaux

Prélever au moins 50 g de l'échantillon. Moudre en particules dont au moins 50 % passent par un tamis à mailles de 0,5 mm et ne laissent pas plus de 10 % de refus sur le tamis à mailles rondes de 1 mm.

4.1.3. Aliments liquides ou pâteux, aliments constitués essentiellement de matières grasses

Prélever et peser à 10 mg près, 25 g environ de l'échantillon, y ajouter une quantité appropriée de sable anhydre, pesée à 10 mg près, et mélanger jusqu'à obtention d'un produit homogène.

4.2. Dessication 4.2.1. Aliments à l'exception de ceux mentionnés en 4.2.2 et 4.2.3

Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré à 5 g environ de l'échantillon et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient dans l'étuve préalablement chauffée à 103 ºC, le couvercle étant enlevé. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un temps minimum. Laisser sécher durant quatre heures à partir du moment où l'étuve a atteint à nouveau la température de 103 ºC. Remettre le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l'étuve, laisser refroidir durant 30 à 45 minutes dans le dessicateur (3.6) et peser à 1 mg près.

Dans le cas des aliments constitués essentiellement de matières grasses, effectuer une dessication complémentaire de 30 minutes dans l'étuve à 103 ºC. L'écart entre les deux pesées ne doit pas excéder 0,1 % d'humidité.

4.2.2. Céréales, farines, gruaux et semoules

Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon broyé et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient dans l'étuve préalablement chauffée à 130 ºC, le couvercle étant enlevé. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un temps minimum. Laisser sécher durant deux heures comptées à partir du moment où l'étuve a atteint à nouveau la température de 130 ºC. Remettre le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l'étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessicateur (3.6) et peser à 1 mg près.

4.2.3. Aliments composés contenant plus de 4 % de saccharose ou de lactose : aliments simples tels que caroube, produits céréaliers hydrolysés, germes de malt, cossettes de betteraves, solubles de poisson et sucres ; aliments composés contenant plus de 25 p.cent de sels minéraux renfermant de l'eau de cristallisation

Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient dans l'étuve à vide (3.5) préalablement chauffée à une température de 80 à 85 ºC, le couvercle étant enlevé. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un temps minimum.

Amener la pression à 100 Torrs et laisser sécher à cette pression durant quatre heures, soit sous un courant d'air sec et chaud, soit à l'aide d'un déshydratant (300 g environ pour 20 échantillons). Dans ce dernier cas, couper la connexion avec la pompe à vide lorsque la pression prescrite est atteinte. Compter la durée de séchage à partir du moment où l'étuve a atteint à nouveau la température de 80 à 85 ºC. Ramener ensuite avec précaution l'étuve à la pression atmosphérique. Ouvrir l'étuve, couvrir immédiatement le récipient de son couvercle, retirer le récipient de l'étuve, laisser refroidir durant 30 à 45 minutes dans le dessicateur (3.6) et peser à 1 mg près. Procéder à une dessication complémentaire de 30 minutes dans l'étuve à vide à la température de 80 à 85 ºC et peser à nouveau. L'écart entre les deux pesées ne doit pas excéder 0,1 % d'humidité.

4.3. Prédessication 4.3.1. Aliments, à l'exception de ceux mentionnés en 4.3.2

Les aliments solides, dont la teneur en humidité est élevée et rend le broyage difficile, doivent être prédesséchés comme suit.

Peser à 10 mg près, 50 g de l'échantillon non broyé (une division grossière peut être effectuée, si nécessaire, dans le cas des aliments comprimés ou agglomérés) dans un récipient approprié (par exemple, plaque en aluminium de 20 X 12 cm avec bord de 0,5 cm). Laisser sécher dans une étuve à la température de 60 à 70 ºC, jusqu'à ce que la teneur en humidité soit ramenée à une valeur comprise entre 8 et 12 p.cent. Retirer de l'étuve, laisser refroidir à découvert dans le laboratoire durant une heure et peser à 10 mg près. Broyer immédiatement après comme indiqué en 4.1.1 et effectuer la dessication comme indiqué en 4.2.1 ou 4.2.3, selon la nature de l'aliment.

4.3.2. Céréales

Les grains ayant un taux en humidité supérieur à 17 p.cent doivent être prédesséchés comme suit:

Peser, à 10 mg près, 50 g du grain non moulu dans un récipient approprié (par exemple, plaque en aluminium de 20 X 12 cm avec bord de 0,5 cm). Laisser sécher dans une étuve pendant 5 à 7 minutes à la température de 130 ºC. Retirer de l'étuve, laisser refroidir à découvert dans le laboratoire durant deux heures et peser à 10 mg près. Moudre immédiatement après, comme indiqué en 4.1.2 et effectuer la dessication comme indiqué en 4.2.2.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité, en pour cent de l'échantillon, est donnée par les formules suivantes: 5.1. Dessication sans prédessication >PIC FILE= "T0002769">

où:

E = masse initiale, en grammes, de la prise d'essai,

m = masse, en grammes, de la prise d'essai sèche.

5.2. Dessication avec prédessication >PIC FILE= "T0002770">

où:

E = masse initiale, en grammes, de la prise d'essai,

M = masse, en grammes, de la prise d'essai après prédessication,

M' = masse, en grammes, de la prise d'essai après broyage ou mouture,

m = masse, en grammes, de la prise d'essai sèche.

5.3. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,2 % d'humidité.

6. Observation

Si un broyage s'avère nécessaire et s'il ressort que celui-ci entraîne une variation de la teneur en humidité du produit, les résultats d'analyse concernant les composants de l'aliment doivent être convertis conformément à la teneur en humidité de l'échantillon initial.

2. DOSAGE DES BASES AZOTÉES VOLATILES

A. PAR MICRODIFFUSION

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en bases azotées volatiles, exprimées en ammoniac des aliments des animaux.

2. Principe

L'échantillon est extrait par l'eau, la solution est déféquée et filtrée. Les bases azotées volatiles sont déplacées à l'aide d'une solution de carbonate de potassium par microdiffusion, recueillies dans une solution d'acide borique et titrées par l'acide sulfurique.

3. Réactifs 3.1. Solution à 20 p.cent (p/v) d'acide trichloracétique.

3.2. Indicateur : dissoudre 33 mg de vert de bromocrésol et 65 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol à 95-96 p.cent (v/v).

3.3. Solution d'acide borique : dans un ballon jaugé de 1 l, dissoudre 10 g d'acide borique p.a. dans 200 ml d'éthanol à 95-96 p.cent (v/v) et 700 ml d'eau. Ajouter 10 ml d'indicateur (3.2). Mélanger et ajuster si nécessaire la coloration de la solution au rouge clair par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. 1 ml de cette solution permet de fixer au maximum 300 ¶g de NH3.

3.4. Solution saturée de carbonate de potassium : dissoudre 100 g de carbonate de potassium p.a. dans 100 ml d'eau à l'ébullition. Laisser refroidir et filtrer.

3.5. Acide sulfurique 0,02 N.

4. Appareillage 4.1. Mélangeur (culbuteur) : environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Cellules de Conway (v. schéma), en verre ou en matière plastique.

4.3. Microburettes, graduées au 1/100 ml.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 10 g de l'échantillon et les introduire dans un ballon jaugé de 200 ml avec 100 ml d'eau. Mélanger durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajouter 50 ml de solution d'acide trichloracétique (3.1), compléter au volume avec de l'eau, agiter vigoureusement et filtrer sur un filtre à plis.

Introduire à la pipette dans la partie centrale de la cellule de Conway 1 ml de solution d'acide borique (3.3) et dans la couronne de la cellule 1 ml du filtrat de l'échantillon. Couvrir partiellement à l'aide du couvercle graissé. Laisser tomber rapidement dans la couronne 1 ml de solution saturée de carbonate de potassium (3.4) et fermer le couvercle de façon étanche. Remuer avec précaution la cellule en lui donnant un mouvement de rotation dans un plan horizontal, afin d'assurer le mélange des deux réactifs. Laisser incuber soit durant quatre heures au moins à la température ambiante, soit durant une heure à 40 ºC.

Titrer les bases volatiles dans la solution d'acide borique par l'acide sulfurique 0,02 N (3.5) en utilisant une microburette (4.3). Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire, en l'absence d'échantillon à analyser.

6. Calcul des résultats

1 ml de H2SO4 0,02 N correspond à 0,34 mg d'ammoniac.

Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats des deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:

10 p.cent en valeur relative pour les teneurs en ammoniac inférieures à 1,0 p.cent;

0,1 en valeur absolue pour les teneurs en ammoniac égales ou supérieures à 1,0 p.cent.

7. Observation

Si la teneur en ammoniac de l'échantillon est supérieure à 0,6 p.cent, diluer le filtrat initial.

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B. PAR DISTILLATION

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en bases azotées volatiles, exprimées en ammoniac, des farines de poisson ne contenant pratiquement pas d'urée. Elle n'est applicable que pour des teneurs en ammoniac inférieures à 0,25 p.cent.

2. Principe

L'échantillon est extrait par l'eau, la solution est déféquée et filtrée. Les bases azotées volatiles sont déplacées à l'ébullition par addition d'oxyde de magnésium et recueillies dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré en retour par une solution d'hydroxyde de sodium.

3. Réactifs 3.1. Solution à 20 p.cent (p/v) d'acide trichloracétique.

3.2. Oxyde de magnésium p.a.

3.3. Émulsion d'antimousse (silicone, par ex.).

3.4. Acide sulfurique 0,1 N.

3.5. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N.

3.6. Solution à 0,3 p.cent (p/v) de rouge de méthyle dans l'éthanol à 95-96 p.cent (v/v).

4. Appareillage 4.1. Mélangeur (culbuteur) : environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Appareil à distiller du type Kjeldahl.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 10 g de l'échantillon et les introduire avec 100 ml d'eau dans un ballon jaugé de 200 ml. Mélanger durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajouter 50 ml de solution d'acide trichloracétique (3.1), compléter au volume avec de l'eau, agiter vigoureusement et filtrer sur un filtre à plis.

Prélever une quantité de filtrat limpide en fonction de la teneur présumée en bases azotées volatiles (100 ml conviennent, en général). Diluer à 200 ml et ajouter 2 g d'oxyde de magnésium (3.2) et quelques gouttes d'émulsion antimousse (3.3). La solution doit être alcaline au papier de tournesol ; si elle ne l'est pas, ajouter de l'oxyde de magnésium (3.2). Distiller 150 ml environ de la solution dans un appareil du type Kjeldahl et recueillir le distillat dans un erlenmeyer contenant un volume exactement mesuré (25 à 50 ml) d'acide sulfurique 0,1 N (3.4). Au cours de la distillation, éviter une surchauffe des parois. Faire bouillir durant 2 minutes la solution sulfurique, refroidir et titrer l'excès d'acide sulfurique en retour par la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N (3.5) en présence de l'indicateur au rouge de méthyle (3.6).

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire, en l'absence d'échantillon à analyser.

6. Calcul des résultats

1 ml de H2SO4 0,1 N correspond à 1,7 mg d'ammoniac.

Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser, en valeur relative, 10 p.cent d'ammoniac.

3. DOSAGE DU PHOSPHORE TOTAL

Méthode photométrique

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en phosphore total des aliments des animaux. Elle est particulièrement indiquée pour l'analyse des produits pauvres en phosphore. Dans certains cas (produits riches en phosphore), une méthode gravimétrique peut être appliquée.

2. Principe

L'échantillon est minéralisé, soit par voie sèche (pour les aliments organiques), soit par voie humide (pour les composés minéraux et les aliments liquides) et mis en solution acide. La solution est traitée par le réactif vanado-molybdique. La densité optique de la solution jaune ainsi formée est mesurée au spectrophotomètre à 430 nm.

3. Réactifs 3.1. Carbonate de calcium p.a.

3.2. Acide chlorhydrique p.a., d : 1,1 (6 N environ).

3.3. Acide nitrique p.a., d : 1,045.

3.4. Acide nitrique p.a., d : 1,38 à 1,42.

3.5. Acide sulfurique p.a., d : 1,84.

3.6. Réactif vanado-molybdique : Mélanger 200 ml de solution d'heptamolybdate d'ammonium (3.6.1), 200 ml de solution de monovanadate d'ammonium (3.6.2) et 134 ml d'acide nitrique (3.4) dans un ballon jaugé de 1 l. Compléter au volume avec de l'eau. 3.6.1. Solution d'heptamolybdate d'ammonium : Dissoudre dans l'eau chaude 100 g d'heptamolybdate d'ammonium p.a. (NH4) 6Mo7 O24 7 4 H2O. Ajouter 10 ml d'ammoniac (d : 0,91) et compléter à 1 l avec de l'eau.

3.6.2. Solution de monovanadate d'ammonium : Dissoudre dans 400 ml d'eau chaude 2,35 g de monovanadate d'ammonium p.a. NH4VO3. Ajouter lentement et tout en agitant 20 ml d'acide nitrique dilué (7 ml de HNO3 (3.4) + 13 ml de H2O) et compléter à 1 l avec de l'eau.

3.7. Solution étalon à 1 mg de phosphore par ml : Dissoudre dans l'eau 4,387 g de dihydrogénophosphate de potassium p.a. KH2PO4. Compléter à 1 l avec de l'eau.

4. Appareillage 4.1. Creusets à incinération, en quartz ou porcelaine.

4.2. Four à moufle électrique, muni d'un thermostat réglé à 550 ºC.

4.3. Matras de Kjeldahl, 250 ml.

4.4. Ballons jaugés et pipettes de précision.

4.5. Spectrophotomètre.

4.6. Tubes à essai, diamètre : 16 mm environ, à rodage normalisé 14,5 ; capacité : 25 à 30 ml.

5. Mode opératoire 5.1. Préparation de la solution

Selon la nature de l'échantillon, préparer une solution comme indiqué en 5.1.1 ou 5.1.2. 5.1.1. Cas général

Peser, à 1 mg près, 1 g ou plus de l'échantillon. Introduire la prise d'essai dans un matras de Kjeldahl, ajouter 20 ml d'acide sulfurique (3.5), agiter pour imprégner complètement la matière d'acide et éviter qu'elle n'adhère aux parois du ballon, chauffer et maintenir pendant 10 minutes à ébullition. Laisser refroidir légèrement, ajouter 2 ml d'acide nitrique (3.4), chauffer doucement, laisser refroidir légèrement, ajouter à nouveau un peu d'acide nitrique (3.4) et porter à ébullition. Répéter ces opérations jusqu'à obtention d'une solution incolore. Refroidir, ajouter un peu d'eau, transvaser le liquide dans un ballon jaugé de 500 ml en rinçant le matras à l'eau chaude. Laisser refroidir, compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer.

5.1.2. Échantillons contenant des matières organiques et exempts de dihydrogénophosphates de calcium et de magnésium

Peser, à 1 mg près, 2,5 g environ de l'échantillon dans un creuset à incinération. Mélanger intimement la prise d'essai à 1 g de carbonate de calcium (3.1). Calciner au four à 550 ºC ± 5 ºC jusqu'à obtention de cendres blanches ou grises (une petite quantité de charbon ne gêne pas).

Transvaser les cendres dans un bécher de 250 ml. Ajouter 20 ml d'eau et de l'acide chlorhydrique (3.2) jusqu'à cessation de l'effervescence. Ajouter ensuite 10 ml d'acide chlorhydrique (3.2) en excès. Porter le bécher sur un bain de sable et évaporer à sec pour insolubiliser la silice. Reprendre le résidu par 10 ml d'acide nitrique (3.3) et faire bouillir pendant 5 minutes sur le bain de sable, sans évaporer à sec. Transvaser le liquide dans un ballon jaugé de 500 ml en rinçant le bécher à plusieurs reprises à l'eau chaude. Laisser refroidir, compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer.

5.2. Développement de la coloration et mesure de la densité optique

Diluer une partie aliquote du filtrat obtenu en 5.1.1 ou 5.1.2 pour obtenir une concentration en phosphore atteignant au maximum 40 ¶g/ml. Introduire 10 ml de cette solution dans un tube à essai (4.6) et y ajouter 10 ml du réactif vanadomolybdique (3.6). Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes au moins à la température de 20 ºC. Mesurer la densité optique au spectrophotomètre à 430 nm par comparaison avec une solution obtenue par addition de 10 ml du réactif vanadomolybdique (3.6) à 10 ml d'eau.

5.3. Courbe d'étalonnage

Préparer à partir de la solution étalon (3.7) des solutions contenant respectivement 5, 10, 20, 30 et 40 ¶g de phosphore par ml. Prélever 10 ml de chacune de ces solutions et y ajouter 10 ml du réactif vanado-molybdique (3.6). Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes au moins à la température de 20 ºC. Mesurer les densités optiques dans les conditions indiquées en 5.2.

Tracer la courbe d'étalonnage en portant en ordonnée les valeurs de la densité optique et en abcisse les quantités correspondantes de phosphore. La courbe est linéaire pour les concentrations comprises entre 0 et 40 ¶g/ml.

6. Calcul des résultats

Déterminer la quantité de phosphore de la prise d'essai en se référant à la courbe d'étalonnage.

Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:

3 p.cent en valeur relative pour les teneurs en phosphore inférieures à 5 p.cent;

0,15 en valeur absolue pour les teneurs en phosphore égales ou supérieures à 5 p.cent.

4. DOSAGE DES MATIÈRES GRASSES BRUTES

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en matières grasses brutes des aliments des animaux. Elle ne concerne pas l'analyse des graines et fruits oléagineux définis dans le règlement 136/66/CEE du Conseil du 22 septembre 1966. La détermination de la teneur en huile de ces produits fait l'objet de l'annexe V du règlement (CEE) nº 1470/68 de la Commission du 23 septembre 1968.

Deux procédés sont prévus en fonction de la nature de l'aliment. 1.1. Procédé A (extrait éthéré) : appliqué à tous les aliments, sauf à ceux mentionnés en 1.2.

1.2. Procédé B : appliqué aux aliments dont les matières grasses ne peuvent être totalement extraites par l'éther diéthylique sans hydrolyse préalable, aux aliments d'origine animale, glutens, pulpes séchées de pommes de terre, drèches séchées de brasserie et de distillerie, levures séchées, déchets de biscuiterie, de pains et aliments cuits, produits laitiers et aliments contenant une forte proportion de ceux-ci (au moins 40 p.cent) et aux aliments composés enrichis en graisses.

2. Principe 2.1. Procédé A : Les matières grasses sont extraites par l'éther diéthylique. Le solvant est éliminé et le résidu est séché et pesé.

2.2. Procédé B : L'échantillon est hydrolysé à chaud par l'acide chlorhydrique. La solution est refroidie et filtrée. Le résidu, lavé et séché, est soumis à l'extraction par l'éther diéthylique selon le procédé A.

3. Réactifs 3.1. Éther diéthylique, anhydre, d : 0,720, éb : 34,5 ºC, pratiquement exempt de peroxydes.

3.2. Sulfate de sodium, p.a., anhydre.

3.3. Acide chlorhydrique 3 N.

3.4. Adjuvant de filtration, par ex. terre de diatomée, Hyflo-supercel.

3.5. Tétrachlorure de carbone p.a.

4. Appareillage 4.1. Extracteur selon Soxhlet ou appareil équivalent.

4.2. Appareil de chauffage à température réglable, antidéflagrant.

4.3. Étuve à dessication par le vide (moins de 100 Torrs).

5. Mode opératoire 5.1. Procédé A (voir observation 7.1)

Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon et les mélanger à 2 à 3 g (ou plus, si nécessaire) de sulfate de sodium anhydre (3.2). Introduire le mélange dans une cartouche à extraction exempte de matières grasses et recouvrir d'un tampon de coton dégraissé. (Le mélange peut se faire éventuellement dans la cartouche.)

Placer la cartouche dans un extracteur (4.1) et extraire durant six heures par l'éther diéthylique (3.1). Si on utilise un extracteur selon Soxhlet, régler le chauffage pour obtenir 15 siphonnages au moins à l'heure. Recueillir l'extrait éthéré dans un ballon sec, muni de quelques fragments de pierre ponce (1) et taré. (1)Remplacer les fragments de pierre ponce par des perles de verre lorsque la matière grasse doit faire l'objet d'examens qualitatifs ultérieurs.

Éliminer l'éther par distillation et sécher ensuite le résidu d'évaporation pendant une heure et demie dans l'étuve à dessication par le vide (4.3) à la température de 75 ºC. Refroidir dans un dessicateur et peser. Effectuer une seconde dessication pendant 30 minutes pour s'assurer que le poids de la matière grasse reste constant (la perte de poids doit être inférieure à 1 mg).

5.2. Procédé B

Peser, à 1 mg près, 2,5 g de l'échantillon (voir observation 7.2) et les introduire dans un bécher de 400 ml ou un erlenmeyer de 300 ml. Ajouter 100 ml d'acide chlorhydrique 3 N (3.3) et quelques fragments de pierre ponce. Recouvrir le bécher d'un verre de montre ou munir l'erlenmeyer d'un réfrigérant à reflux. Amener le mélange à ébullition douce, à l'aide d'une petite flamme ou d'une plaque chauffante, et l'y maintenir durant une heure. Éviter que le produit adhère aux parois du récipient.

Refroidir et ajouter une quantité d'adjuvant de filtration (3.4) suffisante pour éviter toute perte de matière grasse lors de la filtration. Filtrer sur un double papier-filtre mouillé, exempt de matières grasses. Laver le résidu à l'eau froide jusqu'à disparition de réaction acide. Vérifier que le filtrat ne contient pas de matières grasses. La présence de celles-ci dans le filtrat indique qu'une extraction de l'échantillon par l'éther diéthylique, selon le procédé indiqué en 5.1, doit être effectuée préalablement à l'hydrolyse.

Placer le double papier-filtre contenant le résidu sur un verre de montre et sécher durant une heure et demie dans l'étuve à la température de 95 à 98 ºC.

Introduire le double filtre et le résidu sec dans une cartouche à extraction, extraire par l'éther diéthylique et poursuivre le mode opératoire comme indiqué en 5.1 deuxième alinéa.

6. Calcul des résultats

Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,3 p.cent de matière grasse.

7. Observations 7.1. Pour les produits à teneur élevée en matières grasses, difficiles à broyer ou non appropriés au prélèvement d'une prise d'essai réduite homogène, procéder comme suit. Peser, à 1 mg près, 20 g de l'échantillon et les mélanger à 10 g ou plus de sulfate de sodium anhydre (3.2). Procéder à l'extraction par l'éther diéthylique (3.1) comme indiqué en 5.1. Compléter l'extrait obtenu à 500 ml avec du tétrachlorure de carbone (3.5) et homogénéiser. Prélever 50 ml de la solution et les porter dans un petit ballon sec, muni de quelques fragments de pierre ponce (1) et taré. Éliminer le solvant par distillation, sécher et poursuivre le mode opératoire comme indiqué en 5.1 dernier alinéa. Éliminer le solvant du résidu d'extraction se trouvant dans la cartouche et broyer le résidu à la finesse de 1 mm. Placer à nouveau le produit dans la cartouche à extraction (ne pas ajouter de sulfate de sodium), extraire par l'éther diéthylique et poursuivre le mode opératoire comme indiqué en 5.1 deuxième et troisième alinéas.

Calculer le résultat en pour cent de l'échantillon, en tenant compte de la partie aliquote utilisée lors de la première extraction, selon la formule ci-après:

(10 a + b) 7 5

dans laquelle:

a = extrait éthéré en grammes de la partie aliquote, après la première extraction,

b = extrait éthéré en grammes après la deuxième extraction.

7.2. La prise d'essai des produits pauvres en matières grasses peut être portée à 5 g. (1)Remplacer les fragments de pierre ponce par des perles de verre lorsque la matière grasse doit faire l'objet d'examens qualitatifs ultérieurs.