QUATRIÈME DIRECTIVE DE LA COMMISSION du 5 décembre 1972 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (73/46/CEE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (1), modifée par la directive nº 72/275/CEE du 20 juillet 1972 (2), et notamment son article 2,

considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux, pour constater si les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;

considérant que les directives nº 71/250/CEE, nº 71/393/CEE et nº 72/199/CEE de la Commission, des 15 juin 1971 (3), 18 novembre 1971 (4) et 27 avril 1972 (5), ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires ; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une quatrième série de méthodes;

considérant que les mesures prévues à la présente directive sont conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne les teneurs en humidité des graisses et des huiles animales et végétales, ainsi que les teneurs en magnésium et en cellulose brute des aliments sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.

Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive nº 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.

Article 2

Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne leurs teneurs en rétinol (vitamine A), thiamine (aneurine, vitamine B 1), acides ascorbique et déhydroascorbique (vitamine C) sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.

Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive nº 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, à l'exception de la partie concernant la préparation de l'échantillon à analyser, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.

Article 3

Les États membres mettent en vigueur, le 1er janvier 1974 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.

Article 4

Les États membres sont destinataires de la présente directive.

Fait à Bruxelles, le 5 décembre 1972.

Par la Commission

Le président

S. L. MANSHOLT (1)JO nº L 170 du 3.8.1970, p. 2. (2)JO nº L 171 du 29.7.1972, p. 39. (3)JO nº L 155 du 12.7.1971, p. 13. (4)JO nº L 279 du 20.12.1971, p. 7. (5)JO nº L 123 du 29.5.1972, p. 6.

ANNEXE I

1. DOSAGE DE L'HUMIDITÉ DANS LES GRAISSES ET LES HUILES ANIMALES ET VÉGÉTALES

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité (eau et autres matières volatiles) des graisses et des huiles animales et végétales.

2. Principe

L'échantillon est soumis à la dessiccation à 103 ºC jusqu'à cessation de la diminution de masse. La perte de masse est déterminée par pesée.

3. Appareillage 3.1. Récipient à fond plat, en matériau résistant à la corrosion, diamètre : 8 à 9 cm, hauteur : 3 cm environ

3.2. Thermomètre à mercure, avec bulbe renforcé, et chambre de dilatation à l'extrémité supérieure, gradué de 80 ºC environ à 110 ºC au moins, longueur : 10 cm environ

3.3. Bain de sable ou plaque chauffante électrique

3.4. Dessiccateur, contenant un déshydratant efficace

3.5. Balance analytique

4. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 20 g environ de l'échantillon homogénéisé dans le récipient (3.1) sec et taré, contenant le thermomètre (3.2). Chauffer sur le bain de sable ou la plaque chauffante (3.3), en agitant constamment à l'aide du thermomètre, de façon que la température atteigne 90 ºC en 7 minutes environ.

Réduire l'intensité du chauffage en suivant la fréquence avec laquelle les bulles montent du fond du récipient. La température ne doit pas dépasser 105 ºC. Continuer à agiter en raclant le fond du récipient jusqu'à cessation de la formation de bulles.

Pour assurer l'élimination complète de l'humidité, répéter à plusieurs reprises le chauffage à 103 ºC ± 2 ºC, en refroidissant à 93 ºC entre les chauffages successifs. Laisser refroidir ensuite dans le dessiccateur (3.4) jusqu'à température ambiante et peser. Répéter cette opération jusqu'à ce que la perte de masse entre deux pesées successives n'excède plus 2 mg.

N.B. Une augmentation de masse de l'échantillon après chauffage répété indique une oxydation de la graisse. Dans ce cas, calculer le résultat à partir de la pesée effectuée immédiatement avant le début de l'augmentation de masse.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité pour cent d'échantillon est donnée par la formule: >PIC FILE= "T0006033">

dans laquelle:

Mo = masse, en grammes, de la prise d'essai,

M1 = masse, en grammes, du récipient avec son contenu, avant le chauffage,

M2 = masse, en grammes, du récipient avec son contenu, après le chauffage.

Les résultats inférieurs à 0,05 p. cent doivent être rapportés par la mention «moins de 0,05 p. cent».

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,05 p. cent en valeur absolue.

2. DOSAGE DU MAGNÉSIUM - par spectrophotométrie d'absorption atomique -

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser le magnésium dans les aliments des animaux. Elle est particulièrement indiquée pour déterminer les teneurs en magnésium inférieures à 5 p. cent.

2. Principe

L'échantillon est incinéré et mis en solution dans l'acide chlorhydrique dilué. S'il ne contient pas de substances organiques, il est mis directement en solution dans l'acide chlorhydrique dilué. La solution est diluée et la teneur en magnésium est déterminée par spectrophotométrie d'absorption atomique à 285,2 nm, par comparaison avec des solutions étalon.

3. Réactifs 3.1. Acide chlorhydrique p.a., d : 1,16

3.2. Acide chlorhydrique p.a., d : 1,19

3.3. Magnésium, en ruban ou en fil, ou sulfate de magnésium MgSO4.7H2O p.a. séché sous vide à la température ambiante

3.4. Solution de sel de strontium (chlorure ou nitrate) à 2,5 p. cent (p/v) de strontium (= 76,08 g de SrCl2.6H2O p.a./1 ou 60,38 g de Sr (NO3)2 p.a./1)

3.5. Solution étalon de magnésium : peser, à 1 mg près, 1 g de magnésium (3.3), préalablement débarrassé avec soin de sa pellicule d'oxyde, ou une quantité correspondante de sulfate de magnésium (3.3), l'introduire dans un ballon jaugé de 1 000 ml, ajouter 80 ml d'acide chlorhydrique (3.1), laisser dissoudre et compléter à 1 000 ml par de l'eau. 1 ml de cette solution contient 1,000 mg de magnésium.

4. Appareillage 4.1. Creusets à incinération en platine, quartz ou porcelaine

4.2. Four à moufle électrique, avec thermostat

4.3. Spectrophotomètre d'absorption atomique

5. Mode opératoire 5.1. Mise en solution 5.1.1. Aliments constitués exclusivement de substances minérales

Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon et les introduire dans un ballon jaugé de 500 ml avec 250 à 300 ml d'eau. Ajouter 40 ml d'acide chlorhydrique (3.1), amener à ébullition et maintenir le liquide en ébullition douce durant 30 minutes. Laisser refroidir, compléter au volume par de l'eau, homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.

En présence de silice, traiter 5 g de l'échantillon par une quantité suffisante (15 à 30 ml) d'acide chlorhydrique (3.2) et évaporer à sec sur un bain d'eau. Poursuivre comme indiqué en 5.1.2, à partir de la troisième phrase.

5.1.2. Aliments constitués essentiellement de substances minérales

Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon dans un creuset à incinération et incinérer à 550 ºC au four à moufle jusqu'à obtention de cendres exemptes de particules charbonneuses. Pour éliminer la silice, ajouter aux cendres une quantité suffisante (15 à 30 ml) d'acide chlorhydrique (3.2) et évaporer à sec sur un bain d'eau. Sécher ensuite durant une heure à l'étuve à 105 ºC. Reprendre le résidu par 10 ml d'acide chlorhydrique (3.1) et transférer à l'aide d'eau chaude dans un ballon jaugé de 500 ml. Amener à ébullition, laisser refroidir et compléter au volume par de l'eau. Homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.

5.1.3. Aliments constitués essentiellement de substances organiques

Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon dans un creuset à incinération et incinérer à 550 ºC dans un four à moufle, jusqu'à obtention de cendres exemptes de particules charbonneuses. Reprendre les cendres par 5 ml d'acide chlorhydrique (3.2), évaporer à sec sur un bain d'eau et sécher ensuite durant une heure à l'étuve à 105 ºC, pour insolubiliser la silice. Reprendre le résidu par 5 ml d'acide chlorhydrique (3.1), transférer à l'aide d'eau chaude dans un ballon jaugé de 250 ml, amener à ébullition, laisser refroidir et compléter au volume par de l'eau. Homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.

5.2. Mesure de l'absorption atomique

Préparer, en diluant la solution étalon (3.5) par de l'eau, au moins 5 solutions de référence de concentrations croissantes, choisies en fonction de la zone de mesure optimum du spectrophotomètre. Ajouter à chaque solution 10 ml de solution de sel de strontium (3.4) et compléter ensuite au volume à 100 ml par de l'eau.

Diluer par de l'eau une partie aliquote du filtrat obtenu en 5.1.1, 5.1.2. ou 5.1.3 de façon à obtenir une concentration en magnésium comprise dans les limites de concentration des solutions de référence. La concentration en acide chlorhydrique de cette solution ne doit pas dépasser 0,4 N. Ajouter 10 ml de solution de sel strontium (3.4) et compléter ensuite au volume à 100 ml par de l'eau.

Mesurer l'absorption de la solution à doser et des solutions de référence à la longueur d'onde de 285,2 nm.

6. Calcul des résultats

Calculer la quantité de magnésium de l'échantillon à partir des solutions de référence. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 5 p. cent, en valeur relative.

3. DOSAGE DE LA CELLULOSE BRUTE

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser, dans les aliments des animaux, les matières organiques exemptes de graisses et insolubles en milieu acide et en milieu alcalin, conventionnellement désignées sous le nom de cellulose brute.

2. Principe

L'échantillon, éventuellement dégraissé, est traité successivement par des solutions bouillantes d'acide sulfurique et d'hydroxyde de potassium de concentrations déterminées. Le résidu est séparé par filtration sur amiante, lavé, séché, pesé et calciné à 900 ºC. La perte de poids résultant de la calcination correspond à la cellulose brute de la prise d'essai.

3. Réactifs 3.1. Acide sulfurique 0,26 N

3.2. Amiante traitée : ajouter à une amiante pour creuset de Gooch environ 5 fois son poids d'acide chlorhydrique dilué (1 vol. d'acide chlorhydrique, d : 1,19 + 3 vol. d'eau). Faire bouillir le mélange durant 45 minutes environ, laisser refroidir, filtrer sur entonnoir Büchner. Laver le résidu d'abord à l'eau, jusqu'à disparition d'acide chlorhydrique dans les eaux de lavage, et ensuite à l'acétone (3.6). Sécher l'amiante dans l'étuve et la calciner ensuite durant 2 h à 900 ºC. Laisser refroidir et conserver en flacon bouché. L'amiante ainsi traitée peut être utilisée plusieurs fois. Elle doit répondre aux prescriptions données en 5.1 à propos de l'essai à blanc.

3.3. Émulsion d'antimousse (silicone, par ex.)

3.4. Solution d'hydroxyde de potassium 0,23 N

3.5. Acide chlorhydrique 0,5 N

3.6. Acétone, pur

3.7. Éther diéthylique, pur

4. Appareillage 4.1. Bechers de 600 ml au moins, marqués de traits de repère au niveau de 200 ml

4.2. Disques de porcelaine, diamètre : 80 mm environ, épaisseur : 4 mm environ, perforés d'environ 32 trous de 4 mm environ de diamètre

4.3. Fioles à vide de 2 l environ, à bouchon de caoutchouc, marquées de traits de repère au niveau de 800 ml et munies d'un entonnoir de verre de 120 mm de diamètre

4.4. Plaques filtrantes, diamètre : 40 mm environ, épaisseur : 4 mm environ, à bord oblique adapté au cône de l'entonnoir (4.3), perforées d'environ 16 trous de 4 mm environ de diamètre et recouvertes d'une grille métallique à mailles de 1 mm environ de côté. Les plaques et grilles métalliques doivent être inaltérables aux acides et aux alcalis

4.5. Creusets à incinération en platine ou en quartz

4.6. Four à moufle électrique, avec thermostat

4.7. Dessiccateur

4.8. Filtre d'amiante : mettre en suspension 2 g d'amiante (3.2) dans 100 ml d'eau. Filtrer sous vide sur une plaque filtrante recouverte d'une grille métallique (4.4) et placée dans l'entonnoir d'une fiole à vide (4.3). Recueillir le filtrat et le filtrer à nouveau sur le même filtre. Éliminer le filtrat

5. Mode opératoire

Peser 3 g de l'échantillon, à 1 mg près, et 2 g d'amiante traitée (3.2) dans un becher (4.1), ajouter 200 ml d'acide sulfurique (3.1) et quelques gouttes d'émulsion d'antimousse (3.3). Porter rapidement à ébullition et laisser bouillir pendant 30 minutes exactement. Pour maintenir le volume constant, couvrir le becher d'un dispositif refroidisseur, tel qu'un ballon à fond rond de 500 ml soumis à une circulation d'eau froide. Interrompre l'ébullition en ajoutant 50 ml environ d'eau froide et filtrer immédiatement sous vide sur un filtre d'amiante préalablement préparé comme indiqué en 4.8.

Laver le résidu par 5 portions de 100 ml environ d'eau très chaude pour obtenir un volume final de filtrat de 800 ml. Transférer quantitativement le résidu dans le becher (4.1), préalablement garni d'un disque de porcelaine (4.2) pour régulariser l'ébullition. Ajouter 200 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4). Porter rapidement à ébullition et laisser bouillir pendant 30 minutes exactement. Ajouter 50 ml environ d'eau froide et filtrer immédiatement sous vide sur un nouveau filtre d'amiante préalablement préparé comme indiqué en 4.8. Laver le résidu à l'aide d'eau très chaude jusqu'à neutralité des eaux de lavage (essai au papier de tournesol), puis à trois reprises par de l'acétone (3.6) (en tout 100 ml environ d'acétone).

Transférer quantitativement le résidu dans un creuset à incinération (4.5), le dilacérer, si nécessaire, et sécher dans l'étuve à 130 ºC jusqu'à poids constant.

Laisser refroidir en dessiccateur et peser rapidement. Introduire ensuite le creuset dans le four à moufle (4.6) et laisser calciner durant 30 minutes à 900 ºC. Laisser refroidir en dessiccateur et peser rapidement.

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire à l'amiante traitée (3.2), en l'absence d'échantillon. La perte de poids résultant de la calcination des 6 g d'amiante ne doit pas être supérieure à 10 mg.

6. Calcul des résultats

La teneur en cellulose brute pour cent d'échantillon est donnée par la formule: >PIC FILE= "T0006034">

dans laquelle:

a = perte de poids à la calcination, lors du dosage,

b = perte de poids à la calcination, lors de l'essai à blanc.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:

0,3 en valeur absolue, pour les teneurs en cellulose brute inférieures à 10 p. cent;

3 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs en cellulose brute égales ou supérieures à 10 p. cent.

7. Observations 7.1. Les aliments contenant plus de 10 p. cent de matières grasses doivent être dégraissés préalablement à l'analyse par de l'éther diéthylique. A cet effet, placer la prise d'essai (3 g pesés à 1 mg près) sur un filtre d'amiante (4.8). Couvrir 3 fois avec environ 50 ml d'éther diéthylique (3.7) et filtrer chaque fois sous vide avec précaution. Transférer quantitativement la prise d'essai dégraissée et l'amiante dans un becher (4.1) et poursuivre l'analyse comme indiqué en 5.

7.2. Les aliments contenant des matières grasses non directement extractibles doivent être dégraissés comme indiqué en 7.1 et être soumis, en outre, à un nouveau dégraissage après le lavage du résidu de l'attaque acide.

A cet effet, laver le résidu de cette attaque à trois reprises par de l'acétone (3.6) (en tout 100 ml), puis par 3 fois 50 ml d'éther diéthylique (3.7). Transférer ensuite quantitativement le résidu dans un becher (4.1) et poursuivre l'analyse comme indiqué en 5 deuxième paragraphe (traitement par la solution d'hydroxyde de potassium).

7.3. Dans le cas des aliments riches en calcium (plus de 2 p. 100 de calcium), placer la prise d'essai (3 g pesés à 1 mg près) dans un becher (4.1) avec 100 ml d'acide chlorhydrique 0,5 N (3.5) et laisser reposer à froid durant 5 minutes. Filtrer immédiatement et laver à l'eau froide. Utiliser comme adjuvant de filtration les 2 g d'amiante prévus pour l'ébullition avec l'acide sulfurique. Si la filtration s'avère difficile, diluer la suspension par de l'acétone. Procéder ensuite comme indiqué en 5.

ANNEXE II

1. DOSAGE DU RÉTINOL (VITAMINE A)

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser le rétinol (vitamine A) dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 10 000 UI/kg pour les aliments fortement pigmentés et de 4 000 UI/kg pour les autres produits (1). Les produits y sont classés en deux groupes, selon leur teneur présumée en rétinol:

Groupe A : teneurs inférieures à 200 000 UI/kg,

Groupe B : teneurs égales ou supérieures à 200 000 UI/kg.

2. Principe

L'échantillon est hydrolysé à chaud par une solution d'hydroxyde de potassium en milieu éthanolique et en présence d'un antioxygène ou en atmosphère d'azote. Le mélange est soumis à l'extraction par le 1,2-dichloréthane. L'extrait est évaporé à sec et repris par (1)1 UI = 0,3 ¶g de rétinol.

l'éther de pétrole. La solution est chromatographiée sur colonne d'oxyde d'aluminium (pour les produits du groupe B, la chromatographie n'est requise que dans certains cas). Le rétinol est dosé par spectrophotométrie à 610 nm après développement d'un complexe coloré selon la réaction de Carr-Price, dans le cas des produits du groupe A ; par spectrophotométrie dans l'UV à 325 nm dans le cas des produits du groupe B.

3. Réactifs a) utilisés pour l'analyse des produits des groupes A et B 3.1. Éthanol à 96 p. cent (v/v)

3.2. Solution à 10 p. cent (p/v) d'ascorbate de sodium p.a., ou

3.3. Azote, purifié

3.4. Solution à 50 p. cent (p/v) d'hydroxyde de potassium p.a.

3.5. Solution d'hydroxyde de potassium 1 N

3.6. Solution d'hydroxyde de potassium 0,5 N

3.7. 1,2-dichloréthane p.a.

3.8. Éther de pétrole, pur, ébullition 30-50 ºC. Si nécessaire, purifier comme suit. Agiter 1 000 ml d'éther de pétrole avec des portions de 20 ml d'acide sulfurique concentré jusqu'à ce que l'acide reste incolore. Éliminer l'acide et laver l'éther successivement par 500 ml d'eau, deux fois 250 ml d'une solution à 10 p. cent d'hydroxyde de sodium et trois fois 500 ml d'eau. Éliminer la couche aqueuse, sécher l'éther durant 1 h sur charbon actif et sulfate de sodium anhydre, filtrer et distiller

3.9. Oxyde d'aluminium, standardisé selon Brockmann : calciner durant 8 h à 750 ºC, refroidir en dessiccateur et conserver en flacon de verre brun, à bouchon rodé. Avant l'utilisation en chromatographie, humidifier comme suit : introduire dans un flacon de verre brun 10 g d'oxyde d'aluminium et 0,7 ml d'eau, boucher hermétiquement, réchauffer durant 5 minutes dans un bain d'eau bouillante tout en agitant énergiquement. Laisser refroidir en agitant. Vérifier l'activité de l'oxyde d'aluminium ainsi préparé en soumettant à l'analyse selon 5.3 et 5.4 une quantité connue de rétinol étalon (3.17)

3.10. Oxyde d'aluminium basique, degré d'activité I

3.11. Éther diéthylique, pur. Éliminer les peroxydes et les traces d'eau par chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium basique (3.10) (25 g d'oxyde d'aluminium pour 250 ml d'éther diéthylique)

3.12. Solutions d'éther de pétrole (3.8) à 4, 8, 12, 16 et 20 p. cent (v/v) d'éther diéthylique (3.11)

3.13 Solution de sulfure de sodium 0,5 mole dans la glycérine à 70 p. cent (v/v), préparée à partir de sulfure de sodium p.a.

b) utilisés exclusivement pour l'analyse des produits du groupe A 3.14. Benzène p.a., cristallisable

3.15. Chloroforme p.a. Éliminer l'éthanol, le phosgène et les traces d'eau par chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium basique (3.10) (50 g d'oxyde d'aluminium pour 200 ml de chloroforme) il convient de chromatographier une seconde fois les 50 premiers ml d'éluat)

3.16. Réactif selon Carr-Price : Agiter 25 g environ de trichlorure d'antimoine p.a. (conservé en dessiccateur) avec 100 ml de chloroforme (3.15) jusqu'à saturation de la solution. Un faible dépôt de trichlorure d'antimoine ne gêne pas. Ajouter 2 ml d'anhydride acétique p.a. Conserver en glacière dans un flacon de verre brun à bouchon rodé. Durée de conservation : plusieurs semaines

3.17. Rétinol étalon, contrôlé par spectrophotométrie

c) utilisés exclusivement pour l'analyse des produits du groupe B 3.18. Isopropanol, pour chromatographie

4. Appareillage 4.1. Bain d'eau

4.2. Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballons ronds de différentes capacités

4.3. Tubes pour chromatographie, en verre (longueur : 300 mm, diamètre intérieur : 13 mm environ)

4.4. Spectrophotomètre avec cuvettes de 10 mm d'épaisseur (en quartz pour mesures dans l'UV)

4.5. Lampe UV, 365 nm

5. Mode opératoire

N.B. Toutes les manipulations doivent se faire à l'abri de la lumière directe, éventuellement dans un appareillage de verre brun 5.1. Prise d'essai

Prélever une prise d'essai de l'échantillon finement divisé, proportionnelle à la teneur présumée en vitamine A, soit:

0,1 à 1,0 g pour les concentrats (teneurs supérieures à 20 000 UI/g),

3,0 à 5,0 g pour les prémélanges (teneurs comprises entre 400 et 20 000 UI/g),

10 à 20 g pour les mélanges minéraux,

30 g pour les produits du groupe A.

Introduire immédiatement la prise d'essai dans un ballon de 500 ml à bouchon rodé.

5.2. Hydrolyse et extraction (1)

Ajouter successivement à la prise d'essai 40 ml d'éthanol (3.1), 2 ml de solution d'ascorbate de sodium (3.2) (2), 10 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (3.13).

Chauffer durant 30 minutes à 70-80 ºC sous réfrigérant à reflux et laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 50 ml d'éthanol (3.1) et 100 ml (prélevés à la pipette) de 1,2-dichloréthane (3.7). Agiter énergiquement et décanter le liquide surnageant dans une ampoule à décanter. Ajouter dans l'ampoule 150 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.5), agiter durant 10 secondes et laisser reposer jusqu'à séparation des phases. Recueillir la phase dichloréthanique (phase inférieure) dans une ampoule à décanter, ajouter 40 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.6), agiter durant 10 secondes et laisser reposer jusqu'à séparation des phases. Recueillir la phase dichloréthanique dans une ampoule à décanter et laver 6 à 8 fois à l'aide de portions de 40 ml d'eau, jusqu'à absence d'alcali (essai à la phénolphtaléine). Recueillir la phase dichloréthanique et éliminer les dernières traces d'eau à l'aide de bandes de papier-filtre.

Évaporer à sec une partie aliquote de la solution, sous vide et sur bain d'eau à la température de 40 ºC. Reprendre rapidement le résidu par 5 ml d'éther de pétrole (3.8).

Pour les produits du groupe A, chromatographier comme indiqué en 5.3.1.

Pour les produits du groupe B, transférer la solution dans un ballon jaugé de 50 ml, compléter au volume par de l'éther de pétrole (3.8) homogénéiser et mesurer la densité optique comme indiqué en 5.4.2.

5.3. Chromatographie 5.3.1. Produits du groupe A

Remplir un tube pour chromatographie (4.3), jusqu'à une hauteur de 200 mm, d'oxyde d'aluminium (3.9) préalablement imprégné d'éther de pétrole (3.8). Introduire dans le tube la solution obtenue en 5.2 et ajouter immédiatement (1)Pour les aliments d'allaitement et les produits tendant à s'agglomérer ou à gonfler, doubler la quantité des réactifs indiqués sous 5.2 premier et deuxième alinéas. (2)L'addition d'ascorbate de sodium n'est pas nécessaire lorsque l'hydrolyse est effectuée en atmosphère d'azote.

20 ml d'éther de pétrole (3.8). Éluer successivement par des portions de 10 ml des solutions d'éther de pétrole à 4, 8, 12, 16 et 20 p. cent d'éther diéthylique (3.12), sous vide partiel ou sous pression, la vitesse d'écoulement étant de 2 à 3 gouttes par seconde.

Le carotène est élué en premier lieu (1). Le rétinol est généralement élué par la solution d'éther de pétrole à 20 p. cent d'éther diéthylique (3.12). L'éluation est contrôlée sous lumière UV (brève irradiation de la colonne par une lampe au mercure). La bande fluorescente du rétinol se sépare nettement des bandes jaunes de xanthophylle qui la suivent. Recueillir la fraction de l'éluat contenant le rétinol dans un erlenmeyer.

5.3.2. Produits du groupe B

La chromatographie ne doit être effectuée que si les mesures de la densité optique obtenues en 5.4.2 ne sont pas conformes aux prescriptions indiquées en 5.4.2.

Si la chromatographie s'avère nécessaire, introduire dans la colonne chromatographique une partie aliquote de la solution dans l'éther de pétrole obtenue en 5.2, contenant environ 500 UI de rétinol, et chromatographier comme indiqué en 5.3.1.

5.4. Mesure de la densité optique 5.4.1. Produits du groupe A

Évaporer à sec, sous vide, l'éluat contenant le rétinol, obtenu en 5.3.1. Reprendre le résidu par 2 ml de benzène (3.14). Prélever 0,3 ml de cette solution et ajouter 3 ml du réactif selon Carr-Price (3.16). Il se développe une coloration bleue. Mesurer la densité optique au spectrophotomètre à 610 nm, 30 secondes exactement après le début de la réaction. Déterminer la teneur en rétinol, en se référant à une courbe d'étalonnage obtenue à partir de solutions benzéniques de concentrations croissantes en rétinol étalon traitées par le réactif selon Carr-Price (2 à 16 UI de vitamine A étalon (3.17) par 0,3 ml de benzène (3.14) + 3 ml du réactif selon Carr-Price (3.16). La courbe d'étalonnage doit être contrôlée régulièrement et à brefs intervalles de temps à l'aide de l'étalon et d'une solution fraîchement préparée du réactif selon Carr-Price.

5.4.2. Produits du groupe B

Prélever une partie aliquote de la solution dans l'éther de pétrole obtenue en 5.2, contenant environ 200 UI de rétinol. Évaporer à sec, sous vide, et reprendre le résidu par 25 ml d'isopropanol (3.18). Mesurer la densité optique au spectrophotomètre à 325, 310 et 334 nm. Le maximum d'absorption se situe à 325 nm. La teneur en rétinol A de la solution est calculée comme suit:

E325 7 18,30 = UI de rétinol

Toutefois, les rapports des densités optiques

E310 : E325 et E334 : E325

doivent être de 6 : 7 = 0,857.

Si l'un de ces rapports s'écarte sensiblement de cette valeur ( 0,880), la mesure des densités optiques doit être précédée d'une chromatographie, selon le procédé indiqué en 5.3.2. Si la mesure des densités optiques effectuée après la chromatographie indique que les rapports ci-dessus mentionnés s'écartent encore sensiblement de la valeur 0,857 (0,880), le dosage doit être effectué selon le procédé indiqué pour les produits du groupe A.

6. Calcul des résultats

Calculer la teneur en rétinol de l'échantillon en tenant compte du poids de la prise d'essai et des dilutions effectuées au cours de l'analyse. Exprimer le résultat en UI de rétinol par kg. (1) >PIC FILE= "T0006035">

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser: - 20 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs en rétinol inférieures à 75 000 UI/kg,

- 15 000 UI pour les teneurs comprises entre 75 000 et 150 000 UI/kg,

- 10 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs comprises entre 150 000 et 250 000 UI/kg,

- 25 000 UI pour les teneurs comprises entre 250 000 et 500 000 UI/kg,

- 5 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs supérieures à 500 000 UI/kg.

2. DOSAGE DE LA THIAMINE (ANEURINE, VITAMINE B1)

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser la thiamine (aneurine, vitamine B1) dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm.

2. Principe

L'échantillon est traité à chaud par l'acide sulfurique dilué et hydrolysé ensuite par voie enzymatique. La solution obtenue est soumise à une oxydation alcaline. Le thiochrome formé est extrait par l'isobutanol et dosé par fluorimétrie.

3. Réactifs 3.1. Solution étalon de thiamine à 100 ¶g/ml : dissoudre 112,3 mg de chlorhydrate de thiamine très pur, préalablement desséché sous vide jusqu'à poids constant, dans 1 000 ml d'acide sulfurique 0,2 N (3.2). Au froid et à l'obscurité, cette solution est stable durant un mois

3.2. Acide sulfurique 0,2 N

3.3. Métabisulfite de sodium, Na2S2O5, pur

3.4. Solution à 20 p. cent (p/v) de ferricyanure de potassium p.a.

3.5. Solution à 25 p. cent (p/v) d'hydroxyde de potassium p.a.

3.6. Mélange oxydant : mélanger 2 ml de solution de ferricyanure de potassium (3.4) à 48 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.5). Ce mélange ne se conserve pas plus de 4 h

3.7. Isobutanol, p.a.

3.8. Solution d'acétate de sodium 2,5 N

3.9. Préparation multienzymatique contenant de la protéase, de la phosphatase et de l'amylase (par ex. clarase)

3.10. Éthanol à 96 p. cent (v/v)

4. Appareillage 4.1. Bain d'eau

4.2. Centrifugeuse (3 500 t/m) avec tubes de 30 à 50 ml, munis de bouchons rodés

4.3. Fluorimètre

5. Mode opératoire 5.1. Hydrolyse enzymatique

Introduire dans deux ballons jaugés A et B de 250 ml des quantités identiques de l'échantillon finement divisé, contenant 100 ¶g environ de thiamine et 125 ml d'acide sulfurique (3.2). Ajouter en outre, dans le ballon A seulement, 1,0 ml de solution étalon (3.1) (étalon interne).

Agiter vigoureusement, porter les ballons sur un bain d'eau bouillante et les y maintenir durant 15 minutes en agitant de temps en temps. Laisser refroidir jusqu'à 45 ºC environ. Ajouter dans chaque ballon 20 ml de solution d'acétate de sodium (3.8) et 0,5 g de préparation multienzymatique (3.9), laisser ensuite reposer durant 20 minutes à la température ambiante. Ajouter 20 ml de solution d'acétate de sodium (3.8), compléter au volume par de l'eau, homogénéiser et filtrer. Recueillir les filtrats A et B après en avoir éliminé les 15 premiers ml. Préparer les solutions suivantes. 5.1.1. Solution témoin T

Introduire dans un tube à centrifuger (4.2), 5 ml du filtrat A et 10 mg environ de métabisulfite de sodium (3.3). Plonger le tube durant 15 minutes dans un bain d'eau bouillante et laisser ensuite refroidir jusqu'à température ambiante.

5.1.2. Solutions A (étalon interne) et B (échantillon)

Introduire 5 ml du filtrat A dans un tube à centrifuger (4.2) et 5 ml du filtrat B dans un autre tube à centrifuger (4.2).

5.2. Oxydation

Ajouter aux solutions T, A et B 5 ml du mélange oxydant (3.6) et, après une minute, 10 ml d'isobutanol (3.7). Boucher les tubes et agiter vigoureusement durant 5 secondes. Laisser reposer durant une minute et centrifuger pour séparer les phases. Prélever dans chaque tube 5 ml de la phase isobutanolique surnageante, les introduire respectivement dans des ballons jaugés de 25 ml, compléter au volume par de l'éthanol (3.10) et homogénéiser (= extraits T, A et B).

5.3. Mesure de la fluorescence

Effectuer les mesures à la longueur d'onde pour laquelle le fluorimètre donne une réponse optimale à la fluorescence du thiochrome. Irradier à 365 nm environ.

Ajuster l'instrument au zéro à l'aide de l'extrait T. Mesurer l'intensité de la fluorescence des extraits A et B.

6. Calcul des résultats

La teneur en ¶g de thiamine par kg d'échantillon est donnée par la formule: >PIC FILE= "T0006036">

dans laquelle:

a = intensité de la fluorescence de l'extrait A (étalon interne)

b = intensité de la fluorescence de l'extrait B (échantillon)

c = poids de la prise d'essai en g

d = quantité de thiamine en ¶g ajoutée à la prise d'essai (étalon interne).

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:

10 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs inférieures à 500 ppm et

5 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs égales ou supérieures à 500 ppm.

3. DOSAGE DE L'ACIDE ASCORBIQUE ET DE L'ACIDE DÉHYDROASCORBIQUE (VITAMINE C)

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser la somme des acides ascorbique et déhydroascorbique (vitamine C) dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm. Les produits y sont classés en deux groupes, selon leur teneur présumée en vitamine C:

Groupe A : teneurs inférieures à 10 g/kg

Groupe B : teneurs égales ou supérieures à 10 g/kg.

2. Principe

L'échantillon, mis en suspension dans une solution diluée d'acide métaphosphorique, est soumis à l'extraction par le chloroforme. La phase aqueuse est traitée par une solution de 2,6-dichlorophénol-indophénol, pour transformer l'acide ascorbique en acide déhydroascorbique, et ensuite par une solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine. L'hydrazone formée est extraite par un mélange d'acétate d'éthyle, d'acide acétique glacial et d'acétone. La solution est chromatographiée sur une colonne de gel de silice, l'éluat est évaporé à sec et le résidu est dissous dans l'acide sulfurique dilué. La densité optique de la solution est mesurée au photomètre à 509 nm.

Pour les produits du groupe A, l'éluat, issu de la chromatographie sur colonne, est soumis, en outre, à une chromatographie sur couche mince pour isoler l'hydrazone.

3. Réactifs 3.1. Solution étalon à 0,05 p. cent d'acide L-ascorbique : dissoudre 50 mg d'acide L-ascorbique p.a. dans 20 ml environ de solution d'acide métaphosphorique (3.2) et compléter à 100 ml par de l'eau. Préparer immédiatement avant l'emploi

3.2. Solution à 10 p. cent (p/v) d'acide métaphosphorique : dissoudre dans l'eau 200 g d'acide métaphosphorique p.a., broyés au mortier, et compléter à 2 000 ml par de l'eau. Conserver à 4 ºC. Renouveler après une semaine

3.3. Chloroforme p.a.

3.4. Solution à 0,5 p. cent (p/v) de 2,6-dichlorophénol-indophénol p.a. Préparer immédiatement avant l'emploi

3.5. Auxiliaire de filtration (S. et S. nº 121 ou équivalent)

3.6. Solution acide à 2 p. cent (p/v) de 2,4-dinitrophénylhydrazine : dissoudre 2 g de 2,4-dinitrophénylhydrazine dans 100 ml d'acide sulfurique dilué (25 ml d'acide sulfurique p.a., d : 1,84, dilués à 100 ml par de l'eau). Au froid, cette solution se conserve une semaine

3.7. Azote, ou

3.8. Anhydride carbonique

3.9. Mélange d'acétate d'éthyle p.a./acide acétique glacial/acétone p.a. : 96/2/2 en vol

3.10. Mélange de dichlorométhane p.a./acide acétique glacial : 97/3 en vol

3.11. Gel de silice, granulométrie : 0,05 à 0,2 mm

3.12. Gel de silice H, selon Stahl, pour chromatographie sur couche mince

3.13. Acide sulfurique dilué : introduire 105 ml d'eau dans un ballon jaugé de 200 ml, compléter au volume par de l'acide sulfurique p.a., d : 1,84

3.14. Solvant d'élution pour chromatographie sur couche mince : mélanger 75 ml d'éther diéthylique p.a., 25 ml d'acétate d'éthyle p.a. et 4,0 ml d'acide acétique à 96 p. cent (p/v) p.a. Renouveler après 2 à 3 chromatographies

4. Appareillage 4.1. Bain d'eau réglé à 20 ºC par l'ultrathermostat

4.2. Centrifugeuse (3 500 t/m) avec tubes de 40 à 50 ml, munis de bouchons rodés

4.3. Appareil rotatif, à évaporation sous vide, avec ballons de 250 ml

4.4. Tubes pour chromatographie, en verre (longueur : 100 mm, diamètre intérieur : 20 mm), avec plaque de verre fritté (par ex. tubes d'Allihn)

4.5. Spectrophotomètre ou colorimètre à filtres, avec cuvettes de 10 mm d'épaisseur

4.6. Appareillage pour chromatographe sur couche mince, avec plaques de gel de silice (3.12), épaisseur de couche : 0,5 à 0,6 mm (les plaques prêtes à l'emploi conviennent). Sécher les plaques durant 2 h 30 à 3 h dans l'étuve à 120-130 ºC. Laisser refroidir et conserver ensuite en dessiccateur durant 24 h au moins avant l'emploi

4.7. Étuve, réglée à 120-130 ºC.

5. Mode opératoire 5.1. Extraction

Introduire dans deux ballons jaugés, A et B, de 250 ml à bouchon rodé, des quantités identiques de l'échantillon finement divisé, contenant 200 ¶g environ de vitamine C. Ajouter, dans le ballon A seulement, 0,4 ml de solution étalon (3.1) et homogénéiser en secouant légèrement (étalon interne).

Ajouter dans chaque ballon 30 ml de chloroforme (3.3) et 25 ml de solution d'acide métaphosphorique (3.2) à 4 ºC. Agiter brièvement et laisser ensuite reposer 10 à 15 minutes. Ajouter 25 ml d'eau, boucher les ballons, agiter vigoureusement durant 10 secondes et laisser reposer 10 à 15 minutes dans le bain d'eau (4.1). Centrifuger pour séparer la phase aqueuse de la phase chloroformique. Poursuivre les opérations simultanément sur les extraits aqueux A (étalon interne) et B, comme indiqué ci-après.

5.2. Oxydation

Prélever à la pipette 40 ml de la solution aqueuse surnageante (légèrement trouble) obtenue en 5.1, les introduire dans un tube à réaction à bouchon rodé, ajouter 0,5 à 1 ml de solution de 2,6-dichlorophénol-indophénol (3.4) et homogénéiser. Il se forme une coloration rouge qui doit persister 15 minutes au moins. Ajouter ensuite 300 mg environ d'auxiliaire de filtration (3.5), agiter et filtrer sur un filtre à plis sec. Le filtrat ne doit pas nécessairement être limpide.

5.3. Réaction avec la 2,4-dinitrophénylhydrazine et extraction de l'hydrazone

Prélever à la pipette 10 ml du filtrat obtenu en 5.2, les introduire dans un tube à centrifuger (4.2), ajouter 2 ml de solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine (3.6) et homogénéiser. Faire passer rapidement dans le tube un courant d'azote (3.7) ou d'acide carbonique (3.8), boucher le tube et le plonger durant 15 h environ (une nuit) dans le bain d'eau (4.1). Ajouter ensuite 3 ml d'eau, 20 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9) et 800 mg environ d'auxiliaire de filtration (3.5). Boucher le tube, agiter vigoureusement durant 30 secondes et centrifuger. Introduire 15 ml de la phase surnageante dans un ballon à évaporation et évaporer sous pression réduite dans l'évaporateur rotatif (4.3) jusqu'à obtention d'un résidu huileux. Dissoudre le résidu dans 2 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9) en réchauffant à 50 ºC, laisser refroidir, ajouter 10 ml du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10) et homogénéiser.

5.4. Chromatographie sur colonne

Remplir un tube pour chromatographie (4.4) jusqu'à une hauteur de 30 mm, du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10). Mettre en suspension (en agitant vigoureusement) 5 g de gel de silice (3.11) dans 30 ml du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10), verser la suspension dans le tube. Laisser déposer et tasser ensuite sous faible pression d'azote (3.7).

Transvaser dans le tube la solution obtenue en 5.3, rincer le ballon avec une petite quantité du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10) et transvaser dans le tube, remplir ensuite celui-ci du mélange (3.10) et poursuivre le lavage de la colonne avec le même mélange (3 à 4 portions de 5 ml environ) jusqu'à obtention d'un éluat incolore. Éliminer la fraction de l'éluat colorée en jaune.

Éluer la zone rougeâtre en tête de colonne par le mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9), recueillir l'éluat et l'évaporer à sec. 5.4.1. Pour les produits du groupe A (teneurs en vitamine C inférieures à 10 g/kg) dissoudre le résidu dans 2,0 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9) et procéder immédiatement à la chromatographie sur couche mince comme indiqué en 5.5.

5.4.2. Pour les produits du groupe B (teneurs en vitamine C égales ou supérieures à 10 g/kg), reprendre le résidu huileux par 4,0 ml d'acide sulfurique dilué (3.13), agiter vigoureusement pour dissoudre complètement le résidu et procéder à la mesure de la densité optique comme indiqué en 5.6.

5.5 Chromatographie sur couche mince

Effectuer les opérations indiquées ci-après en double. Déposer sous forme de trait sur la plaque pour chromatographie sur couche mince (4.6) 0,5 ml de la solution obtenue en 5.4.1. Développer durant 20 minutes au moins à l'acide du solvant d'élution (3.14), en cuve saturée, jusqu'à séparation nette de la zone de l'hydrazone colorée en rose. Laisser sécher à l'air. Délimiter la zone rose, racler celle-ci à l'aide d'une spatule et transférer quantitativement la masse pulvérulente dans un tube pour chromatographie (4.4).

Éluer successivement une fois par 2 ml et deux fois par 1,5 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9). Recueillir l'éluat dans un petit ballon (la dernière fraction doit être incolore). Évaporer à sec, reprendre le résidu huileux par 4,0 ml d'acide sulfurique dilué (3.13), agiter vigoureusement pour dissoudre complètement le résidu et procéder à la mesure de la densité optique.

5.6. Mesure de la densité optique

Mesurer la densité optique au photomètre à 509 nm, 20 à 30 minutes après la mise en solution du résidu dans l'acide sulfurique. Effectuer les mesures par comparaison avec de l'acide sulfurique dilué (3.13).

5.7. Essai à blanc

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire en l'absence d'échantillon.

6. Calcul des résultats

La teneur en g de vitamine C par kg d'échantillon est donnée par la formule: >PIC FILE= "T0006037">

dans laquelle:

a = densité optique du blanc

b = densité optique de la solution de l'étalon interne

c = densité optique de la solution de l'échantillon

d = poids en grammes de la prise d'essai.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs en vitamine C inférieures à 10 g/kg et 5 p. cent, en valeur relative, pour les teneurs égales ou supérieures à 10 g/kg.