DIRECTIVE 2006/56/CE DE LA COMMISSION

du 12 juin 2006

modifiant les annexes de la directive 93/85/CEE du Conseil concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu la directive 93/85/CEE du Conseil du 4 octobre 1993 concernant la lutte contre le flétrissement bactérien de la pomme de terre (1), et notamment son article 12,

considérant ce qui suit:

Un des organismes nuisibles que l’on trouve sur la pomme de terre est le Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., agent pathogène de la maladie dite «flétrissement bactérien de la pomme de terre» (ci-après dénommé «agent pathogène»).

La directive 93/85/CEE du Conseil a défini les mesures détaillées que les États membres doivent prendre contre cet organisme afin de le localiser et d’en déterminer la diffusion, d’en prévenir l’apparition et la propagation et, s’il est détecté, d’en prévenir la propagation et de le combattre en vue de son éradication.

En ce qui concerne les procédures de détection et d’identification, il s’agit d’y incorporer des méthodes récemment mises au point, à savoir l’hybridation fluorescente in situ (FISH) et l’amplification en chaîne par polymérase (PCR), ainsi que des améliorations relatives à divers éléments techniques de la procédure actuelle de détection et d’identification.

En ce qui concerne les éléments techniques des mesures de lutte, des dispositions améliorées ont été prévues pour le mode de conservation des échantillons testés afin de garantir la traçabilité de l’organisme, les éléments nécessaires pour déterminer l’étendue de la contamination probable, les modalités de notification d’une présence confirmée de l’organisme et de la zone contaminée considérée ainsi que les mesures de mise en œuvre dans les lieux de production désignés comme contaminés et dans les zones délimitées.

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

Les annexes de la directive 93/85/CEE sont remplacées par les textes correspondants figurant dans l’annexe de la présente directive.

Article 2

1. Les États membres adoptent et publient, le 31 mars 2007 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive. Ils communiquent immédiatement à la Commission le texte de ces dispositions ainsi qu’un tableau de correspondance entre ces dispositions et la directive.

Ils appliquent ces dispositions à compter du 1er avril 2007.

Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées de cette référence lors de leur publication officielle. Les modalités de ladite référence sont arrêtées par les États membres.

2. Les États membres communiquent immédiatement à la Commission le texte des principales dispositions de droit national qu’ils adoptent dans le domaine régi par la présente directive.

Article 3

La présente directive entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l’Union européenne.

Article 4

Les États membres sont destinataires de la présente directive.

(1) JO L 259 du 18.10.1993, p. 2.

ANNEXE I

PROTOCOLE DE TEST EN VUE DU DIAGNOSTIC, DE LA DÉTECTION ET DE L’IDENTIFICATION DE L’AGENT RESPONSABLE DU FLÉTRISSEMENT BACTÉRIEN DE LA POMME DE TERRE, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

CHAMP D’APPLICATION DU PROTOCOLE DE TEST

Le protocole présenté ci-dessous décrit les différentes étapes à suivre pour:

i) le diagnostic du flétrissement bactérien sur les tubercules et sur les plants de pomme de terre;

ii) la détection de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sur des échantillons de tubercules et de plants de pomme de terre;

iii) l’identification de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. ssp. sepedonicus).

PRINCIPES GÉNÉRAUX

Les protocoles optimisés pour les différentes méthodes, les réactifs validés et les modalités de la préparation du matériel nécessaire aux tests et aux contrôles figurent dans les appendices. Une liste des laboratoires retenus pour l’optimisation et la validation des protocoles est fournie à l’appendice 1.

Étant donné que les protocoles impliquent la détection d’un organisme nuisible à mettre en quarantaine et incluent l’utilisation de cultures viables de C. m. ssp. sepedonicus en tant que matériels de contrôle, il est nécessaire de mettre en œuvre les procédures dans des conditions de quarantaine appropriées, au moyen des installations adéquates d’élimination des déchets et dans le respect des exigences liées aux licences appropriées délivrées par les autorités officielles de quarantaine.

Les paramètres des tests doivent garantir une détection cohérente et reproductible des taux de C. m. ssp. sepedonicus aux seuils fixés pour les méthodes sélectionnées.

La préparation précise de témoins positifs est impérative.

La réalisation des tests selon les seuils requis implique également l’établissement de paramètres corrects, la maintenance et le calibrage des équipements, la manipulation et la conservation soigneuse des réactifs et toutes les mesures visant à empêcher la contamination entre échantillons, comme la séparation des témoins positifs et des échantillons des tests. Des normes de contrôle de la qualité doivent être appliquées pour éviter toute erreur, notamment d’ordre administratif, dans l’étiquetage et la documentation.

L’apparition suspectée d’un foyer, au sens de l’article 4, paragraphe 2, de la directive 93/85/CEE, implique une réaction positive aux tests de diagnostic ou de dépistage réalisés sur un échantillon, comme cela est indiqué dans les diagrammes.

Si le premier test de dépistage (IF ou PCR/FISH) est positif, il y a suspicion de contamination par le Cms, et un second test de dépistage doit être effectué. Si le second test de dépistage est positif, la suspicion est confirmée (apparition suspectée), et il y a lieu de poursuivre les tests conformément au protocole. Si le second test de dépistage est négatif, l’échantillon est considéré comme non contaminé par le Cms.

La réaction positive au test d’immunofluorescence visée à l’article 4, paragraphe 2, est donc définie comme une réaction positive au test d’immunofluorescence confirmée par un second test de dépistage (PCR/FISH).

La présence confirmée visée à l’article 5, paragraphe 1, de la directive 93/85/CEE implique l’isolement et l’identification d’une culture pure de C. m. ssp. sepedonicus avec confirmation de la pathogénicité.

1. PRÉSENTATION DU DIAGRAMME FONCTIONNEL

1.1. Protocole de détection en vue du diagnostic du flétrissement bactérien sur des tubercules et des plants de pomme de terre présentant des symptômes de la maladie

La procédure de test concerne les tubercules de pomme de terre et les plants présentant des symptômes caractéristiques du flétrissement bactérien ou permettant d’en suspecter la présence. Elle comporte un test rapide de dépistage, l’isolement de l’organisme pathogène à partir du tissu vasculaire infecté sur des milieux de diagnostic et, en cas de résultat positif, l’identification de la culture comme étant C. m. ssp. sepedonicus.

1.2. Protocole de détection et d’identification de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sur des échantillons de tubercules de pommes de terre asymptomatiques

Principe

La procédure de test vise à détecter des infections latentes de tubercules de pomme de terre. Tout résultat positif d’au moins deux tests de dépistage, fondés sur des principes biologiques différents, doit être complété par l’isolement de l’organisme pathogène, suivi, en cas d’isolement de colonies caractéristiques, de la confirmation d’une culture pure comme étant C. m. ssp. sepedonicus. Le résultat positif d’un unique test de dépistage n’est pas suffisant pour que l’échantillon soit considéré comme suspect.

Les tests de dépistage et les tests d’isolement doivent autoriser des seuils de détection compris entre 103 et 104 cellules/ml d’extrait concentré remis en suspension, inclus à titre de témoins positifs dans chaque série de tests.

1.3. Protocole de détection et d’identification de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sur des échantillons de plants de pomme de terre asymptomatiques

2. RECHERCHE VISUELLE DES SYMPTÔMES DU FLÉTRISSEMENT BACTÉRIEN

2.1. Plants de pomme de terre

Dans le contexte climatique européen, il est rare d’observer les symptômes dans les champs, et lorsque c’est le cas, ce n’est possible qu’en fin de saison. En outre, il arrive fréquemment que les symptômes soient masqués par ceux d’autres maladies, par des dommages mécaniques ou par la sénescence, ou soient confondus avec eux. Les symptômes peuvent donc facilement passer inaperçus lors d’inspections sur place. Les symptômes du flétrissement sont très différents de ceux qui caractérisent le flétrissement bactérien. D’une manière générale, le premier progresse en effet lentement et se limite initialement au bord des feuilles. Les jeunes feuilles infectées continuent souvent à se développer, mais de façon moins marquée aux endroits infectés, ce qui donne aux feuilles des formes irrégulières. Les feuilles touchées par l’obstruction des tissus vasculaires situés plus bas sur la tige développent fréquemment des tâches chlorotiques intercostales de couleur jaune ou orange. Il arrive que les folioles, les feuilles et même les tiges infectées finissent par mourir. Souvent, les feuilles et les tubercules sont simplement rabougris. Il arrive occasionnellement de constater une atrophie des plants. Des illustrations en couleurs d’une série de symptômes sont présentées à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2. Tubercules de pomme de terre

Les premiers symptômes sont, surtout près du talon, un aspect légèrement vitreux ou translucide du tissu, sans ramollissement autour du système vasculaire. L’anneau vasculaire peut présenter, au talon, une couleur légèrement plus foncée que la normale. Les premiers symptômes aisément identifiables sont une coloration jaunâtre de l’anneau vasculaire et le fait que, lorsqu’on presse doucement le tubercule, des colonnes de matière ressemblant à du fromage sortent des vaisseaux. Cet exsudat contient des millions de bactéries. Un brunissement du tissu vasculaire peut apparaître. À ce stade, le bulbe présente des symptômes semblables à ceux du flétrissement bactérien à Ralstonia solanacearum. Dans un premier temps, ces symptômes peuvent se limiter à une partie de l’anneau, qui n’est pas nécessairement proche du talon, avant de se propager graduellement à l’ensemble de l’anneau. Au fur et à mesure de la progression de l’infection, les tissus vasculaires sont détruits et le cortex extérieur peut se séparer du cortex intérieur. Aux stades avancés de l’infection, des fissures, aux bords souvent rouge-brun, apparaissent à la surface du tubercule. Dans plusieurs cas observés récemment en Europe, on constate un pourrissement simultané du cortex central et de l’anneau vasculaire entraînant une infestation secondaire avec creusement interne et nécrose. Une infestation fongique ou bactérienne secondaire peut masquer les symptômes et il peut être malaisé, voire impossible, de distinguer les symptômes avancés du flétrissement bactérien de ceux d’autres pourritures des tubercules. Des formes asymptomatiques ne sont pas à exclure. Des illustrations en couleurs d’une série de symptômes sont présentées à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON

3.1. Tubercules de pomme de terre

Nota bene:

— la taille de l’échantillon standard est de 200 tubercules par test. Un échantillonnage plus intensif implique davantage de tests sur des échantillons de cette taille. Un nombre plus important de tubercules dans l’échantillon entraînera une inhibition ou une interprétation difficile des résultats. Lorsqu’on ne dispose pas d’un tel nombre de tubercules, la procédure peut cependant être appliquée sans difficulté à des échantillons de moins de 200 tubercules,

— la validation de toutes les méthodes de détection décrites ci-après est fondée sur la réalisation de tests sur des échantillons de 200 tubercules,

— l’extrait de pomme de terre décrit ci-dessous peut également être utilisé pour détecter la présence de la bactérie responsable du flétrissement bactérien de la pomme de terre, Ralstonia solanacearum.

Prétraitement facultatif préalable à la préparation de l’échantillon:

Laver les tubercules en appliquant des désinfectants (composés chlorés lorsque le test PCR doit être utilisé pour éliminer l’ADN pathogène) et des détergents appropriés entre les échantillons. Sécher les tubercules à l’air. Cette procédure de lavage est particulièrement utile (sans être obligatoire) pour les échantillons comportant des éléments de sol en excédent et si un test PCR ou une procédure d’isolement direct doivent être mis en œuvre.

3.1.1. À l’aide d’un scalpel ou d’un couteau à légumes propre et désinfecté, peler chaque tubercule au niveau du talon de manière à faire apparaître le tissu vasculaire. Découper soigneusement un petit cône de tissu vasculaire au niveau du talon, en veillant à prélever aussi peu que possible de tissu non vasculaire (voir le site web accessible à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota bene:

le cas échéant, mettre de côté les tubercules qui présentent des symptômes suspects de flétrissement bactérien et les tester séparément.

Si des symptômes suspects de flétrissement bactérien sont observés lors du prélèvement du cône de talon, il convient de procéder à une inspection visuelle du tubercule après l’avoir coupé à proximité du talon. Tout tubercule coupé présentant des symptômes suspects doit être subérifié pendant deux jours à température ambiante, puis conservé en quarantaine (à une température comprise entre 4 et 10 °C) jusqu’à ce que tous les tests aient été achevés. Tous les tubercules de l’échantillon (y compris ceux qui présentent des symptômes suspects) doivent être conservés comme prescrit à l'annexe II.

3.1.2. Rassembler les cônes de talons dans des récipients jetables neufs qui peuvent être fermés et/ou scellés (dans le cas de récipients réutilisés, les nettoyer et les désinfecter intégralement à l’aide de composés chlorés). Il est préférable de traiter immédiatement les cônes de talons. À défaut, il convient de les entreposer dans le récipient, sans addition de tampon, et, soit de les réfrigérer pour une période inférieure à 72 heures, soit de les conserver à température ambiante pour une période inférieure à 24 heures. Le séchage et la subérisation ainsi que le développement de saprophytes lors de l’entreposage des cônes sont susceptibles de gêner la détection de l’agent responsable du flétrissement bactérien.

3.1.3. Traiter les cônes de talons en suivant l’une des procédures ci-dessous:

a) recouvrir les talons d’un bain de tampon d’extraction en volume suffisant (environ 40 ml) (voir l’appendice 3) et les placer dans un agitateur rotatif (entre 50 et 100 tours/minute) pendant 4 heures à une température inférieure à 24 °C ou pendant 16 à 24 heures s’ils sont réfrigérés; ou

b) homogénéiser les talons à l’aide d’un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d’extraction (voir l’appendice 3), soit dans un mixeur (par exemple Waring ou Ultra Thurax), soit en les broyant avec un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (par exemple Homex) dans un sac de macération jetable scellé (par exemple de type Stomacher ou «Bioreba strong guage polythène» de 150 mm × 250 mm, stérilisé par radiations ionisantes).

Nota bene:

Il existe un risque élevé de contaminations croisées d’échantillons lorsque les échantillons sont homogénéisés au moyen d’un mixeur. Prendre des précautions pour éviter toute vaporisation ou débordement au cours du processus d’extraction. Veiller à utiliser des lames de mixeur et des vaisseaux fraîchement stérilisés pour chaque échantillon. En cas d’utilisation du test PCR, éviter tout transport d’ADN sur les récipients ou le dispositif de broyage. Le broyage dans des sacs jetables et l’utilisation de tubes jetables est recommandé en cas de recours au test PCR.

3.1.4. Décanter le liquide surnageant. S’il est excessivement trouble, le clarifier par une centrifugation à vitesse ralentie (à 180 g au maximum pendant 10 minutes, à une température de 4 à 10 °C ou par une filtration sous vide (40 à 100 µm), en lavant le filtre avec un tampon d’extraction supplémentaire (~ 10 ml) (voir l’appendice 3).

3.1.5. Concentrer la fraction bactérienne par centrifugation à une vitesse de 7 000 g pendant 15 minutes (ou de 10 000 g pendant 10 minutes), à une température comprise entre 4 et 10 °C, puis éliminer le liquide surnageant sans agiter le culot.

3.1.6. Remettre le culot en suspension dans un tampon de 1,5 ml (voir l’appendice 3). Utiliser 500 µl pour les tests relatifs à C. m. ssp. sepedonicus, 500 µl pour les tests relatifs à Ralstonia solanacearum et 500 µl à des fins de référence. Ajouter du glycérol stérile à la concentration finale de 10 à 25 % (en volume) aux 500 µl de l’aliquote de référence et à l’aliquote de test restante, passer au vortex et stocker à une température de –16 à –24 °C (semaines) ou de –68 à –86 °C (mois). Maintenir les aliquotes de test à une température de 4 à 10 °C pendant les tests.

Congélations et dégels répétés ne sont pas recommandés.

Si l’extrait doit être transporté, veiller à ce qu’il soit livré sous 24 à 48 heures dans une glacière.

3.1.7. Afin d’éviter toute contamination, il est impératif que tous les témoins positifs et échantillons de C. m. ssp. sepedonicus soient traités séparément, aussi bien pour les tests d’immunofluorescence que pour tous les autres tests.

3.2. Plants de pomme de terre

Nota bene:

Pour la recherche de populations latentes de C. m. ssp. sepedonicus, il est conseillé de tester des échantillons composites. La procédure peut facilement être appliquée à des échantillons composites comportant jusqu’à 200 parties de tiges (lorsque des enquêtes sont réalisées, elles doivent être fondées sur un échantillon statistiquement représentatif de la population végétale considérée.)

3.2.1. À l’aide d’un couteau ou d’un sécateur propre et désinfecté, détacher un segment d’un à deux centimètres au niveau de la base de chaque tige, juste au-dessus du niveau du sol.

Après les avoir brièvement désinfectés au moyen d’éthanol à 70 %, sécher immédiatement les segments de tige au papier absorbant.

Rassembler les segments de tiges dans un récipient stérile fermé en observant les procédures d’échantillonnage exposées ci-après.

3.2.2. Traiter les segments de tiges en suivant l’une des procédures suivantes:

a) recouvrir les segments de tiges d’un bain de tampon d’extraction en volume suffisant (environ 40 ml) (voir l’appendice 3) et les placer dans un agitateur rotatif (entre 50 et 100 tours/minute) pendant 4 heures à une température inférieure à 24 °C ou pendant 16 à 24 heures s’ils sont réfrigérés; ou

b) procéder immédiatement au broyage des segments dans un sac de macération résistant (par exemple, Stomacher ou Bioreba) avec un volume approprié de tampon d’extraction (voir l’appendice 3), en utilisant un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (Homex, par exemple). À défaut, il convient soit de réfrigérer les segments (pour une période inférieure à 72 heures), soit de les conserver à température ambiante (pour une période inférieure à 24 heures).

3.2.3. Décanter le liquide surnageant après sédimentation pendant 15 minutes.

3.2.4. Il n’est habituellement pas nécessaire de procéder à une nouvelle clarification de l’extrait ou de la concentration de la fraction bactérienne, mais celle-ci peut toutefois être réalisée par filtration et/ou centrifugation selon la méthode décrite aux sections 3.1.4 à 3.1.6.

3.2.5. Séparer l’extrait d’échantillon initial ou concentré en deux parties égales. En maintenir une tout au long du test à une température de 4 à 10 °C et entreposer l’autre à une température de –16 à –24 °C (semaines) ou de –68 à –86 °C (mois) après y avoir incorporé 10 à 25 % (en volume) de glycérol stérile, pour le cas où il serait nécessaire de pratiquer un second test.

4. TEST D’IMMUNOFLUORESCENCE

Principe

Compte tenu de sa capacité reconnue à atteindre les seuils requis, il est recommandé d’utiliser le test d’immunofluorescence comme principal test de dépistage.

Si le test d’immunofluorescence est utilisé comme principal test de dépistage et qu’il produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test PCR ou FISH à titre de test secondaire. Si le test d’immunofluorescence est utilisé comme test secondaire et qu’il produit un résultat positif, l’analyse doit être complétée par des tests supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

Nota bene:

Toujours utiliser un anticorps polyclonal lorsque le test d’immunofluorescence est utilisé comme test principal. Lorsqu’un test d’immunofluorescence réalisé avec un anticorps polyclonal produit un résultat positif, un test supplémentaire de l’échantillon avec un anticorps monoclonal peut permettre de gagner en spécificité, mais aussi se révéler moins sensible.

Il convient d’utiliser les anticorps d’une souche de référence de C. m. ssp. sepedonicus. Il est recommandé de déterminer le titre pour chaque nouveau lot d’anticorps. Le titre est défini comme la plus haute dilution à laquelle on obtient une réaction optimale lorsqu’on teste une suspension contenant entre 105 et 106 cellules par millilitre d’une souche homologue de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant un conjugué approprié d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), conformément aux recommandations du fabricant. La solution brute d’anticorps polyclonaux ou monoclonaux doit présenter un titre d’immunofluorescence d’au moins 1:2 000. Lors du test, la/les dilution(s) de travail des anticorps doivent être approximativement égales à la moitié du titre. Utiliser des anticorps validés (voir site web à l’adresse: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Le test doit être effectué sur des extraits d’échantillon fraîchement préparés. Le cas échéant, il peut être pratiqué avec succès sur des extraits conservés en solution de glycérol à une température de –68 °C à –86 °C Le glycérol peut être séparé de l’échantillon par l’ajout d’un ml de tampon d’extrait concentré (voir l’appendice 4), centrifugation pendant 15 minutes à 7 000 g et resuspension dans le même volume de tampon d’extrait concentré. Cela est rarement nécessaire, particulièrement lorsque l’échantillon est fixé à la lame par flambage (voir le point 2.2).

Préparer des lames témoins positives distinctes d’une souche homologue ou de toute autre souche de référence de C. m. ssp. sepedonicus, dans une suspension d’extrait de pomme de terre, comme indiqué dans l’appendice 2 et, éventuellement, dans une solution tampon.

Du tissu infecté naturellement (conservé par lyophilisation ou congélation entre –16 °C et –24 °C) devrait, dans la mesure du possible, être utilisé à titre de témoin similaire sur la même lame.

À titre de témoins négatifs, utiliser des aliquotes d’extrait d’échantillon ayant préalablement produit un résultat négatif lors de tests.

Utiliser des lames multipuits de microscope dotées de préférence de 10 fenêtres d’au moins 6 mm de diamètre.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

4.1. Préparer les lames en utilisant l’une des méthodes suivantes:

i) extraits finaux contenant relativement peu d’amidon: déposer à la pipette sur la première fenêtre un volume standard (15 µl conviennent pour un diamètre de fenêtre de 6 mm; choisir une quantité plus importante pour les fenêtres de plus grand diamètre) d’une solution au 1/100e de l’extrait concentré de pomme de terre remis en suspension. Ensuite, déposer à la pipette un volume similaire d’extrait concentré non dilué (1/1) sur les fenêtres restantes de la rangée. La rangée suivante peut faire office de double ou servir à un deuxième échantillon, comme indiqué à la figure 1;

ii) autres extraits: préparer des dilutions décimales (au 1/10e, au 1/100e et au 1/1000e) de l’extrait concentré remis en suspension dans la solution tampon. Déposer à la pipette sur une rangée de fenêtres un volume standard (15 µl conviennent pour un diamètre de fenêtre de 6 mm; choisir une quantité plus importante pour les fenêtres de plus grand diamètre) de la suspension d’extrait pur et de chaque dilution. La rangée suivante peut faire office de double ou servir à un deuxième échantillon, comme indiqué à la figure 2.

4.2. Faire sécher les gouttes à température ambiante ou par chauffage à des températures comprises entre 40 °C et 45 °C. Fixer les cellules bactériennes sur la lame par chauffage (15 minutes à 60 °C), par flambage, à l’aide d’éthanol à 95 % ou suivant les instructions spécifiques des fournisseurs des anticorps.

En cas de besoin, des lames fixées peuvent alors être réfrigérées et entreposées dans une boîte à dessiccation, pour la plus courte durée possible (jusqu’à un maximum de 3 mois) avant un nouveau test.

Procédure du test d’immunofluorescence:

i) conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée au point 4.1.i): préparer une série de dilutions au demi de l’anticorps dans un tampon d’immunofluorescence. Le premier puits doit recevoir 1/2 du titre (T/2), les autres 1/4 du titre (T/4), 1/2 du titre (T/2), le titre (T) et deux fois le titre (2T);

ii) conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée au point 4.1.ii): préparer la dilution de travail de l’anticorps dans un tampon d’immunofluorescence. La dilution de travail a un effet sur la spécificité.

Figure 1. Préparation de la lame de test conformément aux points 4.1 i) et 4.3 i)

Dilution de l’extrait concentré remis en suspension 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Dilution d’extrait concentré remis en suspension (T = titre) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dilution au demi de l’antisérum/anticorps Échantillon 1 1 2 3 4 5 Double de l’échantillon 1 ou de l’échantillon 2 6 7 8 9 10





Figure 2. Préparation de la lame de test conformément aux points 4.1 ii) et 4.3 ii)

Dilution de travail de l’antisérum/anticorps 1/1 1/10 1/100 vide vide  Dilution au dixième d’extrait concentré remis en suspension Échantillon 1 1 2 3 4 5 Double de l’échantillon 1 ou de l’échantillon 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Disposer les lames sur du papier humide. Couvrir complètement chaque fenêtre de test avec une ou plusieurs dilutions d’anticorps. Le volume d’anticorps appliqué sur chaque fenêtre doit être au moins équivalent au volume d’extrait appliqué.

En l’absence d’instructions spécifiques des fournisseurs des anticorps, appliquer la procédure suivante:

4.3.2. faire incuber les lames sur du papier humide et sous cloche pendant 30 minutes, à température ambiante (18 à 25 °C);

4.3.3. éliminer les gouttelettes de chaque lame et rincer soigneusement dans une solution tampon pour immunofluorescence. Laver par immersion pendant cinq minutes dans une solution tampon IF-Tween (voir l’appendice 3) puis encore cinq minutes dans une solution tampon IF. Éviter toute vaporisation ou débordement qui pourrait entraîner une contamination croisée. Éliminer précautionneusement au buvard l’humidité excédentaire;

4.3.4. disposer les lames sur du papier humide. Couvrir les fenêtres de test avec du conjugué FITC à la dilution utilisée lors du titrage. Le volume de conjugué appliqué sur les fenêtres doit être identique au volume d’anticorps utilisé;

4.3.5. faire incuber les lames sur du papier humide et sous cloche pendant 30 minutes, à température ambiante (18 à 25 °C);

4.3.6. éliminer de la lame les gouttes de conjugué. Rincer et laver comme indiqué ci-dessus (point 4.3.3).

Éliminer avec soin l’humidité excédentaire;

4.3.7. dans chaque fenêtre, déposer à la pipette 5 à 10 µl d’une solution de glycérol tamponnée au phosphate à 0,1 M (voir l’appendice 3) ou un support antidécoloration du commerce, puis couvrir d’une lamelle.

Lecture du test d’immunofluorescence:

4.4.1. Examiner les lames de test à l’aide d’un microscope à épifluorescence et de filtres adaptés à l’excitation de l’isothiocyanate de fluorescéine, en immersion dans l’huile ou dans l’eau et avec un grossissement de 500 à 1 000. Examiner les fenêtres selon deux diamètres perpendiculaires et en en suivant le pourtour. Pour les échantillons ne présentant pas de cellules ou n’en présentant qu’un faible nombre, observer au moins 40 champs microscopiques.

Commencer par contrôler la lame du témoin positif. Les cellules doivent présenter une fluorescence vive et être complètement colorées au titre d’anticorps ou de dilution de travail déterminés. En cas de coloration aberrante, le test IF (section 4) doit être réitéré.

4.4.2. Rechercher dans les fenêtres des lames de test la présence de cellules présentant une fluorescence vive et une morphologie caractéristique de C. m. ssp. sepedonicus (voir site web à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensité de la fluorescence doit être équivalente à celle de la souche témoin positive pour une dilution d’anticorps identique. Les cellules dont la coloration est incomplète ou qui présentent une faible fluorescence ne doivent pas être prises en considération.

Au moindre soupçon de contamination, le test doit être recommencé. Ce peut être le cas si toutes les lames d’un lot montrent des cellules positives en raison de la contamination du tampon ou si des cellules positives sont isolées (hors des fenêtres) sur le milieu de montage de la lame.

4.4.3. II existe un certain nombre de problèmes inhérents à la spécificité du test d’immunofluorescence. Des populations indésirables de cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et de bactéries saprophytes provoquant des réactions croisées qui présentent une taille et une morphologie similaires à C. m. sepedonicus risquent fort d’apparaître dans les extraits de cônes de talons et de segments de tiges de pommes de terre.

4.4.4. Seules les cellules fluorescentes présentant une taille et une morphologie caractéristiques au titre ou à la dilution de travail des anticorps visés au point 4.3 doivent être prises en considération.

4.4.5. Interprétation du test d’immunofluorescence:

i) Si l’échantillon contient des cellules présentant une fluorescence vive et une morphologie caractéristique, évaluer le nombre moyen de cellules caractéristiques par champ microscopique et calculer le nombre de ces cellules par millilitre d’extrait concentré remis en suspension (voir l’appendice 4). La lecture du test d’immunofluorescence est considérée comme positive lorsque l’échantillon contient au moins 5 × 103 cellules caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en suspension. L’échantillon est alors considéré comme potentiellement contaminé et il y a lieu de poursuivre les tests.

ii) La lecture du test d’immunofluorescence est considérée comme négative si l’échantillon contient moins de 5 × 103 cellules par millilitre d’extrait concentré remis en suspension et l’échantillon est considéré comme non contaminé. Il n’est pas utile de poursuivre les tests.

5. TEST FISH

Principe

Si le test FISH est utilisé comme test de dépistage initial et qu’il produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test d’immunofluorescence à titre de deuxième test de dépistage obligatoire. Si le test FISH est utilisé comme test secondaire et qu’il produit un résultat positif, le diagnostic doit être complété par des tests supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

Nota bene:

utiliser des oligo-sondes validées spécifiques de C. m. ssp. sepedonicus (voir l’appendice 7). Les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre la détection reproductible d’au moins 103 à 104 cellules/ml de C. m. ssp. sepedonicus ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs.

Il est préférable d’appliquer la procédure décrite ci-après à des extraits d’échantillon fraîchement préparés, mais elle peut également fonctionner avec des extraits d’échantillon conservés en solution de glycérol à des températures de –16 °C à –24 °C ou de –68 °C à –86 °C.

À titre de témoins négatifs, utiliser des aliquotes d’extrait d’échantillon ayant préalablement produit un résultat négatif lors de tests de recherche de C. m. ssp. sepedonicus.

À titre de témoins positifs, préparer des suspensions contenant entre 105 et 106 cellules/ml de C. m. ssp. sepedonicus (souches NCPPB 4053 ou PD 406, par exemple) dans une solution tampon phosphatée à 0,01 M, à partir d’une culture de trois à cinq jours (voir l’appendice 2 pour la préparation). Préparer des lames témoins positives distinctes de la souche homologue ou de toute autre souche de référence de C. m. ssp. sepedonicus, dans une suspension d’extrait de pomme de terre, comme indiqué dans l’appendice 2.

L’utilisation d’une oligo-sonde eubactérienne marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) permet de contrôler le processus d’hybridation en colorant toutes les eubactéries présentes dans l’échantillon.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

5.1. Fixation de l’extrait de pomme de terre

Le protocole exposé ci-après est basé sur Wullings et al., (1998).

5.1.1. Préparer la solution de fixation (voir l’appendice 7).

5.1.2. Introduire à la pipette 100 µl de chaque extrait dans un tube Eppendorf et centrifuger pendant 8 minutes à 7 000 g.

5.1.3. Éliminer le liquide surnageant et dissoudre l’extrait concentré dans 500 µl de fixatif préparé moins de 24 heures auparavant. Passer au vortex et laisser incuber toute la nuit à 4 °C.

On peut également utiliser de l’éthanol à 96 % comme fixatif. Dans ce cas, dissoudre l’extrait concentré visé au point 5.1.2 dans un mélange constitué de 50 µl de tampon phosphaté à 0,01 M et de 50 µl d’éthanol à 96 %. Mélanger au vortex et laisser incuber à 4 °C pendant 30 à 60 minutes.

5.1.4. Centrifuger pendant 8 minutes à 7 000 g, éliminer le liquide surnageant et remettre l’extrait concentré en suspension dans 75 µl de tampon phosphaté à 0,01 M.

5.1.5. Déposer 16 µl des suspensions fixées sur une lame multitest comme indiqué à la figure 3. Sur chaque lame, appliquer deux échantillons différents, non dilués, et en diluer 10 µl à 1:100 (dans un tampon phosphaté à 0,01 M). Le reste de la solution d’échantillon (49 µl) peut être conservé à –20 °C après addition d’un volume d’éthanol à 96 %. S’il y a lieu de réitérer le test FISH, éliminer l’éthanol par centrifugation et le remplacer par un volume équivalent de tampon phosphaté à 0,01 M (homogénéiser au vortex).

Figure 3. Disposition d’une lame pour test FISH

Échantillon 1 Témoin Témoin Témoin Échantillon 2 fenêtre 1 fenêtre 2 fenêtre 3 fenêtre 4 fenêtre 5 Échantillon 1 Témoin Témoin Témoin Échantillon 2 fenêtre 6 fenêtre 7 fenêtre 8 fenêtre 9 fenêtre 10 Lamelle 1 Lamelle 2

5.1.6. Sécher les lames à l’air (ou dans un séchoir, à 37 °C), puis les fixer par flambage.

Il est possible d’interrompre la procédure à ce stade et d’entamer l’hybridation le lendemain. Les lames doivent être entreposées à l’abri de la poussière, dans un lieu sec et à température ambiante.

5.2. Préhybridation et hybridation

5.2.1. Préparer une solution de lysozyme à raison de 10 mg de lysozyme (Sigma L-6876) pour 10 ml de tampon (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Cette solution peut être conservée, mais ne doit être congelée et dégelée qu’une fois. Couvrir intégralement chaque échantillon d’environ 50 µl de solution de lysozyme et laisser incuber 10 minutes à température ambiante, puis plonger une seule fois les lames dans de l’eau déminéralisée et les sécher au papier filtre.

Autre possibilité: dans chaque puits, en remplacement du lysozyme, ajouter au tampon (2 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) 50 µl de protéinase K à 40-400 µg/ml, puis laisser incuber à 37 °C pendant 30 minutes.

5.2.2. Déshydrater les cellules par bains successifs d’éthanol à 50 %, 80 % et 96 % d’une minute chacun. Disposer les lames sur un support et les laisser sécher à l’air libre.

5.2.3. Préparer une chambre d’incubation humide en tapissant le fond d’une boîte hermétique de papier absorbant ou de papier filtre imprégné d’hybmix 1x (voir l’appendice 7). Faire préincuber la boîte pendant au moins 10 minutes dans le four à hybridation, à une température de 55 °C.

5.2.4. Préparer la solution d’hybridation (voir l’appendice 7) à raison de 45 µl par lame, puis faire préincuber pendant cinq minutes à 55 °C.

5.2.5. Disposer les lames sur une plaque chauffante à 45 °C et verser 10 µl de solution d’hybridation dans chacun des quatre puits de chaque lame.

5.2.6. Couvrir chaque lame de deux lamelles (24 × 24 mm) en ayant soin de ne pas emprisonner d’air, puis placer les lames dans la chambre d’hybridation humide préchauffée et les y laisser une nuit, dans l’obscurité et à une température de 55 °C, pour permettre le déroulement de l’hybridation.

5.2.7. Préparer trois béchers contenant 1 l d’eau ultrapure, 1 l d’hybmix 1x (334 ml d’hybmix 3x et 666 ml d’eau ultrapure) et 1 l d’hybmix 1/2x (167 ml d’hybmix 3x et 833 ml d’eau ultrapure). Faire préincuber chacun de ces béchers au bain-marie, à 55 °C.

5.2.8. Débarrasser les lames des lamelles et les placer sur un support.

5.2.9. Éliminer l’excédent de sonde en procédant par incubation pendant 15 mn à 55 °C dans le bécher contenant l’hybmix 1x.

5.2.10. Transférer le support à lames dans une solution de lavage à l’hybmix 1/2 et laisser incuber pendant 15 mn supplémentaires.

5.2.11. Plonger brièvement les lames dans un bain d’eau ultrapure et sécher au papier filtre. Éliminer l’humidité excédentaire en disposant doucement du papier filtre sur la surface à sécher. Verser à la pipette dans chaque fenêtre entre 5 et 10 µl de solution support anti-décoloration (par exemple, Vectashield de Vecta Laboratories, CA, USA ou équivalente) et couvrir toute la surface de la lame d’une grande lamelle (24 × 60 mm).

5.3. Lecture du test FISH

5.3.1. Procéder immédiatement à l’observation des lames au moyen d’un microscope à épifluorescence, sous un film d’huile et à un grossissement de 630 à 1 000 x. Avec un filtre adapté à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les cellules eubactériennes (y compris la plupart des cellules gram-négatives) présentes dans l’échantillon prennent une coloration verte fluorescente. Avec un filtre adapté à la tétramethylrhodamine-5-isothiocyanate, les cellules de C. m. ssp. sepedonicus marquées au Cy3 apparaissent en rouge fluorescent. Comparer la morphologie des cellules avec celle des témoins positifs. Les cellules doivent être entièrement colorées et présenter une fluorescence vive. En cas de coloration aberrante, le test FISH (section 9,4) doit être réitéré. Examiner les fenêtres selon deux diamètres perpendiculaires et en en suivant le pourtour. Pour les échantillons ne présentant pas ou ne présentant qu’un faible nombre de cellules, observer au moins 40 champs microscopiques.

5.3.2. Rechercher dans les fenêtres des lames de test la présence de cellules présentant une fluorescence vive et une morphologie caractéristique de C. m. ssp. sepedonicus (voir site web à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensité de la fluorescence doit être équivalente ou supérieure à celle de la souche témoin positive. Les cellules dont la coloration est incomplète ou qui présentent une faible fluorescence ne doivent pas être prises en considération.

5.3.3. Au moindre soupçon de contamination, le test doit être recommencé. Ce peut être le cas si toutes les lames d’un lot montrent des cellules positives en raison de la contamination du tampon ou si des cellules positives sont isolées (hors des fenêtres) sur le milieu de montage de la lame.

5.3.4. II existe un certain nombre de problèmes inhérents à la spécificité du test FISH. Des populations indésirables de cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et de bactéries saprophytes provoquant des réactions croisées qui présentent une taille et une morphologie similaires à C. m. ssp. sepedonicus sont susceptibles d’apparaître dans les extraits de cônes de talons et de segments de tiges de pommes de terre. Ce phénomène est toutefois beaucoup moins fréquent que dans le cas du test d’immunofluorescence.

5.3.5. Seules les cellules fluorescentes présentant une taille et une morphologie caractéristiques doivent être prises en considération (voir le point 5.3.2).

5.3.6. Interprétation du résultat du test FISH:

i) les résultats du test FISH sont valides lorsqu’on observe des cellules présentant une fluorescence vive de couleur verte ainsi qu’une taille et une morphologie caractéristiques de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant le filtre FITC et des cellules présentant une fluorescence vive de couleur rouge en utilisant le filtre rhodamine dans tous les témoins positifs mais dans aucun témoin négatif. Si l’échantillon contient des cellules présentant une fluorescence vive et une morphologie caractéristique, évaluer le nombre moyen de cellules caractéristiques par champ microscopique et calculer le nombre de ces cellules par millilitre d’extrait concentré remis en suspension (voir l’appendice 4). Les échantillons contenant au moins 5 × 103 cellules caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en suspension sont considérés comme potentiellement contaminés. Il y a lieu de poursuivre les tests. Les échantillons contenant moins de 5 × 103 cellules caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en suspension sont considérés comme négatifs;

ii) le test FISH est négatif si l’on n’observe pas, en utilisant le filtre rhodamine, de cellules de la taille et de la morphologie caractéristiques de C. m. ssp. sepedonicus qui présentent une fluorescence vive de couleur rouge, pour autant que des cellules caractéristiques présentant une fluorescence vive de couleur rouge soient observées avec le filtre rhodamine dans les préparations de témoins positifs.

6. TEST PCR

Principes

Si le test PCR est utilisé comme principal test de dépistage et qu’il produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test d’immunofluorescence à titre de second test de dépistage obligatoire. Si le test PCR est utilisé comme test secondaire et qu’il produit un résultat positif, le diagnostic doit être complété par des tests supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

L’exploitation complète de cette méthode en tant que test de dépistage principal n’est recommandée que quand une expertise spécialisée a été acquise en la matière.

Nota bene:

Les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre la détection reproductible de 103 à 104 cellules/ml de C. m. ssp. sepedonicus ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs. Des expériences d’optimisation peuvent se révéler nécessaires pour obtenir des niveaux maximaux de sensibilité et de spécificité dans tous les laboratoires.

Utiliser des réactifs et des protocoles PCR validés. Sélectionner de préférence une méthode avec contrôle interne.

Prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l’échantillon par de l’ADN cible. Afin de réduire autant que possible la possibilité de contamination par de l’ADN cible, il conviendrait que le test PCR soit réalisé par des techniciens expérimentés, dans des laboratoires de biologie moléculaire spécialisés.

Les témoins négatifs (en ce qui concerne les procédures de PCR et d'extraction d’ADN) doivent toujours être traités comme échantillons finaux dans la procédure, afin de faire apparaître si un transfert d’ADN est intervenu.

Il convient d’inclure les témoins négatifs suivants dans le test PCR:

— extrait d’échantillon ayant produit précédemment des résultats négatifs pour C. m. ssp. sepedonicus,

— tampons témoins utilisés pour extraire la bactérie et l’ADN de l’échantillon,

— mélange réactif destiné au PCR.

De même, il convient d’y inclure les témoins positifs suivants:

— aliquotes d’extraits finaux remis en suspension après ajout de C. m. ssp. sepedonicus (voir l’appendice 2 pour la préparation),

— suspension en milieu aqueux de 106 cellules par millilitre d’un isolat virulent de C. m. ssp. sepedonicus (par exemple: NCPPB 2140 ou NCPPB 4053),

— utilisation également, si possible, d’ADN extrait d’échantillons témoins positifs lors du test PCR.

Pour éviter les risques de contamination, préparer les témoins positifs dans un environnement distinct de celui des échantillons à tester.

Autant que possible, les extraits d’échantillons doivent être exempts de terre. Dans certains cas, il pourrait donc être recommandable de préparer des extractions de pommes de terre lavées s’il est prévu d’utiliser des protocoles PCR.

6.1. Méthodes de purification de l’ADN

Utiliser des échantillons témoins positifs et négatifs selon la méthode décrite ci-dessus.

Préparer le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

Il existe toute une série de méthodes pour la purification de l’ADN cible dans le cas de substrats d’échantillons complexes, en vue d’éliminer les inhibiteurs de la PCR et d’autres réactions enzymatiques et de concentrer l’ADN cible dans l’extrait d’échantillon.

La méthode suivante a été optimisée pour une utilisation avec la méthode PCR validée décrite à l’appendice 6.

6.1. a) Méthode de Pastrik (2000)

1. Déposer à la pipette 220 µl de tampon lyse (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.

2. Ajouter 100 µl d’extrait d’échantillon et le placer dans un bloc chauffant ou un bain-marie à 95 °C pendant dix minutes.

3. Déposer le tube sur de la glace pendant cinq minutes.

4. Ajouter 80 µl de solution concentrée de lysozyme (50 mg de lysozyme par millilitre dans 10 mM Tris HCl, pH 8,0) et laisser incuber à 37 °C pendant 30 minutes.

5. Ajouter 220 µl d’Easy DNA® solution A (Invitrogen), bien homogénéiser au vortex et laisser incuber à 65 °C pendant 30 minutes.

6. Ajouter 100 µl d’Easy DNA® solution B (Invitrogen), homogénéiser vigoureusement au vortex jusqu’à ce que le précipité circule librement dans le tube et que l’échantillon présente une viscosité uniforme.

7. Ajouter 500 µl de chloroforme et homogénéiser au vortex jusqu’à ce que la viscosité diminue et que le mélange soit homogène.

8. Centrifuger à 15 000 g pendant 20 minutes à 4 °C pour séparer les phases et former l’interphase.

9. Verser la phase supérieure dans un nouveau tube Eppendorf.

10. Ajouter 1 millilitre d’éthanol à 100 % (–20 °C), homogénéiser brièvement au vortex et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes.

11. Centrifuger à 15 000 g pendant 20 minutes à 4 °C et éliminer l’éthanol de l’extrait concentré.

12. Ajouter 500 µl d’éthanol à 80 % (–20 °C) et mélanger en retournant le tube.

13. Centrifuger à 15 000 g pendant 10 minutes à 4 °C, conserver l’extrait concentré et éliminer l’éthanol.

14. Laisser sécher l’extrait à l’air libre ou dans un DNA Speed Vac.

15. Remettre en suspension l’extrait concentré dans 100 µl d’eau ultrapure stérile et le laisser à température ambiante pendant au moins 20 minutes.

16. Le conserver à –20 °C jusqu’au moment de l’utiliser pour la PCR.

17. Isoler tout précipité blanc par centrifugation et utiliser 5 µl du liquide surnageant contenant l’ADN pour la PCR.

6.1. b) Autres méthodes

D’autres méthodes d’extraction de l’ADN (Qiagen DNeasy Plant Kit, par exemple) peuvent être appliquées, à condition qu’elles soient d’une efficacité reconnue comme équivalente pour la purification d’ADN issu d’échantillons témoins contenant entre 103 et 104 cellules d’agent pathogène par millilitre.

6.2. PCR

6.2.1. Préparer les matrices de test et de contrôle pour la PCR suivant les protocoles validés (voir l’appendice 6). Préparer une dilution décimale de l’extrait d’ADN issu de l’échantillon (1:10 dans de l’eau ultrapure).

6.2.2. Préparer le mélange réactif destiné à la PCR dans un environnement exempt de toute contamination suivant les protocoles publiés (voir l’appendice 6). Le protocole PCR validé est une réaction multiplex qui intègre également un contrôle PCR interne.

6.2.3. Ajouter 5 µl d’extrait d’ADN à 25 µl de réactif PCR dans des tubes PCR stériles.

6.2.4. Constituer un échantillon témoin négatif ne contenant que le mélange réactif destiné à la PCR et ajouter à la place de l’échantillon une eau ultrapure de même provenance que celle utilisée dans le mélange PCR.

6.2.5. Placer les tubes dans le même cycleur thermique que celui utilisé lors du test préliminaire et lancer le programme PCR optimisé comme il convient (voir l’appendice 6).

6.3. Analyse du produit de la réaction PCR

6.3.1. Décoder les amplimères PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Soumettre à une tension de 5 à 8 V/cm une quantité d’au moins 12 µl de mélange réactif d’ADN amplifié provenant de chaque échantillon, associé à 3 µl de tampon de lest (appendice 6) sur des gels d’agarose à 2,0 % dans un tampon d’EDTA (TAE) tris-acétate (appendice 6). Utiliser un marqueur d’ADN approprié, comme le «100 bp ladder».

6.3.2. Pour révéler les bandes d’ADN, utiliser la coloration au bromure d’éthidium (à 0,5 mg/l) pendant une période 30 à 45 minutes, en prenant les précautions qui s’imposent pour la manipulation de cet agent mutagène.

6.3.3. Dans le cas des produits PCR présentant la taille attendue (appendice 6), visualiser le gel coloré par diaphanoscopie sous UV ondes courtes (par exemple, λ = 302 nm) et noter les résultats.

6.3.4. Pour tous les nouveaux cas/résultats, vérifier l’authenticité de l’amplimère en pratiquant une analyse de restriction enzymatique sur un échantillon de l’ADN amplifié restant. À cet effet, faire incuber à température optimale sur une durée optimale, en employant un enzyme et un tampon appropriés (voir l’appendice 6). Décoder les fragments digérés par électrophorèse sur gel d’agarose selon la méthode indiquée plus haut et visualiser par diaphanoscopie sous UV la disposition caractéristique des fragments après restriction enzymatique et coloration au bromure d’éthydium. Comparer ensuite avec les témoins positifs pré et post-digestion.

Interprétation du résultat du test PCR:

Le test PCR est négatif si l’on met en évidence l’amplimère PCR spécifique de C. m. ssp. sepedonicus de la taille attendue pour l’ensemble des échantillons témoins positifs, mais pas pour l’échantillon concerné (dans le cas d’un PCR multiplex avec amorces de contrôle interne spécifiques à la plante, un second produit PCR de la taille attendue doit être amplifié avec l’échantillon concerné).

Le test PCR est positif si l’on met en évidence l’amplimère PCR spécifique de C. m. ssp. sepedonicus, présentant la taille et (au besoin) la disposition post-restriction attendues, à condition qu’il ne soit pas amplifié par l’un des échantillons témoins négatifs. On peut également confirmer avec fiabilité un résultat positif en recommençant le test avec une deuxième série d’amorces PCR (voir la section 9.3).

Nota bene:

On peut suspecter une inhibition du PCR si l’amplimère attendu est obtenu à partir de l’échantillon témoin positif contenant C. m. ssp. sepedonicus en solution aqueuse alors que les témoins positifs contenant C. m. ssp. sepedonicus dans de l’extrait de pomme de terre produisent un résultat négatif. Dans les protocoles PCR multiplex avec contrôles PCR internes, l’inhibition de la réaction est probable quand on n’obtient aucun des deux amplimères.

On peut suspecter une contamination si l’amplimère attendu est mis en évidence dans un au moins des témoins négatifs.

7. TEST BIOLOGIQUE

Nota bene:

Les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre la détection reproductible de 103 à 104 cellules/ml de C. m. ssp. sepedonicus formant des colonies, ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs (pour la préparation, voir l’appendice 2).

Pour obtenir le plus haut degré de sensibilité de détection, il est préférable d’utiliser un extrait d’échantillon fraîchement préparé, dans des conditions de croissance optimales. Toutefois la méthode peut être appliquée avec succès à des extraits conservés en solution de glycérol entre –68 °C et –86 °C.

Certaines variétés d’aubergine constituent un excellent milieu d’enrichissement sélectif pour la culture de C. m. ssp. sepedonicus, même en l’absence de symptômes, et permettent également de réaliser un excellent test de confirmation sur hôte.

Pour réduire le risque d’obtenir des résultats faussement négatifs, les conditions de croissance doivent être optimales.

Pour les détails de la culture, voir l’appendice 8.

7.1. Répartir sur des aubergines, selon l’une des méthodes indiquées plus bas (points 7.3 ou 7.4), la totalité du reste de l’aliquote de test d’extrait concentré remis en suspension obtenu comme indiqué aux sections 3.1.6 ou 3.2.5. Utiliser uniquement des plants au stade de la deuxième ou de la troisième feuille, jusqu’au développement complet de la troisième vraie feuille. Pour utiliser intégralement l’extrait concentré remis en suspension et assurer l’efficacité de l’inoculation, l’exécution des procédures décrites ci-après requiert entre 15 et 25 aubergines par échantillon.

7.2. Avant l’inoculation, ne pas arroser les aubergines pendant une ou deux journées afin de réduire la pression de turgescence.

Inoculation par incision

7.3.1. Tenir le plant entre deux doigts et déposer à la pipette sur la tige, entre les cotylédons et la première feuille, une goutte (environ 5 à 10 µl) d’extrait concentré en suspension.

7.3.2. À l’aide d’un scalpel stérile, pratiquer, en partant de la goutte d’extrait concentré, une incision diagonale d’une longueur de 1,0 cm et d’une profondeur égale approximativement aux deux tiers de l’épaisseur de la tige.

7.3.3. Refermer l’incision avec de la vaseline stérile au moyen d’une seringue.

7.4. Inoculation par injection

À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille hypodermique (pas moins de 23 G), pratiquer l’inoculation dans les tiges d’aubergine juste au-dessus des cotylédons. Répartir l’échantillon entre les aubergines.

7.5. À titre de témoins positifs, inoculer cinq plants par la même méthode (voir les points 7.3 ou 7.4) avec une suspension aqueuse contenant entre 105 et 106 cellules/ml d’une culture connue de C. m. ssp. sepedonicus, et, si possible, avec de l’extrait de tubercule naturellement infecté (voir la section 4).

7.6. À titre de témoins négatifs, inoculer cinq plants par la même méthode (voir les points 7.3 ou 7.4) avec une solution tampon stérile d’extrait concentré.

7.7. Laisser incuber les plants jusqu’à quatre semaines entre 18 °C et 24 °C dans des locaux adaptés aux conditions de quarantaine. Pendant l’incubation, maintenir une lumière suffisante et un degré élevé d’humidité (de 70 % à 80 %), en assurant un arrosage approprié pour prévenir tout engorgement hydrique ou flétrissement de sécheresse. Les cellules de C. m. sepedonicus ne résistent pas à des températures supérieures à 30 °C; leur température idéale de culture se situe à 21 °C. Pour éviter les risques de contamination, faire incuber les témoins positifs et négatifs en serre ou phytotron sur des étagères nettement séparées ou, si la place est limitée, prévoir un compartimentage rigoureux. Si des plants correspondant à des échantillons différents doivent incuber à proximité les uns des autres, les séparer à l’aide d’écrans appropriés. Prendre grand soin d’éviter toute contamination croisée lors de la fertilisation, de l’arrosage, des inspections et de toute autre manipulation. Il est essentiel d’éviter toute présence d’insectes dans les serres ou les phytotrons, car ils sont susceptibles de disséminer la bactérie d’un échantillon à l’autre.

7.8. Au bout d’une semaine, examiner régulièrement les plants pour y déceler l’apparition de symptômes. Dénombrer les plants présentant des symptômes. Le C. m. ssp. sepedonicus provoque chez l’aubergine un flétrissement des feuilles qui peut se manifester en premier lieu par une flaccidité sur les bords ou entre les nervures. Au départ, le tissu flétri peut prendre une couleur vert foncé ou un aspect tacheté, mais il pâlit avant de se nécroser. Les flétrissures entre les nervures présentent souvent l’aspect graisseux de tissus gorgés d’eau. Le tissu nécrosé présente souvent un bord jaune vif. Les plants ne meurent pas nécessairement. Plus les symptômes tardent à apparaître, plus les chances de survie sont élevées. Les plants peuvent surmonter l’infection. Les jeunes aubergines sont considérablement plus sensibles à de faibles populations de C. m. ssp. sepedonicus que les plants plus âgés, d’où la nécessité d’utiliser des plants au stade de la troisième feuille ou juste avant.

Des flétrissements peuvent également être provoqués par des populations d’autres bactéries ou de champignons présentes dans l’extrait concentré de tissu tuberculaire. Il s’agit entre autres de Ralstonia solanacearum, d’Erwinia carotovora ssp. carotovora et d’E. carotovora ssp. atroseptica, d’Erwinia chrysanthemi, de Phoma exigua var. foveata, ainsi que de vastes populations de bactéries saprophytes. Erwinia chrysanthemi, en particulier, peut induire au niveau des feuilles des symptômes et un flétrissement très semblables aux symptômes de C. m. sepedonicus, à cette seule différence près que les infections à Erwinia chrysanthemi provoquent un noircissement des tiges. D’autres types de flétrissements se distinguent de ceux causés par C. m. ssp. sepedonicus par le fait que des feuilles ou des plants entiers fanent rapidement. Il est également possible de recourir à une coloration de Gram pour distinguer C. m. ssp. sepedonicus d’Erwinia spp.

7.9. Dès l’apparition de symptômes sur les aubergines, il y a lieu de procéder à de nouvelles opérations d’isolement à partir de segments de tissu provenant des feuilles flétries ou de la tige des plants (pour la macération des tissus, se reporter au point 3.1.3). Désinfecter la surface des feuilles et des tiges d’aubergine en les frottant avec de l’éthanol à 70 %. Effectuer un test IF ou PCR sur la sève d’aubergine et procéder à l’isolement sur un milieu approprié [sélectif] (voir la section 8). Il est aussi possible de préparer une coloration de Gram (voir l’appendice 9). Identifier les cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus et confirmer leur pathogénécité (voir les sections 9 et 10).

7.10. Dans certaines circonstances et en particulier si les conditions de culture ne sont pas optimales, C. m. ssp. sepedonicus peut être présent dans les aubergines à l’état d’infection latente, même après des périodes d’incubation allant jusqu’à quatre semaines. Si aucun symptôme n’est observé après quatre semaines, effectuer un test IF ou PCR sur un échantillon composite de segments de tiges de 1 cm provenant de chaque plant test, prélevés au-dessus du point d’inoculation. Si le test est positif, pratiquer un nouvel isolement sur un milieu approprié (sélectif), conformément à la procédure exposée à la section 8. Identifier les cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus et confirmer leur pathogénécité (voir les sections 9 et 10).

Interprétation des résultats du test biologique.

Les résultats du test biologique sont valides lorsque les plants constituant le témoin positif présentent des symptômes caractéristiques, qu’il est possible d’isoler à nouveau les bactéries sur ces plants et qu’aucun symptôme n’est observé sur les témoins négatifs.

Le test biologique est négatif si les plants tests ne sont pas infectés par C. m. ssp. sepedonicus, sous réserve que C. m. ssp. sepedonicus soit mis en évidence sur les témoins positifs.

Le test biologique est positif si les plants tests sont infectés par C. m. ssp. sepedonicus.

8. ISOLEMENT DE C. M. SSP. SEPEDONICUS

Nota bene:

Le diagnostic ne peut être confirmé que par l’isolement et la mise en évidence, de C. m. ssp. sepedonicus (voir la section 9), suivis d’une validation par un test du pouvoir pathogène (voir la section 10). Bien qu’il s’agisse d’un organisme difficile à isoler, il est possible de le faire au départ de tissu présentant des symptômes d’infection.

Il peut toutefois se trouver étouffé par des bactéries saprophytes à croissance rapide, ce qui le rend difficile à isoler directement à partir de l’extrait concentré de tissu de tubercule ou de tige (obtenu aux sections 3.1.6 ou 3.2.5). L’isolement direct de C. m. ssp. sepedonicus reste envisageable sur milieu sélectif et à partir d’une dilution appropriée d’extrait concentré, remis en suspension, de cônes de pommes de terre prélevés au talon ou de tiges de pomme de terre.

Les isolements doivent être pratiqués sur tous les tubercules ou segments de tiges de pommes de terre et toutes les aubergines ne présentant aucun symptôme mais pour lesquels le test IF ou PCR pratiqué sur l’échantillon composite (voir la section 7.10) a produit un résultat positif. Le cas échéant, les tiges d’aubergines doivent subir une macération suivant la méthode décrite à la section 3.1.3.

À titre de témoins positifs, préparer des dilutions au dixième d’une suspension de 106 ufc/ml de C. m. ssp. sepedonicus (par exemple, NCPPB 4053 ou PD 406). Pour éviter toute possibilité de contamination, préparer les témoins positifs totalement à l’écart des échantillons à tester.

Pour chaque lot nouvellement préparé de milieu sélectif, il importe de vérifier qu’il convient bien pour la culture de l’agent pathogène avant de l’utiliser pour tester des échantillons de routine.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

8.1. Étalement sur milieu sélectif

8.1.1. À partir de 100 µl d’une aliquote d’échantillon d’extrait concentré de pomme de terre remis en suspension ou de sève d’aubergine, effectuer des dilutions au dixième dans un tampon d’extrait concentré (voir l’appendice 3).

8.1.2. Les tentatives d’isolation à partir d’extrait concentré de pomme de terre non dilué se soldent généralement par un échec en raison des difficultés que présente la culture de Cms et de la concurrence des saprophytes. Étant donné que la bactérie est généralement présente en masse dans les tissus infectés, il est le plus souvent possible d’évacuer les saprophytes par dilution tout en conservant l’agent pathogène. Il est donc recommandé de recourir à la technique d’étalement sur lame et d’étaler, à l’aide d’un applicateur («crosse de hockey»), 100 µl de chaque échantillon, à des dilutions de 1/100e à 1/10 000e, sur un milieu MTNA ou NCP-88 (voir l’appendice 5).

Nota bene:

Une autre stratégie peut consister à étaler l’aliquote initiale de 100 µl d’extrait concentré de pomme de terre sur une première lame gélosée à l’aide d’un applicateur, à étendre en stries sur une deuxième lame le reliquat resté sur l’applicateur et à procéder de même sur une troisième lame. L’applicateur permet ainsi d’obtenir sur les lames un effet de dilution.

8.1.3. Faire incuber les lames à l’abri de la lumière et à des températures comprises entre 21 °C et 23 °C.

8.1.4. Un premier examen des lames, avec comptage, par référence aux lames témoins, des éventuelles colonies d’aspect semblable à C. m. ssp. sepedonicus, doit avoir lieu au bout de trois jours. Les comptages suivants sont à effectuer au bout de cinq, de sept et enfin de dix jours.

8.2. Purification des colonies suspectes

Nota bene:

Il y a lieu de repiquer sur milieu YGM les colonies d’aspect semblable à C. m. ssp. sepedonicus, à des fins d’inoculation ultérieure d’aubergines et/ou d’identification. Cette opération doit être effectuée avant que les lames ne connaissent un foisonnement excessif, soit de préférence au bout de trois à cinq jours.

8.2.1. Pratiquer un ensemencement en stries des colonies d’aspect semblable à C. m. ssp. sepedonicus sur un des milieux suivants (les formules figurent à l’appendice 5):

gélose nutritive avec dextrose (uniquement pour les repiquages),

gélose avec levure, peptone et glucose,

gélose avec extrait de levure et sels minéraux.

Laisser incuber jusqu’à 10 jours à une température comprise entre 21 °C et 24 °C.

C. m. ssp. sepedonicus se multiplie lentement et produit généralement en dix jours des colonies de la taille et de la forme d’une tête d’épingle, convexes et de couleur crème (des photographies de colonies caractéristiques de C. m. ssp. sepedonicus sont présentées à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Ensemencer à nouveau en stries pour obtenir des cultures pures.

Les taux de croissance sont meilleurs pour les repiquages. Les colonies caractéristiques sont de couleur crème ou ivoire, parfois jaune, arrondies, lisses, gonflées, convexes et de consistance mucoïde à fluidale. Elles possèdent des bords bien dessinés, et leur diamètre s'étend généralement de 1 à 3 mm.

Une simple coloration de Gram (voir l’appendice 9) peut aider à sélectionner des colonies en vue de tests supplémentaires.

8.2.3. Identifier les cultures supposées (voir la section 9) et réaliser un test du pouvoir pathogène (voir la section 10).

9. IDENTIFICATION

Identifier des cultures pures d’isolats supposés de C. m. ssp. sepedonicus en utilisant au moins deux des tests suivants, fondés sur des principes biologiques différents.

Le cas échéant, inclure des souches de référence connues pour chaque test effectué.

9.1. Tests d’identification nutritionnels et enzymatiques

Rechercher les caractéristiques phénotypiques ci-après qui sont systématiquement présentes ou absentes chez C. m. ssp. sepedonicus, suivant les méthodes de Lelliott et Stead (1987), de Klement et al. (1990), de Schaad (2001), anonyme (1987).

Tous les milieux doivent incuber à 21 °C et être examinés au bout de six jours. Si l’on ne constate aucune multiplication, laisser incuber jusqu’à 20 jours.

Chaque test doit inclure une souche connue de C. m. ssp. sepedonicus à titre de témoin. Les tests nutritionnels et physiologiques doivent être effectués sur de l’inoculat provenant de repiquages sur gélose nutritive. Les comparaisons morphologiques doivent se faire à partir de cultures sur gélose nutritive avec dextrose.

Tests Résultats attendus Oxydation/fermentation (O/F) Inerte ou faiblement oxydant Oxydase – Croissance à 37 °C – Activité uréasique – Hydrolyse de l’esculine + Hydrolyse de l’amidon – ou faible Tolérance d’une solution de NaCl à 7 % – Production d’indole – Activité de la catalase + Production de H2S – Utilisation du citrate – Liquéfaction de la gélatine – Production d’acide à partir de glycérol – Production d’acide à partir de lactose – ou faible Production d’acide à partir de rhamnose – Production d’acide à partir de salicine – Coloration de Gram (voir l’appendice 9) +

9.2. Test d’immunofluorescence (IF)

a) Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans un tampon d’immunofluorescence (voir l’appendice 3).

b) Préparer une dilution au demi d’un antisérum approprié.

c) Suivre la procédure du test d’immunofluorescence (voir section 4).

d) Pour qu’un test IF soit positif, le titre obtenu avec la culture doit être équivalent à celui obtenu avec le témoin positif.

9.3. Test PCR

a) Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans de l’eau ultrapure.

b) Dans un bloc chauffant ou dans un bain d’eau bouillante, chauffer 100 µl de la suspension dans des tubes fermés à 100 °C pendant 4 minutes. Si nécessaire, l’addition de NaOH fraîchement préparé à une concentration finale de 0,05 M peut faciliter la lyse des cellules. Les échantillons peuvent ensuite être stockés à des températures de –16 °C à –24 °C jusqu’au moment d’être utilisés.

c) Appliquer des procédures PCR appropriées pour amplifier les amplimères spécifiques de C. m. ssp. sepedonicus specific amplicons (par exemple: Pastrik, 2000; voir l’appendice 4; Li et de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik et Rainey, 1999; Schaad et al., 1999.

d) L’identification de C. m. ssp. sepedonicus est positive lorsque les amplimères PCR sont de la même taille et présentent les mêmes polymorphismes de longueur des fragments de restriction que pour la souche témoin positive.

9.4. Test FISH

a) Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans de l’eau ultrapure.

b) Suivre la procédure du test FISH (voir section 5).

c) Le test FISH est positif si l’on obtient les mêmes réactions avec la culture et le témoin positif.

9.5. Test de profil des acides gras (FAP)

a) Développer la culture pendant 72 heures à 21 °C (+/– 1 °C) sur gélose de soja Trypticase (Oxoid).

b) Appliquer une procédure de test FAP appropriée (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) Pour qu’un test FAP soit positif, le profil de la culture supposée doit être identique à celui du témoin positif. La présence des acides gras caractéristiques 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 et 17:0 Anteiso est fortement révélatrice de C. m. sepedonicus. Des bactéries d’autres genres, comme Curtobacterium, Arthrobacter et Micrococcus, possèdent également certains de ces acides, mais très rarement 15:1 Anteiso A, alors qu’il est présent chez tous les Clavibacter spp. à des taux compris entre 1 % et 5 %. Dans le cas de C. m. sepedonicus, ce taux gravite habituellement autour de 5 %.

9.6. BOX-PCR

a) Préparer une suspension d’environ 106 cellules par millilitre dans de l’eau ultrapure.

b) Effectuer le test conformément à la procédure (Smith et al., 2001).

10. TEST DE CONFIRMATION

Le test du pouvoir pathogène doit être effectué à la fois pour apporter la confirmation finale d’un diagnostic de C. m. ssp. sepedonicus et pour évaluer la virulence des cultures identifiées comme étant C. m. ssp. sepedonicus.

10.1. Préparer un inoculum d’environ 106 cellules/ml à partir d’une culture de trois jours de l’isolat à tester et d’une souche témoin positive appropriée de C. m. ssp. sepedonicus.

10.2. Inoculer 5 à 10 tiges de jeunes plants d’aubergine au stade de la troisième feuille (voir les sections 7.3 ou 7.4).

10.3. Faire incuber entre 18 °C et 24 °C à un degré d’humidité relative élevée, en assurant un arrosage approprié pour prévenir tout engorgement hydrique ou stress de sécheresse (voir la section 7.7). Avec des cultures pures, un flétrissement typique devrait apparaître dans les deux semaines; toutefois, les plants ne présentant pas de symptômes (voir la section 7.8) à l’issue de cette période doivent continuer à incuber jusqu’à trois semaines, à des températures favorables à la croissance des aubergines mais ne dépassant pas 25 °C (voir l’appendice 8). Si la culture ne présente pas de symptômes au bout de trois semaines, on ne peut pas confirmer qu’il s’agit d’une forme pathogène de C. m. ssp. sepedonicus.

10.4. Assurer l’isolement par rapport aux plants symptomatiques en prélevant une section de tige à une hauteur de 2 cm au-dessus du point d’inoculation. Réduire et mettre en suspension dans un petit volume d’eau distillée stérile ou de tampon phosphaté à 50 mM (voir l’appendice 3). Isoler de la suspension en diluant par étalement simple ou en stries sur MTNA et YPGA (voir l’appendice 5), laisser incuber pendant trois à cinq jours entre 21 °C et 23 °C, puis observer la formation de colonies caractéristiques de C. m. ssp. sepedonicus.

Appendice 1 Laboratoires pratiquant l’optimisation et la validation des protocoles Laboratoire (1) Lieu Pays Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Vienne et Linz Autriche Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgique Plantedirektoratet Lyngby Danemark Central Science Laboratory York Angleterre Scottish Agricultural Science Agency Édimbourg Écosse Laboratoire national de la protection des végétaux, unité de bactériologie Angers France Laboratoire national de la protection des végétaux, station de quarantaine de la pomme de terre Le Rheu France Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Allemagne Pflanzenschutzamt Hannover Hanovre Allemagne State Laboratory Dublin Irlande Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Pays-Bas Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Norvège Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lisbonne Portugal Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slovénie Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanque Espagne (1) Pour les experts de contact, se référer au site web à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Appendice 2 Préparation des témoins positifs et négatifs pour l’application aux cônes des tests de dépistage PCR/IF et FISH Mettre en culture pendant 72 heures une souche virulente de C. m. ssp. sepedonicus [NCPPB 4053 ou PD 406] sur un milieu de base MTNA et mettre en suspension dans un tampon phosphaté à 10 mM de manière à obtenir une densité cellulaire d’environ 1 à 2 × 108 ufc par millilitre. Celle-ci correspond généralement à une suspension légèrement turbide présentant une densité optique de 0,20 à 600 nm. Prélever un cône au talon sur 200 tubercules d’une récolte de variété à peau blanche connue pour être exempte de C. m. spp. sepedonicus. solanacearum. Traiter les talons selon la méthode habituelle et remettre l’extrait concentré en suspension dans 10 millilitres. Verser 900 µl d’extrait concentré remis en suspension dans dix microtubes stériles de 1,5 ml. Ensemencer le premier microtube au moyen de 100 µl de la suspension de C. m. ssp. sepedonicus. Homogénéiser au vortex. Établir des niveaux de contamination au dixième en poursuivant la dilution dans les cinq microtubes suivants. Les six microtubes contaminés seront utilisés comme témoins positifs. Les quatre microtubes non contaminés seront utilisés comme témoins négatifs. Étiqueter les microtubes en conséquence. Préparer des aliquotes de 100 µl dans des microtubes stériles de 1,5 ml de manière à obtenir neuf répliques de chaque échantillon témoin. Entreposer entre –16 et –24 °C jusqu’à utilisation. La présence et la quantification de C. m. ssp. sepedonicus dans les échantillons témoins doit être confirmée en premier lieu par un test d’immunofluorescence. Pour le test PCR, effectuer une extraction d’ADN à partir des échantillons témoins positifs et négatifs de chaque série d’échantillons. Pour les test IF et FISH, effectuer des essais sur les échantillons témoins positifs et négatifs de chaque série d’échantillons. Dans le cas des tests IF, FISH et PCR, C. m. ssp. sepedonicus doit être détecté au minimum dans les témoins positifs à 106 et 104 cellules/ml et être totalement absent des témoins négatifs.

Appendice 3 Tampons pour les procédures de test GÉNÉRALITÉ: les tampons stérilisés non ouverts peuvent être stockés jusqu’à un an. 1. Tampons pour la procédure d’extraction 1.1. Tampon d’extraction (tampon phosphaté à 50 mM, pH 7,0) Ce tampon est utilisé pour l’extraction, par homogénéisation ou agitation, de la bactérie présente dans les tissus de la plante. Na2HPO4 (anhydre) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Eau distillée 1,00 l Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C. Les additifs suivants peuvent être utiles: Objet Quantité (par l) Flocons de Lubrol Défloculant (1) 0,5 g Antimousse au DC silicone Agent antimoussant (1) 1,0 ml Pyrophosphate tétrasodique Antioxydant 1,0 g Polyvinyl pyrrolidone-40 000 (PVP-40) Liaison d’inhibiteurs de PCR 50 g 1.2. Tampon d’extrait concentré (tampon phosphaté à 10 mM, pH 7,2) Ce tampon est utilisé pour la remise en suspension et la dilution des extraits de talons de tubercules de pommes de terre concentrés par centrifugation. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Eau distillée 1,00 l Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C. 2. Tampons pour le test d’immunofluorescence 2.1. Tampon IF (tampon au phosphate à 10 mM, pH 7,2) Ce tampon est utilisé pour la dilution des anticorps. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Eau distillée 1,0 l Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. 2.2. Tampon IF-Tween Ce tampon est utilisé pour laver les lames. Ajouter 0,1 % de Tween 20 au tampon IF. 2.3. Glycérol tamponné au phosphate, pH 7,6 Ce tampon est utilisé comme fluide de support sur les fenêtres des lames IF pour renforcer la fluorescence. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glycérol 50 ml Eau distillée 100 ml Des solutions supports anti-décoloration sont disponibles dans le commerce: par exemple, Vectashield® (Vector Laboratories) ou Citifluor® (Leica). (1) À utiliser avec la méthode d’extraction par homogénéisation.

Appendice 4 Détermination du degré de contamination lors des tests IF et FISH 1. Compter le nombre moyen de cellules fluorescentes caractéristiques par champ (c). 2. Compter le nombre de cellules fluorescentes caractéristiques par fenêtre de lame de microscope (C). C = c × S/s où: S = la superficie (S) de la fenêtre d’une lame multipuits, et s = la superficie du champ de l’objectif

s = πi2/4G2K2 où: i = le coefficient du champ (dépend du type d’oculaire et varie de 8 à 24) K = le coefficient du tube (1 ou 1,25) G = le grossissement de l’objectif (100 fois, 40 fois, etc.) 3. Compter le nombre de cellules fluorescentes caractéristiques par millilitre d’extrait concentré remis en suspension (N) N = C × 1 000/y × F où: y = le volume d’extrait concentré remis en suspension sur chaque fenêtre, et F = le facteur de dilution de l’extrait concentré remis en suspension.

Appendice 5 Milieux d’isolement et de culture de C. m. ssp. sepedonicus a) Milieux de culture de type général Gélose nutritive Gélose nutritive (Difco) 23,0 g Eau distillée 1,0 l Dissoudre les ingrédients et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C. Gélose nutritive avec dextrose Gélose nutritive de Difco Bacto contenant 1 % de D-glucose (monohydrate). Stériliser à l’autoclave à 115 °C pendant 20 minutes. Gélose avec levure, peptone et glucose (YPGA) Extrait de levure (Difco) 5,0 g Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g D-glucose (monohydrate) 10,0 g Bacto-Agar (Difco) 15,0 g Eau distillée 1,0 l Dissoudre les ingrédients et stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Milieu de culture avec extrait de levure et sels minéraux (YGM) Extrait de levure bacto (Difco) 2,0 g D-glucose (monohydrate) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Bacto-Agar (Difco) 18 g Eau distillée 1,0 l Dissoudre les ingrédients et stériliser par demi-litre à l’autoclave pendant 20 minutes à 115 °C. b) Milieux de croissance sélectifs validés Milieu MTNA Sauf mention contraire, tous les ingrédients proviennent de BDH. Extrait de levure (Difco) 2,0 g Mannitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7 H2O 0,1 g MnSO4. H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Gélose (Oxoid no 1) 16,0 g Eau distillée 1,0 l Dissoudre les ingrédients et porter le pH à 7,2. Après un passage à l’autoclave (15 minutes à 121 °C) et un refroidissement à 50 °C, ajouter les antibiotiques: triméthoprime 0,06 g, acide nalidixique 0,002 g, amphotéricine B 0,01 g. Entreposer les solutions d’antibiotiques comme suit: triméthoprime (Sigma) et acide nalidixique (Sigma) [tous deux à 5 mg/ml] dans du méthanol à 96 %; amphotéricine B (Sigma) [1 mg/ml] dans du diméthylsulfoxyde. Les solutions entreposées sont stérilisées par filtration. Nota bene: Le milieu généraliste se conserve trois mois. Après l’ajout des antibiotiques, il se conserve un mois en atmosphère réfrigérée. Milieu NCP-88 Gélose nutritive (Difco) 23 g Extrait de levure (Difco) 2 g D-Mannitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7 H2O 0,25 g Eau distillée 1,0 l Dissoudre les ingrédients et porter le pH à 7,2. Après passage à l’autoclave et refroidissement à 50 °C, ajouter les antibiotiques suivants: sulphate de polymixine B (Sigma) 0,003 g, acide nalidixique (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g. Dissoudre les antibiotiques en solutions mères: l’acide nalidixique dans du NaOH à 0,01 M; le cycloheximide dans de l’éthanol à 50 %, le sulphate de polymixine B dans de l’eau distillée. Les solutions entreposées sont stérilisées par filtration. Nota bene: Le milieu généraliste se conserve trois mois. Après l’ajout des antibiotiques, il se conserve un mois en atmosphère réfrigérée.

Appendice 6 Protocole et réactifs PCR validés Nota bene: Les tests préliminaires doivent permettre la détection reproductible d’au moins 103 à 104 cellules de C. m. sepedonicus par millilitre d’extrait d’échantillon. Les tests préliminaires doivent également ne montrer aucun faux résultat positif avec une gamme de souches bactériennes sélectionnées. 1. Protocole PCR multiplex avec contrôle PCR interne (Pastrik, 2000) 1.1. Oligonucléotide amorces Amorce sens PSA-1 5′- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3′ Amorce antisens PSA -R 5′- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3′ Amorce sens NS-7-F 5′- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3′ Amorce antisens NS-8-R 5′- tcc gca ggt tca cct acg ga -3′ Taille de l’amplimère prévue de la matrice d’ADN de C. m. ssp. sepedonicus = 502 bp (en présence de l’amorce PSA). Taille de l’amplimère prévue du contrôle PCR interne 18S rRNA = 377 bp (en présence de l’amorce NS). 1.2. Mélange réactif destiné au PCR Réactif Quantité par réaction Concentration finale Eau ultrapure stérile 15,725 µl 10x tampon PCR (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (fraction V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % Mélange d-nTP (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Amorce PSA-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Amorce PSA-R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Amorce NS-7-F (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Amorce NS-8-R (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Polymérase Taq (5 U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Volume d’échantillon 5,0 µl Volume total: 25,0 µl 1.3. Conditions de la réaction PCR Exécuter le programme suivant: 1 cycle de: i) 3 minutes à 95 °C: dénaturation de la matrice ADN; 10 cycles de: ii) 1 minute à 95 °C: dénaturation de la matrice ADN; iii) 1 minute à 64 °C: hybridation avec les amorces; iv) 1 minute à 72 °C: extension de l’ADN complémentaire; 25 cycles de: v) 30 secondes à 95 °C: dénaturation de la matrice ADN; vi) 30 secondes à 62 °C: hybridation avec les amorces; vii) 1 minute à 72 °C: extension de l’ADN complémentaire; 1 cycle de: viii) 5 minutes à 72 °C: extension finale; ix) maintenir à 4 °C. Nota bene: Ce programme a été optimisé pour une utilisation avec un cycleur thermique MJ Research PTC 200. Une modification de la durée des étapes des cycles ii), iii), iv), v), vi) et vii) peut être nécessaire pour une utilisation avec d’autres modèles. 1.4. Analyse de restriction enzymatique de l’amplimère Les produits PCR amplifiés de l’ADN de C. m. ssp. sepedonicus produisent un polymorphisme de longueur de fragments de restriction distinct avec l’enzyme Bgl II après incubation à 37 °C pendant 30 minutes. Les fragments de restriction obtenus à partir du fragment spécifique de C. m. ssp. sepedonicus ont une longueur de 282 bp et 220 bp. 2. Préparation du tampon de lest 2.1. Bleu de bromophénol (solution concentrée à 10 %) Bleu de bromophénol 5 g Eau distillée (bidest) 50 ml 2.2. Tampon de lest Glycérol (86 %) 3,5 ml Bleu de bromophénol (5.1) 300 µl Eau distillée (bidest) 6,2 ml 3. 10X tampon d’EDTA (TAE) tris-acétate, pH 8,0 Tampon tris 48,4 g Acide acétique glacial 11,42 ml EDTA (sel disodique) 3,72 g Eau distillée 1,00 l Diluer jusqu’à 1x avant utilisation. Également disponible dans le commerce (ex.: Invitrogen ou équivalent) (1) Les méthodes ont été validées en utilisant la polymérase Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq ou Gold) et Gibco BRL. (2) Les concentrations des amorces NS-7-F et NS-8-R ont été optimisées pour l’extraction de noyaux de talons de pommes de terre utilisant la méthode de l’homogénéisation et de la purification de l’ADN suivant Pastrik (2000) [voir sections 6.1.a.) et 6.2]. Une nouvelle optimisation des concentrations de réactifs sera requise si l’extraction par agitation ou d’autres méthodes d’isolement de l’ADN sont utilisées.

Appendice 7 Réactifs validés pour le test FISH 1. Oligosondes Sonde CMS-CY3-01 spécifique de Cms 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Sonde eubactérienne EUB-338-FITC non spécifique 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’ 2. Solution de fixation [ATTENTION! LE FIXATIF CONTIENT DU PARAFORMALDÉHYDE, QUI EST TOXIQUE. PORTER DES GANTS ET NE PAS INHALER. IL EST CONSEILLÉ DE TRAVAILLER SOUS UNE HOTTE DE CHIMISTE]. i) Chauffer 9 ml d’eau pure moléculaire (ex: eau ultrapure à environ 60 °C et ajouter 0,4 g de paraformaldéhyde. Le paraformaldéhyde est dissous après avoir ajouté 5 gouttes de 1N NaOH et remué avec un agitateur magnétique. ii) Ajuster le pH à 7,0 par l’ajout de 1ml de tampon phosphaté à 0,1 M (PB; pH 7,0) et 5 gouttes de 1N HCl. Vérifier le pH avec les bandes indicatrices et ajuster en cas de besoin avec du HCl ou NaOH. [ATTENTION! NE PAS UTILISER DE PH-MÈTRE DANS LES SOLUTIONS CONTENANT DU PARAFORMALDÉDHYDE]. iii) Filtrer la solution à travers un filtre à membrane de 0,22 µm et protéger de la poussière à 4 °C jusqu’à l’utilisation. iv) Nota bene: solution de fixation de remplacement: éthanol à 96 %. 3. Hybmix 3X NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (filtre stérilisé et passé à l’autoclave) 15 mM Diluer jusqu’à 1 x comme requis. 4. Solution d’hybridation Hybmix 1X Dodécylsulfate de sodium (SDS) 0,01 % Sonde EUB 338 5 ng/μl sonde CMSCY301 5 ng/μl Préparer des quantités de solution d’hybridation suivant les calculats du tableau. Pour chaque lame (contenant 2 échantillons différents en double), 90 μl de solution d’hybridation solution sont nécessaires. Tableau: Quantités suggérées pour préparer le mélange d’hybridation. 2 8 Eau ultrapure stérile 50,1 200,4 hybmix 3 x 30,0 120,0 1 % Dodécylsulfate de sodium 0,9 3,6 Sonde EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Sonde CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Volume total (μl) 90,0 360,0 Nota bene: Stocker dans l’obscurité et à –20 °C toutes les solutions contenant des oligosondes sensibles à la lumière. Protéger de la lumière directe du soleil ou de la lumière électrique directe au cours de l’utilisation. 5. Tampon M phosphaté 0,1, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Eau distillée 1,00 l Dissoudre les ingrédients, vérifier le pH et stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C.

Appendice 8 Cultures d’aubergine Semer des graines d’aubergines (Solanum melongena) dans une terre de semis pasteurisée. Repiquer les plantules dans de la terre de rempotage pasteurisée lorsque les cotylédons sont entièrement développés (10 à 14 jours). Les aubergines doivent être cultivées en serre dans les conditions suivantes: Durée du jour 14 heures ou durée naturelle de la journée si elle est supérieure, Température jour 21 à 24 °C, nuit 15 °C.

Variétés sensibles d’aubergine: «Black Beauty», «Long Tom», «Rima», «Balsas». Fournisseur: voir site web à l’adresse http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.