3)

Le chapitre VIII suivant est inséré: «VIII. SUCRES TOTAUX 1. Champ d'application La méthode CLHP-IR permet de doser les sucres totaux (exprimés en sucres invertis) dans les boissons spiritueuses à l'exclusion des liqueurs contenant des œufs et des produits laitiers. Elle a été validée dans le cadre d'une étude interlaboratoires pour le pastis, l'anis distillé, la liqueur de cerises, la crème de (suivie du nom d'un fruit ou de la matière première utilisée) et la crème de cassis, à des niveaux compris dans une fourchette allant de 10,86 g/l à 509,7 g/l. Toutefois, la linéarité de la réponse de l'instrument a été démontrée pour des concentrations comprises entre 2,5 g/l et 20,0 g/l. Cette méthode n'est pas conçue pour doser de faibles niveaux de sucres. 2. Références normatives ISO 3696:1987. Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécifications et méthodes d'essai. 3. Principe Analyses par chromatographie liquide à haute performance de solutions de sucre afin de déterminer leur concentration en glucose, fructose, saccharose, maltose et lactose. Cette méthode utilise une phase stationnaire d'alkylamine, et la détection à l'aide d'un réfractomètre différentiel est citée à titre d'exemple. L'utilisation de résines échangeuses d'anions pour la phase stationnaire serait également possible. 4. Réactifs et matériaux 4.1. Glucose (CAS 50-99-7), d'une pureté d'au moins 99 %. 4.2. Fructose (CAS 57-48-7), d'une pureté d'au moins 99 %. 4.3. Saccharose (CAS 57-50-1), d'une pureté d'au moins 99 %. 4.4. Lactose (CAS 5965-66-2), d'une pureté d'au moins 99 %. 4.5. Monohydrate de maltose (CAS 6363-53-7), d'une pureté d'au moins 99 %. 4.6. Acétonitrile pur (CAS 75-05-8) pour l'analyse CLHP. 4.7. Eau distillée ou déminéralisée, microfiltrée de préférence. 4.8. Solvants (exemple) Le solvant d'élution est composé de: 75 unités en volume d'acétonitrile (4.6), 25 unités en volume d'eau distillée (4.7). Dégazer par barbotage d'hélium à faible débit pendant 5 à 10 minutes avant utilisation. Si l'eau utilisée n'a pas été microfiltrée, il est recommandé de filtrer le solvant avec un filtre pour solvants organiques d'un diamètre de pores inférieur ou égal à 0,45 μm. 4.9. Éthanol absolu (CAS 64-17-5). 4.10. Solution d'éthanol (5 %, v/v). 4.11. Préparation de la solution mère étalon (20 g/l) Peser 2 g de chacun des sucres à analyser (4.1 à 4.5), les transférer sans perte dans une fiole jaugée de 100 ml. (NB 2,11 g de monohydrate de maltose correspondent à 2 g de maltose). Ajuster à 100 ml avec une solution d'alcool à 5 % vol. (4.10), agiter et stocker à environ + 4 °C. Préparer une nouvelle solution mère une fois par semaine. 4.12. Préparation de solutions étalons de travail (2,5 g/l, 5,0 g/l, 7,5 g/l, 10,0 g/l et 20,0 g/l) Diluer la solution mère, 20 g/l, (4.11) de manière adéquate avec une solution d'alcool de 5 % (4.10) pour obtenir cinq solutions standard de 2,5 g/l, 5,0 g/l, 7,5 g/l, 10,0 g/l et 20,0 g/l. Filtrer avec un filtre d'un diamètre de pores inférieur ou égal à 0,45 μm (5.3). 5. Appareil et équipement 5.1. Système CLHP capable de réaliser le retour à la ligne de base de l'ensemble des sucres. 5.1.1. Chromatographe liquide à haute performance avec une vanne d'injection à six voies munie d'une boucle de 10 μl ou de tout autre dispositif, automatique ou manuel, pour l'injection fiable de microvolumes. 5.1.2. Système de pompage permettant l'obtention et le maintien d'un débit constant ou programmé avec une grande précision. 5.1.3. Réfractomètre différentiel. 5.1.4. Intégrateur-calculateur ou enregistreur fonctionnant en toute compatibilité avec l'ensemble du système. 5.1.5. Précolonne: il est recommandé de joindre une précolonne appropriée à la colonne d'analyse. 5.1.6. Colonne (exemple): Matériau: acier inoxydable ou verre. Diamètre interne: 2 à 5 mm. Longueur: 100 à 250 mm (en fonction de la taille des particules d'emballage), par exemple 250 mm pour des particules de 5 μm de diamètre. Phase stationnaire: groupes fonctionnels d'alkylamine lié à de la silice, granulométrie maximale 5 μm. 5.1.7. Conditions de la chromatographie (exemple): Solvant d'élution (4.8), débit: 1 ml/minute. Détection: réfractomètrie différentielle. Pour s'assurer que le détecteur est parfaitement stable, il convient de l'activer quelques heures avant l'emploi. La cellule de référence doit être remplie avec le solvant d'élution. 5.2. Balance d'analyse précise à 0,1 mg près. 5.3. Dispositif de filtration pour petits volumes utilisant une micromembrane de 0,45 μm. 6. Stockage de l'échantillon Dès réception, les échantillons sont entreposés à température ambiante avant d'être analysés. 7. Procédure 7.1. PARTIE A: préparation de l'échantillon 7.1.1. Secouer l'échantillon. 7.1.2. Filtrer l'échantillon avec un filtre d'un diamètre de pores inférieur ou égal à 0,45 μm (5.3). 7.2. PARTIE B: CLHP 7.2.1. Détermination Injecter 10 μl des solutions étalons (4.12) et les échantillons (7.1.2). Effectuer l'analyse dans les conditions appropriées de chromatographie, par exemple celles décrites ci-dessus. 7.2.2. Si un échantillon présente un pic d'une surface (ou d'une hauteur) supérieure au pic correspondant à la solution étalon la plus concentrée, il convient de diluer l'échantillon avec de l'eau distillée et de procéder à une nouvelle analyse. 8. Calcul Comparer les deux chromatogrammes obtenus pour la solution étalon et la boisson spiritueuse. Recenser les pics en fonction de leur temps de rétention. Mesurer leur surface (ou leur hauteur) pour calculer les concentrations par la méthode de référence externe. Tenir compte de toutes les dilutions opérées lors de la préparation de l'échantillon. Le résultat final est la somme de saccharose, de maltose, de lactose, de glucose et de fructose, exprimée en sucre inverti en g/l. Le sucre inverti est égal à la somme de tous les monosaccharides, moins les disaccharides présents, plus la quantité stœchiométrique de glucose et de fructose calculée à partir du saccharose présent. Le sucre inverti (g/l) = glucose (g/l) + fructose (g/l) + maltose (g/l) + lactose (g/l) + saccharose (g/l) × 1,05 1,05 = (poids moléculaire du fructose + poids moléculaire du glucose)/poids moléculaire du saccharose 9. Caractéristiques de performance de la méthode (précision) 9.1. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoires Les données suivantes proviennent d'une étude internationale sur les performances de la méthode, réalisée conformément aux procédures établies au niveau international (1) (2). Année de l'essai interlaboratoires 2000 Nombre de laboratoires 24 Nombre d'échantillons 8 (1) “Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studies”, Horwitz, W. (1995), Pure and Applied Chemistry 67, 332-343. (2) Horwitz, W. (1982), “Analytical Chemistry 54, 67A-76A”. Tableau 1 Fructose, glucose, maltose Analyte Fructose Glucose Maltose Échantillons (× 2) Crème de cassis Norme (50 g/l) Boisson spiritueuse à l'anis Crème de cassis Norme (50 g/l) Boisson spiritueuse à l'anis Norme (10 g/l) Valeur moyenne (g/l) 92,78 50,61 15,62 93,16 50,06 15,81 9,32 Nombre de laboratoires sans cas extrêmes 21 22 21 23 19 21 22 Écart-type de répétabilité, sr (g/l) 2,34 2,12 0,43 3,47 1,01 0,48 0,54 Écart-type relatif de répétabilité, RSDr (%) 2,53 4,2 2,76 3,72 2,03 3,02 5,77 Limite de répétabilité, r (g/l) (r = 2,8 × sr) 6,56 5,95 1,21 9,71 2,84 1,34 1,51 Écart-type de reproductibilité, sr (g/l) 7,72 3,13 0,84 9,99 2,7 0,88 1,4 Écart-type relatif de reproductibilité, RSDR (%) 8,32 6,18 5,37 10,72 5,4 5,54 15,06 Limite de reproductibilité, R (g/l) (R = 2,8 × sR) 21,62 8,76 2,35 27,97 7,57 2,45 3,93

Tableau 2 Saccharose Analyte Saccharose Échantillons Pastis Ouzo Liqueur de cerises Crème de menthe Crème de cassis Norme (100 g/l) Valeur moyenne (g/l) 10,83 29,2 19,7 (*) 103,33 349,96 319,84 99,83 Nombre de laboratoires sans cas extrêmes 19 19 20 18 18 18 Écart-type de répétabilité, sr (g/l) 0,09 0,75 2,17 5,99 4,31 1,25 Écart-type relatif de répétabilité, RSDr (%) 0,81 3,07 2,1 1,71 1,35 1,25 Limite de répétabilité, r (g/l) (r = 2,8 × sr) 0,25 2,1 6,07 16,76 12,06 3,49 Écart-type de reproductibilité, sR (g/l) 0,79 0,92 4,18 9,94 16,11 4,63 Écart-type relatif de reproductibilité, RSDR (%) 7,31 3,76 4,05 2,84 5,04 4,64 Limite de reproductibilité, R (g/l) (R = 2,8 × sR) 2,22 2,57 11,7 27,84 45,12 12,97

Tableau 3 Sucres totaux (Remarque: Ces données ont été calculées pour les sucres totaux, et non pour le sucre inverti tel que défini au point 8).

Échantillons Pastis Ouzo Boisson spiritueuse à l'anis Liqueur de cerises Crème de menthe Crème de cassis Norme (220 g/l) Valeur moyenne (g/l) 10,86 29,2 19,7 (**) 31,59 103,33 349,73 509,69 218,78 Nombre de laboratoires sans cas extrêmes 20 19 20 20 18 18 19 Écart-type de répétabilité, sr (g/l) 0,13 0,75 0,77 2,17 5,89 5,59 2,71 Écart-type relatif de répétabilité, RSDr (%) 1,16 3,07 2,45 2,1 1,69 1,1 1,24 Limite de répétabilité, r (g/l) (r = 2,8 × sr) 0,35 2,1 2,17 6,07 16,5 15,65 7,59 Écart-type de reproductibilité, sR (g/l) 0,79 0,92 1,51 4,18 9,98 14,81 8,53 Écart-type relatif de reproductibilité, RSDR (%) 7,25 3,76 4,79 4,04 2,85 2,91 3,9 Limite de reproductibilité, R (g/l) (R = 2,8 × sR) 2,21 2,57 4,24 11,7 27,94 41,48 23,89