DIRECTIVE DU CONSEIL du 29 mars 1977 concernant la surveillance biologique de la population vis-à-vis du risque saturnin (77/312/CEE)

LE CONSEIL DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne, et notamment son article 235,

vu la proposition de la Commission,

vu l'avis de l'Assemblée (1),

vu l'avis du Comité économique et social (2),

considérant qu'une des tâches essentielles de la Communauté économique européenne est de promouvoir un développement harmonieux des activités économiques dans l'ensemble de la Communauté et une expansion continue et équilibrée, missions qui ne peuvent se concevoir indépendamment d'une lutte contre les pollutions et nuisances et sans l'amélioration de la qualité de la vie et de la protection de l'environnement;

considérant que les diverses utilisations du plomb conduisent actuellement à une pollution saturnine de nombreux milieux de l'environnement;

considérant que les multiples sources de plomb présentes dans l'environnement rendent difficile la détermination de l'exposition globale d'un individu à ce polluant et, par conséquent, que la protection de la santé de l'homme nécessite un contrôle aussi précis que possible de l'imprégnation saturnine globale de l'individu;

considérant qu'il convient d'effectuer une surveillance biologique de la population vis-à-vis du risque saturnin et d'évaluer les résultats de cette surveillance afin d'élaborer, le cas échéant, de nouvelles propositions;

considérant qu'il convient de définir les modalités techniques et les niveaux de référence biologique pour cette surveillance;

considérant que la détermination de la plombémie constitue actuellement le meilleur moyen d'évaluer la dose de plomb reçue récemment par un individu du fait de son exposition au plomb présent dans l'environnement et que l'activité enzymatique de la déhydratase de l'acide delta-aminolévulinique (ALAD) peut servir d'examen indicatif ou complémentaire pour la détermination de l'exposition au plomb;

considérant que le programme d'action des Communautés européennes en matière d'environnement (3) prévoit la coordination des programmes nationaux visant l'amélioration de la qualité de la vie et une action prioritaire pour le plomb,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

Les États membres prennent les mesures nécessaires pour appliquer une procédure commune de surveillance biologique en vue d'évaluer l'exposition de la population au risque saturnin en dehors des lieux de travail.

Article 2

Cette procédure commune, dont l'application est limitée à quatre ans, repose sur la mesure de la plombémie.

A titre d'examen indicatif ou complémentaire, la mesure de l'ALAD pourra également être utilisée selon les modalités prévues aux annexes II et III. (1)JO nº C 28 du 9.2.1976, p. 31. (2)JO nº C 50 du 4.3.1976, p. 9. (3)JO nº C 112 du 20.12.1973, p. 3.

Article 3

1. Les conditions de cette surveillance biologique sont fixées par: - les modalités d'échantillonnage et d'analyse,

- la fréquence d'échantillonnage.

2. Les prises de sang destinées à l'échantillonnage sont effectuées sur des volontaires.

Article 4

L'échantillonnage porte sur: - des groupes de 100 personnes au moins dans des régions urbaines de plus de 0,5 million d'habitants,

- des groupes de 100 personnes au moins, dans la mesure où ce chiffre peut être atteint, choisies parmi les populations exposées à des sources significatives de pollution par le plomb,

- des groupes critiques déterminés par les autorités compétentes des États membres.

Dans chaque État membre et au cours de chaque campagne, il sera effectué au moins 50 analyses par million d'habitants.

Article 5

L'échantillonnage des groupes visés à l'article 4 est effectué au cours d'au moins deux campagnes dans chaque zone considérée pendant la durée du programme, séparée par un intervalle de vingt-quatre mois au minimum. La deuxième campagne ne porte pas nécessairement sur les mêmes individus que ceux de la première campagne.

Article 6

Pour évaluer les résultats de la surveillance biologique en vue des actions prévues à l'article 8, les taux de plombémie suivants, qui tiennent compte des relations dose-effet figurant à l'annexe I, sont considérés, simultanément, comme niveaux de référence:

- 20 microgrammes de plomb pour 100 millilitres de sang au maximum pour 50 % du groupe de population examiné,

- 30 microgrammes de plomb pour 100 millilitres de sang au maximum pour 90 % du groupe de population examiné,

- 35 microgrammes de plomb pour 100 millilitres de sang au maximum pour 98 % du groupe de population examiné.

Article 7

Pour la détermination de la plombémie: - les États membres communiquent à la Commission les noms des laboratoires participant au programme de surveillance biologique et les méthodes d'analyse utilisées,

- la Commission, en liaison avec les États membres, organise des programmes d'intercomparaison auxquels les laboratoires susmentionnés participent,

- la Commission, en liaison avec les États membres, examine les résultats de ces programmes en vue d'améliorer la comparabilité des méthodes d'analyse.

Article 8

Lorsque le résultat des analyses fait ressortir un ou plusieurs dépassements des niveaux de référence visés à l'article 6, les États membres: - vérifient la validité des résultats,

- recherchent les sources d'exposition qui provoquent ces dépassements ; cette action concerne également tous les individus ayant une plombémie supérieure à 35 microgrammes 100 millilitres,

- prennent, à la discrétion de leurs autorités nationales compétentes, les mesures appropriées.

Article 9

1. Les États membres désignent, dans les six mois qui suivent la notification de la présente directive, l'autorité nationale compétente qui communique à la Commission: - les données relatives à la surveillance biologique des groupes de population visés à l'article 4, comportant des indications concernant les méthodes d'analyse, les groupes de population examinés et les zones dans lesquelles ces échantillons ont été pris ; ces données devront offrir toutes garanties en ce qui concerne le respect de l'anonymat des personnes examinées ; les modalités et la forme de transmission de ces données sont élaborées d'un commun accord entre la Commission et les États membres,

- les informations sur les causes ou les facteurs présumés être la cause du dépassement des niveaux de référence visés à l'article 6.

2. L'autorité nationale compétente communique, en outre, à la Commission les mesures prises en vertu de l'article 8 troisième tiret.

Article 10

La Commission réunit au moins deux fois par an les représentants des gouvernements des États membres, en vue notamment: - d'assurer l'exécution harmonisée de la surveillance biologique et en particulier des dispositions prévues aux articles 4 et 5,

- de veiller à la comparabilité des analyses effectuées,

- d'examiner les informations et de faciliter l'échange d'informations entre les États membres sur les résultats obtenus par la surveillance biologique ainsi que sur les mesures prises en vertu de l'article 8.

Article 11

Sur la base des informations recueillies en vertu de l'article 9, la Commission élabore, en liaison avec les autorités nationales compétentes: - un rapport annuel de synthèse sur l'exécution de ce programme qui est transmis aux États membres ainsi qu'au Conseil et à l'Assemblée,

- un rapport général à la fin de ce programme qui sert de fondement pour la préparation éventuelle de nouvelles propositions qui tiendraient également compte des progrès intervenus dans les connaissances scientifiques et techniques.

Article 12

Les États membres prennent les mesures nécessaires pour se conformer à la présente directive dans un délai de douze mois à compter de sa notification et en informent immédiatement la Commission.

Article 13

Les États membres sont destinataires de la présente directive.

Fait à Bruxelles, le 29 mars 1977.

Par le Conseil

Le président

T. BENN

ANNEXE I RELATIONS DOSE-EFFET

Les taux de plombémie retenus pour évaluer les résultats de la surveillance biologique découlent de l'analyse des données scientifiques concernant les différents effets toxiques du plomb. Cette analyse, qui tient compte des variations normales des valeurs biologiques de la population, permet d'établir des relations quasi quantitatives entre la dose et l'effet. Les relations dose-effet suivantes sont retenues comme base de référence pour la mise en oeuvre de la présente directive:

Une décroissance de l'activité ALAD dans les globules rouges, du fait d'une exposition au plomb, tant qu'elle ne donne pas lieu à une perturbation dans l'hématopoïèse peut être acceptée pour la population. Pour les plombémies inférieures à 15-20 ¶g/100 ml, il est actuellement considéré que la décroissance de l'activité ALAD ne produit pas de perturbation dans l'hématopoïèse.

L'augmentation des protoporphyrines érythrocytaires (PPE) dans le sang est indicative d'une interférence avec l'utilisation du fer, inhibant ainsi la synthèse de l'hème. L'augmentation des PPE intervient pour des taux de plombémie supérieurs à 20-30 ¶g/100 ml. Une augmentation des PPE peut cependant être due à d'autres causes.

L'interférence avec la synthèse du glutathion ne peut être tolérée que pour une petite fraction de la population et seulement pour autant qu'elle soit faible et ne produise pas d'autres manifestations subcliniques. Cette interférence inacceptable avec la synthèse du glutathion n'intervient pas pour autant que le taux de plombémie soit inférieur à 30 ¶g/100 ml.

L'augmentation significative de l'excrétion urinaire de l'acide delta-aminolévulinique (ALAU) est un signe d'une perturbation importante du métabolisme des porphyrines et constitue ainsi un signe de santé déficiente. L'augmentation significative du point de vue statistique de l'ALAU n'intervient que pour des taux de plombémie supérieurs à 35 ¶g/100 ml.

ANNEXE II CORRESPONDANCE ENTRE TAUX DE PLOMBÉMIE ET ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

Au sens de l'article 2 de la présente directive, la correspondance entre le taux de plombémie et l'activité enzymatique de l'ALAD mesurée selon la méthode européenne standardisée (annexe 3) est la suivante: >PIC FILE= "T0010807">

Tant que les valeurs de l'ALAD mesurées sont de façon significative supérieures aux limites ci-dessus pour les différentes fractions de population, il n'est pas nécessaire d'effectuer de nouvelles mesures des taux de plombémie à titre de confirmation.

ANNEXE III PRESCRIPTIONS TECHNIQUES CONCERNANT LA DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ ALAD

Méthode européenne standardisée pour la détermination de l'activité de la déhydratase de l'acide delta-aminolévulinique

Le principe de la méthode adoptée pour la détermination de l'activité de la déhydratase de l'acide delta-aminolévulinique est bien connu. Il est basé sur l'incubation de l'enzyme avec un excès de substrat d'acide delta-aminolévulinique. Le porphobilinogène formé après un temps déterminé est mélangé avec le réactif d'Ehrlich modifié et la couleur obtenue est mesurée à l'aide d'un photomètre contre un blanc. La quantité de porphobilinogène produit est indicative de l'activité de l'ALAD.

MÉTHODE Effet de la lumière

Des expériences récentes ont montré que le porphobilinogène surtout est très sensible à la lumière. Toute l'analyse devrait être réalisée en l'absence de toute lumière solaire directe dans le laboratoire (et non seulement à l'endroit où s'effectue l'analyse).

Première phase - Échantillonnage du sang et conservation avant l'analyse - Faire une prise de sang de 2 ml de sang veineux à l'aide d'une seringue en plastique (non stabilisée au plomb) en présence d'héparine séchée ( - Préparer immédiatement quatre prélèvements de 0,2 ml répartis dans des tubes en plastique (non stabilisés au plomb) et les refroidir à 4 ºC. Le pipetage est à effectuer avec des pipettes graduées du type Marbourg.

- Si l'analyse est réalisée dans un délai de 3 heures, le refroidissement des prélèvements n'est pas nécessaire.

- La durée maximale de conservation des échantillons à 4 ºC est de 24 heures.

- Juste avant l'analyse, il faut placer tous les échantillons dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes.

Remarque : Parmi les matières plastiques à retenir, citons le polyéthylène, le polystyrène et le polypropylène. La durée de conservation de 24 heures à 4 ºC résulte d'une estimation prudente. Ce laps de temps est suffisant pour permettre le transport de l'échantillon du lieu de la prise de sang à un laboratoire central en vue de l'analyse. Sur les quatre prélèvements de sang, trois doivent être utilisés pour la détermination de l'ALAD et un pour l'essai témoin.

Deuxième phase - Détermination de l'hématocrite

Cette détermination doit être effectuée: - en même temps que la prise de sang,

- par une méthode capillaire utilisant deux échantillons.

Centrifugation après fermeture d'une extrémité à une vitesse de 30 000 tours par minute au minimum (pas moins de 5 minutes).

Remarque : Cette détermination est de préférence à réaliser sur place, mais pas plus de 24 heures après la prise de sang. Utiliser si possible une centrifugeuse microhématocrite.

Troisième phase - Hémolyse - Hémolyser trois échantillons de sang préalablement dégelés avec 1,3 ml d'eau distillée (préalablement portée à 37 ºC) pendant 10 minutes à 37 ºC ± 0,2 ºC.

- Ajouter l'eau de préférence à l'aide d'une pipette graduée de 2 ml, puis mélanger intimement.

- Ne plus agiter les échantillons à ce stade.

Remarque : Il a été décidé d'utiliser de l'eau et non du Triton X 100 pour l'hémolyse. Les expériences d'hémolyse avec le Triton X 100 conduisent à un freinage considérable de l'activité de l'ALAD, que l'on n'a pas encore expliqué et qui pourrait correspondre à un artéfact.

Quatrième phase - Addition de la solution d'ALA à l'hémolyse - Préparer la solution d'ALA.

- Elle ne doit pas être préparée depuis plus de 5 heures.

- Porter cette solution à 37 ºC pendant au moins 10 minutes avant addition.

- Ajouter 1 ml de cette solution à l'hémolysat, de préférence à l'aide d'une pipette à boule de 1 ml puis mélanger.

Remarque : Un pH de 6,4 a été retenu, des expériences ayant montré que c'est à cette valeur de pH que correspond la meilleure corrélation entre les activités de l'ALAD et les taux de plombémie pour des populations normales. Il ne s'agit pas d'obtenir le maximum d'activité (réalisable par élévation du pH) puisque les activités à déterminer sont suffisamment importantes.

Cinquième phase - Préparation du témoin - 0,2 ml de sang traité comme pour la détermination de l'ALAD jusqu'au moment de l'addition de la solution d'ALA ; au lieu de celle-ci, ajouter 1 ml de solution de HgCl2-TCA, puis 1 ml de solution d'ALA, et procéder ensuite comme pour la détermination de l'ALAD (voir ci-dessous).

- Pour l'addition ci-dessus, on utilisera des pipettes à soufflage.

Remarque : Un témoin seulement est comparé à une série de 3 essais pour chaque échantillon de sang. Si la densité optique obtenue pour le témoin est très haute, on répétera l'opération pour contrôle.

Sixième phase - Incubation - 60 minutes à 37 ºC ± 0,2 ºC au bain-marie.

- Le temps d'incubation à partir de l'addition de la solution d'ALA.

Remarque : Le temps d'incubation de 60 minutes a été choisi pour augmenter naturellement l'activité de l'ALAD, étant donné qu'aucune autre phase n'a eu pour effet d'augmenter l'activité artificiellement. Des expériences ont montré que la relation temps d'incubation - activité est linéaire pour les laps de temps excédant deux heures.

La température d'incubation a été maintenue à 37 ºC pour des raisons pratiques.

Septième phase - Arrêt de la réaction PBG - Ajouter 1 ml de solution HgCl2-TCA au mélange d'incubation, de préférence avec une pipette à soufflage à boule de 1 ml.

Huitième phase - Centrifugation et filtration

- 30 000 tours par minute.

- Filtration sur papier Whatman nº 54 ou équivalent (résistant à l'acide).

Remarque : La centrifugation doit durer environ 10 minutes.

La phase de filtration a été introduite afin d'éviter le pipetage de petites particules sur la surface du liquide surnageant. Ces particules semblent produire une réaction colorée avec le réactif d'Ehrlich. Plusieurs essais ont montré que l'introduction de la phase de filtration améliore la reproductibilité. La phase de filtration peut au besoin être remplacée par une seconde centrifugation.

Neuvième phase - Réaction avec le réactif d'Ehrlich - Mélanger 1 ml de liquide surnageant avec 1 ml de réactif d'Ehrlich modifié à l'aide de pipettes à boule.

- Mélanger au moyen d'un mélangeur du type Vortex pour assurer l'homogénéité.

- Laisser réagir pendant 5 minutes avant de mesurer l'extinction.

Remarque : Il importe, pour assurer l'homogénéité, de veiller à ce que le liquide surnageant filtré se mélange intimement avec le réactif d'Ehrlich.

Dixième phase - Mesure de l'extinction - On étalonnera le spectrophotomètre à l'aide d'une solution de phénolphtaléine dans un tampon basique.

- Mesure d'extinction de l'échantillon par rapport au témoin à 555 nm dans une cellule de 1 cm (ou de 2 cm si l'absorption est très faible).

Onzième phase - Calcul de l'activité enzymatique - L'équation permettant de calculer l'activité est la suivante: >PIC FILE= "T0010808">

OD = extinction mesurée

60 = temps d'incubation

35 = facteur de dilution

62 = coefficient molaire d'extinction en cm2/¶mol

K = coefficient de correction spectrophotométrique

Remarque : Les unités proposées sont conformes aux recommandations relatives à la nomenclature des enzymes de l'union internationale de biochimie.

SOLUTIONS

1. Préparation d'une solution d'ALA

Solution A:

1,78 g de Na2HPO4 7 2H2O dissous dans 100 ml d'eau distillée (de préférence par déionisation).

Solution B:

1,38 g de NaH2PO4 7 1H2O dissous dans 100 ml d'eau distillée.

29 ml de solution A + 71 ml de solution B donnent un tampon de 0,1 M phosphate de Na à pH 6,4.

Cette force ionique de tampon est nécessaire pour empêcher toute variation du pH dans la solution en réaction.

167,6 mg d'ALA-HCl sont dissous dans la solution B (celle-ci devant toujours être acide) ; le pH est ajusté à 6,4 au moyen de la solution A. Le volume est alors porté à 100 ml avec la solution tampon 0,1 M phosphate de Na à pH 6,4. Cette préparation donne une solution de 0,01 M ALA.

2. Solution de HgCl2-TCA

1,35 g de HgCl2 sont dissous dans 100 ml d'acide trichloracétique à 10 %.

3. Solution de réactif d'Ehrlich

Réactifs:

2,5 g de diméthylaminobenzaldéhyde (pDMAB)

0,25 g de HgCl2 dissous dans 10 ml d'acide acétique glacial

acide perchlorique masse spécifique 1,7

acide acétique glacial

Préparation:

Dissoudre le pDMAB dans 50 ml d'acide acétique, ajouter 24,5 ml d'acide perchlorique et 4 ml de solution de HgCl2. Mélanger, refroidir et porter à 100 ml avec de l'acide acétique glacial dans un ballon gradué (1). Conserver dans un flacon sombre.

Calibration:

Une calibration annuelle au niveau communautaire devra avoir lieu par l'intermédiaire d'un laboratoire désigné en commun par les États membres. (1)Si, à ce stade, une coloration brune apparaît, le réactif doit être rejeté.