RÈGLEMENT (CEE) No 690/92 DE LA COMMISSION du 19 mars 1992 établissant une méthode de référence pour la détection de la caséine de lait de vache dans les fromages à base de lait de brebis

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu l'acte d'adhésion de l'Espagne et du Portugal, et notamment son article 67 paragraphes 1 et 2, son article 98, son article 234 paragraphe 2 et son article 310,

vu le règlement (CEE) no 1677/85 du Conseil, du 11 juin 1985, relatif aux montants compensatoires monétaires dans le secteur agricole (1), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 2205/90 (2), et notamment son article 1er paragraphe 1,

vu le règlement (CEE) no 804/68 du Conseil, du 27 juin 1968, portant organisation commune des marchés dans le secteur du lait et des produits laitiers (3), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 374/92 de la Commission (4), et notamment son article 9 paragraphe 3, son article 14 paragraphe 7 et son article 17 paragraphe 4,

vu le règlement (CEE) no 876/68 du Conseil, du 28 juin 1968, établissant, dans le secteur du lait et des produits laitiers, les règles générales relatives à l'octroi des restitutions à l'exportation et aux critères de fixation de leur montant (5), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 1344/86 (6), et notamment son article 6 paragraphe 3,

considérant que les fromages fabriqués exclusivement avec du lait de brebis sont soumis à certaines règles spécifiques en vertu des règlements communautaires du secteur agricole; que, préalablement à l'application de ces règles, il y a lieu de s'assurer que le produit concerné ne contient pas de lait de vache;

considérant qu'une aide au stockage privé des fromages à base de lait de brebis peut être octroyée en vertu du règlement (CEE) no 508/71 du Conseil, du 8 mars 1971, établissant les règles générales régissant l'octroi d'aides pour le stockage privé de fromages de garde (7); qu'une restitution spéciale peut être octroyée pour les mêmes produits dans les conditions fixées par le règlement (CEE) no 876/68; qu'aucun montant compensatoire monétaire n'est appliqué à l'échange de produits à base de lait de brebis en vertu du règlement (CEE) no 1677/85; que l'application de montants compensatoires « adhésion » est exclue pour les échanges de fromages à base de lait de brebis vers l'Espagne et en provenance de celle-ci conformément au règlement (CEE) no 466/86 du Conseil, du 25 février 1986, déterminant les règles générales du régime des montants compensatoires « adhésion » dans le secteur du lait et des produits laitiers en raison de l'adhésion de l'Espagne (8), et par le règlement (CEE) no 3640/90 du Conseil, du 11 décembre 1990, déterminant les règles générales du régime des montants compensatoires « adhésion » dans le secteur du lait et des produits laitiers pendant la deuxième étape de l'adhésion du Portugal (9);

considérant que la Commission ayant effectivement établi les dispositions précitées concernant les fromages fabriqués avec du lait de brebis, il est nécessaire de vérifier par un contrôle approprié qu'aucun lait de vache n'a été incorporé dans les produits concernés; qu'il paraît nécessaire, au niveau du contrôle, d'établir une méthode de référence communautaire de détection du lait de vache, sans préjudice de l'application de méthodes de routine si celles-ci se conforment à certains critères;

considérant que le comité de gestion du lait et des produits laitiers n'a pas émis d'avis dans le délai imparti par son président,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

La méthode d'analyse de référence figurant en annexe est appliquée pour garantir que le fromage devant être fabriqué exclusivement avec du lait de brebis ne contient pas de caséine de lait de vache.

La caséine de lait de vache est considérée comme présente si la teneur apparente en caséine de lait de vache de l'échantillon à analyser est égale ou supérieure à la teneur de l'échantillon de référence décrit en annexe.

Article 2

Les méthodes de routine pour la détection de la caséine de lait de vache dans les fromages à base de lait de brebis peuvent être utilisées dans les conditions suivantes:

- la limite de détection doit être de 0,5 % au maximum,

- il ne peut pas y avoir de résultats faux-positifs. Si cette condition n'est pas remplie, tout échantillon donnant un résultat positif doit être analysé au moyen de la méthode de référence,

- la caséine de lait de vache doit être détectable avec la sensibilité requise, même après de longues périodes de maturation, comme cela peut se produire dans les conditions habituelles de l'exploitation commerciale. Si cette exigence n'est pas satisfaite pour un certain type de fromage à base de lait de brebis, ce fromage doit être analysé au moyen de la méthode de référence.

Article 3

Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Il est applicable à partir du 16 septembre 1992. Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 19 mars 1992. Par la Commission

Ray MAC SHARRY

Membre de la Commission

(1) JO no L 164 du 24. 6. 1985, p. 6. (2) JO no L 201 du 31. 7. 1990, p. 9. (3) JO no L 148 du 28. 6. 1968, p. 13. (4) JO no L 41 du 18. 2. 1992, p. 9. (5) JO no L 155 du 3. 7. 1968, p. 1. (6) JO no L 119 du 8. 5. 1986, p. 36. (7) JO no L 58 du 11. 3. 1971, p. 1. (8) JO no L 53 du 1. 3. 1986, p. 23. (9) JO no L 362 du 27. 12. 1990, p. 3.

g ANNEXE

MÉTHODE DE RÉFÉRENCE POUR LA DÉTECTION DE LA CASÉINE DE LAIT DE VACHE DANS LES FROMAGES À BASE DE LAIT DE BREBIS

1. Objet Détection de la caséine de lait de vache dans les fromages à base de lait de brebis au moyen de la focalisation isoélectrique des caséines g (gamma) après action de la plasmine. 2. Champ d'application Cette méthode convient pour la détection sensible et spécifique de la caséine de lait de vache dans les fromages frais et affinés à base de lait de brebis. 3. Principe de la méthode 3.1. Isolement ou extraction des caséines du fromage. 3.2. Dissolution des caséines isolées et protéolyse par la plasmine (EC.3.4.21.7). 3.3. Focalisation isoélectrique des caséines soumises à l'action de la plasmine en présence d'urée et coloration des protéines avec le bleu brillant G 250 de coomassie. 3.4. Interprétation des profils de caséine g2 après coloration (identification du lait de vache) par comparaison du profil obtenu pour l'échantillon avec celui obtenu sur le même gel pour les échantillons de référence contenant 0 % et 1 % de lait de vache. 4. Réactifs Sauf indication contraire, les produits chimiques utilisés doivent être analytiquement purs. L'eau doit être bidistillée ou d'une pureté équivalente. Remarque: Les données suivantes s'appliquent à des gels de polyacrylamide contenant de l'urée, d'un format de 265 × 125 × 0,25 mm, préparés en laboratoire. En cas d'utilisation d'autres formats et d'autres types de gels, les conditions de séparation devront, le cas échéant, être adaptées. Focalisation isoélectrique 4.1. Réactifs destinés à la préparation des gels de polyacrylamides contenant de l'urée 4.1.1. Solution « mère » ou solution « stock » du gel Dissoudre: 4,85 g d'acrylamide 0,15 g de N,N-méthylène-Bis-acrylamide (BIS) 48,05 g d'urée 12,22 g de glycérol (87 %, exprimés en m/m) dans de l'eau, amener à 100 ml et conserver au frais dans une bouteille de verre brun. Remarque: Les quantités indiquées d'acrylamide neurotoxique peuvent être remplacées par une solution d'acrylamide et bis-acrylamide prémélangés disponible dans le commerce. Dans le cas où la solution du commerce a une concentration de 30 % d'acrylamide et 0,8 % de bis-acrylamide, les quantités indiquées dans la préparation susmentionnée (4,85 g d'acrylamide et 0,15 g de Bis) doivent être remplacées par un volume de 16,2 ml de cette solution du commerce. La solution « stock » ne peut être conservée que maximum dix jours; si sa conductivité est plus que 5 mS, il faut déoniser en mélangeant avec 2 g d'Amberlite MB-3 pendant trente minutes, ensuite filtrer par une membrane de 0,45 mm. 4.1.2. Solution de gel Préparer une solution de gel en mélangeant des additifs et des ampholytes avec la solution « mère » ou solution « stock » de gel (point 4.1.1). 9,0 ml de solution de base de gel 24 mg de v-alanine 500 ml d'ampholyte pH 3,5-9,5 (1) 500 ml d'ampholyte pH 6-7 (1). Mélanger la solution de gel et la dégazer dans un bain à ultrasons ou sous vide pendant deux à trois minutes. Remarque: La solution doit être préparée juste avant d'être coulée (point 6.2). 4.1.3. Catalyseurs Solution de persulfate d'ammonium (PER) à 40 % m/v (masse volume): dissoudre 800 mg de PER dans de l'eau et amener à 2 ml. N,N,NN-tétraméthylènediamine (TEMED). Remarque: La solution PER doit toujours être fraîchement préparée. 4.2. Liquides de contact Kérosène ou paraffine liquide. 4.3. Solution anodique Ajouter de l'eau à 5,77 g d'acide phosphorique (85 % m/m) jusqu'à obtention d'un volume de 100 ml. 4.4. Solution cathodique Dissoudre 2,00 g d'hydroxyde de sodium dans de l'eau jusqu'à obtention d'un volume de 100ml. Préparation des échantillons 4.5. Réactifs destinés à l'isolement (ou extraction) des protéines Dichlorométhane. Solution diluée d'acide acétique: 25 ml d'acide acétique cristallisable. Compléter à 100 ml avec de l'eau distillée acétone desséchée. 4.6. Solution tampon de dissolution des protéines 5,75 g de glycérol (87 % m/m) 24,03 g d'urée 250 mg de dithiothréitol. Dissoudre dans de l'eau distillée jusqu'à obtention d'un volume de 50 ml. Remarque: Stocker dans le réfrigérateur. La solution se conserve au maximum une semaine. 4.7. Réactifs destinés à la protéolyse due à la plasmine 4.7.1. Tampon de carbonate d'ammonium Ajuster jusqu'à pH 8 une solution d'hydrogénocarbonate d'ammonium à 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml d'eau) à l'aide d'une solution de carbonate d'ammonium à 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml d'eau). 4.7.2. Plasmine bovine (EC.3.4.21.7), minimum 5 U/ml 4.7.3. Solution destinée à l'inhibition de l'enzyme Dissoudre 2,624 g d'acide e aminocaproïque (acide amino 6 i-hexanoïque) dans 100 ml d'éthanol à 40 % v/v. 4.8. Préparation des échantillons de référence de lait écrémé de brebis emprésuré contenant 0 % et 1 % de lait de vache Le lait écrémé est préparé par centrifugation de lait de brebis ou de vache cru à 37 °C (2 500 g, vingt minutes). Refroidir le tube et son contenu rapidement à 6-8 °C, puis éliminer complètement la couche de matière grasse rassemblée en surface. Pour la préparation d'un échantillon de référence de 1 %, ajouter 5,00 ml de lait de vache écrémé à 495 ml de lait de brebis écrémé dans un becher de 1 l et ajuster le pH à 6,4 en ajoutant de l'acide lactique dilué à 10 % v/v. Thermostater à 35 °C et ajouter 100 ml de présure de veau (1:10 000, environ 3 000 U/ml), mélanger pendant une minute, puis couvrir le becher d'une feuille d'aluminium et laisser reposer à 35 °C pendant une heure pour laisser le caillé se former. Après formation du caillé, le lait emprésuré est entièrement lyophilisé, sans homogénéisation préalable ou égouttage du lactosérum. Le lait lyophilisé est finement broyé en une poudre homogène. Pour la préparation de l'échantillon de référence de 0 %, suivre la même procédure avec 500 ml de pur lait de brebis écrémé. Remarque: Il est recommandé de vérifier la pureté du lait de brebis par focalisation isoélectrique des caséines soumises à l'action de la plasmine avant la préparation des échantillons de référence. Réactifs destinés à la coloration des protéines 4.9. Fixateur Dissoudre 150 ml d'acide trichloroacétique dans de l'eau jusqu'à obtention d'un volume de 1 000 ml. 4.10. Solution de décoloration Mélanger 500 ml de méthanol et 200 ml d'acide acétique cristallisable avec de l'eau distillée et amener à 2 000 ml. Remarque: Renouveler quotidiennement la solution de décoloration; elle peut être préparée en mélangeant à volume égal une solution « stock » de méthanol à 50 % (v/v) et une solution « stock » d'acide acétique à 20 % (v/v). 4.11. Solution de coloration 4.11.1. Solution de coloration (solution « stock » 1) Dissoudre 3,0 g de bleu brillant G 250 de coomassie (C.I.42655) dans 1 000 ml de méthanol à 90 % (v/v) au moyen d'un agitateur magnétique (environ quarante-cinq minutes); passer la solution à travers deux filtres plissés. 4.11.2. Solution de coloration (solution « stock » 2) Dissoudre 5,0 g de sulfate de cuivre pentahydraté dans 1 000 ml d'acide acétique à 20 % (v/v). 4.11.3. Solution de coloration (prête à l'emploi) Mélanger 125 ml de chaque solution « stock » (points 4.11.1 et 4.11.2) immédiatement avant la coloration. Remarque: La solution de coloration prête à l'emploi peut être réutilisée dans la même journée. 5. Appareillage et accessoires 5.1. Plaques de verre (265 × 125 × 4 mm); rouleaux en caoutchouc d'une largeur de 15 cm; table à niveau réglable 5.2. Feuille de support de gel pour polyacrylamide (265 × 125 mm) 5.3. Seconde feuille (280 × 125 mm). Coller sur les deux longueurs de cette feuille une bande de ruban adhésif de 280 × 6 × 0,25 mm servant d'écarteur permettant l'obtention d'un gel de 0,25 mm d'épaisseur (figure 1) 5.4. Cuve d'électrofocalisation avec plaque de refroidissement (par exemple, 265 × 125 mm) et générateur de tension approprié (> 2,5 kV) ou appareil automatique d'électrophorèse 5.5. Cryostat à circulation, maintenu à la température de 12 ± 0,5 °C 5.6. Centrifugeuse réglable à 3 000 g 5.7. Bandes de papier pour électrodes (> 265 mm de long) 5.8. Flacon compte-gouttes en matière synthétique pour les solutions anodique et cathodique 5.9. Applicateurs d'échantillons 10 × 5 mm (viscose ou papier filtre à faible adsorption des protéines) 5.10. Ciseaux, scalpels et pincettes en acier inoxydable 5.11. Cuves de coloration et de décoloration en acier inoxydable (par exemple, cuves d'une dimension de 265 ×150 mm) 5.12. Homogénéisateur réglable (tige de 10 mm de diamètre, régime de vitesse de rotation 8 000-20 000 tours/min.) 5.13. Agitateur magnétique 5.14. Bain à ultrasons 5.15. Appareil permettant la soudure des feuilles 5.16. Pipettes graduées en microlitres (de 5-25 ml) 5.17. Évaporateur rotatif ou centrifugeuse sous vide (concentrator) 5.18. Bain-marie réglable à 35 et 40 ± 1 °C avec dispositif d'agitation 5.19. Densitomètre (lecture à une longueur d'onde de 634 mm) 6. Mode opératoire 6.1. Préparation des échantillons 6.1.1. Extraction ou isolement des caséines Introduire l'équivalent d'environ 5 g de matière sèche de fromage ou d'échantillon de référence - dans le cas des fromages à croûte fleurie, prélever de préférence dans une zone non affinée - dans un tube de centrifugation de 100 ml, ajouter 60 ml d'eau distillée et homogénéiser à l'aide de l'homogénéisateur (8 000-10 000 tours/min.). Ajouter à pH 4.6 à l'aide de la solution d'acide acétique diluée (point 4.5) et centrifuger (5 mm, 3 000 g). Éliminer la matière grasse et la phase sérique surnageantes. Le culot de centrifugation est homogénéisé dans 40 ml d'eau distillée ajustée à pH 4.5 à l'aide de la solution d'acide acétique diluée. Ajouter 20 ml de dichlorométhane (point 4.5). Homogénéiser à nouveau puis centrifuger (5 mm, 3 000 g). À l'aide d'une spatule, soulever la couche de caséine surnageante entre la phase aqueuse et la phase organique (figure 2) et éliminer les deux phases. Homogénéiser à nouveau la caséine dans 40 ml d'eau distillée (voir ci-dessus) et 20 ml de dichlorométhane et centrifuger. Répéter ce processus jusqu'à ce que la coloration des phases d'extraction devienne négligeable (deux, trois fois). Homogénéiser le résidu de protéines avec 50 ml d'acétone desséchée (point 4.5) et filtrer la solution sur un filtre à plis. Laver le résidu deux fois avec 25 ml d'acétone sur le filtre et laisser sécher à l'air ou sous un courant d'azote; réduire ensuite en fines particules dans un mortier.

Remarque: Les extraits protéiques séchés se conservent indéfiniment à température ambiante. Pour une extraction rapide des protéines, homogénéiser (à 20 000 tours/min.) deux fois avec 100 ml d'acétone chaque fois (point 4.5) l'équivalent de 5 g de matière sèche de fromage, laisser reposer cinq minutes, puis filtrer la solution sur un filtre à plis. Sécher le résidu de filtration avec l'acétone, comme indiqué ci-dessus, pour obtenir finalement de la poudre séchée à l'acétone. La méthode rapide n'est pas applicable aux fromages de type Roquefort. 6.1.2. Transformation des caséines v en caséines g par action de la plasmine Mettre en suspension dans 0,5 ml de tampon carbonate d'ammonium (point 4.7.1) soit 25 mg de caséines obtenues selon le point 6.11, soit 50 mg d'échantillon de référence lyophilisé (point 4.8) ou de poudre sèche à l'acétone (méthode rapide; remarque au point 6.1.1) et homogénéiser pendant vingt minutes en utilisant, par exemple, le traitement ultrasonique. Thermostater à 40 °C et ajouter 10 ml de plasmine (point 4.7.2), mélanger et incuber pendant une heure à 40 °C sans cesser d'agiter. Pour inhiber les enzymes, ajouter 20 ml d'acide e-aminocaproïque (point 4.7.3), puis ajouter 200 mg d'urée et 2 mg de dithiothréïtol. Remarque: Pour obtenir une meilleure symétrie des bandes dans les bandes de caséine focalisées, il est recommandé de lyophiliser la solution après avoir l'acide e-aminocaproïque puis de dissoudre les lyophilisats obtenus dans 0,5 ml de solution tampon (4.6). 6.2. Préparation des gels de polyacrylamide contenant de l'urée Appliquer au rouleau, sur une plaque de verre (point 5.1), la feuille de support du gel (point 5.2) à l'aide de quelques gouttes d'eau; éponger l'eau excédentaire avec une serviette de papier (cette première plaque constitue le dispositif supérieur de coulage des gels). De la même manière, appliquer au rouleau la seconde feuille (point 5.3), pourvue de ruban adhésif (écarteurs de 0,25 mm), sur une autre plaque de verre. Cette seconde plaque posée horizontalement sur table à niveau réglable constitue le dispositif inférieur de coulage des gels. Ajouter à la solution de gel préparée et dégazée (point 4.1.3) 10 ml de chaque catalysateur - TEMED et PER (point 4.1.3) -, mélanger rapidement et verser uniformément au centre de la seconde feuille de support (dispositif inférieur). Poser un bord de la plaque supérieure, support du gel (côté feuille vers le bas) sur la plaque inférieure et l'abaisser jusqu'à ce qu'un film de gel se forme et s'étende uniformément, sans inclusions d'aire, entre les feuilles (figure 3). À l'aide d'une fine spatule, abaisser totalement la plaque supérieure support du gel et poser dessus pour faire pression trois autres plaques de verre. Après polymérisation complète (soixante minutes), récupérer en même temps le gel polymérisé sur la feuille supérieure ainsi que la feuille inférieure en écartant les deux plaques de verre. Nettoyer soigneusement le dos de la feuille de support des restes de gel et de l'urée. Souder entre eux les bords du « sandwich de gel » dans le sens de la largeur; on obtient ainsi un tube que l'on peut conserver au réfrigérateur (maximum six semaines). Remarque: La seconde feuille de support avec les écarteurs peut être réutilisée. Le gel de polyacrylamide peut être découpé en plus petits formats; ceci est recommandé en cas d'échantillonnages restreints ou en cas d'utilisation d'un appareil automatique d'électrophorèse (deux gels de format 4,5 × 5 cm). 6.3. Focalisation isoélectrique Régler le cryostat à 12 °C. Essuyer le dos de la feuille de support du gel à l'aide de kérosène, verser quelques gouttes de kérosène (point 4.2) au centre du bloc de refroidissement. Appliquer le « sandwich de gel » (après l'avoir déroulé) en éliminant les bulles d'aire, côté support vers le bas. Essuyer l'excédent de kérosène et retirer la seconde feuille de support. Imbiber les bandes des solutions anodiques et cathodiques (points 4.3 et 4.4), les couper à la longueur du gel et les mettre en place (distance des électrodes: 9,5 cm). Procéder à la focalisation dans les conditions suivantes. 6.3.1. Format de gel 265 × 125 × 0,25 mm Étape Durée (min.) Tension (V) Courant (mA) Puissance (W) Volts/heures (vh) 1. Préfocalisation 30 maximum 2 500 maximum 15 constante 4 environ 300 2. Focalisation (*) d'échantillons (*) 60 maximum 2 500 maximum 15 constante 4 environ 1 000 3. Focalisation 60 maximum 2 500 maximum 5 maximum 20 environ 3 000 40 maximum 2 500 maximum 6 maximum 20 environ 3 000 30 maximum 2 500 maximum 7 maximum 25 environ 2 500 (*) Application des échantillons: après avoir procédé à la préfocalisation (étape 1), déposer à l'aide d'une pipette 18 ml de chaque solution échantillon sur les applicateurs d'échantillons (10 × 5 mm); les poser sur le gel à intervalle de 1 mm les uns des autres et à 5 mm le long de l'anode. Procéder à la focalisation en respectant les conditions indiquées ci-dessus et après soixante minutes de focalisation d'échantillons, retirer délicatement les applicateurs d'échantillons. Remarque: Si l'épaisseur de la largeur des gels change, les valeurs du courant et de la puissance doivent être adaptées (par exemple en cas d'utilisation d'un gel de format 265 × 125 × 0,5 mm). 6.3.3. Exemple de programmation d'appareil automatique d'électrophorèse (deux gels de 5,0 × 4,5 cm); placer les électrodes sans bande directement sur le gel. Étape Tension Courant Puissance Températuure Volts-heures 1. Préfocalisation 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Focalisation des échantillons 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Focalisation 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Focalisation 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh Placer l'applicateur d'échantillons à l'étape 2 à 00 Vh. Oter l'applicateur d'échantillons à l'étape 2 à 30 Vh. 6.4. Coloration des protéines 6.4.1. Fixation des protéines Après avoir coupé le courant, retirer immédiatement les bandes et placer le gel dans une cuve de coloration/décoloration remplie de 200 ml de fixateur (4.9); laisser reposer quinze minutes en agitant de temps en temps. 6.4.2. Lavage et coloration de la plaque de gel Décanter soigneusement le fixateur et procéder deux fois à un lavage de trente secondes de la plaque de gel avec 100 ml de solution de décoloration (point 4.10). Décanter la solution de décoloration, remplir la cuve avec 250 ml de solution de coloration (point 4.11.3) et procéder à la coloration pendant quarante-cinq minutes en agitant légèrement. 6.4.3. Décoloration de la plaque de gel Décanter la solution de coloration et procéder à deux lavages de la plaque de gel avec 100 ml de solution de décoloration, agiter ensuite pendant deux fois quinze minutes, au moins avec 200 ml de solution de décoloration jusqu'à ce que le fond devienne clair et perde sa coloration. Laver ensuite la plaque de gel avec de l'eau distillée (2 × 2 minutes) et sécher à l'air (deux, trois heures) ou à l'aide d'un sèche-cheveux (environ dix, quinze minutes). Remarque: Les opérations de fixation, de lavage, de coloration et de décoloration doivent s'effectuer à la température de 20 °C. Ne pas utiliser de températures élevées. 7. Interprétation des résultats L'interprétation des résultats se fait en comparant le profil des protéines de l'échantillon à examiner avec les échantillons de référence sur le même gel. Les protéines de la vache sont détectées dans le lait de brebis ou dans les produits dérivés de ce lait par la mise en évidence des caséines g2 et g3 renforcées par action de la plasmine et dont les points isoélectriques se situent entre pH 6,5 et 7,5 (figures 4 et 5). La limite de détection est inférieur à 0,5 %. Pour une interprétation visuelle de la quantité de lait de vache, il est recommandé d'adapter les concentrations d'échantillons et d'échantillons de référence afin d'obtenir le même degré d'intensité des caséines g2 de brebis (voir « g2S » dans les figures 4 et 5. Dans ce cas, la quantité de lait de vache (inférieure, égale ou supérieure à 1 %) dans l'échantillons inconnu peut être jugée directement en comparant l'intensité des caséines g2 de vache (voir « g2C » dans les figures 4 et 5). Remarque: La méthode est satisfaisante s'il existe une réponse positive claire (présence de caséine g2 de vache) dans l'échantillon de référence de 1 % mais pas dans l'échantillon de référence de 0 %. Si tel n'est pas le cas, améliorer le processus en suivant scrupuleusement les instructions de la méthode. 8. Références Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isoelectric focusin of g2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of g2-caseins using plasmin as signal amplifier. En: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, Muenchen (1989). Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (in préparation). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figure 1. Dessin schématique de la seconde feuille

Écarteur

Feuille de polyester

Figure 2. Couche de caséine surnageante entre la phase aqueuse et la phase organique après centrifugation

H2O-Phase

Caséine

CH2Cl2-Phase

Figure 3. Technique de rabat pour la coulée de gels de polyacrylamide ultrafin

a = écarteur (0,25 mm); b = seconde feuille (point 5.3); c, e = plaques de verre (point 5.1); d = solution de gel (point 4.1.2); f = feuille de support de gel (point 5.2)

Figure 4. Focalisation isoélectrique des caséines de fromage de type « pecorino » contenant différentes quantités de lait de vache, soumises à l'action de la plasmine. Le signe % CM = pourcentage de lait de vache, C = vache, S = brebis

Fromage de Pecorino contenant

Figure 5. Superposition de densitogrammes d'échantillons de fromage du type « pecorino » contenant 0, 1, 2, 3 et 7 % de lait de vache après focalisation isoéléctrique. La moitié supérieure du gel a été lue à une longueur d'onde de 634 mm. STD = échantillons de référence contenant 0 et 1 % de lait de vache

(1) Les produits Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) et Servalyt pH 6-7 (Serva) se révèlent particulièrement efficaces pour obtenir la résolution de la -caséine.