2)

la partie D suivante est ajoutée: «D. Méthode de la digestion d’échantillons collectifs utilisant un agitateur magnétique/filtration et détection de larves par test d’agglutination au latex Cette méthode est jugée équivalente uniquement pour les tests réalisés sur de la viande de porcins domestiques 1. Appareillage et réactifs a) Un couteau ou des ciseaux et des pinces pour le prélèvement des échantillons. b) Des plateaux divisés en 50 carrés pouvant contenir chacun des échantillons de viande d’environ 2 g ou d’autres outils donnant des garanties équivalentes en ce qui concerne la traçabilité des échantillons. c) Un mixeur muni d’une lame hachoir tranchante. Lorsque les échantillons pèsent plus de 3 g, utiliser un hache-viande pourvu d’orifices de 2 à 4 mm ou des ciseaux. Dans le cas de viande congelée ou de la langue (après ablation de la couche superficielle, qui ne peut être digérée), il est nécessaire d’utiliser un hache-viande et d’augmenter considérablement la taille de l’échantillon. d) Des agitateurs magnétiques pourvus d’une plaque chauffante avec température contrôlée et des barreaux magnétiques recouverts de téflon d’une longueur approximative de 5 cm. e) Des béchers en verre d’une capacité de 3 litres. f) Des tamis, finesse de la maille 180 μm, d’un diamètre extérieur de 11 cm, pourvus d’un treillis en acier inoxydable. g) Appareillage de filtration en acier pour filtres à mailles de 20 μm muni d’un entonnoir en acier. h) Pompe à vide. i) Des réservoirs en métal ou en plastique d’une capacité de 10 à 15 litres pour récolter les sucs digestifs restants. j) Un agitateur giratoire 3D. k) Une feuille d’aluminium. l) Acide chlorhydrique à 25 %. m) Pepsine, concentration: 1:10 000 NF (US National Formulary) correspondant à 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) et à 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), ou pepsine liquide stabilisée contenant au minimum 660 unités pharmacopée européenne par ml. n) Eau du robinet chauffée à 46-48 °C. o) Une balance d’une précision de 0,1 g. p) Des pipettes de différentes tailles (1, 10 ou 25 ml), des micropipettes conformes aux instructions du fabricant de tests d’agglutination au latex, et des supports pour pipettes. q) Des filtres à mailles en nylon de 20 μm, diamètre adapté au système de filtration. r) Pinces en plastique ou en acier de 10-15 cm. s) Fioles coniques de 15 ml. t) Un pilon à bout conique en Téflon ou en acier adapté aux fioles coniques. u) Un thermomètre d’une précision de 0,5 °C allant de + 1 à + 100 °C. v) Cartes d’agglutination au latex du matériel de test de détection d’antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011. w) Solution tampon avec conservateur (diluant type) du matériel de test de détection d’antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011. x) Tampon complété par un conservateur (contrôle négatif) du matériel de test de détection d’antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011. y) Tampon complété par des antigènes Trichinella spiralis et un conservateur (contrôle positif) du matériel de test de détection d’antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011. z) Tampon à particules de polystyrène recouvert d’anticorps complétés par un conservateur (perles de latex) du matériel de test de détection d’antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011. aa) Bâtons jetables. 2. Collecte d’échantillons Se conformer au chapitre I, point 2. 3. Procédure I. Pour les groupes complets d’échantillons (100 g d’échantillons à la fois), il est impératif de suivre la procédure décrite au chapitre I, point 3 I, lettres a) à i). En outre, la procédure suivante doit s’appliquer: a) Placer le filtre à mailles en nylon de 20 μm sur le support de filtration. Fixer l’entonnoir conique de filtration en acier au support à l’aide du système de blocage et placer le tamis en acier à mailles de 180 μm sur l’entonnoir. Connecter la pompe à vide au support de filtration et au réservoir en métal ou en plastique pour collecter le liquide de digestion. b) Arrêter de remuer et verser le liquide de digestion sur le tamis placé sur l’entonnoir de filtration. Rincer le bécher avec 250 ml d’eau chaude. Verser obligatoirement le liquide de rinçage dans la rampe de filtration après filtration du liquide de digestion. c) À l’aide des pinces, saisir la membrane de filtration en la tenant par un côté. Plier la membrane de filtration au moins en quatre et l’insérer dans la fiole conique de 15 ml. d) Pousser la membrane de filtration au fond de la fiole conique de 15 ml à l’aide du pilon et appuyer fortement en faisant des mouvements de va-et-vient à l’aide du pilon qui doit être placé dans le pli de la membrane de filtration conformément aux instructions du fabricant. e) Ajouter le diluant type dans la fiole conique de 15 ml à l’aide d’une pipette et homogénéiser la membrane de filtration à l’aide du pilon en effectuant des mouvements de va-et-vient successifs de faible amplitude; éviter les mouvements brusques afin de limiter les éclaboussures conformément aux instructions du fabricant. f) Avec une pipette, répartir chaque échantillon, le contrôle négatif et le contrôle positif, dans des zones distinctes de la carte d’agglutination, conformément aux instructions du fabricant. g) À l’aide d’une pipette, ajouter les perles de latex dans chaque zone de la carte d’agglutination, conformément aux instructions du fabricant, sans les mettre en contact avec le ou les échantillons et les contrôles. À l’aide d’un bâton jetable, mélanger doucement les perles de latex dans chaque zone jusqu’à ce que le liquide homogène couvre l’ensemble de la zone. h) Placer la carte d’agglutination sur l’agitateur 3D et agiter conformément aux instructions du fabricant. i) À l’issue du laps de temps prescrit par les instructions du fabricant, arrêter d’agiter et placer la carte d’agglutination sur une surface plane et lire les résultats de la réaction. Si l’échantillon est positif, des agrégats de perles doivent apparaître. Si l’échantillon est négatif, la suspension reste homogène sans agrégats de perles. j) Tout équipement ayant été en contact avec la viande doit être soigneusement décontaminé entre chaque utilisation en le trempant quelques secondes dans l’eau chaude (de 60 °C à 90 °C). Les surfaces comportant des résidus de viande ou une ou plusieurs larves inactivées peuvent être nettoyées avec une éponge propre et de l’eau du robinet. À la fin de la procédure, ajouter éventuellement quelques gouttes de détergent pour dégraisser les équipements, puis rincer plusieurs fois complètement chaque équipement afin d’enlever toutes les traces de détergent. k) Décontaminer soigneusement le pilon après chaque utilisation en le trempant quelques secondes dans au moins 250 ml d’eau chaude (de 60 °C à 90 °C). Enlever obligatoirement les résidus de viande ou les larves inactivées susceptibles de se trouver sur le pilon avec une éponge propre et de l’eau du robinet. À la fin de la procédure, ajouter éventuellement quelques gouttes de détergent pour dégraisser le pilon, puis rincer plusieurs fois complètement celui-ci afin d’enlever toutes les traces de détergent. II. Groupes de moins de 100 g, tel qu’indiqué au chapitre I, point 3 II Pour les groupes de moins de 100 g, il est impératif de suivre la procédure décrite au chapitre I, point 3 II. III. Résultats positifs ou douteux Lorsque l’examen d’un échantillon collectif suivant la procédure d’agglutination au latex donne un résultat positif ou incertain, un nouvel échantillon de 20 g doit être prélevé sur chaque porcin conformément au chapitre I, point 2 a). Les échantillons de 20 g prélevés sur cinq porcins sont regroupés et examinés suivant la méthode décrite au point I. Des échantillons prélevés sur 20 groupes de cinq porcins doivent ainsi être examinés. Lorsque le test d’agglutination au latex effectué à partir d’un groupe de cinq porcins donne un résultat positif, de nouveaux échantillons de 20 g sont prélevés sur chaque porcin du groupe et examinés séparément suivant l’une des méthodes décrites au chapitre I. Les échantillons contenant des parasites doivent être conservés dans de l’alcool éthylique à 90 % en vue de leur conservation et de l’identification des espèces au laboratoire de référence de l’Union ou au laboratoire de référence national. Après le prélèvement des parasites, les liquides positifs doivent être décontaminés en les chauffant à une température d’au moins 60 °C.»