(6)

Les chapitres C.31 à C.46 suivants sont ajoutés: « C.31. ESSAI SUR PLANTE TERRESTRE: ESSAI D'ÉMERGENCE DE PLANTULES ET DE CROISSANCE DE PLANTULES INTRODUCTION 1. La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 208 (2006) pour les essais de produits chimiques de l'OCDE. Les méthodes d'essai sont régulièrement révisées pour tenir compte des progrès scientifiques et de l'adéquation à la pratique réglementaire. La présente méthode d'essai mise à jour a pour objet d'évaluer les effets potentiels de substances chimiques sur l'émergence et la croissance de plantules. Elle ne couvre pas pour autant tous les effets chroniques ni tous les effets sur la reproduction (c'est-à-dire la grenaison, la formation de fleurs, la maturation des fruits). Il est impératif de tenir compte des conditions d'exposition et des propriétés de la substance de l'essai pour garantir l'utilisation de procédés d'essai appropriés (par exemple, lors de l'essai de métaux et de composés métalliques, il convient de prendre en compte les effets de pH et des contre-ions associés) (1). La présente méthode d'essai ne concerne pas les plantes exposées à des vapeurs de substances chimiques. Elle s'applique aux essais de produits chimiques généraux, aux biocides et aux produits de protection des cultures (également désigné par produits phytosanitaires ou pesticides). Elle s'inspire de procédés existants (2) (3) (4) (5) (6) (7). D'autres références en lien avec les essais sur plantes ont également été consultées (8) (9) (10). L'Appendice 1 présente les définitions utilisées. PRINCIPE DE L'ESSAI 2. Le test évalue les effets d'une exposition à la substance chimique d'essai contenue dans le sol (ou une autre matrice de sol appropriée) sur l'émergence des plantules et le début de croissance des plantes supérieures. Les semences sont placées au contact d'un sol traité par la substance chimique d'essai, dont les effets sont évalués au bout d'environ 14 à 21 jours après émergence de 50 % des plantules dans le groupe témoin. Les points finals mesurés représentent l'évaluation visuelle de l'émergence des plantules, le poids sec des pousses (ou bien le poids frais des pousses) et dans certains cas la hauteur des pousses, ainsi que l'évaluation des effets nocifs visibles sur différentes parties de la plante. Ces mesures et observations sont comparées à celles réalisées sur des plantes témoins non traitées. 3. Selon la voie d'exposition probable, la substance chimique d'essai est incorporée dans le sol (ou éventuellement dans une matrice de sol artificiel) ou bien appliquée sur la surface du sol, ce qui représente précisément la voie potentielle d'exposition au produit chimique. La substance est incorporée dans le sol par traitement du sol brut. Après l'application, le sol est transféré dans des pots, puis les graines de l'espèce de plante donnée sont plantées dans le sol. Dans les cas d'application en surface, le produit chimique est appliqué sur le sol en pots dans lequel les graines ont déjà été plantées. Les unités d'essai (témoins et sols traités plus graines) sont ensuite placées dans des conditions appropriées favorisant la germination et/ou la croissance des plantes. 4. Selon l'objectif visé par l'étude, l'essai peut permettre de déterminer la courbe dose-réponse, ou il peut être mis en œuvre à une unique concentration ou un unique taux, et il s'agit alors d'un essai de seuil. Si les résultats de l'essai sur une seule concentration ou un seul taux excèdent un certain seuil de toxicité (par exemple, lorsque des effets supérieurs à x % sont observés), on procède à un essai de détermination de l'ordre de grandeur afin de définir les limites de toxicité supérieures et inférieures, puis à un essai employant plusieurs concentrations ou taux afin de tracer une courbe dose-réponse. Une analyse statistique appropriée permet de calculer une concentration efficace CEx ou un taux d'application efficace TEx (par exemple CE25, TE25, CE50, TE50), pour le paramètre ou les paramètres pertinents les plus sensibles. Cet essai peut également fournir les valeurs calculées de concentration sans effet observé (CSEO) et de concentration minimale avec effet observé (CMEO). INFORMATION SUR LA SUBSTANCE CHIMIQUE D'ESSAI 5. La détermination de la voie d'exposition probable de la substance chimique, et par conséquent la conception de l'essai pourront s'appuyer sur les informations suivantes: formule développée, pureté, solubilité dans l'eau, solubilité dans les solvants organiques, coefficient de partage n-octanol/eau, comportement de sorption par le sol, pression de vapeur, stabilité chimique vis-à-vis de l'eau et de la lumière et biodégradabilité. VALIDITÉ DE L'ESSAI 6. Pour valider l'essai, les critères de performance suivants devront être satisfaits par les témoins: — L'émergence des plantules atteint au moins 70 %; — les plantes ne présentent aucun effet phytotoxique visible (par exemple, chlorose, nécrose, flétrissement, déformation des feuilles et des tiges). Seules des variations normales de la croissance et de la morphologie de l'espèce particulière de plantes sont observées; — le taux de survie moyen des plantules témoins émergées est d'au moins 90 % pendant la durée de l'étude; — les conditions environnementales pour une espèce particulière sont identiques et les milieux de croissance contiennent la même quantité de matrice de sol, de milieu de support ou de substrat provenant de la même source. SUBSTANCE CHIMIQUE DE RÉFÉRENCE 7. L'essai d'une substance chimique de référence à intervalles réguliers permet de vérifier la régularité des performances de l'essai et de la réponse des plantes particulières de l'essai, ainsi que des conditions d'essai. Il est également possible d'utiliser des mesures historiques de biomasse ou de croissance de témoins pour évaluer les performances du système d'essai dans des laboratoires particuliers et ces mesures peuvent également servir de contrôle de qualité intra-laboratoire. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE Sol naturel — Substrat artificiel 8. On peut cultiver les plantes dans des pots contenant un limon sableux, un sable limoneux ou un limon d'argile sableuse dont la teneur en carbone organique peut atteindre 1,5 % (environ 3 % de matières organiques). Un terreau commercial ou un mélange de sol synthétique qui contient jusqu'à 1,5 % de carbone organique conviennent également. Les sols argileux doivent être exclus si la substance chimique de l'essai a une affinité élevée avérée pour les argiles. Les sols de champs doivent être tamisés pour homogénéiser la taille de particule en dessous de 2 mm et éliminer les particules grossières. Le type et la texture, la proportion de carbone organique, le pH et la teneur en sels mesurée par la conductivité électronique du sol préparé final doivent être enregistrés, et le sol classé conformément à un schéma de classification standard (11). Pour réduire les effets des pathogènes du sol, celui-ci pourra subir une pasteurisation ou un traitement thermique. 9. L'emploi d'un sol naturel peut compliquer l'interprétation des résultats et augmenter la variabilité, du fait de la variation des propriétés physicochimiques et des populations microbiennes. Ces paramètres peuvent modifier la capacité de rétention d'humidité, la capacité de liaison chimique, l'aération et la teneur en nutriment et en oligoéléments. Les fluctuations de ces facteurs physiques s'ajoutent à des variations des propriétés chimiques telles que le pH et le potentiel redox, qui peuvent affecter la biodisponibilité de la substance d'essai (12) (13) (14). 10. Il est inhabituel d'utiliser des substrats artificiels pour les essais de produits phytosanitaires, mais ils peuvent être employés pour les essais de produits chimiques généraux ou lorsqu'il est souhaitable de réduire la variabilité des sols naturels et d'améliorer la comparabilité des résultats de l'essai. Les substrats doivent être composés de matériaux inertes présentant des interactions minimales avec la substance chimique d'essai, le solvant véhicule ou les deux. Des matériaux inertes appropriés qui absorbent très peu la substance d'essai (15), assurant ainsi une disponibilité maximale de la substance pour les plantules par absorption racinaire, sont le sable de quartz lavé par un acide, la laine minérale et les billes de verre (par exemple, de 0,35 à 0,85 mm de diamètre). La vermiculite, la perlite ou d'autres matériaux très absorbants ne conviennent pas. L'apport de nutriments favorisant la croissance végétale évitera aux plantes les stress dus aux carences nutritives, qui seront évaluées, si possible, par des analyses chimiques ou un contrôle visuel des plantes témoins. Critère de sélection de l'espèce de l'essai 11. L'espèce sélectionnée devra être raisonnablement répandue, par exemple, en termes de diversité taxonomique dans le royaume végétal, de distribution, d'abondance, de caractéristiques du cycle vital spécifique de l'espèce et de régions d'occurrence naturelle, pour permettre le développement d'une série de réponses (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Le choix devra tenir compte des caractéristiques suivantes des espèces d'essai envisagées: — Les semences de l'espèce sont uniformes, et largement disponibles auprès de sources de semences standard fiables, et produisent une germination régulière, fiable et uniforme, ainsi qu'une croissance uniforme des plantules; — La plante est adaptée à l'essai au laboratoire, et susceptible de donner des résultats fiables et reproductibles dans une même installation d'essai et entre des installations d'essai différentes; — La sensibilité de l'espèce d'essai doit correspondre aux réponses des plantes se trouvant dans l'environnement exposé à la substance; — L'espèce a déjà été utilisée dans des essais de toxicité antérieurs de quelque ampleur, et son comportement, par exemple dans des essais biologiques d'herbicides, le criblage de métaux lourds, des essais de stress salin ou minéral ou des études d'allélopathie indique une sensibilité à une large gamme d'agents stressants; — elle est compatible avec les conditions de croissance du procédé de l'essai; — elle se conforme aux critères de validité de l'essai. Certaines des espèces les plus couramment utilisées dans le passé sont indiquées dans l'Appendice 2 et des espèces non cultivées potentielles dans l'Appendice 3. 12. Le nombre d'espèces à inclure dans l'essai dépend des exigences réglementaires en vigueur et n'est par conséquent pas spécifié dans la présente méthode d'essai. Application de la substance chimique d'essai 13. La substance chimique doit être appliquée dans un support approprié (par exemple eau, acétone, éthanol, polyéthylène glycol et gomme arabique). Il est également possible de tester des mélanges (produits préparés ou préparations) contenant les ingrédients actifs et divers adjuvants. Incorporation dans le sol ou dans le substrat artificiel 14. Les substances chimiques hydrosolubles ou en suspension dans l'eau peuvent être ajoutées à de l'eau, et la solution est ensuite mélangée avec du sol à l'aide d'un dispositif de mélange approprié. Ce type d'essai peut convenir pour une exposition au produit chimique par le sol ou par l'eau de porosité et lorsqu'il y a un risque d'absorption racinaire. La quantité de la substance chimique d'essai ajoutée ne doit pas excéder la capacité de rétention d'eau du sol. Le volume d'eau ajouté doit être identique pour chaque concentration de l'essai, tout en restant limité afin d'éviter la formation d'amas de sol aggloméré. 15. Les substances chimiques à faible solubilité dans l'eau doivent être dissoutes dans un solvant volatile approprié (par exemple acétone, éthanol) et mélangées à du sable. Il est possible de retirer ensuite le solvant du sable à l'aide d'un courant d'air sous agitation continue du sable. Le sable traité est ensuite mélangé avec le sol expérimental. Un second témoin constitué seulement de sable ou de solvant est préparé. Les traitements à différentes doses et le second témoin reçoivent des quantités égales de sable duquel le solvant a été mélangé puis ôté. Dans le cas de substances chimiques d'essai solides insolubles, le mélange de sol sec et de produit chimique est préparé dans un dispositif de mélange approprié. Ensuite, le sol est ajouté aux pots et les graines y sont immédiatement semées. 16. Lorsqu'un substrat artificiel remplace le sol, les produits chimiques solubles dans l'eau peuvent être dissous dans la solution nutritive juste avant le début de l'essai. Les produits chimiques insolubles dans l'eau, mais qu'il est possible de mettre en suspension dans l'eau grâce à un support de solvant, sont ajoutés avec le support à la solution nutritive. Les produits chimiques insolubles dans l'eau pour lesquels il n'existe aucun support hydrosoluble non toxique doivent être dissous dans un solvant volatil approprié. La solution mélangée avec du sable ou des billes de verre est placée dans un appareil rotatif sous vide et évaporée, en formant un revêtement uniforme de produit chimique sur le sable ou les billes. Une portion tarée de billes est extraite par le même solvant organique et le produit chimique de l'essai dosé avant de remplir les pots. Application en surface 17. Dans le cas de produits phytosanitaires, l'application de la solution d'essai se fait souvent par pulvérisation sur la surface du sol d'une solution d'essai. Le modèle et la capacité de tous les équipements utilisés pour conduire l'essai, en particulier les appareils utilisés pour préparer et administrer la substance chimique d'essai, doivent permettre sa mise en œuvre précise, avec une couverture reproductible. Celle-ci doit être uniforme sur les surfaces de sol. On s'efforcera d'éviter d'éventuelles interactions par absorption ou réaction des produits chimiques avec le matériel (par exemple, tubes de plastique et produits chimiques, composants ou éléments en acier). La pulvérisation de la substance chimique d'essai sur la surface de sol simule des applications par pulvérisations usuelles. En général, les volumes pulvérisés se situent dans l'intervalle utilisé en pratique agronomique normale et ils doivent être notés (quantité d'eau etc.). Le type de buse choisi doit permettre de couvrir uniformément la surface de sol. Dans le cas d'applications de solvants ou de supports, un second groupe de plantes témoins est mis en place et ne reçoit que le solvant ou le support, sauf pour les produits phytosanitaires testés sous forme de formulations. Vérification de la concentration ou du taux de substance chimique d'essai 18. Les concentrations ou les taux d'application doivent être confirmés par une vérification analytique appropriée. L'analyse de la concentration la plus élevée de solutions d'essai, associée au relevé des dilutions consécutives et à l'utilisation d'applicateurs étalonnés (par exemple, verrerie analytique étalonnée, étalonnage du pulvérisateur) confirmera éventuellement la vérification des concentrations et les taux de l'essai pour substances chimiques solubles. Pour les substances chimiques insolubles, la vérification devra s'appuyer sur les poids de substance chimique d'essai ajoutés au sol. L'analyse du sol peut être nécessaire dans le cas où l'homogénéité de l'application doit être démontrée. RÉALISATION DE L'ESSAI Modèle de l'essai 19. Des graines de la même espèce sont semées en pots. Le nombre de graines par pot dépend de l'espèce, de la taille du pot et de la durée de l'essai, et doit garantir des conditions de croissance adéquates et uniformes et éviter la surpopulation pendant la durée de l'essai. La densité maximale de graines est d'environ 3 à 10 graines par cm2, selon la taille des graines. Par exemple, des densités d'un ou deux plants de maïs, de soja, de tomate, de concombre ou de betterave à sucre par récipient de 15 cm, de trois plants de colza ou de pois par récipient de 15 cm et de 5 à 10 graines d'oignons, de blé ou d'autres petites graines par récipient de 15 cm sont recommandées. Le nombre de graines et de répliques de pots (une réplique correspond à un pot, et par conséquent les plantes dans un même pot ne peuvent faire fonction de répliques) doit satisfaire aux conditions d'une analyse statistique optimale (21). Il convient de noter que la variabilité augmente pour les espèces d'essai à grosses graines dont on n'utilise moins de graines par pot (réplique) par rapport à des espèces d'essai pour lesquelles il est possible d'utiliser des nombres plus élevés de petites graines par pot. En plantant un nombre égal de graines dans chaque pot, cette variabilité diminue. 20. L'utilisation de groupes de contrôle permet de confirmer que les effets observés ne peuvent être associés ou attribués qu'à l'exposition à la substance chimique d'essai. Le groupe de contrôle approprié doit être identique sous tous rapports avec le groupe d'essai, à l'exception de l'exposition à la substance chimique d'essai. Dans un essai donné, toutes les plantes de l'essai, y compris les témoins devront provenir de la même source. Pour éliminer tout biais, une répartition aléatoire des pots d'essai et témoins est indispensable. 21. Il convient d'éviter l'emploi de graines recouvertes d'un insecticide ou d'un fongicide (c'est à dire les graines enrobées). Toutefois, l'utilisation de certains fongicides de contact non systémiques (par exemple captan, thiram) est autorisée par certaines autorités réglementaires (22). Le problème éventuel des pathogènes disséminés par les semences peut être résolu par une brève immersion des semences dans une solution d'hypochloride à 5 %, suivie d'un rinçage abondant à l'eau courante et d'un séchage. Aucun autre traitement curatif par des produits phytosanitaires n'est autorisé. Conditions de l'essai 22. Les conditions de l'essai doivent être aussi proches que possible des conditions nécessaires à la croissance normale ou des conditions environnementales habituelles pour l'espèce et les variétés testées (voir par exemple Appendice 4). Les plantes émergentes doivent être entretenues par de bonnes pratiques horticoles dans des chambres à environnement contrôlé, des phytotrons ou des serres. Si l'on dispose des installations adéquates, ces pratiques comprennent habituellement le contrôle et l'enregistrement suffisamment fréquents (par exemple quotidien) de la tempérante, de l'humidité, de la concentration de dioxyde de carbone, des variables de luminosité (intensité, longueur d'onde, domaine de longueur d'onde autorisant la photosynthèse) et de la périodicité lumineuse, du fonctionnement des dispositifs d'arrosage, etc, permettant d'assurer une croissance satisfaisante de la plante estimée par l'observation des plantes témoins. Les températures de serre sont contrôlées par des systèmes de ventilation, de chauffage et/ou de refroidissement. Les conditions suivantes sont généralement recommandées pour les essais en serre: — température: 22 °C ± 10 °C; — humidité: 70 % ± 25 %; — photopériode: 16 heures de lumière au minimum; — intensité lumineuse: 350 ± 50 μE/m2/s. Un éclairage d'appoint peut être nécessaire si l'intensité descend en dessous de 200 μE/m2/s, longueur d'onde 400-700 nm, sauf pour certaines espèces dont les exigences en lumière sont moindres. Les conditions environnementales doivent être contrôlées et notées pendant la durée de l'étude. Les plantes sont cultivées dans des pots en plastique non poreux ou émaillé posés sur une clayette ou une soucoupe. On peut les déplacer périodiquement pour diminuer la variabilité de croissance entre plantes (provoquées par des différences de conditions d'essai dans les installations de culture). La taille des pots doit être suffisante pour une croissance. 23. Des suppléments peuvent compléter les nutriments du sol pour assurer une bonne vigueur végétale. Les besoins en nutriments et le calendrier de leur addition sont déterminés par l'observation des plantes témoins. Il est recommandé d'alimenter en eau par le fond des récipients d'essai (par exemple, en utilisant des mèches en fibres de verre). Toutefois, un arrosage initial par le haut peut stimuler la germination des graines et faciliter le déplacement du produit chimique dans le sol lors d'une application sur la surface du sol. 24. Les conditions de croissance spécifiques doivent être adaptées à l'espèce d'essai et à la substance chimique d'essai à l'étude. Il faut maintenir les plantes témoins et traitées dans les mêmes conditions environnementales, et prendre par conséquent des dispositions pour empêcher une exposition croisée (par exemple par des substances volatiles) entre différents traitements, et une exposition des témoins à la substance chimique d'essai. Essais à une seule concentration ou un seul taux 25. Plusieurs facteurs prévalent lorsque l'on cherche à déterminer la concentration ou le taux approprié d'une substance dans le cadre d'un essai à une seule concentration ou un seul taux (stimulation/limite). Ils comprennent les propriétés physiques et chimiques de la substance, lorsqu'il s'agit de substances chimiques à usage général. Pour les produits phytosanitaires, il convient de tenir compte des propriétés physico-chimiques et du régime d'utilisation de la substance chimique d'essai, de sa concentration ou de son taux maximal, du nombre d'applications par saison et/ou de la persistance de la substance chimique d'essai. La détermination d'éventuelles propriétés phytotoxiques d'un produit chimique général peut demander la mise en œuvre de l'essai à une teneur maximale de 1 000 mg/kg de sol sec. Essai de détermination de l'ordre de grandeur 26. Le cas échéant, un essai de détermination de l'ordre de grandeur peut contribuer à fixer la concentration ou le taux d'application à expérimenter dans l'étude dose-réponse définitive. Dans un tel essai, les concentrations ou les taux à tester sont largement espacés (par exemple 0,1, 1,0, 10, 100 et 1 000 mg/kg de sol sec). Dans le cas de produits phytosanitaires, on peut calculer les concentrations ou les taux à partir de la concentration ou du taux d'application recommandé ou maximal, par exemple, 1/100, 1/10, ou 1 fois la concentration ou le taux d'application recommandé ou maximal. Essais à plusieurs concentrations ou taux d'application 27. L'objectif d'un essai à plusieurs concentrations ou taux d'application est l'établissement d'une relation dose-réponse et la détermination d'une valeur de CEx ou de TEx lié à l'émergence, à la biomasse et/ou à des effets visuels par rapport à des témoins non exposés, comme il est exigé par les autorités réglementaires. 28. L'intervalle entre les concentrations ou les taux ainsi que leur nombre doivent être suffisants pour établir une relation dose-réponse et une équation de régression, et obtenir une estimation des CEx ou des TEx. Les intervalles de concentration ou de taux doivent englober les valeurs de CEx ou de TEx à déterminer. Par exemple, si l'on recherche une CE50, il est préférable de conduire l'essai à des taux produisant un effet de 20 à 80 %. Le nombre recommandé de concentrations ou de taux d'essai pour atteindre cet objectif est d'au moins 5 en série géométrique, plus un témoin non traité, espacés d'un facteur d'au plus trois. Pour chaque groupe de traitement et de contrôle, le nombre de répliques doit être au moins égal à quatre et le nombre total de graines au moins égal à 20. Pour certaines plantes à faible taux de germination ou aux caractéristiques de croissance variables, davantage de répliques peuvent être nécessaires pour augmenter la puissance statistique de l'essai. Lorsque l'on utilise un grand nombre de concentrations ou de taux d'essai, on peut réduire le nombre de répliques. Pour estimer le CSEO, il faut parfois davantage de répliques pour obtenir la puissance statistique adéquate (23). Observations 29. Pendant la période d'observation, c'est-à-dire 14 à 21 jours après l'émergence de 50 % des plantes témoins (et également des témoins de solvant, le cas échéant), les plantes sont examinées fréquemment (au moins une fois par semaine et si possible une fois par jour) pour enregistrer l'émergence, la phytoxicité visuelle et la mortalité. A la fin de l'essai, le pourcentage d'émergence et la biomasse des plantes survivantes sont mesurés, ainsi que les effets nocifs visibles sur différentes parties de la plante, en particulier des anomalies dans l'apparence des plantules émergées, une croissance avortée, une chlorose, une décoloration, une mortalité et des effets sur le développement végétal. La biomasse finale peut être mesurée par le poids sec moyen des pousses des plantes survivantes, après récolte des pousses à la surface du sol et séchage à masse constante à 60 °C, ou bien par le poids frais des pousses. La hauteur de la pousse peut constituer un autre effet mesuré, parfois exigé par les autorités réglementaires. Il convient d'utiliser une notation homogène des lésions visuelles pour évaluer les réponses toxiques détectables. Des exemples pratiques d'évaluations visuelles qualitatives et quantitatives sont proposés dans les références (23) (24). RÉSULTATS ET RAPPORT Analyse statistique Essai à une seule concentration ou un seul taux 30. Pour chaque espèce végétale, les données sont analysées en utilisant une méthode statistique appropriée (21). Il convient de noter la valeur d'un effet à la concentration ou au taux de l'essai, ou bien l'incapacité à obtenir un effet donné à la concentration ou au taux de l'essai (par exemple, < x % de l'effet observé à la concentration ou au taux y). Essais à plusieurs concentrations ou taux d'application 31. Une relation dose-réponse est établie par une équation de régression. Différents modèles sont applicables, par exemple, pour estimer une CEx ou un TEx (par exemple CE25, TE 25, CE50, TE50) et leurs limites de confiance pour l'émergence sous forme de résultats tout ou rien, d'unités logit, probit, Weibull, les méthodes de Spearman-Karber et Spearman-Karber abrégées peuvent convenir. Pour évaluer la croissance des plantules (poids et hauteur) en points finals continus, CEx ou TEx et leurs limites de confiance peuvent être estimés à l'aide d'une analyse de régression appropriée (par exemple analyse de régression non linéaire Bruce-Versteeg (25)). Autant que possible, la valeur de R2 sera supérieure ou égale à 0.7 pour les espèces les plus sensibles et les concentrations ou taux d'essai utilisés comprendront les effets à 20 % et à 80 %. Dans la mesure où il faut estimer le CSEO, il est préférable d'appliquer des tests statistiques puissants qui seront choisis en fonction de la distribution des données (21) (26). Rapport d'essai 32. Le rapport d'essai doit mentionner les résultats des études ainsi qu'une description détaillée des conditions d'essai, une discussion approfondie des résultats, une analyse des données et les conclusions tirées de l'analyse. Un résumé sous forme de tableaux et une synthèse des résultats sont proposés. Le rapport doit comporter les informations suivantes: Substance chimique d'essai: — données d'identification de la substance chimique, propriétés pertinentes de la substance d'essai (par exemple log Pow, solubilité dans l'eau, pression de vapeur et informations sur le devenir et le comportement dans l'environnement lorsqu'elles sont disponibles); — détails sur la préparation de la solution d'essai et vérification des concentrations d'essai comme il est spécifié dans le paragraphe 18. Espèces soumises à l'essai: — détails sur l'organisme expérimental: espèce/variété, familles de plantes, noms scientifiques et communs, source et histoire de la graine aussi détaillées que possible (à savoir, nom du fournisseur, pourcentage de germination, classe de taille de la semence, numéro du lot, année de la semence ou saison de croissance de la récolte, date de l'évaluation de la germination), viabilité, etc.; — nombre d'espèces monocotylédones et dicotylédones soumises à l'essai; — justification du choix de l'espèce; — description du stockage, du traitement et de la maintenance des semences. Conditions d'essai: — installation utilisée dans l'essai (par exemple, chambre de croissance, phytotron, serre); — description du système d'essai (par exemple, dimension des pots, matière des pots et quantité de sol); — caractéristiques du sol (texture ou type de sol: par exemple distribution et classification des particules du sol, propriétés physiques et chimiques, en particulier pourcentage de matières organiques, pourcentage de carbone organique, pH); — préparation du sol ou du substrat (par exemple, sol artificiel, sable, et autres) avant l'essai; — description du milieu nutritif, le cas échéant; — application de la substance chimique d'essai: description de la méthode d'application, description du matériel, taux d'exposition et volume, en particulier vérification chimique, description de la méthode d'étalonnage, description des conditions environnementales pendant l'application; — conditions de croissance: intensité lumineuse (par exemple, domaine longueur d'onde autorisant la photosynthèse), photopériode, températures maximales et minimales, régime et procédé d'arrosage, fertilisation; — nombre de graines par pot, nombre de plantes par dose; nombre de répliques (pots) par taux d'exposition; — type et nombre de contrôles (témoins négatifs et/ou positifs, témoin de solvant le cas échéant); — durée de l'essai. Résultats: — tableau de tous les effets mesurés pour chaque réplique, taux ou concentration d'essai et espèce; — pourcentage d'inhibition pour chaque espèce par rapport aux témoins; — mesures de biomasse (poids sec ou poids frais des pousses) des plantes en pourcentages de témoins; — hauteur des pousses des plantes en pourcentages des témoins, lorsqu'elles ont été mesurées; — pourcentage de lésions visibles et description qualitative et quantitative des lésions visibles (chlorose, nécrose, flétrissement, déformation des feuilles et des tiges ainsi qu'une absence quelconque d'effet) provoquées par la substance chimique d'essai par rapport aux plantes témoins; — description de l'échelle d'évaluation utilisée pour estimer les lésions visibles, lorsqu'une évaluation visuelle est rapportée; — pour les études à un seul taux, le pourcentage de lésions doit être rapporté; — valeurs CEx ou TEx (par exemple CE50, TE50, CE25, TE25) et limites de confiance correspondantes. Pour chaque analyse de régression, l'écart type pour l'équation de régression et l'écart type pour l'estimation des paramètres individuels (par exemple pente, interception) seront fournis; — valeurs de CSEO (et de CMEO) dans le cas où elles ont été calculées; — description des protocoles statistiques et des hypothèses adoptées; — présentation graphique de ces données et relation dose-réponse de l'espèce soumise à l'essai. Variantes des protocoles décrits dans la présente méthode d'essai et tous les événements inhabituels survenus pendant l'essai. BIBLIOGRAPHIE (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) Organisation internationale de normalisation. (1993). ISO 11269-1. Qualité du sol -Détermination des effets des polluants sur la flore du sol -- Partie 1: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (3) Organisation internationale de normalisation. (1995). ISO 11269-2. Qualité du sol -Détermination des effets des polluants sur la flore du sol -- Partie 2: Effets des substances chimiques sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850,4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850,4025: Target Area Phytotoxicity; — 850,4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850,4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850,4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850,4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/IS0 11269-1. (1993) Détermination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S.Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174. (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J... (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OCDE (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Série sur les essais et l'évaluation no 54, Organisation de coopération et de développement économiques, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Chapitre C.33 de la présente annexe: Essai de reproduction chez le lombric (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Appendice 1 Définitions Ingrédient actif (i.a.) [ou substance active (s.a.)] : matériau destiné à exercer un effet biologique spécifique (par exemple, lutte contre les insectes, contre les maladies végétales, contre les mauvaises herbes, dans la zone de traitement), également désigné par ingrédient actif ou substance active de qualité technique, Substance chimique : une substance ou un mélange. Produits phytosanitaires ou pesticides : matériaux dotés d'une activité biologique spécifique utilisés intentionnellement pour protéger les plantes cultivées contre les nuisibles (par exemple, maladies fongiques, insectes, plantes compétitrices). CEx · concentration efficace à x % ou TEx. taux efficace à x % : concentration ou taux qui provoque un changement ou une altération indésirable de x % de l'effet mesuré de l'essai par rapport au témoin (par exemple, une réduction de 25 % ou de 50 % de l'émergence des plantules, du poids des pousses, du nombre final de plantes présentes ou une augmentation de 25 % ou de 50 % d'une lésion visuelle constituent respectivement une CE25/TE25 ou une CE50/TE50). Émergence : apparition du coléoptile ou du cotylédon au-dessus de la surface du sol. Formulation : produit formulé commercial contenant la substance active (ingrédient actif), que l'on appelle également préparation finale (8) ou produit final typique. CMEO (concentration minimale avec effet observé) : concentration la plus faible de la substance chimique d'essai à laquelle a été observé l'effet. Dans cet essai, la concentration correspondant à la CMEO a un effet statistiquement significatif (p < 0,05) pendant une durée d'exposition donnée par rapport au témoin, et est supérieure à la valeur de CSEO. Plantes non visées : plantes situées hors de la zone contenant les plantes visées. Pour les produits phytosanitaires, ce terme se réfère généralement à des plantes situées hors de la surface de traitement. CSEO (concentration sans effet observé) : concentration la plus élevée de substances d'essai à laquelle aucun effet n'est observé. Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO n'a pas d'effet statistiquement significatif (p < 0,05) pendant une durée d'exposition donnée lorsqu'on la compare au témoin. Phytotoxicité : anomalies préjudiciables (selon des mesures et des évaluations visuelles) par rapport à l'apparence et au modèle de croissance normaux des plantes, qui apparaissent en réponse à une substance chimique donnée. Réplique : unité expérimentale qui représente le groupe de contrôle et/ou le groupe de traitement. Dans ces études, la réplique est définie par un pot. Évaluation visuelle : appréciation des dommages visuels d'après l'observation du port de la plante, de sa vigueur, de malformations, d'une chlorose, d'une nécrose et de l'apparence globale par rapport à un témoin. Substance chimique d'essai : toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d'essai. Appendice 2 Liste des espèces habituellement utilisées dans les essais sur plantes Famille Espèces Noms vulgaires DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Carotte Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Tournesol Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Laitue Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Moutarde blanche Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Chou chinois Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Colza Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Chou Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Navet Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Cresson alénois Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Radis Chenopodiaceae Beta vulgaris Betterave à sucre Cucurbitaceae Cucumis sativa Concombre Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soja Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Haricot mungo Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Haricot Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Pois Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Fenugrec Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Lotier corniculé Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Trèfle des prés Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Vesce cultivée Linaceae Linum usitatissimum Lin Polygonaceae Fagopyrum esculentum Sarasin Solanaceae Solanum lycopersicon Tomate MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Oignon Poaceae (Gramineae) Avena sativa Avoine Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Orge Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Raygras pérenne Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Riz Poaceae (Gramineae) Secale cereale Seigle Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorgho Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Blé Poaceae (Gramineae) Zea mays Maïs Appendice 3 Liste des espèces non cultivées potentielles Espèces potentielles selon l'OCDE pour les essais de toxicité sur plantes Note: Le tableau suivant fournit des informations sur 52 espèces non cultivées (les références sont données entre parenthèses pour chaque entrée). Les taux d'émergence indiqués sont issus de la littérature publiée et ne sont fournis qu'à titre d'indication générale. L'expérience individuelle peut varier en fonction de la source de semence et d'autres facteurs. FAMILLE Nom botanique de l'espèce (Nom commun français) Durée de vie (9) et habitat Poids des graines (mg) Photopériode pour la germination ou la croissance (10) Profondeur du semis (mm) (11) Durée de germination (jours) (12) Traitements spéciaux (13) Essai de toxicité (14) Distributeurs de semences (15) Autres références (16) APIACEAE Torilis japónica (Torillis du Japon) A, В zones perturbées, haies, pâturages (16, 19) 1,7 – 1,9 (14, 19). L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19). stratification froide (7, 14, 18, 19) une maturation peut être nécessaire (19) germination inhibée par l'obscurité (1, 19) aucun traitement particulier (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (Pâquerette vivace) Ρ prairie, terres arables, gazon (16, 19) 0,09 – 0,17 (4, 19). L = D (14) 0 4) 3 (50 %) (19). 11 (100 %) (18). germination non affectée par une irradiation (18, 19) aucun traitement particulier (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Bleuet des champs) A champs, bords de routes, habitats ouverts (16) 4,1 – 4,9 (4, 14). L = D (14) 0 — 3 (2, 4, 14). 14-21 (100 %) (14) aucun traitement particulier (2,4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (Centaurée noire) Ρ champs, bords de routes, habitats ouverts (16, 19) 2,4 – 2,6 (14, 19). L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19). 4 (97 %) (18). une maturation peut être nécessaire (18, 19) germination inhibée par l'obscurité (19) aucun traitement particulier (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (Inule aulnée) Ρ sites humides, perturbés 16) 1 – 1,3 (14, 14, 19). 0 (4, 29) aucun traitement particulier (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (Liondent hérissé) Ρ champs, bords de routes, zones perturbées (16, 19) 0,85 – 1,2 (14, 19). L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19). 7 (80 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (17, 18, 19) aucun traitement particulier (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Rudbeckie hérissée) Β, Ρ perturbé (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) aucun traitement particulier (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (Solidage du Canada) Ρ pâturages, zones ouvertes (16) 0,06 – 0,08 (4, 14). L = D (11) 0 (4) 14-21 11) mélanger avec une quantité égale de sable et tremper dans du GA 500 ppm pendant 24 h (11) aucun traitement particulier (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum A champs, habitats ouverts (16) 25 – 61 (14, 29) 0(1) 5(29) la germination peut être inhibée par l'obscurité (1) tremper dans l'eau tiède pendant 12 heures (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (Lampourde épineuse) A habitats ouverts (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) scarification (14) aucun traitement particulier (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (Violette des champs) A champs, habitats ouverts (16) 67,4 (14) L = D (14) 10 - 20 (6, 21) aucun traitement particulier (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (Cardamine des prés) Ρ champs, bords de routes, gazon (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19). 15 (98 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (18, 19) aucun traitement particulier (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (Lychnis fleur de coucou) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) une maturation peut être nécessaire (18) aucun traitement particulier (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (Chénopode blanc) A bordures de champs, zones perturbées (16, 19) 0,7 – 1,5 (14, 19, 34). L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19). le traitement diffère en fonction de la couleur de la graine (19) dormance en stockage à sec (19) germination inhibée par l'obscurité (1, 18, 19) stratification froide (18) aucun traitement particulier (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (Millepertuis perforé) Ρ champs, terres arables, habitats ouverts (16, 19) 0,1 – 0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (1, 18, 19) aucun traitement particulier (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (Etoile du matin) A bords de routes, habitats ouverts, champs de maïs (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) germination non affectée par une irradiation (1) aucun traitement particulier (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (Souchet rond) Ρ terres arables, pâturages, bords de routes (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10 - 20 (6, 10) 12 (91 %) (10) germination inhibée par l'obscurité (1) aucun traitement particulier (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (Lotie corniculé) Ρ zones herbeuses, bords de routes, habitats ouverts (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarification (14, 19) germination non affectée par une irradiation (18, 19) aucun traitement particulier (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Casse fétide) A bois humide (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) tremper les graines humides dans l'eau pendant 24 heures (9) scarification (14) la viabilité des graines dépend de leur couleur (1) aucun traitement particulier (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata (Chanvre) A sol alluvial (16) 11 – 13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) tremper les graines humides dans l'eau pendant 24 heures (9) germination non affectée par une irradiation (1) aucun traitement particulier (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (Trèfle des prés) Ρ champs, bords de routes, terres arables (16, 19) 1,4 – 1,7 (14, 19) L= D (14) 1 (50 %) (19) scarification (14, 18) peut requérir une maturation (19) germination non affectée par une irradiation (1, 19) aucun traitement particulier (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (Agripaume) Ρ zones ouvertes (16) 0,75 – 1,0 (4, 14) L= D (14) 0 (4) aucun traitement particulier (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (Menthe verte) Ρ zones humides (16) 2,21 (4) 0 (4) aucun traitement particulier (4) POST (4) F Nepeta cataria (Herbe à chats) Ρ zones perturbées (16) 0,54 (4, 14) L= D (14) 0 (4) aucun traitement particulier (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (Brunelle commune) Ρ terres arables, zones herbeuses, sites perturbés (16, 19) 0,58 – 1,2. (4, 14, 19) L= D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19). 7 (91 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (18, 19) meilleure germination avec les grosses graines (1) aucun traitement particulier (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (Epiaire officinale) Ρ prairies, bordures de champs (19) 14-18 (14, 19) L= D (14) 7 (50 %) (19) aucun traitement particulier (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (Abutilón) A champs, habitats ouverts (16) 8,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) scarification (14) aucun traitement particulier (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (Sida épineux) A champs, bords de route (16) 3,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 21) scarification (14) germination non affectée par une irradiation (1) aucun traitement particulier (6,21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (Grand coquelicot) A champs, terres arables, sites perturbés (16, 19) 0,1 – 0,3 (4, 14, 19, 29) L= D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) stratification froide et scarification (1, 19, 32) aucun traitement particulier (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (Agrostide vulgaire) pelouses, pâturages (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10). germination inhibée par l'obscurité (1, 17-19) aucun traitement particulier (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (Vulpin agreste) A champs, habitats ouverts (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) scarification (14) traiter avec 101 mg/l de KNO3 (14) stratification chaude (1) germination inhibée par l'obscurité (1) aucun traitement particulier (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (Avoine folle) A zones cultivées, habitats ouverts (16) 7 – 37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10 — 20 (6, 10) 3 (70 %) (18). scarification (7, 32) germination inhibée par l'obscurité (1) stratification froide (1,18) aucun traitement particulier (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (Brome des toits) A champs, bords de routes, terres arables (16) 0,45 – 2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) période de maturation (1, 7, 32) germination inhibée par la lumière (1) aucun traitement particulier (14) PRE & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (Crételle) P champs, bords de routes, habitats ouverts (16, 19) 0,5 – 0,7 (14, 19, 29). L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19). germination non affectée par une irradiation (19) aucun traitement particulier (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (Digitaire sanguine) A champs, gazon, habitats ouverts (16) 0,52 – 0,6 (14,30) L = D (14) 10 - 20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7). scarification, stratification froide & maturation (1, 7, 14, 32) traiter avec 101 mg/l de KNO3 (14) germination inhibée par l'obscurité (1) aucun traitement particulier (21 ) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (panic pied-de-coq) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10 - 20 (7, 21) scarification (7, 32) germination non affectée par une irradiation (1) aucun traitement particulier (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Elyme du Canada) P riverain, sites perturbés (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) aucun traitement particulier (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (Fétuque des prés) P champs, zones humides (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10). 2 (50 %) (19). aucun traitement particulier (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (Orge naine) A pâturages, bords de routes, habitats ouverts (16) 3,28 (14) stratification chaude (1) germination non affectée par une irradiation (1) PRE (31) 7 Phieum pratense (Fléole des prés) P pâturages, terres arables, sites perturbés (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10). 8 (50 %) (19). germination inhibée par l'obscurité (19) germination non affectée par une irradiation (17) aucun traitement particulier (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (Renouée faux-liseron) A habitats ouverts, bords de routes (16) 5 – 8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) stratification froide pendant 4- 8 semaines (1, 2, 4, 20, 29) germination non affectée par une irradiation (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (Renouée à feuille de patience) A sol humide (16) 1,8 – 2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18). germination non affectée par une irradiation (1) germination inhibée par l'obscurité (18) stratification froide (1) aucun traitement particulier (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (Renouée de Pennsylvanie) A champs, habitats ouverts (16) 3,6 – 7 (14, 29) 2 (29) stratification froide pendant 4 semaines à 0 - 5 °C (1, 29) germination inhibée par l'obscurité (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (Renouée persicaire) A zones perturbées, terres arables (16, 19) 2,1 – 2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) 14 (13) 2 (50 %) (19). scarification, stratification froide, traitement au GA (14) stratification froide, maturation (17 - 19) germination inhibée par l'obscurité (19) aucun traitement particulier (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (Patience crépue) P terres arables, bords de routes, zones ouvertes (16, 19) 1,3 – 1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19). 6 (100 %) (33). germination inhibée par une irradiation (18, 19) une maturation peut être requise (18) aucun traitement particulier (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (Mourron rouge) A terres arables, zones ouvertes, sites perturbés (16, 19) 0,4 – 0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19). stratification froide, traitement au G A (1, 14, 18, 19, 32) lumière requise pour la germination (1) aucun traitement particulier (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (Renoncule acre) Ρ terres arables, bords de routes, zones ouvertes (16, 19) 1,5 – 2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 - 56 (19, 29) aucun traitement particulier (5, 14, 22, 24 - 26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (Benoîte commune) Ρ bordures de haies, zones humides (16, 19) 0,8 – 1,5 (14, 19). L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19). 16 (79 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (18, 19) stratification à chaude (1) aucun traitement particulier (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (Gailiet gratteron) A terres arables, zones humides, sites perturbés (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19). 6 (100 %) (18). stratification froide (1, 18, 19) germination non affectée par une irradiation (18, 19) la lumière inhibe la germination (1) aucun traitement particulier (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (Caille-lait blanc) Ρ haies sur talus, zones ouvertes (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) aucun traitement particulier (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (Digitale pourpre) B, P haies, zones ouvertes (16, 19) 0,1 – 0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19). 8 (99 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (1,17-19) aucun traitement particulier (4, 22-26) POST (4, 22 - 26) D, G, F Veronica persica (Véronique de Perse) A terres arables, zones ouvertes, sites perturbés (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18). germination inhibée par l'obscurité (18, 19) stratification froide (18) aucun traitement particulier (14) PRE & POST (28) A 32 Distributeurs de semences cités ID Fournisseur Coordonnées Fournisseur A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 - 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 - 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 - 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 - 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 - 7333 www.thompson-morgan.com RÉFÉRENCES CITÉES (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. 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Les espèces végétales sont les suivantes: — tomate (Solanum lycopersicon), — concombre (Cucumis sativus), — laitue (Lactuca sativa), — soja (Glycine max), — chou (Brassica oleracea var. capitata), — carotte (Daucus carota), — avoine (Avena sativa), — raygras pérenne (Lolium perenne), — maïs (Zea mays), — oignon (Allium cepa). C.32. ESSAI DE REPRODUCTION CHEZ L'ENCHYTRÉE INTRODUCTION 1. La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 220 (2004) de l'OCDE pour les essais de produits chimiques. Elle est destinée à évaluer les effets des substances chimiques sur la reproduction d'un ver enchytrée, Enchytraeus albidus, Henle 1873, dans le sol. Elle repose pour l'essentiel sur une méthode développée par l'Umweltbundesamt (Allemagne) (1) qui a été soumise à un essai tournant (2). D'autres méthodes d'évaluation de la toxicité des substances chimiques sur les enchytrées et les lombrics ont aussi été prises en considération (3)(4)(5)(6)(7)(8). CONSIDÉRATIONS INITIALES 2. Les annélides pédocoles du genre Enchytraeus sont des espèces écologiquement pertinentes pour les essais d'écotoxicité. Bien que fréquents dans les sols à lombrics, les enchytrées colonisent souvent en abondance de nombreux sols qui n'abritent pas de lombrics. Les enchytrées se prêtent à des essais en laboratoire, ainsi qu'à des essais sur le terrain et en partie sur le terrain. Sur le plan pratique, de nombreuses espèces ď Enchytraeus sont faciles à manipuler et à élever et leur génération est nettement plus courte que celle des lombrics. Aussi la durée d'un essai de reproduction chez l'enchytrée n'est-elle que de 4 à 6 semaines, contre 8 semaines chez les lombrics (Eisenia fetida). 3. Des notions de base sur l'écologie et l'écotoxicologie des enchytrées en milieu terrestre sont fournies par les références (9)(10)(11)(12). PRINCIPE DE L'ESSAI 4. Les enchytrées adultes sont exposés à une gamme de concentrations de la substance chimique d'essai mélangée à un sol artificiel. Cet essai peut être divisé en deux étapes: a) un essai de détermination de l'ordre de grandeur des concentrations, si des informations manquent, où la mortalité constitue le principal résultat évalué après deux semaines d'exposition et b) l'essai de reproduction proprement dit dans lequel on évalue le nombre total de vers juvéniles produits par animal parent et la survie des animaux parents. L'essai proprement dit dure six semaines. À la fin des trois premières semaines, on enlève les vers adultes et on note leurs changements morphologiques. Au terme des trois semaines suivantes, le nombre de descendants éclos des cocons engendrés par les adultes est compté. On compare le taux de reproduction des animaux exposés à la substance chimique d'essai à celui du(des) témoin(s), afin de déterminer i) la concentration sans effet observé (CSEO) et/ou ii) la CEx (par exemple CE10, CE50), à l'aide d'un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % du taux de reproduction. Les concentrations expérimentales doivent couvrir la CEx (par exemple CE10, CE50), de façon à ce que la CEx soit interpolée plutôt qu'extrapolée. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE CHIMIQUE D'ESSAI 5. Il est préférable de connaître l'hydrosolubilité, le log Koe, le coefficient de partage entre l'eau et le sol (chapitre C.18 ou C.19 de la présente annexe, par exemple) et la pression de vapeur de la substance chimique d'essai. Des informations supplémentaires sur le devenir de la substance chimique d'essai dans le sol, notamment sa vitesse de photolyse et d'hydrolyse, seraient souhaitables. 6. La présente méthode d'essai convient à l'essai de substances chimiques hydrosolubles ou insolubles; néanmoins, le mode d'application de la substance d'essai variera en conséquence. Cette méthode d'essai ne s'applique pas aux substances volatiles, à savoir les substances dont la constante de Henry ou le coefficient de partage air/eau sont supérieurs à un, ou les substances dont la pression de vapeur dépasse 0,0133 Pa à 25 °C. VALIDITÉ DE L'ESSAI 7. Pour que l'essai soit valide, les témoins doivent satisfaire aux critères suivants: — la mortalité des adultes n'excédera pas 20 % à la fin de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur des concentrations et à la fin des trois premières semaines de l'essai de reproduction. — si dix adultes ont été déposés dans chaque récipient au début de l'essai, on doit retrouver en moyenne au moins 25 vers juvéniles par récipient à la fin de l'essai. — le coefficient de variation autour du nombre moyen de vers juvéniles ne doit pas dépasser 50 % à la fin de l'essai de reproduction. Un essai qui ne remplirait pas les critères de validité susmentionnés doit être arrêté, à moins que la poursuite de l'essai puisse être justifiée. Cette justification doit figurer dans le rapport d'essai. SUBSTANCE CHIMIQUE DE RÉFÉRENCE 8. Afin de vérifier que la réaction des organismes d'expérience ne change pas de façon significative au cours du temps, une substance chimique de référence sera soit testée à intervalles réguliers, soit incluse dans chaque essai. La carbendazime, qui affecte la survie et la reproduction des enchytrées (13)(14), est une substance de référence appropriée, tout comme d'autres produits chimiques dont la toxicité est bien connue. Le Derosal™, fourni par AgrEvo (Francfort, Allemagne), est un produit renfermant de la carbendazime à raison de 360 g/l (32,18 %) d'ingrédient actif, qui a été utilisé dans un essai tournant (2). La CE50 pour la reproduction déterminée au cours de l'essai tournant s'élevait à 1,2 ± 0,8 mg d'ingrédient actif/kg de masse sèche (2). Si un étalon toxique positif est inclus dans la série d'essais, on n'applique qu'une seule concentration et un nombre d'expériences identiques égal à celui des témoins. En ce qui concerne la carbendazime, on recommande l'essai de 1,2 mg d'ingrédient actif/kg de poids sec (testé sous forme liquide). DESCRIPTION DE L'ESSAI Matériel 9. Les récipients expérimentaux doivent être composés de verre ou d'un autre matériau chimiquement inerte. On utilisera des bocaux en verre (volume: 0,20 - 0,25 litre; diamètre ± 6 cm, par exemple) munis de couvercles transparents (en verre ou en polyéthylène, par exemple) afin de réduire l'évaporation de l'eau, tout en autorisant les échanges gazeux entre le sol et l'atmosphère. Les couvercles doivent être transparents pour laisser passer la lumière. 10. Cet essai requiert du matériel de laboratoire courant et en particulier: — armoire à séchage; — stéréomicroscope; — pH-mètre et photomètre — balances suffisamment précises; — instruments appropriés permettant de réguler la température; — instruments appropriés permettant de réguler l'humidité (pas essentiel si les récipients expérimentaux ont des couvercles); — incubateur ou petite chambre équipée d'un conditionnement de l'air; — pinces, crochets ou anses; — cuve de développement photographique Préparation du sol artificiel 11. Dans cet essai, on utilise un sol artificiel (5)(7) composé comme suit (en poids secs, séchés à 105 °C jusqu'à obtention d'un poids constant): — 10 % de tourbe à sphaigne, séchée à l'air et finement broyée (une dimension des particules de 2±1 mm est acceptable); il est recommandé de vérifier qu'un sol préparé avec un lot frais de tourbe convient à la culture des vers, avant de l'utiliser dans un essai; — 20 % d'argile kaolinique (taux de kaolinite de préférence supérieur à 30 %); — environ 0,3 à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO3 pulvérisé, de qualité pour analyse) pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5; la quantité de carbonate de calcium à ajouter peut dépendre principalement de la qualité/nature de la tourbe; — environ 70 % de sable quartzique (selon la quantité de CaCO3 nécessaire) séché à l'air, composé en majorité de sable fin (plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm). Avant d'utiliser le sol artificiel dans l'essai proprement dit, il est conseillé de démontrer que ce sol convient à la culture des vers et qu'il permet de répondre aux critères de validité de l'essai. Cette précaution vise en particulier à vérifier que le bon fonctionnement de l'essai ne sera pas compromis si la teneur en carbone organique du sol artificiel est réduite, par exemple si le pourcentage de tourbe est ramené à 4-5 % et que le taux de sable est augmenté en conséquence. Cette réduction de la teneur en carbone organique est susceptible de diminuer les possibilités d'adsorption de la substance chimique d'essai sur le sol (carbone organique) et d'augmenter la disponibilité de la substance d'essai pour les vers. Il a été démontré qu'Enchytraeus albidus peut satisfaire aux critères de validité concernant la reproduction lorsqu'il est testé sur le terrain sur des sols dont la teneur en carbone organique est inférieure à celle mentionnée ci-dessus (2,7 %, par exemple) (15), et on a constaté (bien que l'expérience en la matière soit limitée) que ce ver peut aussi satisfaire aux critères de validité lorsqu'il est mis à l'essai sur un sol artificiel renfermant 5 % de tourbe. Remarque: Lorsqu'on utilise un sol naturel dans un essai supplémentaire (réalisé à un niveau supérieur dans le cadre d'essais séquentiels, par exemple), l'adéquation du sol à la culture des vers et au respect des critères de validité doit aussi être démontrée. 12. Les ingrédients secs du sol sont mélangés complètement (par exemple, dans un grand mélangeur de laboratoire), et ce au moins une semaine avant le début de l'essai. Le sol mélangé doit être entreposé durant deux jours pour que l'acidité s'équilibre/se stabilise. Pour déterminer le pH, on mélange le sol avec une solution 1 M de chlorure de potassium (KCl) ou 0,01 M de chlorure de calcium (CaCl2) dans des proportions de 1/5 [voir (16) et Appendice 3]. Si l'acidité du sol dépasse les valeurs incluses dans la gamme requise (voir paragraphe 11), elle peut être ajustée par l'addition d'une quantité appropriée de CaCO3. Si le sol est trop alcalin, il peut être rééquilibré par l'ajout d'un mélange comprenant les ingrédients cités au paragraphe 11, à l'exclusion du CaCO3. 13. La capacité maximale de rétention d'eau du sol artificiel est déterminée conformément aux procédures décrites à l'Appendice 2. Un ou deux jours avant le début de l'essai, le sol artificiel sec est préhumidifié par l'ajout d'une quantité suffisante d'eau désionisée pour atteindre environ la moitié de sa teneur en eau finale, à savoir 40 à 60 % de la capacité maximale de rétention d'eau. Au début de l'essai, le sol préhumidifié est divisé en autant de portions que de concentrations expérimentales, témoins et substance chimique de référence utilisés dans l'essai. La teneur en humidité est ajustée à 40-60 % de la capacité maximale de rétention d'eau par l'addition de la solution contenant la substance d'essai et/ou d'eau distillée ou désionisée (voir paragraphes 19-21). La teneur en humidité est déterminée au début et à la fin de l'essai (par séchage à 105 °C jusqu'à obtention d'un poids constant) et doit se situer dans la gamme optimale pour la survie des vers. Il est possible d'estimer en gros le taux d'humidité du sol en pressant doucement une poignée de sol dans une main: si le taux d'humidité est correct, de petites gouttes d'eau apparaissent entre les doigts. Sélection et préparation des animaux d'essai 14. L'espèce recommandée dans cet essai est Enchytraeus albidus, Henle 1837 (ver blanc), de la famille des Enchytraeidae (ordre des Oligochaeta, phylum des annélides). E. albidus est l'un des plus grands représentants des enchytrées, des spécimens mesurant jusqu'à 35 mm de long ayant été recensés (17)(18). Espèce à répartition mondiale, E. albidus colonise des habitats marins, dulcicoles et terrestres, constitués la plupart du temps de matière organique en décomposition (algues, compost), et fréquente rarement les prairies (9). Le fait qu'il tolère une gamme étendue de conditions écologiques et certaines variations morphologiques indiquent qu'il pourrait exister différentes races. 15. E. albidus est vendu dans le commerce, comme nourriture pour les poissons. Il y a lieu de vérifier si la culture est contaminée par d'autres espèces, généralement plus petites (1)(19). Dans l'affirmative, tous les vers doivent être lavés à l'eau dans une boîte de Petri. On sélectionne ensuite les grands spécimens adultes d'E. albidus (au moyen d'un stéréomicroscope), afin de lancer une nouvelle culture et on jette tous les autres vers. E. albidus s'élève facilement sur des matières organiques très diverses (voir Appendice 4). Le cycle de vie d'E. albidus est court: il met entre 33 jours (à 18 °C) et 74 jours (à 12 °C) à atteindre sa maturité (1). Seules les cultures qui auront pu être maintenues en laboratoire durant au moins cinq semaines (1 génération) sans poser de problème seront utilisées dans l'essai. 16. D'autres espèces du genre Enchytraeus conviennent également, par exemple E. buchholzi, Vejdovsky 1879, ou E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (voir Appendice 5). Si on utilise d'autres espèces ď Enchytraeus, il faut les identifier clairement et justifier ce choix dans le rapport. 17. Les animaux utilisés dans les essais sont des vers adultes. Il doivent porter des oeufs (points blancs) dans la région du clitellum et mesurer à peu près la même taille (environ 1 cm de long). La synchronisation de la culture d'élevage n'est pas nécessaire. 18. Si les enchytrées ne sont pas élevés sur un type de sol et dans des conditions (y compris alimentaires) identiques à celles de l'essai final, ils doivent passer par une période d'acclimatation comprise entre 24 heures et 3 jours. Il convient d'acclimater au départ un plus grand nombre d'adultes que ne le requiert l'essai, afin de pouvoir rejeter les individus blessés ou inutilisables pour une autre raison. Au terme de la période d'acclimatation, seuls les vers portant des oeufs et ne manifestant aucun comportement anormal (par exemple, essayant d'échapper du sol) sont sélectionnés pour l'essai. Les vers sont prélevés soigneusement à l'aide d'une pince de bijoutier, de crochets ou d'anses et placés dans une boîte de Petri contenant une petite quantité d'eau douce. À cet effet, il est préférable d'utiliser une eau douce reconstituée, telle que décrite au chapitre C.20 de la présente annexe (Daphnia magna, Essai de reproduction, l'eau désionisée, déminéralisée ou du robinet risquant d'être néfaste aux vers. Les vers sont examinés au stéréomicroscope et tous ceux qui ne portent pas d'oeufs sont éliminés. On veillera à éliminer toutes les mites ou les collemboles qui auraient pu infecter les cultures. Les vers sains qui ne serviront pas à l'essai sont remis dans la culture mère. Préparation des concentrations expérimentales Substance chimique d'essai hydrosoluble 19. Une solution de la substance chimique d'essai dans de l'eau désionisée est préparée en quantité suffisante pour toutes les expériences identiques d'une concentration expérimentale. Il est recommandé d'utiliser la quantité d'eau nécessaire pour obtenir le taux d'humidité requis, à savoir 40 à 60 % de la capacité maximale de rétention d'eau (voir paragraphe 13). Chaque solution de la substance d'essai est mélangée complètement avec un lot du sol préhumidifié, avant d'être introduite dans le récipient expérimental. Substance chimique d'essai non soluble dans l'eau 20. Les substances chimiques non solubles dans l'eau mais solubles dans des solvants organiques peuvent être dissoutes dans le plus petit volume possible d'un véhicule approprié (par exemple de l'acétone). Seuls des solvants volatils peuvent être utilisés. Le véhicule est pulvérisé sur, ou mélangé à, une petite quantité, 2,5 g par exemple, de sable quartzique fin. Ensuite, le véhicule est éliminé par évaporation sous une hotte durant au moins une heure. Ce mélange de sable quartzique et de la substance chimique d'essai est ajouté au sol préhumidifié, auquel il sera mélangé complètement après l'ajout de la quantité nécessaire d'eau désionisée pour atteindre l'humidité requise. Le mélange final est introduit dans les récipients expérimentaux. 21. Pour les substances chimiques peu solubles dans l'eau et les solvants organiques, on mélange l'équivalent de 2,5 g de sable quartzique finement broyé par récipient expérimental à la quantité nécessaire de la substance chimique d'essai pour obtenir la concentration expérimentale voulue. Ce mélange de sable quartzique et de la substance chimique d'essai est ajouté au sol préhumidifié, auquel il sera mélangé complètement après l'ajout de la quantité nécessaire d'eau désionisée pour atteindre l'humidité requise. Le mélange final est réparti entre les récipients expérimentaux. On répète la procédure pour chaque concentration expérimentale et on prépare un témoin approprié. 22. En principe, les substances ne devraient pas être mises à l'essai à des concentrations supérieures à 1 000 mg/kg de masse sèche de sol. Cependant, certains objectifs expérimentaux particuliers pourront exiger des concentrations supérieures. CONDUITE DES ESSAIS Groupes traités et témoins 23. Pour chaque concentration expérimentale, une quantité de sol d'essai correspondant à 20 g de poids sec est placée dans le récipient expérimental (voir paragraphes 19-21). On prépare également des récipients témoins sans substance chimique d'essai. La nourriture est introduite dans chaque récipient selon les procédures décrites au paragraphe 29. Dix vers choisis au hasard sont assignés à chaque récipient expérimental. Les vers sont soigneusement transférés dans les récipients et déposés à la surface du sol à l'aide de pinces, de crochets ou d'anses, par exemple. Le nombre d'expériences identiques pour les concentrations expérimentales et les témoins dépend de la conception de l'essai (voir paragraphe 34). Les récipients expérimentaux sont placés au hasard dans l'incubateur et leurs emplacements sont modifiés au hasard chaque semaine. 24. Si la substance chimique d'essai est appliquée à l'aide d'un véhicule, une série de témoins contenant du sable quartzique sur lequel le solvant a été pulvérisé ou auquel le solvant a été mélangé devrait être mise à l'essai parallèlement à la série traitée avec la substance chimique d'essai. La concentration du solvant ou du dispersant devrait être identique à celle utilisée dans les récipients expérimentaux contenant la substance d'essai. Une série de témoins contenant un supplément de sable quartzique (2,5 g par récipient) devrait aussi être mise à l'essai pour les substances administrées conformément à la procédure décrite au paragraphe 21. Conditions expérimentales 25. La température expérimentale est de 20 ± 2 °C. Pour dissuader les vers de s'échapper du sol, l'essai est mené sous des cycles réglés de lumière et d'obscurité (de préférence 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité), avec un éclairement de 400 à 800 lux dans la zone des récipients expérimentaux. 26. Pour vérifier l'humidité du sol, on pèse les récipients au début de l'essai, puis une fois par semaine. La perte de poids est compensée par l'ajout d'une quantité équivalente d'eau désionisée. Remarquons que la perte d'eau peut être réduite par le maintien d'un taux d'humidité de l'air élevé (> 80 %) dans l'incubateur. 27. Le taux d'humidité et le pH sont à mesurer au début et à la fin de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur des concentrations et de l'essai proprement dit. Les mesures doivent être effectuées sur des échantillons de sol traités (à toutes les concentrations) et témoins, préparés et entretenus de la même manière que les cultures expérimentales, mais ne contenant pas de vers. La nourriture ne sera ajoutée à ces échantillons de sol qu'au début de l'essai, afin de faciliter l'activité microbienne, et ce dans des quantités identiques à celles administrées aux cultures expérimentales. Il n'est pas nécessaire d'ajouter plus de nourriture dans ces récipients au cours de l'essai. Alimentation 28. On utilisera une nourriture à même de satisfaire aux besoins de la population d'enchytrées. Les flocons d'avoine, de préférence autoclavés avant l'emploi pour éviter une contamination microbienne (un traitement à la chaleur convient également) constituent une nourriture appropriée. 29. La première fois, on administre la nourriture en mélangeant 50 mg de flocons d'avoine moulus au sol de chaque récipient, avant d'y introduire les vers. Par la suite, la nourriture est dispensée une fois par semaine jusqu'au 21ème jour. Aucune nourriture n'est fournie le 28ème jour, car à cette date les adultes auront été enlevés et les vers juvéniles ne demandent désormais qu'un supplément relativement minime de nourriture. Au cours de l'essai, on introduit 25 mg de flocons d'avoine moulus dans chaque récipient, en les déposant soigneusement à la surface du sol de façon à éviter de blesser les vers. Pour réduire la croissance fongique, on enfouit les flocons d'avoine dans le sol en les recouvrant de petites quantités de sol. Si des restes de nourriture subsistent, on diminue la ration. Conception de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur des concentrations 30. Si nécessaire, un essai de détermination de l'ordre de grandeur sera mené avec, par exemple, cinq concentrations expérimentales: 0,1, 1,0, 10, 100 et 1 000 mg/kg (masse sèche de sol). Une expérience par concentration et par témoin suffit. 31. L'essai de détermination de l'ordre de grandeur dure deux semaines. À la fin de l'essai, on évalue la mortalité des vers. Un ver est consigné comme mort s'il ne réagit pas à un stimulus mécanique appliqué à l'extrémité antérieure. Outre le taux de mortalité, il pourrait être utile de disposer d'autres informations pour sélectionner la gamme de concentrations à appliquer dans l'essai proprement dit. Des modifications du comportement des adultes (par exemple, s'ils deviennent incapables de creuser le sol, s'ils restent prostrés contre la paroi en verre du récipient) et de leur morphologie (par exemple, des blessures ouvertes) devraient, par conséquent, aussi être notées, de même que la présence de vers juvéniles. Cette dernière peut être déterminée par la méthode de coloration décrite à l'Appendice 6. 32. La moyenne géométrique des données de la mortalité donne une idée approximative de la CL50. On établit la gamme de concentrations pour l'essai proprement dit, en supposant que les effets sur la reproduction sont inférieurs à ceux de la CL50 d'un facteur pouvant aller jusqu'à 10. Il ne s'agit toutefois que d'une relation empirique, susceptible de ne pas se vérifier dans des cas particuliers. Les observations supplémentaires effectuées au cours de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur, telles que la présence de vers juvéniles, peuvent permettre d'ajuster plus finement la gamme de concentrations expérimentales à appliquer dans l'essai proprement dit. 33. Pour déterminer la CL50 avec précision, on recommande de conduire l'essai en y incluant au moins quatre expériences identiques par concentration expérimentale et un nombre suffisant de concentrations pour obtenir au moins quatre résultats moyens différents et statistiquement significatifs à ces concentrations. Le cas échéant, un nombre identique de concentrations et d'expériences identiques sera mis à l'essai pour les témoins. Conception de l'essai de reproduction proprement dit 34. Trois conceptions, s'appuyant sur les recommandations émises à l'issue d'un essai tournant sont proposées (2): — Pour déterminer la CSEO, tester au moins cinq concentrations formant une série géométrique. Il est recommandé d'inclure quatre expériences identiques par concentration expérimentale et huit témoins. Les concentrations sont espacées d'un facteur n'excédant pas 1,8. — Pour déterminer la CEx (CE10, CE50, par exemple), tester au moins cinq concentrations couvrant la CEx, de façon à interpoler la CEx au lieu de l'extrapoler. Il est recommandé d'inclure au moins quatre expériences identiques par concentration expérimentale et quatre témoins identiques. Le facteur d'espacement peut varier: il est inférieur ou égal à 1,8 dans la gamme censée produire un effet et supérieur à 1,8 aux concentrations supérieures et inférieures. — Une approche combinée permet de déterminer à la fois la CSEO et la CEx. Pour ce faire, on utilise huit concentrations formant une série géométrique. Il est recommandé d'inclure quatre expériences identiques par concentration et huit témoins. Les concentrations sont espacées d'un facteur n'excédant pas 1,8. 35. Chaque récipient expérimental contient dix vers adultes (voir paragraphe 23). La nourriture est déposée dans les récipients expérimentaux au début de l'essai, puis une fois par semaine (voir paragraphe 29) jusqu'au 21ème jour inclus. Le 21ème jour, on prélève soigneusement à la main les échantillons de sol, afin d'observer et de compter les vers adultes vivants et de recenser leurs éventuels changements de comportement (incapacité de creuser le sol, prostration contre la paroi en verre du récipient expérimental, par exemple) et de morphologie (blessures ouvertes, par exemple). Tous les vers adultes sont ensuite retirés des récipients expérimentaux et du sol d'essai. Le sol d'essai renfermant des cocons est incubé durant trois semaines supplémentaires dans les mêmes conditions expérimentales, à ceci près que la nourriture n'est administrée que le 35ème jour (25 mg de flocons d'avoine moulus par récipient). 36. Après six semaines, les vers éclos sont comptés. On recommande d'appliquer la méthode de coloration au rouge de Bengale (voir Appendice 6), bien que d'autres techniques d'extraction et de flottation par voie humide (mais sans chauffage) (voir Appendice 6) aient également fait leurs preuves (4)(10)(11)(20). La coloration au rouge de Bengale est recommandée car l'extraction par voie humide à partir d'un sol peut être gênée par la turbidité causée par les particules d'argile en suspension. Essai limite 37. Si la concentration la plus élevée (1 000 mg/kg) de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur n'engendre aucun effet, l'essai de reproduction peut être conduit comme un essai limite, à la dose de 1 000 mg/kg pour démontrer que la CSEO sur la reproduction est supérieure à cette valeur. Résumé et calendrier de l'essai 38. Les étapes de l'essai peuvent se résumer comme suit: Calendrier Essai de détermination de l'ordre de grandeur des concentrations Essai proprement dit Jour –7 ou précédents — Préparer le sol artificiel (mélanger les ingrédients secs) — Préparer le sol artificiel (mélanger les ingrédients secs) Jour –5 — Vérifier le pH du sol artificiel — Mesurer la capacité de rétention d'eau maximale du sol — Vérifier le pH du sol artificiel — Mesurer la capacité de rétention d'eau maximale du sol Jour –5 à –3 — Trier les vers en vue de leur acclimatation — Trier les vers en vue de leur acclimatation Jour -3 à 0 — Acclimater les vers durant au moins 24 heures — Acclimater les vers durant au moins 24 heures Jour –1 — Préhumidifier le sol artificiel et le diviser en lots — Préhumidifier le sol artificiel et le diviser en lots Jour 0 — Préparer les solutions mères — Appliquer la substance chimique d'essai — Peser le substrat expérimental dans les récipients expérimentaux — Y incorporer à la nourriture — Introduire les vers — Mesurer le pH et le taux d'humidité du sol — Préparer les solutions mères — Appliquer la substance chimique d'essai — Peser le substrat expérimental dans les récipients expérimentaux — Y incorporer la nourriture — Introduire les vers — Mesurer le pH et le taux d'humidité du sol Jour 7 — Vérifier le taux d'humidité du sol — Vérifier le taux d'humidité du sol — Administrer la nourriture Jour 14 — Déterminer la mortalité adulte — Estimer le nombre de vers juvéniles — Mesurer le pH et le taux d'humidité du sol — Vérifier le taux d'humidité du sol — Administrer la nourriture Jour 21 — Observer le comportement des adultes — Retirer les adultes — Déterminer la mortalité adulte — Vérifier le taux d'humidité du sol — Administrer la nourriture Jour 28 — Vérifier le taux d'humidité du sol — Ne pas administrer de nourriture Jour 35 — Vérifier le taux d'humidité du sol — Administrer la nourriture Jour 42 — Compter les vers juvéniles — Mesurer le pH et le taux d'humidité du sol RÉSULTATS ET RAPPORT Traitement des résultats 39. La présente méthode d'essai ne prescrit aucune démarche statistique stricte pour analyser les résultats de l'essai, bien que l'Appendice 7 en présente les grandes lignes. 40. Dans l'essai de détermination de l'ordre de grandeur, le principal effet observé est la mortalité. Les changements comportementaux (par exemple, l'incapacité de creuser le sol; la prostration contre la paroi du récipient expérimental) ou morphologiques (par exemple des blessures ouvertes) chez les vers adultes doivent néanmoins aussi être enregistrés, de même que la présence de vers juvéniles. Il faut normalement appliquer l'analyse probit (21) ou la régression logistique pour déterminer la CL50. Toutefois, dans les cas où cette méthode d'analyse ne convient pas (par exemple si l'on obtient moins de trois concentrations engendrant une mortalité partielle), d'autres méthodes peuvent être utilisées, notamment les moyennes mobiles (22), la méthode de Spearman-Karber simplifiée (23) ou une simple interpolation (par exemple la moyenne géométrique de la CL0 et de la CL100, calculée en multipliant la racine carrée de la CL0 par la CL100). 41. Dans l'essai proprement dit, l'effet observé est la fécondité (c'est-à-dire le nombre de vers juvéniles produits). Néanmoins, comme dans l'essai de détermination de l'ordre de grandeur, tous les autres signes de nocivité doivent être consignés dans le rapport final. Pour calculer les résultats de la reproduction, il faut connaître la moyenne arithmétique et l'écart-type par traitement et par témoin afin d'effectuer l'analyse statistique. 42. Si on a pratiqué une analyse de la variance, l'écart-type, s, et les degrés de liberté, dl, peuvent être remplacés respectivement par l'estimation de la variance “fusionnée” obtenue par analyse de la variance (ANOVA) et par ses degrés de liberté, à condition que la variance ne dépende pas de la concentration. Dans ce cas, on utilisera les variances uniques des témoins et des échantillons traités. On calcule généralement ces valeurs à l'aide d'un logiciel statistique commercial, en utilisant les résultats par récipient comme des expériences identiques. Si la fusion des résultats relatifs aux témoins négatifs et au(x) témoin(s) contenant le solvant semble plus pertinente que de calculer les résultats de l'essai comparativement à l'un de ces deux témoins, il faudra vérifier à l'aide d'un test qu'ils ne présentent pas de différence significative (pour les tests appropriés, voir au paragraphe 45 et à l'Appendice 7). 43. Si les résultats des expériences identiques présentent une distribution normale et des variances homogènes, d'autres tests statistiques et déductions pourront être effectués. Estimation de la CSEO 44. Il est préférable d'appliquer des tests puissants. Il faudrait savoir si les données ont une distribution à peu près normale, en se reportant, par exemple, aux expériences précédentes (essais tournants) ou à d'autres données antérieures. L'homogénéité de la variance est plus déterminante. On a constaté empiriquement que la variance s'accroît souvent lorsque la moyenne s'accroît. Dans ce cas, une transformation des données pourrait déboucher sur l'homogénéité de la variance. Néanmoins, cette transformation devrait s'appuyer sur des données antérieures plutôt que sur les données en cours d'étude. En présence de données homogènes, il faudrait recourir à des tests t de comparaison multiple, tels que le test de Williams (α= 0,05, unilatéral) (24)(25), ou, dans certains cas, le test de Dunnett (26)(27). Remarquons que, dans le cas d'une reproduction inégale, les valeurs de t en tableau doivent être corrigées, comme l'ont suggéré Dunnett et Williams. En présence d'une variation importante, il peut arriver que la croissance ou la décroissance des résultats ne soit pas régulière. Avec un tel écart à la monotonicité, le test de Dunnett est plus approprié. Si la variance n'est pas homogène, il peut être utile d'examiner de plus près les répercussions possibles sur la variance afin de déterminer si les tests t peuvent être appliqués sans perdre beaucoup en puissance (28). Sinon, un test U de comparaison multiple, par exemple un test U de Bonferroni selon Holm (29), ou, si ces données présentent une variance hétérogène, mais concordent par ailleurs avec une relation dose-effet sous-jacente monotone, un autre test non paramétrique [par exemple un test de Jonckheere-Terpstra (30)(31) ou de Shirley (32)(33)] peuvent être appliqués et sont généralement préférables aux tests t à variance inégale. (voir aussi le schéma exposé à l'Appendice 7). 45. Si un essai limite a été conduit et que les conditions requises par les tests paramétriques (normalité, homogénéité) sont remplies, le test t de Student en paire peut être utilisé ou, sinon, le test U de Mann-Whitney (29). Estimation de la CEx 46. Pour calculer une quelconque valeur de CEx, on utilise la moyenne par traitement dans l'analyse de la régression (linéaire ou non linéaire), après avoir obtenu une fonction dose-effet appropriée. S'agissant de la croissance des vers considérée comme une réponse continue, les valeurs de la CEx peuvent être estimées à l'aide d'une analyse de la régression adéquate (35). Les fonctions appropriées aux résultats épousant une valeur de tout ou rien (mortalité/survie et nombre de descendants produits) sont les fonctions sigmoïdes normales, logistiques ou de Weibull, à deux ou quatre paramètres, dont certaines peuvent aussi modéliser des réponses hormétiques. Si la fonction dose-effet a été ajustée par une analyse de la régression linéaire, il faudrait trouver un r2 (coefficient de détermination) et/ou une pente significatifs avant d'estimer la CEx en insérant une valeur correspondant à x % de la moyenne du témoin dans l'équation obtenue par l'analyse de la régression. Des limites de confiance à 95 % sont calculées selon la méthode de Fieller (mentionnée par Finney (21)) ou par une autre méthode récente appropriée. 47. Sinon, la réponse est modélisée comme un pourcentage ou une proportion du paramètre du modèle, paramètre qui est interprété comme le résultat moyen du témoin. Dans ce cas, la courbe sigmoïde normale (logistique, Weibull) peut souvent être facilement ajustée aux résultats à l'aide de la régression probit (21). Dans ce cas, la fonction de pondération doit être ajustée pour les résultats métriques selon Christensen (36). Cependant, si on observe une hormèse, l'analyse probit doit être remplacée par une fonction logistique ou de Weibull à quatre paramètres, ajustée par une régression non linéaire (36). S'il est impossible d'ajuster une fonction dose-effet appropriée aux données, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour estimer la CEx et ses limites de confiance, telles que les moyennes mobiles d'après Thompson (22) et la méthode simplifiée de Spearman-Karber (23). RAPPORT D'ESSAI 48. Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes: Substance chimique d'essai: — état physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques (par exemple hydrosolubilité, pression de vapeur); — identification chimique de la substance chimique d'essai selon la nomenclature de l'IUPAC, numéro CAS, lot de fabrication, lot de conditionnement, formule structurale et pureté. — date d'expiration de l'échantillon. Espèce d'expérience — animal d'expérience utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions d'élevage. Conditions expérimentales: — ingrédients et préparation du sol artificiel; — méthode d'application de la substance chimique d'essai; — description des conditions expérimentales, notamment la température, le taux d'humidité, le pH, etc.; — description complète de la conception de l'essai et du mode opératoire. Résultats de l'essai: — mortalité des vers adultes après deux semaines et nombre de vers juvéniles à la fin de l'essai de détermination de l'ordre de grandeur; — mortalité des vers adultes après trois semaines d'exposition et recensement complet des vers juvéniles à la fin de l'essai proprement dit; — tout symptôme physique ou pathologique et changement comportemental observé chez les organismes d'expérience; — CL50, CSEO et/ou CEx (par exemple CE50, CE10) pour la reproduction si certaines d'entre elles sont applicables avec des intervalles de confiance et représentation graphique du modèle ajusté utilisé pour leur calcul, toutes les informations et observations utiles à l'interprétation des résultats. Écarts par rapport aux procédures décrites dans la présente méthode d'essai et faits inhabituels survenus au cours de l'essai. BIBLIOGRAPHIE (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. 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Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë en utilisant d