Règlement (CE) no 213/2001 de la Commission

du 9 janvier 2001

portant modalités d'application du règlement (CE) n° 1255/1999, en ce qui concerne les méthodes à utiliser pour l'analyse et l'évaluation de la qualité du lait et des produits laitiers et modifiant les règlements (CE) n° 2771/1999 et (CE) n° 2799/1999

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu le règlement (CE) n° 1255/1999 du Conseil du 17 mai 1999 portant organisation commune des marchés dans le secteur du lait et des produits laitiers(1), et notamment ses articles 10 et 15, son article 26, paragraphe 3, son article 29, paragraphe 1, et son article 31, paragraphe 14,

considérant ce qui suit:

(1) Les règlements de la Commission (CEE) n° 1216/68, (CEE) n° 3942/92, (CE) n° 86/94, (CE) n° 2721/95, (CE) n° 1080/96, (CE) n° 1081/96, (CE) n° 1082/96, (CE) n° 1854/96, (CE) n° 880/98 et (CE) n° 1459/98 dont les références complètes figurent à l'annexe XXVI du présent règlement fixent des méthodes de référence et de routine pour l'analyse et l'évaluation de la qualité du lait et des produits laitiers ainsi que le domaine et les règles d'application desdites méthodes. Pour des raisons de clarté, afin de fournir aux opérateurs du secteur un corpus unique desdites méthodes et des règles pour leur application, il convient de procéder à la refonte des règlements susmentionnés, en les regroupant dans un seul texte. Dans le même but, il convient de modifier les règlements de la Commission (CE) n° 2771/1999 du 16 décembre 1999 portant modalités d'application du règlement (CE) n° 1255/1999 du Conseil en ce qui concerne les mesures d'intervention sur le marché du beurre et de la crème de lait(2) et (CE) n° 2799/1999 du 17 décembre 1999 portant modalités d'application du règlement (CE) n° 1255/1999 en ce qui concerne l'octroi d'une aide au lait écrémé et au lait écrémé en poudre destinés à l'alimentation des animaux et la vente dudit lait écrémé en poudre(3) en vue d'incorporer dans le présent règlement leurs annexes concernant des méthodes d'analyse.

(2) Les caractéristiques de composition et de qualité du lait et des produits laitiers fixées dans le cadre des régimes prévus par le règlement (CE) n° 1255/1999 doivent être vérifiées pour garantir qu'elles sont strictement conformes aux exigences fixées.

(3) Il est souvent disposé que les méthodes de référence à utiliser pour de telles vérifications sont des méthodes publiées par des organismes internationaux tels que CEN, FIL, ISO et AOAC International et régulièrement mises à jour par ces organismes. Dans certains cas, une méthode de référence communautaire est établie; dans d'autres cas, aucune méthode de référence n'est spécifiée dans la réglementation communautaire. En vue de garantir l'uniformité d'application des méthodes de référence, il convient d'établir chaque année une liste des méthodes de référence et de préciser que la méthode à appliquer doit figurer sur cette liste.

(4) L'application de méthodes de routine ne doit pas être exclue; les conditions de leur utilisation doivent, dès lors, être spécifiées.

(5) Afin d'établir une pratique uniforme pour l'évaluation des résultats des analyses, il convient également de fixer des méthodes communes. Il en va de même pour l'évaluation sensorielle des produits concernés et pour le réexamen des résultats qui ont fait l'objet d'une contestation.

(6) Pour effectuer certaines analyses il n'existe pas actuellement de méthodes de référence internationalement acceptées qui ont été validées; de ce fait, aucune information n'est disponible quant aux variations des résultats d'analyse d'un laboratoire à l'autre; il convient dès lors de fixer des méthodes au niveau communautaire, qui ont été validées conformément aux règles établies internationalement et qui sont appliquées en tant que méthodes de référence.

(7) Le règlement (CE) n° 2571/97 de la Commission du 15 décembre 1997 relatif à la vente à prix réduit de beurre et à l'octroi d'une aide à la crème, au beurre et au beurre concentré destinés à la fabrication de produits de pâtisserie, de glaces alimentaires et autres produits alimentaires(4), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 635/2000(5), prévoit, dans certaines circonstances, le traçage de la crème, du beurre et du beurre concentré pour garantir une utilisation finale correcte de ces produits. Compte tenu de l'importance du traçage pour le bon fonctionnement du régime et afin de garantir une égalité de traitement entre opérateurs qui y participent, il convient d'établir, dans la mesure du possible, des méthodes communes de détermination de certains de ces traceurs.

(8) Le beurre concentré doit faire l'objet d'un traçage soumis à contrôle, conformément au règlement (CEE) n° 3143/85 de la Commission du 11 novembre 1985 relatif à l'écoulement à prix réduit de beurre d'intervention destiné à la consommation directe sous forme de beurre concentré(6), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 101/1999(7) et au règlement (CEE) n° 429/90 de la Commission du 20 février 1990 relatif à l'octroi par adjudication d'une aide au beurre concentré destiné à la consommation directe dans la Communauté(8), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 124/1999(9) et au règlement (CE) n° 2571/97. Le strict respect des conditions relatives au marquage du beurre concentré est indispensable pour prévenir le risque de détournement. Il convient dès lors de définir une méthode commune de détection de ces traceurs.

(9) Une aide au stockage privé des fromages à base de lait de brebis peut être octroyée en vertu de l'article 9 du règlement (CE) n° 1255/1999. Une restitution spéciale peut être octroyée pour les mêmes produits en vertu de l'article 31 du même règlement. Il est prévu d'importer dans la Communauté à partir de certains pays tiers dans des conditions préférentielles des fromages à base de lait de brebis, de lait de chèvre et de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne. En raison des dispositions susvisées, il est nécessaire de vérifier par des contrôles appropriés qu'il n'a pas été incorporé de lait de vache dans les produits concernés. Par conséquent il convient d'établir une méthode de référence communautaire de détection du lait de vache, sans préjudice de l'application de méthodes de routine si celles-ci sont conformes à certains critères.

(10) Le règlement (CEE) n° 2921/90 de la Commission du 10 octobre 1990 relatif à l'octroi des aides au lait écrémé en vue de la fabrication de caséine et de caséinates(10), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 2654/1999(11), prévoit que l'absence de coliformes doit être constatée. La méthode de référence acceptée sur le plan international pour la recherche des coliformes dans le lait et les produits laitiers est la norme internationale FIL73A:1985; toutefois, elle n'est applicable que sous une forme modifiée pour la détection des coliformes dans une certaine quantité de produit. Une méthode communautaire de référence pour la détection des coliformes fondée sur la norme susmentionnée est donc établie.

(11) Le règlement (CEE) n° 2658/87 du Conseil du 23 juillet 1987 relatif à la nomenclature tarifaire et statistique et au tarif douanier commun(12), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 254/2000(13), différencie les taux des droits de douane pour les aliments composés pour animaux relevant de la position tarifaire 2309, en fonction de leur teneur en produits laitiers. Afin d'assurer une application uniforme des dispositions en question, il convient de déterminer une méthode d'analyse de la teneur en lactose obligatoire pour tous les États membres et de retenir à cette fin une méthode généralement reconnue.

(12) Le règlement (CE) n° 1255/1999 prévoit que certaines conditions qualitatives doivent être respectées en ce qui concerne le beurre et le lait écrémé en poudre destinés à l'intervention ou, dans le cas du lait écrémé en poudre, destiné à l'alimentation des animaux; il convient par conséquent de fixer des méthodes de référence pour la vérification desdites conditions.

(13) La mise en oeuvre de certaines des méthodes introduites pour la première fois par le présent règlement nécessite une période d'adaptation; il convient dès lors d'en différer l'application.

(14) Le comité de gestion du lait et des produits laitiers n'a pas émis d'avis dans le délai imparti par son président,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

CHAPITRE I

DISPOSITIONS GÉNÉRALES

Article premier

Objet et champ d'application

Le présent règlement fixe les règles relatives à l'application des méthodes d'analyse chimique, physique, microbiologique et pour l'évaluation sensorielle du lait et des produits laitiers dans le cadre des régimes prévus par l'organisation commune des marchés dans le secteur du lait et des produits laitiers, établie par le règlement (CE) n° 1255/1999, ainsi que certaines de ces méthodes.

Article 2

Liste de méthodes

1. La liste des méthodes de référence applicables aux analyses visées à l'article 1er est fixée à l'annexe I.

2. Au moins une fois par an, la Commission met à jour ladite liste conformément à la procédure prévue à l'article 42 du règlement (CE) n° 1255/1999.

Article 3

Méthodes de routine

Des méthodes de routine peuvent être utilisées pour les analyses prévues par la réglementation communautaire à condition qu'elles soient correctement calibrées et régulièrement contrôlées par rapport à la méthode de référence.

La procédure figurant à l'annexe II peut être appliquée à la vérification des résultats obtenus par des méthodes de routine, proches des limites spécifiées dans les règlements concernés.

En cas de litige, les résultats obtenus par la méthode de référence sont déterminants.

Article 4

Validation des méthodes de référence

1. Une méthode de référence est validée si elle est conforme à des critères de précision préétablis, concernant la limite de répétabilité et de reproductibilité.

2. Si une méthode de référence fixée par les règlements concernés n'a pas été validée, les États membres établissent une limite de reproductibilité provisoire.

Cette limite est obtenue conformément à la procédure définie à l'annexe III, point b). Toutefois, pendant les dix-huit mois suivant l'entrée en vigueur du présent règlement, les États membres peuvent utiliser une procédure équivalente.

Le respect de la limite est vérifié au moins une fois par an.

3. Si les résultats de l'application de méthodes de référence validées ou de méthodes avec des chiffres provisoires relatifs à la précision indiquent qu'une limite a été dépassée, la méthode d'évaluation des résultats d'analyse décrite à l'annexe IV s'applique en vue de déterminer la différence critique par rapport à cette limite.

Article 5

Admissibilité des résultats d'analyses

1. Les analyses sont effectuées dans des laboratoires qui appliquent une méthode interne de contrôle de la qualité conforme à celle décrite à l'annexe V, point a), ou une méthode d'un niveau comparable.

Une description détaillée de la méthode appliquée doit être disponible dans le laboratoire.

2. Les laboratoires établissent leurs normes internes de précision dans une série pour toutes les méthodes selon:

a) la méthode définie à l'annexe V, point b), ou

b) une méthode validée, publiée, donnant une répétabilité établie.

Le respect de la limite de reproductibilité doit être vérifié au moins une fois par an conformément à la procédure définie à l'annexe III, point a).

Le deuxième alinéa ne s'applique pas si le laboratoire a participé à un programme d'essai d'aptitude au cours de l'année.

3. Le rapport de laboratoire sur les résultats de l'analyse doit contenir des éléments suffisants pour permettre une évaluation des résultats selon l'annexe IV et l'annexe VIII.

4. Les résultats d'une analyse sont considérés admissibles s'ils ont été obtenus conformément aux critères d'acceptabilité spécifiés dans la méthode interne de contrôle de la qualité visée au paragraphe 1 et aux normes internes de précision visées au paragraphe 2.

Article 6

Évaluation sensorielle

1. En ce qui concerne le beurre, les méthodes de l'annexe VI sont appliquées pour la vérification du travail des estimateurs et la fiabilité des résultats. La méthode décrite à l'annexe VII est appliquée en tant que méthode de référence pour l'évaluation sensorielle.

2. En ce qui concerne le lait et les produits laitiers autres que le beurre, les États membres utilisent, comme méthode de référence pour l'évaluation sensorielle, soit la norme FIL 99C/1997 soit d'autres méthodes comparables qu'ils communiquent à la Commission.

Les méthodes de l'annexe VI peuvent être appliquées pour la vérification du travail des estimateurs et la fiabilité des résultats.

Article 7

Échantillonnage et contestation des résultats d'analyses

1. En vue des analyses prévues par la réglementation communautaire, des échantillons en double doivent être pris.

2. La procédure définie à l'annexe VIII s'applique dans les cas où les résultats d'une analyse ne sont pas acceptés par l'opérateur.

CHAPITRE II

MÉTHODES D'ANALYSES

Article 8

Teneur en eau/matières sèches/matières grasses dans le beurre

1. La méthode d'analyse décrite à l'annexe IX est appliquée, en tant que méthode de référence, pour la détermination de la teneur en eau du beurre.

2. La méthode d'analyse décrite à l'annexe X est appliquée, en tant que méthode de référence, pour la détermination de la teneur en matières sèches non grasses du beurre.

3. La méthode d'analyse décrite à l'annexe XI est appliquée, en tant que méthode de référence, pour la détermination de la teneur en matières grasses du beurre.

Article 9

Traceurs

1. La méthode d'analyse décrite à l'annexe XII s'applique comme méthode de référence pour la détermination de la vanilline dans le beurre concentré, dans le beurre ou dans la crème.

2. La méthode d'analyse décrite à l'annexe XIII s'applique comme méthode de référence pour déterminer la quantité d'ester éthylique de l'acide β-apo-8'-caroténique dans le beurre concentré ou le beurre.

3. La méthode d'analyse décrite à l'annexe XIV s'applique comme méthode de référence pour la détermination de la teneur du beurre et du beurre concentré en stigmastérol ou en β-sitostérol.

4. Le beurre concentré, le beurre, ou la crème ont été tracés conformément à la relevante réglementation communautaire si les résultats obtenus correspondent aux spécifications du point 8 des annexes visées aux paragraphes 1, 2 et 3.

Article 10

Détection de la caséine de lait de vache

1. La méthode d'analyse de référence figurant en annexe XV est appliquée pour garantir que le fromage devant être produit exclusivement avec du lait de brebis, du lait de chèvre ou du lait de bufflonne ou un mélange de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne ne contient pas de caséine de lait de vache.

La caséine de lait de vache est considérée comme présente si la teneur apparente en caséine de lait de vache de l'échantillon à analyser est égale ou supérieure à la teneur de l'échantillon de référence contenant 1 % de lait de vache, prévu à l'annexe XV.

2. Les méthodes de routine pour la détection de la caséine de lait de vache dans les fromages visés au paragraphe 1 peuvent être utilisées dans les conditions suivantes:

a) la limite de détection doit être de 0,5 % ou moins;

b) il ne peut pas y avoir de résultats faux positifs;

c) la caséine de lait de vache doit être détectable avec la sensibilité requise, même après de longues périodes de maturation, comme cela peut se produire dans les conditions habituelles de l'exploitation commerciale.

Si la condition prévue au point b) n'est pas remplie, tout échantillon donnant un résultat positif doit être analysé au moyen de la méthode de référence.

Si l'exigence prévue au point c) n'est pas satisfaite pour un des types de fromages visés au paragraphe 1, ce fromage doit être analysé au moyen de la méthode de référence.

Article 11

Détection des coliformes

1. La méthode d'analyse de référence décrite en annexe XVI est applicable pour la détection de la présence de coliformes dans le beurre, le lait écrémé en poudre, la caséine et les caséinates.

2. Des méthodes de routine pour la détection des coliformes peuvent être utilisées, à condition que les résultats obtenus soient comparables à ceux obtenus par la méthode de référence décrite à ladite annexe. Les méthodes de routine doivent, en particulier, avoir une limite de détection suffisante. Il ne peut y avoir de faux négatifs. Si l'on ne peut exclure l'apparition de faux positifs, tout résultat positif doit être confirmé en utilisant la méthode de référence.

Article 12

Teneur en lactose

La méthode pour déterminer la teneur en lactose des produits relevant de la position 2309 de la nomenclature combinée est définie à l'annexe XVII.

Article 13

Détection du lactosérum présure

1. La méthode pour détecter la présence de lactosérum présure dans le lait écrémé en poudre destiné au stockage public est définie à l'annexe XVIII.

2. La méthode pour détecter la présence de lactosérum présure dans le lait écrémé en poudre et dans les mélanges destinés à l'alimentation animale est définie à l'annexe XIX.

Article 14

Détection du babeurre

La méthode pour détecter la présence du babeurre dans le lait écrémé en poudre est définie à l'annexe XX.

Article 15

Résidus d'antimicrobiotique

La méthode pour déterminer la présence de résidus d'antibiotiques et de sulfonamides/dapson dans le lait écrémé en poudre est définie à l'annexe XXI.

Article 16

Teneur en lait écrémé en poudre

La méthode pour déterminer la teneur en lait écrémé en poudre dans les aliments composés des animaux est définie à l'annexe XXII.

Article 17

Détection de l'amidon

La méthode pour détecter la présence d'amidon dans le lait écrémé en poudre, le lait en poudre dénaturé et les aliments composés pour animaux est définie à l'annexe XXIII.

Article 18

Teneur en humidité du babeurre acide en poudre

La méthode pour déterminer la teneur en humidité du babeurre acide en poudre destiné à être utilisé dans les aliments pour animaux est définie à l'annexe XXIV.

Article 19

Détection des matières grasses étrangères

La méthode pour déterminer la présence de matières grasses étrangères dans les matières grasses lactiques est définie à l'annexe XXV.

CHAPITRE III

DISPOSITIONS FINALES

Article 20

Modifications du règlement (CE) n° 2771/1999

Le règlement (CE) n° 2771/1999 est modifié comme suit:

1) À l'article 4, paragraphe 1, la première phrase est remplacée par le texte suivant: "Les autorités compétentes contrôlent la qualité du beurre selon les méthodes visées à l'annexe I et sur la base des échantillons prélevés selon les modalités visées à l'annexe IV".

2) À l'annexe I, le texte de la note n° 2 de bas de page est remplacé par le texte suivant: "Voir annexe I du règlement (CE) n° 213/2001."

3) Les annexes II et III sont supprimées.

4) À l'annexe IV, point 2, avant-dernière ligne, les termes "à l'annexe III" sont remplacés par les termes "à l'annexe VII du règlement (CE) n° 213/2001."

Article 21

Modification du règlement (CE) n° 2799/1999

Le règlement (CE) n° 2799/1999 est modifié comme suit:

1) À l'article 20, les paragraphes 1, 2, 3 et 4 sont remplacés par le texte suivant: "1. La teneur en lait écrémé en poudre des mélanges et des aliments composés est vérifiée au moyen d'une analyse, effectuée au moins en double, conformément à la méthode définie à l'annexe XXII du règlement (CE) n° 213/2001, complétée par les mesures de contrôle mentionnées à l'article 17, paragraphe 3, du présent règlement. En cas de discordance entre les résultats de ces vérifications, le résultat des contrôles sur place est déterminant.

2. L'absence de lactosérum présure est établie selon la méthode définie à l'annexe XIX du règlement (CE) n° 213/2001.

3. La teneur en amidon des aliments composés est établie par les mesures de contrôle mentionnées à l'article 17, paragraphe 3, du présent règlement qui doivent être complétées par la méthode d'analyse définie à l'annexe XXIII du règlement (CE) n° 213/2001.

4. La teneur en humidité du babeurre acide en poudre est établie selon la méthode d'analyse définie à l'annexe XXIV du règlement (CE) n° 213/2001."

2) Les annexes III, IV, V et VI sont supprimées.

Article 22

Abrogations

Les règlements (CEE) n° 1216/68, (CEE) n° 3942/92, (CE) n° 86/94, (CE) n° 2721/95, (CE) n° 1854/96, (CE) n° 1080/96, (CE) n° 1081/96, (CE) n° 1082/96, (CE) n° 880/98 et (CE) n° 1459/98 sont abrogés.

Les références faites aux règlements abrogés s'entendent comme faites au présent règlement.

Article 23

Entrée en vigueur

Le présent règlement entre en vigueur le septième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Toutefois, les méthodes prévues aux annexes III, IV point 4, V, VI et VIII sont applicables à partir du dix-huitième mois après l'entrée en vigueur de ce règlement.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 9 janvier 2001.

Par la Commission

Franz Fischler

Membre de la Commission

(1) JO L 160 du 26.6.1999, p. 48.

(2) JO L 333 du 24.12.1999, p. 11.

(3) JO L 340 du 31.12.1999, p. 3.

(4) JO L 350 du 20.12.1997, p. 3.

(5) JO L 76 du 25.3.2000, p. 9.

(6) JO L 298 du 12.11.1985, p. 9.

(7) JO L 11 du 16.1.1999, p. 14.

(8) JO L 45 du 21.2.1990, p. 8.

(9) JO L 16 du 21.1.1999, p. 19.

(10) JO L 279 du 11.10.1990, p. 22.

(11) JO L 325 du 17.12.1999, p. 10.

(12) JO L 256 du 7.9.1987, p. 1.

(13) JO L 28 du 3.2.2000, p. 16.

ANNEXE I

(Article 2)

LISTE DES MÉTHODES DE RÉFÉRENCERemarques concernant la liste des méthodes de référence de l'Union européenne:

Remarque 1: Isolation des matières grasses du lait comme décrit dans la norme FIL 6B:1989 (protection contre la lumière).

Remarque 2: Aucune méthode de référence n'a été établie.

Remarque 3: L'échantillon doit être préparé conformément à la norme FIL 122C:1996 ou conformément à la norme FIL 73A:1985.

Remarque 4: Incubation pendant 48 heures à une température de 55 °C, précautions à prendre contre l'assèchement du milieu de culture.

Remarque 5: % m.s.n.g. = % matière sèche - % matière grasse.

Remarque 6: Le beurre doit correspondre à la classe nationale de qualité de l'État de production visé à l'annexe V du règlement (CE) n° 2771/1999 de la Commission.

Remarque 7: Directive 84/4/CEE de la Commission.

Remarque 8: Règlement (CE) n° 1758/94 de la Commission (JO L 183 du 19.7.1994, p. 14).

Remarque 9: Directive 78/633/CEE de la Commission.

>TABLE>

>TABLE>

ANNEXE II

(Article 3)

VÉRIFICATION DES RÉSULTATS OBTENUS PAR LES MÉTHODES DE ROUTINE, PROCHES DES LIMITES POUR LES CARACTÉRISTIQUES DE COMPOSITION ET DE QUALITÉ SPÉCIFIÉES DANS LES RÈGLEMENTS

Si mo est une limite pour les caractéristiques de composition et de qualité spécifiées dans un règlement, la limite de décision (L) est:

>PICTURE>

si RRout/RRef <= 1RRout: Limite de reproductibilité de la méthode de routine

RRef: Limite de reproductibilité de la méthode de référence

Si mo est une limite supérieure et RRout/RRef > 1, la limite de décision est obtenue par la formule:

>PICTURE>

Si, dans les mêmes conditions, mo est une limite inférieure, la limite de décision est obtenue par la formule:

>PICTURE>

dans laquelle CrD95 est la différence critique de la méthode de référence, cf. annexe IV.

Si mo est une limite supérieure, un résultat final obtenu par une méthode de routine, supérieur à la limite de décision, doit être remplacé par un résultat final obtenu par la méthode de référence. Ce résultat final doit être fondé sur au moins le même nombre d'analyses/d'échantillons que le résultat final de la méthode de routine.

Si mo est une limite inférieure, suivre la même procédure pour un résultat final obtenu par une méthode de routine, qui est inférieur à la limite de décision.

Remarque

La procédure décrite ci-dessus peut être appliquée en l'absence d'effets décelables dus à la matrice.

Ces effets peuvent être décelés de la manière suivante: pour chaque échantillon utilisé pour l'étalonnage, la différence (wi) entre les résultats obtenus par la méthode de référence et par la méthode de routine est calculée.

L'écart type calculé selon la formule:

>PICTURE>

m: nombre d'échantillons utilisés pour l'étalonnage

est comparé avec la moyenne arithmétique de l'écart type de répétabilité de la méthode de référence et de la méthode de routine:

>PICTURE>

Un effet du à la matrice ne peut pas être exclu si:

>PIC FILE= "L_2001037FR.001502.EPS">

formule dans laquelle:

f= m (f: nombre de degrés de liberté)

α= probabilité d'erreur; α = 0,05.

Dans ce cas, d'autres recherches sont nécessaires pour qu'il soit possible de fixer une limite de décision.

ANNEXE III

(Articles 4 et 5)

a) Procédure relative à la détermination de la conformité avec une limite de reproductibilité établie (analyse chimique)

La conformité avec la limite de reproductibilité est vérifiée par comparaison des résultats du laboratoire avec ceux d'un laboratoire expérimenté(1), obtenus avec un échantillon identique. Une double détermination est effectuée dans les deux laboratoires et les résultats sont évalués selon la formule:

>PICTURE>

dans laquelle

CrD95: différence critique (P = 0,95)

>PICTURE>: moyenne arithmétique de deux résultats obtenus dans le laboratoire 1

>PICTURE>: moyenne arithmétique de deux résultats obtenus dans le laboratoire 2

R: limite de reproductibilité: à établir par interpolation

r: limite de répétabilité: si la précision varie avec la concentration.

Si la différence critique est dépassée, une autre expérience doit être réalisée dans un délai de deux mois. Si les résultats de cette seconde expérience ne sont pas conformes à la limite de reproductibilité, les autorités compétentes prennent toutes mesures nécessaires.

b) Procédure à suivre pour obtenir une limite de reproductibilité provisoire (analyse chimique)

Une limite de reproductibilité provisoire (Rprov) est établie à l'aide de l'équation suivante:

>PICTURE>

dans laquelle

>PICTURE>: moyenne de deux résultats obtenus dans le laboratoire 1

>PICTURE>: moyenne de deux résultats obtenus dans le laboratoire 2 (cf. annexe III, partie a)

r: limite de répétabilité ou limite de répétabilité provisoire.

Remarques:

1. Rprov peut être utilisée pour calculer les différences critiques (cf. annexe VI).

2. Rprov est fixée à 2r si la valeur calculée pour Rprov est inférieure à 2r.

3. Si la valeur calculée est supérieure à 3r ou supérieure au double de la valeur R calculée au moyen de l'équation Horwitz(2), Rprov est alors une valeur inacceptablement élevée et ne peut être utilisée pour calculer la différence critique.

4. Rprov doit être calculée au moins une fois par an sur la base des résultats obtenus dans deux laboratoires (cf. annexe IV).

5. La valeur moyenne de Rprov doit être utilisée pour calculer les différences critiques. Les règles établies aux points 2 et 3 s'appliquent à la valeur moyenne de Rprov.

La limite de reproductibilité (valeur R) est obtenue à partir de la valeur RSDR calculée comme suit:

>PICTURE>

(>PICTURE>

= moyenne arithmétique des résultats obtenus)

Exemples de valeurs RSDR calculées

>TABLE>

Pour une concentration de l'analyte de 1 g/100 g on obtient:

>PICTURE>.

(1) En règle générale, le laboratoire expérimenté doit être un laboratoire qui a participé avec succès soit à la validation de la méthode d'essai soit à un test d'adéquation

(2) Équation de Horwitz:

>PICTURE>

dans laquelle:

RSDR: Écart type relatif de la reproductibilité

c: concentration exprimée en fraction décimale (exemple: 10 g/100 g = 0,1).

Référence:

Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72(5), 784-806 (1989).

ANNEXE IV

(Article 4)

ÉVALUATION DES RÉSULTATS D'ANALYSE OBTENUS SELON DES MÉTHODES VALIDÉES

S'il ressort d'un résultat d'analyse qu'une limite a été dépassée, la moyenne arithmétique de deux résultats ou plus est calculée. La procédure suivante s'applique:

1) Si le résultat d'analyse est un résultat unique, une seconde analyse est effectuée dans des conditions de répétabilité. Si les deux analyses ne peuvent être effectuées dans ces conditions, une nouvelle analyse est effectuée en double dans des conditions de répétabilité et les résultats obtenus sont utilisés pour estimer la conformité avec la différence critique.

2) La valeur absolue de la différence entre la moyenne arithmétique des résultats obtenus dans des conditions de répétabilité et la limite sont calculées. Une valeur absolue de la différence, qui est supérieure à la différence critique, signifie que l'échantillon analysé ne remplis pas les conditions requises.

La différence critique est établie au moyen de la formule suivante:

>PICTURE>

dans laquelle

>PICTURE>: moyenne arithmétique des résultats obtenus

mo: limite

n: nombre d'analyses/échantillon

Si la précision varie avec la concentration, il peut être nécessaire d'établir r et R par interpolation.

Normalement, un résultat final enregistré pour un échantillon doit indiquer qu'une limite a été respectée.

Des résultats finals compris

- dans l'intervalle

>PICTURE>

et

>PICTURE>, si la limite est une valeur maximale,

- dans l'intervalle

>PICTURE>

et

>PICTURE>, si la limite est une valeur minimale,

ne devraient donc se produire qu'exceptionnellement.

Des résultats finals situés dans les intervalles mentionnés ne sont acceptables que s'ils ne se produisent qu'une fois sur 5 échantillons au maximum analysés par lot. Si moins de 5 échantillons sont analysés pour chaque lot, un résultat compris dans la fourchette mentionnée est acceptable. Toutefois, la règle selon laquelle il n'est obtenu qu'un résultat situé dans les fourchettes mentionnées pour 5 échantillons analysés doit être respectée si les lots sont fournis régulièrement par un producteur.

3) Si le résultat final x est calculé à l'aide d'une formule telle que x = y1 +/- y2 (exemple: eau + teneur en matière sèche non grasse du beurre pour calculer la teneur en matière grasse), dans laquelle y1 et y2 sont les résultats finaux d'un seul type d'analyse, alors les limites générales de répétabilité et de reproductibilité rx et Rx des résultats finals x sont calculées comme suit:

>PICTURE>

>PICTURE>

formule dans laquelle r1 et r2 sont les limites de répétabilité et R1 et R2 les limites de reproductibilité respectives de y1 et y2.

x est comparé avec la limite m0 selon les règles établies aux points 1 et 2. La différence critique est calculée selon la formule

>PICTURE>

dans laquelle x est la moyenne arithmétique des résultats xi obtenus.

4) Si le résultat final est calculé selon une formule telle que

>PICTURE>

(exemple: teneur de matières grasses sur la matière sèche du fromage)

formule dans laquelle y1 et y2 sont les résultats finaux d'un seul type d'analyse, les limites générales de répétabilité et de reproductibilité rx et Rx sont calculées comme suit:

>PICTURE>

>PICTURE>

>PICTURE>

μ1: limite ou valeur cible pour y1 (exemple: matière grasse)

μ2: limite ou valeur cible pour y2 (exemple: matière sèche)

>PICTURE>

>PICTURE>

formule dans laquelle

r1: limite de répétabilité y1

r2: limite de répétabilité y2

>PICTURE>

>PICTURE>

formule dans laquelle

R1: limite de reproductibilité y1

R2: limite de reproductibilité y2.

Les procédures de calcul de rx et Rx ne sont pas applicables que si les limites relatives de répétabilité et de reproductibilité (r*1, r*2; R*1; R*2) sont égales ou inférieures à 0,15.

x est comparé avec la limite μx suivant les règles prévues aux points 1. et 2. La différence critique est établie selon la formule

>PICTURE>

dans laquelle

>PICTURE>

est la valeur arithmétique des résultats x obtenus par ordre chronologique(1).

(1) N.B.:

Si, par exemple, on obtient les résultats y11, y12, y21 et y22, la moyenne arithmétique de y11/y21 et y12/y22 doit être calculée.

ANNEXE V

CONTRÔLE INTERNE

(Article 5)

a) Méthode de contrôle interne de la qualité (CIQ) (analyse chimique)

Définition du matériau de contrôle

Un matériau utilisé aux fins du CIQ est soumis à la même procédure, éventuellement partielle, que celle appliquée aux matériaux testés.

Un matériau de contrôle peut être:

- un matériau de référence certifié,

- un matériau de référence interne,

- un matériau approuvé par un essai interlaboratoire,

- un matériau supplémenté.

Procédure à suivre pour établir le CIQ

Le laboratoire doit fixer le CIQ conformément à la procédure décrite dans le document de l'IUPAC "Directives harmonisées relatives au contrôle interne de la qualité dans les laboratoires d'analyse"(1).

Le CIQ s'effectue par inclusion des matériaux de contrôle dans la séquence analytique ou par une analyse en réplication de l'échantillon à tester. Les matériaux de contrôle doivent être similaires, par leur composition chimique, aux échantillons à tester, et posséder une stabilité appropriée pendant la période à prendre en considération. Il doit être démontré qu'ils peuvent être convenablement divisés en portions identiques pour analyse et que leur concentration en analyte convient pour l'intervalle recherché.

Un matériau de contrôle doit être introduit au moins une fois dans chaque série d'analyses et la valeur obtenue portée sur un graphique de contrôle en vue de mesurer les erreurs à long terme. En outre, le laboratoire doit périodiquement démontrer qu'il remplit les conditions de répétabilité pendant la série d'analyses. Ceci s'effectue par une répétition de l'analyse des matériaux de contrôle et/ou des matériaux à tester. Les résultats de ces analyses doivent être comparés avec toute limite de répétabilité publiée et les données existantes sur le degré interne de précision.

Si des matériaux de contrôle sont utilisés, les valeurs obtenues pour l'analyse du matériau de contrôle entre les séries sont représentées sur un graphique Shewhart [ISO 8258 (1991)] avec des limites de contrôle appropriées. Les limites d'action sont fixées à

>PICTURE>,

st étant l'écart type total,

les limites d'avertissement étant fixées

>PICTURE>

Écart type total:

>PICTURE>

formule dans laquelle:

sb: écart type entre séries

sw: écart type à l'intérieur d'une série

n: nombre de déterminations

Dans les cas où il n'est pas utilisé de matériaux de contrôle (par exemple par manque de stabilité) au moins un des matériaux à tester doit être analysé en double dans chaque série.

Les différences absolues résultant des analyses en double à l'intérieur d'une série (cf. annexe III) sont transcrites sur graphique. La ligne centrale représente 1,128 sw, la limite inférieure est égale à zéro, la limite supérieure (limite d'activité) représente 3,686 sw, formule dans laquelle sw, est l'écart type à l'intérieur d'une série.

La méthode de contrôle doit comprendre des matériaux à teneurs faibles et élevées lorsque la fourchette de concentration est grande.

Si les matériaux à tester couvrent une large fourchette de concentrations d'analyte, le laboratoire doit établir le rapport entre la précision et la concentration. Si la précision est proportionnelle à la concentration, le contrôle suivant doit s'effectuer sur la base de la précision relative (c'est-à-dire la différence absolue en pourcentage de la valeur moyenne).

La fiabilité du système d'analyse disparaît si l'une des situations suivantes se présente:

A) la valeur actuelle de la représentation graphique se situe en dehors des limites d'action;

B) la valeur actuelle et la valeur précédente se situent en dehors des limites d'avertissement mais à l'intérieur des limites d'action;

C) si des matériaux de contrôle sont utilisés, neuf valeurs successives se situent du même côté de la droite moyenne.

Dans cette situation, le laboratoire

A) arrête l'analyse en attendant le résultat des essais de diagnostic et des mesures propres à remédier à la situation et

B) rejette les résultats de la série et procède à une nouvelle analyse des matériaux à tester.

b) Procédure de sélection du matériau de contrôle interne et de fixation des limites de précision "internes" (analyse chimique)

Des données relatives à la précision des essais de laboratoire sont établies par une analyse en réplication de matériaux de contrôle et/ou une analyse en réplication d'échantillons à tester.

Pour établir des paramètres de précision relatifs aux variations au sein d'une série et entre séries, destinés à être utilisés par la suite pour établir les graphiques de contrôle, les laboratoires procèdent selon la procédure suivante. Les laboratoires peuvent adopter des procédures différentes s'ils sont en mesure de démontrer de façon appropriée que des données fiables quant à la précision ont été calculées.

1. Sélection des matériaux de contrôle

S'il y a lieu que le laboratoire utilise un matériau de contrôle, des données doivent être réunies auparavant en vue de fixer des limites. Dans la mesure du possible, des Matériaux de Référence Certifiés (MRC) doivent être utilisés. Les matériaux de contrôle proposés doivent être analysés dans des conditions de répétabilité au cours d'une même série comprenant des MRC appropriés et faire l'objet de réplications et d'essais aléatoires. Si cette méthode n'est pas utilisable, les laboratoires s'efforceront de participer à des essais d'aptitude et d'établir des moyennes consensuelles (valeurs attribuées) qui peuvent être considérées comme une véritable moyenne conventionnelle accompagnée d'une forte incertitude. D'autres procédures consistent notamment à attribuer une valeur réelle par la formulation ou l'utilisation de matériaux de contrôle dopés.

En outre, si le laboratoire effectue régulièrement ce type d'analyse et a déjà établi un contrôle statistique, tous les nouveaux matériaux de contrôle (par exemple matériaux demandés pour cause de rupture de stock) doivent être obtenus par référence aux analyses à propos desquelles un contrôle est en cours avec les matériaux existants.

2. Fixation de limites

Après avoir choisi un matériau de contrôle, le laboratoire fixe, à l'aide de ce matériau, des chiffres de précision à l'intérieur d'une série et entre les séries.

La condition minimale requise pour la fixation des chiffres de précision à l'intérieur d'une série est que le matériau de contrôle soit analysé en 12 doubles. L'analyse en double doit être effectuée dans des conditions de répétabilité, c'est-à-dire par le même opérateur, avec les mêmes réactifs, etc. L'analyse en double du matériau de contrôle doit être effectuée au hasard à l'intérieur d'une série d'analyses. Chaque double doit être effectuée un jour différent au cours d'une période déterminée, afin de garantir une variation raisonnable entre les séries, compte tenu des variations normales concernant par exemple les réactifs, le réétalonnage des instruments et, le cas échéant, le changement des analystes.

NB.

Il faut savoir que l'utilisation de données qui ne sont pas entièrement représentatives de la variation entre les séries peut amener à refaire inutilement une analyse par suite de la fixation de limites trop étroites. À l'inverse, un laboratoire présentant des données de précision trop imprécises peut être dans l'impossibilité de respecter les limites prescrites dans les méthodes de référence; on pourrait supposer que son niveau de performance est faible par rapport à d'autres laboratoires comparables et il se pourrait qu'il ne fournisse pas les données appropriées pour le but recherché.

2.1. Détermination de la précision à l'intérieur d'une série

2.1.1. Précision à l'intérieur d'une série lorsqu'un matériau de contrôle est disponible

Des données doubles (au moins 12 doubles) doivent tout d'abord être soumises au test de variance maximale de Cochran. Ceci implique la comparaison de l'intervalle de double maximal au carré avec la somme des intervalles au carré.

>PICTURE>

formule dans laquelle

di= la différence entre doubles.

La valeur du paramètre de Cochran, C, est comparée avec les valeurs des tables [ISO 5725 (1994)]. Si une valeur peut être classée comme suspecte ou aberrante, le résultat doit être analysé en vue d'en trouver l'explication, par exemple erreur technique, erreur informatique, erreur dans la réalisation de l'essai, analyse d'un échantillon inadéquat. Si l'explication de l'erreur technique est telle qu'il s'avère impossible de remplacer le résultat douteux, celui-ci doit être éliminé comme cas effectivement aberrant. Si des valeurs suspectes ou aberrantes, qui ne peuvent être expliquées, subsistent, les valeurs suspectes sont retenues comme correctes et les valeurs statistiques aberrantes rejetées. Le laboratoire doit s'efforcer d'obtenir des valeurs de remplacement.

Dès que le laboratoire a l'assurance que les données ne comportent plus de valeurs aberrantes, l'écart type à l'intérieur de la série sw est calculé comme suit:

Pour chaque paire Xi1, Xi2 des données doubles p, la somme des doubles,

>PICTURE>

et la différence des doubles,

>PICTURE>

sont calculées et additionnées pour donner

>PICTURE>

>PICTURE>

>PICTURE>

L'estimation de l'écart type à l'intérieur de la série est la suivante:

>PICTURE>

La limite interne de précision est 2,8 sw.

Si une méthode de référence est utilisée, la limite interne de précision est comparée avec la limite de répétabilité publiée. Le laboratoire doit se conformer à l'exigence de la méthode de référence. Si cette exigence n'est pas respectée une enquête s'impose.

Les limites fixées doivent être considérées comme provisoires et susceptibles d'être révisées.

2.1.2. Précision à l'intérieur d'une série en l'absence d'un matériau de contrôle

Le laboratoire peut opter pour l'établissement de la précision à l'intérieur d'une série par analyse double d'échantillons à tester, représentatifs (minimum de 12 analyses doubles). S'il est impossible d'utiliser des matériaux de contrôle, par exemple à cause de leur instabilité, des données sur des doubles doivent être produites par cette méthode.

NB.

Il est supposé que les analyses couvrent une fourchette de valeurs relativement étroite et que, de ce fait, une valeur unique peut être appliquée à tous les échantillons. Si la fourchette des résultats est plus large, qu'elle dépasse par exemple un ordre de grandeur et que la précision dépend de la concentration, les laboratoires doivent s'efforcer d'utiliser les écarts types relatifs.

Les données doivent être soumises au test de Cochran comme au point 2.1.1. Dès que le laboratoire a l'assurance que les données ne comprennent pas de valeurs aberrantes, l'écart type à l'intérieur de la série et la limite interne de précision peuvent être calculés comme au point 2.1.1.

L'écart type à l'intérieur de la série, sw, peut être utilisé pour établir des graphiques de contrôle (cf. annexe II). Les limites fixées doivent être considérées comme provisoires et sujettes à révision.

2.2. Détermination de la précision entre séries

Calculer la valeur moyenne (S1/2) pour chaque paire et soumettre les valeurs obtenues au test de Grubbs [ISO 5725 (1994)]. Les critères de rejet/d'acceptation pour les valeurs aberrantes ou suspectes sont celles décrites au point 2.1.1. Le laboratoire s'efforcera de trouver une valeur de remplacement pour tout résultat refusé. Dès que le laboratoire a l'assurance que les données sont exemptes de valeurs aberrantes, l'écart type Sb entre les séries est calculé.

>PICTURE>

ou 0 si l'indication sous le signe de la racine carrée est négative.

L'écart type total st est utilisé pour établir les graphiques de contrôle pour la moyenne de n déterminations (cf. annexe II). Les limites fixées doivent être considérées comme provisoires et sujettes à révision.

3. Révision des limites initiales

Les limites de contrôle fixées conformément aux dispositions ci-dessus doivent être considérées comme des estimations initiales.

Pour mettre à jour les limites fixées sur la base d'une précision acceptable à l'intérieur des séries (section 2.1.2.), il convient de réunir d'autres données de double au sujet des échantillons à tester. L'intervalle avant révision dépendra de la fréquence d'analyse. À titre indicatif, les données devraient être révisées après obtention de dix nouvelles valeurs doubles. Toutes les données devraient alors être soumises au test de Cochran et les limites fixées de nouveau sur la base de la nouvelle valeur de l'écart type. Les décisions ultérieures relatives à la validité des limites de contrôle doivent être prises en tenant compte des données supplémentaires.

La révision des données initiales obtenues au sujet de la précision à l'intérieur d'une série dépend aussi de la fréquence de l'analyse. À titre indicatif, après que dix autres données ont été obtenues à partir de l'analyse du matériau de contrôle à raison d'une analyse par lot, les hypothèses de départ faites au sujet de l'écart type et de la moyenne devraient être révisées.

Toutes les données doivent être soumises au test de Grubbs, afin de déceler les valeurs extrêmes aberrantes. L'écart moyen et l'écart type devraient être recalculés sur la base des nouvelles données.

En outre, à ce stade, le laboratoire devrait appliquer un graphique Cusum [BS 5700: (1984) et modification 5480 (1987)] pour analyser tous les problèmes pouvant être associés par exemple au vieillissement des réactifs. Tout résultat simple sortant des limites du "masque-V" Cusum doit être analysé.

Les nouvelles limites (écart moyen et écart type) doivent être contrôlées régulièrement selon la technique Cusum. Toute indication selon laquelle la validité du matériau de contrôle est mise en doute doit être analysée soigneusement.

4. Communication des données de précision

Le laboratoire transmet les informations suivantes à l'autorité nationale compétente:

- la méthode employée

- l'écart type à l'intérieur des séries, sw, et la limite interne de précision

- l'écart type entre séries sb

- l'écart type total, s1

- le nombre d'analyses nécessaires pour obtenir les données de précision.

(1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995)

ANNEXE VI

(Article 6)

ÉVALUATION DES ESTIMATEURS ET DE LA FIABILITÉ DES RÉSULTATS RELATIFS AUX ANALYSES SENSORIELLES

Les procédures suivantes sont applicables en cas de recours à des méthodes de notation (norme FIL 99C/1997).

a) Détermination de "l'indice de répétabilité"

Au moins dix échantillons seront analysés sous forme de double en aveugle par un estimateur au cours d'une période de 12 mois. Cette opération se fait habituellement en plusieurs sessions. Les résultats des caractéristiques des divers produits sont évalués par application de la formule suivante:

>PICTURE>

dans laquelle

w1: indice de répétabilité

xi1: note relative à la première évaluation de l'échantillon xi

xi2: note relative à la seconde évaluation de l'échantillon xi

n: nombre d'échantillons

Les échantillons à évaluer doivent représenter une large gamme de qualité. w1 ne doit pas dépasser 1,5 (échelles à 5 points).

b) Détermination de "l'indice de l'écart"

Cet indice doit être utilisé pour vérifier si un estimateur utilise la même échelle d'évaluation de la qualité qu'un groupe d'estimateurs expérimentés. Les notes données par l'estimateur sont comparées avec la moyenne des notes accordées par le groupe.

La formule suivante est utilisée pour l'évaluation des résultats:

>PICTURE>

formule dans laquelle:

xi1; xi2: cf. point a)

>PICTURE>;

>PICTURE>: note moyenne accordée par le groupe d'estimateurs respectivement pour la première et la seconde évaluation de l'échantillon xi

n: nombre d'échantillons (au moins 10 par période de 12 mois).

Les échantillons à évaluer doivent représenter une large gamme de qualité. D1 ne doit pas dépasser 1,5 (échelles à 5 points).

Les États membres communiquent toute difficulté rencontrée lors de l'application de cette méthode.

c) Comparaison des résultats obtenus dans diverses régions d'un État membre et dans divers États membres

Le cas échéant, au moins une fois par an un test permettant de comparer les résultats obtenus par des estimateurs de différentes régions doit être organisé. Si des différences significatives sont observées, les mesures nécessaires doivent être prises pour en déterminer les raisons et aboutir à des résultats comparables.

Les États membres peuvent organiser des tests permettant de comparer les résultats obtenus par leurs propres estimateurs et par les estimateurs d'États membres voisins. En cas de différences significatives, une étude approfondie est entreprise en vue d'obtenir des résultats comparables.

Les États membres communiquent les résultats de ces comparaisons à la Commission.

ANNEXE VII

(Article 6)

ÉVALUATION SENSORIELLE DU BEURRE

1. Champ d'application

L'objectif du présent procédé d'évaluation sensorielle du beurre est de fournir une méthode uniforme, applicable dans tous les États membres.

2. Définitions

Par évaluation sensorielle, on entend l'examen des propriétés d'un produit par les organes des sens.

Par jury, on entend un groupe d'évaluateurs sélectionnés travaillant, au cours de l'évaluation, sans communiquer entre eux et sans exercer d'influence les uns sur les autres.

Par notation, on entend l'évaluation sensorielle par un jury, au moyen d'une échelle numérique. Une nomenclature des défauts doit être utilisée.

Par classification, on entend une classification de la qualité effectuée sur la base de la notation.

Par documents de contrôle, on entend les documents utilisés pour enregistrer les notes attribuées à chaque propriété et la qualité finale du produit (la composition chimique peut également être consignée dans ces documents).

3. Salle d'essai

3.1. Des précautions doivent être prises pour que les évaluateurs dans la salle d'essai ne soient pas influencés par des facteurs extérieurs.

3.2. La salle d'essai doit être exempte d'odeurs étrangères et facile à nettoyer. Les murs doivent être de couleur claire.

3.3. La salle d'essai et son éclairage ne doivent pas affecter les propriétés des produits à noter. La salle doit être équipée d'un système approprié de contrôle de la température.

4. Sélection des évaluateurs

L'évaluateur doit être familiarisé avec les produits du beurre et posséder les compétences nécessaires pour effectuer une classification sensorielle. Ses compétences doivent être évaluées régulièrement (au moins une fois par an) par l'autorité compétente.

5. Exigences applicables au jury

Le jury doit être composé d'un nombre impair d'évaluateurs, au minimum trois. La majorité d'entre eux doivent être employés auprès de l'autorité compétente ou être des personnes agréées non employées dans le secteur du lait.

Plusieurs facteurs doivent être pris en considération avant l'évaluation afin d'obtenir des performances optimales de la part des sujets:

- les sujets ne doivent souffrir d'aucune maladie pouvant affecter leurs performances. Si de telles conditions se présentent, il convient d'intégrer un autre sujet au panel,

- les sujets doivent être à l'heure pour participer à l'évaluation et s'assurer qu'ils ont réservé suffisamment de temps pour effectuer l'évaluation,

- les sujets doivent éviter d'utiliser des produits fortement odorants tels que parfums, lotions après-rasage, déodorants, et de manger des aliments fortement aromatisés (épicés), etc,

- les sujets ne peuvent ni fumer, ni manger, ni boire autre chose que de l'eau pendant la dernière demi-heure précédant l'évaluation.

6. Évaluation de la valeur de chaque propriété

6.1. L'évaluation sensorielle doit être effectuée en relation avec les trois propriétés suivantes: l'aspect, la consistance et la flaveur.

L'aspect couvre les éléments suivants: la couleur, la pureté apparente, la moisissure et la dispersion de l'eau. La dispersion de l'eau est testée conformément à la norme FIL 112A/1989.

La consistance couvre les éléments suivants: la fermeté et la tartinabilité.

Des méthodes physiques peuvent être appliquées pour l'évaluation de la consistance du beurre. La Commission envisage d'harmoniser ces méthodes.

La flaveur couvre les éléments suivants: le goût et l'odeur.

Un écart de température important par rapport à la température recommandée empêche une évaluation fiable de la consistance et de la flaveur. La température a une importance capitale.

6.2. Chaque propriété doit faire l'objet d'une évaluation sensorielle séparée. La notation doit être effectuée conformément au tableau 1.

6.3. Il peut être souhaitable pour les évaluateurs, avant de commencer l'évaluation, de noter ensemble un ou plusieurs échantillons de référence pour l'aspect, la consistance et la flaveur, dans un souci d'uniformité.

6.4. Les notes sont les suivantes:

>TABLE>

Dans les cas où la note exigée n'est pas obtenue, une description du défaut doit être donnée. La note donnée par chaque évaluateur pour chaque propriété doit être enregistrée dans le document de contrôle. Le produit est accepté ou rejeté sur la base d'une décision prise à la majorité. Les cas où les différences entre les notes attribuées à chaque propriété dépassent 1 point ne devraient pas se produire fréquemment (pas plus d'une fois pour 20 échantillons), à défaut de quoi la compétence du jury devrait être soumise à un contrôle par le président du jury.

7. Surveillance

Un président de jury, qui doit être un employé officiel de l'autorité compétente et peut être un membre du jury, doit être généralement responsable de la procédure entière. Il doit enregistrer les notes attribuées à chaque propriété dans le document de contrôle et certifier si le produit est accepté ou rejeté.

8. Échantillonnage et préparation de l'échantillon

8.1. - Il est souhaitable que l'identité des échantillons soit tenue secrète au cours de l'évaluation pour éviter toute influence.

- L'échantillonnage et la préparation de l'échantillon devraient être organisés par le président du jury préalablement à l'évaluation, sans la présence des autres membres du jury.

8.2. Dans les cas où l'évaluation sensorielle est effectuée dans l'entrepôt frigorifique, l'échantillon est prélevé au moyen d'une sonde à beurre. Si elle est effectuée ailleurs que dans l'entrepôt frigorifique, un échantillon d'au moins 500 g devrait être prélevé.

8.3. Au cours de l'évaluation, le beurre devrait avoir la température de 10 à 12 °C. De grands écarts par rapport à cette température devraient être évités à tout prix.

9. Nomenclature

Voir tableau 2 ci-joint.

Tableau1: notation du beurre

>TABLE>

>TABLE>

>TABLE>

Tableau 2: nomenclature des défauts du beurre

I. Aspect

1. aqueux, goutelettes d'eau apparentes

2. couleur non homogène bicolore

3. rayé

4. marbré

5. tacheté (points colorés, taches de beurre fondu)

6. séparation d'huile

7. trop coloré

8. inclusion d'air apparente (poreux)

9. granuleux

10. matières étrangères

11. moisi

12. sel non dissous

II. Consistance

14. pâte courte, cassante, beurre grumeleux

15. pâteux, pommadeux

16. collant

17. dur

18. mou

III. Flaveur

20. manque d'arôme, fade

21. impur(1)

22. goût étranger, arrière-goût

23. goût de vieux

24. goût de fromage,

goût de fromage acide

25. acide

26. levuré

27. a) goût de cuit

b) goût de brûlé

28. goût de moisi

29. rance

30. huileux, goût d'huile de poisson, goût de poisson

31. suiffeux

32. a) goût d'oxydé

b) goût métallique

33. goût de fourrage

34. âcre, amer

35. trop salé

36. goût de vase, fade, putride

37. malté (goût de malt)

38. goût de produits chimiques

(1) Cette appellation doit être utilisée le plus rarement possible et seulement quand on ne peut définir le défaut de façon plus précise.

ANNEXE VIII

(Article 7)

PROCÉDURE À SUIVRE EN CAS DE CONTESTATION DES RÉSULTATS D'ANALYSE (ANALYSE CHIMIQUE)

1. Une nouvelle analyse est effectuée à la demande de l'opérateur, dans les 7 jours ouvrables qui suivent la communication des résultats de la première analyse, à condition que des échantillons doubles du produit soient disponibles sous scellé et aient été stockés dans des conditions appropriées auprès des organismes compétents.

2. L'organisme compétent envoie, à la demande et aux frais de l'opérateur ces échantillons à un second laboratoire. Ce dernier doit être autorisé à exécuter des analyses officielles et doit avoir une qualification prouvée pour exécuter les analyses concernées. Cette qualification doit être établie par une participation réussie à des études en collaboration, des tests d'adéquation ou des comparaisons interlaboratoires. Le second laboratoire doit utiliser la méthode de référence. Les résultats obtenus par les deux laboratoires sont évalués comme suit:

a) Les deux laboratoires respectent les exigences de répétabilité et de reproductibilité

La moyenne arithmétique des résultats des tests obtenus par les deux laboratoires est communiquée comme étant le résultat final. Celui-ci est évalué à partir de la différence critique à l'aide de la formule suivante:

>PICTURE>

formule dans laquelle

>PICTURE>: moyenne arithmétique de tous les résultats obtenus par les deux laboratoires

mo: limite

R: reproductibilité

r: répétabilité

n1: nombre de résultats obtenus par le laboratoire 1

n2: nombre de résultats obtenus par le laboratoire 2.

Remarque:

Si le résultat final est calculé suivant la formule

>PICTURE>

ou

>PICTURE>

(voir respectivement annexe IV, points 3 et 4), remplacer R2 et r2 par R2x et r2x dans la formule.

b) Les deux laboratoires respectent la condition de répétabilité mais pas la condition de reproductibilité

Si la deuxième analyse confirme la première, la quantité soumise à analyse est rejetée comme non conforme. Dans le cas contraire, la quantité est acceptée.

c) Un seul laboratoire respecte la condition de répétabilité

Le résultat final du laboratoire respectant la condition de répétabilité est pris en considération pour arrêter la décision sur l'acceptabilité de la quantité soumise à analyse.

d) Aucun laboratoire ne respecte la condition de répétabilité mais la condition de reproductibilité est respectée

Le point a) s'applique.

e) Aucun laboratoire ne respecte ni la condition de répétabilité ni la condition de reproductibilité

La quantité soumise à analyse est acceptée si les résultats obtenus par un laboratoire aboutissent à cette conclusion.

f) Les résultats ont été obtenus par des méthodes non validées

La quantité soumise à analyse est acceptée si les résultats obtenus par un laboratoire aboutissent à cette conclusion.

3. Les résultats de la deuxième analyse sont communiqués à l'opérateur par l'autorité compétente dans les meilleurs délais. Les coûts de la seconde analyse sont à la charge de l'opérateur dans le cas où la quantité soumise à analyse est rejetée.

4. Dans les 5 jours ouvrables qui suivent la prise d'échantillons, si l'opérateur porte la preuve que la procédure d'échantillonnage n'était pas correcte, l'échantillonnage doit, si possible, être répété. Dans le cas où un nouveau échantillonnage n'est pas possible, la quantité soumise à analyse est acceptée.

ANNEXE IX

(Article 8)

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN EAU DU BEURRE

1. Portée et champ d'application

La présente méthode de référence sert à déterminer la teneur en eau du beurre.

2. Référence

Fédération internationale de la laiterie - Norme 50 C: 1995 - lait et produits laitiers - méthode d'échantillonnage.

3. Définition

Teneur en eau du beurre: la perte de masse après l'achèvement du processus de chauffage spécifié dans la présente norme. Cette teneur est exprimée en grammes pour 100 grammes.

4. Principe

Évaporation de l'eau de la portion à analyser en présence de pierre ponce à une température de 102 °C dans un four à dessication.

5. Matériel et produits

Matériel de laboratoire usuel, et en particulier:

5.1. Balance de précision, sensibilité 1 mg.

5.2. Dessicateur fourni avec un agent desséchant efficace (par exemple un gel de silice fraîchement séché avec indicateur hygroscopique).

5.3. Four à dessication ventilé, avec dispositif thermostatique assurant une température de 102 ± 2 °C dans tout l'espace de travail.

5.4. Plats en verre, porcelaine ou métal non corrosif, d'une hauteur d'environ 20 mm et d'un diamètre compris entre 60 et 80 mm.

5.5. Granules de pierre ponce en lavée, d'un diamètre compris entre 0,8 et 10 mm.

6. Échantillonnage

Voir norme FIL 50 C: 1995.

7. Mode opératoire

7.1. Préparation de l'échantillon à analyser

Chauffer l'échantillon de laboratoire dans le récipient fermé en verre ou en matière plastique adéquate, empli au moins à moitié et au plus aux deux tiers, à une température telle que l'échantillon soit assez mou pour qu'on puisse le malaxer facilement jusqu'à obtention d'un état homogène (soit au moyen d'un agitateur mécanique, soit manuellement). Le malaxage doit s'effectuer normalement à une température ne dépassant pas 35 °C. Laisser refroidir l'échantillon à température ambiante. Aussitôt que possible après le refroidissement, ouvrir le récipient contenant l'échantillon et remuer ce dernier pendant un bref laps de temps (pas plus de 10 secondes) à l'aide d'un instrument approprié, par exemple une cuillère ou une spatule, avant de le peser.

7.2. Détermination de la teneur en eau

7.2.1. Placer environ 10 grammes de pierre ponce dans le plat (5.4).

7.2.2. Sécher le plat contenant la pierre ponce dans le four (5.3) à 102 ± 2 °C pendant au moins une heure.

Remarque:

les phases de séchage visées aux points 7.2.2, 7.2.5 et 7.2.7 commencent lorsque la température dans le four atteint 102 ± 2 °C.

7.2.3. Laisser le plat refroidir dans le dessicateur (5.2) jusqu'à la température de la pièce où se trouve la balance et peser avec une précision de 1 mg.

7.2.4. Peser dans le plat, avec une précision de 1 mg, une portion d'environ 5 g de l'échantillon à analyser.

7.2.5. Placer le plat dans le four à 102 ± 2 °C et le laisser pendant 3 heures.

7.2.6. Laisser le plat refroidir dans le dessiccateur jusqu'à la température de la pièce où se trouve la balance et le peser avec une précision de 1 mg.

7.2.7. Renouveler le processus de séchage pendant des périodes supplémentaires d'une heure en refroidissant et en pesant chaque fois conformément aux indications données au point 7.2.6, jusqu'à obtention d'une masse constante (acquise lorsque la variation de masse ne dépasse pas 1 mg).

Dans l'éventualité d'un accroissement de la masse, prendre comme base de calcul la masse la plus basse enregistrée.

8. Expression des résultats

8.1. Méthode de calcul et formule

Calculer la teneur en eau W en pourcentage de la masse, en appliquant la formule

>PICTURE>

où

>TABLE>

8.2. Répétabilité

La différence en valeur absolue entre les résultats respectifs de deux déterminations effectuées simultanément ou successivement sans perte de temps intermédiaire par le même opérateur dans les mêmes conditions sur un matériel à analyser identique, ne doit pas dépasser 0,2 %.

8.3. Reproductibilité

La différence en valeur absolue entre deux résultats respectivement obtenus par deux opérateurs travaillant dans des laboratoires différents sur un matériel à examiner identique, ne doit pas dépasser 0,3 %.

9. Rapport d'analyse

Le rapport d'analyse doit spécifier la méthode utilisée et les résultats obtenus. Il doit aussi mentionner tous les détails opératoires non spécifiés dans la présente norme internationale ou considérés comme facultatifs, ainsi que les détails relatifs à tout incident susceptible d'avoir influé sur les résultats. Le rapport doit contenir tous les éléments d'information nécessaires à l'identification complète de l'échantillon.

ANNEXE X

(Article 8)

BEURRE: DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN MATIÈRES SÈCHES NON GRASSES

1. Portée et champ d'application

La présente norme décrit une méthode servant à déterminer la teneur du beurre en matières sèches non grasses.

2. Références

FIL - Norme 50 C: 1995 - Lait et produits laitiers - Méthodes d'échantillonnage.

3. Définitions

Teneur du beurre en matières sèches non grasses: le pourcentage des substances en cause, rapporté à la masse, déterminé selon le mode opératoire spécifié; il est exprimé en grammes pour 100 grammes.

4. Principe

Évaporation de l'eau d'une masse connue de beurre, extraction des matières grasses au pétrole léger et pesage du résidu.

5. Réactif

Pétrole léger ayant un intervalle d'ébullition compris entre 30 et 60 °C. Le réactif ne doit pas laisser subsister plus de 1 mg de résidu après l'évaporation de 100 ml.

6. Matériels et produits

6.1. Balance de précision ayant une sensibilité de 1 mg.

6.2. Dessicateur pourvu d'un agent desséchant efficace (par exemple un gel de silice fraîchement séché avec indicateur hygroscopique).

6.3. Four à dessication, ventilé, avec dispositif thermostatique assurant une température de 102 +- 2 °C dans la totalité de l'espace de travail.

6.4. Plats en verre, en porcelaine ou en métal non corrosif, ayant un rebord d'une hauteur d'environ 20 mm, un diamètre de 60 à 80 mm, et munis d'un agitateur en verre.

6.5. Creuset à filtration, verre fritté, diamètre des pores 16 à 40 μm, avec flacon d'aspiration.

7. Échantillonnage

Voir FIL - Norme 50 C: 1995.

8. Mode opératoire

8.1. Préparation de l'échantillon à analyser

Chauffer l'échantillon de laboratoire dans le récipient fermé en verre ou en matière plastique adéquate, empli au moins à demi et au plus aux deux tiers, à une température telle que l'échantillon soit assez mou pour qu'on puisse le malaxer facilement jusqu'à obtention d'un état homogène (soit au moyen d'un agitateur mécanique, soit manuellement). Le malaxage doit s'effectuer normalement à une température ne dépassant pas 35 °C. Laisser refroidir l'échantillon à température ambiante. Aussitôt que possible après le refroidissement, ouvrir le récipient contenant l'échantillon et remuer ce dernier pendant un bref laps de temps (pas plus de 10 secondes) à l'aide d'un instrument approprié, par exemple une cuillère ou une spatule, avant de le peser.

8.2. Détermination

8.2.1. Sécher le plat avec l'agitateur (6.4) et le creuset à filtration (6.5) dans le four (6.3) pendant une heure. Laisser ces objectifs refroidir dans le dessicateur et les peser ensemble (c'est-à-dire plat, agitateur et creuset à filtration) avec une précision de 1 mg (m0).

Notes:

- En règle générale, une durée de refroidissement de 45 minutes est suffisante.

- Il importe que la même combinaison plat/agitateur/creuset à filtration soit utilisée pour chaque portion à analyser lorsque le lot en cause en comporte plusieurs.

8.2.2. Enlever le creuset à filtration, enregistrer le poids de l'ensemble constitué par le plat et par l'agitateur, avec une précision de 1 mg (m1).

8.2.3. Peser dans le plat, avec une précision de 1 mg, une portion d'environ 5 g de l'échantillon à analyser (8.1) (m2).

8.2.4. Placer le plat (contenant l'agitateur et le beurre) dans le four à 102 +- 2 °C et l'y laisser toute la nuit.

8.2.5. Laisser le plat (8.2.3) refroidir jusqu'à température ambiante.

8.2.6. Verser 15 ml d'esther de pétrole chaud (environ 25 °C) dans le plat et détacher à l'aide de l'agitateur en verre la plus grande quantité possible du sédiment adhérant au plat. Transférer le solvant dans le creuset à filtration et le filtrer dans le flacon à aspiration.

8.2.7. Effectuer l'opération 8.2.6 quatre nouvelles fois. S'il n'y a pas de traces de matières grasses à la surface du plat, transférer quantitativement, pendant le quatrième lavage, la plus grande quantité possible du sédiment dans le creuset à filtration. S'il subsiste des traces de matières grasses, répéter l'opération 8.2.6 jusqu'à leur élimination totale.

8.2.8. Laver le sédiment dans le creuset à filtration avec 25 ml d'esther de pétrole chaud.

8.2.9. Sécher le plat et l'agitateur, ainsi que le creuset à filtration, dans le four à 102 +- 2 °C, pendant 30 minutes.

8.2.10. Laisser refroidir dans le dessicateur jusqu'à température ambiante et peser avec une précision de 1 mg.

8.2.11. Répéter les opérations 8.2.9 et 8.2.10 jusqu'à obtention d'une masse constante (acquise lorsque la variation de masse ne dépasse pas 1 mg) pour l'ensemble constitué par le plat, l'agitateur et le creuset à filtration (m3).

9. Expression des résultats

9.1. Calcul de la teneur en matières sèches non grasses

Calculer la teneur en matières sèches non grasses (msng), exprimée en pourcentage de la masse, en appliquant la formule:

>PICTURE>

où

m0 désigne la masse en grammes du plat vide avec l'agitateur en verre et le creuset à filtration (8.2.1);

m1 désigne la masse en grammes du plat vide avec l'agitateur en verre (8.2.2);

m2 désigne la masse en grammes de la portion à analyser et du plat avec l'agitateur en verre (8.2.3);

m3 désigne la masse en grammes du plat avec l'agitateur et le creuset à filtration contenant le sédiment (8.2.11)

Transcrire le résultat avec une décimale.

9.2. Répétabilité

La différence en valeur absolue entre les résultats respectifs de deux déterminations, effectuées simultanément ou successivement sans perte de temps intermédiaire par le même opérateur dans les mêmes conditions sur un matériel à analyser identique, ne doit pas dépasser 0,1 %.

9.3. Reproductibilité

La différence en valeur absolue entre deux résultats respectivement obtenus par deux opérateurs travaillant dans des laboratoires différents sur un matériel à analyser identique, ne doit pas dépasser 0,2 %.

10. Rapport d'analyse

Le rapport d'analyse doit spécifier la méthode utilisée et les résultats obtenus. Il doit aussi mentionner tous les détails opératoires non spécifiés dans la présente norme internationale ou considérés comme facultatifs, ainsi que les détails relatifs à tout incident susceptible d'avoir influé sur les résultats. Le rapport doit contenir tous les éléments d'information nécessaires à l'identification complète de l'échantillon.

Note:

>TABLE>

Il est permis d'en conclure que les résultats chiffrés relatifs à la précision obtenus pour la détermination des matières sèches non grasses sont également valables pour la détermination de la teneur en matières sèches non grasses laitières.

ANNEXE XI

(Article 8)

DÉTERMINATION DE LA TENEUR DU BEURRE EN MATIÈRES GRASSES

La teneur en matières grasses se calcule indirectement à partir de la teneur en eau et de la teneur en matières sèches non grasses, respectivement déterminées selon les annexes IX et X. Le pourcentage de matières grasses, rapporté à la masse, est égal à

>PICTURE>

>TABLE>

>TABLE>

ANNEXE XII

(Article 9)

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN VANILLINE DANS LE BEURRE CONCENTRÉ, DANS LE BEURRE OU DANS LA CRÈME À L'AIDE DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE À HAUTE PERFORMANCE

1. Objet et champ d'application

La méthode décrit un mode opératoire permettant la détermination quantitative de vanilline dans le beurre, le beurre concentré ou dans la crème.

2. Principe

Extraction d'une quantité connue d'échantillon à l'aide d'un mélange d'isopropanol/éthanol/acétonitrile (1:1:2). Précipitation de la plus grande partie de la matière grasse par réfrigération (température comprise entre - 15 et - 20 °C), suivie par une centrifugation.

Après dilution avec de l'eau, détermination de la teneur en vanilline par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

3. Appareillage

Matériel courant de laboratoire, et notamment les éléments suivants:

3.1. congélateur, d'une amplitude de température comprise entre - 15 et - 20 °C;

3.2. seringues, jetables, d'une capacité de 2 ml;

3.3. microfiltres à membranes (diamètre des pores: 0,45 μm), résistant à une solution contenant 5 % de solution d'extraction (4.4);

3.4. système de chromatographie liquide composé d'une pompe (flux de 1,0 ml/min), d'un injecteur (injection de 20 μl, automatique ou manuelle), d'un détecteur d'UV (fonctionnant à 306 nm, 0,01 AU pleine échelle), d'un enregistreur ou d'un intégrateur ainsi que d'un four thermostatique à colonne fonctionnant à 25 °C;

3.5. colonne analytique (250 mm x 4,6 mm ID) garnie avec la phase LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) ou équivalent;

3.6. précolonne (environ 20 mm x 3 mm ID) garnie à sec avec la phase Perisorb RP 18 (30 à 40 μm) ou équivalent.

4. Réactifs

Tous les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique reconnue.

4.1. Isopropanol

4.2. Éthanol 96 % (v/v)

4.3. Acétonitrile

4.4. Solution d'extraction

Mélanger de l'isopropanol (4.1), de l'éthanol (4.2) et de l'acétonitrile (4.3) dans le rapport de 1:1:2 (v/v).

4.5. Vanilline (4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde)

4.5.1. Solution mère de vanilline (= 500 μg/ml)

Peser à 0,1 mg près environ 50 mg (mg CM) de vanilline (4.5) dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 25 ml de solution d'extraction (4.4) et compléter avec de l'eau.

4.5.2. Solution étalon de vanilline (= 10 μg/ml)

À l'aide d'une pipette, introduire 5 ml de solution mère de vanilline (4.5.1) dans une fiole jaugée de 250 ml et compléter avec de l'eau.

4.6. Méthanol, qualité CLHP

4.7. Acide acétique glacial

4.8. Eau, qualité CLHP

4.9. Phase mobile CLHP

Mélanger 300 ml de méthanol (4.6) à environ 500 ml d'eau (4.8) et à 20 ml d'acide acétique (4.7) dans une fiole jaugée de 1000 ml et compléter en volume avec de l'eau (4.8). Filtrer à travers un filtre (0,45 μm) (3.3).

5. Mode opératoire

5.1. Préparation de l'échantillon pour essai

5.1.1. Beurre

Chauffer l'échantillon jusqu'à ce qu'il commence à fondre. Éviter toute surchauffe locale au-dessus de 40 °C. Lorsque l'échantillon devient suffisamment plastique, l'homogénéiser en l'agitant. Remuer le beurre pendant 15 s avant de prendre un échantillon. Introduire dans une fiole jaugée de 100 ml environ 5 g (g SM) de beurre et le peser à 1 mg près.

5.1.2. Beurre concentré

Immédiatement avant l'échantillonnage, placer dans un four à 40-50 °C le récipient contenant le beurre concentré jusqu'à ce qu'il fonde complètement. Mélanger l'échantillon en le faisant tourner ou en le remuant; éviter la formation de bulles d'air lors d'une opération trop vigoureuse. Introduire dans une fiole jaugée de 100 ml environ 4 g (g SM) de beurre concentré et le peser à 1 mg près.

5.1.3. Crème

Chauffer l'échantillon dans un bain-marie ou une étuve à une température de 35 à 40 °C. Répartir la graisse de manière homogène en le faisant tourner et, si nécessaire, en le remuant. Refroidir rapidement l'échantillon (20 +- 2 °C). L'échantillon doit avoir un aspect homogène, sinon recommencer l'opération. Introduire dans une fiole jaugée de 100 ml environ 10 g (g SM) de crème et le peser à 1 mg près.

5.2. Préparation de la solution d'essai

Ajouter environ 75 ml de solution d'extraction (4.4) à la prise d'essai (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), remuer ou secouer vigoureusement pendant environ 15 min et compléter avec la solution d'extraction (4.4). Transférer environ 10 ml de cet extrait dans un tube à essai pourvu d'un bouchon. Placer le tube à essai dans le congélateur (3.1) et le laisser reposer environ 30 min. Centrifuger l'extrait froid pendant 5 min à environ 2000 rpm et décanter immédiatement. Laisser la solution décantée se refroidir à la température ambiante. Introduire à la pipette 5 ml de la solution décantée dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter avec de l'eau. Filtrer une partie aliquote à l'aide d'un microfiltre à membrane (3.3). Le filtrat est prêt pour la détermination par CLHP.

5.3. Calibrage

Introduire à la pipette 5 ml de la solution étalon de vanilline (4.5.2) dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 5 ml de solution d'extraction (4.4) et compléter avec de l'eau jusqu'à la marque. Cette solution contient 0,5 μg/ml de vanilline.

5.4. Détermination par CLHP

Laisser le système chromatographique se stabiliser pendant environ 30 min. Injecter la solution étalon (5.3). Répéter cette opération jusqu'à ce que la différence de l'aire des pics ou la hauteur des pics entre deux injections successives soit inférieure à 2 %. Dans les conditions décrites, le temps de rétention de la vanilline est d'environ 9 min. Analyser la solution étalon (5.3) en double en injectant 20 μl. Injecter 20 μl des solutions d'essai (5.2). Déterminer la superficie ou la hauteur du pic de vanilline obtenu. Recommencer en double l'injection de solution étalon (5.3) après 10 injections d'échantillons pour essais (5.2).

6. Calcul des résultats

Calculer la superficie (ou la hauteur) moyenne (AC) des pics de vanilline correspondant aux injections en double encadrant chaque lot de solutions d'essai (4 surfaces ou hauteurs).

Calculer le facteur de réponse (R):

>PICTURE>

où CM est la masse de vanilline en mg (4.5.1).

La teneur (mg/kg) en vanilline (C) de l'échantillon d'essai est donnée par la formule suivante:

>PICTURE>

où

AS= superficie du pic de vanilline de l'échantillon d'essai,

SM= masse de l'échantillon d'essai en g (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3).

Lorsque la crème est analysée pour la détermination de la vanilline, on doit exprimer la concentration du traceur en mg de traceur/kg de matière grasse butyrique, en multipliant C par 100/f, f étant la teneur en matière grasse de la crème en % (m/m).

20= facteur qui prend en compte les dilutions de l'étalon et de l'échantillon d'essai,

0,96= facteur de correction pour la teneur en matière grasse lors de la première dilution de l'échantillon d'essai.

Note:

On peut utiliser les hauteurs de pics au lieu de la surface des pics (voir point 8.3).

7. Précision de la méthode

7.1. Répétabilité (r)

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées dans l'intervalle de temps le plus bref possible par un seul opérateur utilisant le même appareillage sur du matériel d'essai identique ne doit pas dépasser 16 mg/kg.

7.2. Reproductibilité (R)

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par des opérateurs de différents laboratoires, utilisant des appareillages différents sur du matériel d'essai identique, ne peut dépasser 27 mg/kg.

8. Limites de tolérance

8.1. Trois échantillons doivent être prélevés sur le produit tracé afin de vérifier l'homogénéité.

8.2. Traceur obtenu soit à partir de vanille soit à partir de vanilline synthétique.

8.2.1. Le taux d'incorporation de 4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde est de 250 g par tonne de beurre concentré ou de beurre. Lorsque c'est de la crème qui est tracée, le taux d'incorporation est de 250 g par tonne de matière grasse butyrique.

8.2.2. On utilise les résultats obtenus pour les trois échantillons à partir de l'analyse du produit pour vérifier le taux et l'homogénéité de l'incorporation du traceur, et on compare le plus faible de ces résultats avec les limites suivantes [en prenant en considération la différence critique pour une probabilité de 95 % (DCr95)]:

- 221,0 mg/kg (95 % du taux d'incorporation minimal),

- 159,0 mg/kg (70 % du taux d'incorporation minimal).

La concentration du traceur dans l'échantillon donnant le résultat le plus faible est utilisée par interpolation entre 221,0 mg/kg et 159,0 mg/kg.

8.3. Traceur obtenu exclusivement à partir de gousses de vanille ou d'extraits intégraux de ces dernières.

8.3.1. Le taux d'incorporation du 4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde est 100 g par tonne de beurre concentré ou de beurre. Lorsque c'est de la crème qui est tracée, le taux d'incorporation est de 100 g par tonne de matière grasse butyrique.

8.3.2. On utilise les résultats obtenus pour les trois échantillons à partir de l'analyse du produit pour vérifier le taux et l'homogénéité de l'incorporation du traceur, et on compare le plus faible de ces résultats avec les limites suivantes [en prenant en considération la différence critique pour une probabilité de 95 % (DCr95)]:

- 79,0 mg/kg (95 % du taux d'incorporation minimal),

- 54,0 mg/kg (70 % du taux d'incorporation minimal).

La concentration du traceur dans l'échantillon donnant le résultat le plus faible est utilisée par interpolation entre 79,0 mg/kg et 54,0 mg/kg.

9. Notes

9.1. La répétabilité r est la valeur en dessous de laquelle la différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus avec la même méthode sur du matériel d'essai identique dans les mêmes conditions (même matériel, même laboratoire et dans un bref intervalle de temps) peut - selon toute vraisemblance - se situer dans une probabilité précise; en l'absence d'autres indications, cette probabilité est de 95 %.

9.2. La reproductibilité R est la valeur en dessous de laquelle la différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus avec la même méthode sur du matériel d'essai identique dans des conditions différentes (opérateurs différents, matériel différent, laboratoires différents et/ou délai différent) peut être escomptée se situer dans une probabilité précise; en l'absence d'autres indications, cette probabilité est de 95 %.

9.3. La récupération de la vanilline ajoutée à un niveau de 250 mg/kg de butteroil varie de 97,0 à 103,8. La teneur moyenne qui a été constatée était de 99,9 % avec un écart type de 2,7 %.

9.4. La solution étalon contient 5 % de solution d'extraction pour compenser l'élargissement du pic provoqué par la présence de 5 % de solution d'extraction des échantillons d'essai. Cela permet une quantification par hauteur de pic.

9.5. L'analyse se fonde sur une ligné d'étalonnage linéaire (intercept: zéro).

En utilisant des dilutions appropriées de la solution étalon (4.5.2), on vérifie la linéarité la première fois que l'analyse est effectuée et ensuite à intervalles réguliers ainsi qu'après la modification ou la rénovation de l'équipement CLHP.

ANNEXE XIII

(Article 9)

DÉTERMINATION DE LA QUANTITÉ D'ESTER ÉTHYLIQUE DE L'ACIDE β-APO-8'CAROTÉNIQUE DANS LE BEURRE CONCENTRÉ ET LE BEURRE PAR SPECTROMÉTRIE

1. Portée et champ d'application

La méthode décrit une procédure pour déterminer la quantité d'ester éthylique de l'acide β-apo-8'-caroténique (ester apo-caroténique) dans le beurre concentré et le beurre. L'ester apo-caroténique est la somme de toutes les substances présentes dans un concentré d'échantillons obtenu dans les conditions décrites dans la méthode, qui absorbent le rayonnement à 440 nm.

2. Principe

La matière grasse butyrique est dissoute dans de l'essence minérale légère et l'absorbance est mesurée à 440 nm. La quantité d'ester apo-caroténique est déterminée par référence à une norme externe.

3. Équipement

3.1. Pipettes graduées à 0,25, 0,50, 0,75 et 1,0 ml.

3.2. Spectrophotomètre, conçu pour un usage à 440 nm (et 447-449 nm) et équipé de cellules de 1 cm de longueur de chemin optique.

3.3. Fioles volumétriques, 20 ml et 100 ml.

3.4. Balance analytique, sensibilité de 0,1 mg.

4. Réactifs

Tous les réactifs doivent avoir un degré analytique reconnu.

4.1. Suspension d'ester apo-caroténique (environ 20 %).

4.1.1. Établir le contenu de la suspension comme suit:

Peser avec précision environ 400 mg dans une fiole jaugée, (100 ml), dissoudre dans 20 ml de chloroforme (4.4) et amener au volume avec du cyclohexane (4.5). Diluer 5 ml de cette solution à 100 ml avec du cyclohexane (solution A). Diluer 5 ml de la solution A à 100 ml avec du cyclohexane. Mesurer l'absorbance à 447-449 nm (mesurer le maximum en prenant le cyclohexane comme blanc et en utilisant des cuves de 1 cm de trajet optique).

>PICTURE>

Amax= absorbance maximale de la solution de mesure

A= poids de l'échantillon (g)

2550= valeur de référence A (1 %, 1 cm)

P exprime la pureté de la suspension (%).

Remarque:

l'ester apo-caroténique en suspension est sensible à l'air, à la chaleur et à la lumière. Il peut se conserver environ douze mois dans son emballage original, fermé (scellé sous azote) et stocké dans un endroit frais. Après ouverture, le contenu doit être utilisé dans un bref délai.

4.1.2. Solution standard d'ester apo-caroténique, environ 0,2 mg/ml

Prélever environ, à 0,1 mg près, 0,100 g d'ester apo-caroténique en suspension (4.1.1) (Wg), dissoudre dans de l'essence minérale (4.2), transférer quantitativement dans une fiole volumétrique de 100 ml et compléter jusqu'au trait avec de l'essence minérale.

Cette solution contient (W.P) 10 mg/ml d'ester apo-caroténique.

Remarque:

la solution doit être stockée dans un endroit frais, dans le noir. Après un mois, elle n'est plus utilisable.

4.2. Essence minérale (40-60 °C).

4.3. Sulfate de sodium, anhydre, cristallisé, préalablement séché à 102 °C pendant deux heures.

4.4. Chloroforme.

4.5. Cyclohexane.

5. Procédure

5.1. Préparation de l'échantillon test

5.1.1. Beurre concentré

Faire fondre l'échantillon dans un four à 45 °C environ.

5.1.2. Beurre

Faire fondre l'échantillon dans un four à 45 °C environ et en filtrer une partie à l'aide d'un filtre contenant environ 10 g de sulfate de sodium anhydre (4.3). L'opération doit se faire à l'abri de toute lumière naturelle ou artificielle forte et la température doit rester maintenue à 45 °C. Prélever une quantité convenable de matière grasse butyrique.

5.2. Détermination

Prélever, à 1 mg près, environ 1 g de beurre concentré ou de matière grasse butyrique (5.1.2), (Mg). Transférer quantitativement dans une fiole volumétrique de 20 ml (Vml), remplir jusqu'au trait avec de l'essence minérale (4.2) et mélanger soigneusement.

Déposer une petite quantité de ce mélange sur une cellule de 1 cm et mesurer l'absorbance à 440 nm par rapport à de l'essence minérale comme valeur de référence. On obtient la concentration d'ester apo-caroténique dans la solution par référence à la courbe d'étalonnage (C μg/ml).

5.3. Courbe d'étalonnage

Introduire à l'aide des pipettes graduées 0, 0,25, 0,5, 0,75 et 1,0 ml de solution standard d'ester apo-caroténique (4.1.2) dans cinq fioles volumétriques de 100 ml. Diluer en remplissant jusqu'au trait avec de l'essence minérale (4.2) et mélanger.

Les concentrations des solutions s'échelonnent entre 0 et 2 μg/ml et sont calculées de manière précise par référence à la concentration de la solution standard (4.1.2), WP/10 mg/ml. Mesurer les absorbances à 440 nm par rapport à de l'essence minérale (4.2) comme valeur de référence.

Reporter les valeurs d'absorbance sur l'axe des ordonnées et les concentrations d'ester apo-caroténique sur l'axe des abscisses.

6. Calcul des résultats

6.1. La teneur en ester apo-caroténique, exprimée en mg/kg de produit, est donnée par:

Beurre concentré (C.V)/M

Beurre: 0,82 (C.V)M

où:

C= la teneur en ester apo-caroténique, μg/ml, donnée par la courbe d'étalonnage (5.3)

V= volume (ml) de la solution d'essai (5.2)

M= la masse (g) de la portion test (5.2)

0,82= un coefficient correcteur pour la teneur en matière grasse butyrique du beurre.

7. Précision de la méthode

7.1. Répétitivité

7.1.1. Analyse du beurre

La différence de résultats entre deux déterminations effectuées sur du matériel de test identique, dans le laps de temps le plus bref possible et par un seul opérateur utilisant le même équipement ne devra pas excéder 1,4 mg/kg.

7.1.2. Analyse du beurre concentré

La différence de résultats entre deux déterminations effectuées sur du matériel de test identique, dans le laps de temps le plus bref possible et par un seul opérateur utilisant le même équipement ne devra pas excéder 1,6 mg/kg.

7.2. Reproductibilité

7.2.1. Analyse du beurre

La différence de résultats entre deux déterminations effectuées sur du matériel de test identique, par des opérateurs travaillant dans des laboratoires différents et utilisant des équipements différents ne devra pas excéder 4,7 mg/kg.

7.2.2. Analyse du beurre concentré

La différence de résultats entre deux déterminations effectuées sur du matériel de test identique, par des opérateurs travaillant dans des laboratoires différents et utilisant des équipements différents ne devra pas excéder 5,3 mg/kg.

7.3. Source des données techniques

Les données techniques ont été définies sur la base d'une expérience menée en 1995, qui impliquait onze laboratoires et qui portait sur douze échantillons tracés (six doubles aveugles) pour le beurre et sur douze échantillons tracés (six doubles aveugles) pour le beurre concentré.

8. Limites de tolérance

8.1. Pour vérifier si le produit a été tracé correctement, il faut prélever trois échantillons du produit tracé.

8.2. Beurre

8.2.1. Le taux d'incorporation pour le beurre, compte tenu de l'absorbance de fond, est de 22 mg/kg.

8.2.2. On utilise les résultats obtenus pour les trois échantillons à partir de l'analyse du produit pour vérifier le taux et l'homogénéité de l'incorporation du traceur, et on compare le plus faible de ces résultats avec les limites suivantes [en prenant en considération la différence critique pour une probabilité de 95 % (DCr95)]:

- 18,0 mg/kg (95 % du taux d'incorporation minimal),

- 13,0 mglkg (70 % du taux d'incorporation minimal).

La concentration du traceur dans l'échantillon donnant le résultat le plus faible est utilisée par interpolation entre 18,0 mg/kg et 13,0 mg/kg.

8.3. Beurre concentré

8.3.1. Le taux d'incorporation pour le beurre concentré, compte tenu de l'absorbance de fond, est de 24 mg/kg.

8.3.2. On utilise les résultats obtenus pour les trois échantillons à partir de l'analyse du produit pour vérifier le taux et l'homogénéité de l'incorporation du traceur, et on compare le plus faible de ces résultats avec les limites suivantes [en prenant en considération la différence critique pour une probabilité de 95 % (DCr95)]:

- 20,0 mg/kg (95 % du taux d'incorporation minimal),

- 14,0 mg/kg (70 % du taux d'incorporation minimal).

La concentration du traceur dans l'échantillon donnant le résultat le plus faible est utilisée par interpolation entre 20,0 mg/kg et 14,0 mg/kg.

ANNEXE XIV

(Article 9)

DÉTERMINATION DU SITOSTÉROL OU DU STIGMASTÉROL DANS LE BEURRE CONCENTRÉ OU LE BEURRE PAR LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. Objet et domaine d'application

La méthode décrit une procédure permettant la détermination quantitative du sitostérol ou du stigmastérol dans le beurre concentré et le beurre. Le sitostérol est la somme du β-sitostérol et du 22-dihydro-β-sitostérol, les autres sitostérols étant considérés comme peu importants.

2. Principe

Le beurre concentré ou le beurre est saponifié à l'aide d'hydroxyde de potassium dans une solution d'éthanol et les insaponifiables sont extraits à l'aide d'éther.

Les stérols sont transformés en triméthyl-silyl-éthers et sont analysés par chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire par rapport à un étalon interne: la bétuline.

3. Appareillage

3.1. Ballon de saponification de 150 ml équipé d'un réfrigérant à reflux à embouts rodés.

3.2. Ampoules à décanter de 500 ml.

3.3. Ballons de 250 ml.

3.4. Ampoules d'égalisation de la pression, de 250 ml ou d'une contenance similaire, destinées à recueillir l'éther à jeter.

3.5. Colonne de verre, de 350 mm x 20 mm, dotée d'un accord en verre fritté.

3.6. Bain-marie ou manchon isotherme.

3.7. Flacons à réaction, de 2 ml.

3.8. Appareil de chromatographie en phase gazeuse pouvant être utilisé avec une colonne capillaire, muni d'un dispositif de fonctionnement composé:

3.8.1. d'un four thermostaté pour les colonnes pouvant maintenir la température souhaitée avec une précision de +- 1 °C;

3.8.2. d'un injecteur thermoréglable;

3.8.3. d'un détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur;

3.8.4. d'un intégrateur-enregistreur pouvant être utilisé avec le convertisseur-amplificateur (3.8.3).

3.9. Colonne capillaire en verre de silice entièrement recouverte de BP 1 ou d'une substance équivalente d'une épaisseur uniforme de 0,25 μm; la colonne doit être en mesure de résoudre les dérivés triméthyl-silyl du lanostérol et du sitostérol. Une colonne BP 1 de 12 m de longueur et de diamètre interne de 0,2 mm est appropriée.

3.10. Microseringue à aiguille en acier trempé pour chromatographie en phase gazeuse de 1 μl.

4. Réactifs

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente.

4.1. Éthanol, pur au moins à 95 %.

4.2. Hydroxyde de potassium, solution à 60 %, dissoudre 600 g d'hydroxyde de potassium (minimum 85 %) dans de l'eau et compléter à 1 l avec de l'eau.

4.3. Bétuline d'une pureté d'au moins 99 %.

4.3.1. Solutions de bétuline dans l'éther diéthylique (4.4).

4.3.1.1. La concentration de la solution de bétuline utilisée pour la détermination du sitostérol doit être de 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. La concentration de la solution de bétuline utilisée pour la détermination du stigmastérol doit être 0,4 mg/ml.

4.4. Éther diéthylique, de pureté analytique (exempt de péroxydes ou de résidus).

4.5. Sulfate de sodium, anhydre, en granulés, préalablement séché à 102 °C pendant 2 heures.

4.6. Réactif de silylation, par exemple, TRI-SIL (pouvant être obtenu auprès de Pierce Chemical Co, Cat n° 49001), ou équivalent (Attention: le TRI-SIL est inflammable et toxique, corrosif et peut-être carcinogène. Le personnel de laboratoire doit bien connaître les règles de sécurité applicables au TRI-SIL et prendre les précautions qui s'imposent).

4.7. Lanostérol.

4.8. Sitostérol, de pureté connue, égale ou supérieure à 90 % (P).

Note 1:

La pureté des matériaux étalons utilisés pour le calibrage doit être déterminée à l'aide de la méthode de normalisation. On part de l'hypothèse que tous les stérols présents dans l'échantillon sont représentés dans le chromatogramme, que la surface totale des pics représente 100 % des constituants stéroliques et que les stérols donnent la même réponse au détecteur. La linéarité du système doit être vérifiée pour les niveaux de concentration considérés.

4.8.1. Solution étalon de sitostérol: préparer une solution à 0,001 mg/ml près, contenant environ 0,5 mg/ml (W1) de sitostérol (4.8) dans de l'éther diéthylique (4.4).

4.9. Stigmastérol, d'une pureté connue, égale ou supérieure à 90 % (P).

4.9.1. Solution étalon de stigmastérol, préparer une solution à 0,001 mg/ml près, contenant environ 0,2 mg/ml (W1) de stigmastérol (4.9) dans l'éther diéthylique (4.4).

4.10. Mélange pour le test de résolution: préparer une solution contenant 0,05 mg/ml de lanostérol (4.7) et 0,5 mg/ml de sitostérol (4.8) dans de l'éther diéthylique (4.4).

5. Mode opératoire

5.1. Préparation des solutions étalons pour la chromatographie: ajouter la solution étalon interne (4.3.1) à la solution étalon de stérol appropriée en même temps qu'à l'échantillon saponifié (5.2.2).

5.1.1. Solution chromatographique étalon de sitostérol: transférer 1 ml de solution étalon de sitostérol (4.8.1) dans chacun des deux flacons à réaction (3.7) et éliminer l'éther sous un flux d'azote. Ajouter 1 ml de solution interne (4.3.1.1) et éliminer l'éther sous un flux d'azote.

5.1.2. Solution chromatographique étalon de stigmastérol: transférer 1 ml de solution étalon de stigmastérol (4.9.1) dans chacun des deux flacons à réaction (3.7) et éliminer l'éther sous un flux d'azote. Ajouter 1 ml de solution étalon interne (4.3.1.2) et éliminer l'éther sous un flux d'azote.

5.2. Préparation des insaponifiables

5.2.1. Faire fondre l'échantillon de beurre à une température de 35 °C au maximum; le mélanger soigneusement en le remuant.

Peser à 1 mg près, environ 1 g de beurre (W2) ou de beurre concentré (W2) dans un flacon de 150 ml (3.1). Ajouter 50 ml d'éthanol (4.1) et 10 ml de solution d'hydroxyde de potassium (4.2). Adapter le réfrigérant à reflux et porter à environ 75 °C pendant 30 minutes. Détacher le réfrigérant et laisser refroidir le ballon à la température ambiante.

5.2.2. Ajouter 1,0 ml de solution étalon interne dans le ballon (4.3.1.1 s'il s'agit de déterminer le sitostérol ou 4.3.1.2 s'il s'agit de déterminer le stigmastérol). Mélanger soigneusement. Transférer le contenu du ballon quantitativement dans une ampoule à décanter de 500 ml (3.2). Rincer le ballon avec 50 ml d'eau, puis 250 ml d'éther diéthylique (4.4). Agiter vigoureusement l'ampoule à décanter pendant 2 minutes et laisser les phases se séparer. Éliminer la phase aqueuse inférieure et laver la phase éthérée en agitant avec 4 parties aliquotes successives de 100 ml d'eau.

Note 2:

Pour éviter la formation d'une émulsion, il est indispensable que les deux premiers rinçages à l'eau soient effectués délicatement (10 inversions). Pour le troisième rinçage, on peut agiter vigoureusement pendant 30 secondes. Si une émulsion se forme, elle peut être éliminée par l'addition de 5 à 10 ml d'éthanol. Si de l'éthanol est ajouté, il est indispensable de procéder à deux nouveaux et vigoureux lavages à l'eau.

5.2.3. Faire passer la phase éthérée limpide et exempte de savon sur une colonne en verre (3.5) contenant 30 g de sulfate de sodium anhydre (4.5). Collecter l'éther dans un ballon de 250 ml (3.3). Ajouter des billes antiprojection et évaporer jusqu'à la quasi-dessication dans un bain-marie ou un manchon isotherme en prenant soin de collecter les solvants à éliminer:

Note 3:

Si des extraits d'échantillons sont évaporés à sec à une température trop élevée, il peut y avoir des pertes de stérol.

5.3. Préparation des triméthyl-silyl-éthers

5.3.1. Transférer la solution d'éther restant dans le ballon dans un flacon à réaction de 2 ml (3.7) à l'aide de 2 ml d'éther et éliminer l'éther sous un flux d'azote. Laver le ballon avec deux parties aliquotes supplémentaires de 2 ml d'éther en transférant dans le flacon et en éliminant l'éther sous azote à chaque fois.

5.3.2. Silyler l'échantillon en ajoutant 1 ml de TRI-SIL (4.6). Fermer le flacon et agiter vigoureusement pour dissoudre. Si la dissolution est incomplète, porter à 65-70 °C. Laisser reposer pendant au moins 5 minutes avant d'injecter dans le chromatographe en phase gazeuse. Silyler les étalons de la même manière que les échantillons. Silyler le mélange pour le test de résolution (4.10) de la même manière que les échantillons.

Note 4:

La silylation doit se faire dans un environnement anhydre. Une silylation incomplète de la bétuline est indiquée par un second pic proche de celui de la bétuline.

La présence d'éthanol lors de la silylation interférera avec la silylation. Ceci peut résulter d'un lavage insuffisant lors de l'extraction. Si ce problème persiste, un cinquième rinçage, avec agitation vigoureuse pendant 30 secondes, peut être introduit à l'étape de l'extraction.

5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.4.1. Choix des conditions opératoires.

Programmer le chromatographe en phase gazeuse selon les instructions du fabricant.

Les conditions opératoires indicatives sont les suivantes:

- température de la colonne: 265 °C

- température de l'injecteur: 280 °C

- température du détecteur: 300 °C

- débit du gaz vecteur: 0,6 ml/min

- pression de l'hydrogène: 84 kPa

- pression de l'air: 155 kPa

- injection fractionnée: de 10/1 à 50/1; le rapport de fuite doit être optimisé en fonction des instructions du fabricant et la linéarité de la réponse du détecteur validée ensuite pour l'étendue des concentrations qui nous intéressent.

Note 5:

Il est particulièrement important que la chambre de vaporisation soit régulièrement nettoyée.

- quantité de substance injectée: 1 μl de solution TMSE.

Laisser le système s'équilibrer jusqu'à l'obtention d'une réponse suffisamment stable avant d'entreprendre toute analyse.

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de manière à obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:

- le pic de sitostérol doit présenter une résolution suffisante par rapport au lanostérol. La figure 1 présente un chromatogramme typique tel qu'il doit être obtenu à partir d'un mélange silylé du test de résolution (4.10)

- les temps de rétention relatifs des stérols suivants devraient être d'environ:

cholestérol: 1,0

stigmastérol: 1,3

sitostérol: 1,5

bétuline: 2,5

- le temps de rétention de la bétuline devrait être d'environ 24 minutes.

5.4.2. Mode opératoire analytique:

Injecter 1 μl de solution étalon silylée (stigmastérol ou sitostérol) et ajuster les paramètres de calibr