10)

les chapitres C.27, C.28, C.29 et C.30 sont ajoutés: «C.27 ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN SYSTÉME EAU-SÉDIMENT DOPÉ INTRODUCTION 1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 218 (2004) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode d’essai est conçue pour évaluer les effets d’une exposition prolongée à des substances chimiques sur des larves de Chironomus sp., un diptère vivant dans les sédiments d’eau douce. Elle s’appuie sur des protocoles d’essais de toxicité sur Chironomus riparius et Chironomus tentans, mis au point en Europe (1) (2) (3) et en Amérique du Nord (4) (5) (6) (7) (8), et soumis à des essais circulaires (1) (6) (9). D’autres espèces de chironomes bien documentées peuvent aussi être employées, par exemple Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Le scénario d’exposition appliqué dans cette méthode d’essai consiste à introduire la substance d’essai dans le sédiment. La sélection du mode d’exposition dépend de la finalité de l’essai. Le dopage du sédiment vise à simuler l’accumulation de produits chimiques persistants dans le sédiment. Ce chargement s’effectue dans un système expérimental eau-sédiment. 3. En général, les substances à tester sur des organismes vivant dans les sédiments subsistent longtemps dans ce compartiment. Ces organismes peuvent être exposés par diverses voies. L’importance relative de chaque voie d’exposition et le temps pris par chacune d’entre elles pour contribuer à l’effet toxique global dépendent des propriétés physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe> 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, l’ingestion d’aliments contaminés peut constituer une voie d’exposition non négligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicité des substances fortement lipophiles, on envisagera d’ajouter de la nourriture au sédiment avant l’application de la substance d’essai. La présente méthode d’essai est axée sur l’exposition à long terme, de façon à couvrir toutes les voies d’exposition potentielles. L’essai dure de 20 à 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et de 28 à 65 jours pour C. tentans. Si l’on a besoin de données à court terme pour un motif précis, par exemple pour étudier les effets d’une substance chimique instable, des récipients supplémentaires, ajoutés au dispositif expérimental, peuvent être retirés après 10 jours d’essai. 4. Les effets observés sont le nombre total d’adultes émergés et temps écoulé jusqu’à l’émergence. Si l’on a besoin de données à court terme, il est recommandé de ne mesurer la survie et la croissance des larves qu’après 10 jours, en ajoutant le nombre nécessaire de récipients supplémentaires. 5. L’utilisation d’un sédiment reconstitué est recommandée en raison de ses avantages par rapport aux sédiments naturels: — la variabilité expérimentale est réduite parce que le sédiment reconstitué forme une “matrice normalisée” reproductible; en outre, il n’est plus nécessaire de trouver des sources de sédiments non contaminés et non pollués, — les essais peuvent être effectués à n’importe quel moment de l’année, la variabilité saisonnière n’intervenant plus, et il n’est pas nécessaire de traiter préalablement le sédiment afin d’éliminer la faune indigène; l’utilisation de sédiments reconstitués diminue aussi le coût associé à la collecte sur le terrain d’une quantité suffisante de sédiments pour les essais systématiques, — les sédiments reconstitués permettent de comparer la toxicité des substances et de les classer en conséquence. 6. L’appendice 1 contient les définitions employées dans la présente méthode d’essai. PRINCIPE DE L’ESSAI 7. Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de concentrations de la substance d’essai dans un système sédiment-eau. Une fois la substance d’essai incorporée au sédiment, des larves au premier stade sont introduites dans des béchers où les concentrations d’eau et de sédiment ont été stabilisées. L’émergence des chironomes et leur vitesse de développement sont mesurées à la fin de l’essai. La survie des larves et leur poids peuvent aussi être mesurés après 10 jours si nécessaire (en ajoutant le nombre d’expériences identiques requis). Ces données sont analysées, soit à l’aide d’un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % de l’émergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE15, CE50, etc.), soit par la vérification d’une hypothèse statistique afin de déterminer une CSEO/CMEO. Cette dernière nécessite une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des témoins à l’aide de tests statistiques. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI 8. Il faudrait connaître l’hydrosolubilité de la substance d’essai, sa pression de vapeur, son coefficient de partage mesuré ou calculé dans le sédiment et sa stabilité dans l’eau et le sédiment. Il convient de disposer d’une méthode d’analyse fiable pour quantifier la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, dans l’eau des pores et dans le sédiment, et pour laquelle la précision et le seuil de détection sont connus. Il est également utile de connaître la formule structurale et la pureté de la substance d’essai ainsi que son devenir chimique (par exemple sa dissipation, sa dégradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complémentaires pour tester les substances se prêtant difficilement à l’essai en raison de leurs propriétés physico-chimiques sont fournies à la référence (12). SUBSTANCES CHIMIQUES DE RÉFÉRENCE 9. Des substances de référence pourront être testées régulièrement afin de démontrer, la fiabilité du protocole et des conditions de l’essai. Voici quelques exemples de toxiques de référence ayant fait leurs preuves dans des essais circulaires et des études de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophénol, chlorure de cadmium et chlorure de potassium (1) (2) (5) (6) (13). VALIDITÉ DE L’ESSAI 10. Pour que l’essai soit valide, les conditions suivantes doivent être remplies: — l’émergence chez les témoins doit atteindre au moins 70 % à la fin de l’essai (1) (6), — s’agissant de C. riparius et C. yoshimatsui, l’émergence au stade adulte dans les récipients témoins doit avoir lieu entre 12 et 23 jours après leur introduction dans les récipients expérimentaux; C. tentans nécessite une période de 20 à 65 jours, — à la fin de l’essai, le pH et la concentration d’oxygène dissous seront mesurés dans chaque récipient. La concentration d’oxygène devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) à la température appliquée et le pH de l’eau sus-jacente devrait être compris entre 6 et 9 dans tous les récipients expérimentaux, — la température de l’eau ne devrait pas varier de plus de ± 1,0 °C et pourrait être contrôlée grâce à une chambre isotherme, auquel cas la température de la chambre devra être confirmée à intervalles appropriés. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE Récipients expérimentaux 11. L’essai se déroule dans des béchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de diamètre. D’autres récipients peuvent être utilisés à condition qu’ils permettent de garantir une profondeur adéquate d’eau et de sédiment. Le sédiment doit offrir une superficie de 2 à 3 cm2 par larve. Le quotient de la profondeur de la couche de sédiment par la profondeur de la couche d’eau sus-jacente doit être égal à 1/4. Les récipients et les autres appareils qui entreront en contact avec le système d’essai doivent être composés uniquement de verre ou d’un autre matériau chimiquement inerte (par exemple du Téflon). Sélection des espèces 12. Chironomus riparius est l’espèce qui convient le mieux. Chironomus tentans peut aussi être utilisé, mais il est plus difficile à manipuler et nécessite une période d’essai plus longue. Chironomus yoshimatsui convient également. La méthode de culture de Chironomus riparius est détaillée à l’appendice 2. D’autres documents décrivent les conditions de culture des autres espèces: Chironomus tentans (4) et Chironomus yoshimatsui (11). L’identification de l’espèce est à confirmer avant l’essai, mais n’est pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent d’un élevage interne. Sédiment 13. Il est préférable d’employer un sédiment reconstitué (également dénommé sédiment artificiel ou synthétique). Néanmoins, si l’on opte pour un sédiment naturel, il faudrait le caractériser, au moins quant au pH et à la teneur en carbone organique, (la détermination d’autres paramètres, tels que le rapport C/N et la granulométrie est aussi recommandée) et s’assurer qu’il n’est pas contaminé et n’abrite pas d’autres organismes qui pourraient entrer en compétition avec les chironomes ou les consommer. Avant d’utiliser un sédiment naturel dans un essai de toxicité sur les chironomes, il est également recommandé de le maintenir durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai (conditionnement). Le sédiment reconstitué décrit ci-dessous, basé sur le sol artificiel utilisé dans la méthode d’essai C.8, est recommandé (14) (1) (15) (16): a) 4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 5,5 à 6,0; il est important d’utiliser une tourbe sous forme de poudre, finement broyée (dimension des particules ≤ 1 mm) et séchée uniquement à l’air; b) 20 % (poids sec) d’argile kaolinique (teneur en kaolinite de préférence supérieure à 30 %); c) 75-76 % (poids sec) de sable quartzique (composé en majorité de sable fin, plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm); d) ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que la teneur en humidité du mélange final atteigne 30 à 50 %; e) ajouter du carbonate de calcium de qualité chimiquement pure (CaCO3) pour ajuster le pH du mélange final composant le sédiment à 7,0 ± 0,5. Il convient d’obtenir 2 % (± 0,5 %) de carbone organique dans le mélange final en y ajoutant les quantités appropriées de tourbe et de sable, comme indiqué en a) et en c). 14. Les sources de tourbe, de kaolin et de sable doivent être connues. On vérifiera que les composants du sédiment ne sont pas contaminés par des substances chimiques (par exemple des métaux lourds, des composés organochlorés, des composés organophosphorés, etc.). Un exemple de préparation de sédiment reconstitué est décrit à l’appendice 3. Les composants peuvent aussi être mélangés à l’état sec, à condition de démontrer qu’après l’ajout de l’eau sus-jacente, les composants du sédiment ne se séparent pas (flottement de particules de tourbe, par exemple) et que la tourbe ou le sédiment sont suffisamment conditionnés. Eau 15. Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable selon les critères spécifiés aux appendices 2 et 4 peut servir à l’essai. Toute eau appropriée, naturelle (eau superficielle ou souterraine), reconstituée (voir appendice 2) ou eau du robinet déchlorée, est acceptable comme eau pour l’élevage et les essais si les chironomes y survivent sur toute la durée de l’élevage et de l’essai sans manifester de signes de stress. Au début de l’essai, le pH de l’eau d’essai se situera entre 6 et 9 et sa dureté totale ne dépassera pas 400 mg/l en CaCO3. Néanmoins, si l’on suspecte une interaction entre les ions qui provoquent la dureté et la substance d’essai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le même type d’eau doit être utilisé tout au long de l’étude. Les caractéristiques de la qualité de l’eau énumérées à l’appendice 4 sont à mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractéristiques sont susceptibles d’avoir été significativement modifiées. Solutions mères – sédiments dopés 16. Les sédiments dopés sont généralement préparés à la concentration souhaitée en ajoutant directement une solution de la substance d’essai au sédiment. Une solution mère de la substance d’essai dissoute dans de l’eau désionisée est mélangée au sédiment reconstitué à l’aide d’un agitateur à rouleaux, d’un mélangeur pour aliments ou mélangée à la main. Si la substance d’essai est peu soluble dans l’eau, elle peut être dissoute dans un volume aussi petit que possible d’un solvant organique adéquat (hexane, acétone ou chloroforme, par exemple). Cette solution est ensuite mélangée à 10 g de sable quartzique fin par récipient d’essai. Il faut attendre que le solvant s’évapore jusqu’à ce qu’il soit totalement éliminé du sable; le sable est ensuite mélangé avec la quantité appropriée de sédiment par bécher. Seuls des agents très volatils peuvent être utilisés pour solubiliser, disperser ou émulsifier la substance d’essai. On n’oubliera pas de tenir compte de la quantité de sable apportée avec le mélange de la substance d’essai et du sable lors de la préparation du sédiment (ce dernier sera préparé avec moins de sable). Il faudra veiller à mélanger complètement la substance d’essai au sédiment et à l’y répartir uniformément. Si nécessaire, on analysera des sous-échantillons afin de déterminer le degré d’homogénéité. CONCEPTION DE L’ESSAI 17. La conception de l’essai définit le nombre et l’espacement des concentrations expérimentales, le nombre de récipients à chaque concentration et le nombre de larves par récipient. La marche à suivre pour estimer une valeur de CE, la CSEO et mener un essai limite est décrite. Conduite d’une analyse de régression 18. La concentration efficace (par exemple, CE15, CE50) et la gamme de concentrations dans laquelle l’effet produit par la substance d’essai est d’intérêt doivent être couvertes par les concentrations incluses dans l’essai. Généralement, l’exactitude, et plus particulièrement la validité, de l’estimation des concentrations efficaces (CEx) s’accroissent lorsque la concentration efficace se situe dans la gamme des concentrations testées. Il faut éviter d’extrapoler des résultats très en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concentration maximale. Il est utile de conduire un essai préliminaire pour déterminer la gamme des concentrations à utiliser (voir paragraphe 27). 19. S’il faut estimer la CEx, au moins cinq concentrations et trois répétitions par concentration doivent être mises à l’essai. En tout état de cause, il est recommandé de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne estimation du modèle. Le facteur séparant les concentrations ne doit pas excéder deux (sauf dans les cas où la courbe dose-effet présente une pente faible). Le nombre de répétitions par traitement peut être diminué si le nombre de concentrations expérimentales entraînant différents effets est augmenté. L’augmentation du nombre de répétitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations expérimentales tend à réduire les intervalles de confiance pour l’essai. Le nombre de répétitions sera augmenté s’il y a lieu d’estimer le taux de survie et la croissance des larves après dix jours. Procédure d’estimation d’une CSEO/CMEO 20. S’il faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concentrations expérimentales et au moins quatre répétitions par concentration, le facteur séparant les concentrations n’excédant pas deux. Le nombre d’expériences identiques doit être tel qu’il fournit une puissance statistique permettant de détecter une différence de 20 % avec le témoin, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). S’agissant de la vitesse de développement, une analyse de la variance (ANOVA) convient généralement, telle que le test de Dunnett ou le test de Williams (17) (18) (19) (20). S’agissant du taux d’émergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être utilisés. Essai limite 21. Si l’essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur des concentrations n’a engendré aucun effet, un essai limite peut être conduit (une concentration expérimentale et un témoin). L’essai limite se pratique avec une concentration suffisamment élevée pour permettre aux décideurs d’exclure tout effet toxique possible de la substance d’essai et la limite est fixée à une concentration censée ne jamais être atteinte dans les conditions réelles. Une concentration de 1 000 mg/kg (poids sec) est recommandée. Il est généralement nécessaire de mener au moins six répétitions pour les organismes traités et les témoins. Il y a lieu de démontrer que la puissance statistique est suffisante pour détecter une différence de 20 % avec les témoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne l’effet sur la vitesse de développement et sur le poids, le test t constitue une méthode statistique appropriée, si les données respectent les conditions exigées par ce test (normalité, variances homogènes). On pourra recourir au test t à variance inégale ou à un test non paramétrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. S’agissant du taux d’émergence, le test exact de Fisher convient. MODE OPÉRATOIRE Conditions d’exposition Préparation du système sédiment dopé – eau 22. La procédure de mélange de la substance d’essai au sédiment décrite dans la méthode d’essai C.8, Toxicité pour les vers de terre, est recommandée pour cet essai (14). Les sédiments dopés sont placés au fond des récipients avant d’y verser l’eau, de façon à obtenir un ratio volumique sédiment-eau de 1/4 (voir paragraphes 11 et 15). La profondeur de la couche de sédiment doit être comprise entre 1,5 et 3 cm. Afin d’éviter la séparation des constituants du sédiment et la resuspension des particules fines pendant le remplissage de la colonne d’eau, on peut recouvrir le sédiment d’un disque en plastique durant cette opération et retirer le disque juste après. D’autres dispositifs conviennent également. 23. Les récipients expérimentaux doivent être couverts (par des plaques de verre, par exemple). On prendra soin de remplacer les volumes d’eau évaporée durant l’étude, le cas échéant, et ce avec de l’eau distillée ou désionisée afin d’empêcher l’accumulation de sels. Stabilisation 24. Une fois que le sédiment dopé surmonté d’une couche d’eau a été préparé, il est souhaitable de laisser la substance d’essai se répartir entre la phase aqueuse et le sédiment (3) (4) (6) (13), et ce, de préférence, dans les mêmes conditions de température et d’aération que durant l’essai. L’équilibre met de quelques heures à quelques jours à s’établir, voire 4-5 semaines dans de rares cas, selon le sédiment et la substance chimique. Il ne faut pas attendre que l’équilibre soit atteint, car beaucoup de substances risquent de se dégrader durant cette période, mais un temps d’attente de 48 heures est recommandé. Au terme de cette période d’équilibrage, on mesure la concentration de la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, les pores et le sédiment, au moins pour la concentration la plus élevée et la plus faible (voir paragraphe 38). Ces déterminations analytiques de la substance d’essai permettent de calculer le bilan massique et d’exprimer les résultats en fonction des concentrations mesurées. Introduction des organismes d’essai 25. Quatre à cinq jours avant d’introduire les organismes d’essai dans les récipients, des amas d’œufs sont prélevés dans les cultures et déposés dans de petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de la culture mère tout comme un milieu fraîchement préparé peuvent être utilisés. Si ce dernier est utilisé, on ajoutera une petite quantité de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat d’une suspension de paillettes pour poissons finement broyées, au milieu de culture (voir appendice 2). Seuls des amas d’œufs fraîchement pondus peuvent être utilisés. Normalement, les larves commencent à éclore quelques jours après la ponte (2 à 3 jours pour Chironomus riparius à 20 °C et 1 à 4 jours pour Chironomus tentans à 23 °C et Chironomus yoshimatsui à 25 °C) et le développement des larves se déroule en quatre stades, dont chacun dure 4 à 8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours après l’éclosion). Il est possible de vérifier le stade de développement des moucherons d’après la largeur de la capsule céphalique (6). 26. Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont déposées dans chaque récipient contenant le sédiment dopé et l’eau, à l’aide d’une pipette émoussée. L’aération de l’eau doit être interrompue dès qu’on introduit les larves dans les récipients expérimentaux, et ce durant 24 heures après l’ajout des larves (voir paragraphes 25 et 32). Selon le protocole expérimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilisées par concentration s’élève au moins à 60 pour l’estimation d’une valeur de concentration efficace (CE) et à 80 pour la détermination de la CSEO. Concentrations d’essai 27. Il peut être utile de conduire un essai de détermination de l’ordre de grandeur pour délimiter la gamme de concentrations à appliquer dans l’essai proprement dit. À cet effet, on utilise une série de concentrations largement espacées de la substance d’essai. Afin de reproduire la même densité de surface par chironome que dans l’essai proprement dit, les chironomes sont exposés à chaque concentration de la substance d’essai durant une période permettant d’estimer les concentrations expérimentales appropriées et aucune expérience identique n’est nécessaire. 28. Les concentrations pour l’essai définitif sont choisies en fonction des résultats de l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. Au moins cinq concentrations doivent être appliquées et sélectionnées comme décrit aux paragraphes 18 à 20. Témoins 29. L’essai inclura le nombre nécessaire de récipients témoins pourvus du sédiment mais exempts de toute substance d’essai (voir paragraphes 19-20). Si la substance d’essai a été appliquée à l’aide d’un solvant (voir paragraphe 16), il convient d’ajouter un témoin dont le sédiment contient également le solvant. Système expérimental 30. Des systèmes statiques sont utilisés. Des systèmes semi-statiques ou à écoulement continu avec renouvellement intermittent ou continu de l’eau sus-jacente peuvent être utilisés dans des cas exceptionnels, par exemple si les spécifications de la qualité de l’eau deviennent inappropriées pour l’organisme d’expérience ou affectent l’équilibre chimique (si, par exemple, la concentration d’oxygène dissous devient trop basse, la concentration des excréta augmente de façon trop importante ou si des minéraux lessivés à partir du sédiment affectent le pH et/ou la dureté de l’eau). Néanmoins, d’autres méthodes d’amélioration de la qualité de l’eau sus-jacente, telles que l’aération, seront normalement suffisantes et préférables. Alimentation 31. Les larves ont besoin d’être nourries, de préférence quotidiennement TetraPhyll; ou au moins trois fois par semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 à 0,5 mg (0,35-0,5 mg pour C. yoshimatsui) de nourriture pour poissons (suspendue dans l’eau ou finement moulue, par exemple TetraMin ou TetraPhyll; voir les détails à l’appendice 2). Il peut être nécessaire d’augmenter légèrement cette quantité pour les larves plus âgées: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste de l’essai. On diminuera la ration alimentaire de tous les organismes traités et témoins si des champignons se développent ou si des organismes témoins meurent. Si la croissance fongique s’avère impossible à enrayer, l’essai doit être renouvelé. Si l’essai porte sur des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, la quantité de nourriture nécessaire à la survie et à la croissance naturelle des organismes peut être ajoutée au sédiment reconstitué avant la période de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour poissons est remplacée par une ration végétale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles finement broyées d’ortie (Urtica dioica), de mûrier (Morus alba), de trèfle blanc ou rampant (Trifolium repens), d’épinard (Spinacia oleracea), par exemple, ou d’un autre matériau végétal (Cerophyl ou alpha-cellulose). Conditions d’incubation 32. L’eau sus-jacente est soumise à une légère aération, mise en route de préférence 24 heures après l’introduction des larves et maintenue jusqu’à la fin de l’essai (il faut veiller à ce que la concentration d’oxygène dissous ne tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). L’air est insufflé à travers une pipette Pasteur en verre fixée 2 à 3 cm au-dessus de la couche de sédiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance d’essai est volatile, il faudra éventuellement supprimer l’aération. 33. L’essai est mené à température constante (20 °C ± 2 °C). Pour C. tentans et C. yoshimatsui, les températures recommandées s’élèvent respectivement à 23 °C et 25 °C (± 2 °C). La photopériode est de 16 heures et l’éclairement compris entre 500 et 1 000 lux. Durée de l’exposition 34. L’exposition débute avec l’introduction des larves dans les récipients traités et témoins. La durée maximale de l’exposition s’élève à 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et à 65 jours pour C. tentans. Si les moucherons émergent plus tôt, l’essai peut s’achever au moins cinq jours après l’émergence du dernier adulte témoin. Observations Émergence 35. La durée du développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles adultes totalement émergés sont à déterminer. Les mâles sont faciles à identifier grâce à leurs antennes plumeuses. 36. Au moins trois fois par semaine, on vérifiera que les organismes des récipients expérimentaux ne manifestent aucun comportement anormal (sortie du sédiment, nage inhabituelle par exemple) par rapport aux témoins. Chaque jour, durant la période supposée de l’émergence, on comptera le nombre de moucherons émergés et on consignera le sexe et le nombre de moucherons complètement émergés. Après identification, les moucherons sont retirés des récipients. Tout amas d’œufs déposé avant la fin de l’essai doit être recensé puis enlevé afin d’empêcher la réintroduction de larves dans le sédiment. Le nombre de pupes visibles n’ayant pas réussi à émerger est aussi enregistré. Des indications sur la façon de mesurer l’émergence sont données à l’appendice 5. Croissance et survie 37. S’il faut fournir des données sur la survie et la croissance des larves après 10 jours, des récipients d’essai supplémentaires seront ajoutés dès le début de l’essai, pour pouvoir être utilisés ultérieurement. Le sédiment de ces récipients supplémentaires sera tamisé à travers des mailles de 250 μm pour retenir les larves. La mort est déterminée par deux critères: l’immobilité et l’absence de réaction à un stimulus mécanique. Les larves non récupérées doivent aussi être comptabilisées parmi les mortes (les larves qui sont mortes au début de l’essai ont pu être dégradées par des microbes). Après avoir déterminé le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par récipient expérimental, on calcule le poids sec individuel moyen par récipient. Il est utile d’établir à quel stade se trouvent les larves survivantes, et ce d’après la largeur de la capsule céphalique de chaque individu. Mesures analytiques Concentration de la substance d’essai 38. Avant le début de l’essai (c’est-à-dire avant l’introduction des larves), on prélève des échantillons du sédiment d’au moins un récipient par traitement, afin de déterminer analytiquement la concentration de la substance d’essai dans le sédiment. Il est recommandé d’analyser, au minimum, des échantillons de l’eau sus-jacente, de l’eau des pores, et du sédiment, au début (voir paragraphe 24) et à la fin de l’essai, et ce de la concentration la plus élevée et d’une concentration plus basse. Les concentrations de la substance d’essai nous renseignent sur le comportement et la répartition de la substance d’essai dans le système eau-sédiment. 39. Lorsqu’on effectue des mesures intermédiaires (par exemple au septième jour) et si l’analyse requiert des échantillons volumineux qui ne peuvent être prélevés des récipients sans influencer le système expérimental, les analyses seront pratiquées sur des échantillons provenant de récipients expérimentaux supplémentaires traités de la même façon (y compris par la présence des organismes d’essai), mais non utilisés pour des observations biologiques. 40. Pour isoler l’eau interstitielle, on recommande de centrifuger les échantillons à 10 000 g et à 4 °C durant 30 minutes. Cependant, s’il est démontré que la substance d’essai ne s’adsorbe pas sur les filtres, la filtration est également acceptable. Avec des échantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans l’eau des pores soient impossibles à analyser. Paramètres physico-chimiques 41. Le pH de l’eau et la température des récipients d’essai doivent être mesurés de façon appropriée (voir paragraphe 10). La dureté de l’eau et la teneur en ammoniac sont mesurées dans les récipients témoins et dans un récipient traité à la concentration la plus élevée, au début et à la fin de l’essai. RÉSULTATS ET RAPPORT Traitement des résultats 42. Cet essai vise à déterminer l’effet de la substance d’essai sur la vitesse de développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles totalement émergés ou, dans le cas de l’essai de 10 jours, les effets sur la survie et le poids des larves. Si rien n’indique que les deux sexes présentent des différences statistiques de sensibilité, les résultats obtenus sur les mâles et les femelles peuvent être regroupés pour l’analyse statistique. Les différences de sensibilité entre les sexes peuvent être jugées statistiquement par un test (de tableau) χ2 - r × 2, par exemple. La survie des larves et le poids sec individuel moyen par récipient doivent être déterminés après dix jours, le cas échéant. 43. Il est préférable de calculer les concentrations efficaces, exprimées en fonction du poids sec, à partir des concentrations mesurées dans le sédiment au début de l’essai (voir paragraphe 38). 44. Pour estimer ponctuellement la CE50 ou une quelconque CEx, les statistiques par récipient peuvent être utilisées comme des expériences identiques proprement dites. Lorsqu’on calcule un intervalle de confiance pour une quelconque CEx, il faut tenir compte de la variabilité entre les récipients ou montrer que celle-ci est négligeable. Si le modèle est ajusté par la méthode des moindres carrés, il convient d’appliquer une transformation des données pour les statistiques par récipient afin d’accroître l’homogénéité de la variance. Toutefois, les valeurs de la CEx sont à calculer après que les résultats ont été “retransformés” de façon à recouvrer leur valeur originale. 45. Si l’analyse statistique vise à déterminer la CSEO/CMEO par la vérification d’une hypothèse, la variabilité entre les récipients doit être prise en compte, par exemple à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) “emboîtée”. Par contre, des tests plus robustes (21) peuvent être utilisés au cas où les hypothèses habituelles de l’analyse de la variance ne se vérifient pas. Taux d’émergence 46. Le taux d’émergence donne une réponse par tout ou rien et peut être analysé par le test de Cochran-Armitage appliqué de façon régressive si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de Mantel-Haenszel avec des valeurs de p corrigées selon Bonferroni-Holm peuvent être employés. S’il s’avère que la variabilité entre expériences identiques à la même concentration est supérieure à ce qu’une distribution binomiale indiquerait (variation souvent qualifiée d’“extra-binomiale”), on appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test exact de Fisher) comme proposé à la référence (21). La somme des moucherons émergés par récipient, ne, est déterminée et divisée par le nombre de larves introduites, na: où: TE = taux d’émergence ne = nombre de moucherons émergés par récipient na = nombre de larves introduites par récipient 47. Une variante plus appropriée aux échantillons de grande taille, lorsque la variance est extra-binomiale, consiste à traiter le taux d’émergence comme une réponse continue et à appliquer une méthode telle que le test de William si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Le test de Dunnett convient dans le cas où la relation ne s’avère pas monotone. Ici, on considère qu’un échantillon est de grande taille lorsque le nombre de moucherons émergés et le nombre de chironomes non émergés dépassent chacun cinq, par récipient expérimental. 48. Pour réaliser l’analyse de la variance (ANOVA), il convient d’appliquer aux valeurs de TE une transformation “arcsinus-racine carrée” ou “Freeman-Tukey” afin d’obtenir une distribution proche de la normale et d’égaliser les variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être employés lorsqu’on utilise des fréquences absolues. La transformation arcsinus-racine carrée consiste à calculer l’inverse du sinus (sinus-1) de la racine carrée du TE. 49. Pour les taux d’émergence, les valeurs de la CEx sont calculées par une analyse de régression [ou par probit (22), logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropriés, etc.]. Si l’analyse de la régression échoue (par exemple, lorsqu’il y a moins de deux réponses partielles), on fait appel à d’autres méthodes non paramétriques telles que la moyenne mobile ou une simple interpolation. Vitesse de développement 50. La période de développement moyenne représente le temps moyen écoulé entre l’introduction des larves (jour 0 de l’essai) et l’émergence de la cohorte expérimentale de moucherons (pour calculer la période de développement réelle, il faut tenir compte de l’âge des larves au moment de l’introduction). La vitesse de développement est l’inverse de la période de développement (unité: 1/jour) et représente la partie du développement larvaire qui s’effectue par jour. Pour évaluer la toxicité dans les sédiments, il est préférable de choisir la vitesse de développement, car sa variance est plus faible et ses valeurs sont plus homogènes et plus proches d’une distribution normale, en comparaison avec la période de développement. C’est pourquoi les tests paramétriques puissants conviennent mieux à la vitesse de développement qu’à la période de développement. Si la vitesse de développement est traitée comme une réponse continue, les valeurs de la CEx peuvent être estimées par l’analyse de la régression, par exemple (23), (24). 51. Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observés le jour × sont considérés comme ayant émergé au milieu de l’intervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de l’intervalle d’observation, habituellement 1 jour). La vitesse de développement moyenne par récipient (x) est calculée comme suit: où: : vitesse de développement moyenne par récipient i : indice de l’intervalle d’observation m : nombre maximal d’intervalles d’observation : nombre de moucherons émergés durant l’intervalle d’observation i ne : nombre total de moucherons émergés à la fin de l’expérience (= ) xi : vitesse de développement des moucherons émergés durant l’intervalle i où: jouri : jour d’observation (compté depuis l’application) li : durée de l’intervalle d’observation I (exprimé en jours, habituellement 1 jour) Rapport d’essai 52. Le rapport d’essai doit fournir au moins les informations suivantes: Substance d’essai: — état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (hydrosolubilité, pression de vapeur, coefficient de partage dans le sol (ou dans le sédiment s’il est connu), stabilité dans l’eau, etc.), — identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structurale, numéro CAS, etc.), pureté et méthode d’analyse pour la quantification de la substance d’essai. Espèce d’essai: — animal d’essai utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions d’élevage, — informations sur la manipulation des amas d’œufs et des larves, — âge des animaux d’expérience au moment où ils ont été déposés dans les récipients expérimentaux. Conditions expérimentales: — sédiment utilisé, c’est-à-dire naturel ou reconstitué, — pour les sédiments naturels: localisation et description du site de prélèvement et notamment, si possible, son histoire en matière de contamination; caractéristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et granulométrie, le cas échéant, — préparation du sédiment reconstitué: ingrédients et caractéristiques (teneur en carbone organique, pH, humidité, etc. au début de l’essai), — préparation de l’eau d’essai (si l’eau est reconstituée) et caractéristiques (concentration d’oxygène, pH, conductivité, dureté, etc. au début de l’essai), — profondeur du sédiment et de l’eau sus-jacente, — volume de l’eau sus-jacente et de l’eau des pores; poids du sédiment humide avec et sans eau des pores, — récipients expérimentaux (matériau et dimension), — méthode de chargement du sédiment: concentrations expérimentales appliquées, nombre d’expériences identiques et utilisation d’un solvant, le cas échéant, — phase de stabilisation du système sédiment dopé-eau: durée et conditions, — conditions d’incubation: température, cycle et intensité de lumière, aération (fréquence et intensité), — informations détaillées sur la nourriture: type, préparation, quantité et régime d’administration. Résultats: — concentrations d’essai nominales, concentrations d’essai mesurées et résultats de toutes les analyses conduites pour déterminer la concentration de la substance d’essai dans le récipient expérimental, — qualité de l’eau dans les récipients expérimentaux: pH, température, oxygène dissous, dureté et teneur en ammoniac, — remplacement de l’eau d’essai évaporée, le cas échéant, — nombre de moucherons mâles et femelles émergés par récipient et par jour, — nombre de larves non émergées sous la forme de moucherons par récipient, — poids sec individuel moyen des larves par récipient, et par stade larvaire, s’il y a lieu, — pourcentage d’émergence par expérience identique et concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles), — vitesse de développement moyenne des moucherons totalement émergés par expérience identique et concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles), — estimation des effets toxiques observés, par exemple CEx (et intervalles de confiance associés), CSEO et/ou CMEO, et méthodes statistiques employées pour les déterminer, — analyse des résultats, y compris les répercussions sur les résultats d’un écart éventuel à la présente méthode d’essai. BIBLIOGRAPHIE: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J., and Kirby R.S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations, no 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Méthode d’essai C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre. (15) Suedel B.C. and J.H. Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C. and C. Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. (19) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (20) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. (21) Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Appendice 1 DÉFINITIONS Les définitions suivantes s’appliquent aux fins de la présente méthode d’essai: Le sédiment reconstitué, ou artificiel ou synthétique, désigne le mélange de matériaux utilisés pour reproduire au mieux les composants physiques d’un sédiment naturel. L’eau sus-jacente est l’eau surmontant le sédiment dans le récipient expérimental. L’eau interstitielle, ou l’eau des pores, se réfère à l’eau qui occupe les vides laissés entre le sédiment et les particules de sol. Le sédiment dopé est un sédiment auquel on a ajouté la substance d’essai. Une substance d’essai est toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d’essai. Appendice 2 Recommandations pour la culture de Chironomus riparius 1. Les larves de Chironomus peuvent être élevées dans des cristallisoirs ou de grands récipients. Du sable quartzique fin est déposé en couche mince (environ 5 à 10 mm d’épaisseur) sur le fond du récipient. Le Kieselguhr (par exemple l’art. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une couche encore plus mince de quelques millimètres à peine suffit). Une eau de qualité appropriée, profonde de plusieurs centimètres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas d’évaporation, le niveau d’eau doit toujours être ramené à sa hauteur initiale, afin de prévenir toute dessiccation. L’eau peut être remplacée, si nécessaire. Une légère aération est fournie. Les récipients d’élevage des larves doivent être placés dans des cages appropriées, afin d’empêcher la fuite des adultes émergeant. La cage sera suffisamment grande pour permettre aux adultes émergés d’essaimer, sans quoi la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions minimales: 30 × 30 × 30 cm). 2. Les cages doivent être gardées à température ambiante, ou à 20 ± 2 °C si elles sont installées dans une chambre à ambiance constante, avec une photopériode de 16 heures de lumière (intensité: environ 1 000 lux) et 8 heures d’obscurité. Une humidité relative de l’air inférieure à 60 % serait susceptible d’empêcher la reproduction. Eau de dilution 3. Toute eau naturelle ou reconstituée appropriée peut être utilisée. L’eau d’un puits, de l’eau du robinet déchlorée et un milieu artificiel (Elendt “M4” ou “M7”, voir ci-après) sont souvent utilisés. L’eau doit être aérée avant emploi. Si nécessaire, on peut renouveler l’eau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement l’eau usée des récipients expérimentaux, sans détruire les tubes des larves. Alimentation des larves 4. Les larves de Chironomus reçoivent des paillettes pour poissons (TetraMin®, TetraPhyll® ou une autre marque déposée équivalente), à raison d’environ 250 mg par récipient et par jour. Cette nourriture peut être administrée sous la forme d’une poudre moulue à sec ou d’une suspension dans l’eau: 1,0 g de paillettes ajoutées à 20 ml d’eau de dilution et agitées de façon à obtenir un mélange homogène. Cette préparation peut être administrée à raison d’environ 5 ml par récipient et par jour (agiter avant emploi). Les larves plus âgées peuvent en recevoir plus. 5. La nourriture est ajustée en fonction de la qualité de l’eau. Si le milieu de culture devient trouble, il convient de réduire la ration. Les quantités de nourriture données sont soigneusement notées. Un manque de nourriture fera émigrer les larves vers la colonne d’eau, tandis qu’un excès de nourriture intensifiera l’activité microbienne et abaissera la concentration d’oxygène. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes. 6. Certaines cellules d’algues vertes (Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) peuvent aussi être ajoutées lors de la préparation de nouveaux récipients de culture. Alimentation des adultes émergents 7. Certains expérimentateurs ont suggéré de nourrir les adultes émergés au moyen d’un tampon d’ouate imbibé d’une solution de sucrose saturée. Émergence 8. À 20 ± 2 °C, les adultes commencent à émerger des récipients d’élevage des larves après environ 13 à 15 jours. Il est facile de distinguer les mâles d’après leurs antennes plumeuses. Amas d’œufs 9. Dès que des adultes sont présents dans la cage d’élevage, il faut vérifier trois fois par semaine, dans tous les récipients d’élevage de larves, si des amas d’œufs gélatineux n’ont pas été déposés. Le cas échéant, les amas d’œufs doivent être soigneusement enlevés et transférés dans un petit récipient contenant un échantillon de l’eau d’élevage. Les amas d’œufs servent à préparer un nouveau récipient de culture (2 à 4 amas d’œufs par récipient, par exemple) ou à pratiquer des essais de toxicité. 10. Les larves au premier stade devraient éclore après 2-3 jours. Préparation de nouveaux récipients de culture 11. Une fois que les cultures ont été lancées, il devrait être possible de préparer un nouveau récipient de culture de larves, une fois par semaine ou moins souvent, suivant les besoins de l’essai, et de retirer les récipients plus anciens après que les moucherons adultes ont émergé. Ce système permet d’obtenir régulièrement un contingent d’adultes, avec une organisation minimale. Préparation des solutions d’essai “M4” et “M7” 12. Elendt (1990) a décrit le milieu “M4”. Le milieu “M7” est préparé comme le milieu “M4”, sauf pour les substances reprises au tableau 1, dont les concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu “M7” que dans le milieu “M4”. Une publication sur le milieu “M7” est en préparation (Elendt, communication personnelle). La solution d’essai ne doit pas être préparée selon les instructions d’Elendt et Bias (1990), car les concentrations de NaSiO35H2O, NaNO3, KH2PO4 et K2HPO4 indiquées pour la préparation des solutions mères ne conviennent pas. Préparation du milieu “M7” 13. Chaque solution mère (I) est préparée séparément et une solution mère combinée (II) est préparée à partir de ces solutions mères (I) (voir tableau 1). Cinquante millilitres de la solution mère combinée (II) additionnés de la quantité de chaque solution mère de macronutriments indiquée au tableau 2 sont amenés à 1 litre avec de l’eau désionisée pour préparer le milieu “M7”. On prépare une solution mère de vitamines en ajoutant trois vitamines à de l’eau désionisée, comme indiqué au tableau 3 et on verse 0,1 ml de la solution mère combinée de vitamines au milieu “M7” final, peu avant l’emploi (la solution mère de vitamines est stockée congelée par petites aliquotes). Le milieu est aéré et stabilisé. BIBLIOGRAPHIE: BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. Tableau 1 Solutions mères d’éléments en traces pour les milieux M4 et M7 Solutions mères (I) Quantité (mg) pour former une solution d’1 litre avec de l’eau désionisée Pour préparer la solution mère combinée (II): mélanger les quantités suivantes (ml) de solutions mères (I) et compléter à 1 litre avec de l’eau désionisée Concentrations finales dans les solutions expérimentales (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tableau 2 Solutions mères de macronutriments pour les milieux M4 et M7 Quantité (mg) pour former une solution d’1 litre avec de l’eau désionisée Quantités de solutions mères de macronutriments ajoutées pour préparer les milieux M4 et M7 (ml/l) Concentrations finales dans les solutions expérimentales M4 et M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tableau 3 Solution mère de vitamines pour les milieux M4 et M7. Les trois solutions de vitamines seront mélangées de façon à ne former qu’une solution mère de vitamines Quantité pour former une solution d’un litre avec de l’eau désionisée (mg) Quantité de solution mère de vitamines ajoutée pour préparer les milieux M4 et M7 (ml/l) Concentrations finales dans les solutions d’essai M4 et M7 (mg/l) Hydrochlorure de thiamine 750 0,1 0,075 Cyanocobalamine (B12) 10 0,1 0,0010 Biotine 7,5 0,1 0,00075 BIBLIOGRAPHIE: Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Appendice 3 PRÉPARATION DU SÉDIMENT RECONSTITUÉ Composition du sédiment Le sédiment sera reconstitué comme suit: Ingrédient Caractéristiques % du sédiment poids sec Tourbe Tourbe de sphaigne, pH aussi proche que possible de 5,5-6,0, pas de résidus de plantes visibles, finement broyée, particules (≤ 1 mm) et séchée à l’air 4 - 5 Sable quartzique Dimension des particules: > 50 % des particules doivent mesurer entre 50 et 200 μm 75 - 76 Argile kaolinique Taux de kaolinite ≥ 30 % 20 Carbone organique Ajusté par l’addition de tourbe et de sable 2 (± 0,5) Carbonate de calcium CaCO3, pulvérisé, chimiquement pur 0,05 - 0,1 Eau Conductivité ≤ 10 μS/cm 30 - 50 Préparation La tourbe est séchée à l’air et broyée en poudre fine. Une suspension de la quantité requise de poudre de tourbe dans de l’eau désionisée est préparée à l’aide d’un homogénéisateur à haute performance. Le pH de cette suspension est ajusté à 5,5 ± 0,5 avec du CaCO3. La suspension est conditionnée durant au moins deux jours en l’agitant doucement à 20 ± 2 °C, afin de stabiliser le pH et d’établir une flore microbienne stable. Le pH est vérifié à nouveau; il devrait atteindre 6,0 ± 0,5. Ensuite la suspension de tourbe est mélangée avec les autres ingrédients (sable et argile kaolinique) et de l’eau désionisée pour former un sédiment homogène avec une teneur en eau de 30 à 50 % du poids sec du sédiment. Le pH du mélange final est encore mesuré et ajusté à 6,5-7,5 avec du CaCO3, si nécessaire. On prélève des échantillons de sédiment afin de déterminer le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant d’utiliser le sédiment reconstitué dans l’essai de toxicité sur les chironomes, il est recommandé de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai subséquent. Stockage Les ingrédients secs destinés à la préparation du sédiment artificiel peuvent être entreposés dans un endroit sec et frais, à température ambiante. Le sédiment reconstitué (humide) ne doit pas être stocké avant son utilisation dans l’essai. Il doit être utilisé immédiatement après la période de conditionnement de sept jours qui achève sa préparation. BIBLIOGRAPHIE: Chapitre C.8 de la présente annexe: Toxicité pour les vers de terre. Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Appendice 4 Caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable Substance Concentrations Matières particulaires < 20 mg/l Carbone organique total < 2 mg/l Ammoniac non ionisé < 1 μg/l Dureté en CaCO3 < 400 mg/l (17) Chlore résiduel < 10 μg/l Totalité des pesticides organophosphorés < 50 ng/l Totalité des pesticides organochlorés et des biphényles polychlorés < 50 ng/l Chlore organique total < 25 ng/l Appendice 5 Conseils pour suivre l’émergence des larves de chironomes Les béchers expérimentaux sont coiffés par des pièges à émergence, du 20e jour jusqu’à la fin de l’essai. Le schéma ci-dessous illustre un exemple de piège: A: toile de nylon. B: coupelles en plastique renversées. C: bécher expérimental sans bec. D: ouvertures recouvertes de toile par où s’effectuent les échanges. E: eau. F: sédiment. C. 28. ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN SYSTÈME EAU CHARGÉE-SÉDIMENT INTRODUCTION 1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 219 de l’OCDE (2004) pour les essais de produits chimiques. Elles est conçue pour évaluer les effets d’une exposition prolongée à des substances chimiques sur des larves de Chironomus sp., un diptère vivant dans les sédiments d’eau douce. Elle s’inspire principalement de la ligne directrice du BBA, dans laquelle l’exposition s’effectue à l’aide d’un système expérimental sédiment-eau, composé de sol artificiel et d’une colonne d’eau (1). Elle tient compte également des protocoles d’essais de toxicité sur Chironomus riparius et Chironomus tentans, mis au point en Europe et en Amérique du Nord (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) et soumis à des essais circulaires (1) (6) (9). D’autres espèces de chironomes bien documentées peuvent aussi être employées, par exemple Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Le scénario d’exposition appliqué dans la présente méthode d’essai consiste à introduire la substance d’essai dans l’eau. La sélection du scénario d’exposition dépend de la finalité de l’essai. Le scénario d’exposition qui consiste à doper la colonne d’eau, vise à simuler des pertes par dispersion lors de l’épandage de pesticides et couvre le pic de concentrations initial dans l’eau interstitielle. Il s’applique également à d’autres types d’exposition (notamment des fuites de produits chimiques), à l’exclusion des processus d’accumulation d’une durée supérieure à celle de l’essai. 3. En général, les substances à tester sur des organismes vivant dans les sédiments subsistent longtemps dans ce compartiment. Ces organismes peuvent être exposés par diverses voies. L’importance relative de chaque voie d’exposition et le temps pris par chacune d’entre elles pour contribuer à l’effet toxique global dépendent des propriétés physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, l’ingestion d’aliments contaminés peut constituer une voie d’exposition non négligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicité des substances fortement lipophiles, on envisagera d’ajouter de la nourriture au sédiment avant l’application de la substance d’essai. La présente méthode d’essai est axée sur l’exposition à long terme, de façon à couvrir toutes les voies d’exposition potentielles. L’essai dure de 20 à 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et de 28 à 65 jours pour C. tentans. Si l’on a besoin de données à court terme pour un motif précis, par exemple pour étudier les effets de substances chimiques instables, des récipients supplémentaires, ajoutés au dispositif expérimental, peuvent être retirés après 10 jours d’essai. 4. Les effets mesurés sont le nombre total d’adultes émergés et temps écoulé jusqu’à l’émergence. Si l’on a besoin de données à court terme, il est recommandé de ne mesurer la survie et la croissance des larves qu’après 10 jours, en ajoutant le nombre nécessaire de récipients supplémentaires. 5. L’utilisation d’un sédiment reconstitué est recommandée en raison de ses avantages par rapport aux sédiments naturels: — la variabilité expérimentale est réduite parce que le sédiment reconstitué forme une “matrice normalisée” reproductible; en outre, il n’est plus nécessaire de trouver des sources de sédiments non contaminés et non pollués, — les essais peuvent être effectués à n’importe quel moment de l’année, la variabilité saisonnière n’intervenant plus et il n’est pas nécessaire de traiter préalablement le sédiment afin d’éliminer la faune indigène; l’utilisation de sédiments reconstitués diminue aussi le coût associé à la collecte sur le terrain d’une quantité suffisante de sédiments pour les essais systématiques, — les sédiments reconstitués permettent de comparer la toxicité des substances et de les classer en conséquence; les essais pratiqués sur des sédiments naturels et artificiels ont fourni des données de toxicité comparables pour plusieurs substances chimiques (2). 6. L’appendice 1 contient les définitions applicables à la présente méthode d’essai. PRINCIPE DE L’ESSAI 7. Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de concentrations de la substance d’essai dans un système sédiment-eau. L’essai débute par l’introduction de larves au premier stade dans les béchers expérimentaux contenant le système sédiment-eau et l’ajout de la substance d’essai à l’eau. L’émergence des chironomes et leur vitesse de développement sont mesurées à la fin de l’essai. La survie des larves et leur poids peuvent aussi être mesurés après 10 jours si nécessaire (en ajoutant le nombre d’expériences identiques requis). Ces données sont analysées, soit à l’aide d’un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % de l’émergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE15, CE50, etc.), soit par la vérification d’une hypothèse statistique afin de déterminer une CSEO/CMEO. Cette dernière requiert une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des témoins à l’aide de tests statistiques. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI 8. Il faudrait connaître l’hydrosolubilité de la substance d’essai, sa pression de vapeur, son coefficient de partage mesuré ou calculé dans le sédiment et sa stabilité dans l’eau et le sédiment. Il convient de disposer d’une méthode d’analyse fiable pour quantifier la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, l’eau interstitielle et le sédiment, et pour laquelle la précision et le seuil de détection sont connus. Il est également utile de connaître la formule structurale et la pureté de la substance d’essai ainsi que son devenir chimique (par exemple dissipation, dégradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complémentaires pour tester les substances se prêtant difficilement à l’essai en raison de leurs propriétés physico-chimiques sont fournies à la référence (12). SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE 9. Des substances de référence pourront être testées régulièrement pour démontrer la fiabilité du protocole et des conditions de l’essai. Voici quelques exemples de toxiques de référence ayant fait leurs preuves dans des essais circulaires et des études de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophénol, chlorure de cadmium et chlorure de potassium (1) (2) (5) (6) (13). VALIDITÉ DE L’ESSAI 10. Pour que l’essai soit valide, les conditions suivantes doivent être remplies: — l’émergence chez les témoins doit atteindre au moins 70 % à la fin de l’essai (1) (6), — s’agissant de C. riparius et C. yoshimatsui, l’émergence au stade adulte dans les récipients témoins doit avoir lieu entre 12 et 23 jours après leur introduction dans les récipients expérimentaux; C. tentans nécessite une période de 20 à 65 jours, — à la fin de l’essai, le pH et la concentration d’oxygène dissous seront mesurés dans chaque récipient. La concentration d’oxygène devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) à la température appliquée et le pH de l’eau sus-jacente devrait être compris entre 6 et 9 dans tous les récipients expérimentaux, — la température de l’eau ne devrait pas varier de plus de ± 1,0 °C et pourrait être contrôlée grâce à une chambre isotherme, auquel cas la température de la chambre devra être confirmée à intervalles appropriés. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE Récipients expérimentaux 11. L’essai se déroule dans des béchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de diamètre. D’autres récipients peuvent être utilisés à condition qu’ils permettent de garantir une profondeur adéquate d’eau et de sédiment. Le sédiment doit offrir une superficie de 2 à 3 cm2 par larve. Le quotient de la profondeur de la couche de sédiment par la profondeur de la couche d’eau sus-jacente doit être égal à 1/4. Les récipients et les autres appareils qui entreront en contact avec le système d’essai doivent être composés uniquement de verre ou d’un autre matériau chimiquement inerte (par exemple du Téflon). Sélection des espèces 12. Chironomus riparius est l’espèce qui convient le mieux. Chironomus tentans peut aussi être utilisé, mais il est plus difficile à manipuler et nécessite une période d’essai plus longue. Chironomus yoshimatsui convient également. La méthode de culture de Chironomus riparius est détaillée à l’appendice 2. D’autres documents décrivent les conditions de culture des autres espèces: Chironomus tentans (4) et Chironomus yoshimatsui (11). L’identification des espèces est à confirmer avant l’essai, mais n’est pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent d’un élevage interne. Sédiment 13. Il est préférable d’employer un sédiment reconstitué (également dénommé sédiment artificiel ou synthétique). Néanmoins, si l’on opte pour un sédiment naturel, il faudrait le caractériser, au moins quant au pH et à la teneur en carbone organique (la détermination d’autres paramètres, tels que le rapport C/N et la granulométrie est aussi recommandée), et s’assurer qu’il n’est pas contaminé et n’abrite pas d’autres organismes qui pourraient entrer en compétition avec les chironomes ou les consommer. Avant d’utiliser un sédiment naturel dans un essai de toxicité sur les chironomes, il est également recommandé de le maintenir durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai (conditionnement). Le sédiment reconstitué décrit ci-dessous, basé sur le sol artificiel utilisé dans la méthode d’essai C.8 est recommandé (14) (1) (15) (16): a) 4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 5,5 à 6,0; il est important d’utiliser une tourbe sous forme de poudre, finement broyée (dimension des particules ≤ 1 mm) et séchée uniquement à l’air; b) 20 % (poids sec) d’argile kaolinique (teneur en kaolinite de préférence supérieure à 30 %); c) 75-76 % (poids sec) de sable quartzique (composé en majorité de sable fin, plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm); d) ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que la teneur en humidité du mélange final atteigne 30 à 50 %; e) ajouter du carbonate de calcium de qualité chimiquement pure (CaCO3) pour ajuster le pH du mélange final de sédiments à 7,0 ± 0,5; f) il convient d’obtenir 2 % (± 0,5 %) de carbone organique dans le mélange final en y ajoutant les quantités appropriées de tourbe et de sable, comme indiqué en a) et en c). 14. Les sources de tourbe, d’argile kaolinique et de sable doivent être connues. On vérifiera que les composants du sédiment ne sont pas contaminés par des substances chimiques (par exemple des métaux lourds, des composés organochlorés, organophosphorés, etc.). Un exemple de préparation de sédiment reconstitué est décrit à l’appendice 3. Les composants peuvent aussi être mélangés à l’état sec, à condition de démontrer qu’après l’ajout de l’eau sus-jacente, les composants du sédiment ne se séparent pas (flottement de particules de tourbe, par exemple) et que la tourbe ou le sédiment sont suffisamment conditionnés. Eau 15. Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable selon les critères spécifiés aux appendices 2 et 4 convient à l’essai. Toute eau appropriée, naturelle (eau superficielle ou souterraine), reconstituée (voir appendice 2) ou eau du robinet déchlorée, est acceptable comme eau pour l’élevage et les essais si les chironomes y survivent sur toute la durée de l’élevage et de l’essai sans manifester de signes de stress. Au début de l’essai, le pH de l’eau d’essai se situera entre 6 et 9 et sa dureté totale ne dépassera pas 400 mg/l en CaCO3. Néanmoins, si l’on suspecte une interaction entre les ions qui provoquent la dureté et la substance d’essai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le même type d’eau doit être utilisé tout au long de l’étude. Les caractéristiques de la qualité de l’eau énumérées à l’appendice 4 sont à mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractéristiques sont susceptibles d’avoir été significativement modifiées. Solutions mères – eau chargée 16. Les concentrations expérimentales sont calculées en fonction des concentrations dans la colonne d’eau recouvrant le sédiment. Les solutions d’essai sont généralement préparées aux concentrations choisies par dilution d’une solution mère. Il est préférable de préparer les solutions mères en dissolvant la substance d’essai dans le milieu d’essai. Dans certains cas, il sera nécessaire d’utiliser des solvants ou des dispersants pour obtenir une solution mère à la concentration voulue. Voici quelques exemples de solvants appropriés: acétone, éthanol, méthanol, éthylèneglycol, monoéthyléther, diméthyléther d’éthylèneglycol, diméthylformamide et triéthylèneglycol. Les dispersants qui peuvent être utilisés sont le Cremophor RH40, le Tween 80, la méthylcellulose à 0,01 % et l’HCO-40. La concentration de l’agent solubilisant dans le milieu d’essai final doit être minimale (≤ 0,1 ml/l) et identique dans tous les traitements. L’agent solubilisant, s’il est utilisé, ne doit pas avoir d’effets significatifs sur la survie, ni d’effet nocif visible sur les larves de chironomes, et ce d’après l’observation des organismes du récipient témoin traité uniquement au solvant. Néanmoins, l’utilisation de ces substances est à éviter dans la mesure du possible. CONCEPTION DE L’ESSAI 17. La conception de l’essai définit le nombre et l’espacement des concentrations expérimentales, le nombre de récipients à chaque concentration et le nombre de larves par récipient. La marche à suivre pour estimer une valeur de CE, la CSEO et effectuer un essai limite est décrite. L’analyse de régression est préférable à une approche par vérification d’hypothèses. Conduite d’une analyse de régression 18. La concentration efficace (par exemple, CE15, CE50) et la gamme de concentrations dans laquelle l’effet de la substance d’essai est d’intérêt doivent être couvertes par les concentrations incluses dans l’essai. Généralement, l’exactitude, et plus particulièrement la validité, de l’estimation des concentrations efficaces (CEx) s’accroissent lorsque la concentration efficace se situe dans la gamme des concentrations testées. Il faut éviter d’extrapoler des résultats très en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concentration maximale. Il est utile de conduire un essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur afin de délimiter la gamme des concentrations à appliquer (voir paragraphe 27). 19. S’il faut estimer la CEx, au moins cinq concentrations et trois répétitions par concentration doivent être testées. En tout état de cause, il est recommandé de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne estimation du modèle. Le facteur séparant les concentrations ne doit pas excéder deux (sauf dans les cas où la courbe dose-effet présente une pente faible). Le nombre de répétitions par traitement peut être diminué si le nombre de concentrations expérimentales entraînant différents effets est augmenté. L’augmentation du nombre de répétitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations expérimentales tend à réduire les intervalles de confiance pour l’essai. Le nombre de répétitions sera augmenté s’il y a lieu d’estimer le taux de survie et la croissance des larves après dix jours. Procédure d’estimation d’une CSEO/CMEO 20. S’il faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concentrations expérimentales et au moins quatre répétitions par concentration, le facteur séparant les concentrations n’excédant pas deux. Le nombre d’expériences identiques doit être tel qu’il fournit une puissance statistique permettant de détecter une différence de 20 % avec le témoin, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). S’agissant de la vitesse de développement, une analyse de la variance (ANOVA) convient généralement, telle que le test de Dunnett ou le test de Williams (17) (18) (19) (20). S’agissant du taux d’émergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être utilisés. Essai limite 21. Si l’essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur des concentrations n’a engendré aucun effet, un essai limite peut être conduit (une concentration expérimentale et un témoin). L’essai limite vise à montrer que la concentration toxique de la substance d’essai est supérieure à la concentration limite testée. Aucune concentration ne peut être recommandée pour cette méthode d’essai; cela est laissé à l’appréciation des instances réglementaires. Généralement, il est nécessaire de mener au moins six répétitions pour les organismes traités et les témoins. Il y a lieu de démontrer que la puissance statistique est suffisante pour révéler une différence de 20 % avec les témoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne l’effet sur la vitesse de développement et sur le poids, le test t constitue une méthode statistique appropriée, si les données respectent les conditions exigées par ce test (normalité, variances homogènes). On pourra recourir au test t à variance inégale ou à un test non paramétrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. S’agissant du taux d’émergence, le test exact de Fisher est approprié. MODE OPÉRATOIRE Conditions d’exposition Préparation du système eau chargée-sédiment 22. Une quantité appropriée de sédiment reconstitué (voir paragraphes 13-14 et appendice 3) est déposée dans les récipients expérimentaux, de façon à former une couche d’au moins 1,5 cm. La profondeur de l’eau versée sur ce sédiment atteindra 6 cm (voir paragraphe 15). Le ratio entre la profondeur du sédiment et la profondeur de l’eau n’excédera pas 1/4 et la couche de sédiment ne dépassera pas 3 cm. Le système sédiment-eau sera laissé sous aération légère pendant 7 jours avant l’ajout des organismes d’essai (voir paragraphe 14 et appendice 3). Afin d’éviter la séparation des constituants du sédiment et la resuspension des particules fines durant le remplissage de la colonne d’eau, on peut recouvrir le sédiment d’un disque en plastique et retirer le disque juste après le remplissage. D’autres dispositifs conviennent également. 23. Les récipients expérimentaux doivent être couverts (par des plaques de verre, par exemple). On prendra soin de remplacer les volumes d’eau évaporée durant l’étude, le cas échéant, et ce avec de l’eau distillée ou désionisée afin d’empêcher l’accumulation de sels. Introduction des organismes d’essai 24. Quatre à cinq jours avant d’introduire les organismes d’essai dans les récipients, des amas d’œufs sont prélevés dans les cultures et déposés dans de petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de la culture mère tout comme un milieu fraîchement préparé peuvent être utilisés. Si ce dernier est utilisé, on ajoutera une petite quantité de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat d’une suspension de paillettes pour poissons finement broyées, au milieu de culture (voir appendice 2). Seuls des amas d’œufs fraîchement pondus peuvent être utilisés. Normalement, les larves commencent à éclore quelques jours après la ponte (2 à 3 jours pour Chironomus riparius à 20 °C et 1 à 4 jours pour Chironomus tentans à 23 °C et Chironomus yoshimatsui à 25 °C) et le développement des larves se déroule en quatre stades, dont chacun dure 4 à 8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours après l’éclosion). Il est possible de vérifier le stade de développement des moucherons d’après la largeur de la capsule céphalique (6). 25. Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont déposées dans chaque récipient contenant le sédiment chargé et l’eau, à l’aide d’une pipette émoussée. L’aération de l’eau doit être interrompue dès qu’on introduit les larves dans les récipients expérimentaux, et ce durant 24 heures après l’ajout des larves (voir paragraphes 24 et 32). Selon le protocole expérimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilisées par concentration s’élève au moins à 60 pour l’estimation d’une valeur de concentration efficace (CE) et à 80 pour la détermination de la CSEO. 26. Vingt-quatre heures après l’introduction des larves dans les récipients expérimentaux, la substance d’essai est ajoutée à la colonne d’eau sus-jacente et une légère aération est à nouveau dispensée. De petits volumes de la solution contenant la substance d’essai sont injectés en dessous de la surface de la colonne d’eau à l’aide d’une pipette. Ensuite, il convient de mélanger l’eau sus-jacente en prenant soin de ne pas remuer le sédiment. Concentrations d’essai 27. Il peut être utile de conduire un essai de détermination de l’ordre de grandeur pour délimiter la gamme de concentrations à appliquer dans l’essai proprement dit. À cet effet, on utilise une série de concentrations largement espacées de la substance d’essai. Afin de reproduire la même densité de surface par chironome que dans l’essai proprement dit, les chironomes sont exposés à chaque concentration de la substance d’essai durant une période permettant d’estimer les concentrations expérimentales appropriées et aucune expérience identique n’est nécessaire. 28. Les concentrations expérimentales pour l’essai définitif sont choisies en fonction des résultats de l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. Au moins cinq concentrations doivent être appliquées et sélectionnées comme indiqué aux paragraphes 18 à 20. Témoins 29. L’essai comportera le nombre nécessaire de récipients témoins pourvus du sédiment mais exempts de toute substance d’essai (voir paragraphes 19-20). Si la substance d’essai a été appliquée à l’aide d’un solvant (voir paragraphe 16), il convient d’ajouter un témoin dont le sédiment contient également le solvant. Système expérimental 30. Des systèmes statiques sont utilisés. Des systèmes semi-statiques ou à écoulement continu avec renouvellement intermittent ou continu de l’eau sus-jacente peuvent être utilisés dans des cas exceptionnels, par exemple si les spécifications de la qualité de l’eau deviennent inappropriées pour l’organisme d’expérience ou affectent l’équilibre chimique (si, par exemple, la concentration d’oxygène dissous devient trop basse, la concentration des excréta augmente de façon trop importante ou si des minéraux lessivés à partir du sédiment affectent le pH et/ou la dureté de l’eau). Néanmoins, d’autres méthodes d’amélioration de la qualité de l’eau sus-jacente, telles que l’aération, seront normalement suffisantes et préférables. Alimentation 31. Les larves ont besoin d’être nourries, de préférence quotidiennement ou au moins trois fois par semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 à 0,5 mg (0,35-0,5 mg pour C. yoshimatsui) de nourriture pour poissons (suspendue dans l’eau ou finement broyée, par exemple TetraMin ou TetraPhyll; voir les détails à l’appendice 2). Il peut être nécessaire d’augmenter légèrement cette quantité pour les larves plus âgées: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste de l’essai. On diminuera la ration alimentaire de tous les organismes traités et témoins si des champignons se développent ou si des organismes témoins meurent. Si la croissance fongique s’avère impossible à enrayer, l’essai doit être renouvelé. Si l’essai porte sur des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log Koe > 5) ou des substances liées de façon covalente au sédiment, la quantité de nourriture nécessaire à la survie et à la croissance naturelle des organismes peut être incorporée au sédiment reconstitué avant la période de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour poissons est remplacée par une ration végétale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles finement broyées d’ortie (Urtica dioica), de mûrier (Morus alba), de trèfle blanc ou rampant (Trifolium repens), d’épinard (Spinacia oleracea) ou d’un autre matériau végétal (Cerophyl ou alpha-cellulose). Conditions d’incubation 32. L’eau sus-jacente est soumise à une légère aération, mise en œuvre de préférence 24 heures après l’introduction des larves et maintenue jusqu’à la fin de l’essai (il faut veiller à ce que la concentration d’oxygène dissous ne tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). L’air est insufflé à travers une pipette Pasteur en verre fixée 2 à 3 cm au-dessus de la couche de sédiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance d’essai est volatile, il faudra éventuellement supprimer l’aération. 33. L’essai est mené à température constante (20 °C ± 2 °C). Pour C. tentans et C. yoshimatsui, les températures recommandées s’élèvent respectivement à 23 °C et 25 °C (± 2 °C). La photopériode est de 16 heures et l’éclairement compris entre 500 et 1 000 lux. Durée de l’exposition 34. L’exposition débute avec l’introduction des larves dans les récipients traités et témoins. La durée maximale d’exposition atteint 28 jours pour C. riparius et C. yoshimatsui et 65 jours pour C. tentans. Si les moucherons émergent plus tôt, l’essai peut s’achever au moins cinq jours après l’émergence du dernier adulte témoin. OBSERVATIONS Émergence 35. La durée du développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles adultes totalement émergés sont à déterminer. Les mâles sont faciles à identifier grâce à leurs antennes plumeuses. 36. Au moins trois fois par semaine, on vérifiera que les organismes des récipients d’essai ne manifestent aucun comportement anormal (sortie du sédiment, nage inhabituelle, par exemple) par rapport aux témoins. Chaque jour, durant la période supposée de l’émergence, il faut compter le nombre de moucherons émergés et consigner le sexe et le nombre de moucherons complètement émergés. Une fois identifiés, les moucherons sont retirés des récipients. Tout amas d’œufs déposé avant la fin de l’essai doit être recensé puis enlevé afin d’empêcher la réintroduction de larves dans le sédiment. Le nombre de pupes visibles n’ayant pas réussi à émerger est aussi enregistré. Des indications sur la façon de mesurer l’émergence sont données à l’appendice 5. Croissance et survie 37. S’il faut fournir des données sur la survie et la croissance des larves après 10 jours, des récipients expérimentaux supplémentaires seront inclus dès le début de l’essai, pour pouvoir être utilisés ultérieurement. Le sédiment de ces récipients supplémentaires est tamisé à travers des mailles de 250 μm pour retenir les larves. La mort est déterminée par deux critères: l’immobilité et l’absence de réaction à un stimulus mécanique. Les larves non récupérées doivent aussi être comptabilisées parmi les mortes (les larves qui sont mortes au début de l’essai ont pu être dégradées par des microbes). Après avoir déterminé le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par récipient expérimental, on calcule le poids sec individuel moyen par récipient. Il est utile d’établir à quel stade se trouvent les larves survivantes, et ce d’après la largeur de la capsule céphalique de chaque individu. Mesures analytiques Concentration de la substance d’essai 38. Il est recommandé d’analyser, au minimum, des échantillons de l’eau sus-jacente, de l’eau interstitielle, et du sédiment, au début (de préférence une heure après l’application de la substance d’essai) et à la fin de l’essai, et ce pour la concentration la plus élevée et pour une concentration plus faible. La concentration de la substance d’essai nous renseigne sur le comportement et la répartition de la substance d’essai dans le système eau-sédiment. Le prélèvement d’échantillons de sédiment au début de l’essai risque de perturber le système d’essai (enlèvement de larves, par exemple), il faut donc inclure des récipients expérimentaux supplémentaires pour effectuer des déterminations analytiques au début de l’essai et, s’il y a lieu, au cours de l’essai (voir paragraphe 39). Il n’est pas forcément nécessaire d’analyser le sédiment si la répartition de la substance d’essai entre l’eau et le sédiment a été clairement déterminée par une étude eau/sédiment menée dans des conditions comparables (par exemple, quotient sédiment/eau, type d’application, teneur en carbone organique du sédiment). 39. Lorsqu’on effectue des mesures intermédiaires (par exemple au septième jour) et si l’analyse requiert des échantillons volumineux qui ne peuvent être prélevés des récipients sans influencer le système expérimental, les analyses seront pratiquées sur des échantillons provenant de récipients expérimentaux supplémentaires traités de la même façon (y compris par la présence des organismes d’essai), mais non utilisés pour les observations biologiques. 40. Pour isoler l’eau interstitielle, on recommande de centrifuger des échantillons à 10 000 g et à 4 °C durant 30 minutes. Cependant, s’il est démontré que la substance d’essai ne s’adsorbe pas sur les filtres, la filtration est également acceptable. Avec des échantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans l’eau interstitielle soient impossibles à analyser. Paramètres physico-chimiques 41. Le pH, l’oxygène dissous dans l’eau d’essai et la température des récipients expérimentaux doivent être mesurés de façon appropriée (voir paragraphe 10). La dureté de l’eau et la teneur en ammoniac sont mesurées dans les récipients témoins et dans un récipient traité à la concentration la plus élevée, au début et à la fin de l’essai. RÉSULTATS ET RAPPORT Traitement des résultats 42. Cet essai vise à déterminer l’effet de la substance d’essai sur la vitesse de développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles totalement émergés ou, dans le cas de l’essai de 10 jours, les effets sur la survie et le poids des larves. Si rien n’indique que les deux sexes présentent des différences statistiques de sensibilité, les résultats obtenus sur les mâles et les femelles peuvent être regroupés pour l’analyse statistique. Les différences de sensibilité entre les sexes peuvent être appréciées statistiquement par un test (de tableau) a χ2 - r x 2, par exemple. La survie des larves et le poids sec individuel moyen par récipient doivent être déterminés après dix jours, le cas échéant. 43. Il est préférable de calculer les concentrations efficaces, exprimées en concentrations dans l’eau sus-jacente, en fonction des concentrations mesurées au début de l’essai (voir paragraphe 38). 44. Pour estimer ponctuellement la CE50 ou une quelconque CEx, les statistiques par récipient peuvent être utilisées comme des expériences identiques proprement dites. Lorsqu’on calcule un intervalle de confiance pour une quelconque CEx, il faut tenir compte de la variabilité entre les récipients ou montrer que celle-ci est négligeable. Si le modèle est ajusté par la méthode des moindres carrés, il convient d’appliquer une transformation des données pour les statistiques par récipient afin d’accroître l’homogénéité de la variance. Toutefois, les valeurs de la CEx sont à calculer après que les résultats ont été “retransformés” de façon à recouvrer leur valeur originale. 45. Si l’analyse statistique vise à déterminer la CSEO/CMEO par la vérification d’hypothèses, la variabilité entre les récipients doit être prise en compte, par exemple à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) “emboîtée”. Par contre, des tests plus robustes (21) peuvent être utilisés au cas où les hypothèses habituelles de l’analyse de la variance ne se vérifient pas. Taux d’émergence 46. Le taux d’émergence donne une réponse par tout ou rien et peut être analysé par le test de Cochran-Armitage appliqué de façon régressive si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de Mantel-Haenszel avec des valeurs de p corrigées selon Bonferroni-Holm peuvent être employés. S’il s’avère que la variabilité entre expériences identiques à la même concentration est supérieure à ce qu’une distribution binomiale indiquerait (variation souvent qualifiée d’“extra-binomiale”), on appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test exact de Fisher) comme proposé à la référence (21). 47. La somme des moucherons émergés par récipient, ne, est déterminée et divisée par le nombre de larves introduites, na: où: TE = taux d’émergence ne = nombre de moucherons émergés par récipient ne = nombre de larves introduites par récipient 48. Une variante plus appropriée aux échantillons de grande taille, lorsque la variance est extra-binomiale, consiste à traiter le taux d’émergence comme une réponse continue et à appliquer une méthode telle que le test de Williams, si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les résultats du taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Le test de Dunnett convient dans le cas où la relation ne s’avère pas monotone. Ici, on considère qu’un échantillon est de grande taille lorsque le nombre de moucherons émergés et le nombre de chironomes non émergés dépassent chacun cinq, par récipient d’essai. 49. Pour appliquer l’analyse de la variance (ANOVA), il convient d’appliquer aux valeurs de TE une transformation “arcsinus-racine carrée” ou “Freeman-Tukey” afin d’obtenir une distribution proche de la normale et d’égaliser les variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être employés lorsqu’on utilise des fréquences absolues. La transformation arcsinus-racine carrée consiste à calculer l’inverse du sinus (sinus-1) de la racine carrée du TE. 50. Pour les taux d’émergence, les valeurs de la CEx sont calculées par une analyse de régression [ou par probit (22), logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropriés, etc.]. Si l’analyse de la régression échoue (par exemple, lorsqu’il y a moins de deux réponses partielles), on fait appel à d’autres méthodes non paramétriques telles que la moyenne mobile ou une simple interpolation. Vitesse de développement 51. La période moyenne de développement représente le temps moyen écoulé entre l’introduction des larves (jour 0 de l’essai) et l’émergence de la cohorte expérimentale de moucherons (pour calculer la période réelle de développement, il faut tenir compte de l’âge des larves au moment de l’introduction). La vitesse de développement est l’inverse de la période de développement (unité: 1/jour) et représente la partie du développement larvaire qui s’effectue par jour. Pour évaluer la toxicité dans les sédiments, il est préférable de choisir la vitesse de développement car sa variance est plus faible et ses valeurs sont plus homogènes et plus proches d’une distribution normale, en comparaison avec la période de développement. C’est pourquoi les tests paramétriques puissants conviennent mieux à la vitesse de développement qu’à la période de développement. Si la vitesse de développement est traitée comme une réponse continue, les valeurs de la CEx peuvent être estimées par l’analyse de la régression, par exemple (23), (24). 52. Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observés le jour x sont considérés comme ayant émergé au milieu de l’intervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de l’intervalle d’observation, habituellement 1 jour). La vitesse de développement moyenne par récipient (x) est calculée comme suit: où: : vitesse de développement moyenne par récipient i : indice de l’intervalle d’observation m : nombre maximal d’intervalles d’observation : nombre de moucherons émergés durant l’intervalle d’observation i ne : nombre total de moucherons émergés à la fin de l’expérience (= ) xi : vitesse de développement des moucherons émergés durant l’intervalle i où: jouri : jour d’observation (compté à partir de l’application) li : durée de l’intervalle d’observation i (exprimée en jours, habituellement 1 jour) Rapport d’essai 53. Le rapport d’essai doit fournir au moins les informations suivantes: Substance d’essai: — état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (hydrosolubilité, pression de vapeur, coefficient de partage dans le sol (ou dans le sédiment s’il est connu), stabilité dans l’eau, etc.), — identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structurale, numéro CAS, etc.), pureté et méthode d’analyse pour la quantification de la substance d’essai. Espèce d’essai: — animal d’essai utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions d’élevage, — informations sur la manipulation des amas d’œufs et des larves, — âge des animaux d’expérience au moment où ils ont été déposés dans les récipients d’essai. Conditions expérimentales: — sédiment utilisé, c’est-à-dire naturel ou reconstitué, — pour les sédiments naturels: localisation et description du site de prélèvement et notamment, si possible, son histoire en matière de contamination; caractéristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et granulométrie, le cas échéant, — préparation du sédiment reconstitué: ingrédients et caractéristiques (teneur en carbone organique, pH, humidité, etc. au début de l’essai), — préparation de l’eau d’essai (si l’eau est reconstituée) et caractéristiques (concentration d’oxygène, pH, conductivité, dureté, etc. au début de l’essai), — profondeur du sédiment et de l’eau sus-jacente, — volume de l’eau sus-jacente et de l’eau interstitielle; poids du sédiment humide avec et sans eau interstitielle, — récipients expérimentaux (matériau et dimension), — méthode de préparation des solutions mères et des concentrations expérimentales, — application de la substance d’essai: concentrations expérimentales utilisées, nombre d’expériences identiques et utilisation d’un solvant, le cas échéant, — conditions d’incubation: température, cycle et intensité de lumière, aération (fréquence et intensité), — informations détaillées sur la nourriture: type de nourriture, préparation, quantité et régime d’administration. Résultats: — concentrations d’essai nominales, concentrations d’essai mesurées et résultats de toutes les analyses conduites pour déterminer la concentration de la substance d’essai dans le récipient expérimental, — qualité de l’eau dans les récipients expérimentaux: pH, température, oxygène dissous, dureté et teneur en ammoniac, — remplacement de l’eau d’essai évaporée, le cas échéant, — nombre de moucherons mâles et femelles émergés par récipient et par jour, — nombre de larves non émergées sous la forme de moucherons par récipient, — poids sec individuel moyen des larves par récipient, et par stade larvaire, s’il y a lieu, — pourcentage d’émergence par expérience identique et par concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles), — vitesse de développement moyenne des moucherons totalement émergés par expérience identique et par concentration d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles), — estimation des effets toxiques observés, par exemple CEx (et intervalles de confiance associés), CSEO et/ou CMEO, et méthodes statistiques employées pour les déterminer, — analyse des résultats, y compris les répercussions sur les résultats d’un écart éventuel à la présente méthode d’essai. BIBLIOGRAPHIE: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environnement Canada (1997). 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A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Appendice 1 DÉFINITIONS Les définitions suivantes s’appliquent aux fins de la présente méthode d’essai: Le sédiment reconstitué, ou artificiel ou synthétique, désigne le mélange de matériaux utilisés pour reproduire au mieux les composants physiques d’un sédiment naturel. L’eau sus-jacente est l’eau recouvrant le sédiment dans le récipient d’essai. L’eau interstitielle, ou l’eau des pores, se réfère à l’eau qui occupe les vides laissés entre le sédiment et les particules de sol. L’eau chargée est l’eau d’essai à laquelle on a ajouté la substance d’essai. Une substance d’essai est toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d’essai. Appendice 2 Recommandations pour la culture de Chironomus riparius 1. Les larves de Chironomus peuvent être élevées dans des cristallisoirs ou de grands récipients. Du sable quartzique fin est déposé en couche mince (environ 5 à 10 mm d’épaisseur) sur le fond du récipient. Le Kieselguhr (par exemple l’art. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une couche encore plus mince de quelques millimètres à peine suffit). Une eau de qualité appropriée, profonde de plusieurs centimètres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas d’évaporation, le niveau d’eau doit toujours être ramené à sa hauteur initiale, afin de prévenir toute dessiccation. L’eau peut être remplacée, si nécessaire. Une légère aération est fournie. Les récipients d’él