FR Journal officiel de l’Union européenne L 220/1

RÈGLEMENT (CE) N o761/2009 DE LA COMMISSION

du 23 juillet 2009

modifiant, aux fins de son adaptation au progrès technique, le règlement (CE) no 440/2008 établissant des méthodes d'essai conformément au règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH)

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu le règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil du 18 décembre 2006 concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le règlement (CEE) no 793/93 du Conseil et le règlement (CE) no 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE (1) de la Commission, et notamment son article 13, paragraphe 3,

considérant ce qui suit:

(1) Le règlement (CE) no 440/2008 de la Commission (2) définit les méthodes d'essai à appliquer pour déterminer les propriétés physico-chimiques ainsi que la toxicité et l'écotoxicité des substances, aux fins du règlement (CE) no 1907/2006.

(2) Il convient de mettre à jour le règlement (CE) no 440/2008 afin de tenir compte des modifications apportées à certaines méthodes d'essai et d'intégrer plusieurs nouvelles méthodes d'essai adoptées par l'OCDE. Les parties concernées ont été consultées sur la présente proposition. Les modifications proposées adaptent les méthodes en question au progrès scientifique et technique.

(3) Il y a lieu de réviser les dispositions concernant la pression de vapeur afin d'inclure la nouvelle méthode par effusion dans le règlement.

(4) Il est nécessaire d'ajouter une nouvelle méthode permettant de mesurer le diamètre moyen géométrique des fibres pondéré en fonction de leur longueur.

(5) Il convient de mettre à jour le règlement (CE) no 440/2008 pour y inclure en priorité une nouvelle méthode d'essai in vitro pour l'irritation cutanée, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins expérimentales, conformément à la directive 86/609/CEE du Conseil du 24 novembre 1986 concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives des États membres relatives à la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques (3). Bien qu'une méthode d'essai in vitro d'irritation cutanée soit encore en discussion à l'OCDE, il est nécessaire, dans ce cas exceptionnel, d'inclure la méthode B 46 dans le présent règlement. Il conviendra de mettre à jour la méthode B 46 dans les meilleurs délais lorsqu'un accord aura été trouvé au sein de l'OCDE ou lorsque de nouvelles informations justifiant une telle révision seront disponibles.

(6) Il y a lieu de réviser les dispositions concernant l'essai d'inhibition des algues, afin d'inclure des espèces supplémentaires et de satisfaire aux exigences en matière d'évaluation des dangers et de classification des substances chimiques.

(7) Il est nécessaire d'ajouter une nouvelle méthode pour mesurer la minéralisation aérobie dans les eaux superficielles par un essai de simulation de la biodégradation, ainsi qu'une nouvelle méthode d'évaluation de la toxicité pour le genre Lemna au moyen d'un essai d'inhibition de la croissance.

(8) Il convient dès lors de modifier le règlement (CE) no 440/2008 en conséquence.

(9) Les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l’avis du comité institué par l’article 133 du règlement (CE) no 1907/2006,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

L'annexe du règlement (CE) no 440/2008 est modifiée comme suit:

1) La partie A est modifiée comme suit: a) le chapitre A.4 est remplacé par le chapitre A.4 dont le texte figure à l'annexe I du présent règlement; b) le chapitre A.22, dont le texte figure à l'annexe II du présent règlement, est ajouté.

2) La partie B est modifiée comme suit: Le chapitre B.46, dont le texte figure à l'annexe III du présent règlement, est ajouté.

3) La partie C est modifiée comme suit: a) le chapitre C.3 est remplacé par le chapitre C.3 dont le texte figure à l'annexe IV du présent règlement; b) les chapitres C.25 et C.26, dont le texte figure aux annexes V et VI du présent règlement, sont ajoutés.

Article 2

Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l'Union européenne.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre. Fait à Bruxelles, le 23 juillet 2009. Par la Commission Stavros DIMAS Membre de la Commission

(1) JO L 396 du 30.12.2006, p. 1.

(2) JO L 142 du 31.5.2008, p. 1.

(3) JO L 358 du 18.12.1986, p. 1.

ANNEXE I A.4. PRESSION DE VAPEUR 1. MÉTHODE Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 104 (2004) de l'OCDE. 1.1. INTRODUCTION Cette version révisée de la méthode A.4(1) comprend une technique supplémentaire d’effusion par thermogravimétrie isotherme, conçue pour les substances à très faible pression de vapeur (jusqu’à 10–10 Pa). Compte tenu des besoins en méthodes, en particulier pour les substances à faible pression de vapeur, les autres protocoles de cette version sont réévalués en ce qui concerne les autres domaines d’application. À l'équilibre thermodynamique, la pression de vapeur d'une substance pure ne dépend que de la température. Les principes fondamentaux sont énoncés dans les références (2) et (3). Aucune méthode de mesure n'est applicable à toute la gamme de pressions de vapeur comprises entre moins de 10–10 Pa et 105 Pa. Le présent document présente huit méthodes applicables dans différentes gammes de pression de vapeur. Le tableau 1 compare ces différentes méthodes quant à leur application et à la gamme de mesure. Ces méthodes ne conviennent qu'aux substances qui ne se décomposent pas dans les conditions de l'essai. Il est également possible d'estimer la pression de vapeur lorsque les méthodes expérimentales ne peuvent être employées pour des raisons techniques; une méthode d'estimation est recommandée dans l’appendice. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La pression de vapeur d'une substance est définie comme la pression de saturation régnant au-dessus d'une substance solide ou liquide. L'unité SI de pression à utiliser est le pascal (Pa). Les anciennes unités de pression se convertissent comme suit: 1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosphère = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa L'unité SI de température est le kelvin (K). La conversion des degrés Celsius en kelvins obéit à la formule suivante: T = t + 273,15 où T est la température thermodynamique exprimée en kelvins et t représente la température en degrés Celsius. Tableau 1 Méthode de mesure Substances Répétabilité estimée Reproductibilité estimée Gamme recommandée Solide Liquide Méthode dynamique à bas point de fusion oui jusqu'à 25 % 1 à 5 % jusqu'à 25 % 1 à 5 % 103 Pa à 2. 103 Pa 2.103 Pa à 105 Pa Méthode statique oui oui 5 à 10 % 5 à 10 % 10 Pa à 105 Pa 10–2 Pa à 105 Pa (1) Méthode de l’isoténiscope oui oui 5 à 10 % 5 à 10 % 102 Pa à 105 Pa Méthode d'effusion: balance de pression de vapeur oui oui 5 à 20 % jusqu'à 50 % 10–3 à 1 Pa Méthode d'effusion: cellule de Knudsen oui oui 10 à 30 % — 10–10 à 1 P Méthode d'effusion: thermogravimétrie isotherme oui oui 5 à 30 % jusqu'à 50 % 10–10 à 1 Pa Méthode par saturation des gaz oui oui 10 à 30 % jusqu'à 50 % 10–10 à 103 Pa Méthode de la jauge à rotor oui oui 10 à 20 % — 10–4 à 0,5 Pa 1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI En général, la pression de vapeur est déterminée à différentes températures. À l'intérieur d'un intervalle de température limité, le logarithme de la pression de vapeur d'une substance pure est une fonction linéaire de l'inverse de la température thermodynamique, suivant la forme simplifiée de l'équation de Clapeyron-Clausius: où: p = pression de vapeur de la substance en pascals ΔHv = chaleur de vaporisation en J mol–1 R = constante molaire des gaz parfaits 8,314 J mol–1K–1 T = température exprimée en kelvins (K) 1.4. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire de recourir à des substances de référence. Elles servent surtout à vérifier la fiabilité d'une méthode de temps à autre et à comparer les résultats obtenus par différentes méthodes. 1.5. DESCRIPTION DES MÉTHODES 1.5.1. Méthode dynamique (méthode de Cottrell) 1.5.1.1. Principe La pression de vapeur est déterminée par la mesure de la température d'ébullition de la substance à différentes pressions prédéfinies, comprises approximativement entre 103 et 105 Pa. Cette méthode est aussi recommandée pour la détermination du point d'ébullition et peut être utilisée à cette fin jusqu'à 600 K. En raison de la pression hydrostatique de la colonne de liquide, les températures d'ébullition des liquides sont environ 0,1 °C plus élevées à une profondeur de 3 à 4 cm qu'à la surface. Dans la méthode de Cottrell (4), le thermomètre est placé dans la vapeur située au-dessus de la surface du liquide et le dispositif de pompage est conçu pour que le liquide en ébullition mouille constamment le réservoir du thermomètre. Une fine couche de liquide en équilibre avec la vapeur à la pression atmosphérique recouvre le réservoir. Le thermomètre affiche donc le point d'ébullition réel, sans être affecté par la surchauffe ou la pression hydrostatique. La pompe employée à l'origine par Cottrell est représentée à la figure 1. Le tube A contient le liquide en ébullition. Un fil de platine B scellé au fond favorise l'uniformité de l'ébullition. Le tube latéral C est relié à un condenseur, et l'enveloppe D empêche le condensat froid d'atteindre le thermomètre E. Lorsque le liquide présent dans le tube A bout, des bulles et du liquide captés par l'entonnoir sont envoyés sur le réservoir du thermomètre par les deux branches de la pompe F. Figure 1 Figure 2 Pompe de Cottrell (4) A: thermocouple B: volume vide tampon C: jauge de pression D: vide E: point de mesure F: élément chauffant (puissance environ 150 W) 1.5.1.2. Appareillage Un appareil de grande précision, faisant appel au principe de Cottrell, est schématisé à la figure 2. Il se compose d'un tube dont la partie inférieure est dévolue à l'ébullition, équipé d'un réfrigérant dans sa partie médiane, ainsi que d'un orifice d'évacuation et d'un joint plat rodé dans sa partie supérieure. La pompe de Cottrell est montée dans la partie où siège l'ébullition, partie chauffée par une cartouche électrique. La température est mesurée au moyen d'un thermocouple à enveloppe ou d'un thermomètre à résistance, introduits dans le joint plat situé dans la partie supérieure. L'orifice d'évacuation est relié au système de régulation de la pression. Ce dernier se compose d'une pompe à vide, d'un volume tampon, d'un manostat qui régule la pression en modulant l'arrivée d'azote et d'un manomètre. 1.5.1.3. Mode opératoire La substance est introduite dans la partie où a lieu l'ébullition. Les solides non pulvérulents peuvent poser des problèmes qui sont parfois résolus en chauffant la gaine de refroidissement. L'appareil est fermé avec le joint plat et la substance est dégazée. Cette méthode ne convient pas aux substances moussantes. La plus basse des pressions souhaitées est alors établie et le chauffage est mis en marche; au même moment, le capteur de température est connecté à un enregistreur. L'équilibre est atteint lorsque la température d'ébullition enregistrée demeure constante à pression constante. Il faut prendre particulièrement soin d'éviter les soubresauts pendant l'ébullition. En outre, la condensation sur le réfrigérant doit être complète. Lorsqu'on détermine la pression de vapeur de solides à bas point de fusion, il faut veiller à ce que le condenseur ne s'obstrue pas. Ce point d'équilibre étant enregistré, on règle la pression sur une valeur plus élevée. Le processus se poursuit de la même manière jusqu'à ce qu'une pression de 105 Pa soit atteinte (environ 5 à 10 points de mesure au total). Les mesures seront répétées, à titre de vérification, avec des pressions décroissantes. 1.5.2. Méthode statique 1.5.2.1. Principe Dans la méthode statique (5), la pression de vapeur à l'équilibre thermodynamique est déterminée à une température spécifiée. Cette méthode convient pour des substances et des mélanges liquides ou solides, dans la gamme comprise entre 10–1 et 105 Pa et, avec certaines précautions, dans la gamme de 1 à 10 Pa. 1.5.2.2. Appareillage Le dispositif comporte un bain à température constante (précision de ±0,2 K), un récipient pour l'échantillon relié à une ligne de vide, un manomètre et un système de régulation de la pression. Le récipient contenant l'échantillon (figure 3a) est connecté à la ligne de vide par l'intermédiaire d'un robinet et d'un manomètre différentiel (tube en U rempli d'un liquide manométrique approprié) qui sert à indiquer le zéro. Comme liquide manométrique, on utilise du mercure, des silicones et des phtalates, suivant la gamme de pression et le comportement chimique de la substance d’essai. Toutefois, l'utilisation du mercure est à éviter autant que possible pour ne pas nuire à l'environnement. La substance d’essai ne doit pas réagir avec le fluide du tube en U ni s'y dissoudre notablement. Le tube en U peut être remplacé par une jauge de pression (figure 3b). Pour le manomètre, le mercure peut être utilisé dans la gamme comprise entre la pression normale et 102 Pa, tandis que les huiles de silicone et les phtalates conviennent aux pressions inférieures à 102 Pa et jusqu'à 10 Pa. D'autres jauges de pression sont utilisables en dessous de 102 Pa, et les manomètres à membrane chauffable peuvent même être employés en dessous de 10–1 Pa. La température est mesurée sur la paroi extérieure du récipient contenant l'échantillon ou dans le récipient lui-même. 1.5.2.3. Mode opératoire Le tube en U de l'appareil décrit à la figure 3a est rempli avec le liquide choisi, qui doit être dégazé à haute température avant que les mesures soient commencées. La substance d’essai est introduite dans l'appareil et dégazée à température réduite. Dans le cas d'un échantillon à plusieurs composants, la température doit être suffisamment basse pour ne pas altérer la composition du mélange. Une agitation permettra d'atteindre l'équilibre plus rapidement. L'échantillon peut être refroidi avec de l'azote liquide ou de la neige carbonique, mais il convient d'éviter soigneusement la condensation de l'air ou du fluide de la pompe. On ouvre le robinet à vide au-dessus du récipient contenant l'échantillon afin de pratiquer une aspiration pendant plusieurs minutes pour éliminer l'air. Si nécessaire, le dégazage est répété plusieurs fois. Figure 3a Figure 3b Lorsque l'échantillon est chauffé avec le robinet à vide fermé, la pression de vapeur augmente, ce qui modifie l'équilibre du fluide dans le tube en U. On compense ce changement en injectant de l'azote ou de l'air dans l'appareil jusqu'à ce que le manomètre différentiel indique à nouveau zéro. La pression requise à cet effet peut être lue sur le manomètre ou déterminée à l'aide d'un instrument plus précis. Cette pression correspond à la pression de vapeur de la substance à la température de la mesure. L'appareil représenté sur la figure 3b permet une lecture directe de la pression de vapeur. La pression de vapeur est déterminée à des intervalles de température rapprochés et judicieusement choisis (environ 5 à 10 points de mesure au total), jusqu'à la température maximale désirée. Les mesures effectuées aux basses températures doivent être répétées à titre de vérification. Si les valeurs des mesures répétées ne coïncident pas avec la courbe obtenue en augmentant la température, cela peut traduire l'un des cas de figure suivants: i) l'échantillon renferme encore de l'air (dans le cas de substances très visqueuses, par exemple) ou des substances à bas point d'ébullition qui sont libérées durant le chauffage; ii) la substance subit une réaction chimique dans l'intervalle de température étudié (décomposition, polymérisation, par exemple). 1.5.3. Méthode de l’isoténiscope 1.5.3.1. Principe L'isoténiscope (6) est fondé sur le principe de la méthode statique. Un échantillon est introduit dans une ampoule maintenue à température constante et reliée à un manomètre et à une pompe à vide. Les impuretés plus volatiles que la substance sont éliminées par dégazage à pression réduite. À des températures sélectionnées, la pression de vapeur de l'échantillon est équilibrée par la pression connue d'un gaz inerte. L'isoténiscope a été conçu pour mesurer la pression de vapeur de certains hydrocarbures liquides, mais il se prête aussi à l'étude des solides. En général, cette méthode ne convient pas pour des systèmes à plusieurs composants. Les résultats ne sont affectés que par de légères erreurs lorsque l'échantillon renferme des impuretés non volatiles. La gamme recommandée s'étend de 102 à 105 Pa. 1.5.3.2. Appareillage Un exemple de dispositif de mesure est donné à la figure 4. Pour la description complète, voir la norme ASTM D 2879-86 (6). 1.5.3.3. Mode opératoire Dans le cas des liquides, la substance elle-même sert de fluide de remplissage dans le manomètre différentiel. Une quantité de liquide, suffisante pour remplir l'ampoule et la branche courte du manomètre, est introduite dans l'isoténiscope. Ce dernier est relié au système de vide, mis sous vide puis rempli d'azote. L'évacuation et la purge du système sont répétées deux fois pour chasser l'oxygène résiduel. L'isoténiscope rempli est placé en position horizontale pour permettre à l'échantillon de s'étendre en fine couche dans l'ampoule destinée à le contenir et dans le manomètre. La pression du système est réduite à 133 Pa et l'échantillon est chauffé doucement jusqu'à ce qu'il entre en ébullition (élimination des gaz dissous). La position de l'isoténiscope est ensuite modifiée de façon que l'échantillon retourne dans l'ampoule et remplisse la branche courte du manomètre. La pression est maintenue à 133 Pa. La pointe de l'ampoule à échantillon est chauffée par une petite flamme jusqu'à ce que la vapeur dégagée par l'échantillon prenne une extension suffisante pour déplacer une partie de l'échantillon de la partie supérieure de l'ampoule et de la branche courte du manomètre vers le manomètre, créant ainsi un espace dépourvu d'azote et rempli de vapeur. L'isoténiscope est ensuite placé dans un bain thermostaté, et la pression de l'azote est ajustée de manière à égaler celle de l'échantillon. À l'équilibre, la pression de l'azote et la pression de vapeur de la substance ont la même valeur. Figure 4 Dans le cas des solides, et suivant la gamme de pression et de température, des liquides manométriques tels que des huiles de silicone ou des phtalates sont utilisés. Le liquide manométrique dégazé est introduit dans un renflement situé sur la branche longue de l'isoténiscope. Un échantillon du solide est alors déposé dans l'ampoule et subit un dégazage à température élevée. Après cela, l'isoténiscope est incliné, afin que le liquide manométrique puisse couler dans le tube en U. 1.5.4. Méthode d'effusion: balance de pression de vapeur (7) 1.5.4.1. Principe Un échantillon de la substance d’essai est chauffé dans un petit fourneau, placé sous une cloche sous vide. Le fourneau est doté d'un couvercle percé de petits trous de diamètre connu. La vapeur de la substance, qui s'échappe par l'un des trous, est dirigée vers le plateau d'une balance très sensible qui se trouve également dans la cloche sous vide. Sur certains modèles d'appareil, le plateau de la balance est entouré par une enceinte de réfrigération, qui dissipe la chaleur vers l'extérieur par conduction thermique; la vapeur sortante se condense sur le plateau ainsi refroidi par radiation. L'impulsion du jet de vapeur exerce une force sur la balance. Il est possible de déterminer la pression de vapeur de deux manières: directement à partir de la force exercée sur le plateau de la balance ou à partir de la vitesse d'évaporation en utilisant l'équation de Herz-Knudsen (2): où: G = vitesse d'évaporation (kg s–1 m–2) M = masse molaire (g mol–1) T = température (K) R = constante molaire des gaz parfaits (J mol–1 K–1) p = pression de vapeur (Pa) La gamme de mesure recommandée est comprise entre 10–3 et 1 Pa. 1.5.4.2. Appareillage Le principe général de l'appareil est illustré à la figure 5. Figure 5 A. Socle F. Enceinte de réfrigération et barre de refroidissement B. Instrument à bobine mobile G. Fourneau d'évaporation C. Cloche à vide H. Vase de Dewar contenant de l'azote liquide D. Balance avec plateau I. Mesure de la température de l'échantillon E. Instrument de mesure du vide J. Substance d'essai 1.5.5. Méthode d'effusion: cellule de Knudsen 1.5.5.1. Principe La méthode repose sur l'estimation de la masse de substance d’essai qui jaillit sous forme de vapeur par un micro-orifice d'une cellule de Knudsen (8) sous un vide très poussé, par unité de temps. La masse de vapeur dégagée par effusion s'obtient soit en déterminant la perte de masse de la cellule, soit en condensant la vapeur à basse température et en mesurant la quantité de substance volatilisée par chromatographie. La pression de vapeur se calcule par l'équation de Hertz-Knudsen (voir paragraphe 1.5.4.1) avec des facteurs de correction qui dépendent des paramètres de l'appareil (9). La gamme de pressions recommandée est comprise entre 10–10 et 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Appareillage Le principe général de l'appareil est illustré à la figure 6. Figure 6 1: Vers la pompe à vide 7: Couvercle fileté 2: Puits pour le thermomètre à résistance de platine ou le système de mesure et de régulation de la température 8: Écrous papillon 3: Couvercle de la chambre à vide 9: Boulons 4: Joint torique 10: Cellules à effusion en acier inoxydable 5: Chambre à vide en aluminium 11: Cartouches chauffantes 6: Dispositif permettant d'installer et d'ôter les cellules à effusion 1.5.6. Méthode d'effusion: thermogravimétrie isotherme 1.5.6.1. Principe La méthode repose sur la détermination thermogravimétrique (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20), à hautes températures et à pression ambiante, de vitesses d'évaporation accélérée de la substance d'essai. Les vitesses d'évaporation vT s'obtiennent en exposant la substance sélectionnée à l’atmosphère d’un gaz inerte s'écoulant lentement et en mesurant en continu la perte de poids à des températures isothermes T définies, exprimées en kelvins, durant des périodes de temps appropriées. Les pressions de vapeur pT sont déduites des valeurs vT à l'aide de la relation linéaire entre le logarithme de la pression de vapeur et le logarithme de la vitesse d'évaporation. Si nécessaire, les valeurs correspondant aux températures de 20 et 25 °C peuvent être extrapolées par la régression du log pT en fonction de 1/T. Cette méthode convient aux substances ayant des pressions de vapeur aussi faibles que 10–10 Pa (10–12 mbar) et offrant un degré de pureté aussi proche que possible de 100 %, de manière à ne pas fausser l'interprétation des pertes de poids mesurées. 1.5.6.2. Appareillage Le principe général du montage expérimental est schématisé à la figure 7. Figure 7 La plaque portant l'échantillon, suspendue à une microbalance et placée dans une enceinte thermostatée, est exposée à un flux d'azote sec qui emporte les molécules vaporisées de la substance d'essai. Au sortir de l'enceinte, le flux gazeux est purifié dans une unité de sorption. 1.5.6.3. Mode opératoire La substance d'essai est étalée en une couche homogène sur la surface d'une plaque de verre dépoli. S'il s'agit d'un solide, la plaque est mouillée uniformément par une solution de la substance dans un solvant approprié et séchée sous atmosphère inerte. Pour les mesures, la plaque enduite est suspendue dans l'analyseur thermogravimétrique et sa perte de poids est ensuite mesurée en continu en fonction du temps. La vitesse d'évaporation vT à une température définie se calcule d'après la perte de poids Δm de la plaque portant l'échantillon selon la formule: où F représente la superficie recouverte de substance d'essai, normalement la superficie de la plaque portant l'échantillon, et t est le temps écoulé durant la perte de poids Δm. La pression de vapeur pT est calculée en fonction de la vitesse d'évaporation vT: Log pT = C + D log vT où C et D sont des constantes propres au dispositif expérimental employé, qui dépendent du diamètre de l'enceinte de mesure et du débit du gaz. Ces constantes sont à déterminer une fois par la mesure d'une série de substances dont la pression de vapeur est connue et par la régression du log pT en fonction de log vT (11)(21)(22). La relation entre la pression de vapeur pT et la température T en kelvins est décrite ci-dessous: Log pT = A + B · 1/T où A et B représentent des constantes obtenues par la régression du log pT en fonction de 1/T. Avec cette équation, la pression de vapeur peut être calculée par extrapolation pour n'importe quelle autre température. 1.5.7. Méthode par saturation de gaz (23) 1.5.7.1. Principe Un gaz inerte est envoyé à température ambiante et à un débit connu, à travers ou sur un échantillon de la substance d’essai, suffisamment lentement pour qu'il devienne saturé de vapeur. Il est extrêmement important de parvenir à la saturation de la phase gazeuse. La substance transportée est recueillie, généralement à l'aide d'un adsorbant, et sa quantité est déterminée. Au lieu de recueillir la vapeur pour une analyse ultérieure, il est possible de mesurer directement la quantité de substance transportée par des techniques analytiques, telles que la chromatographie en phase gazeuse. La pression de vapeur est calculée en supposant que la loi des gaz parfaits est respectée et que la pression totale d'un mélange de gaz est égale à la somme des pressions des gaz qui le composent. La pression partielle de la substance d'essai, autrement dit sa pression de vapeur, est calculée à partir du volume total connu du gaz et du poids de la substance transportée. La méthode par saturation de gaz est applicable aux substances solides ou liquides. Cette méthode peut être utilisée jusqu'à des pressions de vapeur de 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14); elle est surtout fiable pour des pressions de vapeur inférieures à 103 Pa. Au-dessus de 103 Pa, les pressions de vapeur sont généralement surestimées, probablement à cause de la formation d'aérosols. Comme la pression de vapeur est mesurée à température ambiante, il n'est pas nécessaire d'extrapoler les résultats à partir de mesures réalisées à hautes températures et l'on évite de ce fait les erreurs grossières fréquemment associées à ce type d'extrapolation. 1.5.7.2. Appareillage Cette méthode requiert une enceinte thermostatée. Le schéma de la figure 8 montre une enceinte comportant trois supports à échantillons solides et trois supports à échantillons liquides, qui permettent de réaliser, en trois exemplaires, l'analyse d'une substance solide ou liquide. La température est réglée avec une précision d'au moins 0,5 °C. Figure 8 L'azote convient dans la plupart des cas comme gaz porteur inerte, mais d'autres gaz doivent parfois être utilisés (24). Le gaz porteur doit être sec. Le courant gazeux est divisé en six courants, qui sont régulés par des vannes à pointeau (orifice d'environ 0,79 mm), et pénètre dans l'enceinte par des tubes en cuivre de 3,8 mm de diamètre intérieur. Une fois l'équilibre thermique atteint, le gaz passe à travers l'échantillon, puis sur l'adsorbant, et enfin sort de l'enceinte. Les échantillons solides sont disposés dans des tubes en verre de 5 mm de diamètre intérieur, entre deux tampons de laine de verre (voir figure 9). La figure 10 montre un support à échantillon liquide et un système adsorbant. La méthode la plus reproductible pour mesurer la pression de vapeur des liquides consiste à remplir le support de perles de verre ou d’un adsorbant inerte tel que de la silice, que l’on recouvre de liquide. Une autre possibilité consiste à faire barboter le gaz porteur dans une colonne de la substance d’essai liquide à l'aide d'un verre fritté. Figure 9 Figure 10 Le système adsorbant se compose d'une section avant et d'une section arrière. À de très faibles pressions de vapeur, l'adsorbant ne retient que de petites quantités, et l'adsorption sur la laine de verre et sur le tube en verre, entre l'échantillon et l'adsorbant, peut représenter un sérieux problème. Des pièges refroidis au CO2 solide permettent aussi de recueillir efficacement la substance vaporisée. Ils n'affectent pas la perte de charge dans la colonne de saturation; de plus, il est facile d'isoler quantitativement la substance recueillie. 1.5.7.3. Mode opératoire Le débit du gaz porteur sortant est mesuré à température ambiante. Pour s’assurer de la valeur exacte du volume total du gaz porteur, on vérifie fréquemment le débit au cours de l’expérience. Il est préférable de pratiquer un contrôle continu au moyen d’un débitmètre massique. La saturation de la phase gazeuse peut exiger un temps de contact considérable et, partant, des débits gazeux assez faibles (25). À l’issue de l’expérience, les deux sections du système adsorbant, avant et arrière, sont analysées séparément. La substance retenue dans chaque section est désorbée par ajout d'un solvant. On analyse quantitativement les solutions ainsi obtenues afin de déterminer le poids de la substance désorbée dans chaque section. Le choix de la méthode analytique (ainsi que de l'adsorbant et du solvant désorbant) est dicté par la nature de la substance d’essai. On mesure l'efficacité de la désorption en fixant une quantité connue de la substance d’essai sur l'adsorbant, puis en la désorbant et en déterminant la quantité recueillie. Il importe de tester l'efficacité de la désorption en utilisant des concentrations proches de, ou égales à, celle de l’échantillon dans les conditions de l'essai. Afin d'assurer la saturation du gaz porteur avec la substance d’essai, trois débits gazeux différents sont utilisés. Si la pression de vapeur calculée est indépendante du débit, on considère que le gaz est saturé. La pression de vapeur est calculée d'après l'équation suivante: où: p = pression de vapeur (Pa) W = masse de substance d'essai évaporée (g) V = volume de gaz saturé (m3) R = constante molaire des gaz parfaits (8,314 J mol–1 K–1) T = température (K) M = masse molaire de la substance d’essai (g mol–1) Les volumes mesurés doivent être corrigés pour tenir compte des différences de pression et de température entre le débitmètre et le saturateur. 1.5.8. Méthode de la jauge à rotor 1.5.8.1. Principe Cette méthode fait appel à une jauge de viscosité à rotor dans laquelle l'élément de mesure est une petite bille d'acier suspendue dans un champ magnétique et maintenue en rotation par des champs tournants (26)(27)(28). Des bobines capteuses permettent de mesurer sa vitesse de rotation. Lorsque la bille a atteint une vitesse de rotation donnée, généralement proche de 400 tours par seconde, on cesse de lui fournir de l'énergie et la friction du gaz provoque sa décélération. La diminution de la vitesse de rotation est mesurée en fonction du temps. La pression de vapeur est déduite du ralentissement de la bille d'acier, fonction de la pression. La gamme de mesure recommandée est comprise entre 10–4 et 0,5 Pa. 1.5.8.2. Appareillage La figure 11 schématise le dispositif expérimental. La tête de mesure est placée dans une enceinte thermostatée à ± 0,1 °C près. La cellule contenant l'échantillon est placée dans une enceinte séparée, également thermostatée avec une précision de 0,1 °C. Toutes les autres parties du dispositif sont maintenues à une température plus élevée afin d'éviter la condensation. L'ensemble du système est relié à un système de vide poussé. Figure 11 2. RÉSULTATS ET RAPPORT 2.1. RÉSULTATS Quelle que soit la méthode choisie, la pression de vapeur doit être déterminée à au moins deux températures. Dans le domaine compris entre 0 et 50 °C, il est préférable d'effectuer des mesures à au moins trois températures, en vue de vérifier la linéarité de la courbe de pression de vapeur. Dans le cas de la méthode d'effusion (cellule de Knudsen et thermogravimétrie isotherme) et de la méthode par saturation de gaz, il est recommandé un intervalle de températures des mesures compris entre 120 et 150 °C, au lieu de 0 à 50 °C. 2.2. RAPPORT D’ESSAI Le rapport d'essai doit comprendre les informations suivantes: — méthode utilisée, — caractéristiques précises de la substance (identité et impuretés) et étape préliminaire de purification, le cas échéant, — pressions de vapeur mesurées à au moins deux températures, et de préférence à au moins trois températures, dans la gamme comprise entre 0 et 50 °C (ou 120 et 150 °C), — dont au moins une est inférieure ou égale à 25 °C, pour autant que la méthode choisie le permette d’un point de vue technique, — toutes les données brutes, — courbe de log p en fonction de 1/T, — estimation de la pression de vapeur à 20 °C ou à 25 °C. Si une transition est observée (changement d'état, décomposition), il y a lieu de noter les informations suivantes: — nature du changement, — température à laquelle se produit le changement à pression atmosphérique, — pression de vapeur à 10 et 20 °C en dessous de la température de la transition et à 10 et 20 °C au-dessus de cette température (sauf s'il s'agit une transition de l'état solide à l'état gazeux). Toutes les informations et remarques utiles à l'interprétation des résultats doivent être rapportées, en particulier celles qui concernent les impuretés et l'état physique de la substance. 3. BIBLIOGRAPHIE 1) Journal Officiel des Communautés européennes L 383 A (1992) 26-47. 2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. 5) NF T 20-048 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10–1 à 105 Pa — méthode statique. 6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. 7) NF T 20-047 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10–3 à 1 Pa — méthode de la balance de pression de vapeur. 8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. 10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532. 11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000) 12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28 13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269-278. 14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122. 15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. 16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400. 17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168. 18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31. 19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. 20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512-20. 21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. 22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002) 23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC 24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. 28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Lorsqu'on utilise un manomètre à capacitance. Appendice Méthode d'estimation INTRODUCTION Les valeurs estimées de la pression de vapeur peuvent être utilisées pour: — choisir la méthode expérimentale appropriée, — fournir une estimation ou une valeur limite lorsque la méthode expérimentale n'est pas applicable pour des raisons techniques. MÉTHODE D'ESTIMATION La pression de vapeur des liquides et des solides peut être estimée à l'aide de la corrélation modifiée de Watson (a). La seule donnée expérimentale requise est le point d'ébullition normal. Cette méthode est applicable entre 105 et 10–5 Pa. Le «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (b) contient des informations détaillées sur cette méthode. Voir aussi «OECD Environmental Monograph No.67» (c). PROCÉDURE DE CALCUL La pression de vapeur se calcule de la façon suivante: où: T = température choisie Tb = point d'ébullition normal Pvp = pression de vapeur à la température T ΔHvb = la chaleur de vaporisation ΔZb = coefficient de compressibilité (estimé à 0,97) m = facteur empirique qui dépend de l'état physique à la température choisie De plus, où KF est un facteur empirique tenant compte de la polarité de la substance Les facteurs KF de plusieurs types de substances sont énumérés dans la référence (b). Souvent, les données disponibles mentionnent un point d'ébullition à pression réduite. Dans ce cas, la pression de vapeur se calcule de la façon suivante: où T1 représente le point d'ébullition à la pression réduite P1. RAPPORT Si l'on utilise la méthode d'estimation, le calcul doit être accompagné d'une documentation détaillée. BIBLIOGRAPHIE a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

ANNEXE II A.22. DIAMÈTRE MOYEN GÉOMÉTRIQUE PONDÉRÉ PAR LA LONGUEUR DES FIBRES 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION La présente méthode décrit une procédure permettant de mesurer le diamètre moyen géométrique pondéré par la longueur (LWGMD) de fibres minérales artificielles (FMA) en vrac. Dans la mesure où le LWGMD de la population a une probabilité de 95 % d'être compris dans les limites de confiance à 95 % (LWGMD ± deux erreurs types) de l'échantillon, la valeur rapportée (valeur d'essai) sera la limite de confiance inférieure à 95 % de l'échantillon (c'est-à-dire LWGMD — deux erreurs types). Cette méthode repose sur une mise à jour (juin 1994) d'une ébauche de procédure industrielle du HSE approuvée lors d'une réunion entre l'ECFIA et le HSE, à Chester, le 26 septembre 1993, et développée aux fins et sur la base d'un deuxième essai interlaboratoire (1, 2). Cette méthode de mesure peut être utilisée pour caractériser le diamètre des fibres de substances ou de produits en vrac contenant des FMA, et notamment des fibres céramiques réfractaires (FCR), des fibres vitreuses artificielles (FVA) et des fibres cristallines et polycristallines. La pondération par la longueur permet de compenser les répercussions sur la distribution du diamètre de la cassure des fibres longues lors de l'échantillonnage ou de la manipulation du matériau. Des statistiques géométriques (moyenne géométrique) sont utilisées pour mesurer la distribution des diamètres des FMA dans la mesure où cette distribution est en général proche de la loi log-normale. La mesure de la longueur et du diamètre est une opération à la fois fastidieuse et longue, mais si seules les fibres en contact avec une ligne infiniment mince du champ de vision d'un MEB sont mesurées, la probabilité de sélectionner une fibre donnée est proportionnelle à sa longueur. Comme cette méthode tient compte de la longueur dans les calculs de pondération par la longueur, la seule mesure requise est le diamètre et le LWGMD-2ET peut être calculé comme décrit. 1.2. DÉFINITIONS Particule: objet dont le rapport longueur/largeur est inférieur à 3:1. Fibre: objet dont le rapport longueur/largeur (rapport d'aspect) est d'au moins 3:1. 1.3. PORTÉE ET LIMITATIONS Cette méthode est conçue pour examiner la distribution des diamètres ayant un diamètre moyen compris entre 0,5 μm et 6 μm. Les diamètres supérieurs peuvent être mesurés à l'aide d'un grossissement inférieur du BEM, mais cette méthode est de plus en plus limitée à mesure que les distributions de fibres deviennent plus fines. Il est dès lors conseillé d'effectuer les mesures avec un microscope électronique à transmission (MET) si le diamètre moyen est inférieur à 0,5 μm. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Un certain nombre d'échantillons représentatifs sont prélevés sur un tissu en fibres ou dans un rembourrage en vrac. La longueur des fibres en vrac est réduite par pressage, puis un sous-échantillon représentatif est dispersé dans de l'eau. Des aliquotes sont extraites et filtrées à l'aide d'un filtre en polycarbonate à pores de 0,2 μm, avant d'être préparées pour l'examen à l'aide de techniques de microscopie électronique à balayage (MEB). Les diamètres des fibres sont mesurés grâce à un grossissement de l'écran de × 10 000 ou plus (1) à l'aide d'un échantillonnage linéaire, de manière à obtenir une estimation impartiale du diamètre moyen. L'intervalle de confiance inférieur à 95 % (sur la base d'un test unilatéral) est calculé afin d'obtenir une estimation de la valeur minimale du diamètre moyen géométrique des fibres du matériau. 1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.5.1. Sécurité/Précautions Il conviendra de réduire au minimum l'exposition aux fibres en suspension dans l'atmosphère, ainsi que d'utiliser une hotte ou une boîte à gants lors de la manipulation des fibres. Des contrôles périodiques de l'exposition du personnel seront réalisés afin de déterminer l'efficacité des méthodes de contrôle. Lors de la manipulation des FMA, le personnel portera des gants jetables afin de réduire les risques d'irritation cutanée et d'éviter toute contamination croisée. 1.5.2. Appareillage/Équipement — Presses et matrices (capables de produire 10 MPa). — Filtres en polycarbonate à pores capillaires de 0,2 μm (25 mm de diamètre). — Filtre membrane en ester de cellulose à pores de 5 μm destiné à être utilisé comme filtre secondaire. — Appareil de filtration en verre (ou systèmes de filtration jetables) conçus pour accueillir des filtres de 25 mm de diamètre (par exemple, kit de microanalyse en verre Millipore, type no XX10 025 00). — Eau fraîchement distillée et filtrée au travers d'un filtre à pores de 0,2 μm pour éliminer les micro-organismes. — Pulvérisateur cathodique avec cible en or ou or/palladium. — Microscope électronique à balayage avec une résolution pouvant descendre jusqu'à 10 nm et un grossissement × 10 000. — Divers: spatules, lame de scalpel de type 24, petites pinces, tubes MEB, colle carbone ou papier adhésif carbone, argent colloïdal. — Sonde ultrasonore ou bain d'ultrasons de laboratoire — Sonde ou perce-bouchon pour prélever des échantillons dans le tissu de FMA 1.5.3. Procédure d'essai 1.5.3.1. Échantillonnage Pour les tissus et les bains, une sonde ou un perce-bouchon de 25 mm est utilisé pour prélever des échantillons de la coupe transversale. Les prélèvements doivent être effectués à des intervalles identiques sur toute la largeur d'une petite longueur de tissu ou être recueillis dans des zones aléatoires si de grandes longueurs sont disponibles. Le même équipement peut être utilisé pour extraire des échantillons aléatoires dans du rembourrage. Chaque fois que possible, six échantillons seront prélevés de manière à refléter les variations spatiales dans le matériau en vrac. Les six échantillons doivent être pressés dans une matrice de 50 mm de diamètre à 10 MPa. Le matériau est ensuite mélangé à l'aide d'une spatule et pressé à nouveau à 10 MPa. Le matériau est ensuite retiré de la matrice et conservé dans une bouteille en verre hermétiquement fermée. 1.5.3.2. Préparation de l'échantillon Si nécessaire, les liants organiques peuvent être éliminés en plaçant la fibre à l'intérieur d'un four à 450 °C pendant environ une heure. Utilisez des cônes pour la délimitation et coupez des quarts pour subdiviser l'échantillon (cette opération doit être réalisée à l'intérieur d'une enceinte à poussières). Avec une spatule, ajoutez une petite quantité (< 0,5 g) d'échantillon à 100 ml d'eau fraîchement distillée et filtrée à l'aide d'un filtre membrane de 0,2 μm (d'autres sources d'eau ultrapure peuvent être utilisées à condition qu'elles soient de qualité satisfaisante). Dispersez soigneusement à l'aide d'une sonde ultrasonore fonctionnant à 100 W et réglée pour produire une cavitation (si vous ne disposez pas de sonde, utilisez la méthode suivante: agitez à plusieurs reprises et retournez pendant 30 secondes; envoyez des ultrasons dans un bain d'ultrasons de laboratoire pendant cinq minutes: puis agitez à nouveau à plusieurs reprises et retournez pendant 30 secondes supplémentaires). Directement après la dispersion de la fibre, retirez un certain nombre d'aliquotes (par exemple, trois aliquotes de 3, 6 et 10 ml) à l'aide d'une pipette à goulot large (capacité de 2-5 ml). Filtrez sous vide chaque aliquote au travers d'un filtre en polycarbonate de 0,2 μm soutenu par un filtre secondaire MEC à pores de 5 µm, en utilisant un entonnoir de filtration en verre de 25 mm avec un réservoir cylindrique. Placez environ 5 ml d'eau distillée filtrée dans l'entonnoir et pipetez lentement l'aliquote dans l'eau en tenant l'embout de la pipette sous le ménisque. La pipette et le réservoir doivent être soigneusement nettoyés après le pipetage dans la mesure où les fibres minces ont tendance à se situer plus à la surface. Retirez le filtre en douceur et séparez-le du filtre secondaire avant de le placer dans un récipient pour qu'il sèche. Coupez un quart ou une moitié de la section du dépôt filtré avec une lame de scalpel de type 24 par un mouvement d'oscillation. Fixez soigneusement la section coupée sur la plaque d'un MEB à l'aide d'adhésif ou de colle carbone. L'argent colloïdal doit être appliqué à au moins trois endroits afin d'améliorer le contact électrique sur les bords du filtre et de la plaque. Lorsque la colle/l'argent colloïdal est sec/sèche, pulvérisez cathodiquement environ 50 nm d'or ou d'or/palladium sur la surface du dépôt. 1.5.3.3. Étalonnage et fonctionnement du MEB 1.5.3.3.1. Étalonnage L'étalonnage du MEB doit être vérifié au moins une fois par semaine (idéalement une fois par jour) à l'aide d'une grille d'étalonnage certifiée. Les valeurs de l'étalonnage doivent être comparées à une norme certifiée, et si la valeur mesurée (MEB) se situe en dehors de la plage de ±2 % de la valeur certifiée, l'étalonnage du MEB doit être ajusté et une nouvelle fois vérifié. Le MEB doit offrir au minimum une résolution d'un diamètre minimal visible de 0,2 µm, en utilisant une matrice de prélèvement réelle et à un grossissement de × 2 000. 1.5.3.3.2. Fonctionnement Le MEB doit être utilisé à un grossissement de 10 000 (2) dans des conditions offrant une bonne résolution et une image acceptable à des vitesses de balayage réduites (par exemple, 5 secondes par trame). Bien que les conditions de fonctionnement de MEB différents puissent varier, il convient en général, pour obtenir les meilleures visibilité et résolution possibles avec des matériaux de poids atomique relativement faible, d'utiliser des tensions d'accélération de 5-10 keV avec une dimension du spot réduite et une petite distance de travail. Comme une traversée linéaire est réalisée, il convient d'utiliser une inclinaison de 0o pour réduire au minimum le recentrage ou, si le MEB a une phase eucentrique, d'utiliser la distance de travail eucentrique. Un grossissement inférieur peut être utilisé si le matériau ne contient pas de petites fibres et que les diamètres des fibres sont importants (> 5 μm). 1.5.3.4. Mesurage 1.5.3.4.1. Examen à faible grossissement pour analyse de l'échantillon Au départ, l'échantillon doit être examiné avec un faible grossissement afin de déterminer s'il y a agglutination des grandes fibres et pour déterminer la densité des fibres. En cas d'agglutination excessive, il est conseillé de préparer un nouvel échantillon. Pour garantir la fiabilité des statistiques, il convient de mesurer un nombre minimal de fibres. Une densité élevée des fibres est souhaitable dans la mesure où l'examen de champs vides prend du temps et n'apporte rien à l'analyse. Cependant, si le filtre est surchargé, il peut devenir difficile de mesurer toutes les fibres mesurables. En outre, dans la mesure où les petites fibres risquent d'être cachées par les grandes, elles sont susceptibles de ne pas être vues. Une densité supérieure des fibres de 150 fibres par millimètre de traversée linéaire peut entraîner une surestimation du LWGMD. D'un autre côté, les faibles concentrations de fibres augmentent le temps d'analyse. Il est en outre souvent plus intéressant du point de vue du coût de préparer un échantillon d'une densité proche de la valeur optimale que de persister à dénombrer des filtres à faible concentration. La densité de fibres optimale doit donner une moyenne d'environ une ou deux fibres dénombrables par champ de vision à un grossissement de 5 000. Cependant, dans la mesure où la densité optimale dépend de la taille (diamètre) des fibres, l'opérateur devra décider si la densité des fibres est proche ou non de la valeur optimale. 1.5.3.4.2. Pondération par la longueur du diamètre des fibres Seules les fibres qui touchent (ou traversent) une ligne (infiniment) mince tracée sur l'écran du MEB sont comptées. C'est la raison pour laquelle une ligne horizontale (ou verticale) est tracée en travers du centre de l'écran. Il est également possible de placer un point unique au centre de l'écran et de procéder à un balayage continu dans une seule direction à travers le filtre. Toute fibre dont le rapport d'aspect est supérieur à 3:1 et qui touche ou traverse ce point voit son diamètre mesuré et enregistré. 1.5.3.4.3. Mesure des fibres Il est recommandé de mesurer au moins 300 fibres. Chaque fibre est mesurée une seule fois, au point d'intersection avec la ligne ou le point tracé(e) sur l'image (ou à proximité du point d'intersection si les bords de la fibre sont cachés). Si des fibres présentant des coupes transversales non uniformes sont présentes, une mesure représentant le diamètre moyen de la fibre doit être utilisée. Le plus grand soin devra être accordé à la définition du bord et à la mesure de la distance la plus courte entre les bords des fibres. La mesure peut être effectuée en ligne ou hors ligne, sur des images ou des photos enregistrées. Il est recommandé d'utiliser des systèmes de mesure d'image semi-automatiques qui transfèrent directement les données dans une feuille de calcul, dans la mesure où ils permettent de gagner du temps, d'éviter les erreurs de transcription et d'automatiser les calculs. Les extrémités des grandes fibres doivent être vérifiées à un grossissement plus faible afin de s'assurer qu'elles ne reviennent pas dans le champ de vision où est effectué le mesurage et qu'elles ne sont mesurées qu'une seule fois. 2. DONNÉES 2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS En général, les diamètres des fibres n'ont pas une distribution normale. Il est cependant possible d'obtenir une distribution proche de la normale en effectuant une transformation log. Calculez la moyenne arithmétique (lnD moyenne) et l'écart-type (SDlnD) du log par rapport aux valeurs de base (lnD) des diamètres des fibres n (D). (1) (2) L'écart-type est divisé par la racine carrée du nombre de mesures (n) pour obtenir l'erreur type (ETlnD). (3) Soustrayez deux fois l'erreur type de la moyenne et calculez l'exponentielle de cette valeur (moyenne moins deux erreurs types) pour obtenir la moyenne géométrique moins deux erreurs types géométriques. (4) 3. RÉSULTATS PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra au minimum les informations suivantes: — la valeur de LWGMD-2ET, — toutes les déviations, en particulier celles qui risquent d'affecter la précision et la fiabilité des résultats, ainsi que les justifications correspondantes. 4. RÉFÉRENCES 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Cette valeur de grossissement est indiquée pour les fibres de 3 µm. Pour les fibres de 6 µm, un grossissement de × 5 000 peut s'avérer plus pertinent. (2) Pour les fibres de 3 μm, voir la note de bas de page précédente.

ANNEXE III B.46. IRRITATION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE D'ÉPIDERME HUMAIN RECONSTITUÉ 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION L'irritation cutanée désigne l'apparition de lésions réversibles de la peau après application d'une substance d'essai pendant une durée pouvant aller jusqu'à 4 heures [selon la définition du système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH)] (1). La présente méthode d'essai propose une procédure in vitro qui, en fonction des informations requises, peut permettre de déterminer le pouvoir d'irritation cutanée des substances et constituer un essai de substitution à part entière, dans le cadre d'une stratégie d'essai fondée sur la force probante des données (2). Traditionnellement, l’évaluation de l'irritation cutanée impliquait le recours à des animaux de laboratoire (voir méthode B.4) (3). En considération des préoccupations relatives au bien-être des animaux, la méthode B.4 permet de déterminer la corrosion/l'irritation cutanée au moyen d'une stratégie d'essai séquentielle faisant appel à des méthodes d'essai in vitro et ex vivo validées, afin d'éviter de faire souffrir des animaux. Trois méthodes ou lignes directrices d'essai in vitro validées [B.40, B 40 bis et TG 435 (4, 5, 6)] sont utiles pour le volet corrosivité de la stratégie d'essai séquentielle proposée par la méthode B.4. La présente méthode d'essai s'appuie sur des modèles d'épiderme humain reconstitué qui, par leur conception globale (utilisation de kératinocytes prélevés sur l'épiderme humain en tant que source; tissu et architecture cellulaire représentatifs) reproduisent fidèlement les propriétés biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine, c'est-à-dire l'épiderme. La procédure décrite dans la présente méthode d'essai permet de caractériser les substances irritantes correspondant à la catégorie de danger 2 selon le SGH des Nations unies. La présente méthode d'essai inclut également une série de normes de performance pour l'évaluation de méthodes d'essai similaires sur épiderme humain reconstitué ou de variantes de ces méthodes (7). Des études de prévalidation, d'optimisation et de validation ont été réalisées pour deux méthodes d'essai in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) disponibles dans le commerce — EpiSkinTM et EpiDermTM –, qui utilisent des modèles d'épiderme humain reconstitué. Ces références ont été fondées sur la phrase de risque R38. Certains aspects de recalcul aux fins du SGH sont abordés dans la référence 25. Les méthodes dont la performance est équivalente à celle d'EpiSkinTM (méthode de référence validée 1) sont recommandées en tant que méthodes d'essai de substitution à part entière pour remplacer l'essai in vivo sur le lapin aux fins de la classification en tant que substance irritante de catégorie 2 selon le SGH. Les méthodes de performance équivalente à celle d'EpiDermTM (méthode de référence validée 2) ne sont recommandées qu'en tant que méthodes d'essai de dépistage, ou dans le cadre d'une stratégie d'essai séquentielle fondée sur la force probante des données, aux fins de la classification en tant que substance irritante de catégorie 2 selon le SGH. Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode d'essai in vitro d'évaluation de l'irritation cutanée sur modèle d'épiderme humain reconstitué, il convient de déterminer la fiabilité, la précision et les limitations de cette méthode pour l'usage préconisé, de manière à s'assurer que ces caractéristiques sont comparables à celles de la méthode de référence validée 1, conformément aux normes de performance figurant dans la présente méthode d'essai (appendice). Deux autres méthodes d'essai in vitro sur modèle d'épiderme humain reconstitué ont été validées conformément aux exigences de la présente méthode d'essai et donnent des résultats similaires à ceux de la méthode de référence validée 1 (18). Il s'agit de la méthode d'essai EpiDermTM modifiée (méthode de référence modifiée 2) et de la méthode d'essai SkinEthic RHETM (méthode réplique 1) 1.2. DÉFINITIONS Aux fins de la présente méthode d'essai, les définitions suivantes s'appliquent: Précision: degré de concordance entre les résultats de la méthode d'essai et les valeurs de référence acceptées. C'est une mesure de la performance de la méthode d'essai et un aspect de la pertinence. Le terme est souvent utilisé de façon interchangeable avec «concordance» pour désigner la proportion de résultats corrects d'une méthode d'essai. Substance témoin de lot: substance de référence induisant une viabilité cellulaire moyenne du tissu. Viabilité cellulaire: paramètre mesurant l’activité totale d’une population cellulaire (par exemple, capacité des déshydrogénases mitochondriales cellulaires à réduire le colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bleu de thiazol]), qui, selon l’effet mesuré et le protocole utilisé pour l’essai, correspond au nombre total de cellules vivantes et/ou à la vitalité des cellules. TE50 : temps d'exposition nécessaire pour réduire la viabilité cellulaire de 50 % après application de la substance marqueur à une concentration fixe spécifiée, voir également CI50 Taux de faux négatifs: proportion des substances positives faussement déclarées négatives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la méthode d'essai. Taux de faux positifs: proportion des substances négatives (non actives) qui sont faussement déclarées positives. C'est un indicateur de la performance de la méthode d'essai. Dose infinie: quantité de substance d'essai appliquée sur la peau qui dépasse la quantité requise pour recouvrir entièrement et uniformément la surface la peau. SGH (système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques): système de classification des substances et des mélanges en fonction de types normalisés et de niveaux de danger physique, sanitaire et environnemental, qui élabore les éléments de communication correspondants tels que pictogrammes, mentions d'avertissement, mentions de danger ou de mise en garde et fiches de sécurité, de manière à fournir des informations sur les effets indésirables des produits dans un souci de protection des personnes (employeurs, travailleurs, transporteurs, consommateurs et services d'intervention d'urgence) et de l'environnement (1); ce système est mis en œuvre dans l'UE par le règlement (CE) no 1272/2008. CI50 : concentration d'une substance marqueur qui réduit la viabilité des tissus de 50 % (CI50) après un temps d'exposition déterminé, voir également TE50. Normes standard: normes, fondées sur une méthode de référence validée, permettant d'évaluer la comparabilité d'une méthode d'essai proposée qui est structurellement et fonctionnellement similaire. Elles comprennent: I) les éléments essentiels de la méthode d'essai; II) une liste minimale de substances de référence choisies parmi les substances utilisées pour démontrer les performances acceptables de la méthode de référence validée; et III) en fonction des résultats obtenus pour la méthode de référence validée, les niveaux comparables d'exactitude et de fiabilité devant être obtenus pour la méthode d'essai proposée évaluée à l'aide des substances de référence de la liste minimale. Fiabilité: mesure dans laquelle une méthode d'essai peut être reproduite au fil du temps par un même laboratoire et par plusieurs laboratoires utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité intra et interlaboratoire. Sensibilité: proportion des substances actives/positives correctement classées par l'essai. La sensibilité permet de mesurer la précision d'une méthode d'essai qui donne des résultats relatifs à des catégories, et c'est un aspect important pour l'évaluation de la pertinence d'une méthode d'essai. Spécificité: proportion des substances inactives/négatives correctement classées par l'essai. La spécificité de mesurer la précision d'une méthode d'essai qui donne des résultats relatifs à des catégories, et c'est un aspect important pour l'évaluation de la pertinence d'une méthode d'essai. Irritation cutanée: apparition de lésions réversibles sur la peau à la suite de l’application d’une substance d’essai pendant une durée pouvant aller jusqu’à quatre heures. L'irritation cutanée est une réaction locale, non immunogène, qui se manifeste après une stimulation (24). Elle se caractérise essentiellement par un processus réversible impliquant des réactions inflammatoires et par la plupart des signes cliniques caractéristiques de l'irritation (érythème, œdème, démangeaisons et douleur) qui sont associés au processus inflammatoire. 1.3. CHAMP D'APPLICATION ET LIMITES Une des limitations des essais sur modèles d'épiderme humain reconstitué relevant de la présente méthode d'essai est qu'ils permettent uniquement la classification des substances dans la catégorie 2 des substances irritantes pour la peau selon le SGH des Nations unies. Comme ils ne permettent pas de classer les substances dans la catégorie facultative 3 définie dans le SGH, toutes les autres substances ne sont pas classées (sans catégorie). En fonction des besoins de réglementation et de l'inclusion ultérieure de nouveaux critères d'évaluation, de l'amélioration ou du développement de nouvelles répliques des essais, une révision de la présente méthode pourra se révéler nécessaire. La présente méthode d'essai permet de caractériser le danger des substances irritantes à un seul constituant (19), mais elle ne fournit pas d'informations appropriées sur la corrosion cutanée. Les gaz et les aérosols ne peuvent pas être testés, et les mélanges n'ont pas encore fait l'objet d'une étude de validation. 1.4. PRINCIPE DE L'ESSAI La substance d'essai est appliquée localement sur un modèle tridimensionnel d'épiderme humain reconstitué, consistant en kératinocytes normaux prélevés sur un épiderme humain et mis en culture pour former un modèle multicouche hautement différencié d'épiderme humain. Il se compose d'une couche basale, d'un stratum spinosum et d'une couche granulaire organisés, ainsi que d'un stratum corneum multicouche contenant des couches lipidiques lamellaires intercellulaires dont la disposition est identique à celle que l'on observe in vivo. Le principe de l'essai sur modèle d'épiderme humain reconstitué s’appuie sur l'hypothèse selon laquelle les substances irritantes sont capables de pénétrer dans le stratum corneum par diffusion et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. La viabilité cellulaire est mesurée par le virage, obtenu par une déshydrogénase, du colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bleu de thiazol; numéro EINECS 206-069-5, numéro CAS 298-93-1)] en un sel de formazan bleu que l'on mesure quantitativement après extraction des tissus (20). Les substances irritantes sont détectées par leur capacité à abaisser la viabilité cellulaire sous un seuil déterminé (≤ 50 % pour les substances irritantes de catégorie 2 selon le SGH des Nations unies). Les substances qui donnent des viabilités cellulaires supérieures au seuil défini ne seront pas classées (> 50 %, sans catégorie). Les systèmes de modèles d'épiderme humain reconstitué peuvent être utilisés pour tester des solides, des liquides, des semi-solides et des cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non, et les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l'eau. Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d'une poudre fine. Dans la mesure où cinquante-huit substances soigneusement sélectionnées et représentant un large éventail de classes ont été utilisées pour la validation des systèmes d'essai sur modèle d'épiderme humain reconstitué, les méthodes devraient pouvoir être appliquées d'une manière générale à l'ensemble des classes chimiques (16). La validation porte sur treize substances irritantes de catégorie 2 selon le SGH. Acides non corrosifs, bases, sels et autres substances inorganiques non irritantes n'ont pas été inclus dans l'étude de validation. Certaines classes connues de substances irritantes organiques comme les hydroperoxydes, les phénols et les surfactants n'ont pas été inclus non plus, ou alors seulement de façon limitée. 1.5. DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES Avant d'appliquer de manière systématique une méthode validée conforme à la présente méthode d'essai, les laboratoires peuvent souhaiter faire la preuve de leur compétence technique à l'aide des dix substances recommandées dans le tableau 1. Dans le cadre de la présente méthode d'essai, la catégorie 3 facultative selon le SGH des Nations unies ne correspond à aucune catégorie. Dans le cas de nouvelles méthodes d'essai similaires (répliques) mises au point conformément à la présente méthode, qui sont structurellement et fonctionnellement similaires aux méthodes de référence validées, ou dans le cas de modifications des méthodes validées, il convient d'utiliser les normes de performance décrites dans l'appendice de la présente méthode d'essai pour démontrer que la nouvelle méthode d'essai a une fiabilité et une précision comparables avant de l'utiliser à des fins réglementaires. Tableau 1 Substances de vérification, constituant un sous-ensemble des substances de référence énumérées dans l'appendice Substance Numéro CAS Score in vivo État physique Catégorie SGH Acide naphtylacétique 86-87-3 0 S Sans cat. Isopropanol 67-63-0 0,3 L Sans cat. Stéarate de méthyle 112-61-8 1 S Sans cat. Butyrate d'heptyle 5870-93-9 1,7 L Cat. 3 facultative Salicylate d'hexyle 6259-76-3 2 L Cat. 3 facultative 3-p-cuményl-2-méthylpropionaldéhyde 103-95-7 2,3 L Cat. 2 1-bromohexane 111-25-1 2,7 L Cat. 2 Méthacrylate de butyle 97-88-1 3 L Cat. 2 1-méthyl-3-phényl-1-pipérazine 5271-27-2 3,3 S Cat. 2 Heptanal 111-71-7 4 L Cat. 2 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE Les éléments et le protocole d'un essai d'évaluation de l'irritation cutanée sur modèle d'épiderme humain reconstitué sont décrits ci-après. Le modèle d'épiderme humain reconstitué peut être constitué, préparé ou obtenu dans le commerce (par exemple, les modèles EpiSkin™, EpiDerm™ et SkinEthic RHE™). Les protocoles d'essai standard pour les modèles EpiSkin™, EpiDerm™ et SkinEthic RHE™ peuvent être obtenus à l'adresse suivante: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu](21, 22, 23). Les essais doivent être réalisés comme indiqué ci-après: 1.6.1. Éléments du modèle d'épiderme humain reconstitué 1.6.1.1. Conditions générales applicables au modèle L’épithélium doit être constitué à partir de kératinocytes humains normaux. Plusieurs couches de cellules épithéliales viables (couche basale, stratum spinosum, stratum granulosum) doivent être présentes au-dessous d'un stratum corneum fonctionnel. Le stratum corneum doit comporter plusieurs couches présentant le profil lipidique nécessaire pour constituer une barrière fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide des substances marqueurs cytotoxiques comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-100. La fonction de barrière doit être évaluée soit en déterminant la concentration à laquelle une substance marqueur réduit de 50 % la viabilité des tissus (CI50) après un temps d'exposition donné, soit en déterminant le temps d'exposition requis pour réduire la viabilité cellulaire de 50 % (TE50) après application de la substance marqueur à une concentration fixe déterminée. Le modèle doit présenter des propriétés de confinement telles que la substance d’essai ne puisse contourner le stratum corneum pour pénétrer dans les tissus viables, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de l'exposition de la peau. Enfin, le modèle de peau ne doit présenter aucune contamination bactérienne (y compris mycoplasmique), virale ou mycosique. 1.6.1.2. Conditions applicables au modèle fonctionnel: 1.6.1.2.1. Viabilité La viabilité est de préférence mesurée au moyen du colorant MTT (20). Dans ces cas, la densité optique (DO) du colorant (solubilisé) extrait du tissu traité par le témoin négatif (TN) doit être au moins vingt fois supérieure à la DO du solvant d’extraction seul. Le tissu traité par le témoin négatif doit être stable en culture (c’est-à-dire qu’il doit présenter des mesures de viabilité comparables) pendant la durée de la période d’exposition. 1.6.1.2.2. Fonction de barrière Le stratum corneum et sa composition lipidique doivent être suffisants pour résister à la pénétration rapide de substances marqueurs cytotoxiques tels que le SDS ou le Triton X-100, évaluée par la CI50 ou le TE50. 1.6.1.2.3. Morphologie L'examen histologique de la peau/l'épiderme reconstitué(e) doit être réalisé par un personnel dûment qualifié qui montrera que le modèle présente une structure semblable à celle de la peau/de l'épiderme humain. 1.6.1.2.4. Reproductibilité La reproductibilité dans le temps des résultats de la méthode sur un modèle donné doit être démontrée, de préférence à l'aide d'une substance témoin de lot (référence) appropriée (voir appendice). 1.6.1.2.5. Contrôles de qualité (CQ) du modèle Chaque lot de modèle d'épiderme utilisé doit satisfaire à certains critères de fabrication dont les plus importants sont ceux relatifs à la viabilité (paragraphe 1.6.1.2.1) et à la fonction de barrière (paragraphe 1.6.1.2.2). Il convient que le fournisseur du modèle de peau (ou l'expérimentateur en cas d'utilisation d'un modèle «maison») définisse une plage de valeurs acceptables (limites inférieure et supérieure) pour la CI50 et le TE50. Les propriétés de barrière des tissus doivent être vérifiées par le laboratoire après réception des tissus. Seuls les résultats obtenus avec des tissus présentant les qualités requises pourront être retenus pour prédire de façon fiable les effets irritants. À titre d'exemple, les plages de valeurs acceptables pour les méthodes de référence validées sont indiquées ci-dessous. Tableau 2 Exemples de critères de contrôle de qualité des lots Limite inférieure d'acceptation Moyenne de la plage de valeurs acceptables Limite supérieure d'acceptation Méthode de référence validée 1 (18 heures de traitement par SDS) CI50 = 1,0 mg/ml CI50 = 2,32 mg/ml CI50 = 3,0 mg/ml Méthode de référence validée 2 (1 % Triton X100) TE50 = 4,8 h TE50 = 6,7 h TE50 = 8,7 h 1.6.1.3. Application des substances d’essai et des substances témoins Un nombre suffisant de tissus (répliques) doit être utilisé pour chaque traitement et pour les témoins (au moins trois répliques par essai). Pour les substances liquides comme pour les substances solides, il convient d'appliquer une quantité suffisante de substance d'essai pour recouvrir uniformément la surface de la peau, sans pour autant utiliser une dose infinie (voir 1.2. Définitions), c'est-à-dire au minimum 25 μL/cm2 ou 25 mg/cm2. Dans le cas de substances solides, il convient d'humidifier la surface de l'épiderme avec de l'eau déionisée ou distillée avant application, afin d'assurer un bon contact avec la peau. Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d'une poudre fine. À la fin de la période d'exposition, la surface cutanée doit être nettoyée avec soin à l'aide d'un tampon aqueux ou de NaCl à 0,9 %, afin d'éliminer la substance d'essai. En fonction du modèle d'épiderme humain reconstitué utilisé, la période d'exposition peut varier entre 15 et 60 minutes et la température d'incubation entre 20 et 37 °C. Pour de plus amples informations, voir les modes opératoires standard pour les trois méthodes (21, 22, 23). Des témoins négatifs (TN) et positifs (TP) doivent être utilisés simultanément pour chaque étude afin de démontrer que la viabilité (TN), la fonction de barrière et la sensibilité tissulaire qui en résulte (TP) se situent dans une fourchette historique définie de valeurs acceptables. La substance recommandée en tant que TP est une solution aqueuse de SDS à 5 %. On recommande comme substance TN de l'eau ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). 1.6.1.4. Mesures de la viabilité cellulaire La condition essentielle du protocole est que les mesures de la viabilité ne soient pas réalisées immédiatement après l'exposition aux substances d'essai, mais après une période d'incubation post-traitement suffisamment longue des tissus rincés dans un milieu frais. Cette période permet non seulement la récupération des tissus après des effets faiblement irritants, mais aussi l'apparition d'effets cytotoxiques manifestes. Durant la phase d'optimisation de l'essai (9, 10, 11, 12, 13), une période d'incubation post-traitement de 42 heures s'est révélée optimale et a donc été utilisée pour la validation des méthodes d'essai de référence. Le test de virage du MTT est une méthode quantitative validée qui devrait être utilisée pour mesurer la viabilité cellulaire. Elle est compatible avec une utilisation sur un modèle tissulaire tridimensionnel. L’échantillon de peau est placé dans une solution MTT à la concentration appropriée (par exemple, 0,3-1 mg/ml) pendant 3 heures. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l’aide d’un solvant (isopropanol), et l'on mesure la concentration du formazan en déterminant sa DO à 570 nm avec une bande passante de ±30 nm au maximum. Les propriétés optiques de la substance d'essai ou son action chimique sur le MTT sont susceptibles d'interférer avec la détermination et de conduire à une estimation erronée de la viabilité (car la substance d'essai peut aussi bien inhiber ou faire disparaître la coloration que la provoquer). Cela peut survenir lorsque la substance d'essai n'a pas été totalement éliminée de la peau par rinçage ou lorsqu'elle a pénétré dans l'épiderme. Si la substance d'essai agit directement sur le MTT, si elle est naturellement colorée ou si elle se colore durant le traitement du tissu, des contrôles supplémentaires doivent être pratiqués pour détecter et corriger les interférences de la substance d'essai avec la mesure de la viabilité. Pour de plus amples précisions sur la manière de tester la réduction directe du MTT, veuillez consulter le protocole des méthodes de référence validées (21, 22, 23). Une coloration non spécifique (CNS) dues à ces interférences ne doit pas dépasser 30 % des TN (pour les corrections). Si CNS > 30 %, la substance d'essai est considérée comme incompatible avec l'essai. 1.6.1.5. Critères d'acceptabilité des déterminations Pour chaque détermination réalisée sur des lots valables (voir paragraphe 1.6.1.2.5), les tissus traités par le témoin négatif (TN) doivent présenter une DO rendant compte de la qualité des tissus ayant été soumis à toutes les étapes d'expédition et de réception et à l'intégralité du protocole d'irritation. Les valeurs de DO des témoins ne doivent pas être inférieures aux limites inférieures historiques. De la même façon, les résultats obtenus pour les tissus traités par le témoin positif (TP), c'est-à-dire la solution aqueuse de SDS à 5 %, doivent rendre compte de la sensibilité conservée par les tissus et de leur capacité à réagir à une substance irritante dans les conditions de chaque détermination (par exemple, viabilité ≤ 40 % pour la méthode de référence validée 1 et ≤ 20 % pour la méthode de référence validée 2). Il y a lieu de définir les mesures associées et appropriées de la variabilité entre les répliques de tissu (par exemple, si l'écart-type est utilisé, il doit être ≤ 18 %). 2. RÉSULTATS 2.1. RÉSULTATS Pour chaque traitement, il convient de présenter, sous forme de tableau, les résultats obtenus pour chaque échantillon de tissu (par exemple, les valeurs de DO et le pourcentage de viabilité cellulaire calculé pour chaque substance d'essai, ainsi que la classification correspondante), y compris les résultats obtenus, le cas échéant, en reproduisant les expériences. Pour chaque essai, on précisera en outre les valeurs moyennes ± écart-type. Les interactions observées entre le réactif MTT et les substances d'essai colorées seront signalées pour chaque substance testée. 2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS La valeur de DO obtenue pour chaque échantillon d'essai peut être utilisée pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport au témoin négatif, lequel correspond à une viabilité cellulaire arbitrairement fixée à 100 %. La valeur seuil du pourcentage de viabilité cellulaire, qui établit la distinction entre les substances d'essai irritantes et les substances d'essai non classifiées, de même que les procédures statistiques utilisées pour évaluer les résultats et identifier les substances irritantes, doivent être clairement définies et documentées, et il convient de démontrer qu'elles sont appropriées. Les valeurs seuils permettant de déterminer l'irritation qui sont associées aux méthodes de référence validées sont indiquées ci-dessous: La substance d'essai est considérée comme irritante pour la peau conformément à la catégorie 2 du SGH des Nations unies: i) si la viabilité du tissu après exposition et incubation post-traitement est inférieure ou égale (≤) à 50 %. La substance d'essai est considérée comme étant sans catégorie: ii) si la viabilité du tissu après exposition et incubation post-traitement est supérieure (>) à 50 %. 3. RAPPORTS 3.1. RAPPORT D'ESSAI Le rapport d'essai doit mentionner les informations suivantes: Substances d’essai et témoins: — nom(s) chimique(s), tels que le nom IUPAC ou CAS, et le cas échéant, le numéro CAS, — pureté et composition de la substance (en pourcentage en poids), — propriétés physicochimiques utiles pour la conduite de l'essai (par exemple, état physique, stabilité et volatilité, pH, hydrosolubilité), — le cas échéant, traitement des substances d’essai/témoins avant l’essai (par exemple, chauffage, réduction en poudre), — conditions de stockage, justification du choix du modèle de peau et du protocole utilisés. Conditions d'essai: — système cellulaire utilisé, — informations sur l’étalonnage du dispositif et de la bande passante utilisés pour la mesure de la viabilité cellulaire (spectrophotomètre, par exemple), — informations complètes sur le modèle spécifique de peau utilisé, et notamment sur ses performances. Il s'agit notamment de: i) la viabilité; ii) la fonction de barrière; iii) la morphologie; iv) la reproductibilité et la valeur prédictive; v) les contrôles de qualité (CQ) du modèle; — détails du protocole utilisé, — doses d'essai utilisées, durée de l'exposition et de la période d'incubation post-traitement, — description de toute modification éventuelle du protocole, — référence aux données historiques du modèle. Il s'agit notamment de: i) l'acceptabilité des données de CQ par rapport aux données historiques des lots; ii) l'acceptabilité des valeurs des témoins positifs et négatifs par rapport aux moyennes et aux fourchettes des témoins positifs et négatifs; — description des critères d'évaluation utilisés, notamment la justification du choix des valeurs-seuils pour le modèle prédictif. Résultats: — présentation sous forme de tableau des résultats de chaque échantillon d’essai, — description des autres effets observés. Discussion des résultats Conclusions 4. BIBLIOGRAPHIE 1. Nations unies (NU) (2007). Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH), deuxième édition révisée, Nations unies, New York et Genève, 2007. Accessible à l'adresse suivante: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_f.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Available at: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649 3. Méthode d'essai B.4. TOXICITÉ AIGUË; IRRITATION/CORROSION CUTANÉE 4. Méthode d'essai B.40. CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI DE RÉSISTANCE ÉLECTRIQUE TRANSCUTANÉE (RET). 5. Méthode d'essai B.40 BIS. CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE DE PEAU HUMAINE 6. OCDE (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Adopted July 19, 2006. Voir à l'adresse suivante: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Voir la rubrique «Download Study Documents» à l'adresse suivante: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57-93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765-770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107-114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351-367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329-249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109-129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619. 17. J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351-358. 18. ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays. 5 November 2008. 19. CE (2006). Règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil du 18 décembre 2006 concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le règlement (CEE) no 793/93 du Conseil et le règlement (CE) no 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE de la Commission ( Journal officiel de l'Union européenne L 396/1 du 30.12.2006). OPOCE, Luxembourg. 20. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. 21. EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Voir la rubrique «Download Study Documents» à l'adresse suivante: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Voir la rubrique «Download Study Documents» à l'adresse suivante: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP. Sera disponible dans la rubrique «Download Study Documents» à l'adresse suivante: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lammintausta, K. Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, pp 7-18. 25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, November 13, 2008. Appendice Évaluation des performances des modèles d'épiderme humain reconstitué in vitro proposés pour tester l'irritation cutanée INTRODUCTION Les procédures dont l'utilisation est proposée dans le cadre de la présente méthode d'essai doivent être évaluées à l'aide de substances représentant l'éventail complet des scores d'irritation de Draize, afin de déterminer leur fiabilité et leur précision. Les valeurs de fiabilité et de précision obtenues lors de l'évaluation des procédures proposées à l'aide des vingt substances de référence recommandées (tableau 2) doivent être comparables à celles obtenues par la méthode de référence validée 1 (tableau 3) (1). Les normes de précision et de fiabilité à atteindre sont indiquées aux points II et III ci-après. Des substances non classées et des substances classées (catégorie 2 du SGH des Nations unies), représentant les classes chimiques pertinentes, sont incluses afin que la fiabilité et la performance (sensibilité, spécificité, taux de faux négatifs, taux de faux positifs et précision) de la méthode d'essai proposée puissent être comparées à celles de la méthode de référence validée 1. Il convient de déterminer la fiabilité de la méthode d'essai, ainsi que sa capacité à détecter correctement des substances irritantes de catégorie 2 selon le SGH des Nations unies, avant d'appliquer cette méthode pour tester de nouvelles substances. NORMES DE PERFORMANCE Les normes de performance se composent des trois éléments suivants: I) les éléments essentiels de la méthode d'essai; II) les substances de référence; et III) les valeurs de précision et de fiabilité (2). Ces normes de performances sont fondées sur celles qui ont été définies à l'issue de l'étude CEVMA de validation des méthodes d'évaluation de l'irritation cutanée (3). I) Les éléments essentiels de la méthode d'essai Conditions générales applicables au modèle L’épithélium doit être constitué à partir de kératinocytes humains normaux. Plusieurs couches de cellules épithéliales viables (couche basale, stratum spinosum, stratum granulosum) doivent être présentes au-dessous d'un stratum corneum fonctionnel. Le stratum corneum doit comporter plusieurs couches présentant le profil lipidique nécessaire pour constituer une barrière fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide des substances marqueurs cytotoxiques comme le SDS ou le Triton X-100. La fonction de barrière doit être évaluée soit en déterminant la concentration à laquelle une substance marqueur réduit de 50 % la viabilité des tissus (CI50) après un temps d'exposition donné, soit en déterminant le temps d'exposition requis pour réduire la viabilité cellulaire de 50 % (TE50) après application de la substance marqueur à une concentration fixe déterminée. Le modèle doit présenter des propriétés de confinement telles que la substance d’essai ne puisse contourner le stratum corneum pour pénétrer dans les tissus viables, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de l'exposition de la peau. Enfin, le modèle de peau ne doit présenter aucune contamination bactérienne (y compris mycoplasmique), virale ou mycosique. Conditions applicables au modèle fonctionnel Viabilité La viabilité est de préférence mesurée au moyen du colorant MTT (4). La densité optique (DO) du colorant (solubilisé) extrait du tissu traité par le témoin négatif (TN) doit être au moins vingt fois supérieure à la DO du solvant d’extraction seul. Le tissu traité par le témoin négatif doit être stable en culture (c’est-à-dire qu’il doit présenter des mesures de viabilité comparables) pendant la durée de la période d’exposition. Fonction de barrière Le stratum corneum et sa composition lipidique doivent être suffisants pour résister à la pénétration rapide de substances marqueurs cytotoxiques tels que le SDS ou le Triton X-100, évaluée par la CI50 ou le TE50. Morphologie L'examen histologique de la peau/l'épiderme reconstitué(e) doit être réalisé par un personnel dûment qualifié qui montrera que le modèle présente une structure semblable à celle de la peau/de l'épiderme humain. Reproductibilité La reproductibilité dans le temps des résultats de la méthode sur un modèle donné doit être démontrée, de préférence à l'aide d'une substance témoin de lot (référence) appropriée (voir définition au paragraphe 1.2). Contrôles de qualité (CQ) du modèle Chaque lot de modèle d'épiderme utilisé doit satisfaire à certains critères de fabrication dont les plus importants sont ceux relatifs à la viabilité et à la fonction de barrière. Il convient que le fournisseur du modèle de peau (ou l'expérimentateur en cas d'utilisation d'un modèle «maison») définisse une plage de valeurs acceptables (limites inférieure et supérieure) pour la CI50 et le TE50. Les propriétés de barrière des tissus doivent être vérifiées par le laboratoire après réception des tissus. Seuls les résultats obtenus avec des tissus présentant les qualités requises pourront être retenus pour prédire de façon fiable les effets irritants. À titre d'exemple, les plages de valeurs acceptables pour les méthodes de référence validées sont indiquées ci-dessous. Tableau 1 Exemples de critères de contrôle de qualité des lots Limite inférieure d'acceptation Moyenne de la plage de valeurs acceptable Limite supérieure d'acceptation Méthode de référence validée 1 (18 heures de traitement par SDS) CI50 = 1,0 mg/ml CI50 = 2,32 mg/ml CI50 = 3,0 mg/ml Méthode de référence validée 2 (1 % Triton X100) TE50 = 4,8 h TE50 = 6,7 h TE50 = 8,7 h II) Substances de référence Les substances de référence sont utilisées pour déterminer si la fiabilité et la précision d'une nouvelle méthode d'essai in vitro sur épiderme humain reconstitué, dont on a démontré qu'elle était suffisamment similaire sur les plans structurel et fonctionnel aux méthodes de référence validées ou qu'elle représentait une modification mineure d'une méthode de référence validée, sont comparables à celles de la méthode de référence validée 1 (1). Les vingt substances de référence figurant dans le tableau 2 comprennent des substances qui représentent différentes classes chimiques d'intérêt, ainsi que des substances classées dans la catégorie 2 du SGH des Nations unies. Le tableau comprend dix substances classées dans la catégorie 2 du SGH NU, trois substances classées dans la catégorie facultative 3 du SGH et sept substances non classées. Aux fins de la présente méthode d'essai, la catégorie 3 facultative selon le SGH des NU ne correspond à aucune catégorie. Ces substances de référence représentent le nombre minimal de substances à utiliser pour évaluer la précision et la fiabilité d'une méthode d'essai proposée pour évaluer l'irritation cutanée sur épiderme humain reconstitué. Si une substance du tableau n'est pas disponible, il est possible d'utiliser d'autres substances pour lesquelles il existe des données de référence in vivo appropriées. Si nécessaire, il est possible d'ajouter à la liste minimale de substances de référence d'autres substances représentant d'autres classes chimiques et pour lesquelles des données de référence in vivo appropriées sont disponibles. Tableau 2 Substances de référence pour la détermination des valeurs de précision et de fiabilité des modèles d'épiderme humain reconstitué pour l'évaluation de l'irritation cutanée Substance (1) No CAS No Einecs État physique Score in vivo Cat. SGH in vitro Cat. SGH in vivo 1-bromo-4-chlorobutane 6940-78-9 230-089-3 L 0 Cat. 2 Sans cat. Phtalate de diéthyle 84-66-2 201-550-6 L 0 Sans cat. Sans cat. Acide naphtylacétique 86-87-3 201-705-8 S 0 Sans cat. Sans cat. Phénoxyacétate d'allyle 7493-74-5 231-335-2 L 0,3 Sans cat. Sans Cat. Isopropanol 67-63-0 200-661-7 L 0,3 Sans cat. Sans Cat. 4-(méthylthio)-benzaldéhyde 3446-89-7 222-365-7 L 1 Cat. 2 Sans Cat. Stéarate de méthyle 112-61-8 203-990-4 S 1 Sans cat. Sans Cat. Butyrate d'heptyle 5870-93-9 227-526-5 L 1,7 Sans cat. Cat. 3 facult. Salicylate d'hexyle 6259-76-3 228-408-6 L 2 Sans cat. Cat. 3 facult. Phosphate-de-triisobutyle- 126-71-6 204-798-3 L 2 Cat. 2 Cat. 3 facult. Décane-1-ol 112-30-1 203-956-9 L 2,3 Cat. 2 Cat. 2 3-p-cuményl-2-méthylpropionaldéhyde 103-95-7 203-161-7 L 2,3 Cat. 2 Cat. 2 1-bromohexane 111-25-1 203-850-2 L 2,7 Cat. 2 Cat. 2 Hydrochlorure de 2-chlorométhyl-4-méthoxy-3,5 diméthyl pyridine 86604-75-3 434-680-9 S 2,7 Cat. 2 Cat. 2 Alpha-terpinéol 98-55-5 202-680-6 L 2,7 Cat. 2 Cat. 2 Disulfure de dipropyle 629-19-6 211-079-8 L 3 Sans cat. Cat. 2 Méthacrylate de butyle 97-88-1 202-615-1 L 3 Cat. 2 Cat. 2 Méthyl-2 tert-butyle-5 thiophénol; thio PTBT 7340-90-1 438-520-9 L 3,3 Cat. 2 Cat. 2 1-méthyl-3-phényl-1-pipérazine 5271-27-2 431-180-2 S 3,3 Cat. 2 Cat. 2 Heptanal 111-71-7 203-898-4 L 4 Cat. 2 Cat. 2 Les substances figurant dans le tableau 2 sont une sélection représentative des cinquante-huit substances utilisées dans l'étude internationale CEVMA de validation de l'irritation cutanée (1). Les choix du CEVMA sont fondés sur les critères suivants: — les substances sont disponibles dans le commerce, — elles sont représentatives de l'éventail complet des scores d'irritation de Draize (des substances non irritantes aux substances très irritantes), — elles ont une structure chimique bien définie, — elles sont représentatives de la reproductibilité et de la valeur prédictive de la méthode validée telles que définies par l'étude de validation CEVMA, — elles sont représentatives de la fonctionnalité chimique utilisée pour la validation, — elles ne sont pas associées à un profil extrêmement toxique (cancérogène ou toxique pour la reproduction, par exemple) ni à des coûts d'élimination prohibitifs. III) Valeurs de précision et de fiabilité définies La performance (sensibilité, spécificité, taux de faux négatifs, taux de faux positifs et précision) de la méthode d'essai proposée doit être comparable à celle de la méthode de référence validée 1 (tableau 3), c'est-à-dire que la sensibilité doit être supérieure ou égale à (≥) 80 %, la spécificité doit être supérieure ou égale à (≥) 70 % et la précision supérieure ou égale à (≥) 75 %. La performance doit être calculée à l'aide des classifications obtenues pour les vingt substances par les différents laboratoires participants. Dans chaque laboratoire, la classification de chaque substance doit être obtenue en utilisant la valeur moyenne de la variabilité entre les différents essais réalisés (au minimum trois essais valables). Tableau 3 Performance de la méthode de référence validée 1 (2) Méthode d'essai Nombre de substances Sensibilité Spécificité Taux de faux négatifs Taux de faux positifs Précision Méthode de référence validée 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Méthode de référence validée 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % La fiabilité de la méthode de référence proposée doit être comparable à celle des méthodes de référence validées. Reproductibilité intralaboratoire Une évaluation de la variabilité intralaboratoire doit faire apparaître une concordance des classifications (catégorie 2/sans catégorie), obtenues lors de plusieurs essais indépendants réalisés avec les vingt substances de référence par un même laboratoire, égale ou supérieure à (≥) 90 %. Reproductibilité interlaboratoire L'évaluation de la reproductibilité interlaboratoire n'est pas indispensable si la méthode d'essai proposée ne doit être utilisée que dans un seul laboratoire. En cas de transfert des méthodes entre les laboratoires, la concordance des classifications (catégorie 2/sans catégorie), obtenues lors de plusieurs essais indépendants réalisés avec les vingt substances de référence par au moins trois laboratoires (de préférence), doit être égale ou supérieure à (≥) 80 %. BIBLIOGRAPHIE 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 55