Décision de la Commission

du 4 juillet 2000

établissant des procédures de diagnostic, des méthodes d'échantillonnage et des critères pour l'appréciation des résultats des tests en laboratoire de confirmation et de diagnostic différentiel de la maladie vésiculeuse du porc

[notifiée sous le numéro C(2000) 1805]

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

(2000/428/CE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu la directive 92/119/CEE du Conseil du 17 décembre 1992 établissant des mesures communautaires générales de lutte contre certaines maladies ainsi que des mesures spécifiques à l'égard de la maladie vésiculeuse du porc(1), modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion de l'Autriche, de la Finlande et de la Suède, et notamment son annexe II, paragraphe 3,

considérant ce qui suit:

(1) Il est nécessaire d'établir, au niveau communautaire, des procédures de diagnostic, des méthodes d'échantillonnage et des critères pour l'appréciation des résultats des tests en laboratoire de confirmation de la maladie vésiculeuse du porc, ainsi que de différenciation de la fièvre aphteuse, de manière à améliorer la lutte contre ces deux maladies.

(2) L'annexe III de la directive 92/119/CEE définit les fonctions et les tâches du laboratoire communautaire de référence pour la maladie vésiculeuse du porc dans le but de coordonner, en consultation avec la Commission, les méthodes employées dans les États membres pour diagnostiquer la maladie. Ces fonctions et ces tâches comprennent l'organisation périodique de tests comparatifs périodiques et la fourniture de réactifs types au niveau communautaire.

(3) Des tests de laboratoire ont été récemment mis au point pour assurer un diagnostic rapide de la maladie vésiculeuse et la distinguer de la fièvre aphteuse.

(4) Les résultats des essais comparatifs les plus récents exécutés au niveau communautaire suggèrent, notamment, que les tests mis au point pour détecter l'antigène ou le génome du virus de la maladie vésiculeuse du porc sont fiables et peuvent efficacement compléter le test d'isolement du virus pour le diagnostic virologique de la maladie vésiculeuse du porc.

(5) L'expérience acquise ces dernières années dans la lutte contre la maladie vésiculeuse du porc a abouti à l'identification des procédures et des critères d'échantillonnage les plus appropriés pour l'appréciation des résultats des tests de laboratoire et l'établissement d'un diagnostic correct de cette maladie dans différentes situations.

(6) L'avis et les recommandations du comité scientifique sur la santé animale et le bien-être animal en matière de maladie vésiculaire du porc ont été pris en considération.

(7) Les mesures prévues par la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:

Article premier

1. Les États membres veillent à ce que la confirmation de la maladie vésiculeuse du porc et le diagnostic différentiel par rapport à la fièvre aphteuse soient fondés sur:

a) la détection de signes cliniques de la maladie;

b) la détection du virus, de l'antigène ou du génome dans des échantillons de tissu d'épithélium, de fluide vésiculaire ou de matières fécales;

c) la démonstration d'une réponse d'anticorps spécifiques dans les échantillons de sérum,

conformément aux procédures, aux méthodes d'échantillonnage et aux critères d'appréciation des résultats des tests de laboratoire décrits dans le manuel joint en annexe à la présente décision.

2. Toutefois, les laboratoires de diagnostic nationaux mentionnés à l'annexe II, point 5, de la directive 92/119/CEE peuvent appliquer des modifications aux tests de laboratoire mentionnés dans le manuel joint en annexe à la présente décision ou utiliser des tests différents, pourvu qu'une sensibilité et une spécificité égale puissent être démontrées.

La sensibilité et la spécificité de ces tests modifiés ou différents doivent être évaluées dans le cadre des essais comparatifs périodiques organisés par le laboratoire communautaire de référence pour la maladie vésiculeuse du porc.

Article 2

La présente décision est applicable à partir du 1er octobre 2000.

Article 3

Les États membres sont destinataires de la présente décision.

Fait à Bruxelles, le 4 juillet 2000.

Par la Commission

David Byrne

Membre de la Commission

(1) JO L 62 du 15.3.1993, p. 69.

ANNEXE

MANUEL DES PROCÉDURES DE DIAGNOSTIC, DE MÉTHODES D'ÉCHANTILLONNAGE ET DE CRITÈRES À UTILISER POUR L'APPRÉCIATION DES RÉSULTATS DES TESTS EN LABORATOIRE DE CONFIRMATION ET DE DIAGNOSTIC DIFFÉRENTIEL DE LA MALADIE VÉSICULEUSE DU PORC

CHAPITRE PREMIER

Introduction, objectifs et définitions

1. Le présent manuel:

a) énonce les orientations et les exigences minimales relatives aux procédures de diagnostic, de méthodes d'échantillonnage et de critères à appliquer à l'appréciation des résultats des tests de laboratoire de manière à assurer un diagnostic correct de la maladie vésiculeuse du porc, avec toutefois une insistance particulière sur le diagnostic différentiel par rapport à la fièvre aphteuse;

b) intègre les dispositions de l'annexe II de la directive 92/119/CEE, et notamment de ses points 4, 7 et 8;

c) est établi principalement à l'intention des autorités responsables de la lutte contre la maladie vésiculeuse du porc, en raison de quoi il met l'accent sur les principes et les applications des tests de laboratoire ainsi que sur l'interprétation de leurs résultats plutôt que sur le détail des techniques de laboratoire.

2. Aux fins du présent manuel, on entend par:

a) "porc séropositif": tout porc dont le sérum contient un taux d'anticorps supérieur ou égal à celui du sérum de référence no 4 de la maladie vésiculeuse du porc visé au chapitre X, selon le test de neutralisation du virus utilisé par le laboratoire national;

b) "faux positif": tout porc séropositif d'une exploitation réagissant positivement aux tests sérologiques de dépistage de la maladie vésiculeuse du porc sans avoir été précédemment en contact avec le virus de la maladie vésiculeuse du porc et qui ne semble pas avoir contaminé les porcs voisins. Un porc séropositif est confirmé faux positif lorsque les conditions visées au point C du chapitre VIII sont remplies;

c) "porcs voisins": les porcs qui sont en contact direct, ou ont été en contact direct au cours des 28 derniers jours, avec un ou plusieurs porcs séropositifs ou avec un ou plusieurs porcs suspects d'être infectés par le virus de la maladie vésiculeuse du porc. Il s'agit de porcs se trouvant ou s'étant trouvés dans le même enclos ou dans des enclos adjacents s'il existe des possibilités de contacts entre les porcs d'un enclos à l'autre.

CHAPITRE II

Lignes directrices relatives aux contrôles sur les porcs présentant des signes cliniques de la maladie vésiculaire du porc

1. Lorsque la présence du virus de la maladie vésiculeuse du porc est suspectée dans une exploitation, les États membres veillent à ce qu'un nombre statistiquement significatif de porcs soit contrôlés aussi rapidement que possible par le vétérinaire officiel pour détecter les signes cliniques de la maladie décrits au chapitre IX.

2. Lorsque des porcs présentent des signes cliniques suggérant la présence de maladie vésiculeuse du porc ou de fièvre aphteuse, les États membres veillent à ce que soit effectué dans les plus brefs délais un diagnostic différentiel fondé sur un échantillonnage et des examens de laboratoire appropriés, conformément aux dispositions des chapitres IV, VII et VIII du présent manuel.

CHAPITRE III

Procédures générales pour l'échantillonnage et le transport des échantillons

1. Toute personne pénétrant dans une exploitation sur laquelle pèse une suspicion de maladie vésiculeuse du porc, ou quittant une telle exploitation, doit observer les mesures d'hygiène les plus strictes afin de réduire le risque de contamination ou de propagation du virus.

2. Tous les porcs utilisés pour le prélèvement d'échantillons doivent être marqués de façon univoque pour pouvoir être identifiés aux fins d'un rééchantillonnage ultérieur. Pour chaque porc utilisé aux fins de prélèvement d'échantillons, il est recommandé de noter conjointement la marque univoque d'identification de l'animal et son emplacement dans l'exploitation, particulièrement dans le cas de porcs suspects.

3. Les échantillons doivent être envoyés au laboratoire accompagnés des formulaires appropriés mentionnant le parcours des porcs utilisés pour le prélèvement des échantillons et les éventuels signes cliniques observés.

4. Comme chez le porc toute affection de type vésiculeux peut être due à la fièvre aphteuse, il y a lieu de prendre des précautions spéciales afin d'assurer un conditionnement sûr des échantillons suspects. Ces précautions visent principalement à empêcher toute rupture ou fuite des conditionnements et les risques afférents de contamination. Elles sont également importantes pour assurer que les spécimens parviennent à destination dans un état satisfaisant. Lorsqu'un conditionnement contient de la glace, il convient d'empêcher toute fuite d'eau. Aucun conditionnement contenant des échantillons suspects de renfermer le virus de la maladie vésiculeuse du porc ne doit être ouvert entre son départ du site contaminé et son arrivée au laboratoire.

5. Les échantillons suspects de renfermer le virus de la maladie vésiculeuse du porc ne doivent être analysés que dans un laboratoire habilité à manipuler le virus de la fièvre aphteuse aux fins de diagnostic, conformément à la législation communautaire sur la lutte contre la fièvre aphteuse, à moins que tout risque de fièvre aphteuse n'ait déjà été écarté.

6. Tous les échantillons peuvent être transportés à 4 °C si le temps de transport prévu jusqu'au laboratoire de destination est inférieur à 48 heures. Dans tous les autres cas, ils doivent être conservés à une température ne dépassant pas - 20 °C.

7. Pour les échantillons expédiés au laboratoire communautaire de référence par des États membres autres que le Royaume-Uni, le seul mode de transport autorisé est le fret aérien vers les aéroports de Londres-Heathrow ou Londres-Gatwick. Avant expédition, le laboratoire doit être informé par télécopie [(44)1483-232621] ou par courrier électronique des précisions concernant le vol et la compagnie aérienne, la date, l'heure d'arrivée prévue et le numéro du connaissement aérien, de sorte que le colis puisse être identifié dès son arrivée. Le colis doit être libellé à l'adresse suivante: Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory Community Reference Laboratory for swine vesicular disease Ash Road, Pirbright, Woking Surrey GU24 ONF Angleterre, Royaume-Uni

L'étiquette du colis doit également porter la mention suivante: "Matériel pathologique d'origine animale sans valeur commerciale. Périssable. Fragile. À réceptionner à l'aéroport par le destinataire. Ne pas ouvrir hors du laboratoire."

Seul le personnel du laboratoire communautaire de référence est autorisé à réceptionner l'envoi à l'aéroport, sous un permis d'importation général spécial émis à cet effet par le ministère britannique de l'agriculture, de l'alimentation et de la pêche. Il s'agit d'une disposition permanente et il n'est donc pas nécessaire d'obtenir un permis distinct pour chaque importation. Toute manipulation par un personnel non habilité de matière suspecte de renfermer l'agent de la maladie vésiculeuse est interdite sur le territoire du Royaume-Uni. Il n'est pas autorisé de faire appel à des sociétés de courrier.

8. Le transport des échantillons vers les laboratoires nationaux doit être effectué conformément aux instructions de l'autorité compétente des États membres.

CHAPITRE IV

Procédures d'échantillonnage dans les exploitations lorsque des porcs présentent des signes cliniques suspects

1. Lorsque l'observation de signes cliniques permet de suspecter la présence de maladie vésiculeuse du porc dans une exploitation, il convient de prélever des échantillons appropriés sur des groupes représentatifs de porcs présentant ces signes cliniques, aux fins de confirmation de la maladie et de diagnostic différentiel par rapport à la fièvre aphteuse.

2. Les échantillons à prélever de préférence dans ces exploitations aux fins de diagnostic sont l'épithélium et le fluide vésiculaire provenant des vésicules intactes ou récemment ouvertes de porcs présentant les symptômes caractéristiques de la maladie. Ces échantillons permettent de détecter la présence du virus de la maladie vésiculeuse du porc, de ses antigènes ou de son génome. Il est recommandé de prélever les échantillons sur cinq ou six porcs.

3. Même si l'on dispose de tissu épithélial frais et de fluide vésiculaire en quantités suffisantes (1 g ou plus), il convient également de prélever:

a) des échantillons de sang provenant des porcs suspects et des porcs voisins, pour les tests sérologiques;

b) des échantillons de matières fécales prélevés sur les porcs suspects, le plancher de leur enclos et le plancher des enclos adjacents, pour les tests virologiques.

4. Les procédures de prélèvement et de transport des échantillons sont les suivantes:

a) pour les échantillons d'épithélium et de fluide vésiculaire:

- si possible, prélever au moins 1 g de tissu d'épithélium d'une vésicule intacte ou récemment ouverte. Pour éviter toute blessure au personnel et pour des motifs de bien-être animal, il est recommandé d'administrer un sédatif aux porcs avant le prélèvement d'échantillons,

- si le transport au laboratoire national est effectué immédiatement (moins de 3 heures), les échantillons épithéliaux peuvent être transportés à l'état sec dans un conditionnement réfrigéré. Si toutefois le temps nécessaire est susceptible de dépasser trois heures, les échantillons doivent être placés dans un petit volume de milieu de transport composé à parts égales de glycérol et d'une solution tampon à 0,04 M, phosphatée ou autre (HEPES), de manière à maintenir des conditions de pH optimales pour la survie du virus de la fièvre aphteuse (de 7,2 à 7,6). Le sérum de transport doit être additionné d'antibiotiques de façon à prévenir toute activité microbienne supplémentaire. Les antibiotiques indiqués et leur concentration finale par ml sont les suivants:

i) pénicilline 1000 UI

ii) sulfate de néomycine 100 UI

iii) sulphate de polymixine B 50 UI

iv) mycostatine 100 UI,

- s'il est possible de prélever le fluide vésiculaire d'une vésicule intacte, celui-ci doit être conservé sans dilution dans un conditionnement distinct;

b) pour les échantillons de sang:

- les échantillons de sang peuvent être prélevés pour les tests sérologiques ou virologiques. Toutefois, ils ne sont généralement prélevés que sur des porcs présumés débarrassés de l'infection clinique ou subclinique, aux fins de recherche d'anticorps. Les échantillons d'épithélium, de fluide vésiculaire ou de matières fécales provenant de porcs présentant des signes cliniques de maladie sont en effet mieux indiqués que les prélèvements sanguins pour la recherche du virus. Il est recommandé de prélever les échantillons de sang entier à l'aide de "vacutainers" sans addition d'anticoagulant et de transporter ces derniers sans les ouvrir;

c) pour les échantillons de matières fécales:

- les échantillons de matières fécales collectés sur les sols de sites suspects d'abriter ou d'avoir abrité des porcs atteints de la maladie vésiculeuse du porc, ainsi que les échantillons de matières fécales recueillis directement ou par imprégnation sur des porcs suspects vivants doivent être placés dans des conditionnements solides et étanches.

L'extérieur de ces conditionnements doit être désinfecté avant l'expédition au laboratoire. On utilisera à cet effet les désinfectants suivants:

- hydroxyde de sodium (dilution 1:100),

- formaline (dilution 1:9 d'une solution de formaline contenant un minimum de 34 % de formaldéhyde),

- hypochlorite de sodium (à 2 % de chlore disponible).

Ces désinfectants doivent être manipulés avec précautions.

CHAPITRE V

Procédures d'échantillonnage pour la sérosurveillance de la maladie vésiculeuse du porc

1. Lorsqu'une sérosurveillance est mise en oeuvre pour:

a) la surveillance d'exploitations dans lesquelles rien ne permet d'établir ou de suspecter la présence de la maladie;

b) la surveillance à l'abattoir, au marché, au centre de rassemblement ou à tout endroit comparable par échantillonnage sérologique de routine;

c) la surveillance non discriminatoire des porcs reçus d'autres États membres dans l'exploitation importatrice,

des échantillons de sang doivent être prélevés sur les porcs aux fins de tests sérologiques, conformément aux dispositions des programmes ou des plans de suivi ou d'éradication approuvés dans le cadre de la décision 90/424/CEE du Conseil(1) ou de la directive 90/425/CEE du Conseil(2), ou encore, en l'absence de telles dispositions, conformément aux procédures définies par les autorités compétentes des États membres.

2. Lorsqu'une sérosurveillance est mise en oeuvre pour:

a) la surveillance d'exploitations situées dans les zones de protection et de surveillance établies après confirmation des foyers de maladie conformément à l'annexe II, points 7 et 8, de la directive 92/119/CEE du Conseil;

b) la surveillance des exploitations visées à l'article 9 de la directive 92/119/CEE,

des échantillons de sang doivent être prélevés sur les porcs aux fins de tests sérologiques selon les principes suivants:

- dans le cas des exploitations de reproduction, il convient d'appliquer une procédure d'échantillonnage aléatoire permettant de détecter une prévalence de 5 % de séroconversions avec un niveau de fiabilité de 95 %,

- dans le cas des exploitations ne détenant que des porcs d'engraissement, la procédure d'échantillonnage doit assurer le prélèvement d'un nombre total d'échantillons au moins égal au nombre requis pour permettre de détecter une prévalence de 5 % avec un niveau de fiabilité de 95 %. Dans tous les cas, les échantillons doivent provenir du plus grand nombre possible d'enclos sélectionnés de manière aléatoire,

- dans le cas des exploitations mixtes pratiquant à la fois la reproduction et l'engraissement, l'échantillonnage doit porter sur chacun des groupes de porcs détenus dans des espaces distincts et permettre de détecter une prévalence de 5 % de séroconversions avec un niveau de fiabilité de 95 %.

CHAPITRE VI

Autres actions et procédures de rééchantillonnage en cas de détection de porcs séropositifs

1. Lorsqu'un unique porc séropositif est détecté dans une exploitation à la suite de la surveillance visée au chapitre V, points 1 a) ou 2, l'autorité compétente veille:

a) à ce que les mesures visées à l'article 4 de la directive 92/119/CEE soient appliquées dans l'exploitation concernée, si ce n'est déjà le cas;

b) à ce qu'un contrôle de l'exploitation conforme aux dispositions du chapitre II, point 1 soit effectué;

c) à ce que des échantillons de sang soit prélevés aux fins de tests sérologiques sur:

- le porc suspect,

- les porcs voisins détenus dans le même enclos que le porc suspect et dans les enclos adjacents. L'échantillonnage doit être conduit de manière à permettre la détection d'une prévalence de 50 % de séroconversions avec un niveau de fiabilité de 95 % dans l'enclos.

2. Toutefois, l'autorité compétente peut décider de lever les mesures visées au point 1 a) si:

a) l'enquête épidémiologique effectuée conformément à l'article 8 de la directive 92/119/CEE suggère que l'exploitation n'a pas été contaminée par la maladie vésiculeuse du porc;

b) aucun signe clinique de la maladie vésiculeuse du porc n'a été détecté dans l'exploitation;

c) l'exploitation n'est pas située dans une zone de surveillance ou de restriction établie après l'apparition d'un foyer de maladie confirmé, ni soumise à d'autres restrictions liées à un foyer de maladie confirmé,

et pourvu que:

- aucun porc ne quitte l'exploitation dans le cadre d'échanges commerciaux intracommunautaires,

- les porcs ne quittent l'exploitation que pour l'abattoir en vue d'un abattage immédiat ou pour une autre exploitation dont aucun porc ne sort dans le cadre d'échanges commerciaux intracommunautaires,

et ce jusqu'à ce que de nouveaux contrôles et tests sérologiques permettent d'exclure définitivement tout risque de maladie vésiculeuse du porc.

3. Si les contrôles et les tests sérologiques effectués conformément aux points 1 b) et 1 c) visés ci-dessus:

a) donnent des résultats négatifs, ou si seul un porc précédemment positif est confirmé positif (faux positif), la maladie vésiculeuse du porc peut être exclue. Les mesures visées au point 1 a) peuvent alors être levées, sauf si l'exploitation est située dans une zone de protection ou de surveillance établie autour d'un foyer de maladie où les mesures d'éradication doivent rester en vigueur conformément à l'annexe II, points 7 ou 8, de la directive 92/119/CEE;

b) démontrent la présence sur l'exploitation de plusieurs porcs séropositifs, il y a lieu soit de confirmer la présence de la maladie vésiculeuse du porc, soit, si les conditions prévues à l'annexe II, point 4, de la directive 92/119/CEE pour la confirmation de la maladie ne sont pas réunies, de prélever d'autres échantillons sur cette exploitation conformément aux procédures d'échantillonnage visées plus haut au point 4.

4. Si l'on détecte la présence de plusieurs porcs séropositifs sur une exploitation à la suite des prélèvements d'échantillons et tests sérologiques visés au chapitre V, points 1 a), 1 c) ou 2, mais que les conditions prévues à l'annexe II, point 4, de la directive 92/119/CEE pour la confirmation de la maladie ne sont pas réunies, il appartient à l'autorité compétente de veiller:

a) à ce que les dispositions visées à l'article 4 de la directive 92/119/CEE soient appliquées ou continuent à être appliquées;

b) à ce qu'un contrôle de l'exploitation conforme aux dispositions du chapitre II, point 1, soit effectué;

c) à ce que de nouveaux échantillons de sang soient prélevés sur les porcs séropositifs et les porcs voisins aux fins de tests sérologiques, conformément au point 1 c);

d) à ce que des échantillons de sang soient prélevés aux fins de tests sérologiques sur des porcs détenus dans les autres bâtiments de l'exploitation, conformément à la procédure visée au chapitre V, point 2;

e) à ce que soit recueilli, aux fins de tests virologiques, un nombre suffisant d'échantillons de matières fécales provenant:

- des porcs séropositifs,

- du plancher des enclos abritant des porcs séropositifs et des enclos adjacents,

- d'enclos sélectionnés de façon aléatoire dans d'autres bâtiments de l'exploitation.

Les échantillons de matières fécales recueillis conformément aux premier et deuxième tirets doivent être examinés dès que possible. Si ces échantillons sont négatifs mais que les résultats des tests sérologiques suggèrent que le virus de la maladie vésiculeuse du porc ait pu contaminer d'autres bâtiments, il y a lieu d'examiner également les échantillons de matière fécale prévus au troisième tiret.

Si au terme de ces nouveaux contrôles et tests les conditions fixées à l'annexe II, point 4, de la directive 92/119/CEE pour la confirmation de la maladie vésiculeuse du porc ne sont pas réunies, les porcs séropositifs sont mis à mort ou abattus conformément aux dispositions de l'annexe II, point 4 d), de la directive 92/119/CEE. Toutefois, si d'autres porcs sont reconnus séropositifs, outre ceux déjà reconnus séropositifs à la suite des échantillonnages précédents, il y a lieu d'appliquer à nouveau les dispositions et les procédures prévues aux points a), b), c), d) et e), mutatis mutandis.

5. Sans préjudice des mesures visées à l'article 9 de la directive 92/119/CEE, si un ou plusieurs porcs sont reconnus séropositifs à la suite des activités de surveillance visées au chapitre V, points 1 b) ou c), l'autorité compétente veille:

a) à ce que, dans la mesure du nécessaire et du possible, des vérifications supplémentaires soient conduites, avec collecte d'échantillons, de manière à confirmer ou à exclure la présence de maladie vésiculeuse du porc sur le site où les porcs concernés ont été détectés, en tenant compte des paramètres locaux;

b) à ce que les mesures visées à l'article 4 de la directive 92/119/CEE soient appliquées dans l'exploitation d'origine de ces porcs;

c) à ce qu'un contrôle conforme aux dispositions du chapitre II, point 1, soit effectué dans l'exploitation d'origine des porcs;

d) à ce que des échantillons de sang soient prélevés aux fins de tests sérologiques sur les porcs détenus dans l'exploitation d'origine des porcs séropositifs, conformément aux dispositions prévues au chapitre V, point 2.

6. Toutefois, l'autorité compétente peut décider de lever les mesures visées au point 5 b) dès lors que:

a) l'enquête épidémiologique effectuée conformément aux articles 4 et 8 de la directive 92/119/CEE suggère que l'exploitation n'a pas été contaminée par la maladie vésiculeuse du porc;

b) aucun signe clinique de la maladie vésiculeuse du porc n'a été détecté dans l'exploitation;

c) l'exploitation n'est pas située dans une zone de surveillance ou de restriction établie après l'apparition d'un foyer de maladie confirmé, ni soumise à d'autres restrictions liées à un foyer de maladie confirmé,

et pourvu que:

- aucun porc ne quitte l'exploitation dans le cadre d'échanges commerciaux intracommunautaires,

- les porcs ne quittent l'exploitation que pour l'abattoir en vue d'un abattage immédiat ou pour une autre exploitation dont aucun porc ne sort dans le cadre d'échanges commerciaux intracommunautaires,

et ce jusqu'à ce que de nouveaux contrôles et tests sérologiques réalisés sur le site où les porcs séropositifs ont été détectés ainsi que dans leur exploitation d'origine permettent d'exclure définitivement tout risque de maladie vésiculeuse du porc.

CHAPITRE VII

Principes et applications des essais virologiques et appréciation de leurs résultats

A. Détection de l'antigène du virus

1. Le sandwich ELISA indirect est devenu la méthode de choix, en remplacement du test de fixation du complément, pour la détection de l'antigène du virus de la maladie vésiculeuse du porc. Le test est identique à celui qui est utilisé pour le diagnostic de la fièvre aphteuse. Les tests pour les deux maladies doivent être exécutés simultanément, à moins que la fièvre aphteuse n'ait déjà été exclue. Il est recommandé de les appliquer notamment aux échantillons d'épithélium ou de fluide provenant des lésions vésiculaires, qui sont susceptibles de contenir à la fois les virus de la maladie vésiculeuse du porc et de la fièvre aphteuse, en quantités importantes si l'infection est sérieuse, ce qui permet de les détecter en quelques heures(3).

Les doubles rangées des plaques ELISA à loges multiples sont enduites de l'antisérum de lapin associé à la maladie vésiculeuse du porc et de chacun des sept sérotypes du virus de la fièvre aphteuse. Ce sont les sérums pièges. Des suspensions témoins sont ajoutées dans chacune des rangées. Des contrôles appropriés sont également inclus. Le sérum homologue de détection (cobaye) est ajouté dans les rangées correspondantes à l'étape suivante, puis l'on ajoute du sérum de lapin anti cobaye conjugué à un enzyme tel que le peroxydase de raifort. Un lavage soigneux est effectué entre les différentes étapes pour éliminer les réactifs non liés. Le test est positif si l'ajout d'un substrat chromogène provoque une réaction colorée. Si elles sont assez fortes, les réactions positives sont clairement visibles à l'oeil nu, mais il est également possible de lire les résultats par spectrophotométrie, auquel cas une absorbance de 0,1 par rapport au fond signale une réaction positive.

2. Pour détecter les antigènes de la maladie vésiculeuse du porc et effectuer un diagnostic différentiel par rapport à la fièvre aphteuse dans des échantillons d'épithélium, de fluide vésiculaire ou de cultures de tissus infectés, il est également possible d'utiliser une technique ELISA aux anticorps monoclonaux faisant appel à des anticorps monoclonaux sélectionnés comme pièges et à des anticorps monoclonaux conjugués à un peroxydase comme détecteurs.

3. Il est possible d'utiliser un test ELISA aux anticorps monoclonaux pour étudier la variation antigénique entre les souches du virus de la maladie vésiculeuse du porc. Les antigènes viraux développés dans les cultures de tissus sont piégés par un antisérum hyperimmun de lapin pour la maladie vésiculeuse du porc et absorbés par la phase solide. On fait alors réagir des ensembles appropriés d'anticorps et on compare les fixations des anticorps monoclonaux aux souches sauvages avec celles des anticorps monoclonaux aux souches mères. Des fixations similaires signalent la présence d'épitopes partagées entre les souches mères et les souches sauvages.

B. Isolement et culture des virus

1. Les suspensions clarifiées des échantillons d'épithélium, de fluide vésiculaire ou de matières fécales suspects de renfermer le virus de la maladie vésiculeuse du porc doivent systématiquement être inoculées sur les cultures de cellules sensibles. Si la quantité et la qualité des échantillons provenant des lésions vésiculaires soumis pour l'examen sont insuffisantes pour la mise en oeuvre immédiate d'un test ELISA, il y a lieu de développer le virus dans des cultures de tissu pour amplifier la production d'antigènes.

2. Pour isoler et développer le virus, on dépose la suspension épithéliale clarifiée sur des cultures monocouches de cellules IB-RS-2. Il y a lieu d'utiliser deux dilutions de suspension épithéliale, l'une forte (1/500) et l'autre faible (1/10), afin d'éviter tout blocage de la culture de virus par l'interféron, qui a la propriété d'empêcher le développement du virus de la maladie vésiculeuse du porc. Pour isoler le virus, seuls des antibiotiques sont ajoutés au sérum de culture. Pour le diagnostic différentiel du virus de la fièvre aphteuse, il convient d'ajouter également des cellules primaires de thyroïde bovine ou des cellules rénales de bébés hamsters (BHK-21).

3. En cas d'effet cytopathique, il convient de séparer le liquide surnageant des cultures positives lorsque l'effet est complet et de l'utiliser lors du test ELISA pour l'identification des virus. Les cultures négatives doivent être inoculées sur les cultures cellulaires fraîches à 48 ou 72 heures. Ce passage aveugle est examiné dans les 72 heures. En l'absence d'effet cytopathe après un autre passage aveugle supplémentaire, l'échantillon peut être déclaré négatif pour la présence de virus vivant.

4. Les suspensions d'échantillons de matières fécales peuvent être traitées comme indiqué ci-dessus au point 1. Comme la concentration de virus est généralement moindre dans les matières fécales que dans l'épithélium, il est essentiel de procéder à un troisième passage aveugle si les deux premiers passages ne sont suivis d'aucun effet cytopathe.

5. L'inoculation simultanée d'une ligne de cellules porcine et d'un des systèmes susmentionnés de cultures cellulaires (de préférence des cellules primaires thyroïdiennes bovines) permet d'évaluer utilement si les échantillons vésiculaires contiennent le virus de la maladie vésiculeuse du porc ou celui de la fièvre aphteuse, car le premier ne se développe que dans des cellules porcines. Toutefois, les isolats de virus de la fièvre aphteuse ayant connu de nombreuses transmissions d'un porc à l'autre peuvent aussi se développer de préférence dans des systèmes de cultures cellulaires d'origine porcine.

C. Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour la détection du génome

1. Il est possible d'employer les méthodes de reconnaissance de l'acide nucléique pour détecter le génome du virus de la maladie vésiculeuse du porc dans les matériels cliniques et pour établir des liens entre les isolats de virus de la maladie vésiculeuse du porc en déterminant la séquence nucléotidique d'une partie du génome. Les techniques utilisant la PCR ont été développées pour améliorer la sensibilité du diagnostic. Des procédures de PCR légèrement différentes faisant appel à la transcriptase inverse ont été décrites. Elles utilisent des amorces correspondant à des régions à haute conservation des gènes 1 C et 1 D.

2. La technique PCR est rapide (les résultats sont généralement disponibles dans un délai de 24 heures); elle détecte tous les génotypes de virus de la maladie vésiculeuse du porc et est suffisamment sensible pour être appliquée à des échantillons provenant de cas cliniques suspects.

3. En cas de suspicion d'infection subclinique, lorsque les échantillons sont recueillis après disparition des signes cliniques ou lors du traitement des échantillons de matières fécales, les techniques améliorées de PCR à la transcriptase inverse, telles que la RT-PCR emboîtée, la PCR immune, la PCR ELISA et d'autres méthodes plus élaborées d'extraction de l'ARN, constituent des systèmes de détection au moins aussi sensibles, mais considérablement plus rapides, que les passages multiples sur des cultures de tissus.

4. Le séquençage d'environ 200 nucléotides du gène 1 D qui code la protéine structurelle majeure VP1 permet de grouper des souches de virus de la maladie vésiculeuse du porc selon leur homologie de séquence, et de mettre ainsi en rapport, sur le plan épidémiologique, les souches responsables de foyers d'infection dans différentes régions ou à différentes époques.

D. Appréciation des résultats des tests virologiques

La détection des antigènes ou du génome du virus de la maladie vésiculeuse du porc au moyen d'ELISA et de la PCR a la même valeur diagnostique que l'isolement du virus.

L'isolement du virus doit néanmoins être considéré comme le test de référence et doit être utilisé, si nécessaire, comme test de confirmation, notamment si un résultat positif par ELISA ou PCR n'est associé à aucun des éléments suivants:

a) la détection de signes cliniques de la maladie;

b) la détection de porcs séropositifs;

c) un lien épidémiologique direct avec un foyer confirmé.

CHAPITRE VIII

Principes et applications des essais sérologiques et appréciation de leurs résultats

A. Test de neutralisation du virus

1. Le micro-test de neutralisation quantitative du virus pour la détection des anticorps contre le virus de la maladie vésiculeuse du porc est effectué au moyen de cellules IB-RS-2 ou d'un système de cellules équivalent, sur des plaques microtitre à fond plat de cultures de tissus.

2. Le virus est cultivé sur monocouches de cellules IB-RS-2 et conservé soit à - 20 °C (après addition de 50 % de glycérol), soit à - 70 °C (sans addition de glycérol). Les sérums sont inactivés à 56 °C pendant 30 minutes avant les tests.

B. Tests ELISA

1. Le test ELISA pour la détection des anticorps est un ELISA concurrent à base d'anticorps monoclonal. Si l'échantillon de sérum contient des anticorps contre le virus de la maladie vésiculeuse du porc, la liaison entre l'antigène du virus et un anticorps monoclonal sélectionné conjugué à un peroxydase est inhibée.

Dans cet ELISA l'antigène viral de la maladie vésiculeuse du porc est piégé dans la phase solide au moyen des anticorps monoclonaux. Puis, on procède à l'incubation des échantillons de sérums à la dilution appropriée, et l'on ajoute l'anticorps monoclonal conjugué au peroxydase. Enfin, l'inhibition de la fixation de l'anticorps monoclonal est mesurée au moyen d' un substrat chromogène.

2. Il est utile d'employer un test ELISA à absorption indirecte mettant en oeuvre des anticorps différents selon les isotypes pour détecter les IgG ou IgM spécifiques du virus de la maladie vésiculeuse du porc, afin d'évaluer la durée d'infection du porc ou de contamination des locaux.

Dans le test ELISA à isotypes spécifiques, l'antigène viral est piégé dans la phase solide à l'aide d'un anticorps capteur d'antigène. Si l'échantillon de sérum contient des anticorps contre le virus de la maladie vésiculeuse du porc, il est possible de les détecter en utilisant un anticorps monoclonal anti-IgG de porc ou anti-IgM de porc conjugué au peroxydase. La fixation est ensuite mesurée au moyen d'un substrat chromogène.

Le test ELISA à isotypes spécifiques peut également contribuer à distinguer les faux positifs des porcs réellement séropositifs, comme indiqué plus bas dans la partie C.

C. Réalisation des tests sérologiques et appréciation des résultats

1. Les tests sérologiques recommandés sont la neutralisation du virus et ELISA. Le chapitre X énumère les sérums de référence, qui sont disponibles auprès du laboratoire communautaire de référence dans le but d'assurer la réalisation dans toute la Communauté de tests standardisés.

Le test par neutralisation du virus doit être considéré comme le test de référence, mais il présente l'inconvénient de prendre deux ou trois jours et d'exiger un dispositif de culture de cellules.

Le test ELISA est plus rapide et plus aisé à normaliser. Le test ELISA concurrent à anticorps monoclonaux est le test ELISA le plus fiable décrit à ce jour pour la recherche des anticorps contre la maladie vésiculeuse du porc. Il est recommandé comme test de dépistage sur un grand nombre d'échantillons.

Le test par neutralisation du virus doit néanmoins être employé lorsqu'il y a lieu à des fins de confirmation, notamment après une première détection d'échantillons positifs dans une exploitation. Les porcs déclarés positifs sur la base d'un test ELISA mais reconnus négatifs sur la base du test par neutralisation du virus peuvent être ignorés.

2. Il est possible de suspecter qu'un porc soit un faux positif(4) lorsqu'il est le seul à être reconnu séropositif et que les conditions suivantes sont réunies:

a) on n'observe aucun signe clinique de maladie dans l'exploitation;

b) l'historique de l'exploitation ne révèle aucun épisode de signes cliniques de la maladie;

c) l'historique de l'exploitation ne révèle aucun rapport avec un foyer avéré de la maladie.

3. Il est possible de confirmer qu'un porc est un faux positif dès lors que:

a) les essais complémentaires ne révèlent la présence d'aucun autre porc séropositif;

b) l'analyse des échantillons prélevés sur les porcs voisins après la détection initiale du faux positif présumé ne révèle aucune séroconversion;

c) le taux d'anticorps constaté lors des rééchantillonnages demeure constant ou accuse une régression.

4. Avant toute confirmation d'un statut de faux positif, il importe néanmoins de tenir compte des critères et des principes supplémentaires suivants:

a) la prévalence des faux positifs est d'environ un porc sur 1000;

b) les sérums des faux positifs présentent généralement le profil suivant:

- faible taux d'anticorps lors du test par neutralisation du virus,

- réaction à peine positive au test ELISA concurrent à base d'anticorps monoclonaux,

- exclusivement des IgM et aucun IgG lors du test ELISA aux isotypes spécifiques pour la maladie vésiculeuse du porc(5).

CHAPITRE IX

Signes et caractéristiques cliniques de la maladie vésiculeuse du porc

La maladie vésiculeuse du porc est une maladie contagieuse causée par un entérovirus de la famille des Picornaviridae. C'est une affection vésiculeuse qui peut revêtir une forme subclinique, légère ou grave selon la souche de virus en cause, la voie et l'importance de l'infection ainsi que les conditions d'élevage des porcs. Des facteurs de stress supplémentaires tels que le transport, la présence d'autres porcs et des températures extrêmes pourraient également prédisposer au développement des signes cliniques.

La maladie se caractérise par un peu de fièvre et l'apparition de vésicules sur les bourrelets, les bulbes du talon, la peau des membres et, plus rarement, le groin, les lèvres, la langue et les mamelles. Le taux de morbidité peut atteindre 100 %, mais la mortalité est très faible, voire inexistante.

L'infection peut revêtir une forme asymptomatique ou légère se traduisant uniquement par une dégradation transitoire de l'aspect général des porcs mais conduisant au bout de quelques jours à la production d'anticorps de neutralisation du virus(6).

Si elle est présente dans ses formes subclinique ou légère, la maladie n'est souvent suspectée qu'à la suite des tests sérologiques effectués aux fins de surveillance ou de certification pour l'exportation. Les foyers de maladie vésiculeuse du porc les plus récemment observés en Europe étaient caractérisés par des symptômes discrets ou l'absence de signes cliniques et ce sont souvent les tests sérologiques qui ont permis d'établir un diagnostic.

Il n'en demeure pas moins qu'il est impossible de distinguer les symptômes de la maladie vésiculeuse du porc de ceux de la fièvre aphteuse. Toute affection de type vésiculeux doit donc être traitée dans un premier temps comme une suspicion de fièvre aphteuse et il importe d'établir dans les plus brefs délais un diagnostic différentiel.

La période d'incubation de la maladie vésiculeuse du porc chez un individu donné s'étend généralement de deux à sept jours, après quoi l'on peut observer une fièvre de 41° tout au plus. Dans l'exploitation, les signes cliniques peuvent toutefois ne se manifester que plus tard. Des vésicules se développent alors sur le bourrelet, en général à la jonction avec le talon. Celles-ci peuvent affecter la totalité du bourrelet et provoquer la perte du sabot. Plus rarement, des vésicules peuvent également apparaître sur le groin, particulièrement sur sa surface dorsale, sur les lèvres, sur la langue et sur les mamelles. On peut également observer une légère atteinte aux genoux. Les porcs affectés peuvent boiter et refuser de s'alimenter pendant quelques jours.

Les jeunes porcs sont plus sévèrement touchés, mais la maladie n'est que rarement mortelle, contrairement à la fièvre aphteuse chez les populations de jeunes porcs.

Des manifestations nerveuses ont été signalées, mais elles sont inhabituelles. Les avortements ne sont pas un effet caractéristique de la maladie vésiculeuse du porc. Les arrêts cardiaques dus à une myocardite multifocale sont un effet possible de la fièvre aphteuse et de l'encéphalo-myocardite, spécialement chez les jeunes porcelets, mais sont exclus en cas de maladie vésiculeuse du porc.

La récupération est généralement complète au bout de deux ou trois semaines et la seule séquelle de la maladie est une ligne horizontale foncée sur le sabot, là où sa croissance a été momentanément interrompue.

Les porcs infectés peuvent excréter le virus par le nez ou la bouche et dans leurs excréments jusqu'à 48 heures avant l'apparition des signes cliniques. La production de virus intervient essentiellement au cours des sept jours suivant l'infection et l'excrétion de virus par le nez ou la bouche cesse généralement au bout de deux semaines. Le virus peut être isolé dans les excréments jusqu'à 20 jours après infection, mais il y a été signalé jusqu'à trois mois après l'infection. Il peut persister un temps considérable dans les tissus nécrosés provenant de la rupture des vésicules et dans les excréments.

CHAPITRE X

Sérums de référence pour la maladie vésiculeuse du porc

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(1) JO L 224 du 18.8.1990, p. 19.

(2) JO L 224 du 18.8.1990, p. 29.

(3) Les réactions positives au test ELISA signalent la présence d'au moins 105 TCID50 (doses infectieuses de culture cellulaire) du virus dans l'échantillon.

(4) Tous les tests sérologiques actuellement utilisés pour la maladie vésiculeuse du porc sont susceptibles de révéler une petite proportion de faux positifs. On ignore les causes de ce phénomène. Il pourrait s'expliquer par une réactivité sérologique croisée du virus de la maladie vésiculeuse du porc et d'un autre picornavirus encore non identifié ou par la présence dans le sérum d'autres facteurs non spécifiques.

(5) On ne détecte habituellement que des IgG ou à la fois des IgG et des IgM dans les échantillons de sérum provenant de porcs infectés par le virus de la maladie vésiculeuse du porc, tandis que les sérums de faux positifs ne contiennent généralement que des IgM. On ne détecte pas d'IgG spécifiques dans les échantillons de sérum de porcs infectés par le virus de la maladie vésiculeuse du porc au cours des 10 à 14 jours précédents, mais il est en principe possible d'en détecter dans un deuxième échantillon de sang. Il demeure toutefois impossible de distinguer de façon fiable les porcs récemment infectés des faux positifs tant que leur système immunitaire n'est pas passé de la production d'IgM à celle d'IgG. Voir également le chapitre IX et la note 6 de bas de page.

(6) Des IgM spécifiques peuvent généralement être détectés dans le sang deux ou trois jours après l'infection et disparaître au bout d'environ 30 à 50 jours; des IgG spécifiques peuvent généralement être détectés dans le sang entre 10 et 14 jours après l'infection et y demeurer des années. L'isotype Ig peut être déterminé au moyen du test ELISA décrit au chapitre VIII, partie B, point 2.