ANNEXE I

Système de tests à effectuer conformément aux articles 3, 4, 5, et 7

1. PRINCIPES GÉNÉRAUX CONCERNANT LA PRÉSENCE DE L’ORGANISME NUISIBLE SPÉCIFIÉ

1.1. La présence de l’organisme nuisible spécifié est soupçonnée en cas de résultat positif lors du premier test de détection effectué sur le végétal spécifié ou sur les échantillons d’eau.

1.2. La présence de l’organisme nuisible spécifié est confirmée dans les cas suivants: a) lorsque le premier ou le second test de détection est un isolement sélectif donnant lieu à des colonies qui présentent une morphologie caractéristique et que deux tests d’identification réalisés sur les colonies donnent des résultats positifs; b) lorsque le premier et le second test de détection sont des tests autres qu’un isolement sélectif et que deux tests d’identification donnent des résultats positifs après que l’échantillon a été soumis à un isolement sélectif donnant lieu à des colonies qui présentent une morphologie caractéristique. L’un de ces deux tests d’identification est l’un de ceux visés aux points 2.2 e), f) et g).

2. TESTS

2.1. Tests de détection

Les tests de détection permettent de détecter systématiquement au moins 104 cellules/ml d’extrait concentré remis en suspension d’échantillons asymptomatiques.

Le deuxième test de détection est fondé sur des principes biologiques différents ou sur des régions de nucléotides différentes par rapport au premier test de détection.

Les tests de détection sont les suivants:

a) tests d’immunofluorescence tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales;

b) isolement de l’organisme nuisible spécifié sur milieu de croissance semi-sélectif mSMSA, tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

c) tests PCR classique utilisant les amorces de Pastrik et al., (2002) (1), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

d) tests PCR en temps réel TaqMan® à l’aide d’amorces et de sondes de: i) Weller et al. (2000) (2), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) [utilisant une sonde TaqMan® modifiée par rapport à la sonde originale décrite par Weller et al. (2000)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) («test NYtor»), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; iv) Massart et al. (2014) (5), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

e) test LAMP (loop-mediated isothermal amplification) utilisant les amorces de Lenarčič et al. (2014) (6) (uniquement pour le matériel végétal symptomatique), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales.

2.2. Tests d’identification

Les tests d’identification sont les suivants:

a) tests d’immunofluorescence tels que décrits dans les normes de diagnostic internationales;

b) tests PCR classiques utilisant les amorces de Pastrik et al. (2002), tels que décrits de façon détaillée dans les normes de diagnostic internationales;

c) tests PCR en temps réel TaqMan® à l’aide d’amorces et de sondes de: i) Weller et al. (2000), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; ii) Vreeburg et al. (2016) [utilisant une sonde TaqMan® modifiée par rapport à la sonde originale décrite par Weller et al. (2000)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; iii) Vreeburg et al. (2018) («test NYtor»), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales; iv) Massart et al. (2014), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

d) test LAMP (loop-mediated isothermal amplification) utilisant les amorces de Lenarčič et al. (2014), tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

e) test PCR multiplex classique spécifique au phylotype [Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

f) codification de l’ADN en code-barres [Wicker et al. (2007) (9)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales;

g) SM MALDI-TOF [van de Bilt et al. (2018) (10)], tel que décrit dans les normes de diagnostic internationales.

3. DIAGRAMMES DES PROCÉDURES

Diagramme no 1: Procédure de diagnostic de la présence de l’organisme nuisible spécifié dans des échantillons du végétal spécifié.

a L’isolement peut être utilisé comme premier ou deuxième test de détection. Si la présence de l’organisme nuisible spécifié est soupçonnée sur le milieu de croissance, les colonies sont purifiées pour obtenir des cultures pures sur lesquelles deux tests d’identification sont effectués.

b L’un de ces deux tests d’identification est l’un de ceux visés aux points 2.2 e), f) et g). Des résultats positifs aux deux tests d’identification sont nécessaires pour confirmer la présence de l’organisme nuisible.

c Le troisième test de détection est fondé sur des principes biologiques différents ou sur des régions de nucléotides différentes.

Diagramme no 2: Procédure de diagnostic de la présence de l’organisme nuisible spécifié dans des échantillons d’eau

a L’un de ces deux tests d’identification est l’un de ceux visés aux points 2.2 e), f) et g). Des résultats positifs aux deux tests d’identification sont nécessaires pour confirmer la présence de l’organisme nuisible.

4. PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON

4.1. Échantillons de tubercules asymptomatiques

L’échantillon standard compte 200 tubercules par test. La procédure de laboratoire appropriée pour traiter les noyaux de talons en vue d’obtenir l’extrait destiné à la détection de l’organisme nuisible spécifié est décrite dans les normes de diagnostic internationales.

4.2. Échantillons prélevés sur des végétaux spécifiés asymptomatiques

La détection des infections latentes est effectuée sur des échantillons composites de segments de tiges ou de pétioles foliaires. La procédure peut être appliquée à un maximum de 200 parties de tiges ou 200 pétioles foliaires issus de différents végétaux dans un seul échantillon. La procédure de laboratoire appropriée pour désinfecter et traiter les segments de tiges ou de pétioles foliaires afin d’obtenir l’extrait destiné à la détection de l’organisme nuisible spécifié est décrite dans les normes de diagnostic internationales.

4.3. Échantillons prélevés sur du matériel symptomatique des végétaux spécifiés

Des fragments de tissus sont retirés dans des conditions d’asepsie de l’anneau vasculaire d’un tubercule de pomme de terre ou des vaisseaux de la tige de végétaux spécifiés présentant des symptômes de flétrissement. La procédure de laboratoire appropriée pour traiter ces tissus afin d’obtenir l’extrait destiné à la détection de l’organisme nuisible spécifié est décrite de façon détaillée dans les normes de diagnostic internationales.

4.4. Échantillons d’eaux de surface ou d’eaux de recyclage (comprenant les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d’eaux usées)

Le principal test de détection de l’organisme nuisible spécifié dans les échantillons d’eaux de surface, d’eaux issues des systèmes de recyclage et d’effluents d’eaux usées (industrie de transformation des pommes de terre) est l’isolement sélectif. La procédure de laboratoire appropriée pour traiter les échantillons d’eau est décrite dans les normes de diagnostic internationales.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, p. 831-842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology 66, p. 2853-2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, p. 112-121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. Bulletin OEPP 48, p. 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, p. 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, p. 19-30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the «Ralstonia solanacearum species complex». In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), p. 449-461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, p. 6790-6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.