ANNEXE I

Méthodes de test pour la détection et l’identification de l’organisme nuisible spécifié visé à l’article 3, paragraphe 2

1. Tests au moyen de spores

Pour la détection et l’identification, des sporanges d’été et des spores dormantes sont utilisés. Ils sont obtenus à partir du sol après tamisage ou directement à partir du matériel végétal.

2. Méthodes de détection

Pour l’extraction de spores de l’organisme nuisible spécifié dans le sol, l’une des méthodes suivantes est utilisée:

a) méthode de tamisage du sol, telle que décrite par Pratt (1976) (1);

b) méthode de tamisage du sol, telle que décrite par van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) technique de centrifugation zonale pour le traitement d’échantillons à haut débit, telle que décrite par Wander et al. (2007) (3).

3. Méthodes d’identification

Après extraction, les spores de l’organisme nuisible spécifié sont identifiées par l’une des méthodes suivantes:

a) identification morphologique à l’aide d’un microscope optique à un grossissement de x 100 à x 400.

b) test PCR classique à l’aide d’amorces fondé sur Lévesque et al. (2001) (4) et van den Boogert et al. (2005) (5);

c) test PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes fondé sur van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) test PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes fondé sur Smith et al. (2014) (7).

4. Viabilité des spores dormantes

La viabilité des spores dormantes peut être déterminée par examen microscopique ou par un test biologique. La viabilité des sporanges peut être déterminée par examen microscopique des sporanges montés dans le lactophénol ou dans l’eau (Przetakiewicz 2015) (8). Les sporanges contenant des granules ou un protoplasme légèrement arrondi peuvent être considérés comme viables. Ceux qui sont plasmolysés de façon permanente ou sans contenu apparent sont considérés comme morts.

À titre de solution de remplacement, ou en cas de doute, un test biologique, tel que décrit à l’annexe IV, point 3, peut être effectué.

5. Détermination des pathotypes

La détermination des pathotypes nécessite des galles fraîches.

L’inoculum du test est obtenu par l’une des méthodes suivantes:

a) la méthode du SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture – Institut de science et de conseil pour l’agriculture écossaise), qui consiste en deux étapes: i) production d’inoculum L’ancien tissu de galle (brun) est fractionné en morceaux plus petits et séché à l’air à température ambiante jusqu’à ce qu’il devienne dur. Ce tissu dur est broyé, soit manuellement soit mécaniquement. Le matériau broyé est tamisé à sec, recueillant la fraction de 25 à 75 μm, puis extrait à l’aide de la méthode chloroforme de Pratt (1976)1; ii) production de galles fraîches Environ 10 mg de spores dormantes extraites sont ajoutés à la surface de 10 ml d’eau distillée stérile dans une petite boîte de Petri en plastique et incubés dans l’obscurité à 20 °C jusqu’à la germination. Les tubercules de pommes de terre à petits germes d’une longueur d’environ 1 à 2 mm sont placés dans des boîtes en plastique transparentes, revêtues intérieurement de papier absorbant humide, les germes marqués étant orientés vers le haut. À l’aide d’une seringue, de la vaseline fondue est disposée en cercle autour des germes. Les cercles doivent être continus et suffisamment élevés pour retenir la suspension de spores sans qu’il y ait de fuite. Les 10 ml de spores dormantes en germination sont à nouveau dilués dans 20 ml d’eau stérile supplémentaire et placés à l’intérieur des cercles à l’aide d’une pipette ou d’un flacon souple jusqu’à ce que les germes soient complètement immergés dans des suspensions de spores. Les boîtes en plastique sont recouvertes de couvercles et incubées pendant 4 jours à une température de 10 °C, après quoi elles sont ouvertes, l’inoculum et les cercles de vaseline sont retirés et les boîtes sont déplacées vers une serre embuée à une température de 15 à 18 °C (16 heures de lumière);

b) la méthode de Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c) la méthode de Potoček et al. (1991) (10);

d) la méthode de Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble et Glynne 1970 (13)).

Pour déterminer tous les pathotypes réputés pertinents pour l’Union [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) et 38(Nevşehir)], un test d’infection différentielle avec différentes variétés du végétal spécifié est utilisé comme indiqué dans le tableau. Le test d’infection est effectué conformément au protocole mentionné au point d) (méthode de Glynne-Lemmerzahl).

Sensibilité sélective des cultivars de pomme de terre pour la détermination des pathotypes de S. endobioticum

Cultivar Pathotypes de S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R «S» Sensible «R» Résistante *: indique une faible sensibilité de la variété à S. endobioticum («présence de champs de sores non nécrotiques sans formation de galles»).

(1) Pratt, MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21 – 29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25 – 31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P, 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165 – 174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200–201.

(5) Van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47 – 57.

(6) Van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129 – 133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422 – 432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114 – 115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191 – 205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 – 60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288 – 297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125 – 135.