Règlement (CE) no 2091/2002 de la Commission

du 26 novembre 2002

modifiant le règlement (CE) n° 2870/2000 établissant des méthodes d'analyse communautaires de référence applicables dans le secteur des boissons spiritueuses

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu le règlement (CEE) n° 1576/89 du Conseil du 29 mai 1989 établissant les règles générales relatives à la définition, à la désignation et à la présentation des boissons spiritueuses(1), modifié par l'acte d'adhésion de l'Autriche, de la Finlande et de la Suède, et notamment son article 4, paragraphe 8,

considérant ce qui suit:

(1) Le règlement (CE) n° 2870/2000 de la Commission du 19 décembre 2000 établissant des méthodes d'analyse communautaires de référence applicables dans le secteur des boissons spiritueuses(2) décrit ces méthodes dans son annexe.

(2) Quatre méthodes d'analyse applicables à la détermination de l'anéthole dans les boissons spiritueuses anisées, de l'acide glycyrrhizique et des chalcones dans les pastis ainsi que du jaune d'oeuf dans les liqueurs aux oeufs et à base d'oeufs ont été validées selon des critères internationalement reconnus dans le cadre d'une action de recherche soutenue par la Commission.

(3) Ces quatre méthodes peuvent être reconnues comme méthodes communautaires de référence et doivent être ajoutées à l'annexe du règlement (CE) n° 2870/2000.

(4) Les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité d'application pour les boissons spiritueuses,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

L'annexe du règlement (CE) n° 2870/2000 est modifiée comme suit:

1) Dans le sommaire de l'annexe, les termes "(p.m.)" sont supprimés en regard des points V, VI, VII et IX.

2) Les points V, VI, VII et IX figurant à l'annexe du présent règlement sont ajoutés après le chapitre III.

Article 2

Le présent règlement entre en vigueur le septième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 26 novembre 2002.

Par la Commission

Franz Fischler

Membre de la Commission

(1) JO L 160 du 12.6.1989, p. 1.

(2) JO L 333 du 29.12.2000, p. 20.

ANNEXE

V. ANÉTHOLE. DOSAGE DU TRANS-ANÉTHOLE DANS LES BOISSONS SPIRITUEUSES PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

1. Champ d'application

Cette méthode convient au dosage du trans-anéthole dans les boissons spiritueuses anisées par chromatographie capillaire en phase gazeuse.

2. Références normatives

ISO 3696: 1987 Eau pour laboratoire à usage analytique - Spécifications et méthodes d'essai

3. Principe

La concentration en trans-anéthole de la boisson spiritueuse est déterminée par chromatographie en phase gazeuse (GC). Après addition de la même quantité d'un étalon interne, à savoir par exemple le 4-allylanisole (estragole) lorsque l'estragole n'est pas naturellement présent dans l'échantillon, la prise d'essai, d'une part, et une solution titrée de référence contenant le trans-anéthole, d'autre part, toutes deux diluées à l'aide d'éthanol à 45 %, sont injectées directement dans le chromatographe. Pour les boissons spiritueuses à forte concentration en sucres, il y a lieu de procéder à une extraction avant la préparation et l'analyse de l'échantillon.

4. Réactifs et matériaux

Au cours de l'analyse, on utilise exclusivement des réactifs de pureté égale ou supérieure à 98 % et une eau de classe 3 au minimum, répondant à la définition de la norme ISO 3696.

Les substances de référence doivent être conservées au froid (à environ 4 °C) et à l'abri de la lumière, dans des récipients en aluminium ou des flacons spéciaux pour réactifs en verre teinté (ambré). Les bouchons doivent être équipés, de préférence, d'un opercule d'étanchéité en aluminium. Le trans-anéthole doit être "décongelé" de son état cristallin avant emploi, mais il ne doit en aucun cas être soumis à des températures excédant 35 °C.

4.1. Éthanol à 96 % vol (CAS 64-17-5)

4.2. 1-methoxy-4- (1-propényl) benzène; (trans-anéthole) (CAS 4180-23-8)

4.3. Étalon interne proposé: 4-allylanisole, (estragole) (CAS 140-67-0)

4.4. Éthanol à 45 % vol

Ajouter 560 g d'eau distillée à 378 g d'éthanol à 96 % vol

4.5. Préparation des solutions étalons

Toutes les substances de référence doivent être conservées à température ambiante (15 à 35 ° C) et à l'abri de la lumière, dans des récipients en aluminium ou des flacons spéciaux pour réactifs en verre teinté (ambré). Les bouchons doivent être équipés, de préférence, d'un opercule d'étanchéité en aluminium.

Le trans-anéthole et le 4-allylanisole étant pratiquement non solubles dans l'eau, il est nécessaire de les dissoudre dans un peu d'éthanol à 96 % vol (point 4.1) avant l'addition d'éthanol à 45 % vol (point 4.4).

Les solutions mères doivent être renouvelées chaque semaine.

4.5.1. Solution étalon A

Solution mère de trans-anéthole (concentration: 2 g/l)

Peser 40 mg de trans-anéthole (point 4.2) dans une fiole jaugée de 20 ml (ou 400 mg dans 200 ml, etc.). Ajouter un peu d'éthanol à 96 % vol (point 4.1) et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Mélanger soigneusement.

4.5.2. Solution étalon interne B

Solution mère d'étalon interne, par exemple d'estragole (concentration: 2 g/l)

Peser 40 mg d'estragole (voir 4.3) dans une fiole jaugée de 20 ml (ou 400 mg dans 200 ml, etc.). Ajouter un peu d'éthanol à 96 % vol (point 4.1) et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Mélanger soigneusement.

4.5.3. Solutions servant à contrôler la linéarité de la réponse du détecteur à ionisation de flamme

La linéarité de la réponse du détecteur à ionisation de flamme doit être contrôlée pour l'analyse d'une fourchette de concentrations de trans-anéthole dans les spiritueux de 0 g/l à 2,5 g/l. Lors de la procédure d'analyse, les échantillons inconnus de spiritueux à analyser sont dilués dix fois (point 8.3). Pour les conditions de l'analyse décrites dans la présente méthode, préparer de la façon suivante des solutions mères correspondant à des concentrations de 0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 et 0,25 g/l de trans-anéthole dans les échantillons à analyser: prélever à l'aide de pipettes 0,5, 1, 1,5, 2 et 2,5 ml de la solution mère A (point 4.5.1) et introduire ces prélèvements dans autant de fioles jaugées de 20 ml. Dans chacune de ces fioles, introduire à la pipette 2 ml de solution étalon interne B (point 4.5.2) et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Mélanger soigneusement.

On utilisera comme solution à 0 g/l la solution à blanc (point 8.4).

4.5.4. Solution étalon C

Introduire à la pipette 2 ml de solution étalon A (point 4.5.1) dans une fiole jaugée de 20 ml, ajouter 2 ml de solution étalon interne B (point 4.5.2) et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Mélanger soigneusement.

5. Appareillage et équipements

5.1. Chromatographe en phase gazeuse, doté d'un détecteur à ionisation de flamme et d'un intégrateur ou de tout autre système d'acquisition et de gestion des données pouvant mesurer les aires ou les hauteurs de pic et équipé d'un dispositif automatique d'échantillonnage ou des appareils nécessaires pour l'injection manuelle de l'échantillon.

5.2. Injecteur de type split/splitless

5.3. Colonne chromatographique capillaire présentant, à titre d'exemple, les caractéristiques suivantes:

longueur: 50 m,

diamètre intérieur: 0,32 mm,

épaisseur du film: 0,2 μm,

phase stationnaire: type FFAP - polymère poreux à liaison croisée polyéthylène glycol TPA modifié.

5.4. Matériels de laboratoire d'usage courant: verrerie jaugée de précision A, balance de laboratoire (précision: ± 0,1 mg).

6. Conditions opératoires de la chromatographie en phase gazeuse

Le type et les dimensions de la colonne ainsi que les conditions opératoires de la chromatographie en phase gazeuse doivent permettre une bonne séparation entre l'anéthole et l'étalon interne ainsi qu'avec tout composé susceptible d'interférer. Les conditions opératoires types pour la colonne présentée à titre d'exemple au point 5.3 sont les suivantes:

6.1. gaz vecteur: hélium de qualité analytique

6.2. débit: 2 ml/mn

6.3. température de l'injecteur: 250 °C

6.4. température du détecteur: 250 °C

6.5. conditions de température du four: palier isotherme à 180 °C pendant 10 minutes

6.6. volume d'injection: 1 μl, split 1:40.

7. Échantillons

Les échantillons doivent être entreposés à température ambiante, à l'abri de la lumière et du froid.

8. Mode opératoire

8.1. Recherche de la présence éventuelle d'estragole dans l'échantillon

Pour vérifier que l'échantillon ne contient pas naturellement de l'estragole, il convient de réaliser une analyse témoin sans addition d'étalon interne. S'il est avéré que l'échantillon contient naturellement de l'estragole, il y a lieu de choisir un autre étalon interne (par exemple, le menthol).

Introduire à la pipette 2 ml d'échantillon dans une fiole jaugée de 20 ml et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Mélanger soigneusement.

8.2. Préparation des échantillons inconnus

Introduire à la pipette 2 ml d'échantillon dans une fiole jaugée de 20 ml, puis ajouter 2 ml de solution étalon interne B (point 4.5.2) et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol. (point 4.4). Mélanger soigneusement.

8.3. Analyse témoin

Introduire à la pipette 2 ml de solution étalon interne B (point 4.5.2) dans une fiole jaugée de 20 ml et porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Mélanger soigneusement.

8.4. Test de linéarité

Avant l'analyse, la linéarité de la réponse du détecteur à ionisation de flamme doit être vérifiée en analysant successivement en triple chacune des solutions titrées servant à contrôler la linéarité (point 4.5.3).

À partir des aires ou hauteurs de pic de l'intégrateur, pour chaque injection, représenter graphiquement la concentration en g/l de la solution mère correspondante en fonction du rapport R.

R= aire ou hauteur de pic du trans-anéthole divisée par l'aire ou la hauteur de pic de l'estragole.

On doit obtenir un tracé linéaire.

8.5. Détermination

Injecter la solution témoin (point 8.3), puis la solution étalon C (point 4.5.4), puis l'un des étalons de linéarité (point 4.5.3) qui servira d'échantillon de contrôle de qualité (à choisir éventuellement en référence à la concentration probable de trans-anéthole dans l'échantillon inconnu), suivi de 5 échantillons inconnus (point 8.2). Pour assurer la stabilité analytique, intercaler un échantillon de contrôle de la linéarité (contrôle de la qualité) après chaque série de cinq échantillons inconnus.

9. Calcul du facteur de réponse

Mesurer soit les aires de pic (à l'aide d'un intégrateur ou d'un autre système d'acquisition et de gestion des données), soit les hauteurs de pic (par intégration manuelle) du trans-anéthole et de l'étalon interne.

9.1. Calcul du facteur de réponse (RFi)

Le facteur de réponse est calculé de la manière suivante:

RFi = (Ci/aire ou hauteur i)*(aire ou hauteur is/Cis)

où:

Ci est la concentration en trans-anéthole de la solution étalon A (point 4.5.1)

Cis est la concentration en étalon interne de la solution étalon B (point 4.5.2)

aire i est l'aire (ou la hauteur) de pic du trans-anéthole

aire is est l'aire (ou la hauteur) de pic de l'étalon interne

Le RFi est calculé à partir des cinq échantillons de la solution C (point 4.5.4).

9.2. Analyse des solutions titrées servant à contrôler la linéarité de la réponse du détecteur à ionisation de flamme

Injecter les solutions de contrôle de la linéarité (point 4.5.3).

9.3. Analyse de l'échantillon

Injecter la solution d'échantillon inconnu (point 8.2)

10. Calcul des résultats

La formule à utiliser pour le calcul de la concentration de trans-anéthole est la suivante:

ci = Cis * (aire ou hauteuri/aire ou hauteuris)*Rfi

où:

ci est la concentration inconnue de trans-anéthole

Cis est la concentration en étalon interne de l'échantillon inconnu (point 4.5.2)

aire ou hauteuri est l'aire ou la hauteur de pic du trans-anéthole

aire ou hauteuris est l'aire (ou la hauteur) de pic de l'étalon interne

RFi est le coefficient de réponse (calculé comme indiqué au point 9.1)

La teneur en trans-anéthole est exprimée en gramme(s) par litre, avec une décimale.

11. Assurance et contrôle de la qualité

Les chromatogrammes doivent présenter une bonne séparation entre l'anéthole et l'étalon interne ainsi qu'avec toute autre substance susceptible d'interférer. La valeur de RFi est calculée à partir des résultats correspondant aux cinq injections de solution C (point 4.5.4). Si le coefficient de variation (CV % = (écart type/moyenne)*100) se situe autour de 1 %, la valeur moyenne du facteur de réponse RFi est acceptable.

L'équation visée ci-dessus doit être utilisée pour calculer la concentration en trans-anéthole de l'échantillon choisi pour le contrôle de qualité parmi les solutions de contrôle de la linéarité (point 4.5.3).

Si les résultats moyens calculés à partir de l'analyse de la solution de contrôle de la linéarité choisie comme étalon interne de contrôle de qualité se situent autour de 2,5 % de leur valeur théorique, les résultats obtenus pour les échantillons inconnus sont jugés acceptables.

12. Traitement des échantillons de spiritueux à forte teneur en sucre et des échantillons de liqueur avant analyse par chromatographie en phase gazeuse

Extraction d'alcool à partir d'une boisson spiritueuse à forte teneur en sucres, afin de déterminer sa teneur en trans-anéthole par chromatographie capillaire en phase gazeuse.

12.1. Principe

On prélève une partie aliquote de l'échantillon de liqueur, à laquelle on ajoute l'étalon interne, à une concentration similaire à celle de l'analyte (trans-anéthole) présent dans la liqueur. On ajoute ensuite du dodécahydrate de phosphate de sodium et du sulfate d'ammonium anhydre. Le mélange est alors bien remué et réfrigéré. Deux phases se séparent et la phase alcoolique supérieure est récupérée. Une partie aliquote de cette phase alcoolique est prélevée et diluée à l'aide d'une solution d'éthanol à 45 % vol (point 4.4). Il convient de noter qu'on n'ajoute pas d'étalon interne à ce stade, puisque cela a déjà été fait. La solution obtenue est prête à être analysée par chromatographie en phase gazeuse.

12.2. Réactifs et matériaux

Au cours de l'extraction, utiliser uniquement des réactifs d'une pureté supérieure à 99 %.

12.2.1. Sulfate d'ammonium anhydre (CAS 7783-20-2)

12.2.2. Dodécahydrate de phosphate de sodium dibasique (CAS 10039-32-4).

12.3. Appareillage et équipements

Fioles coniques, flacons séparateurs, réfrigérateur.

12.4. Mode opératoire

12.4.1. Recherche d'estragole dans l'échantillon

Pour vérifier que l'échantillon ne contient pas d'estragole d'origine naturelle, il convient d'analyser un prélèvement témoin (point 12.6.2) sans addition d'étalon interne. S'il est avéré que l'échantillon contient naturellement de l'estragole, il y a lieu de choisir un autre étalon interne.

12.4.2. Extraction

Introduire à la pipette 5 ml d'éthanol à 96 % vol (point 4.1) dans une fiole conique, puis y ajouter successivement 50 mg d'étalon interne (point 4.3) et 50 ml d'échantillon. Ajouter 12 g de sulfate d'ammonium anhydre (point 12.2.1) et 8,6 g de dodécahydrate de phosphate de sodium dibasique (point 12.2.2). Boucher la fiole conique.

Agiter la fiole pendant au moins trente minutes. Il est possible d'utiliser un dispositif d'agitation mécanique, mais pas un agitateur magnétique à revêtement en téflon, car le téflon absorbe une partie de l'analyte. Noter que les sels ajoutés ne se dissoudront pas complètement.

Placer la fiole bouchée dans un réfrigérateur (T < 5 °C) pendant au moins deux heures.

Après cela, on devrait observer deux couches distinctes en phase liquide et un résidu solide. La couche d'alcool doit être claire; si ce n'est pas le cas, remettre la fiole au froid jusqu'à ce qu'on observe une séparation nette.

Une fois obtenue une couche d'alcool claire, en prélever avec précaution une partie aliquote (10 ml, par exemple), en ayant soin de ne pas troubler la couche aqueuse, puis la verser dans un flacon en verre ambré et reboucher soigneusement.

12.4.3. Préparation de l'extrait d'échantillon à analyser

Attendre que l'extrait (point 12.4.2) soit à température ambiante.

Prélever 2 ml de la couche d'alcool de l'extrait d'échantillon à température ambiante, l'introduire à la pipette dans une fiole jaugée de 20 ml, porter au volume à l'aide d'éthanol à 45 % vol (point 4.4) et mélanger soigneusement.

12.5. Détermination

Suivre la procédure exposée au point 8.5.

12.6. Calcul des résultats

Utiliser la formule suivante pour calculer les résultats:

Ci =( mis/V)*(airei/aireis)*Rfi

où:

mis est la masse d'étalon interne (point 4.3) prélevé (point 12.4.2), exprimée en milligrammes

V est le volume de l'échantillon inconnu (50 ml)

RFi est le facteur de réponse (point 9.1)

airei est l'aire de pic du trans-anéthole

aireis est l'aire de pic de l'étalon interne

Les résultats sont exprimés en grammes par litre, avec une décimale.

12.7. Assurance et contrôle de la qualité

Suivre la procédure exposée au point 11.

13. Caractéristiques de performance de la méthode (précision)

Résultats statistiques de l'essai interlaboratoires

Les tableaux visées ci-après exposent les valeurs concernant l'anéthole.

Les données présentées proviennent d'une étude internationale sur les performances de la méthode, réalisée conformément aux procédures agréées au niveau international.

>TABLE>

>TABLE>

Types d'échantillons

A pastis, doubles en aveugle

B pastis, doubles en aveugle

C pastis, doubles en aveugle

D pastis, doubles en aveugle

E pastis, échantillon unique

F pastis, échantillon unique

>TABLE>

Types d'échantillons

G ouzo, doubles, à deux niveaux de concentration (*)

H anis, doubles en aveugle

I liqueur anisée, doubles

J liqueur anisée, doubles.

VI. ACIDE GLYCYRRHIZIQUE. DOSAGE DE L'ACIDE GLYCYRRHIZIQUE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE À HAUTE PERFORMANCE

1. Domaine d'application

Cette méthode convient au dosage de l'acide glycyrrhizique dans les boissons spiritueuses anisées par chromatographie liquide à haute performance. Le règlement (CEE) n° 1576/89 précise qu'une boisson spiritueuse relevant de la dénomination "Pastis" doit présenter une teneur en acide glycyrrhizique comprise entre 0,05 g/l et 0,5 g/l.

2. Références normatives

ISO 3696: 1987 Eau pour laboratoire à usage analytique - Spécifications et méthodes d'essai

3. Principe

La teneur en acide glycyrrhizique est déterminée en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) avec détection UV. Après filtration, on injecte séparément, directement dans le système CLHP, une solution étalon et l'échantillon test.

4. Réactifs et matériaux

Au cours de l'analyse, on utilise exclusivement des réactifs adaptés à la chromatographie liquide à haute performance, de l'éthanol absolu et une eau de classe 3, répondant à la définition de la norme ISO 3696.

4.1. Éthanol à 96 % vol (CAS 64-17-5)

4.2. Glycyrrhizinate monoammoniacal, C42H62O16.NH3 (sel d'acide glycyrrhizique monoammoniacal)

(Masse molaire: 839,98) (CAS 53956-04-0): pureté minimale de 90 %

(Masse molaire de l'acide glycyrrhizique: 822,94)

4.3. Acide acétique cristallisable CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.4. Méthanol CH3OH (CAS 67-56-1)

4.5. Éthanol à 50 % vol

Pour 1000 ml à 20 °C:

- éthanol à 96 % vol (point 4.1): 521 ml

- eau (point 2.0): 511 ml.

4.6. Préparation des solutions d'élution pour chromatographie liquide à haute performance

4.6.1. Solvant d'élution A (exemple)

80 volumes d'eau (point 2.0)

20 volumes d'acide acétique (point 4.3)

Dégazer le solvant d'élution durant cinq minutes.

NB:

si l'eau utilisée n'est pas microfiltrée, il est souhaitable de filtrer le solvant d'élution à l'aide d'un filtre pour solvants organiques dont le diamètre des pores est inférieur ou égal à 0,45 μm.

4.6.2. Solvant d'élution B

Méthanol (point 4.4)

4.7. Préparation des solutions étalons

Toutes les solutions étalons doivent être renouvelées tous les deux mois.

4.7.1. Solution de référence C

Peser, à 0,1 mg près, 25 mg de glycyrrhizinate monoammoniacal (point 4.2) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre le glycyrrhizinate monoammoniacal dans de l'éthanol à 50 % vol (point 4.5). Après dissolution, compléter au trait de jauge avec une nouvelle quantité d'éthanol à 50 % vol (point 4.5).

Filtrer à l'aide d'un filtre pour solvants organiques.

4.7.2. Solutions étalons (utilisées pour vérifier la linéarité de la réponse des instruments)

Préparer une solution mère en pesant à 0,1 mg près, 100 mg de glycyrrhizinate monoammoniacal dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter un peu d'éthanol à 50 % vol et dissoudre le glycyrrhizinate monoammoniacal. Après dissolution, compléter au trait de jauge avec une nouvelle quantité d'éthanol à 50 % vol (point 4.5).

Préparer au moins quatre autres solutions correspondant à 0,05, 0,1, 0,25 et 0,5 g/l de glycyrrhizinate monoammoniacal en prélevant respectivement 5 ml, 10 ml, 25 ml et 50 ml de la solution mère dans des fioles jaugées séparées de 100 ml. Compléter ensuite au trait de jauge avec une nouvelle quantité d'éthanol à 50 % vol (point 4.5) et mélanger soigneusement.

Filtrer toutes les solutions à l'aide d'un filtre pour solvants organiques.

5. Appareillage et équipements

5.1. Système de séparation

5.1.1. Chromatographe en phase liquide à haute performance

5.1.2. Système de pompage permettant l'obtention et le maintien d'un débit constant ou programmé à haute pression

5.1.3. Système de détection par spectrophotométrie dans le domaine de l'UV, à régler sur une longueur d'onde de 254 nm

5.1.4. Système de dégazage des solvants

5.2. Intégrateur-calculateur ou enregistreur fonctionnant en toute compatibilité avec l'ensemble du système

5.3. Colonne (exemple):

matériau: acier inoxydable ou verre

diamètre intérieur: 4 à 5 mm

longueur: 100 à 250 mm

phase stationnaire: silice greffée avec groupement fonctionnel octadécyle (C18), de préférence sphérique, de granulométrie égale au maximum à 5 μm

5.4. Équipement de laboratoire

5.4.1. Balance de laboratoire (précision: 0,1 mg)

5.4.2. Verrerie jaugée de précision (classe A)

5.4.3. Dispositif de filtration pour petits volumes sur micromembrane

6. Conditions de la chromatographie

6.1. Caractéristiques d'élution (exemple):

- débit d'éluant: 1 ml/minute

- solvant A = 30 %

- solvant B = 70 %.

6.2. Détection

- UV = 254 nm.

7. Mode opératoire

7.1. Préparation de l'échantillon de boisson spiritueuse

Filtrer, si nécessaire, à travers un filtre pour solvants organiques (diamètre des pores égal à 0,45 μm).

7.2. Détermination

Après stabilisation des conditions chromatographiques:

- injecter 20 μl de la solution de référence C (point 4.7.1)

- injecter 20 μl de l'échantillon test

- comparer les deux chromatogrammes obtenus. Identifier les pics de l'acide glycyrrhizique suivant leur temps de rétention. Mesurer leurs aires (ou hauteurs) et calculer la concentration en g/l, jusqu'à deux décimales, en appliquant l'équation suivante:

>PICTURE>

où:

c est la concentration d'acide glycyrrhizique en gramme(s) par litre dans la boisson spiritueuse analysée

C est la concentration de glycyrrhizinate monoammoniacal en gramme(s) par litre dans la solution de référence

h est la surface (ou hauteur) du pic de l'acide glycyrrhizique de la boisson spiritueuse analysée

H est la surface (ou hauteur) du pic de l'acide glycyrrhizique de la solution de référence

P est la pureté du glycyrrhizinate monoammoniacal utilisé comme substance de référence (en %)

823 est la masse molaire de l'acide glycyrrhizique

840 est la masse molaire du glycyrrhizinate monoammoniacal.

8. Caractéristiques de performance de la méthode (précision)

Résultats statistiques de l'essai interlaboratoires

Le tableau visé ci-après présente les valeurs obtenues pour l'acide glycyrrhizique.

Les données présentées proviennent d'une étude internationale sur les performances de la méthode, réalisée conformément aux procédures agréées au niveau international.

>TABLE>

>TABLE>

Types d'échantillons

A pastis, doubles en aveugle

B pastis, doubles, à deux niveaux de concentration (*)

C pastis, doubles en aveugle

D pastis, doubles en aveugle

E pastis, doubles en aveugle

VII. CHALCONES. MÉTHODE DE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE À HAUTE PERFORMANCE POUR VÉRIFIER LA PRÉSENCE DE CHALCONES DANS LE PASTIS

1. Champ d'application

Cette méthode convient pour déterminer si des boissons anisées contiennent ou non des chalcones. Les chalcones sont des substances colorantes naturelles de la famille des flavonoïdes présentes dans le bois de réglisse (Glycyrrhiza glabra).

Pour qu'une boisson spiritueuse anisée puisse être dénommée "Pastis", la présence de chalcones est obligatoire [règlement (CEE) n° 1576/89].

2. Références normatives

ISO 3696: 1987, eau pour laboratoire à usage analytique - Spécifications et méthodes d'essai

3. Principe

Dans une solution d'extrait de réglisse de référence préparée à cet effet, on établit la présence ou l'absence de chalcones par chromatographie liquide à haute performance avec détection UV.

4. Réactifs et matériaux

Au cours de l'analyse, on utilise exclusivement des réactifs adaptés à la chromatographie liquide à haute performance. L'éthanol employé doit titrer 96 % vol. L'eau employée doit être exclusivement de classe 3 (conforme à la définition de la norme ISO 3696).

4.1. Éthanol à 96 % vol (CAS 64-17-5)

4.2. Acétonitrile CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3. Substance de référence: Glycyrrhiza glabra (réglisse)

Bois de réglisse (Glycyrrhiza Glabra) broyé grossièrement. Dimension moyenne des particules, de type "bâtonnet": longueur 10 à 15 mm; épaisseur: 1 à 3 mm.

4.4. Acétate de sodium CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5. Acide acétique cristallisable CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6. Préparation des solutions

4.6.1. Éthanol à 50 % vol

Pour 1000 ml à 20 °C:

- éthanol à 96 % vol (point 4.1): 521 ml

- eau (point 2.0): 511 ml.

4.6.2. Solvant A: acétonitrile

Acétonitrile (point 4.2) de pureté analytique CLHP.

Dégazer

4.6.3. Solvant B: 0,1 M d'une solution tampon d'acétate de sodium de pH 4,66

Dans une fiole jaugée, introduire 8,203 g d'acétate de sodium (point 4.4), ajouter 6,005 g d'acide acétique cristallisable (point 4.5) et porter à 1000 ml avec de l'eau (point 2).

5. Préparation de l'extrait de référence de Glycyrrhiza glabra (point 4.3)

5.1. Peser 10 g de bois de réglisse broyé (Glycyrrhiza glabra, point 4.3) et les placer dans un ballon de distillation.

- Ajouter 100 ml d'éthanol à 50 % vol (point 4.6.1)

- Distiller sous reflux pendant une heure

- Filtrer

- Réserver le filtrat pour une utilisation ultérieure.

5.2. Récupérer l'extrait de bois de réglisse présent dans le filtre.

- Placer dans un ballon de distillation

- Ajouter 100 ml d'éthanol à 50 % vol (point 4.6.1).

- Distiller sous reflux pendant une heure

- Filtrer. Réserver le filtrat pour une utilisation ultérieure.

5.3. L'extraction du bois de réglisse doit être effectuée à trois reprises successives.

5.4. Réunir les trois filtrats.

5.5. Évaporer la phase solvant (du point 5.4) à l'aide d'un évaporateur de type rotatif.

5.6. Récupérer l'extrait résiduel (du point 5.5) à l'aide de 100 ml d'éthanol à 50 % vol (point 4.6.1).

6. Appareillage et équipements

6.1. Système de séparation

6.1.1. Chromatographe en phase liquide à haute performance

6.1.2. Système de pompage permettant l'obtention et le maintien d'un débit constant ou programmé à haute pression

6.1.3. Système de détection par spectrophotométrie dans l'UV/le visible, pouvant être réglé aux longueurs d'onde de 254 et 370 nm

6.1.4. Système de dégazage des solvants

6.1.5. Four à colonne pouvant être réglé à la température de 40 °C [± 0,1) °C]

6.2. Intégrateur-calculateur ou enregistreur dont les performances sont compatibles avec l'ensemble du système de séparation

6.3. Colonne:

matériau: acier inoxydable ou verre

diamètre intérieur: 4 à 5 mm

phase stationnaire: silice greffée avec groupe fonctionnel dérivé octadécyle C 18, de granulométrie maximale 5 μm (phase greffée).

6.4. Matériel courant de laboratoire et notamment:

6.4.1. balance analytique (précision: ± 0,1 mg)

6.4.2. appareil de distillation équipé d'un condenseur à reflux comportant, à titre d'exemple:

- un ballon de 250 ml de capacité, à rodage normalisé

- un condenseur à reflux d'une longueur de 30 cm

- un dispositif de chauffage (toute pyrogénation des matières extractives doit être évitée à l'aide d'un dispositif approprié)

6.4.3. Appareil d'évaporation de type rotatif

6.4.4. Dispositif de filtration (entonnoir dit de Büchner, par exemple)

6.5. Conditions de la chromatographie (à titre d'exemple)

6.5.1. Caractéristiques d'élution solvant A (point 4.6.2)/solvant B (point 4.6.3):

- gradient de 20/80 (v/v) à 50/50 (v/v) en 15 minutes

- gradient de 50/50 (v/v) à 75/25 (v/v) en 5 minutes

- isocratique à 75/25 (v/v) durant 5 minutes

- stabilisation de la colonne entre deux injections

- isocratique 20/80 (v/v) durant 5 minutes.

6.5.2. Débit d'éluant: 1 ml/minute

6.5.3. Paramétrage du détecteur à UV

Le détecteur doit être réglé sur 370 nm pour détecter la présence de chalcones, puis sur 254 nm pour détecter l'acide glycyrrhizique.

NB:

le changement de longueur d'onde (de 370 nm à 254 nm) doit être effectué 30 s avant le début du pic d'élution de l'acide glycyrrhizique.

7. Mode opératoire

7.1. Préparation de l'échantillon de boisson spiritueuse

Filtration à travers un filtre pour solvants organiques (diamètre des pores égal à 0,45 μm)

7.2. Préparation de l'extrait résiduel de réglisse (point 5.6)

Avant analyse, procéder à une dilution au dixième dans de l'éthanol à 50 % vol (point 4.6.1).

7.3. Détermination

7.3.1. Injecter 20 μl de l'extrait de bois de réglisse préparé (point 7.2). Effectuer l'analyse dans les conditions chromatographiques décrites précédemment (point 6.5).

7.3.2. Injecter 20 μl de l'échantillon test (boisson spiritueuse anisée, point 7.1). Effectuer l'analyse dans les conditions chromatographiques décrites précédemment (point 6.5).

7.3.3. Comparer les deux chromatogrammes obtenus. Il doit exister une bonne similitude entre les deux chromatogrammes dans la zone de sortie des chalcones (au cours de la détection à 370 nm dans les conditions d'analyse décrites précédemment). Voir la figure 1.

8. Chromatogramme caractéristique d'un pastis

Figure 1

Chromatogramme réalisé selon la méthode décrite ci-dessus, montrant la présence de chalcones dans un pastis. Les pics 1 à 8 correspondent aux chalcones et le pic 9 à l'acide glycyrrhizique.

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9. Caractéristiques de performance de la méthode (précision)

Résultats de l'essai interlaboratoires

Le tableau visé ci-après présente les caractéristiques de performance pour l'identification de la présence ou de l'absence de chalcones dans les pastis et les boissons spiritueuses anisées.

Les données présentées proviennent d'une étude internationale sur les performances de la méthode, réalisée conformément aux procédures agréées au niveau international.

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Types d'échantillons

A pastis, en double aveugle

B pastis, échantillon unique

C pastis, échantillon unique

D "pastis" (sans chalcones), en double aveugle

E "pastis" (sans chalcones), en double aveugle

F liqueur anisée (sans chalcones), en double aveugle

G liqueur anisée (sans chalcones), doubles en aveugle

H ouzo (sans chalcones), échantillon unique

I ouzo (sans chalcones), échantillon unique

J anis (sans chalcones), doubles en aveugle

K "pastis" (sans chalcones), doubles en aveugle.

IX. JAUNE D'OEUF. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN JAUNE D'OEUF DES BOISSONS SPIRITUEUSES PAR LA MÉTHODE PHOTOMÉTRIQUE

1. Champ d'application

Cette méthode convient pour la détermination d'une teneur en jaune d'oeuf de 40 à 250 g/l dans les liqueurs à base d'oeuf et les liqueurs aux oeufs.

2. Références normatives

ISO 3696:1897 Eau pour laboratoire à usage analytique - Spécification et méthodes d'essai

3. Principe

Les composés phosphorés solubles dans l'éthanol, présents dans le jaune d'oeuf, sont extraits et déterminés par voie photométrique sous forme de complexe molybdate de phosphore.

4. Réactifs

4.1. Eau bidistillée

4.2. Terre d'infusoires

4.3. Éthanol 96 % vol (CAS 64-17-5)

4.4. Solution à 15 % d'acétate de magnésium (CAS 16674-78-5)

4.5. Acide sulfurique à 10 % (CAS 7664-93-9)

4.6. Acide sulfurique 1N

4.7. Solution de dihydrogénophosphate de potassium (CAS 778-77-0), KH2PO4, à 0,16 g/l

4.8. Réactif pour la détermination du phosphate:

20 g de molybdate d'ammonium (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24.4H2O sont dissous dans 400 ml d'eau à 50 °C.

Dans un autre récipient, dissoudre 1 g de vanadate d'ammonium (CAS 7803-55-6), NH4VO3, dans 300 ml d'eau chaude et l'on ajoute, après refroidissement, 140 ml d'acide nitrique concentré (CAS 7697-37-2). Les solutions refroidies sont réunies dans une fiole jaugée de 1000 ml et complétées jusqu'au repère volumétrique.

5. Appareillage et matériel

5.1. Fiole conique de 100 ml

5.2. Bain ultrasonique (ou agitateur magnétique)

5.3. Fiole conique de 100 ml

5.4. Bain-marie à 20 °C

5.5. Filtre (Whatman n° 4 ou équivalent)

5.6. Creuset de porcelaine (ou de platine)

5.7. Bain-marie bouillant

5.8. Plaque chauffante

5.9. Four à moufle

5.10. Fiole jaugée de 50 ml

5.11. Fiole jaugée de 20 ml

5.12. Spectrophotomètre réglé sur 420 nm

5.13. Cuvette de 1 cm.

6. Échantillons

Les échantillons sont entreposés à température ambiante avant d'être analysés.

7. Mode opératoire

7.1. Préparation des échantillons

7.1.1. On introduit 10 g d'échantillon dans une fiole conique de 100 ml (point 5.1).

7.1.2. 70 ml d'éthanol y sont ajoutés progressivement et par petites fractions, en remuant bien à chaque addition. Le mélange est placé dans un bain ultrasonique (point 5.2) pendant 15 minutes [ou remué à l'aide d'un agitateur magnétique (point 5.2) pendant 10 minutes, à température ambiante].

7.1.3. Le contenu de la fiole est transvasé dans une fiole jaugée de 100 ml (point 5.3) et additionné des volumes d'éthanol utilisés pour le rinçage (point 4.3). Compléter avec de l'éthanol (point 4.3) jusqu'au trait de jauge, puis placer les fioles dans un bain-marie à 20 ° C (point 5.4). Toujours à 20 °C, ajuster au trait de jauge.

7.1.4. Filtrer (point 5.5) après addition d'une petite quantité de terre d'infusoires (point 4.2), en rejetant les 20 premiers millilitres.

7.1.5. Transvaser 25 ml du filtrat ainsi obtenu dans un creuset de porcelaine ou de platine (point 5.6). Le filtrat doit ensuite être concentré par évaporation douce au bain-marie (point 5.7), après addition de 5 ml d'une solution d'acétate de magnésium à 15 % (point 4.4).

7.1.6. Placer les creusets sur une plaque chauffante (point 5.8) et les laisser à chauffer jusqu'à ce qu'ils soient à peine secs.

7.1.7. Le résidu sec calciné est porté à l'incandescence dans un four à moufle (point 5.9) réglé sur une température de 600 °C, et ce jusqu'à l'obtention de cendres blanches. L'opération dure au minimum 1 heure et demie, mais peut se prolonger toute une nuit.

7.1.8. Les cendres sont reprises à l'aide de 10 ml d'acide sulfurique à 10 % (point 4.5) et transférées au moyen de rinçages d'eau distillée (point 4.1) dans une fiole jaugée de 50 ml (point 5.10). Celle-ci est complétée avec de l'eau distillée jusqu'au repère volumétrique, à température ambiante. Une partie aliquote de 5 ml de cette solution de cendre est réservée à la préparation de la solution test à utiliser pour le dosage photométrique des phosphates.

7.2. Dosage photométrique des phosphates

7.2.1. Solution comparative

7.2.1.1. Introduire 10 ml d'acide sulfurique à 10 % (point 4.5) dans une fiole jaugée de 50 ml (point 5.10) et compléter jusqu'au repère volumétrique à l'aide d'eau distillée (point 4.1).

7.2.1.2. Dans une fiole jaugée de 20 ml (point 5.11), introduire une partie aliquote de 5 ml de cette solution (point 7.2.1.1), puis ajouter 1 ml d'acide sulfurique 1 N (point 4.6) et 2 ml de réactif au phosphate (point 4.8). Porter à l'aide d'eau distillée (point 4.1) jusqu'à un volume de 20 ml.

7.2.1.3. Fermer sans enfoncer hermétiquement le bouchon, agiter et chauffer pendant 10 mn dans un bain d'eau à ébullition (point 5.7), puis laisser refroidir pendant 20 minutes dans un bain-marie à 20 °C (point 5.4).

7.2.1.4. Verser la solution comparative ainsi obtenue dans une cuvette de 1 cm (point 5.13).

7.2.2. Solution d'échantillon

7.2.2.1. Dans une fiole jaugée de 20 ml (point 5.11), introduire une partie aliquote de 5 ml de la solution de cendres (point 7.1.8), puis ajouter 1 ml d'acide sulfurique 1 N (point 4.6) et 2 ml de réactif au phosphate (point 4.8). Porter à l'aide d'eau distillée (point 4.1) jusqu'à un volume de 20 ml.

7.2.2.2. Fermer sans enfoncer hermétiquement le bouchon, agiter et chauffer pendant 10 mn dans un bain d'eau à ébullition (point 5.7), puis laisser refroidir pendant 20 minutes dans un bain-marie à 20 °C (point 5.4).

7.2.2.3. La solution jaune qui se forme est placée dans une cuvette de 1 cm (point 5.13) et fait immédiatement l'objet, dans un spectrophotomètre à 420 nm (point 5.12), d'une analyse comparée avec la solution de référence (point 7.2.1.4).

7.2.3. Courbe d'étalonnage

7.2.3.1. Pour établir la courbe d'étalonnage, introduire des parties aliquotes de 2 ml du réactif au phosphate (point 4.8) dans des fioles volumétriques de 20 ml (point 5.11) contenant chacune 1 ml d'acide sulfurique 1 N (point 4.6) et, respectivement, 0, 2, 4, 6, 8, et 10 ml de solution de dihydrogénophosphate de potassium (point 4.7). Compléter à l'aide d'eau distillée (point 4.1) jusqu'au repère volumétrique des 20 ml.

7.2.3.2. Fermer sans enfoncer hermétiquement le bouchon, agiter et chauffer pendant 10 mn dans un bain d'eau à ébullition (point 5.7), puis laisser refroidir pendant 20 minutes dans un bain-marie à 20 °C (point 5.4). La solution est ensuite placée dans une cuvette de 1 cm (point 5.13) et fait l'objet, dans un spectrophotomètre à 420 nm (point 5.12), d'une analyse comparée avec la solution de référence (point 7.2.1.4).

7.2.3.3. Établissement de la courbe d'étalonnage

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8. Expression des résultats

La teneur en jaune d'oeuf, exprimée en g/l, est calculée selon la formule suivante:

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où:

110 est le facteur de conversion pour la quantité totale de P2O5 en g dans 100 g de jaune d'oeuf

mg P2O5 est la valeur déterminée par la courbe d'étalonnage

masse volumique est la masse volumique (en g/ml) de la liqueur aux oeufs à la température de 20 ° C

E est le poids de liqueur aux oeufs en g

40 est le facteur de dilution pour une partie aliquote de 5 ml de solution de cendres.

9. Caractéristiques de performance de la méthode (précision)

Résultats statistiques de l'essai interlaboratoires:

L tableau ci-après présente les valeurs obtenues pour le jaune d'oeuf.

Les données présentées proviennent d'une étude internationale sur les performances de la méthode, réalisée conformément aux procédures agréées au niveau international.

>TABLE>

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Types d'échantillons:

A Advocaat, doubles en aveugle

B Advocaat, doubles en aveugle

C Advocaat, doubles en aveugle

D Advocaat (dilué), doubles, avec deux niveaux de concentration (*)

E Advocaat, doubles en aveugle