DIRECTIVE 92/95/CEE DE LA COMMISSION du 9 novembre 1992 modifiant l'annexe de la septième directive 76/372/CEE portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu la directive 70/373/CEE du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (1), modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion de l'Espagne et du Portugal, et notamment son article 2,

considérant que la septième directive 76/372/CEE de la Commission, du 1er mars 1976, portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (2), modifiée par la directive 81/680/CEE (3), prescrit les méthodes à utiliser pour le dosage de l'aflatoxine B1;

considérant qu'il y a lieu d'adapter ces méthodes à l'évolution des connaissances scientifiques et techniques; qu'il convient notamment de disposer d'une méthode qui permette de contrôler les teneurs très faibles d'aflatoxine fixées par la directive 74/63/CEE du Conseil, du 17 décembre 1973, concernant la fixation de teneurs maximales pour les substances et produits indésirables dans les aliments des animaux (4), modifiée en dernier lieu par la directive 91/132/CEE (5);

considérant qu'il convient, en outre, de disposer d'une méthode permettant de doser l'aflatoxine B1 en présence de produits interférents tels que les pulpes d'agrumes;

considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

L'annexe de la directive 76/372/CEE est modifiée conformément à l'annexe de la présente directive.

Article 2

Les États membres mettent en vigueur les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive au plus tard le 1er octobre 1993. Ils en informent immédiatement la Commission.

Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publication officielle. Les modalités de cette référence sont arrêtées par les États membres.

Article 3

Les États membres sont destinataires de la présente directive. Fait à Bruxelles, le 9 novembre 1992. Par la Commission

Ray MAC SHARRY

Membre de la Commission

(1) JO no L 170 du 3. 8. 1970, p. 2. (2) JO no L 102 du 15. 4. 1976, p. 8. (3) JO no L 246 du 29. 8. 1981, p. 32. (4) JO no L 38 du 11. 2. 1974, p. 31. (5) JO no L 66 du 13. 3. 1991, p. 16.

ANNEXE

I. À la partie A « Méthode par chromatographie monodimensionnelle sur couche mince », le texte du point 1 « Objet et domaine d'application » est remplacé par le texte suivant:

« 1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B1 des matières premières et des aliments simples pour les animaux. Cette méthode ne s'applique pas en présence de pulpes d'agrumes. La limite inférieure du dosage est de 0,01 mg/kg (10 ppb).

En présence de substances interférentes qui entravent les déterminations, il y a lieu de recommencer l'analyse selon la méthode B (par chromatographie en phase liquide haute performance). »

II. À la partie B « Méthode par chromatographie bidimensionnelle sur couche mince », le texte est remplacé par le suivant:

« B. DÉTERMINATION DE L'AFLATOXINE B1 PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE

1. Objet et domaine d'application Cette méthode permet le dosage de l'aflatoxine B1 dans les aliments des animaux, y compris ceux contenant des pulpes d'agrumes. La limite inférieure du dosage est de 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Principe L'échantillon est extrait par du chloroforme. L'extrait est filtré et une fraction aliquote est purifiée sur une cartouche de Florisil puis sur une cartouche C18. La séparation finale et la détection sont effectuées par chromatographie en phase liquide haute performance en utilisant une colonne C18 en phase inverse, puis une dérivatisation postcolonne à l'iode permet une détection fluorimétrique. Note: Les mycotoxines sont des substances extrêmement toxiques. Les manipulations doivent être effectuées sous une hotte ventilée. Des précautions particulières doivent être prises du fait de leur nature électrostatique et par conséquent de leur tendance à se disperser sur les surfaces de travail lorsque les toxines sont à l'état sec. 3. Réactifs 3.1. Chloroforme, stabilisé par 0,5 % à 1,0 % d'éthanol, en masse. Voir l'observation 10.2. 3.2. Méthanol, de qualité HPLC pour la prépararation de 3.6. 3.3. Acétone. 3.4. Acétonitrile, de qualité HPLC. 3.5. Solvants d'élution: les préparer la veille de l'utilisation ou les dégazer dans une cuve à ultra-sons. 3.5.1. Acétone (3.3)/eau, 98+2 (v+v). 3.5.2. Eau/méthanol (3.2), 80+20 (v+v). 3.5.3. Eau/acétone (3.3), 85+15 (v+v). 3.6. Phase mobile pour HPLC. La phase mobile est composée d'eau, de méthanol (3.2) et d'acétonitrile (3.4), 130+70+40 (v+v+v). NB: La composition de la phase mobile peut être ajustée en fonction des caractéristiques de la colonne HPLC utilisée. 3.7. Solution aqueuse saturée en iode. Ajouter 2 g d'iode à 400 ml d'eau. Agiter pendant au moins 90 minutes et filtrer sur une membrane filtrante (4.15). Protéger la solution saturée de la lumière pour empêcher la photodégradation. 3.8. Célite 545, lavée à l'acide, ou équivalent. 3.9. Cartouche de Florisil (SEP-PAK Waters ou équivalent). 3.10. Cartouche C18 (SEP-PAK Waters ou équivalent). 3.11. Gaz inerte, par exemple azote. 3.12. Solution étalon d'aflatoxine B1, à une concentration de 10 mg/ml, dans le chloroforme. Vérifier la concentration de la solution de la manière suivante: déterminer le spectre d'absorption de la solution entre 330 et 370 nm au moyen du spectrophotomètre (4.23). Mesurer l'absorbance (A) au maximum d'absorption proche de 363 nm. Calculer la concentration de l'aflatoxine B1 en microgramme par millilitre de solution selon la formule: Concentration (mg/ml) = 312 × A × 1 000

22 300 = 13,991 × A. 3.12.1. Solution mère de la solution étalon d'aflatoxine B1 dans le chloroforme. Transférer quantitativement 2,5 ml de la solution étalon d'aflatoxine B1 (3.12) dans une fiole jaugée de 50 ml et ajuster au volume avec du chloroforme (3.1). Conserver cette solution au froid (4 °C), à l'obscurité, dans un flacon bien fermé et enveloppé d'une feuille d'aluminium. 3.13. Solutions d'aflatoxine B1 pour l'étalonnage en HPLC. NB: Utiliser de la verrerie lavée à l'acide pour la préparation de ces solutions (voir 4, matériel). 3.13.1. Solution d'étalonnage à 4 ng/ml. Laisser la solution mère (3.12.1) revenir à la température ambiante à l'obscurité (pendant quelques heures). Transférer 400 ml de la solution mère (200 ng d'aflatoxine B1) dans une fiole jaugée de 50 ml et évaporer la solution à sec sous un courant de gaz inerte (3.11). Dissoudre le résidu obtenu dans environ 20 ml d'eau/acétone (3.5.3), ajuster au trait de jauge avec de l'eau/acétone (3.5.3) et bien agiter. 3.13.2. Solution d'étalonnage à 3 ng/ml. Transférer quantitativement 7,5 ml de la solution d'étalonnage (3.13.1) dans une fiole jaugée de 10 ml, compléter au volume avec de l'eau/acétone (3.5.3), bien agiter. 3.13.3. Solution d'étalonnage à 2 ng/ml. Transférer quantitativement 25 ml de la solution d'étalonnage (3.13.1) dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au volume avec la solution eau/acétone (3.5.3) et bien agiter. Cette solution est une solution d'étalonnage qui servira également aux répétitions d'injections en HPLC (5.5). 3.13.4. Solution d'étalonnage à 1 ng/ml. Transférer quantitativement 2,5 ml de la solution d'étalonnage (3.13.1) dans une fiole jaugée de 10 ml, ajuster au volume avec la solution eau/acétone (3.5.3) et bien agiter. 3.14. Ampoule contenant 1 millilitre du mélange d'aflatoxines B1, B2 et G2 dans le chloroforme aux concentrations approximatives de 1; 0,5; 1 et 0,5 mg/ml respectivement. 3.14.1. Solution d'essai de séparation chromatographique. Transférer le contenu de l'ampoule (3.14) dans un tube à essai en verre muni d'un bouchon ou dans un flacon à vis. Transférer 40ml de cette solution dans un tube à essai muni d'un bouchon (rincé à l'acide) (4.22). Évaporer le chloroforme sous un courant de gaz inerte (3.11) et redissoudre dans 10 ml de mélange eau/acétone (3.5.3). 3.15. Réactifs pour le test de confirmation (6). 3.15.1. Solution saturée de chlorure de sodium. 3.15.2. Sulfate de sodium, anhydre, granulé. 4. Matériel Attention: L'utilisation de vaisselle non rincée à l'acide pour les solutions aqueuses d'aflatoxine peut être la cause de pertes. Un soin particulier doit être pris avec la verrerie neuve et la verrerie à usage unique telles que les flacons d'injecteur automatique et les pipettes Pasteur. Par conséquent, la verrerie devant contenir les solutions aqueuses d'aflatoxine B1 doit être trempée dans de l'acide dilué (exemple: acide sulfurique à 2 moles/l) pendant plusieurs heures, puis bien rincée à l'eau distillée pour enlever toutes les traces d'acide (exemple: trois rinçages, vérifier au papier pH). En pratique, ce traitement doit être appliqué aux ballons piriformes (4.4), aux fioles jaugées, aux éprouvettes, aux flacons ou aux tubes utilisés pour les solutions d'étalonnage et les extraits finals (particulièrement les flacons de l'injecteur automatique), et les pipettes Pasteur, si celles-ci sont utilisées pour transférer des solutions d'étalonnage ou des extraits. 4.1. Broyeur-mélangeur. 4.2. Tamis à mailles de 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Agitateur mécanique. 4.4. Évaporateur rotatif, avec ballons piriformes de 150 ml à 250 ml. 4.5. Chromatographe en phase liquide haute performance avec injecteur muni d'une boule permettant d'injecter 250 ml. Voir les instructions du fabricant concernant le remplissage partiel ou complet de la boucle. 4.6. Colonne analytique HPLC remplie de particules de 3 mm ou 5 mm C18. 4.7. Pompe sans pulsation pour le réactif postcolonne à l'iode. 4.8. Raccord en T sans volume mort, en acier inoxydable (1/16" ×0,75 mm). 4.9. Capillaire de réaction en Téflon ou en acier inoxydable. Les dimensions suivantes: 3 000 × 0,5 mm à 5 000 × 0,5 mm sont appropriées en combinaison avec les colonnes HPLC à 5mm ou à 3mm. 4.10. Bain thermostaté réglé à 60 °C permettant une régulation de température d'au moins 0,1 °C. 4.11. Détecteur fluorimétrique, assurant des longueurs d'onde d'excitation à 365 nm et des longueurs d'onde d'émission à 435 nm (pour les appareils à filtre: longueur d'onde d'émission > 400 nm). La détection de 0,05 ng d'aflatoxine B1 au moins doit être possible. Il est recommandé d'appliquer une certaine contre-pression (par exemple en employant un régulateur de pression ou une spirale en Téflon ou en acier inoxydable relié à la sortie du détecteur) pour supprimer les bulles d'air dans la cellule de mesure. 4.12. Enregistreur. 4.13. Intégrateur électronique (facultatif). 4.14. Papier filtre plissé de diamètre 24 cm, Machery-Nagel 617 1/4 ou équivalent. 4.15. Membrane filtrante de porosité 0,45 mm, Millipore HAWP 04700 ou équivalent. 4.16. Fiole conique de 500 ml munie d'un bouchon. 4.17. Colonne de verre (diamètre interne d'environ 1 cm, longueur d'environ 30 cm) munie d'un embout Luer. 4.18. Robinet, résistant au chloroforme, avec embout Luer (par exemple Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 ou équivalent). 4.19. Seringue de 10 ml résistant aux produits chimiques, avec embout Luer. 4.20. Seringue de 250 ml pour l'injection HPLC (voir 4.5). 4.21. Microseringue de 100 ml pour la préparation des solutions d'étalonnage (vérifier par pesée que la précision est de 2 % au plus). 4.22. Tubes gradués en verre de 10 ml, avec un bouchon. 4.23. Spectrophotomètre pouvant être utilisé dans la zone UV du spectre d'absorption. 4.24. Matériel pour le test de confirmation (6). 4.24.1. Ampoule à décanter de 100 ml, avec un robinet en Téflon et rincée à l'acide. 4.24.2. Bloc chauffant à 40-50 °C. 5. Procédure 5.1. Préparation de l'échantillon Broyer l'échantillon de façon à ce qu'il passe au travers du tamis (4.2). 5.2. Prise d'essai Peser 50,0 g de l'échantillon ainsi préparé dans la fiole conique (4.16). 5.3. Extraction Ajouter 25 g de Célite (3.8), 250 ml de chloroforme (3.1) et 25 ml d'eau, à la prise d'essai (5.2). Boucher la fiole et agiter pendant 30 minutes à l'aide d'un agitateur (4.3). Filtrer sur filtre plissé (4.14). Recueillir 50 ml du filtrat. Si nécessaire, prendre une fraction aliquote et diluer à 50 ml avec du chloroforme de façon à ce que la concentration en aflatoxine B1 ne soit pas supérieure à 4 ng/ml. 5.4. Purification (les opérations doivent être menées sans interruption significative) Précautions à prendre: - protéger le laboratoire où les analyses sont faites de la lumière du jour. Cela peut être réalisé en utilisant:

(1) Van Egmond, H.P., Heisterkamp, S.H. et Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.

(2) ISO 3534-1977.

(3) JO no L 351 du 2. 12. 1989, p. 39.

1) des films absorbant les UV sur les fenêtres en combinaison avec une lumière tamisée (pas de lumière solaire directe!); 2) des rideaux ou des stores en association avec la lumière artificielle (les tubes fluorescents sont acceptables), - les solutions contenant de l'aflatoxine doivent être protégées de la lumière le plus possible (les conserver à l'obscurité, utiliser des feuilles d'aluminium). 5.4.1. Purification sur SEP-PAK Florisil. 5.4.1.1. Préparation de l'assemblage colonne-cartouche. Attacher un robinet (4.18) à la plus courte tige de la cartouche de Florisil (3.9) (voir figure 1). Laver la cartouche et enlever l'air en prenant 10 ml de chloroforme (3.1) et en faisant passer rapidement 8 ml de chloroforme par le robinet à travers la cartouche avec une seringue (4.19). Attacher la plus longue tige de la cartouche à une colonne de verre (4.17) et introduire les 2 ml de chloroforme restant à travers la cartouche dans la colonne. Fermer le robinet. Enlever la seringue. 5.4.1.2. Purification. Introduire le filtrat recueilli en 5.3 dans l'assemblage colonne-cartouche et le laisser s'écouler par gravité. Rincer avec 5 ml de chloroforme (3.1), suivis de 20 ml de méthanol (3.2). Écarter ces éluats. Pendant ces opérations, s'assurer que l'assemblage colonne-cartouche n'aille pas à sec. Éluer l'aflatoxine B1 par 40 ml du mélange acétone/eau (3.5.1) et recueillir la totalité de l'éluat dans le ballon piriforme de l'évaporateur rotatif (4.4). Concentrer l'éluat à l'aide de l'évaporateur rotatif à 40-50 °C jusqu'à ce que la distillation de l'acétone soit terminée. (NB: Il reste, à ce stade, 0,5 ml environ de liquide dans le ballon. L'expérience a montré qu'une évaporation prolongée n'est pas nuisible et que, s'il reste 0,5 ml de liquide, il n'y a plus alors de quantité significative d'acétone. Des résidus d'acétone peuvent conduire à des pertes d'aflatoxine B1 sur la cartouche C18). Ajouter 1 ml de méthanol (3.2). Agiter le ballon pour dissoudre l'aflatoxine B1, ajouter 4 ml d'eau et mélanger. Déconnecter et jeter la cartouche. Rincer la colonne de verre à l'eau et la garder pour la purification sur C18. 5.4.2. Purification sur SEP-PAK C18. 5.4.2.1. Préparation de l'assemblage colonne-cartouche. Attacher un robinet (4.18) à la plus courte tige de la cartouche C18 (3.10) (voir figure 1). Amorcer la cartouche et enlever l'air en passant rapidement 10 ml de méthanol (3.2) dans la cartouche à l'aide d'une seringue (4.19) par le robinet (les bulles d'air dans la cartouche sont visibles sous forme de taches claires sur un fond grisâtre). Prendre 10 ml d'eau et en injecter 8 ml à travers la cartouche (éviter d'introduire de l'air dans la cartouche lors du passage du méthanol à l'eau). Attacher la tige la plus longue de la cartouche à une colonne de verre (4.17) et passer les 2 ml d'eau restant à travers la cartouche dans la colonne. Fermer le robinet. Enlever la seringue. 5.4.2.2. Purification. Transférer quantitativement dans la colonne (4.17) l'extrait collecté en 5.4.1.2, en rinçant le ballon deux fois avec 5 ml du mélange eau/méthanol (3.5.2) et le laisser s'écouler par gravité. Pendant ces opérations, s'assurer que l'assemblage colonne-cartouche n'aille pas à sec. (Si des bulles d'air se forment dans le rétrécissement près de la cartouche, arrêter le débit et tapoter légèrement le sommet de la colonne de verre pour éliminer les bulles d'air. Puis continuer.) Éluer avec 25 ml du mélange eau/méthanol (3.5.2). Jeter les éluats. Éluer l'aflatoxine B1 par 50 ml d'eau/acétone (3.5.3) et collecter la totalité de l'éluat dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajuster au volume avec de l'eau et mélanger: la solution d'essai ainsi obtenue est utilisée pour la chromatographie (5.5). Attention: La filtration de l'extrait final préalable à l'injection en HPLC n'est généralement pas nécessaire. Si on le considère nécessaire, les filtres en cellulose sont à éviter, car ils peuvent entraîner des pertes d'aflatoxine B1. Les filtres en Téflon sont acceptables. 5.5. Chromatographie en phase liquide haute performance (Voir la figure 2 pour le montage de l'appareillage). Prévoir suffisamment de temps pour laisser les appareils se conditionner et se stabiliser avant l'utilisation. Note 1 Les débits donnés pour la phase mobile HPLC et pour le réactif post-colonne sont simplement indicatifs. Ils peuvent être ajustés suivant les caractéristiques de la colonne HPLC. Note 2 La réponse de l'aflatoxine B1 dépend de la température. Par conséquent, il faut compenser les dérives (voir figure 3). L'injection d'une quantité fixe de la solution d'étalonnage (3.13.3) à intervalles réguliers (par exemple chaque troisième injection) permet de corriger la valeur du pic de l'aflatoxine B1 obtenu entre ces étalons de référence en utilisant la moyenne des réponses. La différence obtenue entre les solutions étalons consécutives doit être très petite (< 10 %). Par conséquent, les injections doivent se suivre sans interruption. Si une interruption est nécessaire, la dernière injection avant l'interruption et la première injection après l'interruption doivent être des injections de solution d'étalonnage (3.13.3). La courbe de calibration étant linéaire et passant par l'origine, les quantités d'aflatoxine B1 dans les échantillons sont déterminées directement par référence aux solutions étalons les plus proches. 5.5.1. Réglage de la pompe HPLC. Régler la pompe HPLC (4.5) à un débit de 0,5 ou de 0,3 ml/min pour une colonne HPLC de 5mm ou 3 mm (4.6) respectivement, en utilisant la phase mobile (3.6). 5.5.2. Réglage de la pompe pour la réaction postcolonne. Régler la pompe (4.7) à un débit de 0,2-0,4 ml/min de solution aqueuse saturée en iode (3.7). À titre indicatif: les débits d'environ 0,4 ou 0,2 ml/min sont à recommander en association avec des débits respectifs de la phase mobile (3.6) de 0,5 et 0,3 ml/min. 5.5.3. Le détecteur fluorimétrique. Régler le détecteur fluorimétrique (4.11) à la longueur d'onde d'excitation = 365 nm et la longueur d'onde d'émission = 435 nm (pour un appareil à filtre: > 400 nm). Ajuster l'atténuation du détecteur de façon à obtenir environ 80 % de déviation pleine échelle pour 1 ng d'aflatoxine B1. 5.5.4. Injecteur. Pour toutes les solutions, injecter 250 ml en suivant les instructions du fabricant de l'injecteur. 5.5.5. Vérification de la séparation chromatographique. Injecter la solution d'essai de séparation chromatographique (3.14.1). La hauteur du point d'inflexion doit être inférieure à 5 % de la somme des hauteurs des pics adjacents. 5.5.6. Vérification de la stabilité du système. Avant chaque série d'analyses, injecter plusieurs fois l'étalon de référence (3.13.3) jusqu'à ce que des surfaces stables de pics soient obtenues (NB: les pics d'aflatoxine B1, entre deux injections consécutives, doivent varier de moins de 6 %). Procéder sans attendre à la vérification de la linéarité (5.5.7). 5.5.7. Vérification de la linéarité. Injecter les solutions d'étalonnage d'aflatoxine B1 (3.13.1 à 3.13.4). Chaque troisième injection, utiliser l'étalon de référence (3.13.3) pour corriger la dérive dans les réponses (NB: les réponses des pics pour les étalons de référence ne doivent pas différer de plus de 10 % en 90 minutes). Corriger la dérive suivant la formule écrite en 7. La droite de calibration doit être linéaire et passer par l'origine à l'intérieur d'une fourchette de deux fois l'erreur standard de Y estimé. Les valeurs trouvées ne doivent pas différer de plus de 3 % des valeurs nominales. Si les conditions sont remplies, continuer sans délai. Sinon, déterminer et rectifier la cause du problème avant de continuer. 5.5.8. Injection des extraits d'échantillon. Injecter les extraits purifiés (5.4.2.2). Toutes les deux injections d'extrait d'échantillon, répéter l'injection de l'étalon de référence (3.13.3) suivant la séquence: étalon de référence, extrait, extrait, étalon de référence, extrait, extrait, étalon de référence, etc. 6. Test de confirmation 6.1. Traitement de l'extrait (5.4.2.2) Ajouter 5 ml de solution de chlorure de sodium (3.15.1) à l'extrait final obtenu en 5.4.2.2. Extraire trois fois avec 2 ml de chloroforme (3.1) pendant 1 minute dans une ampoule à décanter (4.24.1). Filtrer l'extrait chloroformique obtenu dans un tube de 10 ml, à travers 1 g de sulfate de sodium (3.15.2). Un petit entonnoir de 4 cm de diamètre peut être utilisé avec un morceau de laine de verre recouvert de 1 g de sulfate de sodium (3.15.2). Laver la couche de sulfate de sodium avec quelques millilitres de chloroforme et les collecter dans le même tube. Évaporer à sec l'extrait chloroformique dans le même tube en utilisant le bloc chauffant (4.24.2) et redissoudre dans 1 ml de chloroforme. 6.2. Préparation des dérivés et chromatographie sur couche mince Voir la directive 76/372/CEE du Conseil, annexe, méthode A point 5.6.2. 7. Calculs des résultats Calculer la teneur d'aflatoxine B1 (mg/kg) présente dans l'échantillon en utilisant la formule: teneur en aflatoxine B1 exprimée en mg/kg = m × Ve x t

Vm × M × Vf Vc où: m = quantité d'aflatoxine B1 en ng représentée par le pic de l'aflatoxine B1 de l'échantillon calculé comme suit: m = P (échantillon)

P (st1) + P (st2) × 2 r (st) P (échantillon) = surface du pic d'aflatoxine B1 de l'échantillon P (st1) = surface du pic d'aflatoxine B1 de l'étalon de référence (3.13.3) précédant l'injection de l'échantillon P (st2) = surface du pic d'aflatoxine B1 de l'étalon de référence (3.13.3) suivant l'injection de l'échantillon r (st) = quantité d'aflatoxine B1 de l'étalon de référence (3.13.3) injectée en ng Vm = volume de l'extrait d'échantillon injecté, en ml Ve x t = volume final de l'extrait d'échantillon, en ml, compte tenu de la dilution effectuée en (5.3) M = masse de l'échantillon, en g Vf = volume de filtrat transféré sur la cartouche de Florisil (5.4.1.2) en ml. Vc = volume de chloroforme utilisé pour l'extraction de l'échantillon en ml. Si la procédure est suivie comme dans ce protocole, la formule se réduit à: teneur en aflatoxine B1 en mg/kg = 20 × m. 7.1. Les calculs peuvent aussi être faits à partir de la hauteur des pics. 8. Répétabilité Voir le point 10.1 (observations). 9. Reproductibilité Voir le point 10.1. 10. Observations 10.1. Précision Une étude collaborative (1), menée à l'échelon international sur des aliments composés, a conduit aux données de répétabilité et de reproductibilité indiquées dans le tableau 1. Le terme de répétabilité (r) utilisé ici est défini comme la plus grande valeur du rapport, qui n'est plus significative à un niveau de probabilité de 95 %, de deux résultats obtenus pour l'analyse du même échantillon dans le même laboratoire dans des conditions similaires. Le terme de reproductibilité (R) est défini de manière semblable en comparant les résultats obtenus par deux laboratoires différents. En accord avec la norme ISO 3534-1977, 2.35 (2) et la décision 89/610/CEE de la Commission (3), r et R sont aussi donnés dans le tableau 1 en terme de coefficients de variation. Tableau 1 Répétabilité (r) et reproductibilité (R), exprimés en rapport et en coefficients de variation (15 laboratoires) Teneur r R CVr (*) CVR (*) (mg/kg) (%) (%) 8 & 14 1,4 1,7 11 18 (*) CV = coefficient de variation 10.2. Stabilité du chloroforme (3.1) Les caractéristiques de l'absorption sur les cartouches de Florisil peuvent être modifiées si des stabilisants autres que l'éthanol sont utilisés. Cela doit être vérifié pour être en accord avec le point 10.3 si le chloroforme décrit n'est pas disponible. 10.3. Exactitude L'application correcte de la méthode doit être vérifiée par des mesures en double effectuées sur des matériaux de référence garantis. S'ils ne sont pas disponibles, la validité de la méthode doit être vérifiée en effectuant des expériences de récupération menées sur des échantillons exempts d'aflatoxine B1 et contaminés artificiellement. L'écart entre la moyenne et la valeur réelle exprimé en pourcentage de la valeur réelle ne doit pas se situer en dehors des limites 20 % à +10 %. Figure 1 : Assemblage colonne-cartouche 1. Phase mobile

2. Pompe

3. Vanne d'injection

4. Précolonne

5. Colonne analytique HPLC

6. Solution saturée d'iode

7. Pompe à réactif postcolonne 8. Raccord en T

9. Bain thermostaté

10. Spirale de réaction

11. Détecteur fluorimétrique

12. Régulateur de pression

13. Solvants à jeter

14. Enregistreur/intégrateur Figure 2 : Montage du système chromatographique avec la dérivatisation postcolonne réponse moyenne des étalons

de référence adjacents temps étalon de référence extrait (ou calibrant) extrait (ou calibrant) étalon de référence extrait (ou calibrant) Figure 3 : Compensation de la dérive de la réponse de l'aflatoxine B1 en injectant la solution d'étalonnage (3.13.3) à intervalles réguliers »