RÈGLEMENT (CEE) N° 2568/91 DE LA COMMISSION

du 11 juillet 1991

relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes y afférentes

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu le règlement n° 136/66/CEE du Conseil, du 22 septembre 1966, portant établissement d'une organisation commune des marchés dans le secteur des matières grasses (1), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) n° 3577/90 (2), et notamment son article 35 bis,

considérant que l'annexe du règlement n° 136/66/CEE prévoit les dénominations et définitions des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive commercialisées à l'intérieur de chaque État membre ainsi que dans les échanges intracommunautaires et avec les pays tiers;

considérant que, pour pouvoir distinguer les divers types d'huile, il y a lieu de définir les caractéristiques physicochimiques de chacun d'eux ainsi que les caractéristiques organoleptiques des huiles vierges, de manière à assurer la pureté et la qualité des produits en cause, sans préjudice d'autres dispositions existant en la matière;

considérant qu'il convient de déterminer de manière uniforme dans toute la Communauté la présence des caractéristiques des différents types d'huile; que, à cette fin, il y a lieu d'établir les méthodes communautaires d'analyse chimique et d'appréciation organoleptique; qu'il convient cependant de permettre, pendant une période transitoire, l'utilisation d'autres méthodes d'analyse appliquées dans les États membres, tout en prévoyant que, en cas de divergence des résultats, ceux obtenus selon la méthode commune soient déterminants;

considérant que la définition des caractéristiques physicochimiques des huiles d'olives et des méthodes d'analyse entraîne l'adaptation des notes complémentaires du chapitre 15 de la nomenclature combinée;

considérant que la méthode d'évaluation des caractéristiques organoleptiques des huiles vierges comporte la création de jurys de dégustateurs sélectionnés et entraînés; qu'il convient,

dès lors, de prévoir le délai nécessaire pour la mise en place d'une telle structure; que, compte tenu des difficultés que rencontreront certains États membres pour la constitution des jurys de dégustateurs, il convient d'autoriser le recours aux jurys existant dans d'autres États membres;

considérant que, pour assurer le fonctionnement correct du système des prélèvements applicables à l'importation de grignons d'olive, il convient de prévoir une méthode unique pour la détermination de la teneur en huile de ces produits;

considérant que, pour ne pas causer un préjudice au commerce, il est opportun de prévoir une période limitée pour l'écoulement de l'huile conditionnée avant l'entrée en vigueur du présent règlement;

considérant qu'il y a lieu d'abroger le règlement (CEE) n° 1058/77 de la Commission (3), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) n° 1858/88 (4);

considérant que le comité de gestion des matières grasses n'a pas émis d'avis dans le délai imparti par son président,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

1. Sont considérées comme huiles d'olive vierges au sens du point 1 a), b) et c) de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, les huiles dont les caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées à l'annexe I points 1, 2 et 3 du présent règlement.

2. Est considérée comme huile d'olive vierge lampante au sens du point 1 d) de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 4 du présent règlement.

3. Est considérée comme huile d'olive raffinée au sens du point 2 de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 5 du présent règlement.

4. Est considérée comme huile d'olive au sens du point 3 de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 6 du présent règlement.

5. Est considérée comme huile de grignons d'olive brute au sens du point 4 de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 7 du présent règlement.

6. Est considérée comme huile de grignons d'olive raffinée au sens du point 5 de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 8 du présent règlement.

7. Est considérée comme huile de grignons d'olive au sens du point 6 de l'annexe du règlement n° 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 9 du présent règlement.

Article 2

1. La détermination des caractéristiques des huiles prévues à l'annexe I est effectuée selon les méthodes d'analyse suivantes:

- pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcentage d'acide oléique, la méthode reprise à l'annexe II,

- pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode reprise à l'annexe III,

- pour la détermination des alcools aliphatiques, la méthode reprise à l'annexe IV,

- pour la détermination du contenu en stérols, la méthode reprise à l'annexe V,

- pour la détermination de l'érythrodiol et de l'uvaol, la méthode reprise à l'annexe VI,

- pour la détermination des acides gras saturés en position 2 du triglycéride, la méthode reprise à l'annexe VII,

- pour la détermination de la teneur en trilinoléine, la méthode reprise à l'annexe VIII,

- pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode reprise à l'annexe IX,

- pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode reprise aux annexes X «A» et X «B».

- pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode reprise à l'annexe XI,

- pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges, la méthode reprise à l'annexe XII, appliquée conformément au paragraphe 2,

- pour la preuve du raffinage, la méthode reprise à l'annexe XIII.

2. L'analyste, même assisté d'experts, procède à l'appréciation des caractéristiques organoleptiques selon la procédure décrite dans la fiche de dégustation visée à l'annexe XII. Au cas où l'analyste détermine les caractéristiques organoleptiques différentes de celles résultant de la dénomination du produit, il est tenu de faire examiner l'échantillon par un jury de dégustateurs conformément aux dispositions

de l'annexe XII. Toute analyse de révision est effectuée par le jury de dégustateurs conformément à ces dispositions.

Pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques lors des opérations liées au régime d'intervention, le jury de dégustateurs procède à cette appréciation conformément à l'annexe XII.

Article 3

Jusqu'au 31 octobre 1992, l'introduction des méthodes d'analyse prévues à l'article 2 ne fait pas obstacle à ce que les États membres utilisent d'autres méthodes éprouvées et scientifiquement valables, à condition que la libre circulation des produits reconnus conformes à la réglementation en application des méthodes communautaires n'en soit pas entravée. Les États membres concernés communiquent ces autres méthodes à la Commission avant de les utiliser.

Dans le cas où l'une de ces autres méthodes donne un résultat différent de celui déterminé par la méthode communautaire, le résultat obtenu en application de la méthode commune est retenu.

Article 4

1. Aux fins de l'appréciation des caractéristiques organoleptiques, les États membres instituent des jurys de dégustateurs sélectionnés et entraînés selon les règles prévues par la méthode décrite à l'annexe XII.

2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer un jury de dégustateurs sur son territoire, il pourra recourir à un jury de dégustateurs opérant dans un autre État membre.

Article 5

Les notes complémentaires 2, 3 et 4 du chapitre 15 de la nomenclature combinée sont remplacées respectivement par les notes complémentaires 2, 3 et 4 figurant à l'annexe XIV du présent règlement.

Article 6

1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extraction de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 est déterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.

2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcentage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.

Article 7

Les dispositions communautaires concernant la présence de substances indésirables autres que celles visées à l'annexe XI sont applicables.

Article 8

1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures prises pour l'application du présent règlement.

2. Les États membres communiquent à la Commission, au début de chaque semestre, un état récapitulatif des données analytiques des déterminations effectuées au cours du semestre précédent.

Ces résultats sont examinés par le comité de gestion des matières grasses selon la procédure prévue à l'article 39 du règlement n° 136/66/CEE.

Article 9

Le règlement (CEE) n° 1058/77 est abrogé.

Article 10

1. Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. Toutefois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partir du 1erjanvier 1992, sauf en ce qui concerne les opérations liées à l'intervention.

2. Le présent règlement ne s'applique pas aux huiles d'olive et de grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur du présent règlement et commercialisées jusqu'au 31 octobre 1992.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 11 juillet 1991.

Par la Commission

Ray MAC SHARRY

Membre de la Commission

(1) JO n° 172 du 30. 9. 1966, p. 3025/66.

(2) JO n° L 353 du 17. 12. 1990, p. 23.

(3) JO n° L 128 du 24. 5. 1977, p. 6.

(4) JO n° L 166 du 1. 7. 1988, p. 10.

ANNEXE I

CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE

>TABLE>

>TABLE>

ANNEXE II

DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS LIBRES

1.

OBJET

Détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive. La teneur en acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée conventionnellement.

1.1.

Principe

Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution éthanolique d'hydroxyde de potassium.

1.2.

Réactifs

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.

1.2.1.

Oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume.

Note: L'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions particulières.

Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydroxyde de potassium (1.2.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de phénolphtaléine (1.2.3) pour 100 millilitres de mélange.

Note: S'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si nécessaire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.

1.2.2.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique titrée c(KOH) - 0,1 mole par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) - 0,5 mole par litre environ.

La concentration exacte de la solution éthanolique d'hydroxyde de potassium doit être connue et vérifiée immédiatement avant l'emploi. Utiliser une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solution doit être incolore ou jaune paille.

Note: Une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium peut être préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol avec 8 grammes d'hydroxyde de potassium et 0,5 gramme de rognures d'aluminium. Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité requise d'hydroxyde de potassium. Laisser reposer durant plusieurs jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbonate de potassium.

La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon suivante. À 1 000 millilitres d'éthanol, ajouter 4 millilitres de butylite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité requise d'hydroxyde de potassium. Cette solution est prête pour l'emploi.

1.2.3.

Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V) ou bleu alcalin (dans le cas de corps gras fortement coloré) solution à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V).

1.3.

Appareillage

Matériel courant de laboratoire, et notamment:

1.3.1.

Balance analytique

1.3.2.

Fiole conique de 250 millilitres de capacité

1.3.3.

Burette de 10 millilitres de capacité, graduée en 0,05 millilitre.

1.4.

Mode opératoire

1.4.1.

Préparation de l'échantillon pour essai

La détermination est effectuée sur l'échantillon filtré. Si la teneur globale en humidité et en impuretés est inférieure à 1 %, la détermination est effectuée sur l'échantillon tel quel.

1.4.2.

Prise d'essai

Prélever une prise d'essai, selon l'indice d'acide présumé, d'après les indications du tableau suivant.

>TABLE>

Peser la prise d'essai dans la fiole conique (1.3.2).

1.4.3.

Détermination

Dissoudre la prise d'essai (4.5.2) dans 50 à 150 millilitres du mélange oxyde diéthylique/éthanol (1.2.1), préalablement neutralisé.

Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole par litre (1.2.2) (voir note 2) jusqu'à virage de l'indicateur (coloration rose de la phénolpthaléine persistant durant au moins 10 secondes).

Note 1: La solution éthanolique titrée d'hydroxyde de potassium (1.2.2) peut être remplacée par une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium ou de sodium lorsque le volume d'eau introduit n'entraîne pas une séparation de phases.

Note 2: Si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à 0,5 mole par litre.

Note 3: Si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une quantité suffisante du mélange de solvants (1.2.1) pour donner une solution claire.

1.5.

Expression de l'acidité en pourcentage de l'acide oléique

L'acidité, exprimée en pourcentage en poids, est égale à:

V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

V × c ×

M

1 000

×

100

m

=

V × c × M

10 × m

où:

V: volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium utilisée;

c:

concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium utilisée;

M:

poids molaire, en grammes par mole, de l'acide adopté pour l'expression du résultat (= 282);

m:

poids en grammes, de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.

ANNEXE III

DÉTERMINATION DE L'INDICE DE PEROXYDE

1.

OBJET

La présente norme décrit une méthode de détermination de l'indice de peroxyde dans les huiles et matières grasses.

2.

CHAMP D'APPLICATION

La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses animales et végétales.

3.

DÉFINITION

L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon (exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.

4.

PRINCIPE

La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré avec une solution de thiosulfate de sodium.

5.

APPAREILLAGE

Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances oxydantes ou réductrices.

Nota bene: ne pas graisser les surfaces rodées.

5.1.

Cuiller en verre de 3 millilitres.

5.2.

Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence, dioxyde de carbone).

5.3.

Burette de 25 ou 50 millilitres avec graduations de 0,1 millilitre.

6.

RÉACTIFS

6.1.

Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

6.2.

Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz sec et pur).

6.3.

Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente, exempte d'iode et d'iodates.

6.4.

Solution aqueuse de thiosulfate de sodium 0,01 ou 0,002 N, soigneusement normalisée juste avant l'emploi.

6.5.

Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment préparée à partir d'amidon naturel soluble.

7.

ÉCHANTILLON

Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière, conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entièrement et fermés hermétiquement à l'aide de bouchons de liège ou de verre rodé.

8.

MODE OPÉRATOIRE

L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou artificielle. Dans une cuiller en verre (5.1) ou, à défaut, dans une fiole (5.2), peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le tableau ci-après en fonction de l'indice de péroxyde prévu.

>TABLE>

Déboucher une fiole (5.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (6.1). Dissoudre rapidement la prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (6.2) puis 1 millilitre de solution d'iodure de potassium (6.3). Remettre le bouchon rapidement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5 minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 oC.

Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la solution de thiosulfate de sodium (6.4) (solution 0,002 N, si les indices prévus sont inférieurs à 12, et 0,001 N, s'ils sont supérieurs à 12) en agitant vigoureusement et en employant la solution d'amidon (6.5) comme indicateur.

Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.

Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier exède 0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium (6.4) 0,001 N, remplacer les réactifs impurs.

9.

EXPRESSION DES RÉSULTATS

L'indice de péroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme, est fourni par la formule:

IP = V × T × 1 000

IP =

V × T × 1 000

m

où:

V: = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium normalisée (6.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de l'essai à blanc;

T:

=

facteur de normalité exact de la solution de thiosulfate de sodium (6.4) utilisée;

m:

=

poids (en grammes) de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.

ANNEXE IV

DÉTERMINATION DU CONTENU EN ALCOOLS ALIPHATIQUES AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1.

OBJET

La méthode décrit un procédé de détermination du contenu en alcools aliphatiques, simples et totaux, des matières grasses.

2.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse, additionnée de 1-eicosanol comme standard interne, est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La fraction des alcools est séparée de l'extrait insaponifiable par chromatographie sur plaque de gel de silice basique; les alcools récupérés dans le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.

3.

APPAREILLAGE

3.1.

Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts rodés.

3.2.

Ampoule à décanter de 500 millilitres.

3.3.

Ballons de 250 millilitres.

3.4.

Équipement complet pour chromatographie en phase solide, avec plaques de verre de 20 × 20 centimètres.

3.5.

Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.

3.6.

Microseringues de 100 et 500 microlitres.

3.7.

Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout rodé mâle 12/21.

3.8.

Fiole à vide de 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable è l'ampoule filtrante (3.7).

3.9.

Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.

3.10.

Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d'un système de fractionnement, constitué de:

3.10.1.

Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la température désirée avec une précision d'environ 1o C

3.10.2.

Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilanisé

3.10.3.

Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur

3.10.4.

Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertisseur-amplificateur avec un temps de réponse non supérieur à 1 seconde et avec une vitesse de papier variable.

3.11.

Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de long, de 0,25 à 0,32 millimètre de diamètre intérieur, recouverte intérieurement de liquide SE-52 ou SE-54 ou équivalent, avec une épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.

3.12.

Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 microlitres avec aiguille cémentée.

4.

RÉACTIFS

4.1.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre, tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles de verre opaque bien bouchées.

4.2.

Éther éthylique, pour analyses.

4.3.

Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.

4.4.

Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluorescence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.5.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2 N: dissoudre 13 grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol.

4.6.

Benzène, pour chromatographie (5.2.2).

4.7.

Acétone, pour chromatographie (5.2.2).

4.8.

Hexane pour chromatographie (5.2.2).

4.9.

Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).

4.10.

Chloroforme pur, pour analyse.

4.11.

Solution de refroidissement pour la chromatographie sur plaque: cholestérol ou phytostérol, solution à 0,5 % dans le chloroforme.

4.12.

Dichloro-2m-7m fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solution alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.

4.13.

Pyridine anhydre, pour chromatographie.

4.14.

Hexaméthyldisilazane.

4.15.

Triméthylchlorosilane.

4.16.

Solution échantillon des triméthylsilyléthers des alcools aliphatiques de C20 à C28. À préparer au moment de l'emploi des mélanges d'alcools purs.

4.17.

l-eicosanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard interne).

4.18.

Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.19.

Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5.

PROCÉDÉ

5.1.

Préparation de l'insaponifiable

5.1.1.

Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microseringue de 500 microlitres, un volume de solution d'1-eicosanol à 0,1 % dans le chloroforme (4.17) qui contient une quantité d'1-eicosanol

qui corresponde à environ 10 % du contenu en alcools aliphatiques dans l'aliquote de l'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 250 microlitres de la solution d'1-eicosanol à 0,1 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive ou d'huile de semences et 1 500 microlitres s'il s'agit d'huile de grignons d'olive.

Évaporer dans un courant d'azote jusqu'à dessication, puis peser exactement 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.

5.1.2.

Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium à 0,2 N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique jusqu'à ce que la saponification se soit produite (la solution devient limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50 millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant, débrancher le réfrigérant et refroidir le ballon à environ 30o C.

5.1.3.

Transvaser le contenu du ballon, de façon quantitative, dans une ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillée à plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).

Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillant dans une autre ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse, selon les mêmes modalités, en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres d'éther éthylique.

Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant, avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou méthylique.

5.1.4.

Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à l'eau distillée (50 millilitres à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de lavage.

Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 millilitres pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther éthylique.

5.1.5.

Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il n'en reste qu'une petite quantité, puis porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le séchage à l'étuve à 100o C durant un quart d'heure environ et peser après refroidissement dans un dessicateur.

5.2.

Séparation de la fraction alcoolique

5.2.1.

Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice (4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser agir ensuite, bien fermé, pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100o C pendant une heure.

Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours).

Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la séparation de la fraction alcoolique élimine le besoin du traitement de l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des alcools aliphatiques et terpéniques nettement séparée de la bande des stérols.

5.2.2.

Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone 95/5 (V/V) jusquà une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser à la place un mélange hexane-éther éthylique 65/35 (V/V). Fermer le couvercle à l'aide d'un couvercle approprié et laisser ainsi pendant une demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'établisse. Il est possible de fixer sur les surfaces intérieures de la cuve des bandes de papier filtre qui plongent dans l'éluant: cette précaution permet de réduire d'un tiers environ les temps de migration du front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.

Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être changé à chaque essai.

5.2.3.

Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le chloroforme et, avec la microseringue de 100 microlitres, déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1) à 2 centimètres environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la ligne de dé^pot, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de référence des alcools aliphatiques (4.11), dans le but d'identifier la bande des alcools aliphatiques lors du dernier développement.

5.2.4.

Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme décrit au point 5.2.2. La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20o C. Fermer aussitôt la chambre avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque enfermée pendant un petit moment.

5.2.5.

Vaporiser la plaque légèrement et uniformément avec la solution de dichloro-2m-7m fluorescéine. Identifier la bande des alcools aliphatiques par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter la bande avec un crayon noir l'ensemble de la bande des alcools aliphatiques et de la bande immédiatement supérieure qui correspond aux alcools terpéniques.

Note 4: La précision faite de recueillir l'ensemble de la bande des alcools aliphatiques et de la bande des alcools terpéniques est due au fait que dans celle-ci, dans les conditions de la méthode, sont englobées des quantités significatives d'alcools aliphatiques.

5.2.6.

Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud, mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule filtrante.

Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ 10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en chauffant légèrement dans un léger courant d'azote, reprendre avec quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes environ à l'étuve à 105o C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser.

Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction alcoolique.

5.3.

Préparation des triméthylsilyléthers

5.3.1.

Ajouter, dans le tube contenant la fraction alcoolique, le réactif de silylation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 5) dans une proportion de 50 microlitres par milligramme d'alcools aliphatiques, en évitant toute absorption d'humidité (note 6).

Note 5: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosilane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.

5.3.2.

Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète solubilisation des alcools aliphatiques. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse.

Note 6: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou d'altération du réactif. Dans ce cas, l'essai doit être répété.

5.4.

Analyse par chromatographie en phase gazeuse.

5.4.1.

Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne

5.4.1.1.

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de fractionnement et l'extrémité de sortie au détecteur.

Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système de fractionnement et du système d'enregistrement, etc.).

5.4.1.2.

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est conseillé de procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie en phase gazeuse et commencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre une température d'au moins 20o C supérieure à celle d'exercice (note 7). Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis porter le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux et de la séparation, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre pour la colonne, du détecteur et de l'initiateur etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive.

Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

Note 7: La température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20o C à la température maximale prévue pour le liquide de répartition employé.

5.4.2.

Choix des conditions opératoires

5.4.2.1.

Les conditions opératoires maximales sont les suivantes:

- température de la colonne: début isotherme 8 minutes à 180o C, puis programme de 5o C par minute jusqu'à 260o C puis encore 15 minutes à 260o C,

- température de l'évaporateur: 280o C,

- température du détecteur: 290o C,

- vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,

- rapport de séparation: de 1/50 à 1/100,

- sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,

- sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,

- vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,

- quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de TMSE.

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de façon à obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:

- le temps de rétention de l'alcool en C26 doit être de 18 p5 minutes,

- le pic de l'alcool en C22 doit être 80 p20 % de l'échelle de fond et pour l'huile de semences 40 p20 % de l'échelle de fond.

5.4.2.2.

Pour vérifier les conditions exigées ci-dessus, effectuer des injections répétées avec les échantillons de mélanges des TMSE des alcools et retoucher les conditions opératoires jusqu'à obtenir les meilleurs résultats.

5.4.2.3.

Les paramètres d'intégration des pics doivent être imposés de façon à obtenir des valeurs correctes pour les pics qui sont pris en considération.

5.4.3.

Exécution de l'analyse

5.4.3.1.

Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane, aspirer 0,5 microlitre d'air et successivement 0,5 et 1 microlitre de la solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes environ.

5.4.3.2.

Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des alcools aliphatiques présents.

La ligne de base doit toujours correspondre aux conditions requises (5.4.1.2).

5.4.4.

Identification des pics

L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des alcools aliphatiques, analysés dans les mêmes conditions.

La figure 1 montre un chromatogramme de la fraction alcoolique d'une huile d'olive vierge.

5.4.5.

Évaluation quantitative

5.4.5.1.

Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'1-eicosanol et des alcools aliphatiques de C22 à C28.

5.4.5.2.

Calculer le contenu en chaque alcool aliphatique simple, en milligrammes par 100 grammes de matière grasse, comme suit:

alcool x = Ax 7 ms 7 100

alcool x =

Ax 7 ms 7 100

As 7 m

où:

Ax = aire du pic de l'alcools x, en millimètres carrés;

As

=

aire du pic d'l-eicosanol, en millimètres carrés;

ms

=

poids d'l-eicosanol ajouté, en milligrammes;

m

=

poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6.

EXPRESSION DES RÉSULTATS

Rapporter les contenus en alcools aliphatiques simples en milligrammes par 100 grammes de matière grasse et leur somme comme «alcools aliphatiques totaux».

APPENDICE

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires normales, injecter 1à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de l'injection et celui de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

>DEBUT DE GRAPHIQUE>

<?aeFN25,6><?aePD7>Figure 1: Chromatogramme de la fraction alcoolique d'une huile vierge<?aa2A>

<?Þ><?aeBP><?aeNP><?aeTT1> 6 = Tétracosanol <?aeTT2><?aeFA2,><?aeTT3> <?aeTT4><?aeTA5Y0>

<?aeTS>1 = Eicosanol

<?aeFN4>2 = Docosanol

<?aeFN4>3 = Tricosanol

<?aeFN4>4 = Tétracosanol

<?aeTC><?aeTC> 5 = Pentacosanol

<?aeFN4>6 = Hexacosanol

<?aeFN4>7 = Heptacosanol

<?aeFN4>8 = Octacosanol

>FIN DE GRAPHIQUE>

1

2

3

4

5

6

7

8

ANNEXE V

DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION ET DU CONTENU EN STÉROLS AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1.

OBJET

La méthode décrit le procédé de détermination du contenu en stérols, simples et totaux, des matières grasses.

2.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse, additionnée d'a-cholestanol comme standard interne, est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La fraction stérolique est séparée de l'extrait insaponifiable par chromatographie sur plaque de gel de silice basique; les stérols récupérés dans le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.

3.

APPAREILLAGE

3.1.

Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts rodés.

3.2.

Ampoule à décanter de 500 millilitres.

3.3.

Ballons de 250 millilitres.

3.4.

Équipement complet pour chromatographie en phase solide, avec plaques de verre de 20 × 20 centimètres.

3.5.

Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.

3.6.

Microseringues de 100 et 500 microlitres.

3.7.

Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout rodé mâle 12/21.

3.8.

Fiole à vide 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable à l'ampoule filtrante (3.7).

3.9.

Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.

3.10.

Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec colonne capillaire, doté d'un système de séparation, constitué de:

3.10.1.

Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la température désirée avec une précision d'environ 1o C

3.10.2.

Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilanisé

3.10.3.

Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur

3.10.4.

Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertisseur-amplificateur.

3.11.

Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de long, de 0,25 à 0,32 millimètres de diamètre intérieur, recouverte intérieurement de liquide. SE-52 ou SE-54 ou équivalent, avec une épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.

3.12.

Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 micromètres avec aiguille cémentée.

4.

RÉACTIFS

4.1.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre, tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles de verre opaque bien bouchées (éthanol 95 % V/V).

4.2.

Éther éthylique pur, pour analyses.

4.3.

Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.

4.4.

Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluorescence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.5.

Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2N: dissoudre 13 grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol.

4.6.

Benzène, pour chromatographie (5.2.2).

4.7.

Acétone, pour chromatographie (5.2.2).

4.8.

Hexane pour chromatographie (5.2.2).

4.9.

Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).

4.10.

Chloroforme pur, pour analyses.

4.11.

Solution de refroidissement pour la chromatographie sur plaque: cholestérol ou phytostérol, solution à 0,5 % dans le chloroforme.

4.12.

Dichloro-2m-7m fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solution alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.

4.13.

Pyridine anhydre, pour chromatographie.

4.14.

Hexaméthyldisilazane.

4.15.

Triméthylchlorosilane.

4.16.

Solution échantillon des triméthylsilyléthers des stérols: à préparer au moment de l'emploi à partir des stérols tirés des huiles qui les contenaient.

4.17.

a-cholestanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard interne).

4.18.

Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.19.

Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5.

PROCÉDÉ

5.1.

Préparation de l'insaponifiable

5.1.1.

Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microseringue de 500 microlitres, un volume de solution d'a-cholestanol à 0,2 % dans le chloroforme (4.17) qui contienne une quantité d'a-cholestanol correspondant à environ 10 % des stérols contenus dans l'aliquote d'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 500 microgrammes de la solution d'a-cholestane à 0,2 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et 1 500 microlitres s'il s'agit d'huile de semences ou d'huile de grignons d'olive.

Évaporer dans un courant d'azote jusquà dessication, puis peser exactement 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.

Dans le cas d'huiles et de graisses animales ou végétales qui contiennent des quantités considérables de cholestérol, un pic ayant un temps de rétention identique à celui du cholestanol peut être présent. Dans de tels cas, il faut analyser la fraction stérolique en double, avec et sans standard interne.

5.1.2.

Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium à 2N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique jusqu'à que la saponification se soit produite (la solution devient limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50 millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant, débrancher le réfrigérant et refroidir le ballon à environ 30o C.

5.1.3.

Transvaser le contenu du ballon de façon quantitative, dans une ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillé à plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).

Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillant dans une autre ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse, selon les mêmes modalités en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres d'éther éthylique.

Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant, avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou méthylique.

5.1.4.

Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à l'eau distillée (50 ml à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de lavage.

Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 ml pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther éthylique.

5.1.5.

Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il en reste de petites quantités, puis porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le séchage à l'étuve à 100o C durant un quart d'heure environ et peser après refroidissement dans un dessicateur.

5.2.

Séparation de la fraction stérolique.

5.2.1.

Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice (4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser les ensuite enfermées sous hotte pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100o C pendant une heure.

Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours).

Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la séparation de la fraction stérolique élimine le besoin du traitement de l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des stérols nettement séparée de la bande des alcools aliphatiques et terpéniques.

5.2.2.

Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone 95/5 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser à la place un mélange hexane-éther éthylique 55/35 (V/V). Fermer la cuve à l'aide d'une couvercle approprié et laisser ainsi pendant une demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'établisse. Il est possible de fixer sur les surfaces intérieures de la cuve des bandes de papier filtré qui plongent dans l'éluant: cette précaution permet de réduire d'un tiers environ le temps de migration du front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.

Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être chargé à chaque essai.

5.2.3.

Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le chloroforme et, avec la microseringue de 100 millilitres, déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1), à 2 centimètres environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la ligne de dépôt, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de référence des stérols (4.11), dans le but d'identifier la bande des stérols lors du dernier développement.

5.2.4.

Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme décrit en (5.2.2). La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20o C. Fermer aussitôt la chambre avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment.

5.2.5.

Vaporiser légèrement la plaque et de façon uniforme avec la solution de dichloro-22-72 fluorescéine. Identifier la bande des stérols par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter la bande avec un crayon noir le long des bords de la fluorescence.

5.2.6.

Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud, mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule filtrante.

Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ 10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en chauffant légèrement dans un léger courant d'azote, reprendre avec quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes environ à l'étuve à 105o C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser.

Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction stérolique.

5.3.

Préparation des triméthylsilyléthers

5.3.1.

Ajouter, dans le tube contenant la fraction stérolique, le réactif de silylation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 4) dans une proportion de 50 microlitres par milligramme de stérols, en évitant toute absorption d'humidité (note 5).

Note 4: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosilane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.

5.3.2.

Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète solubilisation des stérols. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse.

Note 5: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou de l'altération du réactif. Dans ce cas, l'essai doit être répété.

5.4.

Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.4.1.

Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne

5.4.1.1.

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de séparation et l'extrémité de sortie au détecteur.

Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système de séparation et du système d'enregistrement, etc.).

5.4.1.2.

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est conseillé de procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie en phase gazeuse et commencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre une température d'au moins 20o C supérieure à celle d'exercice (note 6). Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis porter le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux et du fractionnement, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre pour la colonne du détecteur et de l'initiateur, etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité d'au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive.

Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

Note 6: La température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20o C à la température maximale prévue pour le liquide de répartition employé.

5.4.2.

Choix des conditions opératoires

5.4.2.1.

Les conditions opératoires maximales sont les suivantes:

- température de la colonne: 260o C p5o C,

- température de l'évaporateur: 280o C,

- température du détecteur: 290o C,

- vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,

- rapport de séparation: de 1/50 à 1/100,

- sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,

- sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,

- vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,

- quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de TMSE.

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de façon à obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:

- le temps de rétention du b-sitostérol doit être de 20 p5 minutes,

- le pic de campestérol doit être: pour l'huile d'olive (contenu moyen 3 %) 15 p5 % de l'échelle de fond, pour l'huile de soja (contenu moyen 20 %) 80 p10 % de l'échelle de fond,

- il doit y avoir séparation de tous les stérols présents; il est nécessaire que les autres pics séparés soient aussi complètement résolus, ce qui veut dire que le tracé du pic doit rejoindre la ligne de base avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toutefois tolérée à condition, cependant, qu'elle soit quantifiable selon la perpendiculaire au pic à TRR 1,02.

5.4.3.

Exécution de l'analyse

5.4.3.1.

Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane, aspirer 0,5 microlitre d'air et successivement 0,5 et 1 microlitre de la solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes environ.

5.4.3.2.

Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des stérols présents.

La ligne de base doit toujours correspondre aux qualités requises (5.4.1.2).

5.4.4.

Identification des pics

L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des stérols, analysés dans les mêmes conditions.

Les stérols sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol, 24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, D7 campestérol, D5,23 stigmastadiénol, chlérostérol, b-sitostérol, sitostanol, D5-avénastérol, 5,24 stigmastadiénol, D7-stigmasténol, D7-avénastérol.

Dans le tableau 1 sont reportés les temps de rétention relatifs au sitostérol pour les colonnes SE 52 et SE 54.

Les figures 1 et 2 illustrent les chromatogrammes typiques de quelques huiles.

5.4.5.

Évaluation quantitative

5.4.5.1.

Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'a-cholestanol et des stérols. Ne pas considérer les pics éventuels de compositions non comprises dans celles énumérées dans le tableau 1. Le coefficient de réponse GLC de l'a-cholestanol s'entend égal à 1.

5.4.5.2.

Calculer le contenu en chaque stérol simple, en milligrammes par 100 grammes de matière grasse, comme suit:

stérol x = Ax 7 ms 7 100

stérol x =

Ax 7 ms 7 100

As 7 m

où:

Ax = aire du pic du stérol x, en millimètres carrés;

As

=

aire du pic d'á-cholestanol, en millimètres carrés;

ms

=

poids d'á-cholestanol ajouté, en milligrammes;

m:

=

poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6.

EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1.

Rapporter les contenus de chaque stérol en milligrammes par 100 grammes de matière grasse et leur somme comme «stérols totaux».

6.2.

On calcule le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre l'aire du pic correspondant et la somme des aires des pics des stérols.

% du stérol % x = ÓA × 100

% du stérol x =

Ax

ÓA

× 100

Ax = aire du pic x.

ÓA

=

somme des aires de tous les pics.

APPENDICE

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de l'injection et celui de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

>TABLE>

>DEBUT DE GRAPHIQUE>

<?aa8H>Figure 1

<?aeFN8><?aa8K>Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive brute

<?aeVS1><?Þ"FIN DE GRAPHIQUE>

>DEBUT DE GRAPHIQUE>

<?aa8H>Figure 2

<?aeFN8><?aa8K>Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive raffinée

<?aeVS1><?Þ"FIN DE GRAPHIQUE>

ANNEXE VI

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ÉRYTHRODIOL ET EN UVAOL

AVANT-PROPOS

L'érythrodiol (terme générique qui désigne conventionnellement l'ensemble des diols érythrodiol et uvaol) est un élément constitutif de l'insaponifiable que l'on trouve dans certains types de matières grasses. Son dosage peut servir à vérifier la présence d'huile d'olive d'extraction, sa concentration y étant nettement plus élevée que dans d'autres huiles (huiles d'olive de pression, huiles de pépins de raisin).

1.

OBJET

La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en érythrodiol des matières grasses.

2.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans de l'éthanol. L'insaponifiable est ensuite extrait avec de l'éther éthylique, purifié par passage sur une colonne d'alumine et fractionné par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice. Les bandes des fractions stérolique et érythrodiolique sont alors isolées.

Les stérols et l'érythrodiol récupérés sur la plaque sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse.

Le résultat est exprimé en pourcentage d'érythrodiol par rapport à l'ensemble érythrodiol + stérols.

3.

APPAREILLAGE

3.1.

Appareillage décrit à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).

4.

RÉACTIFS

4.1.

Réactifs énumérés à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).

4.2.

Solution de référence d'érythrodiol à 0,5 % dans du chloroforme.

5.

MODE OPÉRATOIRE

5.1.

Préparation de l'insaponifiable

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.1.2 de l'annexe V.

5.2.

Séparation de l'érythrodiol et des stérols

5.2.1.

Voir paragraphe 5.2.1 de la méthode de l'annexe V.

5.2.2.

Voir paragraphe 5.2.2 de la même méthode.

5.2.3.

Préparer une solution d'insaponifiable (à 5 %) dans le chloroforme.

Avec la microseringue de 0,1 millilitre, déposer sur une plaque chromatographique, à environ 1,5 centimètre du bord inférieur, 0,3 millilitre de la solution susmentionnée, en une ligne la plus fine et la plus uniforme possible. À une extrémité de la plaque, déposer, pour référence, quelques microlitres des solutions de cholestérol et d'érythrodiol.

5.2.4.

Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indiquée au paragraphe 5.2.1. La température ambiante doit être d'environ 20o C. Fermer aussitôt avec le couvercle et éluer jusqu'à ce que le niveau du solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et évaporer le solvant dans un courant d'air chaud.

5.2.5.

Vaporiser uniformément la solution de dichloro-2m7m fluorescéine sur la plaque. En examinant cette dernière à la lumière ultraviolette, identifier les bandes de stérols et de l'érythrodiol par alignement avec les éléments de référence, puis délimiter avec une pointe légèrement en dehors des bords de la fluorescence.

5.2.6.

Avec une spatule métallique, racler le gel de silice compris dans les zones délimitées. Introduire le matériau retiré de la plaque dans une fiole de 50 millilitres. Ajouter 15 millilitres de chloroforme chaud, bien agiter et filtrer dans l'ampoule à filtre poreux en transférant le gel de silice sur le filtre même. Laver par trois fois au chloroforme chaud (environ 10 millilitres à chaque fois) et receuillir le filtrat dans un ballon de 100 millilitres. Évaporer jusqu'à obtention d'un volume de 4 à 5 millilitres, transvaser, dans un tube centrifugeur à fond conique de 10 millilitres préalablement pesé, porter à sec en chauffant légèrement dans un courant d'azote, et peser.

5.3.

Préparation des triméthylsilyléthers

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.3 de la méthode de l'annexe V.

5.4.

Analyse par chromatographie en phase gazeuse

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.4 de la même méthode.

L'analyse par chromatographie en phase gazeuse doit être réalisée dans des conditions permettant le respect des exigences de l'analyse des stérols et la séparation des TMSE de l'érythrodiol et de l'uvaol.

Après avoir injecté l'échantillon, laisser le papier se dérouler jusqu'à élution complète des stérols présents, de l'érythrodiol et de l'uvaol. Identifier ensuite les pics (les temps de rétention relatifs de l'érythrodiol et de l'uvaol, par rapport au b-sitostérol, sont respectivement de 1,4 et 1,55 environ).

Calculer ensuite les aires comme indiqué pour les stérols.

6.

EXPRESSION DES RÉSULTATS

Pourcentage de l'Érythrodiol = A1 + A2 + Ó Astérols × 100

Pourcentage de l'Érythrodiol =

A1 + A2

A1 + A2 + Ó Astérols

× 100

où:

A1 : aire du pic de l'érythrodiol, en millimètres carrés;

A2

: aire du pic de l'uvaol, en millimètres carrés;

Ó Astérols : somme des aires des stérols présents, en millimètres carrés.

Indiquer le résultat avec une décimale.

ANNEXE VII

DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS SATURÉS EN POSITION 2 DU TRIGLYCÉRIDE

1.

OBJET

La présente norme décrit une méthode de détermination de la composition de la fraction des acides gras d'une huile ou d'une matière grasse estérifiée dans la position 2 (ou position interne) du glycérol.

2.

CHAMP D'APPLICATION

La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses dont le point de fusion se situe en deça de 45o C, en raison des caractéristiques de l'action de la lipase pancréatique.

Elle n'est pas applicable sans réserves aux huiles et matières grasses contenant des quantités importantes d'acides gras comportant un nombre d'atomes de carbone égal ou inférieur à douze (huile de coco et de palmiste, matière grasse butyrique), des acides gras hautement insaturés (comportant plus de quatre liaisons doubles) comportant un nombre d'atomes de carbone égal ou supérieur à vingt (huiles de poisson et d'animaux marins) ou des acides gras comprenant des groupes oxygénés autres que le groupe acide.

3.

PRINCIPE

Neutralisation éventuelle d'huiles et de matières grasses dans un solvant. Purification par passage sur une colonne d'alumine. Hydrolyse partielle des triglycérides par la lipase pancréatique au cours d'un laps de temps déterminé. Séparation des monoglycérides formés par chromatographie en couche mince et méthanolyse de ces derniers. Analyse des esters méthyliques par chromatographie en phase gazeuse/liquide.

4.

APPAREILLAGE

4.1.

Ballon de 100 millilitres.

4.2.

Ballon de 25 millilitres avec embout rodé.

4.3.

Réfrigérant à air d'une longuer d'un mètre, adaptable à la fiole visée au point 4.2.

4.4.

Fiole conique de 250 millilitres.

4.5.

Bécher de 50 millilitres.

4.6.

Ampoule à décanter de 500 millilitres.

4.7.

Colonne de verre pour chromatographie (diamètre intérieur: 13 millimètres; longueur: 400 millimètres) munie d'un disque en verre fritté et d'un robinet.

4.8.

Tube centrifugeur de 10 millilitres avec bouchon en verre rodé.

4.9.

Burette de 5 millilitres avec graduations de 0,05 millilitre.

4.10.

Seringue hypodermique de 1 millilitre munie d'une aiguille fine.

4.11.

Microseringue pour gouttes de 3 à 4 microlitres.

4.12.

Épandeuse pour chromatographie en couche mince.

4.13.

Plaques de verre pour chromatographie en couche mince (20 × 20 centimètres).

4.14.

Cuve de développement en verre pour chromatographie en couche mince, avec couvercle en verre rodé, convenant pour les plaques de 20 × 20 centimètres.

4.15.

Vaporisateur pour chromatographie en couche mince.

4.16.

Étuve réglée à 103 p2o C.

4.17.

Thermostat réglable entre 30 et 45o C, à 0,5o C près.

4.18.

Évaporateur rotatif.

4.19.

Agitateur électrique vibrant, permettant d'agiter vigoureusement le tube centrifugeur.

4.20.

Lampe à rayons ultraviolets pour l'examen des plaques pour chromatographie en couche mince.

Pour le contrôle de l'activité de la lipase:

4.21.

pH-mètre

4.22.

Agitateur à spirale

4.23.

Burette de 5 millilitres

4.24.

Chronomètre.

Pour la préparation éventuelle de la lipase:

4.25.

Agitateur de laboratoire convenant pour la dispersion et le mélange de matières hétérogènes.

5.

RÉACTIFS

5.1.

n-hexane ou, à défaut, éther de pétrole, (b.e. 30-50o C), de qualité chromatographique.

5.2.

2-propanol (ou éthanol), 95o C (V/V), qualité analytique.

5.3.

2-propanol (ou éthanol) en solution aqueuse 1/1.

5.4.

Éther diéthylique exempt de peroxydes.

5.5.

Acétone.

5.6.

Acide formique à au moins 98 % (m/m).

5.7.

Solvant de développement: mélange de n-hexane (5.1), d'éther diétylique (5.4) et d'acide formique (5.6) selon les proportions 70/30/1 (V/V/V).

5.8.

Alumine activée pour chromatographie, neutre, de degré d'activité Brockmann I.

5.9.

Poudre de silice, avec liant, de qualité adéquate pour la chromatographie en couche mince.

5.10.

Lipase pancréatique de qualité adéquate (notes 1 et 2).

5.11.

Hydroxide de sodium en solution aqueuse (120 grammes par litre).

5.12.

Acide chlorhydrique en solution aqueuse (6 N).

5.13.

Chlorure de calcium (CaC1 2) en solution aqueuse (220 grammes par litre).

5.14.

Cholate de sodium (qualité enzymatique) en solution aqueuse (1 gramme par litre).

5.15.

Solution tampon: solution aqueuse 1 M de tris-hydroxyméthylaminométhane amené à un pH de 8 par addition d'acide chlorhydrique (5.12) (contrôle au potentiomètre).

5.16.

Phénolphtaléine en solution (10 grammes par litre) dans de l'éthanol à 95 % (V/V).

5.17.

Dichloro-2m-7m-fluorescéine en solution (2 grammes par litre) dans de l'éthanol à 95 % (V/V), légèrement alcalinisé par l'addition d'une goutte de solution d'hydroxyde de sodium 1 N par 100 millilitres.

Pour le contrôle de l'activité de la lipase:

5.18.

Huile neutralisée

5.19.

Hydroxyde de sodium en solution aqueuse 0,1 N

5.20.

Cholate de sodium (qualité enzymatique) en solution aqueuse (200 grammes par litre)

5.21.

Gomme arabique en solution aqueuse (100 grammes par litre).

6.

PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON

Si l'échantillon possède un taux d'acidité, déterminé selon l'annexe II, inférieur à 3 %, purifier directement sur alumine comme indiqué au point 6.2.

Si l'échantillon possède un taux d'acidité, déterminé selon l'annexe II, supérieur à 3 %, neutraliser par alcaline en présence d'un solvant, comme indiqué au point 6.1, puis passer sur alumine comme indiqué au point 6.2.

6.1.

Neutralisation par alcaline en présence d'un solvant

Dans une ampoule à décantation (4.6), introduire environ 10 grammes d'huile brute et ajouter 100 millilitres d'hexane (5.1), 50 millilitres de 2-propanol (5.2), quelques gouttes de solution de phénolphtaléine (5.16) et une quantité de soution d'hydroxyde de sodium (5.11) correspondant à la teneur en acides libres de l'huile, majorée de 0,3 %.

Agiter vigoureusement pendant une minute, ajouter 50 millilitres d'eau distillée, agiter de nouveau et laisser reposer.

Après séparation, éliminer la couche inférieure de savon. Éliminer également toutes les couches intermédiaires (mucilage, matières insolubles). Laver la solution d'hexane et d'huile neutralisée avec

plusieurs doses de 25 à 30 millilitres de solution de 2-propanol (5.3) jusqu'à ce que la couleur rose de la phénolphtaléine disparaisse.

Éliminer la majeure partie de l'hexane par distillation sous vide dans l'évaporateur rotatif (4.18) et sécher l'huile à 30-40o C (toujours sous vide) à l'aide d'un courant d'azote pur, jusqu'à élimination de l'hexane.

6.2.

Purification par passage sur alumine

Préparer une suspension de 15 grammes d'alumine activée (5.8) dans 50 millilitres d'hexane (5.1) et verser, tout en agitant, sur la colonne chromatographique (4.7).

Procéder au tassement de l'alumine et laisser tomber le niveau du solvant jusqu'à 1 ou 2 millimètres au dessus de l'absorbant. Verser soigneusement sur la colonne une solution de 5 grammes d'huile dans 25 millilitres d'hexane (5.1). Recueillir l'ensemble de l'effluent de la colonne dans un ballon (4.1).

7.

PRÉPARATION DES PLAQUES CHROMATOGRAPHIQUES

Nettoyer à fond les plaques de verre (4.13) avec de l'éthanol, de l'éther, du pétrole et de l'acétone pour éliminer toute trace de matière grasse.

Dans une fiole conique (4.4), introduire 30 grammes de poudre de silice (5.9). Ajouter 60 millilitres d'eau distillée. Boucher et agiter vigoureusement pendant une minute. Transférer immédiatement la suspension dans l'épandeuse (4.12) et enduire les plaques propres d'une couche de 0,25 millimètre d'épaisseur.

Sécher les plaques pendant 15 minutes à l'air, puis pendant une heure dans l'étuve (4.16) à 103 p 2o C.

Amener les plaques à température ambiante dans un dessicateur avant l'emploi.

Des plaques préparées sont disponibles dans le commerce.

8.

MODE OPÉRATOIRE

8.1.

Hydrolyse par la lipase pancréatique

Peser environ 0,1 gramme de l'échantillon préparé dans le tube centrifugeur (4.8). S'il s'agit d'une matière grasse solide, dissoudre dans 0,2 millilitre d'hexane en chauffant légèrement, si nécessaire.

Ajouter 20 millilitres de lipase (5.10) et 2 millilitres de solution tampon (5.15). Agiter convenablement mais prudemment puis ajouter 0,5 millilitre de solution de cholate de sodium (5.14) et 0,2 millilitre de solution de chlorure de calcium (5.13). Fermer le tube avec le bouchon rodé, agiter prudemment (éviter de mouiller le bouchon) et placer le tube immédiatement dans le thermostat (4.17) maintenu à 40 p 0,5o C. Agiter à la main pendant exactement 1 minute. Retirer le tube du thermostat et agiter vigoureusement à l'aide d'un agitateur électrique (4.19) pendant exactement 2 minutes. Refroidir immédiatement à l'eau courante; ajouter 1 millilitre d'acide chlorydrique (5.12) et 1 millilitre d'éther diéthylique (5.4). Boucher et agiter vigoureusement à l'aide de l'agitateur électrique. Laisser reposer et éliminer la couche organique à l'aide de la seringue (4.10), si nécessaire après centrifugation.

8.2.

Séparation des monoglycérides par chromatographie en couche mince

Appliquer l'extrait sur la plaque chromatographique en une couche mince et uniforme la plus étroite possible, à l'aide de la microseringue (4.11), à environ 1,5 centimètre de l'extrémité inférieure. Introduire la plaque dans la cuve de développement bien saturée (4.14) et développer à l'aide du solvant (5.7) à environ 20o C, jusqu'à environ 1 centimètre de l'extrémité supérieure de la plaque.

Sécher la plaque à l'air, à la température de la cuve, et y pulvériser la solution de dichloro-2m-7m fluorescéine (5.17). Délimiter la bande des monoglycérides (Rfd'environ 0,035) sous lumière ultraviolette (4.20).

8.3.

Analyse des monoglycérides par chromatographie en phase gazeuse/liquide

Récupérer la bande obtenue au point 8.2 à l'aide d'une spatule (en évitant d'enlever les composants restés sur la ligne de base) et la recueillir dans le récipient de méthylation (4.2).

Traiter directement la silice recueillie comme indiqué au point 4.1 de l'annexe X «B», de manière à convertir les monoglycérides en esters méthyliques, puis examiner les esters par chromatographie en phase gazeuse comme indiqué à l'annexe X «A».

9.

EXPRESSION DES RÉSULTATS

Déterminer la composition de la fraction des acides gras en position 2 en exprimant le résultat avec une décimale (note 3).

10.

NOTES

Note 1: Contrôle de l'activité de la lipase

Préparer une émulsion d'huile en agitant dans un agitateur adéquat un mélange composé de 165 millilitres de solution de gomme arabique (5.21) de 15 grammes de glace pilée et de 20 millilitres d'une huile neutralisée (5.18).

Dans un bécher (4.5), verser 10 millilitres de cette émulsion, puis 0,3 millilitre de solution de cholate de sodium (5.20) et 20 millilitres d'eau distillée. Placer le bécher dans un thermostat maintenu à 37 p0,5 oC (note 4). Introduire les électrodes d'un pH-mètre (4.21) et un agitateur à spirale (4.22). À l'aide d'une burette (4.23), ajouter la solution d'hydroxyde de sodium (5.19) goutte à goutte jusqu'à ce que le pH atteigne 8,5.

Ajouter une quantité suffisante de suspension aqueuse de lipase (voir ci-dessous). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3, déclencher le chronomètre (4.24) et commencer à ajouter la solution d'hydroxyde de sodium (5.19) goutte à goutte à la vitesse nécessaire pour maintenir constant le pH de 8,3. Notar à chaque minute le volume de solution alcaline consommée.

Rapporter les observations sur un diagramme en indiquant en abscisse les temps et en ordonnée les millilitres de solution alcaline nécessaires pour maintenir le pH constant.

Le résultat obtenu être une ligne droite.

la suspension de lipase susmentionnée est une suspension à 1 pour 1 000 (m/m) dans l'eau. Pour chaque essai, il convient d'en utiliser une quantité suffisante pour que, environ 1 millilitre de solution alcaline, soit consommé en 4 à 5 minutes.

Normalement, une quantité de poudre de 1 à 5 milligrammes est nécessaire.

L'unité lipasique est définie comme la quantité d'enzymes que libèrent 10 microéquivalents d'acide par minute. L'activité A de la poudre utilisée, exprimée en unités lipasiques par milligramme, est calculée au moyen de la formule suivante:

Note 1: A = V × 10

A =

V × 10

m

V: le volume de solution d'hydroxyde de sodium (5.19) consommé par minute (calculé à partir du graphique).

m:

masse de la prise d'essai de poudre, en milligrammes.

Note 2: Préparation de la lipase

Des lipases ayant un niveau d'activité satisfaisant sont disponibles dans le commerce mais peuvent également être préparées comme suit.

Refroidir 5 kilogrammes de pancréas de porc frais à 0 oC; éliminer la graisse solide et le tissu conjonctif présents, puis triturer dans un mélangeur jusqu'à obtention d'une pâte fluide. Agiter cette masse dans l'agitateur (4.25) avec 2,5 litres d'acétone anhydre pendant 4 à 6 heures, puis centrifuger. Procéder à trois autres extractions sur le résidu avec le même volume d'acétone, puis à deux extractions avec un mélange 1/1 (V/V) d'acétone et d'éther diéthylique, et à deux extractions avec de l'éther diéthylique.

Sécher le résidu sous vide pendant 48 heures pour obtenir une poudre stable, à conserver au réfrigérateur.

Note 3: Dans tous cas, il est conseillé de déterminer la composition des acides gras totaux d'un même échantillon, puisque la comparaison avec celle des acides en position 2 permettra d'enterpréter les chiffres obtenus.

Note 4: La température d'hydrolyse est fixée à 37 oC, puisqu'une huile liquide est utilisée. Celle de l'échantillon est toutefois fixée à 40 oC, pour qu'il soit possible d'examiner les matières grasses dont le point de fusion peut atteindre 45 oC.

ANNEXE VIII

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN TRINOLÉINE

1.

OBJET

Détermination de la composition des triglycérides des huiles végétales liquides, en termes de nombre de carbones équivalent, par chromatographie en phase liquide à haute performance.

La présente norme décrit une méthode de séparation et de détermination de la quantité des triglycérides des huiles végétales en termes de masse moléculaire et de degré de non-saturation, pris comme fonctions du nombre de carbones équivalent (voir note 1).

2.

CHAMP D'APPLICATION

La présente norme est applicable à toutes les huiles végétales contenant des triglycérides d'acides gras à longue chaîne et convient particulièrement pour détecter la présence de faibles quantités d'huiles semi-siccatives (riches en acide linoléique) dans les huiles végétales dont le principal acide gras insaturé est l'acide oléique (huile d'olive).

3.

PRINCIPE

Séparation des triglycérides selon leur nombre de carbones équivalent, par chromatographie en phase liquide à haute performance (phase inverse) et interprétation des chromatogrammes.

4.

APPAREILLAGE

4.1.

Appareil de chromatographie en phase liquide à haute performance permettant un contrôle thermostatique de la température de la colonne.

4.2.

Seringue pour injections de 10 microlitres.

4.3.

Détecteur: réfractomètre différentiel capable de déterminer l'indice de réfraction à 10-4 près.

4.4.

Colonne: tube en acier inoxydable d'une longueur de 250 millimètres et d'un diamètre intérieur de 4,5 millimètres, garni de particules de silice de 5 micromètres de diamètre contenant 22 à 23 % de carbone, sous forme d'octadécylsilane (note 2).

4.5.

Enregistreur et/ou intégrateur.

5.

RÉACTIFS

Les réactifs doivent être de pureté analytique et les solvants d'élution dégazés (ils peuvent être recyclés à plusieurs reprises sans que cela ne se répercute sur les séparations).

5.1.

Chloroforme.

5.2.

Acétone.

5.3.

Acétonitrile.

5.4.

Solvant d'élution: acétonitrile + acétone. (Les proportions doivent être ajustées en fonction de la séparation souhaitée; commencer avec un mélange 50/50).

5.5.

Solvant de solubilisation: acétone ou mélange (1:1) d'acétone et de chloroforme.

5.6.

Triglycérides de référence: triglycérides commerciaux tels que la tripalmitine, la trioléine, etc. (les temps de rétention doivent alors être repris dans le graphique selon le nombre de carbones équivalent), ou chromatogramme de référence obtenu grâce à de l'huile de soya (voir notes 3 et 4, et schémas 1

et 2).

6.

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS

Préparer une solution à 5 % des échantillons à analyser en pesant 0,5 p0,0001 grammes d'échantillon dans une fiole graduée de 10 millilitres et compléter jusqu'à 10 millilitres avec le solvant de solubilisation (5.5).

7.

MODE OPÉRATOIRE

7.1.

Monter le système chromatographique. Pomper le solvant d'élution (5.4) à raison de 1,5 millilitre par millimètre pour purger l'ensemble du système. Attendre jusqu'à obtention d'une ligne de base stable.

Injecter 10 microlitres de l'échantillon préparé comme indiqué au point 6.

8.

CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS

SUITE DU TEXTE SOUS LE NUM.DOC : 391R2568.1Utiliser la méthode de normalisation interne, autrement dit supposer que la somme des pourcentages des aires des pics correspondant au divers triglycérides est égale à 100 %.

Calculer le pourcentage de chaque triglycéride avec une décimale, en utilisant la formule:

Pourcentage du triglycéride = somme des aires des pics × 100

Pourcentage du triglycéride =

aire du pic

somme des aires des pics

× 100

Note 1: Il est possible de déterminer l'ordre d'élution en calculant le nombre de carbones équivalent, souvent défini par le rapport NCE = NC 2n, où NC est le nombre d'atomes de carbone et n le nombre de liaisons doubles.

On peut affiner le calcul en tenant compte de l'origine des liaisons doubles.

Si no, n1, et n1 n représentent le nombre des liaisons doubles attribuable aux acides oléique, linoléique et linolénique, le nombre de carbones équivalent peut être calculé selon la formule:

NCE = NC do no d1 n1 d1 n n1 n,

où les coefficients do, d1 et d1n peuvent être calculés à l'aide des triglycérides de référence. Dans les conditions spécifiées dans la présente méthode, le résultat obtenu se rapproche de la formule:

NCE = NC (2,60 no) (2,35 n1) (2,17 nln).

Note 2: Exemples: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333,

Lichrosphère (Merck) 100 CH18 Art 50377, ou similaires.

Note 3: Avec plusieurs triglycérides de référence, il est également possible de calculer la résolution pour la trioléine,

á = TRm/TRmoléine

en utlisant le temps de rétention corrigé TRm = TR TRsolvant.

Le schéma du log á en fontion du f (nombre de liaisons doubles) permet de déterminer les indices de rétention de tous le triglycérides des acides gras des triglycérides de référence (voir schéma 2).

Note 4: L'efficacité de la colonne doit permettre de séparer nettement le pic des LLL (trilinoléiques) de celui des triglycérides possédant un temps de rétention proche.

>DEBUT DE GRAPHIQUE>

Schéma 1

<?aeFN8>Chromatogramme d'un échantillon d'huile de soja

<?aeFN46,6> <?aePD7>Note: <?aeSL1><?aeUL1>P: acide palmitique; St: acide stéarique; O: acide oléique; L: acide linoléique; Ln: acide linolénique.

<?aeIC><?aeVS1><?Þ"FIN DE GRAPHIQUE>

>DEBUT DE GRAPHIQUE>

<?aePD8>Schéma 2

<?aeFN8>Évolution du log <?aa9A>aen fonction de f (nombre de liaisons doubles)

<?aeVS1><?Þ><?aePD7>Note: <?aeSL1><?aeUL1>La: acide laurique; My: acide myristique; P: acide palmitique; St: acide stéarique; O: acide oléique; L: acide linoléique; <?ss>Ln: acide linolénique.

<?aeIC"FIN DE GRAPHIQUE>

Nombre de liaisons doubles

ANNEXE IX

ANALYSE SPECTROPHOTOMÉTRIQUE

PRÉLIMINAIRES

L'examen spectrophotométrique dans l'ultraviolet peut fournir des indications sur la qualité d'une matière grasse, sur son état de conservation et sur les modifications dues aux processus technologiques.

Les absorptions aux longueurs d'onde prévues dans la méthode sont dues à la présence de systèmes dièniques et trièniques conjugués. Les valeurs de ces absorptions sont exprimées comme extinction spécifique E1 cm 1 % (extinction d'une solution de matière grasse à 1 % dans le solvant prescrit, pour une épaisseur de 1 % cm) noté de façon conditionnelle par K (dit également coefficient d'extinction).

1.

OBJET

La méthode décrit le procédé de l'exécution de l'examen spectrophotométrique dans l'ultraviolet des matières grasses.

2.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse étudiée est dissoute dans le solvant requis, puis on détermine l'extinction de la solution à la longueur d'onde prescrite, par rapport au solvant pur. On calcule les extinctions spécifiques à partir des lectures spectrophotométriques.

3.

APPAREILLAGE

3.1.

Spectrophotomètre pour mesure des extinctions dans l'ultraviolet entre 220 et 360 nm, avec possibilité de lecture pour chaque unité nanométrique.

3.2.

Cuves de quartz prismatique, avec couvercle, de parcours optique de 1 centimètre. Les cuves, remplies d'eau ou d'un autre solvant idoine, ne doivent pas présenter de différences supérieures à 0,01 unité d'extinction.

3.3.

Fioles jaugées de 25 millilitres.

3.4.

Colonne pour chromatographie de 540 millimètres de long et 35,0 millimètres de diamètre, équipée d'un tube à reflux d'un diamètre d'environ 10 millimètres.

4.

RÉACTIFS

4.1.

Isooctane (2,2,4-triméthylpentane) spectrophotométriquement pur: il doit avoir, par rapport à l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 60 % à 220 nm et non inférieure à 95 % à 250 nm

ou bien

- cyclohexane spectrophotométriquement pur: il doit avoir, par rapport à l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 40 % à 220 nm et non inférieure à 95 % à 250 nm,

- un autre solvant approprié capable de dissoudre parfaitement la matière grasse (l'alcool éthylique pour l'huile de ricin).

4.2.

Alumine basique pour chromatographie sur colonne, préparée et contrôlée comme décrit dans l'appendice I.

4.3.

n-Hexane pour chromatographie.

5.

PROCÉDÉ

5.1.

L'échantillon examiné doit être parfaitement homogène et exempt d'impuretés en suspension. Les huiles liquides à température ambiante sont filtrées sur papier à une température d'environ 30o C, les graisses solides sont homogénéisées et filtrées à une température non supérieure à 10o C au-dessus de leur température de fusion.

5.2.

Peser 0,25 gramme environ de l'échantillon ainsi préparé dans une fiole jaugée de 25 millilitres, compléter avec le solvant prescrit et homogénéiser. La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier.

5.3.

Remplir une cuve avec la solution obtenue et mesurer les extinctions, en employant comme référence le solvant employé, aux longueurs d'onde comprises entre 232 et 276 nm.

Les valeurs d'extinction lues doivent être comprises dans l'intervalle de 0,1 à 0,8; dans le cas contraire, il est nécessaire de répéter les mesures en utilisant les solutions plus concentrées ou plus diluées appropriées.

5.4.

Au cas ou serait requise la détermination des extinctions spécifiques après passage sur alumine, on procède de la façon suivante: introduire dans la colonne chromatographique 30 grammes d'alumine basique en suspension dans l'hexane; éliminer l'excès d'hexane après tassement de l'absorbant, ou au moins jusqu'à 1 centimètre environ au dessus du niveau supérieure de l'alumine.

Dissoudre 10 grammes de matière grasse, homogénéisée et filtrée comme décrit au point 5.1, dans 100 millilitres d'hexane et verser cette solution dans la colonne. Recueillir l'éluant et évaporer le solvant sous vide et à une température inférieure à 25o C.

Procéder immédiatement sur la matière grasse obtenue comme décrit au point 5.2.

6.

EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1.

Rapporter les extinctions spécifiques (coefficients d'extinction) aux différentes longueurs d'onde, calculées comme suit:

Kl = c 7 s

Kl =

Eë

c 7 s

oú:

Kë : extinction spécifique à la longueur d'onde l;

Eë

:

extinction mesurée à la longueur d'onde ë;

c

:

concentration de la solution en grammes par 100 millilitres;

s

:

épaisseur de la cuvette en centimètres

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6.2.

L'examen spectrophotométrique de l'huile d'olive selon la méthode officielle des règlements officiels de la Communauté économique européenne prévoit la détermination de l'extinction spécifique, en solution dans l'isooctane, aux longueurs d'onde de 232 et 270 nm et la détermination du DK exprimé comme:

DK = Km Km 4 + Km + 4

DK = Km

Km 4 + Km + 4

2

où Km est l'extinction spécifique à la longueur d'onde m, longueur d'onde d'absorbance maximale aux environs de 270 nm.

APPENDICE I Préparation de l'alumine et contrôle de son activité

A.1.1.

Préparation de l'alumine

Mettre dans un récipient, qui ferme hermétiquement, l'alumine au préalable desséchée au four à 380-400o C pendant 3 heures, ajouter de l'eau distillée à raison de 5 millilitres pour 100 grammes d'alumine, fermer rapidement le récipient, agiter à plusieurs reprises, puis laisser reposer pendant au moins 12 heures avant emploi.

A.1.2.

Contrôle de l'activité de l'alumine

Préparer une colonne chromatographique avec 30 grammes d'alumine. Opérer comme décrit au paragraphe 5.4. Faire passer à travers la colonne un mélange constitué de:

- 95 % d'huile d'olive vierge, ayant une extinction spécifique à 268 nm inférieure à 0,18,

- 5 % d'huile d'arachide traitée avec des terres décolorantes lors de son raffinage, ayant une extinction spécifique à 268 nm supérieure ou égale à 4.

Si le mélange après passage sur colonne présente une extinction spécifique à 268 nm supérieure à 0,11, l'alumine est acceptable, sinon, il faut augmenter le taux d'hydratation.

APPENDICE II Étalonnage du spectrophotomètre

A.2.

L'appareillage doit être contrôlé périodiquement (au moins tout les six mois), que ce soit pour la correspondance de la longueur d'onde ou pour l'exactitude de la réponse.

A.2.1.

Le contrôle de la réponse de la longueur d'onde peut être fait au moyen d'une lampe à vapeur de mercure ou de filtres appropriés.

A.2.2.

Pour le contrôle de la cellule photoélectrique et du photomultiplicateur, procéder ainsi: peser 0,2 gramme de chromate de potassium pur pour spectrophotométrie et dissoudre dans une solution d'hydroxyde de potassium 0,05 N et compléter au volume dans une fiole jaugée de 1 000 millilitres. Prélever ensuite 25 millilitres exactement de la solution obtenue, transférer dans une fiole jaugée de 500 millilitres et compléter au volume avec la même solution d'hydroxyde de potassium.

Mesurer l'extinction à 275 nm de la solution ainsi obtenue, en se servant de la solution d'hydroxyde de potassium comme référence. L'extinction mesurée avec une cuve optique de 1 centimètre devra être de 0,200 p 0,005.

ANNEXE X «A»

ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS

1.

DOMAINE D'APPLICATION

La présente méthode donne des directives générales pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse de la composition qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides gras obtenu selon la méthode visée à l'annexe X B.

La méthode n'est pas applicable aux acides gras polymérisés.

2.

RÉACTIFS

2.1.

Gaz vecteur

Gaz inerte (azote, hélium, argon, hydrogène, etc.) soigneusement desséché et contenant moins de 10 milligrammes par kilogramme d'oxygène.

Note 1: L'hydrogène que l'on utilise comme gaz vecteur uniquement avec les colonnes capillaires permet de doubler la vitesse d'analyse mais présente des dangers. Il existe cependant des dispositifs de sécurité.

2.2.

Gaz auxiliaires

2.2.1.

Hydrogène (de pureté 7 99,9 %), ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.2.2.

Air ou oxygène ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.3.

Produits d'étalonnage

Mélange d'esters méthyliques d'acides gras purs, ou esters méthyliques d'un corps gras, de composition connue, si possible voisine de celle du corps gras à analyser.

Prendre toutes précautions afin d'éviter l'oxydation des acides gras polyinsaturés.

3.

APPAREILLAGE

Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromatographie en phase gazeuse utilisant des colonnes remplies et/ou capillaires et un détecteur à ionisation de flamme. Tout appareillage ayant la même efficacité et la même résolution que celles définies au point 5.1.2 convient.

3.1.

Appareil de chromatographie en phase gazeuse

L'appareil de chromatographie en phase gazeuse doit comprendre les éléments suivants.

3.1.1.

Dispositif d'injection

Utiliser un dispositif d'injection:

a) soit avec des colonnes remplies, le dispositif ayant le plus faible volume mort possible (dans ce cas, il doit pouvoir être porté à une température supérieure, de 20o C à 50o C, à celle de la colonne);

b)

soit avec des colonnes capillaires, auquel cas le dispositif doit être spécialement conçu pour l'utilisation de telles colonnes. Il peut être du type diviseur ou du type à injection totale en tête de colonne refroidie (injecteur «non column»).

Note 2: En l'absence de corps gras contenant des acides gras à moins de 16 atomes de carbone, un injecteur à aiguille mobile peut être utilisé.

3.1.2.

Four

Le four doit être en mesure de porter la colonne à une température d'au moins 260o C et de maintenir la température choisie à 1o C près avec une colonne remplie et à 0,1o C près avec une colonne capillaire. Cette dernière caractéristique est particulièrement importante lorsqu'on utilise un tube en silice fondue.

L'utilisation d'un appareil équipé d'un programmateur de température est recommandée dans tous les cas et, en particulier, en présence d'acides gras à moins de 16 atomes de carbone.

3.1.3.

Colonne remplie

3.1.3.1.

Colonne, en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser: verre ou, à défaut, acier inoxydable, ayant les dimensions suivantes:

a)

longueur: de 1 à 3 mètres. Une colonne relativement courte sera utilisée dans le cas où des acides gras à longue chaîne (> C20) sont présents. Dans le cas de la détermination des acides en C4 et en C6, il est recommandé d'utiliser une colonne de 2 m;

b)

diamètre intérieur: de 2 à 4 millimètres.

Note 3: Si des constituants polyinsaturés à plus de trois doubles liaisons sont présents, une colonne en acier inoxydable peut provoquer leur décomposition.

Note 4: Un système à double colonne remplie peut être utilisé.

3.1.3.2.

Remplissage, comprenant les éléments suivants:

a)

support: terre de diatomées lavée aux acides et silanisée, ou tout autre support inerte pouvant convenir, avec un étroit intervalle de granulométrie (25 micromètres entre 125 et 200 micromètres), la dimension moyenne étant liée au diamètre intérieur et à la longueur de la colonne;

b)

phase stationnaire: phase polaire de type polyester (par exemple polysuccinate de diéthylèneglycol, polysuccinate de butanediol, polyadipate d'éthylèneglycol, etc.), cyanosilicones ou toute autre phase permettant la séparation chromatographique (voir article 5). Le taux d'imprégnation sera compris entre 5 % (m/m) et 20 % (m/m). Pour certaines séparations, des phases apolaires pourront être utilisées.

3.1.3.3.

Conditionnement de la colonne

Après avoir déconnecté la colonne du côté du détecteur, porter progressivement le four à 185o C et maintenir la colonne venant d'être préparée sous un courant de gaz inerte de 20 à 60 millilitres par minute durant au moins 16 heures à cette température, puis durant 2 heures à 195o C.

3.1.4.

Colonne capillaire

3.1.4.1.

Tube en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser, généralement en verre ou en silice fondue. Le diamètre interne doit être compris entre 0,2 et 0,8 millimètre. Intérieurement, il devra subir des traitements appropriés (préparation de l'état de surface, inactivation) avant de recevoir le film de phase stationnaire. Une longueur de 25 mètres est suffisante dans la plupart des cas.

3.1.4.2.

Phase stationnaire, principalement de type polyglycols [poly(éthylène glycol) 20 000], polyesters (polysuccinate de butanediol) ou polysiloxanes polaires (cyanosilicones). Les colonnes greffées, ou réticulées, conviennent.

Note 5: Toutefois les polysiloxanes polaires risquent de donner des difficultés dans l'identification et la séparation de l'acide linolénique et des acides en C20.

Les épaisseurs de film doivent être faibles: 0,1 à 0,2 micromètre.

3.1.4.3.

Montage et conditionnement de la colonne

Respecter les précautions habituelles de montage des colonnes capillaires, c'est-à-dire la disposition de la colonne dans le four (support), le choix et le montage des joints (étanchéité), le positionnement des extrémités de la colonne dans l'injecteur et le détecteur (réduction des volumes morts). Mettre la colonne sous gaz vecteur [par exemple, 0,3 bar (30 kPa) pour une colonne de 25 mètres de longueur et d'un diamètre intérieur de 0,3 millimètre].

Conditionner la colonne par programmation de la température du four à 3o C par minute depuis la température ambiante jusqu'à une température inférieure à 10o C à la limite de décomposition de la phase stationnaire. Maintenir à cette température 1 heure, jusqu'à stabilisation de la ligne de base. Revenir à 180o C pour travailler dans des conditions isothermes.

Note 6: Des colonnes préconditionnées adéquates sont disponibles commercialement.

3.1.5.

Détecteur, de préférence capable d'être porté à une température supérieure à celle de la colonne.

3.2.

Seringue

La seringue doit avoir une capacité de 10 millilitres au maximum et être graduée en 0,1 millilitre.

3.3.

Enregistreur

Lorsque la courbe enregistrée est utilisée pour calculer la composition du mélange analysé, l'enregistreur doit être un appareil électronique de grande précision, compatible avec l'appareillage utilisé, et ayant les caractéristiques suivantes:

a) vitesse de réponse inférieure à 1,5 seconde, de préférence 1 seconde (la vitesse de réponse est le temps nécessaire pour que la plume de l'enregistreur aille de 0 à 90 % lors de l'introduction soudaine d'un signal de 100 %);

b)

largeur du papier, 20 centimètres au minimum;

c)

vitesse de déroulement du papier, réglable à des valeurs comprises entre 0,4 et 2,5 centimètres par minute.

3.4.

Intégrateur ou calculateur (facultatif)

L'emploi d'un intégrateur électronique ou d'un calculateur permet un calcul rapide et précis. Celui-ci doit fournir une réponse linéaire, avoir une sensibilité suffisante, et la correction de la déviation de la ligne de base doit être satisfaisante.

4.

MODE OPÉRATOIRE

Les détails opératoires donnés en 4.1 à 4.3 concernent l'emploi d'un détecteur à ionisation de flamme.

En variante, un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à conductibilité thermique (catharomètre) peut être utilisé. Les conditions opératoires doivent alors être modifiées comme décrit à l'article 6.

4.1.

Conditions d'essai

4.1.1.

Choix des conditions optimales de travail

4.1.1.1.

Sur colonne remplie

Pour choisir les conditions de travail, il y a lieu de tenir compte des variables suivantes:

a) la longueur et le diamètre de la colonne;

b)

la nature et la quantité de la phase stationnaire;

c)

la température de la colonne;

d)

le débit du gaz vecteur;

e)

la résolution souhaitée;

f)

l'importance de la prise d'essai, choisie de façon telle que l'ensemble détecteur-électromètre fournisse une réponse linéaire;

g)

la durée de l'analyse.

En général, les valeurs données dans le tableau 1 et le tableau 2 seront celles donnant les résultats désirés, à savoir un nombre de plateaux théoriques, au moins égal à 2 000 par mètre de colonne pour le stéarate de méthyle, et élution de celui-ci en 15 minutes environ.

Lorsque l'appareil le permet, l'injecteur devrait être à une température voisine de 200o C, et le détecteur à une température égale ou supérieure à celle de la colonne.

En général, le rapport du débit d'hydrogène du détecteur à ionisation de flamme à celui du gaz vecteur, varie de 1:2 à 1:1, selon le diamètre de la colonne. Le débit d'oxygène est d'environ 5 à 10 fois celui de l'hydrogène.

>TABLE>

>TABLE>

4.1.1.2.

Sur colonne capillaire

Les caractéristiques d'efficacité et de perméabilité des colonnes capillaires font que la séparation entre constituants et la durée de l'analyse sont très dépendantes du débit de gaz vecteur dans la colonne. Il y aura nécessité, en jouant sur ce paramètre (ou plus simplement sur la perte de charge en tête de colonne), d'optimiser les conditions opératoires selon que l'on recherche, soit à améliorer les séparations, soit à faire de l'analyse rapide.

4.1.2.

Détermination du nombre de plateaux théoriques (efficacité) et de la résolution

(Voir figure 1)

Effectuer l'analyse d'un mélange de stéarate et d'oléate de méthyle en proportions sensiblement équivalentes (par exemple, esters méthyliques de beurre de cacao).

Choisir l'importance de la prise d'essai, la température de la colonne et le débit du gaz vecteur, de façon que le maximum du pic du stéarate de méthyle soit enregistré environ 15 minutes après le pic du solvant, et que ce pic corresponde à environ les trois quarts de l'échelle totale.

Calculer le nombre de plateaux théoriques, n, à l'aide de la formule

n = 16 [ W1 ]²

n = 16 [

dr1

W1

]²

et la résolution R, par la formule

R = W1 + W2

R =

2D

W1 + W2

où:

dr(I): distance de rétention, en millimètres, mesurée à partir du début du chromatogramme jusqu'au maximum du pic du stéarate de méthyle;

w(I) et w(II):

largeurs, en millimètres, des pics du stéarate et de l'oléate de méthyle, mesurées entre les points d'intersection avec la ligne de base des tangentes aux points d'inflexion de la courbe;

D:

distance, en millimètres, entre les maxima relatifs des pics du stéarate et de l'oléate de méthyle.

>DEBUT DE GRAPHIQUE>

<?aePD8>Figure 1<?aa7A>

<?Þ>Chromatogramme pour la détermination du nombre de plateaux théoriques (efficacité) et de la résolution.

<?aeFN28,6"FIN DE GRAPHIQUE>

Les conditions opératoires sont celles donnant un nombre de plateaux théoriques pour le stéarate de méthyle, au moins égal à 2 000 par mètre de colonne, et une résolution d'au moins 1.25.

4.2.

Prise d'essai

À l'aide de la seringue (4.2), prélever de 0,1 à 2 microlitres de la solution d'esters méthyliques obtenue selon la méthode visée à l'annexe X «B» et les injecter dans la colonne.

Dans le cas des esters exempts de solvants, préparer une solution à 100 milligrammes par millilitre environ dans