DÉCISION D'EXÉCUTION (UE) 2015/1554 DE LA COMMISSION

du 11 septembre 2015

portant modalités d'application de la directive 2006/88/CE en ce qui concerne les exigences relatives à la surveillance et aux méthodes de diagnostic

[notifiée sous le numéro C(2015) 6188]

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

LA COMMISSION EUROPÉENNE,

vu le traité sur le fonctionnement de l'Union européenne,

vu la directive 2006/88/CE du Conseil du 24 octobre 2006 relative aux conditions de police sanitaire applicables aux animaux et aux produits d'aquaculture, et relative à la prévention de certaines maladies chez les animaux aquatiques et aux mesures de lutte contre ces maladies (1), et notamment son article 49, paragraphe 3, son article 50, paragraphe 4, son article 57, point b) et son article 61, paragraphe 3,

considérant ce qui suit:

L'éradication des maladies répertoriées et l'obtention du statut «indemne de maladie» par un État membre, une zone ou un compartiment devraient reposer sur des principes et une démarche scientifique identiques dans toute l'Union. En conséquence, il est nécessaire de définir au niveau de l'Union des exigences spécifiques applicables aux programmes de surveillance et d'éradication, ainsi que les méthodes d'échantillonnage et de diagnostic à utiliser par les États membres pour obtenir le statut «indemne de maladie» à l'échelle de l'État membre ou d'une zone ou compartiment de celui-ci.

Les examens de laboratoire à effectuer en cas de suspicion d'une maladie répertoriée ou pour confirmer la présence d'une telle maladie devraient être identiques dans toute l'Union et respecter les mêmes normes et protocoles scientifiques. Conformément à la directive 2006/88/CE, il est nécessaire d'établir les méthodes et procédures de diagnostic spécifiques à utiliser par les laboratoires désignés à cet effet par l'autorité compétente de chaque État membre.

Le Code sanitaire pour les animaux aquatiques adopté par l'Organisation mondiale de la santé animale (OIE) (ci-après le «code aquatique») établit des normes pour l'amélioration de la santé des animaux aquatiques et le bien-être des poissons d'élevage dans le monde, y compris des normes de sécurité sanitaire applicables aux échanges internationaux d'animaux aquatiques et des produits qui en sont issus. Un certain nombre de chapitres du code aquatique énoncent des recommandations concernant l'utilisation de certains tests de diagnostic. Ces tests, proposés par l'OIE, sont décrits dans le Manuel des tests de diagnostic pour les animaux aquatiques de l'OIE (ci-après le «manuel aquatique»). Pour garantir la cohérence entre les normes internationales et les exigences de l'Union relatives aux méthodes de diagnostic des maladies des animaux aquatiques, il convient que les règles énoncées dans la présente décision tiennent compte des normes et recommandations figurant dans le code aquatique.

À cet égard, le manuel aquatique énumère, pour un grand nombre des maladies répertoriées, plusieurs tests et procédures à utiliser aux fins des examens de laboratoire. Afin d'uniformiser, à l'échelle de l'Union, la base scientifique utilisée pour le diagnostic des maladies répertoriées, il est nécessaire de désigner, parmi les tests et procédures de diagnostic recommandés par l'OIE, ceux qui devraient être obligatoires aux fins des examens de laboratoire à réaliser dans le cadre des programmes de surveillance ainsi que pour écarter une suspicion de maladie répertoriée ou confirmer la présence d'une telle maladie. Comme il sera également nécessaire, dans certains cas, de disposer de méthodes et de procédures de substitution, il convient que des descriptions et des explications scientifiques sur les conditions et les modalités d'application de ces méthodes de substitution soient fournies, surtout en ce qui concerne les procédures de diagnostic détaillées.

Aux fins de l'obtention de diagnostics précis et reproductibles, il importe que les procédures et protocoles détaillés à utiliser soient validés conformément aux normes de qualité pertinentes visées à l'annexe VI, partie I, de la directive 2006/88/CE. Dans un grand nombre des méthodes de diagnostic établies par la présente décision, l'utilisation de kits de diagnostic disponibles dans le commerce est une composante nécessaire des protocoles, et ces kits de diagnostic ont été validés lors d'essais menés dans le cadre de l'accréditation par les laboratoires de référence de l'Union pour les différentes maladies. Pour des raisons de sécurité juridique, la dénomination commerciale des kits de diagnostic qui ont été validés devrait être utilisée dans la présente décision.

Il se peut que certains États membres éprouvent des difficultés à obtenir, pour une ou plusieurs des maladies répertoriées, le statut «indemne de maladie» à l'échelle de l'État membre ou pour une zone ou un compartiment de celui-ci. En pareille situation, l'État membre peut souhaiter ne pas obtenir ou ne pas retrouver le statut «indemne» pour ces maladies répertoriées. Les mesures minimales de lutte à appliquer dans les cas où l'État membre concerné ne souhaite pas obtenir ou retrouver le statut «indemne» devraient être identiques dans toute l'Union et respecter les mêmes critères. Il est donc nécessaire, conformément à la directive 2006/88/CE, de fixer des modalités de confinement pour empêcher la propagation de ces maladies répertoriées, et de définir les conditions minimales requises pour la levée de ces mesures de confinement.

La décision 2001/183/CE de la Commission (2) fixe les exigences relatives aux plans d'échantillonnage et aux méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la nécrose hématopoïétique infectieuse et de la septicémie hémorragique virale, qui font partie des maladies répertoriées. La décision 2003/466/CE de la Commission (3) fixe les exigences relatives aux plans d'échantillonnage et aux méthodes de diagnostic pour la détection de l'anémie infectieuse du saumon, ainsi que les critères de zonage et les mesures de surveillance officielle à adopter après suspicion ou confirmation de la présence de cette maladie. La décision 2002/878/CE de la Commission (4) fixe les exigences relatives aux plans d'échantillonnage et aux méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la bonamiose et de la marteiliose, qui sont des maladies des mollusques. Afin d'actualiser ces exigences, ces trois décisions devraient être remplacées par la présente décision. Les décisions 2001/183/CE, 2002/878/CE et 2003/466/CE devraient dès lors être abrogées.

A ADOPTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:

Article premier

Objet

La présente décision établit des règles concernant:

la surveillance, les zones tampons, les méthodes d'échantillonnage et de diagnostic à utiliser par les États membres en rapport avec leur statut sanitaire ou celui de zones ou compartiments de ceux-ci en ce qui concerne les maladies non exotiques des animaux aquatiques énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE (ci-après dénommées les «maladies répertoriées»);

Article 2

Définitions

Aux fins de la présente décision, on entend par:

Article 3

Exigences minimales relatives aux programmes d'éradication et de surveillance

Les États membres veillent à ce que les règles relatives aux programmes de surveillance et d'éradication, aux zones tampons, aux méthodes d'échantillonnage et de diagnostic énoncées à l'annexe I, ainsi qu'aux méthodes spécifiques et aux procédures détaillées énoncées à l'annexe II soient respectées en cas d'octroi, de retrait ou de rétablissement, pour une ou plusieurs des maladies répertoriées, du statut «indemne de maladie» pour un État membre ou une zone ou compartiment de celui-ci.

Article 4

Exigences minimales relatives aux méthodes et aux procédures spécifiques de diagnostic

Les États membres veillent à ce que les méthodes de lutte figurant à l'annexe I, ainsi que les méthodes spécifiques et procédures détaillées de diagnostic énoncées à l'annexe II soient respectées lors des examens de laboratoire réalisés en vue de confirmer ou d'exclure la présence d'une maladie répertoriée.

Article 5

Mesures minimales de lutte contre les maladies répertoriées et exigences minimales pour la levée des mesures de confinement dans des État membres, des zones ou des compartiments non déclarés indemnes de maladies répertoriées

Les États membres veillent à ce que les mesures minimales de lutte et les exigences minimales pour la levée des mesures de confinement énoncées à l'annexe I soient respectées lors de la mise en œuvre de mesures de lutte et de la levée des mesures de confinement à l'égard d'une ou plusieurs maladies répertoriées dans un État membre ou dans une zone ou un compartiment non déclarés indemnes de ces maladies.

Article 6

Abrogations

Les décisions 2001/183/CE, 2002/878/CE et 2003/466/CE sont abrogées.

Article 7

Date de mise en application

La présente décision est applicable à partir du 1er avril 2016.

Article 8

Destinataires

Les États membres sont destinataires de la présente décision.

(1) JO L 328 du 24.11.2006, p. 14.

(2) Décision 2001/183/CE de la Commission du 22 février 2001 fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de certaines maladies des poissons et abrogeant la décision 92/532/CEE (JO L 67 du 9.3.2001, p. 65).

(3) Décision 2003/466/CE de la Commission du 13 juin 2003 établissant les critères de zonage et les mesures de surveillance officielle à adopter après suspicion ou confirmation de la présence de l'anémie infectieuse du saumon (AIS) (JO L 156 du 25.6.2003, p. 61).

(4) Décision 2002/878/CE de la Commission du 6 novembre 2002 établissant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de deux maladies des mollusques, la bonamiose (Bonamia ostreae) et la marteiliose (Marteilia refringens) (JO L 305 du 7.11.2002, p. 57).

(14) Les échantillons doivent être prélevés et examinés au cours de deux périodes de tests d'un mois chaque année (au printemps et en automne), ou selon ce qui convient en fonction de considérations d'ordre pratique.

(12) Les échantillons doivent être prélevés et stockés puis examinés au cours de deux périodes de tests d'un mois chaque année (au printemps et en automne), ou selon ce qui convient en fonction de considérations d'ordre pratique.

la présence de la MPB doit être considérée comme confirmée lorsque la PCR en deux étapes suivie d'un séquençage, réalisée selon les méthodes et procédures détaillées indiquées à l'annexe II, partie 6, se révèle positive pour le VSPB et que des signes pathognomoniques de la MPB sont observés chez les hôtes sélectionnés.

Si la PCR en deux étapes donne un résultat positif, celui-ci doit être corroboré par le séquençage du produit d'amplification avant la mise en place des premières mesures de lutte prévues à l'article 28 de la directive 2006/88/CE, si possible, concrètement, par la mise en évidence, par examen histologique et microscopie électronique à transmission, de signes pathognomoniques de la MPB chez les hôtes sensibles sélectionnés.

la MPB n'ait pas été détectée au cours des deux années suivant l'exécution des mesures visées aux points a), b) et c), et que toute suspicion au cours de cette période ait été écartée conformément aux procédures établies au point II.3.

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la MPB et toutes les autres fermes aquacoles ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conformément au point a) situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des crustacés provenant d'États membres, de zones ou de compartiments ayant un statut sanitaire de catégorie I, II ou III en ce qui concerne la MPB;

Les exigences définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisfaites. Dans les cas où il n'est techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication du VSPB de l'environnement de la ferme aquacole;

Le statut «indemne de maladie» ne doit être maintenu que tant que tous les échantillons testés à l'aide des méthodes de diagnostic établies au point II.2 se révèlent négatifs pour la MPB et que toute suspicion de MPB est écartée conformément aux méthodes d'enquête officielle et de diagnostic établies au point II.3.

50 % de ces points de prélèvement doivent faire l'objet d'inspections et de prélèvements chaque année, par rotation. L'échantillonnage doit être réalisé conformément au tableau 6.B de la section II. Les échantillons doivent être sélectionnés, préparés et analysés conformément aux méthodes d'échantillonnage et de diagnostic décrites à la section II et les examens de laboratoire doivent avoir fourni des résultats négatifs en ce qui concerne l'agent de la MPB.

la ferme aquacole infectée par la MPB a été vidée de ses animaux, nettoyée, désinfectée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été observée;

Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la MPB ont été vidées de leurs animaux, nettoyées et désinfectées, puis soumises à une période de vide sanitaire conformément au point I.2.2.1. c);

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et toutes les autres fermes ayant fait l'objet d'un vide sanitaire qui se trouvent à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées:

L'autorité compétente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis soient vidées de leurs crustacés, nettoyées, désinfectées et qu'elles fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déterminée par l'autorité compétente sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas;

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la MPB doivent être vidées de leurs animaux, nettoyées et désinfectées et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines doit être observée. Lorsque la totalité des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été vidées de leurs crustacés, un vide sanitaire synchronisé d'au moins trois semaines doit être mis en place. Le présent paragraphe s'applique également aux nouvelles fermes aquacoles officiellement déclarées infectées pendant la mise en œuvre du programme d'éradication.

dans les aires marines: à une zone située autour du périmètre de protection et dont la zone d'excursion de marée chevauche celle du périmètre de protection, à une zone située autour du périmètre de protection et s'étendant sur un rayon de 10 kilomètres à partir du centre du périmètre de protection ou à une superficie équivalente déterminée selon les données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropriées ou

dans les aires marines et estuariennes: à une zone s'étendant sur un rayon d'au moins une excursion de marée et, en tout état de cause, d'au moins cinq kilomètres autour de la ferme aquacole officiellement déclarée infectée par la MPB, ou à une superficie équivalente déterminée selon les données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropriées; ou

La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, compte tenu des facteurs qui ont une incidence sur les risques de transmission de la MPB aux crustacés d'élevage et aux crustacés sauvages, à savoir: la mortalité, le taux de mortalité et la distribution de la mortalité des crustacés dans la ferme aquacole infectée par la MPB, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisines et la densité de ces dernières, les fermes aquacoles en contact, les espèces présentes dans les fermes aquacoles, les pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique.

les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 4, de la directive 2006/88/CE ont effectivement été appliquées et une zone de confinement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assortie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie à proximité de la ou des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par le VSPB.

elle a été vidée de ses crustacés, nettoyée, désinfectée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été observée;

si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance visé au point a), une infection par le VSPB est confirmée dans une ferme aquacole incluse dans ce programme de surveillance et que, par conséquent, cette ferme a vu son statut sanitaire de catégorie II lui être retiré, elle peut immédiatement retrouver ce statut sanitaire de catégorie II et poursuivre la mise en œuvre du programme de surveillance en vue de l'obtention du statut «indemne de maladie» sans mettre en œuvre le programme d'éradication décrit au point I.2.2 à condition de satisfaire aux conditions suivantes:

Un État membre, une zone ou un compartiment ayant un statut sanitaire de catégorie III en ce qui concerne la MPB conformément à l'annexe III, partie B, de la directive 2006/88/CE peut obtenir le statut sanitaire de catégorie I pour cette maladie répertoriée lorsque toutes les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de ladite directive dans cet État membre, cette zone ou ce compartiment remplissent les conditions fixées à l'annexe V de ladite directive, et que toutes ces fermes aquacoles et, pour autant que les dispositions de l'annexe V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de ladite directive le requièrent, tous les points de prélèvement dans les populations sauvages sélectionnées conformément audit point, ont fait l'objet du programme de surveillance de deux ans ci-après comprenant des inspections sanitaires et le prélèvement d'échantillons en vue d'essais.

Lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvages est requise conformément à l'annexe V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, le nombre et la répartition géographique des points de prélèvement doivent être déterminés de façon à obtenir une couverture raisonnable de l'État membre, de la zone ou du compartiment. Les points de prélèvement doivent aussi être représentatifs des divers écosystèmes abritant des populations sauvages sensibles, à savoir les eaux marines, les estuaires, les cours d'eau et les lacs.

I. Exigences relatives aux programmes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concerne la MPB ainsi que des mesures de confinement destinées à lutter contre l'infection par le virus du syndrome des points blancs (VSPB)

la présence de Bonamia ostreae doit être considérée comme confirmée lorsque l'examen histopathologique, les empreintes tissulaires ou l'hybridation in situ donnent un résultat positif associé à un résultat positif obtenu par la PCR complétée par un séquençage, conformément aux méthodes et procédures approuvées décrites à l'annexe II, partie 5;

aucune infection à Bonamia ostreae n'ait été confirmée au cours des deux années suivant l'exécution des mesures visées aux points a), b) et c), et que toute suspicion au cours de cette période ait été écartée conformément aux procédures établies au point II.3.

la totalité des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalité des autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis et ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conformément au point a) aient été repeuplées avec des mollusques provenant d'États membres, de zones ou de compartiments ayant un statut sanitaire de catégorie I, II ou III en ce qui concerne l'infection à Bonamia ostreae;

Les exigences définies au paragraphe I.2.2, points a), b) et c) soient satisfaites. Dans les cas où il n'est techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication de Bonamia ostreae de l'environnement de la ferme aquacole;

la totalité des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalité des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques ayant fait l'objet d'un vide sanitaire situés à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées avec des mollusques provenant d'États membres, de zones ou de compartiments jouissant d'un statut sanitaire de catégorie I en ce qui concerne l'infection à Bonamia ostreae. Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que toutes fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été vidées de leurs mollusques, nettoyées et désinfectées, puis soumises à une période de vide sanitaire conformément au point I.2.2 c);

L'autorité compétente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis soient vidés de leurs mollusques, nettoyés, désinfectés et qu'ils fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déterminée par l'autorité compétente sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas;

toutes les fermes aquacoles et tous les parcs à mollusques officiellement déclarés infectés par Bonamia ostreae doivent être vidés de leurs mollusques, soumis à un vide sanitaire et si possible nettoyés et désinfectés; la durée de la période de vide sanitaire doit être d'au moins six semaines.

la totalité des fermes aquacoles et des parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE situés à l'intérieur du périmètre de protection et qui ne sont pas officiellement déclarés infectés par Bonamia ostreae doit faire l'objet d'une enquête officielle comprenant au moins un prélèvement d'échantillons visant à tester 150 mollusques, réalisé après le début de la période de transmission de Bonamia ostreae. Lorsque la période de transmission n'est pas connue, l'échantillonnage doit commencer en hiver ou au début du printemps;

La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, compte tenu des facteurs qui ont une incidence sur les risques de propagation de cette maladie répertoriée, à savoir: le nombre, l'âge, le taux de mortalité et la distribution de la mortalité des mollusques dans la ferme aquacole ou le parc à mollusques infecté par Bonamia ostreae, y compris les mollusques sauvages, l'éloignement et la densité des fermes aquacoles ou parcs à mollusques voisins, y compris les mollusques sauvages, la proximité des établissements de transformation et des fermes aquacoles ou parcs à mollusques en contact, les espèces présentes dans les fermes aquacoles ou les parcs à mollusques, en particulier les espèces sensibles et les espèces vectrices, les pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles ou les parcs à mollusques contaminés et dans les fermes aquacoles ou parcs à mollusques voisins, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique.

les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 3, de la directive 2006/88/CE ont effectivement été appliquées et, en particulier, une zone de confinement telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assortie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alentours de la ou des fermes aquacoles ou du ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés par Bonamia ostreae.

les fermes aquacoles et les parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE doivent avoir fait l'objet d'inspections sanitaires et d'échantillonnages pendant une période minimale de deux années consécutives, comme indiqué dans le tableau 5.A de la présente partie;

aucune infection à Marteilia refringens n'ait été confirmée au cours des deux années suivant l'exécution des mesures visées aux points a), b) et c), et que toute suspicion au cours de cette période ait été écartée conformément aux procédures établies au point II.3.

la totalité des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalité des autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis et ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conformément au point a) aient été repeuplées avec des mollusques provenant d'États membres, de zones ou de compartiments ayant un statut sanitaire de catégorie I, II ou III en ce qui concerne l'infection à Marteilia refringens;

Les exigences définies au paragraphe I.2.2, points a), b) et c) soient satisfaites. Dans les cas où il n'est techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication de Marteilia refringens de l'environnement de la ferme aquacole;

Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que toutes fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été vidées de leurs mollusques, nettoyées et désinfectées, puis soumises à une période de vide sanitaire conformément au point I.2.2 c);

la totalité des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalité des autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques ayant fait l'objet d'un vide sanitaire situés à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées avec des mollusques provenant d'États membres, de zones ou de compartiments jouissant d'un statut sanitaire de catégorie I en ce qui concerne Marteilia refringens.

L'autorité compétente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis soient vidés de leurs mollusques, nettoyés, désinfectés et qu'ils fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déterminée par l'autorité compétente sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas;

quatorze mois dans le cas des fermes aquacoles et des parcs à mollusques ayant des liens illimités avec les eaux avoisinantes, à condition que les mollusques infectés des espèces sensibles et les mollusques des espèces sensibles ayant des liens épidémiologiques avec la ferme aquacole ou le parc à mollusques infectés n'aient pas été récoltés ou retirés avant la période de l'année où l'on sait que la prévalence de Marteilia refringens est maximale ou, si cette information n'est pas connue, lorsque les mollusques des espèces sensibles n'ont pas été récoltés ou éliminés avant la période où la température de l'eau dépasse 17 °C.

deux mois dans le cas des fermes aquacoles et des parcs à mollusques ayant des liens illimités avec les eaux avoisinantes, à condition que les mollusques infectés des espèces sensibles et les mollusques des espèces sensibles ayant des liens épidémiologiques avec la ferme aquacole ou le parc à mollusques infectés aient été récoltés ou retirés avant la période de l'année où l'on sait que la prévalence de Marteilia refringens est maximale ou, si cette information n'est pas connue, avant la période où la température de l'eau dépasse 17 °C;

deux mois dans le cas des fermes aquacoles et des parcs à mollusques ayant des liens limités avec les eaux avoisinantes telles que celles des écloseries et des nurseries;

toutes les fermes aquacoles et tous les parcs à mollusques officiellement déclarés infectés par Marteilia refringens sont vidés de leurs mollusques, font l'objet d'un vide sanitaire et sont si possible nettoyés et désinfectés.

l'ensemble des fermes aquacoles et des parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE situés à l'intérieur du périmètre de protection et qui ne sont pas officiellement déclarés infectés par Marteilia refringens doit faire l'objet d'une enquête officielle comprenant au moins un prélèvement d'échantillons visant à tester 150 mollusques, réalisé après le début de la période de transmission de Marteilia refringens. Lorsque la période de transmission n'est pas connue, l'échantillonnage doit commencer après que la température de l'eau a dépassé 17 °C;

La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, compte tenu des facteurs qui ont une incidence sur les risques de propagation de Marteilia refringens, à savoir: le nombre, l'âge, le taux de mortalité et la distribution de la mortalité des mollusques dans la ferme aquacole ou le parc à mollusques infecté par Marteilia refringens, y compris chez les mollusques sauvages, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles ou parcs à mollusques voisins et la densité de ceux-ci, y compris les mollusques sauvages, la proximité des établissements de transformation et des fermes aquacoles ou parcs à mollusques en contact, les espèces, en particulier les espèces sensibles et les espèces vectrices, présentes dans les fermes aquacoles ou les parcs à mollusques, les pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles et les parcs à mollusques contaminés et voisins; les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique.

les mesures prévues au chapitre V, section 3, de la directive 2006/88/CE ont effectivement été appliquées et, en particulier, une zone de confinement telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assortie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alentours de la ou des fermes aquacoles ou du ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés par Marteilia refringens.

I. Exigences relatives aux programmes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concerne l'infection à Marteilia refringens

détection du VAIS par RT-qPCR avec séquençage du gène HE pour vérifier les délétions dans la RHP, et

détection du VAIS par RT-qPCR avec séquençage du gène HE pour vérifier les délétions dans la RHP, et détection du VAIS dans des préparations tissulaires à l'aide d'anticorps spécifiques dirigés contre le VAIS (à savoir IHC sur coupes fixées ou test IFAT sur empreintes tissulaires)

La méthode de diagnostic à utiliser en vue de l'obtention ou du maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concerne l'AIS conformément aux points I.2 et I.3 est l'analyse par RT-qPCR suivie du séquençage des échantillons positifs conformément aux méthodes et procédures détaillées décrites à l'annexe II, partie 3.

immunohistochimie: rein médian et cœur, y compris les valves et le bulbe artériel;

aucune infection par des variants délétés dans la RHP du VAIS n'ait pas été confirmée au cours des deux années suivant l'exécution des mesures visées aux points a), b) et c), et que toute suspicion durant cette période ait été écartée conformément aux procédures établies au point II.3.

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et toutes les autres fermes aquacoles ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conformément au point a) qui sont situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compartiments ayant un statut sanitaire de catégorie I, II ou III en ce qui concerne l'AIS;

Les exigences définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisfaites. Dans les cas où il n'est techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication du VAIS de l'environnement de la ferme aquacole;

il a été vidé de ses poissons, nettoyé, désinfecté et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été observée;

Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été vidées de leurs poissons, nettoyées et désinfectées, puis soumises à une période de vide sanitaire conformément au point I.2.2.1 c);

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par des variants délétés dans la RHP du VAIS ou dans lesquelles la présence de l'AIS a été confirmée et toutes les autres fermes aquacoles ayant fait l'objet d'un vide sanitaire situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compartiments jouissant d'un statut sanitaire de catégorie I en ce qui concerne l'ISA.

L'autorité compétente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis soient vidées de leurs poissons, nettoyées, désinfectées et qu'elles fassent l'objet d'un vide sanitaire. Pour ces fermes, la durée de la période de vide sanitaire est déterminée par l'autorité compétente, sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas;

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par des variants délétés dans la RHP du VAIS ou dans lesquelles la présence de l'AIS a été confirmée doivent être vidées de leurs poissons, nettoyées et désinfectées et une période de vide sanitaire d'au moins trois mois doit être observée. Les périmètres de protection et de surveillance peuvent être levés lorsque toutes les fermes aquacoles situées à l'intérieur du périmètre de protection ont été vidées de leurs poissons, nettoyées et désinfectées et qu'une période de vide sanitaire synchronisé d'au moins six semaines a été respectée.

dans les zones côtières: à une zone située autour du périmètre de protection et dont la zone d'excursion de marée chevauche celle du périmètre de protection, à une zone située autour du périmètre de protection et s'étendant sur un rayon de 10 kilomètres à partir du centre du périmètre de protection ou à une superficie équivalente déterminée selon les données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropriées ou

dans les zones côtières: à une zone s'étendant sur un rayon d'au moins une excursion de marée et, en tout état de cause, d'au moins cinq kilomètres autour de la ferme aquacole officiellement déclarée infectée par l'AIS, ou à une superficie équivalente déterminée selon les données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropriées;

La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, compte tenu des facteurs qui ont une incidence sur les risques de transmission de l'AIS aux poissons d'élevage et aux poissons sauvages, à savoir: la mortalité, le taux de mortalité et la distribution de la mortalité des poissons dans la ferme aquacole infectée par des variants délétés dans la RHP du VAIS ou dans laquelle la présence de l'AIS a été confirmée, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisines et la densité de ces dernières, la proximité des abattoirs, les fermes aquacoles en contact, les espèces présentes dans les fermes aquacoles, les pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique.

les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 3, de la directive 2006/88/CE ont effectivement été appliquées et, en particulier, une zone de confinement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assortie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alentours de la ou des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par des variants délétés dans la RHP du VAIS, ou dans lesquelles la présence de l'AIS a été confirmée.

Un État membre, une zone ou un compartiment ayant un statut sanitaire de catégorie III tel que visé à l'annexe III, partie B, de la directive 2006/88/CE en ce qui concerne l'AIS peut obtenir le statut sanitaire de catégorie I pour cette maladie répertoriée lorsque toutes les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de ladite directive dans cet État membre, cette zone ou ce compartiment satisfont aux exigences définies à l'annexe V de ladite directive, et que toutes ces fermes aquacoles et, pour autant que les dispositions de l'annexe V, partie I, point 2, deuxième paragraphe de cette directive le requièrent, tous les points de prélèvement dans les populations sauvages sélectionnées conformément audit point, ont fait l'objet du programme de surveillance suivant:

Lorsque des fermes aquacoles doivent, plus d'une fois par an, faire l'objet d'inspections sanitaires et d'échantillonnages conformément aux dispositions de l'annexe V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, l'intervalle entre les inspections sanitaires ou entre chaque prélèvement d'échantillons doit être aussi long que possible.

I. Exigences relatives aux programmes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concerne l'AIS ainsi que des mesures de confinement destinées à lutter contre l'infection par des variants délétés dans la région hautement polymorphe (RHP) du virus de l'AIS (VAIS)

l'enquête officielle doit comprendre au moins une inspection sanitaire et un échantillonnage sur 10 poissons en cas de signes cliniques ou de signes post-mortem compatibles avec une infection par l'HVK, ou sur 30 poissons en l'absence de signes cliniques ou de signes post mortem. Les échantillons doivent être testés à l'aide de la méthode de diagnostic indiquée au point b) conformément aux méthodes et procédures de diagnostic détaillées figurant à l'annexe II, partie 2, point II;

Les tissus à examiner sont prélevés sur les branchies et les reins. Il est possible de regrouper des fragments d'organes provenant de deux poissons au maximum.

Les tissus à examiner sont prélevés sur les branchies et les reins. Il est possible de regrouper des fragments d'organes provenant de deux poissons au maximum.

II. Méthodes de diagnostic et d'échantillonnage pour la surveillance visant à l'obtention et au maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concerne l'HVCK

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et toutes les autres fermes aquacoles ayant été soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures conformément au point a) qui se trouvent à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compartiments ayant un statut sanitaire de catégorie I, II ou III en ce qui concerne l'HVCK;

Les exigences définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisfaites. Dans les cas où il n'est techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles concernées doivent faire l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication de l'HVK de l'environnement de la ferme aquacole;

50 % de ces points de prélèvement doivent faire l'objet d'inspections et de prélèvements chaque année, par rotation. L'échantillonnage doit être réalisé conformément au tableau 2.C de la section III. Les échantillons doivent être sélectionnés, préparés et examinés comme indiqué à la section II et les résultats des examens de laboratoire doivent être négatifs en ce qui concerne la présence de l'agent de l'HVCK.

il a été vidé de ses poissons, nettoyé, désinfecté et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été observée;

Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été vidées de leurs poissons, nettoyées et désinfectées, puis soumises à une période de vide sanitaire conformément au point I.2.2.1 c);

Toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par l'HVK et toutes les autres fermes aquacoles soumises à un vide sanitaire qui se trouvent à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées:

L'autorité compétente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis soient vidées de leurs poissons, nettoyées, désinfectées et qu'elles fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déterminée par l'autorité compétente, sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas.

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par l'HVK doivent être vidées de leurs poissons, nettoyées et désinfectées et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines doit être observée; lorsque toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées à l'intérieur d'un même périmètre de protection ont été vidées de leurs poissons, un vide sanitaire synchronisé d'au moins trois semaines doit être respecté. Le présent paragraphe s'applique également aux nouvelles fermes aquacoles officiellement déclarées infectées pendant la mise en œuvre du programme d'éradication.

un périmètre de protection doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole officiellement déclarée infectée par l'HVK et doit correspondre à la totalité du bassin hydrographique de ladite ferme aquacole; l'autorité compétente peut limiter l'extension du périmètre à certaines parties du bassin hydrographique à condition que cela ne remette pas en cause les moyens mis en œuvre pour empêcher la propagation de l'HVCK;

La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, compte tenu des facteurs qui ont une incidence sur les risques de propagation de l'HVCK aux poissons d'élevage et aux poissons sauvages, à savoir: la mortalité, le taux de mortalité et la distribution de la mortalité des poissons dans la ferme aquacole infectée par l'HVK; la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisines et la densité de ces dernières, la proximité des abattoirs, les fermes aquacoles en contact, les espèces présentes dans les fermes aquacoles, les pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique.

les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 4, de la directive 2006/88/CE ont effectivement été appliquées et une zone de confinement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assortie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alentours de la ou des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par l'HVK.

elle a été vidée de ses poissons, nettoyée, désinfectée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été observée;

si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance de quatre ans visé au point a), une infection par l'HVK est confirmée dans une ferme aquacole incluse dans ce programme de surveillance et que, par conséquent, cette ferme a vu son statut sanitaire de catégorie II lui être retiré, elle peut immédiatement retrouver ce statut sanitaire de catégorie II et poursuivre la mise en œuvre du programme de surveillance en vue de l'obtention du statut «indemne de maladie» sans mettre en œuvre le programme d'éradication décrit au point I.2.2, à condition de satisfaire aux conditions suivantes:

Un État membre, une zone ou un compartiment ayant un statut sanitaire de catégorie III en ce qui concerne l'HVCK peut obtenir un statut sanitaire de catégorie I lorsque toutes les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet État membre, cette zone ou ce compartiment respectent les conditions requises pour l'obtention du statut «indemne de maladie» qui sont définies à l'annexe V de ladite directive, et que toutes ces fermes aquacoles et, pour autant que les dispositions de la partie I, point 2, paragraphe 2, de ladite annexe le requièrent, tous les points de prélèvement dans les populations sauvages sélectionnées conformément à cette partie, ont fait l'objet de l'un des programmes de surveillance suivants:

Lorsque des fermes aquacoles ou des populations sauvages doivent, plus d'une fois par an, faire l'objet d'inspections sanitaires ou d'échantillonnages, l'intervalle entre les inspections sanitaires ou entre chaque prélèvement d'échantillons doit être aussi long que possible pendant la saison où la température de l'eau est susceptible d'atteindre les maxima annuels sans pour autant dépasser la limite de 28 °C.

prélever les échantillons au moment de la capture ou lors d'autres manipulations des poissons faisant partie des pratiques de gestion normales. Dans la mesure du possible, les échantillons doivent être prélevés entre 24 et 72 heures après ces pratiques de gestion afin d'augmenter les chances de détection de l'herpèsvirus koï.

Dans la mesure du possible, les poissons qui ont été maintenus longtemps à des températures propices au développement du virus, c'est-à-dire entre 15 et 26 °C pendant deux à trois semaines, doivent faire l'objet d'un échantillonnage. L'approche décrite ci-après est toutefois acceptable:

La surveillance ciblée doit reposer sur un suivi régulier des sites détenant des espèces sensibles. Les sites doivent être contrôlés lorsque la température de l'eau a atteint des niveaux propices au développement de la maladie (> 15 °C) et au plus tôt deux semaines après que ces températures ont été atteintes. Tous les poissons malades ou présentant un comportement anormal qui sont observés sur le site doivent faire l'objet d'un échantillonnage et être testés.

Lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvages est requise conformément à l'annexe V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, le nombre et la répartition géographique des points de prélèvement doivent être déterminés de façon à obtenir une couverture raisonnable de l'État membre, de la zone ou du compartiment. Les points de prélèvement doivent aussi être représentatifs des divers écosystèmes abritant les populations sauvages sensibles, à savoir les cours d'eau et les lacs.

I. Exigences relatives aux programmes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concerne l'HVCK ainsi que des mesures de confinement destinées à lutter contre l'infection par l'herpèsvirus koï (HVK)

la ferme aquacole suspecte doit faire l'objet d'au moins une inspection sanitaire et d'un échantillonnage portant sur dix poissons en cas de signes cliniques ou de signes post-mortem compatibles avec une infection par la SHV ou la NHI, ou par les deux, ou sur au moins 30 poissons en l'absence de signes cliniques ou de signes post mortem. Les échantillons doivent être testés à l'aide d'une ou de plusieurs des méthodes de diagnostic indiquées aux points i) et ii), conformément aux méthodes de diagnostic et procédures détaillées figurant à l'annexe II, partie 1, section II, à savoir:

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et toutes les autres fermes aquacoles ayant été soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures conformément au point a) à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compartiments ayant un statut sanitaire de catégorie I, II ou III en ce qui concerne la SHV ou la NHI, ou les deux à la fois;

les exigences définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisfaites. Dans les cas où il n'est techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles concernées doivent faire l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication du virus de la NHI ou du virus de la SHV, ou de ces deux agents, de l'environnement de la ferme aquacole;

la ferme aquacole dont l'infection par la SHV ou la NHI, ou par les deux, a été officiellement confirmée, doit avoir été vidée de ses poissons, nettoyée et désinfectée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines doit avoir été observée;

Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été évacuées, nettoyées et désinfectées, puis soumises à une période de vide sanitaire conformément au point I.2.2.1 c);

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la SHV ou la NHI, ou par ces deux maladies répertoriées, ainsi que toutes les autres fermes aquacoles soumises à un vide sanitaire situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis qui sont visées au point c), doivent être repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compartiments jouissant d'un statut sanitaire «indemne de maladie» (catégorie I), en ce qui concerne la SHV ou la NHI, ou les deux.

L'autorité compétente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis soient vidées de leurs poissons, nettoyées, désinfectées et qu'elles fassent l'objet d'un vide sanitaire. Pour ces fermes, la durée de la période de vide sanitaire est déterminée par l'autorité compétente, sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas;

toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la SHV ou la NHI, ou par les deux, doivent être vidées de leurs poissons, nettoyées et désinfectées et une période de vide sanitaire d'une durée minimale de six semaines doit être observée. Lorsque toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées à l'intérieur d'un même périmètre de protection ont été vidées de leurs poissons, un vide sanitaire synchronisé d'au moins trois semaines doit être respecté. Le présent paragraphe s'applique également aux nouvelles fermes aquacoles officiellement déclarées infectées pendant la mise en œuvre du programme d'éradication.

dans les zones côtières: à une zone située autour du périmètre de protection et dont la zone d'excursion de marée chevauche celle du périmètre de protection, à une zone située autour du périmètre de protection et s'étendant sur un rayon de 10 kilomètres à partir du centre du périmètre de protection ou à une superficie équivalente déterminée selon les données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropriées

dans les zones côtières: à une zone s'étendant sur un rayon d'au moins une excursion de marée et, en tout état de cause, d'au moins cinq kilomètres autour de la ferme aquacole officiellement déclarée infectée par la SHV ou la NHI, ou par les deux, ou à une superficie équivalente déterminée selon les données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropriées;

La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, compte tenu des facteurs qui ont une incidence sur les risques de propagation de la maladie répertoriée aux poissons d'élevage et aux poissons sauvages, à savoir la mortalité, le taux de mortalité et la distribution de la mortalité dans la ferme aquacole infectée par la SHV ou la NHI, ou par les deux à la fois, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisines et la densité de ces dernières, la proximité des abattoirs, les fermes aquacoles en contact, les espèces présentes dans les fermes aquacoles, les pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique.

les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 4, de la directive 2006/88/CE doivent avoir été effectivement appliquées et une zone de confinement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assortie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, doit avoir été établie aux alentours de la ou des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la SHV ou la NHI, ou par ces deux maladies répertoriées.

elle a été vidée de ses poissons, nettoyée, désinfectée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été observée;

si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance visé au point a), une infection par la SHV ou la NHI, ou par les deux à la fois, est confirmée dans une ferme aquacole incluse dans ce programme de surveillance et que, par conséquent, cette ferme a vu son statut sanitaire de catégorie II lui être retiré, elle peut immédiatement retrouver ce statut sanitaire de catégorie II et poursuivre la mise en œuvre du programme de surveillance en vue de l'obtention du statut «indemne de maladie» sans mettre en œuvre un programme d'éradication tel qu'établi au point I.2.2, à condition de satisfaire aux conditions suivantes:

Au cours de cette période de quatre ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échantillons à l'aide des méthodes de diagnostic spécifiées au point II.2 doivent s'être révélés négatifs pour la SHV ou la NHI, ou pour les deux, et toute suspicion de SHV ou de NHI, ou des deux maladies, doit avoir été écartée conformément aux méthodes d'échantillonnage et de diagnostic établies au point II.3;

Au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échantillons à l'aide des méthodes de diagnostic spécifiées au point II.2. doivent s'être révélés négatifs pour la SHV ou la NHI, ou pour les deux, et toute suspicion de SHV ou de NHI doit avoir été écartée conformément aux méthodes d'échantillonnage et de diagnostic établies au point II.3;

lorsque des fermes aquacoles ou des populations sauvages doivent, plus d'une fois par an, faire l'objet d'inspections sanitaires ou d'échantillonnages, l'intervalle entre les inspections sanitaires et entre chaque prélèvement d'échantillons doit être d'au moins quatre mois et doit être aussi long que possible compte tenu des conditions de température définies au point a);

I.1. Exigences générales relatives aux inspections sanitaires et à l'échantillonnage en ce qui concerne la SHV et la NHI:

I. Exigences relatives aux programmes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concerne la SHV et la NHI ainsi que des mesures de confinement destinées à lutter contre ces maladies répertoriées

SURVEILLANCE DE LA SEPTICÉMIE HÉMORRAGIQUE VIRALE (SHV) ET DE LA NÉCROSE HÉMATOPOÏÉTIQUE INFECTIEUSE (NHI) ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE CES MALADIES

Aux fins des annexes I et II, on entend par:

les méthodes d'échantillonnage et de diagnostic à utiliser pour les examens de laboratoire en cas de suspicion d'une ou plusieurs des maladies non exotiques répertoriées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE (ci-après les «maladies répertoriées») ou pour confirmer la présence de telles maladies, conformément à l'article 28, point a), et à l'article 57, point b), de ladite directive;

les exigences relatives aux programmes d'éradication et de surveillance prévus à l'article 44 de la directive 2006/88/CE, ainsi que les méthodes d'échantillonnage et de diagnostic à utiliser pour déclarer «indemnes de maladie» des États membres ou des zones ou compartiments de ceux-ci, conformément aux dispositions du chapitre VII de ladite directive;

ANNEXE II

MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIAGNOSTIC DÉTAILLÉES

I. Introduction

La présente annexe établit les procédures détaillées des méthodes de diagnostic à appliquer lors des examens de laboratoire prévus par les programmes d'éradication et de surveillance décrits à l'annexe I de la présente décision, et afin de confirmer ou d'écarter les suspicions des maladies non exotiques ci-après qui sont énumérées à l'annexe IV, partie II de la directive 2006/88/CE (ci-après les «maladies répertoriées»), conformément à l'article 57, point b), de cette directive:

1. la septicémie hémorragique virale (SHV) Partie 1 2. la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) Partie 1 3. l'herpèsvirose de la carpe koï (HVCK) Partie 2 4. l'anémie infectieuse du saumon (AIS) Partie 3 5. l'infection à Marteilia refringens Partie 4 6. l'infection à Bonamia ostreae Partie 5 7. la maladie des points blancs (MPB) Partie 6

II. Définitions

Aux fins de la présente annexe, on entend par «milieu de transport», un milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau, 200 UI de pénicilline, 200 μg de streptomycine et 200 μg de kanamycine par millilitre ou d'autres antibiotiques d'efficacité avérée.

PARTIE 1

MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIAGNOSTIC DÉTAILLÉES POUR LA SURVEILLANCE ET LA CONFIRMATION DE LA NHI ET DE LA SHV

I. Méthodes et procédures de diagnostic pour la surveillance de la SHV et de la NHI

Lorsque des prélèvements et des examens de laboratoire sont réalisés en vue de l'obtention ou du maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concerne la NHI ou la SHV visé à l'annexe I, partie 1, section I, à l'aide des méthodes de diagnostic indiquées dans la partie 1, points II.1 et II.2, de ladite annexe, les méthodes et procédures de diagnostic détaillées décrites aux points I.1 à I.6 doivent être appliquées.

I.1. Préparation et expédition des échantillons de poissons

I.1.1. Tissus destinés à un examen virologique sur culture cellulaire

Avant d'être expédiés ou transférés vers le laboratoire, les morceaux d'organes à examiner doivent être prélevés sur le poisson à l'aide d'instruments de dissection stériles et placés dans des tubes en plastique stériles contenant le milieu de transport.

La quantité de tissus de poisson nécessaire pour un examen virologique sur culture cellulaire et par RT-qPCR dépend de la taille des poissons. On prélèvera donc l'alevin entier (si longueur du corps < 4 cm), les viscères, y compris les reins (si 4 cm < longueur du corps < 6 cm) ou, dans le cas des poissons de plus grande taille, les reins, la rate, le cœur et/ou l'encéphale, ainsi que le liquide ovarien des reproductrices au moment du frai.

Du liquide ovarien ou séminal ou des morceaux d'organes provenant de dix poissons au maximum peuvent être regroupés dans un tube stérile contenant au moins 4 ml de milieu de transport; ils constituent un échantillon global. Le poids minimal de tissus contenus dans chaque échantillon doit être de 0,5 gramme (g).

L'examen virologique sur culture cellulaire doit commencer dès que possible et au plus tard 48 heures après le prélèvement des échantillons. Dans des cas exceptionnels, l'examen virologique peut commencer au plus tard 72 heures après la collecte du matériel à examiner à condition que celui-ci soit conservé dans le milieu de transport et que les conditions de température requises pendant le transport aient pu être respectées.

I.1.2. Échantillons destinés à l'analyse par amplification en chaîne par polymérase en présence de transcriptase inverse (RT-PCR ou RT-qPCR)

Les échantillons doivent être prélevés sur le poisson conformément à la procédure décrite au point I.1.1 à l'aide d'un instrument stérile, puis transférés dans des tubes en plastique stériles contenant le milieu de transport. Les tissus de 10 poissons peuvent être rassemblés dans un tube pour constituer un échantillon global. Toutefois, si la quantité d'inoculum est faible, on regroupera les tissus provenant de cinq poissons au maximum. Il est aussi possible de regrouper les échantillons dans des réactifs de stabilisation de l'ARN, à raison de 0,2 g de tissu/ml de réactif selon les recommandations des fabricants, mais chaque poisson devra être traité séparément et ne devra pas être regroupé avec d'autres dans les échantillons en raison de la faible quantité de matériel à utiliser pour l'extraction.

Des poissons entiers peuvent aussi être envoyés au laboratoire.

I.2. Expédition des échantillons de poissons

Les tubes contenant les tissus des poissons dans le milieu de transport qui sont destinés à la culture cellulaire ou à l'analyse par RT-qPCR doivent être placés dans des conteneurs isolés, tels que des boîtes en polystyrène à parois épaisses, avec une quantité suffisante de glace ou d'un autre agent réfrigérant ayant le même effet afin de garantir la réfrigération des échantillons pendant le transport vers le laboratoire. Il y a toutefois lieu d'éviter la congélation des échantillons. La température d'un échantillon pendant son transport ne doit jamais dépasser 10 °C et le récipient de transport doit encore contenir de la glace lors de sa réception, ou un ou plusieurs blocs réfrigérants doivent encore être partiellement ou totalement congelés.

Des poissons entiers peuvent être envoyés au laboratoire si les conditions de température pendant le transport visées au premier paragraphe peuvent être respectées. Le cas échéant, les poissons entiers, éventuellement enveloppés dans du papier absorbant, doivent être placés dans un sac en plastique pour l'expédition. Des poissons vivants peuvent également être expédiés.

I.3. Collecte de matériel de diagnostic supplémentaire

Si le laboratoire de diagnostic y consent, d'autres tissus de poissons peuvent aussi être collectés et préparés en vue d'examens supplémentaires.

I.4. Préparation des échantillons destinés à la culture cellulaire et à l'analyse par RT-qPCR

I.4.1. Congélation dans des cas exceptionnels

En cas de difficultés pratiques empêchant le traitement des échantillons dans les 48 heures suivant la collecte des tissus de poisson, il est possible de congeler les spécimens de tissus dans le milieu de transport à – 20 °C ou à une température inférieure et de procéder à l'examen virologique dans les 14 jours suivants. Toutefois, les tissus ne doivent être congelés et décongelés qu'une seule fois avant examen. Les motifs précis de chaque congélation d'échantillons de tissus de poisson doivent être consignés.

I.4.2. Homogénéisation des organes

Au laboratoire, les tissus de poisson contenus dans les tubes doivent être complètement homogénéisés (à l'aide d'un malaxeur d'échantillons, d'un mélangeur ou d'un ensemble pilon-mortier avec sable stérile) et mis ensuite en suspension dans le milieu de transport d'origine.

Si un échantillon est constitué d'un poisson entier de longueur inférieure à 4 cm, celui-ci doit être réduit en petits fragments à l'aide de ciseaux stériles ou d'un scalpel, après élimination de la partie du corps située à l'arrière de l'anus. Si un échantillon est constitué d'un poisson entier de longueur comprise entre 4 et 6 cm, il y a lieu de prélever les viscères, y compris les reins. Si un échantillon est constitué d'un poisson entier de longueur supérieure à 6 cm, les spécimens de tissus doivent être prélevés comme décrit au point I.1. Les spécimens de tissus doivent être réduits en petits fragments à l'aide de ciseaux stériles ou d'un scalpel et homogénéisés comme décrit au premier paragraphe, puis mis en suspension dans le milieu de transport.

Le rapport final entre les tissus et le milieu de transport doit être ajusté à 1:10 au laboratoire.

I.4.3. Centrifugation de l'homogénat

L'homogénat doit être centrifugé entre 2 000 et 4 000 g dans une centrifugeuse réfrigérée à une température comprise entre 2 et 5 °C pendant 15 minutes et le surnageant doit être recueilli; celui-ci peut ensuite être traité avec des antibiotiques, soit pendant 4 heures à 15 °C, soit pendant une nuit entre 4 et 8 °C. Si l'échantillon a été expédié dans un milieu de transport, le traitement du surnageant par des antibiotiques n'est pas nécessaire.

En cas de difficultés pratiques, telles qu'une panne d'incubateur ou des problèmes de cultures cellulaires, empêchant l'inoculation des cellules dans les 48 heures qui suivent la collecte des échantillons de tissus, le surnageant peut être congelé à – 80 °C et l'examen virologique réalisé dans les quatorze jours.

Si le surnageant recueilli est conservé à – 80 °C au cours des 48 heures suivant l'échantillonnage, il ne peut être réutilisé qu'une seule fois pour l'examen virologique.

Avant d'inoculer les cellules, le surnageant doit être mélangé à parts égales avec un lot de sérums anti-sérotypes indigènes du virus de la nécrose pancréatique infectieuse (NPI), dilués de façon appropriée, et doit être incubé ainsi pendant au minimum une heure à 15 °C ou pendant au maximum 18 heures à 4 °C. Le titre de l'antisérum doit être d'au moins 1/2 000 dans un test de neutralisation sur plaque à 50 %.

Le traitement de tous les inoculums par le sérum anti-virus de la NPI vise à empêcher l'effet cytopathogène (ECP) dû au virus de la NPI de se manifester dans les cultures cellulaires inoculées. Cela permet de réduire la durée des examens virologiques ainsi que le nombre de cas où l'apparition d'un ECP devrait être considérée comme une manifestation possible du virus de la SHV ou de la NHI.

Lorsque les échantillons proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de la NPI, le traitement des inoculums par le sérum antivirus de la NPI peut être omis.

I.4.4. Préparation des échantillons pour les programmes de surveillance faisant appel à la RT-PCR et à la RT-qPCR

Si les échantillons ont été placés dans le milieu de transport, la procédure décrite aux points I.4.2 et I.4.3 doit être suivie. Après centrifugation, le surnageant doit être recueilli et l'ARN extrait. Si aucun autre examen ne doit être réalisé directement après la centrifugation, les échantillons doivent être immédiatement congelés à – 20 °C ou à une température inférieure.

Pour l'analyse des tissus de poisson conservés dans du réactif de stabilisation de l'ARN, d'autres opérations doivent être réalisées dans les délais précisés ci-après sur les échantillons stockés à différentes températures:

échantillons stockés à 37 °C: dans un délai d'un jour;

échantillons stockés à 25 °C: dans un délai d'une semaine

échantillons stockés à 4 °C: dans un délai d'un mois;

échantillons stockés à – 20 °C: délai indéterminé.

Les échantillons globaux conservés dans le réactif de stabilisation de l'ARN doivent être traités de la même manière que les échantillons simples dans du réactif de stabilisation de l'ARN. Dans le cas d'échantillons globaux dans du réactif de stabilisation de l'ARN, le volume de l'échantillon ne doit dépasser le volume recommandé par le fabricant pour l'extraction de l'ARN à l'aide de kits tels que RNeasy Minikit (Qiagen) ou similaires. En cas de regroupement d'échantillons plus grands, les kits ou les méthodes d'extraction doivent être adaptés en conséquence.

Les échantillons recueillis dans des réactifs de stabilisation de l'ARN ne doivent pas être utilisés pour les cultures cellulaires.

I.4.5. Regroupement d'échantillons pour la RT-qPCR

Étant donné que les protocoles de RT-qPCR sont d'une sensibilité identique ou supérieure à celle des méthodes de culture cellulaire, il est dans certains cas acceptable d'utiliser pour la PCR le surnageant des tissus homogénéisés d'organes prélevés sur 10 poissons au maximum et regroupés dans le milieu de culture cellulaire. Toutefois, en raison de la quantité nettement réduite d'inoculum utilisée pour la PCR par rapport à la culture cellulaire, tous les tissus de poissons doivent être soigneusement homogénéisés avant le regroupement du matériel pour l'extraction.

Le même principe s'applique lorsque les échantillons sont recueillis dans des réactifs de stabilisation de l'ARN. Toutefois, dans ce cas, il est souvent difficile de regrouper dans un même tube du matériel pouvant provenir de 10 poissons, et il faut donc réduire le nombre de poissons par échantillon global et le ramener à un chiffre compris entre 2 et 5.

I.5. Examen virologique sur culture cellulaire

I.5.1. Cultures cellulaires et milieux

Des cellules de la lignée cellulaire 2 d'alevins de crapet arlequin (Bluegill fry) (BF-2) ou de la lignée cellulaire 2 de gonades de truite arc-en-ciel (Rainbow trout gonad) (RTG-2) et des cellules de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) ou de poisson tête de boule (Fathead minnow) (FHM) sont cultivées à une température comprise entre 20 et 30 °C dans un milieu approprié, en l'occurrence le milieu essentiel minimal de Eagle (MEM) ou une variante de celui-ci, additionné de sérum fœtal bovin à 10 % et d'antibiotiques à une concentration standard.

Lorsque les cellules sont cultivées dans des flacons fermés, le milieu doit être tamponné à l'aide de bicarbonate. Le milieu utilisé pour la culture cellulaire en unités ouvertes peut être tamponné à l'aide de tris(hydroxyméthyl)aminométhane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) et de bicarbonate de sodium (6 mM). Le pH doit être égal à 7,6 ± 0,2.

Pour l'inoculation des cultures par du matériel tissulaire de poisson, il convient d'utiliser des cultures cellulaires jeunes, âgées normalement d'un jour et monocouches si possible; néanmoins, les cultures d'âge compris entre 4 et 48 heures sont acceptables. Les cellules doivent être en phase de croissance active au moment de l'inoculation.

I.5.2. Inoculation des cultures cellulaires

Une suspension d'organes traitée aux antibiotiques doit être inoculée aux cultures cellulaires en deux dilutions distinctes, à savoir la dilution initiale et, en outre, une dilution au 1:10 de celle-ci (soit des dilutions finales respectives des tissus dans le milieu de culture de 1:100 et 1:1 000), de manière à éviter les interférences homologues. Deux lignées cellulaires au moins doivent être inoculées comme indiqué au point I.5.1. Le rapport entre la quantité d'inoculum et le volume du milieu de culture cellulaire doit être de 1:10 environ.

Pour chaque dilution et chaque lignée cellulaire, il y a lieu d'utiliser une surface de culture minimale d'environ 2 cm2, ce qui correspond à un puits sur une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Des plaques de culture cellulaire doivent être utilisées dans la mesure du possible.

I.5.3. Incubation des cultures cellulaires

Les cultures cellulaires inoculées doivent être incubées à 15 °C pendant sept à dix jours. Si la couleur du milieu de culture vire du rouge au jaune, indiquant une acidification du milieu, il y a lieu d'ajuster le pH à l'aide d'une solution stérile de bicarbonate ou à l'aide de substances équivalentes pour garantir la sensibilité des cellules à l'infection virale.

Tous les six mois au moins, ou lorsqu'on suspecte une diminution de la sensibilité cellulaire, il y a lieu de procéder au titrage des préparations mères congelées de VSHV et VNHI, afin de vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection. La procédure décrite à la section III doit être appliquée, si possible.

I.5.4. Microscopie

Les cultures cellulaires inoculées doivent être examinées régulièrement (au moins trois fois par semaine) au microscope à un grossissement compris entre × 40 et × 150 pour rechercher un ECP. Si un ECP net est observé, les procédures d'identification du virus décrites au point I.6 doivent être mises en œuvre immédiatement.

I.5.5. Repiquage

Si aucun ECP ne s'est manifesté après une première incubation de sept à dix jours, il convient de procéder à un repiquage sur des cultures cellulaires fraîches en utilisant une surface de culture identique à celle de la culture primaire.

Des parties aliquotes du milieu (surnageant) de toutes les cultures ou de tous les puits constituant la culture primaire sont regroupées en pools par lignée cellulaire sept à dix jours après l'inoculation. Les pools non dilués et dilués au 1:10 (ce qui donne respectivement des dilutions finales du surnageant au 1:10 et au 1:100) sont ensuite inoculés chacun à des cultures cellulaires homologues, comme décrit au point I.5.2. Une autre possibilité consiste à inoculer directement des parties aliquotes de 10 % du milieu constituant la culture primaire dans un puits contenant une culture cellulaire fraîche (repiquage de puits à puits). L'inoculation peut être précédée d'une préincubation des dilutions avec le sérum antivirus de la NPI à la dilution appropriée, comme décrit au point I.4.3.

Les cultures inoculées doivent ensuite être incubées à 15 °C pendant sept à dix jours, puis examinées comme indiqué au point I.5.4.

Si un ECP toxique se manifeste au cours des trois premiers jours d'incubation, un repiquage doit être effectué à ce stade, mais les cellules doivent alors être incubées pendant sept jours puis repiquées à nouveau et soumises à une nouvelle période d'incubation de sept jours. Lorsqu'un ECP toxique se manifeste après trois jours, les cellules doivent être repiquées une fois puis incubées jusqu'à ce que se soient écoulés au total quatorze jours à partir de l'inoculation primaire. Aucun signe de toxicité ne doit se manifester au cours des sept derniers jours d'incubation.

Si une contamination bactérienne se produit malgré le traitement antibiotique, le repiquage doit être précédé d'une centrifugation à 2 000-4 000 g pendant 15 à 30 minutes à une température comprise entre 2 et 5 °C, ou d'une filtration du surnageant à travers un filtre de 0,45 μm, ou bien des deux à la fois (membrane à faible capacité de liaison des protéines). En outre, le repiquage doit être réalisé suivant les mêmes procédures que celles décrites pour l'apparition d'un ECP toxique au quatrième alinéa du présent point.

Si aucun ECP ne se manifeste, le test est réputé négatif.

I.6. Identification du virus

Si un ECP a été observé dans une culture cellulaire, le milieu (surnageant) doit être recueilli et examiné par une ou plusieurs des techniques suivantes: méthode immunoenzymatique (ELISA), test d'immunofluorescence (IF), neutralisation, RT-PCR ou RT-qPCR. Si ces méthodes n'ont pas permis d'identifier le virus de façon certaine dans un délai d'une semaine, le surnageant doit être envoyé au laboratoire de référence national ou au laboratoire de référence de l'Union pour les maladies des poissons visé à l'annexe VI de la directive 2006/88/CE en vue d'une identification immédiate.

I.6.1. ELISA

Un test ELISA en double sandwich doit être réalisé pour identifier l'isolat de virus. Les plaques de micropuits sont enduites à raison de 50 μl/puits (0,9 pg) d'une solution d'immunoglobulines (Ig) de sérums anti-NHI ou anti-SHV de lapin purifiées à la protéine A, de qualité reconnue, diluées dans un tampon de carbonate (pH 9,6) contenant 15 mM d'azoture de sodium, puis incubées à 4 °C pour une durée comprise entre 18 heures et 2 semaines.

Sur une plaque de dilution, chaque échantillon contenant 1 % de Triton X-100 et les témoins positifs doit être dilué à l'aide de la solution tampon [à savoir une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-T-BSA, 1 % BSA] dans un rapport de dilution de 4 (1:4, 1:16, 1:64). Les plaques ELISA doivent être lavées dans du PBS contenant 0,05 % de Tween 20 (PBS-T) et 50 μl de chaque dilution doivent être transférés de la plaque de dilution vers la plaque ELISA lavée et enduite.

Les plaques ELISA doivent ensuite être incubées pendant 30 minutes à 37 °C, avant d'être lavées et incubées 30 minutes à 37 °C en présence d'anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques (à savoir IP5B11 pour l'identification du virus de la SHV et HYB-136-3 pour celle du virus de la NHI). 50 μl d'anticorps anti-souris de lapin conjugués à de la peroxydase de raifort (HRP) dilués au 1:1 000 dans du PBS-T-BSA doivent être transférés sur la plaque ELISA.

Enfin, après nouveau lavage, les réactions sont déclenchées par addition de 50 μl d'orthophénylènediamine (OPD) dans chaque puits. Les plaques ELISA doivent être incubées pendant 20 minutes à température ambiante dans l'obscurité, et la réaction doit être arrêtée par addition de 100 μl de H2SO4 0,5 M par puits.

L'absorbance doit être contrôlée à la longueur d'onde de 492 puis de 620 nm dans un lecteur ELISA. Les échantillons sont déclarés positifs ou négatifs après comparaison des résultats aux valeurs d'absorbance des témoins positifs et négatifs. En règle générale, les échantillons présentant une absorbance totale (A) < 0,5 pour du matériel non dilué sont considérés comme étant négatifs; les échantillons dont les valeurs A sont comprises entre 0,5 et 1,0 sont considérés comme suspects et les échantillons avec valeurs A > 1,0 sont considérés comme positifs.

D'autres versions de la technique ELISA d'une efficacité similaire avérée peuvent être utilisées en lieu et place de celles mentionnées au présent point.

I.6.2. Immunofluorescence (IF)

L'identification des agents pathogènes répertoriés que sont les virus de la SHV et de la NHI doit être réalisée en infectant des cellules dans des plaques 96 puits «Black» ou des plaques 24 puits classiques, ou sur lamelles dans des plaques 24 puits. Si l'identification du virus de la NHI ou de la SHV, ou des deux, s'effectue par infection de cellules sur des lamelles, le protocole suivant doit être appliqué:

a) les lamelles doivent être ensemencées lorsque les cellules sont entre 60 et 90 % de confluence après 24 heures de culture. On utilisera de préférence des cellules EPC en raison de leur forte adhérence aux surfaces de verre, mais d'autres lignées cellulaires, telles que BF-2, RTG-2 ou FHM, peuvent également être utilisées. On inoculera 150 μl de surnageant de culture cellulaire à deux dilutions différentes (1:10 et 1:1 000) en deux exemplaires à des cultures monocouches âgées d'un jour qui sont ensuite incubées à 15 °C pendant 24 heures;

b) le milieu de culture cellulaire est ensuite éliminé, et les monocouches de cellules infectées sont fixées avec 0,5 ml d'une solution aqueuse d'acétone glacée (80 % v/v). La fixation doit avoir lieu sous hotte pendant 15 minutes à la température ambiante, puis la solution d'acétone doit être éliminée et les lamelles séchées à l'air pendant au moins 30 minutes. À ce stade, les plaques doivent être traitées immédiatement ou bien stockées à une température de – 20 °C en vue d'une utilisation ultérieure;

c) les anticorps monoclonaux spécifiques (à savoir IP5B11 pour le virus de la SHV et HYB-136-3 pour le virus de la NHI) doivent être dilués dans du PBST 0,01 M, à pH 7,2, à la dilution recommandée par le fournisseur des AcM; ils doivent ensuite être ajoutés aux cultures monocouches fixées, à raison de 50 à 100 μl/puits, et les plaques doivent ensuite être incubées pendant une heure à 37 °C dans une étuve humide;

d) les lamelles doivent être rincées en douceur trois fois dans du PBS contenant 0,05 % de Tween 20 (PBS-T), et le tampon doit être totalement éliminé après le dernier rinçage. Les cellules doivent ensuite être incubées pendant une heure à 37 °C avec des anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou du tétraméthylrhodamine-5-(et 6-)isothiocyanate (TRITC), utilisés comme anticorps primaires, dilués conformément aux instructions du fournisseur, avant nouveau rinçage au PBS-T puis séchage. Les cultures colorées doivent être montées sur lames de verre à l'aide d'une solution saline de glycérol puis examinées en lumière ultraviolette incidente. Utiliser des oculaires 10 × ou 12 × et des lentilles d'objectif × 25 ou × 40, dont les ouvertures numériques sont respectivement > 0,7 et > 1,3.

Il est aussi possible de recourir à d'autres techniques d'IF (pour ce qui est des cultures cellulaires, de la fixation et des anticorps de référence) d'efficacité équivalente avérée.

I.6.3. Neutralisation

Les cellules présentes dans le surnageant recueilli doivent être éliminées par centrifugation (entre 2 000 et 4 000 g) ou par filtration sur membrane (0,45 μm) à l'aide d'une membrane à faible capacité de liaison des protéines, puis le surnageant doit être dilué au 1:100 et au 1:10 000 dans le milieu de culture.

Des parties aliquotes d'au moins deux dilutions du surnageant doivent être mélangées et incubées séparément pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs suivants:

a) du sérum contenant l'anticorps spécifique de groupe contre le virus de la SHV, à une dilution de 1:50 (v:v),

b) du sérum contenant l'anticorps spécifique de groupe contre le virus de la NHI, à une dilution de 1:50 (v:v),

c) un lot d'antisérums anti-sérotypes indigènes du virus de la NPI, à une dilution de 1:50 (v:v),

d) le milieu seul (témoin positif).

Au moins deux cultures cellulaires doivent être inoculées à l'aide de 50 μl du mélange surnageant-sérum de chaque virus, puis incubées à 15 °C. L'apparition de l'ECP doit être vérifiée comme indiqué au point I.5.4.

Les souches et les isolats du virus de la SHV qui ne réagissent pas dans les tests de neutralisation doivent être identifiés par les techniques IF ou ELISA.

D'autres tests de neutralisation présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisés.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Préparation de l'ARN viral

Toutes les manipulations sur l'ARN doivent être réalisées sur de la glace, et des gants doivent être utilisés.

L'ARN doit être extrait par la méthode phénol/chloroforme ou par chromatographie d'affinité sur colonnes, selon les instructions du fabricant. Il est possible d'utiliser les kits d'extraction de l'ARN disponibles dans le commerce, qui permettent d'obtenir un ARN de qualité utilisable dans les protocoles de RT-PCR détaillés ci-après.

L'ARN doit être remis en suspension dans de l'eau distillée exempte d'ARNase (c.-à-d. de l'eau traitée avec du pyrocarbonate de diéthyle à 0,1 %) ou un tampon d'élution approprié.

I.6.4.2. RT-PCR

Les amorces suivantes doivent être utilisées pour la détection du VNHI:

amorce sens 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

amorce antisens 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Les cycles suivants doivent être utilisés (RT-PCR en une seule étape): 1 cycle: 50 °C pendant 30 minutes; 1 cycle: 95 °C pendant 2 minutes; 30 cycles: 95 °C pendant 30 secondes, 50 °C pendant 30 secondes, 72 °C pendant 60 secondes; 1 cycle: 72 °C pendant 7 minutes et trempage à 4 °C.

Les amorces suivantes doivent être utilisées pour la détection du VSHV:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Les cycles suivants doivent être utilisés (RT-PCR en une seule étape): 50 °C pendant 30 minutes, 95 °C pendant 15 minutes, 35 cycles de 94 °C pendant 30 secondes, 55 °C pendant 30 secondes et 68 °C pendant 60 secondes. La réaction doit être ensuite maintenue à une température de 68 °C pendant 7 minutes.

La quantité et la spécificité des réactions de RT-PCR doivent être évaluées par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 % à l'aide de bromure d'éthidium, et les produits des réactions doivent être observés en lumière UV. Un amplicon de PCR de 693 paires de bases (pb) peut être observé pour le VNHI. Pour le VSHV, la taille de l'amplicon peut atteindre 505 pb.

Les résultats de la PCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à-dire qu'une optimisation des protocoles thermiques pourrait s'avérer nécessaire en fonction du thermocycleur utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hybridation des amorces ou d'une contamination au laboratoire. Afin de dissiper tout doute, il convient de prévoir des témoins positifs et négatifs et des amplicons de séquences appropriés. En ce qui concerne les amorces du VSHV, l'utilisation de cellules BF-2 nécessite une attention particulière, car les amorces peuvent réagir avec l'ADN/l'ARN de la lignée cellulaire et produire des faux-positifs de même taille. Si le test est réalisé sur du surnageant provenant de cellules BF-2, tous les fragments amplifiés par PCR doivent être séquencés.

I.6.4.3. RT-qPCR pour le VSHV

Pour le VSHV, l'amplification doit être réalisée à l'aide de la sonde et des amorces suivantes:

amorce sens: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

amorce antisens: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

et sonde: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR en une étape:

À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus sur la plaque. Succession de cycles: 50 °C pendant 30 minutes, 95 °C pendant 15 minutes, 40 cycles de 94 °C pendant 15 secondes, 60 °C pendant 40 secondes et 72 °C pendant 20 secondes, à adapter si nécessaire. D'autres versions de RT-PCR ou de RT-qPCR présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisées.

I.6.4.4. RT-qPCR pour le VNHI

Pour le VNHI, l'amplification doit être réalisée à l'aide de la sonde et des amorces suivantes:

amorce sens: 5′-AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

amorce antisens: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′;

et sonde: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

RT-qPCR en deux étapes:

L'analyse reposant sur une amplification en deux étapes, des précautions doivent être prises lors de la manutention des tubes entre les réactions, afin d'éviter toute contamination.

Succession de cycles (après l'étape de la transcription inverse): 50 °C pendant 2 minutes, 95 °C pendant 10 minutes, puis 40 cycles de 95 °C pendant 15 secondes et 60 °C pendant 1 minute, à adapter si nécessaire.

D'autres versions de RT-PCR ou de RT-qPCR présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisées.

II. Méthodes et procédures de diagnostic détaillées pour écarter une suspicion de SHV ou de NHI ou des deux maladies, ou pour confirmer la présence d'une de ces maladies ou des deux

Lorsqu'un examen de laboratoire est requis pour confirmer ou exclure la présence de la NHI ou de la SHV, ou de ces deux maladies à la fois, conformément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, à l'aide des méthodes de diagnostic établies à l'annexe I, partie 1, point II.3, les méthodes et procédures de diagnostic détaillées suivantes doivent être appliquées:

a) isolement classique du virus suivi d'une identification de celui-ci par séroneutralisation ou par technique immunochimique ou moléculaire;

b) détection du virus par RT-PCR ou RT-qPCR;

c) autres techniques de diagnostic, telles que IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1. Isolement classique du virus suivi de son identification

II.1.1. Sélection des échantillons

Au moins dix poissons présentant des signes typiques de NHI ou de SHV doivent être sélectionnés pour un examen.

II.1.2. Préparation et expédition des échantillons de poissons

La préparation et l'expédition aux fins de l'isolement classique du virus doivent être effectuées selon les méthodes et procédures indiquées au point I.2.

II.1.3. Collecte de matériel de diagnostic supplémentaire

La collecte de matériel supplémentaire aux fins de l'isolement classique du virus doit être réalisée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.3.

II.1.4. Préparation des échantillons en vue de l'examen de cultures cellulaires

La préparation des échantillons en vue de l'examen de cultures cellulaires aux fins de l'isolement classique du virus doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.4.

II.1.5. Examen virologique sur culture cellulaire

L'examen virologique aux fins de l'isolement classique du virus doit être effectué selon les méthodes et procédures indiquées au point I.5.

II.1.6. Identification du virus

L'identification du virus aux fins de son isolement classique doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.6.

II.2. Détection du virus par RT-qPCR

II.2.1. Sélection des échantillons

La sélection des échantillons aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.1.2.

II.2.2. Préparation et expédition des échantillons de poisson

La préparation et l'expédition des échantillons aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doivent être réalisées selon les méthodes et procédures indiquées au point I.2.

II.2.3. Collecte de matériel de diagnostic supplémentaire

La collecte de matériel de diagnostic supplémentaire aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.3.

II.2.4. Préparation des échantillons pour la RT-qPCR

La préparation des échantillons aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doit être réalisée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR

La détection du virus par RT-qPCR doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées aux points I.6.4.1, I.6.4.3 et I.6.4.4.

II.3. Autres techniques de diagnostic

Le surnageant préparé comme indiqué au point I.4.3 peut être soumis à un test ELISA, à un test d'immunofluorescence indirecte (IFAT) ou à une analyse par RT-PCR conformément aux instructions figurant respectivement aux points I.6.1, I.6.2 ou I.6.4. Les tissus peuvent être soumis à d'autres techniques de diagnostic telles que l'IFAT sur coupes congelées ou l'analyse immunohistochimique sur tissus fixés au formol. Ces techniques rapides doivent être complétées par un examen virologique conformément au point II a) ou au point II b), dans les 48 heures suivant l'échantillonnage:

a) si un résultat négatif a été obtenu ou

b) si un résultat positif a été obtenu avec un matériel représentant le premier cas de NHI ou SHV.

III. Titrage destiné à vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection

Lors du titrage destiné à vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection visé au point I.5.3, les procédures décrites ci-après doivent être respectées.

Il convient d'utiliser au moins deux isolats de VSHV et un isolat de VNHI. Ces isolats doivent être représentatifs des principaux groupes de virus dans l'Union européenne, à savoir, en ce qui concerne le VSHV, un isolat pathogène issu de truite arc-en-ciel évoluant en eau douce et un isolat pathogène de turbot évoluant en eau de mer et, en ce qui concerne le VNHI, une souche pathogène de truite arc-en-ciel provenant de l'Union européenne. Il convient d'utiliser des isolats bien définis provenant des États membres. Des lots de virus ayant subi un petit nombre de passages sont propagés, dans des flacons de culture cellulaire, sur des cellules BF-2 ou RTG-2 dans le cas du VSHV, et sur des cellules EPC ou FHM dans le cas du VNHI. Il convient d'utiliser un milieu de culture contenant au moins 10 % de sérum. Pour l'inoculation, la multiplicité d'infection doit être faible (< 1).

Lorsque l'ECP est total, le virus est récolté par centrifugation du surnageant de la culture cellulaire à 2 000 g pendant quinze minutes, stérilisé et filtré à travers une membrane de 0,45 μm, puis réparti dans des cryotubes étiquetés. Le virus doit être conservé à – 80 °C.

Une semaine après la congélation, trois fioles de chaque virus sont décongelées sous eau froide et titrées sur leurs lignées cellulaires respectives. Chaque isolat de virus doit être décongelé et titré tous les six mois au moins, ou dès que l'on suspecte une diminution de la sensibilité d'une lignée cellulaire.

Les procédures de titrage doivent être décrites en détail et la même procédure doit être appliquée à chaque fois.

Le titrage par dilution limite doit comprendre au moins six réplicats de chaque série de dilutions. Les titres doivent être comparés à ceux obtenus antérieurement. Si le titre d'un des trois isolats viraux baisse d'un facteur 100 ou plus par rapport au titre initial, la lignée cellulaire ne doit plus être utilisée à des fins de surveillance.

Si différentes lignées cellulaires sont conservées au laboratoire, chaque lignée doit être examinée séparément.

Des registres sont conservés pendant dix ans au moins.

PARTIE 2

MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIAGNOSTIC DÉTAILLÉES POUR LA SURVEILLANCE ET LA CONFIRMATION DE L'HERPÈSVIROSE DE LA CARPE KOÏ (HVCK)

I. Méthodes et procédures de diagnostic détaillées pour écarter une suspicion d'HVCK ou confirmer la présence de cette maladie

Lorsqu'un examen de laboratoire est requis pour confirmer la présence de l'HVCK ou pour écarter une suspicion de cette maladie, conformément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, à l'aide des méthodes de diagnostic établies à l'annexe I, partie 2, section III, les méthodes et procédures de diagnostic détaillées indiquées aux points I.1 à I.2 de la présente partie doivent être appliquées.

I.1. Préparation des échantillons de poissons

À des fins de diagnostic, il est possible d'utiliser des poissons (expédiés vivants ou morts et emballés séparément dans des conteneurs aseptiques hermétiques) ou bien des organes ou des morceaux d'organes congelés conservés dans de l'éthanol de concentration comprise entre 80 % et la concentration de l'éthanol absolu, ou dans un milieu de transport viral (en vue d'un traitement dans les 48 heures suivant le prélèvement) pour procéder aux essais par des méthodes fondées sur la PCR classique ou la qPCR.

Pour la détection de l'HVK, les branchies et les reins doivent être prélevés; en outre, la rate, l'encéphale et les intestins peuvent être inclus dans un échantillon supplémentaire distinct. En cas d'infection aiguë, il est possible de regrouper des tissus provenant de cinq poissons au maximum.

De surcroît, des échantillons non létaux tels que du sang, des frottis et des biopsies de branchies et des prélèvements de mucus peuvent être utilisés dans certains cas (c'est-à-dire que des poissons de grande valeur peuvent être utilisés lorsque l'on suspecte la présence de l'HVK).

I.1.1. Extraction de l'ADN

L'ADN doit être extrait conformément aux procédures standard.

Il est possible d'utiliser les kits d'extraction de l'ADN disponibles dans le commerce, qui permettent d'obtenir un ADN de qualité utilisable dans les protocoles de PCR décrits au point I.2.

I.2. Détection et identification de l'agent infectieux par des méthodes basées sur l'amplification en chaîne par polymérase (PCR)

I.2.1. qPCR pour la détection de l'HVK

Pour la détection de l'HVK par qPCR, le protocole suivant doit être appliqué:

amorce sens (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;

amorce antisens (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′

et sonde (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Succession de cycles: un cycle de 95 °C pendant 15 minutes, suivi de 40 cycles de 94 °C pendant 15 secondes et 60 °C pendant 60 secondes. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus sur la plaque. Cependant, d'autres versions de qPCR présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisées.

I.2.2. PCR classique pour la détection de l'HVK

Le protocole décrit au présent point, qui cible le gène codant pour la thymine kinase (TK) de l'HVK, doit être utilisé. Toutefois, d'autres protocoles de PCR dont la sensibilité et la spécificité sont, de toute évidence, similaires à celles du protocole décrit peuvent être utilisés à la place de ce dernier.

Amorce sens (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

amorce antisens (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Succession de cycles: un cycle de 95 °C pendant 5 minutes, suivi de 35 cycles de 95 °C pendant 30 secondes, 52 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant une minute et d'un cycle de 72 °C pendant 10 minutes. La taille du produit doit être de 409 bp.

Les résultats de la PCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à-dire qu'une optimisation des protocoles thermiques pourrait s'avérer nécessaire en fonction du thermocycleur utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hybridation des amorces ou d'une contamination. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus sur la plaque. Cependant, d'autres versions de qPCR présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisées.

La première détection du virus dans une zone doit être confirmée par séquençage ou par envoi d'échantillons à un laboratoire de référence national ou au laboratoire de référence de l'Union pour les maladies des poissons visé à l'annexe VI de la directive 2006/88/CE en vue d'une identification immédiate.

II. Méthodes et procédures de diagnostic détaillées pour la surveillance de l'HVCK

Lorsque des prélèvements et des examens de laboratoire sont réalisés en vue de l'obtention ou du maintien d'un statut sanitaire donné en ce qui concerne l'HVCK comme indiqué à l'annexe I, partie 2, section I, à l'aide des méthodes de diagnostic décrites dans la partie 2, sections II ou III, de ladite annexe, les méthodes et procédures de diagnostic figurant aux points II.1 et II.2 de la présente partie doivent être appliquées.

II.1. Préparation des échantillons de poisson

Dans la mesure du possible, les poissons qui ont été maintenus longtemps à des températures propices au développement du virus (c'est-à-dire entre 15 et 26 °C pendant deux à trois semaines) doivent faire l'objet d'un échantillonnage. Si possible, les échantillons doivent être prélevés au minimum 24 heures et au maximum 72 heures après des pratiques de gestion susceptibles de réactiver le virus dans les poissons vecteurs, telles que la capture en filet ou le transport, afin d'augmenter les chances de détection de l'HVK.

Aux fins de la surveillance de l'HVCK, les poissons peuvent être expédiés vivants ou morts et emballés séparément dans des conteneurs aseptiques hermétiques; sinon, il est aussi possible d'utiliser des organes ou des morceaux d'organes congelés conservés dans de l'alcool de concentration comprise entre 80 % et 100 % ou dans un milieu de transport viral (en vue d'un traitement dans les 48 heures suivant le prélèvement) pour des tests par des méthodes fondées sur la PCR. Pour la surveillance de l'HVCK, les branchies et les reins doivent être prélevés.

Le regroupement de tissus de plusieurs poissons doit être évité dans la mesure du possible. Si ce regroupement est nécessaire, il ne portera que sur deux poissons au maximum. Les échantillons de plus grande taille doivent être homogénéisés au moyen d'un ensemble mortier-pilon ou d'un malaxeur, et des sous-échantillons devront être prélevés avant la clarification en vue de l'extraction de l'ADN. Une autre solution consiste à prélever des sous-échantillons de chaque tissu présent dans l'échantillon et à les placer dans des tubes de lyse.

II.1.1. Extraction de l'ADN

L'ADN doit être extrait conformément aux procédures standard. Il est possible d'utiliser les kits d'extraction de l'ADN disponibles dans le commerce, qui permettent d'obtenir un ADN de qualité utilisable dans les protocoles de PCR décrits au point II.2.

Le rapport acceptable entre les tissus et le milieu est de 1:9 p/v. Les essais doivent porter sur 20 à 25 mg de tissus.

II.2. Surveillance de l'HVCK par méthodes fondées sur la PCR

Pour la surveillance de l'HVCK, il y a lieu de recourir à la qPCR. Si des échantillons positifs apparaissent dans une zone qui n'a pas été préalablement confirmée positive, les résultats de l'essai doivent être confirmés:

a) par séquençage d'un produit de PCR ou de PCR nichée («nested PCR») obtenu à partir des échantillons. La séquence consensus obtenue doit coïncider (à 98 % au moins) avec les séquences de référence;

b) ou par envoi des échantillons à un laboratoire national de référence.

II.2.1. qPCR pour la détection de l'HVK

Le protocole de qPCR décrit ci-dessous doit être appliqué:

amorce sens (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;

amorce antisens (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′

et sonde (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Succession de cycles: un cycle de 95 °C pendant 15 minutes, suivi de 50 cycles de 94 °C pendant 15 secondes et 60 °C pendant 60 secondes.

Les résultats de la qPCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à-dire qu'une optimisation des protocoles thermiques pourrait s'