RÈGLEMENT (CE) N° 1459/98 DE LA COMMISSION du 8 juillet 1998 établissant une méthode de référence pour la détermination de la vanilline dans le beurre concentré, dans le beurre et dans la crème

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu le règlement (CEE) n° 804/68 du Conseil du 27 juin 1968 portant organisation commune des marchés dans le secteur du lait et des produits laitiers (1), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 1587/96 (2), et notamment son article 6, paragraphe 6, et son article 12, paragraphe 3,

considérant que le règlement (CE) n° 2571/97 de la Commission du 15 décembre 1997 relatif à la vente à prix réduit de beurre et à l'octroi d'une aide à la crème, au beurre et au beurre concentré destinés à la fabrication de produits de pâtisserie, de glaces alimentaires et autres produits alimentaires (3) prévoit, dans certaines circonstances, le traçage de la crème, du beurre et du beurre concentré pour garantir une utilisation finale correcte de ces produits;

considérant que, compte tenu de l'importance du traçage pour le bon fonctionnement du régime et afin de garantir une égalité de traitement entre opérateurs qui y participent, il convient d'établir des méthodes communes de détermination des traceurs visés dans le règlement (CE) n° 2571/97;

considérant qu'il est difficile d'établir de telles méthodes de référence pour tous les traceurs simultanément; que l'établissement d'une méthode de référence permettant la détermination de la vanilline dans le beurre concentré, dans le beurre ou dans la crème constitue un nouveau pas dans cette direction;

considérant que les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité de gestion du lait et des produits laitiers,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

La méthode d'analyse précisée en annexe s'applique comme méthode de référence pour la détermination de la vanilline dans le beurre concentré, dans le beurre ou dans la crème visés au règlement (CE) n° 2571/97.

Le beurre concentré, le beurre ou la crème ont été tracés conformément à l'article 6 du règlement (CE) n° 2571/97 si les résultats obtenus correspondent aux spécifications du point 8 de l'annexe.

Article 2

Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Il est applicable à partir du 1er septembre 1998.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 8 juillet 1998.

Par la Commission

Franz FISCHLER

Membre de la Commission

(1) JO L 148 du 28. 6. 1968, p. 13.

(2) JO L 206 du 16. 8. 1996, p. 21.

(3) JO L 350 du 20. 12. 1997, p. 3.

ANNEXE

Détermination de la teneur en vanilline dans le beurre concentré, dans le beurre ou dans la crème à l'aide de la chromatographie liquide à haute performance

1. Objet et champ d'application

La méthode décrit un mode opératoire permettant la détermination quantitative de vanilline dans le beurre, le beurre concentré ou dans la crème.

Elle est applicable aux échantillons reçus dans le cadre du règlement (CE) n° 2571/97.

2. Principe

Extraction d'une quantité connue d'échantillon à l'aide d'un mélange d'isopropanol/éthanol/acétonitrile (1:1:2). Précipitation de la plus grande partie de la matière grasse par réfrigération (température comprise entre -15 et -20 °C), suivie par une centrifugation.

Après dilution avec de l'eau, détermination de la teneur en vanilline par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

3. Appareillage

Matériel courant de laboratoire, et notamment les éléments suivants:

3.1. congélateur, d'une amplitude de température comprise entre -15 et -20 °C;

3.2. seringues, jetables, d'une capacité de 2 ml;

3.3. microfiltres à membranes (diamètre des pores: 0,45 ìm), résistant à une solution contenant 5 % de solution d'extraction (4.4);

3.4. système de chromatographie liquide composé d'une pompe (flux de 1,0 ml/min), d'un injecteur (injection de 20 ìl, automatique ou manuelle), d'un détecteur d'UV (fonctionnant à 306 nm, 0,01 AU pleine échelle), d'un enregistreur ou d'un intégrateur ainsi que d'un four thermostatique à colonne fonctionnant à 25 °C;

3.5. colonne analytique (250 mm × 4,6 mm ID), garnie avec la phase LiChrospher RP 18 (Merck, 5 ìm) ou équivalent;

3.6. précolonne (environ 20 mm × 3 mm ID) garnie à sec avec la phase Perisorb RP 18 (30 à 40 ìm) ou équivalent.

4. Réactifs

Tous les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique reconnue.

4.1. Isopropanol

4.2. Éthanol 96 % (v/v)

4.3. Acétonitrile

4.4. Solution d'extraction

Mélanger de l'isopropanol (4.1), de l'éthanol (4.2) et de l'acétonitrile (4.3) dans le rapport de 1:1:2 (V/V).

4.5. Vanilline (4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde)

4.5.1. Solution mère de vanilline (=500 ìg/ml)

Peser à 0,1 mg près environ 50 mg (mg CM) de vanilline (4.5) dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 25 ml de solution d'extraction (4.4) et compléter avec de l'eau.

4.5.2. Solution étalon de vanilline (=10 ìg/ml)

À l'aide d'une pipette, introduire 5 ml de solution mère de vanilline (4.5.1) dans une fiole jaugée de 250 ml et compléter avec de l'eau.

4.6. Méthanol, qualité CLHP

4.7. Acide acétique glacial

4.8. Eau, qualité CLHP

4.9. Phase mobile CLHP

Mélanger 300 ml de méthanol (4.6) à environ 500 ml d'eau (4.8) et à 20 ml d'acide acétique (4.7) dans une fiole jaugée de 1 000 ml et compléter en volume avec de l'eau (4.8). Filtrer à travers un filtre (0,45 ìm).

5. Mode opératoire

5.1. Préparation de l'échantillon pour essai

5.1.1. Beurre

Chauffer l'échantillon jusqu'à ce qu'il commence à fondre. Éviter toute surchauffe locale au-dessus de 40 °C. Lorsque l'échantillon devient suffisamment plastique, l'homogénéiser en l'agitant. Remuer le beurre pendant 15 s avant de prendre un échantillon. Introduire dans une fiole jaugée de 100 ml environ 5 g (g SM) de beurre et le peser à 1 mg près.

5.1.2. Beurre concentré

Immédiatement avant l'échantillonnage, placer dans un four à 40-50 °C le récipient contenant le beurre concentré jusqu'à ce qu'il fonde complètement. Mélanger l'échantillon en le faisant tourner ou en le remuant; éviter la formation de bulles d'air lors d'une opération trop vigoureuse. Introduire dans une fiole jaugée de 100 ml environ 4 g (g SM) de beurre et le peser à 1 mg près.

5.1.3. Crème

Chauffer l'échantillon dans un bain-marie ou une étuve à une température de 35 à 40 °C. Répartir la graisse de manière homogène en le faisant tourner et, si nécessaire, en le remuant. Refroidir rapidement l'échantillon (20 ± 2 °C). L'échantillon doit avoir un aspect homogène, sinon recommencer l'opération. Introduire dans une fiole jaugée de 100 ml environ 10 g (g SM) de beurre et le peser à 1 mg près.

5.2. Préparation de la solution d'essai

Ajouter environ 75 ml de solution d'extraction (4.4) à la prise d'essai (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), remuer ou secouer vigoureusement pendant environ 15 min et compléter avec la solution d'extraction (4.4). Transférer environ 10 ml de cet extrait dans un tube à essai pourvu d'un bouchon. Placer le tube à essai dans le congélateur (3.1) et le laisser reposer environ 30 min. Centrifuger l'extrait froid pendant 5 min à environ 2 000 rpm et décanter immédiatement. Laisser la solution décantée se refroidir à la température ambiante. Introduire à la pipette 5 ml de la solution décantée dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter avec de l'eau. Filtrer une partie aliquote à l'aide d'un microfiltre à membrane (3.3). Le filtrat est prêt pour la détermination par CLHP.

5.3. Calibrage

Introduire à la pipette 5 ml de la solution étalon de vanilline (4.5.2) dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 5 ml de solution d'extraction (4.4) et compléter avec de l'eau jusqu'à la marque. Cette solution contient 0,5 ìg/ml de vanilline.

5.4. Détermination par CLHP

Laisser le système chromatographique se stabiliser pendant environ 30 min. Injecter la solution étalon (5.3). Répéter cette opération jusqu'à ce que la différence de l'aire des pics ou la hauteur des pics entre deux injections successives soit inférieure à 2 %. Dans les conditions décrites, le temps de rétention de la vanilline est d'environ 9 min. Analyser la solution étalon (5.3) en double en injectant 20 ìl. Injecter 20 ìl des solutions d'essai (5.2). Déterminer la superficie ou la hauteur du pic de vanilline obtenu. Recommencer en double l'injection de solution étalon (5.3) après 10 injections d'échantillons pour essais (5.2).

6. Calcul des résultats

Calculer la superficie (ou la hauteur) moyenne (AC) des pics de vanilline correspondant aux injections en double encadrant chaque lot de solutions d'essai (4 surfaces ou hauteurs).

Calculer le facteur de réponse (R):

R = >NUM>AC/

>DEN>CM

où CM est la masse de vanilline en mg (4.5.1).

La teneur (mg/kg) en vanilline (C) de l'échantillon d'essai est donnée par la formule suivante:

C = >NUM>AS × 20 × 0,96

>DEN>SM × R

où:

AS = superficie du pic de vanilline de l'échantillon d'essai,

SM = masse de l'échantillon d'essai en g (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3),

20 = facteur qui prend en compte les dilutions de l'étalon et de l'échantillon d'essai,

0,96 = facteur de correction pour la teneur en matière grasse lors de la première dilution de l'échantillon d'essai.

Note:

On peut utiliser les hauteurs de pics au lieu de la surface des pics (voir point 8.3).

7. Précision de la méthode

7.1. Répétabilité (r)

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées dans l'intervalle de temps le plus bref possible par un seul opérateur utilisant le même appareillage sur du matériel d'essai identique ne doit pas dépasser 16 mg/kg.

7.2. Reproductibilité (R)

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par des opérateurs de différents laboratoires, utilisant des appareillages différents sur du matériel d'essai identique, ne peut dépasser 27 mg/kg.

8. Limites de tolérance

8.1. Trois échantillons doivent être prélevés sur le produit tracé afin de vérifier l'homogénéité.

8.2. Traceur obtenu soit à partir de vanille soit à partir de vanilline synthétique.

8.2.1. Le taux d'incorporation de 4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde est de 250 g/t.

8.2.2. Si l'on prend en considération une différence critique d'un niveau de probabilité de 95 % (CrD95), la moyenne des analyses effectuées en simple pour vérifier l'homogénéité ne doit pas être inférieure à 236,0 mg/kg.

8.2.3. En plus du critère indiqué au point 8.2.2, il y lieu d'utiliser le résultat le plus faible donné par l'analyse du produit pour vérifier l'homogénéité de la répartition du traceur. À cet effet, on effectue une comparaison avec les limites suivantes:

- 221,5 mg/kg (95 % du taux d'incorporation minimal, la CrD95 d'un seul échantillon prise en considération),

- 159,0 mg/kg (70 % du taux d'incorporation minimal, la CrD95 d'un seul échantillon prise en considération).

C'est la concentration du traceur dans l'échantillon donnant les résultats les plus faibles qui est utilisée en association avec une interpolation entre 221,5 et 159,0 mg/kg.

8.3. Traceur obtenu exclusivement à partir de gousses de vanille ou d'extraits intégraux de ces dernières.

8.3.1. Le taux d'incorporation de 4-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde est de 100 g/t.

8.3.2. Si l'on prend en considération une différence critique d'un niveau de probabilité de 95 % (CrD95), la moyenne des analyses effectuées en simple pour vérifier l'homogénéité ne peut être inférieure à 86,0 mg/kg.

8.3.3. En plus du critère indiqué au point 8.3.2, on utilise pour vérifier l'homogénéité de la répartition du traceur le résultat le plus faible tiré de l'analyse du produit. À cet effet, on effectue une comparaison avec les limites suivantes:

- 79,0 mg/kg (95 % du taux d'incorporation minimal, la CrD95 d'un seul échantillon prise en considération),

- 54,0 mg/kg (70 % du taux d'incorporation minimal, la CrD95 d'un seul échantillon prise en considération).

C'est la concentration du traceur dans l'échantillon qui donne le plus faible résultat qui est utilisé en association avec une interpolation entre 79,0 et 54,0 mg/kg.

9. Notes

9.1. La répétabilité r est la valeur en dessous de laquelle la différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus avec la même méthode sur du matériel d'essai identique dans les mêmes conditions (même matériel, même laboratoire et dans un bref intervalle de temps) peut - selon toute vraisemblance - se situer dans une probabilité précise; en l'absence d'autres indications, cette probabilité est de 95 %.

9.2. La reproductibilité R est la valeur en dessous de laquelle la différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus avec la même méthode sur du matériel d'essai identique dans des conditions différentes (opérateurs différents, matériel différent, laboratoires différents et/ou délai différent) peut être escomptée se situer dans une probabilité précise; en l'absence d'autres indications, cette probabilité est de 95 %.

9.3. La récupération de la vanilline ajoutée à un niveau de 250 mg/kg de butteroil varie de 97,0 à 103,8. La teneur moyenne qui a été constatée était de 99,9 % avec un écart type de 2,7 %.

9.4. La solution étalon contient 5 % de solution d'extraction pour compenser l'élargissement du pic provoqué par la présence de 5 % de solution d'extraction des échantillons d'essai. Cela permet une quantification par hauteur de pic.

9.5. L'analyse se fonde sur une ligne d'étalonnage linéaire (intercept: zéro).

En utilisant des dilutions appropriées de la solution étalon (4.5.2), on vérifie la linéarité la première fois que l'analyse est effectuée et ensuite à intervalles réguliers ainsi qu'après la modification ou la rénovation de l'équipement CLHP.