«ANNEXE XVIII

DÉTERMINATION DE LA DIFFÉRENCE ENTRE LA COMPOSITION RÉELLE ET LA COMPOSITION THÉORIQUE DES TRIGLYCÉRIDES À ECN 42

1. CHAMP D’APPLICATION

Détermination de la différence absolue entre les valeurs expérimentales des triglycérides (TG) à nombre équivalent d’atomes de carbone égal à 42 (ECN 42CLHP) obtenues par détermination dans l’huile par chromatographie liquide haute performance (CLHP) et la valeur théorique des TG à nombre équivalent d’atomes de carbone égal à 42 (ECN 42théorique) calculée d’après la composition en acides gras.

2. DOMAINE D’APPLICATION

La méthode s’applique aux huiles d’olive. Elle vise à détecter la présence de faibles quantités d’huiles de graines (riches en acide linoléique) dans chaque catégorie d’huile d’olive.

3. PRINCIPE

Dans le cas des huiles d’olive pures, la composition des triglycérides à ECN 42 déterminée par CLHP est plus ou moins équivalente à la composition théorique des triglycérides à ECN 42 (calculée à partir de la composition en acides gras déterminée par chromatographie en phase gazeuse). Une différence supérieure aux valeurs adoptées pour chaque catégorie d’huile indique que l’huile contient des huiles de graines.

4. MÉTHODE

La méthode permettant de calculer la composition théorique des triglycérides à ECN 42 ainsi que la différence par rapport aux données CLHP consiste essentiellement en la coordination des résultats d’analyse obtenus par d’autres méthodes. On distingue trois phases: la détermination de la composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse (CPG) sur colonne capillaire, le calcul de la composition théorique des triglycérides à ECN 42 et la détermination des triglycérides à ECN 42 par CLHP.

4.1. Appareillage

4.1.1. Ballons à fond rond de 250 et 500 ml.

4.1.2. Béchers de 100 ml.

4.1.3. Colonne de chromatographie en verre (diamètre intérieur: 21 mm; longueur: 450 mm) avec robinet et cône normalisé (femelle) au sommet.

4.1.4. Ampoules à décanter de 250 ml avec cône normalisé (mâle) à la base, pouvant s’adapter au sommet de la colonne.

4.1.5. Baguette en verre de 600 mm de longueur.

4.1.6. Entonnoir en verre de 80 mm de diamètre.

4.1.7. Fioles jaugées de 50 ml

4.1.8. Fioles jaugées de 20 ml

4.1.9. Évaporateur rotatif.

4.1.10. Chromatographe en phase liquide à haute performance, équipé d’un réglage thermostatique de la température de la colonne.

4.1.11. Vannes d’injection pour 10 μl.

4.1.12. Détecteur: réfractomètre différentiel. La sensibilité pleine échelle doit atteindre au moins 10–4 unités d’indice de réfraction.

4.1.13. Colonne: tube en acier inoxydable de 250 mm de longueur et de 4,5 mm de diamètre intérieur, rempli de particules de silice de 5 μm de diamètre contenant 22 à 23 % de carbone sous forme d’octadécylsilane.

4.1.14. Logiciel de traitement des données.

4.1.15. Flacons d’environ 2 ml, avec bouchon à vis et septa en téflon.

4.2. Réactifs

Les réactifs doivent être de pureté analytique. Les solvants d’élution doivent être dégazés et peuvent être recyclés plusieurs fois sans que cela ait une incidence sur les séparations.

4.2.1. éther de pétrole 40-60 °C pour chromatographie ou hexane.

4.2.2. Éther éthylique, exempt de peroxydes, fraîchement distillé.

4.2.3. Solvant d’élution pour la purification de l’huile par chromatographie sur colonne: mélange d’éther de pétrole/éther éthylique dans les proportions 87/13 (v/v).

4.2.4. Gel de silice, granulométrie 70-230, type Merck 7734, à teneur en eau normalisée de 5 % (m/m).

4.2.5. Laine de verre.

4.2.6. Acétone pour CLHP.

4.2.7. Acétonitrile ou propionitrile pour CLHP.

4.2.8. Solvant d’élution pour CLHP: acétonitrile + acétone (proportions à ajuster pour obtenir la séparation souhaitée; commencer avec le mélange 50:50) ou propionitrile.

4.2.9. Solvant de solubilisation: acétone.

4.2.10. Triglycérides de référence: soit des triglycérides que l’on trouve dans le commerce (tripalmitine, trioléine, etc.); dans ce cas, les temps de rétention sont reportés sur un diagramme en fonction du nombre équivalent d’atomes de carbone; soit des chromatogrammes de référence obtenus pour de l’huile de soja, pour un mélange 30:70 d’huile de soja et d’huile d’olive, et pour de l’huile d’olive pure (voir notes 1 et 2 et figures 1 à 4).

4.2.11. Colonne d’extraction en phase solide avec phase de silice 1 g, 6 ml.

4.3. Préparation des échantillons

Étant donné qu’un certain nombre de substances peuvent interférer et donner lieu à des résultats faux positifs, l’échantillon doit toujours être purifié selon la méthode IUPAC 2.507 utilisée pour la détermination des composés polaires dans les graisses de friture.

4.3.1. Préparation de la colonne de chromatographie

Remplir la colonne (4.1.3) avec 30 ml environ de solvant d’élution (4.2.3); introduire ensuite un tampon de laine de verre (4.2.5) dans la colonne et l’enfoncer jusqu’au fond de la colonne au moyen de la baguette en verre (4.1.5).

Préparer dans un bécher de 100 ml une suspension avec 25 g de gel de silice (4.2.4) dans 80 ml de mélange d’élution (4.2.3); la transférer ensuite dans la colonne au moyen d’un entonnoir en verre (4.1.6).

Afin de s’assurer que la totalité du gel de silice a été transférée dans la colonne, laver le bécher avec le mélange d’élution et transférer également le liquide de lavage dans la colonne.

Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler jusqu’à ce que son niveau se situe à environ 1 cm au-dessus du gel de silice.

4.3.2. Chromatographie sur colonne

Peser, avec un degré de précision de 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g d’huile, préalablement filtrée, homogénéisée et, si nécessaire, déshydratée dans une fiole jaugée de 50 ml (4.1.7).

Diluer dans environ 20 ml de solvant d’élution (4.2.3); si nécessaire, chauffer légèrement pour faciliter la dissolution. Refroidir à température ambiante et porter au volume avec du solvant d’élution.

À l’aide d’une pipette jaugée, introduire 20 ml de solution dans la colonne préparée conformément au point 4.3.1, ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler jusqu’au niveau de la couche de gel de silice.

Éluer ensuite avec 150 ml de solvant d’élution (4.2.3), en réglant le débit du solvant à 2 ml par minute environ (de telle sorte que 150 ml s’écoulent dans la colonne en 60-70 minutes).

Recueillir l’éluat dans un ballon à fond rond de 250 ml (4.1.1) préalablement taré et placé dans un four et le peser avec précision. Éliminer le solvant sous pression réduite dans un évaporateur rotatif (4.1.9) et peser le résidu qui sera utilisé pour préparer la solution pour l’analyse CLHP et pour la préparation des esters méthyliques.

Après passage dans la colonne, l’échantillon doit être récupéré à 90 % au moins pour les catégories d’huile d’olive vierge extra, vierge et raffinée normalement, et à 80 % au moins pour les huiles lampantes et les huiles de grignons.

4.3.3. Purification par extraction en phase solide

Activer la colonne d’extraction en phase solide sur silice en passant 6 ml d’hexane (4.2.3) sous vide, en évitant la dessiccation.

Peser 0,12 g avec un degré de précision de 0,001 g dans un flacon de 2 ml (4.1.15) et dissoudre dans 0,5 ml d’hexane (4.2.3).

Charger la colonne d’extraction en phase solide avec la solution et éluer avec 10 ml de mélange hexane-éther diéthylique (87:13 v/v) (4.2.3) sous vide.

La fraction recueillie est évaporée à sec dans un évaporateur rotatif (4.1.9) à pression réduite et à température ambiante. Le résidu est dissous dans 2 ml d’acétone (4.2.6) en vue de l’analyse des triglycérides (TG).

4.4. Analyse CLHP

4.4.1. Préparation des échantillons pour l’analyse chromatographique

Préparer une solution à 5 % de l’échantillon à analyser en pesant 0,5 ± 0,001 g de l’échantillon dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter à 10 ml avec le solvant de solubilisation (4.2.9).

4.4.2. Procédure

Régler le système chromatographique. Pomper du solvant d’élution (4.2.8) à un débit de 1,5 ml par minute de façon à purger l’ensemble du système. Attendre d’avoir une ligne de base stable.

Injecter 10 μl de l’échantillon préparé selon le point 4.3.

4.4.3. Calcul et expression des résultats

Utiliser la méthode de normalisation des aires des pics, qui consiste à admettre que la somme des aires des pics correspondant aux triglycérides (TG) de ECN 42 à ECN 52 est égale à 100 %.

Calculer le pourcentage relatif de chaque triglycéride selon la formule:

.

Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule.

Voir notes 1 et 4.

4.5. Calcul de la composition des triglycérides (% de moles) à partir de la composition en acides gras (% de l’aire)

4.5.1. Détermination de la composition en acides gras

La composition en acides gras est déterminée par la norme ISO 5508 au moyen d’une colonne capillaire. Les esters méthyliques sont préparés selon la méthode COI/T.20/doc. no 24.

4.5.2. Acides gras pris en considération dans le calcul

Les glycérides sont regroupés selon leur nombre équivalent d’atomes de carbone (ECN — Equivalent Carbon Number), compte tenu des équivalences suivantes entre ECN et acides gras. Seuls les acides gras à 16 ou 18 atomes de carbone ont été pris en considération, car ce sont les seuls qui sont importants pour l’huile d’olive. Les acides gras doivent être normalisés à 100 %.

Acide gras (AG) Abréviation Poids moléculaire (PM) ECN Acide palmitique P 256,4 16 Acide palmitoléique Po 254,4 14 Acide stéarique S 284,5 18 Acide oléique O 282,5 16 Acide linoléique L 280,4 14 Acide linolénique Ln 278,4 12

4.5.3. Conversion en moles du % de l’aire pour tous les acides gras (1)

4.5.4. Normalisation à 100 % des moles d’acides gras (2)

Le résultat indique le pourcentage de chaque acide gras, en moles, dans la position globale (1,2,3) des TG.

On calcule ensuite la somme des acides gras saturés P et S (AGS) et des acides gras insaturés Po, O, L et Ln (AGI):

4.5.5. Calcul de la composition des acides gras en position 2 et en positions 1, 3 des TG

Les acides gras sont répartis en trois groupes, comme suit: un groupe pour la position 2 et deux groupes identiques pour les positions 1 et 3, avec des coefficients différents pour les acides saturés (P et S) et les acides insaturés (Po, O, L et Ln).

4.5.5.1. Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)] (4):

4.5.5.2. Acides gras insaturés en position 2 [Po(2), O(2), L(2) et Ln(2)] (5):

4.5.5.3. Acides gras en positions 1 et 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)] (6):

4.5.6. Calcul des triglycérides

4.5.6.1. TG à un acide gras (AAA, ici LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2. TG à deux acides gras (AAB, ici PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3. TG à trois acides gras distincts (ABC, ici OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4. Triglycérides à ECN 42

Les triglycérides à ECN 42 sont calculés selon les équations 7, 8 et 9, et sont ensuite indiqués par ordre d’élution attendu en CLHP (en général, on observe seulement trois pics).

LLL

PoLL et l’isomère de position LPoL

OLLn et les isomères de position OLnL et LnOL

PoPoL et l’isomère de position PoLPo

PoOLn et les isomères de position OPoLn et OLnPo

PLLn et les isomères de position LLnP et LnPL

PoPoPo

SLnLn et l’isomère de position LnSLn

PPoLn et les isomères de position PLnPo et PoPLn

Les triglycérides à ECN 42 s’obtiennent en additionnant les neuf triglycérides, y compris leurs isomères de position. Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule.

5. ÉVALUATION DES RÉSULTATS

On compare la composition théorique calculée et celle déterminée par CLHP. Si, en valeur absolue, la différence «données CLHP moins données théoriques» est supérieure aux valeurs spécifiées pour la catégorie d’huile concernée dans la norme de commercialisation, l’échantillon contient de l’huile de graines.

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6. EXEMPLE (LA NUMÉROTATION RENVOIE AUX SECTIONS DU TEXTE DE LA MÉTHODE)

— 4.5.1. Calcul du % de moles d’acides gras à partir des données de la CPG (% de l’aire normalisé)

La détermination de la composition en acides gras par CPG donne les valeurs suivantes:

AG P S Po O L Ln PM 256,4 284,5 254,4 282,5 280,4 278,4 % aire 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0

— 4.5.3 Conversion en moles du % de l’aire pour tous les acides gras [voir formule (1)]

moles P = moles S = moles Po = moles O = moles L = moles Ln = Total = 0,35821 moles TG

— 4.5.4 Normalisation à 100 % des moles d’acides gras [voir formule (2)]

% moles P(1,2,3) = % moles S(1,2,3) = % moles Po(1,2,3) = % moles O(1,2,3) = % moles L(1,2,3) = % moles Ln(1,2,3) = Total % moles = 100 %

Somme des acides gras saturés et insaturés en position 1, 2 et 3 des TG [voir formule (3)]:

— 4.5.5 Calcul de la composition en acides gras en position 2 et en position 1 et 3 des TG

— 4.5.5.1 Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)] [voir formule (4)]

— 4.5.5.2 Acides gras insaturés en position 2 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)] [voir formule (5)]

— 4.5.5.3 Acides gras en position 1 et 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)] [voir formule (6)]

— 4.5.6. Calcul des triglycérides

À partir de la composition calculée en acides gras en position 2 et en position 1 et 3 (voir tableau suivant):

AG en positions 1 et 3 position 2 P 16,004 % 0,653 % S 4,325 % 0,177 % Po 1,015 % 1,262 % O 68,526 % 85,296 % L 9,204 % 11,457 % Ln 0,927 % 1,153 % Total 100,0 % 100,0 %

Les triglycérides suivants sont calculés:

LLL

PoPoPo

PoLL avec un isomère de position

SLnLn avec un isomère de position

PoPoL avec un isomère de position

PPoLn avec 2 isomères de position

OLLn avec 2 isomères de position

PLLn avec 2 isomères de position

PoOLn avec 2 isomères de position

— 4.5.6.1. TG à un acide gras (LLL, PoPoPo) [voir formule (7)]

, = 0,09706 mol LLL

— 4.5.6.2 TG à deux acides gras (PoLL, SLnLn, PoPoL) (voir formule (8)]

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3 TG à trois acides gras distincts (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) [voir formule (9)]

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN 42 = 0,69512 mol TG

Note 1: Il est possible de déterminer l’ordre d’élution en calculant le nombre équivalent d’atomes de carbone, souvent défini par la relation , dans laquelle CN est le nombre d’atomes de carbone et n le nombre de doubles liaisons; on peut affiner le calcul en tenant compte de l’origine de la double liaison. Si no, nl et nln sont les nombres de doubles liaisons attribués respectivement aux acides oléique, linoléique et linolénique, le nombre équivalent d’atomes de carbone peut être calculé selon la formule suivante:

dans laquelle les coefficients do, dl et dln peuvent être calculés à l’aide des triglycérides de référence. Dans les conditions spécifiées dans la présente méthode, la relation obtenue sera voisine de:

Note 2: Avec plusieurs triglycérides de référence, il est également possible de calculer la résolution par rapport à la trioléine:

de la trioléine

en utilisant le temps de rétention réduit .

La représentation graphique de log α en fonction de f (nombre de doubles liaisons) permet de déterminer les valeurs de rétention pour tous les triglycérides à acides gras contenus dans les triglycérides de référence — voir figure 1.

Note 3: L’efficacité de la colonne doit permettre de séparer nettement le pic de la trilinoléine des pics des triglycérides dont le TR est proche. L’élution est effectuée jusqu’au pic ECN 52.

Note 4: Une mesure correcte des aires de tous les pics intéressants pour la présente détermination est garantie si le deuxième pic correspondant à ECN 50 est égal à 50 % du maximum de l’échelle.

Figure 1

Représentation graphique de log α en fonction de f (nombre de doubles liaisons)

Figure 2

Huile d’olive à faible teneur en acide linoléique

a)

b)

Figure 3

Huile d’olive à teneur élevée en acide linoléique

a)

b)