ANNEXE II

PROCÉDURE DE TEST POUR DIAGNOSTIQUER, DÉTECTER ET IDENTIFIER RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

DOMAINE D’APPLICATION DE LA PROCÉDURE

La procédure présentée ci-dessous décrit les différentes étapes à suivre pour:

i) diagnostiquer le flétrissement bactérien sur les tubercules de pomme de terre et sur les plantes de pomme de terre et de tomate et quelques autres plantes hôtes;

ii) détecter Ralstonia solanacearum dans des échantillons de tubercules de pomme de terre, de plants de pommes de terre, de tomates et d’autres hôtes, dans l’eau ou dans le sol;

iii) identifier Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

TABLE DES MATIÈRES

Page Principes généraux 40 SECTION I: Application de la procédure de test 40 1. Procédure de détection pour diagnostiquer le flétrissement bactérien (R. solanacearum) sur les tubercules de pomme de terre et sur les plantes de pomme de terre et de tomates ou d’autres plantes hôtes présentant des symptômes de flétrissement bactérien 40 2. Procédure pour détecter et identifier R. solanacearum sur des échantillons de tubercules de pomme de terre asymptomatiques 43 3. Procédure pour détecter et identifier R. solanacearum sur des échantillons de plantes de pomme de terre et de tomate ou d’autres plantes hôtes asymptomatiques 46 SECTION II: Méthodes détaillées pour détecter R. solanacearum sur les tubercules de pomme de terre, les plantes de pomme de terre et de tomate ou d’autres plantes hôtes présentant des symptômes de flétrissement bactérien 48 1. Symptômes 48 2. Tests rapides de dépistage 48 3. Procédure d’isolement 49 4. Tests d’identification de R. solanacearum 49 SECTION III: 1. Méthodes détaillées pour détecter et identifier R. solanacearum sur des échantillons de tubercules de pomme de terre asymptomatiques 49 1.1. Préparation de l’échantillon 49 1.2. Tests 51 2. Méthodes détaillées pour détecter et identifier R. solanacearum sur des échantillons de plantes de pomme de terre et de tomate ou d’autres plantes asymptomatiques 51 2.1. Préparation de l’échantillon 51 2.2. Tests 52 SECTION IV: 1. Procédure pour détecter et identifier R. solanacearum dans l’eau 53 2. Méthodes pour détecter et identifier R. solanacearum dans l’eau 55 2.1. Préparation de l’échantillon 55 2.2. Tests 55 SECTION V: 1. Procédure pour détecter et identifier R. solanacearum dans le sol 56 2. Méthodes pour détecter et identifier R. solanacearum dans le sol 58 2.1. Préparation des échantillons 58 2.2. Tests 58 SECTION VI: Protocoles optimisés pour détecter et identifier R. solanacearum 58 A. Diagnostic et tests de détection 58 1. Test d’exsudation des tiges 58 2. Mise en évidence des granules de poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 58 3. Tests de séro-agglutination 59 4. Isolement sélectif 60 4.1. Étalement sur milieu sélectif 60 4.2. Procédure d’enrichissement 60 5. Test d’immunofluorescence (Test IF) 61 6. Test de réaction en chaîne par polymérase (Test PCR) 64 6.1. Méthodes de purification de l’ADN 65 a) Méthode de Pastrik (2000) 65 b) Autres méthodes 65 6.2. PCR 66 6.3. Analyse du produit de la réaction PCR 66 7. Test FISH 67 8. Tests ELISA 69 a) ELISA indirect 69 b) DAS-ELISA 70 9. Test biologique 71 B. Tests d’identification 72 1. Tests d’identification nutritionnel et enzymatique 72 2. Test IF 72 3. Test ELISA 73 4. Test PCR 73 5. Test FISH 73 6. Test de profil des acides gras (FAP) 73 7. Méthodes de caractérisation de la souche 73 7.1. Détermination du biovar 73 7.2. Empreinte génomique 74 7.3. Méthodes PCR 74 C. Test de confirmation 74 Appendice 1 Laboratoires pratiquant l’optimisation et la validation des protocoles 76 Appendice 2 Milieux d’isolement et de culture de R. solanacearum 77 Appendice 3 A) Matériel de contrôle normalisé disponible dans le commerce 79 B) Préparation des contrôles 80 Appendice 4 Tampons pour les procédures de test 82 Appendice 5 Détermination du degré de contamination lors des tests IF et FISH 85 Appendice 6 Protocoles PCR et réactifs validés 86 Appendice 7 Réactifs validés pour le test FISH 91 Appendice 8 Conditions de culture pour les tomates et les aubergines 93 Références 94

PRINCIPES GÉNÉRAUX

Les protocoles optimisés pour les différentes méthodes, les réactifs validés et les détails de la préparation du matériel nécessaire aux tests et aux contrôles figurent dans les appendices. Une liste des laboratoires retenus pour l’optimisation et la validation des protocoles est fournie à l’appendice 1.

Étant donné que les protocoles impliquent la détection d’un organisme nuisible à mettre en quarantaine et incluent l’utilisation de cultures viables de R. solanacearum en tant que matériels de contrôle, il sera nécessaire de mettre en œuvre les procédures dans des conditions de quarantaine appropriées prévoyant des installations adéquates d’élimination des déchets et dans les conditions des licences appropriées délivrées par les autorités officielles de quarantaine.

Les paramètres des tests doivent garantir une détection cohérente et reproductible des niveaux de R. solanacearum aux seuils fixés par les méthodes sélectionnées.

La préparation précise de témoins positifs est impérative.

La réalisation des tests selon les seuils requis implique également l’établissement de paramètres corrects, la maintenance et l’étalonnage des équipements, la manipulation et la conservation soigneuses des réactifs et toutes les mesures visant à empêcher la contamination entre échantillons, par exemple la séparation des témoins positifs et des échantillons des tests. Des normes de contrôle de la qualité doivent être appliquées pour éviter des erreurs administratives et autres, notamment en ce qui concerne l’étiquetage et la documentation.

L’apparition suspectée au sens de l’article 4, paragraphe 2, de la directive 98/57/CE implique un résultat positif des tests de diagnostic ou de dépistage réalisés sur un échantillon comme précisé dans les diagrammes fonctionnels ci-après. Un premier test de dépistage positif (test IF, PCR/FISH, isolement sélectif) doit être confirmé par un deuxième test de dépistage fondé sur un autre principe biologique.

Si le premier test de dépistage est positif, la contamination par R. solanacearum est suspectée et un deuxième test de dépistage doit être réalisé. Si le deuxième test de dépistage est positif, la suspicion est confirmée (apparition suspectée) et les tests suivant la procédure doivent être poursuivis. Si le deuxième test de dépistage est négatif, l’échantillon est considéré comme non contaminé par R. solanacearum.

La présence confirmée visée à l’article 5, paragraphe 1, de la directive 98/57/CE implique l’isolement et l’identification d’une culture pure de R. solanacearum avec confirmation de la pathogénicité.

SECTION I

APPLICATION DE LA PROCÉDURE DE TEST

1. Procédure de détection pour diagnostiquer le flétrissement bactérien (Ralstonia solanacearum) sur les tubercules de pomme de terre et sur les plantes de pomme de terre et de tomate ou d’autres plantes hôtes présentant des symptômes de flétrissement bactérien

La procédure de test concerne les tubercules de pomme de terre et les plantes présentant des symptômes typiques du flétrissement bactérien ou permettant de soupçonner sa présence. Elle comporte un test rapide de dépistage, l’isolement de l’agent pathogène à partir du tissu vasculaire infecté sur un milieu (sélectif) et, en cas de résultat positif, l’identification de la culture comme étant Ralstonia solanacearum.

2. Procédure pour détecter et identifier Ralstonia solanacearum sur des échantillons de tubercules de pomme de terre asymptomatiques

Principe

La procédure de test vise à détecter des infections latentes de tubercules de pomme de terre. Un résultat positif d’au moins deux tests de dépistage (3) fondés sur des principes biologiques différents doit être complété par l’isolement de l’agent pathogène, suivi, en cas d’isolement de colonies caractéristiques, de la confirmation d’une culture pure comme étant R. solanacearum. Un résultat positif d’un seul test de dépistage n’est pas suffisant pour considérer l’échantillon comme suspect.

Les tests de dépistage et les tests d’isolement doivent permettre de détecter 103 à 104 cellules/ml d’extrait concentré remis en suspension, inclus comme témoins positifs dans chaque série de tests.

3. Procédure pour détecter et identifier Ralstonia solanacearum dans des échantillons de plantes de pommes de terre et de tomates ou d’autre plantes hôtes asymptomatiques

SECTION II

MÉTHODES DÉTAILLÉES POUR DÉTECTER RALSTONIA SOLANACEARUM SUR DES TUBERCULES DE POMME DE TERRE ET DES PLANTES DE POMME DE TERRE ET DE TOMATE OU D’AUTRES PLANTES HÔTES PRÉSENTANT DES SYMPTÔMES DE FLÉTRISSEMENT BACTÉRIEN

1. Symptômes (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Symptômes sur les pommes de terre

Plante de pomme de terre. Le premier stade de l’infection dans le champ se traduit par un flétrissement des feuilles du haut de la plante à température élevée pendant la journée et un retour à l’aspect normal pendant la nuit. Au cours des premiers stades du flétrissement, les feuilles restent vertes, mais plus tard, un jaunissement et une nécrose brune se développent. L’épinastie apparaît également. Le flétrissement d’une pousse ou de plants entiers devient rapidement irréversible et se termine par l’effondrement et la mort de la plante. On peut observer un brunissement du tissu vasculaire des tiges de plantes flétries coupées transversalement, et un exsudat bactérien laiteux apparaît à la surface de la coupe ou peut en être extrait en pinçant la tige. Lorsqu’une tige coupée est placée dans l’eau verticalement, des filets de productions bactériennes s’écoulent des faisceaux vasculaires.

Tubercule de pomme de terre. Les tubercules de pomme de terre doivent être coupés transversalement, près du talon (stolon) ou longitudinalement jusqu’au stolon. Le premier stade de l’infection se traduit par une coloration jaune vitreux à brun clair de l’anneau vasculaire, d’où émerge un suintement bactérien crémeux pâle spontanément après quelques minutes. Par la suite, la décoloration vasculaire devient plus nettement brune, et la nécrose s’étend parfois au tissu parenchymateux. Aux stades avancés, l’infection se propage à partir du talon et des yeux, et un liquide bactérien peut suinter, provoquant l’adhérence des particules de sol. L’épiderme des tubercules peut alors présenter des lésions brun rougeâtre légèrement concaves en raison de l’effondrement interne du tissu vasculaire. Le développement secondaire de pourritures fongiques et bactériennes est commun aux stades avancés de la maladie.

1.2. Symptômes sur les tomates

Plante de tomate. Le premier symptôme visible est la flaccidité des plus jeunes feuilles. Dans des conditions favorables à l’agent pathogène (température du sol d’environ 25 °C, humidité saturée), l’épinastie et le flétrissement d’un côté de la plante ou de l’ensemble de la plante surviennent en quelques jours et provoquent l’effondrement complet de la plante. Dans des conditions moins favorables (température du sol inférieure à 21 °C), le flétrissement est moindre, mais un grand nombre de racines adventices peuvent se développer sur la tige. On peut observer le long de la tige des stries imbibées d’eau partant de la base de la tige, qui témoignent de la nécrose du système vasculaire. Lorsque la tige est coupée transversalement, un exsudat bactérien blanc ou jaunâtre s’écoule du tissu vasculaire brun décoloré de celle-ci.

1.3. Symptômes sur d’autres hôtes

Solanum dulcamara et S. nigrum. Dans des conditions naturelles, des symptômes de flétrissement sont rarement observés sur ces hôtes adventices, sauf si les températures du sol sont supérieures à 25 °C ou si les niveaux d’inoculum sont extrêmement élevés (par exemple: pour S. nigrum se développant dans le voisinage de plantes de pomme de terre ou de tomate malades). Lorsque le flétrissement apparaît, les symptômes sont pareils à ceux décrits pour la tomate. Les plants de S. dulcamara qui ne se flétrissent pas et se développent avec des tiges et des racines dans l’eau peuvent révéler une légère décoloration brune du tissu vasculaire sur la partie transversale de la base de la tige ou les parties sous eau de la tige. Des bactéries peuvent suinter du tissu vasculaire coupé ou constituer des filets de productions bactériennes si la tige coupée est placée verticalement dans l’eau, même en l’absence de symptômes de flétrissement.

2. Tests rapides de dépistage

Des tests rapides de dépistage peuvent faciliter le diagnostic supposé, mais ne sont pas essentiels. Utiliser un ou plusieurs des tests validés suivants:

2.1. Test d’exsudation des tiges

(voir section VI.A.1).

2.2. Mise en évidence des granules de poly-β-hydroxybutyrate (PHB)

La coloration au bleu du Nil A ou au noir du Soudan B (voir section VI.A.2) de frottis fixés à la chaleur d’exsudat bactérien de tissu infecté sur une lame de microscope permet de visualiser les granules caractéristiques de PHB présents dans les cellules de R. solanacearum.

2.3. Tests de séro-agglutination

(voir section VI.A.3).

2.4. Autres tests

Parmi les autres tests rapides de dépistage, on peut citer le test IF (voir section VI.A.5), le test FISH (voir section VI.A.7), les tests ELISA (voir section VI.A.8) et les tests PCR (voir section VI.A.6).

3. Procédure d’isolement

a) Prélever de l’exsudat ou des morceaux de tissu décoloré, soit à partir de l’anneau vasculaire du tubercule de pomme de terre, soit à partir des vaisseaux de la tige de pomme de terre, de tomate ou d’autres plantes hôtes flétries. Mettre en suspension dans un petit volume d’eau distillée stérile ou dans un tampon au phosphate 50 mM (appendice 4). Laisser reposer cinq à dix minutes.

b) Préparer une série de dilutions au dixième de la suspension.

c) Transférer 50-100 µl de la suspension et des dilutions sur un milieu de culture général (NA, YPGA ou SPA; voir appendice 2) et/ou sur le milieu tétrazolium de Kelman (appendice 2), et/ou sur un milieu sélectif validé (par exemple: SMSA; voir appendice 2). Étaler à l’aide d’une technique appropriée par dilution et étalement. Si cela est jugé utile, préparer des boîtes de Petri séparées avec une suspension de cellules diluées appartenant au biovar 2 de R. solanacearum comme témoin positif.

d) Incuber les boîtes pendant deux à six jours à 28 °C. — Sur le milieu nutritif général, les isolats virulents de R. solanacearum forment des colonies fluides, à bord irrégulier, plates, blanchâtres et présentant fréquemment des verticilles caractéristiques au centre. Les formes non virulentes de R. solanacearum forment de petites colonies arrondies non fluides, butyreuses, de couleur uniforme blanchâtre. — Sur le milieu tétrazolium de Kelman et sur le milieu SMSA, les verticilles sont de couleur rouge sang. Les formes non virulentes de R. solanacearum forment de petites colonies arrondies non fluides, butyreuses, de couleur uniforme rouge sombre.

4. Tests d’identification de R. solanacearum

Les tests permettant de confirmer l’identification d’isolats supposés de R. solanacearum sont indiqués dans la section VI.B.

SECTION III

1. Méthodes détaillées pour détecter et identifier Ralstonia solanacearum sur des échantillons de tubercules de pomme de terre asymptomatiques

1.1. Préparation de l’échantillon

Remarques:

— La taille de l’échantillon standard est de deux cents tubercules par test. Un échantillonnage plus intensif implique davantage de tests sur des échantillons de cette taille. Un nombre plus important de tubercules dans l’échantillon entraînera une inhibition ou une interprétation difficile des résultats. Cependant, la procédure peut être appliquée facilement à des échantillons de moins de deux cents tubercules lorsqu’un nombre moins élevé de tubercules est disponible.

— La validation de toutes les méthodes de détection décrites ci-après est fondée sur la réalisation de tests sur des échantillons de deux cents tubercules.

— L’extrait de pomme de terre décrit ci-dessous peut également être utilisé pour détecter la présence de la bactérie responsable du flétrissement bactérien de la pomme de terre, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Prétraitement facultatif préalable à la préparation de l’échantillon:

a) Incuber les échantillons à 25-30 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines avant de réaliser les tests afin d’encourager la multiplication de populations éventuelles de R. solanacearum.

b) Laver les tubercules en utilisant des désinfectants (composés chlorés lorsque le test PCR doit être utilisé pour éliminer l’ADN pathogène) et des détergents appropriés entre chaque échantillon. Sécher les tubercules à l’air. Cette procédure de lavage est particulièrement utile (mais pas obligatoire) pour les échantillons comportant des particules de sol en excédent et si un test PCR ou une procédure d’isolement direct doivent être mis en œuvre.

1.1.1. Enlever la peau de chaque tubercule au niveau du talon (stolon) au moyen d’un scalpel ou d’un couteau à légumes propre et désinfecté, de façon à faire apparaître le tissu vasculaire. Découper soigneusement un petit noyau de tissu vasculaire au niveau du talon et prélever aussi peu que possible de tissu non vasculaire (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Mettre de côté les tubercules (en voie de pourrissement) présentant des symptômes de “pourriture brune” suspects et les tester séparément.

Si, au cours du prélèvement du noyau de talon, des symptômes suspects de flétrissement bactérien sont observés, il convient de procéder à une inspection visuelle de ce tubercule et de le couper à proximité du talon. Tout tubercule coupé présentant des symptômes suspects doit être conservé pendant au minimum deux jours à température ambiante afin de permettre une subérisation, et être entreposé réfrigéré (entre 4 et 10 °C) dans des conditions de quarantaine appropriées. Tous les tubercules, y compris ceux qui présentent des symptômes suspects, doivent être conservés conformément à l’annexe III.

1.1.2. Rassembler les noyaux de talons dans des récipients jetables inutilisés qui peuvent être fermés et/ou scellés (s’il s’agit de récipients réutilisés, ils doivent être nettoyés et désinfectés complètement à l’aide de composés chlorés). Il est préférable de traiter immédiatement les noyaux de talons. Sinon, il convient de les entreposer dans le récipient, sans addition de tampon, pour une période de moins de 72 heures réfrigérés ou de moins de 24 heures à température ambiante.

Traiter les noyaux de talons en suivant l’une des procédures ci-dessous:

a) soit recouvrir les talons avec un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d’extraction (appendice 4) et les placer sur un agitateur rotatif (50-100 tours/minute) pendant 4 heures à une température inférieure à 24 °C ou réfrigérés pendant 16 à 24 heures; ou

b) homogénéiser les talons avec un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d’extraction (appendice 4) dans un mixeur (par exemple: Waring ou Ultra Thurax) ou en les broyant dans un sac de macération jetable scellé (par exemple, sac Stomacher ou de type «Bioreba strong gauge polythene» de 150 mm × 250 mm stérilisé par radiations) en utilisant un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (par exemple: Homex).

NB: Le risque de contaminations croisées d’échantillons est élevé lorsque les échantillons sont homogénéisés en utilisant un mixeur. Prendre des précautions pour éviter la production d’aérosol ou des débordements pendant le processus d’extraction. Veiller à utiliser des lames de mixeur et des récipients fraîchement stérilisés pour chaque échantillon. En cas d’utilisation du test PCR, éviter le transfert d’ADN sur les récipients ou le dispositif de broyage. Le broyage dans des sacs jetables et l’utilisation de tubes jetables sont recommandés en cas de recours au test PCR.

1.1.3. Décanter le liquide surnageant. S’il est excessivement trouble, le clarifier par une centrifugation à basse vitesse (à 180 g au maximum pendant dix minutes, à une température de 4 à 10 °C) ou par une filtration sous vide (40-100 µm), en lavant le filtre avec un tampon d’extraction supplémentaire (~10 ml).

1.1.4. Concentrer la fraction bactérienne par centrifugation à 7 000 g pendant quinze minutes (ou à 10 000 g pendant dix minutes) à une température de 4 à 10 °C et jeter le surnageant sans déranger l’extrait concentré.

1.1.5. Remettre en suspension l’extrait concentré dans un tampon concentré de 1,5 ml (appendice 4). Utiliser 500 µl pour tester R. solanacearum, 500 µl pour Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus et 500 µl à des fins de référence. Ajouter du glycérol stérile à la concentration finale de 10 à 25 % (en volume) aux 500 µl de l’aliquote de référence et à l’aliquote de test restant, homogénéiser au vortex et stocker à une température de –16 à –24 °C (semaines) ou de –68 à –86 °C (mois). Maintenir les aliquotes de test à une température de 4 à 10 °C pendant les tests.

Une congélation et un dégel répétés ne sont pas recommandés.

Si le transport de l’extrait est requis, veiller à effectuer la livraison dans une glacière dans un délai de vingt-quatre heures.

1.1.6. Il est impératif que tous les témoins positifs et les échantillons de R. solanacearum soient traités séparément afin d’éviter toute contamination, aussi bien pour les lames d’immunofluorescence que pour tous les tests.

1.2. Tests

Voir le diagramme et la description des tests et des protocoles optimisés dans les appendices concernés:

Isolement sélectif (voir section VI.A.4)

Test IF (voir section VI.A.5)

Tests PCR (voir section VI.A.6)

Test FISH (voir section VI.A.7)

Tests ELISA (voir section VI.A.8)

Test biologique (voir section VI.A.9)

2. Méthodes détaillées pour détecter et identifier R. solanacearum dans des échantillons de plantes de pomme de terre et de tomate ou d’autres plantes hôtes asymptomatiques

2.1. Préparation de l’échantillon

NB: Pour détecter des populations latentes de R. solanacearum, il est conseillé de tester des échantillons composites. La procédure peut facilement être appliquée à des échantillons composites comportant jusqu’à deux cents morceaux de tiges. Lorsque des recherches sont réalisées, elles doivent être fondées sur un échantillon statistiquement représentatif de la population végétale considérée.

2.1.1. Collecter des segments de tiges de 1 à 2 cm dans un récipient stérile fermé suivant les procédures de prélèvement suivantes:

Plantules de tomate de pépinière: enlever au moyen d’un couteau propre et désinfecté un segment de 1 cm à la base de chaque tige, juste au-dessus du niveau du sol.

Plantes de tomate cultivées en serre ou en plein champ: enlever au moyen d’un couteau propre et désinfecté la pousse latérale la plus basse de chaque plante en coupant juste au-dessus de la jonction avec la tige principale. Enlever le segment de 1 cm le plus bas de chaque pousse latérale.

Autres hôtes: enlever au moyen d’un couteau ou d’un sécateur propre et désinfecté un segment de 1 cm à la base de chaque tige, juste au-dessus du niveau du sol. Dans le cas de S. dulcamara ou d’autres plantes hôtes poussant dans l’eau, enlever des morceaux de 1 à 2 cm des tiges se trouvant sous l’eau ou des stolons ayant des racines aquatiques.

En cas de prélèvement dans un lieu particulier, il est recommandé de tester un échantillon statistiquement représentatif d’au moins dix plants par point de prélèvement de chaque adventice hôte potentiel. La détection de l’agent pathogène sera le plus fiable à la fin du printemps, en été et en automne, bien que des infections naturelles puissent être détectées tout au long de l’année dans les Solanum dulcamara pérennantes poussant dans les cours d’eau. Parmi les hôtes connus figurent les plants de pommes de terre spontanés (repousses), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium et d’autres membres de la famille des solanacées. Pelargonium spp. et Portulaca oleracea sont également des hôtes. Parmi certaines adventices spp. européennes qui peuvent abriter des populations du biovar 2, race 3 de R. solanacearum dans les racines et/ou les rhizosphères dans des conditions environnementales spécifiques, on peut citer Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra et Urtica dioica.

NB: Un examen visuel des symptômes internes (coloration vasculaire ou exsudat bactérien) peut être effectué à ce stade. Mettre de côté tout segment de tige présentant des symptômes et le tester séparément (voir section II).

2.1.2. Désinfecter brièvement les segments avec de l’éthanol à 70 % et les sécher immédiatement avec du papier absorbant. Ensuite, traiter les segments de tiges en suivant l’une des procédures ci-dessous:

a) soit recouvrir les segments avec un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d’extraction (appendice 4) et les placer sur un agitateur rotatif (50-100 tours/minute) pendant 4 heures à une température inférieure à 24 °C ou pendant 16 à 24 heures réfrigérés; ou

b) traiter immédiatement les segments en les broyant dans un sac de macération résistant (par exemple: Stomacher ou Bioreba) avec un volume approprié de tampon d’extraction (appendice 4) en utilisant un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (par exemple: Homex). Si ce n’est pas possible, stocker les segments, pas plus de 72 heures réfrigérés ou de 24 heures à température ambiante.

2.1.3. Décanter le surnageant après sédimentation pendant quinze minutes.

2.1.4. Une nouvelle clarification de l’extrait ou du concentré de la fraction bactérienne n’est habituellement pas requise, mais peut être réalisée par filtration et/ou centrifugation selon la méthode décrite dans la section III.1.1.3 à 1.1.5.

2.1.5. Diviser l’extrait d’échantillon initial ou concentré en deux parties égales. Maintenir une moitié à une température de 4 à 10 °C au cours du test et entreposer l’autre moitié avec 10 à 25 % (en volume) de glycérol stérile à une température de –16 à –24 °C (semaines) ou de –68 à –86 °C (mois) si un test supplémentaire est requis.

2.2. Tests

Voir le diagramme et la description des tests et les protocoles optimisés dans les appendices concernés:

Isolement sélectif (voir section VI.A.4)

Test IF (voir section VI.A.5)

Tests PCR (voir section VI.A.6)

Test FISH (voir section VI.A.7)

Tests ELISA (voir section VI.A.8)

Test biologique (voir section VI.A.9)

SECTION IV

1. Procédure pour détecter et identifier R. solanacearum dans l’eau

2. Méthodes pour détecter et identifier R. solanacearum dans l’eau

Principe

La procédure de détection validée décrite dans la présente section est applicable pour la détection de l’agent pathogène dans les échantillons d’eaux de surface et peut également être utilisée pour tester les échantillons d’effluents issus de la transformation de pommes de terre ou d’effluents d’eaux usées. Cependant, il importe de noter que la sensibilité prévue de la détection variera avec le substrat. La sensibilité du test d’isolement est perturbée par des populations de bactéries saprophytes concurrentes qui sont généralement beaucoup plus importantes dans les effluents issus de la transformation de pommes de terre et les effluents d’eaux usées que dans les eaux de surface. Alors que la procédure ci-après ne doit détecter que 103 cellules/l dans les eaux de surface, la sensibilité de la détection dans les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d’eaux usées est susceptible d’être considérablement plus faible. Pour cette raison, il est recommandé de tester les effluents après les traitements de purification éventuels (par exemple: sédimentation ou filtration) au cours desquels les populations de bactéries saprophytes sont réduites. Les limitations de la sensibilité de la procédure de test doivent être envisagées lors de l’évaluation de la fiabilité des résultats négatifs obtenus, le cas échéant. Tandis que cette procédure a été couronnée de succès lors de son utilisation dans des études visant à déterminer la présence ou l’absence de l’agent pathogène dans les eaux de surface, ses limitations doivent être prises en considération lorsqu’elle est utilisée dans des travaux semblables concernant les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d’eaux usées.

2.1. Préparation de l’échantillon

Remarques:

— La détection de R. solanacearum dans les eaux de surface est plus fiable à la fin du printemps, en été et en automne, lorsque la température de l’eau est supérieure à 15 °C.

— Le fait de recommencer le prélèvement à des moments différents au cours de la période susmentionnée dans des points de prélèvement désignés augmentera la fiabilité de la détection en réduisant les conséquences des variations climatiques.

— Tenir compte des conséquences de pluies abondantes et de la géographie du cours d’eau afin d’éviter des effets de dilution importants qui peuvent occulter la présence de l’agent pathogène.

— Prélever des échantillons d’eaux de surface à proximité de plantes hôtes si ces plantes hôtes sont présentes.

2.1.1. Dans des points de prélèvement sélectionnés, collecter des échantillons d’eau en remplissant des tubes ou des bouteilles stériles jetables à une profondeur si possible supérieure à 30 cm et à une distance maximale de 2 m de la berge. Pour les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d’eaux usées, collecter des échantillons au point de rejet des effluents. La taille des échantillons recommandée va jusqu’à 500 ml par point de prélèvement. Si la préférence est donnée à des échantillons plus modestes, il est conseillé de prélever des échantillons au moins à trois reprises par point de prélèvement, chaque échantillon consistant en deux sous-échantillons répliqués d’au moins 30 ml. Pour une étude intensive, sélectionner au minimum trois points de prélèvement pour 3 km de cours d’eau et veiller à ce que les affluents du cours d’eau fassent également l’objet d’un prélèvement.

2.1.2. Transporter les échantillons dans des conditions d’obscurité et à basse température (4-10 °C) et tester dans un délai de vingt-quatre heures.

2.1.3. Au besoin, la fraction bactérienne peut être concentrée par l’une des méthodes suivantes:

a) Centrifuger 30-50 ml de sous-échantillons à 10 000 g pendant dix minutes (ou à 7 000 g pendant quinze minutes), de préférence à une température de 4 à 10 °C, éliminer le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans un tampon concentré de 1 ml (appendice 4).

b) Filtration sur membrane (dimension minimale des pores de 0,45 µm) suivie du lavage du filtre dans 5-10 ml de tampon concentré et rétention des solutions de lavage. Cette méthode convient à de grands volumes d’eau contenant un petit nombre de saprophytes.

La concentration n’est généralement pas recommandée pour les échantillons d’effluents issus de la transformation de pommes de terre ou d’effluents d’eaux usées, étant donné que des populations plus importantes de bactéries saprophytes concurrentes auront un effet inhibiteur sur la détection de R. solanacearum.

2.2. Tests

Voir le diagramme et la description des tests dans les appendices concernés.

SECTION V

1. Procédure pour détecter et identifier R. solanacearum dans le sol

2. Méthodes pour détecter et identifier R. solanacearum dans le sol

Principes

La procédure de détection validée décrite dans la présente section est applicable pour la détection de l’agent pathogène dans des échantillons de sol, mais peut également être utilisée pour tester les échantillons de déchets solides issus de la transformation de pommes de terre ou de boues d’épuration. Cependant, il convient de noter que ces méthodes ne sont pas assez sensibles pour garantir la détection de populations faibles et/ou inégalement dispersées de R. solanacearum pouvant apparaître dans des échantillons naturellement contaminés de ces substrats.

Les limitations de la sensibilité de cette procédure de test doivent être envisagées lors de l’évaluation de la fiabilité de résultats négatifs obtenus et également lors de son utilisation dans des études visant à déterminer la présence ou l’absence de l’agent pathogène dans les sols ou les boues. Le test le plus fiable de détection de la présence de l’agent pathogène dans le sol d’un champ est de planter un hôte sensible et de surveiller son infection éventuelle, mais même avec cette méthode, de faibles degrés de contamination échapperont à la détection.

2.1. Préparation de l’échantillon

2.1.1. Le prélèvement de sol du champ doit suivre les normes fondamentales utilisées pour le prélèvement de nématodes. Collecter de 0,5 à 1 kg de sol par échantillon dans soixante sites pour 0,3 ha à une profondeur de 10 à 20 cm (ou dans un tamis de 7 × 7 mètres). Si l’on soupçonne la présence de l’agent pathogène, accroître le nombre de points de collecte à 120 pour 0,3 ha. Maintenir les échantillons à une température de 12 à 15 °C avant le test. Prélever les boues issues de la transformation de pommes de terre et les boues d’épuration en collectant au total 1 kg dans des sites représentant le volume total de boues à tester. Bien mélanger chaque échantillon avant le test.

2.1.2. Disperser les sous-échantillons de 10 à 25 g de sol ou de boue avec un agitateur rotatif (250 tours/minute) dans un tampon d’extraction de 60 à 150 ml (appendice 4) pendant deux heures au maximum. Au besoin, l’ajout de 0,02 % de Tween-20 stérile et de 10 à 20 g de gravier stérile peut favoriser la dispersion.

2.1.3. Maintenir la suspension à 4 °C pendant le test.

2.2. Tests

Voir le diagramme et la description des tests dans les appendices concernés.

SECTION VI

PROTOCOLES OPTIMISÉS POUR DÉTECTER ET IDENTIFIER R. SOLANACEARUM

A. DIAGNOSTIC ET TESTS DE DÉTECTION

1. Test d’exsudation des tiges

La présence de R. solanacearum dans des tiges de pommes de terre, de tomates ou d’autres plantes hôtes flétries peut être mise en évidence en procédant au simple test de présomption suivant: sectionner la tige juste au-dessus du sol. Suspendre l’extrémité sectionnée dans un tube d’eau propre. Observer l’écoulement spontané et caractéristique de filets de productions bactériennes des faisceaux vasculaires coupés après quelques minutes.

2. Mise en évidence des granules de poly-β-hydroxybutyrate

1. Préparer, sur une lame de microscope, un frottis à partir de l’exsudat bactérien du tissu infecté ou préparer un frottis à partir d’une culture de 48 heures sur gélose au levure-peptone-glucose (YPGA) ou à la peptone (SPA) (appendice 2).

2. Préparer des frottis témoins positifs obtenus avec une souche du biovar 2 de R. solanacearum et, si cela est jugé utile, un frottis témoin négatif d’un PHB négatif connu.

3. Laisser sécher et passer rapidement le côté inférieur de chaque lame dans une flamme jusqu’à ce que le frottis soit fixé.

4. Colorer la préparation au bleu du Nil ou au noir du Soudan et observer au microscope de la manière décrite ci-après.

Test au bleu du Nil

a) Recouvrir chaque lame d’une solution aqueuse à 1 % de bleu du Nil A. Incuber dix minutes à 55 °C.

b) Égoutter la solution colorante. Laver rapidement sous un filet d’eau courante. Enlever l’eau excédentaire avec du papier absorbant.

c) Recouvrir le frottis dans une solution aqueuse d’acide acétique à 8 % et incuber une minute à température ambiante.

d) Laver rapidement sous un filet d’eau courante. Enlever l’eau excédentaire avec du papier absorbant.

e) Réhumecter en déposant une goutte d’eau et recouvrir d’une lamelle.

f) Examiner le frottis coloré au microscope à épifluorescence sous un film d’huile de 450 nm, à un grossissement de 600 à 1 000, en utilisant un objectif à immersion dans l’huile ou dans l’eau.

g) Observer la fluorescence orange vif des granules de PHB. Faire également des observations en lumière normale afin de vérifier le caractère intracellulaire des granules; vérifier que la morphologie des cellules est caractéristique de R. solanacearum.

Test au noir du Soudan

a) Recouvrir chaque lame avec une solution de noir du Soudan B à 0,3 % dans de l’éthanol à 70 % et incuber dix minutes à température ambiante.

b) Égoutter la solution colorante et laver rapidement à l’eau courante, enlever l’eau excédentaire avec du papier absorbant.

c) Plonger rapidement les lames dans du xylol et sécher avec du papier absorbant. Attention, le xylol est un produit dangereux; prendre les précautions nécessaires et travailler sous une hotte de chimiste.

d) Recouvrir les lames dans une solution aqueuse de safranine à 0,5 % et laisser dix secondes à température ambiante. Attention, la safranine est un produit dangereux; prendre les précautions nécessaires et travailler sous une hotte de chimiste.

e) Laver sous un filet d’eau courante, sécher avec du papier absorbant et recouvrir d’une lamelle.

f) Examiner le frottis coloré au microscope à immersion sous un film d’huile, à un grossissement de 1 000, sous lumière transmise normale en utilisant un objectif à immersion dans l’huile.

g) Observer la coloration bleu noir des granules de PHB dans les cellules de R. solanacearum; les parois des cellules sont colorées en rose.

3. Tests de séro-agglutination

L’agglutination des cellules de R. solanacearum sur l’exsudat bactérien ou les extraits de tissus symptomatiques s’observe le mieux en utilisant des anticorps validés (voir appendice 3) étiquetés par des marqueurs colorés appropriés tels que les cellules de Staphylococcus aureus rouge ou des particules de latex colorées. En cas d’utilisation d’un matériel disponible dans le commerce (voir appendice 3), suivre les instructions des producteurs. Sinon, suivre la procédure suivante:

a) Mélanger les gouttes d’une suspension d’anticorps et d’exsudat bactérien marqués (environ 5 µl dans chaque cas) sur les fenêtres de lames de test multipuits.

b) Préparer des témoins positifs et négatifs en utilisant des suspensions de biovar 2 de R. solanacearum et une souche hétérologue.

c) Observer l’agglutination dans les échantillons positifs après avoir mélangé doucement pendant quinze secondes.

4. Isolement sélectif

4.1. Étalement sur milieu sélectif

NB: Avant d’utiliser cette méthode pour la première fois, réaliser des tests préliminaires pour garantir une détection reproductible des 103 à 104 unités formant des colonies de R. solanacearum par ml ajouté aux extraits des échantillons dont les tests antérieurs étaient négatifs.

Utiliser un milieu sélectif validé approprié, par exemple: SMSA (modifié par Elphinstone et al., 1996; voir appendice 2).

Il faut veiller également à différencier R. solanacearum des autres bactéries susceptibles de développer des colonies sur le milieu. En outre, les colonies de R. solanacearum peuvent présenter une morphologie atypique si les boîtes sont surpeuplées ou si des bactéries antagonistes sont également présentes. Lorsque l’on suspecte des effets de concurrence ou d’antagonisme, l’échantillon doit faire l’objet d’un nouveau test en utilisant un test différent.

La plus grande sensibilité de détection par cette méthode peut être attendue lorsqu’on utilise des extraits d’échantillons fraîchement préparés. Cependant, la méthode est également applicable pour une utilisation avec des extraits qui ont été stockés sous du glycérol entre –68 et –86 °C.

Comme témoins positifs, préparer des dilutions au dixième d’une suspension de 106 ufc/ml d’une souche virulente de biovar 2 de R. solanacearum (par exemple: NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pour éviter toute possibilité de contamination, préparer des témoins positifs de manière totalement séparée des échantillons à tester.

Pour chaque lot nouvellement préparé de milieu sélectif, il y a lieu de tester s’il convient pour la croissance de l’agent pathogène avant de l’utiliser pour tester des échantillons de routine.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

4.1.1. Effectuer le test avec une technique appropriée par dilution et étalement visant à garantir la dilution de toute population formant des colonies de saprophytes. Étaler 50-100 µl par boîte d’extrait d’échantillon et chaque dilution.

4.1.2. Incuber les boîtes à 28 °C. Relever les observations après 48 heures et ensuite quotidiennement pendant une durée allant jusqu’à six jours. Les colonies caractéristiques de R. solanacearum sur le milieu nutritif SMSA sont de couleur blanc laiteux, plates, irrégulières et fluides, et après trois jours d’incubation prennent une coloration rose à rouge sang au centre, présentant des stries internes ou des verticilles (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Des colonies atypiques de R. solanacearum se constituent parfois sur ce milieu. Elles peuvent être petites, entièrement rouges et non fluides ou seulement partiellement fluides et donc difficiles à distinguer des bactéries saprophytes formant des colonies.

4.1.3. Purifier les colonies supposées de R. solanacearum après étalement ou dilution et étalement sur un milieu nutritif général pour obtenir des colonies isolées (voir appendice 2).

4.1.4. Les cultures peuvent être stockées à court terme dans de l’eau stérile (pH 6-8, sans chlore) à température ambiante et dans l’obscurité ou à long terme dans un milieu cryoprotecteur approprié entre –68 et –86 °C ou lyophilisées.

4.1.5. Identifier les cultures supposées (voir section VI.B) et réaliser un test de pathogénicité (voir section VI.C).

Interprétation des résultats du test de dilution-étalement

Le test de dilution-étalement est négatif si aucune colonie bactérienne n’est apparue au bout de six jours ou si aucune colonie caractéristique de R. solanacearum n’est isolée, sous réserve qu’aucune inhibition ne soit soupçonnée en raison de la concurrence ou de l’antagonisme d’autres bactéries et que des colonies caractéristiques de R. solanacearum soient isolées à partir des témoins positifs.

Le test de dilution-étalement est positif si l’on peut isoler des colonies supposées de R. solanacearum.

4.2. Procédure d’enrichissement

Utiliser un milieu d’enrichissement validé tel que le bouillon nutritif modifié de Wilbrink (voir appendice 2).

Cette procédure peut être utilisée pour accroître sélectivement les populations de R. solanacearum dans des extraits d’échantillons et améliorer la sensibilité de détection. La procédure permet également la dilution des inhibiteurs de la réaction PCR (1:100). Il convient cependant de noter que l’enrichissement de R. solanacearum peut échouer en raison de la concurrence ou de l’antagonisme d’organismes saprophytes qui sont souvent enrichis simultanément. Par conséquent, l’isolement de R. solanacearum dans des bouillons de culture enrichis peut se révéler difficile. En outre, comme les populations de saprophytes sérologiquement proches peuvent être augmentées, l’utilisation d’anticorps monoclonaux spécifiques en lieu et place d’anticorps polyclonaux est recommandée en cas d’utilisation du test ELISA.

4.2.1. Pour l’enrichissement PCR, verser 100 µl d’extrait d’échantillon dans 10 ml de milieu nutritif liquide d’enrichissement (appendice 2) précédemment aliquoté dans des tubes ou des flacons exempts d’ADN. Pour l’enrichissement ELISA, des proportions plus importantes de milieu nutritif liquide peuvent être utilisées (par exemple: 100 µl dans 1,0 ml de milieu nutritif liquide d’enrichissement).

4.2.2. Incuber pendant soixante-douze heures entre 27 et 30 °C dans une culture agitée ou statique sans refermer hermétiquement les bouchons pour permettre l’aération.

4.2.3. Bien mélanger avant d’utiliser pour des tests ELISA ou PCR.

4.2.4. Traiter le milieu nutritif liquide d’enrichissement de la même manière que les échantillons dans les tests ci-dessus.

NB: Si une inhibition ou un enrichissement de R. solanacearum est prévu en raison de populations importantes de certaines bactéries saprophytes concurrentes, l’enrichissement d’extraits d’échantillons avant toute centrifugation ou autres actions de concentration peut donner de meilleurs résultats.

5. Test d’immunofluorescence

Principe

Compte tenu de sa capacité reconnue à atteindre les seuils requis, il est recommandé d’utiliser le test d’immunofluorescence comme principal test de dépistage.

Si le test d’immunofluorescence est utilisé comme principal test de dépistage et qu’il produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test d’isolement, un test PCR ou un test FISH à titre de test secondaire. Si le test d’immunofluorescence est utilisé comme test secondaire et qu’il produit un résultat positif, l’analyse doit être complétée par des tests supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

NB: Utiliser une source validée d’anticorps de R. solanacearum (voir site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Il est recommandé de déterminer le titre pour chaque nouveau lot d’anticorps. Le titre est défini comme la plus haute dilution à laquelle on obtient une réaction optimale lorsqu’on teste une suspension contenant entre 105 et 106 cellules/ml d’une souche homologue de R. solanacearum en utilisant un conjugué approprié d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), conformément aux recommandations du fabricant. Les antisérums polyclonaux validés ont tous un titre d’immunofluorescence d’au moins 1:2 000. Lors du test, les dilutions de travail des anticorps doivent être approximativement égales ou égales à celles du titre.

Le test doit être effectué sur des extraits d’échantillon fraîchement préparés. Le cas échéant, il peut être valablement pratiqué sur des extraits conservés en solution de glycérol à une température de –68 °C à –86 °C Le glycérol peut être séparé de l’échantillon par l’ajout de 1 ml de tampon concentré (voir appendice 4), recentrifugation pendant quinze minutes à 7 000 g et remise en suspension dans le même volume de tampon concentré. Cela est rarement nécessaire, particulièrement si les échantillons sont fixés aux lames par flambage.

Préparer des lames témoins positives distinctes d’une souche homologue ou de toute autre souche de référence de R. solanacearum, en suspension dans l’extrait de pomme de terre, comme indiqué à l’appendice 3B et, à titre facultatif, dans le tampon.

Du tissu naturellement infecté (conservé par lyophilisation ou congélation entre –16 et –24 °C) devrait, dans la mesure du possible, être utilisé à titre de témoin similaire sur la même lame.

Comme témoins négatifs, des aliquotes d’extraits d’échantillons qui ont donné précédemment des résultats négatifs aux tests de détection de R. solanacearum peuvent être utilisés.

Les matériels de contrôle normalisés positifs et négatifs disponibles pour une utilisation avec ce test sont énumérés à l’appendice 3.

Utiliser des lames pour microscope multipuits comportant de préférence dix fenêtres d’au moins 6 mm de diamètre.

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

5.1. Préparer les lames de test en utilisant l’une des méthodes suivantes

i) Extraits concentrés contenant relativement peu d’amidon: Déposer à la pipette un volume standard (15 µl est une quantité suffisante pour un diamètre de fenêtre de 6 mm — choisir une quantité plus importante pour les fenêtres de plus grand diamètre) d’une dilution au 1/100e d’extrait concentré de pomme de terre remis en suspension sur la première fenêtre. Ensuite, déposer à la pipette un volume similaire d’extrait concentré non dilué (1/1) sur les fenêtres restantes de la rangée. La deuxième rangée peut servir de double ou pour un deuxième échantillon, comme indiqué à la figure 1.

ii) Dans le cas des autres extraits concentrés: Préparer des dilutions décimales (1/10, 1/100) de l’extrait concentré remis en suspension dans le tampon concentré. Déposer à la pipette sur une rangée de fenêtres un volume standard (15 µl est une quantité suffisante pour un diamètre de fenêtre de 6 mm — choisir une quantité plus importante pour les fenêtres de plus grand diamètre) de l’extrait concentré remis en suspension et de chaque dilution. La deuxième rangée peut servir de double ou pour un deuxième échantillon, comme indiqué à la figure 2.

5.2. Laisser sécher les gouttelettes à température ambiante ou en chauffant à une température de 40 à 45 °C. Fixer les cellules bactériennes sur la lame en chauffant (quinze minutes à 60 °C), en passant à la flamme, avec de l’éthanol à 95 % ou suivant les instructions spécifiques des fournisseurs des anticorps.

Au besoin, les lames fixées peuvent alors être réfrigérées et stockées dans une boîte à dessiccation pendant le temps nécessaire (au maximum trois mois) avant un nouveau test.

5.3. Procédure du test d’immunofluorescence

i) Conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée au point 5.1.i): Préparer une série de dilutions au demi. Le premier puits devrait avoir 1/2 du titre (T/2), les autres 1/4 du titre (T/4), 1/2 du titre (T/2), le titre (T) et deux fois le titre (2T).

ii) Conformément à la méthode de préparation des lames de test indiquée au point 5.1.ii): Préparer la dilution de travail de l’anticorps dans un tampon pour immunofluorescence. La dilution de travail a un effet sur la spécificité.

Figure 1. Préparation de la lame de test conformément aux points 5.1.i) et 5.3.i)

Dilutions de l’extrait concentré remis en suspension 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Dilutions de l’extrait concentré remis en suspension (T = titre) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dilutions au demi de l’antisérum/anticorps Échantillon 1 1 2 3 4 5 Double de l’échantillon 1 ou échantillon 2 6 7 8 9 10





Figure 2. Préparation de la lame de test conformément aux points 5.1.ii) et 5.3.ii)

Dilution de travail de l’antisérum/anticorps 1/1 1/10 1/100 vide vide  Dilution décimale de l’extrait concentré remis en suspension Échantillon 1 1 2 3 4 5 Double de l’échantillon 1 ou échantillon 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Disposer les lames sur du papier absorbant humide. Couvrir complètement chaque fenêtre de test avec une ou des dilutions d’anticorps. La quantité d’anticorps appliquée sur chaque fenêtre doit être au moins équivalente à la quantité d’extrait appliquée.

La procédure suivante devrait être mise en œuvre en l’absence d’instructions spécifiques des fournisseurs des anticorps:

5.3.2. Incuber les lames sur du papier humide sous un couvercle pendant trente minutes à la température ambiante (18-25 °C).

5.3.3. Éliminer les gouttelettes de chaque lame et rincer soigneusement dans un tampon pour immunofluorescence. Laver pendant cinq minutes dans un tampon IF-Tween (appendice 4), puis dans un tampon pour IF. Éviter toute vaporisation ou débordement qui pourrait entraîner une contamination croisée. Éliminer soigneusement l’humidité excédentaire avec un buvard.

5.3.4. Poser les lames sur du papier humide. Couvrir les fenêtres de test avec du conjugué FITC à la dilution utilisée lors du titrage. La quantité de conjugué appliquée sur les fenêtres doit être identique à la quantité d’anticorps utilisée.

5.3.5. Incuber les lames sur du papier humide, sous un couvercle, pendant trente minutes à la température ambiante (18-25 °C).

5.3.6. Éliminer les gouttelettes de conjugué de la lame. Rincer et laver comme indiqué ci-dessus (5.3.3).

Enlever soigneusement l’humidité excédentaire.

5.3.7. Déposer à la pipette 5 à 10 µl d’un tampon phosphaté 0,1 M au glycérol (appendice 4) ou un support antidécoloration commercial sur chaque fenêtre et recouvrir d’une lamelle.

5.4. Lecture du test d’immunofluorescence

5.4.1. Examiner les lames de test avec un microscope équipé d’une source lumineuse épifluorescente et de filtres adaptés pour travailler avec l’isothiocyanate de fluorescéine, sous l’huile ou l’eau, à un grossissement de 500 à 1 000. Examiner les fenêtres selon deux diamètres perpendiculaires et en suivant le pourtour. Pour les échantillons ne présentant pas ou ne présentant qu’un faible nombre de cellules, observer au moins quarante champs microscopiques.

Commencer par contrôler la lame témoin positif. Les cellules doivent présenter une fluorescence vive et être complètement colorées au titre d’anticorps ou à la dilution de travail déterminés. Le test IF (section VI.A.5) doit être recommencé si la coloration n’est pas bonne.

5.4.2. Rechercher la présence de cellules présentant une fluorescence vive, ayant une morphologie caractéristique de R. solanacearum dans les fenêtres de test des lames (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensité de fluorescence doit être équivalente à celle de la souche témoin positif pour une dilution d’anticorps identique. Les cellules dont la coloration est incomplète ou dont la fluorescence est faible ne doivent pas être prises en considération.

En cas de soupçon d’une contamination, le test doit être recommencé. Ce peut être le cas si toutes les lames d’un lot montrent des cellules positives en raison de la contamination du tampon ou si des cellules positives sont isolées (hors des fenêtres) sur le milieu de montage de la lame.

5.4.3. II existe un certain nombre de problèmes inhérents à la spécificité du test d’immunofluorescence. Des populations de cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et de bactéries saprophytes provoquant des réactions croisées d’une taille et d’une morphologie similaires à R. solanacearum sont susceptibles d’apparaître dans des extraits concentrés de talons de pommes de terre et dans des segments de tiges.

5.4.4. Seules les cellules fluorescentes dont la taille et la morphologie sont caractéristiques au titre ou à la dilution de travail des anticorps visés au point 5.3 doivent être prises en considération.

5.4.5. Interprétation du test IF:

i) Si l’échantillon contient des cellules avec une fluorescence vive et une morphologie caractéristique, estimer le nombre moyen de cellules typiques par champ microscopique et calculer le nombre de cellules typiques par ml d’extrait concentré remis en suspension (appendice 5). La lecture du test d’immunofluorescence est considérée comme positive pour les échantillons contenant au moins 5 × 103 cellules typiques par ml d’extrait concentré remis en suspension. L’échantillon est considéré comme potentiellement contaminé, et un nouveau test est requis.

ii) La lecture du test d’immunofluorescence est considérée comme négative pour les échantillons contenant moins de 5 × 103 cellules par ml d’extrait concentré remis en suspension, et l’échantillon est considéré comme négatif. De nouveaux tests ne sont pas obligatoires.

6. Tests PCR

Principes

Si le test PCR est utilisé comme principal test de dépistage et produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test d’isolement ou un test IF à titre de deuxième test de dépistage obligatoire. Si le test PCR est utilisé comme test secondaire et produit un résultat positif, le diagnostic doit être complété par des tests supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

Une exploitation complète de cette méthode en tant que test de dépistage principal n’est recommandée que quand une expertise spécialisée a été acquise en la matière.

NB: Les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre une détection reproductible de 103 à 104 cellules/ml de R. solanacearum ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs. Des expériences d’optimisation peuvent se révéler nécessaires pour obtenir des niveaux maximaux de sensibilité et de spécificité dans tous les laboratoires.

Utiliser des réactifs et des protocoles PCR validés (voir appendice 6). Sélectionner de préférence une méthode avec contrôle interne.

Prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l’échantillon avec de l’ADN cible. Le test PCR devrait être réalisé par des techniciens expérimentés dans des laboratoires de biologie moléculaire spécialisés, afin de réduire autant que possible la possibilité de contamination avec de l’ADN cible.

Des témoins négatifs (pour les procédures d’extraction d’ADN et PCR) devraient toujours être traités comme échantillon final dans la procédure, afin de faire apparaître si un transfert d’ADN est intervenu.

Les témoins négatifs suivants devraient être inclus dans le test PCR:

— Extrait d’échantillon ayant produit précédemment des résultats négatifs pour R. solanacearum

— Tampons témoins utilisés pour extraire la bactérie et l’ADN de l’échantillon

— Mélange réactif pour la PCR

Les témoins positifs suivants devraient être inclus:

— Des aliquotes d’extraits concentrés remis en suspension auxquels R. solanacearum a été ajouté (préparation: voir appendice 3 B).

— Une suspension de 106 cellules/ml d’un isolat virulent de R. solanacearum dans l’eau (exemple: NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; voir appendice 3B).

— Si possible, utiliser aussi de l’ADN extrait d’échantillons témoins positifs dans le test PCR.

Pour éviter une contamination potentielle, préparer les témoins positifs dans un environnement distinct de celui des échantillons à tester.

Les extraits d’échantillons doivent autant que possible être exempts de terre. Dans certains cas, il pourrait donc être recommandable de préparer des extraits à partir de pommes de terre lavées s’il est prévu d’utiliser des protocoles PCR.

Les matériels de contrôle normalisés positifs et négatifs disponibles pour une utilisation avec ce test sont énumérés à l’appendice 3.

6.1. Méthodes de purification de l’ADN

Utiliser des échantillons de contrôle positifs et négatifs selon la méthode décrite ci-dessus (voir appendice 3)

Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons.

Il existe toute une série de méthodes pour purifier l’ADN cible à partir de substrats d’échantillons complexes, ce qui élimine les inhibiteurs de la PCR et d’autres réactions enzymatiques et concentre l’ADN cible dans l’extrait d’échantillon. La méthode suivante a été optimalisée pour une utilisation avec les méthodes PCR validées indiquées à l’appendice 6.

a) Méthode de Pastrik (2000)

1) Déposer à la pipette 220 µl de tampon lyse [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.

2) Ajouter 100 µl d’extrait d’échantillon et le placer dans un bloc chauffant ou au bain-marie à 95 °C pendant dix minutes.

3) Déposer le tube sur de la glace pendant cinq minutes.

4) Ajouter 80 µl de solution concentrée de lysozyme (50 mg de lysozyme par ml dans 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) et incuber à 37 °C pendant trente minutes.

5) Ajouter 220 µl de solution A d’Easy DNA® (Invitrogen), bien mélanger en homogénéisant au vortex et incuber à 65 °C pendant trente minutes.

6) Ajouter 100 µl de solution B d’Easy DNA® (Invitrogen), homogénéiser vigoureusement au vortex jusqu’à ce que le précipité circule librement dans le tube et que l’échantillon soit uniformément visqueux.

7) Ajouter 500 µl de chloroforme et homogénéiser au vortex jusqu’au moment où la viscosité diminue et où le mélange est homogène.

8) Centrifuger à 15 000 g pendant vingt minutes à 4 °C pour séparer les phases et former l’interphase.

9) Verser la phase supérieure dans un nouveau tube Eppendorf.

10) Ajouter 1 ml d’éthanol à 100 % (–20 °C), homogénéiser brièvement au vortex et incuber sur de la glace pendant dix minutes.

11) Centrifuger à 15 000 g pendant vingt minutes à 4 °C et éliminer l’éthanol de l’extrait concentré.

12) Ajouter 500 µl d’éthanol à 80 % (–20 °C) et mélanger en retournant le tube.

13) Centrifuger à 15 000 g pendant dix minutes à 4 °C, conserver l’extrait concentré et éliminer l’éthanol.

14) Laisser sécher l’extrait concentré à l’air libre ou dans un speedvac ADN.

15) Remettre en suspension l’extrait concentré dans 100 µl d’eau ultrapure stérile et le laisser à température ambiante pendant au moins vingt minutes.

16) Entreposer à –20 °C jusqu’au moment où l’extrait est requis pour la PCR.

17) Isoler tout précipité blanc par centrifugation et utiliser 5 µl de liquide surnageant contenant l’ADN pour la PCR.

b) Autres méthodes

D’autres méthodes d’extraction de l’ADN, par exemple: Qiagen DNeasy Plant Kit, pourraient être appliquées, à condition qu’elles soient d’une efficacité équivalente pour purifier l’ADN d’échantillons témoins contenant 103 à 104 cellules pathogènes par ml.

6.2. PCR

6.2.1. Préparer les matrices de test et de contrôle pour la PCR suivant les protocoles validés (section VI.A.6). Préparer une dilution au dixième de l’extrait d’échantillon d’ADN (1:10 dans de l’eau ultrapure).

6.2.2. Préparer le mélange réactif approprié destiné à la PCR dans un environnement exempt de contamination suivant les protocoles publiés (appendice 6). Lorsque c’est possible, il est recommandé d’utiliser un protocole PCR multiplex qui intègre également un contrôle interne de la PCR.

6.2.3. Ajouter 2 à 5 µl d’extrait d’ADN par 25 µl de milieu réactif PCR dans des tubes PCR stériles suivant les protocoles PCR (voir appendice 6).

6.2.4. Incorporer un échantillon témoin négatif ne contenant que le mélange réactif pour PCR et ajouter la même source d’eau ultrapure que celle utilisée dans le mélange pour PCR à la place de l’échantillon.

6.2.5. Placer les tubes dans le même thermocycleur que celui utilisé lors du test préliminaire et lancer le programme PCR optimisé comme il convient (appendice 6).

6.3. Analyse du produit de la réaction PCR

6.3.1. Décoder les amplimères PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Mettre sous une tension de 5 à 8 V/cm une quantité d’au moins 12 µl de mélange réactif d’ADN amplifié provenant de chaque échantillon associés à 3 µl de tampon de lest (appendice 6) sur des gels d’agarose à 2,0 % dans un tampon tris-acétate-EDTA (TAE) (appendice 6). Utiliser un marqueur d’ADN approprié, comme le “100 bp ladder”.

6.3.2. Pour révéler les bandes d’ADN, utiliser la coloration au bromure d’éthidium (à 0,5 mg/l) pendant une durée de trente à soixante minutes, en prenant les précautions qui s’imposent pour la manipulation de cet agent mutagène.

6.3.3. Dans le cas des produits PCR amplifiés présentant la taille attendue (appendice 6), visualiser le gel coloré par diaphanoscopie sous lumière ultraviolette ondes courtes (λ = 302 nm) et noter les résultats.

6.3.4. Pour tous les nouveaux cas ou constatations, vérifier l’authenticité de l’amplimère PCR en pratiquant une analyse de restriction enzymatique sur un échantillon de l’ADN amplifié restant. À cet effet, faire incuber à température optimale sur une durée optimale en employant un enzyme et un tampon appropriés (voir appendice 6). Décoder les fragments digérés par électrophorèse sur gel d’agarose selon la méthode indiquée plus haut et visualiser par diaphanoscopie sous UV la disposition caractéristique des fragments après restriction enzymatique et coloration au bromure d’éthidium. Comparer ensuite avec les témoins positifs pré et post-digestion.

Interprétation du résultat du test PCR

Le test PCR est négatif si l’amplimère PCR spécifique de R. solanacearum de la taille attendue n’est pas détecté pour l’échantillon concerné, mais bien pour l’ensemble des échantillons témoins positifs (dans le cas d’une PCR multiplex avec des amorces de contrôle interne spécifiques à la plante: un second produit PCR de la taille attendue doit être amplifié avec l’échantillon concerné).

Le test PCR est positif si l’amplimère PCR spécifique de R. solanacearum de la taille et du type de restriction (lorsqu’il est requis) attendus est détecté, à condition qu’il ne soit pas amplifié par l’un des échantillons témoins négatifs. Une confirmation fiable du résultat positif peut également être obtenue en recommençant le test avec une deuxième série d’amorces PCR (appendice 6).

NB: Une inhibition de la PCR peut être soupçonnée dans le cas où l’amplimère prévu est obtenu de l’échantillon témoin positif contenant R. solanacearum dans de l’eau et où des résultats négatifs sont obtenus de témoins positifs avec R. solanacearum dans de l’extrait de pomme de terre. Dans les protocoles PCR multiplex avec contrôle interne de la PCR, l’inhibition de la réaction est indiquée quand aucun des deux amplimères n’est obtenu.

La contamination peut être suspectée si l’amplimère attendu est obtenu d’un ou de plusieurs témoins négatifs.

7. Test FISH

Principe

Si le test FISH est utilisé comme principal test de dépistage et produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test d’isolement ou un test IF à titre de deuxième test de dépistage obligatoire. Si le test IF est utilisé comme test secondaire et produit un résultat positif, l’analyse doit être complétée par des tests supplémentaires, comme indiqué dans le diagramme fonctionnel.

NB: Utiliser des oligosondes validées spécifiques de R. solanacearum (voir appendice 7). Les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre une détection reproductible de 103 à 104 cellules/ml de R. solanacearum ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs.

Il est préférable d’appliquer la procédure décrite ci-après à des extraits d’échantillon fraîchement préparés, mais elle peut également fonctionner avec des extraits d’échantillon conservés en solution de glycérol à des températures de –16 °C à –24 °C ou de –68 °C à –86 °C.

À titre de témoins négatifs, utiliser des aliquotes d’extraits d’échantillon ayant préalablement produit un résultat négatif lors de tests de recherche de R. solanacearum.

À titre de témoins positifs, préparer des suspensions contenant entre 105 et 106 cellules/ml du biovar 2 de R. solanacearum (par exemple: la souche NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, voir appendice 3) dans un tampon phosphaté 0,01 M (PB), à partir d’une culture de trois à cinq jours. Préparer des lames témoins positifs séparées de la souche homologue ou de toute autre souche de référence de R. solanacearum, en suspension dans l’extrait de pomme de terre, comme indiqué à l’appendice 3 B.

L’utilisation d’une oligosonde eubactérienne marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) permet de contrôler le processus d’hybridation en colorant toutes les eubactéries présentes dans l’échantillon.

Les matériaux témoins positifs et négatifs normalisés disponibles pour ce test sont énumérés à l’appendice 3, point A.

Tester le matériau témoin de la même façon que les échantillons.

7.1. Fixation de l’extrait de pomme de terre

Le protocole exposé ci-après est fondé sur Wullings et al. (1998).

7.1.1. Préparer la solution de fixation (voir appendice 7).

7.1.2. Introduire à la pipette 100 µl de chaque extrait d’échantillon dans un tube Eppendorf et centrifuger pendant sept minutes à 7 000 g.

7.1.3. Éliminer le surnageant et dissoudre l’extrait concentré dans 200 µl de fixatif préparé moins de vingt-quatre heures auparavant. Homogénéiser au vortex et laisser incuber pendant une heure au réfrigérateur.

7.1.4. Centrifuger pendant sept minutes à 7 000 g, éliminer le surnageant et remettre l’extrait concentré en suspension dans 75 µl de PB 0,01 M (voir appendice 7).

7.1.5. Déposer 16 µl des suspensions fixées sur une lame multitest propre comme indiqué à la figure 7.1. Sur chaque lame, appliquer deux échantillons différents, non dilués, et en diluer 10 µl à 1:100 (dans un tampon phosphaté 0,01 M). Le reste de la solution d’échantillon (49 µl) peut être conservé à –20 °C après addition d’un volume d’éthanol à 96 %. S’il y a lieu de réitérer le test FISH, éliminer l’éthanol par centrifugation et ajouter un volume équivalent de tampon phosphaté 0,01 M (mélanger au vortex).

Figure 7.1. Disposition d’une lame pour le test FISH

Échant. 1 Témoin Témoin Témoin Échant. 2 fenêtre 1 fenêtre 2 fenêtre 3 fenêtre 4 fenêtre 5 Échant. 1 Témoin Témoin Témoin Échant. 2 fenêtre 6 fenêtre 7 fenêtre 8 fenêtre 9 fenêtre 10 Lamelle 1 Lamelle 2

7.1.6. Sécher les lames à l’air (ou dans un séchoir, à 37 °C), puis les fixer par flambage.

Il est possible d’interrompre la procédure à ce stade et d’entamer l’hybridation le lendemain. Les lames doivent être entreposées à l’abri de la poussière, dans un lieu sec et à température ambiante.

7.2. Hybridation

7.2.1. Déshydrater les cellules par bains successifs d’éthanol à 50 %, 80 % et 96 % d’une minute chacun. Disposer les lames sur un support et les laisser sécher à l’air libre.

7.2.2. Préparer une chambre d’incubation humide en tapissant le fond d’une boîte hermétique de papier absorbant ou de papier filtre imprégné d’hybmix 1X (voir appendice 7). Faire préincuber la boîte pendant au moins dix minutes dans le four à hybridation à une température de 45 °C.

7.2.3. Verser 10 µl de solution d’hybridation (appendice 7) sur huit fenêtres (fenêtres 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 et 10; voir fig. 7.1) de chaque lame en laissant vides les deux fenêtres du centre (3 et 8).

7.2.4. Couvrir de lamelles (24 × 24 mm) la première et les quatre dernières fenêtres en prenant soin de ne pas emprisonner d’air. Placer les lames dans la chambre humide préchauffée et les laisser pendant cinq heures dans le four à 45 °C, dans l’obscurité, pour permettre le déroulement de l’hybridation.

7.2.5. Préparer trois béchers contenant 1 l d’eau Milli Q (biologie moléculaire), 1 l d’hybmix 1X [334 ml d’hybmix 3X et 666 ml d’eau Milli Q (biologie moléculaire)] et 1 l d’hybmix 1/8X [(42 ml d’hybmix 3X et 958 ml d’eau Milli Q (biologie moléculaire)]. Faire préincuber chacun de ces béchers au bain-marie à 45 °C.

7.2.6. Débarrasser les lames des lamelles et les placer sur un porte-lames.

7.2.7. Éliminer l’excédent d’échantillon en incubant pendant quinze minutes à 45 °C dans le bécher contenant l’hybmix 1X.

7.2.8. Transférer le porte-lames dans une solution de lavage à l’hybmix 1/8X et laisser incuber pendant quinze minutes supplémentaires.

7.2.9. Plonger brièvement les lames dans un bain d’eau Milli Q et les placer sur un papier filtre. Éliminer l’humidité excédentaire en disposant doucement du papier filtre sur la surface à sécher. Verser à la pipette sur chaque fenêtre entre 5 et 10 µl de solution support anti-décoloration (par exemple: Vectashield de Vecta Laboratories, CA, USA, ou équivalent) et couvrir toute la surface de la lame d’une grande lamelle (24 × 60 mm).

7.3. Lecture du test FISH

7.3.1. Procéder immédiatement à l’observation des lames au moyen d’un microscope à épifluorescence, sous un film d’huile et à un grossissement de 630 à 1 000 ×. Avec un filtre adapté à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les cellules eubactériennes (y compris la plupart des cellules gram-négatives) présentes dans l’échantillon prennent une coloration verte fluorescente. Avec un filtre adapté au tétraméthylrhodamine-5-isothiocyanate, les cellules de R. solanacearum marquées au Cy3 apparaissent en rouge fluorescent. Comparer la morphologie des cellules avec celle des témoins positifs. Les cellules doivent être entièrement colorées et présenter une fluorescence vive. Le test FISH (section VI.A.7) doit être recommencé si la coloration n’est pas bonne. Examiner les fenêtres selon deux diamètres perpendiculaires et en suivant le pourtour. Pour les échantillons ne présentant pas ou ne présentant qu’un faible nombre de cellules, observer au moins quarante champs microscopiques.

7.3.2. Rechercher la présence de cellules présentant une fluorescence vive, ayant une morphologie caractéristique de R. solanacearum dans les fenêtres de test des lames (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensité de fluorescence doit être équivalente à celle de la souche témoin positif ou doit être meilleure. Les cellules dont la coloration est incomplète ou qui présentent une faible fluorescence ne doivent pas être prises en considération.

7.3.3. Au moindre soupçon de contamination, le test doit être recommencé. Ce peut être le cas si toutes les lames d’un lot montrent des cellules positives en raison de la contamination du tampon, ou si des cellules positives sont isolées (hors des fenêtres) sur le milieu de montage de la lame.

7.3.4. II existe un certain nombre de problèmes inhérents à la spécificité du test FISH. Des populations de cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et de bactéries saprophytes provoquant des réactions croisées d’une taille et d’une morphologie similaires à R. solanacearum sont susceptibles d’apparaître dans des extraits concentrés de talons de pommes de terre et des segments de tiges, même si cela est beaucoup moins fréquent que dans le test IF.

7.3.5. Seules les cellules fluorescentes dont la taille et la morphologie sont caractéristiques doivent être prises en considération.

7.3.6. Interprétation du résultat du test FISH

i) Des résultats valides du test FISH sont obtenus si des cellules présentant une fluorescence vive de couleur verte de la taille et de la morphologie caractéristiques de R. solanacearum sont observées en utilisant le filtre FITC et des cellules présentant une fluorescence vive de couleur rouge en utilisant le filtre rhodamine dans tous les témoins positifs mais dans aucun témoin négatif. Si l’échantillon contient des cellules avec une fluorescence vive et une morphologie caractéristique, estimer le nombre moyen de cellules typiques par champ microscopique et calculer le nombre de cellules typiques par ml d’extrait concentré remis en suspension (appendice 4). Les échantillons contenant au moins 5 × 103 cellules typiques par ml d’extrait concentré remis en suspension sont considérés comme potentiellement contaminés. Il convient de poursuivre les tests. Les échantillons contenant moins de 5 × 103 cellules typiques par ml d’extrait concentré remis en suspension sont considérés comme négatifs.

ii) Le test FISH est négatif si des cellules présentant une fluorescence vive de couleur rouge, de la taille et de la morphologie caractéristiques de R. solanacearum, ne sont pas observées en utilisant le filtre rhodamine, pour autant que des cellules présentant une fluorescence vive de couleur rouge soient observées dans les préparations de témoins positifs lors de l’utilisation du filtre rhodamine.

8. Tests ELISA

Principe

ELISA ne peut être utilisé que comme un test facultatif en plus des tests IF, PCR ou FISH en raison de sa sensibilité relativement faible. Lorsque la méthode DAS-ELISA est employée, l’enrichissement et l’utilisation d’anticorps monoclonaux sont obligatoires (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’enrichissement des échantillons avant l’utilisation d’ELISA peut être utile afin d’accroître la sensibilité du test, mais il peut échouer en raison de la concurrence d’autres organismes dans l’échantillon.

NB: Utiliser une source validée d’anticorps de R. solanacearum (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Il est recommandé de déterminer le titre pour chaque nouveau lot d’anticorps. Le titre est défini comme la plus haute dilution à laquelle on obtient une réaction optimale lorsqu’on teste une suspension contenant entre 105 et 106 cellules/ml de la souche homologue de R. solanacearum en utilisant des conjugués d’anticorps secondaires appropriés, conformément aux recommandations du fabricant. Pendant le test, la dilution de travail des anticorps doit être approximativement égale ou égale à celle du titre de la formule commerciale.

Déterminer le titre des anticorps sur une suspension de 105 à 106 cellules/ml de la souche homologue de R. solanacearum.

Inclure un extrait d’échantillon ayant donné précédemment des résultats négatifs pour R. solanacearum et une suspension d’une bactérie ne provoquant pas une réaction croisée dans un tampon au phosphate (PBS) comme témoins négatifs.

Comme témoin positif, utiliser des aliquotes d’extraits d’échantillons qui ont donné précédemment des résultats négatifs, mélangées avec 103 à 104 cellules/ml du biovar 2 de R. solanacearum (par exemple: la souche NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, voir appendices 2 A et B). Pour comparer les résultats de chaque boîte, utiliser une suspension standard de 105 à 106 cellules/ml dans du PBS de R. solanacearum. Faire en sorte que les témoins positifs soient bien séparés sur la plaque de microtitrage de l’échantillon ou des échantillons faisant l’objet du test.

Les matériaux témoins positifs et négatifs normalisés disponibles pour une utilisation avec ce test sont énumérés à l’appendice 3, point A.

Tester le matériau témoin de la même façon que les échantillons.

Deux protocoles ELISA ont été validés:

a) ELISA indirect (Robinson-Smith et al., 1995)

1) Utiliser des aliquotes de 100-200 µl d’extrait d’échantillon. (Chauffer à 100 °C pendant quatre minutes au bain-marie ou dans un bloc chauffant peut réduire des résultats non spécifiques dans certains cas).

2) Ajouter un volume identique de tampon concentré deux fois (appendice 4) et homogénéiser au vortex.

3) Déposer des aliquotes de 100 µl sur au moins deux puits de la plaque de microtitrage (par exemple: Nunc-Polysorp ou équivalent) et incuber une heure à 37 °C ou une nuit à 4 °C.

4) Éliminer les extraits des puits. Laver les puits à trois reprises au PBS-Tween (appendice 4) en laissant la dernière solution de lavage dans les puits pendant au moins cinq minutes.

5) Préparer la dilution appropriée d’anticorps anti-R. solanacearum dans le tampon de saturation (appendice 4). Pour les anticorps commerciaux validés, utiliser les dilutions recommandées (habituellement deux fois plus concentrées que le titre).

6) Ajouter 100 µl à chaque puits et incuber pendant une heure à 37 °C.

7) Éliminer la solution d’anticorps des puits et laver comme indiqué auparavant (point 4).

8) Préparer la dilution appropriée de conjugués secondaires d’anticorps et de phosphatase alcaline dans le tampon de saturation. Ajouter 100 µl à chaque puits et incuber pendant une heure à 37 °C.

9) Éliminer le conjugué d’anticorps des puits et laver comme indiqué auparavant (point 4).

10) Ajouter 100 µl de solution du substrat de la phosphatase alcaline (appendice 4) à chaque puits. Incuber dans l’obscurité à température ambiante et mesurer l’absorbance à 405 nm à intervalles réguliers dans un délai de quatre-vingt-dix minutes.

b) DAS-ELISA

1) Préparer la dilution appropriée d’immunoglobulines polyclonales anti-R. solanacearum dans le tampon concentré de pH 9,6 (appendice 4). Ajouter 200 µl à chaque puits. Incuber à 37 °C pendant quatre à cinq heures ou à 4 °C pendant seize heures.

2) Laver les puits trois fois au PBS-Tween (appendice 4). Ajouter 190 µl d’extrait d’échantillon à deux puits au moins. Ajouter également des témoins positifs et négatifs à deux puits par boîte. Incuber pendant seize heures à 4 °C.

3) Laver les puits trois fois au PBS-Tween (appendice 4).

4) Préparer une dilution appropriée d’anticorps monoclonaux spécifiques de R. solanacearum dans du PBS (appendice 4) contenant également 0,5 % de séralbumine bovine (BSA) et ajouter 190 µl à chaque puits. Incuber à 37 °C pendant deux heures.

5) Laver les puits trois fois au PBS-Tween (appendice 4).

6) Préparer une dilution appropriée d’immunoglobulines antisouris conjuguées à de la phosphatase alcaline dans du PBS. Ajouter 190 µl à chaque puits. Incuber à 37 °C pendant deux heures.

7) Laver les puits trois fois au PBS-Tween (appendice 4).

8) Préparer une solution du substrat de la phosphatase alcaline contenant 1 mg de p-nitrophényl phosphate par ml de substrat tamponné (appendice 4). Ajouter 200 µl à chaque puits. Incuber dans l’obscurité à température ambiante et mesurer l’absorbance à 40 nm à intervalles réguliers dans un délai de quatre-vingt-dix minutes.

Interprétation des résultats des tests ELISA

Le test ELISA est négatif si la densité optique (DO) moyenne des puits du double de l’échantillon est inférieure au double de celle du puits du témoin de l’extrait d’échantillon négatif, pour autant que la DO pour les témoins positifs soit toujours supérieure à 1,0 (après quatre-vingt-dix minutes d’incubation avec le substrat) et soit supérieure à deux fois la DO obtenue pour les extraits d’échantillons négatifs.

Le test ELISA est positif si la densité optique (DO) moyenne des puits du double de l’échantillon est supérieure au double de celle du puits de l’extrait d’échantillon négatif, pour autant que la DO pour tous les puits des témoins négatifs soit inférieure à deux fois la DO obtenue dans les puits des témoins positifs.

Une lecture ELISA négative dans les puits des témoins positifs indique que le test n’a pas été réalisé correctement ou qu’il a été inhibé. Une lecture ELISA positive dans les puits des témoins négatifs indique une contamination croisée ou une liaison d’anticorps non spécifique.

9. Test biologique

NB: Les tests préliminaires réalisés suivant cette méthode doivent permettre une détection reproductible de 103 à 104 unités formant des colonies de R. solanacearum par ml ajoutées aux extraits d’échantillons ayant donné antérieurement des résultats négatifs (préparation: voir appendice 3).

Le degré de sensibilité le plus élevé pour la détection peut être attendu en utilisant un extrait d’échantillon fraîchement préparé et dans des conditions de croissance optimales. Toutefois, la méthode peut être appliquée avec succès aux extraits qui ont été entreposés dans du glycérol entre –68 et –86 °C.

Le protocole suivant est fondé sur celui de Janse (1988):

9.1. Utiliser dix plantes tests d’un cultivar de tomate sensible (par exemple: Moneymaker ou cultivar d’une sensibilité équivalente déterminée par le laboratoire d’essai) au stade de la troisième vraie feuille de chaque échantillon. Pour les détails de la culture, voir appendice 8. Il est également possible d’utiliser des aubergines (par exemple: Black Beauty ou cultivars d’une sensibilité équivalente) en ne choisissant que des plants au stade de la deuxième ou troisième feuille jusqu’au développement complet de la troisième vraie feuille. Cependant, il est apparu que les symptômes sont moins graves et se développent plus lentement sur les aubergines. Si possible, il est donc recommandé d’utiliser des plantules de tomates.

Répartir 100 µl d’extrait entre les plantes tests.

9.2.1. Inoculation par injection

Avec une seringue munie d’une aiguille hypodermique (pas moins de 23G), pratiquer l’inoculation dans les tiges de la plante juste au-dessus des cotylédons. Répartir l’échantillon entre les plantes tests.

9.2.2. Inoculation par incision

Tenir la plante entre deux doigts et déposer à la pipette sur la tige, entre les cotylédons et la première feuille, une goutte (environ 5 à 10 µl) d’extrait concentré en suspension.

À l’aide d’un scalpel stérile, pratiquer, en partant de la goutte d’extrait concentré, une incision diagonale d’une longueur de 1,0 cm et d’une profondeur égale approximativement aux deux tiers de l’épaisseur de la tige.

Refermer l’incision avec de la vaseline stérile au moyen d’une seringue.

9.3. Inoculer par la même technique cinq plantules avec une suspension aqueuse de 105 à 106 cellules/ml préparée à partir d’une culture de quarante-huit heures d’une souche virulente du biovar 2 de R. solanacearum comme témoin positif et avec un tampon concentré (appendice 4) comme témoin négatif. Séparer les plantes témoins positifs et négatifs des autres plantes pour éviter des contaminations croisées.

9.4. Cultiver les plantes tests dans des installations de quarantaine pendant une durée allant jusqu’à quatre semaines à 25-30 °C et dans une humidité relative élevée en assurant un arrosage approprié pour prévenir un engorgement hydrique ou un flétrissement par manque d’eau. Pour éviter une contamination, incuber les plantes témoins positifs et négatifs sur des bancs nettement séparés dans une serre ou une chambre de culture ou, au cas où l’espace serait limité, veiller à une stricte séparation entre les traitements. Si les plantes de différents échantillons doivent incuber à proximité les unes des autres, prévoir une séparation entre elles avec des écrans appropriés. Lors de la fertilisation, de l’arrosage, de l’inspection ou de toute autre manipulation, veiller soigneusement à éviter une contamination croisée. Il est essentiel de maintenir les serres et chambres de culture exemptes d’insectes étant donné qu’ils peuvent transmettre la bactérie d’échantillon à échantillon.

Observer l’apparition des symptômes du flétrissement: épinastie, chlorose et/ou rabougrissement.

9.5. Isoler les plantes infectées (section II.3) et identifier les cultures purifiées de R. solanacearum supposé (section VI. B).

9.6. Si aucun symptôme n’est observé après trois semaines, effectuer un IF/PCR/isolement sur un échantillon composite de morceaux de tiges d'un cm provenant de chaque plante test et prélevés au-dessus du point d’inoculation. Si le test est positif, effectuer un test par dilution et étalement (section 4.1).

9.7. Identifier toute culture purifiée de R. solanacearum supposé (section VI. B).

Interprétation des résultats du test biologique

Des résultats valides du test biologique sont obtenus lorsque les plantes témoins positifs présentent des symptômes typiques, les bactéries peuvent être isolées une nouvelle fois sur ces plantes, et aucun symptôme n’est observé sur les témoins négatifs.

Le test biologique est négatif si les plantes tests ne sont pas infectées par R. solanacearum et sous réserve que R. solanacearum soit détecté sur les témoins positifs.

Le test biologique est positif si les plantes tests sont infectées par R. solanacearum.

B. TESTS D’IDENTIFICATION

Identifier des cultures pures supposées de R. solanacearum en utilisant au moins deux des tests suivants fondés sur des principes biologiques différents.

Inclure des souches de référence connues, le cas échéant, pour chaque test réalisé (voir appendice 3).

1. Tests d’identification nutritionnels et enzymatiques

Déterminer les caractéristiques phénotypiques suivantes, systématiquement présentes ou absentes chez R. solanacearum, suivant les méthodes de Lelliott et Stead (1987), Klement et al. (1990), et Schaad (2001).

Test Résultats attendus Production de pigments fluorescents – Inclusions de poly-β-hydroxybutyrate + Test d’oxydation/fermentation (O/F) O+/F– Activité de la catalase + Test de l’oxydase de Kovac + Réduction du nitrate + Utilisation du citrate + Croissance à 40 °C – Croissance dans du NaCl à 1 % + Croissance dans du NaCl à 2 % – Activité de la dihydrolase d’arginine – Liquéfaction de la gélatine – Hydrolyse de l’amidon – Hydrolyse de l’esculine – Production de lévane –

2. Test IF

2.1. Préparer une suspension d’environ 106 cellules/ml dans un tampon d’immunofluorescence (appendice 4).

2.2. Préparer une série de dilutions au demi d’un antisérum approprié (voir site web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

2.3. Suivre la procédure du test IF (section VI.A.5).

2.4. Pour qu’un test IF soit positif, le titre obtenu avec la culture en immunofluorescence doit être équivalent à celui obtenu avec le témoin positif.

3. Test ELISA

NB: En cas de réalisation de deux tests d’identification seulement, ne pas utiliser d’autre test sérologique en plus de cette méthode.

3.1. Préparer une suspension d’environ 108 cellules/ml dans du PBS 1X (appendice 4).

3.2. Effectuer une procédure ELISA appropriée avec un anticorps monoclonal spécifique de R. solanacearum.

3.3. Un test ELISA est positif si la lecture ELISA obtenue de la culture est au moins égale à la moitié de celle obtenue pour le témoin positif.

4. Tests PCR

4.1. Préparer une suspension d’environ 106 cellules/ml dans de l’eau stérile pour biologie moléculaire.

4.2. Chauffer 100 µl de la suspension dans des tubes fermés dans un bloc chauffant ou au bain-marie bouillant à 100 °C pendant quatre minutes. Les échantillons peuvent ensuite être stockés entre –16 et –24 °C jusqu’au moment où ils sont requis.

4.3. Appliquer des procédures PCR appropriées pour amplifier les amplimères spécifiques de R. solanacearum [voir, par exemple: Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4. Une identification positive de R. solanacearum est obtenue si les amplimères PCR sont de la même taille et présentent les mêmes polymorphismes de taille des fragments de restriction que dans le cas de la souche témoin positif.

5. Test FISH

5.1. Préparer une suspension d’environ 106 cellules/ml dans de l’eau ultrapure.

5.2. Appliquer la procédure FISH (section VI.A.7) avec au moins deux oligosondes spécifiques de R. solanacearum (appendice 7).

5.3. Un test FISH est positif si les mêmes réactions sont obtenues de la culture et du témoin positif.

6. Test de profil des acides gras (FAP)

6.1. Cultiver la culture pendant quarante-huit heures à 28 °C sur des boîtes de gélose trypticase-soja (Oxoid).

6.2. Appliquer une procédure de test FAP appropriée (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Pour qu’un test FAP soit positif, le profil de la culture supposée doit être identique à celui du témoin positif. La présence des acides gras caractéristiques 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH et 18:1 2OH et l’absence de 16:0 3OH sont très indicatives de Ralstonia sp.

7. Méthodes de caractérisation de la souche

Une caractérisation de la souche utilisant l’une des méthodes suivantes est recommandée pour chaque nouveau cas d’isolement de R. solanacearum.

Inclure des souches de référence connues, le cas échéant, pour chaque test réalisé (voir appendice 3).

7.1. Détermination du biovar

On distingue différents biovars de R. solanacearum en fonction de leur aptitude à utiliser et/ou à oxyder trois disaccharides et trois hexoses alcools (Hayward, 1964, et Hayward et al., 1990). Les milieux de croissance pour le test du biovar sont décrits à l’appendice 2. Le test peut être valablement réalisé en inoculant par piqûre profonde les milieux avec des cultures pures d’isolats de R. solanacearum et en incubant à 28 °C. Si les milieux sont répartis dans 96 puits stériles de boîtes de culture (200 µl par puits), un changement de couleur du vert olive au jaune peut être observé dans les 72 heures, ce qui indique un résultat de test positif.

Biovar 1 2 3 4 5 Utilisation de: Maltose – + + – + Lactose – + + – + D (+) Cellobiose – + + – + Mannitol – – + + + Sorbitol – – + + – Dulcitol – – + + –

Des tests supplémentaires différencient des sous-phénotypes du biovar 2

Biovar 2A (répandu dans le monde) Biovar 2A (trouvé au Chili et en Colombie) Biovar 2T (trouvé en zone tropicale) Utilisation de tréhalose – + + Utilisation de méso-inositol + – + Utilisation de D ribose – – + Activité pectolytique (1) faible faible élevée

7.2. Empreinte génomique

Les procédés suivants permettent de réaliser une différenciation moléculaire des souches à l’intérieur du complexe R. solanacearum:

7.2.1. Analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (PTFR) (Cook et al., 1989).

7.2.2. PCR sur des séquences répétitives utilisant des amorces (REP, BOX et ERIC (Louws et al., 1995, Smith et al., 1995).

7.2.3. Analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction amplifiés (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. Méthodes PCR

Des amorces PCR spécifiques (Pastrik et al., 2002; voir appendice 6) peuvent être utilisées pour différencier des souches appartenant à la division 1 (biovars 3, 4 et 5) et à la division 2 (biovars 1, 2A et 2T) de R. solanacearum, telles que définies initialement par l’analyse du PTFR (Cook et al., 1989) et la séquence 16S d’ADNr (Taghavi et al., 1996).

C. TEST DE CONFIRMATION

Le test de pathogénicité doit être effectué en tant que confirmation finale d’un diagnostic de R. solanacearum et pour évaluer la virulence de cultures identifiées comme étant de R. solanacearum.

1) Préparer un inoculum d’environ 106 cellules/ml à partir d’une culture de 24 à 48 heures de l’isolat à tester et d’une souche témoin positif appropriée de R. solanacearum (par exemple: NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, voir appendice 3).

2) Inoculer cinq à dix plantules de tomates ou d’aubergines sensibles au stade de la troisième vraie feuille (voir section VI.A.9).

3) Incuber jusqu’à deux semaines à 25-28 °C et dans une humidité relative élevée en assurant un arrosage approprié pour prévenir un engorgement hydrique ou le stress de sécheresse. Avec des cultures pures, un flétrissement typique devrait apparaître dans les quinze jours. En l’absence de symptômes à l’issue de cette période, la culture ne peut pas être confirmée comme étant une forme pathogène de R. solanacearum.

4) Observer l’apparition de symptômes de flétrissement et/ou d’épinastie, de chlorose et de rabougrissement.