ANNEXE XX

Méthode de détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras par chromatographie gazeuse sur colonne capillaire

1. OBJET

Cette méthode décrit un procédé pour déterminer la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras dans les huiles d’olive. Les cires et les alkyls esters sont séparés en fonction du nombre d’atomes de carbone. La méthode peut être employée notamment pour différencier l’huile d’olive de l’huile de grignons d’olive et comme paramètre de qualité pour les huiles d’olive vierges extra, dans la mesure où elle permet la détection des mélanges frauduleux d’huiles d’olive vierge extra avec des huiles de qualité inférieure, notamment les huiles d’olive vierges, lampantes ou désodorisées.

2. PRINCIPE

L'huile, additionnée d'étalons internes appropriés, est fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté ; la fraction éluée dans les conditions de l’essai (à polarité inférieure à celle des triglycérides) est recueillie puis analysée directement par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE

3.1. Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Colonne en verre pour chromatographie en phase liquide, diamètre intérieur 15,0 mm, hauteur 30 à 40 cm, équipée d’un robinet approprié.

3.3. Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié pour le fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d’un système d'injection directe sur colonne, constitué des éléments suivants:

3.3.1. Four à thermostat équipé d’un programmateur de température.

3.3.2. Injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne

3.3.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur.

3.3.4. Enregistreur-intégrateur (Note 1) approprié pour fonctionner avec le convertisseur-amplificateur (point 3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et vitesse de déroulement du papier variable.

Note 1: Il est également possible d’utiliser des systèmes informatisés qui permettent la saisie des données de chromatographie en phase gazeuse au moyen d’un ordinateur.

3.3.5. Colonne capillaire, silice fondue (pour analyse des cires et des esters méthyliques et éthyliques), longueur 8 à 12 m, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l’intérieur de liquide de répartition (Note 2) à l’épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm.

Note 2: Il existe des phases liquides dans le commerce qui peuvent être utilisées à cette fin, telles que SE52 ou SE 54.

3.4. Microseringue de 10 μl, équipée d’une aiguille en acier trempé, pour injection directe sur colonne.

3.5. Agitateur électrique.

3.6. Évaporateur rotatif.

3.7. Four à moufle.

3.8. Balance analytique garantissant une précision de la mesure de ± 0,1 mg.

3.9. Verrerie normale de laboratoire.

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice, d’une granulométrie comprise entre 60 et 200 μm mesh [NdT: les deux unités de mesure coexistent dans l'original]. Le gel de silice doit être placé dans le four à moufle à 500 °C pendant au moins 4 h. Après refroidissement, y ajouter 2 % d’eau par rapport à la quantité de gel de silice utilisée. Agiter convenablement afin d’homogénéiser la suspension. Conserver dans le dessiccateur pendant au moins 12 heures avant emploi.

4.2. n-hexane, pour chromatographie ou analyse de résidus (la pureté doit être vérifiée).

AVERTISSEMENT: risques d’inflammation des vapeurs. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues. Bien fermer les récipients et utiliser dans un local bien aéré. Éviter l’accumulation de vapeurs et éliminer toute cause possible d’incendie, telle que radiateurs et appareils électriques non antidéflagrants. Nocif par inhalation: peut nuire aux cellules du système nerveux. Éviter de respirer les vapeurs. Utiliser si nécessaire un appareil respiratoire adéquat. Éviter tout contact avec les yeux et la peau.

4.3. Éther éthylique, pour chromatographie.

AVERTISSEMENT: extrêmement inflammable. Modérément toxique. Irritant pour la peau. Nocif par inhalation. Peut être nuisible pour les yeux. Les effets peuvent être différés. Risque de formation de peroxydes explosifs. Risques d’inflammation des vapeurs. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues. Bien fermer les récipients et utiliser dans un local bien aéré. Éviter l’accumulation de vapeurs et éliminer toute cause possible d’incendie, telle que radiateurs et appareils électriques non antidéflagrants. Ne pas évaporer jusqu’à dessiccation totale ou quasi totale. L’adjonction d’eau ou d’un autre agent réducteur approprié peut réduire la formation des peroxydes. Ne pas ingérer. Éviter de respirer les vapeurs. Éviter le contact prolongé ou répété avec la peau.

4.4. n-heptane, pour chromatographie, ou iso-octane.

AVERTISSEMENT: inflammable. Nocif par inhalation. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues. Bien fermer les récipients et utiliser dans un local bien aéré. Éviter de respirer les vapeurs. Éviter le contact prolongé ou répété avec la peau.

4.5. Solution étalon d’arachidate laurique (Note 3), diluée à 0,05 % (m/V) dans de l’heptane (étalon interne pour cires).

Note 3: Il est également possible d’utiliser du palmitate de palmityle, du stéarate de myristyle ou du lauréate d’arachidyle.

4.6. Solution étalon d'heptadécanoate méthylique, diluée à 0,02 % (m/V) dans de l’heptane (étalon interne pour esters méthyliques et éthyliques).

4.7. Soudan 1 (1-phényl-azo-2-naphthol)

4.8. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium, pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

AVERTISSEMENT:

Hydrogène. extrêmement inflammable, sous pression. Tenir à l’écart de sources de chaleur, étincelles ou flammes nues ou d’appareils électriques non antidéflagrants. S’assurer que la soupape de la bouteille est bien fermée lorsqu’elle n’est pas utilisée. Utiliser exclusivement avec un réducteur de pression. Desserrer le ressort du réducteur avant l’ouverture de la soupape de la bouteille. S’éloigner du point de sortie du gaz de la bouteille au moment de l’ouverture de la soupape. Utiliser dans un local bien aéré. Ne pas transférer l’hydrogène d’une bouteille à une autre. Ne pas mélanger de gaz dans la bouteille. S’assurer que les bouteilles ne risquent pas de tomber. Éloigner les bouteilles des rayons du soleil ou de toute autre source de chaleur. Ne pas stocker dans des espaces corrosifs. Ne pas utiliser de bouteilles abîmées ou sans étiquette.

Hélium. comprimé sous haute pression. Réduit l’oxygène disponible pour la respiration. Conserver le conteneur fermé. Utiliser dans un local bien aéré. Ne pas entrer dans les locaux de stockage s’ils ne sont pas bien ventilés. Utiliser exclusivement avec un réducteur de pression. Desserrer le ressort du réducteur avant l’ouverture de la soupape de la bouteille. Ne pas transférer le gaz d’une bouteille à une autre. S’assurer que les bouteilles ne risquent pas de tomber. S’éloigner du point de sortie du gaz de la bouteille au moment de l’ouverture de la soupape. Éloigner les bouteilles des rayons du soleil ou de toute autre source de chaleur. Ne pas stocker dans des espaces corrosifs. Ne pas utiliser de bouteilles abîmées ou sans étiquette. Ne pas inhaler. Utiliser exclusivement à des fins techniques.

4.9. Gaz auxiliaires:

— hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

— air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

AVERTISSEMENT:

Air. Comprimé sous haute pression. Utiliser avec précaution en présence de substances combustibles car la température d’auto-allumage de la plupart des composés organiques dans l’air diminue fortement à haute pression. S’assurer que la soupape de la bouteille est bien fermée lorsqu’elle n’est pas utilisée. Utiliser exclusivement avec un réducteur de pression. Desserrer le ressort du réducteur avant l’ouverture de la soupape de la bouteille. S’éloigner du point de sortie du gaz de la bouteille au moment de l’ouverture de la soupape. Ne pas transférer le gaz d’une bouteille à une autre. Ne pas mélanger de gaz dans la bouteille. S’assurer que les bouteilles ne risquent pas de tomber. Éloigner les bouteilles des rayons du soleil ou de toute autre source de chaleur. Ne pas stocker dans des espaces corrosifs. Ne pas utiliser de bouteilles abîmées ou sans étiquette. Ne pas inhaler et ne pas utiliser pour des appareils respiratoires l’air destiné à des fins techniques.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de la colonne chromatographique

Mettre 15 g de gel de silice (point 4.1) en suspension dans le n-hexane (point 4.2) et l’introduire dans la colonne (point 3.2). Laisser se déposer spontanément, puis utiliser un agitateur électrique pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Filtrer 30 ml de n-hexane afin d’éliminer les impuretés éventuelles. Peser exactement à l’aide de la balance analytique (point 3.8) environ 500 mg de l’échantillon dans l’Erlenmeyer de 25 ml (point 3.1). Ajouter une quantité appropriée d’étalon interne (point 4.5), en fonction du contenu présumé de cires. Par exemple, ajouter 0,1 mg d’arachidate laurique dans le cas de l’huile d’olive et 0,25 à 0,5 mg dans le cas de l’huile de grignons d'olive et 0,05 mg de heptadécanoate méthylique dans le cas des huiles d’olive (point 4.6).

Introduire l’échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatographique à l’aide de deux fractions de 2 ml de n-hexane (point 4.2.).

Laisser couler le solvant jusqu’à 1 mm au-dessus du niveau supérieur de l’absorbant. Filtrer [NdT: passage manquant dans l'original] supplémentaires de n-hexane/éther éthylique (99:1) et recueillir 220 ml à un débit d’environ 15 gouttes toutes les 10 secondes. (Cette fraction contient les esters méthyliques et éthyliques et les cires). (Note 4) (Note 5).

Note 4: Un nouveau mélange n-hexane/éther éthylique (99:1) doit être préparé chaque jour.

Note 5: Pour contrôler visuellement l’élution correcte des cires, il est possible d’ajouter à la solution échantillon 100μl de colorant soudan I dilué à 1 % dans le mélange d’élution. Le colorant ayant un temps de rétention compris entre celui des cires et des triglycérides, il convient de suspendre l’élution lorsque le colorant atteint le fond de la colonne chromatographique, car toutes les cires ont alors été éluées.

Évaporer les fractions ainsi obtenues dans l’évaporateur rotatif jusqu’à l'évacuation pratiquement totale du solvant. Les 2 derniers ml sont évacués avec un faible flux d’azote. Recueillir la fraction contenant les esters méthyliques et éthyliques est diluée avec 2 à 4 ml de n-heptane ou d'iso-octane [NdT: cette phrase est entachée d'une erreur de syntaxe dans l'original].

5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.2.1. Opérations préliminaires

Connecter la colonne et le chromatographe en phase gazeuse (point 3.3), en raccordant, d'une part, le point d'admission au système sur colonne et, d'autre part, le point de sortie au détecteur. Vérifier le bon fonctionnement de l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse (fonctionnement des circuits des gaz, efficacité du système de détection et d'enregistrement, etc.).

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est recommandé de procéder à son conditionnement. Laisser s’écouler un léger débit de gaz à travers la colonne, puis allumer l’appareil de chromatographie en phase gazeuse. Chauffer graduellement jusqu’à atteindre, au bout d’environ 4 heures, une température de 350°C.

Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis régler l’appareillage sur les conditions opératoires (réglage du débit de gaz, allumage de la flamme, raccordement à l’enregistreur électronique (point 3.3.4), réglage de la température du four en fonction de la colonne, réglage du détecteur, etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle requise pour l’analyse. Le tracé de la ligne de base doit être linéaire, exempt de tout pic, et ne doit présenter aucune déviation.

Une déviation rectiligne négative indique que les raccordements de la colonne sont mauvais; une déviation positive indique un conditionnement inadéquat de la colonne.

5.2.2. Choix des conditions opératoires pour les cires et les esters éthyliques et méthyliques (Note 6)

Les conditions opératoires sont en général les suivantes:

— température de la colonne: 20 °C/min 5 °C/min

80 °C au départ (1 minute) 140 °C 335 °C (20)

— température du détecteur: 350 °C.

— quantité injectée: 1μl de solution de n-heptane (2-4 ml).

— gaz vecteur: hélium ou hydrogène à la vitesse linéaire optimale pour le gaz choisi (voir Appendice A).

— sensibilité instrumentale: telle qu'elle permet de satisfaire aux conditions ci-dessus.

Note 6: En raison de la température finale élevée, on admet une déviation positive qui ne doit toutefois pas être supérieure à 10 % de la valeur réelle.

Ces conditions peuvent être modifiées de façon à les adapter aux caractéristiques de la colonne et de l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, afin de séparer toutes les cires et tous les esters éthyliques et méthyliques d'acides gras et d'obtenir une séparation satisfaisante des pics (voir figures 2, 3 et 4) et un temps de rétention de l’étalon interne d'arachidate laurique de 18 ± 3 minutes. Le pic des cires le plus représentatif doit être supérieur à 60 % de l'amplitude réelle, tandis que l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique pour les esters méthyliques et éthyliques doit atteindre l'amplitude réelle.

Les paramètres d’intégration des pics doivent être déterminés de façon à obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.

5.3. Exécution de l’analyse

Prélever 10 μl de la solution à l’aide de la microseringue de 10 μl; tirer le piston de la seringue en arrière jusqu'à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l’aiguille dans le dispositif d’injection et après 1-2 secondes, injecter rapidement. Au bout d’environ 5 secondes, extraire délicatement l’aiguille.

Effectuer l’enregistrement jusqu’à l'élution complète des cires ou des stigmastadiènes, selon la fraction analysée.

La ligne de base doit toujours satisfaire aux conditions requises.

5.4. Identification des pics

Les différents pics sont identifiés en comparant les temps de rétention et les mélanges de cires dont les temps de rétention sont connus du fait qu'ils ont été analysés dans les mêmes conditions. Les alkyl esters sont identifiés à partir de mélanges d’esters méthyliques et éthyliques des principaux acides gras contenus dans l’huile d’olive (palmitique et oléique).

La Figure 1 représente un chromatogramme des cires d’une huile d’olive vierge. Les figures 2 et 3 représentent les chromatogrammes de deux huiles d’olive vierges extra disponibles dans le commerce, l’une contenant des esters méthyliques et éthyliques et l’autre non. La figure 4 représente le chromatogramme d’une huile d’olive vierge extra de qualité optimale et le chromatogramme de la même huile, mais qui contient des pics correspondant à 20 % d’huile désodorisée.

5.5. Analyse quantitative des cires

Procéder au calcul de l'aire des pics correspondant à l’étalon interne d'arachidate laurique et aux esters aliphatiques de C40 à C46 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur totale en cires en additionnant chaque cire, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

où:

Ax = aire correspondant au pic de chaque ester, en données de comptage sous forme numérique As = aire correspondant au pic de l’étalon interne d'arachidate laurique, en données de comptage sous forme numérique ms = masse de l’étalon interne d'arachidate laurique ajouté, en milligrammes m = masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

5.5.1. Analyse quantitative des esters méthyliques et éthyliques

Procéder au calcul des aires des pics correspondant à l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique, aux esters méthyliques des acides gras C16 et C18 et aux esters éthyliques des acides gras C16 et C18 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur de chacun des alkyl esters, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

où:

Ax = aire correspondant au pic de chaque ester C16 et C18, en données de comptage sous forme numérique As = aire correspondant au pic de l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique, en données de comptage sous forme numérique ms = masse de l’étalon interne d'heptadécanoate méthylique ajouté, en milligrammes m = masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Indiquer la somme des teneurs en cires de C40 à C46 (Note 7), en mg/kg de matière grasse.

Indiquer la somme des teneurs en esters méthyliques et éthyliques de C16 à C18, et le total des deux.

Il convient d'indiquer les résultats en arrondissant au mg/kg inférieur ou supérieur.

Note 7: Les constituants à quantifier correspondent aux pics des esters C40 à C46 ayant un nombre d'atomes de carbone pair, selon l’exemple de chromatogramme des cires contenues dans une huile d’olive reproduit dans la figure ci-après. À des fins d'identification, si l’ester C46 est scindé, il est conseillé d’analyser la fraction des cires d’une huile de grignons d’olive dont le pic C46 est clairement identifiable du fait qu'il prédomine.

Indiquer le ratio entre les esters éthyliques et les esters méthyliques.

Figure 1

Chromatogramme de la fraction de cires d’une huile d’olive, à titre d'exemple (1)

Figure 2

Esters méthyliques, esters éthyliques et cires dans une huile d’olive vierge

Figure 3

Esters méthyliques, esters éthyliques et cires dans une huile d’olive vierge extra

Figure 4

Partie d’un chromatogramme d’une huile d’olive vierge extra et de la même huile contenant des pics d’huile désodorisée