«B. 47 MÉTHODE D'ESSAI D'OPACITÉ ET DE PERMÉABILITÉ DE LA CORNÉE BOVINE POUR LA MISE EN ÉVIDENCE DES SUBSTANCES CORROSIVES ET FORTEMENT IRRITANTES POUR L'ŒIL

INTRODUCTION

La méthode d'essai d'opacité et de perméabilité de la cornée bovine (OPCB) est une méthode d'essai in vitro pouvant être utilisée, dans certaines circonstances, compte tenu de ses limites particulières, pour classer des substances et des mélanges dans la catégorie des produits “corrosifs et fortement irritants pour l’œil” (1) (2) (3). Aux fins de la présente méthode d'essai, les substances et mélanges fortement irritants sont définis comme ceux qui provoquent des lésions cutanées persistant, chez le lapin, au moins 21 jours après administration. Bien qu’elle n’ait pas été validée en tant que méthode remplaçant totalement l’essai oculaire in vivo chez le lapin, la méthode OPCB est néanmoins recommandée dans le cadre d’une stratégie d’essai séquentielle visant à établir une classification et un étiquetage réglementaires dans un champ spécifique d’application (4) (5). Les substances et mélanges d’essai (6) peuvent être classés corrosifs ou fortement irritants pour l’œil sans qu’il soit nécessaire de procéder à des essais supplémentaires chez le lapin. En revanche, une substance révélant un résultat négatif à l’issue de l’essai a besoin d’être testée sur des lapins selon une démarche expérimentale de type séquentiel, telle que celle décrite dans la ligne directrice de l’OCDE no 405 (7) (chapitre B.5 de la présente annexe).

L'objet de la présente méthode d'essai est de décrire les procédures utilisées pour évaluer l'effet potentiel corrosif ou fortement irritant pour l'œil d'une substance d'essai. Cet effet est mesuré par la capacité de la substance à provoquer une opacité et une perméabilité cornéennes accrues sur une cornée bovine isolée. Les effets toxiques pour la cornée sont mesurés par: i) la diminution de la capacité de transmission de la lumière (opacité), et ii) l'augmentation du passage de la fluorescéine sodique (perméabilité). Les mesures de l'opacité et de la perméabilité de la cornée après exposition à la substance d'essai sont ensuite combinées pour établir le score d'irritation in vitro (SIIV), utilisé pour classer la substance d'essai en fonction de son pouvoir irritant.

Des substances irritantes pour l’œil qui provoquent des lésions se résorbant en moins de 21 jours et des substances non irritantes ont également été testées par la méthode OPCB. Toutefois, pour les substances entrant dans ces catégories, la précision et la fiabilité de cette méthode n'ont pas été évaluées de façon formelle.

REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES DE LA MÉTHODE

La présente méthode d'essai est fondée sur le protocole expérimental de la méthode OPCB (8) du Comité de coordination interagences pour la validation des méthodes alternatives (ICCVAM), élaboré à la suite d’une étude de validation internationale (4)(5)(9) à laquelle ont participé le Centre européen pour la validation de méthodes alternatives (ECVAM) et le Centre japonais pour la validation de méthodes alternatives (JaCVAM). Ce protocole s’appuie sur des informations provenant de l’Institute for In Vitro Sciences (IIVS) et sur le protocole INVITTOX no124 (10), qui a été utilisé lors de l’étude de prévalidation de l’essai OPCB conduite en 1997-1998 sous l’égide de la Communauté Européenne. Ces protocoles se fondent tous deux sur la méthode d’essai OPCB décrite pour la première fois par Gautheron et al. (11).

Les limites connues de cette méthode d’essai concernent le taux élevé de faux positifs pour les alcools et les cétones, et le taux élevé de faux négatifs pour les substances solides, relevés dans la base de données de validation (voir paragraphe 44) (5). Si l’on exclut de la base de données les substances relevant de ces classes chimiques et physiques, la précision de la méthode OPCB au regard des systèmes de classifications de l’UE, de l’EPA et du SGH se trouve considérablement améliorée (5). Compte tenu de la finalité de cet essai (qui vise exclusivement à détecter les substances corrosives et fortement irritantes pour l’œil), les taux de faux négatifs ne sont pas préoccupants car les substances concernées feront ensuite l’objet d’essais chez le lapin ou d’autres essais in vitro dûment validés, conformément aux exigences de la réglementation, selon une démarche expérimentale séquentielle fondée sur la force probante des données. De surcroît, l’actuelle base de données de validation n’a pas permis de procéder à l’évaluation adéquate de certaines classes de substances chimiques ou de produits (par exemple, les mélanges). Les investigateurs peuvent néanmoins envisager d’avoir recours à cette méthode d’essai pour tous les types de matériel d’essai (y compris les mélanges), auquel cas un résultat positif pourrait être interprété comme révélateur d'un effet corrosif ou fortement irritant pour l’œil. Il convient toutefois d’interpréter avec prudence les résultats positifs obtenus avec des alcools ou des cétones en raison du risque de surestimation.

Tous les modes opératoires faisant intervenir des yeux et des cornées de bovins doivent être conformes aux réglementations et procédures applicables à l’installation d’essai en matière de manipulation des produits dérivés d’animaux qui englobent, sans s’y limiter, les tissus et fluides tissulaires. Le respect des précautions universelles de laboratoire est recommandé (12).

Bien qu’elle prenne en compte certains des effets oculaires évalués par la méthode d’essai d’irritation oculaire chez le lapin, et dans une certaine mesure leur degré de gravité, cette méthode d’essai présente toutefois l’inconvénient de ne pas prendre en considération les lésions de la conjonctive et de l’iris. De surcroît, même si la méthode OPCB ne permet pas en soi d'évaluer la réversibilité des lésions cornéennes, il a été proposé, sur la base d’études menées sur l’œil de lapin, d'utiliser une évaluation de la profondeur initiale de la lésion cornéenne pour distinguer les effets réversibles des effets irréversibles (13). Enfin, la méthode OPCB ne permet pas d'évaluer la toxicité systémique potentielle associée à l'exposition oculaire.

Les travaux visant à mieux caractériser l’utilité et les limites de la méthode OPCB pour la mise en évidence des substances faiblement irritantes ou non irritantes se poursuivent (voir également le paragraphe 45). Les utilisateurs sont également incités à fournir des spécimens et/ou des données aux organismes de validation à des fins d’évaluation formelle des utilisations futures possibles de la méthode d’essai OPCB, notamment pour la mise en évidence des substances faiblement irritantes ou non irritantes.

PRINCIPE DE L'ESSAI

La méthode d'essai OPCB est un modèle organotypique qui permet de maintenir in vitro les fonctions physiologiques et biochimiques normales de la cornée bovine pendant une courte période. Selon cette méthode, les dommages causés par la substance d’essai sont évalués par des mesures quantitatives des modifications de l’opacité et de la perméabilité de la cornée réalisées, respectivement, à l’aide d’un opacitomètre et d’un spectrophotomètre visible. Ces deux mesures entrent dans le calcul du SIIV, utilisé pour assigner une catégorie de classification de danger d’irritation in vitro permettant d’estimer le potentiel d’irritation oculaire in vivo d’une substance d’essai (voir “Critères de décision”).

La méthode d’essai OPCB utilise des cornées isolées provenant d’yeux de bovins récemment abattus. L’opacité cornéenne est mesurée par la quantité de lumière traversant la cornée. La perméabilité est mesurée par la quantité de fluorescéine sodique traversant toute l’épaisseur de la cornée, et détectée dans le milieu de la chambre postérieure. Les substances d’essai, introduites dans la chambre antérieure du porte-cornée, sont appliquées sur la surface épithéliale de la cornée. L’appendice 3 présente une description et un schéma de porte-cornée utilisé dans la méthode OPCB. Ces appareils sont disponibles dans le commerce auprès de différents fabricants, ou peuvent être construits.

Provenance et âge des yeux de bovins et sélection des espèces animales

L’utilisation d’yeux provenant d’animaux d’âges différents peut entraîner des variations de dimension des cornées. Les cornées dont le diamètre horizontal est supérieur à 30,5 mm et l’épaisseur cornéenne centrale (ECC) supérieure ou égale à 1 100 μm ont généralement été prélevées sur des bovins de plus de huit ans, tandis que les cornées ayant un diamètre horizontal inférieur à 28,5 mm et une ECC inférieure à 900 μm proviennent plutôt de bêtes de moins de cinq ans (14). En conséquence, les yeux des bovins âgés de plus de 60 mois ne sont généralement pas utilisés. En général, les yeux des bovins de moins de 12 mois ne sont pas non plus utilisés, car leur développement n’est pas terminé et l'épaisseur ainsi que le diamètre de la cornée sont nettement inférieurs à ceux des yeux provenant de bovins adultes. Toutefois, les cornées issues d’animaux jeunes (entre 6 et 12 mois) sont acceptables car elles présentent certains avantages, tels qu’une plus grande disponibilité, une fourchette d’âge plus restreinte, et des risques moins importants d'exposition potentielle à l'encéphalopathie spongiforme bovine (15) pour le personnel. Une évaluation plus poussée des effets de la taille ou de l’épaisseur cornéenne sur la sensibilité aux substances corrosives et irritantes serait d’une grande utilité, aussi les utilisateurs sont-ils encouragés à consigner l’âge et/ou le poids estimés des animaux ayant fourni les cornées utilisées dans l’étude.

Collecte et transport des yeux au laboratoire

Les yeux sont totalement immergés dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS), dans un récipient de taille adaptée, et transportés jusqu’au laboratoire en ayant soin de limiter le plus possible tout endommagement et/ou toute contamination bactérienne. Les yeux étant prélevés au cours de l'abattage, ils risquent d’entrer en contact avec du sang ou d’autres substances biologiques, notamment des bactéries et autres microorganismes. Il importe donc de réduire au minimum le risque de contamination (par exemple en plaçant le récipient contenant les yeux sur de la glace mouillée, et en ajoutant des antibiotiques à la HBSS utilisée pour le transport [100 UI/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, par exemple]).

Il faut limiter au maximum l’intervalle de temps entre le prélèvement des yeux et l’utilisation des cornées dans le cadre de l’essai OPCB (l'utilisation a en général lieu le jour même du prélèvement) et démontrer qu’il ne compromet pas les résultats de l’essai. Ces résultats dépendent des critères de sélection des yeux, ainsi que des réponses des témoins positifs et négatifs. Tous les yeux utilisés dans l'essai proviennent d'un lot d'yeux collectés le même jour.

Critères de sélection des yeux utilisés dans la méthode OPCB

Chaque lot de traitement (substance d’essai et témoins négatifs et positifs) est composé de trois yeux au minimum. L’essai OPCB nécessite trois cornées servant de témoins négatifs. Toutes les cornées étant prélevées sur le globe oculaire entier puis placées dans les chambres du porte-cornée, les manipulations peuvent entraîner d’éventuels artefacts sur les valeurs de l'opacité et de la perméabilité cornéennes de chaque élément (y compris le témoin négatif). Aussi, les valeurs d’opacité et de perméabilité mesurées sur les cornées témoins négatives servent-elles à corriger les valeurs d’opacité et de perméabilité cornéennes des spécimens et des témoins traités positifs lors du calcul du score d’irritation in vitro.

MODE OPÉRATOIRE

Préparation des yeux

Des cornées exemptes de tout défaut sont découpées en conservant un bord de 2 à 3 mm de sclérotique destiné à faciliter les manipulations ultérieures, et en prenant soin de ne pas endommager l’épithélium et l’endothélium cornéens. Les cornées isolées sont placées dans des porte-cornées spécialement conçus à cet effet, qui se composent de deux compartiments, antérieur et postérieur, respectivement en contact avec les faces épithéliale et endothéliale de la cornée. Il convient de remplir jusqu’à débordement ces deux chambres d’un milieu essentiel minimum de Eagle (MEM) préalablement chauffé (en commençant par la chambre postérieure), en évitant toute formation de bulles d’air. L’appareil est ensuite équilibré à une température de 32 ± 1 °C pendant une heure au moins, afin que les cornées s’équilibrent avec le milieu et atteignent une activité métabolique aussi proche de la normale que possible (la température de la surface cornéenne in vivo est d’environ 32 °C).

Après la période d’équilibrage, un nouveau MEM préalablement chauffé est ajouté dans les deux chambres, et une première mesure d’opacité est effectuée pour chaque cornée. Les cornées présentant une altération macroscopique des tissus (éraflures, pigmentation ou néovascularisation, par exemple) ou une opacité supérieure à 7 unités d'opacité sont écartées. L’opacité moyenne de toutes les cornées équilibrées est calculée. Au moins trois cornées présentant des valeurs d’opacité proches de la valeur médiane de toutes les cornées sont sélectionnées pour servir de témoins négatifs (ou témoins de solvant). Les cornées restantes sont ensuite réparties entre le lot de traitement et celui des témoins positifs.

La capacité calorifique de l’eau étant supérieure à celle de l’air, l’eau procure des conditions de température plus stables pour l’incubation. Aussi est-il recommandé de plonger le porte-cornée dans un bain d’eau pour maintenir son contenu à 32 ± 1°C. Toutefois, il est également possible d’utiliser des incubateurs à air, à condition d’assurer la stabilité de la température (en chauffant au préalable les porte-cornées et le milieu, par exemple).

Application de la substance d'essai

Deux protocoles d’application différents sont utilisés, l’un pour les liquides et les tensioactifs (solides ou liquides), et l’autre pour les solides non tensioactifs.

Les liquides sont testés non dilués, tandis que les tensioactifs le sont à une concentration de 10 % en masse volumique dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, d’eau distillée ou d’un autre solvant dont l’absence d’effets indésirables sur le système d’essai a été démontrée. Les semi-solides, crèmes et cires sont généralement testés en tant que liquides. Il conviendra de justifier de façon appropriée l’utilisation de tout autre taux de dilution. Les cornées sont ensuite exposées aux liquides ou tensioactifs pendant 10 minutes. L’utilisation d’une autre durée d’exposition devra être scientifiquement justifiée.

Les solides non tensioactifs sont généralement testés sous forme de solutions ou de suspensions à une concentration de 20 % dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, d’eau distillée ou d’un autre solvant dont l’absence d’effets indésirables sur le système d’essai a été démontrée. Dans certaines circonstances et uniquement si cela est justifié scientifiquement, les solides peuvent aussi être testés purs par application directe sur la surface cornéenne, selon la méthode en chambre ouverte (voir paragraphe 29). Les cornées sont exposées aux solides pendant quatre heures, mais comme pour les liquides et les tensioactifs, des durées d’exposition différentes sont possibles moyennant une justification scientifique appropriée.

Différentes méthodes d’application peuvent être utilisées, en fonction de la nature physique et des caractéristiques chimiques des substances d’essai (solides, liquides, liquides visqueux ou non visqueux, par exemple). Il est très important que la substance d’essai recouvre convenablement la surface épithéliale puis soit correctement retirée durant les étapes de rinçage. Il conviendra généralement d’utiliser la méthode en chambre fermée pour les substances d’essai liquides non visqueuses ou légèrement visqueuses, tandis que la méthode en chambre ouverte sera privilégiée pour les substances d’essai semi-visqueuses et visqueuses et pour les solides purs.

Dans la méthode en chambre ouverte, la goupille de fermeture et la fenêtre en verre de la chambre antérieure sont retirées avant l’application. La substance d’essai ou témoin (750 μl, ou une quantité suffisante pour recouvrir entièrement la cornée) est directement appliquée sur la surface épithéliale cornéenne à l’aide d’une micropipette. Si la substance d’essai est difficile à pipetter, il est possible d’utiliser une pipette à déplacement positif qui permet un dosage plus précis. L’embout de la pipette à déplacement positif est inséré dans l’embout distributeur de la seringue, de manière à ce que la substance puisse être chargée dans la pipette sous pression. Il convient ensuite de pousser le piston de la seringue tout en tirant simultanément celui de la pipette. Si des bulles d’air se forment dans l’embout de la pipette, il faut alors retirer la substance d’essai (en l’expulsant) et répéter le processus jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air n’apparaisse au moment du remplissage de la pipette. Il est possible d’utiliser si nécessaire une seringue normale (sans aiguille), ce qui permet de mesurer un volume précis de substance d’essai et de l’appliquer plus facilement sur la surface épithéliale de la cornée. Après le dosage, la fenêtre en verre est replacée sur l’ouverture de la chambre antérieure afin de recréer un système fermé.

Incubation post-exposition

Après la période d’exposition, la substance d’essai, ou la substance témoin négative ou positive, est retirée de la chambre antérieure et l’épithélium est rincé au moins trois fois (ou jusqu’à ce qu’aucune trace de la substance d’essai ne soit plus visible) au moyen d’un MEM contenant du rouge de phénol. Le rinçage est effectué à l’aide d’un milieu contenant du rouge de phénol, dont le changement de couleur permet de déterminer l’efficacité du rinçage des substances acides ou alcalines. Il convient de laver à nouveau les cornées si, après trois rinçages, le rouge de phénol est encore altéré (jaune ou violet) ou si la substance d’essai est toujours visible. Une fois le milieu débarrassé de la substance, les cornées subissent un dernier rinçage avec un MEM sans rouge de phénol, ce qui permet de s’assurer que la chambre antérieure est débarrassée de tout rouge de phénol avant la mesure d’opacité. La chambre antérieure est ensuite à nouveau remplie d’un MEM neuf sans rouge de phénol.

Pour les liquides et les tensioactifs, les cornées sont incubées après rinçage pendant deux heures supplémentaires à 32 ± 1 °C. Il peut être utile, dans certaines circonstances (déterminées au cas par cas), de prévoir une durée d’incubation post-exposition plus longue. Les cornées sur lesquelles des solides ont été appliqués sont soigneusement rincées après la période d’exposition de quatre heures, et ne requièrent pas d’incubation supplémentaire.

Au terme de la période d’incubation post-exposition pour les liquides et les tensioactifs, et au terme de la période d’exposition de quatre heures pour les solides non tensioactifs, les degrés d’opacité et de perméabilité de chaque cornée sont enregistrés. En outre, chaque cornée fait l'objet d'un examen visuel et les observations pertinentes sont consignées (exfoliation des tissus, résidus de substance d’essai ou opacité non uniforme, par exemple). Ces observations peuvent s’avérer importantes car elles peuvent se traduire par des variations de lecture de l’opacitomètre.

Substances témoins

Lorsqu’une substance liquide non diluée est soumise à l’essai, il convient d’inclure dans la méthode d’essai OPCB une substance témoin négatif concurrente (solution de chlorure de sodium à 0,9 % ou eau distillée, par exemple) afin de détecter des changements non intrinsèques au système d’essai et de fournir un point de référence pour les critères d’évaluation de l’essai. Cette méthode permet également de garantir que les conditions de l’essai n’entraînent aucune réaction d’irritation indésirable.

Lorsqu’un liquide dilué, un tensioactif ou un solide est soumis à l’essai, il convient d’inclure dans la méthode d’essai OPCB un lot témoin de solvant/véhicule concurrent afin de détecter des changements non intrinsèques au système d’essai et de fournir un point de référence pour les critères d’évaluation de l’essai. On utilisera uniquement des solvants/véhicules dont l’absence d’effets indésirables sur le système d’essai a été démontrée.

Effets mesurés

La perméabilité est déterminée par la quantité de fluorescéine sodique pénétrant la totalité des couches cellulaires de la cornée (de l’épithélium sur la face externe de la cornée à l’endothélium sur sa face interne). Un volume de 1 ml de solution de fluorescéine sodique (respectivement 4 ou 5 mg/ml lors d’essais portant sur des liquides et des tensioactifs ou sur des solides non tensioactifs) est introduit dans la chambre antérieure du porte-cornée, en contact avec la face épithéliale de la cornée, tandis que la chambre postérieure, en contact avec la face endothéliale, est remplie d’un nouveau MEM. Le porte-cornée est ensuite incubé en position horizontale pendant 90 ± 5 min à une température de 32 ± 1 °C. La quantité de fluorescéine sodique passant dans la chambre postérieure est mesurée quantitativement par spectrophotométrie UV-visible. Les mesures spectrophotométriques évaluées à 490 nm sont enregistrées en tant que valeurs de densité optique (DO490) ou d’absorbance, mesurées sur une échelle continue. La perméabilité à la fluorescéine est déterminée à l’aide des valeurs de DO490 données par un spectrophotomètre visible utilisant un trajet optique standard de 1 cm.

Il est également possible d’utiliser un lecteur de plaques de microtitration à 96 puits, à condition: i) de pouvoir définir l’intervalle linéaire du lecteur de plaque servant à déterminer les valeurs de la DO490 de la fluorescéine; et ii) d’utiliser le bon volume d’échantillons de fluorescéine sur la plaque à 96 puits afin d’obtenir des valeurs de la DO490 équivalentes au trajet optique standard de 1 cm (ce qui peut nécessiter de remplir entièrement les puits [généralement 360 μl]).

RÉSULTATS ET RAPPORT

Évaluation des données

D’après Sina et al. (16), cette formule a été établie au cours d'études intra et interlaboratoires. Les données générées pour une série de 36 composés dans le cadre d’une étude interlaboratoires ont été soumises à une analyse à variables multiples afin de déterminer l'équation du meilleur ajustement entre les données in vivo et in vitro. Cette analyse a été réalisée par des scientifiques travaillant dans deux entreprises distinctes, qui ont obtenu des équations pratiquement identiques.

Une fois que les valeurs d’opacité et de perméabilité moyenne (DO490) ont été corrigées de l’opacité de fond et des valeurs DO490 de perméabilité des témoins négatifs, l’opacité moyenne et les valeurs DO490 de perméabilité moyenne pour chaque lot de traitement sont combinées dans une formule établie empiriquement pour calculer, comme suit, le score d’irritation in vitro (SIIV) de chaque lot de traitement:

Critères de décision

Une substance induisant un SIIV ≥ 55,1 est définie comme corrosive ou fortement irritante. Comme indiqué au paragraphe 1, s'il n'est pas démontré que la substance d'essai est corrosive ou fortement irritante pour l'œil, il convient de mener des essais complémentaires à des fins de classification et d'étiquetage. La méthode d’essai OPCB présente une précision d’ensemble comprise entre 79 % (113/143) et 81 % (119/147), un taux de faux positifs allant de 19 % (20/103) à 21 % (22/103) et un taux de faux négatifs allant de 16 % (7/43) à 25 % (10/40), en comparaison avec les données de la méthode d’essai in vivo sur les yeux de lapin classées selon les systèmes de classification de l’EPA (1), de l’UE (2) ou du SGH (3). Si l’on exclut de la base de données les substances relevant de certaines classes chimiques (alcools, cétones) ou physiques (substances solides), la précision de la méthode OPCB au regard des systèmes de classification de l’UE, de l’EPA et du SGH va de 87 % (72/83) à 92 % (78/85), le taux de faux positifs de 12 % (7/58) à 16 % (9/56), et le taux de faux négatifs de 0 % (0/27) à 12 % (3/26).

Même si une substance d’essai n’est pas classée comme corrosive ou fortement irritante pour l'œil, les données de la méthode d'essai OPCB peuvent servir, en association avec des résultats d’essais in vivo sur des yeux de lapin ou d’un autre test in vitro dûment validé, à évaluer plus en profondeur l’utilité et les limites de la méthode OPCB pour la détection des substances faiblement irritantes ou non irritantes (un document d'orientation sur l’utilisation de méthodes d’essai de toxicité oculaire in vitro est en cours d'élaboration).

Critères d'acceptation de l'étude

Un essai est considéré comme acceptable si le témoin positif présente un SIIV compris dans un intervalle de deux écarts-types autour de la moyenne historique actuelle, qui est mise à jour au moins tous les trois mois, ou chaque fois qu’un essai acceptable est mené dans des laboratoires conduisant peu fréquemment (c'est-à-dire moins d'une fois par mois) ce type d’étude. Les réponses du témoin négatif ou du témoin de solvant/véhicule doivent donner des valeurs d’opacité et de perméabilité situées en deçà des limites maximales établies pour les valeurs d’opacité et de perméabilité de fond des cornées bovines traitées avec les témoins négatifs ou les témoins de solvant/véhicule correspondants.

Rapport d'essai

Présentation sous forme de tableau des résultats de chaque échantillon d’essai (par ex., valeurs de l’opacité et de la DO490 et SIIV calculé pour la substance d’essai et les témoins positifs, négatifs et étalons [si inclus], y compris les données des essais répétés, le cas échéant, et la moyenne ± écart type pour chaque essai);

Informations sur l’étalonnage des appareils utilisés pour mesurer l’opacité et la perméabilité (par ex., opacitomètre et spectrophotomètre);

Mode opératoire utilisé pour assurer l'intégrité (précision et fiabilité) de la méthode d'essai au cours du temps (par exemple essai périodique des substances d’épreuve de compétence, utilisation de données antérieures de témoins positifs et négatifs).

Dans la mesure du possible, caractéristiques spécifiques des animaux sur lesquels les yeux ont été prélevés (par ex., âge, sexe et poids de l’animal donneur).

Conditions de stockage et de transport des yeux (par ex., date et heure de la collecte des yeux, délai avant le début de l’essai, moyen de transport et conditions de température, antibiotiques utilisés le cas échéant);

Nom et adresse du commanditaire, de l'installation d'essai et du directeur de l'étude;

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Appendice 1

DÉFINITIONS

Précision: degré de concordance entre les résultats de la méthode d'essai et les valeurs de référence acceptées. La précision constitue une mesure de la performance de la méthode d'essai et un aspect de sa «pertinence». Ce terme est souvent utilisé de façon interchangeable avec «concordance» pour désigner la proportion de résultats corrects d'une méthode d'essai.

Substance étalon: substance utilisée en tant que référence, pour la comparaison avec une substance d'essai. Une substance étalon présente les propriétés suivantes: i) provient d'une ou de plusieurs sources constantes et fiables; ii) présente une similitude structurale et fonctionnelle avec la classe des substances soumises à l'essai; iii) possède des caractéristiques physiques/chimiques connues; iv) est accompagnée de données confirmant ses effets connus, et v) a une puissance connue dans la fourchette de réponses désirées.

Cornée: partie transparente située à l’avant du globe oculaire, recouvrant l’iris et la pupille et laissant pénétrer la lumière vers l’intérieur de l’œil.

Opacité cornéenne: mesure de l’étendue du caractère opaque de la cornée suite à son exposition à une substance d’essai. Une augmentation de l'opacité cornéenne indique un endommagement de la cornée. L’opacité peut être évaluée de manière subjective, par exemple lors du test de Draize réalisé sur les yeux de lapin, ou de manière objective à l'aide d'un instrument de mesure tel qu'un «opacitomètre».

Perméabilité cornéenne: Mesure quantitative de l’endommagement de l’épithélium cornéen via la détermination de la quantité de fluorescéine sodique traversant toutes les couches cellulaires de la cornée.

Catégorie 1 de l'EPA: effet corrosif (destruction irréversible du tissu oculaire) ou complication cornéenne ou irritation persistant plus de 21 jours (1).

Catégorie R41 de l'UE: lésion des tissus oculaires ou dégradation sévère de la vue, provoquée par l'application d'une substance d'essai sur la face antérieure de l'œil, et qui n'est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l'application (2).

Taux de faux négatifs: proportion de substances positives faussement déclarées négatives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la méthode d'essai.

Taux de faux positifs: proportion des substances négatives faussement déclarées positives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la méthode d'essai.

SGH (Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques): système proposant la classification des produits chimiques (substances et mélanges) conformément à des types et des niveaux normalisés de dangers physiques, sanitaires et environnementaux, ainsi que la communication des éléments d'information correspondants, notamment par des pictogrammes, mentions d’avertissement, mentions de danger, conseils de prudence et fiches de données de sécurité, afin de diffuser des informations sur leurs effets indésirables dans l'objectif de protéger les personnes (en particulier les employeurs, employés, transporteurs, consommateurs et personnels des services d'urgence) et l'environnement (3).

Catégorie 1 du SGH: lésion des tissus oculaires ou dégradation sévère de la vue, provoquée par l'application d'une substance d'essai sur la face antérieure de l'œil, et qui n'est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l'application (3).

Danger: propriété intrinsèque d'un agent ou situation susceptible de provoquer des effets néfastes lorsqu'un organisme, un système ou une (sous-)population est exposé(e) à cet agent.

Score d'irritation in vitro (SIIV): formule établie empiriquement et utilisée dans les essais OPCB, dans laquelle les valeurs d'opacité moyenne et de perméabilité moyenne pour chaque lot de traitement sont combinées pour obtenir le score in vitro unique de chaque lot de traitement. SIIV = valeur moyenne d’opacité + (15 x valeur moyenne de perméabilité).

Témoin négatif: réplicat non traité contenant tous les composants d’un système d’essai. Cet échantillon subit les mêmes procédures que les échantillons traités avec la substance d'essai et les autres échantillons témoins afin de déterminer si le solvant interagit avec le système d’essai.

Substance non irritante: substance qui n'est pas classée comme irritant oculaire dans la catégorie I, II ou III de l'EPA, la catégorie R41 ou R36 de l'UE, ou la catégorie 1, 2A ou 2B du SGH.

Substance corrosive pour l'œil: a) substance provoquant des lésions irréversibles des tissus oculaires; b) substance classée comme irritant oculaire dans la catégorie 1 du SGH, la catégorie 1 de l’EPA ou la catégorie R41 de l’UE (1) (2) (3).

Substance irritante pour l'œil: a) substance provoquant une modification réversible de l’œil suite à une application sur la face antérieure de l’œil; b) substance classée comme irritant oculaire dans la catégorie II ou III de l'EPA, la catégorie R36 de l'UE ou la catégorie 2A ou 2B du SGH (1) (2) (3).

Substance fortement irritante pour l'œil: a) substance provoquant des lésions des tissus oculaires suite à une application sur la face antérieure de l’œil, qui ne sont pas résorbées dans les 21 jours suivant le traitement ou entraînent une dégradation sévère de la vue; b) substance classée comme irritant oculaire dans la catégorie 1 du SGH, la catégorie 1 de l’EPA ou la catégorie R41 de l’UE (1) (2) (3).

Opacitomètre: Instrument servant à mesurer l’«opacité cornéenne» en évaluant la quantité de lumière transmise à travers la cornée. En général, cet instrument est composé de deux compartiments, chacun disposant de sa propre source lumineuse et d'une cellule photoélectrique. L’un des compartiments est utilisé pour la cornée traitée tandis que l'autre sert à étalonner l’instrument et à le mettre à zéro. La lumière d’une lampe halogène est dirigée à travers un compartiment témoin (chambre vide, sans vitre ni liquide) vers une cellule photoélectrique, et comparée à la lumière envoyée à travers le compartiment expérimental, qui abrite la chambre contenant la cornée, jusqu'à une cellule photoélectrique. La lumière transmise par les deux cellules photoélectriques est ensuite comparée, et une valeur chiffrée d'opacité s’affiche sur un écran numérique.

Témoin positif: réplicat contenant tous les composants d’un système d’essai, et traité avec une substance induisant notoirement une réponse positive. Afin de pouvoir évaluer la variabilité des réponses du témoin positif dans le temps, la sévérité de la réponse ne devra pas être excessive.

Fiabilité: mesure de la reproductibilité de l'essai mis en œuvre, au sein d'un laboratoire et entre des laboratoires, au cours du temps, en utilisant le même mode opératoire. Elle est évaluée par calcul de la reproductibilité intralaboratoire et interlaboratoires et de la répétabilité intralaboratoire.

Témoin de solvant/véhicule: échantillon non traité contenant tous les composants d’un système d’essai, y compris le solvant ou véhicule utilisé pour tester les échantillons témoins traités ou non avec la substance d’essai afin de déterminer une réponse de référence pour les échantillons traités avec la substance d’essai dissoute dans le même solvant ou véhicule. Testé avec un témoin négatif concurrent, cet échantillon indique également si le solvant ou véhicule interagit avec le système d'essai.

Stratégie d'essai séquentielle: démarche expérimentale séquentielle consistant à examiner toutes les informations existantes sur une substance d'essai dans un ordre déterminé, en ayant recours à chaque étape à une procédure fondée sur la force probante des données pour déterminer si les informations disponibles sont suffisantes pour décider d'une classification des dangers, avant de passer à l'étape suivante. Si le potentiel d’irritation d’une substance d’essai peut être déterminé sur la base des informations existantes, aucun essai supplémentaire n’est nécessaire. Dans le cas contraire, une procédure expérimentale progressive de type séquentiel sur des animaux est alors lancée jusqu’à ce qu’une classification sans équivoque puisse être effectuée.

Méthode d'essai validée: méthode d'essai ayant fait l'objet d'études de validation visant à déterminer sa pertinence (notamment sa précision) et sa fiabilité à des fins spécifiques. Il importe de noter que les performances d'une méthode d'essai validée peuvent être insuffisantes en termes de précision et de fiabilité pour qu'elle soit jugée acceptable pour les besoins envisagés.

Force probante des données: prise en compte des forces et des faiblesses de divers éléments d’information en vue d'aboutir à une conclusion concernant le danger potentiel d’une substance et d’étayer cette conclusion.