2009R0152 — FR — 12.02.2013 — 002.001

Ce document constitue un outil de documentation et n’engage pas la responsabilité des institutions

►B RÈGLEMENT (CE) No 152/2009 DE LA COMMISSION du 27 janvier 2009 portant fixation des méthodes d'échantillonnage et d'analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE) (JO L 054, 26.2.2009, p.1)

Modifié par:









▼B

RÈGLEMENT (CE) No 152/2009 DE LA COMMISSION

du 27 janvier 2009

portant fixation des méthodes d'échantillonnage et d'analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)







LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté européenne, vu le règlement (CE) no 882/2004 du Parlement européen et du Conseil du 29 avril 2004 relatif aux contrôles officiels effectués pour s'assurer de la conformité avec la législation sur les aliments pour animaux et les denrées alimentaires et avec les dispositions relatives à la santé animale et au bien-être des animaux ( 1 ), et notamment son article 11, paragraphe 4, points a), b) et c), considérant ce qui suit: (1) Les actes suivants ont été adoptés aux fins de l'application de la directive 70/373/CEE et restent en vigueur conformément à l'article 61, paragraphe 2, du règlement (CE) no 882/2004: — première directive 71/250/CEE de la Commission du 15 juin 1971 portant fixation de méthodes d'analyse communautaire pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 2 ), — deuxième directive 71/393/CEE de la Commission du 18 novembre 1971 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 3 ), — troisième directive 72/199/CEE de la Commission du 27 avril 1972 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 4 ), — quatrième directive 73/46/CEE de la Commission du 5 décembre 1972 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 5 ), — première directive 76/371/CEE de la Commission du 1er mars 1976 portant fixation de modes de prélèvement communautaires d'échantillons pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 6 ), — septième directive 76/372/CEE de la Commission du 1er mars 1976 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 7 ), — huitième directive 78/633/CEE de la Commission du 15 juin 1978 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 8 ), — neuvième directive 81/715/CEE de la Commission du 31 juillet 1981 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 9 ), — dixième directive 84/425/CEE de la Commission du 25 juillet 1984 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 10 ), — directive 86/174/CEE de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énergétique des aliments composés destinés à la volaille ( 11 ), — onzième directive 93/70/CEE de la Commission du 28 juillet 1993 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 12 ), — douzième directive 93/117/CE de la Commission du 17 décembre 1993 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 13 ), — directive 98/64/CE de la Commission du 3 septembre 1998 portant fixation des méthodes d'analyse communautaires pour la détermination des acides aminés, des matières grasses brutes et de l'olaquindox dans les aliments des animaux et modifiant la directive 71/393/CEE ( 14 ), — directive 1999/27/CE de la Commission du 20 avril 1999 portant fixation des méthodes communautaires d'analyse pour le dosage de l'amprolium, du diclazuril et du carbadox dans les aliments des animaux, modifiant les directives 71/250/CEE, 73/46/CEE et abrogeant la directive 74/203/CEE ( 15 ), — directive 1999/76/CE de la Commission du 23 juillet 1999 portant fixation d'une méthode communautaire pour le dosage du lasalocide-sodium dans les aliments des animaux ( 16 ), — directive 2000/45/CE de la Commission du 6 juillet 2000 établissant des méthodes communautaires d'analyse pour la détermination de la vitamine A, de la vitamine E et du tryptophane dans les aliments pour animaux ( 17 ), — directive 2002/70/CE de la Commission du 26 juillet 2002 établissant des prescriptions pour la détermination des teneurs en dioxines et en PCB de type dioxine des aliments des animaux ( 18 ), — directive 2003/126/CE de la Commission du 23 décembre 2003 relative à la méthode d'analyse applicable en matière d'identification des constituants d'origine animale pour le contrôle officiel des aliments pour animaux ( 19 ). (2) La directive 70/373/CEE ayant été remplacée par le règlement (CE) no 882/2004, il convient de remplacer les actes d'application de cette directive par un règlement unique. Il convient également d'adapter les méthodes à la lumière de l'évolution des connaissances scientifiques et techniques. Les méthodes obsolètes doivent être supprimées. Il est prévu d'actualiser en temps utile les dispositions relatives au prélèvement d'échantillons pour qu'il y soit tenu compte des évolutions récentes de la manière de produire, d'entreposer, de transporter et de commercialiser les aliments pour animaux, mais il convient pour l'instant de maintenir les dispositions en vigueur dans ce domaine. (3) Il convient par conséquent d'abroger les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE et 2003/126/CE. (4) Les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité permanent de la chaîne alimentaire et de la santé animale, considérant ce qui suit: A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:







Article premier

Les prélèvements d'échantillons destinés au contrôle officiel des aliments pour animaux sont effectués conformément aux méthodes décrites à l'annexe I, pour ce qui concerne la détermination des constituants, des additifs et des substances indésirables, à l'exception des résidus de pesticides et des micro-organismes.

Article 2

La préparation des échantillons en vue de l'analyse et l'expression des résultats sont effectuées conformément aux méthodes décrites à l'annexe II.

Article 3

L'analyse réalisée aux fins du contrôle officiel des aliments pour animaux est effectuée conformément aux méthodes décrites à l'annexe III (méthodes d'analyse relatives au contrôle de la composition des matières premières pour aliments des animaux et des aliments composés), à l'annexe IV (méthodes d'analyse relatives au contrôle des teneurs en additifs autorisés des aliments pour animaux), à l'annexe V (méthodes d'analyse relatives au contrôle des substances indésirables dans les aliments pour animaux) et à l'annexe VI (méthodes d'analyse applicables en matière d'identification des constituants d'origine animale pour le contrôle officiel des aliments pour animaux).

Article 4

La valeur énergétique des aliments composés destinés à la volaille est calculée conformément à la méthode décrite à l'annexe VII.

Article 5

Les méthodes d'analyse relatives à la détection d'additifs dont la présence n'est plus autorisée dans les aliments pour animaux, décrites à l'annexe VIII, sont appliquées à des fins de confirmation.

Article 6

Les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE et 2003/126/CE sont abrogées.

Les références faites aux directives abrogées s'entendent comme faites au présent règlement et sont à lire selon le tableau de correspondance figurant à l'annexe IX.

Article 7

Le présent règlement entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l'Union européenne.

Il s'applique à partir du 26 août 2009

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.









ANNEXE I

MÉTHODES D'ÉCHANTILLONNAGE

1. OBJET ET CHAMP D'APPLICATION

Les échantillons destinés au contrôle officiel des aliments pour animaux sont prélevés conformément aux modalités indiquées ci-après. Les échantillons ainsi obtenus sont considérés comme étant représentatifs des lots.

2. PERSONNEL CHARGÉ DU PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS

Les prélèvements sont effectués par des personnes mandatées à cet effet par les États membres.

3. DÉFINITIONS

Lot: quantité de produit constituant une unité et ayant des caractéristiques présumées uniformes.

Échantillon élémentaire: quantité prélevée en un point du lot.

Échantillon global: ensemble d'échantillons élémentaires prélevés sur le même lot.

Échantillon réduit: partie représentative de l'échantillon global, obtenue par réduction de celui-ci.

Échantillon final: partie de l'échantillon réduit ou de l'échantillon global homogénéisé.

4. APPAREILLAGE

4.1. Les appareils destinés aux prélèvements doivent être construits en matériaux qui ne contaminent pas les produits à prélever. Ces appareils peuvent être homologués par les États membres.

4.2. Appareils recommandés pour le prélèvement d'échantillons d'aliments pour animaux solides

4.2.1. Prélèvement manuel

4.2.1.1. Pelle à fond plat et à bords verticaux.

4.2.1.2. Sonde à fente longue ou compartimentée. Les dimensions de la sonde doivent être adaptées aux caractéristiques du lot (profondeur du récipient, dimensions du sac, etc.) et à la taille des particules composant l'aliment.

4.2.2. Prélèvement mécanique

Des appareils mécaniques homologués peuvent être utilisés pour prélever des échantillons d'aliments en mouvement.

4.2.3. Diviseur

Des appareils destinés à diviser l'échantillon en parts approximativement égales peuvent être utilisés pour les prélèvements d'échantillons élémentaires ainsi que pour la préparation des échantillons réduits et des échantillons finals.

5. EXIGENCES QUANTITATIVES







5.A. Concernant le contrôle des substances ou des produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux 5.A.1. Lot La dimension du lot doit être telle que toutes les parties qui le composent puissent être échantillonnées. 5.A.2. Échantillons élémentaires 5.A.2.1. Aliments en vrac: Nombre minimal d'échantillons élémentaires: 5.A.2.1.1. lots n'excédant pas 2,5 tonnes sept 5.A.2.1.2. lots excédant 2,5 tonnes √ 20 fois le nombre de tonnes constituant le lot (1), jusqu'à 40 échantillons élémentaires au maximum. 5.A.2.2. Aliments emballés: Nombre minimal d'emballages à échantillonner (2): 5.A.2.2.1. emballages d'un contenu excédant un kilogramme: 5.A.2.2.1.1. lots composés de 1 à 4 emballages tous les emballages 5.A.2.2.1.2. lots composés de 5 à 16 emballages quatre 5.A.2.2.1.3. lots composés de plus de 16 emballages √ nombre d'emballages constituant le lot (1), jusqu'à 20 emballages au maximum. 5.A.2.2.2. emballages d'un contenu n'excédant pas un kilogramme quatre 5.A.2.3. Aliments liquides ou semi-liquides: Nombre minimal de récipients à échantillonner (2): 5.A.2.3.1. récipients d'un contenu excédant un litre: 5.A.2.3.1.1. lots composés de 1 à 4 récipients tous les récipients 5.A.2.3.1.2. lots composés de 5 à 16 récipients quatre 5.A.2.3.1.3. lots composés de plus de 16 récipients √ nombre de récipients constituant le lot (1), jusqu'à 20 récipients au maximum. 5.A.2.3.2. récipients d'un contenu n'excédant pas un litre quatre 5.A.2.4. Aliments en briques et pierres à lécher Nombre minimal de briques ou de pierres à échantillonner (2): une brique ou pierre par lot de 25 unités, jusqu'à quatre briques ou pierres au maximum 5.A.3. Échantillon global Un seul échantillon global par lot est requis. La quantité totale des échantillons élémentaires destinés à constituer l'échantillon global ne peut être inférieure à ce qui est prévu ci-après. 5.A.3.1. Aliments en vrac 4 kg 5.A.3.2. Aliments emballés: 5.A.3.2.1. emballages d'un contenu excédant un kilogramme 4 kg 5.A.3.2.2. emballages d'un contenu n'excédant pas un kilogramme poids du contenu de quatre emballages d'origine. 5.A.3.3. Aliments liquides ou semi-liquides: 5.A.3.3.1. récipients d'un contenu excédant un litre quatre litres 5.A.3.3.2. récipients d'un contenu n'excédant pas un litre volume du contenu de quatre récipients d'origine. 5.A.3.4. Aliments en briques ou pierres à lécher: 5.A.3.4.1. d'un poids unitaire excédant 1 kilogramme 4 kg 5.A.3.4.2. d'un poids unitaire n'excédant pas 1 kilogramme poids de quatre briques ou pierres d'origine 5.A.4. Échantillons finals L'échantillon global donnera lieu, après réduction, si nécessaire, à l'obtention d'échantillons finals. L'analyse d'au moins un échantillon final est requise. La quantité de l'échantillon final destinée à l'analyse ne peut être inférieure aux valeurs suivantes. Aliments solides 500 g Aliments liquides ou semi-liquides: 500 ml 5.B. Concernant le contrôle des substances ou des produits indésirables susceptibles d'être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux, tels les aflatoxines, l'ergot de seigle, le ricin et le crotalaria dans les matières premières pour aliments des animaux (3) 5.B.1. Lot: voir 5.A.1. 5.B.2. Échantillons élémentaires 5.B.2.1. Aliments en vrac: voir 5.A.2.1. 5.B.2.2. Aliments emballés: Nombre minimal d'emballages à échantillonner: 5.B.2.2.1. lots composés de 1 à 4 emballages tous les emballages 5.B.2.2.2. lots composés de 5 à 16 emballages quatre 5.B.2.2.3. lots composés de plus de 16 emballages √ nombre d'emballages constituant le lot (1), jusqu'à 40 emballages au maximum 5.B.3. Échantillons globaux Le nombre d'échantillons globaux variera en fonction du poids ou de la taille du lot. Le nombre minimal d'échantillons globaux par lot est indiqué ci-après. Le poids total des échantillons élémentaires destinés à constituer chaque échantillon global ne peut être inférieur à 4 kg. 5.B.3.1. Aliments en vrac Poids du lot, en tonne(s): Nombre minimal d'échantillons globaux par lot: inférieur ou égal à 1 1 supérieur à 1 et inférieur ou égal à 10 2 supérieur à 10 et inférieur ou égal à 40 3 supérieur à 40 4 5.B.3.2. Aliments emballés Taille du lot en nombre d'emballages: Nombre minimal d'échantillons globaux par lot: de 1 à 16 1 de 17 à 200 2 de 201 à 800 3 au-delà de 800 4 5.B.4. Échantillons finals Chaque échantillon global donnera lieu, après réduction, à l'obtention d'échantillons finals. L'analyse d'au moins un échantillon final par échantillon global est requise. Le poids de l'échantillon final destiné à l'analyse ne peut être inférieur à 500 grammes. (1) Lorsque le résultat obtenu est un nombre décimal, il doit être arrondi au nombre entier immédiatement supérieur. (2) Pour les emballages ou les récipients dont le contenu n'excède pas un kilogramme ou un litre ainsi que pour les briques ou pierres à lécher dont le poids unitaire n'excède pas 1 kilogramme, le contenu d'un emballage ou d'un récipient d'origine, une brique ou une pierre constituent un échantillon élémentaire. (3) Les méthodes prévues au point 5.A doivent être utilisées pour le contrôle des aflatoxines, de l'ergot de seigle, du ricin et du crotalaria dans les aliments complets et complémentaires.

6. INSTRUCTIONS CONCERNANT LE PRÉLÈVEMENT, LA PRÉPARATION ET LE CONDITIONNEMENT DES ÉCHANTILLONS

6.1. Généralités

Prélever et préparer les échantillons aussi rapidement que possible en tenant compte des précautions requises pour éviter que le produit ne soit altéré ou contaminé. Les instruments ainsi que les surfaces et les récipients destinés à recevoir les échantillons doivent être propres et secs.

6.2. Échantillons élémentaires

6.2.A. Concernant le contrôle des substances ou des produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux

Les échantillons élémentaires doivent être prélevés au hasard dans l'ensemble du lot et être approximativement égaux en poids.

6.2.A.1. Aliments en vrac

Diviser symboliquement le lot en parties approximativement égales. Choisir au hasard un nombre de parties correspondant au nombre d'échantillons élémentaires prévu au point 5.A.2 et prélever au moins un échantillon dans chacune de ces parties.

Selon le cas, l'échantillonnage peut avoir lieu lors de la mise en mouvement du lot (chargement ou déchargement).

6.2.A.2. Aliments emballés

Le nombre requis d'emballages à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5.A.2, prélever une partie du contenu de chaque emballage au moyen d'une sonde ou d'une pelle. Si nécessaire, prélever les échantillons après avoir vidé séparément les emballages. Si nécessaire, écraser les agrégats (en les séparant de la masse et en réunissant ensuite le tout) séparément pour chaque échantillon global.

6.2.A.3. Aliments liquides ou semi-liquides homogènes ou homogénéisables

Le nombre requis de récipients à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5.A.2, effectuer un prélèvement dans chaque récipient après en avoir homogénéisé le contenu, si nécessaire.

Les échantillons élémentaires peuvent être prélevés lors du soutirage du contenu.

6.2.A.4. Aliments liquides ou semi-liquides non homogénéisables

Le nombre requis de récipients à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5.A.2, prélever les échantillons à différents niveaux.

Les échantillons peuvent également être prélevés lors du soutirage du contenu, après élimination des premières fractions.

Dans les deux cas, le volume total prélevé ne peut être inférieur à 10 litres.

6.2.A.5. Aliments en briques et pierres à lécher

Le nombre requis de briques ou de pierres à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5.A.2, prélever une partie de chaque brique ou pierre.

6.2.B. Concernant le contrôle des substances ou des produits indésirables susceptibles d'être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux, tels les aflatoxines, l'ergot de seigle, le ricin et le crotalaria dans les matières premières pour aliments des animaux

Diviser symboliquement le lot en un nombre de parties approximativement égales, correspondant à celui des échantillons globaux prévu au point 5.B.3. Si ce nombre est supérieur à un, répartir le nombre total des échantillons élémentaires prévu au point 5.B.2 de façon approximativement égale dans les différentes parties. Effectuer ensuite des prélèvements de masses approximativement égales ( 20 ) et de façon à ce que la masse totale des échantillons concernant chaque partie ne soit pas inférieure à la quantité minimale de 4 kilogrammes, requise pour chaque échantillon global. Ne pas assembler les échantillons élémentaires provenant de parties différentes.

6.3. Préparation des échantillons globaux

6.3.A. Concernant le contrôle des substances ou des produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux

Mélanger les échantillons élémentaires pour constituer un seul échantillon global.

6.3.B. Concernant le contrôle des substances ou des produits indésirables susceptibles d'être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux, tels les aflatoxines, l'ergot de seigle, le ricin et le crotalaria dans les matières premières pour aliments des animaux

Mélanger les échantillons élémentaires relatifs à chaque partie du lot et constituer le nombre d'échantillons globaux prévu au point 5.B.3, en ayant soin de relever l'origine de chaque échantillon global.

6.4. Préparation des échantillons finals

Mélanger soigneusement chaque échantillon global pour obtenir un échantillon homogène ( 21 ). Si nécessaire, réduire à cet effet l'échantillon global jusqu'à 2 kilogrammes ou 2 litres au moins (échantillon réduit), soit au moyen d'un diviseur mécanique, soit par la méthode des quartiers.

Préparer ensuite au moins trois échantillons finals ayant approximativement la même masse ou le même volume et satisfaisant aux exigences quantitatives du point 5.A.4 ou 5.B.4. Introduire chaque échantillon dans un récipient approprié. Prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter toute modification de la composition de l'échantillon ou toute contamination ou altération pouvant survenir au cours du transport ou du stockage.

6.5. Conditionnement des échantillons finals

Sceller et étiqueter les récipients ou emballages (l'étiquette générale doit être incorporée dans le scellé) de façon à ce qu'il soit impossible de les ouvrir sans briser le scellé.

7. PROCÈS-VERBAL D'ÉCHANTILLONNAGE

Pour chaque prélèvement d'échantillons, établir un procès-verbal d'échantillonnage permettant d'identifier sans ambiguïté le lot échantillonné.

8. DESTINATION DES ÉCHANTILLONS

Pour chaque échantillon global, transmettre au moins un échantillon final le plus rapidement possible au laboratoire mandaté aux fins d'analyse, avec les indications nécessaires à l'analyse.









ANNEXE II

DISPOSITIONS GÉNÉRALES CONCERNANT LES MÉTHODES D'ANALYSE DES ALIMENTS POUR ANIMAUX

A. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS EN VUE DE L'ANALYSE

1. Objet

Les procédures décrites ci-après portent sur la préparation, en vue de leur analyse, des échantillons finals envoyés aux laboratoires de contrôle après leur prélèvement conformément aux dispositions de l'annexe I.

La préparation de ces échantillons doit permettre que les prises d'essais prévues dans les méthodes d'analyse soient homogènes et représentatives des échantillons finals.

2. Précautions à prendre

La procédure à suivre pour préparer des échantillons dépend des méthodes d'analyse appliquées. Il est donc essentiel de veiller à ce que la procédure suivie en la matière soit adaptée à la méthode d'analyse appliquée.

Effectuer toutes les opérations de façon à éviter autant que possible une contamination de l'échantillon ou des modifications de sa composition.

Effectuer les broyages, les mélanges et les tamisages aussi rapidement que possible en exposant au minimum l'échantillon à l'air et à la lumière. Éviter l'utilisation de moulins ou de broyeurs susceptibles de produire un échauffement notable de l'échantillon.

Le broyage manuel est recommandé pour les aliments particulièrement sensibles à la chaleur. Veiller, en outre, à ce que l'appareillage même ne soit pas une source de contamination en oligoéléments.

Si la préparation entraîne inévitablement une modification significative de la teneur en humidité de l'échantillon, déterminer sa teneur en humidité avant et après la préparation selon la méthode prévue à l'annexe III, point A.

3. Procédure

Diviser l'échantillon en sous-échantillons d'analyse et de référence adéquats en recourant à des techniques de division adaptées (par exemple, utilisation d'un diviseur d'échantillon à crans ou pelles ou d'un diviseur d'échantillon statique ou rotatif). La méthode des quartiers opposés n'est pas recommandée, car elle peut aboutir à des sous-échantillons présentant une erreur de division élevée. Conserver l'échantillon de référence dans un récipient approprié, propre et sec, muni d'une fermeture hermétique, et préparer les sous-échantillons d'analyse de 100 grammes au moins, comme indiqué ci-après.

3.1. Aliments pouvant être moulus en l'état

Sauf indication spécifique dans les méthodes d'analyse, tamiser la totalité de l'échantillon sur un tamis à mailles carrées de 1 mm de côté (conforme à la recommandation ISO R565) après l'avoir broyé, si nécessaire. Éviter tout broyage excessif.

Mélanger l'échantillon tamisé et le recueillir dans un récipient approprié, propre et sec, muni d'une fermeture hermétique. Mélanger de nouveau, immédiatement avant de prélever la prise d'essai.

3.2. Aliments pouvant être moulus après dessiccation

Sauf indication spécifique dans les méthodes d'analyse, dessécher l'échantillon, de façon à ramener sa teneur en humidité à un niveau compris entre 8 et 12 %, en appliquant le procédé de prédessiccation décrit au point 4.3 de la méthode de dosage de l'humidité mentionnée à l'annexe III, point A. Procéder ensuite comme indiqué au point 3.1.

3.3. Aliments liquides ou semi-liquides

Recueillir l'échantillon dans un récipient approprié, propre et sec, muni d'une fermeture hermétique. Mélanger soigneusement, immédiatement avant de prélever la prise d'essai.

3.4. Autres aliments

Si l'échantillon ne peut être préparé selon l'un des procédés indiqués ci-dessus, appliquer tout autre procédé de préparation approprié permettant d'obtenir des prises d'essai homogènes et représentatives des échantillons finals.

4. Conservation et stockage des échantillons

Conserver les échantillons à une température ne pouvant modifier leur composition. Utiliser des récipients de verre brun pour les échantillons destinés à l'analyse de vitamines ou de substances particulièrement sensibles à la lumière.

B. DISPOSITIONS CONCERNANT LES RÉACTIFS ET L'APPAREILLAGE UTILISÉS DANS LES MÉTHODES D'ANALYSE

1. Sauf indication spécifique dans les méthodes d'analyse, tous les réactifs doivent être de qualité «pour analyse» (p.a.). Pour l'analyse des oligoéléments, la pureté des réactifs doit être contrôlée par un essai à blanc. Selon le résultat obtenu, une purification supplémentaire des réactifs peut être requise.

2. Les opérations de mise en solution, de dilution, de rinçage ou de lavage, mentionnées dans les méthodes d'analyse sans indication quant à la nature du solvant ou du diluant, impliquent qu'il faut utiliser de l'eau. En règle générale, l'eau doit être déminéralisée ou distillée. Dans des cas particuliers, indiqués dans les méthodes d'analyse, elle doit être soumise à des procédés spécifiques de purification.

3. Compte tenu de l'équipement usuel des laboratoires de contrôle, seuls les instruments et appareils spéciaux ou devant répondre à des conditions spécifiques sont mentionnés dans les méthodes d'analyse. Ce matériel doit être propre, tout particulièrement pour les déterminations de très faibles quantités de substances.

C. APPLICATION DES MÉTHODES D'ANALYSE ET EXPRESSION DES RÉSULTATS

1. Procédé d'extraction

Plusieurs méthodes déterminent un procédé d'extraction spécifique. En règle générale, des procédés d'extraction autres que celui visé dans la méthode peuvent être appliqués, à condition que le procédé d'extraction appliqué ait une efficacité d'extraction équivalente avérée, pour la matrice analysée, à celle du procédé mentionné dans la méthode.

2. Procédé de purification

Plusieurs méthodes déterminent un procédé de purification spécifique. En règle générale, des procédés de purification autres que celui visé dans la méthode peuvent être appliqués, à condition qu'il soit prouvé que le procédé de purification appliqué donne des résultats d'analyse équivalents, pour la matrice analysée, à ceux que donne le procédé mentionné dans la méthode.

3. Mention de la méthode d'analyse appliquée

En général, une seule méthode d'analyse est établie pour la détermination d'une substance dans les aliments pour animaux. Lorsque plusieurs méthodes sont données, la méthode appliquée par le laboratoire de contrôle doit être mentionnée sur le bulletin d'analyse.

4. Nombre de déterminations

Le résultat indiqué sur le bulletin d'analyse est la valeur moyenne obtenue à partir de deux déterminations au moins, effectuées sur des prises d'essai distinctes, et dont la répétabilité est satisfaisante.

Néanmoins, si, lors de l'analyse de substances indésirables, le résultat de la première détermination est nettement (> 50 %) inférieur à la spécification à contrôler, il n'est pas nécessaire de procéder à une détermination supplémentaire, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies.

Si, lors du contrôle de la teneur déclarée en une substance ou en un ingrédient donné, le résultat de la première détermination confirme l'exactitude de la teneur déclarée (ce qui signifie que l'écart entre le résultat de l'analyse et la teneur déclarée se situe dans la plage admissible), il n'est pas nécessaire de procéder à des déterminations supplémentaires, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies.

Dans certains cas, la législation, par exemple la directive 79/373/CEE du Conseil ( 22 ), définit l'écart admissible.

5. Indication du résultat de l'analyse

Le résultat de l'analyse doit être exprimé conformément aux indications données dans la méthode d'analyse avec un nombre approprié de chiffres significatifs, et être corrigé, si nécessaire, en fonction de la teneur en humidité de l'échantillon final avant sa préparation.

6. Incertitude de mesure et taux de récupération en cas d'analyse de substances indésirables

En ce qui concerne les substances indésirables au sens de la directive 2002/32/CE, y compris les dioxines et les PCB de type dioxine, un produit destiné à l'alimentation animale est considéré comme ne satisfaisant pas à la teneur maximale fixée lorsque le résultat de l'analyse est jugé supérieur à la teneur maximale, compte tenu de l'incertitude de mesure élargie et de la correction de la récupération. La concentration analysée, corrigée au titre de la récupération et après soustraction de l'incertitude de mesure élargie, est utilisée pour l'évaluation de la conformité. Ce procédé est applicable uniquement dans les cas où la méthode d'analyse autorise l'estimation de l'incertitude de mesure et de la correction de la récupération (ce qui n'est pas possible, par exemple, dans le cas d'une analyse microscopique).

Le résultat de l'analyse est rapporté comme suit (lorsque la méthode d'analyse appliquée permet d'estimer l'incertitude de mesure et le taux de récupération):

a) corrigé au titre de la récupération, le taux de récupération étant indiqué. La correction de la récupération n'est pas nécessaire lorsque le taux de récupération est compris entre 90 et 110 %;

b) sous la forme «x +/- U», où x est le résultat de l'analyse et U l'incertitude de mesure élargie, calculée à l'aide d'un coefficient de couverture 2 qui donne un niveau de confiance d'environ 95 %.

Néanmoins, si le résultat de l'analyse est nettement (> 50 %) inférieur à la spécification à contrôler, et à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies et que l'analyse vise uniquement à contrôler si les dispositions légales sont respectées, ce résultat peut être mentionné sans correction de la récupération, et la mention du taux de récupération et de l'incertitude de mesure peut être omise dans ce cas.









ANNEXE III

MÉTHODES D'ANALYSE RELATIVES AU CONTRÔLE DE LA COMPOSITION DES MATIÈRES PREMIÈRES POUR ALIMENTS DES ANIMAUX ET DES ALIMENTS COMPOSÉS

A. DOSAGE DE L'HUMIDITÉ

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité des aliments pour animaux. Dans le cas d'aliments pour animaux contenant des substances volatiles telles que des acides organiques, il a été observé qu'une quantité significative de substances volatiles était dosée en même temps que la teneur en humidité.

Elle ne concerne pas l'analyse des produits laitiers en tant que matières premières pour aliments des animaux, l'analyse des substances minérales et des mélanges essentiellement composés de substances minérales, l'analyse des graisses et des huiles animales et végétales, ni l'analyse des graines et des fruits oléagineux.

2. Principe

L'échantillon est soumis à la dessiccation dans des conditions définies, variant en fonction de la nature de l'aliment pour animaux. La perte de poids est déterminée par pesée. Il est nécessaire de procéder à une prédessiccation lorsqu'il s'agit d'aliments solides qui ont une teneur en humidité élevée.

3. Appareillage

3.1. Broyeur construit en matériau n'absorbant pas l'humidité, facile à nettoyer, permettant un broyage rapide et uniforme sans provoquer d'échauffement sensible, évitant au maximum le contact avec l'air extérieur et permettant de satisfaire aux exigences énoncées aux points 4.1.1 et 4.1.2 (par exemple, microbroyeurs à marteaux ou à refroidissement à eau, moulins à cônes démontables, broyeurs à mouvement lent ou à disques dentés).

3.2. Balance d'analyse d'une précision de 1 mg.

3.3. Récipients secs en métal inoxydable ou en verre munis d'un couvercle hermétique; surface utile permettant d'obtenir une répartition de la prise d'essai de 0,3 g par cm2.

3.4. Étuve isotherme (± 2 oC) à chauffage électrique, assurant une régulation rapide de la température et convenablement ventilée ( 23 ).

3.5. Étuve à vide, à chauffage électrique réglable, munie d'une pompe à huile et soit d'un dispositif à introduction d'air chaud déshydraté, soit d'un déshydratant (par exemple, de l'oxyde de calcium).

3.6. Dessiccateur à plaque en métal ou en porcelaine, épaisse, perforée, contenant un déshydratant efficace.

4. Mode opératoire

NB: Les opérations décrites au présent point doivent être effectuées immédiatement après l'ouverture des emballages contenant les échantillons. Les analyses doivent être effectuées au moins en double.

4.1. Préparation

4.1.1. Aliments pour animaux autres que ceux visés aux points 4.1.2 et 4.1.3

Prélever au moins 50 g de l'échantillon. Si nécessaire, broyer ou diviser de façon appropriée pour éviter toute variation de la teneur en humidité (voir point 6).

4.1.2. Céréales et gruaux

Prélever au moins 50 g de l'échantillon. Moudre en particules dont au moins 50 % passent par un tamis à mailles de 0,5 mm et ne laissent pas plus de 10 % de refus sur le tamis à mailles rondes de 1 mm.

4.1.3. Aliments liquides ou pâteux, aliments constitués essentiellement de matières grasses

Prélever et peser, à 10 mg près, 25 g environ de l'échantillon, y ajouter une quantité appropriée de sable anhydre, pesée à 10 mg près, et mélanger jusqu'à obtention d'un produit homogène.

4.2. Dessiccation

4.2.1. Aliments pour animaux autres que ceux visés aux points 4.2.2 et 4.2.3

Tarer, à 1 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l'étuve préchauffée à 103 oC. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Laisser sécher durant quatre heures à partir du moment où l'étuve a de nouveau atteint la température de 103 oC. Remettre le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l'étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (3.6) et peser à 1 mg près.

Dans le cas des aliments constitués essentiellement de matières grasses, effectuer une dessiccation complémentaire de 30 minutes dans l'étuve à 130 oC. L'écart entre les deux pesées ne peut excéder 0,1 % d'humidité.

4.2.2. Céréales, farines, gruaux et semoules

Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon broyé et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l'étuve préchauffée à 130 oC. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Laisser sécher durant deux heures à partir du moment où l'étuve a de nouveau atteint la température de 130 oC. Remettre le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l'étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (3.6) et peser à 1 mg près.

4.2.3. Aliments composés pour animaux contenant plus de 4 % de saccharose ou de lactose: matières premières pour aliments des animaux tels que caroube, produits céréaliers hydrolysés, germes de malt, cossettes de betteraves, solubles de poisson et sucres; aliments composés pour animaux contenant plus de 25 % de sels minéraux renfermant de l'eau de cristallisation Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l'étuve à vide (3.5) préchauffée à une température comprise entre 80 et 85 oC. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Amener la pression à 100 torrs et laisser sécher à cette pression durant quatre heures, soit sous un courant d'air sec et chaud, soit à l'aide d'un déshydratant (300 g environ pour 20 échantillons). Dans ce dernier cas, couper la connexion avec la pompe à vide lorsque la pression prescrite est atteinte. Compter la durée de séchage à partir du moment où l'étuve a de nouveau atteint la température de 80 à 85 oC. Ramener ensuite avec précaution l'étuve à la pression atmosphérique. Ouvrir l'étuve, couvrir immédiatement le récipient de son couvercle, retirer le récipient de l'étuve, laisser refroidir durant 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (3.6) et peser à 1 mg près. Procéder à une dessiccation complémentaire de 30 minutes dans l'étuve à vide à la température de 80 à 85 oC et peser de nouveau. L'écart entre les deux pesées ne peut excéder 0,1 % d'humidité.

4.3. Prédessiccation

4.3.1. Aliments pour animaux autres que ceux mentionnés au point 4.3.2

Les aliments solides, dont la teneur en humidité est élevée et rend le broyage difficile, doivent être prédesséchés comme suit.

Peser, à 10 mg près, 50 g de l'échantillon non broyé (une division grossière peut être effectuée, si nécessaire, dans le cas des aliments comprimés ou agglomérés) dans un récipient approprié (par exemple, une plaque en aluminium de 20 × 12 cm munie d'un bord de 0,5 cm). Laisser sécher dans une étuve à la température de 60 à 70 oC, jusqu'à ce que la teneur en humidité soit ramenée à une valeur comprise entre 8 et 12 %. Retirer de l'étuve, laisser refroidir à découvert dans le laboratoire durant une heure et peser à 10 mg près. Broyer immédiatement après comme indiqué au point 4.1.1 et effectuer la dessiccation comme indiqué au point 4.2.1 ou 4.2.3, selon la nature de l'aliment.

4.3.2. Céréales

Les grains dont la teneur en humidité est supérieure à 17 % doivent être prédesséchés comme suit.

Peser, à 10 mg près, 50 g du grain non moulu dans un récipient approprié (par exemple, une plaque en aluminium de 20 × 12 cm munie d'un bord de 0,5 cm). Laisser sécher dans une étuve pendant 5 à 7 minutes à la température de 130 oC. Retirer de l'étuve, laisser refroidir à découvert dans le laboratoire durant deux heures et peser à 10 mg près. Moudre immédiatement après, comme indiqué au point 4.1.2 et effectuer la dessiccation comme indiqué au point 4.2.2.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité (X), exprimée en pourcentage de l'échantillon, est donnée par les formules suivantes.

5.1. Dessiccation sans prédessiccation

où:

m = poids initial, en grammes, de la prise d'essai,

m0 = poids, en grammes, de la prise d'essai sèche.

5.2. Dessiccation avec prédessiccation

où:

m = poids initial, en grammes, de la prise d'essai,

m1 = poids, en grammes, de la prise d'essai après prédessiccation,

m2 = poids, en grammes, de la prise d'essai après broyage ou mouture,

m0 = poids, en grammes, de la prise d'essai sèche.

5.3. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser 0,2 % de l'humidité (valeur absolue).

6. Observation

Si un broyage se révèle nécessaire et s'il s'avère que celui-ci entraîne une variation de la teneur en humidité du produit, les résultats de l'analyse des composants de l'aliment doivent être corrigés en fonction de la teneur en humidité de l'échantillon initial.

B. DOSAGE DE L'HUMIDITÉ DANS LES GRAISSES ET LES HUILES ANIMALES ET VÉGÉTALES

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité (eau et autres matières volatiles) des graisses et des huiles animales et végétales.

2. Principe

L'échantillon est soumis à la dessiccation à 103 oC jusqu'à cessation de la diminution de la masse (la perte de masse entre deux pesées successives doit être inférieure ou égale à 1 mg). La perte de poids est déterminée par pesée.

3. Appareillage

3.1. Récipient à fond plat, en matériau résistant à la corrosion, d'un diamètre de 8 à 9 cm et d'une hauteur de 3 cm environ.

3.2. Thermomètre, avec bulbe renforcé, et chambre de dilatation à l'extrémité supérieure, gradué de 80 oC environ à 110 oC au moins, d'une longueur de 10 cm environ.

3.3. Bain de sable ou plaque chauffante électrique.

3.4. Dessiccateur, contenant un déshydratant efficace.

3.5. Balance d'analyse.

4. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 20 g de l'échantillon homogénéisé dans le récipient (3.1) sec et taré contenant le thermomètre (3.2). Chauffer sur le bain de sable ou la plaque chauffante (3.3), en agitant constamment à l'aide du thermomètre, de façon à ce que la température atteigne 90 oC en 7 minutes environ.

Réduire l'intensité du chauffage en suivant la fréquence avec laquelle les bulles montent du fond du récipient. La température ne peut dépasser 105 oC. Continuer à agiter en raclant le fond du récipient jusqu'à cessation de la formation de bulles.

Pour assurer l'élimination complète de l'humidité, répéter à plusieurs reprises le chauffage à 103 oC ± 2 oC, en refroidissant à 93 oC entre les chauffages successifs. Laisser refroidir ensuite dans le dessiccateur (3.4) jusqu'à température ambiante et peser. Répéter cette opération jusqu'à ce que la perte de poids entre deux pesées successives n'excède plus 2 mg.

NB: Une augmentation de poids de l'échantillon après chauffage répété indique une oxydation de la graisse. Si cela se produit, calculer le résultat à partir de la pesée effectuée immédiatement avant le début de l'augmentation de poids.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité (X), exprimée en pourcentage de l'échantillon, est donnée par la formule suivante.

où:

m = poids, en grammes, de la prise d'essai,

m1 = poids, en grammes, du récipient avec son contenu, avant le chauffage,

m2 = poids, en grammes, du récipient avec son contenu, après le chauffage.

Les résultats inférieurs à 0,05 % doivent être rapportés par la mention «moins de 0,05 %».

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser 0,05 % en valeur absolue.

C. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN PROTÉINES BRUTES

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en protéines brutes des aliments pour animaux à partir de la teneur en azote dosée selon la méthode de Kjeldahl.

2. Principe

L'échantillon est minéralisé à l'acide sulfurique en présence d'un catalyseur. La solution acide est alcalinisée par une solution d'hydroxyde de sodium. L'ammoniac est entraîné par distillation et recueilli dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré par une solution étalon d'hydroxyde de sodium.

Autre possibilité: l'ammoniac libéré est distillé dans un excès de solution d'acide borique, après quoi l'ammoniac combiné avec l'acide borique est titré par une solution d'acide chlorhydrique ou d'acide sulfurique.

3. Réactifs

3.1. Sulfate de potassium.

3.2. Catalyseur: oxyde de cuivre (II) CuO ou sulfate de cuivre (II) pentahydraté CuSO45H2O.

3.3. Zinc en granulés.

3.4. Acide sulfurique, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Rouge de méthyle (indicateur): dissoudre 300 g de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Solution d'hydroxyde de sodium (utilisation possible de la qualité technique) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Hydroxyde de sodium, solution étalon volumétrique, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Hydroxyde de sodium, solution étalon volumétrique, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Granulés de pierre ponce lavés à l'acide chlorhydrique et calcinés.

3.13. Acétanilide (point de fusion = 114 oC, teneur N = 10,36 %).

3.14. Saccharose (exempt d'azote).

3.15. Acide borique (H3BO3).

3.16. Solution d'indicateur de rouge de méthyle: dissoudre 100 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol ou de méthanol.

3.17. Solution de vert de bromocrésol: dissoudre 100 mg de vert de bromocrésol dans 100 ml d'éthanol ou de méthanol.

3.18. Solution d'acide borique (de 10 g/l à 40 g/l en fonction de l'appareillage utilisé). En cas de détection colorimétrique au point d'équivalence, les indicateurs (rouge de méthyle et vert de bromocrésol) doivent être ajoutés aux solutions d'acide borique. Si 1 l de solution d'acide borique est préparé, avant ajustement du volume, ajouter 7 ml de solution d'indicateur de rouge de méthyle (3.16) et 10 ml de solution de vert de bromocrésol (3.17). En fonction de l'eau utilisée, le pH de la solution d'acide borique peut varier d'un lot à l'autre. Il est fréquent qu'il faille opérer un ajustement au moyen d'un petit volume d'alcali pour obtenir un blanc positif. NB: L'ajout d'environ 3 à 4 ml de NaOH (3.11) dans 1 l de solution d'acide borique à 10 g/l donne généralement de bons ajustements. Conserver la solution à température ambiante et la protéger de la lumière et des sources de vapeurs d'ammoniac pendant sa conversation.

3.19. Acide chlorhydrique, solution étalon volumétrique, c(HCL) = 0,10 mol/l. NB: Il est permis de modifier les concentrations des solutions volumétriques (points 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, et 3.19), à condition d'apporter les corrections nécessaires dans les calculs. Les concentrations devraient toujours être exprimées par des chiffres à quatre décimales.

4. Appareillage

Appareils permettant de réaliser les opérations de minéralisation, de distillation et de titrage selon la méthode de Kjeldahl.

5. Mode opératoire

5.1. Minéralisation

Peser, à 0,001 g près, 1 g de l'échantillon et introduire la prise d'essai dans le ballon de l'appareil de minéralisation. Ajouter 15 g de sulfate de potassium (3.1), une quantité appropriée de catalyseur (3.2) [0,3 à 0,4 g d'oxyde de cuivre (II) ou 0,9 à 1,2 g de sulfate de cuivre (II) pentahydraté], 25 ml d'acide sulfurique (3.4) et, si nécessaire, quelques grains de pierre ponce (3.12) et mélanger.

Chauffer le ballon, avec modération dans un premier temps, en agitant de temps en temps, si nécessaire, jusqu'à carbonisation de la masse et disparition de l'écume; chauffer ensuite plus intensément jusqu'à ébullition régulière du liquide. Le chauffage est approprié si l'acide en ébullition se condense sur la paroi du ballon. Éviter la surchauffe des parois et l'adhérence de particules organiques.

Lorsque la solution apparaît limpide et vert clair, maintenir l'ébullition durant 2 heures puis laisser refroidir.

5.2. Distillation

Ajouter avec précaution une quantité suffisante d'eau pour garantir une dissolution complète des sulfates. Laisser refroidir et ajouter, s'il le faut, quelques grains de zinc (3.3). Procéder conformément au point 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1. Distillation dans de l'acide sulfurique

Introduire, dans le flacon collecteur de l'appareil à distiller, 25 ml exactement mesurés d'acide sulfurique 3.5 ou 3.7, selon la teneur présumée en azote. Introduire quelques gouttes d'indicateur au rouge de méthyle (3.8).

Connecter le ballon de minéralisation au réfrigérant de l'appareil à distiller et plonger l'extrémité du réfrigérant sur une hauteur de 1 cm au moins dans le liquide du flacon collecteur (voir observation 8.3). Verser lentement 100 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.9) dans le ballon de minéralisation sans provoquer de perte d'ammoniac (voir observation 8.1). Chauffer le ballon jusqu'à distillation complète de l'ammoniac.

5.2.2. Distillation dans de l'acide borique

Lorsque le titrage de la teneur en ammoniac du distillat est effectué manuellement, le mode opératoire décrit ci-après est applicable. Lorsque l'unité de distillation est entièrement automatisée, y compris pour ce qui concerne le titrage de la teneur en ammoniac du distillat, suivre les instructions d'utilisation de l'unité de distillation fournies par le fabricant.

Placer un flacon collecteur contenant de 25 à 30 ml de solution d'acide borique (3.18) en sortie du réfrigérant de manière telle que le tube d'évacuation soit plongé dans l'excès de solution d'acide borique. Régler l'unité de distillation pour obtenir 50 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.9). Manier l'unité de distillation conformément aux instructions du fabricant et éliminer l'ammoniac libéré par distillation en ajoutant la solution d'hydroxyde de sodium. Recueillir le distillat dans la solution d'acide borique. La quantité de distillat (durée de distillation à la vapeur) dépend de la quantité d'azote dans l'échantillon. Suivre les instructions du fabricant.

NB: Une unité de distillation semi-automatique effectue automatiquement l'addition d'excès d'hydroxyde de sodium et la distillation à la vapeur.

5.3. Titrage

Procéder conformément au point 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1. Acide sulfurique

Titrer, dans le flacon collecteur, l'excès d'acide sulfurique par la solution d'hydroxyde de sodium (3.10 ou 3.11), selon la concentration de l'acide sulfurique utilisé, jusqu'à atteindre le point d'équivalence.

5.3.2. Acide borique

Titrer le contenu du flacon collecteur par la solution étalon volumétrique d'acide chlorhydrique (3.19) ou par la solution étalon volumétrique d'acide sulfurique (3.6) au moyen d'une burette et lire la quantité de solution titrée utilisée.

En cas de détection colorimétrique au point d'équivalence, le point d'équivalence est atteint dès la première trace de couleur rose dans le contenu. Estimer le contenu de la burette à 0,05 ml près. Un agitateur magnétique illuminé ou un détecteur photométrique peut faciliter la visualisation du point d'équivalence.

Cette étape peut être réalisée automatiquement au moyen d'une unité de distillation à titrage automatique.

Suivre les instructions du fabricant lors de l'utilisation d'une unité de distillation ou d'une unité de distillation avec titreur.

NB: En cas d'utilisation d'un système de titrage automatique, le titrage débute immédiatement après le démarrage de la distillation et la solution d'acide borique à 1 % (3.18) est utilisée. En cas d'utilisation d'une unité de distillation entièrement automatique, le titrage automatique de l'ammoniac peut se faire par détection au point d'équivalence au moyen d'un système potentiométrique (pH). Dans ce cas, un titreur automatique à pH-mètre est utilisé. Le pH-mètre doit être correctement étalonné dans une plage allant de pH 4 à pH 7 conformément aux procédures d'étalonnage habituelles. Le point d'équivalence du titrage est atteint à pH 4,6, qui est le point d'inflexion de la courbe de titrage.

5.4. Essai à blanc

Pour confirmer que les réactifs sont exempts d'azote, effectuer un essai à blanc (minéralisation, distillation et titrage) en utilisant 1 g de saccharose (3.14) en lieu en place de l'échantillon.

6. Calcul des résultats

Les calculs sont effectués conformément au point 6.1 ou 6.2.

6.1. Calcul pour le titrage conformément au point 5.3.1

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

V0 = volume (ml) de NaOH (3.10 ou 3.11) utilisé dans l'essai à blanc,

V1 = volume (ml) de NaOH (3.10 ou 3.11) utilisé pour le titrage de l'échantillon,

c = concentration (mol/l) de l'hydroxyde de sodium (3.10 ou 3.11),

m = poids (g) d'échantillon.

6.2. Calcul pour le titrage conformément au point 5.3.2

6.2.1. Titrage par une solution d'acide chlorhydrique

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

m = poids (g) de la prise d'essai,

c = concentration (mol/l) de la solution étalon volumétrique d'acide chlorhydrique (3.19),

V0 = volume (ml) d'acide chlorhydrique utilisé dans l'essai à blanc,

V1 = volume (ml) d'acide chlorhydrique utilisé dans la prise d'essai.

6.2.2. Titrage par une solution d'acide sulfurique

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

m = poids (g) de la prise d'essai,

c = concentration (mol/l) de la solution étalon volumétrique d'acide sulfurique (3.6),

V0 = volume (ml) d'acide sulfurique (3.6) utilisé dans l'essai à blanc,

V1 = volume (ml) d'acide sulfurique (3.6) utilisé dans la prise d'essai.

7. Vérification de la méthode

7.1. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne peut dépasser:

— 0,2 % en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes inférieures à 20 %,

— 1,0 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en protéines brutes comprises entre 20 et 40 %,

— 0,4 % en valeur absolue pour les teneurs supérieures à 40 %.

7.2. Exactitude

Effectuer l'analyse (minéralisation, distillation et titrage) à l'aide de 1,5 à 2,0 g d'acétanilide (3.13) en présence de 1 g de saccharose (3.14); 1 g d'acétanilide consomme 14,80 ml d'acide sulfurique (3.5). La récupération doit être de 99 % au moins.

8. Observations

8.1. L'appareil peut être de type manuel, semi-automatique ou automatique. Si l'appareil nécessite un transfert entre les étapes de minéralisation et de distillation, ce transfert doit être effectué sans perte. Si le ballon de l'appareil à distiller n'est pas équipé d'un entonnoir à robinet, ajouter l'hydroxyde de sodium immédiatement avant la connexion du ballon au réfrigérant en versant lentement le liquide le long de la paroi.

8.2. Si le produit minéralisé se solidifie, recommencer la détermination en utilisant une quantité d'acide sulfurique (3.4) plus grande que celle indiquée ci-dessus.

8.3. Pour les produits à faible teneur en azote, le volume d'acide sulfurique (3.7) à mettre dans le ballon collecteur peut être réduit, si nécessaire, à 10 ou à 15 ml et porté à 25 ml par addition d'eau.

8.4. Pour les analyses de routine, d'autres méthodes d'analyse peuvent être appliquées pour le dosage des protéines brutes, mais la méthode de Kjeldahl décrite au présent point C est la méthode de référence. L'équivalence entre les résultats de la méthode de substitution (par exemple, la méthode de Dumas) et ceux de la méthode de référence doit être démontrée pour chaque matrice séparément. Étant donné que, même après vérification de l'équivalence, les résultats obtenus au moyen d'une méthode de substitution peuvent s'écarter légèrement des résultats qui auraient été obtenus au moyen de la méthode de référence, il est nécessaire de mentionner sur le bulletin d'analyse la méthode d'analyse appliquée pour le dosage des protéines brutes.

D. DOSAGE DE L'URÉE

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en urée des aliments pour animaux.

2. Principe

L'échantillon est mis en suspension dans de l'eau en présence d'un défécant. La suspension est filtrée. La teneur en urée du filtrat est déterminée, après addition de 4-diméthylaminobenzaldéhyde (4-DMAB), par mesure de la densité optique à la longueur d'onde de 420 mm.

3. Réactifs

3.1. Solution de 4-diméthylaminobenzaldéhyde: dissoudre 1,6 g de 4-DMAB dans 100 ml d'éthanol à 96 % et ajouter 10 ml d'acide chlorhydrique (ρ201,19 g/ml). Ce réactif se conserve au maximum deux semaines.

3.2. Solution de Carrez I: dissoudre dans l'eau 21,9 g d'acétate de zinc Zn(CH3COO)2 2H2O, et 3 g d'acide acétique glacial. Ajuster à 100 ml avec de l'eau.

3.3. Solution de Carrez II: dissoudre dans l'eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4 Fe (CN)6 3 H2O. Ajuster à 100 ml avec de l'eau.

3.4. Charbon actif n'adsorbant pas l'urée (à contrôler).

3.5. Urée, solution à 0,1 % (p/v).

4. Appareillage

4.1. Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Tubes à essais: 160 × 16 mm, à bouchon rodé.

4.3. Spectrophotomètre.

5. Mode opératoire

5.1. Analyse de l'échantillon

Peser, à 1 mg près, 2 g de l'échantillon et les introduire avec 1 g de charbon actif (3.4) dans un flacon jaugé de 500 ml. Ajouter 400 ml d'eau et 5 ml de solution de Carrez I (3.2), agiter pendant environ 30 secondes et ajouter ensuite 5 ml de solution de Carrez II (3.3). Mélanger durant trente minutes dans le culbuteur. Ajuster au trait de jauge avec de l'eau, agiter et filtrer.

Prélever 5 ml des filtrats limpides et incolores, les introduire dans les tubes à essais à bouchon rodé, ajouter 5 ml de solution de 4-DMAB (3.1) et mélanger. Placer les tubes dans un bain d'eau à 20 oC (+/- 4 oC). Après quinze minutes, mesurer la densité optique de la solution d'échantillon au spectrophotomètre à 420 nm par comparaison avec la solution de l'essai à blanc des réactifs.

5.2. Courbe d'étalonnage

Prélever des volumes de 1, 2, 4, 5 et 10 ml de la solution d'urée (3.5), les introduire dans des fioles jaugées de 100 ml et ajuster au trait de jauge avec de l'eau. Prélever 5 ml de chaque solution, y ajouter chaque fois 5 ml de solution de 4-DMAB (3.1), homogénéiser et mesurer la densité optique comme indiqué plus haut par comparaison avec une solution de référence contenant 5 ml de 4-DMAB et 5 ml d'eau exempte d'urée. Tracer la courbe d'étalonnage.

6. Calcul des résultats

Déterminer la quantité d'urée de la prise d'essai en se référant à la courbe d'étalonnage.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l'échantillon.

7. Observations

7.1. Pour les teneurs en urée supérieures à 3 %, réduire la prise d'essai à 1 g ou diluer la solution initiale pour ne pas avoir plus de 50 mg d'urée dans 500 ml.

7.2. Pour les faibles teneurs en urée, augmenter la prise d'essai pour autant que le filtrat reste limpide et incolore.

7.3. Si l'échantillon contient des composés azotés simples, tels que les acides aminés, il convient d'effectuer la mesure de la densité optique à 435 nm.

E. DOSAGE DES BASES AZOTÉES VOLATILES

I. PAR MICRODIFFUSION

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en bases azotées volatiles, exprimées en ammoniac, des aliments pour animaux.

2. Principe

L'échantillon est extrait par l'eau et la solution est déféquée et filtrée. Les bases azotées volatiles sont déplacées à l'aide d'une solution de carbonate de potassium par microdiffusion, recueillies dans une solution d'acide borique et titrées par l'acide sulfurique.

3. Réactifs

3.1. Acide trichloracétique, solution à 20 % (p/v).

3.2. Indicateur: dissoudre 33 mg de vert de bromocrésol et 65 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol à 95-96 % (v/v).

3.3. Solution d'acide borique: dans une fiole jaugée de 1 l, dissoudre 10 g d'acide borique dans 200 ml d'éthanol à 95-96 % (v/v) et 700 ml d'eau. Ajouter 10 ml d'indicateur (3.2). Mélanger et ajuster si nécessaire la coloration de la solution au rouge clair par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. 1 ml de cette solution permet de fixer au maximum 300 μg de NH3.

3.4. Solution saturée de carbonate de potassium: dissoudre 100 g de carbonate de potassium dans 100 ml d'eau en ébullition. Laisser refroidir et filtrer.

3.5. Acide sulfurique 0,01 mol/l.

4. Appareillage

4.1. Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Cellules de Conway (voir schéma), en verre ou en plastique.

4.3. Microburettes, graduées au 1/100 ml.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 10 g de l'échantillon et les introduire avec 100 ml d'eau dans une fiole jaugée de 200 ml. Mélanger ou agiter durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajouter 50 ml de solution d'acide trichloracétique (3.1), ajuster au trait de jauge avec de l'eau, agiter vigoureusement et filtrer sur un filtre à plis.

Introduire à la pipette, dans la partie centrale de la cellule de Conway, 1 ml de solution d'acide borique (3.3) et dans la couronne de la cellule 1 ml du filtrat de l'échantillon. Couvrir partiellement à l'aide du couvercle graissé. Laisser tomber rapidement dans la couronne 1 ml de solution saturée de carbonate de potassium (3.4) et fermer le couvercle de façon hermétique. Remuer avec précaution la cellule en lui donnant un mouvement de rotation dans un plan horizontal, afin d'assurer le mélange des deux réactifs. Laisser incuber soit durant quatre heures au moins à température ambiante, soit durant une heure à 40 oC.

Titrer les bases volatiles dans la solution d'acide borique par l'acide sulfurique (3.5) en utilisant une microburette (4.3).

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire, en l'absence d'échantillon à analyser.

6. Calcul des résultats

1 ml de H2SO40,01 mol/l correspond à 0,34 mg d'ammoniac.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser:

— 10 % en valeur relative pour les teneurs en ammoniac inférieures à 1,0 %,

— 0,1 % en valeur absolue pour les teneurs en ammoniac égales ou supérieures à 1,0 %.

7. Observation

Si la teneur en ammoniac de l'échantillon est supérieure à 0,6 %, diluer le filtrat initial.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. PAR DISTILLATION

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en bases azotées volatiles, exprimées en ammoniac, des farines de poisson ne contenant presque pas d'urée. Elle n'est applicable que pour des teneurs en ammoniac inférieures à 0,25 %.

2. Principe

L'échantillon est extrait par l'eau et la solution est déféquée et filtrée. Les bases azotées volatiles sont déplacées à l'ébullition par addition d'oxyde de magnésium et recueillies dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré en retour par une solution d'hydroxyde de sodium.

3. Réactifs

3.1. Acide trichloracétique, solution à 20 % (p/v).

3.2. Oxyde de magnésium.

3.3. Émulsion antimousse (silicone, par exemple).

3.4. Acide sulfurique 0,05 mol/l.

3.5. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 mol/l.

3.6. Solution à 0,3 % de rouge de méthyle dans l'éthanol à 95-96 % (v/v).

4. Appareillage

4.1. Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Appareil à distiller de type Kjeldahl.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 10 g de l'échantillon et les introduire avec 100 ml d'eau dans une fiole jaugée de 200 ml. Mélanger ou agiter durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajouter 50 ml de solution d'acide trichloracétique (3.1), ajuster au trait de jauge avec de l'eau, agiter vigoureusement et filtrer sur un filtre à plis.

Prélever une quantité de filtrat limpide approprié à la teneur présumée en bases azotées volatiles (100 ml conviennent en général). Diluer à 200 ml et ajouter 2 g d'oxyde de magnésium (point 3.2) et quelques gouttes d'émulsion antimousse (3.3). La solution doit être alcaline au papier de tournesol; si elle ne l'est pas, ajouter de l'oxyde de magnésium (3.2). Procéder conformément aux points 5.2 et 5.3 de la méthode de détermination de la teneur en protéines brutes (point C de la présente annexe).

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire, en l'absence d'échantillon à analyser.

6. Calcul des résultats

1 ml de H2SO40,05 mol/l correspond à 1,7 mg d'ammoniac.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser, en valeur relative, 10 % d'ammoniac.

F. DOSAGE DES ACIDES AMINÉS (À L'EXCEPTION DU TRYPTOPHANE)

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de doser les acides aminés libres (de synthèse et naturels) et totaux (liés dans des peptides et libres) dans les aliments pour animaux au moyen d'un analyseur d'acides aminés. Elle s'applique aux acides aminés suivants: cyst(é)ine, méthionine, lysine, thréonine, alanine, arginine, acide aspartique, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, phénylalanine, proline, serine, tyrosine et valine.

La méthode ne fait pas de distinction entre les sels des acides aminés et ne permet pas de différencier les formes D et L des acides aminés. Elle ne convient pas pour le dosage du tryptophane et des analogues hydroxylés des acides aminés.

2. Principe

2.1. Acides aminés libres

Les acides aminés libres sont extraits à l'aide d'acide chlorhydrique dilué. Les macromolécules azotées coextraites sont précipitées à l'aide d'acide sulfosalicylique et éliminées par filtration. La solution filtrée est ajustée à pH 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d'ions et dosés par réaction avec la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm.

2.2. Acides aminés totaux

Le mode opératoire dépend des acides aminés à examiner. La cyst(é)ine et la méthionine doivent être oxydées pour devenir respectivement de l'acide cystéique et de la méthionine sulfone avant hydrolyse. La tyrosine doit être dosée dans l'hydrolysat d'échantillons non oxydés. Tous les autres acides aminés mentionnés au point 1 peuvent être dosés soit dans un échantillon oxydé, soit dans un échantillon non oxydé.

L'oxydation s'effectue à 0 oC à l'aide d'un mélange d'acide performique et de phénol. L'excédent de réactif d'oxydation est décomposé à l'aide de disulfite de sodium. L'échantillon oxydé ou non oxydé est hydrolysé à l'aide d'acide chlorhydrique (3.20) pendant 23 heures. L'hydrolysat est ajusté à pH 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d'ions et dosés par réaction à la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm (440 nm pour la proline).

3. Réactifs

Utiliser de l'eau bidistillée ou de l'eau de qualité équivalente (conductivité < 10 μS)

3.1. Peroxyde d'hydrogène, p (p/p) = 30 %.

3.2. Acide formique, p (p/p) = 98-100 %.

3.3. Phénol.

3.4. Disulfite de disodium.

3.5. Hydroxyde de sodium.

3.6. Acide 5-sulfosalicylique dihydraté.

3.7. Acide chlorhydrique, densité approximative de 1,18 g/ml.

3.8. Citrate de tri-sodium dihydraté.

3.9. 2,2'-Thiodiéthanol (thiodiglycol).

3.10. Chlorure de sodium.

3.11. Ninhydrine.

3.12. Éther de pétrole, intervalle d'ébullition: 40-60 oC.

3.13. Norleucine ou autre composé pouvant être utilisé comme étalon interne.

3.14. Azote gazeux (< 10 ppm d'oxygène).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Acides aminés.

3.16.1. Substances étalons visées au point 1. Composés purs ne contenant pas d'eau de cristallisation. Sécher sous vide sur P2O5 ou H2SO4 pendant une semaine avant utilisation.

3.16.2. Acide cystéique.

3.16.3. Méthionine sulfone.

3.17. Solution d'hydroxyde de sodium, c = 7,5 mol/l: dissoudre 300 g de NaOH (3.5) dans de l'eau et ajuster à 1 l.

3.18. Solution d'hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l: dissoudre 40 g de NaOH (3.5) dans de l'eau et ajuster à 1 l.

3.19. Solution d'acide formique — phénol: mélanger 889 g d'acide formique (3.2) et 111 g d'eau en ajoutant 4,73 g de phénol (3.3).

3.20. Mélange à hydrolyser, c = 6 mol HCl/l contenant 1 g de phénol/l: ajouter 1 g de phénol (3.3) à 492 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l'eau.

3.21. Mélange d'extraction, c = 0,1 mol HCl/l contenant 2 % de thiodiglycol: prendre 8,2 ml de HCl (3.7), diluer dans environ 900 ml d'eau, ajouter 20 ml de thiodiglycol (3.9) et ajuster à 1 l avec de l'eau (ne pas mélanger directement 3.7 et 3.9).

3.22. Acide 5-sulfosalicylique, ß = 6 %: dissoudre 60 g d'acide 5-sulfosalicylique (3.6) dans de l'eau et ajuster à 1 l avec de l'eau.

3.23. Mélange d'oxydation (acide performique-phénol): mélanger 0,5 ml de peroxyde d'hydrogène (3.1) avec 4,5 ml d'une solution de phénol et d'acide formique (3.19) dans un petit bécher. Incuber à une température de 20 à 30 oC pendant une heure pour obtenir de l'acide performique, laisser refroidir ensuite sur un bain d'eau glacée (15 minutes) avant de l'ajouter à l'échantillon. Attention: éviter tout contact avec la peau et porter des vêtements de protection.

3.24. Tampon au citrate, c = 0,2 mol de Na+/l, pH= 2,20: dissoudre 19,61 g de citrate de sodium (3.8), 5 ml de thiodiglycol (3.9), 1 g de phénol (3.3) et 16,50 ml de HCl (3.7) dans environ 800 ml d'eau. Ajuster le pH à 2,20. Ajuster à 1 l avec de l'eau.

3.25. Tampons d'élution préparés conformément aux prescriptions prévues pour l'analyseur (4.9).

3.26. Réactif à la ninhydrine préparé conformément aux prescriptions prévues pour l'analyseur (4.9).

3.27. Solutions étalons d'acides aminés. Conserver ces solutions à une température inférieure à 5 oC.

3.27.1. Solution mère étalon d'acides aminés (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml de chacun dans l'acide chlorhydrique. S'obtient dans le commerce.

3.27.2. Solution mère étalon d'acide cystéique et de méthionine sulfone, c = 1,25 μmol/ml. Dissoudre 0,2115 g d'acide cystéique (3.16.2) et 0,2265 g de méthionine sulfone (3.16.3) dans du tampon au citrate (3.24) dans une fiole jaugée de 1 l et ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 12 mois au maximum. Cette solution n'est pas utilisée si la solution mère de l'étalon (3.27.1) contient de l'acide cystéique et de la méthionine sulfone.

3.27.3. Solution de l'étalon interne, par exemple norleucine. c = 20 μmol/ml. Dissoudre 0,6560 g de norleucine (3.13) dans du tampon au citrate (3.24) dans une fiole jaugée et ajuster à 250 ml à l'aide du tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 6 mois au maximum.

3.27.4. Solution d'étalonnage des acides aminés à utiliser avec des hydrolysats, c = 5 nmol/50 μl d'acide cystéique et de méthionine sulfone et c = 10 nmol/50 μl des autres acides aminés. Dissoudre 2,2 g de chlorure de sodium (3.10) dans un bécher de 100 ml avec 30 ml de tampon au citrate (3.24). Ajouter 4,00 ml de la solution étalon d'acides aminés (3.27.1), 4,00 ml de solution étalon d'acide cystéique et de méthionine de sulfone (3.27.2) et 0,50 ml de solution de l'étalon interne (3.27.3) le cas échéant. Ajuster le pH à 2,20 avec de l'hydroxyde de sodium (3.18). Transférer dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au trait de jauge de jauge avec du tampon au citrate (3.24) et mélanger. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 3 mois au maximum. Voir aussi les observations du point 9.1.

3.27.5. Solution d'étalonnage des acides aminés à utiliser avec des hydrolysats préparés conformément au point 5.3.3.1 et destinés à être utilisés avec des extraits (5.2). Préparer la solution d'étalonnage conformément au point 3.27.4, mais sans chlorure de sodium. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 3 mois au maximum.

4. Appareillage

4.1. Ballon sphérique de 100 ou de 250 ml pourvu d'un réfrigérant à reflux.

4.2. Flacon en verre de borosilicate de 100 ml avec bouchon à vis avec garniture de caoutchouc/téflon (par exemple Duran, Schott) pouvant être utilisé dans une étuve.

4.3. Étuve à ventilation forcée et régulation de la température d'une précision supérieure à ± 2 oC.

4.4. pH-mètre (à graduation à trois décimales).

4.5. Filtre à membrane (0,22 μm).

4.6. Centrifugeuse.

4.7. Évaporateur rotatif sous vide.

4.8. Agitateur mécanique ou magnétique.

4.9. Analyseur d'acides aminés ou équipement pour CLHP avec colonne échangeuse d'ions, dispositif pour ninhydrine, dérivatisation postcolonne et détecteur photométrique. La colonne est remplie avec des résines de polystyrène sulfonées capables de séparer les différents acides aminés les uns des autres et d'autres produits réagissant à la ninhydrine. Le flux du tampon et du réactif de ninhydrine est assuré par des pompes dont le degré de stabilité du flux est de ±0,5 % dans la période couvrant l'analyse de la solution d'étalonnage et l'analyse de l'échantillon. Avec certains analyseurs d'acides aminés, on peut utiliser des méthodes d'hydrolyse dans lesquelles l'hydrolysat a une concentration de sodium de c = 0,8 mol/l et contient tout l'acide formique résiduel provenant de l'oxydation. D'autres appareils ne donnent pas une séparation satisfaisante de certains acides aminés si l'hydrolysat contient trop d'acide formique et/ou présente des concentrations élevées d'ions sodium. Dans ce cas, le volume de l'acide est réduit par évaporation à environ 5 ml après l'hydrolyse et avant l'ajustement du pH. L'évaporation doit être faite sous vide à 40 oC au maximum.

5. Mode opératoire

5.1. Préparation de l'échantillon

Broyer l'échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à forte teneur en humidité doivent être séchés à l'air à une température de 50 oC au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent être extraits par l'éther de pétrole (3.12) avant broyage.

5.2. Dosage des acides aminés libres dans les aliments pour animaux et les prémélanges

Peser, à 0,2 mg près, une quantité adéquate (1-5 g) de l'échantillon préparé (5.1) dans un erlenmeyer et ajouter 100,0 ml du mélange d'extraction (3.21). Agiter le mélange pendant 60 min à l'aide d'un agitateur mécanique ou magnétique (4.8). Laisser décanter le sédiment et introduire à la pipette 10,0 ml de la solution surnageante dans un bécher de 100 ml.

Ajouter 5,0 ml de la solution d'acide sulfosalicylique (3.22) tout en remuant et poursuivre l'agitation pendant 5 min à l'aide de l'agitateur magnétique. Filtrer ou centrifuger la phase surnageante en vue d'en séparer le précipitat éventuel. Verser 10,0 ml de la solution obtenue dans un bécher de 100 ml, ajuster le pH à 2,20 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium (3.18), transférer le tout dans une fiole jaugée d'un volume approprié à l'aide du tampon au citrate (3.24) et ajuster au trait de jauge avec la solution tampon (3.24).

Si un étalon interne est utilisé, ajouter 1,00 ml de l'étalon interne (3.27.3) par fraction de 100 ml de la solution finale et ajuster au trait de jauge avec la solution tampon (3.24).

Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Si les extraits ne sont pas chromatographiés le même jour, les conserver à une température inférieure à 5 oC.

5.3. Dosage des acides aminés totaux

5.3.1. Oxydation

Peser, à 0,2 mg près, entre 0,1 et 1 g de l'échantillon préparé (5.1) dans:

— un ballon sphérique de 100 ml (4.1) pour hydrolyse ouverte (5.3.2.3), ou

— un ballon sphérique de 250 ml (4.1) si l'on a besoin d'une faible concentration de sodium (5.3.3.1), ou

— un flacon de 100 ml à bouchon à vis (4.2) (pour hydrolyse fermée 5.3.2.4).

La portion d'échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg et une teneur en humidité de 100 mg au plus.

Placer le ballon sphérique ou le flacon dans un bain d'eau glacée et refroidir à 0 oC; ajouter 5 ml du mélange à oxyder (3.23) et mélanger à l'aide d'une spatule de verre à bout courbé. Fermer hermétiquement le ballon/le flacon contenant la spatule à l'aide d'un film hermétique à l'air, placer le bain d'eau glacée avec le récipient ainsi fermé dans un réfrigérateur à 0 oC et l'y laisser séjourner pendant 16 heures. Enlever ensuite le produit du réfrigérateur et décomposer l'excès de réactif d'oxydation par addition de 0,84 g de disulfite de sodium (3.4).

Passer à l'opération du point 5.3.2.1.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1. Hydrolyse des échantillons oxydés

À l'échantillon oxydé préparé conformément au point 5.3.1, ajouter 25 ml du mélange d'hydrolyse (3.20) en prenant soin d'éliminer par rinçage tout résidu de l'échantillon adhérant aux parois du récipient et à la spatule.

Selon la méthode d'hydrolyse utilisée, appliquer la méthode visée au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydrolyse des échantillons non oxydés

Peser dans un ballon sphérique de 100 ml ou de 250 ml (4.1) ou dans un tube de 100 ml pourvu d'un bouchon à vis (4.2), à 0,2 mg près, de 0,1 à 1 g de l'échantillon préparé (5.1). La portion d'échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg. Ajouter avec précaution 25 ml du mélange à hydrolyser (3.20) et mélanger avec l'échantillon. Procéder conformément au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hydrolyse ouverte

Ajouter 3 billes de verre au mélange contenu dans le ballon (préparé conformément au point 5.3.2.1 ou 5.3.2.2) et faire bouillir sous reflux en bouillonnement constant pendant 23 heures. Après l'hydrolyse, rincer le réfrigérant au moyen de 5 ml du tampon au citrate (3.24). Déconnecter le ballon et le faire refroidir dans un bain glacé.

Poursuivre conformément au point 5.3.3.

5.3.2.4. Hydrolyse fermée

Placer le flacon contenant le mélange préparé conformément au point 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 dans une étuve (4.3) chauffée à 110 oC. Pendant la première heure, placer le bouchon à vis sur le récipient de manière à éviter une élévation de la pression (due à l'évolution des substances gazeuses) et une explosion. Ne pas fermer le récipient en vissant le bouchon. Après 1 heure, fermer le récipient à l'aide du bouchon à vis et laisser reposer dans l'étuve (4.3) pendant 23 heures. Après l'hydrolyse, enlever le flacon de l'étuve, ouvrir avec précaution le bouchon et placer le flacon dans un bain d'eau glacée. Laisser refroidir.

Selon la procédure adoptée pour l'ajustement du pH (5.3.3), transférer quantitativement le contenu du flacon dans un bécher de 250 ml ou dans un ballon sphérique de 250 ml à l'aide du tampon au citrate (3.24).

Poursuivre conformément au point 5.3.3.

5.3.3. Ajustement du pH

En fonction de la tolérance en sodium de l'analyseur d'acides aminés (4.9), procéder conformément aux points 5.3.3.1 ou 5.3.3.2 pour l'ajustement du pH.

5.3.3.1. Pour des systèmes chromatographiques (4.9) demandant une faible concentration de sodium

Il est recommandé d'utiliser un étalon interne (3.27.3) si on utilise des analyseurs d'acides aminés demandant une faible concentration de sodium (lorsque le volume d'acide doit être réduit).

Dans ce cas, ajouter 2,00 ml de la solution de l'étalon interne (3.27.3) à l'hydrolysat avant évaporation.

Ajouter 2 gouttes de 1-Octanol (3.15) à l'hydrolysat obtenu conformément à la procédure du point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

À l'aide d'un évaporateur rotatif (4.7), réduire sous vide à 40 oC le volume à un niveau compris entre 5 et 10 ml. Si le volume est accidentellement réduit à moins de 5 ml, l'hydrolysat doit être rejeté et l'analyse recommencée.

Ajuster le pH à 2,20 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium (3.18) et poursuivre conformément au point 5.3.4.

5.3.3.2. Pour tous les autres analyseurs d'acides aminés (4.9)

Recueillir les hydrolysats obtenus conformément au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 et les neutraliser partiellement en ajoutant avec précaution, tout en agitant, 17 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium (3.17), la température restant inférieure à 40 oC.

L'ajustement du pH final à 2,20 s'effectue à température ambiante au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium conforme au point 3.17 et, enfin, d'une solution d'hydroxyde de sodium conforme au point 3.18. Poursuivre conformément au point 5.3.4.

5.3.4. Solution d'échantillon pour chromatographie

Transférer quantitativement l'hydrolysat à pH ajusté (5.3.3.1 ou 5.3.3.2) avec le tampon au citrate (3.24) dans une fiole jaugée de 200 ml et ajuster au trait de jauge à l'aide du tampon (3.24).

Si l'étalon interne (3.27.3) n'a pas encore été utilisé, en ajouter 2,00 ml et ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate (3.24). Mélanger soigneusement.

Poursuivre par la chromatographie (5.4).

Si les solutions des échantillons ne sont pas chromatographiées le même jour, les conserver à une température inférieure à 5 oC.

5.4. Chromatographie

Avant la chromatographie, porter l'extrait (5.2) ou l'hydrolysat (5.3.4) à température ambiante. Agiter le mélange et filtrer une partie appropriée à travers un filtre à membrane de 0,22 μm (4.5). La solution claire obtenue est soumise à une chromatographie par échange d'ions au moyen d'un analyseur d'acides aminés (4.9).

L'injection peut être opérée manuellement ou automatiquement. Il importe que la même quantité de solution (± 0,5 %) soit toujours ajoutée à la colonne pour l'analyse des étalons et des échantillons, sauf lorsqu'un étalon interne est utilisé, et que les rapports sodium/acide aminé dans les solutions étalons et les solutions des échantillons soient aussi identiques que possible.

En général, la fréquence des injections de la solution d'étalonnage dépend de la stabilité du réactif ninhydrine et du système d'analyse. La solution étalon ou d'échantillon est diluée avec un tampon au citrate (3.24) pour donner une surface de pic de la solution étalon de 30 à 200 % de la surface de pic de l'acide aminé dans l'échantillon.

La chromatographie des acides aminés varie légèrement selon le type d'analyseur employé et de résine utilisée. Le système retenu doit permettre de séparer les acides aminés les uns des autres et des substances réagissant à la ninhydrine. Au cours de l'opération, le système chromatographique doit donner une réponse linéaire à des variations des quantités d'acides aminés ajoutés dans la colonne.

Pendant la phase de chromatographie, les rapports de hauteur entre creux et sommets de pics mentionnés ci-dessous sont applicables lorsqu'une solution équimolaire des acides aminés est analysée. Cette solution équimolaire doit contenir au moins 30 % de la charge maximale de chaque acide aminé qui peut être déterminée avec précision à l'aide du système analyseur d'acides aminés (4.9).

Pour la séparation thréonine-sérine, le rapport de hauteur entre la vallée et le sommet du plus bas des deux acides aminés chevauchant, dans le chromatogramme, ne doit pas dépasser 2:10 [si le dosage porte seulement sur la cyst(é)ine, la méthionine, la thréonine et la lysine, une séparation insuffisante des pics voisins aura une influence défavorable sur le dosage]. Pour tous les autres acides aminés, la séparation doit être meilleure que 1:10.

Le système doit garantir que la lysine est séparée des «artefacts de lysine» et de l'ornithine.

6. Calcul des résultats

La surface des pics de l'échantillon et de la solution étalon est mesurée pour chaque acide aminé particulier et la quantité (X), exprimée en grammes d'acide aminé par kg d'échantillon, est calculée selon la formule suivante:

Si un étalon interne est utilisé, multiplier par

A = surface de pic, hydrolysat ou extrait,

B = surface de pic, solution d'étalonnage,

C = surface de pic, étalon interne dans l'hydrolysat ou l'extrait,

D = surface de pic, étalon interne, solution d'étalonnage,

M = poids molaire de l'acide aminé dosé,

c = concentration de l'étalon en μmol/ml,

m = poids en grammes de l'échantillon (corrigé pour obtenir le poids initial si le produit est séché et/ou dégraissé),

V = ml d'hydrolysat total (5.3.4) ou ml du volume de l'extrait dilué total calculé (6.1).

La cystine et la cystéine sont dosées toutes deux sous forme d'acide cystéique dans les hydrolysats de l'échantillon oxydé mais calculées sous forme de cystine (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) en utilisant un M de 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

La méthionine est dosée sous forme de méthionine sulfone dans les hydrolysats de l'échantillon oxydé, mais calculée sous forme de méthionine en utilisant un M de 149,21 g/mol.

La méthionine libre ajoutée est dosée après extraction sous forme de méthionine; pour le calcul, appliquer la même valeur à M.

6.1. Le volume de la dilution totale des extraits (F) pour le dosage des acides aminés libres (5.2) est calculé comme suit: V = volume de l'extrait final.

7. Évaluation de la méthode

La méthode a été testée dans une comparaison interlaboratoire internationale faite en 1990 sur la base de quatre aliments pour animaux différents (aliment composé pour porcs, aliment composé pour poulets de chair, concentré protéique, prémélange). La moyenne et l'écart type des résultats, après élimination des aberrants, sont mentionnés dans les tableaux ci-après.







Moyennes en g/kg Matériau de référence Acide aminé Thréonine Cyst(é)ine Méthionine Lysine Aliment composé pour porcs 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Aliment composé pour poulets de chair 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Concentré protéique 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Prémélange 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = nombre de laboratoires participants.

7.1. Répétabilité

La répétabilité, exprimée sous forme d'«écart type à l'intérieur du laboratoire» de la comparaison interlaboratoire susvisée, est indiquée dans les tableaux ci-après.







Écart type à l'intérieur du laboratoire (Sr) en g/kg Matériau de référence Acide aminé Thréonine Cyst(é)ine Méthionine Lysine Aliment composé pour porcs 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Aliment composé pour poulets de chair 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Concentré protéique 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Prémélange 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = nombre de laboratoires participants.







Coefficient de variation (%) pour l'écart type à l'intérieur du laboratoire (Sr) Matériau de référence Acide aminé Thréonine Cyst(é)ine Méthionine Lysine Aliment composé pour porcs 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Aliment composé pour poulets de chair 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Concentré protéique 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Prémélange 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = nombre de laboratoires participants.

7.2 Reproductibilité

Les résultats relatifs à l'écart type entre laboratoires pour la comparaison interlaboratoire mentionnée ci-dessus figurent au tableau ci-dessous.







Écart type entre laboratoires (SR) en g/kg Matériau de référence Acide aminé Thréonine Cyst(é)ine Méthionine Lysine Aliment composé pour porcs 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Aliment composé pour poulets de chair 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Concentré protéique 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Prémélange 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = nombre de laboratoires participants.







Coefficient de variation (%) pour l'écart type entre laboratoires (SR) Matériau de référence Acide aminé Thréonine Cyst(é)ine Méthionine Lysine Aliment composé pour porcs 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Aliment composé pour poulets de chair 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Concentré protéique 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Prémélange 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = nombre de laboratoires participants.

8. Utilisation de matériaux de référence

L'application correcte de la méthode est vérifiée par répétition des mesures des matériaux de référence certifiés éventuellement disponibles. L'étalonnage au moyen d'une solution d'étalonnage certifiée d'acides aminés est recommandée.

9. Observations

9.1. Par suite des différences entre appareils analyseurs d'acides aminés, les concentrations finales des solutions d'étalonnage des acides aminés (voir 3.27.4 et 3.27.5) et de l'hydrolysat (voir 5.3.4) ont un caractère indicatif. Le champ de la réponse linéaire de l'appareillage doit être vérifié pour tous les acides aminés. La solution étalon est diluée avec un tampon au citrate pour donner des surfaces de pic se situant au milieu du champ.

9.2. Dans les cas où un appareillage de chromatographie liquide à haute performance est utilisé pour analyser les hydrolysats, les conditions d'essai doivent être optimisées conformément aux recommandations du fabricant.

9.3. L'application de la méthode aux aliments pour animaux contenant plus de 1 % de chlorure (concentré, aliments minéraux, aliments complémentaires) pourrait entraîner une sous-estimation de la méthionine, et un traitement spécial est à prévoir.

G. DOSAGE DU TRYPTOPHANE

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de doser le tryptophane total et libre dans les aliments pour animaux. Elle ne fait pas de distinction entre les formes D et L.

2. Principe

Pour le dosage du tryptophane total, l'échantillon est hydrolysé en milieu alcalin avec une solution d'hydroxyde de baryum saturée et il est chauffé à 110 oC pendant vingt heures. Après l'hydrolyse, l'étalon interne est ajouté.

Pour le dosage du tryptophane libre, l'échantillon est extrait dans des conditions d'acidité modérée en présence de l'étalon interne.

Le tryptophane et l'étalon interne dans l'hydrolysat ou dans l'extrait sont dosés par CLHP à l'aide d'un détecteur fluorimétrique.

3. Réactifs

3.1. Utiliser de l'eau bidistillée ou de l'eau de qualité équivalente (conductivité < 10 μS/cm).

3.2. Substance étalon: tryptophane (pureté/teneur ≥ 99 %) séché sous vide sur pentoxyde de phosphore.

3.3. Étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté/teneur ≥ 99 %) séché sous vide sur pentoxyde de phosphore.

3.4. Hydroxyde de baryum octahydraté (veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH)2·8H2O à l'air afin d'éviter la formation de BaCO3 qui pourrait perturber le dosage) (voir l'observation figurant au point 9.3).

3.5. Hydroxyde de sodium.

3.6. Acide orthophosphorique, p (p/p) = 85 %.

3.7. Acide chlorhydrique, ρ201,19 g/ml.

3.8. Méthanol, de qualité CLHP.

3.9. Éther de pétrole, intervalle d'ébullition: 40-60 oC.

3.10. Solution d'hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l: dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l'eau et ajuster au litre avec de l'eau (3.1).

3.11. Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l: prendre 492 ml de HCl (3.7) et ajuster au litre avec de l'eau.

3.12. Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l: prendre 82 ml de HCl (3.7) et ajuster au litre avec de l'eau.

3.13. Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l: prendre 8,2 ml de HCl (3.7) et ajuster au litre avec de l'eau.

3.14. Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l: prendre 34 ml d'acide orthophosphorique (3.6) et ajuster au litre avec de l'eau (3.1).

3.15. Solution concentrée de tryptophane (3.2), c = 2,50 μmol/ml: dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,2553 g de tryptophane (3.2) dans de l'acide chlorhydrique (3.13) et ajuster au trait de jauge avec de l'acide chlorhydrique (3.13). Conserver à - 18 oC pendant quatre semaines au maximum.

3.16. Solution concentrée de l'étalon interne, c = 2,50 μmol/ml: dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,2728 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) dans de l'acide chlorhydrique (3.13) et ajuster au trait de jauge avec de l'acide chlorhydrique (3.13). Conserver à - 18 oC pendant quatre semaines au maximum.

3.17. Solution d'étalonnage de tryptophane et étalon interne: prendre 2,00 ml de solution concentrée de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution concentrée de l'étalon interne (α-méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l'eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10-30 %) que l'hydrolysat fini. Cette solution doit être préparée peu avant d'être utilisée. Se protéger de la lumière directe du soleil pendant la préparation.

3.18. Acide acétique.

3.19. Trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2.

3.20. Éthanolamine p (p/p) > 98 %.

3.21. Solution de 1 g de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (3.19) dans 100 ml de méthanol (3.8).

3.22. Phase mobile pour CLHP: 3,00 g d'acide acétique (3.18) + 900 ml d'eau (3.1) +50,0 ml de solution (3.21) de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (3.19) dans du méthanol (3.8) (1 g/100 ml). Ajuster le pH à 5,00 à l'aide d'éthanolamine (3.20). Ajuster à 1 000 ml avec de l'eau (3.1).

4. Appareillage

4.1. Équipement pour CLHP avec détection spectrofluorimétrique.

4.2. Colonne de chromatographie liquide, 125 mm × 4 mm, C18, particules de 3 μm, ou équivalent.

4.3. pH-mètre.

4.4. Fiole en polypropylène, capacité 125 ml, à large col et bouchon à vis.

4.5. Filtre à membrane, 0,45 μm.

4.6. Autoclave, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7. Agitateur mécanique ou magnétique.

4.8. Agitateur Vortex.

5. Mode opératoire

5.1. Préparation des échantillons

Broyer l'échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à forte teneur en humidité doivent être séchés à l'air à une température de 50 oC au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent être extraits par éther de pétrole (3.9) avant broyage.

5.2. Dosage du tryptophane libre (extrait)

Peser, à 1 mg près, une quantité adéquate (1-5 g) de l'échantillon préparé (5.1) dans une fiole erlenmeyer. Ajouter 100,0 ml d'acide chlorhydrique (3.13) et 5,00 ml de solution concentrée de l'étalon interne (3.16). Agiter ou mélanger pendant 60 minutes à l'aide d'un agitateur mécanique ou magnétique (4.7). Laisser décanter le sédiment et introduire à la pipette 10,0 ml de la solution surnageante dans un bécher. Ajouter 5 ml d'acide orthophosphorique (3.14). Ajuster le pH à 3 avec de l'hydroxyde de sodium (3.10). Ajouter suffisamment de méthanol (3.8) pour obtenir une concentration comprise entre 10 et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans une fiole jaugée de volume approprié et diluer avec de l'eau au volume nécessaire pour la chromatographie [environ le même volume que la solution étalon de calibration (3.17)].

Filtrer quelques millilitres de la solution au travers d'un filtre à membrane de 0,45 μm (4.5) avant d'injecter sur la colonne CLHP. Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Protéger la solution étalon et les extraits de la lumière directe du soleil. Si les extraits ne peuvent pas être analysés le jour même, ils doivent être conservés à une température de 5 oC pendant trois jours au maximum.

5.3. Dosage du tryptophane total (hydrolysat)

Peser, à 0,2 mg près, entre 0,1 et 1 g de l'échantillon préparé (5.1) dans la fiole en polypropylène (4.4). La portion d'échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg. Ajouter 8,4 g d'hydroxyde de baryum octahydraté (3.4) et 10 ml d'eau. Mélanger avec un agitateur Vortex (4.8) ou un agitateur magnétique (4.7). Laisser l'aimant enrobé de téflon dans le mélange. Laver les parois du récipient avec 4 ml d'eau. Poser le bouchon à vis et fermer la fiole sans serrer. Transférer dans un autoclave (4.6) avec de l'eau bouillante et de la vapeur d'eau pendant 30 à 60 minutes. Fermer l'autoclave et le mettre en marche à 110 (± 2) oC pendant vingt heures.

Avant d'ouvrir l'autoclave, réduire la température à un peu moins de 100 oC. Pour éviter la cristallisation de Ba(OH)2·8H2O, ajouter au mélange chaud 30 ml d'eau à la température ambiante. Agiter ou remuer doucement. Ajouter 2,00 ml de la solution concentrée de l'étalon interne (α-méthyl-tryptophane) (3.16). Refroidir les récipients dans un bain d'eau/de glace pendant 15 minutes.

Ajouter ensuite 5 ml d'acide orthophosphorique (3.14). Maintenir le récipient dans le bain réfrigérant et neutraliser au HCl (3.11) tout en remuant, puis ajuster le pH à 3,0 à l'aide de HCl (3.12). Ajouter suffisamment de méthanol pour obtenir une concentration comprise entre 10 et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans une fiole jaugée de volume approprié et diluer avec de l'eau au volume nécessaire pour la chromatographie (par exemple 100 ml). L'addition de méthanol ne doit pas provoquer de précipitation.

Filtrer quelques millilitres de la solution au travers d'un filtre à membrane de 0,45 μm (4.5) avant d'injecter sur la colonne CLHP. Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Protéger la solution étalon et les hydrolysats de la lumière directe du soleil. Si les hydrolysats ne peuvent pas être analysés le jour même, ils doivent être conservés à une température de 5 oC pendant trois jours au maximum.

5.4. Dosage par CLHP

Les conditions suivantes de l'élution isocratique sont proposées à titre indicatif; d'autres conditions peuvent être appliquées, pourvu qu'elles donnent des résultats équivalents (voir également les observations figurant aux points 9.1 et 9.2).







Colonne de chromatographie liquide (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, particules de 3 μm, ou équivalent Température de la colonne: température ambiante Phase mobile (3.22): 3,00 g d'acide acétique (3.18) + 900 ml d'eau (3.1) +50,0 ml de solution (3.21) de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (3.19) dans du méthanol (3.8) (1 g/100 ml). Ajuster le pH à 5,00 à l'aide d'éthanolamine (3.20). Ajuster à 1 000 ml avec de l'eau (3.1). Débit: 1 ml/min Temps d'élution total: environ 34 minutes Longueur d'onde de détection: excitation: 280 nm; émission: 356 nm Volume d'injection: 20 μl

6. Calcul des résultats

La quantité de tryptophane (X), exprimée en g par 100 g d'échantillon, est calculée à l'aide de la formule suivante:

A = surface du pic de l'étalon interne, solution étalon de calibration (3.17),

B = surface du pic de tryptophane, extrait (5.2) ou hydrolysat (5.3),

V1 = volume en ml (2 ml) de solution concentrée de tryptophane (3.15) ajoutée à la solution d'étalonnage (3.17),

c = concentration en μmol/ml (= 2,50) de solution concentrée de tryptophane (3.15) ajoutée à la solution d'étalonnage (3.17),

V2 = volume en ml de la solution concentrée de l'étalon interne (3.16) ajoutée à l'extraction (5.2) (= 5,00 ml) ou à l'hydrolysat (5.3) (= 2,00 ml),

C = surface du pic de l'étalon interne, extrait (5.2) ou hydrolysat (5.3),

D = surface du pic de tryptophane, solution étalon de calibration (3.17),

V3 = volume en ml (= 2,00 ml) de la solution concentrée de l'étalon interne (3.16) ajoutée à la solution étalon de calibration (3.17),

m = poids de l'échantillon en g (corrigé pour obtenir le poids initial si le produit est séché et/ou dégraissé),

M = poids molaire du tryptophane (= 204,23 g/mol).

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser 10 % par rapport au résultat le plus élevé.

8. Résultats d'une étude collaborative

Une étude collaborative communautaire (quatrième comparaison interlaboratoire) a été réalisée: douze laboratoires ont analysé trois échantillons pour certifier la méthode par hydrolyse. Chaque échantillon a été soumis à cinq analyses. Les résultats figurent dans le tableau ci-après.







Échantillon 1 Aliment pour porcs Échantillon 2 Aliment pour porcs complété par du L-tryptophane Échantillon 3 Aliment concentré pour porcs L 12 12 12 n 50 55 50 Moyenne [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2

L = nombre de laboratoires ayant présenté des résultats

n = nombre de résultats individuels retenus une fois les résultats aberrants éliminés (identifiés selon les tests de Cochran-Dixon)

sr = écart type de répétabilité

SR = écart type de reproductibilité

r = répétabilité

R = reproductibilité

CVr = coefficient de variation de la répétabilité, en %

CVR = coefficient de variation de la reproductibilité, en %

Une autre étude collaborative communautaire (troisième comparaison interlaboratoire) a été réalisée: jusqu'à treize laboratoires ont analysé deux échantillons pour certifier la méthode par extraction du tryptophane libre. Chaque échantillon a été soumis à cinq analyses. Les résultats figurent dans le tableau ci-après.







Échantillon 4 Mélange de blé et de soja Échantillon 5 Mélange de blé et de soja (= échantillon 4) avec addition de tryptophane (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Moyenne [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11

L = nombre de laboratoires ayant présenté des résultats

n = nombre de résultats individuels retenus une fois les résultats aberrants éliminés (identifiés selon les tests de Cochran-Dixon)

sr = écart type de répétabilité

SR = écart type de reproductibilité

r = répétabilité

R = reproductibilité

CVr = coefficient de variation de la répétabilité, en %

CVR = coefficient de variation de la reproductibilité, en %

Une autre étude interlaboratoire communautaire a été réalisée: sept laboratoires ont analysé quatre échantillons pour certifier la méthode par hydrolyse. Chaque échantillon a été soumis à cinq analyses. Les résultats figurent dans le tableau ci-après.







Échantillon 1 Aliment composé pour porcs (CRM117) Échantillon 2 Farine de poisson à faible teneur en matières grasses (CR