1979D0542 — FR — 01.12.2008 — 026.001

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établissant une liste de pays tiers ou de parties de pays tiers et définissant les conditions de police sanitaire, les conditions sanitaires et la certification vétérinaire requises à l'importation dans la Communauté de certains animaux vivants et des viandes fraîches qui en sont issues

Modifié par:

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Rectifié par:

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DÉCISION DU CONSEIL

du 21 décembre 1976

établissant une liste de pays tiers ou de parties de pays tiers et définissant les conditions de police sanitaire, les conditions sanitaires et la certification vétérinaire requises à l'importation dans la Communauté de certains animaux vivants et des viandes fraîches qui en sont issues

(79/542/CEE)

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considérant que le système prévu par la directive 72/462/CEE repose sur l'établissement d'une liste des pays tiers, ou des parties de pays tiers, en provenance desquels les États membres autorisent l'importation d'animaux des espèces bovine et porcine et de viandes fraîches provenant d'animaux des espèces bovine, porcine, ovine et caprine ainsi que de solipèdes domestiques, ou bien de l'une ou de plusieurs de ces catégories d'animaux et de viandes fraîches;

vu la directive 72/462/CEE du Conseil, du 12 décembre 1972, concernant des problèmes sanitaires et de police sanitaire lors de l'importation d'animaux des espèces bovine et porcine et de viandes fraîches en provenance des pays tiers ( 1 ), modifiée par la directive 77/98/CEE ( 2 ), et notamment son article 3 paragraphe 1,

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Article premier

Objet et champ d'application

La présente décision établit les conditions sanitaires requises à l'importation d'animaux dans la Communauté, à l'exclusion des équidés, et à l'importation de viandes fraîches ►M61 ————— ◄ provenant de ces animaux, y compris des équidés, à l'exclusion des préparations à base de viandes.

La présente décision ne s'applique pas aux importations d'animaux non domestiques destinés à des spectacles ou des expositions où ces animaux ne sont pas habituellement détenus ou élevés, ni aux importations d'animaux non domestiques appartenant à des cirques ou utilisés à des fins scientifiques, y compris à des fins de conservation ou dans un but expérimental, par un organisme, un institut ou un centre qui a été agréé conformément à l'annexe C de la directive 92/65/CEE.

Les importations d'animaux et de viandes fraîches autorisées conformément à la présente décision demeurent soumises aux autres dispositions qui ont été ou pourraient être adoptées en vertu de la législation alimentaire européenne.

Article 2

Définitions

Aux fins de la présente décision, on entend par:

a) «animaux»: les mammifères terrestres des espèces appartenant aux taxons des proboscidiens (Proboscidea) et des artiodactyles (Artiodactyla), et leurs hybrides;

c) «abats préparés»: les abats dont on a retiré les os, les cartilages, la trachée et les grosses bronches, les ganglions lymphatiques, le tissu connectif, la graisse et les muqueuses; dans le cas des viandes issues d'animaux domestiques de l'espèce bovine, les muscles masséters entiers, incisés conformément à l'annexe I, chapitre VIII, point 41 a), de la directive 64/433/CEE, sont également considérés comme des abats préparés.

Article 3

Conditions applicables à l'importation d'animaux vivants dans la Communauté

Les importations d'animaux vivants dans la Communauté ne sont autorisées que si les animaux satisfont aux dispositions des articles 4, 5 et 6.

Article 4

Lieu d'origine des animaux vivants

Les animaux proviennent d'un pays tiers ou d'une partie d'un pays tiers figurant dans les colonnes 1, 2 et 3 du tableau de l'annexe I, partie 1, pour lequel/laquelle un modèle de certificat vétérinaire prévu pour ces animaux est mentionné à la colonne 4 correspondante.

Article 5

Conditions particulières

Les animaux répondent aux exigences fixées dans le certificat correspondant, établi conformément au certificat type figurant à l'annexe I, partie 2, compte tenu des conditions particulières indiquées dans la colonne 6 du tableau présenté à l'annexe I, partie 1; lorsque cela est spécifié dans la colonne 5 du tableau, les animaux satisfont également aux garanties supplémentaires requises dans le certificat type.

Si l'État membre de destination l'exige, les animaux concernés satisfont aux exigences de certification supplémentaires, qui sont mentionnées pour cet État membre et figurent dans le certificat conformément au modèle correspondant prévu dans la partie 2.

Article 6

Transport d'animaux vivants destinés à l'importation dans la Communauté

1. Les animaux ne sont pas chargés dans un moyen de transport utilisé pour transporter d'autres animaux qui ne sont pas destinés à la Communauté ou qui présentent un statut sanitaire inférieur.

2. Durant leur transport vers la Communauté, les animaux ne doivent pas être déchargés sur le territoire d'un pays tiers ou d'une partie d'un pays tiers non autorisé à importer ce type d'animaux dans la Communauté.

3. Durant leur transport vers la Communauté, les animaux ne peuvent être ni déplacés par route ou par rail, ni conduits à pied à travers le territoire ou une partie du territoire d'un pays tiers non autorisé à importer ce type d'animaux dans la Communauté.

4. Les animaux sont acheminés jusqu'à un poste d'inspection frontalier de la Communauté dans les dix jours suivant la date de chargement dans le pays tiers exportateur et sont accompagnés d'un certificat vétérinaire conforme au modèle de certificat correspondant, rempli et signé par un vétérinaire officiel du pays tiers exportateur.

En cas de transport maritime, le délai de dix jours est prolongé de la durée du voyage maritime. À cette fin, une déclaration du capitaine du navire, établie conformément au modèle figurant à l'addendum de l'annexe I, partie 3 A, est jointe sous sa forme originale au certificat vétérinaire type.

Article 7

Conditions à appliquer après l'importation

Une fois importés et conformément à la directive 91/496/CEE du Conseil:

Article 8

Conditions applicables à l'importation de viandes fraîches dans la Communauté

Les importations dans la Communauté de viandes fraîches destinées à la consommation humaine issues des animaux définis à l'article 2 et d'équidés ne sont autorisées que si ces viandes satisfont aux dispositions des articles 9 à 11.

Article 9

Lieu d'origine des viandes fraîches

Les viandes fraîches proviennent d'un pays tiers ou d'une partie d'un pays tiers figurant dans les colonnes 1, 2 et 3 du tableau de l'annexe II, partie 1, pour lequel/laquelle un modèle de certificat vétérinaire prévu pour ces viandes est mentionné à la colonne 4 correspondante.

Article 10

Conditions particulières

Les viandes fraîches répondent aux exigences fixées dans le certificat correspondant établi conformément au modèle de certificat figurant à l'annexe II, partie 2, compte tenu des conditions particulières indiquées dans la colonne 6 du tableau présenté à l'annexe II, partie 1; lorsque cela est spécifié dans la colonne 5 du tableau, les viandes doivent également satisfaire aux garanties supplémentaires requises dans le certificat type.

Article 11

Présentation des viandes fraîches à un poste d'inspection frontalier de la Communauté

Les viandes fraîches sont présentées à un poste d'inspection frontalier de la Communauté accompagnées d'un certificat vétérinaire établi conformément au modèle correspondant, rempli et signé par un vétérinaire officiel du pays tiers exportateur.

Article 12

Conditions à appliquer après l'importation

1. Une fois importées, les viandes fraîches des catégories suivantes sont acheminées sans délai vers l'établissement de transformation de destination, conformément à la directive 97/78/CE du Conseil:

2. En ce qui concerne les catégories de produits visées au paragraphe 1, point b), l'établissement de destination est un établissement approuvé et agréé pour la transformation de ces produits par l'État membre dans lequel cet établissement est situé.

3. Conformément aux procédures établies par la décision 2001/106/CE, les États membres communiquent aux autres États membres et à la Commission:

a) les noms et adresses des établissements visés au paragraphe 2 et de l'autorité locale chargée de superviser ces établissements, et

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Article 12 bis

Les États membres veillent à ce que les lots de viandes destinées à la consommation humaine, y compris de viandes hachées, introduits sur le territoire de la Communauté et destinés à un pays tiers, soit par transit immédiat, soit après stockage conformément à l'article 12, paragraphe 4, ou à l'article 13 de la directive 97/78/CE, et non destinés à être importés dans la CE, répondent aux exigences suivantes:

Article 12 ter

1. Par dérogation à l'article 12 bis, les États membres autorisent le transit routier ou ferroviaire par la Communauté, entre certains postes d'inspection frontaliers de la Communauté, énumérés à l'annexe IV, de lots en provenance de Russie ou destinés à la Russie, directement ou par un autre pays tiers, pour autant que les conditions suivantes soient remplies:

2. Le déchargement ou le stockage au sens de l'article 12, paragraphe 4, ou de l'article 13 de la directive 97/78/CE sur le territoire de la CE de tels lots ne sont pas autorisés.

3. Des audits sont régulièrement effectués par l'autorité compétente afin de vérifier que le nombre de lots et les quantités de produits quittant le territoire de la CE correspondent au nombre et aux quantités qui y ont été introduites.

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Article 13

Certification

Les certificats vétérinaires requis pour l'importation d'animaux vivants et de viandes fraîches dans la Communauté, tels que prévus par la présente décision, sont établis conformément aux notes figurant dans la partie 2 des annexes I et II. Toutefois, ces dispositions n'excluent pas la possibilité de recourir à la certification électronique ou à d'autres systèmes agréés et harmonisés au niveau communautaire.

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Article ►M54 14 ◄

Les États membres sont destinataires de la présente décision.

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ANNEXE I

ANIMAUX VIVANTS

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PARTIE 1

— au sud d'un point situé sur la frontière entre le Canada et les États-Unis à 118o15' de longitude et 49o de latitude

— à partir d'un point situé sur la frontière entre le Canada et les États-Unis, à 120o15' de longitude et 49o de latitude,

Conditions spécifiques (voir les notes de bas de page de chaque certificat)

pour le transit d'animaux destinés à un abattage immédiat, expédiés d'un État membre à destination d'un autre État membre dans des camions sous scellés numérotés. Le numéro des scellés doit être inscrit sur le certificat sanitaire établi conformément au modèle figurant à l'annexe F de la directive 64/432/CEE du Conseil du 26 juin 1964 relative à des problèmes de police sanitaire en matière d'échanges intracommunautaires d'animaux des espèces bovine et porcine, pour ce qui concerne les animaux des espèces bovine et porcine, et conformément au modèle I figurant à l'annexe E de la directive 91/68/CEE du Conseil du 28 janvier 1991 relative aux conditions de police sanitaire régissant les échanges intracommunautaires d'ovins et de caprins, pour ce qui concerne les animaux des espèces ovine et caprine. En outre, les scellés doivent être intacts à l'arrivée au poste d'inspection frontalier d'entrée dans la Communauté désigné et le numéro des scellés doit être enregistré dans TRACES. Au point de sortie de l'État membre d'origine et avant le transit par le territoire d'un pays tiers, les autorités vétérinaires compétentes doivent apposer sur le certificat un cachet portant la mention: «UNIQUEMENT POUR TRANSIT ENTRE DES PARTIES DE L'UNION EUROPÉENNE PAR LE TERRITOIRE DE L'ANCIENNE RÉPUBLIQUE YOUGOSLAVE DE MACÉDOINE/DU MONTÉNÉGRO/DE LA SERBIE» (biffer la mention inutile).

PARTIE 2

Modèles de certificats vétérinaires

Modèles

modèle de certificat vétérinaire relatif aux animaux appartenant à l'ordre Artiodactyla [à l'exception des bovins (comprenant les espèces des genres Bison et Bubalus ainsi que leurs hybrides) Ovis aries, Capra hircus, Suidae et Tayassuidae] et aux familles Rhinocerotidae et Elephantidae.

modèle de certificat vétérinaire relatif aux espèces non domestiques des familles Suidae, Tayassuidae et Tapiridae.

GS (garanties supplémentaires)

garanties relatives aux tests de dépistage de la fièvre catarrhale du mouton et de la maladie hémorragique épizootique effectués sur des animaux certifiés conformément aux modèles de certificats BOV-X (point II.2.8 B), OVI-X (point II.2.6 D) et RUM (point II.2.6).

garanties relatives aux tests de dépistage de la maladie vésiculeuse du porc et de la peste porcine classique effectués sur des animaux certifiés conformément aux modèles de certificats POR-X (point II.2.4 B), et SUI (point II.2.4 B).

garanties relatives au test de dépistage de la brucellose effectué sur des animaux certifiés conformément aux modèles de certificats POR-X (point II.2.4 C), et SUI (point II.2.4 C).

Notes

f) Lorsque le certificat, y compris les tableaux supplémentaires visés au point e), comporte plus d'une page, chaque page doit être numérotée au bas de la page — (numéro de la page) de (nombre total de pages) —, et le numéro de code du certificat attribué par l'autorité compétente doit figurer en haut de la page.

e) Si des pages supplémentaires sont jointes au certificat pour des raisons liées à l'identification des différents éléments du lot (tableau au point I.28 du modèle de certificat), ces pages sont également considérées comme faisant partie de l'original du certificat, et la signature et le cachet du vétérinaire officiel chargé de la certification doivent figurer sur chacune d'entre elles.

d) Le certificat est établi dans au moins une des langues officielles de l'État membre dans lequel se trouve le poste frontalier effectuant l'inspection et de l'État membre de destination. Néanmoins, ces États membres peuvent autoriser qu'il soit établi dans une autre langue communautaire que la ou les leurs et accompagné, si nécessaire, d'une traduction officielle.

c) L'original de chaque certificat se compose d'une seule feuille, recto verso, ou, si cela ne suffit pas, il est présenté de façon à ce que toutes les pages nécessaires fassent partie d'un tout intégré et indivisible.

b) Un certificat distinct et unique doit être fourni pour les animaux exportés à partir d'un seul des territoires figurant à l'annexe I, partie 1, colonnes 2 et 3, qui ont la même destination et sont transportés dans le même wagon, camion, avion ou navire.

a) Les certificats vétérinaires doivent être établis par le pays exportateur sur la base des modèles figurant à l'annexe I, partie 2, et dans le respect de la mise en pages du modèle correspondant aux animaux concernés. Ils doivent contenir, numérotées selon le modèle, les attestations exigées pour tous les pays tiers et, le cas échéant, les garanties supplémentaires requises pour le pays exportateur ou pour une partie de ce dernier.

Attestation spécifique de police sanitaire pour les animaux mis en quarantaine à Saint-Pierre-et-Miquelon avant leur exportation vers la Communauté européenne

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PARTIE 3

A — Addendum relatif au transport d'animaux par voie maritime

(À remplir et à annexer au certificat vétérinaire lorsque l'acheminement jusqu'à la frontière de la Communauté européenne s'effectue, même partiellement, par voie maritime)

B — Conditions d'agrément des centres de rassemblement

Les centres de rassemblement répondent aux conditions suivantes:

IV. ils disposent, compte tenu de leur capacité d'accueil: a) d'une installation exclusivement destinée à cet usage; b) d'installations appropriées, faciles à nettoyer et à désinfecter, pour charger et décharger les animaux, les héberger convenablement, les abreuver, les nourrir et leur administrer tout traitement dont ils devraient faire l'objet; c) d'installations appropriées pour les inspections et l'isolement; d) d'un équipement approprié pour le nettoyage et la désinfection des salles et des camions; e) d'une surface de stockage suffisante pour le fourrage, la litière et le fumier; f) d'un système adéquat pour la collecte et l'élimination des eaux usées; g) d'un cabinet pour le vétérinaire officiel;

VI. ils n'acceptent que des animaux identifiés individuellement afin de garantir la traçabilité. À cet effet, lorsque des animaux sont admis, le propriétaire ou la personne responsable du centre veille à ce qu'ils soient identifiés de façon adéquate et accompagnés des documents sanitaires ou des certificats appropriés pour l'espèce et les catégories concernées. Cette personne se charge également de consigner dans un registre ou dans une base de données et de conserver pendant une période minimale de trois ans le nom du propriétaire, l'origine, la date d'entrée, la date de sortie, le nombre et l'identification des animaux ou le numéro d'enregistrement du troupeau d'origine et la destination des animaux, ainsi que le numéro d'enregistrement du transporteur et le numéro d'enregistrement du camion qui décharge ou charge les animaux dans les installations;

VIII. les animaux à exporter vers la Communauté européenne qui passent par un centre de rassemblement doivent, dans les six jours qui suivent leur arrivée, être embarqués et acheminés directement jusqu'à la frontière du pays exportateur: a) sans entrer en contact avec des animaux biongulés autres que des animaux répondant aux conditions sanitaires prévues pour l'importation dans la Communauté européenne de la catégorie d'animaux considérée; b) répartis en lots de telle sorte qu'aucun lot ne contienne à la fois des animaux d'élevage ou de rente et des animaux destinés à l'abattage immédiat; c) dans des véhicules de transport ou des conteneurs préalablement nettoyés et désinfectés à l'aide d'un désinfectant officiellement autorisé dans le pays exportateur pour lutter efficacement contre la maladie visée au point II ci-dessus, et construits de telle manière que les fèces, l'urine, les litières ou les fourrages ne puissent s'échapper ou tomber en cours de transport;

X. le pays exportateur désigne les centres agréés pour les animaux d'élevage ou de rente et ceux agréés pour les animaux de boucherie et notifie à la Commission, ainsi qu'aux autorités centrales compétentes des États membres, les noms et adresses de ces installations ainsi que les mises à jour successives;

C — Protocoles de normalisation des matériels et méthodes de test

Tuberculose (TBL)

L'intradermotuberculination simple avec de la tuberculine bovine est effectuée conformément à l'annexe B de la directive 64/432/CEE. Dans le cas des suidés, la tuberculination intradermique simple utilisant la tuberculine aviaire doit être effectuée conformément à l'annexe B de la directive 64/432/CEE, si ce n'est que le point d'injection se situe sur la peau flasque à la base de l'oreille.

Brucellose (Brucella abortus) (BRL)

La séroagglutination, la réaction de fixation du complément, l'épreuve à l'antigène brucellique tamponné et les essais d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) doivent être effectués conformément à l'annexe C de la directive 64/432/CEE.

Brucellose (Brucella melitensis) (BRL)

Le test doit être effectué conformément à l'annexe C de la directive 91/68/CEE.

Leucose enzootique bovine (EBL)

Le test d'immunodiffusion en gélose et l'épreuve d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) doivent être effectués conformément à l'annexe D, chapitre II, points A et C, de la directive 64/432/CEE du Conseil.

Fièvre catarrhale (BTG)

A) L'épreuve ELISA bloquante ou concurrente est effectuée conformément au protocole suivant.

L'épreuve ELISA concurrente, qui utilise l'anticorps monoclonal 3-17-A3, permet de détecter les anticorps de tous les sérotypes connus du virus de la fièvre catarrhale (BTV).

Le principe de l'épreuve consiste dans l'interruption de la réaction entre l'antigène du BTV et un anticorps monoclonal spécifique au groupe (3-17-A3) par l'ajout de sérum d'épreuve. Les anticorps du BTV présents dans le sérum d'épreuve bloquent la réactivité de l'anticorps monoclonal (AcM) et entraînent une réduction du développement escompté de la couleur après ajout d'un anticorps antisouris marqué par un enzyme et de substrat/chromogène. Les sérums peuvent être testés à une seule dilution de 1/5 (méthode du test ponctuel — appendice 1) ou être titrés (méthode de titrage du sérum — appendice 2) afin de définir les points de dilution limite. Les valeurs d'inhibition supérieures à 50 % peuvent être considérées comme positives.

Matériels et réactifs

1. Plaques de microtitration ELISA appropriées.

2. Antigène: fourni sous forme de concentré cellulaire, préparé selon la procédure indiquée ci-dessous et conservé à une température de -20 °C ou de -70 °C.

3. Tampon bloquant: solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,3 % de sérum bovin adulte négatif du virus de la fièvre catarrhale, 0,1 % (v/v) de Tween 20 (fourni sous forme de sirop de polyoxyéthylène sorbiton monolaurate) dans du PBS.

4. Anticorps monoclonal (AcM): 3-17-A3 (fourni sous forme de surnageant de culture tissulaire hybridome) dirigé contre le polypeptide p7 spécifique, stocké à -20 °C ou lyophylisé et dilué à 1/100 avec un tampon bloquant avant utilisation.

5. Conjugué: globuline de lapin antisouris (absorbé et élué), conjugué à la peroxydase de raifort et conservé à l'obscurité à 4 °C.

6. Chromogène et substrat: Orthophényle-diamine (chromogène OPD) dont la concentration finale est de 0,4 mg/ml dans de l'eau distillée/désionisée stérile. Peroxyde d'hydrogène (substrat 30 % p/v), 0,05 % v/v ajouté immédiatement avant utilisation (5 μl de H2O2 /10 ml d'OPD). (Manipuler l'OPD avec précaution — Porter des gants en caoutchouc — Produit suspect d'être mutagène).

7. Acide sulfurique à 1 mole: 26,6 ml d'acide ajouté à 473,4 ml d'eau distillée. (Attention: toujours ajouter l'acide à l'eau, jamais l'eau à l'acide.)

8. Agitateur orbital.

9. Lecteur de plaque ELISA (l'épreuve peut être lue visuellement).

Schéma de l'épreuve

Cc: Contrôle conjugué (pas de sérum/pas d'anticorps monoclonal); C++: Sérum témoin fortement positif; C+: Sérum témoin faiblement positif; C-: Sérum témoin négatif; Cm: Contrôle de l'anticorps monoclonal (sans sérum).







Appendice 1: Dilution unique (1/5) — Schéma (40 sérums/plaque) Contrôles Sérums d'épreuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40







Appendice 2: Schéma de titrage du sérum (10 sérums/plaque) Contrôles Sérums d'épreuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640

Protocole d'essai:

Contrôle conjugué (Cc) : Les puits 1A et 1B correspondent à un contrôle à blanc comprenant l'antigène du BTV et un conjugué. Il peut être utilisé pour étalonner le lecteur ELISA.

Contrôle de l'AcM (Cm) : Les colonnes 1 et 2 et les lignes G et H correspondent au contrôle de l'anticorps monoclonal, formé de l'antigène du BTV, de l'anticorps monoclonal et du conjugué. Ces puits représentent la couleur la plus prononcée. La moyenne des valeurs de la densité optique de ce contrôle représente la valeur d'inhibition de 0 %.

Contrôle positif (C++, C+) : Colonnes 1 et 2, lignes C, D, E et F. Ces puits contiennent l'antigène du BTV, l'antisérum fortement et faiblement positif du BTV, l'AcM et le conjugué.

Contrôle négatif (C-) : Les puits 2A et 2B sont les témoins négatifs, qui contiennent l'antigène du BTV, l'antisérum négatif du BTV, l'AcM et le conjugué.

Sérums d'épreuve : Pour des études sérologiques à grande échelle et des épreuves de contrôle rapides, le sérum pourrait être testé à une dilution unique de 1/5 (appendice 1). Autrement, 10 sérums pourraient être testés à une dilution allant de 1/5 à 1/640 (appendice 2). Il en ressortira des informations sur le titre de l'anticorps contenu dans les sérums à tester.

Mode opératoire:

1. Diluer l'antigène du BTV à la concentration prétitrée dans du PBS. Agiter brièvement (par agitateur à ultrasons) pour disperser les agrégats de virus (à défaut d'appareil, agiter vigoureusement à la pipette) et en ajouter 50 μl dans tous les puits de la plaque ELISA. Tapoter les bords de la plaque pour disperser l'antigène.

2. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. Laver les plaques trois fois par rinçage, vider les loges avec du PBS non stérile et sécher à l'aide de papier buvard.

3. Puits de contrôle: ajouter 100 μl de tampon de blocage aux puits CC. Ajouter 50 μl de sérums positif et négatif de contrôle, à une dilution de 1/5 (10 μl de sérum + 40 μl de tampon de blocage), aux puits C-, C+ et C++, respectivement. Ajouter 50 μl de tampon de blocage aux puits de contrôle AcM. Méthode de titrage ponctuelle: ajouter au tampon de blocage une dilution à 1/5 de chaque sérum d'épreuve afin de doubler les puits des colonnes 3 à 12 (10 μl de sérums + 40 μl de tampon de blocage), ou Méthode de titrage du sérum: préparer une série de dilutions de raison 2 de chaque échantillon d'épreuve (de 1/5 à 1/640) dans un tampon de blocage dans huit puits de chacune des colonnes 3 à 12.

4. Immédiatement après l'ajout des sérums d'épreuve, diluer l'AcM à 1/100 dans un tampon bloquant et ajouter 50 μl à tous les puits de la plaque, sauf le contrôle à blanc.

5. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. Laver trois fois avec du PBS et sécher à l'aide de papier buvard.

6. Diluer le concentré de lapin antisouris à 1/5 000 dans un tampon bloquant et ajouter 50 μl dans toutes les loges de la plaque.

7. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. Laver trois fois avec du PBS et sécher à l'aide de papier buvard.

8. Décongeler l'OPD et, immédiatement avant utilisation, ajouter 5 μl de peroxyde d'hydrogène à 30 % à chaque quantité de 10 ml d'OPD. Ajouter 50 μl dans tous les puits de la plaque. Attendre le développement de la couleur pendant environ 10 minutes et arrêter la réaction à l'aide de l'acide sulfurique à 1 M (50 μl par puits). La couleur devrait se développer dans les puits de contrôle AcM et dans les puits contenant des sérums sans anticorps du BTV.

9. Examiner et enregistrer les plaques soit visuellement, soit à l'aide d'un lecteur spectrophotométrique.

Analyse des résultats

À l'aide d'un logiciel, imprimer les valeurs de densité optique (DO) et le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums à tester et des sérums témoins sur la base de la valeur moyenne enregistrée dans les puits témoins d'antigène. Les valeurs DO et PI sont utilisées pour déterminer si le test a été exécuté dans des limites acceptables. Les limites supérieure (UCL) et inférieure (LCL) de contrôle de l'AcM (antigène plus AcM en l'absence de sérum à tester) se situent entre les valeurs 0,4 et 1,4 de DO. Toute plaque non conforme aux critères précités doit être rejetée.

En l'absence d'un logiciel informatique, imprimer les valeurs DO avec l'imprimante ELISA. Calculer la valeur moyenne de densité optique pour les puits témoins d'antigène, qui équivaut à la valeur à 100 %. Déterminer la valeur DO à 50 % et calculer manuellement la positivité ou la négativité de chaque échantillon.

Pourcentage de la valeur d'inhibition (PI) = 100 - (DO de chaque témoin testé/ DO moyenne de Cm) × 100

Les puits de sérum témoin négatif dédoublés et les puits sans sérum dédoublés devraient enregistrer des valeurs PI comprises entre + 25 % et - 25 % et entre + 95 % et + 105 % respectivement. Le non-respect de ces limites n'a pas pour effet d'invalider les résultats de la plaque, mais il laisse supposer la formation d'une couleur de fond. Les sérums témoins faiblement ou fortement positifs devraient enregistrer des valeurs PI comprises entre + 81 % et + 100 % et entre + 51 % et + 80 % respectivement.

Le seuil de diagnostic pour les sérums à tester est de 50 % (PI de 50 % ou DO de 50 %). Les échantillons donnant des valeurs PI supérieures à 50 % sont considérés comme négatifs. Les échantillons qui présentent des valeurs PI supérieures ou inférieures au seuil pour les puits dédoublés sont considérés comme suspects; ces échantillons peuvent être retestés par la méthode du test ponctuel et/ou par la méthode de titrage. Les échantillons positifs peuvent également être titrés afin d'obtenir une indication du degré de positivité.

Lecture visuelle: les échantillons positifs et négatifs sont facilement repérables à l'œil nu; il peut toutefois être plus difficile d'interpréter à l'œil nu les échantillons faiblement positifs ou fortement négatifs.

Préparation de l'antigène du virus BT pour l'ELISA

1. Laver trois fois 40 à 60 roux de cellules BHK-21 confluentes à l'aide d'un milieu Eagle exempt de sérum, et infecter au moyen du sérotype 1 du virus de la fièvre catarrhale dans un milieu Eagle exempt de sérum.

2. Incuber à 37 °C et examiner l'effet cytopathogène (ECP) chaque jour.

3. Lorsque l'ECP est complet dans 90 à 100 % de la plaque de cellules de chaque roux, récolter le virus par agitation pour détacher les cellules adhérant à la paroi.

4. Centrifuger à 2 ou 3 000 tours/minute pour réduire les cellules en fragments.

5. Jeter la fraction surnageante et remettre les cellules en suspension dans environ 30 ml de PBS contenant 1 % de «Sarkosyl» et 2 ml de fluorure de phényl méthyl sulfonyle (tampon de lyse). Cela peut provoquer une gélification des cellules; auquel cas, il convient d'ajouter davantage de tampon de lyse pour réduire cet effet. (NB: Le fluorure de phényl méthyl sulfonyle est dangereux; le manipuler avec une extrême prudence.)

6. Dissocier les cellules pendant 60 secondes à l'aide d'une sonde ultrasonique fonctionnant à une amplitude de 30 microns.

7. Centrifuger à 10 000 tours/minute pendant dix minutes.

8. Stocker la fraction surnageante à + 4 °C et remettre en suspension le fragment de cellule restant dans 10 à 20 ml de tampon de lyse.

9. Soniquer et clarifier, trois fois au total, en stockant la fraction surnageante à chaque stade.

10. Réunir les fractions surnageantes et centrifuger à 24 000 tours/minute (100 000 g) pendant 120 minutes à une température de + 4 °C sur un coussin de 5 ml de sucrose à 40 % (p/v dans du PBS) en utilisant des tubes de centrifugation Beckmann de 30 ml et un rotor SW 28.

11. Jeter la fraction surnageante, laisser les tubes s'égoutter soigneusement et remettre en suspension le fragment dans du PBS par sonication. Stocker l'antigène dans des aliquotes à - 20 °C.

Titrage de l'antigène du virus BT pour l'ELISA

L'antigène de la fièvre catarrhale pour l'ELISA est titré par la technique ELISA indirecte. Des dilutions de raison 2 d'antigène sont titrées en fonction d'une dilution constante (1/100) d'anticorps monoclonal 3-17-A3. Le protocole est le suivant:

1. Titrer l'antigène du virus BT dans du PBS à une dilution de 1/20 à travers une plaque de microtitrage dans une série de dilutions de raison 2 (50 μl/puits) en utilisant une pipette multiple.

2. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital.

3. Laver trois fois les plaques à l'aide de PBS.

4. Ajouter 50 μl d'anticorps monoclonal 3-17-A3 (dilution 1/100) dans chaque puits de la plaque de microtitrage.

5. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital.

6. Laver trois fois les plaques à l'aide de PBS.

7. Ajouter 50 μl de globuline de lapin antisouris conjuguée à de la peroxydase de raifort, à une concentration prétitrée optimale dans chaque puits de la plaque de microtitrage.

8. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital.

9. Ajouter un substrat et un chromogène comme indiqué ci-dessus. Arrêter la réaction après dix minutes par addition d'acide sulfurique à 1 mole (50 μl/puits).

Dans l'essai concurrent, l'anticorps monoclonal doit se trouver en excédent; c'est pourquoi il est choisi une dilution d'antigène qui se trouve sur la courbe de titrage (non dans la zone de plateau) qui donne approximativement une DO de 0,8 après dix minutes.