1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 1
Ce document constitue un outil de documentation et n'engage pas la responsabilité des institutions
►BRÈGLEMENT (CEE) No2568/91 DE LA COMMISSION
du 11 juillet 1991
►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux
méthodes d'analyse y afférentes ◄
(JO L 248 du 5.9.1991, p. 1)
Modifié par:
Journal officiel
nopage date
►M1 Règlement(CEE) no3682/91 de la Commission du 17 décembre 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2 Règlement(CEE) no1429/92 de la Commission du 26 mai 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Règlement(CEE) no1683/92 de la Commission du 29 juin 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4 Règlement(CEE) no1996/92 de la Commission du 15 juillet1992 L 199 18 18.7.1992
►M5 Règlement(CEE) no3288/92 de la Commission du 12 novembre 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6 Règlement(CEE) no183/93 de la Commission du 29 janvier 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 modifié par le règlement(CEE) no826/93 de la Commission du 6 avril
1993L 87 6 7.4.1993
►M8 Règlement(CEE) no620/93 de la Commission du 17 mars 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9 Règlement(CE) no177/94 de la Commission du 28 janvier 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Règlement(CE) no2632/94 de la Commission du 28 octobre 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11 Règlement(CE) no656/95 de la Commission du 28 mars 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Règlement(CE) no2527/95 de la Commission du 27 octobre 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13 Règlement(CE) no2472/97 de la Commission du 11 décembre 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14 Règlement(CE) no282/98 de la Commission du 3 février 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15 Règlement(CE) no2248/98 de la Commission du 19 octobre 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16 Règlement(CE) no379/1999 de la Commission du 19 février 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17 Règlement(CE) no455/2001 de la Commission du 6 mars 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18 Règlement(CE) no2042/2001 de la Commission du 18 octobre 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19 Règlement(CE) no796/2002 de la Commission du 6 mai 2002 L 128 8 15.5.2002
►M20 Règlement(CE) no1989/2003 de la Commission du 6 novembre 2003 L 295 57 13.11.2003
Rectifié par:
►C1 Rectificatif, JO L 347 du 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
►C2 Rectificatif, JO L 176 du 20.7.1993, p. 26 (183/93)
▼B
RÈGLEMENT (CEE) No2568/91 DE LA COMMISSION
du 11 juillet 1991
►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de
grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,
vu le règlementno136/66/CEE du Conseil, du 22 septembre 1966,
portant établissement d'une organisation commune des marchés dans
le secteur des matières grasses (1), modifié en dernier lieu par le règle-
ment(CEE) no3577/90 (2), et notamment son article 35 bis,
considérantque l'annexe du règlementno136/66/CEE prévoitles déno-
minations et définitions des huiles d'olive et des huiles de grignons
d'olive commercialisées à l'intérieur de chaque État membre ainsi que
dans les échanges intracommunautaires et avec les pays tiers;
considérant que, pour pouvoir distinguer les divers types d'huile, il y a
lieu de définir les caractéristiques physico-chimiques de chacun d'euxainsi que les caractéristiques organoleptiques des huiles vierges, demanière à assurer la pureté et la qualité des produits en cause, sans
préjudice d'autres dispositions existant en la matière;
considérantqu'il convientde dét erminer de manière uniforme dans
toute la Communauté la présence des caractéristiques des différentstypes d'huile; que, à cette fin, il y a lieu d'établir les méthodes commu-nautaires d'analyse chimique et d'appréciation organoleptique; qu'il
convient cependant de permettre, pendant une période transitoire, l'uti-
lisation d'autres méthodes d'analyse appliquées dans les États membres,tout en prévoyant que, en cas de divergence des résultats, ceux obtenusselon la méthode commune soient déterminants;
considérant que la définition des caractéristiques physico-chimiques des
huiles d'olives et des méthodes d'analyse entraîne l'adaptation des notes
complémentaires du chapitre 15 de la nomenclature combinée;
considérant que la méthode d'évaluation des caractéristiques organolep-
tiques des huiles vierges comporte la création de jurys de dégustateurssélectionnés et entraînés; qu'il convient, dès lors, de prévoir le délainécessaire pour la mise en place d'une telle structure; que, comptetenu des difficultés que rencontreront certains États membres pour la
constitution des jurys de dégustateurs, il convient d'autoriser le recours
aux jurys existant dans d'autres États membres;
considérant que, pour assurer le fonctionnement correct du système des
prélèvements applicables à l'importation de grignons d'olive, il convientde prévoir une méthode unique pour la détermination de la teneur en
huile de ces produits;
considérantque, pour ne pas causer un préjudice au commerce, il est
opportun de prévoir une période limitée pour l'écoulement de l'huileconditionnée avant l'entrée en vigueur du présent règlement;
considérantqu'il y a lieu d'abroger le règlement(CEE) n
o1058/77 de la
Commission (3), modifié en dernier lieu par le règlement(CEE) no1858/
88 (4);
considérant que le comité de gestion des matières grasses n'a pas émis
d'avis dans le délai imparti par son président,1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 2
(1)J O no172 du 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)J O noL 353 du 17. 12. 1990, p. 23.
(3)J O noL 128 du 24. 5. 1977, p. 6.
(4)J O noL 166 du 1. 7. 1988, p. 10.
▼B
A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:
Article premier
1. Sontconsidérées comme huiles d'olive vierges, au sens du point1
a), etb) de l'annexe du règlementno136/66/CEE, les huiles dontles
caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées àl'annexe I, points 1 et 2, du présent règlement.
2. Estconsidérée comme huile d'olive lampant e, au sens du point1
c) de l'annexe du règlementn
o136/66/CEE, l'huile dontles caract éris-
tiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 3, duprésentrèglement .
3. Estconsidérée comme huile d'olive raffinée, au sens du point2
de l'annexe du règlementn
o136/66/CEE, l'huile dont les caractéristi-
ques sontconformes à celles indiquées à l'annexe I, point4, duprésentrèglement .
4. Estconsidérée comme huile d'olive composée d'huile d'olive
raffinée etd'huiles d'olive vierges, au sens du point3 de l'annexe du
règlementn
o136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont
conformes à celles indiquées à l'annexe I, point5, du présentrègle-ment.
5. Estconsidérée comme huile de grignons d'olive brut e, au sens du
point4 de l'annexe du règlementn
o136/66/CEE, l'huile dontles carac-
téristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 6, duprésentrèglement .
6. Estconsidérée comme huile de grignons d'olive raffinée, au sens
du point5 de l'annexe du règlementn
o136/66/CEE, l'huile dontles
caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point7, du présentrèglement .
7. Estconsidérée comme huile de grignons d'olive, au sens du point
6 de l'annexe du règlementn
o136/66/CEE, l'huile dont les caractéristi-
ques sontconformes à celles indiquées à l'annexe I, point8, du présentrèglement.
Article 2
1. La détermination des caractéristiques des huiles prévues à
l'annexe I est effectuée selon les méthodes d'analyse suivantes:
— pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcen-
tage d'acide oléique, la méthode reprise à l'annexe II,
— pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode reprise à
l'annexe III,
— pour la détermination de la teneur en cires, la méthode reprise à
l'annexe IV,
— pour la détermination du contenu en stérols, la méthode reprise à
l'annexe V,
— pour la détermination de l'érythrodiol et de l'uvaol, la méthode
reprise à l'annexe VI,
— pour la détermination des acides gras saturés en position 2 du
triglycéride, la méthode reprise à l'annexe VII,
— pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode reprise à l'annexe
IX,
— pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode
reprise aux annexes X «A» etX «B».
— pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode
reprise à l'annexe XI,1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 3
▼M20
▼B
▼M19
▼B
▼M20
▼B
▼B
— pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques des huiles
d'olive vierges, la méthode reprise à l'annexe XII, appliquée confor-mémentau paragraphe 2,
— pour la détermination des stigmastadiènes, la méthode reprise à
l'annexe XVII,
— pour la détermination de la composition des triglycérides à ECN42,
la méthode reprise à l'annexe XVIII,
— pour la détermination du contenu en alcools aliphatiques, la
méthode reprise à l'annexe XIX.
2. La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants
des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges estréalisée par des jurys de dégustateurs agréés par les États membres.
Les caractéristiques organoleptiques d'une huile d'olive visée au
premier alinéa sontconsidérées comme conformes à la cat égorie d'huile
d'olive déclarée, si un jury agréé par l'État membre concerné confirme
le classementà cetégard.
Dans le cas où le jury agréé ne confirme pas la déclaration en ce qui
concerne les caractéristiques organoleptiques de la catégorie d'huiled'olive déclarée, les autorités nationales ou leurs représentants fontprocéder à la demande de l'intéressé à deux contre analyses, par
d'autres jurys agréés, dont au moins une est effectuée par un jury agréé
par l'État membre producteur concerné. Les caractéristiques en questionsontconsidérées comme conformes à celles qui sontdéclarées si lesdeux contre analyses confirment le classement déclaré. Dans le cascontraire les frais des contre analyses, sans préjudice des sanctions
encourues, sont imputées à l'intéressé.
3. En ce qui concerne la vérification par les autorités nationales ou
leurs représentants des caractéristiques des huiles, prévues au para-graphe 1, le prélèvement des échantillons est effectué selon les
normes internationales EN ISO 661 et EN ISO 5555 relatives à la
préparation des échantillons pour essai et à l'échantillonnage. Toutefois,par dérogation au point 6.8 de la norme EN ISO 5555, pour les lotsconstitués par lesdites huiles, en emballages immédiats inférieurs ouégaux à 100 litres, le prélèvement de l'échantillon s'effectue conformé-mentà l'annexe I bisdu présentrèglement .
Sans préjudice des dispositions de la norme EN ISO 5555 et du
chapitre 6 de la norme EN ISO 661, les échantillons sont mis à l'abride la lumière etdes fort es chaleurs dans le plus bref délai etsontenvoyés au laboratoire pour les analyses au plus tard:
— le dixième jour ouvrable suivantcelui du prélèvement , pendantles
mois d'octobre à mai et
— le cinquième jour ouvrable suivantcelui du prélèvement , pendant
les mois de juin à septembre.
4.►
M20 Pour la vérification prévue au paragraphe 3, les analyses
visées aux annexes II, III, IX, X etXII, ainsi que, le cas échéant , lescontre-analyses prévues par les législations nationales, sont effectuéesavant la date de durabilité minimale. Dans le cas où la prise de l'échan-
tillon s'effectue plus de quatre mois avant la date de durabilité
minimale, lesdites analyses sont effectuées au plus tard le quatrièmemois suivantcelui de la prise de l'échant illon. Aucun délai nes'applique pour les autres analyses prévues par ledit règlement. ◄
Sauf si la prise d'échantillon a eu lieu moins d'un mois avant la date de
durabilité minimale, dans le cas où les résultats des analyses ne corres-1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 4
▼M20
▼M11
▼M13
▼M19
▼M17
▼M19
▼M17
▼M17
pondent pas aux caractéristiques de la catégorie d'huile d'olive ou de
grignons d'olive déclarée, l'intéressé en reçoit notification au plus tardun mois avantla fin du délai visé au premier alinéa.
5. Pour la détermination des caractéristiques des huiles d'olive effec-
tuée selon les méthodes prévues au paragraphe 1, les résultats desanalyses sont directement comparés avec les limites prévues par leprésentrèglement .
Article 2 bis
La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants de la
conformité d'un échantillon des huiles d'olive et des huiles de grignons
d'olive avec la catégorie déclarée peut s'effectuer:
a) soit en réalisant, dans n'importe quel ordre, les analyses prévues à
l'annexe I;
b) soitsuivantl'ordre prévu à l'annexe I terrelatif au schéma déci-
sionnel, jusqu'à aboutir à une des décisions mentionnées par ledit
schéma.
Article►M193◄
Au cas où il est constaté que les caractéristiques organoleptiques d'une
huile sont différentes de celles résultant de sa dénomination, l'Étatmembre concerné applique, sans préjudice des autres sanctions éven-
tuelles, des sanctions pécuniaires administratives, dont le montant est
déterminé en fonction de la gravité de l'irrégularité constatée.
Aux fins de l'évaluation de l'irrégularité, il est tenu compte, notamment,
de l'évolution naturelle des caractéristiques d'une huile qui a été
conservée dans des conditions normales.
Les États informent la Commission, au début de chaque semestre, du
nombre et de la nature des irrégularités constatées ainsi que des sanc-
tions appliquées au cours du semestre précédent.
Article 4
1. Aux fins de l'appréciation et du contrôle par les autorités natio-
nales ou leur représentant des caractéristiques organoleptiques, les
États membres peuvent agréer des jurys de dégustateurs.
Les conditions d'agrément sont établies par les États membres, notam-
mentde façon à:
— répondre aux conditions de l'annexe XII, point 4.
— assurer que la formation du chef du jury soit effectuée par un
établissement et dans des conditions, reconnus à cet effet par l'Étatmembre.
— soumettre la validité de l'agrément aux résultats des performances
obtenues dans le cadre d'un système de contrôle annuel institué parl'État membre.
Chaque État membre communique à la Commission la liste des jurys
agréés ainsi que les mesures prises en conformité avec le présent para-graphe.
2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer
un jury de dégustateurs sur son territoire, il peut recourir à un jury de
dégustateurs agréé dans un autre État membre.
3. Chaque État membre établit la liste des jurys de dégustateurs
institués par des organisations professionnelles ou interprofessionnelles1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 5
▼M19
▼M20
▼M19
▼M5
▼M19
▼M5
▼M5
conformément aux conditions décrites au paragraphe 1 et veille au
respectde ces condit ions.
Article 6
1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extrac-
tion de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 estdéterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.
2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcen-
tage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.
Article 7
Les dispositions communautaires concernant la présence de contami-
nants sont applicables.
En ce qui concerne la teneur en solvants halogénés les limites pour
toutes les catégories d'huiles d'olive sont les suivantes:
— teneur maximale de chaque solvant halogéné détecté: 0,1 mg/kg,
— teneur maximale de la somme des solvants halogénés détectés:
0,2 mg/kg
Article 8
1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures
prises pour l'application du présent règlement.
2. Les États membres communiquent à la Commission, au début de
chaque semestre, un état récapitulatif des données analytiques des
déterminations effectuées au cours du semestre précédent.
Ces résultats sont examinés par le comité de gestion des matières
grasses selon la procédure prévue à l'article 39 du règlement n
o136/
66/CEE.
Article 9
Le règlement(CEE) no1058/77 estabrogé.
Article 10
1. Le présentrèglementent re en vigueur le jour suivantcelui de sa
publication au Journal officiel des Communautés européennes . Toute-
fois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partirdu►
M11ernovembre 1992 ◄, sauf en ce qui concerne les opéra-
tions liées à l'intervention.
Cette méthode ne s'applique pas aux huiles d'olive vierges condition-
nées avantle 1ernovembre 1992.
2. Le présentrèglementne s'applique pas aux huiles d'olive etde
grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur duprésentrèglementetcommercialisées jusqu'au 31 oct obre 1992.
Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directe-
ment applicable dans tout État membre.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 6
▼M19
▼B
▼M20
▼B
▼M5
▼B
▼B
ANNEXES
Sommaire
Annexe I: Caractéristiques des huiles d'olive
Annexe I bis: Échantillonnage des lots d'huile d'olive ou d'huile de
grignons d'olive en emballages immédiats de 100 litres au
maximum
Annexe I ter: Schéma décisionnel
Annexe II: Détermination des acides gras libres
Annexe III: Détermination de l'indice de peroxyde
Annexe IV: ►M6Détermination de la teneur en cires au moyen de la
chromatographie en phase gazeuse avec colonne
capillaire ◄
Annexe V: Détermination de la composition et du contenu en stérols au
moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec
colonne capillaire
Annexe VI: Détermination de la teneur en érythrodiol et en uvaol
Annexe VII: Détermination des acides gras saturés en position 2 des
triglycérides
Annexe IX: Analyse spectrophotométrique
Annexe X «A»: Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters
méthyliques d'acides gras
Annexe X «B»: Préparation des esters méthyliques d'acides gras
Annexe XI: Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils
dans l'huile d'olive
Annexe XII: Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge
Annexe XV: Teneur en huile des grignons d'oliveAnnexe XVI: Détermination de l'indice d'iode
Annexe XVII: Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les
huiles végétales
Annexe XVIII: Méthode de détermination de la composition des triglycé-
rides à ECN42
Annexe XIX: Méthode de détermination du contenu en alcools aliphati-
ques1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 7
▼M17
▼M20
▼B
▼M20
▼B
▼M20
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
ANNEXE I
CARACTÉRISTIQUESDES HUILES D'OLIVE
CatégorieAcidité
(%)
(*)Indice de
peroxydes
mEq O2/kg
(*)Cires mg/kg
(**)Acides saturés
en position 2
du triglycéride
(%)Stigmasta-
diène mg/
kg (1)Différence
ECN42 HPLC
etECN42
Calcul théo-
riqueK232(*) K270(*) Delta-K (*)Évaluation
organoleptique
Médiane du
défaut(Md)
(*)Évaluation
organoleptique
Médiane du
fruité (Mf) (*)
1. Huile d'olive vierge extra ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Huile d'olive vierge ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Huile d'olive lampante > 2,0 — ≤300 (3) ≤1,5 ≤0,50 ≤0,3 — — — Md > 2,5 (2)—
4. Huile d'olive raffinée ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 — —
5. Huile d'olive composée
d'huiles d'olive raffinées
etd'huiles d'olive vierges ≤1,0 ≤15 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 — —
6. Huile de grignons d'olive
brute — — > 350 (4) ≤2,2 — ≤0,6 — — — — —
7. Huile de grignons d'olive
raffinée ≤0,3 ≤5 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 — —
8. Huile de grignons d'olive ≤1,0 ≤15 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 — —
(1) Somme des isomères qui pourraient(ou non) êt re séparés par colonne capillaire.
(2) Ou lorsque la médiane des défauts est inférieure ou égale à 2,5 et la médiane du fruité est égale à 0.
(3) Les huiles avec une teneur en cires comprise entre 300 mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme huile d'olive lampante si les alcools aliphatiques to taux sont inférieurs ou égaux à 350 mg/kg ou si le pourcentage en
érytrodiol et uvaol est inférieur ou égal à 3,5.
(4) Les huiles avec une teneur en cires comprise entre 300 mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme huile de grignons d'olive brute si les alcools aliphat iques totaux sont supérieurs à 350 mg/kg et si le pourcentage en érytrodiol
etuvaol estsupérieur à 3,5.▼M201991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 8
CatégorieTeneur en acides gras (1)
Sommes
des
isomères
transoléi-
ques
(%)Sommes
des
isomères
translino-
léiques +
translino-
léniques
(%)Composition en stérols
Stérols
totaux
(mg/kg)Érythro-
diol et
uvaol
(%) (**)Myris-
tique
(%)Linolé-
nique
(%)Arachi-
dique
(%)Eicose-
noïque
(%)Béhé-
nique
(%)Lignocé-
rique
(%)Cholés-
térol
(%)Brassi-
castérol
(%)Campes-
térol
(%)Stigmas-
térol
(%)Bétasitos-
térol
(%) (2)Delta-7-
stigmas-
ténol
(%)
1. Huile d'olive
vierge extra ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Huile d'olive
vierge ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Huile d'olive
lampante ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (3)
4. Huile d'olive
raffinée ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
5. Huile d'olive
composée
d'huiles d'olive
raffinées et
d'huiles d'olive
vierges ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Huile de
grignons d'olive
brute ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (4)
7. Huile de
grignons d'olive
raffinée ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
8. Huile de
grignons d'olive ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Teneur en autres acides gras (%): palmitique: 7,5-20,0; palmitoléique: 0,3-3,5; heptadécanoïque: ≤1,3; heptadécénoïque: ≤0,3; stéarique: 0,5-5,0; oléique: 55,0-83,0; linoléique: 3,5-21,0.
(2) Somme de: Delta-5-23-Stigmastadiénol + Clérostérol + Bêta-Sitostérol + Sitostanol + Delta-5-Avénastérol + Delta-5-24-Stigmastadiénol.
(3) Les huiles avec une teneur en cires comprise entre 300 mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme huile d'olive lampante si les alcools aliphatiques to taux sont inférieurs ou égaux à 350 mg/kg ou si le pourcentage en
érytrodiol et uvaol est inférieur ou égal à 3,5.
(4) Les huiles avec une teneur en cires comprise entre 300 mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme huile de grignons d'olive brute si les alcools aliphat iques totaux sont supérieurs à 350 mg/kg et si le pourcentage en érytrodiol
etuvaol estsupérieur à 3,5.
Notes:
a) Les résultats des analyses doivent être exprimés en indiquant le même nombre de décimales que ceux prévus pour chaque caractéristique. Le dernier c hiffre doit être augmenté d'une unité si le chiffre suivant dépasse 4.
b) Il suffit qu'une seule caractéristique ne soit pas conforme aux valeurs indiquées pour que l'huile soit changée de catégorie ou déclarée non confor me quantà sa puret é.
c) Les caractéristiques indiquées avec astérisque (*), se référant à la qualité de l'huile, impliquent que:
— pour l'huile d'olive lampante, les limites y relatives peuvent ne pas être simultanément respectées,— pour les huiles d'olive vierges, le non-respect d'au moins une de ces limites comporte un changement de catégorie, tout en restant classées dans une d es catégories des huiles d'olive vierges.
d) Les caractéristiques indiquées avec deux astérisques (**) impliquent que, pour toutes les huiles de grignons d'olive, les limites y relatives peu vent ne pas être simultanément respectées.▼M201991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 9
▼M20
ANNEXE I bis
Échantillonnage d'huile d'olive ou d'huile de grignons d'olive livrées en
emballages immédiats de 100 litres au maximum
La présente méthode d'échantillonnage s'applique pour des livraisons d'huiles
d'olive ou de grignons d'olive de 125 000 litres au maximum, conditionnées en
emballages immédiats de 100 litres au maximum.
Lorsque la livraison comporte plus de 125 000 litres, elle est subdivisée en lots
de quantités égales ou inférieures à 125 000 litres. Lorsque la livraison est infé-
rieure à 125 000 litres, elle constitue un lot. La méthode s'applique alors à
chaque lot.
En fonction de la taille du lot, il est établi le nombre minimal de prélèvements
élémentaires, conformément au tableau figurant au point 1.
L'importance du prélèvement élémentaire est établie en fonction de la capacité
des emballages immédiats, selon le tableau prévu au point 2.1.
On entend par «livraison», «prélèvement élémentaire» et «échantillon de labora-
toire», les définitions visées à la norme EN ISO 5555.
On entend par «lot» un ensemble d'unités de vente qui sont produites, fabriquées
et conditionnées dans des circonstances telles que l'huile contenue dans chacune
de ces unités de vente est considérée comme homogène pour toutes les caracté-
ristiques analytiques.
1. NOMBRE DE PRÉLÈVEMENTS ÉLÉMENTAIRES
Le nombre minimal de prélèvements élémentaires est établi en fonction de
la taille du lot conformément au tableau suivant:
Taille du lotinférieure à
(en litres)Nombre minimal de prélèvements
élémentaires
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Les emballages immédiats d'un même prélèvement élémentaire doivent être
choisis de façon contiguë dans le lot.
En cas de doute, l'État membre augmente le nombre de prélèvements
élémentaires à effectuer.
2. CONTENU D'UN PRÉLÈVEMENT ÉLÉMENTAIRE
2.1.Chaque prélèvement élémentaire est constitué par:
Dans le cas où les emballages immé-
diats ont une capacité:Le prélèvement élémentaire porte sur
l'huile de:
a) Supérieure ou égale à 5 litres a) 3 emballages immédiats
b) Supérieure ou égale à 3 litres et
inférieure à 5 litresb) 3 emballages immédiats
c) Supérieure ou égale à 2 litres et
inférieure à 3 litresc) 3 emballages immédiats
d) Supérieure ou égale à 1 litre et
inférieure à 2 litresd) 6 emballages immédiats
e) Supérieure ou égale à 0,75 litre
etinférieure à 1 lit ree) 6 emballages immédiats
f) Inférieure à 0,75 litre f) 3 fois l'huile du nombre minimal
d'emballages dontla capacit é
totale dépasse 1,5 litre1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 10
▼M20
2.2.Les prélèvements élémentaires devront être maintenus dans les embal-
lages immédiats jusqu'au moment des analyses. L'huile des
prélèvements élémentaires est en suite, le cas échéant, subdivisée en
trois échantillons de laboratoire en vue d'effectuer:
a) les analyses visées aux annexes II, III, IX etX;
b) l'analyse visée à l'annexe XII;
c) les autres analyses.
2.3.Les emballages qui constituent un prélèvement élémentaire sont subdi-
visés selon les procédures de contrôle prévues par les législations
nationales.
3. ANALYSES ET RÉSULTATS
a) Chacun des prélèvements élémentaires visés au point 1 est subdivisé en
échantillons de laboratoire, conformément au point 2.5 de la norme EN
ISO 5555, pour être soumis aux analyses suivantes:
— détermination des acides gras libres, visée à l'article 2, paragraphe 1,
premier tiret,
— détermination de l'indice de peroxydes, visée à l'article 2, paragraphe
1, deuxième tiret,
— analyse spectrophotométrique, visée à l'article 2, paragraphe 1,
huitième tiret,
— composition en acides gras, visée à l'article 2, paragraphe 1,
neuvième tiret.
b) Dans le cas où, pour au moins un des prélèvements élémentaires pris sur
le même lot, les résultats d'analyses visées au point a) ne sont pas tous
conformes aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée,
l'ensemble du lotconcerné estdéclaré non conforme.
Dans le cas où, pour chacun des prélèvements élémentaires pris sur le
même lot, les résultats des analyses visées au point a) ne sont pas tous
homogènes, compte tenu des caractéristiques de répétabilité des
méthodes concernées, l'ensemble du lot est déclaré non homogène et
chaque prélèvement élémentaire doit être soumis aux autres analyses
requises. Dans le cas contraire, un seul des prélèvements élémentaires
sur leditlotestsoumis aux aut res analyses requises.
c) Dans les cas où un des résultats d'analyses visées au point b), deuxième
alinéa, n'est pas conforme aux caractéristiques de la catégorie d'huile
déclarée, l'ensemble du lotconcerné estdéclaré non conforme.
Dans le cas où tous les résultats des analyses visées au point b),
deuxième alinéa, sont conformes aux caractéristiques de la catégorie
d'huile déclarée, l'ensemble du lotconcerné estdéclaré conforme.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 11
▼M20
ANNEXE I ter
SCHÉMA DÉCISIONNEL POUR LA VÉRIFICATION DE LA
CONFORMITÉ D'UN ÉCHANTILLON D'HUILE D'OLIVE AVEC LA
CATÉGORIE DÉCLARÉE
L'analyse de la conformité d'une huile d'olive ou de grignons d'olive à la caté-
gorie déclarée peuts'effect uer:
a) soiten réalisantdans n'import e quel ordre les analyses prévues pour vérifier
le respect des caractéristiques stipulées à l'annexe I;
b) soiten réalisantdans l'ordre indiqué par le schéma décisionnel les analyses
qui y sont prévues, jusqu'à aboutir à une des décisions mentionnées par ledit
schéma décisionnel.
Les analyses relatives aux contaminants nécessaires pour vérifier la conformité
avec les normes de la Communauté européenne sont à réaliser indépendamment.
Le schéma décisionnel s'applique à toutes les catégories d'huiles d'olive et de
grignons d'olive. Il se compose de tableaux numérotés de 1 à 11 qui doivent
être abordés en fonction de la déclaration de la catégorie de l'huile en présence
selon l'ordre prévu dans le tableau général.
Pour la lecture du tableau général au tableau 11:
— La double ligne (=) indique le chemin à suivre en cas de conformité
(réponse positive) avec les conditions prévues dans la case qui précède. La
ligne pointillée (…) indique à l'inverse le chemin à suivre en cas de non
conformité.
— Les titres des cases figurant dans les tableaux 1 à 11 se réfèrent aux analyses
prévues par le présentrèglementselon les correspondances ment ionnées à
l'appendice 1 de la présente annexe.
— Les lettres de renvoi figurant dans les cercles de décision négative des
tableaux 1 à 11 correspondent à des informations indicatives mentionnées à
l'appendice 2 de la présente annexe. Elles n'impliquent pas par elles-même
l'obligation de poursuivre les analyses ou la certitude des présomptions
mentionnées.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 12
▼M20
Tableau général1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 13

▼M20
Tableau 11991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 14

▼M20
Tableau 21991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 15

▼M20
Tableau 31991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 16

▼M20
Tableau 41991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 17

▼M20
Tableau 51991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 18

▼M20
Tableau 61991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 19

▼M20
Tableau 71991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 20

▼M20
Tableau 81991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 21

▼M20
Tableau 91991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 22

▼M20
Tableau 101991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 23

▼M20
Tableau 111991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 24

▼M20
Appendice 1
Correspondanceentrelesannexesduprésentrèglementetlesanalysesviséesparleschémadéci-
sionnel
— Acidité Annexe II Détermination des acides gras
libres
— Indice de peroxydes Annexe III Détermination de l'indice de
peroxyde
— Spectrophotométrie dans l'ultra-
violetAnnexe IX Analyse spectrophotométrique
— Évaluation organoleptique Annexe XII Évaluation organoleptique de
l'huile d'olive vierge
— Stigmasta-3,5-diène Annexe XVII Méthode de détermination des
stigamastadiènes dans les huiles
végétales
— Isomères trans des acides gras Annexe X a et Analyse par chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyli-
ques d'acides gras
Annexe X b Préparation des esters méthyliques
d'acides gras
— Composition en acides gras Annexe X a et Analyse par chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyli-
ques d'acides gras
Annexe X b Préparation des esters méthyliques
d'acides gras
—∆ECN42 Annexe XVIII Détermination de la composition
des triglycérides à ECN42 (diffé-
rence entre composition réelle et
composition théorique)
— Composition en stérols et
stérols totauxAnnexe V Détermination de la composition et
du contenu en stérols au moyen de
la chromatographie en phase
gazeuse avec colonne capillaire
— Érythrodiol et uvaol Annexe VI Détermination de la composition en
érythrodiol et en uvaol
— Cires Annexe IV Détermination de la teneur en cires
au moyen de la chromatographie en
phase gazeuse avec colonne capil-
laire
— Alcools aliphatiques Annexe XIX Détermination du contenu en
alcools aliphatiques au moyen de
la chromatographie en phase
gazeuse avec colonne capillaire
— Acides gras saturés en position
2Annexe VII Détermination des acides gras
saturés en position 2 du triglycéride1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 25
▼M20
Appendice 2
Tableau 1
a) Voir huile d'olive vierge ou lampante (critères de qualité, tableau 2 ,o u
critères de qualité et de pureté, tableau 4 )
b) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4 )
Tableau 2
a) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4 )
b) Voir huile d'olive vierge extra (critères de qualité, tableau 1 )
Tableau 3
a) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)
b) Présence d'huile de grignons d'olive
Tableau 4
a) Voir huile d'olive vierge extra et huile d'olive vierge (critères de qualité,
tableaux 1 et 2 )
b) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)
c) Présence d'huile de grignons d'olive
d) Présence d'huiles estérifiées
Tableau 7
a) Présence d'huile de grignons d'olive
b) Présence d'huiles estérifiées
Tableau 8
a) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)
b) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4 )
c) Présence d'huiles estérifiées
Tableau 11
a) Présence d'huiles estérifiées1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 26
▼B
ANNEXE II
DÉTERMINATIONDES ACIDESGRAS LIBRES
1. OBJET
Détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive. La teneur en
acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée conventionnellement.
1.1.Principe
Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis
titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution éthanolique
d'hydroxyde de potassium.
1.2.Réactifs
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau
utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.
1.2.1. Oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume.
Note: L'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des
peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions
particulières.
Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydro-
xyde de potassium (1.2.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de
phénolphtaléine (1.2.3) pour 100 millilitres de mélange.
Note: S'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de
solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si néces-
saire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.
1.2.2. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique titrée c(KOH) - 0,1 mole
par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) - 0,5 mole par litre environ.
La concentration exacte de la solution éthanolique d'hydroxyde de potas-
sium doit être connue et vérifiée immédiatement avant l'emploi. Utiliser
une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans
un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solu-
tion doit être incolore ou jaune paille.
Note: Une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium peut être
préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure
à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol avec 8 grammes
d'hydroxyde de potassium et 0,5 gramme de rognures d'aluminium.
Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité
requise d'hydroxyde de potassium. Laisser reposer durant plusieurs
jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbo-
nate de potassium.
La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon
suivante. À 1 000 millilitres d'éthanol, ajouter 4 millilitres de buty-
lite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques
jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité
requise d'hydroxyde de potassium. Cette solution est prête pour
l'emploi.
1.2.3. Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 %
(V/V) ou bleu alcalin (dans le cas de corps gras fortement coloré) solu-
tion à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V).
1.3.Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
1.3.1. Balance analytique
1.3.2. Fiole conique de 250 millilitres de capacité
1.3.3. Burette de 10 millilitres de capacité, graduée en 0,05 millilitre.
1.4.Mode opératoire
1.4.1. Préparation de l'échantillon pour essai
La détermination est effectuée sur l'échantillon filtré. Si la teneur globale
en humidité et en impuretés est inférieure à 1 %, la détermination est
effectuée sur l'échantillon tel quel.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 27
▼B
1.4.2. Prise d'essai
Prélever une prise d'essai, selon l'indice d'acide présumé, d'après les indi-
cations du tableau suivant.
Indice d'acide présuméMasse de la prise d'essai
(en g)Précision de la pesée de
la prise d'essai
(en g)
< 1 20 0,05
1 à 4 10 0,02
4 à 15 2,5 0,01
15 à 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Peser la prise d'essai dans la fiole conique (1.3.2).
1.4.3. Détermination
Dissoudre la prise d'essai (4.5.2) dans 50 à 150 millilitres du mélange
oxyde diéthylique/éthanol (1.2.1), préalablement neutralisé.
Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole
par litre (1.2.2) (voir note 2) jusqu'à virage de l'indicateur (coloration rose
de la phénolpthaléine persistant durant au moins 10 secondes).
Note 1: La solution éthanolique titrée d'hydroxyde de potassium (1.2.2)
peut être remplacée par une solution aqueuse d'hydroxyde de
potassium ou de sodium lorsque le volume d'eau introduit
n'entraîne pas une séparation de phases.
Note 2: Si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium à
0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à
0,5 mole par litre.
Note 3: Si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une
quantité suffisante du mélange de solvants (1.2.1) pour donner
une solution claire.
1.5.Expression de l'acidité en pourcentage de l'acide oléique
L'acidité, exprimée en pourcentage en poids, est égale à:
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
où:
V: volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium
utilisée;
c: concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée
d'hydroxyde de potassium utilisée;
M: poids molaire, en grammes par mole, de l'acide adopté pour
l'expression du résultat (= 282);
m: poids en grammes, de la prise d'essai.
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique ►M6de deux
déterminations ◄.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 28
▼B
ANNEXE III
DÉTERMINATIONDE L'INDICE DE PEROXYDE
1. OBJET
La présente norme décrit une méthode de détermination de l'indice de
peroxyde dans les huiles etmat ières grasses.
2. CHAMP D'APPLICATION
La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses animales et
végétales.
3. DÉFINITION
L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon
(exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent
l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.
4. PRINCIPE
La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme
est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré
avec une solution de thiosulfate de sodium.
5. APPAREILLAGE
Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances
oxydantes ou réductrices.
Nota bene: ne pas graisser les surfaces rodées.
5.1. Cuiller en verre de 3 millilitres.
5.2. Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au
préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence,
dioxyde de carbone).
5.3. Burette de 25 ou 50 millilitres avec graduations de 0,1 millilitre.
6. RÉACTIFS
6.1. Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été
éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).
6.2. Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier
ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz sec et pur).
6.3. Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente,
exempte d'iode et d'iodates.
6.4. Solution aqueuse de thiosulfate de sodium 0,01 ou 0,002 N, soigneusement
normalisée juste avant l'emploi.
6.5. Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment
préparée à partir d'amidon naturel soluble.
7. ÉCHANTILLON
Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière,
conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entière-
mentetfermés hermét iquementà l'aide de bouchons de liège ou de verre
rodé.
8. MODE OPÉRATOIRE
L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou arti-
ficielle. Dans une cuiller en verre (5.1) ou, à défaut, dans une fiole (5.2),
peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le
tableau ci-après en fonction de l'indice de péroxyde prévu.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 29
▼B
Indice de peroxyde prévu
(en meq 02/kg)Poids de la prise d'essai
(en g)
de 0 à 12 de 5,0 à 2,0
de 12 à 20 de 2,0 à 1,2
de 20 à 30 de 1,2 à 0,8
de 30 à 50 de 0,8 à 0,5
de 50 à 90 de 0,5 à 0,3
Déboucher une fiole (5.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise
d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (6.1). Dissoudre rapidement la
prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (6.2) puis 1
millilitre de solution d'iodure de potassium (6.3). Remettre le bouchon rapi-
dement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5
minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 ºC.
Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la
solution de thiosulfate de sodium (6.4) (solution 0,002 N, si les indices
prévus sontinférieurs à 12, et0,001 N, s'ils sontsupérieurs à 12) en agit ant
vigoureusementeten employantla solut ion d'amidon (6.5) comme indica-
teur.
Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier exède
0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium (6.4) 0,001 N, remplacer
les réactifs impurs.
9. EXPRESSION DES RÉSULTATS
L'indice de péroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par
kilogramme, estfourni par la formule:
IP¼
V/C2T/C21 000
m
où:
V: = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium norma-
lisée (6.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de
l'essai à blanc;
T: = facteur de normalité exact de la solution de thiosulfate de sodium
(6.4) utilisée;
m: = poids (en grammes) de la prise d'essai.
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 30
▼M6
ANNEXE IV
DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN CIRES AU MOYEN DE LA
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE
CAPILLAIRE
1. OBJET
La méthode décrit un procédé pour la détermination de la teneur en
cires de certaines matières grasses, dans les conditions de l'essai.
La méthode peut être employée notamment pour différencier l'huile
d'olive de pression de celle d'extraction (huile de grignons).
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse, additionnée d'un étalon interne approprié, est frac-
tionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté; la
fraction éluée en premier dans les conditions de l'essai (à polarité infé-
rieure à celle des triglycérides) est récupérée, puis analysée directement
par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.
3. MATÉRIEL
3.1. Erlenmeyer de 25 ml.
3.2. Colonne en verre pour chromatographie diamètre intérieur 15,0 mm,
hauteur 30 à 40 cm.
3.3. Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié avec colonne
capillaire, équipé d'un système d'introduction directe dans la colonne,
constitué par:
3.3.1. un four à thermostat pour les colonnes, permettant de maintenir la
température souhaitée à ± 1 ºC près,
3.3.2. un injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne,
3.3.3. un détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur,3.3.4. un enregistreur-intégrateur approprié pour le fonctionnement avec le
convertisseur-amplificateur (3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à
1 seconde etvit esse de déroulementdu papier variable,
3.3.5. une colonne capillaire en verre ou silice fondue: ►
C2longueur 10 à
15 m◄, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l'intérieur
de liquide SE-52 ou SE-54 ou équivalents, à l'épaisseur uniforme
comprise entre 0,10 et 0,30 µm.
3.4. Microseringue pour introduction directe dans la colonne de 10 µl,
équipée d'une aiguille cimentée.
4. RÉACTIFS
4.1. Gel de silice 70-230 mesh, art. 7754 Merck.
Le gel de silice doitêt re placé dans le four à 500 ºC pendant4 heures.
Après refroidissement y ajouter 2 % d'eau. Agiter convenablement afin
d'homogénéiser la masse. Conserver à l'obscurité pendant au moins 12
heures avantl'emploi.
4.2. n-Hexane, pour chromatographie.
4.3. Éther éthylique, pour chromatographie.4.4. n-Heptane, pour chromatographie.
4.5. Solution étalon d'arachidate laurique, solution à 0,1 % (m/v) dans
l'hexane (étalon interne).
4.6. Gaz vecteur: hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse.
4.7. Gaz auxiliaires:
— hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse,
— air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 31
▼M6
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Séparation de la fraction des cires5.1.1. Préparation de la colonne chromatographique
Mettre en suspension 15 g de gel de silice hydraté à 2 % dans le n-
hexane anhydre etles int roduire dans la colonne.
Après tassement spontané, le compléter à l'aide d'un agitateur électrique
pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Percoler 30
ml de n-hexane afin d'éliminer les impuretés éventuelles.
5.1.2. Conduite de la chromatographie sur colonne
Peser exactement 500 mg de l'échantillon dans l'Erlenmeyer de 25 ml,
ajouter la quantité appropriée d'étalon interne, en fonction du contenu
présumé de cires. Exemple: ajouter 0,1 mg d'arachidate laurique dans
le cas de l'huile d'olive et0,25 à 0,5 mg dans le cas de l'huile de
grignons.
Transférer l'échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatogra-
phique préparée comme indiqué au point5.1.1., à l'aide de deux
portions de 2 ml chacune de n-hexane.
Laisser s'écouler le solvantjusqu'à 1 mm au-dessus du niveau supérieur
de l'absorbant. À ce point commence l'élution chromatographique;
recueillir 140 ml du mélange n-hexane/éther éthylique, rapport 99:1,
tout en respectant un débit d'environ 15 gouttes toutes les 10 secondes
(2,1 ml/minute).
La fraction ainsi obtenue est séchée dans l'évaporateur rotatif jusqu'à
élimination pratiquement totale du solvant. Les 2 ou 3 derniers ml du
solvant sont éliminés à l'aide d'un faible courant d'azote; ajouter ensuite
10 ml de n-heptane.
5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse5.2.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne
5.2.1.1. Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en bran-
chant le terminal d'entrée connecté au système on-column et le terminal
de sortie au détecteur.
Effectuer les contrôles généraux de l'appareillage de chromatographie
en phase gazeuse (tenue des circuits des gaz, efficience du détecteur et
du système d'enregistrement, etc.).
5.2.1.2. Si la colonne estut ilisée pour la première fois, il estrecommandé de
procéder à son conditionnement. Laisser s'écouler un léger débit de
gaz à travers la colonne, puis allumer l'appareillage de chromatographie
en phase gazeuse. Chauffer graduellement jusqu'à atteindre une tempé-
rature d'au moins 20 ºC supérieure à celle de fonctionnement (note).
Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis procéder
au réglage de l'appareillage aux conditions de fonctionnement (réglage
du débitdes gaz, allumage de la flamme, branchementà l'enregist reurélectronique, réglage de la température de la chambre pour la colonne,
du détecteur, etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité au moins 2
fois supérieure à celle prévue pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de
la ligne de base doit être linéaire, exempt de pics de toute nature, et ne
doit pas présenter une déviation.
Une déviation rectiligne négative indique une tenue imparfaite des
connexions de la colonne; une déviation positive indique un condition-
nementinsuffisantde la colonne.
Note: La température de conditionnement doit être en tout cas infé-
rieure d'au moins 20 ºC à la température maximale prévue pourl'éluentemployé.
5.2.2. Choix des conditions opératoires
5.2.2.1. D'une manière générale, les conditions opératoires à observer sont les
suivantes:
— température de la colonne: au départ de 80 ºC, puis augmentation de
30 ºC/minute jusqu'à 120 ºC, ensuite programmée de 5 ºC/minute
jusqu'à 340 ºC,
— température du détecteur: 350 ºC,— vitesse linéaire du gaz vecteur: hydrogène 20 à 35 cm/seconde,— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 mV du fond de l'échelle,
— vitesse de déroulement du papier: 30 cm/heure,1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 32
▼M6
— quantité de matière injectée: 0,5 à 1 µl de solution.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques
de la colonne etde l'appareil de chromat ographie en phase gazeuse
(de manière à obtenir des chromatogrammes satisfaisant aux conditions
suivantes: le temps de rétention de l'étalon interne C 32 doit être de 25
± 2 minutes et le pic des cires le plus représentatif doit se situer entre
60 et100 % du fond de l'échelle).
5.2.2.2. Les paramètres d'intégration des pics doivent être déterminés de façon à
obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.
5.2.3. Exécution de l'analyse
5.2.3.1. Prélever 1 µl de la solution à l'aide de la microseringue de 10 µl; retirer
le piston de la seringue de manière à ce que l'aiguille soit vide. Intro-
duire l'aiguille dans le dispositif d'injection et après 1 à 2 secondes
injecter rapidement; au bout d'environ 5 secondes, extraire lentement
l'aiguille.
5.2.3.2. Effectuer l'enregistrement jusqu'à élution complète des cires.
La ligne de base doit toujours répondre aux conditions requises
(5.2.1.2).
5.2.4. Identification des pics
L'identification des différents pics doit être effectuée à partir des temps
de rétention et par comparaison avec des mélanges de cires aux temps
de retention connus, analysés dans les mêmes conditions.
La figure 1 représente un chromatogramme des cires d'une huile d'olive
vierge.
5.2.5. Évaluation quantitative
5.2.5.1. Procéder au calcul des aires des pics de l'étalon interne et des esters
aliphatiques de C 40 à C 46 à l'aide de l'intégrateur.
5.2.5.2. Calculer la teneur en cires de chacun des esters, en mg/kg de matière
grasse, par la formule:
ester (mg/kg) =Ax·ms·►M91 000◄
As·m
Où:
Ax= aire du pic de chaque ester;
As= aire du pic de l'arachidate laurique;
ms= masse de l'arachidate laurique ajoutée, en milligrammes;
m = masse de l'échantillon prélevé pour la détermination, en
grammes.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Indiquer les teneurs des différentes cires, ainsi que leur somme, en mg/
kg de matière grasse.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 33
▼M6
APPENDICE
Détermination de la vitesse linéraire du gaz
Injecter de 1 à 3 µl de méthane (ou propane) dans l'appareil de chromatographie
en phase gazeuse, après son réglage aux conditions opératoires normales. Chro-
nométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, à partir du
moment de son injection jusqu'au moment de la sortie du pic (tM).
La vitesse linéaire, en cm/s, est donnée par la formule L/tM, où L est la
longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 34
▼M6
1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 35
▼B
ANNEXE V
DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION ET DU CONTENU EN
STÉROLS AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE
1. OBJET
La méthode décrit le procédé de détermination du contenu en stérols,
simples et totaux, des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse, additionnée d' α-cholestanol comme standard interne,
est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans
l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La
fraction stérolique est séparée de l'extrait insaponifiable par chromato-
graphie sur plaque de gel de silice basique; les stérols récupérés dans
le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par
chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.
3. APPAREILLAGE
3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts
rodés.
3.2. ►C1Ampoules ◄à décanter de 500 millilitres.
3.3. Ballons de 250 millilitres.3.4. Équipementcompletpour chromat ographie en phase solide, avec
plaques de verre de 20 × 20 centimètres.
3.5. Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.
3.6. Microseringues de 100 et500 microlit res.
3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40
micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres
de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout
rodé mâle 12/21.
3.8. Fiole à vide 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable à
l'ampoule filtrante (3.7).
3.9. Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.3.10. Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec
colonne capillaire, doté d'un système de séparation, constitué de:
3.10.1. Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la
température désirée avec une précision d'environ 1º C
3.10.2. Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en
verre persilanisé
3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur
3.10.4. Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertis-
seur-amplificateur.
3.11. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de
long, de 0,25 à 0,32 millimètres de diamètre intérieur, recouverte inté-
rieurementde liquide. SE-52 ou SE-54 ou équivalent , avec une
épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.
3.12. Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10
►
C1microlitres ◄avec aiguille cémentée.
4. RÉACTIFS
4.1. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre,
tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre
minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à
un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles
de verre opaque bien bouchées (éthanol 95 % V/V).
4.2. Éther éthylique pur, pour analyses.4.3. Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 36
▼B
4.4. Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluores-
cence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le
commerce déjà prêtes à l'emploi).
4.5. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2N: dissoudre 13
grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée,
puis compléter à un litre avec de l'éthanol.
4.6. Benzène, pour chromatographie (5.2.2).
4.7. Acétone, pour chromatographie (5.2.2).
4.8. Hexane pour chromatographie (5.2.2).4.9. Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).
4.10. Chloroforme pur, pour analyses.
4.11. ►
C1Solution de référence ◄pour la chromatographie sur plaque:
cholestérol ou phytostérol, solution à ►M62%◄dans le chloro-
forme.
4.12. Dichloro-2 ′-7′fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est
rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solu-
tion alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.
4.13. Pyridine anhydre, pour chromatographie.
4.14. Hexaméthyldisilazane.
4.15. Triméthylchlorosilane.4.16. Solution échantillon des triméthylsilyléthers des stérols: à préparer au
moment de l'emploi à partir des stérols tirés des huiles qui les conte-
naient.
4.17. α-cholestanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard
interne).
4.18. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase
gazeuse.
4.19. Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en
phase gazeuse.
5. PROCÉDÉ
5.1. Préparation de l'insaponifiable
5.1.1. Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microse-
ringue de 500 microlitres, un volume de solution d' α-cholestanol à
0,2 % dans le chloroforme (4.17) qui contienne une quantité d' α-choles-
tanol correspondant à environ 10 % des stérols contenus dans l'aliquote
d'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5
grammes d'échantillon, il faut ajouter 500 microgrammes de la solution
d'α-cholestane à 0,2 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et 1 500
microlitres s'il s'agit ►
M6 ◄d'huile de grignons
d'olive.
Évaporer dans un courant d'azote jusquà dessication, puis peser exacte-
ment 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.
Dans le cas d'huiles ►M6 ◄qui contiennent des quan-
tités considérables de cholestérol, un pic ayant un temps de rétention
identique à celui du cholestanol peut être présent. Dans de tels cas, il
faut analyser la fraction stérolique en double, avec et sans standard
interne►M6ou utiliser, au lieu de choléstanol, le betulinol ◄.
5.1.2. Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium
à 2N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie
jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique
jusqu'à que la saponification se soit produite (la solution devient
limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50
millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant,
débrancher le réfrigérantetrefroidir le ballon à environ 30º C.
5.1.3. Transvaser le contenu du ballon de façon quantitative, dans une
ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillé à
plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter
environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant
environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).
Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillantdans une aut re
ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse,1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 37
▼B
selon les mêmes modalités en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres
d'éther éthylique.
Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant,
avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou
méthylique.
5.1.4. Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à
l'eau distillée (50 ml à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de
lavage.
Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et
filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 ml pesé
au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther
éthylique.
5.1.5. Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il en reste de petites quantités, puis porter
à sec sous un léger vide ou dans un courantd'azot e, parfaire le séchage
à l'étuve à 100º C durant un quart d'heure environ et peser après refroi-
dissementdans un dessicat eur.
5.2. Séparation de la fraction stérolique.5.2.1. Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice
(4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de
potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser les ensuite enfermées sous
hotte pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100º C
pendantune heure.
Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de
calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent
être employées dans les quinze jours).
Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la sépara-
tion de la fraction stérolique élimine le besoin du traitement de
l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les
composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus
sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des stérols
nettement séparée de la bande des alcools aliphatiques et terpé-
niques.
5.2.2. Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone
95/5 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser
à la place un mélange hexane-éther éthylique 55/35 (V/V). Fermer la
cuve à l'aide d'une couvercle approprié etlaisser ainsi pendantune
demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'éta-
blisse. Il estpossible de fixer sur les surfaces int érieures de la cuve des
bandes de papier filtré qui plongent dans l'éluant: cette précaution
permet de réduire d'un tiers environ le temps de migration du front du
liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.
Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproducti-
bles, le mélange doitêt re chargé à chaque essai.
5.2.3. Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le
chloroforme et, avec la microseringue de ►
C1100 microlitres ◄,
déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1), à 2 centimètres
environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne
continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la
ligne de dépôt, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 micro-
litres de la solution de référence des stérols (4.11), dans le but
d'identifier la bande des stérols lors du dernier développement.
5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme
décrit en (5.2.2). La température ambiante doit être maintenue entre 15
et20º C. Fermer aussit ôtla chambre avec le couvercle etlaisser éluer
jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord
supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de dévelop-
pementetfaire évaporer le solvantdans un courantd'air chaud ou bien
en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment.
5.2.5. Vaporiser légèrementla plaque etde façon uniforme avec la solut ion de
dichloro-22-72fluorescéine. Identifier la bande des stérols par aligne-
ment avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter la
bande avec un crayon noir le long des bords de la fluorescence.
5.2.6. Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone
délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans
l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud,
mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du
vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule
filtrante.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 38
▼B
Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ
10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole
adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un
volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle
dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en
chauffantlégèrementdans un léger courantd'azot e, reprendre avec
quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes
environ à l'étuve à 105º C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser.
Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction stérolique.
5.3. Préparation des triméthylsilyléthers5.3.1. Ajouter, dans le tube contenant la fraction stérolique, le réactif de sily-
lation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-
triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 4) dans une proportion de
50 microlitres par milligramme de stérols, en évitant toute absorption
d'humidité (note 5).
Note 4: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en
outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le
bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosi-
lane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.
5.3.2. Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète
solubilisation des stérols. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes
à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la
solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase
gazeuse.
Note 5: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale
et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une
floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont
l'indice de la présence d'humidité ou de l'altération du réactif.
Dans ce cas, l'essai doit être répété.
5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse
5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne
5.4.1.1. Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant
l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de séparation et
l'extrémité de sortie au détecteur.
Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en
phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur,
efficacité du système de séparation et du système d'enregistrement,
etc.).
5.4.1.2. Si la colonne estut ilisée pour la première fois, il estconseillé de
procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au
travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie
en phase gazeuse etcommencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre
une température d'au moins 20º C supérieure à celle d'exercice (note 6).
Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis porter
le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux
gazeux et du fractionnement, allumage de la flamme, jonction avec
l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre
pour la colonne du détecteur et de l'initiateur, etc.) et enregistrer le
signal à une sensibilité d'au moins deux fois supérieure à celle prévue
pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit
être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas
présenter de dérive.
Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des
connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionne-
mentinsuffisantde la colonne.
Note 6: La température de conditionnement doit être toujours inférieure
d'au moins 20º C à la température maximale prévue pour le
liquide de répartition employé.
5.4.2. Choix des conditions opératoires
5.4.2.1. Les conditions opératoires maximales sont les suivantes:
— température de la colonne: 260º C ± 5º C,
— température de l'évaporateur: 280º C,
— température du détecteur: 290º C,
— vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par
seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,
—►
C1rapportde division ◄: de 1/50 à 1/100,1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 39
▼B
— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,
— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,
— vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,
— quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de
TMSE.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques
de la colonne etdu chromat ographe en phase gazeuse de façon à
obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:
— le temps de rétention du β-sitostérol doit être de 20 ± 5 minutes,
— le pic de campestérol doit être: pour l'huile d'olive (contenu moyen
3 %) 15 ± 5 % de l'échelle de fond, pour l'huile de soja (contenu
moyen 20 %) 80 ± 10 % de l'échelle de fond,
— il doit y avoir séparation de tous les stérols présents; il est néces-
saire que les autres pics séparés soient aussi complètement résolus,
ce qui veutdire que le t racé du pic doitrejoindre la ligne de base
avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toute-
fois tolérée à condition, cependant, qu'elle soit quantifiable selon la
perpendiculaire au pic à TRR 1,02.
5.4.3. Exécution de l'analyse5.4.3.1. Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane,
aspirer 0,5 microlit re d'air etsuccessivement0,5 et1 microlit re de la
solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon
à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la
membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter
rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes
environ.
5.4.3.2. Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des
stérols présents.
La ligne de base doit toujours correspondre aux qualités requises
(5.4.1.2).
5.4.4. Identification des pics
L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de
rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des stérols,
analysés dans les mêmes conditions.
Les stérols sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol,
24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, ∆7
campestérol, ∆ 5,23 stigmastadiénol, chlérostérol, β-sitostérol, sitos-
tanol, ∆5-avénastérol, 5,24 stigmastadiénol, ∆7-stigmasténol, ∆7-
avénastérol.
Dans le tableau 1 sont reportés les temps de rétention relatifs au sitos-
térol pour les colonnes SE 52 et SE 54.
Les figures 1 et 2 illustrent les chromatogrammes typiques de quelques
huiles.
5.4.5. Évaluation quantitative
5.4.5.1. Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l' α-choles-
tanol et des stérols. Ne pas considérer les pics éventuels de
compositions non comprises dans celles énumérées dans le tableau 1.
Le coefficientde réponse GLC de l' α-cholestanol s'entend égal à 1.
5.4.5.2. Calculer le contenu en chaque stérol simple, en milligrammes par 100
grammes de matière grasse, comme suit:
stérol x =A
x·ms· 100
As·m
où:
Ax= aire du pic du stérol x ►M6 ◄;
As= aire du pic d' α-cholestanol ►M6 ◄;
ms= poids d' α-cholestanol ajouté, en milligrammes;
m: = poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en
grammes.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 40
▼B
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
6.1. Rapporter les contenus de chaque stérol en milligrammes par 100
grammes de matière grasse et leur somme comme «stérols totaux».
6.2. On calcule le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre
l'aire du pic correspondantetla somme des aires des pics des st érols.
% du stérol x =Ax
ΣA× 100
Ax= aire du pic x.
ΣA = somme des aires de tous les pics.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 41
▼B
APPENDICE
Détermination de la vitesse linéaire du gaz
Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires
normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer
le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de
l'injection et celui de la sortie du pic (tM).
La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la
longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.
Tableau I
Temps de rétention relatifs des stérols
Pic IdentificationTemps de rétention
relatif
Colonne
SE 54Colonne
SE 52
1 cholestérol ∆-5-cholestène-3 β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5 α-cholestane 0,68 0,64
3 brassicastérol [24S]-24-méthyl- ∆-5,22-cholestadiène-3 β-
ol0,73 0,71
4 24-méthylène-cholestérol 24-méthylén- ∆-5,24-cholestadiène-3 β-ol 0,82 0,80
5 campestérol [24R]-24-méthyl- ∆-5-cholestène-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-méthyl-cholestane-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmastérol [24S]-24-éthyl- ∆-5,22-cholestadiène-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-campestérol [24R]-24-méthyl- ∆-7-cholestène-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadiénol [24S,R]-24-éthyl- ∆-5,23-cholestadiène-3 β-
ol0,95 0,95
10 chlérostérol [24S]-24-éthyl- ∆-5,25-
►C1cholestadiène ◄-3β-ol0,96 0,96
11 β-sitostérol [24R]-24-éthyl- ∆-5-cholestène-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-éthyl-cholestane-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avénastérol [24Z]-24-éthyliden-5-cholestène-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadiénol [24S,R]-24-éthyl- ∆-5,24-cholestadiène-3 β-
ol1,08 1,08
15 ∆-7-stigmasténol [24S,R]-24-éthyl- ►C1∆-7-cholestène ◄
-3β-ol1,12 1,12
16 ∆-7-avénestérol [24Z]-24-éthyliden- ∆-7-cholestène-3 β-ol 1,16 1,161991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 42
▼B
Figure 1
Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive
brute
1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 43
▼B
Figure 2
Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive
raffinée
1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 44
▼B
ANNEXE VI
DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ÉRYTHRODIOL ET EN
UVAOL
AVANT-PROPOS
L'érythrodiol (terme générique qui désigne conventionnellement
l'ensemble des diols érythrodiol et uvaol) est un élément constitutif de
l'insaponifiable que l'on trouve dans certains types de matières grasses.
Son dosage peut servir à vérifier la présence d'huile d'olive d'extraction,
sa concentration y étant nettement plus élevée que dans d'autres huiles
(huiles d'olive de pression, huiles de pépins de raisin).
1. OBJET
La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en érythrodiol
des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en
solution dans de l'éthanol. L'insaponifiable est ensuite extrait avec de
l'éther éthylique, purifié par passage sur une colonne d'alumine et frac-
tionné par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de
silice. Les bandes des fractions stérolique et érythrodiolique sont alors
isolées.
Les stérols et l'érythrodiol récupérés sur la plaque sont transformés en
triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse.
Le résultat est exprimé en pourcentage d'érythrodiol par rapport à
l'ensemble érythrodiol + stérols.
3. APPAREILLAGE
3.1. Appareillage décrit à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).
4. RÉACTIFS
4.1. Réactifs énumérés à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).4.2. Solution de référence d'érythrodiol à 0,5 % dans du chloroforme.
5. MODE OPÉRATOIRE5.1.Préparation de l'insaponifiable
Procéder comme indiqué au paragraphe 5.1.2 de l'annexe V.
5.2.Séparation de l'érythrodiol et des stérols
5.2.1. Voir paragraphe 5.2.1 de la méthode de l'annexe V.5.2.2. Voir paragraphe 5.2.2 de la même méthode.5.2.3. Préparer une solution d'insaponifiable (à 5 %) dans le chloroforme.
Avec la microseringue de 0,1 millilitre, déposer sur une plaque chromato-
graphique, à environ 1,5 centimètre du bord inférieur, 0,3 millilitre de la
solution susmentionnée, en une ligne la plus fine et la plus uniforme
possible. À une extrémité de la plaque, déposer, pour référence, quelques
microlitres des solutions de cholestérol et d'érythrodiol.
5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indi-
quée au paragraphe 5.2.1. La température ambiante doit être d'environ
20º C. Fermer aussitôt avec le couvercle et éluer jusqu'à ce que le niveau
du solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque.
Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et évaporer le
solvantdans un courantd'air chaud.
5.2.5. Vaporiser uniformémentla solut ion de dichloro-2 ′7′fluorescéine sur la
plaque. En examinant cette dernière à la lumière ultraviolette, identifier
les bandes de stérols et de l'érythrodiol par alignement avec les éléments
de référence, puis délimiter avec une pointe légèrement en dehors des
bords de la fluorescence.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 45
▼B
5.2.6. Avec une spatule métallique, racler le gel de silice compris dans les
zones délimitées. Introduire le matériau retiré de la plaque dans une fiole
de 50 millilitres. Ajouter 15 millilitres de chloroforme chaud, bien agiter
et filtrer dans l'ampoule à filtre poreux en transférant le gel de silice sur
le filtre même. Laver par trois fois au chloroforme chaud (environ 10
millilitres à chaque fois) et receuillir le filtrat dans un ballon de 100
millilitres. Évaporer jusqu'à obtention d'un volume de 4 à 5 millilitres,
transvaser, dans un tube centrifugeur à fond conique de 10 millilitres
préalablementpesé, port er à sec en chauffantlégèrementdans un courant
d'azote, et peser.
5.3.Préparation des triméthylsilyléthers
Procéder comme indiqué au paragraphe 5.3 de la méthode de l'annexe V.
5.4.Analyse par chromatographie en phase gazeuse
Procéder comme indiqué au paragraphe 5.4 de la même méthode.
L'analyse par chromatographie en phase gazeuse doit être réalisée dans
des conditions permettant le respect des exigences de l'analyse des stérols
et la séparation des TMSE de l'érythrodiol et de l'uvaol.
Après avoir injecté l'échantillon, laisser le papier se dérouler jusqu'à
élution complète des stérols présents, de l'érythrodiol et de l'uvaol. Iden-
tifier ensuite les pics (les temps de rétention relatifs de l'érythrodiol et de
l'uvaol, par rapportau β-sitostérol, sont respectivement de 1,4 et 1,55
environ).
Calculer ensuite les aires comme indiqué pour les stérols.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Pourcentage de l'Érythrodiol =A1+A2
A1+A2+ΣAstérols× 100
où:
A1: aire du pic de l'érythrodiol ►M6 ◄;
A2: aire du pic de l'uvaol ►M6 ◄;
ΣAstérols: somme des aires des stérols présents
►M6 ◄.
Indiquer le résultat avec une décimale.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 46
▼B
ANNEXE VII
DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS SATURÉS EN POSITION 2 DU
TRIGLYCÉRIDE
1. OBJET
La présente norme décrit une méthode de détermination de la composition
de la fraction des acides gras d'une huile ou d'une matière grasse estérifiée
dans la position 2 (ou position interne) du glycérol.
2. CHAMP D'APPLICATION
La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses dont le
point de fusion se situe en deça de 45º C, en raison des caractéristiques
de l'action de la lipase pancréatique.
Elle n'estpas applicable sans réserves aux huiles etmat ières grasses
contenant des quantités importantes d'acides gras comportant un nombre
d'atomes de carbone égal ou inférieur à douze (huile de coco et de
palmiste, matière grasse butyrique), des acides gras hautement insaturés
(comportant plus de quatre liaisons doubles) comportant un nombre
d'atomes de carbone égal ou supérieur à vingt (huiles de poisson et d'ani-
maux marins) ou des acides gras comprenantdes groupes oxygénés aut res
que le groupe acide.
3. PRINCIPE
Neutralisation éventuelle d'huiles et de matières grasses dans un solvant.
Purification par passage sur une colonne d'alumine. Hydrolyse partielledes triglycérides par la lipase pancréatique au cours d'un laps de temps
déterminé. Séparation des monoglycérides formés par chromatographie
en couche mince et méthanolyse de ces derniers. Analyse des esters
méthyliques par chromatographie en phase gazeuse/liquide.
4. APPAREILLAGE
4.1. Ballon de 100 millilitres.
4.2. Ballon de 25 millilitres avec embout rodé.
4.3. Réfrigérant à air d'une longuer d'un mètre, adaptable à la fiole visée au
point4.2.
4.4. Fiole conique de 250 millilitres.
4.5. Bécher de 50 millilitres.4.6. Ampoule à décanter de 500 millilitres.4.7. Colonne de verre pour chromatographie (diamètre intérieur: 13 millimè-
tres; longueur: 400 millimètres) munie d'un disque en verre fritté et d'un
robinet.
4.8.►
C1Tube à centrifuger ◄de 10 millilitres avec bouchon en verre rodé.
4.9. Burette de 5 millilitres avec graduations de 0,05 millilitre.4.10. Seringue hypodermique de 1 millilitre munie d'une aiguille fine.4.11. Microseringue pour gouttes de 3 à 4 microlitres.
4.12. Épandeuse pour chromatographie en couche mince.
4.13. Plaques de verre pour chromatographie en couche mince (20 × 20 centi-
mètres).
4.14. Cuve de développementen verre pour chromat ographie en couche mince,
avec couvercle en verre rodé, convenantpour les plaques de 20 × 20
centimètres.
4.15. Vaporisateur pour chromatographie en couche mince.4.16. Étuve réglée à 103 ± 2º C.4.17. Thermostat réglable entre 30 et 45º C, à 0,5º C près.
4.18. Évaporateur rotatif.
4.19. Agitateur électrique vibrant, permettant d'agiter vigoureusement le tube
centrifugeur.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 47
▼B
4.20. Lampe à rayons ultraviolets pour l'examen des plaques pour chromatogra-
phie en couche mince.
Pour le contrôle de l'activitéde la lipase:
4.21. pH-mètre4.22. Agitateur à spirale
4.23. Burette de 5 millilitres
4.24. Chronomètre.
Pour la préparation éventuelle de la lipase:
4.25. Agitateur de laboratoire convenant pour la dispersion et le mélange de
matières hétérogènes.
5. RÉACTIFS
5.1. n-hexane ou, à défaut, éther de pétrole, (b.e. 30-50º C), de qualité chroma-
tographique.
5.2. 2-propanol (ou éthanol), 95º C (V/V), qualité analytique.
5.3. 2-propanol (ou éthanol) en solution aqueuse 1/1.5.4. Éther diéthylique exempt de peroxydes.5.5. Acétone.
5.6. Acide formique à au moins 98 % (m/m).
5.7. Solvant de développement: mélange de n-hexane (5.1), d'éther diétylique
(5.4) etd'acide formique (5.6) selon les proport ions 70/30/1 (V/V/V).
5.8. Alumine activée pour chromatographie, neutre, de degré d'activité Brock-
mann I.
5.9. Poudre de silice, avec liant, de qualité adéquate pour la chromatographie
en couche mince.
5.10. Lipase pancréatique de qualité adéquate (notes 1 et 2).5.11.►
C1Hydroxyde ◄de sodium en solution aqueuse (120 grammes par
litre).
5.12. Acide chlorhydrique en solution aqueuse (6 N).5.13. Chlorure de calcium (CaC1 2) en solution aqueuse (220 grammes par
litre).
5.14. Cholate de sodium (qualité enzymatique) en solution aqueuse (1 gramme
par litre).
5.15. Solution tampon: solution aqueuse 1 M de tris-hydroxyméthylaminomé-
thane amené à un pH de 8 par addition d'acide chlorhydrique (5.12)
(contrôle au potentiomètre).
5.16. Phénolphtaléine en solution (10 grammes par litre) dans de l'éthanol à
95 % (V/V).
5.17. Dichloro-2 ′-7′-fluorescéine en solution (2 grammes par litre) dans de
l'éthanol à 95 % (V/V), légèrement alcalinisé par l'addition d'une goutte
de solution d'hydroxyde de sodium 1 N par 100 millilitres.
Pour le contrôle de l'activitéde la lipase:
5.18. Huile neutralisée5.19. Hydroxyde de sodium en solution aqueuse 0,1 N5.20. Cholate de sodium (qualité enzymatique) en solution aqueuse (200
grammes par litre)
5.21. Gomme arabique en solution aqueuse (100 grammes par litre).
6. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON
Si l'échantillon possède un taux d'acidité, déterminé selon l'annexe II,
inférieur à 3 %, purifier directement sur alumine comme indiqué au point
6.2.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 48
▼B
Si l'échantillon possède un taux d'acidité, déterminé selon l'annexe II, su-
périeur à 3 %, neutraliser par alcaline en présence d'un solvant, comme
indiqué au point6.1, puis passer sur alumine comme indiqué au point6.2.
6.1.Neutralisation par alcaline en présence d'un solvant
Dans une ampoule à décantation (4.6), introduire environ 10 grammes
d'huile brute et ajouter 100 millilitres d'hexane (5.1), 50 millilitres de 2-
propanol (5.2), quelques gouttes de solution de phénolphtaléine (5.16) et
une quantité de soution d'hydroxyde de sodium (5.11) correspondant à la
teneur en acides libres de l'huile, majorée de 0,3 %.
Agiter vigoureusement pendant une minute, ajouter 50 millilitres d'eau
distillée, agiter de nouveau et laisser reposer.
Après séparation, éliminer la couche inférieure de savon. Éliminer égale-
ment toutes les couches intermédiaires (mucilage, matières insolubles).
Laver la solution d'hexane et d'huile neutralisée avecplusieurs doses de25 à 30 millilitres de solution de 2-propanol (5.3) jusqu'à ce que la
couleur rose de la phénolphtaléine disparaisse.
Éliminer la majeure partie de l'hexane par distillation sous vide dans l'éva-
porateur rotatif (4.18) et sécher l'huile à 30-40º C (toujours sous vide) à
l'aide d'un courant d'azote pur, jusqu'à élimination de l'hexane.
6.2.Purification par passage sur alumine
Préparer une suspension de 15 grammes d'alumine activée (5.8) dans 50
millilitres d'hexane (5.1) et verser, tout en agitant, sur la colonne chroma-
tographique (4.7).
Procéder au tassement de l'alumine et laisser tomber le niveau du solvant
jusqu'à 1 ou 2 millimètres au dessus de l'absorbant. Verser soigneusement
sur la colonne une solution de 5 grammes d'huile dans 25 millilitres
d'hexane (5.1). Recueillir l'ensemble de l'effluentde la colonne dans un
ballon (4.1).
7. PRÉPARATION DES PLAQUES CHROMATOGRAPHIQUES
Nettoyer à fond les plaques de verre (4.13) avec de l'éthanol, de l'éther, du
pétrole et de l'acétone pour éliminer toute trace de matière grasse.
Dans une fiole conique (4.4), introduire 30 grammes de poudre de silice
(5.9). Ajouter 60 millilitres d'eau distillée. Boucher et agiter vigoureuse-
ment pendant une minute. Transférer immédiatement la suspension dans
l'épandeuse (4.12) etenduire les plaques propres d'une couche de 0,25
millimètre d'épaisseur.
Sécher les plaques pendant15 minut es à l'air, puis pendantune heure dans
l'étuve (4.16) à 103 ± 2º C.
Amener les plaques à température ambiante dans un dessicateur avant
l'emploi.
Des plaques préparées sontdisponibles dans le commerce.
8. MODE OPÉRATOIRE8.1.Hydrolyse par la lipase pancréatique
Peser environ 0,1 gramme de l'échantillon préparé dans le ►
C1tube à
centrifuger ◄(4.8). S'il s'agitd'une mat ière grasse solide, dissoudre
dans 0,2 millilitre d'hexane en chauffant légèrement, si nécessaire.
Ajouter 20 millilitres de lipase (5.10) et 2 millilitres de solution tampon
(5.15). Agiter convenablement mais prudemment puis ajouter 0,5 millilitrede solution de cholate de sodium (5.14) et 0,2 millilitre de solution de
chlorure de calcium (5.13). Fermer le tube avec le bouchon rodé, agiter
prudemment (éviter de mouiller le bouchon) et placer le tube immédiate-
ment dans le thermostat (4.17) maintenu à 40 ± 0,5º C. Agiter à la main
pendant exactement 1 minute. Retirer le tube du thermostat et agiter
vigoureusement à l'aide d'un agitateur électrique (4.19) pendant exacte-
ment 2 minutes. Refroidir immédiatement à l'eau courante; ajouter 1
millilitre d'acide chlorydrique (5.12) et 1 millilitre d'éther diéthylique
(5.4). Boucher et agiter vigoureusement à l'aide de l'agitateur électrique.
Laisser reposer etéliminer la couche organique à l'aide de la seringue
(4.10), si nécessaire après centrifugation.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 49
▼B
8.2.Séparation des monoglycérides par chromatographie en couche mince
Appliquer l'extrait sur la plaque chromatographique en une couche mince
et uniforme la plus étroite possible, à l'aide de la microseringue (4.11), à
environ 1,5 centimètre de l'extrémité inférieure. Introduire la plaque dans
la cuve de développementbien sat urée (4.14) etdévelopper à l'aide du
solvant (5.7) à environ 20º C, jusqu'à environ 1 centimètre de l'extrémité
supérieure de la plaque.
Sécher la plaque à l'air, à la température de la cuve, et y pulvériser la
solution de dichloro-2 ′-7′fluorescéine (5.17). Délimiter la bande des
monoglycérides (Rfd'environ 0,035) sous lumière ultraviolette (4.20).
8.3.Analyse des monoglycérides par chromatographie en phase gazeuse/
liquide
Récupérer la bande obtenue au point 8.2 à l'aide d'une spatule (en évitant
d'enlever les composants restés sur la ligne de base) et la recueillir dans le
récipient de méthylation (4.2).
Traiter directement la silice recueillie comme indiqué au point 4.1 de
l'annexe X «B», de manière à convertir les monoglycérides en esters
méthyliques, puis examiner les esters par chromatographie en phasegazeuse comme indiqué à l'annexe X «A».
9. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Déterminer la composition de la fraction des acides gras en position 2 en
exprimant le résultat avec une décimale (note 3).
10. NOTES
Note 1: Contrôle de l'activité de la lipase
Préparer une émulsion d'huile en agitant dans un agitateur
adéquat un mélange composé de 165 millilitres de solution de
gomme arabique (5.21) de 15 grammes de glace pilée etde 20
millilitres d'une huile neutralisée (5.18).
Dans un bécher (4.5), verser 10 millilitres de cette émulsion, puis
0,3 millilitre de solution de cholate de sodium (5.20) et 20 milli-
litres d'eau distillée. Placer le bécher dans un thermostat maintenu
à 37 ± 0,5 ºC (note 4). Introduire les électrodes d'un pH-mètre
(4.21) et un agitateur à spirale (4.22). À l'aide d'une burette
(4.23), ajouter la solution d'hydroxyde de sodium (5.19) goutte à
goutte jusqu'à ce que le pH atteigne 8,5.
Ajouter une quantité suffisante de suspension aqueuse de lipase
(voir ci-dessous). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3,
déclencher le chronomètre (4.24) et commencer à ajouter la solu-
tion d'hydroxyde de sodium (5.19) goutte à goutte à la vitesse
nécessaire pour maintenir constant le pH de 8,3. Notar à chaque
minute le volume de solution alcaline consommée.
Rapporter les observations sur un diagramme en indiquant en
abscisse les temps et en ordonnée les millilitres de solution alca-
line nécessaires pour maintenir le pH constant.
Le résultat obtenu être une ligne droite.la suspension de lipase susmentionnée est une suspension à 1
pour 1 000 (m/m) dans l'eau. Pour chaque essai, il convientd'en
utiliser une quantité suffisante pour que, environ 1 millilitre de
solution alcaline, soit consommé en 4 à 5 minutes.
Normalement, une quantité de poudre de 1 à 5 milligrammes est
nécessaire.
L'unité lipasique est définie comme la quantité d'enzymes que
libèrent 10 microéquivalents d'acide par minute. L'activité A de
la poudre utilisée, exprimée en unités lipasiques par milligramme,
estcalculée au moyen de la formule suivant e:
A¼
V/C210
m
V: le volume de solution d'hydroxyde de sodium (5.19)
consommé par minute (calculé à partir du graphique).
m: masse de la prise d'essai de poudre, en milligrammes.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 50
▼B
Note 2: Préparation de la lipase
Des lipases ayant un niveau d'activité satisfaisant sont disponibles
dans le commerce mais peuventégalementêt re préparées comme
suit.
Refroidir 5 kilogrammes de pancréas de porc frais à 0 ºC;
éliminer la graisse solide et le tissu conjonctif présents, puis
triturer dans un mélangeur jusqu'à obtention d'une pâte fluide.
Agiter cette masse dans l'agitateur (4.25) avec 2,5 litres d'acétone
anhydre pendant 4 à 6 heures, puis centrifuger. Procéder à trois
autres extractions sur le résidu avec le même volume d'acétone,
puis à deux extractions avec un mélange 1/1 (V/V) d'acétone et
d'éther diéthylique, et à deux extractions avec de l'éther diéthy-
lique.
Sécher le résidu sous vide pendant48 heures pour obt enir une
poudre stable, à conserver au réfrigérateur.
Note 3: Dans tous cas, il est conseillé de déterminer la composition des
acides gras totaux d'un même échantillon, puisque la comparaison
avec celle des acides en position 2 permettra d'enterpréter les
chiffres obtenus.
Note 4: La température d'hydrolyse est fixée à 37 ºC, puisqu'une huile
liquide est utilisée. Celle de l'échantillon est toutefois fixée à
40 ºC, pour qu'il soitpossible d'examiner les mat ières grasses
dont le point de fusion peut atteindre 45 ºC.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 51
▼M20
▼B
ANNEXE IX
ANALYSESPECTROPHOTOMÉTRIQUE
PRÉLIMINAIRES
L'examen spectrophotométrique dans l'ultraviolet peut fournir des indica-
tions sur la qualité d'une matière grasse, sur son état de conservation et
sur les modifications dues aux processus technologiques.
Les absorptions aux longueurs d'onde prévues dans la méthode sont dues à
la présence de systèmes dièniques et trièniques conjugués. Les valeurs de
ces absorptions sont exprimées comme extinction spécifique E1cm 1 %
(extinction d'une solution de matière grasse à 1 % dans le solvant prescrit,
pour une épaisseur de 1 % cm) noté de façon conditionnelle par K (dit
également coefficient d'extinction).
1. OBJET
La méthode décrit le procédé de l'exécution de l'examen spectrophotomé-
trique dans l'ultraviolet des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse étudiée est dissoute dans le solvant requis, puis on déter-
mine l'extinction de la solution à la longueur d'onde prescrite, par rapport
au solvant pur. On calcule les extinctions spécifiques à partir des lectures
spectrophotométriques.
3. APPAREILLAGE
3.1. Spectrophotomètre pour mesure des extinctions dans l'ultraviolet entre 220
et 360 nm, avec possibilité de lecture pour chaque unité nanométrique.
3.2.►C1Cuves de quartz ◄, avec couvercle, de parcours optique de 1 centi-
mètre. Les cuves, remplies d'eau ou d'un autre solvant idoine, ne doivent
pas présenter de différences supérieures à 0,01 unité d'extinction.
3.3. Fioles jaugées de 25 millilitres.
3.4. Colonne pour chromatographie ayant une partie supérieure de 270 mm de
long et 35 mm de diamètre ainsi qu'une partie inférieure de 270 mm de
long et10 mm de diamèt re.
4. RÉACTIFS
4.1. Isooctane (2,2,4-triméthylpentane) spectrophotométriquement pur: il doit
avoir, par rapport à l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 60 %
à 220 nm etnon inférieure à 95 % à 250 nm
ou bien
— cyclohexane spectrophotométriquement pur: il doit avoir, par rapport à
l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 40 % à 220 nm et non
inférieure à 95 % à 250 nm.
4.2. Alumine basique pour chromatographie sur colonne, préparée et contrôlée
comme décritdans l'appendice I.
4.3. n-Hexane pour chromatographie.
5. PROCÉDÉ
5.1. L'échantillon examiné doit être parfaitement homogène et exempt d'impu-
retés en suspension. Les huiles liquides à température ambiante sont
filtrées sur papier à une température d'environ 30º C, les graisses solides
sont homogénéisées et filtrées à une température non supérieure à 10º C
au-dessus de leur température de fusion.
5.2. Peser 0,25 gramme environ de l'échantillon ainsi préparé dans une fiole
jaugée de 25 millilitres, compléter avec le solvant prescrit et homogénéiser.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 52
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution
présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier.
5.3. Remplir une cuve avec la solution obtenue et mesurer les extinctions, en
employantcomme référence le solvantemployé, aux longueurs d'onde
comprises entre 232 et 276 nm.
Les valeurs d'extinction lues doivent être comprises dans l'intervalle de 0,1
à 0,8; dans le cas contraire, il est nécessaire de répéter les mesures en utili-
sant les solutions plus concentrées ou plus diluées appropriées.
5.4. Au cas ou serait requise la détermination des extinctions spécifiques après
passage sur alumine, on procède de la façon suivante: introduire dans la
colonne chromatographique 30 grammes d'alumine basique en suspension
dans l'hexane; éliminer l'excès d'hexane après tassement de l'absorbant, ou
au moins jusqu'à 1 centimètre environ au dessus du niveau supérieure de
l'alumine.
Dissoudre 10 grammes de matière grasse, homogénéisée et filtrée comme
décrit au point 5.1, dans 100 millilitres d'hexane et verser cette solution
dans la colonne. Recueillir l'éluantetévaporer le solvantsous vide età
une température inférieure à 25º C.
Procéder immédiatement sur la matière grasse obtenue comme décrit au
point5.2.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
6.1. Rapporter les extinctions spécifiques (coefficients d'extinction) aux diffé-
rentes longueurs d'onde, calculées comme suit:
Kλ¼Eλ
c/C1s
où:
Kλ: extinction spécifique à la longueur d'ondeλ;
Eλ: extinction mesurée à la longueur d'onde λ;
c: concentration de la solution en grammes par 100 millilitres;
s: épaisseur de la cuvette en centimètres
Les résultats sont exprimés avec deux décimales.
6.2. L'examen spectrophotométrique de l'huile d'olive selon la méthode offi-
cielle des règlements officiels de la Communauté économique européenne
prévoit la détermination de l'extinction spécifique, en solution dans l'isooc-
tane, aux longueurs d'onde de 232 et 270 nm et la détermination du ∆K
exprimé comme:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
où Kmest l'extinction spécifique à la longueur d'onde m, longueur d'onde
d'absorbance maximale aux environs de 270 nm.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 53
▼B
APPENDICE I
Préparation de l'alumine et contrôle de son activité
A.1.1. Préparation de l'alumine
Mettre dans un récipient, qui ferme hermétiquement, l'alumine au préa-
lable desséchée au four à 380-400º C pendant3 heures, ajout er de l'eau
distillée à raison de 5 millilitres pour 100 grammes d'alumine, fermer
rapidement le récipient, agiter à plusieurs reprises, puis laisser reposer
pendantau moins 12 heures avantemploi.
A.1.2. Contrôle de l'activité de l'alumine
Préparer une colonne chromatographique avec 30 grammes d'alumine.
Opérer comme décritau paragraphe 5.4. Faire passer à t ravers la colonne
un mélange constitué de:
— 95 % d'huile d'olive vierge, ayant une extinction spécifique à 268 nm
inférieure à 0,18,
— 5 % d'huile d'arachide traitée avec des terres décolorantes lors de son
raffinage, ayant une extinction spécifique à 268 nm supérieure ou
égale à 4.
Si le mélange après passage sur colonne présente une extinction spéci-
fique à 268 nm supérieure à 0,11, l'alumine estaccept able, sinon, il faut
augmenter le taux d'hydratation.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 54
▼B
APPENDICE II
Étalonnage du spectrophotomètre
A.2. L'appareillage doit être contrôlé périodiquement (au moins tout les six
mois), que ce soitpour la correspondance de la longueur d'onde ou
pour l'exactitude de la réponse.
A.2.1. Le contrôle de la réponse de la longueur d'onde peut être fait au moyen
d'une lampe à vapeur de mercure ou de filtres appropriés.
A.2.2. Pour le contrôle de la cellule photoélectrique et du photomultiplicateur,
procéder ainsi: peser 0,2 gramme de chromate de potassium pur pour
spectrophotométrie et dissoudre dans une solution d'hydroxyde de potas-
sium 0,05 N etcomplét er au volume dans une fiole jaugée de 1 000
millilitres. Prélever ensuite 25 millilitres exactement de la solution
obtenue, transférer dans une fiole jaugée de 500 millilitres et compléter
au volume avec la même solution d'hydroxyde de potassium.
Mesurer l'extinction à 275 nm de la solution ainsi obtenue, en se servant
de la solution d'hydroxyde de potassium comme référence. L'extinction
mesurée avec une cuve optique de 1 centimètre devra être de
0,200 ± 0,005.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 55
▼B
ANNEXE X «A»
ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES
ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDESGRAS
1. DOMAINE D'APPLICATION
La présente méthode donne des directives générales pour la détermina-
tion par chromatographie en phase gazeuse de la composition
qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides
gras obtenu selon la méthode visée à l'annexe X B.
La méthode n'est pas applicable aux acides gras polymérisés.
2. RÉACTIFS2.1.Gaz vecteur
Gaz inerte (azote, hélium, argon, hydrogène, etc.) soigneusement
desséché etcont enantmoins de 10 milligrammes par kilogramme
d'oxygène.
Note 1: L'hydrogène que l'on utilise comme gaz vecteur uniquement
avec les colonnes capillaires permetde doubler la vit esse d'ana-
lyse mais présente des dangers. Il existe cependant des
dispositifs de sécurité.
2.2.Gaz auxiliaires
2.2.1. Hydrogène (de pureté ≥99,9 %), ne contenant pas d'impuretés organi-
ques.
2.2.2. Air ou oxygène ne contenant pas d'impuretés organiques.
2.3.Produits d'étalonnage
Mélange d'esters méthyliques d'acides gras purs, ou esters méthyliques
d'un corps gras, de composition connue, si possible voisine de celle du
corps gras à analyser.
Prendre toutes précautions afin d'éviter l'oxydation des acides gras poly-
insaturés.
3. APPAREILLAGE
Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromato-
graphie en phase gazeuse utilisant des colonnes remplies et/ou
capillaires et un détecteur à ionisation de flamme. Tout appareillage
ayant la même efficacité et la même résolution que celles définies au
point5.1.2 convient .
3.1.Appareil de chromatographie en phase gazeuse
L'appareil de chromatographie en phase gazeuse doit comprendre les
éléments suivants.
3.1.1. Dispositif d'injection
Utiliser un dispositif d'injection:
a) soitavec des colonnes remplies, le disposit if ayantle plus faible
volume mort possible (dans ce cas, il doit pouvoir être porté à une
température supérieure, de 20º C à 50º C, à celle de la colonne);
b) soit avec des colonnes capillaires, auquel cas le dispositif doit être
spécialement conçu pour l'utilisation de telles colonnes. Il peut être
du type diviseur ou du type à injection totale en tête de colonne
refroidie (injecteur «non column»).
Note 2: En l'absence de corps gras contenant des acides gras à moins
de 16 atomes de carbone, un injecteur à aiguille mobile peut
être utilisé.
3.1.2. Four
Le four doit être en mesure de porter la colonne à une température d'au
moins 260º C et de maintenir la température choisie à 1º C près avec
une colonne remplie et à 0,1º C près avec une colonne capillaire. Cette1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 56
▼B
dernière caractéristique est particulièrement importante lorsqu'on utilise
un tube en silice fondue.
L'utilisation d'un appareil équipé d'un programmateur de température
est recommandée dans tous les cas et, en particulier, en présence
d'acides gras à moins de 16 atomes de carbone.
3.1.3. Col onne remplie
3.1.3.1. Colonne, en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser: verre ou, à
défaut, acier inoxydable, ayant les dimensions suivantes:
a) longueur: de 1 à 3 mètres. Une colonne relativement courte sera
utilisée dans le cas où des acides gras à longue chaîne (> C20) sont
présents. Dans le cas de la détermination des acides en C4eten C6,
il estrecommandé d'ut iliser une colonne de 2 m;
b) diamètre intérieur: de 2 à 4 millimètres.
Note 3: Si des constituants polyinsaturés à plus de trois doubles liaisons
sontprésent s, une colonne en acier inoxydable peutprovoquer
leur décomposition.
Note 4: Un système à double colonne remplie peut être utilisé.
3.1.3.2. Remplissage, comprenant les éléments suivants:
a) support: terre de diatomées lavée aux acides et silanisée, ou tout
autre support inerte pouvant convenir, avec un étroit intervalle de
granulométrie (25 micromètres entre 125 et 200 micromètres), la
dimension moyenne étant liée au diamètre intérieur et à la longueur
de la colonne;
b) phase stationnaire: phase polaire de type polyester (par exemple
polysuccinate de diéthylèneglycol, polysuccinate de butanediol,
polyadipate d'éthylèneglycol, etc.), cyanosilicones ou toute autre
phase permettant la séparation chromatographique (voir article 5).
Le taux d'imprégnation sera compris entre 5 % (m/m) et 20 % (m/
m). Pour certaines séparations, des phases apolaires pourront être
utilisées.
3.1.3.3. Conditionnement de la colonne
Après avoir déconnecté la colonne du côté du détecteur, porter progres-
sivement le four à 185º C et maintenir la colonne venant d'être préparée
sous un courant de gaz inerte de 20 à 60 millilitres par minute durant au
moins 16 heures à cette température, puis durant 2 heures à 195º C.
3.1.4. Col onne capillaire
3.1.4.1. Tube en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser, généralement en
verre ou en silice fondue. Le diamètre interne doit être compris entre
0,2 et 0,8 millimètre. Intérieurement, il devra subir des traitements
appropriés (préparation de l'état de surface, inactivation) avant de rece-
voir le film de phase stationnaire. Une longueur de 25 mètres estsuffisante dans la plupart des cas.
3.1.4.2. Phase stationnaire, principalement de type polyglycols [poly(éthylène
glycol) 20 000], polyesters (polysuccinate de butanediol) ou polysilo-
xanes polaires (cyanosilicones). Les colonnes greffées, ou réticulées,
conviennent.
Note 5: Toutefois les polysiloxanes polaires risquent de donner des
difficultés dans l'identification et la séparation de l'acide linolé-
nique etdes acides en C
20.
Les épaisseurs de film doivent être faibles: 0,1 à 0,2 micromètre.
3.1.4.3. Montage et conditionnement de la colonne
Respecter les précautions habituelles de montage des colonnes capil-
laires, c'est-à-dire la disposition de la colonne dans le four (support),
le choix et le montage des joints (étanchéité), le positionnement des
extrémités de la colonne dans l'injecteur et le détecteur (réduction des
volumes morts). Mettre la colonne sous gaz vecteur [par exemple,
0,3 bar (30 kPa) pour une colonne de 25 mètres de longueur et d'un
diamètre intérieur de 0,3 millimètre].
Conditionner la colonne par programmation de la température du four à
3º C par minute depuis la température ambiante jusqu'à une température
inférieure à 10º C à la limite de décomposition de la phase stationnaire.
Maintenir à cette température 1 heure, jusqu'à stabilisation de la ligne
de base. Revenir à 180º C pour travailler dans des conditions
isothermes.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 57
▼B
Note 6: Des colonnes préconditionnées adéquates sont disponibles
commercialement.
3.1.5. Détecteur, de préférence capable d'être porté à une température supé-
rieure à celle de la colonne.
3.2.Seringue
La seringue doitavoir une capacit é de 10 ►C1microlitres au
maximum et être graduée en 0,1 microlitres ◄.
3.3.Enregistreur
Lorsque la courbe enregistrée est utilisée pour calculer la composition
du mélange analysé, l'enregistreur doit être un appareil électronique de
grande précision, compatible avec l'appareillage utilisé, et ayant les
caractéristiques suivantes:
a) vitesse de réponse inférieure à 1,5 seconde, de préférence 1 seconde
(la vitesse de réponse est le temps nécessaire pour que la plume de
l'enregistreur aille de 0 à 90 % lors de l'introduction soudaine d'un
signal de 100 %);
b) largeur du papier, 20 centimètres au minimum;
c) vitesse de déroulement du papier, réglable à des valeurs comprises
entre 0,4 et 2,5 centimètres par minute.
3.4.Intégrateur ou calculateur (facultatif)
L'emploi d'un intégrateur électronique ou d'un calculateur permet un
calcul rapide etprécis. Celui-ci doitfournir une réponse linéaire, avoir
une sensibilité suffisante, et la correction de la déviation de la ligne de
base doit être satisfaisante.
4. MODE OPÉRATOIRE
Les détails opératoires donnés en 4.1 à 4.3 concernent l'emploi d'un
détecteur à ionisation de flamme.
En variante, un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un
détecteur à conductibilité thermique (catharomètre) peut être utilisé. Les
conditions opératoires doivent alors être modifiées comme décrit à
l'article 6.
4.1.Conditions d'essai
4.1.1. Choix des conditions optimales de travail
4.1.1.1. Sur colonne remplie
Pour choisir les conditions de travail, il y a lieu de tenir compte des
variables suivantes:
a) la longueur etle diamèt re de la colonne;
b) la nature et la quantité de la phase stationnaire;
c) la température de la colonne;
d) le débitdu gaz vect eur;
e) la résolution souhaitée;
f) l'importance de la prise d'essai, choisie de façon telle que l'ensemble
détecteur-électromètre fournisse une réponse linéaire;
g) la durée de l'analyse.
En général, les valeurs données dans le tableau 1 et le tableau 2 seront
celles donnant les résultats désirés, à savoir un nombre de plateaux
théoriques, au moins égal à 2 000 par mètre de colonne pour le stéarate
de méthyle, et élution de celui-ci en 15 minutes environ.
Lorsque l'appareil le permet, l'injecteur devrait être à une température
voisine de 200º C, et le détecteur à une température égale ou supérieure
à celle de la colonne.
En général, le rapport du débit d'hydrogène du détecteur à ionisation de
flamme à celui du gaz vecteur, varie de 1:2 à 1:1, selon le diamètre de
la colonne. Le débitd'oxygène estd'environ 5 à 10 fois celui de
l'hydrogène.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 58
▼B
Tableau 1
Diamètre intérieur de la colonne (en
mm)Vitesse du gaz vecteur (en ml/min)
21 5 à 2 5
32 0 à 4 0
44 0 à 6 0
Tableau 2
Concentration de la phase stationnaire
[en % (m/m)]Température de la colonne
(en ºC)
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Sur colonne capillaire
Les caractéristiques d'efficacité et de perméabilité des colonnes capil-
laires font que la séparation entre constituants et la durée de l'analyse
sont très dépendantes du débit de gaz vecteur dans la colonne. Il y
aura nécessité, en jouant sur ce paramètre (ou plus simplement sur la
perte de charge en tête de colonne), d'optimiser les conditions opéra-
toires selon que l'on recherche, soit à améliorer les séparations, soit à
faire de l'analyse rapide.
4.1.2. Détermination du nombre de plateaux théoriques (efficacité) et de la
résolution
(Voir figure 1)
Effectuer l'analyse d'un mélange de stéarate et d'oléate de méthyle en
proportions sensiblement équivalentes (par exemple, esters méthyliques
de beurre de cacao).
Choisir l'importance de la prise d'essai, la température de la colonne et
le débit du gaz vecteur, de façon que le maximum du pic du stéarate de
méthyle soit enregistré environ 15 minutes après le pic du solvant, et
que ce pic corresponde à environ les trois quarts de l'échelle totale.
Calculer le nombre de plateaux théoriques, n, à l'aide de la formule
n¼16dr1
W1/C20/C21
2
etla résolut ion R, par la formule
R¼2∆
W1þW2
où:
dr(I): distance de rétention, en millimètres, mesurée à partir du
débutdu chromat ogramme jusqu'au maximum du pic du
stéarate de méthyle;
w(I)etw(II): largeurs, en millimètres, des pics du stéarate et de
l'oléate de méthyle, mesurées entre les points d'intersec-
tion avec la ligne de base des tangentes aux points
d'inflexion de la courbe;
∆: distance, en millimètres, entre les maxima relatifs des
pics du stéarate et de l'oléate de méthyle;
etl'indice de résolut ion Ir, par la formule1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 59
▼M2
▼M2
a
b
où:
a = la hauteur du pic le plus petit, mesurée par rapport à la ligne de
base,
b = la hauteur du point le plus bas du val compris entre les deux pics
adjacents, mesurée par rapport à la ligne de base.
Figure 1
Chromatogramme pour la détermination du nombre de plateaux théoriques (effi-
cacité) et de la résolution.
Les conditions opératoires sont celles donnant un nombre de plateauxthéoriques pour le stéarate de méthyle, au moins égal à 2 000 par mètre
de colonne, etune résolut ion d'au moins 1.25.
4.2.Prise d'essai
À l'aide de la seringue (4.2), prélever de 0,1 à 2 microlitres de la solu-
tion d'esters méthyliques obtenue selon la méthode visée à l'annexe X
«B» etles inject er dans la colonne.
Dans le cas des esters exempts de solvants, préparer une solution à 100
milligrammes par millilitre environ dans de l'heptane pour chromatogra-
phie en phase gazeuse et injecter 0,1 à 1 microlitre de cette solution.
Pour la recherche de constituants présents à l'état de traces, cette prise
d'essai pourra être augmentée (jusqu'à dix fois).
4.3.Analyse
Dans les cas usuels, opérer dans les conditions décrites en 5.1.1.
Toutefois, il est possible d'opérer avec une température de colonne plus
basse, dans le cas où il estnécessaire de doser des acides gras dontle
nombre d'atomes de carbone est inférieur à 12, ou plus élevée, dans le1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 60
▼B
▼B
cas où il estnécessaire de doser des acides gras dontle nombre
d'atomes de carbone est supérieur à 20.
Éventuellement, il est possible d'opérer en température programmée
dans les deux cas. Par exemple, si l'échantillon contient des esters
méthyliques d'acides gras à moins de 12 atomes de carbone, injecter
l'échantillon à 100º C (ou à 50-60º C si l'acide butyrique est présent)
et programmer immédiatement à un débit de 4 à 8º C par minute
jusqu'à la température optimale. Dans certains cas les deux procédés
peuventêt re combinés.
Après la période de programmation de température, continuer l'élution
en température isotherme jusqu'à élution de tous les constituants. Si
l'appareil ne peut pas travailler en température programmée, opérer à
deux températures fixées entre 100 et 195º C.
Si nécessaire, il estrecommandé de faire une analyse sur deux phases
fixes de polarités différentes pour vérifier l'absence de pics masqués,
par exemple dans le cas de la présence simultanée de C18:3etC20:0ou
de C18:3etC18:2conjugués.
4.4.Préparation du chromatogramme de référence et des courbes de
référence
Analyser le mélange témoin (voir point 2.3), dans les conditions opéra-
toires identiques à celles de l'essai, et déterminer les temps de rétention
ou les distances de rétention pour les acides gras constitutifs. Tracer sur
papier semi-logarithmique pour chaque taux d'insaturation, les courbes
donnant le logarithme du temps de rétention ou de la distance de réten-
tion en fonction du nombre d'atomes de carbone; dans des conditions
isothermes et pour des esters à chaîne droite et un taux d'insaturation
fixé, ces courbes doivent être des droites. Ces droites doivent être prati-
quementparallèles.
Éviter les conditions opératoires favorisant l'existence de «pics
masqués», c'est-à-dire que deux constituants ne puissent être distingués
par suite d'une résolution insuffisante.
5. EXPRESSION DES RÉSULTATS5.1.Analyse qualitative
Pour l'essai, identifier les pics du méthyl ester en se reportant aux
courbes préparées au point 4.4 au besoin en interpolant.
5.2.Analyse quantitative
5.2.1. Détermination de la composition
Utiliser la méthode de normalisation interne (sauf exceptions), c'est-à-
dire admettre que la totalité des constituants présents dans l'échantillon
est représentée sur le chromatogramme, donc que la somme des aires
des pics représente 100 % des constituants (élution totale).
Si l'appareillage comporte un intégrateur, utiliser les chiffres fournis par
celui-ci. Dans le cas contraire, déterminer l'aire de chaque pic en multi-
pliant la hauteur du pic par sa largeur à mi-hauteur, en tenant compte
des diverses atténuations éventuellement utilisées au cours de l'enregis-
trement.
5.2.2. Mode de calcul
5.2.2.1. Cas général
Calculer la teneur en un constituant donné, exprimée en pourcentage en
masse, des esters méthyliques, en déterminant le pourcentage représenté
par le rapportde l'aire du pic correspondantà la somme des aires de la
totalité des pics, à l'aide de la formule:
Ai
ΣA/C2100
où:
Ai: aire du pic correspondantau composé i;
ΣA: somme des aires de la totalité des pics.
Donner le résultat avec une décimale.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 61
▼B
Note 7: Dans ce cas général, le résultat du calcul basé sur les aires rela-
tives est considéré représenter un pourcentage en masse. Dans
le cas où cette hypothèse n'est pas permise, voir le point
5.2.2.2.
5.2.2.2. Cas de l'emploi des facteurs de correction
Dans certains cas, par exemple en présence d'acides gras dont le
nombre d'atomes de carbone est inférieur à 8 ou d'acides à fonctions
secondaires, lors de l'emploi de détecteurs à conductivité thermique,
ou si le plus grand degré de précision estspécialementdemandé, il y a
lieu de faire intervenir des facteurs de correction pour convertir les
pourcentages des aires des pics en pourcentages en masse des consti-
tuants.
Déterminer les facteurs de correction à l'aide d'un chromatogramme
obtenu à partir d'un mélange témoin d'esters méthyliques de composi-
tion exactement connue dans des conditions identiques à celles de
l'essai.
Pour ce mélange témoin, le pourcentage en masse du composé i est
donné par la formule:
mi
Σm/C2100
où:
mi: masse du composé i dans le mélange témoin.
Σm: somme des masses des divers constituants du mélange témoin.
À partir du chromatogramme du mélange témoin (4.4), calculer le pour-
centage (aire/aire) du composé i comme suit:
Ai
ΣA/C2100
où:
Ai: aire du pic correspondantau composé i;
ΣA: somme des aires de la totalité des pics.
D'où, le facteur de correction:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Habituellement, les facteurs de correction sont exprimés par rapport à
KC16et les facteurs relatifs deviennent:
K0
i¼Ki
KC16
Pour l'échantillon, la teneur en chaque composé i, exprimée en pourcen-
tage en masse des esters méthyliques, est:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Donner le résultat avec une décimale.
5.2.2.3. Cas de l'emploi d'un étalon interne
Dans certaines analyses (par exemple, lorsque tous les acides gras ne
sontpas quant ifiés, etque des acides en C4eten C6sontprésent s à
côté d'acides en C16eten C18, ou bien lorsqu'il estnécessaire de dét er-
miner la quantité absolue d'acides gras dans un échantillon), il est
nécessaire d'utiliser un étalon interne. Des acides gras en C5,C15ou
C17sont utilisés fréquemment. Le facteur de correction de l'étalon
interne doit être déterminé (s'il y a lieu).1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 62
▼B
Le pourcentage en masse du composé i, exprimé en esters méthyliques,
estpar suit e donné par la formule:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
où:
Ai: surface du pic correspondant au constituant i;
As: surface du pic correspondant à l'étalon interne;
K′i: facteur de correction du compose i (relatif à KC16);
K′s: facteur de correction de l'étalon interne (relatif à KC16);
m: masse, en milligrammes, de l'échantillon;
ms: masse, en milligrammes, de l'étalon interne.
Donner le résultat avec une décimale.
6. CAS PARTICULIER DE LA DÉTERMINATION DES ISOMÈRES
«TRANS»
Il est possible de déterminer le contenu des isomères «trans» des acides
gras avec un nombre d'atomes de carbone compris entre 10 et 24, par
séparation des esters méthyliques, en utilisant des colonnes chromato-
graphiques capillaires présentant une polarité particulière.
6.1. Colonne capillaire en silice d'un diamètre interne de 0,25 à 0,32 milli-
mètre et d'une longueur de 50 mètres, recouverte de
cyanopropysilicone, l'épaisseur du film étant comprise entre 0,1 et 0,3
micromètre (type SP 2340, type SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 et types
similaires).
6.2. Les esters méthyliques sont préparés selon le procédé B présenté dans
l'autre annexe (X/B). Les substances grasses ayant une acidité libre su-
périeure à 3 % doivent être préalablement neutralisées conformément
au point6.1 de l'annexe VII.
6.3. Les conditions de travail pour la chromatographie en phase gazeuse
sontdans l'ensemble les suivant es:
— température de la colonne programmée de 150 ºC à 230 ºC (par
exemple 165 ºC pendant 15 minutes puis augmentation de 5 ºC par
minute jusqu'à 200 ºC),
— température de l'injecteur: 250 ºC si on utilise le système d'injecteur
diviseur ou la température initiale de la colonne si on emploie le
système on column,
— température du détecteur: 260 ºC,
— débit du gaz vecteur (hélium et hydrogène): 1,2 millilitre par
minute.
La quantité injectée doit être telle que dans les conditions de sensibilité
employées la hauteur du pic correspondant à l'ester méthylique de
l'acide arachidique soitégale ou supérieure à 20 % du bas de l'échelle.
6.4. L'identification des divers esters méthyliques s'effectue sur la base des
temps de rétention qui sont comparés à ceux de mélanges de référence.
(Comme indiqué au point2.3).
Les esters des acides gras «trans» sont élués avant les isomères corres-
pondants «cis». Un exemple de chromatogramme est présenté dans la
figure 2.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 63
▼M2
▼M2
Figure 2
Chromatographie type en phase gazeuse relative à la détermination des
isomères trans des acides gras avec colonne capillaire
6.5. L'efficacité de la colonne déterminée selon le point 4.1.2 doit permettre
une séparation de certains couples critiques, par exemple le couple
formé par le massif des acides transoléiques et le pic de l'acide oléique,
trans C 18: 1/ «cis» C 18: 1, avec un indice de résolution supérieur à 2.
6.6. Le pourcentage des divers acides gras «trans» est calculé sur la base du
rapportent re la surface du pic y afférentetla somme des surfaces de
tous les pics présents.
Sont pris en considération les pourcentages des acides:
— «trans» octadécénoïques (T 18: 1), indiqués à l'annexe I du présent
règlementcomme somme des isomères t ransoléiques,
— «cis-trans» et «trans-cis» octadécadiénoïques [(CT/TC) 18: 2] indi-
qués à l'annexe I du présentrèglementcomme somme des isomères
translinoléiques,
— «trans-cis-trans», «cis-cis-trans», «cis-trans-cis», «trans-cis-cis»,
octadécatriénoïques [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], indiqués
à l'annexe I du présentrèglementcomme somme des isomères
translinoléniques.
Note 8: Compte tenu des caractéristiques particulières de cette
méthode, donner les résultats avec deux décimales.
►M27.◄CAS PARTICULIER DE L'UTILISATION D'UN DÉTECTEUR
À CONDUCTIBILITÉ THERMIQUE (CATHAROMÈTRE)
Un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à
conductibilité thermique (catharomètre), peut être utilisé également
pour la détermination de la composition qualitative et quantitative d'un
mélange d'esters méthyliques d'acides gras. Dans ce cas, les conditions
spécifiées aux points 3 et 4, doivent être modifiées comme indiqué dans
le tableau 3.
Pour l'analyse quantitative, utiliser les facteurs de correction définis en
5.2.2.2.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 64
▼B
▼B
Tableau 3
Variable Valeur/condition
Colonne Longueur: 2 à 4 m
diamètre intérieur: 4 mm
Support Granulométrie entre 160 et
200 µm
Taux d'imprégnation de la phase
stationnaire15 à 25 % (m/m)
Gaz vecteur Hélium, ou à défaut hydrogène, à
teneur aussi faible que possible en
oxygène
Gaz auxiliaires Néant
Température de l'injecteur De 40 à 60 ºC supérieure à celle
de la colonne
Température de la colonne 180 à 200 ºC
Débit du gaz vecteur Généralement compris entre 60 et
80 ml/min
Quantités injectées Généralement comprises entre 0,5
et2 µl
►M28.◄RAPPORT D'ESSAI
Le rapport d'essai doit indiquer les méthodes utilisées pour la prépara-
tion des esters méthyliques et pour l'analyse par chromatographie en
phase gazeuse, ainsi que les résultats obtenus. Il doit, en outre,
mentionner tous les détails opératoires non prévus dans la présente
norme internationale, ou facultatifs, ainsi que les incidents éventuels
susceptibles d'avoir agi sur les résultats.
Le rapport d'essai doit donner tous les renseignements nécessaires à
l'identification complète de l'échantillon.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 65
▼M19
ANNEXE X «B»
PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS DE
L'HUILE D'OLIVE ET DE L'HUILE DE GRIGNONS D'OLIVE
Les deux méthodes suivantes sont recommandées pour la préparation des esters
méthyliques d'acides gras des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive.
Méthode A: Transestérification à froid au moyen d'une solution méthanolique
d'hydroxyde de potassium.
Méthode B: Méthylation à chaud au moyen d'une solution méthanolique de
méthylate de sodium suivie d'une estérification en milieu acide.
Le choix entre l'une ou l'autre méthode dépendra du paramètre analytique à
déterminer et de la catégorie de l'huile, comme indiqué ci-après:
a) détermination de la différence entre la teneur réelle et la teneur théorique des
triglycérides à ECN42 ( ∆ECN42):
— la méthode A sera appliquée aux échantillons des huiles de toutes les
catégories après purification de l'huile par passage sur une colonne de
gel de silice.
b) détermination de la composition en acides gras:
— la méthode A sera appliquée directement aux échantillons d'huiles des
catégories suivantes:
— huiles d'olive vierges avec une acidité libre inférieure à 3,3 %,
— huile d'olive raffinée,— huile d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges etd'huile d'olive
raffinée),
— huile de grignons d'olive raffinée,— huile de grignons d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges etd'huile
de grignons d'olive raffinée),
— la méthode B sera appliquée directement aux échantillons d'huiles des
catégories suivantes:
— huile d'olive vierge avec une acidité libre supérieure à 3,3 %,
— huile de grignons d'olive brute;
c) détermination des acides gras des isomères trans
— la méthode A sera appliquée directement aux échantillons d'huiles des
catégories suivantes:
— huiles d'olive vierges avec une acidité libre inférieure à 3,3 %,
— huile d'olive raffinée,— huile d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges etd'huile d'olive
raffinée),
— huile de grignons d'olive raffinée,— huile de grignons d'olive (coupage d'huiles d'olive vierges etd'huile
de grignons d'olive raffinée),
— la méthode A sera appliquée aux échantillons d'huiles des catégories
suivantes après purification de l'huile par passage sur une colonne de
gel de silice:
— Huile d'olive vierge avec une acidité libre supérieure à 3,3 %.
— Huile de grignons d'olive brute.
PURIFICATION DES ÉCHANTILLONS D'HUILE
Si nécessaire, les échantillons seront purifiés par passage de l'huile sur une
colonne de gel de silice, en utilisant comme solvant d'élution de l'hexane/oxyde
diéthylique (87:13, v/v) comme décrit dans la méthode IUPAC 2.507.
Comme procédure alternative, il est possible d'avoir recours à l'extraction en
phase solide en utilisant des cartouches de gel de silice. Placer une cartouche
de gel de silice (1 g, 6 ml) dans un appareil d'élution à vide et laver avec 6 ml
d'hexane. Cesser d'appliquer le vide pour éviter que la colonne ne sèche. Intro-
duire ensuite dans la colonne une solution d'huile (environ 0,12 g) dans 0,5 ml
d'hexane et appliquer le vide pour que la solution s'introduise dans la silice, puis
éluer avec 10 ml d'hexane/oxyde diéthylique (87:13 v/v) sous vide. Homogé-
néiser la totalité des éluats et diviser en deux volumes similaires. Faire
évaporer un des volumes jusqu'à dessiccation dans un évaporateur rotatif sous
pression réduite et à température ambiante. Dissoudre le résidu dans 1 ml d'hep-
tane. La solution obtenue est prête pour l'analyse des acides gras par CPG. Faire
évaporer le second volume etdissoudre le résidu dans 1 ml d'acét one pour l'ana-
lyse des triglycérides par HPCL si nécessaire.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 66
▼M19
MÉTHODES POUR LA PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES
D'ACIDES GRAS
1.Méthode A: Transestérification à froid au moyen d'une solution
méthanolique d'hydroxyde de potassium
1.1.Application
Cette méthode rapide est applicable aux huiles d'olive et aux huiles de
grignons d'olive ayantune t eneur en acides gras libres inférieure à
3,3 %. Les acides gras libres ne sontpas est érifiés par l'hydroxyde de
potassium. Les esters éthyliques d'acides gras se transestérifient plus
lentement que les esters glycéridiques et il est possible qu'ils ne se
méthylent que partiellement.
1.2.Principe
Les esters méthyliques se forment par transestérification dans une solu-
tion méthanolique d'hydroxyde de potassium comme phase
intermédiaire avant la saponification (point 5 de la méthode ISO
5509:2000, point5 de la mét hode IUPAC 2.301).
1.3.Réactifs
Méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eauHeptane pour chromatographie
Hydroxyde de potassium, solution méthanolique d'environ 2 N:
dissoudre 11,2 g d'hydroxyde de potassium dans 100 ml de méthanol.
1.4.Matériel
Éprouvettes à bouchon vissant (de 5 ml de capacité) avec un bouchon
muni d'un jointde PTFE.
Pipettes graduées ou automatiques de 2 ml et 0,2 ml.
1.5.Mode opératoire
Dans une éprouvette à bouchon vissant de 5 ml, peser environ 0,1 g de
l'échantillon d'huile. Ajouter 2 ml d'heptane et agiter. Ajouter 0,2 ml de
la solution méthanolique 2 N d'hydroxyde de potassium, boucher à
l'aide du bouchon muni d'un jointen PTFE, bien fermer etagit er éner-
giquementpendant30 secondes. Laisser reposer jusqu'à ce que la part ie
supérieure de la solution devienne claire. Décanter la couche supé-rieure, qui est celle qui contient les esters méthyliques. La solution
d'heptane est prête pour l'injection dans le chromatographe. Il est
conseillé de maintenir la solution au réfrigérateur jusqu'au moment de
l'analyse chromatographique. Il n'est pas recommandé de stocker la
solution pendant plus de 12 heures.
2.Méthode B: Méthylation à chaud au moyen d'une solution méthano-
lique de méthylate de sodium suivie d'une estérification en milieu
acide
2.1.Application
Cette méthode est applicable aux huiles d'olive et aux huiles de
grignons d'olive ayantune t eneur en acides gras libres supérieure à
3,3 %.
2.2.Principe
Neutralisation des acides gras libres et méthanolyse alcaline des glycé-
rides, suivie d'une estérification des acides gras en milieu acide (point
4.2 de la méthode IUPAC n
o2.301).
2.3.Réactifs
— Heptane pour chromatographie.
— Méthanol ne contenant pas plus de 0,05 % d'eau (m/m).— Méthylate de sodium, solution méthanolique 0,2 N: dissoudre 5 g de
sodium dans 1 000 ml de méthanol (peut être préparé à partir de
solutions commerciales).
— Phénolphtaléine, 0,2 % solution méthanolique.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 67
▼M19
— Acide sulfurique, dans la solution méthanolique 1 N: ajouter 3 ml
d'acide sulfurique à 96 % à 100 ml de méthanol.
— Solution saturée de chlorure de sodium dans l'eau.
2.4.Matériel
— Ballon volumétrique de 50 ml de capacité, à fond plat et à col rodé
long etét roit
— Réfrigérantà reflux. Réfrigérantà air (de 1 m de long) muni d'un
jointrodé
— Régularisateur d'ébullition
— Entonnoir en verre.
2.5.Mode opératoire
Verser 0,25 g de l'échantillon d'huile dans un ballon volumétrique muni
d'un col rodé de 50 ml. À l'aide de l'entonnoir, ajouter 10 ml de la solu-
tion méthanolique 0,2 N de méthylate de sodium et le régularisateur
d'ébullition. Adapter le réfrigérant à reflux, agiter et porter à ébullition.
La solution doit devenir limpide au bout d'environ 10 minutes. La réac-
tion est pratiquement terminée après 15 minutes. Retirer le ballon de lasource de chaleur, attendre l'arrêt du reflux, retirer le réfrigérant et
ajouter deux gouttes de la solution de phénolphtaléine. Ajouter quelques
ml d'acide sulfurique 1 N dans la solution méthanolique jusqu'à ce
qu'elle devienne incolore, puis ajouter encore 1 ml en excès. Brancher
le réfrigérant et porter de nouveau à ébullition pendant environ 20
minutes. Retirer le ballon de la source de chaleur et le refroidir sous
un courant d'eau. Retirer le réfrigérant, ajouter 20 ml de la solution
saturée de chlorure de sodium et agiter. Ajouter 5 ml d'heptane, boucher
le ballon etagit er énergiquementpendant15 secondes.
Laisser décanter jusqu'à séparation complète des deux phases. Ajouter
de nouveau une partie de la solution saturée de chlorure de sodium
jusqu'à ce que la phase aqueuse atteigne la partie inférieure du col du
ballon. La couche supérieure qui se trouve dans le col du ballon est
celle qui contient les esters méthyliques. La solution obtenue est prête
pour l'injection dans le chromatographe en phase gazeuse.
Précaution: La méthylation avec la méthode B doit être réalisée sous
hotte ventilée.
2.6.Alternatives à la méthylation selon la méthode B
2.6.1. Méthode C
2.6.1.1. Principe
La matière grasse soumise à l'analyse est traitée avec une solution
méthanolique d'acide chlorhydrique dans une ampoule fermée, à 100 ºC
2.6.1.2. Matériel
— Ampoule de verre épais d'une capacité d'environ 5 ml (hauteur 40 à
45 mm, diamètre 14 à 16 mm).
— Pipettes graduées de 1 et 2 ml.
2.6.1.3. Réactifs
Solution d'acide chlorhydrique dans 2 % de méthanol, préparée à partir
d'acide chlorhydrique gazeux et de méthanol anhydre (note 1).
Hexane pour chromatographie
Note 1: Il estpossible d'employer des solut ions commerciales de chlo-
rure d'hydrogène dans le méthanol. En laboratoire, il est facile
de préparer de petites quantités d'acide chlorhydrique gazeux
en modifiantla solut ion commerciale (p = 1,18), par l'ajoutde
quelques gouttes d'acide sulfurique concentré. Le méthanolétant très avide de gaz chlorhydrique, il est bon de prendre
toutes les précautions d'usage pour la dissolution (par exemple
introduire le gaz à l'aide d'un petit entonnoir renversé qui arrive
juste à affleurement du niveau du méthanol). Il est possible de
préparer à l'avance des quantités importantes de solutions
méthanoliques d'acide chlorhydrique qui se conservent parfaite-
mentà l'obscurit é dans des flacons munis de bouchons de
verre. Ce réactif peut également être préparé en dissolvant du
chlorure d'acétyle dans le méthanol anhydre.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 68
▼M19
2.6.1.4. Mode opératoire
— Verser dans l'ampoule de verre 0,2 g de la matière grasse préalable-
ment séchée au sulfate de sodium et filtrée, puis 2 ml de la solution
méthanolique d'acide chlorhydrique. Fermer l'ampoule.
— Submerger l'ampoule à 100 ºC pendant40 minut es.— Faire refroidir l'ampoule sous un courantd'eau, l'ouvrir etajout er
2 ml d'eau distillée et 1 ml d'hexane.
— Centrifuger et extraire la phase d'hexane, prête à l'emploi.
2.6.2. Méthode D
2.6.2.1. Principe
La matière grasse analysée est chauffée à reflux avec du méthanol, de
l'hexane et de l'acide sulfurique. Les esters méthyliques obtenus sont
extraits à l'éther de pétrole.
2.6.2.2. Matériel
— Tube à essai d'environ 20 ml de capacité avec réfrigérant à reflux
d'air d'environ 1 m de long, muni d'un jointrodé.
— Pipette graduée de 5 ml.— Entonnoir à décantation de 50 ml.— Éprouvettes de 10 ml et 25 ml.— Tube à essai à fond conique de 15 ml.
2.6.2.3. Réactifs
— Réactif de méthylation: méthanol anhydre, hexane et acide sulfu-
rique concentré (p = 1,84 dans la proportion suivante: 75:25:1 (V/
V/V).
— Éther de pétrole 40-60 ºC.— Sulfate de sodium anhydre.
2.6.2.4. Mode opératoire
Introduire dans le tube de 20 ml, 0,1 g d'huile et ajouter 5 ml du réactif
de méthylation.
Adapter le réfrigérant à reflux et chauffer au bain-marie à ébullition
pendant 30 minutes (note 2).
Transférer quantitativement le mélange dans un entonnoir à décantation
de 50 ml avec 10 ml d'eau distillée et 10 ml d'éther de pétrole. Agiter
vigoureusement et attendre que se produise la séparation des phases.
Séparer la phase aqueuse etlaver deux fois la couche ét hérée avec
20 ml d'eau distillée. Ajouter dans l'entonnoir à décantation une petite
quantité de sulfate de sodium anhydre, agiter, laisser reposer quelques
minutes et filtrer, en recueillant le filtrat dans un tube à fond conique
de 15 ml.
Évaporer le solvantau bain-marie dans un courantd'azot e.
Note 2: Pour contrôler l'ébullition, introduire une baguette de verre
dans le tube et limiter la température du bain-marie à 90 ºC.
3.Paramètres de précision
L'évaluation statistique de la précision des méthodes A et B a été
publiée par le Conseil Oléicole International dans sa méthode COI/
T.20/DOC. n
o24.
RECOMMANDATIONS POUR L'ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE GAZEUSE DES ESTERS D'ACIDES GRAS DE L'HUILE
D'OLIVE ET DE L'HUILE DE GRIGNONS D'OLIVE
1.Mode opératoire
L'analyse par chromatographie en phase gazeuse de solutions d'esters
gras dans l'hexane sera réalisée conformémentà la norme ISO 5508,
au moyen d'une colonne capillaire (50 m de long × 0,25 ou 0,32 mm
de diamètre interne) recouverte de cyanopropylsilicone, tel qu'indiqué
pour la détermination des acides gras isomères trans (COI/T.20/Doc.
no17).
La Figure 1 présente le profil chromatographique typique d'une huile de
grignons d'olive contenant des esters méthyliques et éthyliques d'acides
gras etdes isomères trans d'esters méthyliques.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 69
▼M19
2.Calculs
2.1. Pour calculer la composition en acides gras et le ∆ECN42, les acides
gras suivants doivent être pris en compte:
Myristique (C14:0)
Palmitique (C16:0). Somme des aires des pics correspondant aux esters
méthyliques et éthyliques.
Palmitoléique (C16:1). Somme des aires des pics correspondant aux
isomères ω9etω7de l'ester méthylique.
Heptadécanoïque (C17:0).
Heptadécénoïque (C17:1).
Stéarique (C18:0).Oléique (C18:1). Somme des aires des pics correspondantaux isomères
ω9etω7de l'ester méthylique, de l'ester éthylique et des isomères trans
de l'ester méthylique.
Linoléique (C18:2). Somme des aires des pics correspondantaux est ers
méthyliques et éthyliques et aux isomères trans de l'ester méthylique.
Arachidique (C20:0).
Linolénique (C18:3). Somme des aires de l'ester méthylique et des
isomères trans de l'ester méthylique.
Eïcosénoïque (C20:1)
Béhénique (C22:0)
Lignocérique (C24:0)Le squalène n'est pas pris en compte pour le calcul de l'aire totale.
2.2. Pour calculer le pourcentage de trans-C18:1, on utilisera le pic corres-
pondant aux esters méthyliques de cet acide gras. Pour la somme
[trans-C18:2 + trans-C18:3], on additionnera tous les pics correspon-
dantaux isomères trans de ces deux acides gras. Pour calculer l'aire
totale, on tiendra compte de tous les pics mentionnées en 2.1 (voir
COI/T.20/Doc. n
o17).
Le calcul du pourcentage de chaque acide gras sera effectué conformé-
mentà la formule suivant e:
% X = (Aire X × 100)/(aire totale)1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 70
▼M19
Figure 1: Profil chromatographique d'une huile de grignons d'olive, obtenu
avec la méthode de méthylation à froid. Les pics chromatographiques corres-
pondent aux esters méthyliques, sauf indication contraire.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 71
▼B
ANNEXE XI
DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN SOLVANTS HALOGÉNÉS
VOLATILS DANS L'HUILE D'OLIVE
1. PRINCIPE
Analyse par chromatographie en phase gazeuse selon la technique de
l'espace de tête (head space) .
2. APPAREILLAGE
2.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse, équipé d'un détecteur à
capture d'électrons (ECD).
2.2. Appareillage pour espace de tête (head space) .
2.3. Colonne de chromatographie en phase gazeuse en verre de 2 mètres de
long et de 2 millimètres de diamètre, phase stationnaire.
OV101 à 10 % ou équivalent, imprégnant une terre de diatomée calcinée,
lavée aux acides etsilanisée, de granulomét rie de 80 à 100 Mesh.
2.4. Gaz vecteur et gaz auxiliaire: azote pour chromatographie en phase
gazeuse, adaptée à la détection par capture d'électrons.
2.5. Flacons en verre de 10 à 15 millimètres munis d'une garniture en téflon et
d'un bouchon en aluminium muni d'un office pour prélèvementpar
seringue.
2.6. Pinces à fermeture hermétique.2.7. Seringue pour gaz de 0,5 à 2 millilitres.
3. RÉACTIFS
Standard: solvants halogénés volatils à un degré de pureté approprié à un
usage de chromatographie en phase gazeuse.
4. PROCÉDURE D'ANALYSE
4.1. Peser exactement environ 3 grammes d'huile dans un flacon en verre (à ne
pas réutiliser), boucher le flacon jusqu'à fermeture hermétique. Introduire le
flacon dans un thermostat à 70 ºC pendant 1 heure. Prélever avec précision
au moyen de la seringue un volume de 0,2 à 0,5 millilitre de l'espace de
tête. L'injecter dans la colonne de l'appareil de chromatographie en phase
gazeuse réglé comme suit:
— température injecteur: 150 ºC,
— température colonne: 70 à 80 ºC,— température détecteur: 200 à 250 ºC.
4.2. Solutions de référence. Préparer des solutions standard, en utilisant de
l'huile d'olive raffinée sans trace de solvants, à des concentrations variables
ent re 0,05 et1 milligramme par kilogramme eten rapportà la t eneur
présumée de l'échantillon. La dilution éventuelle doit être effectuée avec
du pentane.
4.3. Évaluation quantitative. Faire le rapport entre les surfaces ou les hauteurs
des pics de l'échantillon et de la solution standard ayant la concentration
présumée le plus proche. Si l'écartrelat if estsupérieur à 10 %, il estnéces-
saire de refaire l'analyse par comparaison avec une nouvelle solution
standard jusqu'à ce que sa concentration respecte l'écart relatif susmen-
tionné. La teneur est établie sur la base d'une moyenne d'injections
élémentaires.
4.4. Expression des résultats. Les résultats sont exprimés en milligrammes par
kilogramme (ppm). La limite de détection de la méthode est de 0,01 milli-
gramme par kilogramme.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 72
▼M19
ANNEXE XII
ÉVALUATIONORGANOLEPTIQUEDESHUILESD'OLIVESVIERGES1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
La présente méthode a pour but d'établir les critères nécessaires à l'évalua-
tion des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges au sens
du point1 de l'annexe du règlement136/66/CEE etde décrire la mét hode
pour leur classementà cetégard.
La méthode décrite n'est applicable que pour le classement des huiles
d'olive vierges, en fonction de l'existence du fruité et de l'intensité des
défauts, déterminés par un groupe de dégustateurs sélectionnés et entraînés,
constitué en jury conformément au point 4.
2. GÉNÉRALITÉS
Pour le vocabulaire général de base, la salle de dégustation, la méthodo-
logie générale ainsi que le verre de dégustation des huiles, il est
recommandé de se conformer aux prescriptions prévues par le Conseil
Oléicole International.
3. VOCABULAIRE SPÉCIFIQUE3.1.Attributs positifs
Fruité : ensemble des sensations olfactives, dépendant de la variété des
olives et caractéristiques de l'huile, provenant de fruits sains et frais, verts
ou mûrs, perçu par voie directe ou rétronasale.
Amer : goût caractéristique de l'huile obtenue d'olives vertes ou au stade de
véraison.
Piquant : sensation tactile de picotement, caractéristique des huiles
produites au début de la campagne, principalement à partir d'olives encore
vertes.
3.2.Attributs négatifs
Chômé : flaveur caractéristique de l'huile tirée d'olives entassées dans un
état avancé de fermentation anaérobie.
Moisi-humide : flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives attaquées
par des moisissures et des levures par suite d'un stockage des fruits pendant
plusieurs jours dans l'humidité.
Lies: flaveur caractéristique de l'huile restée en contact avec les «boues» de
décantation dans les piles et les cuves.
Vineux-vinaigré : flaveur caractéristique de certaines huiles rappelant le vin
ou le vinaigre. Elle est due fondamentalement à un processus de fermenta-
tion des olives qui donne lieu à la formation d'acides acétique, acétate
d'éthyle et éthanol.
Métallique : flaveur qui rappelle les métaux. Elle est caractéristique de
l'huile qui est demeurée longtemps en contact avec des surfaces métalli-
ques, au cours des processus de broyage, de malaxage, de pression ou de
stockage.
Rance : flaveur des huiles ayantsubi un processus d'oxydat ion.
Cuit ou brûlé : flaveur caractéristique des huiles qui tire son origine d'un
réchauffement excessif et/ou prolongé au cours de son obtention et tout
particulièrement pendant le thermo-malaxage de la pâte, si celui-ci est
réalisé dans des conditions thermiques inappropriées.
Foin-bois : flaveur caractéristique de certaines huiles provenant d'olives
sèches.
Grossier : sensation bucco tactile dense et pâteuse produite par certaines
huiles.
Lubrifiants : flaveur de l'huile qui rappelle celle du gazole, de la graisse ou
de l'huile minérale.
Margines : flaveur acquise par l'huile à la suite d'un contact prolongé avec
les eaux de végétation.
Saumure : flaveur de l'huile obtenue d'olives conservées en saumure.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 73
▼M19
Sparte : flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives pressées dans des
scourtins en sparte neuf. Elle peut être différente selon qu'il s'agit de scour-
tins fabriqués à partir de sparte vert ou de sparte sec.
Terre : flaveur de l'huile obtenue d'olives ramassées avec de la terre, ou
boueuses etnon lavées.
Ver: flaveur de l'huile issue d'olives ayant subi une forte attaque de larves
de la mouche de l'olive ( Bactrocera Oleae ).
Concombre : flaveur de l'huile caractéristique d'un conditionnement hermé-
tique excessivement prolongé, notamment dans des récipients en fer-blanc,
et qui est attribuée à la formation de 2-6 nonadiénal.
4. JURY
Le jury estnommé par l'Ét atmembre etil estcomposé d'un chef de jury et
de huit à douze dégustateurs. Toutefois, pour la campagne 2001/2002 le
nombre des dégustateurs peut être moindre que huit.
Le chef du jury doit avoir reçu une formation solide, et être un expert
averti des différents types d'huiles. Il est responsable du jury, de son orga-
nisation et de son fonctionnement, de la préparation, de la codification et
de la présentation des échantillons aux dégustateurs ainsi que du recueil
des données et de leur traitement statistique.
Le chef du jury sélectionne les dégustateurs et veille à leur entraînement et
au contrôle de leurs performances, afin d'assurer qu'ils se maintiennent à un
niveau d'aptitude adéquat.
Les dégustateurs pour les contrôles organoleptiques d'huile d'olive doivent
être choisis et entraînés en fonction de leur habileté à distinguer entre des
échantillons similaires, conformément au guide du Conseil Oléicole Inter-
national pour la sélection, l'entraînement et le contrôle des dégustateurs
qualifiés d'huile d'olive vierge.
Les jurys doivent s'engager à participer à des évaluations organoleptiques
prévues sur un plan national, communautaire ou international, pour le
contrôle périodique et l'harmonisation des critères de perception. Par
ailleurs, ils doivent fournir annuellement à l'État membre concerné tous
renseignements sur leur composition et le nombre d'évaluations réalisées
en tant que jury agréé.
5. PROCÉDURE POUR L'ÉVALUATION ORGANOLEPTIQUE ET LE
CLASSEMENT
5.1.Utilisation de la feuille de profil par le dégustateur
La feuille de profil à utiliser par le dégustateur figure à l'appendice A de la
présente méthode.
Chaque dégustateur faisant partie du jury doit sentir, puis déguster (1)
l'huile soumise à examen, contenue dans le verre à dégustation, afin d'en
analyser les perceptions olfactives, gustatives, tactiles et kinesthésiques. Il
doit ensuite porter sur la feuille de profil à sa disposition l'intensité à
laquelle il perçoit chacun des attributs négatifs et positifs.
Au cas où des attributs négatifs non indiqués sur la feuille de profil seraient
perçus, ils doivent être portés sous la rubrique «autres», en employant le ou
les termes les décrivant avec le plus de précision parmi ceux définis au
point 3.2 de la présente méthode.
5.2.Utilisation des données par le chef de jury
Le chef du jury doitrecueillir les feuilles de profil remplies par chacun des
dégustateurs; il doit contrôler les intensités attribuées; dans l'hypothèse
d'une anomalie constatée, il demandera au dégustateur de réviser sa feuille
de profil et, si nécessaire, de répéter l'essai.
Le chef du jury peut saisir les données de chaque dégustateur sur un logi-
ciel informatique conforme à la méthode du calcul statistique de la médiane
figurantà l'appendice B. La saisie des données pour un échant illon està
réaliser à l'aide d'une matrice composée de 10 colonnes correspondant aux
10 attributs sensoriels et de n lignes correspondant aux n dégustateurs du
jury.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 74
(1) ll pourra s'abstenir de déguster quand il observera quelques attributs négatifs extrême-
ment intenses, et notera sur la feuille de profil cette circonstance exceptionnelle.
▼M19
Lorsqu'un attribut négatif est porté sous la rubrique «autres» par au moins
50 % du jury, le chef du jury doitprocéder au calcul de la médiane de cet
attribut et au classement correspondant.
Dans le cas des analyses effectuées dans le cadre de contrôles de confor-
mité à la norme, ou de contre-expertises, le chef de jury doit faire
procéder à l'évaluation organoleptique de l'huile en triplicata, à au moins
une journée d'intervalle; la médiane des attributs sera calculée à partir de
l'ensemble des données des feuilles de profil des trois essais.
5.3.Classement des huiles
L'huile est classée sous les dénominations ci-dessous, en fonction de la
médiane des défauts et de la médiane de l'attribut fruité. Par médiane des
défauts on entend la médiane de l'attribut négatif perçu avec l'intensité la
plus forte. La valeur du coefficient de variation robuste pour cet attribut
négatif doit être inférieure ou égale à 20 %.
a)Huile d'olive Vierge extra : la médiane des défauts est égale à 0 et la
médiane du fruité est supérieure à 0;
b)Huile d'olive Vierge : la médiane des défauts est supérieure à 0 et infé-
rieure ou égale à 2,5 etla médiane du fruit é estsupérieure à 0;
c)Huile d'olive vierge courante : la médiane des défauts est supérieure à
2,5 etinférieure ou égale à 6,0; ou, la médiane des défaut s estinférieure
ou égale à 2,5 etla médiane du fruit é estégale à 0;
d)Huile d'olive vierge lampante : la médiane des défauts est supérieure à
6,0.
Toutefois, à partir du 1ernovembre 2003 les catégories c) et d) sont
remplacées par la catégorie:
c)Huile d'olive lampante : la médiane des défauts est supérieure à 2,5; ou
la médiane des défauts est inférieure ou égale à 2,5 et la médiane du
fruité est égale à 0.
5.4.Cas particulier
Lorsque la médiane d'un attribut positif autre que le fruité est supérieur à
5,0, le chef de jury le signalera sur le certificat d'analyse de l'huile.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 75
▼M19
APPENDICE A
1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 76
▼M19
APPENDICE B
MÉTHODE DE CALCUL DE LA MÉDIANE ET DES INTERVALLES DE
CONFIANCE
Médiane
La médiane est le nombre réel Xm caractérisé par le fait que la probabilité (P)
que les valeurs de la distribution (X) soient inférieures à ce nombre (Xm), est
inférieur ou égale à 0,5 et que, simultanément, la probabilité (P) que les valeurs
de la distribution (X) soient inférieures ou égales à Xm, est supérieure ou égale
à 0,5. Une autre définition considère la médiane comme étant le 50epercentile
d'une distribution de nombres ordonnés par ordre croissant. En d'autres termes,
la médiane représente la valeur centrale d'une série ordonnée de nombres
impairs, ou bien la moyenne des deux valeurs centrales d'une série ordonnée
de nombres pairs.
Écart-type robuste
Pour obtenir une estimation fiable de la variabilité qui se produit autour de la
médiane, il faut se reporter à l'estimation de l'écart type robuste d'après Stuart
et Kendall. La formule de l'écart type asymptotique S dépend du N et IQR. N
est le nombre d'observations et IQR l'intervalle interquartile, c'est-à-dire, l'esti-
mation robuste de la variabilité des données considérées (l'intervalle
interquartile renferme exactement 50 % des cas d'une distribution de probabilité
quelconque). Le calcul de l'intervalle interquartile s'effectue en calculant la
dimension de l'écartent re le 75eetle 25epercentile.
IQR = 75epercentile - 25epercentile
Le percentile est la valeur Xpc caractérisée par le fait que la probabilité (P) que
les valeurs de la distribution soient inférieures à Xpc est inférieure ou égale à un
centième déterminé et que, simultanément, la probabilité (P) que les valeurs de
la distribution soient inférieures ou égales à Xpc est supérieure ou égale audit
centième. Le centième indique la fraction de distribution retenue. Dans le cas
de la médiane, celle-ci estégale à 50/100.
Autrement dit, le percentile est la valeur de distribution correspondant à une aire
déterminée tracée à partir de la courbe de distribution ou de densité. À titre
d'exemple, le 25epercentile représente la valeur de distribution correspondant à
une aire égale à 0,25 ou 25/100.
Coefficient de variation % robuste
Le CVR représente un nombre pur, c'est-à-dire sans dimension, qui indique le
pourcentage de variabilité de la série de nombres analysée par rapport à la
valeur Me de la médiane; pour cette raison, ce coefficient est très utile pour
vérifier la fiabilité des membres du jury.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 77
▼M19
Intervalles de confiance à 95 % sur la médiane
Les intervalles de confiance (I.C) à 95 % (valeur de l'erreur de première espèce
égale à 0,05 ou 5 %) représentent l'intervalle où la valeur de la médiane pourrait
varier dans l'hypothèse où il serait possible de répéter l'expérience un nombre de
fois infini. Dans la pratique, cet intervalle indique l'intervalle de variabilité de
l'essai dans les conditions opératoires retenues, dans l'hypothèse où l'essai pour-
rait être répété plusieurs fois. L'intervalle aide à évaluer, comme dans le cas du
CVR, la fiabilité de l'essai.
I. C. Sup. = Me + (c.S)
I. C. Inf. = Me - (c.S)
Où c, dans le cas de l'intervalle de confiance à 0,95, est égal à 1,96.
Le classementesteffect ué par comparaison des valeurs de la médiane avec les
intervalles de référence déterminés au point 5.3 de la méthode. Le logiciel infor-
matique permet un classement visualisé sur un tableau des données statistiques
ou sur un graphique.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 78
▼M20
▼M19
▼B
ANNEXE XV
1. TENEUR EN HUILE DES GRIGNONS D'OLIVE
1.1.Matériel
— appareil d'extraction approprié muni d'un ballon de 200 à 250 millili-
tres,
— bain à chauffage électrique (bain de sable, bain d'eau, etc.) ou plaque
chauffante,
— balance analytique,— étuve réglée à 80 ºC au maximum,— étuve à chauffage électrique muni d'un dispositif de thermorégulation
réglé à 103 ºC ± 2 ºC et permettant de réaliser une insufflation d'air
ou une pression réduite,
— broyeur mécanique facile à nettoyer et permettant le broyage sans
échauffement et sans diminution sensible de leur teneur en eau et enhuile,
— cartouche d'extraction et coton hydrophile ou papier filtre, exempts de
produits extractibles à l'hexane,
— dessiccateur,— tamis à trous de 1 millimètre de diamètre,
— pierre ponce en petits grains, préalablement séchée.
1.2.Réactif
n-hexane technique dont le résidu à l'évaporation complète doit être infé-
rieur à 0,002 gramme pour 100 millilitres.
2. MODE OPÉRATOIRE2.1.Préparation de l'échantillon pour essai
Broyer l'échantillon pour laboratoire, si nécessaire, dans le broyeur méca-
nique préalablement bien nettoyé afin de le réduire en particules pouvant
traverser complètement le tamis.
Utiliser un vingtième environ de l'échantillon pour parfaire le nettoyage du
broyeur, rejeter cette mouture, broyer le reste, le recueillir, le mélanger
avec soin etl'analyser sans délai.
2.2.Prise d'essai
Peser, à 0,01 gramme près, dès la fin du broyage, environ 10 grammes de
l'échantillon pour essai.
2.3.Préparation de la cartouche d'extraction
Placer la prise d'essai dans la cartouche et boucher celle-ci avec le tampon
de coton hydrophile. Dans le cas où on a utilisé un papier filtre, emballer la
mouture dans ce papier.
2.4.Préséchage
Si le grignon est très humide (teneur en eau et en matières volatiles supé-
rieure à 10 %), effectuer un préséchage en plaçant pendant un temps
convenable la cartouche remplie (ou le papier filtre) dans l'étuve chauffée
à 80 ºC au maximum, pour ramener la teneur en eau et en matières vola-
tiles au-dessous de 10 %.
2.5.Préparation du ballon
Peser, à 1 milligramme près, le ballon contenant 1 à 2 grains de pierre
ponce, préalablementséché à l'ét uve à 103 ºC ± 2 ºC puis refroidi pendant
au moins une heure dans un dessiccateur.
2.6.Première extraction
Placer dans l'appareil d'extraction la cartouche (ou le papier filtre) conte-
nant la prise d'essai. Verser dans le ballon la quantité nécessaire d'hexane.
Adapter le ballon à l'appareil d'extraction et placer le tout sur le bain à
chauffage électrique. Conduire le chauffage dans des conditions telles que
le débit du reflux soit au moins de trois gouttes à la seconde (ébullition
modérée, non tumultueuse).1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 79
▼B
Après quatre heures d'extraction, laisser refroidir. Enlever la cartouche de
l'appareil d'extraction et la placer dans un courrant d'air afin d'éliminer la
majeure partie du solvant qui l'imprègne.
2.7.Deuxième extraction
Vider la cartouche dans le microbroyeur et broyer aussi finement que
possible. Replacer quantitativement le mélange dans la cartouche et celle-
ci dans l'appareil d'extraction.
Recommencer l'extraction pendant encore deux heures en utilisant le même
ballon contenant la première extraction.
La solution obtenue dans le ballon d'extraction doit être limpide. À défaut,
la filtrer sur un papier filtre en lavant plusieurs fois le premier ballon et le
papier filtre avec de l'hexane. Recueillir le filtrat et le solvant de lavage
dans un deuxième ballon préalablementséché ett aré à 1 milligramme près.
2.8.Élimination du solvant et pesée de l'extrait
Chasser par distillation sur bain à chauffage électrique la majeure partie du
solvant. Éliminer les dernières traces de solvant en chauffant le ballon à
l'étuve à 103 ºC ± 2 ºC pendant 20 minutes. Faciliter cette élimination,
soit en insufflant de l'air de temps à autre ou de préférence un gaz inerte,
soiten opérantsous pression réduit e.
Laisser refroidir le ballon dans un dessiccateur pendant au moins une
heure, etle peser à 1 milligramme près.
Chauffer à nouveau 10 minutes dans les mêmes conditions, refroidir au
dessiccateur et peser.
La différence entre les résultats de ces deux pesées doit être inférieure ou
égale à 10 milligrammes. Sinon, chauffer à nouveau pendantdes périodes
de dix minutes suivies du refroidissement et de la pesée, jusqu'à ce que la
différence de masse soitau plus égale à 10 milligrammes. Ret enir la
dernière pesée du ballon.
Effectuer deux déterminations sur le même échantillon pour essai.
3. EXPRESSION DES RÉSULTATS3.1.Mode de calcul et formule
a) L'extrait exprimé en pourcentage en masse du produit tel quel, est égal
à:
S=m
1×100
m0
où:S est le pourcentage en masse d'extrait du produit tel quel,
m0estla masse, en grammes, de la prise d'essai,
m1estla masse, en grammes, de l'ext raitaprès séchage.
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux détermina-
tions, si les conditions de répétabilité sont remplies.
Exprimer le résultat avec une seule décimale.
b) L'extrait est rapporté à la matière sèche en utilisant la formule suivante:
S×100
100 − U= extrait en % gras/sec
où: S est le pourcentage en masse d'extrait du produit tel quel [voir
sous a)],
U est sa teneur en eau et en matières volatiles.
3.2.Répétabilité
La différence entre les résultats des deux déterminations, effectuées simul-
tanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste, ne doit
pas être supérieure à 0,2 gramme d'extrait à l'hexane pour 100 grammes
d'échantillon.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 80
▼B
Dans le cas contraite, répéter l'analyse sur deux autres prises d'essai. Si
cette fois encore la différence dépasse 0,2 gramme, prendre comme résultat
la moyenne arithmétique des quatre déterminations effectuées.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 81
▼B
ANNEXE XVI
DÉTERMINATIONDE L'INDICE D'IODE
1. OBJET
La présente norme internationale décrit une méthode destinée à la détermi-
nation de l'indice d'iode dans les corps gras d'origine animale et végétale.
2. DÉFINITION
Aux fins de la présente norme internationale, les définitions suivantes sont
applicables.
2.1. Indice d'iode: la masse d'iode absorbée par l'échantillon dans les conditions
opératoires spécifiées par la présente norme internationale.
L'indice d'iode estexprimé en nombre de grammes d'iode par 100 grammes
d'échantillon.
3. PRINCIPE
Mise en solution d'une prise d'essai dans un solvant et addition du réactif
de Wijs. Au terme d'un laps de temps déterminé, addition d'une solution
d'iodure de potassium et d'eau; titrage de l'iode libéré par une solution de
thiosulfate de sodium.
4. RÉACTIFS
Tous les réactifs sont de qualité analytique reconnue.
4.1. Iodure de potassium, solution à 100 grammes par litre, exempte d'iode ou
d'iodate.
4.2. Solution d'amidon.
Mélanger 5 grammes d'amidon soluble dans 30 millilitres d'eau, ajouter ce
mélange à 1 000 millilitres d'eau bouillante, bouillir 3 minutes et laisser
refroidir.
4.3. Solution volumétrique standard de thiosulfate de sodium.
c(Na2S303.5H20) = 0,1 mole par litre, normalisé pas plus de sept jours avant
l'usage.
4.4. Solvantpréparé en mélangeantdes volumes égaux de cyclohexane et
d'acide acétique.
4.5. Réactif de Wijs contenant du monochlorure d'iode dans de l'acide acétique.
Utiliser le réactif de Wijs se trouvant dans le commerce.
Note: Le réactif contient 9 grammes de ICI3+ 9 grammes de I dans l'acide
acétique.
5. APPAREILLAGE
Le matériel courant de laboratoire et notamment:
5.1. Nacelles de pesée en verre, appropriées à la prise d'essai etpouvantêt re
introduites dans les fioles (5.2).
5.2. Fioles coniques, d'une capacité de 500 millilitres, pourvues de bouchons en
verre etcomplèt ementsèches.
6. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON À ANALYSER. L'ÉCHAN-
TILLON HOMOGÉNÉISÉ EST SÉCHÉ SUR SULFATE DE SODIUM
ET FILTRÉ.
7. MODE OPÉRATOIRE
7.1. Prise d'essai
La masse de la prise d'essai varie selon l'indice d'iode présumé, comme
l'indique le tableau 1.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 82
▼B
Tableau 1
Indice d'iode présumé Masse de la prise d'essai (en g)
moins que 5 3,00
5 à 20 1,00
21 à 50 0,40
51 à 100 0,20
101 à 150 0,13
151 à 200 0,10
Peser la prise d'essai à 0,1 milligramme près dans une nacelle de pesée en
verre (5.1).
7.2. Détermination
Introduire la prise d'essai dans une fiole de 500 millilitres (5.2). Ajouter 20
millilitres de solvant (4.4) pour dissoudre les corps gras. Ajouter exacte-
ment 25 millilitres du réactif de Wijs (4.5), boucher, agiter le contenu et
placer la fiole dans un endroit sombre. Ne pas utiliser de pipette pour le
réactif de Wijs.
Préparer un essai à blanc avec le solvantetle réact if mais sans la prise
d'essai.
Pour les échantillons ayant un indice d'iode inférieur à 150, laisser les
fioles dans un endroitsombre pendant1 heure; pour ceux ayantun indice
d'iode supérieur à 150 et pour les produits polymérisés ou des produits
oxydés dans une mesure considérable, les laisser pendant2 heures.
Une fois ce laps de temps écoulé, ajouter 20 millilitres de la solution
d'iodure de potassium (4.1) et 150 millilitres d'eau dans chaque fiole.
Titrer avec la solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3)
jusqu'à ce que la couleur jaune due à l'iode aitprat iquementdisparu.
Ajouter quelques gouttes de la solution d'amidon (4.2) et poursuivre la
titration jusqu'au moment où la couleur bleue disparaît après avoir agité
vigoureusementle cont enu.
Note: La détermination potentiométrique du point final est tolérée.
7.3. Nombre de déterminations
Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.
8. EXPRESSION DES RÉSULTATS
L'indice d'iode estégal à:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
où:
c: valeur numérique de la concentration exacte, en moles par litre, de la
solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3)
utilisée;
V1: valeur numérique du volume, en millilitres, de la solution de thiosul-
fate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée pour l'essai à
blanc;
V2: valeur numérique du volume, en millilitres, de la solution de thiosul-
fate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée pour la
détermination;
m: valeur numérique de la masse, en grammes, de la prise d'essai (7.1).
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations,
à condition que le critère de répétabilité soit rempli.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 83
▼M11
ANNEXE XVII
MÉTHODE DE DÉTERMINATION DES STIGMASTADIÈNES DANS
LES HUILES VÉGÉTALES
1. OBJET
Détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales contenant de
faibles concentrations de ces hydrocarbures, en particulier dans les huiles
d'olive vierge etles huiles de grignons d'olive.
2. CHAMP D'APPLICATION
La méthode est utilisable pour toutes les huiles végétales, mais les
mesures ne sontfiables que lorsque la t eneur en hydrocarbures est
comprise entre 0,01 et 4 mg/kg. Cette méthode est particulièrement
adaptée pour détecter la présence d'huiles végétales raffinées (olive,
grignons d'olive, tournesol, palme, etc) dans l'huile d'olive vierge, étant
donné que les huiles raffinées contiennent des stigmastadiènes, alors que
les huiles vierges n'en contiennent pas.
3. PRINCIPE
Isolement de l'insaponifiable. Séparation de la fraction d'hydrocarbures
stéroïdes par chromatographie sur colonne sur gel de silice et analyse
par chromatographie capillaire en phase gazeuse.
4. APPAREILLAGE
4.1. Flacons appropriés de 250 millilitres avec condenseur à reflux.4.2. Ampoules à décanter de 500 millilitres.4.3. Flacons à fond rond de 100 millilitres.4.4. Évaporateur rotatif.4.5. Colonne de chromatographie en verre (de 1,5 à 2,0 centimètres de
diamètre interne sur 50 centimètres de longueur) avec bouchon en Teflon
et tampon de laine de verre ou disque de verre fritté dans le fond. Pour
préparer la colonne de gel de silice, verser de l'hexane dans la colonne de
chromatographie sur une hauteur d'environ 5 centimètres, puis compléter
avec une suspension de gel de silice dans de l'hexane (15 grammes dans
40 millilitres) en utilisant des fractions d'hexane. Laisser reposer, puis
soumettre à de légères vibrations. Ajouter du sulfate de sodium anhydre
sur environ 0,5 centimètre de hauteur, puis éluer l'hexane en excès.
4.6. Appareil de chromatographie en phase gazeuse avec détecteur d'ionisation
à flamme, injecteur-diviseur ou sur colonne refroidie («on -column») et
four programmable à ± 1 ºC près.
4.7. Colonne capillaire en silice fondue pour chromatographie en phase
gazeuse (0,25 ou 0,5 millimètre de diamètre interne sur 25 mètres de
longueur) recouvertes d'une phase de phénylméthylsilicone à 5 % formant
un film de 0,25 micron d'épaisseur.
Remarque 1.
Il est possible d'utiliser d'autres colonnes de polarité similaire ou infé-
rieure.
4.8. Intégrateur-enregistreur permettant une intégration de vallée à vallée.4.9. Microseringue de 5 à 10 µl (microlitres) pour chromatographie en phase
gazeuse avec aiguille cémentée.
4.10. Chauffe-ballon électrique ou plaque chauffante.
5. RÉACTIFS
Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être purs. Il convient
d'utiliser de l'eau distillée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente.
5.1. Hexane ou mélange d'alcanes de point d'ébullition compris entre 65 et
70 ºC, distillés à l'aide d'une colonne de fractionnement.
Remarque 2.
Le solvant doit être distillé pour éliminer les impuretés.
5.2. Éthanol à 96 v/v.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 84
▼M11
5.3. Sulfate de sodium anhydre.
5.4. Solution d'hydroxyde de potassium alcoolique à 10 %. Ajouter 10 millili-
tres d'eau à 50 grammes d'hydroxyde de potassium, mélanger, puis
dissoudre le mélange dans de l'éthanol jusqu'à obtention de 500 millilitres
de solution.
Remarque 3.
La potasse alcoolique brunit au repos. Elle doit être préparée fraîchement
chaque jour etconservée dans des flacons en verre brun bin fermés.
5.5. Gel de silice 60 pour colonne de chromatographie, maille 70 à 230
(Merck réf. 7734 ou similaire).
Remarque 4.
En général, le gel de silice peut être utilisé directement tel qu'il se
présente dans le conteneur, sans traitement préalable. Toutefois, certains
lots de silice peuvent présenter une faible activité, ce qui se traduit par
une mauvaise séparation chromatographique. Dans ce cas, il convient de
traiter le gel de silice de la façon suivante: désactiver le gel de silice en le
chauffantà 550 ºC pendant4 heures au minimum. Après chauffage,
placer le gel de silice dans un déssicateur jusqu'à refroidissement, puis
le transvaser dans un flacon fermé. Ajouter 2 % d'eau et secouer jusqu'à
disparition des grumeaux et obtention d'une poudre flottant librement. Si
certains lots de gel de silice donnent des chromatogrammes présentant
des pics parasites, le gel de silice doit être traité comme indiqué ci-
dessus. Une autre solution consiste à utiliser un autre gel de silice pur
(Merck, réf. 7754).
5.6. Solution mère (200 ppm) de cholesta-3,5-diène (Sigma, pureté de 99 %)
dans de l'hexane. (10 milligrammes dans 50 millilitres).
5.7. Solution standard de cholesta-3,5-diène dans de l'hexane à une concentra-
tion de 20 ppm, obtenue par dilution de la solution précédente.
Remarque 5.
Conservées à une température inférieure à 4 ºC, les solutions désignées
aux points 5.6 et 5.7 se conserveront pendant au moins 4 mois.
5.8. Solution de n-nonacosane dans de l'hexane à une concentration d'environ
100 ppm.
5.9. Gaz vecteur pour la chromatographie: hélium ou hydrogène d'une pureté
de 99,9990 %.
5.10. Gaz auxiliaires pour le détecteur d'ionisation à flamme: hydrogène d'une
pureté de 99,9990 % et air purifié.
6. MÉTHODE
6.1.Préparation de l'insaponifiable:
6.1.1. Peser 20 ± 0,1 grammes d'huile dans un flacon de 250 millilitres (point
4.1), ajouter 1 millilitre de la solution standard de cholesta-3,5-diène (20
microgrammes) et 75 millilitres de potasse alcoolique à 10 %, mettre en
place le condenseur à reflux etchauffer en maint enanten légère ébulli-
tion pendant 30 minutes. Éloigner le flacon contenant l'échantillon de la
source de chaleur etlaisser refroidir légèrement(ne pas laisser refroidir
complètement, sinon l'échantillon figerait). Ajouter 100 millilitres d'eau
et transvaser la solution dans une ampoule à décanter (point 4.2) avec
100 millilitres d'hexane. Secouer le mélange énergiquement pendant 30
secondes etlaisser les différent es couches se former.
Remarque 6.
S'il se forme une émulsion qui ne disparaît pas rapidement, ajouter de
petites quantités d'éthanol.
6.1.2. Transférer la phase aqueuse du dessous dans une seconde ampoule à
décanter et extraire à nouveau avec 100 millilitres d'hexane. Récupérer à
nouveau la phase inférieure et laver les extraits d'hexane (regroupés dans
une autre ampoule à décanter) trois fois avec chaque fois 100 millilitres
d'un mélange éthanol-eau (1: 1) jusqu'à obtention d'un pH neutre.
6.1.3. Faire passer la solution d'hexane sur du sulfate de sodium anhydre (50
grammes), laver avec 20 millilitres d'hexane et faire sécher dans un
évaporateur rotatif à 30 ºC et à une faible pression.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 85
▼M11
6.2.Séparation de la fraction d'hydrocarbures stéroïdes:
6.2.1. Placer le résidu dans la colonne de fractionnement avec deux fractions d'1
millilitre d'hexane, faire s'écouler l'échantillon le long de la colonne en
amenant le niveau de la solution au-dessus du sulfate de sodium et
commencer l'élution chromatographique avec l'hexane à un débit de 1
millilitre par minute environ. Éliminer le premier éluat de 25 à 30 millili-
tres, puis recueillir la fraction de 40 millilitres suivante. Ensuite,
transférer cette fraction dans un flacon à fond rond de 100 millilitres
(point4.3).
Remarque 7.
La première fraction contient les hydrocarbures saturés (figure 1a) et la
seconde, les hydrocarbures stéroïdes. En poursuivant l'élution, on obtient
du squalène et des composés apparentés. Pour obtenir une bonne sépara-
tion entre les hydrocarbures saturés et les hydrocarbures stéroïdes, le
volume des fractions doit être optimal. À cet effet, il convient d'ajuster
le volume de la première fraction de manière que, lors de l'analyse de la
seconde fraction, les pics représentant les hydrocarbures saturés soient
faibles (figure 1c); si ces pics ne se forment pas, mais que l'intensité du
pic standard est faible, il faut réduire le volume. En tout état de cause, il
est inutile de séparer complètement les composants de la première et de
la seconde fractions, étant donné qu'il n'y a pas de chevauchement des
pics lors de l'analyse par chromatographie en phase gazeuse si les condi-
tions de la CG sont ajustées conformément au point 6.3.1. En général, il
est inutile d'optimaliser le volume de la seconde fraction car on obtient
une bonne séparation avec les composants suivants. Quoi qu'il en soit. la
formation d'un grand pic à un temps de rétention inférieur d'environ 1,5
minute à celui du pic standard est due au squalène et témoigne d'une
mauvaise séparation.
6.2.2. Faire évaporer la seconde fraction dans un évaporateur à 30 ºC et à une
faible pression jusqu'à séchage, puis dissoudre immédiatement le résidu
dans 0,2 millilitre d'hexane. Conserver la solution au réfrigérateur jusqu'à
analyse.
Remarque 8.
Les résidus désignés aux points 6.1.3 et 6.2.2 ne doivent pas être
conservés secs et à température ambiante. Dès leur obtention, il convient
d'ajouter le solvant et de conserver les solutions au réfrigérateur.
6.3.Chromatographie en phase gazeuse
6.3.1. Conditions opératoires applicables à l'injection:
— température de l'injecteur: 300 ºC,
— température du détecteur: 320 ºC,
— intégrateur-enregistreur: les paramètres d'intégration doivent être fixés
de manière à permettre une évaluation correcte des aires. Le mode
d'intégration de vallée à vallée est recommandé,
— sensibilité: environ 16 fois l'atténuation minimale,
— quantité de solution injectée: 1 microlitre,
— températures de programmation du four: température initiale de 235 ºC
pendant 6 minutes, puis élévation de 2 ºC par minute jusqu'à 285 ºC,
— injecteur avec diviseur de débit 1: 15,
— vecteur: hélium ou hydrogène à une pression d'environ 120 kPa.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques du
chromatographe et de la colonne, de manière que les chromatogrammes
répondent aux exigences suivantes: formation du pic standard interne à
plus ou moins 5 minutes du temps indiqué au point 6.3.2; le pic standard
interne doit s'étirer sur au moins 80 % de l'échelle totale.
Il y a lieu de vérifier le système de chromatographie en phase gazeuse en
injectant un mélange de solution mère de cholestadiène (point 5.6) et de
solution de n-nonacosane (point 5.8). Le pic du cholesta-3,5-diène doit seformer avantcelui du n-nonacosane (figure 1c); si cela ne se produitpas,
deux mesures peuvent être prises: réduire la température du four et/ou
utiliser une colonne moins polaire.
6.3.2. Identification des pics
Le pic standard interne se forme à environ 19 minutes et le stigmasta-3,5-
diène à un temps de rétention relatif d'environ 1,29 (voir figure 1b). Le
stigmastadiène s'accompagne de faibles quantités d'isomère et, générale-
ment, ils produisent un pic chromatographique unique. Néanmoins, si la
colonne est trop polaire ou si elle présente un grand pouvoir de résolu-
tion, l'isomère peut former un petit pic avant celui du stigmasta-3,5-1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 86
▼M11
diène et très près de lui (figure 2). Pour garantir que les stigmastadiènes
produisentun pic unique, il estconseillé de remplacer la colonne par une
autre moins polaire ou à diamètre interne plus large.
Remarque 9.
La méthode de détermination des hydrocarbures stéroïdes appliquée à
l'analyse d'une huile végétale raffinée permet d'obtenir un pic témoin
pour les stigmastadiènes. La substance fait apparaître un pic de hauteur
appréciable, facilementident ifiable.
6.3.3. Analyse quantitative
La teneur en stigmastadiène est déterminée par la formule suivante:
mg/kg de stigmastadiènes =As/C2Mc
Ac/C2Mo
où:As= aire du pic de stigmastadiène (si le pic est résolu en deux
isomères, somme des aires des deux isomères).
Ac= aire du standard interne (cholestadiène).
Mc= masse de standard ajoutée, en microgrammes.
Mo= masse d'huile prélevée, en grammes.
Limite de détection: 0,01 mg/kg environ.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 87
▼M11
Figure 1
Chromatogrammes (chromatographie en phase gazeuse) obtenus par
analyse d'échantillons d'huile d'olive sur une colonne capillaire en silice
fondue (0,25 millimètre de diamètre interne sur 25 mètres de longueur)
recouverte d'un film de 0,25 micron d'épaisseur de phénylméthylsilicone
à5% .
a) Première fraction (30 millilitres) d'une huile vierge, éluée avec le stan-
dard.
b) Seconde fraction (40 millilitres) d'une huile d'olive contenant 0,10 mg/
kg de stigmastadiènes.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 88
▼M11
c) Seconde fraction (40 millilitres) contenant une petite proportion de la
première fraction.
Figure 2
Chromatogramme en phase gazeuse obtenu à partir d'un échantillon
d'huile d'olive raffinée analysé sur une colonne DB-5 sur laquelle figure
l'isomère de stigmasta-3,5-diène.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 89
▼M13
ANNEXE XVIII
DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION DES TRIGLYCÉRIDES À
ECN42 (DIFFÉRENCE ENTRE COMPOSITION THÉORIQUE ET
COMPOSITION RÉELLE)
1.Objet
Détermination de la composition des triglycérides (TAG) dans les
huiles d'olive, en terme d'indice d'équivalent carbone, par les diffé-
rences entre les résultats d'analyse obtenus par chromatographie en
phase liquide à haute performance (HPLC) et la composition théorique,
calculée au départde la composit ion en acides gras.
2.Champ d'application
La norme s'applique aux huiles d'olive. La méthode vise à détecter la
présence de faibles quantités d'huiles de graines (riches en acide lino-
léique) dans chaque catégorie d'huile d'olive.
3.Principe
La composition des triglycérides à ECN42 déterminée par HPLC et la
composition théorique des triglycérides à ECN42 (calculée sur la base
de la détermination GLC de la composition en acides gras) correspon-
dent dans une certaine limite pour les huiles pures. Une différence
supérieure aux valeurs mentionnées dans le règlement pour chaque caté-
gorie d'huile indique que l'huile contient des huiles de graines.
4.Méthode
La méthode permettant de calculer la composition théorique des trigly-
cérides à ECN42 etla différence ent re les données HPLC etcelle-ci est
constituée par la coordination des données d'analyse obtenues par
d'autres méthodes; on peut distinguer trois phases: détermination de la
composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse,
calcul de la composition théorique des triglycérides à ECN42, détermi-
nation HPLC des triglycérides à ECN42.
4.1.Appareillage
4.1.1. Ballons à fond rond de 250 et500 ml.4.1.2. Béchers de 100 ml.
4.1.3. Colonne en verre pour chromatographe (diamètre intérieur: 21 mm,
longueur 450 mm) avec robinetetcône normalisé (femelle) au sommet .
4.1.4. Ampoules à décanter de 250 ml avec cône normalisé (mâle) à la base,
pouvants'adapt er au sommetde la colonne.
4.1.5. Baguette en verre de 600 mm de longueur.4.1.6. Entonnoir en verre de 80 mm de diamètre.4.1.7. Ballons tarés de 50 ml.4.1.8. Ballons tarés de 20 ml.4.1.9. Évaporateur rotatif.4.1.10. Chromatographe en phase liquide à haute performance, équipé d'un
contrôle thermostatique de la température de la colonne.
4.1.11. Vannes d'injection pour 10 µl.
4.1.12. Détecteur: réfractomètre différentiel. La sensibilité pleine échelle doit
atteindre au moins 10
−4unités d'indice de réfraction.
4.1.13. Colonne: tube en acier inoxydable de 250 mm de longueur et de 4,5 mm
de diamètre intérieur, rempli de particules de silice de 5 µmd e
diamètre, avec 22 à 23 % de carbone sous forme d'octadécylsilane
(note 2).
4.1.14. Enregistreur et/ou intégrateur.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 90
▼M13
4.2.Réactifs
Les réactifs doivent être de pureté analytique. Les solvants d'élution
doivent être dégazés et peuvent être recyclés plusieurs fois sans que
les séparations n'en soient affectées.
4.2.1. Éther de pétrole 40-60 ºC pour chromatographie.4.2.2. Éther éthylique, exempt de peroxydes, fraîchement distillé.4.2.3. Solvant d'élution pour chromatographe en verre: mélange d'éther de
pétrole/éther éthylique selon les proportions 87/13 (v/v).
4.2.4. Gel de silice, granulométrie 70-230, type Merck 7734, normalisé avec
5 % d'eau (m/m)
4.2.5. Laine de verre.4.2.6. Acétone.4.2.7. Acétonitrile.
4.2.8. Solvant d'élution HPLC: acétonitrile + acétone (dont les proportions
doivent être ajustées pour obtenir la séparation souhaitée; commencer
avec le mélange 50:50).
4.2.9. Solvant de solubilisation: acétone.4.2.10. Triglycérides de référence: soit des triglycérides que l'on trouve dans le
commerce (tripalmitine, trioléine, etc.) et les temps de rétention sont
alors reportés conformément à l'indice d'équivalent carbone, soit des
chromatogrammes de référence obtenus à partir d'huile de soja, d'un
mélange d'huile de soja-huile d'olive 30:70 etd'huile d'olive pure (voir
not es 3 et4 etfigures 1, 2, 3 et4).
4.3.Préparation des échantillons
Étant donné qu'un certain nombre de substances peuvent provoquer une
interférence et donner ainsi des résultats positifs erronés, l'échantillon
doit toujours être purifié selon la méthode IUPAC 2.507, utilisée pour
la détermination des substances polaires dans les huiles oxydées.
4.3.1. Préparation de la colonne de chromatographie
Remplir la colonne (4.1.3) avec 30 ml environ de solvantd'élut ion
(4.2.3); introduire ensuite un tampon de laine de verre (4.2.5) dans la
colonne, l'enfoncer jusqu'au fond de la colonne au moyen de la baguette
en verre (4.1.5).
Préparer dans un bécher de 100 ml une suspension avec 25 g de gel de
silice (4.2.4) dans 80 ml de mélange d'élution (4.2.3); la transférer
ensuite dans la colonne au moyen d'un entonnoir en verre (4.1.6).
Afin d'être sûr que la totalité du gel de silice a été transférée dans la
colonne, laver le bécher avec le mélange d'élution et transférer égale-
mentle liquide de lavage dans la colonne.
Ouvrir le robinetetlaisser le solvants'écouler jusqu'à ce que son niveau
se situe à 1 cm au-dessus du gel de silice.
4.3.2. Chromatographie sur colonne
Peser, avec un degré de précision de 0,001 g, 2,5 +/−0,1 g d'huile, préa-
lablement filtrée, homogénéisée et, si nécessaire, déshydratée dans un
ballon taré de 50 ml (4.1.7). Diluer dans 20 ml environ de solution
d'élution (4.2.3); si nécessaire, chauffer légèrement pour faciliter la
dissolution. Refroidir à température ambiante et porter au volume avec
du solvantd'élut ion.
À l'aide d'une pipette jaugée, introduire 20 ml de solution dans la
colonne préparée conformémentau point4.3.1, ouvrir le robinetetfaire
éluer le solvantjusqu'au niveau de la couche de gel de silice.
Éluer ensuite avec 150 ml de solvant d'élution (4.2.3), en réglant le
débit du solvant à la vitesse de 2 ml par minute environ (de telle sorte
que 150 ml passentpar la colonne en 60-70 minut es).
Recueillir l'éluatdans un ballon à fond rond de 250 ml (4.1.1) préala-
blementt aré etpesé avec précision. Éliminer le solvantsous pression
réduite (Rotavapor) et peser le résidu qui sera utilisé pour préparer la
solution pour l'analyse HPLC et pour la préparation des esters méthyli-
ques.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 91
▼M13
Après passage dans la colonne, l'échantillon doit être récupéré au moins
à 90 % pour les catégories d'huile d'olive extra-vierges, vierges et raffi-
nées normalementetà 80 % pour les huiles lampant es etles huiles de
grignons.
4.4.Analyse HPLC
4.4.1. Préparation de l'échantillon pour l'analyse chromatogra-
phique
Préparer une solution à 5 % de l'échantillon à analyser en pesant 0,5 +/
− 0,001 g de l'échantillon dans une fiole jaugée de 10 ml et complétée à
10 ml avec le solvantde solubilisat ion (4.2.9).
4.4.2. Procédure
Mettre en marche le système chromatographique. Pomper du solvant
d'élution (4.2.8) à un débit de 1,5 ml par minute de façon à purger
l'ensemble du système. Attendre d'avoir une ligne de base stable.
Injecter 10 µl des échantillons préparés selon le point 4.3.
4.4.3. Calcul et expression des résultats
Utiliser la méthode de normalisation interne, c'est-à-dire admettre que
la somme des aires des pics correspondantaux t riglycérides (TAG) de
ECN 42 à ECN 52 est égale à 100 %. Calculer le pourcentage relatif de
chaque triglycéride selon la formule:
% triglycéride = aire du pic × 100 / somme des aires des pics.
Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule.Note 1: L'ordre d'élution peut être déterminé en calculant les indices
d'équivalentcarbone, souventdéfinis par la relat ion ECN = CN−2n,
dans laquelle CN estl'indice de carbone etn le nombre de doubles liai-
sons; il peut être calculé de manière plus précise en tenant compte de
l'origine de la double liaison. Si n
o,nletnlnsontles nombres de doubles
liaisons attribuées respectivement aux acides oléique, linoléique et lino-
lénique, l'indice d'équivalentcarbone peutêt re calculé selon la formule:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln,
dans laquelle les coefficients do,dletdlnpeuvent être calculés à partir
des triglycérides de référence. Dans les conditions énoncées dans cette
méthode, la relation obtenue sera voisine de:
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Note 2: Exemples: Lichrosorb (Merck) RP18 Art50333
Lichrosphere ou équivalent(Merck) 100 CH18 Art
50377.
Note 3: Avec plusieurs triglycérides de référence, il est également
possible de calculer la résolution par rapport à la trioléine:
α= TR' / TR de trioléine
en utilisant le temps de rétention réduit TR' = TR − TR du solvant.
Le graphique représentant le logarithme αen fonction de f (nombre de
doubles liaisons) permet de déterminer les valeurs de rétention pour
tous les triglycérides des acides gras contenus dans les triglycérides de
référence — voir figure 2.
Note 4: L'efficacité de la colonne doit permettre de séparer nettement le
pic de la trilinoléine des pics des triglycérides dont le TR est proche.
L'élution est effectuée jusqu'au pic ECN 52.
Note 5: Une mesure correcte des aires de tous les pics intéressants pour
la présente détermination est garantie si le deuxième pic correspondant
à ECN 50 estégal à 50 % du maximum de l'échelle.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 92
▼M13
4.5.Détermination de la composition des triglycérides (moles %) au
départ des données relatives aux acides gras GLC
4.5.1. Détermination de la composition des acides gras
La composition des acides gras est déterminée par chromatographie en
phase gazeuse selon la méthode CEE décrite à l'annexe X A du règle-
ment(CEE) no2568/91 au moyen d'une colonne capillaire. Les esters
méthyliques sont préparés selon la méthode décrite à l'annexe X B
(méthylate de sodium en solution méthanolique).
4.5.2. Acides gras intervenant dans le calcul
Les glycérides sontregroupés par leur indice d'équivalentcarbone
(ECN), compte tenu des équivalences suivantes entre ECN et acides
gras. Seuls les acides gras ayant 16 ou 18 atomes de carbone ont été
pris en considération, car ce sont les seuls qui sont importants pour
l'huile d'olive.
Acide gras (AG) AbréviationPoids molé-
culaire (PM)ECN
Acide palmitique P 256,4 16
Acide palmitoléique Po 254,4 14Acide stéarique S 284,5 18
Acide oléique O 282,5 16
Acide linoléique L 280,4 14Acide linolénique Ln 278,4 12
4.5.3. Conversion en moles du % de l'aire pour tous les acides
gras
moles P ¼
% aire P
PM Pmoles S ¼% aire S
PM Smoles Po ¼% aire Po
PM Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
moles O ¼
% aire O
PM Omoles L ¼% aire L
PM Lmoles Ln ¼% aire Ln
PM Ln
4.5.4. Normalisation des acides gras à 100 %
moles % P 1 ;2;3 ðÞ ¼moles P /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)moles % S 1 ;2;3 ðÞ ¼
moles S /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moles % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼moles Po /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moles % O 1 ;2;3 ðÞ ¼moles O /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moles % L 1 ;2;3 ðÞ ¼moles L /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
moles % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼moles Ln /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Le résultat indique le pourcentage de chaque acide gras en moles dans
la position globale (1,2,3-) des TAG.
Calculer alors la somme des acides gras sat urés P etS (SAG) etles
acides gras insaturés Po, O, L et Ln (AGI):
moles % SAG = moles % P + moles % S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)moles % AGI = 100 - moles %1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 93
▼M13
4.5.5. Calcul de la composition des TAG en acides gras en posi-
tions 2 et 1-3
Les acides gras sont répartis en trois ensembles de la manière suivante:
deux ensembles identiques pour les positions 1 et 3 et un pour la posi-
tion 2, avec différents coefficients pour les acides saturés (P et S) et les
acides insaturés (Po, O, L et Ln).
4.5.5.1. Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)]
moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2. Acides gras insaturés en position 2 [Po(2), O(2), L(2) et Ln(2)]
moles % Po 2 ðÞ ¼ moles % Po 1 ;2;3 ðÞ
moles % AGI/C3100/C0moles % P 2 ðÞ /C0 moles % S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)moles % O 2 ðÞ ¼
moles % O 1 ;2;3 ðÞ
moles % AGI/C3100/C0moles % P 2 ðÞ /C0 moles % S 2 ðÞ ½/C138
moles % L 2 ðÞ ¼moles % L 1 ;2;3 ðÞ
moles % AGI/C3100/C0moles % P 2 ðÞ /C0 moles % S 2 ðÞ ½/C138
moles % Ln 2 ðÞ ¼moles % Ln 1 ;2;3 ðÞ
moles % AGI/C3100/C0moles % P 2 ðÞ /C0 moles % S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Acides gras en positions 1 et 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et
Ln(1,3)]
moles % P 1 ;3ðÞ ¼moles % P 1 ;2;3 ðÞ /C0 moles % P 2 ðÞ
2þmoles % P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)moles % S 1 ;3ðÞ ¼
moles % S 1 ;2;3 ðÞ /C0 moles % S 2 ðÞ
2þmoles % S 1 ;2;3 ðÞ
moles % Po 1 ;3ðÞ ¼moles % Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 moles % Po 2 ðÞ
2þmoles % Po 1 ;2;3 ðÞ
moles % O 1 ;3ðÞ ¼moles % O 1 ;2;3 ðÞ /C0 moles % O 2 ðÞ
2þmoles % O 1 ;2;3 ðÞ
moles % L 1 ;3ðÞ ¼moles % L 1 ;2;3 ðÞ /C0moles % L 2 ðÞ
2þmoles % L 1 ;2;3 ðÞ
moles % Ln 1 ;3ðÞ ¼moles % Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0 moles % Ln 2 ðÞ
2þmoles % Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Calcul des triglycérides
4.5.6.1. TAG avec un acide gras (AAA, ici LLL, PoPoPo)
moles % AAA ¼moles % A 1 ;3ðÞ /C3 moles % A 2 ðÞ/C3 moles % A 1 ;3ðÞ
10 000(7)
4.5.6.2. TAG avec deux acides gras (AAB, ici PoPoL, PoLL)
moles % AAB ¼moles % A 1 ;3ðÞ /C3 moles % A 2 ðÞ/C3 moles % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
moles % ABA ¼
moles % A 1 ;3ðÞ /C3 moles % B 2 ðÞ/C3 moles % A 1 ;3ðÞ
10 0001991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 94
▼M13
4.5.6.3. TAG avec trois acides gras différents (ABC, ici OLLn, PLLn, PoOLn,
PPoLn)
moles % ABC ¼moles % A 1 ;3ðÞ /C3 moles % B 2 ðÞ/C3 moles % C 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) moles % BCA ¼
moles % B 1 ;3ðÞ /C3 moles % C 2 ðÞ/C3 moles % A 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000
moles % CAB ¼moles % C 1 ;3ðÞ /C3 moles % A 2 ðÞ/C3 moles % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000
4.5.6.4. Triglycérides avec ECN42
Les triglycérides suivants avec ECN42 sont calculés selon l'équation 7,
8 et 9, par ordre de l'élution attendue dans la HPLC (normalement trois
pics seulement).
LLL
PoLL etl'isomère de posit ion LPoLOLLn etles isomères de posit ion OLnL etLnOL
PoPoL etl'isomère de posit ion PoLPo
PoOLn etles isomères de posit ion OPoLn etOLnPoPLLn etles isomères de posit ion LLnP etLnPL
PoPoPo
SLnLn etl'isomère de posit ion LnSLnPPoLn etles isomères de posit ion PLnPo etPoPLn
Les triacylglycérides avec ECN42 s'obtiennent en calculant la somme
des neuf triglycérides, y compris leurs isomères de position. Les résul-
tats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule.
5.Évaluation des résultats
Comparer la composition théorique calculée et celle déterminée par
HPLC. Si la différence «données HPLC moins données théoriques» est
supérieure aux valeurs mentionnées dans le règlement pour la catégorie
d'huile appropriée, l'échantillon contient de l'huile de graines.
Note: Les résultats sont donnés avec un chiffre derrière la virgule.
6.Exemple (Les nombres se réfèrent aux sections du texte de la
méthode.)
4.5.1. Calcul des acides gras par le % de moles à partir des
données de la GLC (% de l'aire)
On obtient les données suivantes pour la composition en acides gras par
GLC:
AG
PMP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
% de l'aire 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Conversion du % de l'aire en moles pour tous les acides
gras
moles P ¼10
256 ;4¼0;03900 moles P voir formule (1)
moles S ¼3
284 ;5¼0;01054 moles S voir formule (1)
moles Po ¼1
254 ;4¼0;00393 moles Po voir formule (1)1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 95
▼M13
moles O ¼75
282 ;5¼0;26549 moles O voir formule (1)
moles L ¼10
280 ;4¼0;03566 moles L voir formule (1)
moles Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 moles Ln voir formule (1)
Total = 0,35822 moles TG
4.5.4. Normalisation des acides gras à 100 %
moles % P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 moles P /C3100
0;35822 moles¼10;888 % voir formule (2)
moles % S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 moles S /C3100
0;35822 moles¼2;944 % voir formule (2)
moles % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 moles Po /C3100
0;35822 moles¼1;097 % voir formule (2)
moles % O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 moles O /C3100
0;35822 moles¼74;113 % voir formule (2)
moles % L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 moles L /C3100
0;35822 moles¼9;956 % voir formule (2)
moles % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 moles Ln /C3100
0;35822 moles¼1;003 % voir formule (2)
Total moles % = 100,0 %
La somme des acides gras saturés et insaturés dans la position 1, 2, 3
des TAG:
moles % SAG = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % voir formule (3)
moles % AGI = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % voir formule (3)
4.5.5. Calcul de la composition en acides gras dans les positions 2
et1-3 des TAG
4.5.5.1. Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)]
moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % voir formule (4)
moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % voir formule (4)
4.5.5.2. Acides gras insaturés en positions 1-3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et
Ln(1,3)]
moles % Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 moles % voir formule (5)
moles % O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 moles % voir formule (5)
moles % L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 moles % voir formule (5)
moles % Ln 2 ðÞ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼1;154 moles % voir formule (5)
4.5.5.3. Acides gras en positions 1-3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et
Ln(1,3)]
moles % P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 moles % voir formule (6)
moles % S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 moles % voir formule (6)1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 96
▼M13
moles % Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 % moles voir formule (6)
moles % O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 moles % voir formule (6)
moles % L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 moles % voir formule (6)
moles % Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003 — 1 ;154
21;003¼0;927 moles % voir formule (6)
4.5.6. Calcul des triglycérides
À partir de la composition calculée en acides gras dans les positions sn-
2 et sn-1,3 (voir tableau suivant):
AG en position 1-3 position 2
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Total 100,0 % 100,0 %
Calculer les triglycérides suivants:
LLL
PoPoPo
PoLL avec 1 isomère de positionSLnLn avec 1 isomère de positionPoPoL avec 1 isomère de position
PPoLn avec 2 isomères de position
OLLn avec 2 isomères de positionPLLn avec 2 isomères de position
PoOLn avec 2 isomères de position
4.5.6.1. TAG avec un acide gras (LLL, PoPoPo) voir formule (7)
moles % LLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10 000= 0,09708 mol LLL
moles % PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10 000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TAG avec deux acides gras (PoLL, SLnLn, PoPoL) voir formule (8)
moles % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,02141
moles % LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10 000= 0,01070
0,03211 mol PoLL
moles % SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,00093
moles % LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10 000= 0,000021991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 97
▼M13
0,00095 mol SLnLn
moles % PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,00236
moles % PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10 000= 0,00118
0,00354 mol PoPoL
4.5.6.3. TAG avec trois acides gras différents (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
voir formule (9)
moles % PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,00375
moles % LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10 000= 0,00012
moles % PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10 000= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
moles % OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,14577
moles % LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,14577
moles % LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10 000= 0,14577
0,43671 mol OLLn
moles % PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,03400
moles % LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,00111
moles % LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10 000= 0,03400
0,06911 mol PLLn
moles % PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,01605
moles % LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10 000= 0,01605
moles % OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10 000= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol TAG1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 98
▼M14
Figure 1: Évolution du log αen fonction de f (nombre de liaisons
doubles)
Note: La: acide laurique; My: acide myristique; P: acide palmitique; St:
acide stéarique; O: acide oléique; L: acide linoléique; Ln: acide
linolénique.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 99
▼M14
Figure 2: Huile de soja
Figure 3: Huile de soja / huile d'olive 30/70
1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 100
▼M14
Figure 4: Huile d'olive
1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 101
▼M19
ANNEXE XIX
DÉTERMINATION DU CONTENU EN ALCOOLS ALIPHATIQUES AU
MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC
COLONNE CAPILLAIRE
1. OBJET
La méthode décrit un procédé de détermination du contenu en alcools
aliphatiques, simples et totaux, des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse, additionnée de 1-eicosanol comme standard interne,
est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans
l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La
fraction des alcools est séparée de l'extrait insaponifiable par chromato-
graphie sur plaque de gel de silice basique; les alcools récupérés dans le
gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par
chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.
3. APPAREILLAGE
3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts
rodés.
3.2. Ampoule à décanter de 500 millilitres.3.3. Ballons de 250 millilitres.3.4. Équipementcompletpour chromat ographie en phase solide, avec
plaques de verre de 20 × 20, centimètres.
3.5. Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.
3.6. Microseringues de 100 et500 microlit res.
3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40
micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres
de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout
rodé mâle 12/21.
3.8. Fiole à vide de 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable
à l'ampoule filtrante (3.7).
3.9. Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.3.10. Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec
colonne capillaire, équipé d'un système de fractionnement, constitué de:
3.10.1. Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la
température désirée avec une précision d'environ 1 ºC.
3.10.2. Ensemble d'injection thermoréglable avec élément vaporisateur en verre
persilanisé.
3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur.
3.10.4. Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertis-
seur-amplificateur avec un temps de réponse non supérieur à 1 seconde
etavec une vit esse de papier variable.
3.11. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de
long, de 0,25 à 0,32 millimètre de diamètre intérieur, recouverte inté-
rieurementde liquide SE-52 ou SE-54 ou équivalent , avec une
épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.
3.12. Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 microli-
tres avec aiguille cémentée.
3.13. Balance de précision ayantune sensibilit é de 1 mg (avec affichage
0.1 mg).
4. RÉACTIFS
4.1. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre,
tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titreminimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à
un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles
de verre opaque bien bouchées.
4.2. Éther éthylique, pour analyses.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 102
▼M19
4.3. Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.
4.4. Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluores-
cence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le
commerce déjà prêtes à l'emploi).
4.5. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2 N: dissoudre 13
grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée,
puis compléter à un litre avec de l'éthanol.
4.6. Benzène, pour chromatographie (5.2.2).4.7. Acétone, pour chromatographie (5.2.2).4.8. Hexane pour chromatographie (5.2.2).
4.9. Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).
4.10. Chloroforme pur, pour analyse.4.11. Solution de référence pour la chromatographie sur plaque: cholestérol
ou phytostérol, solution à 0,5 % dans le chloroforme.
4.12. Dichloro-2'-7' fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est
rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solu-
tion alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.
4.13. Pyridine anhydre, pour chromatographie.
4.14. Hexaméthyldisilazane.4.15. Triméthylchlorosilane.4.16. Solution étalon de triméthylsilyléthers des alcools aliphatiques de C20 à
C28. À préparer au momentde l'emploi à part ir de mélanges d'alcools
purs.
4.17. 1-eicosanol, solution à 0,1 % (m/V) dans le chloroforme (standard
interne).
4.18. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase
gazeuse.
4.19. Gaz auxiliaire: nitrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse.
5. PROCÉDÉ5.1.Préparation de l'insaponifiable
5.1.1. Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microse-
ringue de 500 microlitres, un volume de solution d'1-eicosanol à 0,1 %
dans le chloroforme (4.17) qui contient une quantité d'1-eicosanol qui
corresponde à environ 10 % du contenu en alcools aliphatiques dans
l'aliquote de l'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple,
pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 250 microlitres de la solu-
tion d'1-eicosanol à 0,1 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et
1 500 microlitres s'il s'agit d'huile de grignons d'olive.
Evaporer dans un courant d'azote jusqu'à dessiccation, puis peser exac-
tement 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.
5.1.2. Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium
à 2 N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie
jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique
jusqu'à ce que la saponification se soit produite (la solution devient
limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50
millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant,
débrancher le réfrigérantetrefroidir le ballon à environ 30 ºC.
5.1.3. Transvaser le contenu du ballon, de façon quantitative, dans une
ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillée à
plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter
environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant
environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).
Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillantdans une aut re
ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse,
selon les mêmes modalités, en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres
d'éther éthylique.
Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant,
avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou
méthylique.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 103
▼M19
5.1.4. Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à
l'eau distillée (50 millilitres à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de
l'eau de lavage.
Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et
filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 millilitres
pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités
d'éther éthylique.
5.1.5. Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il n'en reste qu'une petite quantité, puis
porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le
séchage à l'étuve à 100 ºC durant un quart d'heure environ et peser
après refroidissementdans un dessiccat eur.
5.2.Séparation de la fraction alcoolique
5.2.1. Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice
(4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de
potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser agir ensuite; bien sécher
sous hotte aspirante, pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve
à 100 ºC pendantune heure.
Retirer de l'étuve et conserver dans un dessiccateur à chlorure de
calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent
être employées dans les quinze jours).
Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la sépara-
tion de la fraction alcoolique élimine le besoin du traitement de
l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les
composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus
sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des alcools
aliphatiques et terpéniques nettement séparée de la bande des
stérols.
5.2.2. Introduire dans la cuve de développement un mélange hexane-éther
éthylique 65/35 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre (*).
Fermer la cuve à l'aide d'un couvercle approprié etlaisser ainsi pendant
une demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur
s'établisse. Il est possible de fixer sur les surfaces intérieures de la
cuve des bandes de papier filtre qui plongent dans l'éluant: cette précau-
tion permet de réduire d'un tiers environ les temps de migration du
front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.
Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproducti-
bles, le mélange doitêt re changé à chaque essai.
5.2.3. Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le
chloroforme et, avec la microseringue de 100 microlitres, déposer sur
la plaque chromatographique (5.2.1) à 2 centimètres environ d'un bord,
0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et
uniforme possible. Dans l'alignementde la ligne de dépôt , déposer, à
une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de réfé-
rence des alcools aliphatiques (4.11), dans le but d'identifier la bande
des alcools aliphatiques lors du dernier développement.
5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme
décrit au point 5.2.2. La température ambiante doit être maintenue entre
15 et20 ºC. Fermer aussit ôtla cuve avec le couvercle etlaisser éluer
jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord
supérieur de la plaque.
Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer
le solvantdans un courantd'air chaud ou bien en laissantla plaque
sécher sous hotte aspirante pendant un petit moment.
5.2.5. Vaporiser la plaque légèrementetuniformémentavec la solut ion de
dichloro-2'-7' fluorescéine. Identifier la bande des alcools aliphatiques
par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence;
délimiter la bande avec un crayon noir l'ensemble de la bande des
alcools aliphatiques et de la bande immédiatement supérieure qui
correspond aux alcools terpéniques.
Note 4: La précision faite de recueillir l'ensemble de la bande des
alcools aliphatiques et de la bande des alcools terpéniques est
due au faitque dans celle-ci, dans les condit ions de la1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 104
(*) Dans ces cas en particuliers, il faut employer le mélange éluant benzène-acétona 95/5
(v/v) pour obtenir une bonne séparation de bandes.
▼M19
méthode, sont englobées des quantités significatives d'alcools
aliphatiques.
5.2.6. Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone
délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans
l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud,
mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du
vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8), reliée à l'ampoule
filtrante.
Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ
10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole
adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un
volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle
dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en
chauffantlégèrementdans un léger courantd'azot e, reprendre avec
quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes
environ à l'étuve à 105 ºC, puis laisser refroidir au dessiccateur et peser.
Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction alcoolique.
5.3.Préparation des triméthylsilyléthers
5.3.1. Ajouter, dans le tube contenant la fraction alcoolique, le réactif de sily-
lation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-
triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 5) dans une proportion de
50 microlitres par milligramme d'alcools aliphatiques, en évitant toute
absorption d'humidité (note 6).
Note 5: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en
outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le
bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosi-
lane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.
Note 6: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale
et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une
floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont
l'indice de la présence d'humidité ou d'altération du réactif.
Dans ce cas, l'essai doit être répété.
5.3.2. Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète
solubilisation des alcools aliphatiques. Laisser reposer pendant au moins
15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques
minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatogra-
phie en phase gazeuse.
5.4.Analyse par chromatographie en phase gazeuse
5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne
5.4.1.1. Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant
l'extrémité d'entrée à l'injecteur connecté au système de fractionnement
et l'extrémité de sortie au détecteur. Effectuer les contrôles généraux du
complexe de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit
des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système de fractionnement
et du système d'enregistrement, etc.).
5.4.1.2. Si la colonne estut ilisée pour la première fois, il estconseillé de
procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au
travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie
en phase gazeuse et commencer un chauffage graduel jusqu'à atteindre
une température d'au moins 20 ºC supérieure à celle d'exercice (note 7).
Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis porter le
complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux
et de la séparation, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur
électronique, régulation de la température de la chambre pour la
colonne, du détecteur et de l'initiateur etc.) et enregistrer le signal à
une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exé-
cution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être
linéaire, exemptde pic de quelque nat ure que ce soitetne doitpas
présenter de dérive. Une dérive rectiligne négative indique une étan-
chéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive
indique un conditionnement insuffisant de la colonne.
Note 7: La température de conditionnement doit être toujours inférieure
d'au moins 20 ºC à la température maximale prévue pour le
liquide de répartition employé.1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 105
▼M19
5.4.2. Choix des conditions opératoires
5.4.2.1. Les conditions opératoires indicatives sont les suivantes:
— température de la colonne: début isotherme 8 minutes à 180 ºC, puis
programme de 5 ºC par minute jusqu'à 260 ºC puis encore 15
minutes à 260 ºC,
— température de l'évaporateur: 280 ºC,— température du détecteur: 290 ºC,— vitesse linéaire du gaz vecteur: hélium, 20 à 35 centimètres par
seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,
— rapportde division: de 1/50 à 1/100,— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,— vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,— quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de
TMSE.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques
de la colonne etdu chromat ographe en phase gazeuse de façon à
obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:
— le temps de rétention de l'alcool en C26 doit être de 18 ± 5 minutes,
— le pic de l'alcool en C22 doitêt re 80 ± 20 % de l'échelle de fond
pour l'huile d'olive etpour l'huile de semences 40 ± 20 % de
l'échelle de fond.
5.4.2.2. Pour vérifier les conditions exigées ci-dessus, effectuer des injections
répétées avec les échantillons de mélanges des TMSE des alcools et
retoucher les conditions opératoires jusqu'à obtenir les meilleurs résul-
tats.
5.4.2.3. Les paramètres d'intégration des pics doivent être imposés de façon à
obtenir des valeurs correctes pour les pics qui sont pris en considéra-
tion.
5.4.3. Exécution de l'analyse
5.4.3.1. Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane,
aspirer 0,5 microlitre d'air et successivement 0,5 à 1 microlitre de la
solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon
à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la
membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter
rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes
environ.
5.4.3.2. Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des
alcools aliphatiques présents. La ligne de base doit toujours corres-
pondre aux conditions requises (5.4.1.2):
5.4.4. Identification des pics
L'identification des pics individuels est effectuée sur la base des temps
de rétention et par comparaison avec le Mélange des TMSE des alcools
aliphatiques, analysés dans les mêmes conditions.
La figure 1 montre un chromatogramme de la fraction alcoolique d'une
huile d'olive vierge.
5.4.5. Évaluation quantitative
5.4.5.1. Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'1-eicosanol
etdes alcools aliphat iques C
22,C24,C26etC28.
5.4.5.2. Calculer le contenu en chaque alcool aliphatique individuel, en milli-
grammes pour 1 000 grammes de matière grasse, comme suit:
où:
Ax= aire du pic de l'alcools x
As= aire du pic d'1-eicosanol
ms=. poids d'1-eicosanol ajouté, en milligrammes1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 106
▼M19
m = poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en
grammes.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Rapporter les contenus en alcools aliphatiques simples en milligrammes
pour 1 000 grammes de matière grasse et leur somme comme «alcools
aliphatiques totaux».1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 107
▼M19
APPENDICE
Détermination de la vitesse linéaire du gaz
Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires
normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer
le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de
l'injection et celui de la sortie du pic (tM).
La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la
longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.
Figure 1 — Chromatogramme de la fraction alcoolique d'une huile vierge
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol4 = Tétracosanol
5 = Pentacosanol
6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol1991R2568 — FR — 01.11.2003 — 020.001 — 108