1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 1
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►BRÈGLEMENT (CEE) No2568/91 DE LA COMMISSION
du 11 juillet 1991
►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux
méthodes d'analyse y afférentes ◄
(JO L 248 du 5.9.1991, p. 1)
Modifié par:
Journal officiel
nopage date
►M1 Règlement(CEE) no3682/91 de la Commission du 17 décembre 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2 Règlement(CEE) no1429/92 de la Commission du 26 mai 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Règlement(CEE) no1683/92 de la Commission du 29 juin 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4 Règlement(CEE) no1996/92 de la Commission du 15 juillet1992 L 199 18 18.7.1992
Rectifié par:
►C1 Rectificatif, JO L 347 du 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
▼B
RÈGLEMENT (CEE) No2568/91 DE LA COMMISSION
du 11 juillet 1991
►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de
grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,
vu le règlementno136/66/CEE du Conseil, du 22 septembre 1966,
portant établissement d'une organisation commune des marchés dans
le secteur des matières grasses (1), modifié en dernier lieu par le règle-
ment(CEE) no3577/90 (2), et notamment son article 35 bis,
considérantque l'annexe du règlementno136/66/CEE prévoitles déno-
minations et définitions des huiles d'olive et des huiles de grignons
d'olive commercialisées à l'intérieur de chaque État membre ainsi que
dans les échanges intracommunautaires et avec les pays tiers;
considérant que, pour pouvoir distinguer les divers types d'huile, il y a
lieu de définir les caractéristiques physico-chimiques de chacun d'euxainsi que les caractéristiques organoleptiques des huiles vierges, demanière à assurer la pureté et la qualité des produits en cause, sans
préjudice d'autres dispositions existant en la matière;
considérantqu'il convientde dét erminer de manière uniforme dans
toute la Communauté la présence des caractéristiques des différentstypes d'huile; que, à cette fin, il y a lieu d'établir les méthodes commu-nautaires d'analyse chimique et d'appréciation organoleptique; qu'il
convient cependant de permettre, pendant une période transitoire, l'uti-
lisation d'autres méthodes d'analyse appliquées dans les États membres,tout en prévoyant que, en cas de divergence des résultats, ceux obtenusselon la méthode commune soient déterminants;
considérant que la définition des caractéristiques physico-chimiques des
huiles d'olives et des méthodes d'analyse entraîne l'adaptation des notes
complémentaires du chapitre 15 de la nomenclature combinée;
considérant que la méthode d'évaluation des caractéristiques organolep-
tiques des huiles vierges comporte la création de jurys de dégustateurssélectionnés et entraînés; qu'il convient, dès lors, de prévoir le délainécessaire pour la mise en place d'une telle structure; que, comptetenu des difficultés que rencontreront certains États membres pour la
constitution des jurys de dégustateurs, il convient d'autoriser le recours
aux jurys existant dans d'autres États membres;
considérant que, pour assurer le fonctionnement correct du système des
prélèvements applicables à l'importation de grignons d'olive, il convientde prévoir une méthode unique pour la détermination de la teneur en
huile de ces produits;
considérantque, pour ne pas causer un préjudice au commerce, il est
opportun de prévoir une période limitée pour l'écoulement de l'huileconditionnée avant l'entrée en vigueur du présent règlement;
considérantqu'il y a lieu d'abroger le règlement(CEE) n
o1058/77 de la
Commission (3), modifié en dernier lieu par le règlement(CEE) no1858/
88 (4);
considérant que le comité de gestion des matières grasses n'a pas émis
d'avis dans le délai imparti par son président,1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 2
(1)J O no172 du 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)J O noL 353 du 17. 12. 1990, p. 23.
(3)J O noL 128 du 24. 5. 1977, p. 6.
(4)J O noL 166 du 1. 7. 1988, p. 10.
▼B
A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:
Article premier
1. Sontconsidérées comme huiles d'olive vierges au sens du point1
a), b) etc) de l'annexe du règlementno136/66/CEE, les huiles dontles
caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées à
l'annexe I points 1, 2 et 3 du présent règlement.
2. Estconsidérée comme huile d'olive vierge lampant e au sens du
point1 d) de l'annexe du règlementno136/66/CEE, l'huile dontles
caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 4
du présentrèglement .
3. Estconsidérée comme huile d'olive raffinée au sens du point2 de
l'annexe du règlementno136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques
sontconformes à celles indiquées à l'annexe I point5 du présentrègle-
ment.
4. Estconsidérée comme huile d'olive au sens du point3 de l'annexe
du règlementno136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont
conformes à celles indiquées à l'annexe I point6 du présentrèglement .
5. Estconsidérée comme huile de grignons d'olive brut e au sens du
point4 de l'annexe du règlementno136/66/CEE, l'huile dontles carac-
téristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 7 du
présentrèglement .
6. Estconsidérée comme huile de grignons d'olive raffinée au sens
du point5 de l'annexe du règlementno136/66/CEE, l'huile dontles
caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I point 8
du présentrèglement .
7. Estconsidérée comme huile de grignons d'olive au sens du point
6 de l'annexe du règlementno136/66/CEE, l'huile dont les caractéristi-
ques sontconformes à celles indiquées à l'annexe I point9 du présentrèglement.
Article 2
1. La détermination des caractéristiques des huiles prévues à
l'annexe I est effectuée selon les méthodes d'analyse suivantes:
— pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcen-
tage d'acide oléique, la méthode reprise à l'annexe II,
— pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode reprise à
l'annexe III,
— pour la détermination des alcools aliphatiques, la méthode reprise à
l'annexe IV,
— pour la détermination du contenu en stérols, la méthode reprise à
l'annexe V,
— pour la détermination de l'érythrodiol et de l'uvaol, la méthode
reprise à l'annexe VI,
— pour la détermination des acides gras saturés en position 2 du
triglycéride, la méthode reprise à l'annexe VII,
— pour la détermination de la teneur en trilinoléine, la méthode reprise
à l'annexe VIII,
— pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode reprise à l'annexe
IX,
— pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode
reprise aux annexes X «A» etX «B».
— pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode
reprise à l'annexe XI,
— pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques des huiles
d'olive vierges, la méthode reprise à l'annexe XII, appliquée confor-mémentau paragraphe 2,
— pour la preuve du raffinage, la méthode reprise à l'annexe XIII.
2.►
M3L'analyste expert en analyse sensorielle ou assisté
d'experts ◄, procède à l'appréciation des caractéristiques organolepti-
ques selon la procédure décrite dans la fiche de dégustation visée à1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 3
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l'annexe XII. Au cas où l'analyste détermine les caractéristiques orga-
noleptiques différentes de celles résultant de la dénomination duproduit, il est tenu de faire examiner l'échantillon par un jury de dégus-
tateurs conformément aux dispositions de l'annexe XII. Toute analyse
de révision est effectuée par le jury de dégustateurs conformément àces dispositions.
Pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques lors des opéra-
tions liées au régime d'intervention, le jury de dégustateurs procède àcette appréciation conformément à l'annexe XII.
Article 3
Jusqu'au 31 octobre 1992, l'introduction des méthodes d'analyse
prévues à l'article 2 ne fait pas obstacle à ce que les États membres
utilisent d'autres méthodes éprouvées et scientifiquement valables, à
condition que la libre circulation des produits reconnus conformes à laréglementation en application des méthodes communautaires n'en soitpas entravée. Les États membres concernés communiquent ces autresméthodes à la Commission avant de les utiliser.
Dans le cas où l'une de ces autres méthodes donne un résultat différent
de celui déterminé par la méthode communautaire, le résultat obtenu enapplication de la méthode commune est retenu.
Article 4
1. Aux fins de l'appréciation des caractéristiques organoleptiques, les
États membres instituent des jurys de dégustateurs sélectionnés et
entraînés selon les règles prévues par la méthode décrite à l'annexe XII.
2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer
un jury de dégustateurs sur son territoire, il pourra recourir à un jury de
dégustateurs opérant dans un autre État membre.
Article 5
Les notes complémentaires 2, 3 et 4 du chapitre 15 de la nomenclature
combinée sont remplacées respectivement par les notes complémen-taires 2, 3 et 4 figurant à l'annexe XIV du présent règlement.
Article 6
1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extrac-
tion de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 est
déterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.
2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcen-
tage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.
Article 7
Les dispositions communautaires concernant la présence de substances
indésirables autres que celles visées à l'annexe XI sont applicables.
Article 8
1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures
prises pour l'application du présent règlement.
2. Les États membres communiquent à la Commission, au début de
chaque semestre, un état récapitulatif des données analytiques desdéterminations effectuées au cours du semestre précédent.
Ces résultats sont examinés par le comité de gestion des matières
grasses selon la procédure prévue à l'article 39 du règlement n
o136/
66/CEE.
Article 9
Le règlement(CEE) no1058/77 estabrogé.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 4
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Article 10
1. Le présentrèglementent re en vigueur le jour suivantcelui de sa
publication au Journal officiel des Communautés européennes . Toute-
fois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partir
du►M11ernovembre 1992 ◄, sauf en ce qui concerne les opéra-
tions liées à l'intervention.
2. Le présentrèglementne s'applique pas aux huiles d'olive etde
grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur duprésentrèglementetcommercialisées jusqu'au 31 oct obre 1992.
Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directe-
ment applicable dans tout État membre.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 5
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ANNEXES
Sommaire
Annexe I: Caractéristiques des huiles d'olive …
Annexe II: Détermination des acides gras libres …
Annexe III: Détermination de l'indice de peroxyde …Annexe IV: Détermination du contenu en alcools aliphatiques au moyen
de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capil-
laire …
Annexe V: Détermination de la composition et du contenu en stérols au
moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec
colonne capillaire …
Annexe VI: Détermination de la teneur en érythrodiol et en uvaol …Annexe VII: Détermination des acides gras saturés en position 2 des
triglycérides …
Annexe VIII: Détermination de la teneur en trilinoléine …Annexe IX: Analyse spectrophotométrique …
Annexe X «A»: Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters
méthyliques d'acides gras …
Annexe X «B»: Préparation des esters méthyliques d'acides gras …
Annexe XI: Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils
dans l'huile d'olive …
Annexe XII: Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge …
Annexe XIII: Preuve du raffinage …Annexe XIV: Notes complémentaires 2, 3 et 4 du chapitre 15 de la nomen-
clature combinée …
Annexe XV: Teneur en huile des grignons d'olive …
Annexe XVI: Détermination de l'indice d'iode …1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 6
ANNEXE I
CARACTÉRISTIQUESDES HUILES D'OLIVE
CatégorieAcidité
(%)Indice de
peroxyde
(mEq/O2/
kg)Solvants
halógénés
(mg/kg)
(1)Alcools
aliphati-
ques
(mg/kg)Acides
saturés en
position 2
du triglycé-
ride
(%)Erythrodiol
etuvaol
(%)Trilino-
léine
(%)Cholestérol
(%)Brassicas-
térol
(%)Campes-
térol
(%)Stigmas-
térol
(%)Beta-sitos-
térol
(%)
(2)Delta-7-
Stigmas-
térol
(%)Stérols
totaux
(mg/kg)
1. Huile d'olive vierge
extra M 1,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
2. Huile d'olive vierge M 2,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0003. Huile d'olive vierge
courante M 3,3 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
4. Huile d'olive vierge
lampante > 3,3 > 20 > 0,20 M 400 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1 000
5. Huile d'olive
raffinée M 0,5 M 10 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
6. Huile d'olive M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0007. Huile de grignons
d'olive brute m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2 500
8. Huile de grignons
d'olive raffinée M 0,5 M 10 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
9. Huile de grignons
d'olive M 1,5 M 15 M 0,20 — M 2,0 > 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
M = maximum, m = minimum.
(1) Limite maximale totale pour les composés détectés par détecteur à capture d'électrons. Pour les composants détectés individuellement, la limite m aximale estde 0,10 mg/kg.
(2) Delta-5-23-Stigmastadiénol + Clerostérol + Betasitostérol + Sitostanol + Delta-5-Avenastérol + Delta-5-24-Stigmastadiénol.
Note: Il suffit qu'une seule caractéristique ne soit pas conforme aux valeurs indiquées pour que l'huile soit changée de classe ou déclarée non conforme qua ntà sa puret é.▼B1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 7
CatégorieTeneur en acidesSomme des
isomères
transoléi-
ques
%Somme des
isomères
translinoléi-
ques+transl-
inoléniques
%K232K270K270après
alumine +Delta K Panel test
Myristique
%Linolénique
%Arachidique
%Éicose-
noïque
%Béhénique
%Lignocé-
rique
%
1. Huile d'olive vierge
extra M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,40 M 0,20 M 0,10 M 0,01 ≥6,5
2. Huile d'olive vierge M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥5,5
3. Huile d'olive vierge
courante M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥3,5
4. Huile d'olive vierge
lampante M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,10 < 0,10 M 3,70 > 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Huile d'olive raffinée M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —6. Huile d'olive M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —
7. Huile de grignons
d'olive brute M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,10 —————
8. Huile de grignons
d'olive raffinée M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Huile de grignons
d'olive M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —▼M21991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 8
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ANNEXE II
DÉTERMINATIONDES ACIDESGRAS LIBRES
1. OBJET
Détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive. La teneur en
acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée conventionnellement.
1.1.Principe
Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis
titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution éthanolique
d'hydroxyde de potassium.
1.2.Réactifs
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau
utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.
1.2.1. Oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume.
Note: L'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des
peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions
particulières.
Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydro-
xyde de potassium (1.2.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de
phénolphtaléine (1.2.3) pour 100 millilitres de mélange.
Note: S'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de
solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si néces-
saire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.
1.2.2. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique titrée c(KOH) - 0,1 mole
par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) - 0,5 mole par litre environ.
La concentration exacte de la solution éthanolique d'hydroxyde de potas-
sium doit être connue et vérifiée immédiatement avant l'emploi. Utiliser
une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans
un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solu-
tion doit être incolore ou jaune paille.
Note: Une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium peut être
préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure
à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol avec 8 grammes
d'hydroxyde de potassium et 0,5 gramme de rognures d'aluminium.
Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité
requise d'hydroxyde de potassium. Laisser reposer durant plusieurs
jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbo-
nate de potassium.
La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon
suivante. À 1 000 millilitres d'éthanol, ajouter 4 millilitres de buty-
lite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques
jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité
requise d'hydroxyde de potassium. Cette solution est prête pour
l'emploi.
1.2.3. Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 %
(V/V) ou bleu alcalin (dans le cas de corps gras fortement coloré) solu-
tion à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V).
1.3.Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
1.3.1. Balance analytique
1.3.2. Fiole conique de 250 millilitres de capacité
1.3.3. Burette de 10 millilitres de capacité, graduée en 0,05 millilitre.
1.4.Mode opératoire
1.4.1. Préparation de l'échantillon pour essai
La détermination est effectuée sur l'échantillon filtré. Si la teneur globale
en humidité et en impuretés est inférieure à 1 %, la détermination est
effectuée sur l'échantillon tel quel.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 9
▼B
1.4.2. Prise d'essai
Prélever une prise d'essai, selon l'indice d'acide présumé, d'après les indi-
cations du tableau suivant.
Indice d'acide présuméMasse de la prise d'essai
(en g)Précision de la pesée de
la prise d'essai
(en g)
< 1 20 0,05
1 à 4 10 0,024 à 15 2,5 0,01
15 à 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Peser la prise d'essai dans la fiole conique (1.3.2).
1.4.3. Détermination
Dissoudre la prise d'essai (4.5.2) dans 50 à 150 millilitres du mélange
oxyde diéthylique/éthanol (1.2.1), préalablement neutralisé.
Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole
par litre (1.2.2) (voir note 2) jusqu'à virage de l'indicateur (coloration rose
de la phénolpthaléine persistant durant au moins 10 secondes).
Note 1: La solution éthanolique titrée d'hydroxyde de potassium (1.2.2)
peut être remplacée par une solution aqueuse d'hydroxyde de
potassium ou de sodium lorsque le volume d'eau introduit
n'entraîne pas une séparation de phases.
Note 2: Si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium à
0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à
0,5 mole par litre.
Note 3: Si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une
quantité suffisante du mélange de solvants (1.2.1) pour donner
une solution claire.
1.5.Expression de l'acidité en pourcentage de l'acide oléique
L'acidité, exprimée en pourcentage en poids, est égale à:
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
où:
V: volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium
utilisée;
c: concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée
d'hydroxyde de potassium utilisée;
M: poids molaire, en grammes par mole, de l'acide adopté pour
l'expression du résultat (= 282);
m: poids en grammes, de la prise d'essai.
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux détermina-
tions.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 10
▼B
ANNEXE III
DÉTERMINATIONDE L'INDICE DE PEROXYDE
1. OBJET
La présente norme décrit une méthode de détermination de l'indice de
peroxyde dans les huiles etmat ières grasses.
2. CHAMP D'APPLICATION
La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses animales et
végétales.
3. DÉFINITION
L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon
(exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent
l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.
4. PRINCIPE
La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme
est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré
avec une solution de thiosulfate de sodium.
5. APPAREILLAGE
Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances
oxydantes ou réductrices.
Nota bene: ne pas graisser les surfaces rodées.
5.1. Cuiller en verre de 3 millilitres.
5.2. Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au
préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence,
dioxyde de carbone).
5.3. Burette de 25 ou 50 millilitres avec graduations de 0,1 millilitre.
6. RÉACTIFS
6.1. Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été
éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).
6.2. Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier
ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz sec et pur).
6.3. Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente,
exempte d'iode et d'iodates.
6.4. Solution aqueuse de thiosulfate de sodium 0,01 ou 0,002 N, soigneusement
normalisée juste avant l'emploi.
6.5. Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment
préparée à partir d'amidon naturel soluble.
7. ÉCHANTILLON
Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière,
conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entière-
mentetfermés hermét iquementà l'aide de bouchons de liège ou de verre
rodé.
8. MODE OPÉRATOIRE
L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou arti-
ficielle. Dans une cuiller en verre (5.1) ou, à défaut, dans une fiole (5.2),
peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le
tableau ci-après en fonction de l'indice de péroxyde prévu.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 11
▼B
Indice de peroxyde prévu
(en meq 02/kg)Poids de la prise d'essai
(en g)
de 0 à 12 de 5,0 à 2,0
de 12 à 20 de 2,0 à 1,2de 20 à 30 de 1,2 à 0,8de 30 à 50 de 0,8 à 0,5
de 50 à 90 de 0,5 à 0,3
Déboucher une fiole (5.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise
d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (6.1). Dissoudre rapidement la
prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (6.2) puis 1
millilitre de solution d'iodure de potassium (6.3). Remettre le bouchon rapi-
dement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5
minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 ºC.
Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la
solution de thiosulfate de sodium (6.4) (solution 0,002 N, si les indices
prévus sontinférieurs à 12, et0,001 N, s'ils sontsupérieurs à 12) en agit ant
vigoureusementeten employantla solut ion d'amidon (6.5) comme indica-
teur.
Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.
Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier exède
0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium (6.4) 0,001 N, remplacer
les réactifs impurs.
9. EXPRESSION DES RÉSULTATS
L'indice de péroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par
kilogramme, estfourni par la formule:
IP¼
V/C2T/C21 000
m
où:
V: = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium norma-
lisée (6.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de
l'essai à blanc;
T: = facteur de normalité exact de la solution de thiosulfate de sodium
(6.4) utilisée;
m: = poids (en grammes) de la prise d'essai.
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 12
▼B
ANNEXE IV
DÉTERMINATION DU CONTENU EN ALCOOLS ALIPHATIQUES AU
MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC
COLONNE CAPILLAIRE
1. OBJET
La méthode décrit un procédé de détermination du contenu en alcools
aliphatiques, simples et totaux, des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse, additionnée de 1-eicosanol comme standard interne,
est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans
l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La
fraction des alcools est séparée de l'extrait insaponifiable par chromato-
graphie sur plaque de gel de silice basique; les alcools récupérés dans le
gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par
chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.
3. APPAREILLAGE
3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts
rodés.
3.2. Ampoule à décanter de 500 millilitres.
3.3. Ballons de 250 millilitres.
3.4. Équipementcompletpour chromat ographie en phase solide, avec
plaques de verre de 20 × 20 centimètres.
3.5. Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.
3.6. Microseringues de 100 et500 microlit res.
3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40
micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres
de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout
rodé mâle 12/21.
3.8. Fiole à vide de 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable
è l'ampoule filtrante (3.7).
3.9. Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.
3.10. Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec
colonne capillaire, équipé d'un système de fractionnement, constitué de:
3.10.1. Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la
température désirée avec une précision d'environ 1º C
3.10.2. Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en
verre persilanisé
3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur
3.10.4. Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertis-
seur-amplificateur avec un temps de réponse non supérieur à 1 seconde
etavec une vit esse de papier variable.
3.11. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de
long, de 0,25 à 0,32 millimètre de diamètre intérieur, recouverte inté-
rieurementde liquide SE-52 ou SE-54 ou équivalent , avec une
épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.
3.12. Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 microli-
tres avec aiguille cémentée.
4. RÉACTIFS
4.1. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre,
tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre
minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à
un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles
de verre opaque bien bouchées.
4.2. Éther éthylique, pour analyses.
4.3. Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 13
▼B
4.4. Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluores-
cence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le
commerce déjà prêtes à l'emploi).
4.5. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2 N: dissoudre 13
grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée,
puis compléter à un litre avec de l'éthanol.
4.6. Benzène, pour chromatographie (5.2.2).
4.7. Acétone, pour chromatographie (5.2.2).
4.8. Hexane pour chromatographie (5.2.2).4.9. Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).
4.10. Chloroforme pur, pour analyse.
4.11. Solution de refroidissement pour la chromatographie sur plaque: choles-
térol ou phytostérol, solution à 0,5 % dans le chloroforme.
4.12. Dichloro-2 ′-7′fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est
rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solu-
tion alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.
4.13. Pyridine anhydre, pour chromatographie.4.14. Hexaméthyldisilazane.
4.15. Triméthylchlorosilane.
4.16. Solution échantillon des triméthylsilyléthers des alcools aliphatiques de
C
20àC28. À préparer au momentde l'emploi des mélanges d'alcools
purs.
4.17. l-eicosanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard
interne).
4.18. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase
gazeuse.
4.19. Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en
phase gazeuse.
5. PROCÉDÉ
5.1. Préparation de l'insaponifiable5.1.1. Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microse-
ringue de 500 microlitres, un volume de solution d'1-eicosanol à 0,1 %
dans le chloroforme (4.17) qui contient une quantité d'1-eicosanol qui
corresponde à environ 10 % du contenu en alcools aliphatiques dans
l'aliquote de l'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple,
pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 250 microlitres de la solu-
tion d'1-eicosanol à 0,1 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive ou
d'huile de semences et1 500 microlit res s'il s'agitd'huile de grignons
d'olive.
Évaporer dans un courant d'azote jusqu'à dessication, puis peser exacte-
ment 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.
5.1.2. Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d' ►
C1hydroxyde de
potassium 2 N ◄, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer
au bain-marie jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation
énergique jusqu'à ce que la saponification se soit produite (la solution
devient limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis
ajouter 50 millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du
réfrigérant, débrancher le réfrigérant et refroidir le ballon à environ
30º C.
5.1.3. Transvaser le contenu du ballon, de façon quantitative, dans une
ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillée à
plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter
environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant
environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).
Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillantdans une aut re
ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse,
selon les mêmes modalités, en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres
d'éther éthylique.
Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant,
avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou
méthylique.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 14
▼B
5.1.4. Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à
l'eau distillée (50 millilitres à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de
l'eau de lavage.
Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et
filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 millilitres
pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités
d'éther éthylique.
5.1.5. Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il n'en reste qu'une petite quantité, puis
porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le
séchage à l'étuve à 100º C durant un quart d'heure environ et peser
après refroidissementdans un dessicat eur.
5.2. Séparation de la fraction alcoolique5.2.1. Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice
(4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de
potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser agir ensuite, bien fermé,
pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100º C pendant
une heure.
Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de
calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent
être employées dans les quinze jours).
Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la sépara-
tion de la fraction alcoolique élimine le besoin du traitement de
l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les
composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus
sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des alcools
aliphatiques et terpéniques nettement séparée de la bande des
stérols.
5.2.2. Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone
95/5 (V/V) jusquà une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser à
la place un mélange hexane-éther éthylique 65/35 (V/V). Fermer le
couvercle à l'aide d'un couvercle approprié etlaisser ainsi pendantunedemi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'éta-
blisse. Il estpossible de fixer sur les surfaces int érieures de la cuve des
bandes de papier filtre qui plongent dans l'éluant: cette précaution
permet de réduire d'un tiers environ les temps de migration du front
du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.
Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproducti-
bles, le mélange doitêt re changé à chaque essai.
5.2.3. Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le
chloroforme et, avec la microseringue de 100 microlitres, déposer sur
la plaque chromatographique (5.2.1) à 2 centimètres environ d'un bord,
0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et
uniforme possible. Dans l'alignementde la ligne de dépôt , déposer, à
une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de réfé-
rence des alcools aliphatiques (4.11), dans le but d'identifier la bande
des alcools aliphatiques lors du dernier développement.
5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme
décrit au point 5.2.2. La température ambiante doit être maintenue entre
15 et20º C. Fermer aussit ôtla chambre avec le couvercle etlaisser
éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre
du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve
de développementetfaire évaporer le solvantdans un courantd'air
chaud ou bien en laissant la plaque enfermée pendant un petit moment.
5.2.5. Vaporiser la plaque légèrementetuniformémentavec la solut ion de
dichloro-2 ′-7′fluorescéine. Identifier la bande des alcools aliphatiques
par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence;
délimiter la bande avec un crayon noir l'ensemble de la bande des
alcools aliphatiques et de la bande immédiatement supérieure qui
correspond aux alcools terpéniques.
Note 4: La précision faite de recueillir l'ensemble de la bande des
alcools aliphatiques et de la bande des alcools terpéniques est
due au faitque dans celle-ci, dans les condit ions de la
méthode, sont englobées des quantités significatives d'alcools
aliphatiques.
5.2.6. Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone
délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans
l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud,
mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 15
▼B
vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule
filtrante.
Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ
10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole
adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un
volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle
dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en
chauffantlégèrementdans un léger courantd'azot e, reprendre avec
quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes
environ à l'étuve à 105º C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser.
Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction alcoolique.
5.3. Préparation des triméthylsilyléthers
5.3.1. Ajouter, dans le tube contenant la fraction alcoolique, le réactif de sily-
lation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-
triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 5) dans une proportion de
50 microlitres par milligramme d'alcools aliphatiques, en évitant toute
absorption d'humidité (note 6).
Note 5: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en
outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le
bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosi-
lane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.
5.3.2. Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète
solubilisation des alcools aliphatiques. Laisser reposer pendant au moins
15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques
minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatogra-
phie en phase gazeuse.
Note 6: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale
et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une
floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont
l'indice de la présence d'humidité ou d'altération du réactif.
Dans ce cas, l'essai doit être répété.
5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse.
5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne
5.4.1.1. Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant
l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de fractionne-
ment et l'extrémité de sortie au détecteur.
Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en
phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur,
efficacité du système de fractionnement et du système d'enregistrement,
etc.).
5.4.1.2. Si la colonne estut ilisée pour la première fois, il estconseillé de
procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au
travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie
en phase gazeuse etcommencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre
une température d'au moins 20º C supérieure à celle d'exercice (note 7).
Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis porter le
complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux
et de la séparation, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur
électronique, régulation de la température de la chambre pour la
colonne, du détecteur et de l'initiateur etc.) et enregistrer le signal à
une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exé-
cution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être
linéaire, exemptde pic de quelque nat ure que ce soitetne doitpas
présenter de dérive.
Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des
connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionne-
mentinsuffisantde la colonne.
Note 7: La température de conditionnement doit être toujours inférieure
d'au moins 20º C à la température maximale prévue pour le
liquide de répartition employé.
5.4.2. Choix des conditions opératoires5.4.2.1. Les conditions opératoires maximales sont les suivantes:
— température de la colonne: début isotherme 8 minutes à 180º C, puis
programme de 5º C par minute jusqu'à 260º C puis encore 15
minutes à 260º C,
— température de l'évaporateur: 280º C,1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 16
▼B
— température du détecteur: 290º C,
— vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par
seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,
—►C1rapportde division ◄: de 1/50 à 1/100,
— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,— vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,— quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de
TMSE.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques
de la colonne etdu chromat ographe en phase gazeuse de façon à
obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:
— le temps de rétention de l'alcool en C
26doit être de 18 ± 5 minutes,
— le pic de l'alcool en C22doitêt re 80 ± 20 % de l'échelle de fond et
pour l'huile de semences 40 ± 20 % de l'échelle de fond.
5.4.2.2. Pour vérifier les conditions exigées ci-dessus, effectuer des injections
répétées avec les échantillons de mélanges des TMSE des alcools et
retoucher les conditions opératoires jusqu'à obtenir les meilleurs résul-
tats.
5.4.2.3. Les paramètres d'intégration des pics doivent être imposés de façon à
obtenir des valeurs correctes pour les pics qui sont pris en considéra-
tion.
5.4.3. Exécution de l'analyse5.4.3.1. Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane,
aspirer 0,5 microlit re d'air etsuccessivement0,5 et1 microlit re de la
solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon
à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la
membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter
rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes
environ.
5.4.3.2. Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des
alcools aliphatiques présents.
La ligne de base doit toujours correspondre aux conditions requises
(5.4.1.2).
5.4.4. Identification des pics
L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de
rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des alcools
aliphatiques, analysés dans les mêmes conditions.
La figure 1 montre un chromatogramme de la fraction alcoolique d'une
huile d'olive vierge.
5.4.5. Évaluation quantitative5.4.5.1. Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'1-eicosanol
etdes alcools aliphat iques de C
22àC28.
5.4.5.2. Calculer le contenu en chaque alcool aliphatique simple, en milli-
grammes par 100 grammes de matière grasse, comme suit:
alcool x =Ax·ms· 100
As·m
où:
Ax= aire du pic de l'alcools x, en millimètres carrés;
As= aire du pic d'l-eicosanol, en millimètres carrés;
ms= poids d'l-eicosanol ajouté, en milligrammes;
m = poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en
grammes.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Rapporter les contenus en alcools aliphatiques simples en milligrammes
par 100 grammes de matière grasse et leur somme comme «alcools
aliphatiques totaux».1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 17
▼B
APPENDICE
Détermination de la vitesse linéaire du gaz
Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires
normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer
le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de
l'injection et celui de la sortie du pic (tM).
La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la
longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.
Figure 1:Chromatogramme de la fraction alcoolique d'une huile vierge
1 = Eicosanol
2 = Docosanol3 = Tricosanol
4 = Tétracosanol
5 = Pentacosanol6 = Hexacosanol
7 = Heptacosanol
8 = Octacosanol1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 18
▼B
ANNEXE V
DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION ET DU CONTENU EN
STÉROLS AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE
1. OBJET
La méthode décrit le procédé de détermination du contenu en stérols,
simples et totaux, des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse, additionnée d' α-cholestanol comme standard interne,
est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans
l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La
fraction stérolique est séparée de l'extrait insaponifiable par chromato-
graphie sur plaque de gel de silice basique; les stérols récupérés dans
le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par
chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.
3. APPAREILLAGE
3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts
rodés.
3.2. ►C1Ampoules ◄à décanter de 500 millilitres.
3.3. Ballons de 250 millilitres.3.4. Équipementcompletpour chromat ographie en phase solide, avec
plaques de verre de 20 × 20 centimètres.
3.5. Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.
3.6. Microseringues de 100 et500 microlit res.
3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40
micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres
de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout
rodé mâle 12/21.
3.8. Fiole à vide 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable à
l'ampoule filtrante (3.7).
3.9. Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.3.10. Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec
colonne capillaire, doté d'un système de séparation, constitué de:
3.10.1. Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la
température désirée avec une précision d'environ 1º C
3.10.2. Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en
verre persilanisé
3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur
3.10.4. Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertis-
seur-amplificateur.
3.11. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de
long, de 0,25 à 0,32 millimètres de diamètre intérieur, recouverte inté-
rieurementde liquide. SE-52 ou SE-54 ou équivalent , avec une
épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.
3.12. Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10
►
C1microlitres ◄avec aiguille cémentée.
4. RÉACTIFS
4.1. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre,
tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre
minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à
un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles
de verre opaque bien bouchées (éthanol 95 % V/V).
4.2. Éther éthylique pur, pour analyses.4.3. Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 19
▼B
4.4. Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluores-
cence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le
commerce déjà prêtes à l'emploi).
4.5. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2N: dissoudre 13
grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée,
puis compléter à un litre avec de l'éthanol.
4.6. Benzène, pour chromatographie (5.2.2).
4.7. Acétone, pour chromatographie (5.2.2).
4.8. Hexane pour chromatographie (5.2.2).4.9. Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).
4.10. Chloroforme pur, pour analyses.
4.11. ►
C1Solution de référence ◄pour la chromatographie sur plaque:
cholestérol ou phytostérol, solution à 0,5 % dans le chloroforme.
4.12. Dichloro-2 ′-7′fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est
rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solu-
tion alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.
4.13. Pyridine anhydre, pour chromatographie.4.14. Hexaméthyldisilazane.
4.15. Triméthylchlorosilane.
4.16. Solution échantillon des triméthylsilyléthers des stérols: à préparer au
moment de l'emploi à partir des stérols tirés des huiles qui les conte-
naient.
4.17. α-cholestanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard
interne).
4.18. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase
gazeuse.
4.19. Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en
phase gazeuse.
5. PROCÉDÉ
5.1. Préparation de l'insaponifiable5.1.1. Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microse-
ringue de 500 microlitres, un volume de solution d' α-cholestanol à
0,2 % dans le chloroforme (4.17) qui contienne une quantité d' α-choles-
tanol correspondant à environ 10 % des stérols contenus dans l'aliquote
d'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5
grammes d'échantillon, il faut ajouter 500 microgrammes de la solution
d'α-cholestane à 0,2 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et 1 500
microlitres s'il s'agit d'huile de semences ou d'huile de grignons d'olive.
Évaporer dans un courant d'azote jusquà dessication, puis peser exacte-
ment 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon.
Dans le cas d'huiles et de graisses animales ou végétales qui contien-
nent des quantités considérables de cholestérol, un pic ayant un temps
de rétention identique à celui du cholestanol peut être présent. Dans de
tels cas, il faut analyser la fraction stérolique en double, avec et sans
standard interne.
5.1.2. Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium
à 2N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie
jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique
jusqu'à que la saponification se soit produite (la solution devient
limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50
millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant,
débrancher le réfrigérantetrefroidir le ballon à environ 30º C.
5.1.3. Transvaser le contenu du ballon de façon quantitative, dans une
ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillé à
plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter
environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant
environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1).
Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillantdans une aut re
ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse,
selon les mêmes modalités en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres
d'éther éthylique.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 20
▼B
Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant,
avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou
méthylique.
5.1.4. Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à
l'eau distillée (50 ml à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de
lavage.
Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et
filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 ml pesé
au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther
éthylique.
5.1.5. Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il en reste de petites quantités, puis porter
à sec sous un léger vide ou dans un courantd'azot e, parfaire le séchage
à l'étuve à 100º C durant un quart d'heure environ et peser après refroi-
dissementdans un dessicat eur.
5.2. Séparation de la fraction stérolique.5.2.1. Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice
(4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de
potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser les ensuite enfermées sous
hotte pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100º C
pendantune heure.
Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de
calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent
être employées dans les quinze jours).
Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la sépara-
tion de la fraction stérolique élimine le besoin du traitement de
l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les
composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus
sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des stérols
nettement séparée de la bande des alcools aliphatiques et terpé-
niques.
5.2.2. Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone
95/5 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser
à la place un mélange hexane-éther éthylique 55/35 (V/V). Fermer la
cuve à l'aide d'une couvercle approprié etlaisser ainsi pendantune
demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'éta-
blisse. Il estpossible de fixer sur les surfaces int érieures de la cuve des
bandes de papier filtré qui plongent dans l'éluant: cette précaution
permet de réduire d'un tiers environ le temps de migration du front du
liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.
Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproducti-
bles, le mélange doitêt re chargé à chaque essai.
5.2.3. Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le
chloroforme et, avec la microseringue de ►
C1100 microlitres ◄,
déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1), à 2 centimètres
environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne
continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la
ligne de dépôt, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 micro-
litres de la solution de référence des stérols (4.11), dans le but
d'identifier la bande des stérols lors du dernier développement.
5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme
décrit en (5.2.2). La température ambiante doit être maintenue entre 15
et20º C. Fermer aussit ôtla chambre avec le couvercle etlaisser éluer
jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord
supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de dévelop-
pementetfaire évaporer le solvantdans un courantd'air chaud ou bien
en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment.
5.2.5. Vaporiser légèrementla plaque etde façon uniforme avec la solut ion de
dichloro-22-72fluorescéine. Identifier la bande des stérols par aligne-
ment avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter labande avec un crayon noir le long des bords de la fluorescence.
5.2.6. Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone
délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans
l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud,
mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du
vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule
filtrante.
Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ
10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 21
▼B
adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un
volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle
dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en
chauffantlégèrementdans un léger courantd'azot e, reprendre avec
quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes
environ à l'étuve à 105º C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser.
Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction stérolique.
5.3. Préparation des triméthylsilyléthers
5.3.1. Ajouter, dans le tube contenant la fraction stérolique, le réactif de sily-
lation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-
triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 4) dans une proportion de
50 microlitres par milligramme de stérols, en évitant toute absorption
d'humidité (note 5).
Note 4: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en
outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le
bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosi-
lane à diluer par un même volume de pyridine anhydre.
5.3.2. Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète
solubilisation des stérols. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes
à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la
solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase
gazeuse.
Note 5: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale
et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une
floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont
l'indice de la présence d'humidité ou de l'altération du réactif.
Dans ce cas, l'essai doit être répété.
5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne
5.4.1.1. Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant
l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de séparation et
l'extrémité de sortie au détecteur.
Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en
phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur,
efficacité du système de séparation et du système d'enregistrement,
etc.).
5.4.1.2. Si la colonne estut ilisée pour la première fois, il estconseillé de
procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au
travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie
en phase gazeuse etcommencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre
une température d'au moins 20º C supérieure à celle d'exercice (note 6).
Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis porter
le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux
gazeux et du fractionnement, allumage de la flamme, jonction avec
l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre
pour la colonne du détecteur et de l'initiateur, etc.) et enregistrer le
signal à une sensibilité d'au moins deux fois supérieure à celle prévue
pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit
être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas
présenter de dérive.
Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des
connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionne-
mentinsuffisantde la colonne.
Note 6: La température de conditionnement doit être toujours inférieure
d'au moins 20º C à la température maximale prévue pour le
liquide de répartition employé.
5.4.2. Choix des conditions opératoires
5.4.2.1. Les conditions opératoires maximales sont les suivantes:
— température de la colonne: 260º C ± 5º C,
— température de l'évaporateur: 280º C,— température du détecteur: 290º C,
— vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par
seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde,
—►
C1rapportde division ◄: de 1/50 à 1/100,
— sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale,
— sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond,1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 22
▼B
— vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure,
— quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de
TMSE.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques
de la colonne etdu chromat ographe en phase gazeuse de façon à
obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:
— le temps de rétention du β-sitostérol doit être de 20 ± 5 minutes,
— le pic de campestérol doit être: pour l'huile d'olive (contenu moyen
3 %) 15 ± 5 % de l'échelle de fond, pour l'huile de soja (contenu
moyen 20 %) 80 ± 10 % de l'échelle de fond,
— il doit y avoir séparation de tous les stérols présents; il est néces-
saire que les autres pics séparés soient aussi complètement résolus,
ce qui veutdire que le t racé du pic doitrejoindre la ligne de base
avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toute-
fois tolérée à condition, cependant, qu'elle soit quantifiable selon la
perpendiculaire au pic à TRR 1,02.
5.4.3. Exécution de l'analyse
5.4.3.1. Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane,
aspirer 0,5 microlit re d'air etsuccessivement0,5 et1 microlit re de la
solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon
à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la
membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter
rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes
environ.
5.4.3.2. Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des
stérols présents.
La ligne de base doit toujours correspondre aux qualités requises
(5.4.1.2).
5.4.4. Identification des pics
L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de
rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des stérols,
analysés dans les mêmes conditions.
Les stérols sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol,
24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, ∆7
campestérol, ∆ 5,23 stigmastadiénol, chlérostérol, β-sitostérol, sitos-
tanol, ∆5-avénastérol, 5,24 stigmastadiénol, ∆7-stigmasténol, ∆7-
avénastérol.
Dans le tableau 1 sont reportés les temps de rétention relatifs au sitos-
térol pour les colonnes SE 52 et SE 54.
Les figures 1 et 2 illustrent les chromatogrammes typiques de quelques
huiles.
5.4.5. Évaluation quantitative
5.4.5.1. Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l' α-choles-
tanol et des stérols. Ne pas considérer les pics éventuels de
compositions non comprises dans celles énumérées dans le tableau 1.
Le coefficientde réponse GLC de l' α-cholestanol s'entend égal à 1.
5.4.5.2. Calculer le contenu en chaque stérol simple, en milligrammes par 100
grammes de matière grasse, comme suit:
stérol x =Ax·ms· 100
As·m
où:
Ax= aire du pic du stérol x, en millimètres carrés;
As= aire du pic d' α-cholestanol, en millimètres carrés;
ms= poids d' α-cholestanol ajouté, en milligrammes;
m: = poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en
grammes.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
6.1. Rapporter les contenus de chaque stérol en milligrammes par 100
grammes de matière grasse et leur somme comme «stérols totaux».1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 23
▼B
6.2. On calcule le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre
l'aire du pic correspondantetla somme des aires des pics des st érols.
% du stérol x =Ax
ΣA× 100
Ax= aire du pic x.
ΣA = somme des aires de tous les pics.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 24
▼B
APPENDICE
Détermination de la vitesse linéaire du gaz
Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires
normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer
le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de
l'injection et celui de la sortie du pic (tM).
La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la
longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.
Tableau I
Temps de rétention relatifs des stérols
Pic IdentificationTemps de rétention
relatif
Colonne
SE 54Colonne
SE 52
1 cholestérol ∆-5-cholestène-3 β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5 α-cholestane 0,68 0,64
3 brassicastérol [24S]-24-méthyl- ∆-5,22-cholestadiène-3 β-
ol0,73 0,71
4 24-méthylène-cholestérol 24-méthylén- ∆-5,24-cholestadiène-3 β-ol 0,82 0,80
5 campestérol [24R]-24-méthyl- ∆-5-cholestène-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-méthyl-cholestane-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmastérol [24S]-24-éthyl- ∆-5,22-cholestadiène-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-campestérol [24R]-24-méthyl- ∆-7-cholestène-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadiénol [24S,R]-24-éthyl- ∆-5,23-cholestadiène-3 β-
ol0,95 0,95
10 chlérostérol [24S]-24-éthyl- ∆-5,25-
►C1cholestadiène ◄-3β-ol0,96 0,96
11 β-sitostérol [24R]-24-éthyl- ∆-5-cholestène-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-éthyl-cholestane-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avénastérol [24Z]-24-éthyliden-5-cholestène-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadiénol [24S,R]-24-éthyl- ∆-5,24-cholestadiène-3 β-
ol1,08 1,08
15 ∆-7-stigmasténol [24S,R]-24-éthyl- ►C1∆-7-cholestène ◄
-3β-ol1,12 1,12
16 ∆-7-avénestérol [24Z]-24-éthyliden- ∆-7-cholestène-3 β-ol 1,16 1,161991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 25
▼B
Figure 1
Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive
brute
1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 26
▼B
Figure 2
Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive
raffinée
1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 27
▼B
ANNEXE VI
DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ÉRYTHRODIOL ET EN
UVAOL
AVANT-PROPOS
L'érythrodiol (terme générique qui désigne conventionnellement
l'ensemble des diols érythrodiol et uvaol) est un élément constitutif de
l'insaponifiable que l'on trouve dans certains types de matières grasses.
Son dosage peut servir à vérifier la présence d'huile d'olive d'extraction,
sa concentration y étant nettement plus élevée que dans d'autres huiles
(huiles d'olive de pression, huiles de pépins de raisin).
1. OBJET
La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en érythrodiol
des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en
solution dans de l'éthanol. L'insaponifiable est ensuite extrait avec de
l'éther éthylique, purifié par passage sur une colonne d'alumine et frac-
tionné par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de
silice. Les bandes des fractions stérolique et érythrodiolique sont alors
isolées.
Les stérols et l'érythrodiol récupérés sur la plaque sont transformés en
triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse.
Le résultat est exprimé en pourcentage d'érythrodiol par rapport à
l'ensemble érythrodiol + stérols.
3. APPAREILLAGE
3.1. Appareillage décrit à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).
4. RÉACTIFS
4.1. Réactifs énumérés à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).4.2. Solution de référence d'érythrodiol à 0,5 % dans du chloroforme.
5. MODE OPÉRATOIRE5.1.Préparation de l'insaponifiable
Procéder comme indiqué au paragraphe 5.1.2 de l'annexe V.
5.2.Séparation de l'érythrodiol et des stérols
5.2.1. Voir paragraphe 5.2.1 de la méthode de l'annexe V.5.2.2. Voir paragraphe 5.2.2 de la même méthode.5.2.3. Préparer une solution d'insaponifiable (à 5 %) dans le chloroforme.
Avec la microseringue de 0,1 millilitre, déposer sur une plaque chromato-
graphique, à environ 1,5 centimètre du bord inférieur, 0,3 millilitre de la
solution susmentionnée, en une ligne la plus fine et la plus uniforme
possible. À une extrémité de la plaque, déposer, pour référence, quelques
microlitres des solutions de cholestérol et d'érythrodiol.
5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indi-
quée au paragraphe 5.2.1. La température ambiante doit être d'environ
20º C. Fermer aussitôt avec le couvercle et éluer jusqu'à ce que le niveau
du solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque.
Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et évaporer le
solvantdans un courantd'air chaud.
5.2.5. Vaporiser uniformémentla solut ion de dichloro-2 ′7′fluorescéine sur la
plaque. En examinant cette dernière à la lumière ultraviolette, identifier
les bandes de stérols et de l'érythrodiol par alignement avec les éléments
de référence, puis délimiter avec une pointe légèrement en dehors des
bords de la fluorescence.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 28
▼B
5.2.6. Avec une spatule métallique, racler le gel de silice compris dans les
zones délimitées. Introduire le matériau retiré de la plaque dans une fiole
de 50 millilitres. Ajouter 15 millilitres de chloroforme chaud, bien agiter
et filtrer dans l'ampoule à filtre poreux en transférant le gel de silice sur
le filtre même. Laver par trois fois au chloroforme chaud (environ 10
millilitres à chaque fois) et receuillir le filtrat dans un ballon de 100
millilitres. Évaporer jusqu'à obtention d'un volume de 4 à 5 millilitres,
transvaser, dans un tube centrifugeur à fond conique de 10 millilitres
préalablementpesé, port er à sec en chauffantlégèrementdans un courant
d'azote, et peser.
5.3.Préparation des triméthylsilyléthers
Procéder comme indiqué au paragraphe 5.3 de la méthode de l'annexe V.
5.4.Analyse par chromatographie en phase gazeuse
Procéder comme indiqué au paragraphe 5.4 de la même méthode.
L'analyse par chromatographie en phase gazeuse doit être réalisée dans
des conditions permettant le respect des exigences de l'analyse des stérols
et la séparation des TMSE de l'érythrodiol et de l'uvaol.
Après avoir injecté l'échantillon, laisser le papier se dérouler jusqu'à
élution complète des stérols présents, de l'érythrodiol et de l'uvaol. Iden-
tifier ensuite les pics (les temps de rétention relatifs de l'érythrodiol et de
l'uvaol, par rapportau β-sitostérol, sont respectivement de 1,4 et 1,55
environ).
Calculer ensuite les aires comme indiqué pour les stérols.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Pourcentage de l'Érythrodiol =A1+A2
A1+A2+ΣAstérols× 100
où:
A1: aire du pic de l'érythrodiol, en millimètres carrés;
A2: aire du pic de l'uvaol, en millimètres carrés;
ΣAstérols: somme des aires des stérols présents, en millimètres carrés.
Indiquer le résultat avec une décimale.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 29
▼B
ANNEXE VII
DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS SATURÉS EN POSITION 2 DU
TRIGLYCÉRIDE
1. OBJET
La présente norme décrit une méthode de détermination de la composition
de la fraction des acides gras d'une huile ou d'une matière grasse estérifiée
dans la position 2 (ou position interne) du glycérol.
2. CHAMP D'APPLICATION
La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses dont le
point de fusion se situe en deça de 45º C, en raison des caractéristiques
de l'action de la lipase pancréatique.
Elle n'estpas applicable sans réserves aux huiles etmat ières grasses
contenant des quantités importantes d'acides gras comportant un nombre
d'atomes de carbone égal ou inférieur à douze (huile de coco et de
palmiste, matière grasse butyrique), des acides gras hautement insaturés
(comportant plus de quatre liaisons doubles) comportant un nombre
d'atomes de carbone égal ou supérieur à vingt (huiles de poisson et d'ani-
maux marins) ou des acides gras comprenantdes groupes oxygénés aut res
que le groupe acide.
3. PRINCIPE
Neutralisation éventuelle d'huiles et de matières grasses dans un solvant.
Purification par passage sur une colonne d'alumine. Hydrolyse partielledes triglycérides par la lipase pancréatique au cours d'un laps de temps
déterminé. Séparation des monoglycérides formés par chromatographie
en couche mince et méthanolyse de ces derniers. Analyse des esters
méthyliques par chromatographie en phase gazeuse/liquide.
4. APPAREILLAGE
4.1. Ballon de 100 millilitres.
4.2. Ballon de 25 millilitres avec embout rodé.
4.3. Réfrigérant à air d'une longuer d'un mètre, adaptable à la fiole visée au
point4.2.
4.4. Fiole conique de 250 millilitres.
4.5. Bécher de 50 millilitres.4.6. Ampoule à décanter de 500 millilitres.4.7. Colonne de verre pour chromatographie (diamètre intérieur: 13 millimè-
tres; longueur: 400 millimètres) munie d'un disque en verre fritté et d'un
robinet.
4.8.►
C1Tube à centrifuger ◄de 10 millilitres avec bouchon en verre rodé.
4.9. Burette de 5 millilitres avec graduations de 0,05 millilitre.4.10. Seringue hypodermique de 1 millilitre munie d'une aiguille fine.4.11. Microseringue pour gouttes de 3 à 4 microlitres.
4.12. Épandeuse pour chromatographie en couche mince.
4.13. Plaques de verre pour chromatographie en couche mince (20 × 20 centi-
mètres).
4.14. Cuve de développementen verre pour chromat ographie en couche mince,
avec couvercle en verre rodé, convenantpour les plaques de 20 × 20
centimètres.
4.15. Vaporisateur pour chromatographie en couche mince.4.16. Étuve réglée à 103 ± 2º C.4.17. Thermostat réglable entre 30 et 45º C, à 0,5º C près.
4.18. Évaporateur rotatif.
4.19. Agitateur électrique vibrant, permettant d'agiter vigoureusement le tube
centrifugeur.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 30
▼B
4.20. Lampe à rayons ultraviolets pour l'examen des plaques pour chromatogra-
phie en couche mince.
Pour le contrôle de l'activité de la lipase:
4.21. pH-mètre4.22. Agitateur à spirale
4.23. Burette de 5 millilitres
4.24. Chronomètre.
Pour la préparation éventuelle de la lipase:
4.25. Agitateur de laboratoire convenant pour la dispersion et le mélange de
matières hétérogènes.
5. RÉACTIFS
5.1. n-hexane ou, à défaut, éther de pétrole, (b.e. 30-50º C), de qualité chroma-
tographique.
5.2. 2-propanol (ou éthanol), 95º C (V/V), qualité analytique.
5.3. 2-propanol (ou éthanol) en solution aqueuse 1/1.5.4. Éther diéthylique exempt de peroxydes.5.5. Acétone.
5.6. Acide formique à au moins 98 % (m/m).
5.7. Solvant de développement: mélange de n-hexane (5.1), d'éther diétylique
(5.4) etd'acide formique (5.6) selon les proport ions 70/30/1 (V/V/V).
5.8. Alumine activée pour chromatographie, neutre, de degré d'activité Brock-
mann I.
5.9. Poudre de silice, avec liant, de qualité adéquate pour la chromatographie
en couche mince.
5.10. Lipase pancréatique de qualité adéquate (notes 1 et 2).5.11.►
C1Hydroxyde ◄de sodium en solution aqueuse (120 grammes par
litre).
5.12. Acide chlorhydrique en solution aqueuse (6 N).5.13. Chlorure de calcium (CaC1 2) en solution aqueuse (220 grammes par
litre).
5.14. Cholate de sodium (qualité enzymatique) en solution aqueuse (1 gramme
par litre).
5.15. Solution tampon: solution aqueuse 1 M de tris-hydroxyméthylaminomé-
thane amené à un pH de 8 par addition d'acide chlorhydrique (5.12)
(contrôle au potentiomètre).
5.16. Phénolphtaléine en solution (10 grammes par litre) dans de l'éthanol à
95 % (V/V).
5.17. Dichloro-2 ′-7′-fluorescéine en solution (2 grammes par litre) dans de
l'éthanol à 95 % (V/V), légèrement alcalinisé par l'addition d'une goutte
de solution d'hydroxyde de sodium 1 N par 100 millilitres.
Pour le contrôle de l'activité de la lipase:
5.18. Huile neutralisée5.19. Hydroxyde de sodium en solution aqueuse 0,1 N5.20. Cholate de sodium (qualité enzymatique) en solution aqueuse (200
grammes par litre)
5.21. Gomme arabique en solution aqueuse (100 grammes par litre).
6. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON
Si l'échantillon possède un taux d'acidité, déterminé selon l'annexe II,
inférieur à 3 %, purifier directement sur alumine comme indiqué au point
6.2.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 31
▼B
Si l'échantillon possède un taux d'acidité, déterminé selon l'annexe II, su-
périeur à 3 %, neutraliser par alcaline en présence d'un solvant, comme
indiqué au point6.1, puis passer sur alumine comme indiqué au point6.2.
6.1.Neutralisation par alcaline en présence d'un solvant
Dans une ampoule à décantation (4.6), introduire environ 10 grammes
d'huile brute et ajouter 100 millilitres d'hexane (5.1), 50 millilitres de 2-
propanol (5.2), quelques gouttes de solution de phénolphtaléine (5.16) et
une quantité de soution d'hydroxyde de sodium (5.11) correspondant à la
teneur en acides libres de l'huile, majorée de 0,3 %.
Agiter vigoureusement pendant une minute, ajouter 50 millilitres d'eau
distillée, agiter de nouveau et laisser reposer.
Après séparation, éliminer la couche inférieure de savon. Éliminer égale-
ment toutes les couches intermédiaires (mucilage, matières insolubles).
Laver la solution d'hexane et d'huile neutralisée avecplusieurs doses de25 à 30 millilitres de solution de 2-propanol (5.3) jusqu'à ce que la
couleur rose de la phénolphtaléine disparaisse.
Éliminer la majeure partie de l'hexane par distillation sous vide dans l'éva-
porateur rotatif (4.18) et sécher l'huile à 30-40º C (toujours sous vide) à
l'aide d'un courant d'azote pur, jusqu'à élimination de l'hexane.
6.2.Purification par passage sur alumine
Préparer une suspension de 15 grammes d'alumine activée (5.8) dans 50
millilitres d'hexane (5.1) et verser, tout en agitant, sur la colonne chroma-
tographique (4.7).
Procéder au tassement de l'alumine et laisser tomber le niveau du solvant
jusqu'à 1 ou 2 millimètres au dessus de l'absorbant. Verser soigneusement
sur la colonne une solution de 5 grammes d'huile dans 25 millilitres
d'hexane (5.1). Recueillir l'ensemble de l'effluentde la colonne dans un
ballon (4.1).
7. PRÉPARATION DES PLAQUES CHROMATOGRAPHIQUES
Nettoyer à fond les plaques de verre (4.13) avec de l'éthanol, de l'éther, du
pétrole et de l'acétone pour éliminer toute trace de matière grasse.
Dans une fiole conique (4.4), introduire 30 grammes de poudre de silice
(5.9). Ajouter 60 millilitres d'eau distillée. Boucher et agiter vigoureuse-
ment pendant une minute. Transférer immédiatement la suspension dans
l'épandeuse (4.12) etenduire les plaques propres d'une couche de 0,25
millimètre d'épaisseur.
Sécher les plaques pendant15 minut es à l'air, puis pendantune heure dans
l'étuve (4.16) à 103 ± 2º C.
Amener les plaques à température ambiante dans un dessicateur avant
l'emploi.
Des plaques préparées sontdisponibles dans le commerce.
8. MODE OPÉRATOIRE8.1.Hydrolyse par la lipase pancréatique
Peser environ 0,1 gramme de l'échantillon préparé dans le ►
C1tube à
centrifuger ◄(4.8). S'il s'agitd'une mat ière grasse solide, dissoudre
dans 0,2 millilitre d'hexane en chauffant légèrement, si nécessaire.
Ajouter 20 millilitres de lipase (5.10) et 2 millilitres de solution tampon
(5.15). Agiter convenablement mais prudemment puis ajouter 0,5 millilitrede solution de cholate de sodium (5.14) et 0,2 millilitre de solution de
chlorure de calcium (5.13). Fermer le tube avec le bouchon rodé, agiter
prudemment (éviter de mouiller le bouchon) et placer le tube immédiate-
ment dans le thermostat (4.17) maintenu à 40 ± 0,5º C. Agiter à la main
pendant exactement 1 minute. Retirer le tube du thermostat et agiter
vigoureusement à l'aide d'un agitateur électrique (4.19) pendant exacte-
ment 2 minutes. Refroidir immédiatement à l'eau courante; ajouter 1
millilitre d'acide chlorydrique (5.12) et 1 millilitre d'éther diéthylique
(5.4). Boucher et agiter vigoureusement à l'aide de l'agitateur électrique.
Laisser reposer etéliminer la couche organique à l'aide de la seringue
(4.10), si nécessaire après centrifugation.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 32
▼B
8.2.Séparation des monoglycérides par chromatographie en couche mince
Appliquer l'extrait sur la plaque chromatographique en une couche mince
et uniforme la plus étroite possible, à l'aide de la microseringue (4.11), à
environ 1,5 centimètre de l'extrémité inférieure. Introduire la plaque dans
la cuve de développementbien sat urée (4.14) etdévelopper à l'aide du
solvant (5.7) à environ 20º C, jusqu'à environ 1 centimètre de l'extrémité
supérieure de la plaque.
Sécher la plaque à l'air, à la température de la cuve, et y pulvériser la
solution de dichloro-2 ′-7′fluorescéine (5.17). Délimiter la bande des
monoglycérides (Rfd'environ 0,035) sous lumière ultraviolette (4.20).
8.3.Analyse des monoglycérides par chromatographie en phase gazeuse/
liquide
Récupérer la bande obtenue au point 8.2 à l'aide d'une spatule (en évitant
d'enlever les composants restés sur la ligne de base) et la recueillir dans le
récipient de méthylation (4.2).
Traiter directement la silice recueillie comme indiqué au point 4.1 de
l'annexe X «B», de manière à convertir les monoglycérides en esters
méthyliques, puis examiner les esters par chromatographie en phase
gazeuse comme indiqué à l'annexe X «A».
9. EXPRESSION DES RÉSULTATS
Déterminer la composition de la fraction des acides gras en position 2 en
exprimant le résultat avec une décimale (note 3).
10. NOTES
Note 1: Contrôle de l'activité de la lipase
Préparer une émulsion d'huile en agitant dans un agitateur
adéquat un mélange composé de 165 millilitres de solution de
gomme arabique (5.21) de 15 grammes de glace pilée etde 20
millilitres d'une huile neutralisée (5.18).
Dans un bécher (4.5), verser 10 millilitres de cette émulsion, puis
0,3 millilitre de solution de cholate de sodium (5.20) et 20 milli-
litres d'eau distillée. Placer le bécher dans un thermostat maintenu
à 37 ± 0,5 ºC (note 4). Introduire les électrodes d'un pH-mètre
(4.21) et un agitateur à spirale (4.22). À l'aide d'une burette
(4.23), ajouter la solution d'hydroxyde de sodium (5.19) goutte à
goutte jusqu'à ce que le pH atteigne 8,5.
Ajouter une quantité suffisante de suspension aqueuse de lipase
(voir ci-dessous). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3,
déclencher le chronomètre (4.24) et commencer à ajouter la solu-
tion d'hydroxyde de sodium (5.19) goutte à goutte à la vitesse
nécessaire pour maintenir constant le pH de 8,3. Notar à chaque
minute le volume de solution alcaline consommée.
Rapporter les observations sur un diagramme en indiquant en
abscisse les temps et en ordonnée les millilitres de solution alca-
line nécessaires pour maintenir le pH constant.
Le résultat obtenu être une ligne droite.
la suspension de lipase susmentionnée est une suspension à 1
pour 1 000 (m/m) dans l'eau. Pour chaque essai, il convientd'en
utiliser une quantité suffisante pour que, environ 1 millilitre de
solution alcaline, soit consommé en 4 à 5 minutes.
Normalement, une quantité de poudre de 1 à 5 milligrammes est
nécessaire.
L'unité lipasique est définie comme la quantité d'enzymes que
libèrent 10 microéquivalents d'acide par minute. L'activité A de
la poudre utilisée, exprimée en unités lipasiques par milligramme,
estcalculée au moyen de la formule suivant e:
A¼V/C210
m
V: le volume de solution d'hydroxyde de sodium (5.19)
consommé par minute (calculé à partir du graphique).
m: masse de la prise d'essai de poudre, en milligrammes.
Note 2: Préparation de la lipase1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 33
▼B
Des lipases ayant un niveau d'activité satisfaisant sont disponibles
dans le commerce mais peuventégalementêt re préparées comme
suit.
Refroidir 5 kilogrammes de pancréas de porc frais à 0 ºC;
éliminer la graisse solide et le tissu conjonctif présents, puis
triturer dans un mélangeur jusqu'à obtention d'une pâte fluide.
Agiter cette masse dans l'agitateur (4.25) avec 2,5 litres d'acétone
anhydre pendant 4 à 6 heures, puis centrifuger. Procéder à trois
autres extractions sur le résidu avec le même volume d'acétone,
puis à deux extractions avec un mélange 1/1 (V/V) d'acétone et
d'éther diéthylique, et à deux extractions avec de l'éther diéthy-
lique.
Sécher le résidu sous vide pendant48 heures pour obt enir une
poudre stable, à conserver au réfrigérateur.
Note 3: Dans tous cas, il est conseillé de déterminer la composition des
acides gras totaux d'un même échantillon, puisque la comparaison
avec celle des acides en position 2 permettra d'enterpréter les
chiffres obtenus.
Note 4: La température d'hydrolyse est fixée à 37 ºC, puisqu'une huile
liquide est utilisée. Celle de l'échantillon est toutefois fixée à
40 ºC, pour qu'il soitpossible d'examiner les mat ières grasses
dont le point de fusion peut atteindre 45 ºC.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 34
▼B
ANNEXE VIII
DÉTERMINATIONDE LA TENEUREN ►C1 TRILINOLÉINE ◄
1. OBJET
Détermination de la composition des triglycérides des huiles végétales
liquides, en termes de nombre de carbones équivalent, par chromatographie
en phase liquide à haute performance.
La présente norme décrit une méthode de séparation et de détermination de
la quantité des triglycérides des huiles végétales en termes de masse molé-
culaire et de degré de non-saturation, pris comme fonctions du nombre de
carbones équivalent(voir not e 1).
2. CHAMP D'APPLICATION
La présente norme est applicable à toutes les huiles végétales contenant des
triglycérides d'acides gras à longue chaîne et convient particulièrement pour
détecter la présence de faibles quantités d'huiles semi-siccatives (riches en
acide linoléique) dans les huiles végétales dont le principal acide gras insa-
turé est l'acide oléique (huile d'olive).
3. PRINCIPE
Séparation des triglycérides selon leur nombre de carbones équivalent, par
chromatographie en phase liquide à haute performance (phase inverse) et
interprétation des chromatogrammes.
4. APPAREILLAGE
4.1. Appareil de chromatographie en phase liquide à haute performance permet-
tant un contrôle thermostatique de la température de la colonne.
4.2. Seringue pour injections de 10 microlitres.
4.3. Détecteur: réfractomètre différentiel capable de déterminer l'indice de
réfraction à 10−4près.
4.4. Colonne: tube en acier inoxydable d'une longueur de 250 millimètres et
d'un diamètre intérieur de 4,5 millimètres, garni de particules de silice de
5 micromètres de diamètre contenant 22 à 23 % de carbone, sous forme
d'octadécylsilane (note 2).
4.5. Enregistreur et/ou intégrateur.
5. RÉACTIFS
Les réactifs doivent être de pureté analytique et les solvants d'élution
dégazés (ils peuventêt re recyclés à plusieurs reprises sans que cela ne se
répercute sur les séparations).
5.1. Chloroforme.
5.2. Acétone.
5.3. Acétonitrile.
5.4. Solvant d'élution: acétonitrile + acétone. (Les proportions doivent être ajus-
tées en fonction de la séparation souhaitée; commencer avec un mélange
50/50).
5.5. Solvant de solubilisation: acétone ou mélange (1:1) d'acétone et de chloro-
forme.
5.6. Triglycérides de référence: triglycérides commerciaux tels que la tripalmi-
tine, la trioléine, etc. (les temps de rétention doivent alors être repris dans
le graphique selon le nombre de carbones équivalent), ou chromatogramme
de référence obtenu grâce à de l'huile de soya (voir notes 3 et 4, et schémas
1 et2).
6. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Préparer une solution à 5 % des échantillons à analyser en pesant ►C10,5
± 0,001 grammes ◄d'échantillon dans une fiole graduée de 10 millilitres
et compléter jusqu'à 10 millilitres avec le solvant de solubilisation (5.5).1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 35
▼B
7. MODE OPÉRATOIRE
7.1. Monter le système chromatographique. Pomper le solvant d'élution (5.4) à
raison de 1,5 millilitre par ►C1minute ◄pour purger l'ensemble du
système. Attendre jusqu'à obtention d'une ligne de base stable.
Injecter 10 microlitres de l'échantillon préparé comme indiqué au point 6.
8. CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS
Utiliser la méthode de normalisation interne, autrement dit supposer que la
somme des pourcentages des aires des pics correspondant au divers trigly-
cérides estégale à 100 %.
Calculer le pourcentage de chaque triglycéride avec une décimale, en utili-
santla formule:
Pourcentage du triglycéride =aire du pic
somme des aires des pics× 100
Note 1: Il est possible de déterminer l'ordre d'élution en calculant le
nombre de carbones équivalent, souvent défini par le rapport NCE
= NC − 2n, où NC estle nombre d'at omes de carbone etn le
nombre de liaisons doubles.
On peut affiner le calcul en tenant compte de l'origine des liaisons
doubles.
Si no,n1,e tn1nreprésentent le nombre des liaisons doubles attri-
buable aux acides oléique, linoléique etlinolénique, le nombre de
carbones équivalentpeutêt re calculé selon la formule:
NCE = NC − dono−d1n1−d1nn1n,
où les coefficients do,d1etd1npeuventêt re calculés à l'aide des
triglycérides de référence. Dans les conditions spécifiées dans la
présente méthode, le résultat obtenu se rapproche de la formule:
NCE = NC − (2,60 no) − (2,35 n1) − (2,17 nln).
Note 2: Exemples: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art50333,
Lichrosphère (Merck) 100 CH18 Art50377, ou simi-
laires.
Note 3: Avec plusieurs triglycérides de référence, il est également possible
de calculer la résolution pour la trioléine,
α=T R′/TR′oléine
en utlisant le temps de rétention corrigé TR ′=T R−T Rsolvant.
Le schéma du log αen fontion du f (nombre de liaisons doubles)
permet de déterminer les indices de rétention de tous le triglycé-
rides des acides gras des triglycérides de référence (voir schéma
2).
Note 4: L'efficacité de la colonne doit permettre de séparer nettement le
pic des LLL ►C1(trilinoléine) ◄de celui des triglycérides
possédant un temps de rétention proche.
Note 5: Pour les huiles de grignons d'olive brutes, en vue d'obtenir une
bonne séparation du pic de la trilinoléine de ceux adjacents, il
fautpurifier au préalable l'huile conformémentau point6.2 de
l'annexe VII, ou, alternativement, on fait absorber 200 µl d'huile,
sans les diluer, sur une colonne de silice pour extraction de liquide
solide (type SEP PAK silica cartriage-waters port. no51 900).
Les triglycérides sont élués avec 20 ml d'hexane anhydre pour
HPLC.
Le produitélué estséché dans un courantd'azot e etrepris en
isopropanol ou acétone (5 ml). On injecte 10-20 µl en HPLC.
Pour les deux méthodes de purification, il faut contrôler que la
composition en acides gras de l'huile soit la même avant et après
la purification. Si la composition n'est pas la même, on doit réduire
progressivement la qualité d'absorbant utilisé.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 36
▼M4
▼B
Schéma 1
Chromatogrammed'un échantillon d'huile de soja
Note: P: acide palmitique; St: acide stéarique; O: acide oléique; L: acide
linoléique; Ln: acide linolénique.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 37
▼B
Schéma 2
Évolution du log αen fonction de f (nombre de liaisons doubles)
Note: La: acide laurique; My: acide myristique; P: acide palmitique; St:
acide stéarique; O: acide oléique; L: acide linoléique; Ln: acide lino-
lénique.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 38
▼B
ANNEXE IX
ANALYSESPECTROPHOTOMÉTRIQUE
PRÉLIMINAIRES
L'examen spectrophotométrique dans l'ultraviolet peut fournir des indica-
tions sur la qualité d'une matière grasse, sur son état de conservation et
sur les modifications dues aux processus technologiques.
Les absorptions aux longueurs d'onde prévues dans la méthode sont dues à
la présence de systèmes dièniques et trièniques conjugués. Les valeurs de
ces absorptions sont exprimées comme extinction spécifique E1cm 1 %
(extinction d'une solution de matière grasse à 1 % dans le solvant prescrit,
pour une épaisseur de 1 % cm) noté de façon conditionnelle par K (dit
également coefficient d'extinction).
1. OBJET
La méthode décrit le procédé de l'exécution de l'examen spectrophotomé-
trique dans l'ultraviolet des matières grasses.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
La matière grasse étudiée est dissoute dans le solvant requis, puis on déter-
mine l'extinction de la solution à la longueur d'onde prescrite, par rapport
au solvant pur. On calcule les extinctions spécifiques à partir des lectures
spectrophotométriques.
3. APPAREILLAGE
3.1. Spectrophotomètre pour mesure des extinctions dans l'ultraviolet entre 220
et 360 nm, avec possibilité de lecture pour chaque unité nanométrique.
3.2.►C1Cuves de quartz ◄, avec couvercle, de parcours optique de 1 centi-
mètre. Les cuves, remplies d'eau ou d'un autre solvant idoine, ne doivent
pas présenter de différences supérieures à 0,01 unité d'extinction.
3.3. Fioles jaugées de 25 millilitres.
3.4. Colonne pour chromatographie de 540 millimètres de long et 35,0 millimè-
tres de diamètre, équipée d'un tube à reflux d'un diamètre d'environ 10
millimètres.
4. RÉACTIFS
4.1. Isooctane (2,2,4-triméthylpentane) spectrophotométriquement pur: il doit
avoir, par rapport à l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 60 %
à 220 nm etnon inférieure à 95 % à 250 nm
ou bien
— cyclohexane spectrophotométriquement pur: il doit avoir, par rapport à
l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 40 % à 220 nm et non
inférieure à 95 % à 250 nm,
— un autre solvant approprié capable de dissoudre parfaitement la matière
grasse (l'alcool éthylique pour l'huile de ricin).
4.2. Alumine basique pour chromatographie sur colonne, préparée et contrôlée
comme décritdans l'appendice I.
4.3. n-Hexane pour chromatographie.
5. PROCÉDÉ
5.1. L'échantillon examiné doit être parfaitement homogène et exempt d'impu-
retés en suspension. Les huiles liquides à température ambiante sont
filtrées sur papier à une température d'environ 30º C, les graisses solides
sont homogénéisées et filtrées à une température non supérieure à 10º C
au-dessus de leur température de fusion.
5.2. Peser 0,25 gramme environ de l'échantillon ainsi préparé dans une fiole
jaugée de 25 millilitres, compléter avec le solvant prescrit et homogénéiser.
La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution
présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier.
5.3. Remplir une cuve avec la solution obtenue et mesurer les extinctions, en
employantcomme référence le solvantemployé, aux longueurs d'onde
comprises entre 232 et 276 nm.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 39
▼B
Les valeurs d'extinction lues doivent être comprises dans l'intervalle de 0,1
à 0,8; dans le cas contraire, il est nécessaire de répéter les mesures en utili-
sant les solutions plus concentrées ou plus diluées appropriées.
5.4. Au cas ou serait requise la détermination des extinctions spécifiques après
passage sur alumine, on procède de la façon suivante: introduire dans la
colonne chromatographique 30 grammes d'alumine basique en suspension
dans l'hexane; éliminer l'excès d'hexane après tassement de l'absorbant, ou
au moins jusqu'à 1 centimètre environ au dessus du niveau supérieure de
l'alumine.
Dissoudre 10 grammes de matière grasse, homogénéisée et filtrée comme
décrit au point 5.1, dans 100 millilitres d'hexane et verser cette solution
dans la colonne. Recueillir l'éluantetévaporer le solvantsous vide età
une température inférieure à 25º C.
Procéder immédiatement sur la matière grasse obtenue comme décrit au
point5.2.
6. EXPRESSION DES RÉSULTATS
6.1. Rapporter les extinctions spécifiques (coefficients d'extinction) aux diffé-
rentes longueurs d'onde, calculées comme suit:
Kλ¼Eλ
c/C1s
où:
Kλ: extinction spécifique à la longueur d'ondeλ;
Eλ: extinction mesurée à la longueur d'onde λ;
c: concentration de la solution en grammes par 100 millilitres;
s: épaisseur de la cuvette en centimètres
Les résultats sont exprimés avec deux décimales.
6.2. L'examen spectrophotométrique de l'huile d'olive selon la méthode offi-
cielle des règlements officiels de la Communauté économique européenne
prévoit la détermination de l'extinction spécifique, en solution dans l'isooc-
tane, aux longueurs d'onde de 232 et 270 nm et la détermination du ∆K
exprimé comme:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
où Kmest l'extinction spécifique à la longueur d'onde m, longueur d'onde
d'absorbance maximale aux environs de 270 nm.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 40
▼B
APPENDICE I
Préparation de l'alumine et contrôle de son activité
A.1.1. Préparation de l'alumine
Mettre dans un récipient, qui ferme hermétiquement, l'alumine au préa-
lable desséchée au four à 380-400º C pendant3 heures, ajout er de l'eau
distillée à raison de 5 millilitres pour 100 grammes d'alumine, fermer
rapidement le récipient, agiter à plusieurs reprises, puis laisser reposer
pendantau moins 12 heures avantemploi.
A.1.2. Contrôle de l'activité de l'alumine
Préparer une colonne chromatographique avec 30 grammes d'alumine.
Opérer comme décritau paragraphe 5.4. Faire passer à t ravers la colonne
un mélange constitué de:
— 95 % d'huile d'olive vierge, ayant une extinction spécifique à 268 nm
inférieure à 0,18,
— 5 % d'huile d'arachide traitée avec des terres décolorantes lors de son
raffinage, ayant une extinction spécifique à 268 nm supérieure ou
égale à 4.
Si le mélange après passage sur colonne présente une extinction spéci-
fique à 268 nm supérieure à 0,11, l'alumine estaccept able, sinon, il faut
augmenter le taux d'hydratation.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 41
▼B
APPENDICE II
Étalonnage du spectrophotomètre
A.2. L'appareillage doit être contrôlé périodiquement (au moins tout les six
mois), que ce soitpour la correspondance de la longueur d'onde ou
pour l'exactitude de la réponse.
A.2.1. Le contrôle de la réponse de la longueur d'onde peut être fait au moyen
d'une lampe à vapeur de mercure ou de filtres appropriés.
A.2.2. Pour le contrôle de la cellule photoélectrique et du photomultiplicateur,
procéder ainsi: peser 0,2 gramme de chromate de potassium pur pour
spectrophotométrie et dissoudre dans une solution d'hydroxyde de potas-
sium 0,05 N etcomplét er au volume dans une fiole jaugée de 1 000
millilitres. Prélever ensuite 25 millilitres exactement de la solution
obtenue, transférer dans une fiole jaugée de 500 millilitres et compléter
au volume avec la même solution d'hydroxyde de potassium.
Mesurer l'extinction à 275 nm de la solution ainsi obtenue, en se servant
de la solution d'hydroxyde de potassium comme référence. L'extinction
mesurée avec une cuve optique de 1 centimètre devra être de
0,200 ± 0,005.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 42
▼B
ANNEXE X «A»
ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES
ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDESGRAS
1. DOMAINE D'APPLICATION
La présente méthode donne des directives générales pour la détermina-
tion par chromatographie en phase gazeuse de la composition
qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides
gras obtenu selon la méthode visée à l'annexe X B.
La méthode n'est pas applicable aux acides gras polymérisés.
2. RÉACTIFS2.1.Gaz vecteur
Gaz inerte (azote, hélium, argon, hydrogène, etc.) soigneusement
desséché etcont enantmoins de 10 milligrammes par kilogramme
d'oxygène.
Note 1: L'hydrogène que l'on utilise comme gaz vecteur uniquement
avec les colonnes capillaires permetde doubler la vit esse d'ana-
lyse mais présente des dangers. Il existe cependant des
dispositifs de sécurité.
2.2.Gaz auxiliaires
2.2.1. Hydrogène (de pureté ≥99,9 %), ne contenant pas d'impuretés organi-
ques.
2.2.2. Air ou oxygène ne contenant pas d'impuretés organiques.
2.3.Produits d'étalonnage
Mélange d'esters méthyliques d'acides gras purs, ou esters méthyliques
d'un corps gras, de composition connue, si possible voisine de celle du
corps gras à analyser.
Prendre toutes précautions afin d'éviter l'oxydation des acides gras poly-
insaturés.
3. APPAREILLAGE
Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromato-
graphie en phase gazeuse utilisant des colonnes remplies et/ou
capillaires et un détecteur à ionisation de flamme. Tout appareillage
ayant la même efficacité et la même résolution que celles définies au
point5.1.2 convient .
3.1.Appareil de chromatographie en phase gazeuse
L'appareil de chromatographie en phase gazeuse doit comprendre les
éléments suivants.
3.1.1. Dispositif d'injection
Utiliser un dispositif d'injection:
a) soitavec des colonnes remplies, le disposit if ayantle plus faible
volume mort possible (dans ce cas, il doit pouvoir être porté à une
température supérieure, de 20º C à 50º C, à celle de la colonne);
b) soit avec des colonnes capillaires, auquel cas le dispositif doit être
spécialement conçu pour l'utilisation de telles colonnes. Il peut être
du type diviseur ou du type à injection totale en tête de colonne
refroidie (injecteur «non column»).
Note 2: En l'absence de corps gras contenant des acides gras à moins
de 16 atomes de carbone, un injecteur à aiguille mobile peut
être utilisé.
3.1.2. Four
Le four doit être en mesure de porter la colonne à une température d'au
moins 260º C et de maintenir la température choisie à 1º C près avec
une colonne remplie et à 0,1º C près avec une colonne capillaire. Cette1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 43
▼B
dernière caractéristique est particulièrement importante lorsqu'on utilise
un tube en silice fondue.
L'utilisation d'un appareil équipé d'un programmateur de température
est recommandée dans tous les cas et, en particulier, en présence
d'acides gras à moins de 16 atomes de carbone.
3.1.3. Col onne remplie
3.1.3.1. Colonne, en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser: verre ou, à
défaut, acier inoxydable, ayant les dimensions suivantes:
a) longueur: de 1 à 3 mètres. Une colonne relativement courte sera
utilisée dans le cas où des acides gras à longue chaîne (> C20) sont
présents. Dans le cas de la détermination des acides en C4eten C6,
il estrecommandé d'ut iliser une colonne de 2 m;
b) diamètre intérieur: de 2 à 4 millimètres.
Note 3: Si des constituants polyinsaturés à plus de trois doubles liaisons
sontprésent s, une colonne en acier inoxydable peutprovoquer
leur décomposition.
Note 4: Un système à double colonne remplie peut être utilisé.
3.1.3.2. Remplissage, comprenant les éléments suivants:
a) support: terre de diatomées lavée aux acides et silanisée, ou tout
autre support inerte pouvant convenir, avec un étroit intervalle de
granulométrie (25 micromètres entre 125 et 200 micromètres), la
dimension moyenne étant liée au diamètre intérieur et à la longueur
de la colonne;
b) phase stationnaire: phase polaire de type polyester (par exemple
polysuccinate de diéthylèneglycol, polysuccinate de butanediol,
polyadipate d'éthylèneglycol, etc.), cyanosilicones ou toute autre
phase permettant la séparation chromatographique (voir article 5).
Le taux d'imprégnation sera compris entre 5 % (m/m) et 20 % (m/
m). Pour certaines séparations, des phases apolaires pourront être
utilisées.
3.1.3.3. Conditionnement de la colonne
Après avoir déconnecté la colonne du côté du détecteur, porter progres-
sivement le four à 185º C et maintenir la colonne venant d'être préparée
sous un courant de gaz inerte de 20 à 60 millilitres par minute durant au
moins 16 heures à cette température, puis durant 2 heures à 195º C.
3.1.4. Col onne capillaire
3.1.4.1. Tube en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser, généralement en
verre ou en silice fondue. Le diamètre interne doit être compris entre
0,2 et 0,8 millimètre. Intérieurement, il devra subir des traitements
appropriés (préparation de l'état de surface, inactivation) avant de rece-
voir le film de phase stationnaire. Une longueur de 25 mètres estsuffisante dans la plupart des cas.
3.1.4.2. Phase stationnaire, principalement de type polyglycols [poly(éthylène
glycol) 20 000], polyesters (polysuccinate de butanediol) ou polysilo-
xanes polaires (cyanosilicones). Les colonnes greffées, ou réticulées,
conviennent.
Note 5: Toutefois les polysiloxanes polaires risquent de donner des
difficultés dans l'identification et la séparation de l'acide linolé-
nique etdes acides en C
20.
Les épaisseurs de film doivent être faibles: 0,1 à 0,2 micromètre.
3.1.4.3. Montage et conditionnement de la colonne
Respecter les précautions habituelles de montage des colonnes capil-
laires, c'est-à-dire la disposition de la colonne dans le four (support),
le choix et le montage des joints (étanchéité), le positionnement des
extrémités de la colonne dans l'injecteur et le détecteur (réduction des
volumes morts). Mettre la colonne sous gaz vecteur [par exemple,
0,3 bar (30 kPa) pour une colonne de 25 mètres de longueur et d'un
diamètre intérieur de 0,3 millimètre].
Conditionner la colonne par programmation de la température du four à
3º C par minute depuis la température ambiante jusqu'à une température
inférieure à 10º C à la limite de décomposition de la phase stationnaire.
Maintenir à cette température 1 heure, jusqu'à stabilisation de la ligne
de base. Revenir à 180º C pour travailler dans des conditions
isothermes.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 44
▼B
Note 6: Des colonnes préconditionnées adéquates sont disponibles
commercialement.
3.1.5. Détecteur, de préférence capable d'être porté à une température supé-
rieure à celle de la colonne.
3.2.Seringue
La seringue doitavoir une capacit é de 10 ►C1microlitres au
maximum et être graduée en 0,1 microlitres ◄.
3.3.Enregistreur
Lorsque la courbe enregistrée est utilisée pour calculer la composition
du mélange analysé, l'enregistreur doit être un appareil électronique de
grande précision, compatible avec l'appareillage utilisé, et ayant les
caractéristiques suivantes:
a) vitesse de réponse inférieure à 1,5 seconde, de préférence 1 seconde
(la vitesse de réponse est le temps nécessaire pour que la plume de
l'enregistreur aille de 0 à 90 % lors de l'introduction soudaine d'un
signal de 100 %);
b) largeur du papier, 20 centimètres au minimum;
c) vitesse de déroulement du papier, réglable à des valeurs comprises
entre 0,4 et 2,5 centimètres par minute.
3.4.Intégrateur ou calculateur (facultatif)
L'emploi d'un intégrateur électronique ou d'un calculateur permet un
calcul rapide etprécis. Celui-ci doitfournir une réponse linéaire, avoir
une sensibilité suffisante, et la correction de la déviation de la ligne de
base doit être satisfaisante.
4. MODE OPÉRATOIRE
Les détails opératoires donnés en 4.1 à 4.3 concernent l'emploi d'un
détecteur à ionisation de flamme.
En variante, un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un
détecteur à conductibilité thermique (catharomètre) peut être utilisé. Les
conditions opératoires doivent alors être modifiées comme décrit à
l'article 6.
4.1.Conditions d'essai
4.1.1. Choix des conditions optimales de travail
4.1.1.1. Sur colonne remplie
Pour choisir les conditions de travail, il y a lieu de tenir compte des
variables suivantes:
a) la longueur etle diamèt re de la colonne;
b) la nature et la quantité de la phase stationnaire;
c) la température de la colonne;
d) le débitdu gaz vect eur;
e) la résolution souhaitée;
f) l'importance de la prise d'essai, choisie de façon telle que l'ensemble
détecteur-électromètre fournisse une réponse linéaire;
g) la durée de l'analyse.
En général, les valeurs données dans le tableau 1 et le tableau 2 seront
celles donnant les résultats désirés, à savoir un nombre de plateaux
théoriques, au moins égal à 2 000 par mètre de colonne pour le stéarate
de méthyle, et élution de celui-ci en 15 minutes environ.
Lorsque l'appareil le permet, l'injecteur devrait être à une température
voisine de 200º C, et le détecteur à une température égale ou supérieure
à celle de la colonne.
En général, le rapport du débit d'hydrogène du détecteur à ionisation de
flamme à celui du gaz vecteur, varie de 1:2 à 1:1, selon le diamètre de
la colonne. Le débitd'oxygène estd'environ 5 à 10 fois celui de
l'hydrogène.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 45
▼B
Tableau 1
Diamètre intérieur de la colonne (en
mm)Vitesse du gaz vecteur (en ml/min)
21 5 à 2 5
32 0 à 4 0
44 0 à 6 0
Tableau 2
Concentration de la phase stationnaire
[en % (m/m)]Température de la colonne
(en ºC)
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Sur colonne capillaire
Les caractéristiques d'efficacité et de perméabilité des colonnes capil-
laires font que la séparation entre constituants et la durée de l'analyse
sont très dépendantes du débit de gaz vecteur dans la colonne. Il y
aura nécessité, en jouant sur ce paramètre (ou plus simplement sur la
perte de charge en tête de colonne), d'optimiser les conditions opéra-
toires selon que l'on recherche, soit à améliorer les séparations, soit à
faire de l'analyse rapide.
4.1.2. Détermination du nombre de plateaux théoriques (efficacité) et de la
résolution
(Voir figure 1)
Effectuer l'analyse d'un mélange de stéarate et d'oléate de méthyle en
proportions sensiblement équivalentes (par exemple, esters méthyliques
de beurre de cacao).
Choisir l'importance de la prise d'essai, la température de la colonne et
le débit du gaz vecteur, de façon que le maximum du pic du stéarate de
méthyle soit enregistré environ 15 minutes après le pic du solvant, et
que ce pic corresponde à environ les trois quarts de l'échelle totale.
Calculer le nombre de plateaux théoriques, n, à l'aide de la formule
n¼16dr1
W1/C20/C21
2
etla résolut ion R, par la formule
R¼2∆
W1þW2
où:
dr(I): distance de rétention, en millimètres, mesurée à partir du
débutdu chromat ogramme jusqu'au maximum du pic dustéarate de méthyle;
w
(I)etw(II): largeurs, en millimètres, des pics du stéarate et de
l'oléate de méthyle, mesurées entre les points d'intersec-
tion avec la ligne de base des tangentes aux points
d'inflexion de la courbe;
∆: distance, en millimètres, entre les maxima relatifs des
pics du stéarate et de l'oléate de méthyle;
etl'indice de résolut ion Ir, par la formule
a
b1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 46
▼M2
▼M2
où:
a = la hauteur du pic le plus petit, mesurée par rapport à la ligne de
base,
b = la hauteur du point le plus bas du val compris entre les deux pics
adjacents, mesurée par rapport à la ligne de base.
Figure 1
Chromatogramme pour la détermination du nombre de plateaux théoriques (effi-
cacité) et de la résolution.
Les conditions opératoires sont celles donnant un nombre de plateaux
théoriques pour le stéarate de méthyle, au moins égal à 2 000 par mètre
de colonne, etune résolut ion d'au moins 1.25.
4.2.Prise d'essai
À l'aide de la seringue (4.2), prélever de 0,1 à 2 microlitres de la solu-
tion d'esters méthyliques obtenue selon la méthode visée à l'annexe X
«B» etles inject er dans la colonne.
Dans le cas des esters exempts de solvants, préparer une solution à 100
milligrammes par millilitre environ dans de l'heptane pour chromatogra-
phie en phase gazeuse et injecter 0,1 à 1 microlitre de cette solution.
Pour la recherche de constituants présents à l'état de traces, cette prise
d'essai pourra être augmentée (jusqu'à dix fois).
4.3.Analyse
Dans les cas usuels, opérer dans les conditions décrites en 5.1.1.
Toutefois, il est possible d'opérer avec une température de colonne plus
basse, dans le cas où il estnécessaire de doser des acides gras dontle
nombre d'atomes de carbone est inférieur à 12, ou plus élevée, dans le
cas où il estnécessaire de doser des acides gras dontle nombre
d'atomes de carbone est supérieur à 20.
Éventuellement, il est possible d'opérer en température programmée
dans les deux cas. Par exemple, si l'échantillon contient des esters1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 47
▼B
▼B
méthyliques d'acides gras à moins de 12 atomes de carbone, injecter
l'échantillon à 100º C (ou à 50-60º C si l'acide butyrique est présent)
et programmer immédiatement à un débit de 4 à 8º C par minute
jusqu'à la température optimale. Dans certains cas les deux procédés
peuventêt re combinés.
Après la période de programmation de température, continuer l'élution
en température isotherme jusqu'à élution de tous les constituants. Si
l'appareil ne peut pas travailler en température programmée, opérer à
deux températures fixées entre 100 et 195º C.
Si nécessaire, il estrecommandé de faire une analyse sur deux phases
fixes de polarités différentes pour vérifier l'absence de pics masqués,
par exemple dans le cas de la présence simultanée de C18:3etC20:0ou
de C18:3etC18:2conjugués.
4.4.Préparation du chromatogramme de référence et des courbes de
référence
Analyser le mélange témoin (voir point 2.3), dans les conditions opéra-
toires identiques à celles de l'essai, et déterminer les temps de rétention
ou les distances de rétention pour les acides gras constitutifs. Tracer sur
papier semi-logarithmique pour chaque taux d'insaturation, les courbes
donnant le logarithme du temps de rétention ou de la distance de réten-
tion en fonction du nombre d'atomes de carbone; dans des conditions
isothermes et pour des esters à chaîne droite et un taux d'insaturation
fixé, ces courbes doivent être des droites. Ces droites doivent être prati-
quementparallèles.
Éviter les conditions opératoires favorisant l'existence de «pics
masqués», c'est-à-dire que deux constituants ne puissent être distingués
par suite d'une résolution insuffisante.
5. EXPRESSION DES RÉSULTATS5.1.Analyse qualitative
Pour l'essai, identifier les pics du méthyl ester en se reportant aux
courbes préparées au point 4.4 au besoin en interpolant.
5.2.Analyse quantitative
5.2.1. Détermination de la composition
Utiliser la méthode de normalisation interne (sauf exceptions), c'est-à-
dire admettre que la totalité des constituants présents dans l'échantillon
est représentée sur le chromatogramme, donc que la somme des aires
des pics représente 100 % des constituants (élution totale).
Si l'appareillage comporte un intégrateur, utiliser les chiffres fournis par
celui-ci. Dans le cas contraire, déterminer l'aire de chaque pic en multi-
pliant la hauteur du pic par sa largeur à mi-hauteur, en tenant compte
des diverses atténuations éventuellement utilisées au cours de l'enregis-
trement.
5.2.2. Mode de calcul5.2.2.1. Cas général
Calculer la teneur en un constituant donné, exprimée en pourcentage en
masse, des esters méthyliques, en déterminant le pourcentage représenté
par le rapportde l'aire du pic correspondantà la somme des aires de la
totalité des pics, à l'aide de la formule:
Ai
ΣA/C2100
où:
Ai: aire du pic correspondantau composé i;
ΣA: somme des aires de la totalité des pics.
Donner le résultat avec une décimale.
Note 7: Dans ce cas général, le résultat du calcul basé sur les aires rela-
tives est considéré représenter un pourcentage en masse. Dans
le cas où cette hypothèse n'est pas permise, voir le point
5.2.2.2.
5.2.2.2. Cas de l'emploi des facteurs de correction1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 48
▼B
Dans certains cas, par exemple en présence d'acides gras dont le
nombre d'atomes de carbone est inférieur à 8 ou d'acides à fonctions
secondaires, lors de l'emploi de détecteurs à conductivité thermique,
ou si le plus grand degré de précision estspécialementdemandé, il y a
lieu de faire intervenir des facteurs de correction pour convertir les
pourcentages des aires des pics en pourcentages en masse des consti-
tuants.
Déterminer les facteurs de correction à l'aide d'un chromatogramme
obtenu à partir d'un mélange témoin d'esters méthyliques de composi-
tion exactement connue dans des conditions identiques à celles de
l'essai.
Pour ce mélange témoin, le pourcentage en masse du composé i est
donné par la formule:
mi
Σm/C2100
où:
mi: masse du composé i dans le mélange témoin.
Σm: somme des masses des divers constituants du mélange témoin.
À partir du chromatogramme du mélange témoin (4.4), calculer le pour-
centage (aire/aire) du composé i comme suit:
Ai
ΣA/C2100
où:
Ai: aire du pic correspondantau composéi;
ΣA: somme des aires de la totalité des pics.
D'où, le facteur de correction:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Habituellement, les facteurs de correction sont exprimés par rapport à
KC16et les facteurs relatifs deviennent:
K0
i¼Ki
KC16
Pour l'échantillon, la teneur en chaque composé i, exprimée en pourcen-
tage en masse des esters méthyliques, est:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Donner le résultat avec une décimale.
5.2.2.3. Cas de l'emploi d'un étalon interne
Dans certaines analyses (par exemple, lorsque tous les acides gras ne
sontpas quant ifiés, etque des acides en C4eten C6sontprésent s à
côté d'acides en C16eten C18, ou bien lorsqu'il estnécessaire de dét er-
miner la quantité absolue d'acides gras dans un échantillon), il est
nécessaire d'utiliser un étalon interne. Des acides gras en C5,C15ou
C17sont utilisés fréquemment. Le facteur de correction de l'étalon
interne doit être déterminé (s'il y a lieu).
Le pourcentage en masse du composé i, exprimé en esters méthyliques,
estpar suit e donné par la formule:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
où:
Ai: surface du pic correspondant au constituant i;
As: surface du pic correspondant à l'étalon interne;
K′i: facteur de correction du compose i (relatif à KC16);
K′s: facteur de correction de l'étalon interne (relatif à KC16);1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 49
▼B
m: masse, en milligrammes, de l'échantillon;
ms: masse, en milligrammes, de l'étalon interne.
Donner le résultat avec une décimale.
6. CAS PARTICULIER DE LA DÉTERMINATION DES ISOMÈRES
«TRANS»
Il est possible de déterminer le contenu des isomères «trans» des acides
gras avec un nombre d'atomes de carbone compris entre 10 et 24, par
séparation des esters méthyliques, en utilisant des colonnes chromato-
graphiques capillaires présentant une polarité particulière.
6.1. Colonne capillaire en silice d'un diamètre interne de 0,25 à 0,32 milli-
mètre et d'une longueur de 50 mètres, recouverte de
cyanopropysilicone, l'épaisseur du film étant comprise entre 0,1 et 0,3
micromètre (type SP 2340, type SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 et types
similaires).
6.2. Les esters méthyliques sont préparés selon le procédé B présenté dans
l'autre annexe (X/B). Les substances grasses ayant une acidité libre su-
périeure à 3 % doivent être préalablement neutralisées conformémentau point6.1 de l'annexe VII.
6.3. Les conditions de travail pour la chromatographie en phase gazeuse
sontdans l'ensemble les suivant es:
— température de la colonne programmée de 150 ºC à 230 ºC (par
exemple 165 ºC pendant 15 minutes puis augmentation de 5 ºC par
minute jusqu'à 200 ºC),
— température de l'injecteur: 250 ºC si on utilise le système d'injecteur
diviseur ou la température initiale de la colonne si on emploie le
systèmeon column,
— température du détecteur: 260 ºC,— débit du gaz vecteur (hélium et hydrogène): 1,2 millilitre par
minute.
La quantité injectée doit être telle que dans les conditions de sensibilité
employées la hauteur du pic correspondant à l'ester méthylique de
l'acide arachidique soitégale ou supérieure à 20 % du bas de l'échelle.
6.4. L'identification des divers esters méthyliques s'effectue sur la base des
temps de rétention qui sont comparés à ceux de mélanges de référence.
(Comme indiqué au point2.3).
Les esters des acides gras «trans» sont élués avant les isomères corres-
pondants «cis». Un exemple de chromatogramme est présenté dans la
figure 2.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 50
▼M2
▼M2
Figure 2
Chromatographie type en phase gazeuse relative à la détermination des isomères
trans des acides gras avec colonne capillaire
6.5. L'efficacité de la colonne déterminée selon le point 4.1.2 doit permettre
une séparation de certains couples critiques, par exemple le couple
formé par le massif des acides transoléiques et le pic de l'acide oléique,
trans C 18: 1/ «cis» C 18: 1, avec un indice de résolution supérieur à 2.
6.6. Le pourcentage des divers acides gras «trans» est calculé sur la base du
rapportent re la surface du pic y afférentetla somme des surfaces de
tous les pics présents.
Sont pris en considération les pourcentages des acides:
— «trans» octadécénoïques (T 18: 1), indiqués à l'annexe I du présent
règlementcomme somme des isomères t ransoléiques,
— «cis-trans» et «trans-cis» octadécadiénoïques [(CT/TC) 18: 2] indi-
qués à l'annexe I du présentrèglementcomme somme des isomères
translinoléiques,
— «trans-cis-trans», «cis-cis-trans», «cis-trans-cis», «trans-cis-cis»,
octadécatriénoïques [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], indiqués
à l'annexe I du présentrèglementcomme somme des isomères
translinoléniques.
Note 8: Compte tenu des caractéristiques particulières de cette
méthode, donner les résultats avec deux décimales.
►M27.◄CAS PARTICULIER DE L'UTILISATION D'UN DÉTECTEUR
À CONDUCTIBILITÉ THERMIQUE (CATHAROMÈTRE)
Un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à
conductibilité thermique (catharomètre), peut être utilisé également
pour la détermination de la composition qualitative et quantitative d'un
mélange d'esters méthyliques d'acides gras. Dans ce cas, les conditions
spécifiées aux points 3 et 4, doivent être modifiées comme indiqué dans
le tableau 3.
Pour l'analyse quantitative, utiliser les facteurs de correction définis en
5.2.2.2.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 51
▼B
▼B
Tableau 3
Variable Valeur/condition
Colonne Longueur: 2 à 4 m
diamètre intérieur: 4 mm
Support Granulométrie entre 160 et
200 µm
Taux d'imprégnation de la phase
stationnaire15 à 25 % (m/m)
Gaz vecteur Hélium, ou à défaut hydrogène, à
teneur aussi faible que possible en
oxygène
Gaz auxiliaires Néant
Température de l'injecteur De 40 à 60 ºC supérieure à celle
de la colonne
Température de la colonne 180 à 200 ºC
Débit du gaz vecteur Généralement compris entre 60 et
80 ml/min
Quantités injectées Généralement comprises entre 0,5
et2 µl
►M28.◄RAPPORT D'ESSAI
Le rapport d'essai doit indiquer les méthodes utilisées pour la prépara-
tion des esters méthyliques et pour l'analyse par chromatographie en
phase gazeuse, ainsi que les résultats obtenus. Il doit, en outre,
mentionner tous les détails opératoires non prévus dans la présente
norme internationale, ou facultatifs, ainsi que les incidents éventuels
susceptibles d'avoir agi sur les résultats.
Le rapport d'essai doit donner tous les renseignements nécessaires à
l'identification complète de l'échantillon.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 52
▼B
ANNEXE X «B»
PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS,
CONFORMÉMENTÀL'ANNEXEVIPOINTSIETIIDURÈGLEMENT
(CEE) No72/77 OU SELON LA MÉTHODE ALTERNATIVE DÉCRITE
CI-DESSOUS
PRÉAMBULE
Le choix de la méthode à suivre doit être fonction de la composition en
acides et de l'acidité de la matière grasse à analyser et de l'analyse par
chromatographie en phase gazeuse à effectuer.
On notera en particulier:
— que, en ce qui concerne les matières grasses contenant des acides gras
inférieurs à C12, seules doivent être utilisées les méthodes d'analyse en
fiole fermée ou au sulfate diméthylique,
— que, en ce qui concerne les matières grasses ayant une acidité supé-
rieure à 3 %, seules doivent être utilisées les méthodes au méthanol et
à l'acide chlorhydrique ou au sulfate diméthylique,
— que, pour les déterminations par chromatographie en phase gazeuse des
isomères trans, seules doivent être utilisées les méthodes au méthylate
de sodium ou au sulfate diméthylique,
— que la méthode au méthanol, à l'hexane et à l'acide sulfurique doit être
utilisée pour la préparation des esters méthyliques de petites quantités
de matières grasses provenant de séparation par chromatographie sur
couche mince.
La présence d'insaponifiables peut être négligée pour autant qu'elle ne
dépasse pas 3 % autrement, les esters méthyliques doivent être préparés à
partir des acides gras.
1. OBJET
On trouvera ci-dessous la description de cinq méthodes de préparation des
esters méthyliques de matières grasses:
a) au méthylate de sodium;
b) au méthylate de sodium en fiole fermée;
c) au méthanol et à l'acide chlorhydrique en fiole fermée;
d) au sulfate diméthylique;
e) au méthanol, à l'hexane et à l'acide sulfurique.
Méthode A
2. PRINCIPE
La matière grasse à analyser est chauffée à reflux à l'aide d'alcool méthy-
lique et de méthylate de sodium. Les esters méthyliques obtenus sont
extraits à l'éther éthylique.
3. MATÉRIEL
3.1. Ballon de 100 millilitres avec réfrigérant à reflux, muni à l'extrémité supé-
rieure d'un tube à chaux soudée, avec joints rodés.
3.2.►C1Éprouvettes ◄graduées de 50 millilitres.
3.3. Pipette graduée de 5 millilitres, avec subdivisions de 0,1 millilitre.3.4. Ampoules à décanter de 250 millilitres.
3.5. Ballon de 200 millilitres.
4. RÉACTIFS
4.1. Méthanol anhydre.
4.2. Méthylate de sodium, solution méthanolique à 1 % environ: cette solution
se prépare en dissolvant0,34 gramme de sodium mét allique dans 100 milli-
litres de méthanol anhydre.
4.3. Éther éthylique.4.4. Chlorure de sodium, solution à 10 %.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 53
▼B
4.5. Éther de pétrole à 40-60 ºC.
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Dans le ballon de 100 millilitres, introduire 2 grammes de matière grasse
préalablement déshydratée au sulfate de sodium et filtrée. Ajouter 35 milli-
litres de méthanol, adapter le réfrigérant et faire bouillir à reflux durant
quelques minutes.
5.2. Interrompre le réchauffement, détacher le réfrigérant et ajouter rapidement
3,5 millilitres de solution de méthylate de sodium; relier le réfrigérant et
faire bouillir à reflux durant 3 heures au moins. La méthylation est consi-
dérée comme complète quand toute la matière grasse est passée dans la
solution et que le mélange de réaction est parfaitement limpide à tempéra-
ture ambiante.
5.3. Refroidir et verser le mélange de réaction dans une ampoule à décanter de
250 millilitres, ajouter 35 à 40 millilitres d'éther éthylique, 100 millilitres
d'eau et 5 à 6 millilitres de solution de chlorure de sodium à 10 %. Agiter
et attendre la séparation des strates: la phase aqueuse est transférée dans
une deuxième ampoule à décanter et à nouveau extraite avec 25 millilitres
d'éther éthylique.
Ajouter à l'ensemble des extraits éthérés 50 millilitres d'éther de pétrole à
40-60 ºC; cela provoque la séparation de l'eau qui doit être éliminée.
Laver trois fois la phase éthérée avec des doses de 10 à 15 millilitres d'eau,
sécher sur le sulfate de sodium et filtrer sur papier en recueillant le filtrat
dans le ballon de 200 millilitres.
Distiller le solvant en en complétant l'allongement au bain-marie dans un
courantd'azot e pur.
Méthode B
2. PRINCIPE
La matière grasse à analyser doit être traitée au méthylate de sodium en
solution méthanolique, en fiole fermée, à 85-90 ºC.
3. MATÉRIEL
3.1. Fiole de verre à parois robustes, d'environ 5 millilitres (hauteur 40 à 45
millimètres; diamètre 14 à 16 millimètres).
3.2. Pipette graduée d'1 millilitre avec subdivisions de 0,1 millilitre.
4. RÉACTIFS
4.1. Méthylate de sodium, solution méthanolique à ►C11,5 % environ ◄.
Cette solution se prépare en dissolvant 0,50 gramme de sodium métallique
dans 100 millilitres de méthanol anhydre.
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Dans la fiole de verre, introduire 2 grammes de matière grasse préalable-
ment déshydratée au sulfate de sodium et filtrée. Ajouter 0,3 gramme
(environ 0,4 millilitre) de solution de méthylate de sodium et fermer la
fiole à la flamme.
5.2. Maintenir la fiole pendant deux heures dans un bain à 85-92 ºC et agiter de
temps en temps; c'est la limpidité du contenu de la fiole qui, après,
sédimentation de la glycérine et du résidu des réactifs, indique l'estérifica-
tion.
5.3. Ramener à température ambiante. Ouvrir la fiole au moment de l'emploi
des esters méthyliques. Ceux-ci ne demandent pas d'autre manipulation
avant l'introduction dans le chromatographe en phase gazeuse.
Méthode C
2. PRINCIPE
La matière grasse à analyser doit être traitée au méthanol et à l'acide chlor-
hydrique, en fiole fermée, à 100 ºC.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 54
▼B
3. MATÉRIEL
3.1. Fiole de verre, à parois robustes, d'environ 5 millilitres (hauteur 40 à 45
millimètres; diamètre 14 à 16 millimètres).
3.2. Pipettes graduées d'1 et de 2 millimètres.
4. RÉACTIFS
4.1. Solution méthanolique d'acide chlorhydrique à 2 %. À préparer avec de
l'acide chlorhydrique gazeux et du méthanol anhydre (note 1).
4.2. Hexane pour chromatographie en phase gazeuse.
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Introduire dans la fiole de verre 0,2 gramme de matière grasse préalable-
ment déshydratée au sulfate de sodium et filtrée, ainsi que 2 millilitres de
solution méthanolique d'acide chlorhydrique. Fermer la fiole à la flamme.
5.2. Maintenir la fiole dans un bain à 100 ºC durant quarante minutes.5.3. Refroidir la fiole à l'eau courante, ouvrir, ajouter 2 millilitres d'eau distillée
et 1 millilitre d'hexane. Centrifuger et prélever la phase hexanique, qui est
prête à l'emploi.
Méthode D
2. PRINCIPE
La matière grasse à analyser est saponifiée avec une solution méthylalcoo-
lique d'hydroxyde de potassium, puis traitée au sulfate diméthylique. Après
addition d'acide chlorhydrique, la séparation des esters méthyliques qui se
sont formés s'opère spontanément. Après traitement à l'alumine, on obtient
des esters méthyliques d'une grande pureté.
3. MATÉRIEL
3.1.►
C1Erlen en verre ◄, à parois robustes, d'une capacité de 20 millilitres
environ, avec bouchon rodé 10/19 et crochets de sécurité.
3.2. Réfrigérants à reflux à cinq boules, attache rodée 10/19.3.3. Filtres de verre à septum poreux, gradation G 2, diamètre 20 millimètres.3.4. Éprouvettes de verre, d'une capacité de 10 millilitres environ, à fond
conique.
3.5. Seringues d'1 etde 5 millilit res.
4. RÉACTIFS
4.1. Hydroxyde de potassium, solution à 10 % dans l'alcool méthylique pour
chromatographie en phase gazeuse.
4.2. Indicateur vert de bromocrésol: solution à 0,05 % dans l'alcool méthylique.4.3. Sulfate diméthylique (d = 1,335 à 15 ºC).4.4. Acide chlorhydrique concentré (d = 1,19) dilué 1 + 1 dans l'alcool méthy-
lique pour chromatographie en phase gazeuse.
4.5. Oxyde d'aluminium standardisé selon Brockmann pour chromatographie
d'absorption.
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Introduire dans l'éprouvette de 20 millilitres environ 2,2 millilitres de
matière grasse préalablement déshydratée au sulfate de sodium et filtrée,
ajouter 5 millilitres de la solution d'hydroxyde de potassium et quelques
granulés de quartz pour régulariser l'ébullition. Adapter le réfrigérant à
reflux et chauffer à flamme faible durant 5 minutes en agitant: la saponifi-
cation est complète lorsque la solution est limpide. Refroidir alors à l'eau
courante et détacher le réfrigérant.
5.2. Ajouter deux gouttes d'indicateur et, à l'aide d'une seringue, 1 millilitre de
sulfate diméthylique, lentement. Fermer hermétiquement l'éprouvette et
agiter 2 ou 3 minutes, en plongeant fréquemment le fond de l'éprouvette
dans un bain-marie en ébullition: la réaction est complète lorsque l'indica-
teur vire du bleu au jaune. Refroidir alors l'éprouvette à l'eau courante, puis1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 55
▼B
ouvrir et ajouter 5 millilitres de la solution méthanolique d'acide chlorhy-
drique.
5.3. Après avoir agité pendant quelques secondes, mettre l'éprouvette dans une
position inclinée, lui imprimer de faibles secousses facilitant l'affleurement
des esters méthyliques sous la forme d'une masse huileuse (note A).
Prélever les esters méthyliques au moyen d'une seringue, les introduire dans
une éprouvette à fond conique, ajouter un volume d'alumine égal à un quart
environ du volume des esters méthyliques, agiter et filtrer sur papier.
Note A: Si la séparation des esters méthyliques ne se produit pas spontané-
ment, ajouter 5 millilitres d'eau dans l'éprouvette et agiter.
Méthode E
2. PRINCIPE
La matière grasse à analyser est chauffée à l'aide d'un système à reflux,
avec du méthanol, de l'hexane et de l'acide sulfurique. Les esters méthyli-
ques obtenus sont extraits à l'éther de pétrole.
3. MATÉRIEL
3.1.►C1Erlen◄d'environ 20 millilitres, muni d'un réfrigérant à reflux à air,
d'une longueur d'1 mètre environ, avec joints rodés.
3.2. Pipette graduée de 5 millilitres.
3.3. Ampoule à décanter de 50 millilitres.
3.4. Tubes gradués de 10 etde 25 millilit res.3.5. Éprouvette de 15 millilitres, à fond conique.
4. RÉACTIFS
4.1. Réactifs de méthylation: méthanol anhydre, hexane, acide sulfurique
concentré (d = 1,84), dans un rapport de 75:25:1 (V/V/V).
4.2. Éther de pétrole à 40-60 ºC.
4.3. Sulfate de sodium anhydre.
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Dans l'éprouvette de 20 millilitres, introduire les produits provenant de la
plaque et ajouter 5 millilitres de réactif de méthylation.
5.2. Adapter le réfrigérant à reflux et chauffer durant 30 minutes dans un bain-
marie bouillant(not e 2).
5.3. Transférer le mélange dans une ampoule à décanter de 50 millilitres, à
l'aide de 10 millilitres d'eau distillée et de 10 millilitres d'éther de pétrole.
Agiter vigoureusement, attendre la séparation de phases, allonger la strate
aqueuse et laver la strate éthérée deux fois avec 20 millilitres d'eau
distillée. Ajouter dans l'ampoule à décanter une petite quantité de sulfate
de sodium anhydre, agiter, laisser reposer durant quelques minutes et filtrer,
recueillir ensuite le filtrat dans une éprouvette de 15 millilitres à fond
conique.
Évaporer le solvantau bain-marie, dans un courantd'azot e.
Note 1: Il est possible de préparer aisément de petites quantités d'acide
chlorhydrique gazeux en laboratoire en modifiant la solution dispo-
nible dans le commerce ( ρ= 1,18) par ajout de quelques gouttes
d'acide sulfurique concentré ( ρ= 1,84). Le gaz libéré peutêt re
facilementséché si on le faitbarbot er dans l'acide sulfurique
concentré. L'acide chlorhydrique étant rapidement absorbé par le
méthanol, il est recommandé de prendre les précautions habituelles
lors de la dissolution, par exemple en introduisant le gaz par une
petite ampoule renversée dont le rebord effleure la surface du
liquide. La solution méthanolique d'acide chlorhydrique peut être
préparée en grandes quantités à l'avance, puisqu'elle se conserve
parfaitement dans des bouteilles à bouchon de verre conservées
dans l'obscurité.
Note 2: Pour contrôler l'ébullition, introduire une baguette de verre dans
l'éprouvette et limiter la température du bain-marie à 90 ºC.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 56
▼B
ANNEXE XI
DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN SOLVANTS HALOGÉNÉS
VOLATILS DANS L'HUILE D'OLIVE
1. PRINCIPE
Analyse par chromatographie en phase gazeuse selon la technique de
l'espace de tête (head space) .
2. APPAREILLAGE
2.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse, équipé d'un détecteur à
capture d'électrons (ECD).
2.2. Appareillage pour espace de tête (head space) .
2.3. Colonne de chromatographie en phase gazeuse en verre de 2 mètres de
long et de 2 millimètres de diamètre, phase stationnaire.
OV101 à 10 % ou équivalent, imprégnant une terre de diatomée calcinée,
lavée aux acides etsilanisée, de granulomét rie de 80 à 100 Mesh.
2.4. Gaz vecteur et gaz auxiliaire: azote pour chromatographie en phase
gazeuse, adaptée à la détection par capture d'électrons.
2.5. Flacons en verre de 10 à 15 millimètres munis d'une garniture en téflon et
d'un bouchon en aluminium muni d'un office pour prélèvementpar
seringue.
2.6. Pinces à fermeture hermétique.2.7. Seringue pour gaz de 0,5 à 2 millilitres.
3. RÉACTIFS
Standard: solvants halogénés volatils à un degré de pureté approprié à un
usage de chromatographie en phase gazeuse.
4. PROCÉDURE D'ANALYSE
4.1. Peser exactement environ 3 grammes d'huile dans un flacon en verre (à ne
pas réutiliser), boucher le flacon jusqu'à fermeture hermétique. Introduire le
flacon dans un thermostat à 70 ºC pendant 1 heure. Prélever avec précision
au moyen de la seringue un volume de 0,2 à 0,5 millilitre de l'espace de
tête. L'injecter dans la colonne de l'appareil de chromatographie en phase
gazeuse réglé comme suit:
— température injecteur: 150 ºC,
— température colonne: 70 à 80 ºC,— température détecteur: 200 à 250 ºC.
4.2. Solutions de référence. Préparer des solutions standard, en utilisant de
l'huile d'olive raffinée sans trace de solvants, à des concentrations variables
ent re 0,05 et1 milligramme par kilogramme eten rapportà la t eneur
présumée de l'échantillon. La dilution éventuelle doit être effectuée avec
du pentane.
4.3. Évaluation quantitative. Faire le rapport entre les surfaces ou les hauteurs
des pics de l'échantillon et de la solution standard ayant la concentration
présumée le plus proche. Si l'écartrelat if estsupérieur à 10 %, il estnéces-
saire de refaire l'analyse par comparaison avec une nouvelle solution
standard jusqu'à ce que sa concentration respecte l'écart relatif susmen-
tionné. La teneur est établie sur la base d'une moyenne d'injections
élémentaires.
4.4. Expression des résultats. Les résultats sont exprimés en milligrammes par
kilogramme (ppm). La limite de détection de la méthode est de 0,01 milli-
gramme par kilogramme.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 57
▼B
ANNEXE XII
ÉVALUATION ORGANOLEPTIQUE DE L'HUILE D'OLIVE VIERGE
1. OBJET
La présente méthode a pour but d'établir les critères nécessaires à l'éva-
luation des caractéristiques de la flaveur de l'huile d'olive vierge et de
développer la méthodologie nécessaire.
2. DOMAINE D'APPLICATION
La méthode décrite n'est applicable qu'à l'évaluation et à la classification
organoleptique de l'huile d'olive vierge utilisable pour la consommation
directe. Elle se limite à classer l'huile vierge dans une échelle numérique
établie en rapport avec la perception des stimuli de sa flaveur, d'après le
jugement d'un groupe de dégustateurs sélectionnés, constitués en jury.
3. VOCABULAIRE GÉNÉRAL DE BASE DE L'ANALYSE SENSO-
RIELLE
Se référer au chapitre «Analyse sensorielle: vocabulaire général de base».
4. VOCABULAIRE SPÉCIFIQUE POUR L'HUILE D'OLIVE
4.1. Sensations agréables, suscitées par les attributs caractéristiques de qualité
des huiles d'olive vierges:
Fruité: flaveur qui rappelle à la fois l'odeur etle goûtdu fruitsain et
frais, récolté au stade optimal de maturité.
Fruité mûr: flaveur de l'huile d'olive tirée de fruits mûrs, généralement
d'odeur effacée etde saveur sucrée.
Fruité vert: flaveur de l'huile tirée de fruits encore verts.
4.2. Sensations plus ou moins agréables en fonction de l'intensité avec
laquelle elles sontperçues, qui ne sontpas à considérer comme des
défauts, mais qui ont une influence sur l'harmonie du fruité:
Pomme: flaveur de l'huile d'olive qui rappelle ce fruit.
Doux: saveur agréable de l'huile pas expressémentsucrée, dans laquelle
les attributs amers, astringents et piquants ne prédominent pas.
Herbe: flaveur caractéristique de certaines huiles qui rappelle celle de
l'herbe fraîchementfauchée.
Feuilles vertes (amer): flaveur de l'huile obtenue d'olives trop vertes ou
qui ontét é broyées mélangées aux feuilles etbrindilles.
Amer: goût caractéristique de l'huile obtenue d'olives vertes ou au stade
de la véraison. Il peut être plus ou moins agréable en fonction de son
intensité.
Âpre: sensation caractéristique chez certaines huiles dont la dégustation
provoque une réaction kinesthésique bucco-tactile d'astringence.
Piquant: sensation gustative de picotement, caractéristique des huiles
produites au début de la campagne, principalement à partir d'olives
encore vertes. Elle est due à l'action des substances phénoliques sur les
terminales du nerf trijumeau qui s'étendent sur toute la cavité buccale.
Amande: cette flaveur peut revêtir deux formes différentes: l'une typique
de l'amande fraîche, l'autre propre de l'amande sèche et saine qui peut
être confondue avec un début de rance. Un arrière-goût tout à fait singu-
lier estperçu lorsque l'huile demeure en cont actavec la langue etle
palais. Elle est associée aux huiles douces et à l'odeur éteinte.
Plat ou éteint: flaveur de l'huile d'olive dont les caractéristiques organo-
leptiques sont très faibles par suite de la perte de leurs constituants
aromatiques.
Foin: flaveur caractéristique de certaines huiles qui rappelle celle de
l'herbe plus ou moins desséchée.
4.3. Sensations toujours désagréables, même si leur intensité est à peine
perceptible, à considérer comme des défauts organoleptiques:1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 58
▼M3
▼M3
Sparte: flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives pressées dans
des scourtins en sparte neufs. La flaveur peut être différente selon qu'il
s'agisse de scourtins fabriqués à partir de sparte vert ou de sparte sec.
Terre: flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives ramassées avec
de la terre ou boueuses et non lavées. Dans certains cas, cette flaveur
peutêt re accompagnée de celle de moisi.
Vieux ou renfermé: flaveur caractéristique de l'huile lorsqu'elle demeure
trop longtemps dans les récipients de stockage. Elle peut également être
relevée chez des huiles conditionnées pendant une période de temps trop
prolongée.
Ver: flaveur caractéristique de l'huile issue d'olives ayant subi une forte
attaque de larves de la mouche de l'olive (Dacus oleae) .
Métallique: flaveur qui rappelle les métaux. Elle est caractéristique de
l'huile qui est demeurée longtemps en contact avec des aliments ou des
surfaces métalliques, dans des conditions impropres, au cours des
processus de broyage, de malaxage, de pression ou de stockage.
Moisi-humide: flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives attaquées
par des moisissures et des levures par suite d'un chômage des fruits
pendantplusieurs jours etdans l'humidit é.
Rance: flaveur caractéristique et commune à toutes les huiles et graisses
ayant subi un processus d'auto-oxydation, par suite d'un contract prolongé
avec l'air. Cette flaveur est désagréable et irréversible.
Chômé: flaveur caractéristique de l'huile tirée d'olives amoncelées dans
un état avancé de fermentation.
Saumure: flaveur de l'huile obtenue d'olives conservées dans des solu-
tions salines.
Grignons: flaveur caractéristique qui rappelle celle des grignons d'olive.
Savonneux: flaveur donnant lieu à une sensation olfacto-gustative rappe-
lantcelle du savon vert .
Margines: flaveur caractéristique acquise par l'huile à la suite d'une
mauvaise décantation et d'un contact prolongé avec les eaux de végéta-
tion.
Vineux-vinaigré: flaveur caractéristique de certaines huiles rappelant le
vin ou le vinaigre. Cette flaveur est due fondamentalement à la formation
d'acide acétique, acétate d'éthyle et éthanol, en quantités supérieures à la
normale dans l'arôme de l'huile d'olive.
Concombre: flaveur de l'huile qui se produit à la suite d'un conditionne-
ment hermétique excessivement prolongé, notamment dans des récipients
en fer-blanc, et qui est attribuée à la formation de 2-6 nonadiénal.
Cuit ou brûlé: flaveur carctéristique des huiles qui tire son origine d'un
réchauffement excessif et/ou prolongé au cours de son obtention et tout
particulièrement pendant le thermo-malaxage de la pâte, si celui-ci est
réalisé dans des conditions inappropriées.
Lies: flaveur caractéristique de l'huile récupérée des boues décantées dans
les piles etréservoirs sout errains.
Scourtin: flaveur caractéristique de l'huile obtenue d'olives pressées dans
des scourtins salis de résidus fermentés.
Lubrifiants: odeur de l'huile d'olive obtenue dans une huilerie dont l'équi-
pement d'extraction n'a pas fait l'objet de l'élimination appropriée des
résidus de pétrole, de graisse ou d'huile minérale.
Grossier: perception caractéristique chez certaines huiles dont la dégusta-
tion provoque une sensation bucco-tactile dense et pâteuse.
5. VERRE POUR LA DÉGUSTATION DES HUILES
Se référer au chapitre «Verre pour la dégustation des huiles».
6. SALLE DE DÉGUSTATION
Se référer au chapitre «Guide pour l'installation d'une salle de dégusta-
tion».1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 59
▼B
▼B
7. USTENSILES
Chaque cabine doit être munie des ustensiles nécessaires et à la portée du
dégustateur afin de lui permettre de remplir convenablement sa tâche, à
savoir:
— verres (normalisés) contenant les échantillons marqués en code au
niveau de deux chiffres pris au hasard, ou avec des chiffres etdes
lettres. Les inscriptions sont à faire au crayon indélébile et inodore,
— verres de montre, portant les mêmes inscriptions, pour couvrir les
verres,
— feuille de notation (voir figure 2), complétée avec les instructions
d'emploi,
— crayon ou stylo à bille,— plateaux avec des rouelles de pomme,— un verre d'eau à la température ambiante.
8. MÉTHODOLOGIE
Cette section établit les connaissances préalables qui s'avèrent nécessaires
pour la réalisation de l'analyse sensorielle des huiles d'olive vierges et
s'attache à normaliser la conduite et la façon de procéder des dégustateurs
devant intervenir dans les essais, auxquels il appartiendra de prendre
connaissance aussi bien des recommandations à caractère général que
des recommandations spécifiques pour la dégustation des huiles d'olive.
8.1.Rôle de l'organisateur ou responsable du jury (ou groupe de dégusta-
teurs)
L'organisateur du jury doit jouir d'une formation solide, tout en étant un
connaisseur et un expert averti de tous les types d'huile auxquels il aura
affaire au cours de son travail. Il est la clef du jury et le responsable de
son organisation et de son fonctionnement. Il doit convoquer suffisam-
ment à l'avance les dégustateurs et s'attachera à leur éclaircir tout doute
susceptible de surgir quant à la réalisation des essais, tout en s'abstenant
de leur suggérer des opinions, quelles qu'elles soient, sur l'échantillon.
Il est le responsable de l'inventaire des ustensiles, de leur parfait
nettoyage, de la préparation et de la codification des échantillons, ainsi
que de leur présentation aux dégustateurs conformément au protocole
d'essai retenu, du recueil des données et de leur traitement statistique,
afin d'obtenir les meilleurs résultats avec le moindre effort.
Le travail du responsable du jury requiert de l'adresse sensorielle, de la
méticulosité dans la préparation des essais, de l'ordre strict pour leur
exécution, ainsi que de l'habileté et de la patience pour planifier et effec-
tuer les essais. Le responsable du jury a en outre pour mission de relever
le moral des membres du groupe, en stimulant entre eux l'intérêt, la
curiosité et l'esprit compétitif. Il doit éviter que son opinion soit connue
et empêcher que les critères dominants de leaders éventuels ne l'empor-
tent sur les dégustateurs restants. Il est également de son ressort de
veiller à l'entraînement, à la sélection et au contrôle des dégustateurs,
afin de s'assurer qu'ils se maintiennent sur un niveau d'aptitude adéquat.
8.2.Conditions de l'essai
8.2.1. Volume de l'échantillon
Chaque verre doit contenir 15 millilitres d'huile.
8.2.2. Température de l'essai
Les échantillons d'huile à déguster doivent être maintenus dans les verres
à une température de 28 ºC ± 2 ºC. Cette température a été retenue du
faitqu'elle permetle plus aisémentde relever des différences organolep-
tiques, à température normale, lorsque les huiles sont utilisées comme
condiment. Une autre raison à l'appui du choix de cette valeur réside
dans le fait que des températures plus basses ou plus élevées produisent
une faible volatilisation des composants aromatiques ou au contraire vola-
tils qui sont propres aux huiles chauffées.
8.2.3. Horaire des essais
Pour la dégustation des huiles, les heures de travail optimales sont celles
de la matinée: il est prouvé que des périodes de perception optimale pour
le goûtetl'odoratexist entpendantla journée.
Une période d'acuité olfacto-gustative accrue précède les repas qui sont
suivis par une diminution de cette acuité.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 60
▼B
Toutefois, ce critère ne doit pas être poussé à l'extrême, au point que la
faim puisse constituer un facteur de distraction chez les dégustateurs et
être à l'origine d'une réduction de leur capacité de discrimination et,
notamment, de leurs critères de préférence et d'acceptation.
9. DÉGUSTATEURS
Les personnes intervenant en qualité de dégustateurs dans les essais orga-
noleptiques d'huiles d'olive alimentaires doivent être entraînées et choisies
en fonction de leur habilité à faire la distinction entre échantillons simi-
laires; il y a lieu de ne pas perdre de vue que la précision améliore avec
l'entraînement (voir section s'y rapportant).
Pour chaque essai il faut disposer de huit à douze dégustateurs. Toutefois,
il convient de prévoir quelques dégustateurs supplémentaires auxquels on
peutfaire appel en cas d'absences évent uelles.
9.1.Règles générales de conduite à observer par les candidats et les
dégustateurs
Les présentes recommandations visent le comportement devant être
observé par les candidats et les dégustateurs au cours de leur travail.
Dès réception de la communication du responsable du jury l'invitant à
intervenir dans un essai organoleptique, le dégustateur doit être en mesure
de l'effectuer aux heures indiquées et est tenu au respect des règles ci-
après.
9.1.1. S'abstenir de fumer pendant au moins 30 minutes avant l'heure fixée pour
l'essai.
9.1.2. Ne pas utiliser un parfum, un cosmétique ou un savon dont l'odeur pour-
rait persister au moment de l'essai. Les mains doivent être lavées avec un
savon non parfumé ou peu parfumé, puis rincées etséchées aut antde fois
que nécessaire pour éliminer toute trace d'odeur.
9.1.3. Ne rien manger pendant au moins une heure avant la dégustation.9.1.4. Dans l'hypothèse où ses conditions physiologiques seraient affectées,
notamment son sens de l'odorat ou du goût, ou s'il se trouve sous le
coup d'un effetpsychologique quelconque qui l'empêcheraitde se concen-
trer, il doit prévenir le responsable du jury afin que celui-ci le retire du
test ou prenne les décisions opportunes, compte tenu de la possibilité
pour ce dégustateur de s'écarter des valeurs moyennes du reste des
membres du jury.
9.1.5. Après avoir rempli les règles précitées, le dégustateur doit s'installer dans
la cabine qui lui a été assignée, d'une manière aussi ordonnée et silen-
cieuse que possible.
9.1.6. Une fois assis, il doitvérifier si le mat ériel dontil a besoin estbien rangé
eten règle etsi l'inscript ion en code de chaque verre correspond bien à
celle apposée sur le verre de montre le recouvrant.
9.1.7. Il doit lire attentivement les instructions figurant dans la feuille de nota-
tion et ne commencer l'examen de l'échantillon que lorsqu'il se sera tout à
fait identifié et familiarisé avec la tâche dont il doit s'acquitter. En cas de
doute, il doit s'adresser au responsable du jury pour discuter en privé avec
lui des difficultés recontrées.
9.1.8. Le dégustateur doit prendre le verre, en le maintenant couvert avec le
verre de montre, puis l'incliner légèrement et dans cette position il le
fera tourner entièrement afin d'en mouiller le plus possible la surface in-
térieure. Après cette opération, il doit enlever le verre de montre et flairer
l'échantillon par des inspirations suaves, lentes et intenses, pour pouvoir
se faire un critère sur l'échantillon soumis à son apréciation. La durée de
l'olfaction ne doit pas dépasser 30 secondes. Si pendant ce temps le
dégustateur n'est parvenu à aucune conclusion, il doit faire une pause
avant de procéder à une nouvelle tentative. Une fois conclu l'essai
olfactif, il est procédé au jugement de la flaveur (ensemble des sensations
olfacto-gustativo-tactiles). Pour ce faire, prendre une petite gorgée d'huile,
de 3 millilitres environ. Il est très important de distribuer l'huile sur toute
la cavité buccale, depuis la partie antérieure de la bouche et la langue, en
passant par les parties latérales et la partie postérieure jusqu'au voile du
palais; comme chacun sait, les quatre saveurs fondamentales (sucrée,
salée, acide etamère) sonten effetperçues avec une int ensit é variable
selon les différentes zones de la langue et du palais.
Il y a lieu d'insister sur la nécessité de répandre l'huile en quantité suffi-
sante et très lentement sur la partie postérieure de la langue jusqu'au voile
du palais et la gorge, en concentrant l'attention sur l'ordre d'apparition des1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 61
▼B
stimuli amer et piquant; s'il n'est pas procédé ainsi, chez certaines huiles
ces deux stimuli peuvent passer inaperçus ou encore le stimulus amer
peut être masqué par le stimulus piquant.
Des aspirations brèves et successives, en faisant pénétrer de l'air par la
bouche, permettent non seulement de répandre l'échantillon sur toute la
cavité buccale, mais également de percevoir par voie rétro-nasale les
composants volatils aromatiques.
La sensation tactile doit aussi être prise en considération. C'est ainsi que
la fluidité, l'empâtement et la démangeaison ou picotement doivent être
annotés dès détection et, si l'essai l'exige, il faut en quantifier l'intensité.
9.1.9. L'évaluation organoleptique d'une huile d'olive vierge doit porter sur un
seul échantillon par séance, dans le souci d'éviter l'effet de contraste que
pourrait provoquer la dégustation immédiate d'autres échantillons.
Étant donné que les dégustations successives sont affectées par la fatigue
ou par la perte d'acuité, causées par les précédentes, il importe d'utiliser
un produitcapable d'éliminer de la bouche les rest es d'huile de la dégus-
tation venant d'être effectuée.
Il est recommandé d'utiliser un petit morceau de pomme de quelque 15
grammes qui, après mastication, peut être jeté dans le crachoir. Par la
suite, se rincer la bouche avec un peu d'eau à la température ambiante.
Laisser passer au moins 15 minutes avant de procéder à la dégustation
suivante.
9.2.Présélection des candidats
Il appartiendra au responsable du jury, moyennant des entrevenues
personnelles, d'opérer cette présélection qui a pour but de connaître la
personnalité des candidats et les conditions qui les entourent. Pour ce
qui estdes condit ions physiologiques etpsychologiques, celles à remplir
par les candidats ne sont pas très rigoureuses du fait que, en principe,
toute personne normale est susceptible de déployer cette activité. Les
conditions en matière d'âge, de sexe, et certaines habitudes (fumer), etc.
passent de nos jours au second plan face à d'autres aspects, tels que: la
santé, l'intérêt personnel et le fait d'avoir du temps disponible pour ce
travail.
Lors de l'entrevue, le responsable du jury doit expliquer au candidat les
caractéristiques de la fonction qu'il va assurer et lui dire combien de
temps cela va à peu près l'occuper. Par la suite, le responsable du jury
doit obtenir du candidat des données lui permettant d'en évaluer à la fois
l'intérêt et la motivation, tout en lui demandant d'indiquer combien de
temps il va pouvoir réellement consacrer à cette activité. Le questionnaire
ci-après peutservir de référence.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 62
▼B
(1)
C'estsur la base des données ainsi recueillies que le responsable du jury
va effectuer la présélection. Les candidats faisant preuve de peu d'intérêt
pour ce genre de travail, ayant peu de temps disponible ou incapables de
préciser leurs idées, serontéliminés.
9.3.Déterminationdu«seuilmoyen»dugroupepourdes«attributscarac-
téristiques»
Choisir soigneusementquat re huiles, de manière que chacune d'elles soit
considérée comme étant représentative des attributs: chômé, vineux, rance
et amer, avec une intensité aussi marquée et nette que possible.
Prélever une partie aliquote de chacune desdites huiles et préparer des
échantillons à différentes concentrations (raison 2) par dilutions succes-
sives avec le supportapproprié jusqu'à ce que, dans les deux ou t rois
dernières dilutions, il ne soit plus possible de détecter de différence avec
le verre contenant uniquement le support. Un dernier couple doit être
formé par deux verres contenant le support.
La série doit être complété par des verres à des concentrations supé-
rieures, jusqu'à huit au total.
Préparer une quantité suffisante d'échantillons aux différentes concentra-
tions afin de pouvoir remettre des séries complètes de chaque attribut à
chacun des candidats.
Pour pouvoir établir le «seuil moyen» des candidats au regard de chaque
attribut, il faut leur présenter un verre contenant 15 millilitres de l'une
quelconque des concentrations préparées, en même temps qu'un verre
contenant uniquement 15 millilitres du «support». Après avoir réalisé1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 63
(1) Prière de préciser quel est, à votre avis, l'intérêt que peut présenter l'évaluation de tout
aliment, ou encore de l'huile d'olive, sous l'angle de ses caractéristiques organolepti-
ques.
▼B
l'essai, le candidat doit indiquer si le contenu des verres est identique ou
différent.
Le même essai doit être répété en ce qui concerne les concentrations
restantes de l'attribut étudié.
Noter le nombre de réponses correctes obtenues, au regard de chaque
concentration, de l'ensemble des candidats et l'exprimer en pourcentage
du nombre d'essais effectués.
Représenter par ordre croissant, en abscisses, les concentrations testées et,
en ordonnées, le pourcentage des identifications correctes intervenues au
regard de chaque concentration.
La figure 1 donne un exemple pratique des développements qui précè-
dent. Le seuil de détection est défini sur abscisses en extrapolant de la
courbe le pointde l'ordonnée correspondantà 75 % des réponses exact es.
Cette concentration «seuil» qui peut être différente pour chaque huile de
départ, car elle est fonction de l'intensité de l'attribut présent, doit être
similaire pour les différents groupes de candidats de divers jurys; elle
n'est tributaire d'aucune coutume, habitude ou préférence tendancieuse. Il
s'agit, en conséquence, d'un point de repère commun à tout groupe
humain normal et peut servir à l'homogénéisation des différents jurys
seulement en raison de leur acuité olfacto-gustative.
À partir de la concentration «seuil» du groupe ainsi obtenue, procéder
comme suit.
Préparer une série de concentrations croissantes et décroissantes de sorte
que cette «concentration seuil» se situe à l'échelon 10 de cette échelle. Il
appert que des concentrations 11 et 12 seront plus diluées et, dès lors, il
sera très difficile de détecter chez elles la présence de l'huile avec
l'attribut choisi.
À partir de la concentration C10, les échantillons restants peuvent être
préparés par application de la formule suivante:
C10×an, où: «a» est une constante qui correspond au facteur de dilution
égal à 1,5 et«n» l'exposantqui varie de 9 à − 2.
Par exemple: posantque le seuil obt enu pour l'huile rance estégal à 0,32,
que la C10estégale à 0,32 etcomme «a» estégal à 1,5, la série d'échan-
tillons aura les concentrations suivantes:
Échantillon 1 2 3456789 1 0 1 1 1 2
Concentration 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
S'il est procédé de la même façon pour les trois autres attributs, l'on
obtiendra, à partir des seuils respectifs calculés également comme indiqué
ci-dessus, des échelles qui présenteront pour tous les laboratoires des
intensités aromatiques similaires pour chaque stimulus bien que les huilesde départ aient des défauts perceptibles à des intensités différentes.
9.4.Sélection de dégustateurs par la méthode de «classification d'inten-
sité»
La sélection doit intervenir à partir d'un nombre de candidats deux ou
trois fois supérieur à celui jugé nécessaire pour la constitution de l'équipe
de dégustateurs, afin de faciliter le choix des plus sensibles ou de ceux
faisant preuve d'une capacité de discrimination plus poussée. Il est recom-
mandé en tous cas de réaliser les essais avec le même produit qui fera
l'objet d'analyse par la suite (au cas particulier, il y a lieu d'utiliser
toujours de l'huile d'olive).1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 64
▼B
Figure 1
Pour le choix de la méthode, il y a lieu de ne pas perdre de vue, indépen-
damment de son efficacité, que la procédure à retenir doit être la plus
économique possible quant à la quantité d'huile, au nombre d'échantillons
à utiliser et au temps réservé à la sélection. L'efficacité d'une procédure
de sélection se caractérise par le choix des niveaux optimaux des trois
variables dépendantes ci-après: a) «coût» déterminé par le nombre
d'essais; b) «proportion» de candidats potentiellement aptes, mais qui
par hasard ont été malheureusement éliminés lors de la sélection et c)
«proportion» de candidats non aptes mais qui, par un hasard favorable,
ont été acceptés alors qu'ils n'auraient pas dû l'être.
La procédure de sélection retenue est celle décrite sous le titre de «The
intensity rating test» (essai de classification d'intensité) dans les normes
A.S.T.M. (American Society for Testing and Materials Publication),
S.T.P. (Special Technical Publication) no440, page 53, modifiée sur
quatre points:
1) réduction du nombre d'échantillons dans la série;
2) extension des stimuli, à l'effet d'augmenter le nombre de notations
olfacto-gustatives sur lesquelles est basée la sélection, dans le souci
de les adapter aux défauts les plus communs perceptibles dans l'huile
d'olive;
3) variation de la relation de concentration dans la série;4) traitement statistique des résultats.
Matériel nécessaire— Bouteilles ou ballons de 1 500 millilitres
— Verres à dégustation de couleur foncée
— Éprouvettes de 10, 15, 1 000 et 1 500 millilitres.
Produits nécessaires— Paraffine Merck (référence 7.160, DAB 8, USP XX) ou support
huileux inodore etinsipide (huile d'olive ou aut re similaire, récem-
mentraffinée)
— Huiles: chômée, vineuse, rance etamère.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 65
▼B
9.4.1. Mode opératoire
Après avoir préparé les dilutions, passer à la sélection en commençant par
vingt-cinq candidats, conformément à la méthodologie qui sera expliquée
ci-après pour chaque stimulus.
1) Préparer des séries de douze verres à dégustation, marqués en code
(une série par candidat). Verser dans chaque verre 15 millilitres de
chacune des différentes concentrations, préparées d'après la formule
C10×an.
2) Une fois remplis et couverts avec le verre de montre, les verres
doivent rester dans la salle de dégustation à une température de 20 à
22 ºC pendantau moins une heure avantle commencementdes essais
afin d'homogénéiser leur température avec la température ambiante.
3) Le responsable de l'essai alignera ensuite les douze verres de chaque
série, par ordre décroissant de concentration.
Par la suite, chaque candidat est invité à réaliser l'essai séparément, en
suivant les instructions ci-après.
9.4.2. Instructions pour le candidat
Les douze verres rangés en ligne devantle candidatcont iennentdes dilu-
tions de chacun des stimuli chômé, vineux, rance ou amer, selon le cas.
Les verres se distinguent les uns des autres par l'intensité de l'odeur, étant
précisé que celui à l'odeur la plus intense est placé à l'extrême gauche,
l'intensité de l'odeur des verres restants diminuant graduellement vers la
droite. Le dernier verre à droite peut présenter une odeur tellement faible
qu'il sera peut-être impossible de la détecter.
Procédez comme suit: familiarisez-vous avec les odeurs dégagées par les
verres de la série. Pour ce faire, commencez par celui qui se trouve à
droite (no12) et efforcez-vous de retenir l'intensité des odeurs, sans pour
autant vous fatiguer.
À partir du moment où vous estimez que vous vous êtes habitué à
l'échelle de concentration des odeurs dégagées par les verres de la série,
sortez de la pièce.
Pendantce t emps, le responsable de l'essai choisira un verre de la série et
le placera au même niveau que le dernier à droite (no12) tout en rappro-
chant les verres restants pour combler le vide laissé par celui qu'il a
choisi. Retournez alors dans la pièce pour poursuivre l'essai.
La preuve demandée estla suivant e.
Le verre qui a été choisi par le responsable de l'essai doit être replacé à
sa place exacte dans la série. Pour ce faire, vous pouvez le flairer et le
comparer aux verres restants autant de fois que nécessaire, étant précisé
que si vous voulez le replacer à son endroitexactdans la série, vous ne
devez pas oublier que l'odeur qu'il dégage doit être plus intense que celle
du verre placé immédiatement à droite et moins intense que celle du
verre placé immédiatement à gauche. L'essai est à répéter avec troisautres verres.
Dans le but de faciliter l'opération et le recueil des réponses, il doit être
remis à chaque candidat, outre les instructions précitées, le relevé suivant.
9.4.3. Obtention des résultats
Pour faciliter la mise en ordre des données de chacun des candidats, le
responsable du jury doit les noter de la manière suivante:1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 66
▼B
9.4.4. Procédure statistique de notation
Au cas particulier de la sélection effectuée, les verres qui sont à replacer
à leur endroit exact doivent être les mêmes pour les candidats. Conformé-
ment aux calculs statistiques réalisés à cet effet, ces verres correspondent,
dans l'ordre de la série, aux places ci-après pour chaque stimulus:
Chômé (Ch) Vineux (Vi) Rance (Ra) Amer (Am)
Verre noVerre noVerre noVerre no
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Le numéro correspondantà la place occupée par les verres dans l'ordre de
la série ne peut pas être modifié, étant donné que les calculs statistiques
pour cet essai ont été réalisés en tenant compte de la probabilité que les
verres indiqués soientreplacés à leur endroitexactpar hasard.
Néanmoins, à l'effet d'éviter de laisser filtrer des informations d'un
candidatà l'aut re, le responsable du jury doitveiller à:
1) empêcher toute communication entre les candidats. Modifier le code
pour chaque candidat;
2) empêcher que les candidats aient connaissance de la place occupée par
les verres qu'on leur a retiré,
3) modifier l'ordre de remise des verres, à chaque candidat, bien que
ceux-ci soientles mêmes pour t ous.
Chaque candidat recevra ensuite une notation en fonction des résultats
qu'il aura obtenus. Pour ce faire, procéder comme suit:
Désigner par ei
1,ei
2,…ei
12les douze verres contenant les douze concen-
trations correspondantes d'un stimulus «i» (i = n'importe lequel des quatre
stimuli: chômé, vineux, rance et amer) alignés par ordre décroissant de
l'intensité du stimulus considéré.
Designer par ei
kun des verres choisis etpar K ′la position que le candidat
aura assignée au verre au momentde le replacer dans la série. Les valeurs
de K etK ′sont, en conséquence, des nombres entiers compris entre 1 et
12 inclus, qui correspondentaux posit ions réelle etassignée par lecandidat, respectivement.
Désigner par T (écartmaximal admis) une valeur, fixée au préalable,
dans notre cas égale à 3, de manière, que si (K ′− K) > T, le candidat
soit automatiquement éliminé (
1).
Par contre, si (K ′−K )≤T, le candidat, en principe, n'est pas éliminé et
peut, dès lors, poursuivre l'essai, du fait qu'il s'est révélé capable de
replacer le stimulus considéré à sa place exacte ou tout au moins aux
endroits immédiats les plus proches.
Dans ce cas, la notation assignée à un candidat lorsqu'il évalue un
stimulus (concentration) déterminé, par exemple de la série «chôme»
(Ch), estégale au carré de la différence ent re le numéro d'ordre qui
correspond à la place exacte occupée par le verre dans la série et celle à
laquelle il a été replacé par le candidat, à savoir:
Ph(Ch)=( K′−K )2
Étant donné que cette opération doit être réalisée par chaque candidat sur
quatre concentrations de la série de chaque stimulus, la notation partielle
pour ledit stimulus (Ch par exemple) serait la suivante:1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 67
(1) Le responsable du jury voudra bien insister auprès du candidat afin que l'essai se réalise
raisonnablement, c'est-à-dire sans qu'il y ait perte d'acuité par fatigue olfative.
▼B
ZCh=PhCh+PjCh+PlCh+PmCh
Dans un souci de meilleure compréhension, voici les exemples ci-après:
Exemple no1:
Supposons que les réponses du candidatA, en ce qui concerne les quat re
concentrations du stimulus (i) qui ont été retirées de la série, sont les
suivantes:
Place exacte du
verre dans la série
(K)Place à laquelle le
verre a été rangé par
le candidat(K ′)Écartde la place exact e
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Ce candidatestéliminé, du faitque sa valeur T estsupérieure à 3.
Exemple no2:
Supposons qu'un autre candidat replace les quatre concentrations du
stimulus considéré comme suit:
Place exacte du
verre dans la série
(K)Place à laquelle le
verre a été rangé par
le candidat(K ′)Écartde la place exact e
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 4 4−4=−0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Ce candidat n'est pas éliminé, la notation qui lui est assignée au regard de
ce stimulus étant:
Zi=O2+O2+32+( −1 )2=1 0
La notation finale du candidat aux fins de sa sélection ou non en tant que
dégustateur en fonction de ses réponses au regard des quatre stimuli
considérés se présente comme suit:
PhCh+PjCh+PlCh+PmCh=ZCh
PhVi+PjVi+PlVi+PmVi=ZVi
PhRa+PjRa+PlRa+PmRa=ZRa
PhAm+PjAm+PlAm+PmAm=ZAm
Z final = ZCh,+…+ZAm
où:
Ch: = Chômé;
Vi: = Vineux;
Ra: = Rance;Am: = Amer.
Il s'agit maintenant de déterminer jusqu'à quelle valeur maximale de Z il
estpossible de considérer que le candidatpossède de bons niveaux de
perception, de mémoire olfactive et d'organisation mentale pour donner
la réponse appropriée au regard des quatre stimuli considérés. De toute
évidence, Z est toujours une valeur non négative et Z = O signifie que
le candidat a reconnu et quantifié correctement l'ensemble des seize
intensités qui lui ont été présentées (quatre pour chaque stimulus). Des
valeurs de Z distinctes de O indiquent que le candidat a reconnu les
zones des échelles où se situent les intensités choisies, mais que, à inté-
rieur de ces zones, il n'a pas été en mesure de replacer le stimulus à sa
place exacte du fait qu'il ne possède pas une bonne capacité de discrimi-1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 68
▼B
nation, associés à la gamme d'intensité qui lui a été présentée pour un ou
plusieurs des stimuli considérés.
Ainsi donc, il y aura lieu de déterminer une valeur critique Z telle que,
dans l'hypothèse où le candidat replacerait tous les verres au hasard à
l'intérieur des zones qu'il avait reconnues auparavant, la probabilité d'une
notation définitive Z, inférieure à Zc, soit une quantité suffisamment
petite ( α)qui peut être fixée au préalable. En d'autres termes, il faut
s'assurer que la probabilité, par ce procédé, de sélectionner un dégustateur
pour le jury ne réunissant pas des conditions de discrimination suffisantes
pour les intensités des stimuli utilisés aux fins de la sélection soit infé-
rieure à α.
Une fois fixée la valeur de α(dans notre cas = 0,05), l'obtention de Zodépend de la distribution de probabilité de la variable Z, celle-ci dépen-
dant à son tour des distributions de probabilité des variables p (K ′).
Après avoir effectué les calculs statistiques correspondants, la valeur
obtenue pour Zcestégale à 34.
Dès que la notation Z est obtenue pour tous les candidats, ceux dont la
notation est supérieure à 34 doivent être éliminés.
Voir, à titre d'exemple, les notations des candidats A et B:
Stimulus Candidat A Candidat B
Chômé (Ch) ZCh=1 0 ZCh=1 2
Vineux (Vi) ZVi=1 0 ZVi=1 1
Rance (Ra) ZRa=1 0 ZRa=1 5
Amer (Am) ZAm=4 ZAm=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Les valeurs de Z pour les deux candidats considérés étant de 34 et de 38
respectivement, le candidat A sera retenu, alors que le candidat B sera
éliminé. Après avoir éliminé tous les candidats ayant obtenu une notation
supérieure à 34, les restants sont classés en fonction de leurs valeurs Z
jusqu'à compléter l'équipe de douze candidats que nous souhaitons réunir.
9.5.Entraînement
L'entraînement a pour objectif fondamental:
a) de familiariser les dégustateurs avec les multiples variantes olfacto-
gustativo-tactiles qu'offrent les huiles d'olive vierges;
b) de familiariser les dégustateurs avec la méthodologie sensorielle spéci-
fique;
c) d'accroître l'habilité individuelle pour reconnaître, identifier et quanti-
fier les stimuli sensoriels
et
d) d'améliorer l'acuité et la mémoire eu égard aux différents stimuli
considérés, afin d'aboutir à des jugements consistants.
La période d'entraînement consiste d'habitude en une série de séances,
suivant les possibilités de l'équipe et de l'étude, au cours desquelles, après
avoir analysé individuellement les huiles, les dégustateurs discutent
ensemble avec le responsable du jury les difficultés recontrées, etcommentent les qualifications en vue d'unifier les critères et les opinions.
Le niveau d'entraînement atteint après un nombre donné de séance est
évalué en relevant l'augmentation du pourcentage de réponses exactes,
au cas où on utiliserait des essais de discrimination, ou en analysant les
variances des qualifications individuelles moyennes du groupe, lorsqu'il
s'agitd'essais à l'aide d'une échelle.
L'utilité pratique de cette période d'entraînement a été amplement
discutée, mais actuellement elle est considérée très efficace et même
indispensable si on veutdisposer de données sensorielles exact es et
précises.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 69
▼B
9.6.Contrôle
Les équipes de dégustateurs vétérans réalisent d'habitude des dégustations
régulières etsuivies avec des preuves sensorielles qui exigentde gros
efforts de leur part. Des décisions revêtant une grande importance techno-
logique etcommerciale dépendent , bien des fois, de leur jugementetc'est
ainsi qu'après avoir été sélectionnés et bien entraînés, les dégustateurs
doivent être soumis à des contrôles devant garantir la fiabilité des résul-
tats.
De toute évidence, il serait nécessaire, après avoir constitué les jurys et
les avoir soumis à des essais de routine, de contrôler régulièrement leur
«performance» à des intervalles appropriés.
10. PROCÉDURE À SUIVRE POUR L'ÉVALUATION ORGANOLEP-
TIQUE DE L'HUILE D'OLIVE VIERGE
Dès accomplissement des conditions indiquées dans les normes précitées,
disponibilité des moyens nécessaires et sélection du groupe de dégusta-
teurs, chacun d'eux doit sentir, puis déguster (1) l'huile soumise à
examen, contenue dans le verre à dégustation, afin d'en analyser les
perceptions olfactives, gustatives, tactiles et kinesthésiques à l'aide de la
feuille faisantl'objetde la figure 2, sur laquelle il doitnot er leur présence
et la valeur qu'il attribue à leur intensité. Par la suite, il doit passer à la
phase de notation de la qualité de l'huile.
10.1.Utilisation de la feuille de la figure 2 (description de la flaveur et nota-
tion de la qualité)
Sur la partie gauche de cette feuille sont portées quelques-unes des
perceptions sensorielles les plus caractéristiques que l'on retrouve le plus
souventchez les huiles d'olive etqui en décriventla flaveur. Au cas où
l'on percevrait d'autres stimuli ne correspondant pas aux qualificatifs
énumérés, le dégustateur doit les noter sous la rubrique «autres» en
employantle ou les qualificat ifs les décrivantavec le plus de précision.
Les stimuli perceptibles doivent être évalués proportionnellement à leur
intensité par l'indication d'un signe (+) dans la case correspondante,
conformément au critère suivant:
1 = à peine perceptible
2 = léger3 = moyen4 = grand5 = extrême
Sur la partie droite de cette feuille est portée une échelle allant de 1 à 9
points (9 pour la qualité exceptionnelle et 1 pour la pire), qui doit être
utilisée par le dégustateur pour donner une notation unique, d'ensemble,
aux caractéristiques de l'huile. Cette notation unique, d'ensemble, aux
caractéristiques de l'huile. Cette notation doit être en accord avec les
vertus, les défauts repérés dans l'huile et déjà relevés dans la partie
gauche de la feuille.
La première colonne (défauts) de la table de notation comporte cinq
rubriques, dès lors, la classification des huiles doit être basée essentielle-
ment sur l'absence totale ou la présence de flaveurs défectueuses, ainsi
que sur la plus ou moins grande gravité ou intensité des défauts. Toute-
fois, l'échelle d'évaluation étant de 9 points, il y a lieu de tenir compte de
certaines nuances ou de certains aspects, décrits dans la deuxième
colonne «caractéristiques», qui contribuent de manière définitive à
prendre une décision sur la notation totale de qualité.
10.2.Notation finale
Le responsable du jury doitrecueillir les fiches remplies par chaque
dégustateur, pour vérifier que les attributs sensoriels et les intensités
avec lesquelles il les a perçus etnot és dans la «feuille du profil» concor-
dent avec l'évaluation attribuée à l'huile dans la «table de notation». En
cas de différence sensible, le responsable doit demander au dégustateur
de réviser sa feuille de notation.
Si nécessaire, le dégustateur doit répéter l'essai.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 70
(1) Il pourra s'en abstenir quand il observera quelque attribut extrêmement et intensément
désagréable, et notera sur la feuille de notation cette circonstance exceptionnelle.
▼B
Enfin, le responsable du jury doit procéder à la mise en tableau des nota-
tions de l'ensemble du groupe et au calcul de la moyenne arithmétique et
de l'erreur-type (de la moyenne) en résultant.
Si l'erreur-type est supérieure à l'erreur de la méthode, il doit faire répéter
l'essai à l'ensemble du groupe.
Seul dans le cas d'une analyse de révision, le groupe doitrépét er les
essais jusqu'à obtenir trois évaluations par échantillon. La notation finale
est la résultante de la moyenne des trois notations données, avec un
chiffre décimal.
Si la valeur de l'intensité moyenne de l'amer et/ou piquant est supérieure
à 2,5, il faut donner à l'huile la notation correspondante, tout en ajoutant
qu'elle est particulièrement amère et/ou piquante.
Expression des résultats: Le responsable du jury, sur la base de la nota-
tion moyenne, détermine la catégorie dans laquelle l'échantillon est
classé, conformémentaux limit es prévues à l'annexe I. ►M3À cette
fin, le responsable du jury applique, jusqu'au 31 octobre 1993, une tolé-
rance de + 0,5 si la notation moyenne est égale ou supérieure à 5 points.
Il n'indique dans le rapportd'analyse que la cat égorie dans laquelle
l'échantillon est classé. Dans le cas d'examen effectué par l'analyste
conformémentà l'art icle 2 paragraphe 2 premier alinéa du présentrègle-
ment, celui-ci applique la même procédure de détermination de la
catégorie. ◄
Note: Les échantillons doivent être conservés en récipients fermés et au
réfrigérateur jusqu'au moment de leur analyse et doivent y être
replacés jusqu'à compléter les trois évaluations.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 71
▼M3
Figure 2
Huile d'olive vierge
ANALYSE SENSORIELLE:VOCABULAIREGÉNÉRAL DE BASE
1. OBJET
La présente norme a pour objet de regrouper les termes généraux utilisés
pour l'analyse sensorielle etde fournir leur définit ion.
2. VOCABULAIRE2.1.Terminologie générale
Analyse sensorielle (subst.):1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 72
▼B
▼B
examen des propriétés organoleptiques d'un produit par les organes des
sens.
Perception (subst.):
prise de connaissance sensorielle d'objets ou d'événements extérieurs.
Organoleptique (adj.) (caractère ou propriété):
qualifie toute propriété d'un produit perceptible par les organes des sens.
Expert (subst.):
(en ce qui concerne l'examen des caractères organoleptiques)
dégustateur spécialisé dans l'analyse sensorielle d'un produit déterminé et
ayant des connaissances fondamentales en matière d'élaboration dudit
produitetdes préférences du marché.
Dégustateur (subst.):
personne perspicace, sensible, sélectionnée et entraînée qui évalue les
caractères organoleptiques d'un produit alimentaire avec les organes des
sens.
Jury (subst.):
groupe de dégustateurs ayant fait l'objet d'une sélection et d'un entraîne-
ment spéciaux, qui se réunissent pour effectuer, sous des conditions
contrôlées, l'analyse sensorielle du produit.
Sensation (subst.):
phénomène subjectif résultat du stimulus d'un système sensoriel. Ce
phénomène est subjectivement discriminable ou objectivement définis-
sable au moyen de l'organe sensoriel considéré, en fonction de la nature
ou de la qualité du stimulus, ainsi que de son intensité.
Acuité (subst.):
aptitude des organes sensoriels à percevoir qualitativement et quantitati-
vement un stimulus de faible intensité ou des différences légères entre
stimuli.
En français, ce terme doit être distingué du terme «sensibilité» qui ne fait
pas référence au niveau d'aptitude.
Dégustation (subst.):
opération qui consiste à percevoir, analyser et juger les caractères organo-
leptiques et, plus particulièrement, les caractères olfactogustatifs, tactiles
et kinesthésiques d'un produit alimentaire.
Acceptation (subst.):
acte consistant, pour un individu ou une population, à recevoir favorable-
mentun produit .
Harmonie (subst.):
qualité d'un produit qui provoque une sensation d'ensemble agréable.
Cette sensation est due à la perception des constituants du produit en
tant que stimuli olfactogustatifs, tactiles et kinesthésiques et ce, en raison
de leurs rapports de concentration appropriés.
Acceptabilité (subst.):
état d'un produit reçu favorablement par un individu ou une population,
en fonction de ses propriétés organoleptiques.
Discrimination (subst.):
différenciation qualitative et/ou quantitative entre deux ou plusieurs
stimuli.
Compensation (subst.):
résultat de l'interaction consécutive à un ensemble de stimuli de manière
que chacun d'eux est perçu moins intensément que s'il agissait isolément.
Aspect (subst.):
ensemble des caractères organoleptiques perçus par l'organe de la vue:
taille, forme, couleur, conformation, turbidité, limpidité, fluidité, mousse
eteffervescence.
Ce terme est à utiliser de préférence à «apparence».1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 73
▼B
Attribut (subst.):
propriété caractéristique perceptible.
2.2.Terminologie relative à la physiologie
Stimulus (subst.):
agentphysique ou chimique qui produitspécifiquementla réponse des
récepteurs sensoriels externes ou internes. (Pl.: stimuli ou stimulus).
Goût (subst.):
(sens du goût)
sens dont les récepteurs ont leur siège dans la bouche, notamment sur la
langue, et qui sont activés par différents composés en solution.
Gustatif (adj.):
qualifie la propriété d'un produit capable de stimuler l'appareil gustatif en
éveillant les sensations correspondant à une ou plusieurs des quatre
saveurs fondamentales: sucrée, salée, acide et amère.
Récepteur (subst.):
structure spécialisée d'un organe sensoriel excitable, capable de recevoir
un stimulus et de la convertir en influx nerveux.
Note: Les récepteurs sont classés d'après le type d'énergie associée au
stimulus (lumière, chaleur, son, etc.).
Olfaction (subst.):
fonction de l'organe olfactif, en vue de la perception et de la discrimina-
tion des molécules qui y accèdent, en phase gazeuse depuis l'extérieur,
par voie nasale directe ou indirecte.
Intensité (subst.):
degré d'énergie d'une qualité mesurable à l'aide d'une échelle quantitative
de valeurs supérieures au seuil.
Adaptation sensorielle (subst.):
modification temporaire de l'acuité pour percevoir des stimuli sensoriels,
à la suite d'une exposition continue et répétée au même stimulus ou à un
stimulus similaire.
Inhibition (subst.):
manque de réponse d'un organe sensoriel ou d'une partie dudit organe,
malgré le fait, qu'il soit soumis à l'action d'un stimulus approprié ayant
une intensité supérieure au seuil.
Réponse (subst.):
action par laquelle les cellules sensorielles répondent à celle d'un ou de
plusieurs stimuli relatifs à une modalité sensorielle définie.
Corps (subst.):
sensation tactile perçue dans la bouche et qui confère un degré de densité,
de viscosité, de consistance ou de compacité à un produit alimentaire.
Fragrance (subst.):
odeur fraîche, suave etdélicieuse.
Sentir (verbe):
(sens actif appliqué à l'odorat). Désigne l'action de percevoir une odeur.
Synonyme odorer (en français, le verbe odorer, bien que peu usité, peut
être considéré comme synonyme).
Objectif (adj.):
a) qualifie la sensation provoquée par la représentation réelle et véri-
fiable de l'objet, en réduisant au minimum les facteurs humains (tels
par exemple, la préférence, l'habitude, l'affectivité);
b) qualifie la technique qui, moyennant des méthodes sensorielles ou
instrumentales, permet de réduire au minimum les erreurs person-
nelles.
Note: L'emploi, comme synonyme, du terme «instrumental» n'est pas
recommandé.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 74
▼B
Subjectif (adj.):
qualifie la sensation provoquée par une perception, conditionnée par la
pensée ou les sentiments de chacun, et pas seulement par le stimulus.
Kinesthésie:ensemble de sensations résultant d'une pression appliquée à l'échantillon
par un mouvement dans la cavité buccale ou avec les doigts (par
exemple, pression des doigts dans le cas d'un fromage).
Seuil (subst.):
Seuil absolu:valeur minimale d'un stimulus sensoriel, nécessaire:
— à l'éveil d'une sensation (seuil d'apparition ou de détection),
ou
— à la reconnaissance de la sensation perçue (seuil d'identification).
Seuil différentiel:
valeur minimale d'un stimulus sensoriel donnant lieu à une différence
perceptible dans l'intensité de la sensation.
Seuil final:valeur maximale d'un stimulus au-dessus de laquelle il n'y a plus de diffé-
rence perceptible dans l'intensité de la sensation.
Seuil préférentiel:
valeur quantitative minimale d'un stimulus ou valeur critique supra-limi-
naire de ce stimulus correspondant à l'apparition d'une réponse
d'attraction ou de rejet par rapport à un stimulus neutre, par exemple,
dans le choix entre une solution sucrée et l'eau.
Note: Il faut faire la distinction entre seuil absolu de préférence et seuil
différentiel de préférence.
Infra-liminaire (adj.):
qualifie un stimulus se situant au-dessous du seuil absolu.
Supra-liminaire (adj.):
qualifie un stimulus se situant au-dessus du seuil absolu.
Fatigue sensorielle:
forme de l'adaptation sensorielle correspondant à une diminution d'acuité.
Compensation (subst.):
résultat de l'interaction consécutive à un ensemble de stimuli de manière
à ce que chacun d'eux soitperçu moins int ensémentque s'il agissaitisolé-
ment.
Synergique (adj.):
effet ou action conjugée de substances déterminées, de manière à ce que
l'intensité des caractères organoleptiques résultant de leur association soit
supérieure à celle qui est attendue de la simple addition des intensités de
chacun d'eux pris isolément.
Effet de contraste:
augmentation de la réponse aux différences entre deux stimuli simultanés
ou consécutifs.
Contraire de l'effet de convergence.
Effet de convergence:diminution de la réponse aux différences entre deux stimuli simultanés ou
consécutifs.
Contraire de l'effet de contraste.
2.3.Terminologie relative aux propriétés organoleptiques
Acide (adj.):
a) qualifie la saveur élémentaire provoquée par des solutions aqueuses
diluées de la plupart des acides (par exemple, acides citrique, lactique
et tartrique);1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 75
▼B
b) qualifie la propriété des corps purs ou mélanges dont la dégustation
provoque cette saveur.
Le substantif correspondant est acidité.
Aigre (adj.):
qualifie la sensation olfactogustative, avec prédominance d'acides généra-
lement d'origine fermentative, ainsi que les produits alimentaires qui
produisent cette sensation.
Certains facteurs contribuant à cette sensation sont liés au processus de
fermentation, par exemple acétique ou lactique, d'un produit alimentaire.
Amère (saveur) (adj.):
a) qualifie la saveur élémentaire provoquée par des solutions aqueuses
diluées de diverses substances, telles que la quinine, la caféine et des
hétérosides déterminés;
b) qualifie la propriété des corps purs et mélanges dont la dégustation
provoque cette saveur.
Le substantif correspondant est amertume.Salée (saveur) (adj.):
a) sensation caractéristique perçue à travers le sens du goût; celle provo-
quée par une solution de chlorure de sodium en est l'exemple le plustypique;
b) qualifie la propriété des corps purs ou mélanges dont la dégustation
provoque cette saveur.
Le substantif correspondant est salinité.Sucrée (saveur) (adj.):
a) qualifie la saveur élémentaire provoquée par les solutions aqueuses de
diverses substances telles que le saccharose;
b) qualifie la propriété des corps purs ou mélanges dont la dégustation
provoque cette saveur.
Le substantif correspondant est sucrosité.
Astringente (saveur) (adj.):
a) qualifie la sensation complexe produite dans la bouche par une solu-
tion aqueuse diluée de produits tels que certains tannins (par exemple,
les tannins du kaki et de la prunelle);
b) qualifie la propriété des corps purs ou mélanges qui produisent cette
sensation.
Le substantif correspondant est astringence.Flaveur (subst.):
on entend par flaveur l'ensemble des perceptions des stimuli olfactogusta-
tifs, tactiles et kinesthésiques permettant à un sujet d'identifier un produit
alimentaire et d'établir un critère, à différents niveaux, favorable ou défa-
vorable sur leditproduit .
Saveur (subst.):
a) sensations perçues par les papilles gustatives lorsqu'elles sont stimu-
lées par certaines substances solubles;
b) qualité de la sensation particulière produite par ces substances.
Saveur élémentaire (subst.):
chacune des quatre saveurs reconnues: sucrée, salée, acide, amère.
Odeur (subst.):
a) ensemble des sensations perçues par l'organe olfactif en inspirant
certaines substances volatiles;
b) qualité de la sensation particulière produite par chacune des
substances précitées.
Arôme (subst.):
a) sensations agréables perçues par l'organe olfactif par voie indirecte
lors de la dégustation d'un produit alimentaire;
b) en parfumerie etdans le langage ordinaire ce t erme estappliqué égale-
ment aux mêmes sensations perçues par voie nasale directe.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 76
▼B
Arrière-goût (subst.):
ensemble des sensations perçues après disparition du stimulus de la
bouche etqui diffèrentde celles perçues préalablement .
Aromatique (adj.):
a) qualifie la propriété des corps purs ou mélanges dont la dégustation
produitles sensat ions qualifiées par «arôme»;
b) qualifie les produits alimentaires dont l'examen par voie nasale directe
produitles sensat ions de fragrance etde fraîcheur.
Texture (subst.):
ensemble des caractéristiques de l'état solide ou rhéologique d'un produit
alimentaire capable de stimuler les mécanorécepteurs, lors de la dégusta-
tion, et notamment ceux situés dans la région buccale.
Note: Ce terme s'applique uniquement aux propriétés objectives et non
aux sensations produites et qui sont désignées par des termes géné-
raux, telles que consistance, fibrosité, onctuosité, etc.
«Paladear » (savourer ou déguster dans la bouche) (verbe):
action tendant à ce qu'un produit alimentaire situé dans la bouche entre
en contact avec toutes ses zones sensibles dans le but de percevoir les
sensations buccales qu'il provoque.
Note: Ce vocabulaire peut être enrichi en consultant les Normes ISO
5492, parties I à V, et d'autres ouvrages, tel celui élaboré par J.L.
MagnenLescahierstechniquesduCentrenationaldecoordination
des études et recherches sur la nutrition et l'alimentation, etc.
VERRE POUR LA DÉGUSTATIONDES HUILES
1. OBJET
La présente norme a pour but de décrire les caractéristiques du verre
destiné à l'analyse organoleptique des huiles comestibles (odeur, saveur,
flaveur).
Elle décrit, en outre, le dispositif de chauffage adapté, nécessaire pour
l'obtention et le maintien de la température adéquate pour cette analyse.
2. DESCRIPTION DU VERRE
Le croquis de la figure 1 a été dessiné dans le but d'optimiser les caracté-
ristiques souhaitables d'un ustensile de cette nature et dont les aspects
fondamentaux sont précisés ci-après:
a) stabilité maximale, évitant le balancement du verre et le renversement
de l'huile y contenue;
b) forme facilement adaptable aux cavités d'un bloc de chauffage permet-
tant un chauffage uniforme de la base du verre;
c) rétrécissement de la bouche favorisant la concentration des odeurs et
en facilitant l'identification;
d) en verre foncé, de façon à ce que le dégustateur ne puisse pas appré-
cier la couleur de l'huile, ce qui élimine tout préjugé et la possibilité
de prendre des biais susceptibles de nuire à l'objectivité de la détermi-
nation.
2.1.Dimensions
Le croquis du verre faitl'objetde la figure 1, avec les dimensions
suivantes:
— capacité totale … . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 ml ± 10 ml,
— hauteur totale …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 mm ± 1mm,— diamètre de la bouche … . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mm ± 1mm,— diamètre de la partie la plus large …. . . . . . . . . . . 70 mm ± 1mm,— diamètre de la base … .......................... 3 5 m m ± 1 m m ,
— épaisseur des parois latérales du verre …. . . . . . . 1,5 mm ± 0,2 mm,— épaisseur du fond de verre … ................... 5 m m ± 1 m m .1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 77
▼B
Chaque verre doit être accompagné d'un verre de montre au diamètre
dépassantde près de 10 millimèt res celui de la bouche. Ce verre servira
de couverole pour éviter la perte d'arôme et l'entrée de poussière.
2.2.Caractéristiques de fabrication
Le verre doit être fabriqué en verre résistant, de couleur foncée pour
empêcher l'appréciation de la couleur du contenu, et exempt de rayures
etde bulles.
Le bord doitêt re régulier, lisse età rebord.Le verre doit être en verre recuit, pour lui permettre de résister aux varia-
tions de température qu'il a à subir au cours des essais.
2.3.Règles d'emploi
Le nettoyage des verres doit se faire en se servant de savon ou de déter-
gent non parfumé et être suivi de plusieurs rinçages jusqu'à élimination
totale du produit employé. Enfin, ils doivent être rincés à l'eau distillée,
puis, après égouttage, séchés dans une étuve de dessiccation.
Il ne faut pas utiliser des acides concentrés ni des mélanges à l'acide
chromique.
Les verres doivent être gardés dans l'étuve jusqu'à utilisation, ou bien
conservés dans une armoire en les protégeant contre toute contamination
d'odeurs anormales.
Avant chaque utilisation, il faut s'assurer par olfaction que les verres sont
exempts d'odeurs anormales. Lors de la préparation de l'essai, veiller à
noter le code de chaque verre et de l'huile correspondante. Cette corres-
pondance du code etde l'huile ne sera connue que du responsable de
l'essai.
3. DISPOSITIF DE CHAUFFAGE DES ÉCHANTILLONS
L'examen organoleptique des échantillons doit se faire à une température
donnée qui se situe, pour les huiles alimentaires, à 28 ± 2 ºC. Pour y
parvenir, il faut installer à l'intérieur de chaque cabine, à la portée du
dégustateur, un dispositif de chauffage (voir figure 2). Ce dispositif
consiste en un bloc d'aluminium submergé dans un bain d'eau réglée au
thermostat, à l'effet d'obtenir une température uniforme. Ce bloc
comporte une série de cavités pour y adapter le fond des verres. La diffé-
rence de température entre le dispositif de chauffage et l'huile contenue
dans les verres disposés dans les cavités des différents blocs ne doit pas
être supérieure à ± 2 ºC.
Figure 1 — Verre à dégustation
(Dimensions en millimètres)1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 78
▼B
Figure 2 — Dispositif de chauffage des échantillons
GUIDE POUR L'INSTALLATIOND'UNE SALLE DE DÉGUSTATION
1. INTRODUCTION
La salle de dégustation a pour but de procurer au groupe de dégustateurs
intervenant dans les essais sensoriels un milieu approprié, confortable et
normalisé qui puisse faciliter leur travail et contribuer à améliorer la répé-
tabilité et la reproductibilité des résultats.
2. OBJET
La présente norme a pour but de préciser les conditions essentielles dont
il y a lieu de tenir compte pour l'aménagement d'une salle de dégustation.
3. SPÉCIFICATIONS GÉNÉRALES POUR L'INSTALLATION
Toute pièce, quelle que soit sa superficie (voir point 3.1), doit réunir les
spécifications suivantes.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 79
▼B
La pièce doitêt re agréable etconvenablementéclairée (voir point3.2),
tout en conservant un aspect neutre. Dans ce but, il est recommandé d'uti-
liser pour les parois de l'uni de teinte relaxante et claire, de manière à
créer une atmosphère détendue (1).
La pièce doit pouvoir être nettoyée aisément. En outre, elle doit être à
l'écart de toute source de bruit; partant, elle sera, de préférence, insono-
risée. De même, elle doit être à l'écart de toutes odeurs anormales, raison
pour laquelle il faut, si possible, la doter d'un dispositif efficace de venti-
lation. En cas de fluctuations sensibles de la température ambiante, la
salle de dégustation doit être munie d'une installation d'air conditionné,
afin d'y maintenir la température aux alentours de 20-22 ºC.
3.1.Dimensions
Les dimensions de la pièce dépendentsouventdes possibilit és des labora-
toires ou des entreprises. En général, la pièce doit être suffisamment
spacieuse pour permettre l'installation d'environ dix cabines, ainsi que
d'une zone pour la préparation des échantillons.
De toute évidence, il serait préférable que l'espace réservé aux installa-
tions soit plus grand, car on pourrait ainsi prévoir des dépendances
annexes pour, par exemple, nettoyer le matériel, ranger des mets, ainsi
que pour les réunions en «jury ouvert».
3.2.Éclairage
L'éclairage général, qu'il soitassuré par la lumière solaire ou par des
lampes (par exemple, des tubes type «lumière du jour») doit être
uniforme, réglable etavec lumière diffuse.
3.3.Température et état hygrométrique
Le local doit être constamment maintenu dans des conditions thermiques
et hygrométriques agréables. Sauf circonstances spéciales, il est recom-
mandé d'y maintenir une température de 20 à 22 ºC et un état
hygrométrique de 60 à 70 % d'humidité relative.
4. DESCRIPTION DES CABINES
4.1.Caractéristiques générales
Les cabines pour l'analyse sensorielle doivent être montées l'une à côté de
l'autre dans la pièce.
Elles doivent être identiques et séparées entre elles par des cloisons suffi-
samment hautes et larges pour isoler les dégustateurs une fois assis.
Les cabines peuvent être fabriquées avec tout matériau approprié et
d'entretien facile (par exemple, bois, contre-plaqué vitrifié, panneaux
laminés, etc.). En cas d'utilisation de peintures, celles-ci doivent être
tout à fait inodores après séchage.
Les sièges prévus dans chaque cabine doivent être confortables et à
hauteur réglable.
Chaque cabine doitêt re pourvue égalementd'éclairage individuel réglable
tant en ce qui concerne la direction que l'intensité.
Il serait très souhaitable de munir les cabines d'un poussoir faisant fonc-
tionner un avertisseur lumineux, devant permettre au dégustateur de
communiquer à la personne qui s'occupe de lui de l'extérieur, sans pour
autant distraire les autres, qu'il a achevé l'essai, qu'il désire qu'on lui
remette de nouveaux échantillons, qu'il lui manque un ustensile quel-
conque, qu'il a observé quelque irrégularité ou encore qu'il souhaite des
renseignements, etc.
4.2.Dimensions
Les cabines doivent être suffisamment amples et confortables.
En général, il fauts'en t enir aux dimensions ci-après:
— largeur:
0,75 mètre (sans évier),1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 80
(1) La couleur de la pièce et son éclairage peuvent avoir une incidence sur les résultats de
l'analyse sensorielle.
▼B
0,85 mètre (avec évier),
— longueur:
0,50 mètre (table),
0,20 mètre (excès de la cloison),
— hauteur des cloisons:
0,60 mètre au minimum mesuré à partir de la table,
— hauteur de la table:
0,75 mètre.
4.3.Disposition
La surface de la table doit pouvoir être nettoyée aisément.
Une partie de cette surface doit être réservée au montage d'un évier doté
d'eau courante potable. Au cas où cela ne serait pas faisable, cet espace
doit être réservé pour y poser une cuvette, un crachoir ou similaire.
Lorsque, pendant la réalisation de l'essai, les échantillons doivent être
maintenus à une température constante supérieure ou inférieure à la
température ambiante, il convient de disposer d'un équipement approprié
à cette fin (bain-marie, plaque de chauffage, etc.).
On peut également installer une étagère, à 1,10 mètre environ du sol,
pour y ranger différents accessoires (verres, petit matériel, etc.).
Au cas où la disposition des cabines dans la salle de dégustation le
permet, il conviendrait d'installer un dispositif pour faciliter la présenta-
tion des échantillons. Ce dispositif peut être en forme de glissière
(figure 1), de girelle tournant verticalement (figure 2), ce qui est particu-
lièrementindiqué pour les verres ou coupes de forme haut e, ou en passe-
plat horizontal si les récipients dans lesquels on sert les échantillons ne
sont pas très hauts (figure 3). Tout simplement, la cabine doit comporter
une ouverture suffisante pour permettre le passage des plateaux de service
et des verres contenant les échantillons à examiner.
5. PIÈCES COMPLÉMENTAIRES
Si l'espace disponible le permet, il conviendrait de prévoir des pièces
séparées pour préparer les échantillons (à des fins culinaires ou autres),
ranger les verres ou ustensiles, ainsi que pour les discussions préalables
ou postérieures aux essais. S'il en était ainsi, il faut assurer que ces pièces
soientt oujours propres etqu'elles ne gênentpas, de par leurs odeurs,
bruits ou causeries des personnes y réunies, le travail du jury dans la salle
de dégustation.
La figure 4 donne un exemple schématisé d'une salle de dégustation et
des installations complémentaires.
Note: Les conditions décrites ci-avant sont des conditions idéales. Néan-
moins, au cas où il ne seraitpas possible de disposer d'une salle
réservée uniquementaux analyses sensorielles, les essais pourraient
être réalisés dans une pièce réunissant les conditions minimales
décrites (lumière, température, bruits, odeurs), en y installant des
cabines mobiles à partir d'éléments démontables et pliables, de
manière à assurer, tout au moins, la séparation voulue entre chaque
dégustateur.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 81
▼B
DISPOSITION DE LA CABINE
Figure 1
1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 82
▼B
DISPOSITIF EN GIRELLE POUR LA PRÉSENTATION DES ÉCHANTIL-
LONS
Figure 2
1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 83
▼B
DISPOSITIF EN PASSE-PLAT POUR LA PRÉSENTATION DES ÉCHAN-
TILLONS
Figure 3
1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 84
▼B
LABORATOIRE D'ANALYSE SENSORIELLE
Figure 4 — Exemple de salle de dégustation
1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 85
▼B
ANNEXE XIII
PREUVE DU RAFFINAGE
1. NEUTRALISATION ET DÉCOLORATION DE L'HUILE D'OLIVE EN
LABORATOIRE
1.1.Neutralisation de l'huile
1.1.1. Appareillage
— becher de 300 millilitres de forme haute,
— centrifugeuse de laboratoire avec tubes de 100 millilitres,
— becher de 250 millilitres,
— ballons de 100 millilitres,— ampoule à décanter d'un litre.
1.1.2. Réactifs
— solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 12 %,
— solution éthanolique à 1 % de phénolphtaléine,— hexane pur pour analyse,
— alcool isopropylique pur pour analyse.
1.1.3. Mode opératoire
a)Huiles d'acidité exprimée en acide oléique inférieure à 30 %
Introduire, dans un becher de 300 millilitres de forme haute, 50
grammes d'huile brute et chauffer à 65 ºC au bain-marie. En agitant
lentement, ajouter une quantité de solution d'hydroxyde de sodium à
12 % correspondantà l'acidit é libre de l'huile, avec un excès de 5 %.
Continuer à agiter pendant cinq minutes, en maintenant la température
à 65 ºC.
Tranférer le tout dans des tubes à centrifuger de 100 millilitres,
séparer la pâte savonneuse par centrifugation. Verser l'huile décantée
dans un becher de 250 millilitres et laver avec 50 à 60 millilitres d'eau
distillée bouillante tout en éliminant la couche aqueuse à l'aide d'un
siphon. Répéter les lavages jusqu'à élimination complète des traces
de savon résiduel (disparition de la coloration rose à la phénolphta-
léine).
Centrifuger l'huile pour éliminer les petites quantités d'eau résiduelle.
b)Huiles d'acidité exprimée en acide oléique supérieure à 30 %
Dans une ampoule à décanter d'un litre, introduire 50 grammes d'huile
brute. 200 millilitres d'hexane, 100 millilitres d'alcool isopropylique et
une quantité de solution d'hydroxyde de sodium à 12 % correspondant
à l'acidité libre de l'huile, avec un excès de 0,3 %. Agiter énergique-
ment pendant une minute. Ajouter 100 millilitres d'eau distillée, agiter
de nouveau etlaisser reposer.
Après séparation des couches, laisser s'écouler la couche inférieure
contenant les savons. Entre les deux couches (huileuse au-dessus et
aqueuse au-dessous) se forme souventune couche int ermédiaire
constituée de mucilages et de substances insolubles qui doit également
être éliminée.
Procéder ensuite au lavage de la solution hexanique d'huile neutre
avec des portions de 50 à 60 millilitres d'une solution d'alcool isopro-
pylique/eau distillée 1/1 (v/v) jusqu'à disparition de la coloration rose
à la phénolphtaléine. Procéder ensuite à l'élimination complète de
l'hexane par distillation sous vide (par exemple, à l'évaporateur
rotatif).
1.2.Décoloration de l'huile neutralisée
1.2.1. Appareillage
— ballon de 250 millilitres à 3 cols rodés permettant d'insérer:
a) un thermomètre gradué en degrés et permettant de faire des
lectures jusqu'à 90 ºC;
b) un agitateur mécanique tournant à 250-300 tours par minute
équipé pour le fonctionnement sous vide;1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 86
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c) un raccord vers la pompe à vide,
— pompe à vide, munie d'un manomètre, capable de donner des pres-
sions résiduelles de 15-30 millibars.
1.2.2 Mode opératoire
Peser dans le ballon à 3 cols 100 grammes environ de l'huile neutralisée.
Insérer le thermomètre et l'agitateur, relier à la pompe à vide et chauffer
jusqu'à 90 ºC en agitant.
Maintenir cette température, toujours sous agitation, jusqu'à ce que l'huile
à analyser soit totalement débarrassée de son humidité (trente minutes
environ).
Interrompre alors le vide et ajouter 2 à 3 grammes de terre activée. Réta-
blir le vide jusqu'à obtention d'une pression résiduelle de 15-30 millibars
et, toujours à la température de 90 ºC, agiter pendant trente minutes à 250
tours par minute environ.
Filtrer ensuite à chaud dans une étuve thermostatique (50-60 ºC).1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 87
▼B
ANNEXE XIV
NOTES COMPLÉMENTAIRES 2, 3 ET 4 DU CHAPITRE 15 DE LA
NOMENCLATURECOMBINÉE
1.«Note 2A: Estseule considérée comme huile d'olive, au sens des numéros de
code NC 1509 et1510, l'huile provenantexclusivementdu t rait e-
mentdes olives, à l'exclusion de l'huile d'olive réest érifiée etde
tout mélange d'huile d'olive avec des huiles d'une autre nature.
La présence d'huile d'olive réestérifiée ou d'huiles d'une autre
nature est établie à l'aide des méthodes indiquées dans les annexes
VII, IX et XII. Les caractéristiques analytiques relatives à la
teneur en stérols et en acides de toutes les huiles d'olive des
numéros de code NC 1509 et1510 figurentdans le t ableau ci-
dessous.
TableauI — Teneur en acides en pourcentagesTableau II — Teneur en stérols en pourcen-
tages
Acide myristique M 0,1, Cholestérol M 0,5,
Acide linolénique M 0,9, Brassicastérol M 0,2,
Acide arachidique M 0,7, Campestérol M 4,0,
Acide eicosénique M 0,5, Stigmastérol ≤Campestérol
Acide béhénique M 0,3, Bétasitostérol (1) m 93,0,
Acide lignocérique M 0,5. ∆7-Stigmastérol M 0,5.
m = minimum
M = maximum
(1) Delta-5-23 Stigmastérol + Cholestérol + Betasitostérol + Sitostanol + Delta-5-Avenastérol +
Delta-5-24-Stigmastadienol)
Note 2B: Sontconsidérées comme “huiles d'olive vierges” les huiles obt e-
nues, à partir de l'olive, uniquement par des procédés mécaniques,
ou par d'autres procédés physiques, dans des conditions, notam-
ment thermiques, n'altérant pas l'huile, n'ayant pas subi d'autre
traitement que le lavage, la décantation, la centrifugation et la
filtration, à l'exclusion des huiles obtenues à partir de l'olive à
l'aide de solvants (1510), et définies aux points I et II ci-dessous.
I. Estconsidérée comme “huile d'olive vierge lampant e”, au sens
de la sous-position 1509 10 10, quelle que soit son acidité,
l'huile présentant:
a) une teneur en alcools aliphatiques non supérieure à 400
milligrammes par kilogramme;
b) une teneur en érythrodiol et uvaol non supérieure à 4,5 %;
c) un contenu en acides gras saturés dans la position 2 des
triglycérides non supérieur à 1,3 %;
d) et/ou une des caractéristiques suivantes:
— d1) un nombre de peroxyde supérieur à 20 milliéquiva-
lents 02 par kilogramme;
— d2) une teneur en solvants halogénés volatils totaux su-
périeure à 0,2 milligramme par kilogramme eten
tout cas supérieure à 0,1 milligramme par kilo-
gramme pour chacun d'entre eux;
— d3) un coefficient d'extinction K270 supérieur à 0,25, et,
après traitement de l'huile sur alumine activée, non
supérieur à 0,11. Des huiles ayantune t eneur en
acides gras libres, exprimée en acide oléique, supé-
rieure à 3,3 g par 100 g peuventavoir, après
passage sur alumine activée, conformément à la
méthode indiquée dans l'annexe XV, un coefficient
d'extinction K270 supérieur à 0,11. Dans ce cas,
après neutralisation et décoloration effectuées en1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 88
▼B
laboratoire, elles doivent avoir les caractéristiques
suivantes:
— un coefficient d'extinction K270 non supérieur à
1,20,
— une variation ( ∆K) (1) du coefficient d'extinction
au voisinage de 270 manomètres supérieure à
0,01 etnon supérieure à 0,16,
soit:∆K=K
m− 0,5 (Km−4+Km+4)
Kmdésigne le coefficient d'extinction à la
longueur d'onde du maximum de la courbe
d'absorption au voisinage de 270 nm,
Km−4etKm+4désignent les coefficients d'extinc-
tion aux longueurs d'onde inférieure et supérieure
de 4 nm à celle de Km;
— d4) des caractéristiques organoleptiques faisant appa-
raître des défauts perceptibles avec une intensité
supérieure à la limite d'acceptabilité, avec un résultat
d'analyse sensorielle inférieur à 3,5.
II. Estconsidérée comme “huile d'olive vierge”, au sens du code
NC 1509 10 90, l'huile d'olive qui présente les caractéristiques
suivantes:
a) une acidité, exprimée en acide oléique, non supérieure à 3,3
grammes par 100 grammes;
b) un nombre de peroxyde non supérieur à 20 milliéquivalents
02 par kilogramme;
c) une teneur en alcools aliphatiques non supérieure à 300
milligrammes par kilogramme;
d) une teneur en solvants halogénés volatils totaux non supé-
rieure à 0,2 milligramme par kilogramme eten t outcas non
supérieure à 0,1 milligramme par kilogramme pour chacun
d'entre eux;
e) un coefficient d'extinction K270 non supérieur à 0,250 et,
après passage de l'huile sur alumine activée, non supérieur
à 0,10 (1);
f) une variation du coefficient d'extinction ( ∆K) au voisinage
de 270 nanomètres non supérieure à 0,010;
g) des caractéristiques organoleptiques faisant même apparaître
des défauts perceptibles avec une intensité inférieure à la
limite d'acceptabilité, avec un résultat d'analyse sensorielle
de plus de 3,5;
h) une teneur en érythrodiol + uvaol non supérieure à 4,5 %;
i) un contenu d'acides gras saturés dans la position 2 des
triglycérides non supérieur à 1,3 %.
Note 2C: Estconsidérée comme relevantdu code NC 1509 90 00 l'huile
d'olive obtenue par traitement des huiles relevant des codes NC
1509 10 10 et/ou 1509 10 90, même coupée d'huile d'olive vierge,
qui présente les caractéristiques suivantes:
a) une acidité, exprimée en acide oléique, non supérieure à 3,3
grammes par 100 grammes;
b) une teneur en alcools aliphatiques non supérieure à 350 milli-
grammes par kilogrammes;
c) un coefficient d'extinction K270 supérieur à 0,25 et non supé-
rieur à 1,20 et, après passage de l'échantillon sur alumine
activée, supérieur à 0,10;
d) une variation du coefficient d'extinction ( ∆K) au voisinage de
270 nanomètres supérieure à 0,01 et non supérieure à 0,16;
e) une teneur en érythrodiol et uvaol non supérieure à 4,5 %;
f) un contenu en acides gras saturés en position 2 non supérieur à
1,5 %.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 89
(1) Lorsque le K270 estsupérieur à 0,25, on doitprocéder à une nouvelle dét erminat ion
après passage sur alumine; le K270 ne doitpas dépasser 0,10.
▼B
Note 2D: Sontconsidérées comme “huiles brut es” relevantdu code NC
1510 00 10 les huiles, notamment les huiles de grignons d'olive,
qui présentent les caractéristiques suivantes:
a) une acidité, exprimée en acide oléique, supérieure à 2 grammes
par 100 grammes;
b) une teneur en érythrodiol et uvaol supérieure à 12 %;
c) un contenu d'acides gras saturés dans la position 2 des triglycé-
rides non supérieur à 1,8 %.
Note 2E: Sontconsidérées comme huiles relevantdu code NC 1510 00 90
les huiles obtenues par traitement des huiles relevant du code NC
1510 00 10, même coupées d'huile d'olive vierge, ne présentant pas
les caractéristiques en question aux points I et II, à condition
qu'elles présentent un contenu d'acides gras saturés dans la position
2 des triglycérides non supérieur à 2 %».
2.«Note 3: Sontexclus des codes NC 1522 00 31 et1522 00 39:
a) les résidus provenant du traitement des corps gras contenant de
l'huile dont l'indice d'iode, déterminé selon la méthode indiquée
à l'annexe XVI, estinférieur à 70 ou supérieur à 100;
b) les résidus provenant du traitement des corps gras contenant de
l'huile dontl'indice d'iode estcompris ent re 70 et100, mais dont
la surface du pic ayant le volume de rétention du bêta-sitostérol,
déterminée conformément aux dispositions de l'annexe V du
règlement visé à la note complémentaire 4 ci-dessous, repré-
sente moins de 93 % de la superficie totale des pics des stérols.»
3.«Note 4: Les méthodes d'analyse à suivre pour la détermination des caracté-
ristiques des produits en question ci-dessus sont celles prévues aux
annexes du règlement(CEE) no2568/91.»1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 90
▼B
ANNEXE XV
1. TENEUR EN HUILE DES GRIGNONS D'OLIVE
1.1.Matériel
— appareil d'extraction approprié muni d'un ballon de 200 à 250 millili-
tres,
— bain à chauffage électrique (bain de sable, bain d'eau, etc.) ou plaque
chauffante,
— balance analytique,— étuve réglée à 80 ºC au maximum,— étuve à chauffage électrique muni d'un dispositif de thermorégulation
réglé à 103 ºC ± 2 ºC et permettant de réaliser une insufflation d'air
ou une pression réduite,
— broyeur mécanique facile à nettoyer et permettant le broyage sans
échauffement et sans diminution sensible de leur teneur en eau et enhuile,
— cartouche d'extraction et coton hydrophile ou papier filtre, exempts de
produits extractibles à l'hexane,
— dessiccateur,— tamis à trous de 1 millimètre de diamètre,
— pierre ponce en petits grains, préalablement séchée.
1.2.Réactif
n-hexane technique dont le résidu à l'évaporation complète doit être infé-
rieur à 0,002 gramme pour 100 millilitres.
2. MODE OPÉRATOIRE2.1.Préparation de l'échantillon pour essai
Broyer l'échantillon pour laboratoire, si nécessaire, dans le broyeur méca-
nique préalablement bien nettoyé afin de le réduire en particules pouvant
traverser complètement le tamis.
Utiliser un vingtième environ de l'échantillon pour parfaire le nettoyage du
broyeur, rejeter cette mouture, broyer le reste, le recueillir, le mélanger
avec soin etl'analyser sans délai.
2.2.Prise d'essai
Peser, à 0,01 gramme près, dès la fin du broyage, environ 10 grammes de
l'échantillon pour essai.
2.3.Préparation de la cartouche d'extraction
Placer la prise d'essai dans la cartouche et boucher celle-ci avec le tampon
de coton hydrophile. Dans le cas où on a utilisé un papier filtre, emballer la
mouture dans ce papier.
2.4.Préséchage
Si le grignon est très humide (teneur en eau et en matières volatiles supé-
rieure à 10 %), effectuer un préséchage en plaçant pendant un temps
convenable la cartouche remplie (ou le papier filtre) dans l'étuve chauffée
à 80 ºC au maximum, pour ramener la teneur en eau et en matières vola-
tiles au-dessous de 10 %.
2.5.Préparation du ballon
Peser, à 1 milligramme près, le ballon contenant 1 à 2 grains de pierre
ponce, préalablementséché à l'ét uve à 103 ºC ± 2 ºC puis refroidi pendant
au moins une heure dans un dessiccateur.
2.6.Première extraction
Placer dans l'appareil d'extraction la cartouche (ou le papier filtre) conte-
nant la prise d'essai. Verser dans le ballon la quantité nécessaire d'hexane.
Adapter le ballon à l'appareil d'extraction et placer le tout sur le bain à
chauffage électrique. Conduire le chauffage dans des conditions telles que
le débit du reflux soit au moins de trois gouttes à la seconde (ébullition
modérée, non tumultueuse).1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 91
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Après quatre heures d'extraction, laisser refroidir. Enlever la cartouche de
l'appareil d'extraction et la placer dans un courrant d'air afin d'éliminer la
majeure partie du solvant qui l'imprègne.
2.7.Deuxième extraction
Vider la cartouche dans le microbroyeur et broyer aussi finement que
possible. Replacer quantitativement le mélange dans la cartouche et celle-
ci dans l'appareil d'extraction.
Recommencer l'extraction pendant encore deux heures en utilisant le même
ballon contenant la première extraction.
La solution obtenue dans le ballon d'extraction doit être limpide. À défaut,
la filtrer sur un papier filtre en lavant plusieurs fois le premier ballon et le
papier filtre avec de l'hexane. Recueillir le filtrat et le solvant de lavage
dans un deuxième ballon préalablementséché ett aré à 1 milligramme près.
2.8.Élimination du solvant et pesée de l'extrait
Chasser par distillation sur bain à chauffage électrique la majeure partie du
solvant. Éliminer les dernières traces de solvant en chauffant le ballon à
l'étuve à 103 ºC ± 2 ºC pendant 20 minutes. Faciliter cette élimination,
soit en insufflant de l'air de temps à autre ou de préférence un gaz inerte,
soiten opérantsous pression réduit e.
Laisser refroidir le ballon dans un dessiccateur pendant au moins une
heure, etle peser à 1 milligramme près.
Chauffer à nouveau 10 minutes dans les mêmes conditions, refroidir au
dessiccateur et peser.
La différence entre les résultats de ces deux pesées doit être inférieure ou
égale à 10 milligrammes. Sinon, chauffer à nouveau pendantdes périodes
de dix minutes suivies du refroidissement et de la pesée, jusqu'à ce que la
différence de masse soitau plus égale à 10 milligrammes. Ret enir la
dernière pesée du ballon.
Effectuer deux déterminations sur le même échantillon pour essai.
3. EXPRESSION DES RÉSULTATS
3.1.Mode de calcul et formule
a) L'extrait exprimé en pourcentage en masse du produit tel quel, est égal
à:
S=m1×100
m0
où: S est le pourcentage en masse d'extrait du produit tel quel,
m0estla masse, en grammes, de la prise d'essai,
m1estla masse, en grammes, de l'ext raitaprès séchage.
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux détermina-
tions, si les conditions de répétabilité sont remplies.
Exprimer le résultat avec une seule décimale.
b) L'extrait est rapporté à la matière sèche en utilisant la formule suivante:
S×100
100 − U= extrait en % gras/sec
où: S est le pourcentage en masse d'extrait du produit tel quel [voir
sous a)],
U est sa teneur en eau et en matières volatiles.
3.2.Répétabilité
La différence entre les résultats des deux déterminations, effectuées simul-
tanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste, ne doit
pas être supérieure à 0,2 gramme d'extrait à l'hexane pour 100 grammes
d'échantillon.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 92
▼B
Dans le cas contraite, répéter l'analyse sur deux autres prises d'essai. Si
cette fois encore la différence dépasse 0,2 gramme, prendre comme résultat
la moyenne arithmétique des quatre déterminations effectuées.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 93
▼B
ANNEXE XVI
DÉTERMINATIONDE L'INDICE D'IODE
1. OBJET
La présente norme internationale décrit une méthode destinée à la détermi-
nation de l'indice d'iode dans les corps gras d'origine animale et végétale.
2. DÉFINITION
Aux fins de la présente norme internationale, les définitions suivantes sont
applicables.
2.1. Indice d'iode: la masse d'iode absorbée par l'échantillon dans les conditions
opératoires spécifiées par la présente norme internationale.
L'indice d'iode estexprimé en nombre de grammes d'iode par 100 grammes
d'échantillon.
3. PRINCIPE
Mise en solution d'une prise d'essai dans un solvant et addition du réactif
de Wijs. Au terme d'un laps de temps déterminé, addition d'une solution
d'iodure de potassium et d'eau; titrage de l'iode libéré par une solution de
thiosulfate de sodium.
4. RÉACTIFS
Tous les réactifs sont de qualité analytique reconnue.
4.1. Iodure de potassium, solution à 100 grammes par litre, exempte d'iode ou
d'iodate.
4.2. Solution d'amidon.
Mélanger 5 grammes d'amidon soluble dans 30 millilitres d'eau, ajouter ce
mélange à 1 000 millilitres d'eau bouillante, bouillir 3 minutes et laisser
refroidir.
4.3. Solution volumétrique standard de thiosulfate de sodium.
c(Na2S303.5H20) = 0,1 mole par litre, normalisé pas plus de sept jours avant
l'usage.
4.4. Solvantpréparé en mélangeantdes volumes égaux de cyclohexane et
d'acide acétique.
4.5. Réactif de Wijs contenant du monochlorure d'iode dans de l'acide acétique.
Utiliser le réactif de Wijs se trouvant dans le commerce.
Note: Le réactif contient 9 grammes de ICI3+ 9 grammes de I dans l'acide
acétique.
5. APPAREILLAGE
Le matériel courant de laboratoire et notamment:
5.1. Nacelles de pesée en verre, appropriées à la prise d'essai etpouvantêt re
introduites dans les fioles (5.2).
5.2. Fioles coniques, d'une capacité de 500 millilitres, pourvues de bouchons en
verre etcomplèt ementsèches.
6. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON À ANALYSER. L'ÉCHAN-
TILLON HOMOGÉNÉISÉ EST SÉCHÉ SUR SULFATE DE SODIUM
ET FILTRÉ.
7. MODE OPÉRATOIRE
7.1. Prise d'essai
La masse de la prise d'essai varie selon l'indice d'iode présumé, comme
l'indique le tableau 1.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 94
▼B
Tableau 1
Indice d'iode présumé Masse de la prise d'essai (en g)
moins que 5 3,00
5 à 20 1,00
21 à 50 0,40
51 à 100 0,20
101 à 150 0,13
151 à 200 0,10
Peser la prise d'essai à 0,1 milligramme près dans une nacelle de pesée en
verre (5.1).
7.2. Détermination
Introduire la prise d'essai dans une fiole de 500 millilitres (5.2). Ajouter 20
millilitres de solvant (4.4) pour dissoudre les corps gras. Ajouter exacte-
ment 25 millilitres du réactif de Wijs (4.5), boucher, agiter le contenu et
placer la fiole dans un endroit sombre. Ne pas utiliser de pipette pour le
réactif de Wijs.
Préparer un essai à blanc avec le solvantetle réact if mais sans la prise
d'essai.
Pour les échantillons ayant un indice d'iode inférieur à 150, laisser les
fioles dans un endroitsombre pendant1 heure; pour ceux ayantun indice
d'iode supérieur à 150 et pour les produits polymérisés ou des produits
oxydés dans une mesure considérable, les laisser pendant2 heures.
Une fois ce laps de temps écoulé, ajouter 20 millilitres de la solution
d'iodure de potassium (4.1) et 150 millilitres d'eau dans chaque fiole.
Titrer avec la solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3)
jusqu'à ce que la couleur jaune due à l'iode aitprat iquementdisparu.
Ajouter quelques gouttes de la solution d'amidon (4.2) et poursuivre la
titration jusqu'au moment où la couleur bleue disparaît après avoir agité
vigoureusementle cont enu.
Note: La détermination potentiométrique du point final est tolérée.
7.3. Nombre de déterminations
Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.
8. EXPRESSION DES RÉSULTATS
L'indice d'iode estégal à:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
où:
c: valeur numérique de la concentration exacte, en moles par litre, de la
solution de thiosulfate de sodium volumétrique standard (4.3)
utilisée;
V1: valeur numérique du volume, en millilitres, de la solution de thiosul-
fate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée pour l'essai à
blanc;
V2: valeur numérique du volume, en millilitres, de la solution de thiosul-
fate de sodium volumétrique standard (4.3) utilisée pour la
détermination;
m: valeur numérique de la masse, en grammes, de la prise d'essai (7.1).
Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations,
à condition que le critère de répétabilité soit rempli.1991R2568 — FR — 21.07.1992 — 004.001 — 95