1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 1
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►BSEPTIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 1ermars 1976
portant fixation de méhodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des
animaux
(76/372/CEE)
(JO L 102 du 15.4.1976, p. 8)
Modifiée par:
Journal officiel
nopage date
►M1Directive 81/680/CEE de laCommission du 30 juillet 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directive 92/95/CEE de laCommission du 9 novembre 1992 L 327 54 13.11.1992
►M3Directive 94/14/CE de laCommission du 29 ma rs 1994 L 94 30 13.4.1994
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SEPTIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 1ermars 1976
portant fixation de méhodes d'analyse communautaires pour le
contrôle officiel des aliments des animaux
(76/372/CEE)
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,vu ladirective du Conseil, du 20 juillet 1970, concerna nt l'introduction
de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse
communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(
1),
modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion(2) et notamment son
article 2,
considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels
des aliments des animaux visant à constater que les conditionsprescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ouadministratives concernant la qualité et la composition des aliments
des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélè-
vement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;
considérant que les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE,
73/46/CEE, 74/203/CEE et 75/84/CEE de laCommission, des 15 juin1971(
3), 18 novembre 1971(4), 27 avril 1972(5), 5 décembre 1972(6),
25 mars 1974(7) et 20 décembre 1974(8) ont déjà fixé un certain
nombre de méthodes d'analyse communautaires; que, compte tenu de
l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convientd'arrêter une septième série de méthodes;
considérant que les mesures prévues à la présente directive sont
conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux,
A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premier
Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles offi-
ciels des aliments des animaux, en ce qui concerne leur teneur enaflatoxine B
1sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe de
laprésente directive.
Article 2
Les États membres mettent en vigueur, le 1eroctobre 1976 au plus tard,
les dispositions législatives, réglementaires ou administratives néces-saires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ilsen informent immédiatement la Commission.
Article 3
Les États membres sont destinataires de la présente directive.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 2
(1)J O noL 170 du 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O noL 73 du 27. 3. 1972, p. 14.
(3)J O noL 155 du 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O noL 279 du 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O noL 123 du 29. 5. 1972, p. 6.
(6)J O noL 83 du 30. 3. 1973, p. 21.
(7)J O noL 108 du 22. 4. 1974, p. 7.
(8)J O noL 32 du 5. 2. 1975, p. 26.▼M1
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ANNEXE
DOSAGE DE L'AFLATOXINE B1
A. MÉTHODE PAR CHROMATOGRAPHIE MONODIMENSIONNELLE
SUR COUCHE MINCE
1. Objet et domaine d'application
La méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B1des
matières premières et des aliments simples pour les animaux. Cette
méthode ne s'applique pas en présence de pulpes d'agrumes. La
limite inférieure du dosage est de 0,01 mg/kg (10 ppb).
En présence de substances interférentes qui entravent les détermi-
nations, il y a lieu de recommencer l'analyse selon la méthode B
(par chromatographie en phase liquide haute performance).
2. Principe
L'échantillon est soumis à l'extraction par du chloroforme. L'extrait
est filtré, une partie aliquote en est prélevée et purifiée par chroma-
tographie sur colonne de gel de silice. L'éluat est évaporé et le
résidu est repris par un volume déterminé de chloroforme ou d'un
mélange de benzène et d'acétonitrile. Une partie aliquote de cette
solution est soumise à la chromatographie sur couche mince. La
quantité d'aflatoxine B1est déterminée sous irradiation UV du chro-
matogramme soit visuellement, soit par fluorodensitométrie, par
comparaison avec des quantités connues d'aflatoxine B1-étalon.
L'identité de l'aflatoxine B1extraite de l'aliment doit être confirmée
par les procédés indiqués.
3. Réactifs
NB:Tous les réactifs doivent être de qualité «pour analyse» dans
la mesure où aucune autre indication n'est donnée.
3.1. Acéton
3.2. Chloroforme, stabilisé par 0,5 à 1,0 pour cent d'éthanol à 96 pour
cent (v/v).
3.3. n-Hexane
3.4. Méthanol
3.5. Éther diéthylique anhydre, exempt de peroxydes.
3.6. Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v).
3.7. Mélange de chloroforme (3.2) et de méthanol (3.4): 97/3 (v/v).
3.8. Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granulométrie:
0,05 à 0,20 mm.
3.9. Coton hydrophile, préalablement dégraissé par le chloroforme, ou
laine de verre.
3.10. Sulfate de sodium, anhydre, granulé.
3.11. Gaz inerte, par exemple azote.
3.12. Acide chlorhydrique 1 N.
3.13. Acide sulfurique à 50 pour cent (v/v).
3.14. Terre de diatomées (Hyflosupercel), lavée à l'acide.
3.15. Gel de silice G-HR ou équivalent, pour chromatographie sur
couche mince.
3.16. Solution étalon à 0,1 µg environ d'aflatoxine B1par millilitre dans
le chloroforme (3.2) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (3.6),
préparée et contrôlée comme indiqué sous le point 7.
3.17. Solution étalon qualitative à 0,1 µg environ d'aflatoxines B1et B2par ml dans le chloroforme (3.2) ou dans le mélange benzène/
acétonitrile (3.6). Ces concentrations sont données à titre indicatif.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 3
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Elles doivent être ajustées de manière à obtenir la même intensité
de fluorescence pour les deux aflatoxines.
3.18. Solvants de développement:
3.18.1. Chloroforme (3.2)/acétone (3.1): 9/1 (v/v), cuve non saturée;
3.18.2. Éther diéthylique (3.5)/méthanol (3.4)/eau: 96/3/1 (v/v/v), cuve non
saturée;
3.18.3. Éther diéthylique (3.5)/méthanol (3.4)/eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cuve
saturée;
3.18.4. Chloroforme (3.2)/méthanol (3.4): 94/6 (v/v), cuve saturée;
3.18.5. Chloroforme (3.2)/méthanol (3.4): 97/3 (v/v), cuve saturée.
4. Appareillage
4.1. Broyeur-mélangeur.
4.2. Appareil à secouer ou agitateur magnétique.
4.3. Filtres plissés, Schleicher et Schüll no588 ou équivalent, diamètre:
24 cm.
4.4. Tubes pour chromatographie, en verre (diamètre intérieur: 22 mm,
longueur: 300 mm), avec robinet de téflon et réservoir de 250 ml.
4.5. Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon à fond rond de
500 ml.
4.6. Fioles coniques de 500 ml, à bouchon rodé.
4.7. Appareillage pour chromatographie sur couche mince.
4.8. Plaques de verre pour chromatographie sur couche mince,
200 × 200 mm, préparées comme suit (les quantités indiquées
conviennent pour recouvrir cinq plaques): introduire 30 g de gel
de silice G-HR (3.15) dans une fiole conique, ajouter 60 ml d'eau,
boucher et agiter une minute. Étendre la suspension sur les plaques
de manière à obtenir une couche uniforme de 0,25 mm d'épaisseur.
Laisser sécher à l'air et conserver ensuite dans un dessicateur muni
de gel de silice. Au moment de l'emploi, activer les plaques en les
maintenant durant 1 heure dans l'étuve à 110 ºC.
Les plaques prêtes à l'emploi conviennent dans la mesure où elles
donnent des résultats semblables à ceux des plaques préparées
comme indiqué ci-dessus.
4.9. Lampe UV à ondes longues (360 nm). L'intensité d'irradiation doit
permettre de distinguer encore nettement une tache de 1,0 ng d'afla-
toxine B1sur une plaque pour chromatographie sur couche mince, à
une distance de 10 cm de la lampe.
4.10. Tubes de 10 ml, gradués, avec bouchons de polyéthylène.
4.11. Spectrophotomètre UV.
4.12. Fluorodensitomètre (éventuellement).
5. Mode opératoire
5.1. Préparation de l'échantillon (voir observations,partie C,point 1)
Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un
tamis à mailles de 1 mm (conforme à la recommandation ISO R
565).
5.2. Extraction
Introduire 50,0 g de l'échantillon moulu et homogénéisé dans une
fiole conique de 500 ml (4.6). Ajouter 25 g de terre de diatomées
(3.14), 25 ml d'eau et 250 ml de chloroforme (3.2). Boucher le
flacon, secouer ou agiter durant 30 minutes à l'aide de l'appareil
(4.2) et filtrer sur filtre plissé (4.3). Éliminer les 10 premiers ml
de filtrat et recueillir ensuite 50 ml.
5.3. Purification sur colonne
Munir l'extrémité inférieure d'un tube pour chromatographie (4.4)
d'un tampon de coton ou de laine de verre (3.9), remplir les deux
tiers du tube de chloroforme (3.2) et ajouter 5 g de sulfate de
sodium (3.10).1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 4
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Vérifier que la surface supérieure de la couche de sulfate de
sodium est plane puis ajouter par petites fractions 10 g de gel de
silice (3.8). Remuer avec précaution après chaque addition pour
éliminer les bulles d'air. Laisser déposer durant 15 minutes et
ajouter ensuite avec précaution 15 g de sulfate de sodium (3.10).
Laisser descendre le liquide jusqu'à proximité immédiate de la
surface supérieure de la couche de sulfate de sodium.
Mélanger les 50 ml d'extrait recueillis en 5.2 à 100 ml de n-hexane
(3.3) et transvaser quantitativement le mélange dans la colonne.
Laisser descendre le liquide jusqu'à la surface supérieure de la
couche de sulfate de sodium. Éliminer le liquide écoulé. Ajouter
ensuite 100 ml d'éther diéthylique (3.5) et laisser à nouveau
descendre le liquide jusqu'à lasurfa ce supérieure de lacouche de
sulfate de sodium. Au cours de ces opérations, veiller que le débit
d'écoulement soit de 8 à 12 ml par minute et que la colonne ne soit
pas mise à sec. Éliminer les liquides écoulés. Éluer ensuite par
150 ml du mélange chloroforme/méthanol (3.7) et recueillir la tota-
lité de l'éluat.
Évaporer celui-ci presque à sec, sous un courant de gaz inerte
(3.11) et à une température ne dépassant pas 50 ºC, au moyen de
l'appareil rotatif à évaporation sous vide (4.5). Amener quantitative-
ment le résidu à l'aide de chloroforme (3.2) ou du mélange
benzène/acétonitrile (3.6) dans un tube de 10 ml (4.10). Concentrer
la solution sous un courant de gaz inerte (3.11) et amener ensuite le
volume à 2,0 ml à l'aide de chloroforme (3.2) ou du mélange
benzène/acétonitrile (3.6).
5.4. Chromatographie sur couche mince
Déposer ponctuellement sur une plaque pour chromatographie sur
couche mince (4.8), à 2 cm du bord inférieur et à des intervalles
de 2 cm, les volumes indiqués ci-après de la solution étalon et de
l'extrait:
— 10, 15, 20, 30 et 40 µl de la solution étalon d'aflatoxine B1(3.16);
— 10 µl de l'extrait obtenu en 5.3 et, en superposition sur le même
point, 20 µl de lasolution éta lon (3.16);
— 10 et 20 µl de l'extrait obtenu en 5.3.
Développer le chromatogramme à l'abri de la lumière, à l'aide de
l'un des solvants de développement (3.18). Le choix du solvant
doit être établi au préalable en déposant sur la plaque 25 µl de la
solution étalon qualitative (3.17) et en s'assurant que, lors du déve-
loppement, les aflatoxines B1et B2sont complètement séparées.
Laisser évaporer les solvants à l'abri de la lumière et irradier
ensuite par la lumière UV en plaçant la plaque à 10 cm de la lampe
(4.9). Les taches d'aflatoxine B1donnent une fluorescence bleue.
5.5. Déterminations quantitatives
Procéder aux déterminations soit visuellement, soit par fluorodensi-
tométrie comme indiqué ci-après:
5.5.1. Mesures visuelles
Déterminer la quantité d'aflatoxine B1de l'extrait en comparant
l'intensité de fluorescence des taches de l'extrait à celle des taches
de la solution étalon. Interpoler si nécessaire. La fluorescence
obtenue par superposition de l'extrait à l'étalon doit être plus forte
que celle des 10 µl d'extrait et elle ne doit donner lieu qu'à la
perception d'une seule tache. Si l'intensité de fluorescence donnée
par les 10 µl d'extrait est plus forte que celle des 40 µl de solution
étalon, diluer l'extrait 10 ou 100 fois par du chloroforme (3.2) ou
par le mélange benzène/acétonitrile (3.6) avant de le soumettre à
une nouvelle chromatographie sur couche mince.
5.5.2. Mesures par fluorodensitométrie
Mesurer l'intensité de fluorescence des taches d'aflatoxine B1au
fluorodensitomètre (4.12) en utilisant une longueur d'onde d'excita-
tion de 365 nm et une longueur d'onde d'émission de 443 nm.
Déterminer la quantité d'aflatoxine B1des dépôts de l'extrait en
comparant les intensités de fluorescence des taches de l'extrait et
de lasolution éta lon.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 5
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5.6. Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B1
Confirmer l'identité de l'aflatoxine B1de l'extrait par les procédés
ci-après:
5.6.1. Traitement par l'acide sulfurique
Pulvériser de l'acide sulfurique (3.13) sur le chromatogramme
obtenu en 5.4. La fluorescence des taches d'aflatoxine B1doit virer
du bleu au jaune sous irradiation UV.
5.6.2. Chromatographie bidimensi onnelle impliquant la
formation d'aflatoxine B1— hémiacétal (aflatoxine B2a)
NB:Les opérations décrites ci-après doivent être effectuées en
suivant le schéma présenté dans la figure 3.
5.6.2.1. Application des solutions
Tracer sur une plaque (4.8) deux droites parallèles à deux côtés
contigus (à des distances de 6 cm de ces côtés), destinées à déli-
miter la migration des fronts de solvants. Déposer sur une plaque
à l'aide de pipettes capillaires ou de microseringues les solutions
indiquées ci-après:
—au point A: un volume d'extrait purifié de l'échantillon obtenu
en 5.3, contenant 2,5 nanogrammes environ d'aflatoxine B1;
—aux points B et C: 25 µl de lasolution éta lon (3.16).
5.6.2.2. Dével oppement
Développer le chromatogramme dans la direction I à l'aide du
solvant de développement (3.18.1) [couche de 1 cm dans une cuve
non saturée], à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le front de
solvant atteigne la ligne de délimitation. Retirer la plaque de la
cuve et laisser sécher durant cinq minutes à l'abri de la lumière et
à la température ambiante. Pulvériser ensuite de l'acide chlorhy-
drique (3.12) sur une bande de 2,5 cm de hauteur couvrant les
points A et B (indiquée en traits hachurés dans la fig. 3), jusqu'à
assombrissement, en protégeant le reste de la plaque par une feuille
de verre. Laisser réagir durant dix minutes à l'obscurité et sécher à
l'aide d'un courant d'air à la température ambiante.
Développer ensuite le chromatogramme dans la direction II à l'aide
du solvant de développement (3.18.1) [couche de 1 cm dans une
cuve non saturée], à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le front de
solvant atteigne la ligne de délimitation. Retirer la plaque de la
cuve et laisser sécher à la température ambiante.
5.6.2.3. Interprétation du chromatogramme
Examiner le chromatogramme sous lumière UV (4.9) et vérifier les
observations indiquées ci-après:
a) Apparition d'une tache fluorescente bleue d'aflatoxine B1prove-
nant de la solution étalon déposée en C (migration dans la
direction I).
b) Apparition d'une tache fluorescente bleue d'aflatoxine B1(n'ayant pas réagi avec l'acide chlorhydrique) et d'une tache
fluorescente bleue plus intense d'aflatoxine B1-hémiacétal,
provenant de la solution étalon déposée en B (migration dans
ladirection II).
c) Apparition de taches similaires à celles indiquées sous b),
provenant de l'extrait de l'échantillon déposé en A. L'emplace-
ment de ces taches est défini par la distance de migration de
l'aflatoxine B1à partir du point A dans la direction I (même
distance que celle parcourue par l'étalon déposé en C) suivie
des distances de migration parcourues dans la direction II par
l'aflatoxine B1(n'ayant pas réagi avec l'acide chlorhydrique) et
par l'aflatoxine B1-hémiacétal (mêmes distances que celles
parcourues par l'étalon déposé en B). Les intensités de fluores-
cence des taches d'hémiacétal provenant de l'extrait et de
l'étalon déposé en B devraient correspondre.
6. Calcul des résultats
6.1. À partir de mesures visuelles
La teneur en microgrammes d'aflatoxine B1par kilogramme
d'échantillon (ppb) est donnée par la formule1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 6
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S/C1Y/C1V
W/C1X
dans laquelle:
Y et X sont respectivement les volumes en microlitres de solution
étalon d'aflatoxine B1(3.16) et de l'extrait, ayant une intensité de
fluorescence semblable;
S = concentration en microgrammes d'aflatoxine B1par ml de la
solution étalon (3.16);
V = volume final de l'extrait en microlitres, compte tenu des
dilutions éventuelles;
W = poids en grammes de la prise d'essai correspondant au
volume d'extrait soumis à la purification sur colonne.
6.2. À partir des mesures fluorodensitométriques
La teneur en microgrammes d'aflatoxine B1par kilogramme
d'échantillon (ppb) est donnée par la formule
S/C1V
W/C1Y
dans laquelle:
Y = volume en microlitres de l'extrait déposé sur la plaque (10
ou 20 µl);
S = quantité en nanogrammes d'aflatoxine B1du dépôt de
l'extrait (compte tenu du volume Y), déduite des détermina-
tions;
V = volume final de l'extrait en microlitres, compte tenu des
dilutions éventuelles;
W = poids en grammes de la prise d'essai, correspondant au
volume d'extrait soumis à la purification sur colonne.
7. Préparation et contrôle de la solution étalon (3.16)
7.1. Détermination de la concentration en aflatoxine B1
Préparer une solution d'aflatoxine B1étalon dans le chloroforme
(3.2) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (3.6) dont la concen-
tration est de 8 à 10 µg par millilitre. Déterminer le spectre
d'absorption entre 330 et 370 nm à l'aide du spectrophotomètre
(4.11).
Relever la densité optique (A) à 363 nm dans le cas de la solution
chloroformique; à 348 nm dans le cas de la solution dans le
mélange benzène/acétonitrile.
Calculer la concentration en microgrammes d'aflatoxine B1par
millilitre de solution à partir des formules ci-après:
312/C1A/C11000
20600pour lasolution chloroformique;
312/C1A/C11000
19800pour la solution dans le mélange benzène/acétoni-
trile.
Effectuer à l'abri de la lumière les dilutions convenables pour
obtenir une solution étalon de travail dont la concentration en afla-
toxine B1est de 0,1 µg environ par millilitres. Conservée en
réfrigérateur à 4 ºC, cette solution est stable durant deux semaines.
7.2. Contrôle de la pureté chromatographique
Déposer sur une plaque (4.8) 5 µl de la solution étalon à 8 — 10 µg
d'aflatoxine B1par millilitre (voir 7.1). Développer le chromato-
gramme comme indiqué en 5.4. Sous lumière UV, la fluorescence
ne doit donner lieu qu'à la perception d'une seule tache et aucune
fluorescence ne doit être perçue dans la zone du dépôt d'origine.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 7
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8. Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles
effectuées sur le même échantillon par le même analyste ne devrait
pas dépasser:
— 25 pour cent du résultat le plus élevé pour les teneurs en aflato-
xine B1de 10 à 20 µg/kg,
— 5 µg, en valeur absolue, pour les teneurs de 20 à 50 µg/kg,— 10 pour cent du résultat le plus élevé pour les teneurs supé-
rieures à 50 µg/kg.
9. Reproductibilité
Voir observations, partie C, point 2,
B. DÉTERMINATION DE L'AFLATOXINE B
1PAR CHROMATOGRAPHIE
LIQUIDE HAUTE
1. Objet et domaine d'application
Cette méthode permet le dosage de l'aflatoxine B1dans les aliments
des animaux, y compris ceux contenant des pulpes d'agrumes. La
limite inférieure du dosage est de 0,001 mg/kg (1 ppb).
2. Principe
L'échantillon est extrait par du chloroforme. L'extrait est filtré et
une fraction aliquote est purifiée sur une cartouche de Florisil puis
sur une cartouche C18. La séparation finale et la détection sont
effectuées par chromatographie en phase liquide haute performance
en utilisant une colonne C18en phase inverse, puis une dérivatisa-
tion postcolonne à l'iode permet une détection fluorimétrique.
Note:Les mycotoxines sont des substances extrêmement toxiques.
Les manipulations doivent être effectuées sous une hotte ventilée.
Des précautions particulières doivent être prises du fait de leur
nature électrostatique et par conséquent de leur tendance à se
disperser sur les surfaces de travail lorsque les toxines sont à l'état
sec.
3. Réactifs
3.1. Chloroforme, stabilisé par 0,5 % à 1,0 % d'éthanol, en masse. Voir
l'observation 10.2.
3.2. Méthanol, de qualité HPLC pour la prépararation de 3.6.
3.3. Acétone.3.4. Acétonitrile, de qualité HPLC.3.5. Solvants d'élution: les préparer la veille de l'utilisation ou les
dégazer dans une cuve à ultrasons.
3.5.1. Acétone (3.3)/eau, 98 + 2 (v + v).3.5.2. Eau/méthanol (3.2), 80 + 20 (v + v).3.5.3. Eau/acétone (3.3), 85 + 15 (v + v).
3.6. Phase mobile pour HPLC.
La phase mobile est composée d'eau, de méthanol (3.2) et d'acéto-
nitrile (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v).
NB:La composition de la phase mobile peut être ajustée en fonc-
tion des caractéristiques de la colonne HPLC utilisée.
3.7. Solution aqueuse saturée en iode. Ajouter 2 g d'iode à 400 ml
d'eau. Agiter pendant au moins 90 minutes et filtrer sur une
membrane filtrante (4.15). Protéger la solution saturée de la lumière
pour empêcher la photodégradation.
3.8. Célite 545, lavée à l'acide, ou équivalent.3.9. Cartouche de Florisil (SEP-PAK Waters ou équivalent).3.10. Cartouche C
18(SEP-PAK Waters ou équivalent).
3.11. Gaz inerte, par exemple azote.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 8
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▼M2
3.12. Solution étalon d'aflatoxine B1, à une concentration de 10 µg/ml,
dans le chloroforme. Vérifier la concentration de la solution de la
manière suivante: déterminer le spectre d'absorption de la solution
entre 330 et 370 nm au moyen du spectrophotomètre (4.23).
Mesurer l'absorbance (A) au maximum d'absorption proche de
363 nm. Calculer la concentration de l'aflatoxine B1en micro-
gramme par millilitre de solution selon la formule:
Concentration èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C201000
22300¼13;991/C2A:
3.12.1. Solution mère de la solution étalon d'aflatoxine B1dans le chloro-
forme.
Transférer quantitativement 2,5 ml de la solution étalon d'aflatoxine
B1(3.12) dans une fiole jaugée de 50 ml et ajuster au volume avec
du chloroforme (3.1). Conserver cette solution au froid (4 ºC), àl'obscurité, dans un flacon bien fermé et enveloppé d'une feuille
d'aluminium.
3.13. Solutions d'aflatoxine B
1pour l'étalonnage en HPLC.
NB:Utiliser de la verrerie lavée à l'acide pour la préparation de ces
solutions (voir 4, matériel).
3.13.1. Solution d'étalonnage à 4 ng/ml.
Laisser la solution mère (3.12.1) revenir à la température ambiante
à l'obscurité (pendant quelques heures). Transférer 400 µl de la
solution mère (200 ng d'aflatoxine B1) dans une fiole jaugée de
50 ml et évaporer la solution à sec sous un courant de gaz inerte
(3.11). Dissoudre le résidu obtenu dans environ 20 ml d'eau/acétone
(3.5.3), ajuster au trait de jauge avec de l'eau/acétone (3.5.3) et bien
agiter.
3.13.2. Solution d'étalonnage à 3 ng/ml.
Transférer quantitativement 7,5 ml de la solution d'étalonnage
(3.13.1) dans une fiole jaugée de 10 ml, compléter au volume
avec de l'eau/acétone (3.5.3), bien agiter.
3.13.3. Solution d'étalonnage à 2 ng/ml.
Transférer quantitativement 25 ml de la solution d'étalonnage
(3.13.1) dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au volume avec la
solution eau/acétone (3.5.3) et bien agiter.
Cette solution est une solution d'étalonnage qui servira également
aux répétitions d'injections en HPLC (5.5).
3.13.4. Solution d'étalonnage à 1 ng/ml.
Transférer quantitativement 2,5 ml de la solution d'étalonnage
(3.13.1) dans une fiole jaugée de 10 ml, ajuster au volume avec la
solution eau/acétone (3.5.3) et bien agiter.
3.14. Ampoule contenant 1 millilitre du mélange d'aflatoxines B1,B2et
G2dans le chloroforme aux concentrations approximatives de 1;
0,5; 1 et 0,5 µg/ml respectivement.
3.14.1. Solution d'essai de séparation chromatographique.
Transférer le contenu de l'ampoule (3.14) dans un tube à essai en
verre muni d'un bouchon ou dans un flacon à vis. Transférer 40µl
de cette solution dans un tube à essai muni d'un bouchon (rincé à
l'acide) (4.22). Évaporer le chloroforme sous un courant de gaz
inerte (3.11) et redissoudre dans 10 ml de mélange eau/acétone
(3.5.3).
3.15. Réactifs pour le test de confirmation (6).3.15.1. Solution saturée de chlorure de sodium.
3.15.2. Sulfate de sodium, anhydre, granulé.
4. Matériel
Attention: L'utilisation de vaisselle non rincée à l'acide pour les
solutions aqueuses d'aflatoxine peut être la cause de pertes. Un
soin particulier doit être pris avec la verrerie neuve et la verrerie à
usage unique telles que les flacons d'injecteur automatique et les
pipettes Pasteur. Par conséquent, la verrerie devant contenir les1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 9
▼M2
solutions aqueuses d'aflatoxine B1doit être trempée dans de l'acide
dilué (exemple: acide sulfurique à 2 moles/l) pendant plusieurs
heures, puis bien rincée à l'eau distillée pour enlever toutes les
traces d'acide (exemple: trois rinçages, vérifier au papier pH). En
pratique, ce traitement doit être appliqué aux ballons piriformes
(4.4), aux fioles jaugées, aux éprouvettes, aux flacons ou aux tubes
utilisés pour les solutions d'étalonnage et les extraits finals (particu-
lièrement les flacons de l'injecteur automatique), et les pipettes
Pasteur, si celles-ci sont utilisées pour transférer des solutions d'éta-
lonnage ou des extraits.
4.1. Broyeur-mélangeur.
4.2. Tamis à mailles de 1,0 mm (ISO R 565).
4.3. Agitateur mécanique.4.4. Évaporateur rotatif, avec ballons piriformes de 150 ml à 250 ml.4.5. Chromatographe en phase liquide haute performance avec injecteur
muni d'une boule permettant d'injecter 250 µl. Voir les instructions
du fabricant concernant le remplissage partiel ou complet de la
boucle.
4.6. Colonne analytique HPLC remplie de particules de 3 µm ou 5 µm
C
18.
4.7. Pompe sans pulsation pour le réactif postcolonne à l'iode.
4.8. Raccord en T sans volume mort, en acier inoxydable (1/16 ″
× 0,75 mm).
4.9. Capillaire de réaction en Téflon ou en acier inoxydable. Les dimen-
sions suivantes: 3 000 × 0,5 mm à 5 000 × 0,5 mm sont appropriées
en combinaison avec les colonnes HPLC à 5µm ou à 3µm.
4.10. Bain thermostaté réglé à 60 ºC permettant une régulation de tempé-
rature d'au moins 0,1 ºC.
4.11. Détecteur fluorimétrique, assurant des longueurs d'onde d'excitation
à 365 nm et des longueurs d'onde d'émission à 435 nm (pour les
appareils à filtre: longueur d'onde d'émission > 400 nm). La détec-
tion de 0,05 ng d'aflatoxine B1au moins doit être possible. Il est
recommandé d'appliquer une certaine contre-pression (par exemple
en employant un régulateur de pression ou une spirale en Téflon ou
en acier inoxydable relié à la sortie du détecteur) pour supprimer
les bulles d'air dans la cellule de mesure.
4.12. Enregistreur.4.13. Intégrateur électronique (facultatif).4.14. Papier filtre plissé de diamètre 24 cm, Machery-Nagel 617 1/4 ou
équivalent.
4.15. Membrane filtrante de porosité 0,45 µm, Millipore HAWP 04700
ou équivalent.
4.16. Fiole conique de 500 ml munie d'un bouchon.4.17. Colonne de verre (diamètre interne d'environ 1 cm, longueur
d'environ 30 cm) munie d'un embout Luer.
4.18. Robinet, résistant au chloroforme, avec embout Luer (par exemple
Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 ou équi-
valent).
4.19. Seringue de 10 ml résistant aux produits chimiques, avec embout
Luer.
4.20. Seringue de 250 µl pour l'injection HPLC (voir 4.5).
4.21. Microseringue de 100 µl pour la préparation des solutions d'étalon-
nage (vérifier par pesée que la précision est de 2 % au plus).
4.22. Tubes gradués en verre de 10 ml, avec un bouchon.
4.23. Spectrophotomètre pouvant être utilisé dans la zone UV du spectre
d'absorption.
4.24. Matériel pour le test de confirmation (6).
4.24.1. Ampoule à décanter de 100 ml, avec un robinet en Téflon et rincée
à l'acide.
4.24.2. Bloc chauffant à 40-50 ºC.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 10
▼M2
5. Procédure
5.1. Préparation de l'échantillon
Broyer l'échantillon de façon à ce qu'il passe au travers du tamis
(4.2).
5.2. Prise d'essai
Peser 50,0 g de l'échantillon ainsi préparé dans la fiole conique
(4.16).
5.3. Extraction
Ajouter 25 g de Célite (3.8), 250 ml de chloroforme (3.1) et 25 ml
d'eau, à la prise d'essai (5.2). Boucher la fiole et agiter pendant 30
minutes à l'aide d'un agitateur (4.3). Filtrer sur filtre plissé (4.14).
Recueillir 50 ml du filtrat. Si nécessaire, prendre une fraction
aliquote et diluer à 50 ml avec du chloroforme de façon à ce que
la concentration en aflatoxine B1ne soit pas supérieure à 4 ng/ml.
5.4. Purification (les opérations doivent être menées sans interruption
significative)
Précautions à prendre:
— protéger le laboratoire où les analyses sont faites de la lumière
du jour. Cela peut être réalisé en utilisant:
1) des films absorbant les UV sur les fenêtres en combinaison
avec une lumière tamisée (pas de lumière solaire directe!);
2) des rideaux ou des stores en association avec la lumière arti-
ficielle (les tubes fluorescents sont acceptables),
— les solutions contenant de l'aflatoxine doivent être protégées de
lalumière le plus possible (les conserver à l'obscurité, utiliser
des feuilles d'aluminium).
5.4.1. Purification sur SEP-PAK Florisil.
5.4.1.1. Préparation de l'assemblage colonne-cartouche.
Atta cher un robinet (4.18) à laplus courte tige de laca rtouche de
Florisil (3.9) (voir figure 1). Laver la cartouche et enlever l'air en
prenant 10 ml de chloroforme (3.1) et en faisant passer rapidement
8 ml de chloroforme par le robinet à travers la cartouche avec une
seringue (4.19). Atta cher laplus longue tige de laca rtouche à une
colonne de verre (4.17) et introduire les 2 ml de chloroforme
restant à travers la cartouche dans la colonne. Fermer le robinet.
Enlever laseringue.
5.4.1.2. Purification.
Introduire le filtrat recueilli en 5.3 dans l'assemblage colonne-
cartouche et le laisser s'écouler par gravité. Rincer avec 5 ml de
chloroforme (3.1), suivis de 20 ml de méthanol (3.2). Écarter ces
éluats. Pendant ces opérations, s'assurer que l'assemblage colonne-
cartouche n'aille pas à sec. Éluer l'aflatoxine B1par 40 ml du
mélange acétone/eau (3.5.1) et recueillir la totalité de l'éluat dans
le ballon piriforme de l'évaporateur rotatif (4.4). Concentrer l'éluat
à l'aide de l'évaporateur rotatif à 40-50 ºC jusqu'à ce que la distilla-
tion de l'acétone soit terminée. ( NB:Il reste, à ce stade, 0,5 ml
environ de liquide dans le ballon. L'expérience a montré qu'une
évaporation prolongée n'est pas nuisible et que, s'il reste 0,5 ml deliquide, il n'y a plus alors de quantité significative d'acétone. Des
résidus d'acétone peuvent conduire à des pertes d'aflatoxine B
1sur
laca rtouche C18). Ajouter 1 ml de méthanol (3.2). Agiter le ballon
pour dissoudre l'aflatoxine B1, ajouter 4 ml d'eau et mélanger.
Déconnecter et jeter laca rtouche. Rincer lacolonne de verre à
l'eau et la garder pour la purification sur C18.
5.4.2. Purification sur SEP-PAK C18.
5.4.2.1. Préparation de l'assemblage colonne-cartouche.
Atta cher un robinet (4.18) à laplus courte tige de laca rtouche C18(3.10) (voir figure 1). Amorcer la cartouche et enlever l'air en
passant rapidement 10 ml de méthanol (3.2) dans la cartouche à
l'aide d'une seringue (4.19) par le robinet (les bulles d'air dans la
cartouche sont visibles sous forme de taches claires sur un fond
grisâtre). Prendre 10 ml d'eau et en injecter 8 ml à travers la
cartouche (éviter d'introduire de l'air dans la cartouche lors du
passage du méthanol à l'eau). Attacher la tige la plus longue de la
cartouche à une colonne de verre (4.17) et passer les 2 ml d'eau1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 11
▼M2
restant à travers la cartouche dans la colonne. Fermer le robinet.
Enlever laseringue.
5.4.2.2. Purification.
Transférer quantitativement dans la colonne (4.17) l'extrait collecté
en 5.4.1.2, en rinçant le ballon deux fois avec 5 ml du mélange
eau/méthanol (3.5.2) et le laisser s'écouler par gravité. Pendant ces
opérations, s'assurer que l'assemblage colonne-cartouche n'aille pas
à sec. (Si des bulles d'air se forment dans le rétrécissement près de
la cartouche, arrêter le débit et tapoter légèrement le sommet de la
colonne de verre pour éliminer les bulles d'air. Puis continuer.)
Éluer avec 25 ml du mélange eau/méthanol (3.5.2). Jeter les éluats.
Éluer l'aflatoxine B1par 50 ml d'eau/acétone (3.5.3) et collecter la
totalité de l'éluat dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajuster au volume
avec de l'eau et mélanger: la solution d'essai ainsi obtenue est
utilisée pour la chromatographie (5.5).
Attention: La filtration de l'extrait final préalable à l'injection en
HPLC n'est généralement pas nécessaire. Si on le consi-
dère nécessaire, les filtres en cellulose sont à éviter, car
ils peuvent entraîner des pertes d'aflatoxine B1. Les
filtres en Téflon sont acceptables.
5.5. Chromatographie en phase liquide haute performance
(Voir la figure 2 pour le montage de l'appareillage). Prévoir suffi-
samment de temps pour laisser les appareils se conditionner et se
stabiliser avant l'utilisation.
Note 1
Les débits donnés pour la phase mobile HPLC et pour le réactif
post-colonne sont simplement indicatifs. Ils peuvent être ajustés
suivant les caractéristiques de la colonne HPLC.
Note 2
La réponse de l'aflatoxine B1dépend de la température. Par consé-
quent, il faut compenser les dérives (voir figure 3). L'injection
d'une quantité fixe de la solution d'étalonnage (3.13.3) à intervalles
réguliers (par exemple chaque troisième injection) permet de
corriger la valeur du pic de l'aflatoxine B1obtenu entre ces étalons
de référence en utilisant la moyenne des réponses. La différence
obtenue entre les solutions étalons consécutives doit être très petite
(< 10 %). Par conséquent, les injections doivent se suivre sans
interruption. Si une interruption est nécessaire, la dernière injection
avant l'interruption et la première injection après l'interruption
doivent être des injections de solution d'étalonnage (3.13.3). La
courbe de calibration étant linéaire et passant par l'origine, les
quantités d'aflatoxine B1dans les échantillons sont déterminées
directement par référence aux solutions étalons les plus proches.
5.5.1. Réglage de la pompe HPLC.
Régler lapompe HPLC (4.5) à un débit de 0,5 ou de 0,3 ml/min
pour une colonne HPLC de 5µm ou 3 µm (4.6) respectivement, en
utilisant la phase mobile (3.6).
5.5.2. Régla ge de lapompe pour laréa ction postcol onne.
Régler lapompe (4.7) à un débit de 0,2-0,4 ml/min de solution
aqueuse saturée en iode (3.7). À titre indicatif: les débits d'environ
0,4 ou 0,2 ml/min sont à recommander en association avec des
débits respectifs de lapha se mobile (3.6) de 0,5 et 0,3 ml/min.
5.5.3. Le détecteur fluorimétrique.
Régler le détecteur fluorimétrique (4.11) à lalongueur d'onde
d'excitation = 365 nm et la longueur d'onde d'émission = 435 nm
(pour un appareil à filtre: > 400 nm). Ajuster l'atténuation du détec-
teur de façon à obtenir environ 80 % de déviation pleine échelle
pour 1 ng d'aflatoxine B1.
5.5.4. Injecteur.
Pour toutes les solutions, injecter 250 µl en suivant les instructions
du fabricant de l'injecteur.
5.5.5. Vérification de la séparation chromatographique.
Injecter la solution d'essai de séparation chromatographique
(3.14.1). Laha uteur du point d'inflexion doit être inférieure à 5 %
de la somme des hauteurs des pics adjacents.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 12
▼M2
5.5.6. Vérification de la stabilité du système.
Avant chaque série d'analyses, injecter plusieurs fois l'étalon de
référence (3.13.3) jusqu'à ce que des surfaces stables de pics soient
obtenues ( NB:les pics d'aflatoxine B1, entre deux injections consé-
cutives, doivent varier de moins de 6 %). Procéder sans attendre à
la vérification de la linéarité (5.5.7).
5.5.7. Vérification de la linéarité.
Injecter les solutions d'étalonnage d'aflatoxine B1(3.13.1 à 3.13.4).
Chaque troisième injection, utiliser l'étalon de référence (3.13.3)
pour corriger ladérive da ns les réponses ( NB:les réponses des
pics pour les étalons de référence ne doivent pas différer de plus
de 10 % en 90 minutes). Corriger ladérive suiva nt laformule
écrite en 7. La droite de calibration doit être linéaire et passer par
l'origine à l'intérieur d'une fourchette de deux fois l'erreur standard
de Y estimé. Les valeurs trouvées ne doivent pas différer de plus de
3 % des valeurs nominales. Si les conditions sont remplies, conti-
nuer sans délai. Sinon, déterminer et rectifier la cause du problème
avant de continuer.
5.5.8. Injection des extraits d'échantillon.
Injecter les extraits purifiés (5.4.2.2). Toutes les deux injections
d'extrait d'échantillon, répéter l'injection de l'étalon de référence
(3.13.3) suivant la séquence: étalon de référence, extrait, extrait,
étalon de référence, extrait, extrait, étalon de référence, etc.
6. Test de confirmation
6.1. Traitement de l'extrait (5.4.2.2)
Ajouter 5 ml de solution de chlorure de sodium (3.15.1) à l'extrait
final obtenu en 5.4.2.2. Extraire trois fois avec 2 ml de chloroforme
(3.1) pendant 1 minute dans une ampoule à décanter (4.24.1).
Filtrer l'extrait chloroformique obtenu dans un tube de 10 ml, à
travers 1 g de sulfate de sodium (3.15.2). Un petit entonnoir de4 cm de diamètre peut être utilisé avec un morceau de laine de
verre recouvert de 1 g de sulfate de sodium (3.15.2).
Laver la couche de sulfate de sodium avec quelques millilitres de
chloroforme et les collecter dans le même tube. Évaporer à sec
l'extrait chloroformique dans le même tube en utilisant le bloc
chauffant (4.24.2) et redissoudre dans 1 ml de chloroforme.
6.2. Préparation des dérivés et chromatographie sur couche mince
Voir ladirective 76/372/CEE du Conseil, a nnexe, méthode A point
5.6.2.
7. Calculs des résultats
Calculer la teneur d'aflatoxine B
1(µg/kg) présente dans l'échantillon
en utilisant la formule:
teneur en aflatoxine B 1exprim´ee en èmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
où:
m = quantité d'aflatoxine B1en ng représentée par le
pic de l'aflatoxine B1de l'échantillon calculé
comme suit:
m¼P´echantillonðÞ
Ps t1ðÞ þPs t2ðÞ/C22rs tðÞ
P(échantillon) = surface du pic d'aflatoxine B1de l'échantillon
P(st1) = surface du pic d'aflatoxine B1de l'étalon de réfé-
rence (3.13.3) précédant l'injection de
l'échantillon
P(st2) = surface du pic d'aflatoxine B1de l'étalon de réfé-
rence (3.13.3) suivant l'injection de l'échantillon1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 13
▼M2
r(st) = quantité d'aflatoxine B1de l'étalon de référence
(3.13.3) injectée en ng
Vm= volume de l'extrait d'échantillon injecté, en ml
Vext= volume final de l'extrait d'échantillon, en ml,
compte tenu de ladilution effectuée en (5.3)
M = masse de l'échantillon, en gV
f= volume de filtrat transféré sur la cartouche de
Florisil (5.4.1.2) en ml.
Vc= volume de chloroforme utilisé pour l'extraction
de l'échantillon en ml.
Si laprocédure est suivie comme da ns ce protocole, laformule se
réduit à:
teneur en aflatoxine B1en µg/kg = 20 × m.
7.1. Les calculs peuvent aussi être faits à partir de la hauteur des pics.
8. Répétabilité
Voir le point 10.1 (observations).
9. Reproductibilité
Voir le point 10.1.
10. Observations
10.1. Précision
Une étude collaborative(1), menée à l'échelon international sur des
aliments composés, a conduit aux données de répétabilité et de
reproductibilité indiquées dans le tableau 1. Le terme de répétabi-
lité (r) utilisé ici est défini comme la plus grande valeur du
rapport, qui n'est plus significative à un niveau de probabilité de
95 %, de deux résultats obtenus pour l'analyse du même échantillon
dans le même laboratoire dans des conditions similaires. Le terme
de reproductibilité (R) est défini de manière semblable en compa-
rant les résultats obtenus par deux laboratoires différents. En
accord avec la norme ISO 3534-1977, 2.35(2) et ladécision 89/
610/CEE de laCommission(3), r et R sont aussi donnés dans le
tableau 1 en terme de coefficients de variation.
Tableau 1
Répétabilité (r) et reproductibilité (R), exprimés en rapport et
en coefficients de variation
(15 laboratoires)
Teneur r R CVr(*) CVR(*)
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = coefficient de variation
10.2. Stabilité du chloroforme (3.1)
Les caractéristiques de l'absorption sur les cartouches de Florisil
peuvent être modifiées si des stabilisants autres que l'éthanol sont
utilisés. Cela doit être vérifié pour être en accord avec le point
10.3 si le chloroforme décrit n'est pas disponible.
10.3. Exactitude
L'application correcte de la méthode doit être vérifiée par des
mesures en double effectuées sur des matériaux de référence
garantis. S'ils ne sont pas disponibles, la validité de la méthode1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 14
(1) Van Egmond, H.P., Heisterkamp, S.H. et Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3)J O noL 351 du 2. 12. 1989, p. 39.
▼M2
doit être vérifiée en effectuant des expériences de récupération
menées sur des échantillons exempts d'aflatoxine B1et contaminés
artificiellement. L'écart entre la moyenne et la valeur réelle
exprimé en pourcentage de la valeur réelle ne doit pas se situer en
dehors des limites −20 % à +10 %.
Figure 1: Assemblage colonne-cartouche1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 15
▼M2
Figure 2: Montage du système chromatographique avec la dériva-
tisation postcolonne
Figure 3: Compensation de la dérive de la réponse de l'aflatoxineB
1en injectant la solution d'étalonnage (3.13.3) à intervalles régu-
liers
C. OBSERVATIONS CONCERNANT LES MÉTHODES A ET B
1.Dégraissage
Les échantillons contenant plus de 5 % de matières grasses doivent être
dégraissés par de l'éther de pétrole (point d'ébullition 40-60 ºC) après la
préparation indiquée au point 5.1. Dans ces cas, les résultats d'analyse
doivent être rapportés au poids de l'échantillon non dégraissé.
2.Reproductibilité des résultats pour la méthode A
La reproductibilité des résultats, c'est-à-dire la variation entre les résultats
obtenus par deux ou plusieurs laboratoires sur le même échantillon, a été
évaluée à:
environ 50 % de la valeur moyenne des résultats pour les valeurs moyennes
en aflatoxine B1de 10 à 20µg/kg,
environ 10 µg/kg à partir de la valeur moyenne pour les valeurs moyennes de
20 à 50 µg/kg,
environ 20 % de la valeur moyenne pour les valeurs moyennes supérieures à
50 µg/kg.1976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 16
▼M3
▼B
ANNEXE
Figure 1
Figure 21976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 17
▼B
Figure 31976L0372 — FR — 03.05.1994 — 003.001 — 18