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►B DÉCISION DE LA COMMISSION
du 15juillet 1994
établissant les conditions de police sanitaire et la certification vétérinaire applicables à l’importa-
tion de sperme de bovins en provenance de pays tiers
(94/577/CE)
(JO L 221 du 26.8.1994, p. 26)
Modifiée par:
Journalofficiel
no page date
►M1 Décision 1999/495/CE de la Commission du 1erjuillet 1999 L 192 56 24.7.1999
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DÉCISION DE LA COMMISSION
du 15juillet 1994
établissant les conditions de police sanitaire et la certification vétéri-
naire applicables à l’importation de sperme de bovins en prove-
nance de pays tiers
(94/577/CE)
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté européenne,
vu la directive 88/407/CEE du Conseil, du 14 juin 1988, fixant les
exigences de police sanitaire applicables aux échanges intracommunau-taires et aux importations de sperme d’animaux de l’espèce bovine (
1),
modifiée en dernier lieu par la directive 93/60/CEE (2), et notamment
ses articles 10 et 11,
considérant que la liste des pays tiers en provenance desquels les États
membres autorisent l’importation de sperme d’animaux domestiques del’espèce bovine, ci-après dénommée «la liste», a été établie par ladécision 90/14/CEE de la Commission (
3), modifiée par la décision
91/276/CEE (4);
considérant que la situation sanitaire d’Israël a entraîné une interdiction
d’importation à l’égard de ce pays, arrêtée par la décision 91/277/CEEde la Commission (
5);
considérant que les décisions 91/479/CEE (6), 91/549/CEE (7), 92/
123/CEE (8), 92/124/CEE (9), 92/125/CEE (10), 92/126/CEE (11), 92/
127/CEE (12), 92/128/CEE (13), 92/386/CEE (14), 92/387/CEE (15)e t9 2 /
455/CEE (16) de la Commission fixent les conditions sanitaires et la
certification vétérinaire applicables à l’importation de sperme de bovinsen provenance respectivement des États-Unis d’Amérique, du Canada,de Pologne, de Finlande, de Nouvelle-Zélande, d’Australie, de Suisse,de Suède, de Hongrie, de Norvège et de Tchécoslovaquie;
considérant que la directive 93/60/CEE, qui doit être mise en œuvre
dans les États membres le 1
erjuillet 1994 au plus tard, modifie la
directive 88/407/CEE et rend donc nécessaire la modification des déci-sions relatives aux pays tiers susmentionnés; que, pour simplifier lalégislation communautaire dans ce domaine et éviter toute ambiguïté, ilconvient de regrouper les décisions susmentionnées et d’abroger cellesconcernant chaque pays individuellement;
considérant que, vu les dispositions de l’accord sur l’espace économique
européen, iln’est pas nécessaire de maintenir l es certificats vétérinairespour les importations de sperme d’animaux de l’espèce bovine enprovenance d’Autriche, de Finlande, de Norvège et de Suède;
considérant que, conformément à l’avis du comité scientifique vétéri-
naire, un test supplémentaire de dépistage de la maladie hémorragiqueépizootique est exigé;
(1)J OnoL 194 du 22. 7. 1988, p. 10.
(2)J OnoL 186 du 28. 7. 1993, p. 28.
(3)J OnoL 8 du 11. 1. 1990, p. 71.
(4)J OnoL 135 du 30. 5. 1991, p. 58.
(5)J OnoL 135 du 30. 5. 1991, p. 60.
(6)J OnoL 258 du 16. 9. 1991, p. 1.
(7)J OnoL 298 du 29. 10. 1991, p. 6.
(8)J OnoL 48 du 22. 2. 1992, p. 1.
(9)J OnoL 48 du 22. 2. 1992, p. 10.
(10)J OnoL 48 du 22. 2. 1992, p. 19.
(11)J OnoL 48 du 22. 2. 1992, p. 28.
(12)J OnoL 48 du 22. 2. 1992, p. 37.
(13)J OnoL 48 du 22. 2. 1992, p. 46.
(14)J OnoL 204 du 21. 7. 1992, p. 13.
(15)J OnoL 204 du 21. 7. 1992, p. 22.
(16)J OnoL 247 du 27. 8. 1992, p. 1.
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considérant que le Canada est le seul pays où des examens de routine
pour ladite maladie sont effectués tous les six mois, préalablement à lacollecte de sperme; qu’il est donc nécessaire d’autoriser une périodetransitoire pour l’application de la présente décision en ce qui concernele Canada, afin de donner aux autorités vétérinaires canadiennes letemps nécessaire pour introduire le nouveau test dans leur programmede routine;
considérant, par ailleurs, que, étant donné les progrès réalisés récem-
ment en matière d’épidémiologie de la fièvre catarrhale, il est désormaispossible d’autoriser l’importation de sperme de bovins en provenanced’Australie;
considérant qu’ilapparaît que l a situation sanitaire des pays tiers figu-
rant sur la liste est bonne et contrôlée par des services vétérinaires bienstructurés et organisés en ce qui concerne les maladies transmissiblespar le sperme;
considérant que les autorités vétérinaires compétentes des pays tiers
figurant sur la liste se sont engagées à notifier à la Commission desCommunautés européennes et aux États membres, par télex ou téléco-pieur et dans un délai de 24 heures, la confirmation de l’apparitiond’une quelconque des maladies figurant sur la liste A de l’Officeinternational des épizooties (OIE) ou toute modification de la politiquede vaccination concernant l’une de ces maladies ou, dans un délaiapproprié, l’apparition de maladies figurant sur la liste B de l’OIE ettoute proposition de modification des règles d’importation applicablesaux animaux domestiques ou au sperme ou aux embryons de cesanimaux;
considérant que les autorités vétérinaires compétentes des pays tiers
figurant sur la liste se sont engagées à contrôler officiellement la déli-vrance des certificats en application de la présente décision et à veiller àce que l’ensemble des certificats, dérogations et résultats de laboratoirepertinents, sur lesquels peut avoir été fondée la certification, soientconservés dans un dossier officielpendant au moins douze mois aprèsl’expédition du sperme auquel ils se réfèrent;
considérant que les autorités vétérinaires compétentes des pays tiers
figurant sur la liste se sont engagées à agréer officiellement les centresde collecte de sperme pour l’exportation de sperme de bovins vers laCommunauté économique européenne, conformément à l’article 9 de ladirective 88/407/CEE du Conseil;
considérant que les conditions sanitaires et la certification vétérinaire
doivent être adaptées au statut sanitaire du pays tiers en cause;
considérant que les mesures prévues par la présente décision sont
conformes à l’avis du comité vétérinaire permanent,
A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:
Article premier
Les États membres autorisent l’importation de sperme de bovins
remplissant les conditions fixées dans les certificats établis dans lapartie 1 des annexes A, B, C et D et provenant seulement des pays tiersénumérés dans la partie 2 des annexes A, B, C et D respectivement.
Toutefois, ils autorisent les importations, en provenance du Canada, de
sperme de bovins collecté et traité conformément à la décision 91/549/CEE, jusqu’au 31 décembre 1994.
Article 2
Les décisions 91/479/CEE, 92/123/CEE, 92/124/CEE, 92/125/CEE, 92/
126/CEE, 92/127/CEE, 92/128/CEE, 92/386/CEE, 92/387/CEE et 92/445/CEE sont abrogées.
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La décision 91/549/CEE est abrogée à partir du 1erjanvier 1995.
Article 3
Les dispositions relatives au Canada, visées à l’article 1erpremier alinéa,
sont applicables à partir du 1erjanvier 1995.
Article 4
Les États membres sont destinataires de la présente décision.
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ANNEXE A
PARTIE 1
CERTIFICAT SANITAIRE
relatif à l’importation de sperme de bovins

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▼B
13. Je soussigné, vétérinaire officiel, certifie, après avoir lu la directive 88/407/CEE du Conseil et en avoir pri s
connaissance, que:
a) ............................................................................................................................. .....
(nom du pays exportateur)
a été indemne de peste bovine et de fièvre aphteuse pendant les douze mois précédant immédiatement l a
collecte du sperme à exporter et jusqu’à la date d’expédition de ce dernier, et qu’aucune vaccination contr e
ces maladies n’a été effectuée pendant cette même période.
b) Le centre de collecte de sperme où a été collecté le sperme à exporter:
i) a été agréé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) est géré et contrôlé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre II de la directive 88/407/CEE;
iii) a été indemne, pendant une période commençant trente jours avant la date de collecte du sperme à
exporter et finissant trente jours après cette collecte (pour le sperme frais, finissant le jour d e
l’expédition), de rage, de tuberculose, de brucellose, de fièvre charbonneuse et de pleuropneumoni e
contagieuse bovine.
c) Les bovins se trouvant dans le centre de collecte de sperme:
i) proviennent de troupeaux et/ou sont issus de vaches satisfaisant aux conditions définies à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) ont été soumis aux tests énumérés à l’annexe B chapitre Ierde la directive 88/407/CEE, préalablement à
leur entrée en station d’isolement;
iii) ont satisfait aux exigences d’isolement et aux tests préalables à l’admission prévus à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
iv) ont été soumis aux examens de routine prévus à l’annexe B chapitre II de la directive 88/407/CEE, s’il s
ont séjourné dans le centre de collecte pendant au moins un an.
d) Le sperme destiné à l’exportation:
i) provient de donneurs ayant séjourné
.............................................................................................................................
(nom du pays exportateur)
au cours des six mois précédant immédiatement la collecte du sperme à exporter et satisfaisant au x
conditions fixées à l’annexe C de la directive 88/407/CEE;
ii) provient de donneurs:
— qui se trouvaient dans un centre de collecte de sperme où tous les bovins ont présenté, au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter, des résultats négatifs à un test d e
séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche de rhinotrachéite bovine infectieuse ou d e
vulvovaginite pustuleuse infectieuse (1)
ou
— qui ont réagi négativement à un test de séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche d e
rhinotrachéite bovine infectieuse ou de vulvovaginite pustuleuse infectieuse, effectué au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter (1)
ou
— qui sont séropositifs, ayant été vaccinés conformément à l’annexe B chapitre II de la directiv e
88/407/CEE (1) et ayant présenté un résultat négatif à un test de séroneutralisation ou à un tes t
ELISA effectué dans le centre de collecte de sperme agréé, préalablement à la vaccination (1);
(1) Biffer la mention inutile.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) a été traité, stocké et transporté dans des conditions conformes aux dispositions de la directiv e
88/407/CEE.
Fait à ............................................................ ,
(lieu)le .................................................................
(date)
/SS74(cachet) (2)Signature (2): .........................................................................
Nom en lettres capitales: ..........................................................
Titre officiel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La signature et le cachet doivent être d’une couleur différente de celle des caractères d’imprimerie.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTIE 2
Liste des pays autorisés à utiliser le modèle de certificat sanitaire établi à la
partie 1 de l’annexe A
RÉPUBLIQUE TCHÈQUEHONGRIENOUVELLE-ZÉLANDEPOLOGNEROUMANIESUISSERÉPUBLIQUE SLOVAQUE
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ANNEXE B
PARTIE 1
CERTIFICAT SANITAIRE
relatif à l’importation de sperme de bovins en provenance des États-Unis d’Amérique

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▼B
13. Je soussigné, vétérinaire officiel, certifie, après avoir lu la directive 88/407/CEE du Conseil et en avoir pri s
connaissance, que:
a) ............................................................................................................................. .....
(nom du pays exportateur)
a été indemne de peste bovine et de fièvre aphteuse pendant les douze mois précédant immédiatement l a
collecte du sperme à exporter et jusqu’à la date d’expédition de ce dernier, et qu’aucune vaccination contr e
ces maladies n’a été effectuée pendant cette même période.
b) Le centre de collecte de sperme où a été collecté le sperme à exporter:
i) a été agréé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) est géré et contrôlé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre II de la directive 88/407/CEE;
iii) a été indemne, pendant une période commençant trente jours avant la date de collecte du sperme à
exporter et finissant trente jours après cette collecte (pour le sperme frais, finissant le jour d e
l’expédition), de rage, de tuberculose, de brucellose, de fièvre charbonneuse et de pleuropneumoni e
contagieuse bovine.
c) Les bovins se trouvant dans le centre de collecte de sperme:
i) proviennent de troupeaux et/ou sont issus de vaches satisfaisant aux conditions définies à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) ont été soumis aux tests énumérés à l’annexe B chapitre Ierde la directive 88/407/CEE, préalablement à
leur entrée en station d’isolement;
iii) ont satisfait aux exigences d’isolement et aux tests préalables à l’admission prévus à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
iv) ont été soumis aux examens de routine prévus à l’annexe B chapitre II de la directive 88/407/CEE, s’il s
ont séjourné dans le centre de collecte pendant au moins un an.
d) Le sperme destiné à l’exportation:
i) provient de donneurs ayant séjourné
.............................................................................................................................
(nom du pays exportateur)
au cours des six mois précédant immédiatement la collecte du sperme à exporter et satisfaisant au x
conditions fixées à l’annexe C de la directive 88/407/CEE;
ii) provient de donneurs:
— qui se trouvaient dans un centre de collecte de sperme où tous les bovins ont présenté, au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter, des résultats négatifs à un test d e
séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche de rhinotrachéite bovine infectieuse ou d e
vulvovaginite pustuleuse infectieuse (1)
ou
— qui ont réagi négativement à un test de séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche d e
rhinotrachéite bovine infectieuse ou de vulvovaginite pustuleuse infectieuse, effectué au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter (1)
ou
— qui sont séropositifs, ayant été vaccinés conformément à l’annexe B chapitre II de la directiv e
88/407/CEE (1) et ayant présenté un résultat négatif à un test de séroneutralisation ou à un tes t
ELISA effectué dans le centre de collecte de sperme agréé, préalablement à la vaccination (1);
(1) Biffer la mention inutile.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) a été traité, stocké et transporté dans des conditions conformes aux dispositions de la directiv e
88/407/CEE;
iv) provient de taureaux qui ont été soumis deux fois, avant et après la collecte, à douze mois d’intervalle,
avec des résultats négatifs, aux tests suivants dans un laboratoire agréé (le test postérieur à la collect e
doit être effectué sur un échantillon de sang prélevé au moins vingt et un jours après la collecte d u
sperme destiné à l’exportation):
— un test ELISA concurrent pour le dépistage de la fièvre catarrhale, conformément à l’annexe E,
— un test d’immunodiffusion sur gel d’agar conformément à l’annexe C et un test de séroneutralisa -
tion pour tous les sérotypes de la maladie hémorragique épizootique connus dans le pays exporta -
teur.
Fait à ............................................................ ,
(lieu)le .................................................................
(date)
/SS74(cachet) (2)Signature (2): .........................................................................
Nom en lettres capitales: ..........................................................
Titre officiel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La signature et le cachet doivent être d’une couleur différente de celle des caractères d’imprimerie.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTIE 2
Liste des pays autorisés à utiliser le modèle de certificat sanitaire établi à la
partie 1 de l’annexe B
ÉTATS-UNIS D’AMÉRIQUE
1994D0577 — FR — 05.07.1999 — 001.001 — 13
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ANNEXE C
PARTIE 1
CERTIFICAT SANITAIRE
relatif à l’importation de sperme de bovins

1994D0577 — FR — 05.07.1999 — 001.001 — 14
▼B
13. Je soussigné, vétérinaire officiel, certifie, après avoir lu la directive 88/407/CEE du Conseil et en avoir pri s
connaissance, que:
a) ............................................................................................................................. .....
(nom du pays exportateur)
a été indemne de peste bovine et de fièvre aphteuse pendant les douze mois précédant immédiatement l a
collecte du sperme à exporter et jusqu’à la date d’expédition de ce dernier, et qu’aucune vaccination contr e
ces maladies n’a été effectuée pendant cette même période.
b) Le centre de collecte de sperme où a été collecté le sperme à exporter:
i) a été agréé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) est géré et contrôlé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre II de la directive 88/407/CEE;
iii) a été indemne, pendant une période commençant trente jours avant la date de collecte du sperme à
exporter et finissant trente jours après cette collecte (pour le sperme frais, finissant le jour d e
l’expédition), de rage, de tuberculose, de brucellose, de fièvre charbonneuse et de pleuropneumoni e
contagieuse bovine.
c) Les bovins se trouvant dans le centre de collecte de sperme:
i) proviennent de troupeaux et/ou sont issus de vaches satisfaisant aux conditions définies à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) ont été soumis aux tests énumérés à l’annexe B chapitre Ierde la directive 88/407/CEE, préalablement à
leur entrée en station d’isolement;
iii) ont satisfait aux exigences d’isolement et aux tests préalables à l’admission prévus à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
iv) ont été soumis aux examens de routine prévus à l’annexe B chapitre II de la directive 88/407/CEE, s’il s
ont séjourné dans le centre de collecte pendant au moins un an.
d) Le sperme destiné à l’exportation:
i) provient de donneurs ayant séjourné
.............................................................................................................................
(nom du pays exportateur)
au cours des six mois précédant immédiatement la collecte du sperme à exporter et satisfaisant au x
conditions fixées à l’annexe C de la directive 88/407/CEE;
ii) provient de donneurs:
— qui se trouvaient dans un centre de collecte de sperme où tous les bovins ont présenté, au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter, des résultats négatifs à un test d e
séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche de rhinotrachéite bovine infectieuse ou d e
vulvovaginite pustuleuse infectieuse (1)
ou
— qui ont réagi négativement à un test de séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche d e
rhinotrachéite bovine infectieuse ou de vulvovaginite pustuleuse infectieuse, effectué au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter (1)
ou
— qui sont séropositifs, ayant été vaccinés conformément à l’annexe B chapitre II de la directiv e
88/407/CEE (1) et ayant présenté un résultat négatif à un test de séroneutralisation ou à un tes t
ELISA effectué dans le centre de collecte de sperme agréé, préalablement à la vaccination (1);
(1) Biffer la mention inutile.
1994D0577 — FR — 05.07.1999 — 001.001 — 15
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) a été traité, stocké et transporté dans des conditions conformes aux dispositions de la directiv e
88/407/CEE;
iv) provient de taureaux qui:
— soit se trouvaient dans le centre agréé le 1erjuillet 1994,
— soit ont été introduits dans le centre agréé après le 1erjuillet 1994, ayant été soumis, avec de s
résultats négatifs, aux tests suivants pour le dépistage de la fièvre catarrhale et de la maladi e
hémorragique épizootique dans un laboratoire agréé, préalablement à leur admission,
et qui, dans un cas comme dans l’autre, ont été soumis, tous les six mois, avec des résultats négatifs,
aux tests suivants dans un laboratoire agréé:
— un test ELISA concurrent pour le dépistage de la fièvre catarrhale, conformément à l’annexe E,— un test d’immunodiffusion sur gel d’agar conformément à l’annexe C et un test de séroneutralisa
-
tion pour tous les sérotypes de la maladie hémorragique épizootique connus dans le pays exporta -
teur.
Fait à ............................................................ ,
(lieu)le .................................................................
(date)
/SS74(cachet) (2)Signature (2): .........................................................................
Nom en lettres capitales: ..........................................................
Titre officiel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La signature et le cachet doivent être d’une couleur différente de celle des caractères d’imprimerie.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — FR — 05.07.1999 — 001.001 — 16
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PARTIE 2
Liste des pays autorisés à utiliser le modèle de certificat sanitaire établi à la
partie 1 de l’annexe C
CANADA: à l’exclusion de la région de la vallée de l’Okanagan, en Colombie
britannique, définie comme la zone délimitée par une ligne tracée àpartir d’un point situé sur la frontière qui sépare le Canada desÉtats-Unis d’Amérique, par 120 °15 /prime1de longitude et 49 °de latitude,
dans une direction nord jusqu’à un point situé par 119 °35 /prime1de
longitude et 50 °30 /prime1de latitude, dans une direction nord-est jusqu’à
un point situé par 119 °de longitude et 50 °45 /prime1de latitude, dans une
direction sud jusqu’à un point situé sur la frontière qui sépare leCanada des États-Unis d’Amérique par 118 °15 /prime1de longitude et 49 °
de latitude.
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ANNEXE D
PARTIE 1
CERTIFICAT SANITAIRE
relatif à l’importation de sperme de bovins en provenance des États-Unis d’Amérique

1994D0577 — FR — 05.07.1999 — 001.001 — 18
▼B
13. Je soussigné, vétérinaire officiel, certifie, après avoir lu la directive 88/407/CEE du Conseil et en avoir pri s
connaissance, que:
a) ............................................................................................................................. .....
(nom du pays exportateur)
a été indemne de peste bovine et de fièvre aphteuse pendant les douze mois précédant immédiatement l a
collecte du sperme à exporter et jusqu’à la date d’expédition de ce dernier, et qu’aucune vaccination contr e
ces maladies n’a été effectuée pendant cette même période.
b) Le centre de collecte de sperme où a été collecté le sperme à exporter:
i) a été agréé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) est géré et contrôlé selon les conditions définies à l’annexe A chapitre II de la directive 88/407/CEE;
iii) a été indemne, pendant une période commençant trente jours avant la date de collecte du sperme à
exporter et finissant trente jours après cette collecte (pour le sperme frais, finissant le jour d e
l’expédition), de rage, de tuberculose, de brucellose, de fièvre charbonneuse et de pleuropneumoni e
contagieuse bovine.
c) Les bovins se trouvant dans le centre de collecte de sperme:
i) proviennent de troupeaux et/ou sont issus de vaches satisfaisant aux conditions définies à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
ii) ont été soumis aux tests énumérés à l’annexe B chapitre Ierde la directive 88/407/CEE, préalablement à
leur entrée en station d’isolement;
iii) ont satisfait aux exigences d’isolement et aux tests préalables à l’admission prévus à l’annexe B
chapitre Ierde la directive 88/407/CEE;
iv) ont été soumis aux examens de routine prévus à l’annexe B chapitre II de la directive 88/407/CEE, s’il s
ont séjourné dans le centre de collecte pendant au moins un an.
d) Le sperme destiné à l’exportation:
i) provient de donneurs ayant séjourné
.............................................................................................................................
(nom du pays exportateur)
au cours des six mois précédant immédiatement la collecte du sperme à exporter et satisfaisant au x
conditions fixées à l’annexe C de la directive 88/407/CEE;
ii) provient de donneurs:
— qui se trouvaient dans un centre de collecte de sperme où tous les bovins ont présenté, au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter, des résultats négatifs à un test d e
séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche de rhinotrachéite bovine infectieuse ou d e
vulvovaginite pustuleuse infectieuse (1)
ou
— qui ont réagi négativement à un test de séroneutralisation ou à un test ELISA pour la recherche d e
rhinotrachéite bovine infectieuse ou de vulvovaginite pustuleuse infectieuse, effectué au cours de s
douze mois précédant la collecte du sperme à exporter (1)
ou
— qui sont séropositifs, ayant été vaccinés conformément à l’annexe B chapitre II de la directiv e
88/407/CEE (1) et ayant présenté un résultat négatif à un test de séroneutralisation ou à un tes t
ELISA effectué dans le centre de collecte de sperme agréé, préalablement à la vaccination (1);
(1) Biffer la mention inutile.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) a été traité, stocké et transporté dans des conditions conformes aux dispositions de la directiv e
88/407/CEE;
iv) provient de taureaux qui ont été soumis deux fois, avant et après la collecte, à douze mois d’intervalle,
avec des résultats négatifs, aux tests suivants dans un laboratoire agréé (le test postérieur à la collect e
doit être effectué sur un échantillon de sang préIevé au moins vingt et un jours après la collecte d u
sperme destiné à l’exportation):
— un test ELISA concurrent pour le dépistage de la fièvre catarrhale, conformément à l’annexe E,
— un test d’immunodiffusion sur gel d’agar conformément à l’annexe E et un test de séroneutralisa -
tion pour tous les sérotypes de la maladie hémorragique épizootique connus dans le pays exporta -
teur,
— un test de séroneutralisation pour le virus akabane.
Fait à ............................................................ ,
(lieu)le .................................................................
(date)
/SS74(cachet) (2)Signature (2): .........................................................................
Nom en lettres capitales: ..........................................................
Titre officiel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La signature et le cachet doivent être d’une couleur différente de celle des caractères d’imprimerie.
►(1)M1
►(2)M1
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▼B
PARTIE 2
Liste des pays autorisés à utiliser le modèle de certificat sanitaire établi à la
partie 1 de l’annexe D
AUSTRALIE
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▼B
ANNEXE E
Protocole relatif à un test de dosage par immuno-absorption à liaison enzy-
matique, bloquant ou concurrent, à l’aide d’un anticorps monoclonal spéci-fique à un groupe pour la recherche des anticorps du virus de la fièvre
catarrhale
TEST ELISA CONCURRENT DE RECHERCHE DE LA FIÈVRE
CATARRHALE À L’AIDE DE L’ANTICORPS MONOCLONAL 3-17-A3
Le test permet de dépister les anticorps de tous les sérotypes connus du virus de
la fièvre catarrhale (VFC).
Le principe du test est l’interruption de la réaction entre l’antigène du VFC et un
anticorps monoclonal spécifique au groupe (3-17-A3) par l’addition de dilutionsdu sérum à tester. Les anticorps du VFC présents dans le sérum à tester bloquentla réactivité de l’anticorps monoclonal (AMC), ce qui atténue le changementescompté de couleur lors de l’addition du substrat enzymatique.
MATÉRIEL ET RÉACTIFS
1. Plaques de microtitrage à fond plat.
2. Antigène: préparé selon la procédure décrite ci-dessous.3. Tampon bloquant: 5 % (p/v) de poudre de lait séché «Marvel», 0,1 % (v/v) de
«Tween-20» (fourni sous forme de sirop de polyoxyéthylène sorbiton mono-laurate) dans du PBS (phosphate-buffered saline).
4. Anticorps monoclonal: 3-17-A3 (fournis sous forme de surnageant de culture
tissulaire hybridome) stocké à − 20 °C ou lyophilisé, dilué au 1/50 avec un
tampon bloquant avant utilisation, dirigé contre le polypeptide p7 spécifiqueau groupe.
5. Conjugué: globuline de lapin anti-souris (adsorbée et éluée), conjuguée à de
la peroxidase de raifort et conservée à l’obscurité à 4 °C.
6. Substrat et chromogène: 0,2 g d’orthophénylène diamine (OPD) dissoute dans
un tampon composé de 2,553 g d’acide citrique et 4,574 g de di-sodiumhydrogénorthophosphate porté à 500 ml avec de l’eau distillée, subdivisé enfractions aliquotes de 25 ml et conservé à l’obscurité à − 20 °C puis addi-
tionné de 12 µl/25 ml de peroxyde d’hydrogène (30 % p/v) immédiatement
avant utilisation.
MANIPULER L’OPD AVEC PRÉCAUTIONS — PORTER DES GANTS
EN CAOUTCHOUC — PRODUIT SUSPECT D’ÊTRE MUTAGÈNE.
7. Acide sulfurique 1 M: 26,6 ml d’acide ajouté à 473,4 ml d’eau distillée.
ATTENTION: TOUJOURS AJOUTER L’ACIDE À L’EAU, JAMAIS
L’EAU À L’ACIDE.
8. Agitateur orbital.9. Lecteur de plaques ELISA (le test peut être lu visuellement).
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SCHÉMA DE L’ÉPREUVE
PROTOCOLE D’ESSAI
Contrôle à blanc
La ligne 1, d eAàH ,e s tu n contrôle à blanc comprenant l’antigène du VFC et le
conjugué. Il peut être utilisé pour étalonner le lecteur ELISA.
Contrôle de l’AMC
La ligne 2, d eAàH ,e s tle contrôle de l’anticorps monoclonal et comprend
l’antigène du VFC, l’anticorps monoclonal et le conjugué. Il s’agit d’un contrôlenégatif. La moyenne des valeurs de densité optique de cette ligne de contrôlereprésente la valeur d’inhibition 0 %.
Contrôle positif
La ligne 3, d eAàHe s tle contrôle positif. Il comprend l’antigène du VFC, des
dilutions d’antisérums positifs du VFC, l’AMC et le conjugué. Ce contrôle sert àindiquer que le test se déroule normalement et que des niveaux similairesd’inhibition devraient être obtenus d’un test à l’autre.
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Sérums à tester
Dans le schéma de test présenté ci-avant, dix-huit sérums doivent être testés dans
des dilutions de 1/2, 1/4, 1/8 et 1/16. Il en ressortira des informations sur le titrede l’anticorps contenu dans les sérums à tester. La gamme des dilutions pourraitêtre élargie encore pour obtenir des titres finals de dilution du sérum. À l’inverse,pour des études sérologiques à grande échelle, le sérum pourrait être testé à unedilution unique (1/4) ou à deux dilutions (1/2 et 1/4) en tant qu’épreuve decontrôle rapide.
MODE OPÉRATOIRE
1. Diluer l’antigène du VFC à la concentration prétitrée dans du PBS. Agiter
brièvement (par agitateur à ultrason) pour disperser les agrégats de virus (àdéfaut de cet appareil, agiter vigoureusement à la pipette) et en ajouter 50 µl
dans toutes les loges de la plaque ELISA. Tapoter les bords de la plaque pourdisperser l’antigène.
2. Incuber à 37 °C pendant soixante minutes dans un agitateur orbital. Laver les
plaques en rinçant les loges avec du PBS non stérile, puis sécher à l’aide depapier buvard.
3. Ajouter 50 µl de tampon bloquant par loge. Ajouter les sérums à tester et le
sérum positif dans les loges appropriées et diluer le contenu de la plaque àl’aide d’une pipette à canaux multiples. Ne pas ajouter de sérum au contrôle àblanc ou au contrôle de l’AMC.
4. Immédiatement après addition des sérums à tester, diluer l’AMC dans le
tampon bloquant (à une dilution prétitrée) et en ajouter 50 µldans toutes l es
loges de la plaque, à l’exception du contrôle à blanc.
5. Incuber à 37 % pendant soixante minutes dans un agitateur orbital. Laver trois
fois avec du PBS et sécher à l’aide de papier buvard.
6. Diluer le concentré de globuline de lapin anti-souris au 1/5 000 dans le
tampon bloquant et en introduire 50 µl dans toutes les loges de la plaque.
7. Incuber à 37 °C pendant soixante minutes dans un agitateur orbital. Laver
trois fois avec du PBS et sécher à l’aide de papier buvard.
8. Décongeler l’OPD et, immédiatement avant utilisation, ajouter 12 µlde
peroxyde d’hydrogène à 30 % à chaque fraction de 25 mld’OPD. Enintroduire 50 µl dans toutes les loges de la plaque. Attendre le virage de la
couleur pendant environ dix minutes et arrêter la réaction à l’aide d’acidesulfuriqu e1M( 5 0 µl). La couleur devrait virer dans les loges de contrôle de
l’ANC et dans les loges contenant des sérums SANS anticorps dirigés contrele VMC.
9. Examiner les plaques soit visuellement, soit à l’aide d’un lecteur spectropho-
tométrique et enregistrer les résultats.
ANALYSE DES RÉSULTATS
Calculer la moyenne de densité optique (DO) à partir des contrôles AMC. Cela
représente la valeur d’inhibition 0 %. Les valeurs de densité optique des sérums àtester sont exprimées en pourcentage des valeurs d’inhibition, à l’aide de laformule suivante:
pourcentage de la valeur d’inhibition = 100 − DO en présence du sérum à
testerDO en l’absence du sérum à tester × 100
Les valeurs d’inhibition supérieures à 4 0 % à une dilution du sérum de 1/4 sont
considérées comme positives. La lecture visuelle est possible dans la mesure ouune inhibition de 40 % est la plus faible valeur aisément discernable à l’œil nu.
PRÉPARATION DE L’ANTIGÈNE VFC POUR LA TECHNIQUE ELISA
1. Laver trois fois dix roux de cellules BHK-21 confluentes à l’aide d’un
milieuEagle exempt de sérum, puis infecter par le sérotype 1 du virus de la
fièvre catarrhale dans un milieu Eagle exempt de sérum.
2. Incuber à 37 °C et examiner chaque jour pour observer l’effet cytopathogène
(ecp).
3. Lorsque l’ecp devient évident sur 80 à 90 % de la plaque de cellules de
chaque roux, récupérer le virus en agitant pour détacher les cellules adhérantà la paroi.
4. Centrifuger à2 000-3 000tours par minute pour obtenir un culot cellulaire.5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans environ 30 ml
de PBS contenan t1%d e «Sarkosyl» et 2 ml de fluorure de phénylméthyl-
sulphonyl (tampon lyse). Cette opération peut entraîner une gélification des
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cellules, auquel cas il faut ajouter davantage de tampon lyse pour atténuer
cet effet.
NB: le fluorure de phénylméthylsulphonyl est dangereux. Le manipuler avec
une extrême prudence.
6. Fragmenter les cellules pendant soixante secondes à l’aide d’une sonde
ultrasonique fonctionnant à une amplitude de 30 microns.
7. Centrifuger à 10 000 tours par minute pendant dix minutes.8. Stocker le surnageant à + 4 °C et remettre le reste du culot cellulaire en
suspension dans 10 à 20 mlde tampon l yse.
9. Agiter à l’aide d’un appareil à ultrason et clarifier en récupérant le surna-
geant à chaque stade, trois fois au total.
10. Réunir les fractions surnageantes et centrifuger à24 000tours par minute
pendant cent vingt minutes à + 4 °C sur un coussin de 5 mlde sucrose à 40
% (p/v dans du PBS) en utilisant des tubes de centrifugation Beckmann de30 mlet un rotor SW 28.
11. Jeter le surnageant, laisser s’égoutter les tubes soigneusement et remettre le
granule de culot cellulaire en suspension dans du PBS, en le soumettant auxultrasons. Stocker l’antigène en fractions aliquotes à − 70 °C.
TITRAGE DE L’ANTIGÈNE VFC POUR LA TECHNIQUE ELISA
L’antigène de la fièvre catarrhale est titré par la technique ELISA indirecte. Des
dilutions 1/2 d’antigène sont titrées par rapport à une dilution constante (1/50)d’anticorps monoclonal 3-17-A3. Le protocole est le suivant:
MODE OPÉRATOIRE
1. Diluer l’antigène VFC dans du PBS sur l’ensemble de la plaque de microti-
trage dans une série de dilutions 1/2 (50 µl par loge) en utilisant une pipette à
canaux multiples.
2. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital.
3. Laver trois fois les plaques avec du PBS.4. Ajouter 50 µl d’anticorps monoclonal 3-17-A3 (dilué au 1/50) dans chaque
loge de la plaque de microtitrage.
5. Incuber pendant 1 heure à 37 °C dans un agitateur orbital.
6. Laver trois fois les plaques avec du PBS.7. Ajouter dans chaque loge de la plaque de microtitrage 50 µl de globuline de
lapin anti-souris conjuguée à de la peroxydase de raifort, diluée jusqu’à uneconcentration optimale prétitrée.
8. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital.
9. Ajouter le substrat et le chromogène comme indiqué précédemment. Arrêter
la réaction au bout de dix minutes en ajoutant de l’acide sulfuriqu e1M( 5 0
µlpar l oge).
Dans l’essai concurrent, l’anticorps monoclonal doit se trouver en excédent; on
utilise donc une dilution d’antigène qui se trouve sur la courbe de titrage (et nondans la zone de plateau) et qui donne approximativement une DO de 0,8 au boutde dix minutes.
Protocole relatif à l’essai d’immunodiffusion sur gel d’agar en vue de la
détection d’anticorps de la maladie hémorragique épizootique
Le test d’immunodiffusion sur gel d’agar est effectué selon le protocole suivant:
MATÉRIELS ET RÉACTIFS
1. Antigène
Préparer l’antigène précipitant dans un quelconque système de culture cellu-
laire compatible avec la multiplication rapide du (des) sérotype(s) appro-prié(s) du virus de la maladie hémorragique épizootique. Les cellules BHK ouVero sont recommandées. L’antigène est présent dans le fluide supernageant àla fin de la croissance virale mais doit être concentré de 50 à 100 fois pourêtre efficace. On y parvient à l’aide d’une quelconque méthode de concentra-tion protéique type; le virus de l’antigène peut être inactivé par addition de0,3 % (v/v) de béta-propiolactone.
2. Sérum de contrôle positif connu
À l’aide d’un sérum de référence international et d’antigène un sérum type
nationalest produit, standardisé en vue d’obtenir une proportion optimal e par
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▼B
rapport au sérum de référence international, liophylisé et utilisé comme sérum
de contrôle connu dans chaque test.
3. Sérum à tester.
MODE OPÉRATOIRE
1. Verser de l’agarose à 1 % dans un tampon de borate ou de barbitol de
sodium, pH 8,5 à 9,0 dans une boîte de Pétri à une profondeur minimale de3,0 mm.
2. Un ensemble à tester de sept loges exemptes d’humidité, de 5,0 mm de
diamètre, est creusé dans l’agar. Le schéma comprend une loge centrale et sixloges disposées dans un cercle d’un rayon de 3 mm.
3. Remplir la loge centrale à l’aide d’antigène standard. Remplir les loges
périphériques 2, 4 et 6 avec des sérums positifs connus, les loges 1, 3 et 5avec des sérums à tester.
4. Le système est incubé pendant soixante-douze heures au maximum à tempéra-
ture ambiante dans une chambre humide fermée.
INTERPRÉTATION
Un sérum à tester est positif s’ilforme une l igne de précipitine spécifique avec
l’antigène ainsi qu’une ligne complète d’identité avec le sérum de contrôle. Unsérum à tester est négatif s’il ne forme pas de ligne spécifique avec l’antigène etn’infléchit pas la courbe du sérum de contrôle. Les boîtes de Pétri doivent êtreexaminées sur fond sombre et en éclairage indirect.