A)

L’épreuve ELISA bloquante ou de compétition est effectuée conformément au protocole suivant. L’épreuve ELISA de compétition, qui utilise l’anticorps monoclonal 3-17-A3, permet de détecter les anticorps de tous les sérotypes connus du virus de la fièvre catarrhale (VFC). Le principe de l’épreuve consiste dans l’interruption de la réaction entre l’antigène du VFC et un anticorps monoclonal spécifique au groupe (3-17-A3) par l’ajout de sérum d’épreuve. Les anticorps du VFC présents dans le sérum d’épreuve bloquent la réactivité de l’anticorps monoclonal (AcM) et entraînent une réduction du développement escompté de la couleur après ajout d’un anticorps antisouris marqué par un enzyme et de substrat/chromogène. Les sérums peuvent être testés à une seule dilution de 1/5 (méthode du test ponctuel - appendice 1) ou être titrés (méthode de titrage du sérum - appendice 2) afin de définir les points de dilution limite. Des valeurs d’inhibition supérieures à 50 % peuvent être considérées comme positives. Matériels et réactifs 1. Plaques de microtitrage ELISA appropriées. 2. Antigène: fourni sous forme de concentré cellulaire, préparé selon la procédure indiquée ci-dessous et conservé à une température de – 20 °C ou de – 70 °C. 3. Tampon bloquant: solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,3 % de sérum bovin adulte négatif du virus de la fièvre catarrhale, 0,1 % (v/v) de Tween 20 (fourni sous forme de sirop de polyoxyéthylène sorbiton monolaurate) dans du PBS. 4. Anticorps monoclonal: 3-17-A3 (fourni sous forme de surnageant de culture tissulaire hybridome) dirigé contre le polypeptide VP7 spécifique, stocké à – 20 °C ou lyophilisé et dilué à 1/100 avec un tampon bloquant avant utilisation. 5. Conjugué: globuline de lapin anti-souris (adsorbée et éluée), conjuguée à de la peroxydase de raifort et conservée à l’obscurité à 4 °C. 6. Chromogène et substrat: orthophényle-diamine (chromogène OPD) dont la concentration finale est de 0,4 mg/ml dans de l’eau distillée stérile. Peroxyde d’hydrogène (substrat 30 % p/v), 0,05 % v/v ajouté immédiatement avant utilisation (5 μl de H2O2/10 ml d’OPD). (Manipuler l’OPD avec précaution - Porter des gants en caoutchouc - Produit suspecté d’être mutagène). 7. Acide sulfurique à 1 mole: 26,6 ml d’acide ajouté à 473,4 ml d’eau distillée. (Attention: toujours ajouter l’acide à l’eau, jamais l’eau à l’acide.) 8. Agitateur orbital. 9. Lecteur de plaque ELISA (l’épreuve peut être lue visuellement). Schéma de l’épreuve Cc: Contrôle conjugué (pas de sérum/pas d’anticorps monoclonal); C++: Sérum témoin fortement positif; C+: Sérum témoin faiblement positif; C–: Sérum témoin négatif; Cm: Contrôle de l’anticorps monoclonal (sans sérum).



APPENDICE 1 Dilution unique (1/5) - Schéma (40 sérums/plaque) Contrôles Sérums d’épreuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



APPENDICE 2 Schéma de titrage du sérum (10 sérums/plaque) Contrôles Sérums d’épreuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protocole d’essai Contrôle conjugué (Cc) : Les puits 1A et 1B correspondent à un contrôle à blanc comprenant l’antigène du VFC et un conjugué. Il peut être utilisé pour étalonner le lecteur ELISA. Contrôle de l’AcM (Cm) : Les colonnes 1 et 2 et les lignes G et H correspondent au contrôle de l’anticorps monoclonal, formé de l’antigène du VFC, de l’anticorps monoclonal et du conjugué. Ces puits représentent la couleur la plus prononcée. La moyenne des valeurs de la densité optique de ce contrôle représente la valeur d’inhibition de 0 %. Contrôle positif (C++, C+) : Colonnes 1 et 2, lignes C, D, E et F. Ces puits contiennent l’antigène du VFC, l’antisérum fortement et faiblement positif du VFC, l’AcM et le conjugué. Contrôle négatif (C–) : Les puits 2A et 2B sont les témoins négatifs, qui contiennent l’antigène du VFC, l’antisérum négatif du VFC, l’AcM et le conjugué. Sérums d’épreuve : Pour des études sérologiques à grande échelle et des épreuves de contrôle rapides, les sérums peuvent être testés à une dilution unique de 1/5 (appendice 1). Autrement, 10 sérums peuvent être testés à une dilution allant de 1/5 à 1/640 (appendice 2). Il en ressortira des informations sur le titre de l’anticorps contenu dans les sérums à tester. Mode opératoire 1. Diluer l’antigène du VFC à la concentration prétitrée dans du PBS. Agiter brièvement (par agitateur à ultrasons) pour disperser les agrégats de virus (à défaut d’appareil, agiter vigoureusement à la pipette) et en ajouter 50 μl dans tous les puits de la plaque ELISA. Tapoter les bords de la plaque pour disperser l’antigène. 2. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. Laver les plaques trois fois par rinçage, vider les loges avec du PBS non stérile et sécher à l’aide de papier buvard. 3. Puits de contrôle: ajouter 100 μl de tampon de blocage aux puits Cc. Ajouter 50 μl de sérums positif et négatif de contrôle, à une dilution de 1/5 (10 μl de sérum + 40 μl de tampon de blocage), aux puits C–, C+ et C++, respectivement. Ajouter 50 μl de tampon de blocage aux puits de contrôle AcM. Méthode de titrage ponctuelle: ajouter au tampon de blocage une dilution à 1/5 de chaque sérum d’épreuve afin de doubler les puits des colonnes 3 à 12 (10 μl de sérums + 40 μl de tampon de blocage), ou Méthode de titrage du sérum: préparer une série de dilutions de raison 2 de chaque échantillon d’épreuve (de 1/5 à 1/640) dans un tampon de blocage dans huit puits de chacune des colonnes 3 à 12. 4. Immédiatement après l’ajout des sérums d’épreuve, diluer l’AcM à 1/100 dans un tampon bloquant et ajouter 50 μl à tous les puits de la plaque, sauf le contrôle à blanc. 5. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. Laver trois fois avec du PBS et sécher à l’aide de papier buvard. 6. Diluer le concentré de lapin antisouris à 1/5 000 dans un tampon bloquant et ajouter 50 μl dans tous les puits de la plaque. 7. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. Laver trois fois avec du PBS et sécher à l’aide de papier buvard. 8. Décongeler le dichlorhydrate d’o-phénylènediamine (OPD) et, immédiatement avant utilisation, ajouter 5 μl de peroxyde d’hydrogène à 30 % à chaque quantité de 10 ml d’OPD. Ajouter 50 μl dans tous les puits de la plaque. Attendre le développement de la couleur pendant environ 10 minutes et arrêter la réaction à l’aide de l’acide sulfurique à 1 mole (50 μl par puits). La couleur devrait se développer dans les puits de contrôle AcM et dans les puits contenant des sérums sans anticorps du VFC. 9. Examiner et enregistrer les plaques soit visuellement, soit à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique. Analyse des résultats À l’aide d’un logiciel, imprimer les valeurs de densité optique (DO) et le pourcentage d’inhibition (PI) des sérums à tester et des sérums témoins sur la base de la valeur moyenne enregistrée dans les puits témoins d’antigène. Les valeurs DO et PI sont utilisées pour déterminer si le test a été exécuté dans des limites acceptables. Les limites supérieure (UCL) et inférieure (LCL) de contrôle de l’AcM (antigène plus AcM en l’absence de sérum à tester) se situent entre les valeurs 0,4 et 1,4 de DO. Toute plaque non conforme aux critères précités doit être rejetée. En l’absence d’un logiciel informatique, imprimer les valeurs DO avec l’imprimante ELISA. Calculer la valeur moyenne de densité optique pour les puits témoins d’antigène, qui équivaut à la valeur à 100 %. Déterminer la valeur DO à 50 % et calculer manuellement la positivité ou la négativité de chaque échantillon. Pourcentage de la valeur d’inhibition (PI) = 100 – (DO de chaque témoin testé/DO moyenne de Cm) × 100. Les puits de sérum témoin négatif dédoublés et les puits de contrôle à blanc dédoublés doivent enregistrer des valeurs PI comprises entre + 25 % et – 25 % et entre + 95 % et + 105 % respectivement. Le non-respect de ces limites n’a pas pour effet d’invalider les résultats de la plaque, mais il laisse supposer la formation d’une couleur de fond. Les sérums témoins fortement et faiblement positifs doivent enregistrer des valeurs PI comprises entre + 81 % et + 100 % et entre + 51 % et + 80 % respectivement. Le seuil de diagnostic pour les sérums à tester est de 50 % (PI de 50 % ou DO de 50 %). Les échantillons donnant des valeurs PI supérieures à 50 % sont considérés comme négatifs. Les échantillons qui présentent des valeurs PI supérieures ou inférieures au seuil pour les puits dédoublés sont considérés comme suspects; ces échantillons peuvent être retestés par test ponctuel ou par titrage. Les échantillons positifs peuvent également être titrés afin de fournir une indication du degré de positivité. Lecture visuelle: les échantillons positifs et négatifs sont facilement repérables à l’œil nu; il peut toutefois être plus difficile d’interpréter à l’œil nu les échantillons faiblement positifs ou fortement négatifs. Préparation de l’antigène du virus de la fièvre catarrhale pour l’ELISA 1. Laver trois fois 40 à 60 roux de cellules BHK-21 confluentes à l’aide d’un milieu Eagle exempt de sérum, et infecter au moyen du sérotype 1 du virus de la fièvre catarrhale dans un milieu Eagle exempt de sérum. 2. Incuber à 37 °C et examiner l’effet cytopathogène (ECP) chaque jour. 3. Lorsque l’ECP est complet dans 90 à 100 % de la plaque de cellules de chaque roux, récolter le virus par agitation pour détacher les cellules adhérant à la paroi. 4. Centrifuger à une vitesse comprise entre 2 000 et 3 000 tours/minute pour réduire les cellules en fragments. 5. Jeter la fraction surnageante et remettre les cellules en suspension dans environ 30 ml de PBS contenant 1 % de «Sarkosyl» et 2 ml de fluorure de phényl méthyl sulfonyle (tampon de lyse). Cela peut provoquer une gélification des cellules; auquel cas, il convient d’ajouter davantage de tampon de lyse pour réduire cet effet. (NB: le fluorure de phényl méthyl sulfonyle est dangereux; le manipuler avec une extrême prudence.) 6. Dissocier les cellules pendant 60 secondes à l’aide d’une sonde ultrasonique fonctionnant à une amplitude de 30 microns. 7. Centrifuger à 10 000 tours/minute pendant dix minutes. 8. Stocker la fraction surnageante à + 4 °C et remettre en suspension le fragment de cellule restant dans 10 à 20 ml de tampon de lyse. 9. Soniquer et clarifier, trois fois au total, en stockant la fraction surnageante à chaque stade. 10. Réunir les fractions surnageantes et centrifuger à 24 000 tours/minute (100,000 g) pendant 120 minutes à une température de + 4 °C sur un coussin de 5 ml de sucrose à 40 % (p/v dans du PBS) en utilisant des tubes de centrifugation Beckmann de 30 ml et un rotor SW 28. 11. Jeter la fraction surnageante, laisser les tubes s’égoutter soigneusement et remettre en suspension le fragment dans du PBS par sonication. Stocker l’antigène en fractions aliquotes à – 20 °C. Titrage de l’antigène du virus de la fièvre catarrhale pour l’ELISA L’antigène de la fièvre catarrhale pour l’ELISA est titré par la technique ELISA indirecte. Des dilutions de raison 2 d’antigène sont titrées en fonction d’une dilution constante (1/100) d’anticorps monoclonal 3-17-A3. Le protocole est le suivant: 1. Titrer l’antigène du VFC dans du PBS à une dilution de 1/20 à travers une plaque de microtitrage dans une série de dilutions de raison 2 (50 μl/puits) en utilisant une pipette multiple. 2. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. 3. Laver trois fois les plaques à l’aide de PBS. 4. Ajouter 50 μl d’anticorps monoclonal 3-17-A3 (dilution 1/100) dans chaque puits de la plaque de microtitrage. 5. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. 6. Laver trois fois les plaques à l’aide de PBS. 7. Ajouter 50 μl de globuline de lapin antisouris conjuguée à de la peroxydase de raifort, à une concentration prétitrée optimale, dans chaque puits de la plaque de microtitrage. 8. Incuber pendant une heure à 37 °C dans un agitateur orbital. 9. Ajouter un substrat et un chromogène comme indiqué ci-dessus. Arrêter la réaction après dix minutes par addition d’acide sulfurique à 1 mole (50 μl/puits). Dans l’essai concurrent, l’anticorps monoclonal doit se trouver en excédent; c’est pourquoi il est choisi une dilution d’antigène qui se trouve sur la courbe de titrage (non dans la zone de plateau) qui donne approximativement une DO de 0,8 après dix minutes.