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►B RÈGLEMENT (CE) N  o 440/2008 DE LA COMMISSION  
du 30 mai 2008  
établissant des méthodes d'essai conformément au règlement (CE) n  o 1907/2006 du Parlement 
européen et du Conseil concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances 
chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH)  
(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)  
(JO L 142 du 31.5.2008, p. 1)  
Modifié par:  
Journal officiel  
n° page  date  
►M1 Règlement (CE) n  o 761/2009 de la Commission du 23 juillet 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Règlement (UE) n  o 1152/2010 de la Commission du 8 décembre 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Règlement (UE) n  o 640/2012 de la Commission du 6 juillet 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Règlement (UE) n  o 260/2014 de la Commission du 24 janvier 2014  L 81  1  19.3.2014  2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1
RÈGLEMENT (CE) n  o 440/2008 DE LA COMMISSION  
du 30 mai 2008  
établissant des méthodes d'essai conformément au règlement (CE) 
n o 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant 
l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances 
(REACH)
 
(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)  
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,  
vu le traité instituant la Communauté européenne,  
vu le règlement (CE) n  o 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil 
du 18 décembre 2006 concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'auto ­
risation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits 
chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le 
règlement (CEE) n
 o 793/93 du Conseil et le règlement (CE) 
n o 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du 
Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE de la Commission (
 1 ), et notamment son article 13, 
paragraphe 3,  
considérant ce qui suit:  
(1) Conformément au règlement (CE) n  o 1907/2006, il convient que 
des méthodes d'essai soient adoptées au niveau communautaire aux fins de la réalisation d'essais sur des substances lorsque de tels essais sont nécessaires pour produire des informations sur les propriétés intrinsèques desdites substances.
 
(2) La directive 67/548/CEE du Conseil du 27 juin 1967 concernant 
le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étique ­
tage des substances dangereuses (
 2 ) définissait, à l'annexe V, les 
méthodes permettant de déterminer les propriétés physico- chimiques, la toxicité et l'écotoxicité des substances et prépara ­
tions. L'annexe V de la directive 67/548/CEE a été supprimée par la directive 2006/121/CE avec effet au 1
 er juin 2008.  
(3) Il y a lieu que les méthodes d'essai de l'annexe V de la 
directive 67/548/CEE soient intégrées dans le présent règlement.  
(4) Le présent règlement n'exclut pas l'utilisation d'autres méthodes 
d'essai à condition que ladite utilisation soit conforme aux dispositions de l'article 13, paragraphe 3, du règlement (CE) 
n
 o 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 2  
( 1 ) JO L 396 du 30.12.2006, p. 1; rectifié au JO L 136 du 29.5.2007, p. 3. 
( 2 ) JO 196 du 16.8.1967, p. 1. Directive modifiée en dernier lieu par la 
directive 2006/121/CE du Parlement européen et du Conseil (JO L 396 du 30.12.2006, p. 850); rectifiée au JO L 136 du 29.5.2007, p. 281.
 (5) Il importe que les principes de remplacement, de réduction et 
d'affinement de l'utilisation des animaux dans les procédures soient pleinement pris en compte lors de l'élaboration des méthodes d'essai, notamment lorsque des méthodes appropriées et validées permettant de remplacer, réduire ou affiner les essais sur les animaux deviennent disponibles.
 
(6) Les dispositions du présent règlement sont conformes à l'avis du 
comité institué par l'article 133 du règlement (CE) n  o 1907/2006,  
A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:  
Article premier  
Les méthodes d'essai à appliquer aux fins du règlement (CE) n  o 1907/2006 
sont définies à l'annexe du présent règlement.  
Article 2  
La Commission procède, si nécessaire, à une révision des méthodes 
d'essai établies dans le présent règlement en vue de remplacer, réduire ou affiner les essais menés sur les animaux vertébrés.
 
Article 3  
Toutes les références à l'annexe V de la directive 67/548/CEE s'enten ­
dent comme des références au présent règlement.  
Article 4  
Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publi ­
cation au  Journal officiel de l'Union européenne . 
Il s'applique à compter du 1  er juin 2008.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 3
 
ANNEXE  
PARTIE A: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DES PROPRIÉTÉS 
PHYSICO-CHIMIQUES  
TABLE DES MATIÈRES 
A.1. TEMPÉRATURE DE FUSION/DE CONGÉLATION 
A.2. TEMPÉRATURE D'ÉBULLITION 
A.3. DENSITÉ RELATIVE A.4. PRESSION DE VAPEUR A.5. TENSION SUPERFICIELLE 
A.6. SOLUBILITÉ DANS L’EAU 
A.8. COEFFICIENT DE PARTAGE A.9. POINT D'ÉCLAIR 
A.10. INFLAMMABILITÉ (SOLIDES) 
A.11. INFLAMMABILITÉ (GAZ) A.12. INFLAMMABILITÉ (AU CONTACT DE L'EAU) 
A.13. PROPRIÉTÉS PYROPHORIQUES DES SOLIDES ET DES 
LIQUIDES 
A.14. DANGER D'EXPLOSION 
A.15. TEMPÉRATURE D'INFLAMMATION SPONTANÉE DES 
LIQUIDES ET DES GAZ 
A.16. TEMPÉRATURE RELATIVE D'INFLAMMATION SPON ­
TANÉE POUR LES SOLIDES 
A.17. PROPRIÉTÉS COMBURANTES (SOLIDES) A.18. DÉTERMINATION DE LA MASSE MOLÉCULAIRE 
MOYENNE EN NOMBRE ET DE LA DISTRIBUTION DES MASSES MOLÉCULAIRES DES POLYMÈRES 
A.19. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN POLYMÈRES DE 
FAIBLE MASSE MOLÉCULAIRE 
A.20. COMPORTEMENT DE DISSOLUTION EXTRACTION DES 
POLYMÈRES DANS L'EAU 
A.21. PROPRIÉTÉS COMBURANTES (LIQUIDES) A.22. DIAMÈTRE MOYEN GÉOMÉTRIQUE PONDÉRÉ PAR LA 
LONGUEUR DES FIBRES
 
▼M4 
A.23. COEFFICIENT DE PARTAGE (1-OCTANOL/EAU): 
MÉTHODE DU BRASSAGE LENT  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 4
 
A.l. TEMPÉRATURE DE FUSION/DE CONGÉLATION  
1. MÉTHODE  
La plupart des méthodes décrites se basent sur les lignes directrices 
de l'OCDE (1). Leurs principes fondamentaux sont décrits dans les 
références (2) et (3).  
1.1. INTRODUCTION  
Les méthodes et les appareils décrits ci-après permettent de déter ­
miner la température de fusion des produits chimiques, quel que soit 
leur degré de pureté.  
La sélection de la méthode dépend de la nature de la substance à 
tester. Par conséquent, le facteur limitant dépend du fait que la subs ­
tance peut être facilement ou difficilement pulvérisable ou peut ne 
pas l'être du tout.  
Pour certaines substances, il est préférable de déterminer la tempé ­
rature de congélation ou de solidification. C'est pourquoi les normes de ces déterminations figurent également dans cette méthode.
 
Lorsqu'il est difficile, du fait de certaines propriétés de la substance, 
de mesurer les paramètres cités ci-dessus, il peut être approprié de rechercher un point d'écoulement.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La température de fusion est définie comme étant la température à 
laquelle se produit la transition de phase de l'état solide à l'état liquide, à la pression atmosphérique. Idéalement, cette température correspond à la température de congélation.
 
Étant donné que la transition de phase de nombreuses substances a 
lieu dans un certain intervalle de température, celle-ci est souvent décrite comme un intervalle de fusion.
 
Conversion des unités (K en  o C) 
t = T – 273,15  
t: température Celsius en degrés Celsius (  o C) 
T: température thermodynamique en Kelvin (K)  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans 
tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient 
servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre les comparaisons avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes.
 
Certaines substances d'étalonnage sont énumérées dans la référence (4).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 5
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La température (intervalle de température) de la phase de transition 
de l'état solide, à l'état liquide, ou de l'état liquide à l'état solide, est déterminée. En pratique, les températures du début et de la fin de la 
fusion/congélation sont déterminées au cours du chauffage/refroidis ­
sement, à pression atmosphérique, de la substance à étudier. Cinq types de méthodes sont décrites; la méthode en tube capillaire, la méthode par bloc chauffant, la mesure de la température de congé ­
lation, les méthodes d'analyse thermique et la détermination du point 
d'écoulement (mise au point pour les huiles de pétroles).
 
Dans certains cas, il peut être commode de mesurer la température 
de congélation au lieu de la température de fusion.  
1.4.1.  Méthode du tube capillaire  
1.4.1.1.  Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain 
liquide  
Une petite quantité de substance finement broyée est placée dans un 
tube capillaire et tassée avec soin. Le tube est chauffé en même temps qu'un thermomètre dans le bain liquide et l'accroissement de température est ajusté à un peu moins d'1 K/mn pendant la fusion 
réelle. Les températures correspondant au début et à la fin de la 
fusion sont relevées.
 
1.4.1.2.  Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc 
métallique  
Le protocole est le même que celui décrit au paragraphe 1.4.1.1, si 
ce n'est que le tube capillaire et le thermomètre sont placés dans un bloc de métal chauffé et observés à travers des ouvertures aménagées 
dans ce dernier.
 
1.4.1.3.  Détection photo-électrique  
L'échantillon contenu dans le tube capillaire est chauffé automatique ­
ment dans un cylindre métallique. Par une ouverture aménagée dans celui-ci, un faisceau de lumière est envoyé à travers la substance à tester vers une cellule photo-électrique soigneusement étalonnée. Au 
moment de la fusion, les propriétés optiques de la plupart des subs ­
tances sont modifiées en ce sens que l'opacité fait place à la trans ­
parence. De ce fait, l'intensité de la lumière qui atteint la cellule photo-électrique augmente et envoie un signal d'arrêt à l'indicateur 
digital qui affiche la température d'un thermomètre à résistance de 
platine placé dans l'enceinte chauffante. Cette méthode n'est pas applicable à certaines substances fortement colorées.
 
1.4.2.  Méthodes avec bloc chauffant  
1.4.2.1.  Méthode au banc chauffant de Kofler  
Le banc chauffant de Kofler est composé de deux pièces de métal de 
conductivité thermique différente, qui sont chauffées électriquement. 
Il est construit de façon à ce que le gradient de température soit  
quasi  linéaire sur toute sa longueur. La température de ce banc 
chauffant peut varier de 283 à 573 K grâce à un dispositif de lecture de la température comprenant un curseur avec un index et 
une réglette graduée, spécialement conçus pour le banc en question. 
Pour déterminer une température de fusion, une fine couche de subs ­
tance est directement déposée sur la surface du banc. En quelques secondes, il se forme une ligne fine de séparation entre 
la phase fluide et la phase solide. La température à la hauteur de 
cette ligne est lue en plaçant l'index face à cette dernière.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 6
 
1.4.2.2.  Microscope à fusion  
Différents microscopes à platine chauffante sont utilisés pour déter ­
miner des températures de fusion avec de très pentes quantités de substance. La température est généralement mesurée à l'aide d'un 
thermocouple sensible, mais parfois aussi à l'aide d'un thermomètre 
à mercure. Le dispositif type de mesure de la température de fusion grâce à un microscope à platine chauffante comporte une enceinte chauffante qui contient une platine métallique sur laquelle est posée 
une lame de verre destinée à recevoir l'échantillon. Le centre de la 
platine métallique est percé d'un trou permettant le passage de la lumière provenant du miroir éclairant le microscope. Lors de l'utili ­
sation, l'enceinte est fermée à l'aide d'une plaque de verre pour 
empêcher la circulation d'air dans la région où se trouve l'échantillon.
 
Le chauffage de l'échantillon  est réglé au moyen d'un rhéostat. Pour 
effectuer des mesures très précises sur des substances optiquement 
anisotropes, il est possible d'utiliser de la lumière polarisée.  
1.4.2.3.  Méthode du ménisque  
Cette méthode s'applique spécialement aux polyamides.  
La température à laquelle se déplace un ménisque d'huile de silicone, 
emprisonné entre une surface chauffée et une lamelle couvre-objet placée au-dessus de l'échantillon de polyamide à étudier, est déter ­
minée visuellement.
 
1.4.3.  Méthode de détermination de la température de congélation  
L'échantillon est introduit dans un tube à essai spécial et placé dans 
un appareil permettant la détermination de la température de congé ­
lation. L'échantillon est agité doucement durant tout le refroidis ­
sement et la température est relevée à intervalles déterminés. Dès 
que quelques relevés indiquent une température constante, cette dernière est considérée comme la température de congélation (après correction de l'erreur relative au thermomètre).
 
Il convient d'éviter un refroidissement trop fort en maintenant un 
équilibre entre la phase liquide et la phase solide.  
1.4.4.  Analyse thermique  
1.4.4.1.  Analyse thermique différentielle (ATD)  
Cette méthode consiste à enregistrer la différence de température 
entre la substance et la substance de référence en fonction de la 
température pendant que la substance et la substance de référence 
sont soumises à un programme contrôlé de variation de température. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, ce changement est indiqué par un mouvement endother ­
mique (fusion) ou exothermique (congélation) sur la ligne de base de 
l'enregistrement de la température.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 7
 
1.4.4.2.  Analyse calorimétrique différentielle (ACD)  
Cette technique consiste à soumettre une substance et un produit de 
référence à un même programme de variation contrôlée de la tempé ­
rature et à enregistrer la différence d'énergie absorbée par la subs ­
tance et par le produit de référence, en fonction de la température. 
Cette énergie correspond à l'énergie nécessaire pour annuler la diffé ­
rence de température entre la substance et le matériel de référence, Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement 
d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique 
(fusion) ou exothermique (congélation) sur la ligne de base de l'en ­
registrement du flux de chaleur.
 
1.4.5.  Point d'écoulement  
Cette méthode, mise au point pour les huiles de pétrole, s'applique 
aux substances huileuses dont la température de fusion est basse.  
Après un chauffage préliminaire, l'échantillon est refroidi à une 
vitesse spécifique et son écoulement est observé à des intervalles 
de 3 K. La température la plus basse à laquelle on observe un 
mouvement de la substance est considérée comme le point d'écoule ­
ment.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
L'applicabilité et la précision des différentes méthodes utilisées pour 
déterminer la température de fusion/intervalle de fusion sont énumé ­
rées dans le tableau suivant.  
TABLEAU: APPLICABILITÉ DES MÉTHODES  
A. Méthodes du tube capillaire  
Méthode de mesure Substances 
pulvérisables Substances diffici ­
lement pulvérisa ­
bles Gamme de tempéra ­
tures Précision 
approximative (  1 ) Norme existante  
Dispositifs de 
mesure de la température de 
fusion comportant 
un bain de liquide oui seulement 
quelques unes de 273 à 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Dispositifs de 
mesure de la 
température de fusion comportant un bloc métallique oui seulement 
quelques unes de 293 à 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Détection photoé ­
lectrique oui plusieurs avec 
des dispositifs 
d'application de 253 à 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Valeur dépendante du type d'instrument et du degré de pureté de la substance.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 8
 
B. Méthodes utilisant une surface chauffée et méthode de mesure de la température de congélation  
Méthode de mesure Substances 
pulvérisables Substances diffici ­
lement pulvérisa ­
bles Gamme de tempéra ­
tures Précision 
approximative (  1 ) Norme existante  
Banc chauffant de 
Kofler oui non de 283 à > 573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
345176 
Microscope a 
fusion oui quelques-unes 
seulement de 273 à > 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Méthode du 
ménisque non spécifique aux 
polyamides de 293 à > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Méthodes de 
mesure de la température de congélation oui oui de 223 à 573 K ± 0,5 K par ex. BS 4695
 
( 1 ) Valeur dépendante du type d'instrument et du degré de pureté de la substance.  
C. Analyses thermiques  
Méthode de mesure Substances 
pulvérisables Substances diffici ­
lement pulvérisa ­
bles Gamme de tempéra ­
tures Précision 
approximative (  1 ) Norme existante  
Analyse thermique 
différentielle oui oui de 173 à 1 273 K jusqu'à 
600K±0,5Kju ­
squ'à 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 
Analyse calorimé ­
trique différen ­
tielle oui oui de 173 à 1 273 K jusqu'à 
600K±0,5Kju ­
squ'à 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Valeur dépendante du type d'instrument et du degré de pureté de la substance.  
D. Point d'écoulement  
Méthode de mesure Substances 
pulvérisables Substances diffici ­
lement pulvérisa ­
bles Gamme de 
températures Précision 
approximative (  1 ) Norme existante  
Point d'écoule ­
ment pour les 
huiles de 
pétrole et les 
substances 
huileuses pour les huiles 
de pétrole etles 
substances 
huileuses De 223 à 323 
K ± 3,0 K ASTM D 9766  
( 1 ) Valeur dépendante du type d'instrument et du degré de pureté de la substance.  
1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES  
Les procédures de presque toutes les méthodes d'essai ont été 
décrites dans des normes internationales et nationales (voir annexe 1).
 
1.6.1.  Méthodes en tube capillaire  
Lorsqu'elles sont soumises à une élévation lente de la température, 
les substances finement pulvérisées montrent habituellement les 
stades de fusion représentés à la figure 1.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 9
 
Figure 1
  
Durant la détermination de la température de fusion, il y a lieu de 
relever la température au début et à la fin de la fusion.  
1.6.1.1.  Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain 
liquide  
La figure 2 décrit un type d'appareil de mesure de la température de 
fusion standardisé (JIS K 0064); l'appareil est en verre et toutes les 
spécifications sont exprimées en millimètres.  
Figure 2
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 10
 
Bain liquide:  
Il convient de choisir un liquide approprié en fonction de la tempé ­
rature de fusion à déterminer; on utilisera, par exemple de la paraf ­
fine liquide pour des températures de fusion ne dépassant pas 473 K et de l'huile de silicone pour les températures de fusion ne dépassant pas 573 K.
 
Pour les températures de fusion dépassant 523 K, un mélange 
composé de trois parties d'acide sulfurique et de deux parties de 
sulfate de potassium (en rapport de masse) peut être utilisé. Il convient de prendre des précautions appropriées pour utiliser un mélange de ce type.
 
Thermomètre:  
Seuls peuvent être utilisés les thermomètres qui répondent aux 
exigences des normes suivantes ou de leurs équivalents:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Procédé:  
La substance sèche est finement broyée dans un mortier et introduite 
dans un tube capillaire scellé à une extrémité, la hauteur du remplis ­
sage étant fixée à environ 3 mm après tassement. Pour obtenir un 
échantillon uniformément tassé, il faut laisser tomber le tube capil ­
laire d'une hauteur d'environ 700 mm à l'intérieur d'un tube de verre posé verticalement sur un verre de montre.
 
Le tube capillaire rempli est placé dans le bain de telle sorte que la 
partie centrale du réservoir à mercure du thermomètre soit en contact 
avec la partie du tube capillaire où se trouve l'échantillon. En géné ­
ral, le tube capillaire est introduit dans l'appareil au moment où le bain est à environ 10 K en dessous de la température de fusion.
 
Le chauffage du bain est réglé pour  que l'accroissement de température 
soit d'environ 3 K par minute. Le liquide doit être agité. À environ 
10 K en dessous de la température de fusion attendue, l'accroissement de température est réglé à un maximum de 1 K par minute.
 
Calcul:  
Le calcul de la température de fusion s'effectue au moyen de la 
formule suivante:  
T = T  D + 0,00016(T  D – T  E )n 
où 
T = température de fusion corrigée, exprimée en K  
T D = température lue sur le thermomètre D, exprimée en K  
T E = température lue sur le thermomètre E, exprimée en K  
n = nombre de graduations de la colonne de mercure sur la tige 
émergente du thermomètre D.  
1.6.1.2.  Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc 
métallique  
Appareil:  
L'appareil comprend:  
— un bloc métallique cylindrique, dont la partie supérieure est 
creuse et forme une enceinte (voir figure 3),  
— un bouchon métallique, percé de deux ou plusieurs trous, permet ­
tant l'introduction des tubes dans le bloc métallique,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 11
 
— un système de chauffage du bloc métallique, qui peut être 
constitué d'une résistance électrique dans le bloc,  
— un rhéostat pour régler la puissance dans le cas d'un chauffage 
électrique,  
— quatre fenêtres en verre résistant à la chaleur, percées dans les 
parois latérales de l'enceinte, en position diamétralement opposée. Un oculaire permettant d'observer le tube capillaire est installé en 
face d'une de ces fenêtres. Les trois autres fenêtres permettent 
d'éclairer l'intérieur de l'enceinte à l'aide de lampes,
 
— un tube capillaire, en verre résistant à la chaleur, scellé à une 
extrémité (voir point 1.6.1.1).  
Thermomètre:  
Voir nonnes mentionnées au point 1.6.1.1. Des instruments de mesure 
thermoélectriques de précision équivalente sont aussi utilisables.  
Figure 3
  
1.6.1.3.  Détection photo-électrique  
Appareil et procédé:  
L'appareil consiste en une enceinte métallique pourvue d'un système 
de chauffage automatisé. Trois tubes capillaires sont remplis comme 
prévu au point 1.6.1.1 et placés dans le four.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 12
 
Plusieurs programmes d'accroissement linéaire de la température 
permettant d'étalonner l'appareil. L'accroissement de température 
approprié est électriquement réglé à un taux constant et linéaire présélectionné. Des enregistreurs indiquent la température réelle du four et la température de la substance dans les tubes capillaires.
 
1.6.2  Méthode de la surface chauffée  
1.6.2.1  Banc chauffant de Kofler  
Voir annexe.  
1.6.2.2  Microscope à fusion  
Voir annexe.  
1.6.2.3  Méthode du ménisque (polyamides)  
Voir annexe.  
Aux alentours de la température de fusion, l'accroissement de la 
température doit être inférieur à 1 K/mn.  
1.6.3.  Méthodes de détermination de la température de congélation.  
Voir annexe.  
1.6.4.  Analyses thermiques  
1.6.4.1.  Analyse thermique différentielle  
Voir annexe  
1.6.4.2.  Analyse calorimétrique différentielle  
Voir annexe.  
1.6.5.  Détermination du point d'écoulement  
Voir annexe.  
2. DONNÉES  
La correction du thermomètre s'impose dans certains cas.  
3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— la méthode utilisée,  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) 
et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire,  
— une estimation de la précision.  
La température de fusion indiquée dans le rapport est donnée par la 
moyenne de deux mesures au moins qui ne dépassent pas les limites 
de la précision estimée (voir tableau).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 13
 
Si la différence de température entre le début et la fin de la fusion se 
trouve dans les limites de précision de la méthode, la température 
relevée au stade final de la fusion est considérée comme la tempé ­
rature de fusion; sinon les deux températures sont indiquées.  
Si la substance se décompose ou se sublime avant que la température 
de fusion soit atteinte, la température à laquelle cela se produit doit 
être mentionnée.  
Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interpréta ­
tion des résultats doivent être mentionnées, en particulier les impu ­
retés et l'état physique de la substance.  
4. RÉFÉRENCES  
1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n  o 102, décision du Conseil 
C(81) 30 final.  
2) UIPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds.  Experimental thermody ­
namics , Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834.  
3) R. Weissberger ed.,  Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry , 3rd ed, Interscience Publ., New 
York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.  
4) UICPA,  Mesures physico-chimiques: Catalogue de substances de 
référence pour les laboratoires nationaux, Chimie pure et appli ­
quée , 1976, vol. 48, 505-515.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 14
 
Annexe  
Pour plus de détails, on peut consulter par exemple les normes suivantes.  
1. Méthodes du tube capillaire  
1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain 
liquide 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and melting 
range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung der Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren. 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products.  
1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc 
métallique 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunsts ­
toffen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of «melting point»  
2. Méthodes du bloc chauffant  
2.1. Banc chauffant de Kofler 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommanded practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Microscope à fusion 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von reilkristallinen Kunsrstof ­
fen. 
2.3. Méthode du ménisque (polyamides) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of «melting point»  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resine 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du «point de fusion». Méthode du 
ménisque.  
3. Méthodes de détermination de la température de congélation  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of Petroleum Wax (cooling 
curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage. 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point.
 
4. Analyse thermique  
4.1. Analyse thermique différentielle 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Analyse calorimétrique différentielle 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Détermination du point d'écoulement  
NBN 52014 Échantillonnage et analyse des 
produits du pétrole: point de trouble 
et point d'écoulement limite — Mons ­
terneming en ontleding van aardolie ­
producten: Troebelingspunt en vloei ­
punt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroieum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 17
 
A.2. TEMPÉRATURE D'ÉBULLITION  
1. MÉTHODES  
La plupart des méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices 
de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont décrits dans les 
références (2) et (3).  
1.1. INTRODUCTION  
Les méthodes et dispositifs décrits ici peuvent être appliqués aux 
substances liquides et à température de fusion faible, à condition qu'elles ne subissent pas de réaction chimique au-dessous de la température d'ébullition (par exemple, auto-oxydation, réarrange ­
ment, dégradation, etc.). Les méthodes s'appliquent aux substances 
liquides pures et impures.
 
L'importance donnée aux méthodes recourant à la détection photoé ­
lectrique et à l'analyse thermique est due au fait que ces méthodes 
permettent de déterminer non seulement la température de fusion, 
mais également la température d'ébullition. De surcroît, les mesures peuvent être effectuées de manière automatique.
 
La «méthode dynamique» a l'avantage de pouvoir être également 
utilisée pour la détermination de la pression de vapeur et il n'est 
pas nécessaire de ramener la température d'ébullition aux conditions normales de pression (101,325 kPa), puisque la pression normale peut être maintenue au cours de la mesure à l'aide d'un manostat.
 
Observations:  
L'influence des impuretés sur la détermination de la température 
d'ébullition dépend beaucoup de la nature de l'impureté. Si l'échan ­
tillon contient des impuretés volatiles, susceptibles d'avoir une inci ­
dence sur les résultats, il convient de purifier la substance.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La température d'ébullition normale est définie comme la tempéra ­
ture à laquelle la pression de vapeur d'un liquide s'élève à 101,325 
kPa. 
Si la température d'ébullition n'est pas mesurée à la pression atmo ­
sphérique normale, la dépendance de la pression de vapeur vis-à-vis 
de la température peut être décrite à l'aide de l'équation de Clausius- 
Clapeyron:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3RT þ constante  
où: 
p = pression de vapeur de la substance exprimée en pascal  
Δ H v = chaleur de vaporisation en J mol  – 1 
R = constante molaire des gaz parfaits = 8,314 J mol  – 1 K – 1 
T = température thermodynamique exprimée en K  
La température d'ébullition est établie en tenant compte de la pres ­
sion ambiante au moment de la mesure.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 18
 
Conversions  
Pression (unité: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(l'utilisation du «bar» est toujours permise mais non 
recommandée);  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(l'utilisation des unités «mm Hg» et «Torr» n'est pas 
permise);  
1 atm = atmosphère standard = 101,325 Pa 
(l'utilisation de l'unité «atm» n'est pas permise).  
Température (unité: K)  
t = T - 273,15  
t: température Celsius, exprimée en degré Celsius (  o C) 
T: température thermodynamique, exprimée en kelvin (K)  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
II n'est pas nécessaire d'utiliser des substances de référence dans tous 
les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Ces substances de 
référence doivent servir en premier lieu à vérifier la fiabilité de la 
méthode de temps à autre et à permettre la comparaison avec les résultats obtenus à l'aide d'autres méthodes.
 
Certaines substances d'étalonnage figurent dans les méthodes énumé ­
rées dans l'annexe.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Cinq méthodes de détermination de la température d'ébullition (inter ­
valle d'ébullition) sont fondées sur la mesure de la température 
d'ébullition, deux autres sont fondées sur une analyse thermique.  
1.4.1.  Méthode de l'ébulliomètre  
Bien que les ébulliomètres aient été à l'origine mis au point pour la 
détermination du poids moléculaire par élévation de la température 
d'ébullition, ils se prêtent également aux mesures exactes de la 
température d'ébullition. Un appareil très simple est décrit dans la norme ASTM D 1120-72 (voir annexe). Dans cet appareil, le liquide est chauffé jusqu'à ébullition à la pression atmosphérique (conditions 
d'équilibre).
 
1.4.2.  Méthode dynamique  
Cette méthode comporte la mesure de la température de reconden ­
sation de la vapeur à l'aide d'un thermomètre approprié placé dans le reflux pendant l'ébullition. La pression peut être modifiée dans cette méthode.
 
1.4.3.  Méthode par distillation à la température d'ébullition  
Cette méthode comporte la distillation du liquide, la mesure de la 
température de recondensation de la vapeur et la détermination de la 
quantité de distillat.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 19
 
1.4.4.  Méthode selon Siwoloboff  
Un échantillon est chauffé dans un tube à essai, qui est immergé 
dans le liquide contenu dans un bain chauffant. Un capillaire scellé, contenant une bulle d'air dans sa partie inférieure, est plongé dans le 
tube à essai.
 
1.4.5.  Détection photoélectrique  
Suivant le principe de Siwoloboff, l'ascension des bulles permet une 
mesure photoélectrique automatique.  
1.4.6.  Analyse thermique différentielle  
Cette technique permet d'enregistrer la différence de température 
entre la substance et une substance de référence, en fonction de la 
température, pendant que la substance et la substance de référence sont soumises au même programme de variation contrôlée de la température. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant 
un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement 
endothermique (ébullition) sur la ligne de base de l'enregistrement de la température.
 
1.4.7.  Analyse calorimétrique différentielle  
Cette technique permet d'enregistrer la différence entre l'énergie 
absorbée par une substance et par un produit de référence, en fonc ­
tion de la température, alors qu'ils sont soumis au même programme 
de variation contrôlée de la température. Cette énergie correspond à 
l'énergie nécessaire pour annuler la différence de température entre la substance et le matériel de référence. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué 
par un mouvement endothermique (ébullition) sur la ligne de base de 
l'enregistrement du flux de chaleur.
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
L'applicabilité et la précision des différentes méthodes utilisées pour 
déterminer la température d'ébullition/intervalle d'ébullition sont indi ­
quées dans le tableau 1.  
Tableau 1  
Comparaison des méthodes  
Méthode de mesure Précision estimée Norme existante  
Ébulliomètre ± 1,4 K (jusqu'à 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (jusqu'à 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Méthode dynamique ± 0,5 K (jusqu'à 600 K) (  2 ) 
Méthode de distillation (intervalle 
d'ébullition) ± 0,5 K (jusqu'à 600 K) ISO/R918, DIN 53171, 
BS 4591/71 
Méthode selon Siwoloboff ± 2 K (jusqu'à 600 K) (  2 ) 
Détection photoélectrique ± 0,3 K (à 373 K) (  2 ) 
Calorimétrie ± 0,5 K (jusqu'à 600 K) 
± 2,0 K (jusqu'à 1 273 K) ASTM E 537-76 
Analyse calorimétrique différen ­
tielle ± 0,5 K (jusqu'à 600 K) 
± 2,0 K (jusqu'à 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Cette précision n'est valable que pour les appareils simples comme celui décrit dans la norme ASTM D 1120-72; il 
est possible de l'améliorer en utilisant des ébulliomètres plus perfectionnés. 
( 2 ) Valable seulement pour les substances pures. Dans le cas contraire, son utilisation doit être justifiée.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 20
 
1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES  
Les procédures de certaines méthodes d'essai ont été décrites dans 
des normes internationales et nationales (voir annexe).  
1.6.1.  Ébulliomètre  
Voir annexe.  
1.6.2.  Méthode dynamique  
Voir méthode d'essai A.4 pour la détermination de la pression de 
vapeur.  
La température d'ébullition est enregistrée à une pression de 
101,325 kPa.  
1.6.3.  Méthode de distillation (intervalle d'ébullition)  
Voir annexe.  
1.6.4.  Méthode selon Siwoloboff  
L'échantillon est introduit dans un tube à essai ayant environ 5 mm 
de diamètre et chauffé dans un appareil servant à la détermination de la température de fusion (figure 1).
 
La figure 1 donne un exemple d'appareil normalisé servant à déter ­
miner la température de fusion et la température d'ébullition (JIS K 0064) (l'appareil est en verre et toutes les spécifications sont données en millimètres).
 
Figure 1
  
Un tube capillaire (capillaire d'ébullition) scellé à environ 1 cm au- 
dessus de son extrémité inférieure est plongé dans le tube à essai contenant la substance à étudier. La partie scellée du capillaire doit se trouver au-dessous de la surface du liquide. Le tube à essai 
contenant le capillaire doit être attaché au thermomètre avec un élas ­
tique ou fixé au moyen d'un support latéral (voir figure 2).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 21
 
Figure 2  
Méthode selon Siwoloboff  Figure 3  
Méthode modifiée
  
Le liquide du bain est choisi en fonction de la température d'ébulli ­
tion. Pour des températures allant jusqu'à 573 K, on peut utiliser de l'huile de silicone. La paraffine liquide ne convient que pour des températures inférieures à 473 K. Au départ, le chauffage du bain 
doit être réglé de façon à obtenir un accroissement de température de 
3 K/min. Le liquide du bain doit être agité. À environ 10 K au- dessous de la température d'ébullition présumée, le chauffage est réduit de telle sorte que l'accroissement de température ne dépasse 
pas 1 K par minute. À l'approche de la température d'ébullition, des 
bulles commencent à s'échapper rapidement du capillaire à l'ébullition.
 
La température d'ébullition est déterminée par la température à 
laquelle, lors d'un refroidissement momentané, le chapelet de bulles s'interrompt et le liquide s'élève soudain dans le capillaire. La température relevée à ce moment précis correspond à la tempé ­
rature d'ébullition de la substance.
 
Dans la méthode modifiée (figure 3), la température d'ébullition est 
déterminée dans un capillaire à température de fusion. L'extrémité de ce dernier est étirée en une fine pointe d'environ 2 centimètres de 
longueur (a) et une petite quantité de la substance à tester est aspirée 
à l'intérieur. La pointe est alors scellée en emprisonnant une petite bulle d'air. Lors du chauffage dans l'appareil servant à déterminer la température de fusion (b), la bulle d'air se dilate. La température 
d'ébullition correspond à la température à laquelle l'échantillon de 
la substance atteint le niveau de la surface du bain de liquide (c).
 
1.6.5.  Détection photoélectrique  
Un échantillon de la substance à tester est chauffé dans un tube 
capillaire placé à l'intérieur d'un bloc métallique chauffant.  
Un faisceau de lumière est envoyé, par les ouvertures aménagées 
dans le bloc, à travers la substance vers une cellule photoélectrique étalonnée de façon précise.
 
Durant l'élévation de la température de l'échantillon, quelques bulles 
d'air s'échappent du capillaire d'ébullition. Lorsque la température d'ébullition est atteinte, le nombre de bulles augmente très fortement. La modification de l'intensité lumineuse qui s'ensuit est enregistrée 
par la cellule, qui envoie un signal d'arrêt à l'indicateur de tempéra ­
ture (thermomètre à résistance de platine placé dans le bloc).
 
Cette méthode est particulièrement utile parce qu'elle permet d'effec ­
tuer des déterminations au-dessous de la température ambiante 
jusqu'à 253,15 K (– 20  o C) sans aucune modification de l'appareil. 
L'instrument doit simplement être placé dans un bain réfrigérant.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 22
 
1.6.6.  Analyse thermique  
1.6.6.1.  Analyse thermique différentielle  
Voir annexe.  
1.6.6.2.  Analyse calorimétrique différentielle  
Voir annexe.  
2. DONNÉES  
Pour de faibles écarts par rapport à la pression normale (maximum 
±5 kPa), les températures d'ébullition peuvent être ramenées à T  n par 
l'équation de Sidney Young:  
T n = T + (f  T × Δ p) 
où: 
Δ p = (101,325 - p) [attention au signe]  
p = pression barométrique en kPa  
f T = vitesse de variation de la température d'ébullition avec la 
pression, en K/kPa  
T = valeur mesurée de la température d'ébullition, en K  
T n = valeur corrigée de la température d'ébullition, en K, à la 
pression normale.  
Les facteurs de correction de la température (f  T ) et les équations de 
calcul des approximations figurent dans les normes internationales et 
nationales citées dans le texte (valable pour de nombreuses subs ­
tances).  
Par exemple, la méthode DIN 53171 donne les corrections pour les 
solvants contenus dans les peintures:  
Tableau 2  
Facteurs de correction de la température (f  T ) 
Température T (K) Facteur de correction f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
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3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essais contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— la méthode utilisée,  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) 
et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire,  
— une estimation de la précision.  
La température d'ébullition indiquée dans le procès-verbal est la 
moyenne d'au moins deux mesures qui se situent à l'intérieur des limites de précision estimées (tableau 1).
 
Les valeurs mesurées des températures d'ébullition ainsi que leurs 
moyennes doivent être indiquées et la (les) pression(s) à laquelle 
(auxquelles) ont été effectuées les mesures doit (doivent) être notée(s) en kPa. La pression doit de préférence être proche de la pression atmosphérique normale.
 
Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interpréta ­
tion des résultats doivent être fournies, notamment en ce qui concerne les impuretés et l'état physique de la substance.
 
4. RÉFÉRENCES  
(1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n  o 103, décision du Conseil 
C(81) 30 final.  
(2) UICPA, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Expérimenta! thermody ­
namics, Buttenworths, London, 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger éd.: Technique of organic chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. 1, Part I, Chapter VIII.
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Annexe  
Pour plus de détails techniques, on peut, par exemple, consulter les normes 
suivantes:  
1. Ébulliomètre  
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Méthode de distillation (intervalle d'ébullition)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distillation 
characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et 
de l'intervalle de distillation  
3. Analyse thermique différentielle et analyse calorimétrique différen ­
tielle  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of differen ­
tial thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanaly ­
tical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 25
 
A.3. DENSITÉ RELATIVE  
1. MÉTHODE  
Les méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices de 
l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont décrits dans la réfé ­
rence (2).  
1.1. INTRODUCTION  
Les méthodes de détermination de la densité relative décrites s'ap ­
pliquent aux substances solides et liquides, quel que soit leur degré de pureté. Les diverses méthodes à appliquer sont énumérées dans le 
tableau 1.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La densité relative D  20 4 des solides ou des liquides est le rapport 
entre la masse d'un volume de substance à tester, déterminée à 20
 o C, et la masse du même volume d'eau, déterminée à 4  o C. La 
densité relative est un nombre sans dimension.  
La masse volumique, P, d'une substance est le quotient de la masse, 
m, par son volume, v.  
En unités SI, la masse volumique, P, est exprimée en kg/m  3 . 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE (1) (3)  
Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans 
tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la 
méthode et à permettre les comparaisons avec les résultats obtenus 
avec d'autres méthodes.
 
1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES  
Quatre types de méthodes sont utilisés.  
1.4.1.  Méthodes de flottabilité  
1.4.1.1  Aréomètre  (pour les liquides)  
On peut obtenir des mesures de densité suffisamment précises et 
rapides à l'aide d'aréomètres flottants qui permettent de déduire la 
densité d'un liquide à partir de la profondeur d'immersion repérée sur 
une échelle graduée.  
1.4.1.2  Balance hydrostatique  (pour les liquides et les solides)  
La différence entre le poids d'un échantillon mesuré dans l'air et dans 
un liquide approprié (par exemple l'eau) peut servir à déterminer sa 
densité.  
Dans le cas des solides, la densité mesurée n'est représentative que 
de l'échantillon utilisé. Pour déterminer la densité d'un liquide, on pèse un corps d'un volume v tout d'abord dans l'air, puis dans le liquide.
 
1.4.1.3  Méthode du corps immergé  (pour les liquides) (4)  
Dans cette méthode, la densité d'un liquide est déterminée à partir de 
la différence entre les résultats de la pesée du liquide avant et après 
immersion d'un corps de volume connu dans le liquide à étudier.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 26
 
1.4.2.  Méthodes pycnométriques  
Pour les solides ou les liquides, on peut utiliser des pycnomètres de 
forme variée dont les volumes sont connus. La densité est calculée à partir de la différence de poids entre le pycnomètre plein et le 
pycnomètre vide, d'une part, et de son volume connu, d'autre part.
 
1.4.3.  Pycnomètre de comparaison à air  (pour les solides)  
La densité d'un solide de forme quelconque peut être mesurée, à la 
température ambiante, à l'aide d'un pycnomètre de comparaison à gaz. Le volume d'une substance dans l'air ou dans un gaz inerte 
est mesuré dans une éprouvette graduée de volume variable. Pour 
le calcul de la densité, une mesure de masse est effectuée après la mesure du volume.
 
1.4.4.  Densimètre oscillant  (5) (6) (7)  
La densité d'un liquide peut être mesurée à l'aide d'un densimètre 
oscillant. Un oscillateur mécanique, ayant la forme d'un U, vibre à 
une fréquence de résonance spécifique qui dépend de sa masse. 
L'introduction d'un échantillon modifie la fréquence de résonance de l'oscillateur. L'appareil doit être étalonné à l'aide de deux subs ­
tances liquides de densités connues, choisies de préférence de façon 
à ce que leurs densités couvrent l'intervalle de mesure.
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
L'applicabilité des différentes méthodes utilisées pour la détermina ­
tion de la densité relative est représentée au tableau.  
1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES  
Les références des normes citées en exemple, qui peuvent être 
consultées pour obtenir des détails techniques supplémentaires, sont 
jointes à l'annexe.  
Les mesures doivent être réalisées à 20  o C, et au moins en double.  
2. DONNÉES  
Voir normes.  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal contiendra, si possible, les renseignements suivants:  
— la méthode utilisée,  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) 
et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire.  
La densité relative  D 4 20 doit être indiquée selon la définition figurant 
au point 1.2 en même temps que l'état physique de la substance examinée.
 
Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interpréta ­
tion des résultats doivent être mentionnées, en particulier en ce qui 
concerne les impuretés et l'état physique de la substance.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 27
 
Tableau  
Applicabilité des méthodes  
Méthode de mesure Densité Viscosité dyna ­
mique maximale 
possible Normes existantes 
solide liquide  
1.4.1.1. Aréomètre oui 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Balance hydrostatique a) solides oui ISO 1183 (A) b) liquides oui 5 Pa s ISO 901 et 758 
1.4.1.3. Méthode du corps 
immergé oui 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Pycnomètre ISO 3507 
a) solides oui ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
b) liquides oui 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Pycnomètre de compa ­
raison à air oui DIN 55990 partie 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Densimètre oscillant oui 5 Pa s
 
4. RÉFÉRENCES  
(1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n  o 109, décision du 
Conseil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger éd., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.
 
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realisation of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 508.  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von 
Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427-430.  
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeu ­
gnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung — Die Pharmazeu ­
tische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.
 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im 
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 28
 
Annexe  
Pour plus de détails techniques, on peut consulter, par exemple, les normes 
suivantes.  
1. Méthodes de flottabilité  
1.1. Aréomètre 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Produits chimiques à usage industriel — 
détermination de la densité des liquides 
— méthode aréométrique 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Balance hydrostatique  
Pour les substances solides  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Produits chimiques à usage industriel — 
détermination de la densité des solides 
autres que les poudres et les produits 
alvéolaires — méthode de la balance hydrostatique 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Pour les substances liquides  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oil and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 et ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method  
1.3. Méthode du corps immergé 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of density; immersed body method
 
2. Méthodes pycnométriques  
2.1. Pour les substances liquides 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than l00,10
 – 6 m 2 s – 1 at 15 °C 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 
100,10  – 6 m 2 s – 1 at 20 °C, applicable 
in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids 
with higher vapour pressure, approxi- 
mately 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnoter (for viscous liquids of 
all types which do not have a too high 
vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol-water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; détermination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 7: testing of mineral oils and related 
materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products -chemical 
analysis 
ASTM D 2111 (Method C: Halogenated organic 
compounds) 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer 
method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products 
by the capillary-stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Produits chimiques à usage industriel — 
détermination de la densité des solides en poudre et des liquides — méthode pycno ­
métrique
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 31
 
2.2. Pour les substances solides 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Produits chimiques à usage industriel — 
détermination de la densité des solides en 
poudre et des liquides — méthode pycno ­
métrique 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Pycnomètre de comparaison à air  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 32
 
A.4. PRESSION DE VAPEUR  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 104 (2004) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Cette version révisée de la méthode A.4(1) comprend une technique 
supplémentaire d’effusion par thermogravimétrie isotherme, conçue 
pour les substances à très faible pression de vapeur (jusqu’à 10  –10 
Pa). Compte tenu des besoins en méthodes, en particulier pour les 
substances à faible pression de vapeur, les autres protocoles de cette version sont réévalués en ce qui concerne les autres domaines d’ap ­
plication.
 
À l'équilibre thermodynamique, la pression de vapeur d'une subs ­
tance pure ne dépend que de la température. Les principes fonda ­
mentaux sont énoncés dans les références (2) et (3).  
Aucune méthode de mesure n'est applicable à toute la gamme de 
pressions de vapeur comprises entre moins de 10  –10 Pa et 10  5 Pa. Le 
présent document présente huit méthodes applicables dans différentes gammes de pression de vapeur. Le tableau 1 compare ces différentes méthodes quant à leur application et à la gamme de mesure. Ces 
méthodes ne conviennent qu'aux substances qui ne se décomposent 
pas dans les conditions de l'essai. Il est également possible d'estimer la pression de vapeur lorsque les méthodes expérimentales ne peuvent être employées pour des raisons techniques; une méthode 
d'estimation est recommandée dans l’appendice.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La pression de vapeur d'une substance est définie comme la pression 
de saturation régnant au-dessus d'une substance solide ou liquide.  
L'unité SI de pression à utiliser est le pascal (Pa). Les anciennes 
unités de pression se convertissent comme suit: 
1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosphère = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
L'unité SI de température est le kelvin (K). La conversion des degrés 
Celsius en kelvins obéit à la formule suivante:  
T = t + 273,15  
où T est la température thermodynamique exprimée en kelvins et t 
représente la température en degrés Celsius.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 33
 
Tableau 1  
Méthode de mesure Substances Répétabilité 
estimée Reproductibilité 
estimée Gamme recom ­
mandée Solide Liquide  
Méthode dyna ­
mique à bas point 
de fusion oui jusqu'à 25 % 
1 à 5 % jusqu'à 25 % 
1 à 5 % 10 3 Pa à 2. 10  3 Pa 
2.10  3 Pa à 10  5 Pa 
Méthode statique oui oui 5 à 10 % 5 à 10 % 10 Pa à 10  5 Pa 
10 –2 Pa à 10  5 Pa (  1 ) 
Méthode de l’iso ­
téniscope oui oui 5 à 10 % 5 à 10 % 10  2 Pa à 10  5 Pa 
Méthode d'effu ­
sion: balance de 
pression de vapeur oui oui 5 à 20 % jusqu'à 50 % 10  –3 à 1 Pa 
Méthode d'effu ­
sion: cellule de 
Knudsen oui oui 10 à 30 % — 10  –10 à 1 P 
Méthode d'effu ­
sion: thermogravi ­
métrie isotherme oui oui 5 à 30 % jusqu'à 50 % 10  –10 à 1 Pa 
Méthode par satu ­
ration des gaz oui oui 10 à 30 % jusqu'à 50 % 10  –10 à 10  3 Pa 
Méthode de la 
jauge à rotor oui oui 10 à 20 % — 10  –4 à 0,5 Pa  
( 1 ) Lorsqu'on utilise un manomètre à capacitance.  
1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI  
En général, la pression de vapeur est déterminée à différentes tempé ­
ratures. À l'intérieur d'un intervalle de température limité, le loga ­
rithme de la pression de vapeur d'une substance pure est une fonction 
linéaire de l'inverse de la température thermodynamique, suivant la 
forme simplifiée de l'équation de Clapeyron-Clausius:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constante  
où: 
p = pression de vapeur de la substance en pascals  
ΔHv = chaleur de vaporisation en J mol  –1 
R = constante molaire des gaz parfaits 8,314 J mol  –1 K –1 
T = température exprimée en kelvins (K)  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 34
 
1.4. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Il n'est pas nécessaire de recourir à des substances de référence. Elles 
servent surtout à vérifier la fiabilité d'une méthode de temps à autre et à comparer les résultats obtenus par différentes méthodes.
 
1.5. DESCRIPTION DES MÉTHODES  
1.5.1.  Méthode dynamique (méthode de Cottrell)  
1.5.1.1.  Principe  
La pression de vapeur est déterminée par la mesure de la température 
d'ébullition de la substance à différentes pressions prédéfinies, 
comprises approximativement entre 10  3 et 10  5 Pa. Cette méthode 
est aussi recommandée pour la détermination du point d'ébullition et peut être utilisée à cette fin jusqu'à 600 K. En raison de la pression 
hydrostatique de la colonne de liquide, les températures d'ébullition 
des liquides sont environ 0,1 °C plus élevées à une profondeur de 3 à 4 cm qu'à la surface. Dans la méthode de Cottrell (4), le thermo ­
mètre est placé dans la vapeur située au-dessus de la surface du 
liquide et le dispositif de pompage est conçu pour que le liquide en ébullition mouille constamment le réservoir du thermomètre. Une fine couche de liquide en équilibre avec la vapeur à la pression 
atmosphérique recouvre le réservoir. Le thermomètre affiche donc 
le point d'ébullition réel, sans être affecté par la surchauffe ou la pression hydrostatique. La pompe employée à l'origine par Cottrell est représentée à la figure 1. Le tube A contient le liquide en ébul ­
lition. Un fil de platine B scellé au fond favorise l'uniformité de 
l'ébullition. Le tube latéral C est relié à un condenseur, et l'enveloppe D empêche le condensat froid d'atteindre le thermomètre E. Lorsque le liquide présent dans le tube A bout, des bulles et du liquide captés 
par l'entonnoir sont envoyés sur le réservoir du thermomètre par les 
deux branches de la pompe F.  
Figure 1
 Figure 2
  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 35
 
Pompe de Cottrell (4)  
A: thermocouple  
B: volume vide tampon  
C: jauge de pression  
D: vide  
E: point de mesure  
F: élément chauffant (puissance environ 150 W)  
1.5.1.2.  Appareillage  
Un appareil de grande précision, faisant appel au principe de 
Cottrell, est schématisé à la figure 2. Il se compose d'un tube dont 
la partie inférieure est dévolue à l'ébullition, équipé d'un réfrigérant dans sa partie médiane, ainsi que d'un orifice d'évacuation et d'un joint plat rodé dans sa partie supérieure. La pompe de Cottrell est 
montée dans la partie où siège l'ébullition, partie chauffée par une 
cartouche électrique. La température est mesurée au moyen d'un thermocouple à enveloppe ou d'un thermomètre à résistance, intro ­
duits dans le joint plat situé dans la partie supérieure. L'orifice 
d'évacuation est relié au système de régulation de la pression. Ce 
dernier se compose d'une pompe à vide, d'un volume tampon, d'un manostat qui régule la pression en modulant l'arrivée d'azote et d'un manomètre.
 
1.5.1.3.  Mode opératoire  
La substance est introduite dans la partie où a lieu l'ébullition. Les 
solides non pulvérulents peuvent poser des problèmes qui sont 
parfois résolus en chauffant la gaine de refroidissement. L'appareil est fermé avec le joint plat et la substance est dégazée. Cette méthode ne convient pas aux substances moussantes.
 
La plus basse des pressions souhaitées est alors établie et le chauf ­
fage est mis en marche; au même moment, le capteur de température est connecté à un enregistreur.
 
L'équilibre est atteint lorsque la température d'ébullition enregistrée 
demeure constante à pression constante. Il faut prendre particulière ­
ment soin d'éviter les soubresauts pendant l'ébullition. En outre, la 
condensation sur le réfrigérant doit être complète. Lorsqu'on déter ­
mine la pression de vapeur de solides à bas point de fusion, il faut veiller à ce que le condenseur ne s'obstrue pas.
 
Ce point d'équilibre étant enregistré, on règle la pression sur une 
valeur plus élevée. Le processus se poursuit de la même manière jusqu'à ce qu'une pression de 10
 5 Pa soit atteinte (environ 5 à 10 
points de mesure au total). Les mesures seront répétées, à titre de 
vérification, avec des pressions décroissantes.  
1.5.2.  Méthode statique  
1.5.2.1.  Principe  
Dans la méthode statique (5), la pression de vapeur à l'équilibre 
thermodynamique est déterminée à une température spécifiée. Cette méthode convient pour des substances et des mélanges liquides ou 
solides, dans la gamme comprise entre 10
 –1 et 10  5 Pa et, avec 
certaines précautions, dans la gamme de 1 à 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 36
 
1.5.2.2.  Appareillage  
Le dispositif comporte un bain à température constante (précision de 
± 0,2 K), un récipient pour l'échantillon relié à une ligne de vide, un manomètre et un système de régulation de la pression. Le récipient 
contenant l'échantillon (figure 3a) est connecté à la ligne de vide par 
l'intermédiaire d'un robinet et d'un manomètre différentiel (tube en U rempli d'un liquide manométrique approprié) qui sert à indiquer le zéro. Comme liquide manométrique, on utilise du mercure, des sili ­
cones et des phtalates, suivant la gamme de pression et le compor ­
tement chimique de la substance d’essai. Toutefois, l'utilisation du mercure est à éviter autant que possible pour ne pas nuire à l'envi ­
ronnement. La substance d’essai ne doit pas réagir avec le fluide du 
tube en U ni s'y dissoudre notablement. Le tube en U peut être remplacé par une jauge de pression (figure 3b). Pour le manomètre, le mercure peut être utilisé dans la gamme comprise entre la pression 
normale et 10
 2 Pa, tandis que les huiles de silicone et les phtalates 
conviennent aux pressions inférieures à 10  2 Pa et jusqu'à 10 Pa. 
D'autres jauges de pression sont utilisables en dessous de 10  2 Pa, 
et les manomètres à membrane chauffable peuvent même être 
employés en dessous de 10  –1 Pa. La température est mesurée sur 
la paroi extérieure du récipient contenant l'échantillon ou dans le récipient lui-même.
 
1.5.2.3.  Mode opératoire  
Le tube en U de l'appareil décrit à la figure 3a est rempli avec le 
liquide choisi, qui doit être dégazé à haute température avant que les mesures soient commencées. La substance d’essai est introduite dans l'appareil et dégazée à température réduite. Dans le cas d'un échan ­
tillon à plusieurs composants, la température doit être suffisamment 
basse pour ne pas altérer la composition du mélange. Une agitation permettra d'atteindre l'équilibre plus rapidement. L'échantillon peut 
être refroidi avec de l'azote liquide ou de la neige carbonique, mais il 
convient d'éviter soigneusement la condensation de l'air ou du fluide de la pompe. On ouvre le robinet à vide au-dessus du récipient contenant l'échantillon afin de pratiquer une aspiration pendant 
plusieurs minutes pour éliminer l'air. Si nécessaire, le dégazage est 
répété plusieurs fois.  
Figure 3a
 Figure 3b
  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 37
 
Lorsque l'échantillon est chauffé avec le robinet à vide fermé, la 
pression de vapeur augmente, ce qui modifie l'équilibre du fluide 
dans le tube en U. On compense ce changement en injectant de l'azote ou de l'air dans l'appareil jusqu'à ce que le manomètre diffé ­
rentiel indique à nouveau zéro. La pression requise à cet effet peut 
être lue sur le manomètre ou déterminée à l'aide d'un instrument plus 
précis. Cette pression correspond à la pression de vapeur de la subs ­
tance à la température de la mesure. L'appareil représenté sur la figure 3b permet une lecture directe de la pression de vapeur.
 
La pression de vapeur est déterminée à des intervalles de température 
rapprochés et judicieusement choisis (environ 5 à 10 points de 
mesure au total), jusqu'à la température maximale désirée.  
Les mesures effectuées aux basses températures doivent être répétées 
à titre de vérification. Si les valeurs des mesures répétées ne coïn ­
cident pas avec la courbe obtenue en augmentant la température, cela 
peut traduire l'un des cas de figure suivants:  
i) l'échantillon renferme encore de l'air (dans le cas de substances 
très visqueuses, par exemple) ou des substances à bas point d'ébullition qui sont libérées durant le chauffage;
 
ii) la substance subit une réaction chimique dans l'intervalle de 
température étudié (décomposition, polymérisation, par exemple).  
1.5.3.  Méthode de l’isoténiscope  
1.5.3.1.  Principe  
L'isoténiscope (6) est fondé sur le principe de la méthode statique. 
Un échantillon est introduit dans une ampoule maintenue à tempé ­
rature constante et reliée à un manomètre et à une pompe à vide. Les 
impuretés plus volatiles que la substance sont éliminées par dégazage 
à pression réduite. À des températures sélectionnées, la pression de vapeur de l'échantillon est équilibrée par la pression connue d'un gaz inerte. L'isoténiscope a été conçu pour mesurer la pression de vapeur 
de certains hydrocarbures liquides, mais il se prête aussi à l'étude des 
solides. En général, cette méthode ne convient pas pour des systèmes à plusieurs composants. Les résultats ne sont affectés que par de 
légères erreurs lorsque l'échantillon renferme des impuretés non vola ­
tiles. La gamme recommandée s'étend de 10
 2 à 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Appareillage  
Un exemple de dispositif de mesure est donné à la figure 4. Pour la 
description complète, voir la norme ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 38
 
1.5.3.3.  Mode opératoire  
Dans le cas des liquides, la substance elle-même sert de fluide de 
remplissage dans le manomètre différentiel. Une quantité de liquide, suffisante pour remplir l'ampoule et la branche courte du manomètre, 
est introduite dans l'isoténiscope. Ce dernier est relié au système de 
vide, mis sous vide puis rempli d'azote. L'évacuation et la purge du système sont répétées deux fois pour chasser l'oxygène résiduel. L'isoténiscope rempli est placé en position horizontale pour permettre 
à l'échantillon de s'étendre en fine couche dans l'ampoule destinée à 
le contenir et dans le manomètre. La pression du système est réduite à 133 Pa et l'échantillon est chauffé doucement jusqu'à ce qu'il entre 
en ébullition (élimination des gaz dissous). La position de l'isoténi ­
scope est ensuite modifiée de façon que l'échantillon retourne dans l'ampoule et remplisse la branche courte du manomètre. La pression est maintenue à 133 Pa. La pointe de l'ampoule à échantillon est 
chauffée par une petite flamme jusqu'à ce que la vapeur dégagée par 
l'échantillon prenne une extension suffisante pour déplacer une partie de l'échantillon de la partie supérieure de l'ampoule et de la branche courte du manomètre vers le manomètre, créant ainsi un espace 
dépourvu d'azote et rempli de vapeur. L'isoténiscope est ensuite 
placé dans un bain thermostaté, et la pression de l'azote est ajustée de manière à égaler celle de l'échantillon. À l'équilibre, la pression de l'azote et la pression de vapeur de la substance ont la même valeur.
 
Figure 4
  
Dans le cas des solides, et suivant la gamme de pression et de 
température, des liquides manométriques tels que des huiles de sili ­
cone ou des phtalates sont utilisés. Le liquide manométrique dégazé 
est introduit dans un renflement situé sur la branche longue de l'isoténiscope. Un échantillon du solide est alors déposé dans l'am ­
poule et subit un dégazage à température élevée. Après cela, l'isoté ­
niscope est incliné, afin que le liquide manométrique puisse couler 
dans le tube en U.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 39
 
1.5.4.  Méthode d'effusion: balance de pression de vapeur  (7) 
1.5.4.1.  Principe  
Un échantillon de la substance d’essai est chauffé dans un petit 
fourneau, placé sous une cloche sous vide. Le fourneau est doté 
d'un couvercle percé de petits trous de diamètre connu. La vapeur 
de la substance, qui s'échappe par l'un des trous, est dirigée vers le plateau d'une balance très sensible qui se trouve également dans la cloche sous vide. Sur certains modèles d'appareil, le plateau de la 
balance est entouré par une enceinte de réfrigération, qui dissipe la 
chaleur vers l'extérieur par conduction thermique; la vapeur sortante se condense sur le plateau ainsi refroidi par radiation. L'impulsion du 
jet de vapeur exerce une force sur la balance. Il est possible de 
déterminer la pression de vapeur de deux manières: directement à partir de la force exercée sur le plateau de la balance ou à partir de la vitesse d'évaporation en utilisant l'équation de Herz-Knudsen (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
où: 
G = vitesse d'évaporation (kg s  –1 m –2 ) 
M = masse molaire (g mol  –1 ) 
T = température (K)  
R = constante molaire des gaz parfaits (J mol  –1 K –1 ) 
p = pression de vapeur (Pa)  
La gamme de mesure recommandée est comprise entre 10  –3 et 1 Pa.  
1.5.4.2.  Appareillage  
Le principe général de l'appareil est illustré à la figure 5.  
Figure 5
  
A. Socle F. Enceinte de réfrigération et barre de 
refroidissement 
B. Instrument à bobine mobile G. Fourneau d'évaporation C. Cloche à vide H. Vase de Dewar contenant de l'azote 
liquide 
D. Balance avec plateau I. Mesure de la température de l'échantillon E. Instrument de mesure du vide J. Substance d'essai
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 40
 
1.5.5.  Méthode d'effusion: cellule de Knudsen  
1.5.5.1.  Principe  
La méthode repose sur l'estimation de la masse de substance d’essai 
qui jaillit sous forme de vapeur par un micro-orifice d'une cellule de 
Knudsen (8) sous un vide très poussé, par unité de temps. La masse 
de vapeur dégagée par effusion s'obtient soit en déterminant la perte de masse de la cellule, soit en condensant la vapeur à basse tempé ­
rature et en mesurant la quantité de substance volatilisée par chro ­
matographie. La pression de vapeur se calcule par l'équation de 
Hertz-Knudsen (voir paragraphe 1.5.4.1) avec des facteurs de correc ­
tion qui dépendent des paramètres de l'appareil (9). La gamme de 
pressions recommandée est comprise entre 10
 –10 et 1 Pa (10)(11) ­
(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Appareillage  
Le principe général de l'appareil est illustré à la figure 6.  
Figure 6
  
1: Vers la pompe à vide 7: Couvercle fileté 
2: Puits pour le thermomètre à résistance de 
platine ou le système de mesure et de régulation de la température 8: Écrous papillon 
3: Couvercle de la chambre à vide 9: Boulons 
4: Joint torique 10: Cellules à effusion en acier inoxydable 
5: Chambre à vide en aluminium 11: Cartouches chauffantes 
6: Dispositif permettant d'installer et d'ôter 
les cellules à effusion
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 41
 
1.5.6.  Méthode d'effusion: thermogravimétrie isotherme  
1.5.6.1.  Principe  
La méthode repose sur la détermination thermogravimétrique (10) ­
(15)(16)(17)(18)(19)(20), à hautes températures et à pression 
ambiante, de vitesses d'évaporation accélérée de la substance d'essai. 
Les vitesses d'évaporation v  T s'obtiennent en exposant la substance 
sélectionnée à l’atmosphère d’un gaz inerte s'écoulant lentement et en mesurant en continu la perte de poids à des températures 
isothermes T définies, exprimées en kelvins, durant des périodes 
de temps appropriées. Les pressions de vapeur p
 T sont déduites 
des valeurs v  T à l'aide de la relation linéaire entre le logarithme de 
la pression de vapeur et le logarithme de la vitesse d'évaporation. Si 
nécessaire, les valeurs correspondant aux températures de 20 et 25 °C peuvent être extrapolées par la régression du log p
 T en 
fonction de 1/T. Cette méthode convient aux substances ayant des 
pressions de vapeur aussi faibles que 10  –10 Pa (10  –12 mbar) et offrant 
un degré de pureté aussi proche que possible de 100 %, de manière à ne pas fausser l'interprétation des pertes de poids mesurées.
 
1.5.6.2.  Appareillage  
Le principe général du montage expérimental est schématisé à la 
figure 7.  
Figure 7
  
La plaque portant l'échantillon, suspendue à une microbalance et 
placée dans une enceinte thermostatée, est exposée à un flux 
d'azote sec qui emporte les molécules vaporisées de la substance d'essai. Au sortir de l'enceinte, le flux gazeux est purifié dans une unité de sorption.
 
1.5.6.3.  Mode opératoire  
La substance d'essai est étalée en une couche homogène sur la 
surface d'une plaque de verre dépoli. S'il s'agit d'un solide, la 
plaque est mouillée uniformément par une solution de la substance dans un solvant approprié et séchée sous atmosphère inerte. Pour les mesures, la plaque enduite est suspendue dans l'analyseur thermo ­
gravimétrique et sa perte de poids est ensuite mesurée en continu en 
fonction du temps.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 42
 
La vitesse d'évaporation v  T à une température définie se calcule 
d'après la perte de poids Δm de la plaque portant l'échantillon 
selon la formule:  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
où F représente la superficie recouverte de substance d'essai, norma ­
lement la superficie de la plaque portant l'échantillon, et t est le 
temps écoulé durant la perte de poids Δm. 
La pression de vapeur p  T est calculée en fonction de la vitesse 
d'évaporation v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
où C et D sont des constantes propres au dispositif expérimental 
employé, qui dépendent du diamètre de l'enceinte de mesure et du 
débit du gaz. Ces constantes sont à déterminer une fois par la mesure 
d'une série de substances dont la pression de vapeur est connue et par la régression du log p
 T en fonction de log v  T (11)(21)(22).  
La relation entre la pression de vapeur p  T et la température T en 
kelvins est décrite ci-dessous:  
Log p  T = A + B · 1/T  
où A et B représentent des constantes obtenues par la régression du 
log p  T en fonction de 1/T. Avec cette équation, la pression de vapeur 
peut être calculée par extrapolation pour n'importe quelle autre température.
 
1.5.7.  Méthode par saturation de gaz  (23)  
1.5.7.1.  Principe  
Un gaz inerte est envoyé à température ambiante et à un débit connu, 
à travers ou sur un échantillon de la substance d’essai, suffisamment lentement pour qu'il devienne saturé de vapeur. Il est extrêmement 
important de parvenir à la saturation de la phase gazeuse. La subs ­
tance transportée est recueillie, généralement à l'aide d'un adsorbant, et sa quantité est déterminée. Au lieu de recueillir la vapeur pour une analyse ultérieure, il est possible de mesurer directement la quantité 
de substance transportée par des techniques analytiques, telles que la 
chromatographie en phase gazeuse. La pression de vapeur est calculée en supposant que la loi des gaz parfaits est respectée et que la pression totale d'un mélange de gaz est égale à la somme 
des pressions des gaz qui le composent. La pression partielle de la 
substance d'essai, autrement dit sa pression de vapeur, est calculée à partir du volume total connu du gaz et du poids de la substance transportée.
 
La méthode par saturation de gaz est applicable aux substances 
solides ou liquides. Cette méthode peut être utilisée jusqu'à des pres ­
sions de vapeur de 10  –10 Pa (10)(11)(12)(13)(14); elle est surtout 
fiable pour des pressions de vapeur inférieures à 10  3 Pa. Au- 
dessus de 10  3 Pa, les pressions de vapeur sont généralement suresti ­
mées, probablement à cause de la formation d'aérosols. Comme la pression de vapeur est mesurée à température ambiante, il n'est pas 
nécessaire d'extrapoler les résultats à partir de mesures réalisées à 
hautes températures et l'on évite de ce fait les erreurs grossières fréquemment associées à ce type d'extrapolation.
 
1.5.7.2.  Appareillage  
Cette méthode requiert une enceinte thermostatée. Le schéma de la 
figure 8 montre une enceinte comportant trois supports à échantillons solides et trois supports à échantillons liquides, qui permettent de réaliser, en trois exemplaires, l'analyse d'une substance solide ou 
liquide. La température est réglée avec une précision d'au moins 
0,5 °C.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 43
 
Figure 8
  
L'azote convient dans la plupart des cas comme gaz porteur inerte, 
mais d'autres gaz doivent parfois être utilisés (24). Le gaz porteur 
doit être sec. Le courant gazeux est divisé en six courants, qui sont régulés par des vannes à pointeau (orifice d'environ 0,79 mm), et pénètre dans l'enceinte par des tubes en cuivre de 3,8 mm de 
diamètre intérieur. Une fois l'équilibre thermique atteint, le gaz 
passe à travers l'échantillon, puis sur l'adsorbant, et enfin sort de l'enceinte.
 
Les échantillons solides sont disposés dans des tubes en verre de 
5 mm de diamètre intérieur, entre deux tampons de laine de verre 
(voir figure 9). La figure 10 montre un support à échantillon liquide et un système adsorbant. La méthode la plus reproductible pour mesurer la pression de vapeur des liquides consiste à remplir le 
support de perles de verre ou d’un adsorbant inerte tel que de la 
silice, que l’on recouvre de liquide. Une autre possibilité consiste à faire barboter le gaz porteur dans une colonne de la substance d’essai liquide à l'aide d'un verre fritté.  
Figure 9
 Figure 10
  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 44
 
Le système adsorbant se compose d'une section avant et d'une 
section arrière. À de très faibles pressions de vapeur, l'adsorbant 
ne retient que de petites quantités, et l'adsorption sur la laine de verre et sur le tube en verre, entre l'échantillon et l'adsorbant, peut représenter un sérieux problème.
 
Des pièges refroidis au CO  2 solide permettent aussi de recueillir 
efficacement la substance vaporisée. Ils n'affectent pas la perte de charge dans la colonne de saturation; de plus, il est facile d'isoler 
quantitativement la substance recueillie.
 
1.5.7.3.  Mode opératoire  
Le débit du gaz porteur sortant est mesuré à température ambiante. 
Pour s’assurer de la valeur exacte du volume total du gaz porteur, on 
vérifie fréquemment le débit au cours de l’expérience. Il est préfé ­
rable de pratiquer un contrôle continu au moyen d’un débitmètre massique. La saturation de la phase gazeuse peut exiger un temps de contact considérable et, partant, des débits gazeux assez 
faibles (25).
 
À l’issue de l’expérience, les deux sections du système adsorbant, 
avant et arrière, sont analysées séparément. La substance retenue 
dans chaque section est désorbée par ajout d'un solvant. On 
analyse quantitativement les solutions ainsi obtenues afin de déter ­
miner le poids de la substance désorbée dans chaque section. Le choix de la méthode analytique (ainsi que de l'adsorbant et du 
solvant désorbant) est dicté par la nature de la substance d’essai. 
On mesure l'efficacité de la désorption en fixant une quantité connue de la substance d’essai sur l'adsorbant, puis en la désorbant et en déterminant la quantité recueillie. Il importe de tester l'efficacité 
de la désorption en utilisant des concentrations proches de, ou égales 
à, celle de l’échantillon dans les conditions de l'essai.
 
Afin d'assurer la saturation du gaz porteur avec la substance d’essai, 
trois débits gazeux différents sont utilisés. Si la pression de vapeur calculée est indépendante du débit, on considère que le gaz est saturé.
 
La pression de vapeur est calculée d'après l'équation suivante:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
où: 
p = pression de vapeur (Pa)  
W = masse de substance d'essai évaporée (g)  
V = volume de gaz saturé (m  3 ) 
R = constante molaire des gaz parfaits (8,314 J mol  –1 K –1 ) 
T = température (K)  
M = masse molaire de la substance d’essai (g mol  –1 ) 
Les volumes mesurés doivent être corrigés pour tenir compte des 
différences de pression et de température entre le débitmètre et le 
saturateur.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 45
 
1.5.8.  Méthode de la jauge à rotor  
1.5.8.1.  Principe  
Cette méthode fait appel à une jauge de viscosité à rotor dans 
laquelle l'élément de mesure est une petite bille d'acier suspendue 
dans un champ magnétique et maintenue en rotation par des champs 
tournants (26)(27)(28). Des bobines capteuses permettent de mesurer sa vitesse de rotation. Lorsque la bille a atteint une vitesse de rota ­
tion donnée, généralement proche de 400 tours par seconde, on cesse 
de lui fournir de l'énergie et la friction du gaz provoque sa décélé ­
ration. La diminution de la vitesse de rotation est mesurée en fonc ­
tion du temps. La pression de vapeur est déduite du ralentissement 
de la bille d'acier, fonction de la pression. La gamme de mesure 
recommandée est comprise entre 10
 –4 et 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Appareillage  
La figure 11 schématise le dispositif expérimental. La tête de mesure 
est placée dans une enceinte thermostatée à ± 0,1 °C près. La cellule contenant l'échantillon est placée dans une enceinte séparée, égale ­
ment thermostatée avec une précision de 0,1 °C. Toutes les autres 
parties du dispositif sont maintenues à une température plus élevée 
afin d'éviter la condensation. L'ensemble du système est relié à un système de vide poussé.
 
Figure 11
  
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. RÉSULTATS  
Quelle que soit la méthode choisie, la pression de vapeur doit être 
déterminée à au moins deux températures. Dans le domaine compris 
entre 0 et 50 °C, il est préférable d'effectuer des mesures à au moins trois températures, en vue de vérifier la linéarité de la courbe de pression de vapeur. Dans le cas de la méthode d'effusion (cellule 
de Knudsen et thermogravimétrie isotherme) et de la méthode par 
saturation de gaz, il est recommandé un intervalle de températures des mesures compris entre 120 et 150 °C, au lieu de 0 à 50 °C.
 
2.2. RAPPORT D’ESSAI  
Le rapport d'essai doit comprendre les informations suivantes:  
— méthode utilisée,  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 46
 
— caractéristiques précises de la substance (identité et impuretés) et 
étape préliminaire de purification, le cas échéant,  
— pressions de vapeur mesurées à au moins deux températures, et 
de préférence à au moins trois températures, dans la gamme comprise entre 0 et 50 °C (ou 120 et 150 °C),
 
— dont au moins une est inférieure ou égale à 25 °C, pour autant 
que la méthode choisie le permette d’un point de vue technique,  
— toutes les données brutes,  
— courbe de log p en fonction de 1/T,  
— estimation de la pression de vapeur à 20 °C ou à 25 °C.  
Si une transition est observée (changement d'état, décomposition), il 
y a lieu de noter les informations suivantes:  
— nature du changement,  
— température à laquelle se produit le changement à pression atmo ­
sphérique,  
— pression de vapeur à 10 et 20 °C en dessous de la température de 
la transition et à 10 et 20 °C au-dessus de cette température (sauf 
s'il s'agit une transition de l'état solide à l'état gazeux).  
Toutes les informations et remarques utiles à l'interprétation des 
résultats doivent être rapportées, en particulier celles qui concernent 
les impuretés et l'état physique de la substance.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
1) Journal Officiel des Communautés européennes  L 383 A 
(1992) 26-47.  
2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
5) NF T 20-048 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à 
usage industriel — détermination de la pression de vapeur des 
solides et des liquides dans le domaine 10  –1 à 10  5 Pa — 
méthode statique.  
6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
7) NF T 20-047 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à 
usage industriel — détermination de la pression de vapeur des 
solides et des liquides dans le domaine 10  –3 à 1 Pa — méthode 
de la balance de pression de vapeur.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 47
 
8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 
34, 593.  
9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.
 
11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000)  
12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22-28  
13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278.  
14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122.
 
15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147.
 
16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393-400.
 
17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Rela ­
tionship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; 
Pesticide Science 13 (1982) 161-168.
 
18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used 
in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31.
 
19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.
 
20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20.  
21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 
150 °C.  
22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002)  
23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Regis ­
ter, Washington DC  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 48
 
24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 49
 
Appendice  
Méthode d'estimation  
INTRODUCTION  
Les valeurs estimées de la pression de vapeur peuvent être utilisées pour:  
— choisir la méthode expérimentale appropriée,  
— fournir une estimation ou une valeur limite lorsque la méthode expérimentale 
n'est pas applicable pour des raisons techniques.  
MÉTHODE D'ESTIMATION  
La pression de vapeur des liquides et des solides peut être estimée à l'aide de la 
corrélation modifiée de Watson (a). La seule donnée expérimentale requise est le point d'ébullition normal. Cette méthode est applicable entre 10
 5 et 10  –5 Pa. 
Le «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (b) contient des 
informations détaillées sur cette méthode. Voir aussi «OECD Environmental 
Monograph No.67» (c).  
PROCÉDURE DE CALCUL  
La pression de vapeur se calcule de la façon suivante:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
où: 
T = température choisie  
T b = point d'ébullition normal  
P vp = pression de vapeur à la température T  
ΔH vb = la chaleur de vaporisation  
ΔZ b = coefficient de compressibilité (estimé à 0,97)  
m = facteur empirique qui dépend de l'état physique à la température 
choisie  
De plus,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
où K  F est un facteur empirique tenant compte de la polarité de la substance Les 
facteurs K  F de plusieurs types de substances sont énumérés dans la référence (b).  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 50
 
Souvent, les données disponibles mentionnent un point d'ébullition à pression 
réduite. Dans ce cas, la pression de vapeur se calcule de la façon suivante:  
lnP vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
où T  1 représente le point d'ébullition à la pression réduite P  1 . 
RAPPORT  
Si l'on utilise la méthode d'estimation, le calcul doit être accompagné d'une 
documentation détaillée.  
BIBLIOGRAPHIE  
a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 51
 
A.5. TENSION SUPERFICIELLE  
1. MÉTHODE  
Les méthodes décrites se fondent sur les lignes directrices de l'OCDE 
(1). Leurs principes fondamentaux sont décrits dans la référence (2).  
1.1. INTRODUCTION  
Les méthodes décrites s'appliquent à la mesure de la tension super ­
ficielle des solutions aqueuses.  
Avant d'effectuer ces essais, il sera bon d'avoir des informations 
préliminaires sur l'hydrosolubilité, la structure, les propriétés de la 
substance en matière d'hydrolyse et la concentration critique pour la 
formation de micelles.  
Les méthodes suivantes s'appliquent à la plupart des substances 
chimiques, quel que soit leur degré de pureté.  
La mesure de la tension superficielle par la méthode du tensiomètre à 
anneau est limitée aux solutions aqueuses ayant une viscosité dyna ­
mique inférieure à 200 mPa s environ.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
L'enthalpie libre de surface par unité de surface constitue la tension 
superficielle.  
La tension surperficielle s'exprime en:  
N/m (en unités SI) ou  
mN/M (en sous-unités SI)  
1 N/m = 10  3 dynes/cm  
I mN/m = 1 dyne/cm dans le système cgs qui n'est plus utilisé.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉFENCE  
Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans 
tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la 
méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec diffé ­
rentes méthodes.
 
Des substances de référence couvrant une vaste gamme de tensions 
superficielles sont données dans les références (1) et (3).  
1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES  
Les méthodes sont fondées sur la mesure de la force maximale 
qu'il faut exercer verticalement sur un étrier ou un anneau en contact avec la surface du liquide étudié, placé dans un récipient approprié, afin de le séparer de cette surface, ou sur une plaque, 
dont un des bords est en contact avec la surface, afin d'assurer 
l'arrachement du film formé.
 
Les substances hydrosolubles à une concentration supérieure à 
1 mg/ml sont testées en solution aqueuse à une seule concentration.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Ces méthodes fournissent une plus grande précision que ce qui est 
probablement requis pour le contrôle de la protection de l'environ ­
nement.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 52
 
1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES  
La substance est dissoute dans de l'eau distillée à une concentration 
correspondant à 90 % de la saturation de l'hydrosolubilité de cette substance; si cette concentration excède 1 g/l, l'essai est effectué avec 
une concentration de 1 g/l. Les substances dont l'hydrosolubilité est 
inférieure à 1 mg/l n'ont pas besoin d'être testées.
 
1.6.1.  Méthode de la plaque  
Voir ISO 304 et NF T 73-060 (substances tensioactives — détermi ­
nation de la tension superficielle par arrachement de films liquides).  
1.6.2.  Méthode de l'étrier  
Voir ISO 304 et NF T 73-060 (substances tensioactives — détermi ­
nation de la tension superficielle par arrachement de films liquides).  
1.6.3.  Méthode de l'anneau  
Voir ISO 304 et NF T 73-060 (substances tensioactives — détermi ­
nation de la tension superficielle par arrachement de films liquides).  
1.6.4.  Méthode de l'anneau harmonisée OCDE  
1.6.4.1.  Appareil  
Des tensiomètres commerciaux se prêtent à cette mesure. Ils compor ­
tent les éléments suivants:  
— un porte-échantillon mobile,  
— un dynamomètre,  
— un corps de mesure (anneau),  
— un récipient de mesure.  
1.6.4.1.1. P o r t e - é c h a n t i l l o n m o b i l e  
Le porte-échantillon mobile sert de support au récipient de mesure 
thermostaté, qui contient le liquide à étudier. Il est monté sur le même socle que le dynamomètre.
 
1.6.4.1.2. D y n a m o m è t r e  
Le dynamomètre (voir figure) est placé au-dessus du porte-échan ­
tillon. L'erreur dans la mesure de la force ne doit pas dépasser 
± 10  – 6 N, ce qui équivaut à une erreur limite de ± 0,1 mg dans 
une mesure de masse. Dans la plupart des cas, l'échelle de mesure des tensiomètres vendus dans le commerce est étalonnée en mN/m, 
si bien que l'on peut lire directement la tension superficielle en 
mN/m avec une précision de 0,1 mN/m.
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1.6.4.1.3. C o r p s d e m e s u r e ( a n n e a u )  
L'anneau est habituellement constitué par un fil de platine ou de 
platine-iridium ayant une épaisseur de 0,4 millimètres environ et 
une circonférence moyenne de 60 millimètres. Cet anneau est suspendu horizontalement à l'étrier de montage qui est relié par une tige métallique au dynamomètre (voir figure).
 
Figure  
Corps de mesure  
(toutes les dimensions sont exprimées en millimètres)
  
1.6.4.1.4. R é c i p i e n t d e m e s u r e  
Le récipient de mesure qui contient la solution à tester doit être un 
récipient en verre thermostaté. Il doit être conçu de telle sorte que, au cours de la mesure, la température du liquide et de la phase gazeuse au-dessus de la surface reste constante et qu'il n'y ait pas d'évapo ­
ration. Des récipients cylindriques en verre d'un diamètre intérieur 
d'au moins 45 millimètres répondent à ces exigences.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 54
 
1.6.4.2.  Préparation de l'appareil  
1.6.4.2.1. N e t t o y a g e  
La verrerie doit être nettoyée avec soin. Le cas échéant, elle sera 
lavée au mélange sulfochromique chaud, puis à l'acide phosphorique sirupeux (83 à 98 % en poids de H
 3 PO 4 ), rincée abondamment à 
l'eau courante et ensuite à l'eau bidistillée jusqu'au moment où l'on 
obtient une réaction neutre, et, enfin, séchée ou bien rincée avec une 
partie du liquide à mesurer.  
L'anneau sera tout d'abord rincé abondamment à l'eau pour éliminer 
toutes les traces de substances hydrosolubles, plongé 
quelques secondes dans le mélange sulfochromique, rincé à l'eau 
bidistillée jusqu'à ce que l'on obtienne une réaction neutre, et, enfin, rapidement séché au-dessus d'une flamme de méthanol.
 
Note:  
Les traces de substances qui ne sont pas dissoutes ou détruites par 
l'acide chromosulfurique ou l'acide phosphorique, telles que les 
silicones, doivent être éliminées à l'aide d'un solvant organique approprié.
 
1.6.4.2.2. É t a l o n n a g e d e l ' a p p a r e i l  
La validation de l'appareil consiste à vérifier le point zéro et à le 
régler de telle sorte que l'indication donnée par l'appareil permette une détermination fiable en mN/m.
 
Montage:  
L'appareil sera mis à niveau, par exemple à l'aide d'un niveau à bulle 
placé sur le socle du tensiomètre, en ajustant des vis de réglage.  
Réglage du point zéro:  
Après montage de l'anneau sur l'appareil et avant son immersion 
dans le liquide, l'indicateur du tensiomètre doit être réglé à zéro; 
on vérifiera le parallélisme de l'anneau en utilisant la surface du 
liquide comme miroir.  
Étalonnage:  
L'étalonnage de l'appareil peut être effectué par l'une des deux 
méthodes suivantes:  
a) à l'aide d'une masse: ce procédé utilise des cavaliers de masse 
connue (entre 0,1 et 1,0 g), qui sont placés successivement sur l'anneau. Le facteur d'étalonnage Φ
 a , par lequel il y a lieu de 
multiplier toutes les lectures de l'instrument, sera déterminé au 
moyen de l'équation (1):  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
où 
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = masse du cavalier (g)  
g = accélération de la pesanteur (981 cm s  – 2 au niveau de la 
mer)  
b = circonférence moyenne de l'anneau (cm)  
σ a = lecture du tensiomètre après placement du cavalier sur 
l'anneau (mN/m);  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 55
 
b) à l'aide d'eau: ce procédé utilise de l'eau pure dont la tension 
superficielle, par exemple à 23  o C, est égale à 72,3 mN/m. Il 
est plus rapide que l'étalonnage à l'aide de cavaliers, mais il comporte toujours le risque que la tension superficielle de l'eau soit modifiée par des traces de substance tensioactive.
 
Le facteur d'étalonnage Φ b , par lequel il faut multiplier toutes 
les lectures de l'appareil, sera déterminé à l'aide de l'équation 
ci-après (2): 
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
où: 
σ o = valeur donnée dans la littérature pour la tension super ­
ficielle de l'eau (mN/m)  
σ g = valeur mesurée de la tension superficielle de l'eau (mN/m) 
à cette même température.  
1.6.4.3.  Préparation des échantillons  
Les solutions aqueuses de la substance à tester seront préparées 
compte tenu des concentrations requises. Il est impératif que la 
dissolution de la substance soit complète.  
La solution ainsi préparée doit être maintenue à une température 
constante (± 0,5  o C). Étant donné que la tension superficielle d'une 
solution placée dans le récipient de mesure se modifie après un 
certain temps, il faut effectuer plusieurs mesures à des moments 
différents et tracer une courbe donnant la tension superficielle en fonction du temps. Lorsqu'il n'y a plus de modification, on a atteint un état d'équilibre.
 
La poussière ou les vapeurs d'autres substances faussent la mesure. 
Le travail doit donc s'effectuer sous une cloche de protection.  
1.6.5.  Conditions de l'essai  
Les mesures doivent être effectuées à une température de 20  o C 
environ, sans variation supérieure à ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Déroulement de l'essai  
Les solutions à mesurer seront transférées dans le récipient de 
mesure soigneusement nettoyé, en prenant soin d'éviter la formation 
de mousse; ensuite, le récipient de mesure sera placé sur le porte- échantillon qui sera élevé jusqu'à ce que l'anneau soit immergé au- dessous de la surface de la solution. Le porte-échantillon est alors 
abaissé graduellement et uniformément (à une vitesse d'environ 
0,5 cm/mn) pour retirer l'anneau de la surface du liquide et ce, jusqu'à ce que la force maximale soit atteinte. La couche du liquide accroché à l'anneau ne doit pas s'en détacher. Une fois les 
mesures achevées, l'anneau sera immergé à nouveau sous la surface, 
et les mesures répétées jusqu'à ce que l'on parvienne à une tension superficielle constante. À chaque détermination, le temps écoulé depuis le transfert de la solution dans le récipient de mesure sera 
enregistré. Des lectures seront effectuées à la valeur maximale de la 
force nécessaire pour retirer l'anneau de la surface du liquide.
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2. DONNÉES  
Pour calculer la tension superficielle, on multipliera tout d'abord la 
valeur lue sur l'appareil en mN/m par le facteur d'étalonnage Φ a ou 
Φ b (selon la méthode d'étalonnage utilisée). On obtiendra alors une 
valeur qui n'est qu'une approximation et doit ensuite être corrigée.  
Harkins et Jordan (4) ont établi de manière empirique des facteurs de 
correction pour les valeurs de tension superficielle obtenues par la 
méthode de l'anneau, facteurs qui dépendent des dimensions de l'an ­
neau, de la densité du liquide et de sa tension superficielle.  
Étant donné le travail qu'exige la détermination du facteur de correc ­
tion propre à chaque mesure à partir des tables de Harkins & Jordan, 
l'utilisation d'une méthode simplifiée de lecture directe de la tension superficielle corrigée à partir du tableau ci-après est autorisée pour les solutions aqueuses (on recourra à l'interpolation pour les lectures 
qui se situent entre deux valeurs du tableau.)
 
Tableau  
Correction des valeurs mesurées de la tension superficielle  
Valable seulement pour les solutions aqueuses, p ≈1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (rayon moyen de l'anneau) 
r = 0,185 mm (rayon du fil constituant l'anneau)  
Valeur expérimentale (mN/nr) Valeur corrigée (mN/m) 
Étalonnage à l'aide de cavaliers (voir 
1.6.4.2.2. (a)] Étalonnage à l'aide d'eau [voir 
1.6.4.2.2. (b)]  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 
24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 
32 28,1 30,1 
34 19,9 32,1 
36 31,3 34,1 
38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 
42 37,6 40,3 
44 39,5 42,3 
46 41,4 44,4 
48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 
56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 57
 
Valeur expérimentale (mN/nr) Valeur corrigée (mN/m) 
Étalonnage à l'aide de cavaliers (voir 
1.6.4.2.2. (a)] Étalonnage à l'aide d'eau [voir 
1.6.4.2.2. (b)]  
58 53,2 57 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 
66 61,2 65,5 
68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 —
 
Ce tableau a été établi sur la base de la correction de Harkins-Jordan 
et correspond à celle de la norme DIN (DIN 53914) concernant l'eau et les solutions aqueuses (densité ρ = 1 g/cm
 3 ), et pour un anneau 
vendu dans le commerce dont les dimensions sont R = 9,55 mm 
(rayon moyen de l'anneau) et r = 0,185 mm (rayon du fil constituant 
l'anneau). Le tableau donne les valeurs corrigées des mesures de tension superficielle effectuées après un étalonnage au moyen de cavaliers ou d'eau pure.
 
Une autre solution consiste à calculer la tension superficielle, sans 
étalonnage préalable, selon la formule suivante:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
où 
F = la force mesurée sur le dynamomètre au point de rupture du 
film 
R = le rayon de l'anneau  
f = le facteur de correction (1)  
3. RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— méthode utilisée,  
— le type d'eau ou de solution utilisé,  
— les spécifications précises de la substance étudiée (identité et 
impuretés),  
— le résultat des mesures: tension superficielle (lue) en indiquant à 
la fois les différentes lectures et leur moyenne arithmétique, ainsi 
que la valeur moyenne corrigée (compte-tenu du facteur dû au 
matériel et du tableau de correction),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 58
 
— la concentration de la solution,  
— la température de l'essai,  
— l'âge de la solution utilisée, en particulier le temps écoulé entre la 
préparation de la solution et sa mesure,  
— l'évolution de la tension superficielle en fonction du temps à 
partir du moment où la solution a été transférée dans le récipient de mesure,
 
— toutes les informations et observations pertinentes pour l'inter ­
prétation des résultats doivent être signalées, notamment les 
impuretés et l'état physique de la substance.  
3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Étant donné que la tension superficielle de l'eau est de 72,75 mN/m à 
20 o C, les substances dont la tension superficielle est inférieure à 
60 mN/m, dans les conditions propres à cette méthode, doivent être 
considérées comme des produits tensioactifs.  
4. RÉFÉFENCES  
(1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice 115, décision du Conseil 
C(81) 30 Final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Chapter 
XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Inter ­
science Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I.  
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 59
 
A.6. SOLUBILITÉ DANS L’EAU  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 105 (1995) de 
l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode d’essai constitue une révision de la ligne directrice 105 adoptée en 1981. S’il n’y 
a pas eu de modification de fond, la présentation a été remaniée. La révision 
s’appuie sur la méthode d’essai «Hydrosolubilité» de l’Union européenne (
 1 ). 
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
2. La présence d’impuretés peut considérablement modifier la solubilité d’une 
substance dans l’eau. La présente méthode d’essai porte sur la mesure de la solubilité de substances essentiellement pures, stables dans l’eau et non volatiles. Avant de déterminer la solubilité dans l’eau, il est utile de disposer 
d’informations sur la substance telles que la formule développée, la pression 
de vapeur, la constante de dissociation et l’hydrolyse en fonction du pH.
 
3. Les deux méthodes décrites dans cette méthode d’essai, la méthode par 
élution sur colonne et la méthode du flacon, couvrent respectivement les 
solubilités inférieures et supérieures à 10  –2 g/l. Un essai préliminaire simple 
est également décrit. Il permet de déterminer approximativement la quantité de substance à utiliser dans l’essai proprement dit, ainsi que le temps néces ­
saire pour atteindre la saturation.
 
DÉFINITIONS ET UNITÉS  
4. La solubilité d’une substance dans l’eau est la concentration massique de 
saturation de cette substance dans l’eau à une température donnée.  
5. La solubilité dans l’eau est exprimée en masse de soluté par volume de 
solution. L’unité SI est le kg/m  3 , mais on utilise également le g/l.  
SUBSTANCES CHIMIQUES DE RÉFÉRENCE  
6. Il n’y a pas lieu d’employer des substances de référence lorsqu’on étudie 
une substance.  
DESCRIPTION DES MÉTHODES  
Conditions de l’essai  
7. L’essai est pratiqué de préférence à 20 ° C ± 0,5 ° C. La température 
choisie sera maintenue constante dans toutes les parties du dispositif expé ­
rimental où elle peut avoir une influence.  
Essai préliminaire  
8. Des volumes d’eau croissants sont ajoutés progressivement à environ 0,1 g 
d’échantillon (les solides doivent être pulvérisés), à température ambiante, 
dans un flacon gradué de 10 ml fermé par un bouchon en verre. Après 
chaque ajout d’eau, le mélange est agité pendant 10 minutes. On vérifie ensuite visuellement si l’échantillon est complètement dissous. Si des parties non dissoutes de l’échantillon subsistent après l’addition de 10 ml d’eau, 
l’essai se poursuit dans un flacon gradué de 100 ml. La solubilité approxi ­
mative est indiquée dans le tableau 1, au-dessous du volume d’eau qui
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 60
 
dissout complètement l’échantillon. Si la solubilité est faible, le temps requis 
pour dissoudre la substance peut être long et il faut attendre au moins 24 
heures. Si après 24 heures la substance n’est toujours pas dissoute, il y a lieu d’attendre jusqu’à 96 heures ou de procéder à une dilution plus poussée, afin de déterminer s’il convient d’utiliser la méthode par élution sur colonne 
ou la méthode du flacon.
 
Tableau 1  
ml d’eau dissolvant 0,1 g 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
solubilité approximative en g/l > 1 000 1 000 à 
200 200 à 
100 100 à 50 50 à 10 10 à 1 < 1  
Méthode par élution sur colonne  
Principe  
9. Il s’agit d’éluer la substance à étudier avec de l’eau d’une microcolonne 
remplie d’un support inerte et préalablement revêtu d’un excès de la subs ­
tance à étudier (2). La solubilité correspond au plateau de la courbe de la 
concentration massique de l’éluat en fonction du temps.  
Appareillage  
10. L’appareil se compose d’une microcolonne (figure 1) thermostatée, reliée 
soit à une pompe de recirculation (figure 2), soit à un réservoir de remise à niveau (figure 3). La microcolonne contient un support inerte maintenu en place par un petit tampon de laine de verre, qui sert aussi à filtrer les 
particules. Divers matériaux peuvent être employés comme support: billes 
de verre, terre de diatomées ou autres matériaux inertes.
 
11. La microcolonne représentée à la figure 1 convient au montage comportant 
une pompe de recirculation. Elle a un volume tampon correspondant à cinq 
fois le volume de son lit (les premiers cinq volumes de lit sont rejetés au 
début de l’expérience) et au volume de cinq échantillons (prélevés pour analyse pendant l’expérience). On peut cependant réduire le volume tampon à condition de pouvoir ajouter de l’eau au système pendant l’expé ­
rience pour remplacer les premiers cinq volumes de lit éliminés avec les 
impuretés. La colonne est reliée, par un tuyau en matériau inerte, à une pompe de recirculation capable de pomper environ 25 ml/h. La pompe de recirculation peut être, par exemple, une pompe péristaltique ou une pompe 
à membrane. Il faut veiller à ce que le matériau du tuyau n’occasionne 
aucune contamination et/ou adsorption.
 
12. Un montage comportant un réservoir de remise à niveau est schématisé à la 
figure 3. Dans ce montage, la microcolonne est munie d’un robinet d’arrêt à une voie. Elle est reliée au réservoir de remise à niveau par un tube en 
matériau inerte et un raccord en verre rodé. Le débit du réservoir de remise 
à niveau doit avoisiner 25 ml/h.
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Figure 1
  
Dimensions en mm  
A. Raccordement pour joint en verre rodé  
B. Volume tampon  
C. Diamètre intérieur 5  
D. Diamètre extérieur 19  
E. Tampon en laine de verre  
F. Robinet d’arrêt  
Figure 2
  
A. Équilibrage atmosphérique  
B. Débitmètre  
C. Microcolonne  
D. Pompe de circulation thermostatée  
E. Pompe de recirculation  
F. Robinet à deux voies pour l’échantillonnage  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 62
 
Figure 3
  
A. Réservoir de remise à niveau (par exemple, un flacon de laboratoire de 
2,5 litres)  
B. Colonne  
C. Collecteur de fractions  
D. Thermostat  
E. Tuyau en téflon  
F. Joint en verre rodé  
G. Conduite d’eau (entre le thermostat et la colonne, diamètre intérieur 
d’environ 8 millimètres)  
13. Verser environ 600 mg de matériau de support dans un flacon à fond rond 
de 50 ml. Dissoudre une quantité appropriée de substance à étudier dans un solvant volatil de qualité pour analyse et ajouter une quantité déterminée de 
cette solution au matériau support. Le solvant doit être complètement 
évaporé, par exemple à l’aide d’un évaporateur rotatif, sinon l’eau ne pourra pas saturer le support pendant l’élution à cause d’un effet de répar ­
tition à la surface. Faire tremper le support chargé pendant deux heures dans 
environ 5 ml d’eau et verser la suspension dans la microcolonne, ou bien 
verser le support sec dans la microcolonne déjà remplie d’eau et le laisser s’équilibrer pendant deux heures.
 
14. Le chargement du support peut causer des problèmes conduisant à des 
résultats erronés, par exemple lorsque la substance à étudier est déposée 
sous forme d’huile. Ces problèmes doivent être examinés et détaillés dans 
le rapport.  
Méthode avec une pompe de recirculation  
15. La circulation dans la colonne est amorcée. Il est recommandé d’appliquer 
un débit d’environ 25 ml/h, soit dix volumes de lit par heure pour la 
colonne décrite. Les premiers cinq volumes de lit au moins sont rejetés pour éliminer les impuretés hydrosolubles. Après quoi, on laisse fonctionner la pompe jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint. L’équilibre est attesté 
lorsque l’analyse de cinq échantillons successifs donne des concentrations 
qui ne diffèrent pas de plus de ± 30 % de façon aléatoire. Ces prélèvements doivent être séparés entre eux par des intervalles de temps correspondant au passage d’au moins dix volumes de lit. Avec certaines méthodes analy ­
tiques, il peut être préférable de démontrer que l’équilibre est atteint à 
l’aide d’une courbe de la concentration en fonction du temps.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 63
 
Méthode avec réservoir de remise à niveau  
16. Des fractions successives d’éluat sont recueillies et analysées suivant la 
méthode choisie. Les fractions du milieu de l’intervalle d’élution, là où la concentration demeure constante à ± 30 % près dans au moins cinq prélè ­
vements consécutifs, servent à déterminer la solubilité.
 
17. L’eau bidistillée est le meilleur éluant. On peut aussi utiliser de l’eau 
désionisée, caractérisée par une résistivité supérieure à 10 mégaohms/cm 
et une teneur totale en carbone organique inférieure à 0,01 %.  
18. Pour chaque méthode, l’opération est répétée en réduisant le débit de moitié. 
Si les résultats des deux opérations concordent, l’essai est satisfaisant. Si l’on mesure une solubilité plus élevée avec le débit inférieur, il y a lieu de continuer à diminuer le débit de moitié jusqu’à ce que deux essais successifs 
donnent la même solubilité.
 
19. Pour chaque méthode, il faut vérifier la présence de matières colloïdales 
dans les fractions, par détection de l’effet Tyndall. La présence de particules 
fausse les résultats et l’essai doit être répété après avoir amélioré le pouvoir de filtration de la colonne.
 
20. Le pH de chaque échantillon doit être mesuré, de préférence au moyen de 
bandelettes indicatrices spéciales.  
Méthode du flacon  
Principe  
21. La substance est dissoute dans l’eau (les solides doivent être pulvérisés) à 
une température légèrement supérieure à celle de l’essai. Une fois la satu ­
ration obtenue, le mélange est refroidi et maintenu à la température de 
l’essai. Il est toutefois possible de réaliser la mesure directement, à la température de l’essai, si un échantillonnage pertinent prouve que l’équilibre de saturation a été atteint. Ensuite, la concentration de la substance est 
déterminée par une méthode analytique appropriée (3). La solution analysée 
ne doit contenir aucune particule non dissoute.
 
Appareillage  
22. Le matériel suivant est requis:  
— verrerie et instruments courants de laboratoire,  
— dispositif pour agiter les solutions à température constante,  
— si nécessaire, une centrifugeuse (thermostatée de préférence) pour les 
émulsions,  
— équipement d’analyse.  
Mode opératoire  
23. Évaluer la quantité de substance nécessaire pour saturer le volume d’eau 
voulu, à la lumière de l’essai préliminaire. Introduire l’équivalent d’environ 
cinq fois cette quantité dans chacun des trois récipients en verre munis d’un bouchon en verre (tubes à centrifuger, flacons, par exemple). Ajouter un volume d’eau, choisi en fonction de la méthode analytique et de la gamme 
de solubilité, dans chaque récipient. Les récipients sont bouchés herméti ­
quement et ensuite agités à 30 °C. Il convient d’utiliser un système d’agi ­
tation ou mélangeur capable de fonctionner à température constante, par exemple un agitateur magnétique combiné à un bain-marie thermostaté. 
Après un jour, laisser l’un des récipients s’équilibrer pendant 24 heures à 
la température de l’essai en l’agitant de temps en temps. Centrifuger ensuite
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 64
 
le contenu du récipient à la température de l’essai et déterminer, par une 
méthode analytique idoine, la concentration de la substance dans la phase 
aqueuse limpide. Les deux autres flacons sont traités de la même manière après avoir été équilibrés à 30 °C pendant deux et trois jours respective ­
ment. Si les concentrations mesurées au moins dans les deux derniers 
flacons ne diffèrent pas de plus de 15 %, l’essai est satisfaisant. Si les 
résultats obtenus avec les flacons 1, 2 et 3 tendent à croître, il est nécessaire de refaire tout l’essai en appliquant des temps d’équilibrage plus longs.
 
24. L’essai peut aussi être conduit sans préincubation à 30 °C. Afin d’estimer la 
rapidité avec laquelle s’établit l’équilibre de saturation, des échantillons sont 
prélevés jusqu’à ce que la durée de l’agitation n’influence plus les concen ­
trations mesurées.  
25. Le pH de chaque échantillon doit être mesuré, de préférence au moyen de 
bandelettes indicatrices spéciales.  
Déterminations analytiques  
26. Il est préférable d’employer une méthode d’analyse spécifique pour la subs ­
tance, de petites quantités d’impuretés solubles pouvant fausser gravement la 
mesure de la solubilité. Parmi les méthodes possibles, citons la chromato ­
graphie en phase gazeuse ou liquide, le titrage, la photométrie, la voltamé ­
trie. 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
Méthode par élution sur colonne  
27. Pour chaque essai, il faut calculer la moyenne et l’écart-type sur au moins 
cinq échantillons consécutifs issus du plateau de saturation. Les moyennes établies à partir de deux essais pratiqués à des débits différents ne doivent pas s’écarter de plus de 30 %.
 
Méthode du flacon  
28. On calcule la moyenne des résultats obtenus avec chacun des trois flacons. 
Ces résultats ne doivent pas différer de plus de 15 %.  
Rapport d’essai  
Méthode par élution sur colonne  
29. Le rapport d’essai doit comporter les informations suivantes:  
— résultats de l’essai préliminaire,  
— identité chimique de la substance et impuretés (étape de purification 
préliminaire, le cas échéant),  
— concentration, débit et pH pour chaque échantillon,  
— moyennes et écarts-type sur au moins cinq échantillons provenant du 
plateau de saturation pour chaque essai,  
— moyenne d’au moins deux essais successifs,  
— température de l’eau au cours du processus de saturation,  
— méthode d’analyse,  
— nature du matériau du support,  
— chargement du support,  
— solvant utilisé,  
— toute manifestation d’instabilité chimique de la substance pendant l’es ­
sai, 
— toute information utile à l’interprétation des résultats, notamment en ce 
qui concerne les impuretés et l’état physique de la substance.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 65
 
Méthode du flacon  
30. Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:  
— résultats de l’essai préliminaire,  
— identité chimique de la substance et impuretés (étape de purification 
préliminaire, le cas échéant),  
— résultats d’analyse individuels et moyenne si plus d’une valeur a été 
déterminée pour un même flacon,  
— pH de chaque échantillon,  
— moyenne des valeurs de différents flacons lorsque celles-ci concordent,  
— température de l’essai,  
— méthode d’analyse,  
— toute manifestation d’instabilité chimique de la substance pendant l’es ­
sai, 
— toute information utile à l’interprétation des résultats, notamment en ce 
qui concerne les impuretés et l’état physique de la substance.  
BIBLIOGRAPHIE:  
(1) Directive 92/69/CEE de la Commission du 31 juillet 1992 portant 
dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, régle ­
mentaires et administratives relatives à la classification, l’emballage et l’éti ­
quetage des substances dangereuses (JO L 383 du 29.12.1992, p. 113).
 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage indus ­
triel — Détermination de la solubilité dans l’eau des solides et liquides à faible solubilité — Méthode de l’élution sur colonne
 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage indus ­
triel — Détermination de la solubilité dans l’eau des solides et liquides à 
forte solubilité — Méthode du flacon.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 66
 
A.8. COEFFICIENT DE PARTAGE  
1. MÉTHODE  
La méthode par «agitation en flacon» décrite est basée sur les lignes 
directrices de l'OCDE (1).  
1.1. INTRODUCTION  
Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la formule 
développée, la constante de dissociation, l'hydrosolubilité, l'hydro ­
lyse, la solubilité dans le n-Octanol et la tension superficielle de la substance pour exécuter cet essai.
 
Les mesures concernant les substances ionisables ne doivent être 
réalisées qu'avec leur forme non ionisée (acide libre ou base libre) obtenue à l'aide d'un tampon approprié dont le pH est inférieur (acide libre) ou supérieur (base libre) au pK, au moins d'une unité pH.
 
La présente méthode d'essai comporte deux techniques distinctes: la 
méthode par agitation en flacon et la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). La première est applicable lorsque la valeur de log P
 ow (voir définition ci-après) tombe dans 
l'intervalle compris entre 2 et 4, et la seconde dans l'intervalle 
compris entre 0 et 6. Avant d'effectuer l'une de ces techniques expé ­
rimentales, il y a lieu de procéder à une estimation préliminaire du coefficient de partage.
 
La méthode par agitation en flacon ne s'applique qu'aux substances 
essentiellement pures, solubles dans l'eau et dans le n-Octanol. Elle n'est pas applicable aux substances tensioactives (pour lesquelles il convient de fournir une valeur calculée ou une estimation fondée sur 
les solubilités individuelles dans l'eau et le n-Octanol).
 
La méthode de HPLC ne s'applique pas aux acides et aux bases 
forts, aux complexes métalliques, aux substances tensioactives et aux substances qui réagissent avec l'éluant. Pour ces produits, il 
convient de fournir une valeur calculée ou une estimation fondée 
sur les solubilités individuelles dans l'eau et le n-Octanol.
 
La méthode de HPLC est moins sensible à la présence d'impuretés 
dans le composé à tester que la méthode par agitation en flacon. Les 
impuretés peuvent toutefois, dans certains cas, compliquer l'interpré ­
tation des résultats en rendant incertaine l'identification des pics. Pour des mélanges qui donnent des pics non résolus, il faut noter la limite inférieure et la limite supérieure de log P.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le coefficient de partage (P) est défini comme étant le rapport des 
concentrations à l'équilibre (c  i ) d'une substance dissoute dans un 
système biphasique consistant en deux solvants quasiment non miscibles. Dans le cas du n-Octanol et de l'eau:
 
P ow ¼ c nÄoctanol  
c eau 
Le coefficient de partage (P) est donc le quotient de deux concen ­
trations; il est généralement indiqué sous la forme de son logarithme, 
base 10 (log P).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 67
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Méthode par agitation en flacon  
Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans 
tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la 
méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec diffé ­
rentes méthodes.
 
Méthode de HPLC  
Pour établir une corrélation entre les données mesurées par HPLC et 
le coefficient de partage d'un composé, il faut établir une courbe 
d'étalonnage de log P par rapport aux données chromatographiques, 
à l'aide de six points de référence au moins. Le choix des substances de référence appropriées est laissé à l'utilisateur. Au moins un des composés de référence doit, si possible, avoir un P
 ow supérieur, et un 
autre un P  ow inférieur à celui de la substance à étudier. Pour des 
valeurs de log P inférieures à 4, l'étalonnage peut reposer sur les données obtenues avec la méthode par agitation en flacon. Pour des valeurs de log P supérieures à 4, l'étalonnage peut être effectué à 
partir de valeurs validées citées dans la littérature, si celles-ci concor ­
dent avec des valeurs calculées. 11 est préférable, pour une plus grande précision, de choisir des composés de référence dont la struc ­
ture est apparentée à celle de la substance à étudier.
 
Des listes de valeurs de log P ont été établies pour un grand nombre 
de produits chimiques (2) (3). Si l'on ne dispose pas de données 
relatives au coefficient de partage de composés de structures 
voisines, il faut utiliser un étalonnage plus général, établi avec d'au ­
tres composés de référence.  
L'annexe II présente une liste de substances de référence recomman ­
dées et la valeur de leur P  ow . 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
1.4.1.  Méthode par agitation en flacon  
Pour déterminer un coefficient de partage, il faut parvenir à un 
équilibre entre l'ensemble des éléments constitutifs du système s'in ­
fluençant mutuellement et déterminer les concentrations des subs ­
tances dissoutes dans les deux phases. Une étude bibliographique sur ce sujet fait apparaître que plusieurs techniques différentes permettent de résoudre ce problème, à savoir le mélange complet 
de deux phases suivi de leur séparation dans le but de déterminer la 
concentration à l'équilibre de la substance étudiée.
 
1.4.2.  Méthode de HPLC  
La HPLC est effectuée sur des colonnes analytiques remplies d'une 
phase solide contenant de longues chaînes d'hydrocarbures (par exemple C8, C18) liées chimiquement à de la silice, vendue dans le commerce. Les produits chimiques déposés sur une telle colonne 
se déplacent sur toute sa longueur à des vitesses différentes en raison 
de leur différence de taux de partage entre la phase mobile et la phase fixe hydrocarbonée. Les mélanges de produits chimiques sont élués par ordre d'hydrophobicité: les produits hydrosolubles sont 
élués les premiers et les produits liposolubles, les derniers, propor ­
tionnellement à leur coefficient de partage entre l'eau et les hydro ­
carbures. Ainsi peut on établir une relation entre le temps de réten ­
tion sur une telle colonne (à phase inversée) et le coefficient de 
partage n-Octanol/eau. Le coefficient de partage est déduit du  
facteur de capacité k , défini par l'expression suivante:
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 68
 
k ¼ t R Ä t o 
t o 
où t  R = temps de rétention de la substance à étudier et t  0 = temps 
moyen nécessaire à une molécule de solvant pour traverser la 
colonne (temps mort).  
Il n'est pas nécessaire de disposer d'une méthode analytique quanti ­
tative; il suffit de déterminer les temps d'élution.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.5.1.  Répétabilité  
Méthode par agitation en flacon  
Pour garantir la précision du coefficient de partage, on doit procéder 
à des déterminations en double, dans trois conditions d'essai diffé ­
rentes, la quantité de substance spécifiée ainsi que le rapport des 
volumes de solvant pouvant être modifiés. Les valeurs déterminées 
de ce coefficient, exprimées sous la forme de leurs logarithmes communs, doivent se situer dans un intervalle de ± 0,3 unité log.
 
Méthode de HPLC  
Afin d'augmenter la fiabilité des mesures, on procédera à des déter ­
minations en double. Les valeurs de log P issues de mesures indivi ­
duelles doivent se situer dans un intervalle de ± 0,1 unité log.  
1.5.2.  Sensibilité  
Méthode par agitation en flacon  
L'intervalle de mesure de la méthode est déterminé par la limite de 
détection du procédé analytique. Celle-ci doit permettre de déter ­
miner les valeurs de log P  ow dans l'intervalle de - 2 à 4 (cet intervalle 
peut occasionnellement, lorsque les conditions le permettent, être étendu à des valeurs de log P
 ow allant jusqu'à 5) lorsque la concen ­
tration du soluté n'excède pas 0,01 mol par litre dans l'une ou l'autre 
phase.  
Méthode de HPLC  
La méthode de HPLC permet d'estimer des coefficients de partage 
dans une gamme de valeurs de log P  ow comprises entre 0 et 6.  
Normalement, le coefficient de partage d'un composé peut être 
estimé avec une précision de ± 1 unité log de la valeur obtenue 
avec la méthode par agitation en flacon. On peut trouver des exem ­
ples de corrélations dans la littérature (4) (5) (6) (7) (8). Une plus grande précision peut généralement être obtenue lorsque la courbe de 
corrélation est établie avec des composés de référence de structure 
voisine (9).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 69
 
1.5.3.  Spécificité  
Méthode par agitation en flacon  
La loi de partage de Nernst ne s'applique qu'à température, pression 
et pH constants pour les solutions diluées. Rigoureusement, elle ne s'applique qu'à une substance dispersée entre deux solvants purs. Les 
résultats peuvent être affectés par l'apparition simultanée, dans l'une 
ou dans les deux phases, de plusieurs solutés différents.
 
La dissociation ou l'association de molécules dissoutes se traduit par 
des déviations par rapport à la loi de partage citée. Ces déviations s'expliquent par le fait que le coefficient de partage dépend dès lors de la concentration de la solution.
 
En raison des équilibres multiples en présence, cette méthode d'essai 
ne doit pas être appliquée sans correction aux composés ionisables. 
Dans ce cas, il faut envisager de remplacer l'eau par des solutions 
tampons dont le pH doit être distant d'au moins une unité pH du pKa de la substance; il faut tenir compte de l'importance de ce pH pour l'environnement.
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Estimation préliminaire du coefficient de partage  
La valeur du coefficient de partage est estimée de préférence à l'aide 
d'une méthode de calcul (voir annexe 1), ou bien, s'il y a lieu, à 
partir du rapport des valeurs de solubilité de la substance à étudier dans des solvants purs (10).
 
1.6.2.  Méthode par agitation en flacon  
1.6.2.1.  Préparation  
n-Octanol: la détermination du coefficient de partage doit être effec ­
tuée en recourant à un réactif de qualité analytique.  
Eau: utiliser de l'eau distillée ou bidistillée dans un appareil de verre 
ou de quartz. Pour les composés ionisables, remplacer, si c'est 
justifié, l'eau par des solutions tampons.  
Note:  
Ne pas utiliser l'eau provenant directement d'un échangeur d'ions.  
1.6.2.1.1. P r é s a t u r a t i o n d e s s o l v a n t s  
Avant de déterminer un coefficient de partage, les phases du système 
de solvants sont saturées réciproquement par agitation à température 
d'essai. Pour ce faire, il est pratique d'agiter pendant vingt-quatre heures, dans un agitateur mécanique, deux grands flacons contenant du n-Octanol pur de qualité analytique ou de l'eau, avec une quantité 
suffisante de l'autre solvant, puis de les laisser reposer jusqu'à ce que 
les phases se séparent et que l'on parvienne à un état de saturation.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r é p a r a t i o n d e l ' e s s a i  
Le volume liquide doit remplir presque complètement le récipient 
d'essai afin d'éviter toute perte de matière due à la volatilisation. Le 
rapport de volume et les quantités de substance à utiliser sont fixés comme suit:
 
— estimation préliminaire du coefficient de partage (voir ci-avant),  
— quantité minimale de substance à tester requise par le procédé 
analytique utilisé,  
— limite de concentration maximale dans chaque phase de 0,01 mol 
par litre.  
Trois essais sont effectués. Pour le premier, on utilise le rapport n- 
Octanol/eau calculé, pour le second, ce rapport est réduit de moitié et 
pour le troisième, il est doublé (par exemple 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. S u b s t a n c e à é t u d i e r  
Une solution de réserve est préparée dans du n-Octanol présaturé 
d'eau. La concentration de cette solution mère doit être déterminée avec précision avant de l'utiliser pour déterminer le coefficient de 
partage. Cette solution doit être stockée dans des conditions qui 
garantissent sa stabilité.
 
1.6.2.2.  Conditions de l'essai  
La température d'essai doit être maintenue constante (± 1  o C) et se 
situer dans l'intervalle compris entre 20  o C et 25  o C. 
1.6.2.3.  Mesure  
1.6.2.3.1. É t a b l i s s e m e n t d e l ' é q u i l i b r e d e p a r t a g e  
Pour chaque série de conditions d'essai, préparer en double des 
récipients d'essai contenant les quantités requises, mesurées avec 
précision, des deux solvants ainsi que la quantité nécessaire de solu ­
tion de réserve.  
Mesurer le volume des phases de n-Octanol. Placer les récipients 
d'essai dans un agitateur approprié ou les agiter à la main. Lorsqu'on utilise un tube à centrifuger, une méthode recommandée consiste à 
retourner rapidement le tube à 180
 o autour de son axe transversal de 
telle sorte que l'air éventuellement retenu traverse les deux phases. L'expérience a montré que cinquante rotations de ce type suffisent généralement pour établir l'équilibre de partage. Pour plus de certi ­
tude, il est recommandé d'effectuer cent rotations en cinq minutes.
 
1.6.2.3.2. S é p a r a t i o n d e s p h a s e s  
On peut, si nécessaire, centrifuger le mélange pour séparer les 
phases. Cette opération est effectuée à l'aide d'une centrifugeuse de laboratoire maintenue à température ambiante, ou, si l'on utilise une centrifugeuse sans contrôle de température, les tubes a centrifuger 
doivent être gardés à température d'essai pendant au moins une heure 
avant l'essai.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analyse  
Pour déterminer le coefficient de partage, il est nécessaire de déter ­
miner la concentration de la substance à étudier dans les deux phases. Pour ce faire, prélever une portion de chacune des deux 
phases de chaque tube pour chaque série de conditions d'essai et 
les analyser suivant le procédé choisi. La quantité totale de substance présente dans les deux phases doit être calculée et comparée avec la quantité de substance initialement introduite.
 
La phase aqueuse doit être échantillonnée selon un procédé réduisant 
au minimum le risque d'inclusion de traces de n-Octanol: on peut utiliser à cet effet une seringue en verre à aiguille interchangeable. 
Tout d'abord remplir partiellement la seringue d'air, lequel est ensuite 
expulsé doucement, tout en insérant l'aiguille dans la couche de n- Octanol. Prélever un volume adéquat de phase aqueuse. Retirer rapi ­
dement la seringue de la solution et enlever l'aiguille. Le contenu de 
la seringue pourra alors être utilisé comme échantillon aqueux. La 
concentration doit être déterminée dans les deux phases distinctes de préférence par un procédé spécifique à la substance. Exemples de méthodes analytiques susceptibles de convenir:
 
— méthodes photométriques,  
— chromatographie en phase gazeuse,  
— chromatographie en phase liquide haute performance.  
1.6.3.  Méthode HPLC  
1.6.3.1.  Préparation  
Appareil  
Il est nécessaire de disposer d'un chromatographe à phase liquide, 
muni d'une pompe à débit régulier et d'un dispositif de détection approprié. Il est recommandé d'utiliser une valve à injection 
portant des boucles à injection. La présence de groupes polaires 
dans la phase stationnaire peut entraver considérablement le fonc ­
tionnement de la colonne d'HPLC. C'est pourquoi les phases station ­
naires doivent contenir un minimum de groupes polaires (11). On 
peut utiliser des phases inverses à microparticules ou des colonnes 
prêtes à l'emploi vendues dans le commerce. Une colonne de sécurité peut être placée entre le système d'injection et la colonne analytique.
 
Phase mobile  
Le solvant d'élution est préparé avec du méthanol et de l'eau de 
qualité HPLC et dégazé avant utilisation. Il convient d'employer une élution isocratique et d'utiliser un rapport méthanol/eau conte ­
nant un minimum de 25 % d'eau. Normalement, un mélange métha ­
nol-eau 3:1 (v/v) convient pour éluer des composés de log P 6 en moins d'une heure, à un débit de 1 millilitre/minute. Pour les composés dont le log P est élevé, il peut être nécessaire de réduire 
le temps d'élution et celui des composés de référence en diminuant la 
polarité de la phase mobile ou la longueur de la colonne.
 
Les substances très peu solubles dans le n-Octanol ont tendance à 
donner des valeurs de log P  ow anormalement basses avec la méthode 
HPLC; les pics formés par ces composés font parfois partie du front 
du solvant. Ce phénomène est probablement dû au fait que le processus de partage est trop lent pour atteindre l'équilibre dans un laps de temps normal pour une séparation par HPLC. Pour parvenir à 
une valeur fiable, il peut être utile de diminuer le débit ou le rapport 
méthanol/eau.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 72
 
Les substances à tester et les composés de référence doivent être 
solubles, dans la phase mobile, à des concentrations suffisantes 
pour permettre leur détection. On ne peut employer d'additifs avec le mélange méthanol-eau que dans des cas exceptionnels, car ils modifient les propriétés de la colonne. Les chromatogrammes avec 
additifs doivent obligatoirement être effectués avec une autre colonne 
du même type. Si le mélange méthanol-eau n'est pas approprié, on peut utiliser d'autres mélanges solvant organique-eau, par exemple éthanol-eau ou acétonitrile-eau.
 
Le pH de l'éluant est d'une importance capitale pour les composés 
ionisables. Il doit se situer dans l'intervalle de pH auquel fonctionne la colonne, qui est habituellement compris entre 2 et 8. Il est recom ­
mandé de tamponner. Il faut prendre soin d'éviter la précipitation 
saline et la détérioration de la colonne qui se produisent avec certains mélanges phase organique/tampon. Il n'est pas recommandé d'effec ­
tuer des mesures de HPLC avec des phases stationnaires à base de 
silice à un pH supérieur à 8 parce qu'une phase mobile alcaline peut 
altérer rapidement le fonctionnement de la colonne.
 
Solutés  
Les composés de référence doivent être les plus purs possibles. Les 
composés utilisés à des fins d'essai ou d'étalonnage sont, si possible, dissous dans la phase mobile.
 
Conditions de l'essai  
La température ne doit pas varier de plus de ± 2 K pendant les 
mesures.  
1.6.3.2.  Mesure  
Calcul du temps mort t  0 
Le temps mort t  0 peut être déterminé en utilisant soit une série 
d'homologues (par exemple n-alkyl-méthyl-cétones) soit des composés organiques non retenus (par exemple thiourée ou forma ­
mide). Pour calculer le temps mort (t
 0 ) à l'aide d'une série homo ­
logue, il faut injecter un jeu d'au moins 7 membres d'une série 
homologue et déterminer leurs temps de rétention respectifs. Les temps de rétention bruts t
 r(nc + 1) sont tracés en fonction de t  r(nc) . 
L'intersection a et la pente b de l'équation de régression:  
t r(nc + 1)  = a + b t  r(nc) 
sont déterminés (n  c = nombre d'atomes de carbone). Le temps mort 
est défini par l'équation suivante  
t 0 = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 73
 
Courbe d'étalonnage  
L'étape suivante consiste à construire une courbe de corrélation entre 
log k et log P pour des composés de référence appropriés. En pratique, il s'agit d'injecter simultanément un jeu de cinq à dix composés de référence standard dont le log P est proche de la 
gamme prévue et de déterminer les temps de rétention, de préférence 
sur un intégrateur enregistreur lié au système de détection. Les loga ­
rithmes des facteurs de capacité, log k, correspondants sont calculés et tracés en fonction du log P déterminé avec la méthode par agita ­
tion en flacon. L'étalonnage est effectué à intervalles réguliers, au 
moins une fois par jour, afin de pouvoir tenir compte de change ­
ments éventuels du fonctionnement de la colonne.
 
Détermination du facteur de capacité de la substance à tester  
Injecter la substance à tester dans une quantité aussi petite que 
possible de phase mobile. Déterminer (en double) le temps de réten ­
tion qui permet de calculer le facteur de capacité k. Le coefficient de 
partage de la substance à tester peut être déduit par interpolation à partir de la courbe de corrélation des produits de référence. Une extrapolation s'impose pour les coefficients de partage très faibles 
ou très élevés. Il faut alors accorder une attention particulière aux 
limites de confiance de la courbe de régression.
 
2. DONNÉES  
Méthode par agitation en flacon  
La fiabilité des valeurs de P ainsi déterminées peut être vérifiée en 
procédant à une comparaison de la moyenne des déterminations 
effectuées en double avec la moyenne générale.  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) 
et, s'il y a lieu, l'étape de purification préliminaire,  
— si les méthodes ne sont pas applicables (par exemple substance 
tensioactive), il convient de fournir une valeur calculée ou estimée à partir des solubilités individuelles dans l'eau ou le n- 
Octanol,
 
— toutes les informations et remarques pertinentes pour l'interpréta ­
tion des résultats doivent être signalées, en particulier les impu ­
retés et l'état physique de la substance.  
Pour la méthode par agitation en flacon:  
— les résultats de l'estimation préliminaire, s'il y a lieu,  
— la température à laquelle est effectuée la détermination,  
— les données relatives aux procédés analytiques utilisés pour déter ­
miner les concentrations,  
— le temps et la vitesse de centrifugation, s'il y a lieu,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 74
 
— les concentrations mesurées dans les deux phases pour chaque 
détermination (cela signifie qu'un total de douze concentrations 
doit être consigné),  
— le poids de la substance à étudier, le volume de chaque phase 
utilisée dans chaque récipient à essai et la quantité totale calculée de substance à étudier présente dans chaque phase une fois l'équilibre atteint,
 
— les valeurs calculées du coefficient de partage (P) et la moyenne 
doivent être mentionnées pour chaque série de conditions d'essai 
ainsi que la moyenne de l'ensemble des déterminations. Toute 
indication de dépendance du coefficient de partage vis-à-vis de la concentration doit être mentionnée,
 
— la déviation standard des valeurs individuelles de P par rapport à 
leur moyenne,  
— la moyenne P de l'ensemble des déterminations exprimée par son 
logarithme (base 10),  
— la valeur théorique calculée de P  ow , si elle a été déterminée, ou si 
la valeur mesurée est > 10  4 , 
— le pH de l'eau utilisée et de la phase aqueuse pendant l'expé ­
rience,  
— si l'eau est remplacée par un tampon, justifier son utilisation, et 
donner sa composition sa concentration et son pH ainsi que le pH de la phase aqueuse avant et après l'expérience.
 
Pour la méthode par HPLC:  
— le résultat de l'estimation préliminaire, s'il y a lieu,  
— les substances à étudier et les substances de référence ainsi que 
leur degré de pureté,  
— la gamme de température à laquelle sont effectuées les détermi ­
nations,  
— le pH auquel sont effectuées les déterminations,  
— une description détaillée de la colonne analytique et de la 
colonne de sécurité ainsi que de la phase mobile et des 
moyens de détection,  
— des données relatives à la rétention et les valeurs de log P citées 
dans la littérature pour les composés de référence utilisés pour l'étalonnage,
 
— une description détaillée de la ligne de régression ajustée (log k 
en fonction de log P),  
— des données relatives à la rétention moyenne et à la valeur inter ­
polée de log P pour le composé à étudier,  
— une description du matériel et des conditions expérimentales,  
— les profils d'élution,  
— les quantités de produit à étudier et de substances de référence 
introduites dans la colonne,  
— le temps mort et la méthode utilisée pour le calculer.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 75
 
4. RÉFÉRENCES  
(1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n  o 107, décision du 
Conseil C(81) 30 final.  
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(5) H. Ellgehausen. C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
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(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, 
vol. 7, 675.  
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (édité par E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223-339.  
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses, Chem Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(7) (13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Else ­
vier, Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Produits chimiques à usage 
industriel — Détermination du coefficient de partage — Méthode par agitation en flacon.
 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, 
vol. 12, 1459.  
(16) A. Leo, C.Hansch and D. Elkins, Chem. Rev, 1971, 
vol. 71, 525.  
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitam and 
E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, 
vol. 10, 382.  
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam, 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 77
 
Annexe  
METHODES DE CALCUL/ESTIMATION  
INTRODUCTION  
Une introduction générale aux méthodes de calcul des données et des exemples 
figurent dans le «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (a).  
Les valeurs calculées du P  ow peuvent servir:  
— à choisir la méthode expérimentale appropriée (gamme pour la méthode 
par agitation du flacon: log P  ow : de - 2 à 4 T; gamme pour l'HPLC: log 
P ow : de 0 à 6),  
— à déterminer les conditions d'essai appropriées (par exemple, les substances 
de référence pour l'HPLC, le rapport de volume n-Octanol/eau pour la 
méthode par agitation du flacon),  
— de contrôle propre au laboratoire relatif aux erreurs expérimentales éven ­
tuelles,  
— à fournir une estimation de P  ow au cas où les méthodes expérimentales ne 
peuvent être appliquées pour des raisons techniques.  
MÉTHODES D'ESTIMATION  
Estimation préliminaire du coefficient de partage.  
La valeur du coefficient de partage peut être estimée à l'aide de la solubilité de la 
substance à tester dans les solvants purs:  
P estimé ¼ saturation C  nÄOctanol  
saturation C  
eau 
MÉTHODES DE CALCUL  
Principe des méthodes de calcul  
Toutes les méthodes de calcul reposent sur la fragmentation formelle de la 
molécule en sous-structures appropriées pour lesquelles on dispose de données 
précises concernant le log P  ow . Le log P  ow de la molécule entière est alors calculé 
en ajoutant la somme des valeurs des fragments correspondantes et la somme des termes de correction pour les interactions moléculaires.
 
Il existe des listes de constantes de fragments et de termes de correction (b) (c) 
(d) (e) dont certaines sont régulièrement mises à jour (b).  
Critères de qualité  
En général, la fiabilité de la méthode de calcul est inversement proportionnelle à 
la complexité du composé étudié. Dans le cas de molécules simples, dont le 
poids moléculaire est faible et qui contiennent un ou deux groupes fonctionnels, 
on peut prévoir une déviation de 0,1 à 0,3 unité de log P entre les résultats obtenus à l'aide de différentes méthodes de fragmentation et la valeur mesurée. La marge d'erreur peut être plus importante dans le cas de molécules plus 
complexes. Cette marge d'erreur dépend de l'existence des constantes de frag ­
ments et de leur fiabilité ainsi que de la possibilité d'identifier les interactions intramoléculaires (par exemple les liaisons hydrogènes) et de l'utilisation correcte des termes de correction (ce qui ne pose aucune difficulté avec un logiciel 
informatique CLOGP-3) (b). Dans le cas des composés ionisables, il est impor ­
tant de prendre en considération la charge ou le degré d'ionisation.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 78
 
Calcul  
Méthode π de Hansch  
La constante du substituant hydrophobe d'origine, π, établie par Fujita et al. (f) 
est définie comme suit:  
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH)  
où P  ow (PhX) est le coefficient de partage d'un dérivé aromatique et P  ow (PhH), 
celui du composé parent;  
(par exemple π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
Conformément à sa définition la méthode  π s'applique surtout à la substitution 
aromatique. Les valeurs de π d'un grand nombre de substituants ont été rassem ­
blées (b) (c) (d). Elles sont utilisées pour calculer le log P de molécules aroma ­
tiques ou de sous-structures.  
Méthode de Rekker  
Selon Rekker (g), la valeur de log P  ow est calculée de la manière suivante:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j 
où f  i représente les constantes des divers fragments moléculaires et a  i leur 
fréquence dans la molécule à l'étude. Les termes de corrections peuvent être exprimés sous la forme du multiple entier d'une constante unique C
 m (appelée 
«constante magique»). Les constantes de fragments f  i et C  m ont été déterminées à 
partir d'une liste de 1 054 valeurs de P  ow obtenues expérimentalement (825 
composés) à l'aide d'une analyse de régression multiple (c) (h). La détermination 
des termes d'interaction est effectuée conformément aux règles établies décrites 
dans la littérature (e) (h) (i).  
Méthode de Hansch-Leo  
Selon Hansch et Léo (c), la valeur de log P  ow est calculée à l'aide de l'équation 
suivante:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
où f  i représente les constantes des divers fragments moléculaires, F  j les termes de 
correction et a  i et b  j les fréquences correspondantes. Une liste de valeurs de 
fragments (atomes ou groupes) a été déterminée par essai et erreur à partir de valeurs expérimentales de P
 ow, ainsi qu'une liste de termes de correction F  j 
(appelés «facteurs»). Les termes de correction ont été classés en plusieurs 
classes (a) (c). Il est relativement long et compliqué de tenir compte de toutes les règles et de tous les termes de correction mais des logiciels ont été mis au point (b).
 
Méthode mixte  
Le calcul de log P  ow pour des molécules complexes peut être considérable ­
ment amélioré si l'on découpe la molécule en infrastructures de plus grande dimension, pour lesquelles on dispose de valeurs de log P
 ow fiables, provenant 
soit de tableaux (b) (c) soit de mesures. De tels fragments (par exemple des 
hétérocycles, anthraquinone, azobenzène) peuvent être associés avec les valeurs 
de π définies selon Hansch ou avec les constantes de fragments définies par 
Rekker ou par Leo.  
Observations  
i) Les méthodes de calcul ne s'appliquent qu'à des composés partiellement ou 
totalement ionisés lorsqu'il est possible de tenir compte des facteurs de 
correction nécessaires.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 79
 
ii) Si les liaisons hydrogène intramoléculaires peuvent être déterminées, les 
termes de correction correspondants (de + 0,6 à + 1,0 unité log P) doivent 
être ajoutés (a). Les modèles stériques ou les données spectroscopiques rela ­
tives à la molécule peuvent indiquer la présence de telles liaisons.  
iii) Si plusieurs formes tautomériques sont possibles, les calculs doivent être 
basés sur la forme la plus probable.  
iv) Les révisions des listes de constantes de fragments doivent être soigneuse ­
ment suivies.  
Procès-verbal  
Lors de l'utilisation de méthodes de calcul/estimation. Le procès-verbal d'essai 
contiendra, si possible, les renseignements suivants:  
— description de la substance (mélange, impuretés, etc.),  
— indication concernant toute liaison hydrogène intramoléculaire possible, 
charge, ou tout effet inhabituel (par exemple tautomérisme),  
— description de la méthode de calcul,  
— identification ou base de données,  
— particularités du choix des fragments,  
— documentation détaillée du calcul.  
RÉFÉRENCES  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim Ther., 1979, vol. 
14, 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington, D.C. 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 80
 
Annexe II  
Substances de référence recommandées pour la méthode HPLC  
N o Substance de référence Log P  ow pKa 
1 2-butanone 0,3 
2 4-acétylpyridine 0,5 
3 aniline 0,9 
4 acétaniline 1,0 
5 alcool benzylique 1,1 
6 p-méthoxyphénol 1,3 pKa = 10,26 
7 acide phénoxy-acétique 1,4 pKa = 3,12 
8 phénol 1,5 pKa = 9,92 
9 dinitrophénol 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitrile 1,6 
11 phénylacétonitrile 1,6 
12 alcool 4-méthylbenzylique 1,6 
13 acécophénone 1,7 
14 2-nitrophénol 1,8 pKa = 7,17 
15 acide 3-nitrobenzoïque 1,8 pKa = 3,47 
16 4-chloraniline 1,8 pKa = 4,15 
17 nitrobenzène 1,9 
18 alcool cinnamique 1,9 
19 acide benzoïque 1,9 pKa = 4,19 
20 p-crésol 1,9 pKa = 10,17 
21 acide cinnamique 2,1 pKa = 3,89 cis 
pKa = 4,44 trans 
22 anisole 2,1 
23 méthylbenzoate 2,1 
24 benzène 2,1 
25 acide méthylbenzoïque 2,4 pKa = 4,27 
26 chlorophénol 2,4 pKa = 9,1 
27 trichloréthylène 2,4 
28 atrazine 2,6 
29 éthylbenzoate 2,6 
30 2,6-dichlorobenzonitrile 2,6 
31 acide chlorobenzoïque 2,7 pKa = 3,82 
32 toluène 2,7 
33 naphtol 2,7 pKa = 9,34 
34 2,3 dichloroaniiine 2,8 
35 chlorobenzène 2,8 
36 allyl-phényléther 2,9 
37 bromobenzène 3,0  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 81
 
N o Substance de référence Log P  ow pKa 
38 éthylbenzène 3,2 
39 benzophénone 3,2 
40 4-phénylphénone 3,2 pKa = 9,54 
41 thymol 3,3 
42 1,4-dichlorobenzène 3,4 43 diphénylamine 3,4 pKa = 0,79 44 naphtalène 3,6 45 phénylbenzoate 3,6 46 isopropylbenzène 3,7 47 2,4,6-trichlorophénol 3,7 pKa = 6 48 biphényl 4,0 49 benzylbenzoate 4,0 50 2,4-dinitro-6sec.butylphénol 4,1 
51 1,2,4-trichlorobenzène 4,2 
52 acide dodécanoïque 4,2 53 diphényléther 4,2 54 n-butylbenzène 4,5 55 phénanthrène 4,5 56 fluoranthène 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6-diphénylpyridine 4,9 59 triphénylamine 5,7 60 DDT 6,2 
Autre substance de référence dont le log P
 ow est faible 
1 acide nicotinique - 0,07  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 82
 
A.9. POINT D'ÉCLAIR  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Pour réaliser cet essai, il est utile de disposer d'informations préli ­
minaires sur l'inflammabilité de la substance. Le mode opératoire est 
applicable aux substances liquides dont les vapeurs peuvent être enflammées par des sources d'inflammation. Les méthodes d'essai énumérées dans le présent document ne sont valables que pour les 
intervalles de point d'éclair spécifiés dans les méthodes individuelles.
 
Il convient de tenir compte dans le choix de la méthode des 
réactions chimiques éventuelles entre la substance et le support de l'échantillon.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le point d'éclair est la température la plus basse, corrigée pour une 
pression de 101,325 kPa, à laquelle le liquide d'essai dégage des vapeurs, dans les conditions définies dans la méthode d'essai, en 
quantité telle qu'il en résulte dans le récipient d'essai un mélange 
vapeur/air inflammable.
 
Unités:  o C 
t = T - 273,15  
(t est exprimé en  o C et T en K)  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans 
tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient 
servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la 
méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec diffé ­
rentes méthodes.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La substance est placée dans un récipient d'essai que l'on chauffe ou 
que l'on refroidit à la température d'essai, suivant le mode opératoire décrit dans la méthode d'essai individuel. Des essais d'inflammation 
doivent être effectués afin de s'assurer que la substance dégage ou 
non des vapeurs inflammables à la température d'essai,
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.5.1.  Répétabilité  
La répétabilité dépend de l'intervalle de point d'éclair et de la 
méthode d'essai utilisée; maximum 2  o C. 
1.5.2.  Sensibilité  
La sensibilité dépend de la méthode d'essai utilisée.  
1.5.3.  Spécificité  
La spécificité de certaines méthodes d'essai est limitée à certains 
intervalles de point d'éclair et dépend de données relatives à la subs ­
tance (par exemple haute viscosité).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 83
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Préparation  
Un échantillon de la substance à tester est placé dans un appareil 
d'essai conforme aux points 1.6.3.1 ou 1.6.3.2.  
Par mesure de sécurité, il est conseillé d'utiliser pour les substances 
énergétiques ou toxiques, une méthode n'exigeant qu'un échantillon de petite taille (2 cm
 3 environ).  
1.6.2.  Conditions d'essai  
L'appareil doit, dans la limite des règles de sécurité, être placé à 
l'abri des courants d'air.  
1.6.3.  Mode opératoire  
1.6.3.1.  Méthode de l'équilibre  
Voir normes ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Méthode du non-équilibre  
Appareil d'Abel:  
Voir normes BS 2000 partie 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Appareil d'Abel-Pensky:  
Voir normes EN 57, DIN 51755 partie 1 (pour des températures de 5 
à 65  o C), DIN 51755 partie 2 (pour des températures inférieures à 
5 o C), NF M07-036.  
Appareil Tag:  
Voir norme ASTM D 56.  
Appareil de Pensky-Martens:  
Voir normes ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000- 
34, NF M07-019.  
Observations:  
Lorsque le point d'éclair, déterminé par une méthode basée sur le 
non-équilibre (point 1.6.3.2.), a une valeur de 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C ou 
55 ± 2  o C, il importe de confirmer cette valeur par une méthode 
basée sur l'équilibre en utilisant le même appareil.  
Seules les méthodes susceptibles de donner la température du point 
d'éclair peuvent être utilisées pour une notification.  
Pour déterminer le point d'éclair des liquides visqueux (peintures, 
gommes et substances similaires) contenant des solvants, il ne faut utiliser que des appareils et des méthodes d'essai permettant de 
déterminer le point d'éclair des liquides visqueux.
 
Voir normes ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 partie 1.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 84
 
2. DONNÉES  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),  
— la méthode utilisée ainsi que toute variante éventuelle,  
— les résultats et toute observation supplémentaire pertinente pour 
l'interprétation des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
Aucune.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 85
 
A.10.  INFLAMMABILITÉ (SOLIDES)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Avant de procéder à cet essai, il est utile de disposer d'informa ­
tions préliminaires sur les propriétés explosives potentielles de la 
substance.  
Cet essai ne doit être appliqué qu'aux substances poudreuses, granu ­
leuses ou pâteuses.  
De façon à ne pas englober toutes les substances susceptibles d'être 
enflammées, mais uniquement celles qui brûlent rapidement ou celles 
dont la combustion est particulièrement dangereuse d'une façon ou 
d'une autre, ne sont considérées comme très inflammables que les substances dont la vitesse de combustion dépasse une certaine limite.
 
La propagation de l'incandescence dans une poudre métallique peut 
être particulièrement dangereuse en raison des difficultés que 
présente l'extinction du feu. Les poudres métalliques sont considérées 
comme très inflammables si l'incandescence se propage dans tout l'échantillon en un temps déterminé.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le temps de combustion est exprimé en secondes.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Non spécifiées.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La substance est disposée de manière à former une bande ininter ­
rompue ou une traînée de poudre d'environ 250 mm de longueur. Un essai préliminaire est effectué afin de déterminer si, par allumage à la flamme d'un brûleur à gaz, il se produit une propagation de la 
combustion avec ou sans flamme. Si la combustion se propage sur 
une distance de plus de 200 mm en un temps déterminé, un essai complet est effectué pour déterminer la vitesse de combustion.
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Non établis.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 86
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Essai préliminaire  
La substance est disposée en bande ininterrompue ou en traînée de 
poudre d'environ 250 mm de longueur par 20 mm de largeur et 
10 mm de hauteur sur une plaque non combustible, non poreuse et 
peu thermoconductrice. La flamme chaude d'un brûleur à gaz (dia ­
mètre minimum 5 mm) est appliquée à l'une des extrémités de la traînée de poudre jusqu'à ce que celle-ci s'enflamme, ou pendant un 
maximum de 2 minutes (5 minutes pour les poudres métalliques ou 
d'alliages métalliques). Noter si la combustion se propage le long de la traînée sur une distance de 200 mm pendant une durée d'essai de 
4 minutes (40 minutes pour les poudres métalliques). Si la substance 
ne s'enflamme pas et ne propage pas la combustion, avec ou sans flamme, sur une distance de 200 mm pendant une durée d'essai de 4 minutes (ou 40 minutes), la substance n'est pas considérée comme 
très inflammable, et il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si la 
combustion de la substance se propage sur une distance de 200 mm sur la traînée de poudre en moins de 4 minutes (ou de 40 minutes pour les poudres métalliques), le mode opératoire décrit ci-dessous 
(aux points 1.6.2 et suivants) doit être suivi.
 
1.6.2.  Essai de vitesse de combustion.  
1.6.2.1.  Préparation  
Les substances poudreuses ou granuleuses sont versées en vrac dans 
un moule de 250 mm de longueur et de section transversale trian ­
gulaire dont la hauteur et la largeur intérieure sont respectivement de 10 et 20 millimètres. Disposer de part et d'autre du moule, dans le 
sens de la longueur, deux plaques métalliques destinées à jouer le 
rôle de supports latéraux. Ces plaques dépassent de 2 mm le bord supérieur de la section triangulaire transversale (voir figure). Ensuite, laisser tomber trois fois le moule d'une hauteur de 2 cm sur une 
surface dure. Rajouter de la substance s'il y a lieu. Enlever ensuite 
les plaques latérales et racler le trop-plein. Placer une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice sur le moule, retourner l'ensemble et démouler.
 
Les substances pâteuses sont étalées sur une plaque non combustible, 
non poreuse et peu thermoconductrice sous la forme d'un cordon de 
250 mm de longueur et d'environ 1 cm  2 de section transversale.  
1.6.2.2.  Conditions d'essai  
Dans le cas de substances sensibles à l'humidité, effectuer l'essai le 
plus vite possible après avoir retiré la substance de son récipient.  
1.6.2.3.  Mode opératoire  
Disposer le tas dans une hotte, perpendiculairement au sens du 
courant d'air.  
La vitesse de l'air doit suffire à empêcher la fumée de se répandre 
dans le laboratoire et ne doit pas être modifiée au cours de l'essai. Le flux d'air doit former un écran qui entoure l'appareil.
 
L'une des extrémités du tas est enflammée à l'aide de la flamme 
chaude d'un brûleur à gaz (diamètre minimal 5 mm). Lorsque le 
tas a brûlé sur une distance de 80 mm, mesurer la vitesse de combus ­
tion sur les 100 mm suivants.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 87
 
Répéter l'essai six fois, en utilisant chaque fois une plaque propre et 
froide, à moins d'observer un résultat positif avant.  
2. DONNÉES  
Le temps de combustion observé lors de l'essai préliminaire (1.6.1) et 
le temps de combustion le plus court observé au cours de l'essai 
(1.6.2.3) sont pertinents pour l'évaluation.  
3. RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),  
— une description de la substance à essayer, son état physique, y 
compris son taux d'humidité,  
— les résultats des essais préliminaires et des essais de vitesse de 
combustion, si ces derniers ont été effectués,  
— toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation 
des résultats.  
3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Les substances poudreuses, granuleuses ou pâteuses doivent être 
considérées comme très inflammables lorsque le temps de combus ­
tion observé au cours de l'un des essais effectués conformément au mode opératoire décrit au point 1.6.2 est inférieur à 45 secondes. Les 
poudres métalliques ou d'alliages métalliques doivent être considé ­
rées comme très inflammables lorsqu'elles peuvent être enflammées et que la flamme ou la zone de réaction s'étend à tout l'échantillon en 10 minutes ou moins.
 
4. RÉFÉRENCES  
(1) NF T 20-042 (septembre 1985). Produits chimiques à usage 
industriel — Détermination de l'inflammabilité des solides.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 88
 
Annexe  
Figure  
Moule et accessoires nécessaires à la confection des tas  
(toutes les dimensions sont exprimées en millimètres)
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A.11.  INFLAMMABILITÉ (GAZ)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode permet de déterminer si des gaz mélangés à l'air 
à température ambiante (20  o C environ) et à la pression atmosphé ­
rique sont inflammables et, s'ils le sont, dans quel intervalle de concentration. Des mélanges contenant des concentrations croissantes du gaz à tester dans de l'air sont exposés à une étincelle électrique et 
on observe si l'inflammation se produit.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
L'intervalle d'inflammabilité est l'intervalle de concentration entre les 
limites d'explosion supérieure et inférieure. Les limites d'explosion supérieure et inférieure sont les concentrations dans l'air du gaz 
inflammable auxquelles l'inflammation ne se propage pas.
 
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Non spécifiée.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La concentration du gaz dans l'air est augmentée graduellement et le 
mélange est exposé à une étincelle électrique à chaque étape.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Non fixés.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareil  
Le récipient d'essai est un cylindre en verre d'un diamètre intérieur 
de 50 mm au moins et d'une hauteur de 300 mm au moins, disposé 
verticalement. Les électrodes d'inflammation sont distantes l'une de 
l'autre de 3 à 5 mm et placées à 60 mm du fond du cylindre. Le cylindre est équipé d'une soupape. L'appareil doit être protégé par un blindage pour limiter les dégâts d'une explosion éventuelle.
 
La source d'inflammation est une étincelle inductive entretenue d'une 
durée de 0,5 seconde, produite par un transformateur à haute tension avec une tension de sortie de 10 à 15 kV (la puissance maximale est 
de 300 W). Un modèle d'appareil approprié est décrit dans la réfé ­
rence (2).
 
1.6.2.  Conditions d'essai  
L'essai doit avoir lieu à température ambiante (20  o C environ).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 90
 
1.6.3.  Mode opératoire  
Remplir le cylindre en verre d'un mélange air-gaz de concentration 
connue à l'aide de pompes doseuses. Faire jaillir une étincelle au travers de ce mélange et observer si une flamme se détache de la 
source d'inflammation et se propage de manière indépendante. La 
concentration du gaz est modifiée par étapes de 1 % en volume jusqu'à ce que l'inflammation décrite ci-dessus se produise.
 
Si la structure chimique du gaz laisse supposer qu'il doit être inin ­
flammable et s'il est possible de calculer la composition du mélange 
stœchiométrique avec l'air, ne soumettre à essai, par étapes de 1 %, que des mélanges dans une gamme comprise entre 10 % de moins que la composition stœchiométrique et 10 % de plus.
 
2. DONNÉES  
La propagation de la flamme constitue la seule donnée d'information 
valable pour la détermination de cette propriété.  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),  
— une description, incluant les dimensions, de l'appareil utilisé,  
— la température à laquelle l'essai a été réalisé,  
— les concentrations d'essai ainsi que les résultats obtenus,  
— le résultat de l'essai: gaz ininflammable ou très inflammable,  
— lorsque l'on conclut à l'ininflammabilité, il convient de préciser 
l'intervalle de concentration sur lequel a porté l'essai, par étapes 
de 1 %,  
— toute information et observation pertinente pour l'interprétation 
des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) NF T 20-041 (septembre 1985). Produits chimiques à usage 
industriel — Détermination de l'inflammabilité des gaz.  
(2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Re ­
deker und H.Schacke. «Entwicklung einer Standard-Apparatur 
zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127.
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A.12.  INFLAMMABILITÉ (AU CONTACT DE L'EAU)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Cette méthode d'essai peut être utilisée pour déterminer si la réaction 
d'une substance avec l'eau ou l'air humide entraîne le dégagement 
d'une quantité dangereuse d'un gaz ou de plusieurs gaz, susceptibles d'être très inflammables.
 
Elle peut être appliquée à la fois aux substances solides et liquides 
mais non aux substances qui s'enflamment spontanément au contact 
de l'air.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Très inflammables: substances qui, au contact de l'eau ou de l'air 
humide, dégagent une quantité dangereuse de gaz très inflammables 
à raison d'un débit minimal de 1 litre/kg par heure.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
L'essai de la substance comporte plusieurs phases décrites ci-après; si 
l'inflammation intervient à une quelconque de ces phases, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si on sait que la substance ne réagit pas violemment avec l'eau, procéder à la phase 4 (voir 1.3.4).
 
1.3.1.  Phase 1  
Placer la substance à tester dans un bac contenant de l'eau distillée à 
20 o C et noter si le gaz s'enflamme ou non.  
1.3.2.  Phase 2  
Placer la substance à tester sur un papier filtrant flottant sur de l'eau 
distillée à 20  o C contenue dans une capsule et noter si le gaz qui se 
dégage s'enflamme ou non. Le papier-filtre ne sert qu'à maintenir la 
substance en place, ce qui accroît les probabilités d'inflammation.  
1.3.3.  Phase 3  
Mettre la substance à tester en tas sur une hauteur de 2 cm et un 
diamètre de 3 cm environ. Ajouter quelques gouttes d'eau au tas ainsi constitué et noter si le gaz qui se dégage s'enflamme ou non.
 
1.3.4.  Phase 4  
Mélanger la substance d'essai avec de l'eau distillée a 20  o C et 
mesura le débit du gaz pendant 7 heures, à intervalles d'une heure. Si ce débit est variable ou s'il s'accroît après 7 heures, le temps de 
mesure doit être prolongé jusqu'à 5 jours au maximum. L'essai peut 
être arrêté si le débit excède 1 l/kg par heure à un moment donné.
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1.4. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Non spécifiée.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Non indiqués.  
1.4. 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES  
1.6.1.  Phase 1  
1.6.1.1.  Conditions de l'essai  
L'essai est effectué à température ambiante (20  o C, environ).  
1.6.1.2.  Mode opératoire  
Placer une petite quantité (approximativement 2 mm de diamètre) de 
la substance à tester dans un bac contenant de l'eau distillée. Noter 
si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz 
s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse.
 
1.6.2.  Phase 2  
1.6.2.1.  Appareil  
Papier-filtre flottant sur la surface de l'eau distillée dans un récipient 
approprié, par exemple une capsule de 100 mm de diamètre.  
1.6.2.2.  Conditions de l'essai  
L'essai est effectué à température ambiante (20  o C, environ).  
1.6.2.3.  Mode opératoire  
Placer une petite quantité (approximativement 2 mm de diamètre) de 
la substance à tester au centre du papier-filtre. Noter si: i) il y a 
dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse.
 
1.6.3.  Phase 3  
1.6.3.1.  Conditions de l'essai  
L'essai est effectué à température ambiante (20  o C, environ).  
1.6.3.2.  Mode opératoire  
Mettre la substance à tester en tas sur une hauteur de 2 cm et un 
diamètre de 3 cm environ en aménageant au sommet un petit cratère. Ajouter quelques gouttes d'eau dans le creux. Noter si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il 
est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors 
considérée comme substance dangereuse.
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1.6.4.  Phase 4  
1.6.4.1.  Appareil  
L'appareil est monté comme indiqué sur la figure.  
1.6.4.2.  Conditions de l'essai  
S'assurer que le récipient contenant la substance à tester est exempt 
de particules pulvérulentes (< 500 5m). Si celles-ci représentent plus 
de 1 % en poids du total, ou si l'échantillon est friable, réduire la substance en poudre avant de procéder à l'essai, afin de réduire la dimension des particules pendant le stockage et la manutention; 
sinon, la substance est utilisée telle qu'elle est reçue. L'essai doit 
être réalisé à température ambiante (20
 o C environ) et à pression 
atmosphérique.  
1.6.4.3.  Mode opératoire  
Verser de 10 à 20 ml d'eau dans l'entonnoir à robinet de l'appareil ­
lage et placer 10 g de substance dans la fiole conique. Le volume de 
gaz qui se dégage peut être mesuré par tout moyen approprié. Ouvrir le robinet de l'entonnoir pour laisser pénétrer l'eau dans la fiole conique et déclencher un chronomètre. Le dégagement gazeux est 
mesuré toutes les heures pendant sept heures. Si, pendant cette 
période, le dégagement gazeux devient irrégulier, ou si, à la fin de cette période, son débit augmente, il convient de poursuivre les mesures pendant cinq jours. Si, à un moment quelconque des 
mesures, le débit du dégagement gazeux excède 1 litre/kg par 
heure, l'essai peut être interrompu. L'essai doit être réalisé en triple.
 
Si l'identité chimique du gaz est inconnue, celui-ci doit être analysé. 
Si le gaz contient des constituants très inflammables, ou si l'on 
ignore si l'ensemble du mélange est très inflammable, préparer et 
essayer un mélange de même composition conformément à la méthode d'essai (A.11).
 
2. DONNÉES  
La substance est considérée comme dangereuse si:  
— une inflammation spontanée intervient lors d'une phase quel ­
conque du déroulement de l'essai,  
— un gaz inflammable se dégage à un débit supérieur à 1 litre/kg de 
substance par heure.  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),  
— une description détaillée de toute préparation préalable de la 
substance à essayer,  
— les résultats de l'essai (phases 1, 2, 3 et 4),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 94
 
— l'identité chimique du gaz qui se dégage,  
— le débit du dégagement gazeux, si la phase 4 (1.6.4) est effec ­
tuée,  
— le résultat de l'essai: gaz ininflammable ou très inflammable,  
— toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation 
des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) Recommandations relatives au transport des marchandises 
dangereuses. Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New 
York.  
(2) NF T 20-040 (septembre 1985), Produits chimiques à usage 
industriel. Détermination de l'inflammabilité des gaz engendrés par hydrolyse des produits solides et liquides.
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Annexe  
Figure  
Appareillage
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 96
 
A.13.  PROPRIÉTÉS PYROPHORIQUES DES SOLIDES ET DES 
LIQUIDES  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Cet essai est applicable aux substances solides et liquides, qui, en 
petite quantité, s'enflamment spontanément, peu de temps après être entrées en contact avec l'air à température ambiante (20
 o C environ).  
Les substances dont l'inflammation spontanée n'intervient qu'après 
une exposition de plusieurs heures ou de plusieurs jours à tempéra ­
ture ambiante, ou à des températures élevées, ne sont pas couvertes 
par cette méthode d'essai.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Les substances sont considérées comme ayant des propriétés pyro ­
phores si elles s'enflamment ou causent la carbonisation dans les 
conditions décrites au point 1.6.  
L'auto-inflammabilité des liquides peut également exiger d'être 
évaluée selon la méthode A.15 (température d'inflammation spon ­
tanée des liquides et des gaz).  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Non spécifiées.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La substance, solide ou liquide, est ajoutée à un porteur inerte et 
mise en contact avec l'air à température ambiante pendant une 
période de cinq minutes. Si les substances liquides ne s'enflamment 
pas, elles sont absorbées sur un papier-filtre qui est exposé à l'air, à température ambiante (20
 o C environ), pendant cinq minutes. Si la 
substance, solide ou liquide, enflamme ou carbonise un papier-filtre, 
elle est considérée comme pyrophorique.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Répétabilité: en raison de l'importance que revêt l'aspect «sécurité», 
un seul résultat positif est suffisant pour conclure que la substance 
est très inflammable.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Appareillage  
Remplir une capsule de porcelaine de 10 cm de diamètre environ de 
terre d'infusoires, sur une épaisseur de 5 mm environ, à température 
ambiante (20  o C environ).  
Remarque:  
La terre d'infusoires, ou toute autre substance inerte comparable 
généralement disponible, sera prise comme représentative du sol 
sur lequel la substance pourra être accidentellement répandue.  
Les essais concernant les liquides qui ne s'enflamment pas au contact 
de l'air lorsqu'ils sont en contact avec un porteur inerte seront effec ­
tués avec un papier-filtre sec.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 97
 
1.6.2.  Réalisation de l'essai  
a) Solides pulvérulents  
Verser 1 ou 2 cm  3 de substance pulvérulente à tester, d'une hauteur 
d'environ 1 m sur une surface non combustible et observer si la 
substance s'enflamme pendant la chute ou pendant les cinq premières 
minutes de tassement.  
L'essai est répété six fois, à moins qu'une inflammation ne survienne.  
b) Liquides  
Verser environ 5 cm  3 de liquide à essayer dans une capsule de 
porcelaine préparée et observer si la substance s'enflamme dans les 
cinq minutes.  
S'il ne survient pas d'inflammation au cours de six essais, effectuer 
l'essai suivant:  
Déposer à l'aide d'une seringue 0,5 ml de l'échantillon à essayer sur 
un papier-filtre à cet usage et observer si le papier-filtre s'enflamme ou se carbonise dans les cinq minutes qui suivent le dépôt du liquide. 
L'essai est effectué trois fois, à moins qu'une inflammation ou une 
carbonisation ne survienne.
 
2. DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
L'essai peut être interrompu dès que l'un des essais donne un résultat 
positif.  
2.2. ÉVALUATION  
Si la substance s'enflamme dans les cinq minutes après avoir été 
ajoutée à un porteur inerte et exposée à l'air, ou si un liquide carbo ­
nise ou enflamme un papier-filtre dans les cinq minutes après avoir été déposé sur ce dernier et exposé à l'air, il est considéré comme pyrophore.
 
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),  
— les résultats de l'essai,  
— toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation 
des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) NF T 20-039 (septembre 1985), Produits chimiques à usage 
industriel — Détermination de l'inflammabilité spontanée des 
solides et liquides.  
(2) Recommandations relatives au transport des marchandises 
dangereuses — Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New York.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 98
 
A.14.  DANGER D'EXPLOSION  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Cette méthode permet de déterminer si une substance solide ou 
pâteuse présente un danger d'explosion lorsqu'elle est soumise à 
l'effet d'une flamme (sensibilité thermique), à un choc ou à une friction (sensibilité aux stimulations mécaniques), et si une substance liquide présente un danger d'explosion lorsqu'il est soumis à l'effet 
d'une flamme ou d'un choc.
 
La méthode comprend trois parties:  
a) un essai de sensibilité thermique (1),  
b) un essai de sensibilité mécanique (choc) (1),  
c) un essai de sensibilité mécanique (friction) (1).  
La méthode fournit des données permettant d'évaluer la probabilité 
d'amorcer une explosion par certaines stimulations ordinaires. Elle 
n'a pas pour objet d'affirmer qu'une substance n'est pas susceptible 
d'exploser dans certaines conditions.  
La méthode est apte à déterminer si une substance présentera un 
danger d'explosion (sensibilité thermique et mécanique) dans les 
conditions particulières définies par la directive. Elle repose sur un certain nombre de types d'appareils qui sont largement utilisés sur le plan international (1) et qui donnent en règle générale des résultats 
probants. Il est cependant admis qu'elle n'a pas une valeur définitive. 
D'autres appareils que ceux qui sont mentionnés peuvent être utilisés, à condition qu'ils soient reconnus à l'échelle internationale et que les résultats puissent être mis en corrélation avec les résultats obtenus 
avec les appareils spécifiés.
 
Il n'est pas nécessaire d'effectuer les essais lorsque les informations 
disponibles, d'ordre thermodynamique (par exemple: chaleur de 
formation, chaleur de décomposition) ou structural (absence de 
certains groupes réactifs (2) dans la formule développée), montrent que la substance n'est, sans aucun doute, pas susceptible de se décomposer rapidement en libérant des gaz ou de la chaleur (à 
savoir, que ce matériau ne présente aucun risque d'explosion). Il 
est inutile de réaliser un essai de sensibilité mécanique à la friction pour les liquides.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Substances explosibles:  
substances qui sont susceptibles d'exploser sous l'effet d'une flamme, 
ou qui sont sensibles au choc ou à la friction dans l'appareil spécifié (ou dont la sensibilité mécanique est supérieure à celle du 1,3-dini ­
trobenzène dans un autre appareil).
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
1,3-dinitrobenzène, produit technique cristallisé, tamisé (qui passe au 
travers d'une maille de 0,5 mm) pour la méthode d'essai par friction 
et par choc.  
Perhydro-l,3,5,-trinitro-l,3,5-triazine (RDX, hexogène, cyclonite — 
CAS 121-82-4), recristallisé à partir d'une solution aqueuse de cyclo ­
hexanone, tamisé mouillé au travers d'une maille de 250 μm et 
retenu par une maille de 150 μm) puis séché à 103 ± 2  o C (pendant 
4 heures) pour la seconde série d'essais par friction et par choc.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 99
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Des essais préliminaires sont nécessaires pour établir les condi ­
tions de sécurité devant présider à l'exécution des trois essais de sensibilité.
 
1.4.1.  Essais de sécurité de manipulation (3)  
Pour des raisons de sécurité, avant d'effectuer les essais proprement 
dits, des échantillons très réduits (10 mg environ) de substance sont soumis à échauffement sans confinement dans la flamme d'un 
brûleur à gaz, à un choc dans toute forme appropriée d'appareil, et 
à friction en utilisant un maillet et une enclume ou tout autre type de dispositif à friction. Ces essais ont pour objectif de déterminer si la substance est sensible et explosible au point de devoir s'entourer de 
précautions particulières pour réaliser les essais de sensibilité pres ­
crits, notamment les essais de sensibilité thermique, afin d'éviter tout dommage corporel pour l'expérimentateur.
 
1.4.2.  Sensibilité thermique  
Cette méthode consiste à chauffer la substance dans un tube d'acier, 
fermé par des plaques à orifice dont le trou peut avoir différents diamètres, pour déterminer si la substance ou la préparation est susceptible d'exploser dans des conditions de température très 
élevée et de confinement défini.
 
1.4.3.  Sensibilité mécanique (choc)  
Cette méthode consiste à soumettre la substance au choc d'une masse 
spécifiée tombant d'une hauteur définie.  
1.4.4.  Sensibilité mécanique (friction)  
La méthode consiste à soumettre des substances solides ou pâteuses 
à une friction entre des surfaces standard dans des conditions spéci ­
fiées de charge et de mouvement relatif.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Non indiqués.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Sensibilité thermique (effet d'une flamme)  
1.6.1.1.  Appareil  
L'appareil consiste en un tube d'acier non réutilisable et de son 
système de fermeture réutilisable (figure 1), installé dans un 
dispositif de chauffage et de protection. Chaque tube, d'un diamètre interne de 24 mm, d'une longueur de 75 mm et d'une épaisseur de paroi de 0,5 mm, est réalisé par un processus d'emboutissage profond 
à partir d'une tôle (voir appendice). Les tubes sont pourvus d'une 
bride de fermeture à leur extrémité ouverte afin de pouvoir les fermer par une plaque à orifice. Il s'agit d'une plaque solidement assujettie au tube par un joint fileté en deux parties (écrou et écrou borgne), 
résistante à la pression et munie d'un orifice central. L'écrou et 
l'écrou borgne sont en acier au chrome-manganèse (voir annexe) ne produisant aucune étincelle jusqu'à 800
 o C. Les plaques ont une 
épaisseur de 6 mm et sont fabriquées avec un acier résistant à la 
chaleur (voir annexe). L'expérimentateur dispose d'une série de 
plaques dont l'orifice présente différents diamètres.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 100
 
1.6.1.2.  Conditions de l'essai  
L'essai est normalement réalisé avec la substance telle qu'elle est 
reçue; toutefois, dans certains cas, par exemple si elle est comprimée, coulée ou condensée d'une manière quelconque, il peut être néces ­
saire de la désagréger avant de procéder à l'essai.
 
Pour les solides, la masse de matériel à utiliser pour chaque essai est 
déterminée par une opération préliminaire à deux étapes. Placer un volume de substance de 9 cm
 3 dans un tube taré, puis tasser en 
appliquant une force de 80 N sur toute la surface de la section du 
tube. D'autres méthodes de remplissage doivent parfois être utilisées 
pour des raisons de sécurité ou lorsque l'état physique de l'échan ­
tillon peut être modifié par la compression; par exemple, si la subs ­
tance est très sensible à la friction, il ne faut pas tasser. Si le matériel 
est compressible, en rajouter et tasser jusqu'à ce que le tube soit 
rempli jusqu'à 55 mm du bord. Déterminer la masse totale utilisée pour remplir le tube jusqu'à ce niveau, puis ajouter de la substance encore deux fois, en tassant à chaque fois avec une force de 80 N. 
Ensuite, rajouter du matériel et tasser, ou en enlever, de manière à ce 
que le tube soit rempli jusqu'à 15 mm du bord. Effectuer une seconde opération préliminaire en commençant avec une quantité tassée correspondant au tiers de la masse totale déterminée lors de 
l'opération précédente. Ajouter deux fois de la substance en tassant 
avec une force de 80 N et ajuster le niveau à 15 mm du bord du tube en ajoutant du matériel ou en enlevant. La quantité de produit solide déterminée lors de cette seconde opération est utilisée pour chaque 
essai; le remplissage est effectué en trois fois avec des quantités 
égales de substance comprimées afin que leur volume soit de 9 cm
 3 , quelle que soit la force nécessaire pour y parvenir. (Cette 
opération peut être facilitée par l'emploi d'anneaux d'espacement.)  
Les liquides et les gels sont versés dans le tube jusqu'à une hauteur 
de 60 mm, en prenant soin d'éviter la formation de bulles d'air avec 
les gels. L'écrou borgne est glissé sur le tube par le bas, la plaque à orifice appropriée est insérée et l'écrou est serré après qu'a été appliqué un lubrifiant à base de bisulfite de molybdène. Il est impor ­
tant de vérifier qu'aucune substance n'est emprisonnée entre la bride 
et la plaque, ni dans les filetages.
 
Le chauffage est assuré par du propane venant d'une bouteille indus ­
trielle, équipée d'un régulateur de pression (60 à 70 mbar), grâce à un débitmètre, et distribué régulièrement (ce que l'on vérifie en observant les flammes des brûleurs) par un collecteur à quatre 
brûleurs. Les brûleurs sont situés autour de la chambre d'essai, 
comme indiqué à la figure 1. Les quatre brûleurs consomment ensemble 3,2 litres de propane par minute, environ. Il est possible d'utiliser d'autres gaz de chauffage et d'autres brûleurs, mais la 
vitesse de chauffage doit correspondre à celle qui est spécifiée à la 
figure 3. Pour tous les appareils, la vitesse de chauffage doit être vérifiée régulièrement en utilisant des tubes remplis de phtalate de dibutyle, comme indiqué à la figure 3.
 
1.6.1.3.  Déroulement des essais  
Chaque essai est poursuivi jusqu'à ce que le tube se soit fragmenté 
ou que le tube ait été chauffé pendant cinq minutes. Un essai abou ­
tissant à la fragmentation du tube en trois parties, ou plus, qui 
peuvent parfois être reliées l'une à l'autre par d'étroites bandes de métal, comme l'illustre la figure 2, est considéré comme produisant une explosion. Un essai aboutissant à un plus petit nombre de frag ­
ments ou à une absence de fragmentation, est considéré comme ne 
produisant pas d'explosion.
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Une série de trois essais est d'abord effectuée avec une plaque dont 
l'orifice a un diamètre de 6,0 mm et, si aucune explosion ne se 
produit, une seconde série de trois essais est réalisée avec une plaque dont l'orifice a un diamètre de 2,0 mm. S'il se produit une explosion au cours de l'une des séries d'essais, aucun essai supplé ­
mentaire n'est requis.
 
1.6.1.4.  Évaluation  
Le résultat de l'essai est considéré comme positif s'il se produit une 
explosion au cours de l'une des séries d'essais mentionnées ci-avant.  
1.6.2.  Sensibilité mécanique (choc)  
1.6.2.1.  Appareil (figure 4)  
Le mouton de choc classique comprend essentiellement: un bloc de 
fonte avec une embase, une enclume, une colonne, des guides, des masses tombantes, un mécanisme de libération et un support pour 
l'échantillon. L'enclume d'acier (100 mm de diamètre × 70 mm de 
hauteur) est vissée sur un bloc d'acier (230 mm de longueur × 250 mm de largeur × 200 mm de hauteur) avec une embase coulée (450 mm de longueur × 450 mm de largeur × 60 mm de 
hauteur). Une colonne, qui consiste en un tube d'acier étiré sans 
soudure, est fixée dans un support vissé au dos du bloc d'acier. Quatre vis ancrent l'appareil dans un bloc de béton (60 × 60 × 60 cm) de telle sorte que les rails soient absolument verticaux et 
que la chute de la masse tombante ne soit pas entravée. L'expéri ­
mentateur dispose de masses de 5 et 10 kg, en acier trempé et dont la surface d'impact, d'un diamètre minimal de 25 mm, est en acier traité HRC 60 à 63.
 
L'échantillon à essayer est enfermé dans une matrice de choc consti ­
tuée de deux cylindres coaxiaux en acier trempé, placés l'un au dessus de l'autre dans un cylindre d'acier creux faisant office de 
bague de guidage. Les cylindres d'acier trempé doivent avoir un 
diamètre de 10 (- 0,003, - 0,005) mm et une hauteur de 10 mm, des surfaces polies, des arêtes arrondies (rayon de courbure 0,5 mm) et une dureté de HRC 58 à 65. Le cylindre creux doit avoir un 
diamètre extérieur de 16 mm, un alésage de 10 (+ 0,005, + 0,010) 
mm et une hauteur de 13 mm. La matrice de choc est placée sur une enclume intermédiaire (26 mm de diamètre et 26 mm de hauteur) en acier, centrée par une bague munie de perforations permettant aux 
vapeurs de s'échapper.
 
1.6.2.2.  Conditions de l'essai  
L'échantillon doit avoir un volume de 40 mm  3 , ou un volume 
compatible avec l'appareil utilisé. Les substances solides doivent être essayées à l'état sec et préparées comme suit:
 
a) les substances pulvérulentes sont tamisées (maille de 0,5 mm); la 
fraction séparée par tamisage est entièrement utilisée pour l'essai;  
b) les substances comprimées, coulées ou condensées sont désagré ­
gées et tamisées; la fraction de 0,5 à 1 mm de diamètre séparée par tamisage est utilisée pour l'essai et doit être représentative de la substance originale.
 
Les substances sous forme de pâte doivent être essayées à l'état sec 
si c'est possible, ou, en tout cas, après avoir enlevé la plus grande quantité possible de diluant. Pour ce qui est des substances liquides, 
l'essai est réalisé avec un intervalle de 1 mm entre le cylindre d'acier 
du haut et celui du bas.
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1.6.2.3.  Déroulement des essais  
On effectue une série de six essais en faisant tomber une masse de 
10 kg d'une hauteur de 0,40 m (40 J). S'il se produit une explosion au cours des six essais effectués à 40 J, une autre série de six essais 
doit être effectuée en faisant tomber une masse de 5 kg d'une hauteur 
de 0,15 m (7,5 J). Dans d'autres appareils, l'échantillon est comparé avec la substance de référence choisie selon la procédure établie (technique du «up-and-down», etc.).
 
1.6.2.4.  Évaluation  
Le résultat de l'essai est considéré comme positif si une explosion 
(l'inflammation ou un bruit intense équivaut à une explosion) se produit au moins une fois au cours des six essais réalisés avec 
l'appareil de choc indiqué ou si l'échantillon est plus sensible que 
le 1,3-dinitrobenzène ou le RDX lors d'un autre essai par choc.
 
1.6.3.  Sensibilité mécanique (friction)  
1.6.3.1.  Appareil (figure 5)  
L'appareil consiste en une plaque de base en fonte sur laquelle est 
monté le dispositif de friction proprement dit comprenant un crayon fixe en porcelaine et une plaquette mobile en porcelaine. La 
plaquette est fixée dans un coulisseau se déplaçant entre deux 
rails. Le coulisseau est relié par une barre d'entraînement et un engrenage de transmission excentrique à un moteur électrique, de telle sorte que la plaquette se déplace une fois seulement sur une 
distance de 10 mm, en arrière et en avant sous le crayon. Le crayon 
peut être chargé, par exemple, à 120 ou 360 newtons.
 
Les plaquettes de porcelaine plates sont en porcelaine blanche tech ­
nique (rugosité de 9 à 32 μm) et ont les dimensions suivantes: 
25 mm de longueur, 25 mm de largeur et 5 mm de hauteur. Le crayon cylindrique qui est également en porcelaine blanche technique (longueur 15 mm, diamètre 10 mm), présente des extrémités sphé ­
riques rugueuses dont le rayon de courbure est de 10 mm.
 
1.6.3.2.  Conditions de l'essai  
L'échantillon doit avoir un volume de 10 mm  3 , ou un volume 
compatible avec l'appareil utilisé.  
Les substances solides sont essayées à l'état sec et préparées 
comme suit:  
a) les substances pulvérulentes sont tamisées (maille de 0,5 mm); la 
fraction séparée par tamisage est entièrement utilisée pour l'essai;  
b) les substances comprimées, coulées ou condensées sont désagré ­
gées et tamisées; la fraction tamisée d'un diamètre inférieur à 0,5 mm est utilisée pour l'essai.
 
Les substances sous forme de pâte doivent être essayées à l'état sec 
si possible. Si la substance ne peut pas être préparée à l'état sec, la pâte (après avoir enlevé la plus grande quantité possible de diluent) 
est essayée sous la forme d'un film de 0,5 mm d'épaisseur, 2 mm de 
largeur et 10 mm de longueur préparé à l'aide d'un gabarit.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 103
 
1.6.3.3.  Déroulement des essais  
Placer le crayon de porcelaine sur l'échantillon soumis à essai et 
accrocher le poids. Lors de la réalisation de l'essai, les marques laissées par l'éponge sur la plaquette de porcelaine doivent être trans ­
versales par rapport à la direction du mouvement. Veiller à ce que le 
crayon repose sur l'échantillon, à ce que la quantité de substance essayée soit suffisante et à ce que la plaquette se déplace correcte ­
ment sous le crayon. Les substances pâteuses seront appliquées sur le 
plateau à l'aide d'une gabarit de 0,5 mm d'épaisseur avec une rainure 
de 2 × 10 mm. La plaquette de porcelaine accomplit sous le crayon un mouvement de va-et-vient sur une distance de 10 mm dans 
chaque direction en 0,44 secondes. N'utiliser chaque partie de la 
surface de la plaquette et du crayon que pour un seul essai; les deux extrémités de chaque crayon serviront pour deux essais et les deux surfaces de la plaquette pour trois essais.
 
Une série de six essais est effectuée avec une charge de 360 N. Si un 
résultat positif survient au cours de ces six essais, il convient d'ef ­
fectuer une autre série de six essais avec une charge de 120 N. Dans 
d'autres appareils, l'échantillon est comparé avec la substance de référence choisie en suivant un mode opératoire établi (technique «up-and-down», etc.).
 
1.6.3.4.  Évaluation  
Le résultat de l'essai est considéré comme positif s'il se produit au 
moins une explosion (un crépitement, un bruit intense ou une inflam ­
mation sont équivalents à une explosion) au cours de l'un des essais 
réalisés avec l'appareil de friction indiqué ou s'il satisfait aux critères équivalents pour un autre essai de friction.
 
2. DONNÉES  
En principe, une substance est considérée comme présentant un 
risque d'explosion dans le sens de la directive dés qu'un résultat est positif lors des essais de sensibilité thermique, au choc ou à la friction.
 
3. RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— l'identité, la composition, la pureté, le contenu en humidité, etc., 
de la substance soumise à essai,  
— la forme physique de l'échantillon; préciser s'il a été désagrégé, 
cassé ou tamisé,  
— les observations relevées au cours des essais de sensibilité ther ­
mique (par exemple masse de l'échantillon, nombre de fragments, etc.),
 
— les observations relevées au cours des essais de sensibilité méca ­
nique (par exemple formation d'une quantité considérable de fumée ou décomposition complète sans bruit intense, flammes, 
étincelles, crépitation, etc.),
 
— les résultats de chaque type d'essai,  
— si un autre appareil a été utilisé, fournir une justification scien ­
tifique ainsi que la preuve de la corrélation entre les résultats 
obtenus avec l'appareil spécifié et les résultats obtenus avec l'ap ­
pareil utilisé,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 104
 
— tout commentaire utile, se référant notamment aux essais prati ­
qués avec des produits similaires, susceptible d'être pertinent 
pour une interprétation correcte des résultats,  
— toutes observations supplémentaires pertinentes pour l'interpréta ­
tion des résultats.  
3.2. INTERPRÉTATION ET ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Le rapport d'essai doit mentionner tous les résultats considérés 
comme erronés, anormaux, ou non représentatifs. Lorsqu'un des 
résultats est rejeté, fournir une explication et indiquer les résultats 
de tout essai substitutif ou supplémentaire. À moins de pouvoir expliquer un résultat anormal, celui-ci doit être accepté tel quel et utilisé pour classer la substance en conséquence.
 
4. RÉFÉRENCES  
(1) Recommandations relatives au transport des marchandises 
dangereuses, Épreuves et critères, 1990, Nations unies, 
New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. und Swart, K.H. Explosive Stoffe, 1961, 
vol.3, 6-13 and 30-42.  
(4) NFT 20-038 (septembre 1985). Produits chimiques à usage 
industriel — Détermination du danger d'explosion.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 105
 
Annexe  
Exemple de spécification de matériel pour les essais de sensibilité thermique 
(voir norme DIN 1623)  
(1) Tube: Spécification de matériel N  o 1.0336.505 g  
(2) Plaque à orifice: Spécification de matériel N  o 1.4873  
(3) Écrou et écrou borgne: Spécification de matériel N  o 1.3817  
Figure 1  
Appareil d'essai de sensibilité thermique  
(dimensions en mm)
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 106
 
Figure 2  
Essai de sensibilité thermique  
Exemples de fragmentation
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 107
 
Figure 3  
Étalonnage de la vitesse d'échauffement pour essai de sensibilité thermique TEMPS (s)
  
Courbe de température en fonction du temps obtenue en chauffant du phtalate de dibutyle 
(27 cm  3 ) dans un tube fermé (plaque à orifice de 1,5 mm) au moyen d'un débit de propane de 
3,2 litres/minute. La température est mesurée à l'aide d'un thermocouple chromel/alumel gainé 
d'acier inoxydable de 1 mm de diamètre, placé en position centrale, 43 mm sous le bord du tube. Entre 135
 o C et 285  o C, la vitesse d'échauffement doit se situer entre 185 et 
215 K/minute.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 108
 
Figure 4  
Appareil d'essai de sensibilité au choc  
(dimensions en mm)
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 109
 
Figure 4  
suite
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 110
 
Figure 5  
Appareil d'essai de sensibilité à la friction
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 111
 
A.15.  TEMPÉRATURE D'INFLAMMATION SPONTANÉE DES 
LIQUIDES ET DES GAZ  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Les substances explosives qui s'enflamment spontanément au contact 
de l'air à température ambiante ne doivent pas être soumises à cet essai. Le mode opératoire est applicable aux gaz, aux liquides et aux vapeurs qui peuvent être enflammés par une surface chaude, en 
présence d'air.
 
La température d'inflammation spontanée peut être réduite considé ­
rablement par la présence d'impuretés catalytiques, par la matière de 
la surface ou par une augmentation du volume du récipient d'essai.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le degré d'inflammabilité spontanée est exprimé en termes de tempé ­
rature d'inflammation spontanée. La température d'inflammation spontanée est la température la plus basse à laquelle s'enflamme la 
substance à essayer mélangée avec de l'air dans les conditions défi ­
nies dans la méthode d'essai.
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Les substances de références sont citées dans les normes (voir 1.6.3). 
Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la 
fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats 
obtenus avec différentes méthodes.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La méthode permet de déterminer la température minimale de la 
surface interne d'une enceinte qui provoquera l'inflammation d'un 
gaz, d'une vapeur ou d'un liquide injecté dans l'enceinte.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
La répétabilité varie en fonction de l'intervalle de température d'in ­
flammation spontanée et de la méthode d'essai utilisée.  
La sensibilité et la spécificité dépendent de la méthode d'essai 
utilisée.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareil  
L'appareil est décrit dans la méthode évoquée au point 1.6.3.  
1.6.2.  Conditions de l'essai  
Un échantillon de la substance à essayer est essayé selon le 
point 1.6.3.  
1.6.3.  Mode opératoire  
Voir normes IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF 
T 20-037.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 112
 
2. DONNÉES  
Noter la température d'essai, la pression atmosphérique, la quantité 
d'échantillon utilisée et le laps de temps qui s'écoule avant que l'inflammation se produise.
 
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— les spécifications précises de la substance (identité et impuretés),  
— la quantité d'échantillon utilisée, la pression atmosphérique,  
— l'appareil utilisé,  
— les résultats des mesures (température d'essai, résultats concer ­
nant l'inflammation, laps de temps correspondants),  
— toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation 
des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
Aucune.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 113
 
A.16.  TEMPÉRATURE RELATIVE D'INFLAMMATION SPON ­
TANÉE POUR LES SOLIDES  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Les substances explosibles et les substances qui s'enflamment spon ­
tanément au contact de l'air à température ambiante ne doivent pas être soumises à cet essai.
 
L'objectif en est de fournir des données préliminaires sur l'inflam ­
mabilité spontanée des substances solides soumises à de hautes 
températures.  
Si la chaleur engendrée, soit par une réaction de la substance avec 
l'oxygène, soit par décomposition exothermique, ne se dissipe pas assez rapidement dans l'environnement, l'auto-échauffement entraîne l'inflammation spontanée. L'inflammation spontanée se produit par 
conséquent lorsque la vitesse de production de chaleur excède la 
vitesse de perte de chaleur.
 
Le procédé d'essai est utile en tant que test préliminaire de sélection 
des substances solides. Compte tenu de la nature complexe de l'in ­
flammation et de la combustion des solides, la température d'inflam ­
mation spontanée déterminée selon cette méthode d'essai ne doit 
servir qu'à des fins de comparaison.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La température d'inflammation spontanée telle qu'elle est déterminée 
par cette méthode est la température ambiante minimale exprimée en degrés Celsius (
 o C), à laquelle un certain volume d'une substance 
s'enflamme spontanément dans des conditions définies.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Aucune.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Placer un volume défini de la substance soumise à essai dans un four 
à température ambiante; enregistrer la courbe température/temps au 
centre de l'échantillon, la température du four étant portée à 400  o C, 
ou à la température du point de fusion si celle-ci est inférieure, à la vitesse de 0,5
 o C/mn. Pour les besoins de cet essai, la température du 
four à laquelle l'échantillon atteint une température de 400  o C par 
auto-échauffement est appelée température d'inflammation spontanée.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Aucun.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareil  
1.6.1.1.  Four  
Un four de laboratoire à température programmable (d'un volume de 
2 litres environ) équipé d'une circulation d'air naturel et d'un clapet d'explosion. Pour éviter tout risque potentiel d'explosion, il convient 
d'empêcher que les gaz de décomposition puissent entrer en contact 
avec les éléments de chauffage électrique.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 114
 
1.6.1.2.  Cube en treillis de fil métallique  
Couper un morceau de treillis en fil d'acier inoxydable d'une maille 
d'une taille de 0,045 mm, selon le modèle indiqué à la figure 1. Plier le treillis et l'attacher avec du fil métallique en forme de cube ouvert.
 
1.6.1.3.  Thermocouples  
Thermocouples appropriés.  
1.6.1.4.  Enregistreur  
Tout enregistreur à deux canaux, étalonné à l'intervalle 0 — 600  o C 
ou à une tension correspondante.  
1.6.2.  Conditions de l'essai  
Les substances sont testées telles qu'elles sont reçues.  
1.6.3.  Mode opératoire  
Remplir le cube de la substance soumise à essai. Tasser doucement 
en ajoutant de la substance jusqu'à le remplir complètement. 
Suspendre ensuite le cube au centre du four à température ambiante. Placer un thermocouple au centre du cube et l'autre entre le cube et la paroi du four afin d'enregistrer la température du four.
 
Les températures du four et de l'échantillon sont enregistrées en 
continu pendant que la température du four est portée à 400  o C, 
ou au point de fusion si cette valeur est plus basse, à une vitesse 
de 0,5  o C/min.  
Lorsque la substance s'enflamme, le thermocouple de l'échantillon 
indiquera une très forte montée de température par rapport à la 
température du four.  
2. DONNÉES  
La température du four à laquelle la température de l'échantillon 
atteint 400  o C par auto-échauffement est pertinente pour l'évaluation 
(voir figure 2).  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— une description de la substance à essayer,  
— les résultats des mesures incluant la courbe température/temps,  
— toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation 
des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) NF T 20-036 (septembre 1985). Produits chimiques à usage 
industriel — Détermination de la température relative d'inflam ­
mation spontanée des solides.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 115
 
Figure 1  
Modèle de cube d'essai de 20 mm
  
Figure 2  
Courbe type température/temps
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 116
 
A.17.  PROPRIÉTÉS COMBURANTES (SOLIDES)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les propriétés 
explosives éventuelles de la substance avant d'effectuer cet essai.  
Cet essai n'est pas applicable aux liquides, aux gaz, aux substances 
explosives ou très inflammables ou aux peroxydes organiques.  
Cet essai est inadapté quand l'examen de la structure chimique 
montre que la substance ne peut sans aucun doute avoir de réaction de type exothermique avec un combustible.
 
Un essai préliminaire doit être effectué pour s'assurer que cet essai 
ne nécessite pas de précautions particulières.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Temps de combustion: temps de réaction, exprimé en secondes, pris 
par la zone de réaction pour se propager à travers un tas, selon la procédure décrite au point 1.6.
 
Vitesse de combustion: exprimée en millimètres par seconde.  
Vitesse maximale de combustion: valeur la plus élevée parmi les 
vitesses de combustion obtenues avec des mélanges contenant 10 à 90 % en poids de comburant.
 
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Le nitrate de barium (de pureté analytique) est utilisé comme subs ­
tance de référence pour l'essai et l'essai préliminaire.  
Le mélange de référence est composé de nitrate de barium et de 
cellulose en poudre, préparé conformément au point 1.6 et possédant la vitesse de combustion maximale (il s'agit généralement d'un 
mélange contenant 60 % de nitrate de barium en poids).
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Il convient, pour des raisons de sécurité, d'effectuer un essai préli ­
minaire. Il est inutile de continuer l'essai si l'essai préliminaire montre clairement que la substance a des propriétés oxydantes. 
Lorsque ce n'est pas le cas, la substance est soumise à l'essai 
complet.
 
Dans l'essai complet, la substance à essayer et une substance 
combustible définie sont mélangées dans des proportions variables. 
Chacun de ces mélanges est alors disposé en tas, que l'on enflamme 
à une extrémité. La vitesse maximale de combustion est comparée à la vitesse maximale de combustion du mélange de référence.
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Lorsqu'elle est requise, toute méthode de broyage et de mélange 
est valable pour autant que l'écart entre la vitesse maximale de 
combustion et la moyenne arithmétique, dans les six essais, ne 
dépasse pas 10 %.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 117
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Préparation  
1.6.1.1.  Substance à essayer  
L'échantillon à essayer est traité comme suit afin d'obtenir une granu ­
lométrie inférieure à 0,125 mm: tamiser la substance à essayer et 
broyer la fraction restante; répéter cette opération jusqu'à ce que tout l'échantillon soit passé au travers du tamis.
 
Toutes méthodes de broyage et de tamisage respectant les critères de 
qualité requis peuvent être utilisées.  
Avant de préparer le mélange, sécher la substance à 105  o C jusqu'à 
obtention d'un poids constant. Si la température de décomposition de 
la substance est inférieure à 105  o C, la substance doit être séchée à 
une température moins élevée.  
1.6.1.2.  Substance combustible  
On utilise de la cellulose en poudre comme substance combustible. 
Elle doit être du type utilisé en chromatographie en couche mince ou 
en colonne. Un type de cellulose dont la longueur de plus de 85 % 
des fibres est comprise entre 0,020 mm et 0,075 mm s'est avérée adéquate. La poudre de cellulose est tamisée au moyen d'un tamis à mailles de 0,125 mm. Il faut utiliser le même lot de cellulose pour 
tout l'essai.
 
Avant de préparer le mélange, sécher la poudre de cellulose à 105  o C 
jusqu'à ce que son poids soit constant.  
Si de la sciure de bois est utilisée lors de l'essai préliminaire, 
préparer une sciure de bois tendre qui passe au travers d'un tamis d'une maille de 1,6 mm, mélanger, puis sécher à 105
 o C pendant 4 
heures en couche de moins de 25 mm d'épaisseur. Refroidir la sciure 
et la conserver jusqu'à utilisation dans un récipient hermétique aussi 
rempli que possible. Elle sera de préférence utilisée dans les 24 heures après séchage.
 
1.6.1.3.  Source d'allumage  
Utiliser la flamme d'un brûleur à gaz (diamètre; 5 mm minimum). Si 
une autre source d'allumage est utilisée (par exemple lorsque l'essai 
est effectué dans une atmosphère inerte), fournir la description et la justification.
 
1.6.2.  Mode opératoire  
Note:  
Les mélanges de comburants avec de la cellulose ou de la sciure de 
bois doivent être considérés comme des explosifs potentiels et mani ­
pulés avec prudence.  
1.6.2.1.  Essai préliminaire  
La substance séchée est grossièrement mélangée à de la cellulose ou 
à de la sciure de bois sèche dans des proportions de 2 (substance à 
essayer) pour 1 (cellulose ou sciure de bois) en poids et le mélange est disposé en petit tas conique de 3,5 cm (diamètre de base) × 2,5 cm (hauteur) par remplissage sans tassement d'une forme 
conique (par exemple un entonnoir de laboratoire en verre dont le 
tube est bouché).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 118
 
Le tas est placé sur une plaque froide, non-combustible, non poreuse, 
et peu thermo-conductrice. L'essai doit être conduit dans une hotte 
aspirante (voir point 1.6.2.2).  
La source d'allumage est mise en contact avec le cône. L'intensité et 
la durée de la réaction sont observées et enregistrées.  
La substance doit être considérée comme comburante si la réaction 
est intense.  
Lorsqu'il y a doute quant au résultat, il est nécessaire de pratiquer 
l'essai complet décrit ci-après.  
1.6.2.2.  Essai complet  
Préparer des mélanges oxydant/cellulose contenant de 10 à 90 % de 
comburant, en poids, par incréments de 10 %. Pour les cas limites 
utiliser des mélanges comburant/cellulose intermédiaires pour déter ­
miner la vitesse maximale de combustion avec plus de précision.  
On réalise un tas au moyen d'un moule métallique d'une longueur de 
250 mm et dont la section triangulaire transversale a une hauteur 
intérieure de 10 mm et une largeur intérieure de 20 mm. Placer comme cadres latéraux des deux côtés du moule, dans le sens de la longueur, deux plaques métalliques dépassant de 2 mm le bord 
supérieur de la section triangulaire (figure). Remplir ce dispositif 
avec un excès de mélange, sans tasser. Après avoir laissé tomber le moule une fois d'une hauteur de 2 cm sur une surface dure, racler l'excès avec une raclette tenue obliquement. Enlever alors les cadres 
latéraux et égaliser la surface de la poudre à l'aide d'un rouleau. 
Disposer une plaque non-combustible non-poreuse et peu thermo- conductrice sur le moule, retourner et démouler.
 
Disposer le tas dans une hotte perpendiculairement au sens de 
courant d'air.  
Le débit d'air doit être suffisant pour empêcher les vapeurs de se 
répandre dans le laboratoire et il ne doit pas subir de modification au cours de l'essai. Le courant d'air doit former un écran entourant 
l'appareil.
 
Vu les propriétés hygroscopiques de la cellulose et de certaines 
substances à essayer, l'essai doit être effectué aussi rapidement que possible.
 
Enflammer une extrémité du tas par contact avec la flamme.  
Mesurer le temps de réaction sur une distance de 200 mm après que 
la zone de réaction a parcouru une distance initiale de 30 mm.  
L'essai est effectué avec la substance de référence et au moins une 
fois avec chacun des mélanges de substance à essayer et de cellulose.  
Si l'on trouve une vitesse maximale de combustion significativement 
plus grande que celle de la substance de référence, l'essai peut être arrêté; autrement, les essais doivent être répétés cinq fois avec 
chacun des trois mélanges qui donnent les vitesses de combustion 
les plus élevées.
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Si l'on soupçonne que le résultat est un «faux positif», répéter l'essai 
en remplaçant la cellulose par une substance inerte dont la taille des 
particules est la même, comme le  kieselguhr.  Une autre possibilité 
consiste à renouveler l'essai avec le mélange substance à essayer/ cellulose dont la vitesse de combustion est la plus élevée, dans une 
atmosphère inerte (contenu d'oxygène < 2 % v/v).
 
2. DONNÉES  
Pour des raisons de sécurité, la vitesse maximale de combustion — 
et non la valeur moyenne — sera retenue pour caractériser les propriétés comburantes de la substance examinée.
 
Pour l'évaluation d'un mélange donné, retenir la vitesse de combus ­
tion la plus élevée mesurée au cours des six essais.  
Porter sur un graphique la vitesse de combustion la plus élevée de 
chaque mélange en fonction de la concentration de comburant. Déduire de ce graphique la vitesse de combustion maximale.
 
Les six vitesses de combustion mesurées au cours d'une même 
opération pour le mélange qui a donné la vitesse de combustion maximale ne doit pas s'écarter de plus de 10 % de la moyenne arithmétique; dans le cas contraire, il importe d'améliorer les 
méthodes de broyage et de mélange.
 
Comparer la vitesse maximale de combustion obtenue avec la vitesse 
maximale de combustion du mélange de référence (voir point 1.3).  
Si les essais sont réalisés dans une atmosphère inerte, comparer la 
vitesse maximale avec la vitesse de réaction du mélange de référence 
dans une atmosphère inerte.  
3. RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— l'identité, la composition, la pureté, le contenu en humidité etc., 
de la substance à essayer,  
— tout traitement de l'échantillon à essayer (par exemple, broyage, 
séchage...),  
— la source d'allumage utilisée dans les essais,  
— les résultats des mesures,  
— le type de réaction (par exemple combustion rapide superficielle, 
combustion à travers toute la masse, toute observation concernant 
les produits de combustion,...),  
— toute observation supplémentaire, y compris une description de 
l'intensité (flamme, étincelle, fumée, lente incandescence, etc.) et la durée approximative de la réaction observée au cours de l'essai 
préliminaire de sécurité/dépistage pour la substance à essayer 
comme pour la substance de référence,
 
— les résultats des essais effectués avec un matériel inerte, s'il y a 
lieu, 
— les résultats des essais effectués dans une atmosphère inerte, s'il y 
a lieu.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 120
 
3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Une substance est à considérer comme comburante si:  
a) lors de l'essai préliminaire, il y a réaction intense;  
b) lors de l'essai, la vitesse maximale de combustion de la substance 
soumise à essai est supérieure ou égale à celle du mélange de 
référence composé de cellulose et de nitrate de barium.  
Pour éviter un «faux» résultat positif, il faut aussi tenir compte des 
résultats obtenus en essayant la substance mélangée avec un matériel inerte et/ou dans une atmosphère inerte, lors de l'interprétation des 
résultats.
 
4. RÉFÉRENCES  
NF T 20-035 (septembre 1985). Produits chimiques à usage indus ­
triel — Détermination des propriétés comburantes des solides.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 121
 
Annexe  
Figure  
Moule et accessoires nécessaires à la confection de tas  
(toutes les dimensions sont en millimètres)
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 122
 
A.18.  DÉTERMINATION DE LA MASSE MOLÉCULAIRE 
MOYENNE EN NOMBRE ET DE LA DISTRIBUTION DES 
MASSES MOLÉCULAIRES DES POLYMÈRES  
1. MÉTHODE  
Cette méthode de chromatographie sur gel perméable reprend la ligne 
directrice OCDE TG 118 (1996). Les principes fondamentaux et tous autres renseignements techniques sont donnés en référence (1).
 
1.1. INTRODUCTION  
Les propriétés des polymères sont tellement diversifiées qu'il est 
impossible de décrire une méthode unique indiquant avec précision 
des conditions de séparation et d'évaluation qui recouvrent toutes les 
éventualités et particularités rencontrées dans la séparation des poly ­
mères. Les systèmes complexes de polymères, notamment, se prêtent rarement à la chromatographie sur gel perméable. Lorsque la chro ­
matographie sur gel perméable n'est pas applicable, on peut déter ­
miner la masse moléculaire moyenne à l'aide d'autres méthodes (voir annexe). Dans de tels cas, il convient de fournir tous les détails de la méthode utilisée et de justifier son choix.
 
La méthode décrite ci-après est basée sur la norme D1N 55672 (1). 
Celle-ci fournit des indications détaillées sur la manière de réaliser 
les expériences et d'évaluer les données. S'il est nécessaire de modi ­
fier les conditions expérimentales, ces changements doivent être justifiés. D'autres normes peuvent être utilisées, à condition d'en mentionner toutes les références. La méthode décrite fait appel à 
des échantillons de polystyrène de polydispersité connue pour l'éta ­
lonnage et il y aura peut-être lieu de la modifier pour l'adapter aux cas de polymères particuliers, par exemple, les polymères solubles dans l'eau et les polymères ramifiés à longue chaîne.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La masse moléculaire moyenne en nombre M  n et la masse molécu ­
laire moyenne en poids M  w sont déterminées à l'aide des équations 
suivantes: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
où 
H i est l'amplitude du signal du détecteur, par rapport au niveau de 
référence, correspondant au volume de rétention V  i ; 
M i est la masse moléculaire de la fraction de polymère correspondant 
au volume de rétention V  i et 
n est le nombre de points expérimentaux.  
La largeur de la distribution des masses moléculaires, qui représente 
une mesure de la polydispersité du système, est donnée par le rapport 
M w /M n . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 123
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
La méthode par chromatographie sur gel perméable étant une 
méthode relative, il est nécessaire de procéder à un étalonnage. Celui-ci est généralement effectué au moyen de polystyrènes 
étalons à chaîne linéaire et à distribution étroite, dont les masses 
moléculaires moyennes M
 n et M  v ainsi que la distribution des 
masses moléculaires sont connues. La courbe d'étalonnage ne peut être utilisée pour déterminer la masse moléculaire d'un échantillon 
inconnu que si les conditions de séparation des échantillons et des 
étalons ont été sélectionnées de manière identique.
 
Une relation déterminée entre la masse moléculaire et le volume 
d'élution n'est valable que dans les conditions particulières d'une 
expérience donnée. Parmi ces conditions figurent, avant tout, la 
température, le solvant (ou le mélange de solvants), les conditions de chromatographie, ainsi que la colonne de séparation ou le système 
de colonnes.
 
Les masses moléculaires de l'échantillon déterminées de cette 
manière constituent des valeurs relatives et sont désignées par le terme «masses moléculaires en équivalent polystyrène». Cela signifie 
qu'en fonction des différences chimiques et structurelles entre 
l'échantillon à tester et les étalons, les masses moléculaires peuvent dévier des valeurs absolues de manière plus ou moins importante. Si d'autres étalons sont utilisés, par exemple le polyéthylène glycol, le 
poly(éthylène oxyde), le poly(méthacrylate de méthyle) ou l'acide 
polyacrylique, il importe d'en indiquer la raison.
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La chromatographie sur gel perméable permet de déterminer la distri ­
bution des masses moléculaires ainsi que les masses moléculaires moyennes (M
 n , M  w ). La chromatographie sur gel perméable 
constitue un type particulier de chromatographie liquide dans 
lequel l'échantillon à tester est séparé en fonction des volumes hydro ­
dynamiques de chaque constituant (2).  
La séparation s'effectue à mesure que l'échantillon progresse dans 
une colonne remplie d'un matériau poreux, généralement un gel 
organique. Les petites molécules peuvent pénétrer dans les pores tandis que les grosses molécules en sont exclues. Le parcours des grosses molécules est, de ce fait, plus court; elles sont éluées en 
premier lieu. Les molécules de taille moyenne pénètrent dans 
certains des pores; elles sont éluées plus tard. Les molécules les plus petites, dont le rayon hydrodynamique moyen est plus petit que les pores du gel, peuvent pénétrer dans tous les pores. Elles 
sont éluées en dernier lieu.
 
Dans la situation idéale, c'est la taille des espèces moléculaires qui 
régit entièrement la séparation, mais, en pratique, il est difficile d'éviter tout au moins l'interférence de certains effets d'absorption. 
Un remplissage irrégulier de la colonne, de même que des volumes 
morts, peuvent aggraver la situation (2).
 
La détection s'effectue, par exemple, par mesure de l'indice de réfrac ­
tion ou de l'absorption dans l'UV pour donner une courbe de distri ­
bution simple. Cependant, pour pouvoir associer à la courbe des 
valeurs de masses moléculaires réelles, il est nécessaire d'étalonner la colonne par passage de polymères de masse moléculaire connue et, idéalement, d'une structure aussi proche que possible, par 
exemple divers polystyrènes étalons. Une courbe de Gauss en 
résulte généralement, parfois avec une dissymétrie marquée du côté des faibles masses moléculaires, l'axe vertical indiquant la quantité, en poids, des espèces de différentes masses moléculaires éluées, 
tandis que sur l'axe horizontal figure le logarithme de la masse 
moléculaire.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 124
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
La reproductibilité (écart-type relatif) du volume d'élution doit être 
au plus égale à 0,3 pour cent. Il y a lieu d'assurer la reproductibilité de l'analyse grâce à une correction mettant en jeu un étalon interne, 
si un chromatogramme est évalué en fonction du temps et ne satisfait 
pas aux critères mentionnés plus haut (1). Les polydispersités dépen ­
dent des masses moléculaires des étalons. Dans le cas des polys ­
tyrènes étalons, les valeurs typiques sont: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p est la masse moléculaire de l'étalon correspondant au maximum 
du pic)  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Préparation des solutions de polystyrène étalon  
On dissout les polystyrènes étalons en les mélangeant soigneusement 
à l'éluant choisi. On préparera les solutions en observant les recom ­
mandations du fabricant.  
Les concentrations des étalons choisis dépendent de différents 
facteurs, comme le volume d'injection, la viscosité de la solution et la sensibilité du détecteur. Le volume d'injection maximum doit 
être adapté à la longueur de la colonne, en veillant à ne pas 
surcharger celle-ci. Les volumes d'injection courants pour des sépa ­
rations analytiques par chromatographie sur gel perméable, au moyen d'une colonne de 30 cm × 7,8 mm, varient normalement entre 40 et 
100 ml. Il est possible d'injecter des volumes plus importants, mais 
ceux-ci ne peuvent dépasser 250 μl. On doit déterminer le rapport 
optimal entre le volume d'injection et la concentration avant l'étalon ­
nage de la colonne.
 
1.6.2.  Préparation de la solution de l'échantillon  
En principe, la préparation des solutions de l'échantillon s'effectue 
dans les mêmes conditions. L'échantillon est dissous dans un solvant approprié, par exemple le tétrahydrofurane (THF), en agitant 
soigneusement. Il ne doit, en aucun cas, être dissous dans un bain 
à ultrasons. Si nécessaire, la solution de l'échantillon est purifiée au moyen d'un filtre à membrane d'une dimension de pores comprise entre 0,2 et 2 μm.
 
La présence de particules non dissoutes doit être mentionnée dans le 
rapport final, dans la mesure où elle peut résulter d'espèces de masse moléculaire élevée. Il faut recourir à une méthode appropriée pour 
déterminer le pourcentage en poids des particules non dissoutes. Les 
solutions doivent être analysées dans un délai de 24 heures.
 
1.6.3.  Appareillage  
— un réservoir à solvant,  
— un système de dégazage (si nécessaire),  
— une pompe,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 125
 
— un amortisseur d'impulsions (si nécessaire),  
— un système d'injection,  
— des colonnes de chromatographie,  
— un détecteur,  
— un débitmètre (si nécessaire),  
— un système d'enregistrement et de traitement des données,  
— un récipient pour recueillir les solutions usées.  
On doit vérifier que le système de chromatographie sur gel 
perméable est inerte vis-à-vis des solvants utilisés (par exemple, utilisation de capillaires en acier lorsque le solvant est le THF).
 
1.6.4.  Injection et système de distribution du solvant  
Un volume défini de la solution de l'échantillon est chargé sur la 
colonne dans une zone étroitement définie, à l'aide d'un échantillon ­
neur automatique ou manuellement. Si on opère manuellement, le 
fait de retirer ou d'enfoncer le piston de la seringue trop rapidement peut provoquer des modifications dans la distribution des masses moléculaires observées. Le système de distribution du solvant doit, 
dans la mesure du possible, être exempt de pulsations; il est souhai ­
table qu'il comporte un amortisseur d'impulsions. Le débit est de l'ordre de 1 ml/min.
 
1.6.5.  Colonne  
Selon la nature de l'échantillon a tester, le polymère est caractérisé en 
ayant recours à une seule colonne ou à plusieurs colonnes connectées 
en série. Un certain nombre de matériaux poreux pour colonne de 
propriétés définies (par exemple taille des pores, limites d'exclusion) sont disponibles dans le commerce. Le choix du gel de séparation ou celui de la longueur de la colonne dépendent, d'une part, des 
propriétés de l'échantillon à tester (volumes hydrodynamiques, distri ­
bution des masses moléculaires), d'autre part, des conditions particu ­
lières de la séparation, telles que la nature du solvant, la température et le débit (1) (2) (3).
 
1.6.6.  Plateaux théoriques  
La colonne ou la combinaison de colonnes utilisée pour la séparation 
doit être caractérisée par le nombre de plateaux théoriques. Pour ce 
faire, dans le cas où le solvant d'élution est le THF, il y a lieu de faire passer une solution d'ethylbenzène ou d'un autre soluté non polaire approprié sur une colonne de longueur connue. Le nombre 
de plateaux théoriques est donné par l'équation suivante: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
ou N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
où: 
N est le nombre de plateaux théoriques  
V e est le volume d'élution correspondant au maximum du pic  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 126
 
W est la largeur du pic au niveau de la ligne de base  
W 1/2 est la largeur du pic à mi-hauteur.  
1.6.7.  Efficacité de la séparation  
Outre le nombre de plateaux théoriques, paramètre déterminant la 
largeur de bande, l'efficacité de séparation est une autre grandeur caractéristique; c'est la pente de la courbe de calibrage qui la déter ­
mine. L'efficacité de séparation d'une colonne se détermine au 
moyen de la relation suivante:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
section de la colonne ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
où 
V e, M x est le volume d'élution du polystyrène de masse molécu ­
laire M  x 
V e,(10.M x) est le volume d'élution du polystyrène de masse molécu ­
laire 10 fois supérieure  
La résolution du système est généralement définie comme suit:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
où, 
V e1 , V e2 sont les volumes d'élution des deux polystyrènes étalons 
au maximum du pic  
W 1 , W  2 sont les largeurs des pics au niveau de la ligne de base  
M p M 2 sont les masses moléculaires correspondant au maximum 
des pics (elles devraient différer d'un facteur 10).  
La valeur de R pour le système de colonnes doit être supérieure 
à 1,7 (4).  
1.6.8.  Solvants  
Tous les solvants doivent être d'une grande pureté (on emploie du 
THF à 99,5 % de pureté). Le réservoir de solvant (mis, au besoin, 
sous atmosphère de gaz inerte) doit être assez grand pour permettre l'étalonnage de la colonne et plusieurs analyses d'échantillons. Le solvant sera dégazé avant d'être pompé vers la colonne.
 
1.6.9.  Régulation de la température  
La température des composants internes critiques (boucle d'injection, 
colonne(s), détecteur et tuyaux) doit être constante et compatible 
avec le choix du solvant.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 127
 
1.6.10.  Détecteur  
Le détecteur sert à enregistrer de manière quantitative la concentra ­
tion de l'échantillon qui est élue de la colonne. En vue d'éviter un élargissement indésirable des pics, le volume de la cuvette du détec ­
teur sera choisi aussi petit que possible. Il ne doit pas excéder 10 μl, 
sauf pour les détecteurs par diffusion de la lumière et les viscosimè ­
tres. La détection s'effectue généralement par réfractométrie différen ­
tielle. Si les propriétés spécifiques de l'échantillon ou du solvant 
d'élution l'exigent, on peut toutefois utiliser d'autres types de détec ­
teurs tels que les détecteurs UV/VIS ou IR, les viscosimètres, etc.
 
2. RÉSULTATS ET PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
2.1. RÉSULTATS  
On se référera à la norme DIN (1) pour ce qui concerne les critères 
d'évaluation détaillés, de même que pour les spécifications relatives à la collecte et au traitement des données.
 
Pour chaque échantillon analysé, il est nécessaire de réaliser 
deux expériences indépendantes. Leurs résultats seront analysés séparément.
 
Les paramètres M  n , M  w , M  w /M n , M  p doivent être déterminés pour 
chaque mesure. Il est nécessaire d'indiquer de façon explicite que les valeurs mesurées sont des valeurs relatives correspondant a des équi ­
valents de masse moléculaire de l'étalon utilisé.
 
Après avoir déterminé les volumes et les temps de rétention (éven ­
tuellement corrigés au moyen d'un étalon interne), on porte en 
graphique les valeurs de log M  p (M p représentant les maxima des 
pics des polymères d'étalonnage) en fonction de l'une de ces quan ­
tités. Deux points d'étalonnage au moins sont nécessaires pour chaque facteur 10 de masse moléculaire; cinq points de mesure au 
moins sont requis pour la courbe dans son ensemble, qui doit couvrir 
la masse moléculaire estimée de l'échantillon. Le point extrême de la courbe d'étalonnage du côté des faibles masses moléculaires peut être défini grâce au n-hexylbenzène ou à un autre soluté non polaire 
approprié. Les masses moléculaires moyennes en nombre et en 
poids sont généralement déterminées par un traitement électronique des données fondé sur les formules décrites dans la section 1.2. Si on a recours à un traitement manuel, il est opportun de consulter 
l'ASTM D 3536-91 (3).
 
La courbe de distribution doit être présentée sous la forme d'un 
tableau ou d'un graphique (fréquence différentielle ou pourcentages 
cumulatifs en fonction du log M). Dans la représentation graphique, 
une puissance de dix de masse moléculaire doit normalement corres ­
pondre à une largeur de 4 cm environ tandis que pour le maximum du pic une hauteur de 8 cm environ est adéquate. Dans le cas de 
courbes de distribution cumulatives, la différence entre 0 et 100 pour 
cent sur l'axe des ordonnées doit être d'environ 10 cm.
 
2.2. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai doit comporter les renseignements suivants:  
2.2.1.  Substance à tester  
— renseignements disponibles sur la substance à tester (nature, addi ­
tifs, impuretés),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 128
 
— description du traitement de l'échantillon, observations, 
problèmes.  
2.2.2.  Dispositif expérimental  
— réservoir d'éluant, gaz inerte, dégazage de l'éluant, composition 
de l'éluant, impuretés,  
— pompe, amortisseur d'impulsions, système d'injection,  
— colonnes de séparation (fabricant, toutes précisions sur les carac ­
téristiques des colonnes, telles que taille des pores, nature du matériel de séparation etc., nombre, longueur et ordre des 
colonnes utilisées),
 
— nombre de plateaux théoriques de la colonne (ou de la combi ­
naison de colonnes), efficacité de la séparation (résolution du système),
 
— informations sur la symétrie des pics,  
— température de la colonne, mode de régulation de la température,  
— détecteur (principe de mesure, type, volume de la cuvette),  
— débitmètre, s'il y en a un (fabricant, principe de mesure),  
— système utilisé pour rassembler et pour traiter les données (maté ­
riel et logiciel).  
2.2.3.  Étalonnage du système  
— description détaillée de la méthode utilisée pour établir la courbe 
d'étalonnage,  
— précisions sur les critères de qualité propres à cette méthode 
(par exemple, coefficient de corrélation, erreur quadratique 
moyenne, etc.),  
— informations sur toutes les extrapolations, hypothèses et approxi ­
mations effectuées au cours de la procédure expérimentale, ainsi 
que sur l'évaluation et le traitement des données,  
— toutes les mesures effectuées pour établir la courbe d'étalonnage 
doivent être présentées dans un tableau qui comporte, pour 
chaque point d'étalonnage, les informations suivantes:  
— nom de l'échantillon,  
— fabricant de l'échantillon,  
— valeurs caractéristiques M  p , M  n , M  w , M  w /M n des étalons 
fournis par le fabricant ou déduites de mesures ulté ­
rieures, complétées d'indications relatives à la méthode 
de détermination,  
— volume d'injection et concentration d'injection,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 129
 
— valeur de M  p utilisée pour l'étalonnage,  
— volume d'élution ou temps de rétention corrigé mesuré aux 
maxima des pics,  
— M  p calculée au maximum du pic,  
— pourcentage d'erreur sur la M  p calculée et sur la valeur d'éta ­
lonnage.  
2.2.4.  Évaluation  
— évaluation en fonction du temps: toutes méthodes visant à 
améliorer la reproductibilité requise (méthode de correction, 
étalon interne, etc.),  
— préciser si l'évaluation a été effectuée à partir du volume d'élution 
ou à partir du temps de rétention,  
— indiquer les limites de l'évaluation si un pic n'est pas complète ­
ment analysé,  
— décrire les méthodes de lissage lorsqu'on y a recours,  
— décrire les procédés de préparation et de prétraitement de 
l'échantillon,  
— indiquer la présence de particules non dissoutes, s'il y en a,  
— indiquer le volume d'injection ( μl) et la concentration d'injection 
(mg/ml),  
— mentionner les observations témoignant d'effets qui engendrent 
des déviations par rapport au profil idéal de chromatographie sur 
gel perméable,  
— décrire en détail toutes les modifications aux procédures d'essais,  
— préciser les intervalles d'erreur,  
— consigner toutes autres informations et observations utiles pour 
interpréter les résultats.  
3. RÉFÉRENCES  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J. and Bly, D.D. (eds) (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley & Sons.  
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC), American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phie, Pennsylvanie.
 
(4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrène by High Performance Size-Exclusion Chromatography, 
American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Penn ­
sylvanie.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 130
 
Annexe  
Exemples d'autres méthodes de détermination de la masse moléculaire 
moyenne en nombre (M  n ) des polymères  
La chromatographie sur gel perméable constitue la méthode de choix pour la 
détermination de M  n , en particulier lorsqu'on dispose d'un ensemble de subs ­
tances étalons de structure comparable à la structure du polymère. Toutefois, 
lorsque le recours à la chromatographie sur gel perméable présente des difficultés pratiques ou que l'on peut s'attendre à ce que la substance ne satisfasse pas à un critère réglementaire pour la M
 n (ce qui demande confirmation), il existe des 
méthodes de remplacement, par exemple:  
1. Utilisation des propriétés colligatives  
1.1. Ébullioscopie et cryoscopie:  
consistent à mesurer l'élévation du point d'ébullition (ébullioscopie) 
ou l'abaissement du point de congélation (cryoscopie) d'un solvant lorsque le polymère est ajouté. La méthode est basée sur le fait que 
la dissolution d'un polymère dans un liquide exerce sur les points 
d'ébullition et de congélation de celui-ci un effet qui dépend de la masse moléculaire du polymère (1) (2).
 
Le domaine d'application correspond à M  n < 20 000.  
1.2. Abaissement de la pression de vapeur:  
consiste à mesurer la pression de vapeur d'un liquide de référence 
avant et après addition de quantités connues de polymères (1) (2).  
Le domaine d'application correspond à M  n < 20 000 (théoriquement; 
en pratique, ne présente toutefois qu'une valeur limitée).  
1.3. Osmométrie à membrane:  
repose sur le principe de l'osmose, à savoir la tendance naturelle des 
molécules de solvant à traverser une membrane semi-perméable à partir d'une solution diluée vers une solution concentrée de manière à 
réaliser l'équilibre. Dans l'essai, la concentration de la solution diluée 
est nulle tandis que la solution concentrée contient le polymère. Le passage de solvant à travers la membrane induit une différence de pression qui dépend de la concentration et de la masse moléculaire 
du polymère (1) (3) (4).
 
Le domaine d'application correspond à des valeurs de M  n comprises 
entre 20 000 et 200 000.  
1.4. Osmométrie en phase vapeur:  
consiste à comparer la vitesse d'évaporation d'un aérosol de solvant 
pur à celle de trois aérosols au moins contenant le polymère à 
différentes concentrations (1) (5) (6).  
Le domaine d'application correspond à M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 131
 
2. Analyse des groupes terminaux  
Pour utiliser cette méthode, il est nécessaire de connaître à la fois la 
structure globale du polymère et la nature des groupes terminaux situés en bout de chaîne (ceux-ci doivent pouvoir être distingués de ta chaîne principale par exemple, par leur spectre RMN ou par 
titrage et formation de dérivés). La détermination de la concentration 
moléculaire des groupes terminaux présents sur le polymère peut, ensuite, fournir une valeur de la masse moléculaire (7) (8) (9).
 
Le domaine d'application correspond a des valeurs de M  n pouvant 
atteindre 50 000 (avec une fiabilité décroissante).  
3. Références de l'annexe  
(1) Billmeyer, F.W. Jr. (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
(2) Glover, C.A. (1975). Absolute Colligative Property Methods, 
Chapter 4, in Polymer Molecular Weights, Part I (ed. P.E. 
Slade, Jr.), Marcel Dekker, New York.  
(3) ASTM D 375-79 (1979). Standard Practice for Détermination of 
Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane osmometry, American Society for Testing and Materials, Phila ­
delphie, Pennsylvanie.
 
(4) Coll, H. (1989). Membrane osmometry, in: Détermination of 
Molecular Weight (ed. A.R. Cooper), J. Wiley and Sons, pp. 25-52.
 
(5) ASTM D 3592-77 (1977). Standard recommended practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, 
American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Penn ­
sylvanie.  
(6) Morris, C.E.M. (1989). Vapour Pressure Osmometry in Deter ­
mination of Molecular Weight (ed. A.R. Cooper), J. Wiley and 
Sons.  
(7) Schröder, E. Müller, G. & Arndt, K.-F. (1989). Polymer Charac ­
terisadon, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G. (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 in 
Polymer Molecular Weights, Part I, (ed. P.E. Slade, Jr.) Marcel 
Dekker, New York.  
(9) Amiya, S. et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139-2146.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 132
 
A.19.  DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN POLYMÈRES DE 
FAIBLE MASSE MOLÉCULAIRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode de chromatographie sur gel perméable reprend 
la ligne directrice OCDE TG 118 (1996). On trouvera dans 
les références les principes fondamentaux et autres renseigne ­
ments techniques.  
1.1. INTRODUCTION  
Les propriétés des polymères sont tellement diversifiées qu’il est 
impossible de décrire une méthode unique indiquant avec précision des conditions de séparation et d’évaluation qui recouvrent toutes les éventualités et particularités rencontrées dans la séparation des poly ­
mères. Les systèmes complexes de polymères, notamment, se prêtent 
rarement à la chromatographie sur gel perméable. Lorsque la chro ­
matographie sur gel perméable n’est pas applicable, on peut déter ­
miner la teneur en polymères de faible masse moléculaire à l’aide 
d’autres méthodes. Dans de tels cas, il convient de fournir tous les 
détails de la méthode utilisée et de justifier son choix.
 
La méthode décrite ci-après est basée sur la norme DIN 55672 (1). 
Celle-ci fournit des indications détaillées sur la manière de réaliser 
les expériences et d’évaluer les données. S’il est nécessaire de modi ­
fier les conditions expérimentales, ces changements doivent être justifiés. D’autres normes peuvent être utilisées, à condition d’en 
mentionner toutes les références. La méthode décrite fait appel à 
des échantillons de polystyrène de polydispersité connue pour l’éta ­
lonnage et il y aura peut-être lieu de la modifier pour l’adapter aux cas de polymères particuliers, par exemple, les polymères solubles 
dans l’eau et les polymères ramifiés à longue chaîne.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
On définit arbitrairement une masse moléculaire faible comme étant 
une masse moléculaire inférieure à 1 000 daltons.  
La masse moléculaire moyenne en nombre M  n et la masse molécu ­
laire moyenne en poids M  w sont déterminées à l’aide des équations 
suivantes: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
où 
H i est l’amplitude du signal du détecteur, par rapport au niveau de 
référence, correspondant au volume de rétention V  i , par rapport 
au niveau de référence.  
M i est la masse moléculaire de la fraction de polymère correspon ­
dant au volume de rétention, V  i et n est le nombre de points 
expérimentaux.  
La largeur de la distribution des masses moléculaires, qui représente 
une mesure de la polydispersité du système, est donnée par le 
rapport M  W /M n . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 133
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
La méthode par chromatographie sur gel perméable étant une 
méthode relative, il est nécessaire de procéder à un étalonnage. Celui-ci est généralement effectué au moyen de polystyrènes 
étalons à chaîne linéaire et à distribution étroite, dont les masses 
moléculaires moyennes M
 n et M  w , ainsi que la distribution des 
masses moléculaires sont connues. La courbe d’étalonnage ne peut être utilisée pour déterminer la masse moléculaire d’un échantillon 
inconnu que si les conditions de séparation des échantillons et des 
étalons ont été sélectionnées de manière identique.
 
Une relation déterminée entre la masse moléculaire et le volume 
d'élution n'est valable que dans les conditions particulières d'une 
expérience donnée. Parmi ces conditions figurent, avant tout, la température, le solvant (ou le mélange de solvants), les conditions de chromatographie, ainsi que la colonne de séparation ou le système 
de colonnes.
 
Les masses moléculaires de l'échantillon déterminées de cette 
manière constituent des valeurs relatives; on les désigne par le 
terme «masses moléculaires en équivalent-polystyrène». Cela signifie 
qu'en fonction des différences chimiques et structurelles entre l'échantillon à tester et les étalons, les masses moléculaires peuvent dévier des valeurs absolues de manière plus ou moins importante. Si 
d'autres étalons sont utilisés, par exemple le polyéthylèneglycol, le 
poly(éthylène oxyde), le poly(méthacrylate de méthyle) ou l'acide polyacrylique, il importe d'en indiquer la raison.
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La chromatographie sur gel perméable permet de déterminer la distri ­
bution des masses moléculaires ainsi que les masses moléculaires moyennes (M
 n , M  w ). La chromatographie sur gel perméable 
constitue un type particulier de chromatographie liquide dans 
lequel l'échantillon à tester est séparé en fonction des volumes hydro ­
dynamiques de chaque constituant (2).  
La séparation s'effectue à mesure que l'échantillon progresse dans 
une colonne remplie d'un matériau poreux, généralement un gel 
organique. Les petites molécules peuvent pénétrer dans les pores 
tandis que les grosses molécules en sont exclues. Le parcours des grosses molécules est, de ce fait, plus court; elles sont éluées en 
premier lieu. Les molécules de taille moyenne pénètrent dans 
certains des pores; elles sont éluées plus tard. Les molécules les plus petites, dont le rayon hydrodynamique moyen est plus petit que les pores du gel, peuvent pénétrer dans tous les pores. Elles 
sont éluées en dernier lieu.
 
Dans la situation idéale, c'est la taille des espèces moléculaires qui 
régit entièrement la séparation, mais, en pratique, il est difficile d'éviter l'interférence de certains effets d'absorption au moins. Un 
remplissage irrégulier de la colonne, de même que des volumes 
morts, peuvent aggraver la situation (2).
 
La détection s'effectue, par exemple, par mesure de l'indice de réfrac ­
tion ou de l'absorption dans l'UV pour donner une courbe de distri ­
bution simple. Cependant, pour pouvoir associer à la courbe des valeurs de masses moléculaires réelles, il est nécessaire d'étalonner la colonne par passage de polymères de masse moléculaire connue 
et, idéalement, d'une structure aussi proche que possible. Une courbe 
de Gauss en résulte généralement; elle présente parfois une dissymé ­
trie marquée du coté des masses moléculaires faibles, l'axe vertical indiquant la quantité, en poids, des espèces de différentes masses 
moléculaires éluées, tandis que sur l'axe horizontal figure le loga ­
rithme de la masse moléculaire.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 134
 
La teneur en polymères de faible masse moléculaire est déduite de 
cette courbe. Le calcul ne peut être exact que si les espèces à faible 
masse moléculaire se comportent de la même manière, par unité de masse, que l'ensemble du polymère.
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
La reproductibilité (écart-type relatif) du volume d'élution doit être 
au plus égale à 0,3 pour cent. Il y a lieu d'améliorer la reproducti ­
bilité de l'analyse grâce à une correction mettant en jeu un étalon interne, si un chromatogramme est évalué en fonction du temps et ne 
satisfait pas aux critères mentionnés plus haut [voir informations 
complémentaires en (1)]. Les polydispersités dépendent des masses moléculaires des étalons; dans le cas des polystyrènes étalons: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p est la masse moléculaire de l'étalon correspondant au maximum 
du pic)  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Préparation des solutions de polystyrène étalon  
On dissout les polystyrènes étalons en les mélangeant soigneusement 
à l'éluant choisi. On préparera les solutions en observant les recom ­
mandations du fabricant.  
Les concentrations des étalons choisis dépendent de différents 
facteurs, comme le volume d'injection, la viscosité de la solution et la sensibilité du détecteur. Le volume d'injection maximum doit être adapté à la longueur de la colonne, en veillant à ne pas 
surcharger celle-ci. Les volumes d'injection courants pour des sépa ­
rations analytiques par chromatographie sur gel perméable, au moyen d'une colonne de 30 cm × 7,8 mm, varient normalement entre 40 et 100 μl. Il est possible d'injecter des volumes plus importants, mais 
ceux-ci ne peuvent dépasser 250 μl. On doit déterminer le rapport 
optimal entre le volume d'injection et la concentration avant l'étalon ­
nage de la colonne.
 
1.6.2.  Préparation de la solution de l'échantillon  
En principe, la préparation des solutions de l'échantillon s'effectue 
selon les mêmes critères. L'échantillon est dissous dans un solvant approprié, par exemple le THF, en agitant soigneusement. Il ne doit, 
en aucun cas, être dissous dans un bain à ultrasons. Si nécessaire, la 
solution de l'échantillon est purifiée au moyen d'un filtre à membrane d'une dimension de pores comprise entre 0,2 et 2 μm.
 
La présence de particules non dissoutes doit être mentionnée dans le 
rapport final, dans la mesure où elle peut résulter d'espèces de masse moléculaire élevée. Il faut recourir à une méthode appropriée pour 
déterminer le pourcentage en poids des particules non dissoutes. Les 
solutions doivent être analysées dans un délai de 24 heures.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 135
 
1.6.3.  Correction liée à la présence d'impuretés et d'additifs  
S'agissant de la teneur en espèces de M < 1 000, il est généralement 
nécessaire d'apporter une correction pour tenir compte de la présence de composés particuliers non polymériques (par exemple des impu ­
retés ou des additifs), sauf si la teneur mesurée n'excède pas un pour 
cent. Cette correction peut être réalisée par analyse directe de la solution de polymère ou de l'éluat de la chromatographie sur gel perméable.
 
Au cas où l'éluat est trop dilué pour permettre une analyse après 
passage à travers la colonne, il convient de le concentrer. Il est 
éventuellement nécessaire d'évaporer l'éluat à sec puis de le redis ­
soudre. La concentration de l'éluat sera effectuée dans des conditions 
telles qu'aucune modification de sa composition n'intervienne. Le 
traitement de l'éluat après la phase de chromatographie sur gel perméable est fonction de la méthode d'analyse utilisée pour la détermination quantitative.
 
1.6.4.  Appareillage  
Un appareil de chromatographie sur gel perméable se compose des 
éléments suivants:  
— un réservoir à solvant,  
— un système de dégazage (si nécessaire),  
— une pompe,  
— un amortisseur d'impulsions (si nécessaire),  
— un système d'injection,  
— des colonnes de chromatographie,  
— un détecteur,  
— un débimètre (si nécessaire),  
— un système d'enregistrement et de traitement des données,  
— un récipient pour recueillir les solutions usées.  
On doit vérifier que le système de chromatographie sur gel 
perméable est inerte vis-à-vis du solvant utilisé (par exemple, utili ­
sation de capillaires en acier lorsque le solvant est le THF).  
1.6.5.  Injection et système de pompage du solvant  
Un volume défini de la solution de l'échantillon est chargé sur la 
colonne dans une zone étroitement définie, à l'aide d'un échantillon ­
neur automatique ou manuellement. Si on opère manuellement, le 
fait de retirer ou d'enfoncer le piston de la seringue trop rapidement 
peut provoquer des modifications dans la distribution des masses moléculaires observées. Le système de pompage du solvant doit, dans toute la mesure du possible, être exempt de pulsations; il est 
souhaitable qu'il comporte un amortisseur d'impulsions. Le débit est 
de l'ordre de 1 ml/min.
 
1.6.6.  Colonne  
Selon la nature de l'échantillon à tester, le polymère est caractérisé en 
ayant recours à une seule colonne ou à plusieurs colonnes connectées en série. Un certain nombre de matériaux poreux pour colonne de propriétés définies (par exemple taille des pores, limites d'exclusion) 
sont disponibles dans le commerce. Le choix du gel de séparation ou 
celui de la longueur de la colonne dépendent, d'une part, des propriétés de l'échantillon à tester (volumes hydrodynamiques, distri ­
bution des masses moléculaires), d'autre part, des conditions particu ­
lières de la séparation, telles que la nature du solvant, la température 
et le débit (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 136
 
1.6.7.  Plateaux théoriques  
La colonne ou la combinaison de colonnes utilisée pour la séparation 
doit être caractérisée par le nombre de plateaux théoriques. Pour ce faire, dans le cas où le solvant d'élution est le THF, il y a lieu de 
faire passer une solution d'éthylbenzène ou d'un autre soluté non 
polaire approprié sur une colonne de longueur connue. Le nombre de plateaux théoriques est donné par l'équation suivante: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
ou N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
où 
N est le nombre de plateaux théoriques  
V e est le volume d'élution correspondant au maximum du pic  
W est la largeur du pic au niveau de la ligne de base  
W 1/2 est la largeur du pic à mi-hauteur.  
1.6.8.  Efficacité de la séparation  
Outre le nombre de plateaux théoriques, paramètre déterminant la 
largeur de bande, l'efficacité de séparation est une autre grandeur caractéristique; c'est la pente de la courbe de calibrage qui la déter ­
mine. L'efficacité de séparation d'une colonne se détermine au 
moyen de la relation suivante:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
section de la colonne ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
où 
V e;M x est le volume d'élution du polystyrène de masse molécu ­
laire M  x 
V e,(10.M  x ) est le volume d'élution du polystyrène de masse molécu ­
laire 10 fois supérieure.  
La résolution du système est généralement définie comme suit:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
où. 
V e1 , V e2 sont les volumes d'élution des deux polystyrènes étalons 
au maximum du pic.  
W 1 , W  2 sont les largeurs des pics au niveau de la ligne de base.  
M 1, M 2 sont les masses moléculaires correspondant au maximum 
des pics (elles doivent différer d'un facteur 10).  
La valeur de R pour le système de colonnes doit être supérieure 
à 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 137
 
1.6.9.  Solvants  
Tous les solvants doivent être d'une grande pureté (on emploie du 
THF à 99,5 pour cent de pureté}. Le réservoir de solvant (mis, au besoin, sous atmosphère de gaz inerte) doit être assez grand pour 
permettre l'étalonnage de la colonne et plusieurs analyses d'échan ­
tillons. Le solvant sera dégazé avant d'être pompe vers la colonne.
 
1.6.10.  Régulation de la température  
La température des composants internes critiques [boucle d'injection, 
colonne(s), détecteur et tuyaux] doit être constante et compatible avec le choix du solvant.
 
1.6.11.  Détecteur  
Le détecteur sert à enregistrer de manière quantitative la concentra ­
tion de l'échantillon qui est élué de la colonne. En vue d'éviter un élargissement indésirable des pics, le volume de la cuvette du détec ­
teur sera choisi aussi petit que possible. Il ne doit pas excéder 10 μl, 
sauf pour les détecteurs par diffusion de la lumière et les viscosimè ­
tres. La détection s'effectue généralement par réfractométrie différen ­
tielle. Toutefois, si les propriétés spécifiques de l'échantillon ou du solvant d'élution l'exigent, d'autres types de détecteurs peuvent être 
utilisés tels que les détecteurs UV/VIS ou IR, les viscosimètres, etc.
 
2. RÉSULTATS ET PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
2.1. RÉSULTATS  
On se référera à la norme DIN (1) pour ce qui concerne les critères 
d'évaluation détaillés, de même que pour les spécifications relatives à la collecte et au traitement des données.
 
Pour chaque échantillon analysé, on réalisera deux expériences indé ­
pendantes. Leurs résultats seront analysés séparément.  
Il est nécessaire d'indiquer explicitement que les valeurs mesurées 
sont des valeurs relatives correspondant a des équivalents de masse moléculaire de l'étalon utilisé.
 
Dans tous les cas, il est essentiel de déterminer aussi les données 
relatives aux blancs, ceux-ci étant traités de la même manière que les échantillons.
 
Après avoir déterminé les volumes et les temps de rétention (éven ­
tuellement corrigés au moyen d'un étalon interne), on porte en 
graphique les valeurs de log M  p (M p représentant les maxima des 
pics des polymères d'étalonnage) en fonction de l'une de ces quan ­
tités. Deux points d'étalonnage au moins sont nécessaires pour chaque facteur 10 de masse moléculaire; cinq points de mesure au 
moins sont requis, pour la courbe dans son ensemble qui doit couvrir 
la masse moléculaire estimée de l'échantillon. Le point extrême de la courbe d'étalonnage du côté des faibles masses moléculaires peut être défini grâce au n-hexylbenzène ou à un autre soluté non polaire 
approprié. On détermine la portion de la courbe correspondant aux 
masses moléculaires inférieures à 1 000 et on la corrige, si néces ­
saire, pour tenir compte des impuretés et des additifs. Les courbes d'élution sont généralement évaluées au moyen d'un système élec ­
tronique de traitement des données. Si on a recours à un traitement 
manuel, il est opportun de consulter l'ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 138
 
Si un polymère insoluble est retenu sur la colonne, sa masse molé ­
culaire est vraisemblablement supérieure à celle de la fraction soluble 
et il faut en tenir compte pour éviter de surestimer la teneur en polymères de faible masse moléculaire. On trouvera en annexe des indications permettant de corriger la teneur en polymères de faible 
masse moléculaire pour tenir compte des polymères insolubles.
 
La courbe de distribution doit être présentée sous la forme d'un 
tableau ou d'un graphique (fréquence-différentielle ou pourcentages cumulatifs en fonction du log M). Dans la représentation graphique, 
une puissance de dix de masse moléculaire doit normalement corres ­
pondre à une largeur de 4 cm environ, tandis que pour le maximum du pic une hauteur de 8 cm environ est adéquate. Dans le cas de courbes de distribution cumulatives, la différence entre 0 et 100 pour 
cent sur l'axe des ordonnées doit être d'environ 10 cm.
 
2.2. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai doit comporter les renseignements suivants:  
2.2.1.  Substance à tester  
— renseignements disponibles sur la substance à tester (nature, addi ­
tifs, impuretés),  
— description du traitement de l'échantillon, observations, 
problèmes.  
2.2.2.  Dispositif expérimental  
— réservoir d'éluant, gaz inerte, dégazage de l'éluant, composition 
de l'éluant, impuretés,  
— pompe, amortisseur d'impulsions, système d'injection,  
— colonnes de séparation (fabricant, toutes précisions sur les carac ­
téristiques de la colonne, telles que taille des pores, nature du matériel de séparation, etc., nombre, longueur et ordre des colonnes utilisées),
 
— nombre de plateaux théoriques de la colonne (ou de la combi ­
naison de colonnes), efficacité de la séparation (résolution du système),
 
— informations sur la symétrie des pics,  
— température de la colonne, mode de régulation de la température,  
— détecteur (principe de mesure, type, volume de la cuvette),  
— débitmètre s'il y en a un (fabricant, principe de mesure),  
— système utilisé pour rassembler et pour traiter les données (maté ­
riel et logiciel).  
2.2.3.  Étalonnage du système  
— description détaillée de la méthode utilisée pour établir la courbe 
d'étalonnage,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 139
 
— précisions sur les critères de qualité propres à cette méthode 
(par exemple, coefficient de corrélation, erreur quadratique 
moyenne, etc.),  
— informations sur toutes les extrapolations, hypothèses et approxi ­
mations effectuées au cours des processus expérimentaux, ainsi que sur l'évaluation et le traitement des données,
 
— toutes les mesures effectuées pour établir la courbe d'étalonnage 
doivent être présentées dans un tableau qui comporte, pour 
chaque point d'étalonnage, les informations suivantes:  
— nom de l'échantillon,  
— fabricant de l'échantillon,  
— valeurs caractéristiques M  p , M  o , M  w , M  w /M n des étalons 
fournies par le fabricant déduites de mesures ultérieures, 
complétées d'indications relatives à la méthode de détermi ­
nation,  
— volume d'injection et concentration d'injection,  
— valeur de M  p utilisée pour l'étalonnage,  
— volume d'élution ou temps de rétention corrigé mesuré aux 
maxima des pics,  
— M  p calculée au maximum du pic,  
— pourcentage d'erreur sur la M  p calculée et sur la valeur d'éta ­
lonnage.  
2.2.4.  Renseignements sur la teneur en polymères de faible masse molé ­
culaire  
— description des méthodes d'analyse utilisées et de la manière dont 
les expériences ont été menées,  
— informations sur le pourcentage que représente la teneur en 
espèces de faible masse moléculaire (poids/poids) par rapport à 
l'ensemble de l'échantillon,  
— informations sur les impuretés, les additifs et les autres subs ­
tances non polymériques en pourcentage pondéral de l'ensemble de l'échantillon.
 
2.2.5.  Évaluation  
— évaluation en fonction du temps: toutes méthodes visant à 
améliorer la reproductibilité requise (méthode de corrections, 
étalon interne, etc.),  
— préciser si l'évaluation a été effectuée à partir du volume d'élution 
ou à partir du temps de rétention,  
— indiquer les limites de l'évaluation si un pic n'est pas complète ­
ment analyse,  
— décrire les méthodes de lissage lorsqu'on y a recours.  
— décrire les procédés de préparation et de prétraitement de l'échan ­
tillon,  
— indiquer la présence de particules non dissoutes, s'il y en a,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 140
 
— indiquer le volume d'injection ( μl) et la concentration d'injection 
(mg/ml),  
— mentionner les observations témoignant d'effets qui engendrent 
des déviations par rapport au profil idéal de chromatographie sur gel perméable,
 
— décrire en détail toutes les modifications aux procédures d'essais,  
— préciser les intervalles d'erreur,  
— consigner toutes autres informations et observations utiles pour 
interpréter les résultats.  
3. RÉFÉRENCES  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J. et Bly, D.D. (eds.) (1979). Modem 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley & Sons.  
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC), American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phie, Pennsylvanie.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography, American Society for Testing and Materials, Philadelphie, Penn ­
sylvanie.
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Annexe  
Indications permettant de corriger la teneur en polymères de faible masse 
moléculaire pour tenir compte des polymères insolubles  
La présence d'un polymère insoluble dans un échantillon entraîne une perte de 
masse au cours de l'analyse par chromatographie sur gel perméable. Le polymère 
insoluble est irréversiblement retenu sur la colonne ou sur le filtre à échantillon 
lorsque la partie soluble de l'échantillon traverse la colonne. Si l'indice de réfrac ­
tion différentiel (dn/dc) du polymère peut être estimé ou mesuré, il est possible d'estimer la masse que l'échantillon a perdue sur la colonne. Dans ce cas, on 
effectue une correction à l'aide d'un étalonnage externe du réfractomètre, avec des 
étalons dont on connaît la concentration et le dn/dc. Dans l'exemple qui suit, on utilise un étalon de poly(méthacrylate de méthyle).
 
L'étalonnage externe pratiqué lors de l'analyse des polymères acryliques consiste 
à analyser par chromatographie sur gel perméable une solution étalon de concen ­
tration connue de poly(méthacrylate de méthyle) dans du tétrahydrofuranne; les 
résultats servent à calculer la constante du réfractomètre selon l'équation suivante:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
où 
K = est la constante du réfractomètre (microvolts secondes/ml)  
R = est la réponse de l'étalon de poly(méthacrylate de méthyle) 
(microvolts secondes)  
C = est la concentration de l'étalon de poly(méthacrylate de méthyle) 
(mg/ml)  
V = est le volume d'injection (ml) et  
dn/dc = est l'indice de réfraction différentiel d'une solution de poly(méthacry ­
late de méthyle) dans du tétrahydrofuranne (ml/mg).  
Les données suivantes caractérisent généralement un étalon de poly(méthacrylate 
de méthyle):  
R = 2 937 891;  
C = 1,07 mg/ml;  
V = 0,1 ml;  
dn/dc = 9 x 10  – 5 ml/mg.  
La valeur de K résultante, 3,05 x 10  11 , est ensuite utilisée pour calculer la 
réponse théorique du détecteur, c'est-à-dire celle qu'on obtiendrait si 100 pour cent du polymère injecté était élué à travers le détecteur.
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A.20.  COMPORTEMENT DE DISSOLUTION — EXTRACTION DES 
POLYMÈRES DANS L'EAU  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite reprend la version révisée de la ligne directrice 
OCDE TG 120 (1997). On trouvera davantage de renseignements 
techniques en référence (1).  
1.1. INTRODUCTION  
Dans le cas de certains polymères, tels que les polymères en émul ­
sion, un travail préparatoire initial peut être nécessaire avant utilisa ­
tion de la méthode exposée. La méthode n'est pas applicable aux 
polymères liquides ni aux polymères qui réagissent avec l'eau dans 
les conditions d'essai.  
Lorsque la méthode est difficile ou impossible à mettre en pratique, 
le comportement de dissolution-extraction des polymères peut être 
étudié par d'autres méthodes. Dans ce cas, la méthode utilisée devra 
être entièrement détaillée et justifiée.  
1.2. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Le comportement de dissolution — extraction des polymères en 
milieu aqueux est déterminé par la méthode du flacon (voir A.6, Solubilité dans l'eau, méthode du flacon), en y apportant les modi ­
fications décrites ci-après.
 
1.4. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Néant  
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.5.1.  Appareillage  
L'appareillage nécessaire à l'application de la méthode est le suivant:  
— un dispositif permettant de réduire l'échantillon en poudre, tel 
qu'un broyeur produisant des particules de taille déterminée  
— un système d'agitation avec possibilité de régler la température  
— un système de filtration sur membrane  
— un dispositif d'analyse  
— des tamis normalisés.  
1.5.2.  Préparation de la solution de l'échantillon  
Il convient de réduire d'abord un échantillon représentatif à l'état de 
particules d'une taille comprise entre 0,125 et 0,25 mm en utilisant des tamis appropriés. Il peut être nécessaire de refroidir pour garantir la stabilité de l'échantillon ou pour procéder au broyage. Les maté ­
riaux du type du caoutchouc peuvent être pulvérisés à la température 
de l'azote liquide (1).
 
S'il n'est pas possible d'obtenir des particules de la dimension 
requise, on doit s'efforcer de réduire autant que possible la taille des particules et consigner le résultat. Dans le rapport, il est néces ­
saire d'indiquer comment l'échantillon pulvérisé a été conservé avant 
l'analyse.
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1.5.3.  Procédure  
On pèse trois échantillons de la substance à tester, de 10 g chacun, 
dans trois récipients pourvus de bouchons en verre et on ajoute 1 000 ml d'eau dans chacun des récipients. Si la manipulation de 10 g de 
polymère s'avère impossible, il convient d'utiliser la quantité la plus 
grande qui puisse être manipulée, le volume d'eau étant ajusté en proportion.
 
Les récipients sont soigneusement bouchés, puis agités à 20  o C. On 
doit employer un dispositif d'agitation qui puisse fonctionner à température constante. Après une période de 24 heures, le contenu de chaque récipient est centrifugé ou filtré et la concentration du 
polymère dans la phase aqueuse limpide est déterminée à l'aide 
d'une méthode d'analyse appropriée. S'il n'existe pas de méthode permettant une analyse adéquate de la phase aqueuse, on peut obtenir une estimation de la solubilité-extractibilité totale en 
pesant, après séchage, le résidu filtré ou le précipité centrifugé.
 
Il est également nécessaire de différencier au plan quantitatif les 
impuretés et les additifs, d'une part, et les espèces de faible masse moléculaire, d'autre part. Dans le cas d'une détermination par gravi ­
métrie, il est important de réaliser un essai à blanc, c'est-à-dire sans 
utiliser la substance à tester, de manière à pouvoir tenir compte des résidus générés par la méthode expérimentale.
 
On peut déterminer de la même manière le comportement de dissolu ­
tion — extraction des polymères dans l'eau à 37  o C à pH 2 et pH 9 
tel que décrit pour l'expérience réalisée à 20  o C. Les valeurs de pH 
peuvent être obtenues par addition de tampons adéquats ou d'acides et de bases appropriés tels que l'acide chlorhydrique, l'acide acétique, 
les hydroxydes de sodium et de potassium de qualité pour analyse ou 
l'ammoniac.
 
Il convient de mener un ou deux essais, suivant la méthode d'analyse 
utilisée. Lorsqu'on dispose de méthodes suffisamment spécifiques 
pour l'analyse directe du polymère en phase aqueuse, un essai tel 
que décrit plus haut devrait suffire. Mais quand ces méthodes n'exis ­
tent pas et que la détermination du comportement de dissolution- extraction du polymère ne peut se faire que par une analyse indi ­
recte, c'est-à-dire uniquement par la détermination de la teneur en 
carbone organique total (COT) de l'extrait aqueux, il est nécessaire de réaliser un essai supplémentaire. Celui-ci doit aussi être effectué en trois exemplaires, avec des échantillons de polymère dix fois plus 
petits et les mêmes quantités d'eau que celles qui ont été utilisées 
dans le premier essai.
 
1.5.4.  Analyse  
1.5.4.1.  Essais réalisés sur des échantillons d'une seule taille  
Il est possible que l'on dispose de méthodes permettant une analyse 
directe des polymères en phase aqueuse. Sinon, l'analyse indirecte 
des polymères dissous ou extraits peut aussi être envisagée. Pour ce faire, on détermine la teneur totale en parties solubles et on la corrige pour tenir compte des substances non polymériques.
 
L'analyse de l'extrait aqueux pour déterminer la teneur totale en 
espèces polymériques peut être réalisée;  
soit par une méthode suffisamment sensible, par exemple.  
— la détermination du COT par la digestion au persulfate ou au 
dichromate pour donner du CO  2 , suivie d'une estimation par IR 
ou d'une analyse chimique,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 144
 
— la spectrométrie d'absorption atomique (SAA) ou son équivalent 
en émission d'un plasma couplé par induction (PCI), dans le cas 
des polymères contenant du silicium ou un métal,  
— l'absorption UV ou la spectrofluorimétrie pour les polymères 
arylés,  
— la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie 
de masse pour les échantillons de faible masse moléculaire,  
soit par évaporation à sec, sous vide, de l'extrait aqueux, suivie d'une 
analyse du résidu par spectroscopie (IR, UV, etc.) ou par SAA-PCI.  
Si une telle analyse de la phase aqueuse est impossible, l'extrait 
aqueux sera obtenu au moyen d'un solvant organique non miscible à l'eau (un hydrocarbure chlore, par exemple). Le solvant est alors 
évaporé et le résidu analysé, par ex. par IR, UV ou SAA-PCI, pour 
déterminer sa teneur en polymère notifié. Tous les constituants de ce résidu qui s'avèrent être des impuretés ou des additifs doivent être soustraits dans le but de déterminer le degré de dissolution — extrac ­
tion du polymère lui-même.
 
Lorsque de telles substances sont présentes en quantités relativement 
importantes, il peut être nécessaire de soumettre le résidu à une 
analyse par chromatographie en phase liquide à haute performance 
ou en phase gazeuse, par exemple, afin de différencier ces impuretés des monomères et des dérivés des monomères présents, de telle sorte que la teneur réelle en ces dernières espèces puisse être déterminée.
 
Dans certains cas, une simple évaporation à sec du solvant orga ­
nique, suivie de la pesée du résidu sec, peut suffire.  
1.5.4.2.  Essais réalisés sur des échantillons de deux tailles différentes  
La teneur en carbone organique total doit être déterminée pour tous 
les extraits aqueux.  
Une détermination par gravimétrie est réalisée sur la partie non 
dissoute ou non extraite de l'échantillon. Si, après la centrifugation ou la filtration du contenu de chaque récipient, des résidus de poly ­
mère adhèrent encore à la paroi d'un récipient, il faut rincer ce 
dernier avec le filtrat jusqu'à ce qu'il ne comporte plus aucune 
trace visible de résidus. Après quoi, le filtrat est à nouveau filtré ou centrifugé. Les résidus déposés sur le filtre ou dans le tube de centrifugation sont séchés à 40
 o C sous vide et pesés. On poursuit le 
séchage jusqu'à obtention d'une masse constante.  
2. RÉSULTATS  
2.1. ESSAIS RÉALISÉS SUR DES ÉCHANTILLONS D'UNE SEULE 
TAILLE  
Les résultats obtenus pour chacun des trois flacons, ainsi que les 
valeurs moyennes, doivent être consignés et exprimés en unités de 
masse par volume de solution (généralement en mg/l) ou en unités de masse par masse d'échantillon de polymère (habituellement en mg/g). En outre, la perte de masse de l'échantillon (calculée en 
divisant la masse du soluté par la masse de l'échantillon initial) 
sera également mentionnée. Les écarts-types relatifs doivent être calculés. Les diverses valeurs seront consignées à la fois pour le produit total (polymère + principaux additifs, etc.) et pour le poly ­
mère seul (à savoir, après soustraction de la contribution relative à de 
tels additifs).
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2.2. ESSAIS RÉALISÉS SUR DES ÉCHANTILLONS DE DEUX 
TAILLES DIFFÉRENTES  
Les différentes concentrations du carbone organique total dans les 
extraits aqueux provenant des deux séries de trois expériences, ainsi 
que la valeur moyenne pour chaque série, doivent être consignées et 
exprimées en unités de masse par volume de solution (généralement en mgC/l), ainsi qu'en unités de masse par masse de l'échantillon initial (généralement en mgC/g).
 
S'il n'y a pas de différence entre les résultats correspondant aux 
rapports taille de l'échantillon/volume d'eau élevés et bas, cela peut indiquer que tous les constituants susceptibles d'être extraits l'ont effectivement été. Si tel est le cas, une analyse directe n'est, en 
principe, pas nécessaire.
 
Les différentes masses des résidus doivent être consignées et expri ­
mées en pourcentage des masses initiales des échantillons. On calcu ­
lera les valeurs moyennes pour chaque expérience. La différence entre 100 et le pourcentage obtenu représente le pourcentage de 
matières solubles et extractibles dans les échantillons de départ.
 
3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai doit comporter les renseignements suivants:  
3.1.1.  Substance à tester  
— renseignements disponibles sur la substance à tester (nature, addi ­
tifs, impuretés, proportion d'espèces de faible masse moléculaire).  
3.1.2.  Conditions expérimentales  
— description des méthodes utilisées et des conditions expérimen ­
tales,  
— description des méthodes d'analyse et de détection.  
3.1.3.  Résultats  
— résultats de solubilité — extractibilité en mg/l: toutes les valeurs 
et la valeur moyenne obtenues pour les essais d'extraction dans 
les différentes solutions, ventilées en polymères et impuretés, additifs, etc.,
 
— résultats de solubilité — extractibilité en mg/g de polymère,  
— concentrations du carbone organique total dans les extraits 
aqueux, masse du soluté et pourcentages calculés, si on en fait 
la mesure,  
— pH de chaque échantillon,  
— informations sur les valeurs obtenues dans les essais à blanc,  
— description des méthodes d'analyse et de détection,  
— si nécessaire, mention de l'instabilité chimique de la substance à 
tester durant la procédure d'essai et durant la procédure d'analyse,  
— toutes les informations importantes pour interpréter les résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
fur Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 146
 
A.21.  PROPRIÉTÉS COMBURANTES (LIQUIDES)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode vise à déterminer l'aptitude d'un liquide à 
accroître la vitesse de combustion ou l'intensité de la combustion 
d'une substance combustible, ou de provoquer l'inflammation spon ­
tanée d'une substance combustible avec laquelle il est mélangé de manière homogène. La méthode repose sur l'épreuve des Nations 
unies pour les liquides comburants (1) et en est l'équivalent. Toute ­
fois, comme cette méthode A.21 est avant tout conçue pour satisfaire aux exigences du règlement 1907/2006, une seule substance de réfé ­
rence est nécessaire pour effectuer la comparaison. Il peut être néces ­
saire d'effectuer des tests et des comparaisons avec d'autres subs ­
tances de référence lorsque les résultats du test doivent être utilisés à d'autres fins (
 1 ). 
Il n'est pas nécessaire d'effectuer ce test lorsque l'examen de la 
formule structurale établit indubitablement que la substance est inca ­
pable de présenter une réaction exothermique avec un combustible.  
Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les 
éventuelles propriétés explosives de la substance avant de pratiquer ce test.
 
Ce test ne s'applique pas aux solides, gaz, substances explosives ou 
hautement inflammables, ni aux peroxydes organiques.  
Il n'est pas nécessaire d'effectuer ce test lorsque l'on dispose déjà, 
pour la substance concernée, des résultats de l'épreuve des Nations unies pour les liquides comburants (1).
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le temps moyen de montée en pression est la moyenne des temps 
mesurés pour que le mélange testé produise une élévation de pres ­
sion de 690 kPa à 2 070 kPa au-dessus de la pression atmosphérique.  
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
La substance de référence est une solution aqueuse d'acide nitrique 
(qualité pour analyse) à 65 % (poids/poids) (  2 ). ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 147  
( 1 ) Comme par exemple dans le cadre du règlement des Nations unies sur les transports. 
( 2 ) L'acide doit être titré avant l'essai, afin de confirmer sa concentration.
 Le cas échéant, si l'expérimentateur prévoit que les résultats de ce 
test seront peut-être utilisés à d'autres fins (  1 ), il peut également être 
indiqué de tester d'autres substances de référence (  2 ). 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Le liquide à tester est mélangé avec de la cellulose fibreuse dans un 
rapport massique de 1 pour 1 et placé dans une bombe. Si le 
mélange s'enflamme spontanément lors du mélange ou du remplis ­
sage, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai.  
Si le mélange ne s'enflamme pas spontanément, il y lieu d'effectuer 
l'essai complet. Le mélange est chauffé dans la bombe et le temps moyen que met la pression pour s'élever de 690 kPa à 2 070 kPa au- 
dessus de la pression atmosphérique est déterminé. Ce résultat est 
comparé au temps moyen de montée en pression pour le mélange 1:1 de la (des) substance(s) de référence et de cellulose.
 
1.5 CRITÈRES DE QUALITÉ  
Dans une série de cinq essais sur une substance, aucun résultat ne 
devrait s'écarter de plus de 30 % de la moyenne arithmétique. Les résultats qui diffèrent de plus de 30 % de la moyenne devraient être 
rejetés, la procédure de mélange et de remplissage améliorée et les 
essais répétés.
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Préparation  
1.6.1.1.  Substance combustible  
Comme matériau combustible on utilise de la cellulose fibreuse 
séchée ayant une longueur de fibre comprise entre 50 et 250 μm 
pour un diamètre de 25 μm (  3 ). On la fait sécher en couche de moins 
de 25 mm d'épaisseur à 105  o C pendant 4 heures jusqu'à obtention 
d'un poids constant, puis on la maintient dans un dessiccateur en présence de dessiccant jusqu'à refroidissement et utilisation. La 
teneur en eau doit être inférieure à 0,5 % en masse (rapportée au 
poids sec) (
 4 ). Si cela est nécessaire pour satisfaire à cette condition, 
la durée de séchage doit être prolongée (  5 ). Le même lot de cellulose 
doit être utilisé tout au long des essais.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 148  
( 1 ) Comme par exemple dans le cadre du règlement des Nations unies sur les transports. 
( 2 ) Par exemple: acide perchlorique à 50 % (poids/poids) et chlorate de sodium à 40 % 
(poids/poids) sont utilisés dans la référence 1. 
( 3 ) Par exemple Cellulose en poudre Whatman pour chromatographie sur colonne CF 11, 
n o de catalogue 4021 050. 
( 4 ) Confirmé par titrage Karl-Fisher par exemple. 
( 5 ) On peut également obtenir cette teneur en eau, par exemple, en chauffant à 105  o C 
pendant 24 heures sous vide.
 1.6.1.2.  Appareillage  
1.6.1.2.1. B o m b e  
On doit disposer d'une bombe. Le dispositif d'essai est constitué par 
une bombe cylindrique en acier de 89 mm de longueur et de 60 mm de diamètre extérieur (voir figure 1). La bombe comporte deux plats usinés en des points diamétralement opposés (réduisant sa largeur à 
cet endroit à 50 mm), ce qui permet de l'immobiliser pour le serrage 
du bouchon de mise à feu et du bouchon à évent. Elle est alésée intérieurement à 20 mm et comporte aux deux extrémités un cham ­
brage de 19 mm de profondeur taraudé au pas de 1 en tube norma ­
lisé BSP (British Standard Pipe) ou son équivalent métrique. Une 
prise de pression est vissée latéralement dans le corps de la bombe à 35 mm d'une extrémité, et à un angle de 90
 o par rapport aux plats. 
Elle se visse dans un chambrage de 12 mm de profondeur taraudé au 
pas de 1/2 en tube normalisé BSP (ou l'équivalent métrique). Si 
nécessaire, un joint en un matériau inerte est utilisé pour assurer l'étanchéité au gaz. La prise de pression fait saillie latéralement de 55 mm par rapport au corps de la bombe et elle est percée d'un trou 
axial de 6 mm. Elle comporte à son extrémité extérieure un cham ­
brage taraudé pour recevoir un capteur de pression du type à diaphragme. Tout autre type de dispositif de mesure de la pression peut être utilisé, à condition qu'il résiste aux gaz chauds et produits 
de décomposition et qu'il puisse réagir à des accroissements de pres ­
sion de 690 à 2 070 kPa en moins de 5 ms.
 
L'extrémité de la bombe la plus éloignée du raccord est fermée par 
un bouchon fileté qui porte deux électrodes, dont l'une est isolée du 
corps du bouchon et l'autre mise à la masse. L'autre extrémité est 
fermée par un disque de rupture en aluminium de 0,2 mm d'épaisseur (taré à une pression d'environ 2 200 kPa), maintenu en place par un bouchon comportant un évent de 20 mm. Si nécessaire, un joint 
inerte est utilisé pour assurer la bonne étanchéité entre le bouchon 
et la bombe. Un porte-bombe spécial (figure 2) permet de maintenir la bombe dans la position voulue pendant les essais. Il est généra ­
lement constitué par une embase en acier doux de 235 mm × 
184 mm × 6 mm, sur laquelle est soudé obliquement un tube de 
section carrée (de 70 mm × 70 mm × 4 mm) de 185 mm de longueur.
 
À une extrémité du tube carré, on a enlevé une certaine longueur de 
métal sur deux faces opposées, ce qui laisse une longueur de 86 mm 
de tube carré prolongée par deux côtés plats. Les extrémités de ces plats sont coupées à 60
 o par rapport à l'axe du tube et soudées à la 
plaque d'embase. Une encoche de 22 mm de large et de 46 mm de 
profondeur est découpée sur un côté en haut du tube carré, de telle 
manière que lorsque la bombe repose sur le support, bouchon de mise à feu vers la base, le raccord de prise de pression vienne s'y loger. Une entretoise en acier de 30 mm de largeur et 6 mm d'épais ­
seur est soudée sur la paroi intérieure du tube du côté orienté vers le 
bas. Deux trous taraudés dans le côté opposé reçoivent des vis à molettes de 7 mm, qui servent à fixer la bombe. Deux rebords en acier de 12 mm de largeur et de 6 mm d'épaisseur, soudés sur les 
flancs du support à la base de la section carrée soutiennent la cuve 
par le fond.
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1.6.1.2.2. S y s t è m e d ' a l l u m a g e  
Le système d'allumage est constitué par un enroulement de fil au 
Ni/Cr de 25 cm de longueur, de 0,6 mm de section, et d'une résis ­
tance électrique de 3,85 ohm/m. Le fil a été enroulé en forme de bobine sur un mandrin de 5 mm de diamètre; ses extrémités sont reliées aux électrodes du bouchon de mise à feu. La bobine doit 
avoir l'une des configurations présentées à la figure 3. La distance 
entre la face supérieure du bouchon et le point le plus bas de l'en ­
roulement de chauffage doit être de 20 mm. Si les électrodes ne sont pas réglables en longueur, les deux sections de fil chauffant situées 
entre la bobine et la face supérieure du bouchon doivent être isolées 
par une gaine de céramique. Le fil doit être alimenté par une source électrique stable pouvant fournir une intensité d'au moins 10 A.
 
1.6.2.  Réalisation de l'essai  ( 1 ) 
La bombe montée, avec son capteur de pression, mais non fermée 
par son disque de rupture, est posée bouchon d'allumage vers le bas 
dans son support. On mélange 2,5 g du liquide à essayer avec 2,5 g de cellulose séchée dans un bécher en verre à l'aide d'un agitateur en 
verre (
 2 ). Pour des raisons de sécurité, lors de cette opération, le 
manipulateur devrait s'abriter derrière un écran de protection. Si le mélange s'enflamme spontanément au cours du mélange ou du remplissage, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. On 
remplit la bombe en plusieurs fois en tassant par petits chocs 
contre un objet dur; on s'assure qu'il n'y a pas de vide autour de l'enroulement de chauffage et que le mélange est directement en contact avec celui-ci. On doit cependant veiller à ne pas déformer 
l'enroulement en tassant le mélange car cela pourrait entraîner des 
résultats erronés (
 3 ). On met en place le disque de rupture et on visse 
le bouchon à évent en le bloquant. La bombe chargée est alors posée sur le porte-bombe, disque de rupture vers le haut, l'ensemble étant 
placé dans une hotte blindée ou dans une chambre de tir. On 
raccorde les bornes extérieures du bouchon de mise à feu à une source électrique et on applique au dispositif de chauffage un courant de 10 A. Il ne devrait pas s'écouler plus de 10 minutes 
entre le début de la préparation du mélange et le moment de la 
mise sous tension.
 
Le signal émis par le capteur de pression est enregistré sur un 
système permettant d'effectuer un enregistrement permanent de la 
courbe pression/temps et une analyse de cette courbe (enregistreur de signaux transitoires couplé à un enregistreur à bande de papier par exemple). Le mélange est chauffé jusqu'à rupture du disque ou 
pendant une durée d'au moins 60 s. S'il n'y a pas rupture, on doit 
attendre que le mélange ait refroidi avant d'ouvrir la bombe prudem ­
ment au cas où celle-ci serait encore sous pression. Cinq essais sont exécutés avec le mélange et avec chacune des substances de réfé ­
rence. On note le temps nécessaire pour monter de 690 kPa à 2 070 
kPa (pression manométrique). Le temps moyen de montée en pres ­
sion est calculé.
 
Dans certains cas, des substances peuvent engendrer une augmenta ­
tion de pression (trop élevée ou trop faible), due à des réactions chimiques non caractéristiques des propriétés comburantes de ces substances. Il peut alors se révéler nécessaire de répéter l'épreuve 
en remplaçant la cellulose par une substance inerte, par exemple la 
diatomite (kieselguhr), afin de s'assurer de la nature de la réaction.
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( 1 ) Les mélanges de substances comburantes avec de la cellulose doivent être traités comme 
potentiellement explosifs et manipulés avec le plus grand soin. 
( 2 ) Dans la pratique, cela peut être réalisé en préparant un mélange 1:1 du liquide à essayer 
et de cellulose en quantité plus importante que ce qui est nécessaire pour l'essai et en 
transférant 5 ± 0,1 g dans la bombe. Un nouveau mélange doit être préparé pour chaque 
essai. 
( 3 ) Il convient notamment d'éviter tout contact entre les spires adjacentes de la bobine.
 2. DONNÉES  
Temps de montée en pression à la fois pour la substance à essayer et 
pour la (les) substance(s) de référence. Temps de montée en pression pour les essais avec une substance inerte, le cas échéant.
 
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Le temps moyen de montée en pression est calculé à la fois pour la 
substance à essayer et pour la (les) substances(s) de référence.  
Le temps moyen de montée en pression est calculé pour les essais 
réalisés, avec une substance inerte (le cas échéant).  
Le tableau 1 présente quelques exemples.  
Tableau 1  
Exemples de résultats  ( a ) 
Substance (  b ) Temps moyen de montée en pression pour un mélange 
1:1 avec de la cellulose 
(ms) 
Dichromate d'ammonium, solution aqueuse saturée 20 800 
Nitrate de calcium, solution aqueuse saturée 6 700 Nitrate ferrique, solution aqueuse saturée 4 133 Perchlorate de lithium, solution aqueuse saturée 1 686 Perchlorate de magnésium, solution aqueuse saturée 777 
Nitrate de nickel, solution aqueuse saturée 6 250 
Acide nitrique, 65 % 4 767 (
 c ) 
Acide perchlorique, 50 % 121 (  c ) 
Acide perchlorique, 55 % 59 Nitrate de potassium, 30 % solution aqueuse 26 690 Nitrate d'argent, solution aqueuse saturée (
 d ) 
Chlorate de sodium, 40 % solution aqueuse 2 555 (  c ) 
Nitrate de sodium, 45 % solution aqueuse 4 133  
Substance inerte  
Eau: cellulose (  d ) 
( a ) Voir référence (1) pour le classement au transport selon le système des Nations unies. 
( b ) Les solutions saturées doivent être préparées à 20  o C. 
( c ) Valeur moyenne d'après des essais interlaboratoires de comparaison. 
( d ) Pression maximale de 2 070 kPa non atteinte.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 151
 
3. COMPTE RENDU  
3.1. COMPTE RENDU DE L'ESSAI  
Le compte rendu de l'essai doit comprendre les informations 
suivantes:  
— l'identité, la composition, la pureté, etc. de la substance essayée,  
— la concentration de la substance,  
— la méthode de séchage de la cellulose employé,  
— la teneur en eau de la cellulose utilisé,  
— le résultat des mesures,  
— le résultat des essais réalisés avec une substance inerte, le cas 
échéant,  
— les temps moyens de montée en pression calculés,  
— tout écart par rapport à cette méthode et les raisons de celui-ci,  
— toute information ou remarque complémentaire présentant un 
intérêt pour l'interprétation des résultats.  
3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS (  1 ) 
Pour l'évaluation des résultats, on se fonde:  
a) sur le fait que le mélange substance à essayer/cellulose s'en ­
flamme spontanément ou non;  
b) sur la comparaison du temps moyen de montée de 690 kPa à 
2 070 kPa (pression manométrique) avec le temps moyen obtenu pour la (les) substance(s) de référence.
 
Une substance liquide doit être considérée comme comburante 
lorsque:  
a) un mélange 1:1, en poids, de la substance et de cellulose s'en ­
flamme spontanément; ou  
b) un mélange 1:1, en poids, de la substance et de cellulose présente 
un temps moyen de montée en pression inférieur ou égal au 
temps moyen de montée en pression d'un mélange 1:1, en 
poids, d'une solution aqueuse d'acide nitrique à 65 % (poids/ poids) et de cellulose.
 
Afin d'éviter les faux positifs, il y a lieu, si nécessaire, de tenir 
également compte, lors de l'interprétation des résultats, des résultats obtenus dans les essais de la substance avec un matériel inerte.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 152  
( 1 ) Voir la référence 1 pour l'interprétation des résultats des essais effectués selon le règle ­
ment des Nations unies sur le transport, qui utilisent plusieurs substances de référence.
 4. RÉFÉRENCES  
(1) Recommandations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publica ­
tion No: ST/SG/AC.lO/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: 
Test for oxidizing liquids.  
Figure 1  
Bombe
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 153
 
Figure 2  
Porte-bombe
  
Figure 3  
Système d'allumage
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 154
 
A.22.  DIAMÈTRE MOYEN GÉOMÉTRIQUE PONDÉRÉ PAR LA 
LONGUEUR DES FIBRES  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode décrit une procédure permettant de mesurer le 
diamètre moyen géométrique pondéré par la longueur (LWGMD) de 
fibres minérales artificielles (FMA) en vrac. Dans la mesure où le LWGMD de la population a une probabilité de 95 % d'être compris dans les limites de confiance à 95 % (LWGMD ± deux erreurs 
types) de l'échantillon, la valeur rapportée (valeur d'essai) sera la 
limite de confiance inférieure à 95 % de l'échantillon (c'est-à-dire LWGMD — deux erreurs types). Cette méthode repose sur une mise à jour (juin 1994) d'une ébauche de procédure industrielle du HSE 
approuvée lors d'une réunion entre l'ECFIA et le HSE, à Chester, le 
26 septembre 1993, et développée aux fins et sur la base d'un deuxième essai interlaboratoire (1, 2). Cette méthode de mesure peut être utilisée pour caractériser le diamètre des fibres de subs ­
tances ou de produits en vrac contenant des FMA, et notamment des 
fibres céramiques réfractaires (FCR), des fibres vitreuses artificielles (FVA) et des fibres cristallines et polycristallines.
 
La pondération par la longueur permet de compenser les répercus ­
sions sur la distribution du diamètre de la cassure des fibres longues 
lors de l'échantillonnage ou de la manipulation du matériau. Des statistiques géométriques (moyenne géométrique) sont utilisées pour mesurer la distribution des diamètres des FMA dans la 
mesure où cette distribution est en général proche de la loi log- 
normale.
 
La mesure de la longueur et du diamètre est une opération à la fois 
fastidieuse et longue, mais si seules les fibres en contact avec une 
ligne infiniment mince du champ de vision d'un MEB sont mesurées, 
la probabilité de sélectionner une fibre donnée est proportionnelle à sa longueur. Comme cette méthode tient compte de la longueur dans les calculs de pondération par la longueur, la seule mesure requise 
est le diamètre et le LWGMD-2ET peut être calculé comme décrit.
 
1.2. DÉFINITIONS  
Particule : objet dont le rapport longueur/largeur est inférieur à 3:1.  
Fibre : objet dont le rapport longueur/largeur (rapport d'aspect) est 
d'au moins 3:1.  
1.3. PORTÉE ET LIMITATIONS  
Cette méthode est conçue pour examiner la distribution des diamè ­
tres ayant un diamètre moyen compris entre 0,5 μm et 6 μm. Les 
diamètres supérieurs peuvent être mesurés à l'aide d'un grossissement 
inférieur du BEM, mais cette méthode est de plus en plus limitée à mesure que les distributions de fibres deviennent plus fines. Il est dès lors conseillé d'effectuer les mesures avec un microscope électro ­
nique à transmission (MET) si le diamètre moyen est inférieur 
à 0,5 μm.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 155
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Un certain nombre d'échantillons représentatifs sont prélevés sur un 
tissu en fibres ou dans un rembourrage en vrac. La longueur des fibres en vrac est réduite par pressage, puis un sous-échantillon 
représentatif est dispersé dans de l'eau. Des aliquotes sont extraites 
et filtrées à l'aide d'un filtre en polycarbonate à pores de 0,2 μm, 
avant d'être préparées pour l'examen à l'aide de techniques de micro ­
scopie électronique à balayage (MEB). Les diamètres des fibres sont 
mesurés grâce à un grossissement de l'écran de × 10 000 ou plus (
 1 ) 
à l'aide d'un échantillonnage linéaire, de manière à obtenir une estimation impartiale du diamètre moyen. L'intervalle de confiance 
inférieur à 95 % (sur la base d'un test unilatéral) est calculé afin 
d'obtenir une estimation de la valeur minimale du diamètre moyen géométrique des fibres du matériau.
 
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.5.1.  Sécurité/Précautions  
Il conviendra de réduire au minimum l'exposition aux fibres en 
suspension dans l'atmosphère, ainsi que d'utiliser une hotte ou une 
boîte à gants lors de la manipulation des fibres. Des contrôles pério ­
diques de l'exposition du personnel seront réalisés afin de déterminer l'efficacité des méthodes de contrôle. Lors de la manipulation des 
FMA, le personnel portera des gants jetables afin de réduire les 
risques d'irritation cutanée et d'éviter toute contamination croisée.
 
1.5.2.  Appareillage/Équipement  
— Presses et matrices (capables de produire 10 MPa).  
— Filtres en polycarbonate à pores capillaires de 0,2 μm (25 mm de 
diamètre).  
— Filtre membrane en ester de cellulose à pores de 5 μm destiné à 
être utilisé comme filtre secondaire.  
— Appareil de filtration en verre (ou systèmes de filtration jetables) 
conçus pour accueillir des filtres de 25 mm de diamètre (par 
exemple, kit de microanalyse en verre Millipore, type 
n o XX10 025 00).  
— Eau fraîchement distillée et filtrée au travers d'un filtre à pores de 
0,2 μm pour éliminer les micro-organismes.  
— Pulvérisateur cathodique avec cible en or ou or/palladium.  
— Microscope électronique à balayage avec une résolution pouvant 
descendre jusqu'à 10 nm et un grossissement × 10 000.  
— Divers: spatules, lame de scalpel de type 24, petites pinces, tubes 
MEB, colle carbone ou papier adhésif carbone, argent colloïdal.  
— Sonde ultrasonore ou bain d'ultrasons de laboratoire  
— Sonde ou perce-bouchon pour prélever des échantillons dans le 
tissu de FMA  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 156  
( 1 ) Cette valeur de grossissement est indiquée pour les fibres de 3 μm. Pour les fibres de 
6 μm, un grossissement de × 5 000 peut s'avérer plus pertinent.
 1.5.3.  Procédure d'essai  
1.5.3.1.  Échantillonnage  
Pour les tissus et les bains, une sonde ou un perce-bouchon de 
25 mm est utilisé pour prélever des échantillons de la coupe trans ­
versale. Les prélèvements doivent être effectués à des intervalles 
identiques sur toute la largeur d'une petite longueur de tissu ou être recueillis dans des zones aléatoires si de grandes longueurs sont disponibles. Le même équipement peut être utilisé pour extraire 
des échantillons aléatoires dans du rembourrage. Chaque fois que 
possible, six échantillons seront prélevés de manière à refléter les variations spatiales dans le matériau en vrac.
 
Les six échantillons doivent être pressés dans une matrice de 50 mm 
de diamètre à 10 MPa. Le matériau est ensuite mélangé à l'aide d'une spatule et pressé à nouveau à 10 MPa. Le matériau est ensuite retiré de la matrice et conservé dans une bouteille en verre hermétiquement 
fermée.
 
1.5.3.2.  Préparation de l'échantillon  
Si nécessaire, les liants organiques peuvent être éliminés en plaçant 
la fibre à l'intérieur d'un four à 450 °C pendant environ une heure.  
Utilisez des cônes pour la délimitation et coupez des quarts pour 
subdiviser l'échantillon (cette opération doit être réalisée à l'intérieur d'une enceinte à poussières).
 
Avec une spatule, ajoutez une petite quantité (< 0,5 g) d'échantillon 
à 100 ml d'eau fraîchement distillée et filtrée à l'aide d'un filtre membrane de 0,2 μm (d'autres sources d'eau ultrapure peuvent être 
utilisées à condition qu'elles soient de qualité satisfaisante). 
Dispersez soigneusement à l'aide d'une sonde ultrasonore fonction ­
nant à 100 W et réglée pour produire une cavitation (si vous ne disposez pas de sonde, utilisez la méthode suivante: agitez à plusieurs reprises et retournez pendant 30 secondes; envoyez des 
ultrasons dans un bain d'ultrasons de laboratoire pendant cinq 
minutes: puis agitez à nouveau à plusieurs reprises et retournez pendant 30 secondes supplémentaires).
 
Directement après la dispersion de la fibre, retirez un certain nombre 
d'aliquotes (par exemple, trois aliquotes de 3, 6 et 10 ml) à l'aide d'une pipette à goulot large (capacité de 2-5 ml).
 
Filtrez sous vide chaque aliquote au travers d'un filtre en polycarbo ­
nate de 0,2 μm soutenu par un filtre secondaire MEC à pores de 
5 μm, en utilisant un entonnoir de filtration en verre de 25 mm avec 
un réservoir cylindrique. Placez environ 5 ml d'eau distillée filtrée 
dans l'entonnoir et pipetez lentement l'aliquote dans l'eau en tenant 
l'embout de la pipette sous le ménisque. La pipette et le réservoir doivent être soigneusement nettoyés après le pipetage dans la mesure où les fibres minces ont tendance à se situer plus à la surface.
 
Retirez le filtre en douceur et séparez-le du filtre secondaire avant de 
le placer dans un récipient pour qu'il sèche.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 157
 
Coupez un quart ou une moitié de la section du dépôt filtré avec une 
lame de scalpel de type 24 par un mouvement d'oscillation. Fixez 
soigneusement la section coupée sur la plaque d'un MEB à l'aide d'adhésif ou de colle carbone. L'argent colloïdal doit être appliqué à au moins trois endroits afin d'améliorer le contact électrique sur les 
bords du filtre et de la plaque. Lorsque la colle/l'argent colloïdal est 
sec/sèche, pulvérisez cathodiquement environ 50 nm d'or ou d'or/ palladium sur la surface du dépôt.
 
1.5.3.3.  Étalonnage et fonctionnement du MEB  
1.5.3.3.1. É t a l o n n a g e  
L'étalonnage du MEB doit être vérifié au moins une fois par semaine 
(idéalement une fois par jour) à l'aide d'une grille d'étalonnage certi ­
fiée. Les valeurs de l'étalonnage doivent être comparées à une norme 
certifiée, et si la valeur mesurée (MEB) se situe en dehors de la 
plage de ± 2 % de la valeur certifiée, l'étalonnage du MEB doit être ajusté et une nouvelle fois vérifié.
 
Le MEB doit offrir au minimum une résolution d'un diamètre 
minimal visible de 0,2 μm, en utilisant une matrice de prélèvement 
réelle et à un grossissement de × 2 000.  
1.5.3.3.2. F o n c t i o n n e m e n t  
Le MEB doit être utilisé à un grossissement de 10 000 (  1 ) dans des 
conditions offrant une bonne résolution et une image acceptable à des vitesses de balayage réduites (par exemple, 5 secondes par trame). Bien que les conditions de fonctionnement de MEB diffé ­
rents puissent varier, il convient en général, pour obtenir les meil ­
leures visibilité et résolution possibles avec des matériaux de poids atomique relativement faible, d'utiliser des tensions d'accélération de 5-10 keV avec une dimension du spot réduite et une petite distance 
de travail. Comme une traversée linéaire est réalisée, il convient 
d'utiliser une inclinaison de 0
 o pour réduire au minimum le recen ­
trage ou, si le MEB a une phase eucentrique, d'utiliser la distance de travail eucentrique. Un grossissement inférieur peut être utilisé si le 
matériau ne contient pas de petites fibres et que les diamètres des 
fibres sont importants (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Mesurage  
1.5.3.4.1. E x a m e n à f a i b l e g r o s s i s s e m e n t p o u r a n a l y s e d e 
l ' é c h a n t i l l o n  
Au départ, l'échantillon doit être examiné avec un faible grossis ­
sement afin de déterminer s'il y a agglutination des grandes fibres et pour déterminer la densité des fibres. En cas d'agglutination exces ­
sive, il est conseillé de préparer un nouvel échantillon.
 
Pour garantir la fiabilité des statistiques, il convient de mesurer un 
nombre minimal de fibres. Une densité élevée des fibres est souhai ­
table dans la mesure où l'examen de champs vides prend du temps et 
n'apporte rien à l'analyse. Cependant, si le filtre est surchargé, il peut devenir difficile de mesurer toutes les fibres mesurables. En outre, dans la mesure où les petites fibres risquent d'être cachées par les 
grandes, elles sont susceptibles de ne pas être vues.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 158  
( 1 ) Pour les fibres de 3 μm, voir la note de bas de page précédente.
 Une densité supérieure des fibres de 150 fibres par millimètre de 
traversée linéaire peut entraîner une surestimation du LWGMD. D'un 
autre côté, les faibles concentrations de fibres augmentent le temps d'analyse. Il est en outre souvent plus intéressant du point de vue du coût de préparer un échantillon d'une densité proche de la valeur 
optimale que de persister à dénombrer des filtres à faible concen ­
tration. La densité de fibres optimale doit donner une moyenne d'environ une ou deux fibres dénombrables par champ de vision à un grossissement de 5 000. Cependant, dans la mesure où la densité 
optimale dépend de la taille (diamètre) des fibres, l'opérateur devra 
décider si la densité des fibres est proche ou non de la valeur optimale.
 
1.5.3.4.2. P o n d é r a t i o n p a r l a l o n g u e u r d u d i a m è t r e d e s 
f i b r e s  
Seules les fibres qui touchent (ou traversent) une ligne (infiniment) 
mince tracée sur l'écran du MEB sont comptées. C'est la raison pour laquelle une ligne horizontale (ou verticale) est tracée en travers du centre de l'écran.
 
Il est également possible de placer un point unique au centre de 
l'écran et de procéder à un balayage continu dans une seule direction à travers le filtre. Toute fibre dont le rapport d'aspect est supérieur à 3:1 et qui touche ou traverse ce point voit son diamètre mesuré et 
enregistré.
 
1.5.3.4.3. M e s u r e d e s f i b r e s  
Il est recommandé de mesurer au moins 300 fibres. Chaque fibre est 
mesurée une seule fois, au point d'intersection avec la ligne ou le 
point tracé(e) sur l'image (ou à proximité du point d'intersection si 
les bords de la fibre sont cachés). Si des fibres présentant des coupes transversales non uniformes sont présentes, une mesure représentant le diamètre moyen de la fibre doit être utilisée. Le plus grand soin 
devra être accordé à la définition du bord et à la mesure de la 
distance la plus courte entre les bords des fibres. La mesure peut être effectuée en ligne ou hors ligne, sur des images ou des photos enregistrées. Il est recommandé d'utiliser des systèmes de mesure 
d'image semi-automatiques qui transfèrent directement les données 
dans une feuille de calcul, dans la mesure où ils permettent de gagner du temps, d'éviter les erreurs de transcription et d'automatiser les calculs.
 
Les extrémités des grandes fibres doivent être vérifiées à un gros ­
sissement plus faible afin de s'assurer qu'elles ne reviennent pas dans 
le champ de vision où est effectué le mesurage et qu'elles ne sont mesurées qu'une seule fois.
 
2. DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
En général, les diamètres des fibres n'ont pas une distribution 
normale. Il est cependant possible d'obtenir une distribution proche de la normale en effectuant une transformation log.
 
Calculez la moyenne arithmétique (lnD moyenne) et l'écart-type 
(SD  lnD ) du log par rapport aux valeurs de base (lnD) des diamètres 
des fibres n (D). 
moyen lnD ¼ ∑ lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ðlnD – moyen lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
L'écart-type est divisé par la racine carrée du nombre de mesures (n) 
pour obtenir l'erreur type (ET  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Soustrayez deux fois l'erreur type de la moyenne et calculez l'expo ­
nentielle de cette valeur (moyenne moins deux erreurs types) pour 
obtenir la moyenne géométrique moins deux erreurs types géomé ­
triques. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmoyen lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RÉSULTATS  
PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra au minimum les informations 
suivantes:  
— la valeur de LWGMD-2ET,  
— toutes les déviations, en particulier celles qui risquent d'affecter 
la précision et la fiabilité des résultats, ainsi que les justifications correspondantes.
 
4. RÉFÉRENCES  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method 
to measure the length-weigthed geometric mean fibre diame ­
ter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety 
Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 160
 
A.23  COEFFICIENT DE PARTAGE (1-OCTANOL/EAU): MÉTHODE DU 
BRASSAGE LENT  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 123 (2006) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La méthode du brassage 
lent a permis de déterminer avec exactitude des valeurs logarithmiques du 
coefficient de partage 1-octanol/eau (P  OE ) allant jusqu’à 8,2 (  1 ). Aussi 
constitue-t-elle une approche expérimentale appropriée pour la détermination directe du P
 OE de substances fortement hydrophobes.  
2. Les autres méthodes de détermination du coefficient de partage 1-octa ­
nol/eau (P  OE ), sont la méthode par agitation en flacon (2) et la méthode 
par HPLC phase inverse (3). La méthode par agitation en flacon est sujette à 
des artéfacts dus au transfert de micro-gouttelettes d’octanol dans la phase 
aqueuse. Lorsque les valeurs du P  OE augmentent, la présence de ces gout ­
telettes dans la phase aqueuse engendre une surestimation croissante de la concentration de la substance d’essai dans l’eau. Aussi l’usage de cette 
méthode est-il limité aux substances dont le log P
 OE est < 4. À partir de 
valeurs fiables du P  OE directement déterminées, la deuxième méthode 
étalonne la relation entre le temps de rétention sur la colonne HPLC et 
des valeurs mesurées du P  OE . Il existait un projet de ligne directrice de 
l’OCDE permettant de déterminer les coefficients de partage 1-octanol/eau de substances ionisables (4), mais il ne doit plus être utilisé.
 
3. La présente méthode d’essai a été élaborée aux Pays-Bas. La précision des 
méthodes décrites dans ce pays a été validée et optimisée au cours d’un essai tournant de validation auquel ont participé 15 laboratoires (5).
 
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
Signification et utilisation  
4. S’agissant des substances organiques inertes, une relation très significative a 
été mise en évidence entre leur coefficient de partage 1-octanol/eau (P  OE ) et 
leur bioaccumulation dans les poissons. De plus, une corrélation entre le P
 OE et, d’une part, la toxicité pour les poissons et, d’autre part, la sorption 
de produits chimiques sur des solides tels que les sols et les sédiments, a 
également été démontrée. La référence (6) livre un large aperçu de ces 
relations.  
5. Des relations très diverses entre le coefficient de partage 1-octanol/eau et 
d’autres propriétés des substances intéressant la chimie et la toxicologie environnementales ont été établies. Le coefficient de partage 1-octanol/eau est ainsi devenu un paramètre fondamental dans l’évaluation des risques des 
substances chimiques pour l’environnement et dans la prédiction du devenir 
de ces substances dans l’environnement.
 
Champ d’application  
6. La méthode du brassage lent est censée réduire la formation de 
micro-gouttelettes de 1-octanol dans la phase aqueuse, ce qui écarte le 
problème de la surestimation de la concentration en phase aqueuse due à 
la présence de molécules de la substance d’essai dans ces gouttelettes. Par conséquent, la méthode du brassage lent convient particulièrement à la détermination du P
 OE de substances dont le log P  OE est supposément supé ­
rieur ou égal à 5, gamme dans laquelle la méthode par agitation en flacon 
(2) tend à fournir des résultats fausséss.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 161
 
DÉFINITION ET UNITÉS  
7. Le coefficient de partage d’une substance entre l’eau et un solvant lipophile 
(1-octanol) caractérise la répartition à l’équilibre de la substance chimique entre les deux phases. Le coefficient de partage entre l’eau et le 1-octanol 
(P
 OE ) est défini comme étant le rapport des concentrations à l’équilibre de la 
substance d’essai dans du 1-octanol saturé avec de l’eau (C  O ) et dans de 
l’eau saturée avec du 1-octanol (C  E ). 
P OE ¼ C O=C E 
Le rapport de deux concentrations est une valeur adimensionnelle. Il est 
exprimé le plus souvent par son logarithme décimal (log P  OE ). Le P  OE 
dépend de la température et les résultats rapportés doivent préciser la tempé ­
rature de mesure.  
PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
8. En vue de déterminer le coefficient de partage, on laisse le système formé 
par l’eau, le 1-octanol et la substance d’essai s’équilibrer à température 
constante. Ensuite, on mesure les concentrations de la substance d’essai 
dans les deux phases.  
9. La méthode du brassage lent, proposée ici, permet de réduire les difficultés 
expérimentales associées à la formation de micro-gouttelettes dans la méthode par agitation en flacon. Avec le brassage lent, l’eau, le 1-octanol 
et la substance d’essai s’équilibrent dans un réacteur thermostaté soumis à 
une agitation douce. Les échanges entre les phases sont accélérés par le brassage. Ce dernier produit une légère turbulence qui favorise les échanges entre le 1-octanol et l’eau sans provoquer la formation de gouttelettes (1).
 
APPLICABILITÉ DE L’ESSAI  
10. La présence de substances autres que la substance d’essai risquant d’in ­
fluencer le coefficient d’activité de la substance d’essai, celle-ci doit être 
testée à l’état pur. Il convient d’employer une substance d’essai présentant 
le degré de pureté le plus élevé que l’on puisse trouver dans le commerce.  
11. Cette méthode s’applique aux substances pures qui ne se dissocient ni s’as ­
socient et qui ne manifestent aucune activité interfaciale sensible. Cette 
méthode convient également aux mélanges. Le cas échéant, les coefficients 
de partage 1-octanol/eau déterminés varient en fonction de la composition chimique du mélange testé et de la composition électrolytique employée comme phase aqueuse. À condition de prendre certaines mesures supplé ­
mentaires, cette méthode peut aussi s’appliquer à des substances qui se 
dissocient ou s’associent (paragraphe 12).
 
12. Le partage des substances sujettes à la dissociation, telles que les acides 
organiques et les phénols, les bases organiques et les composés organomé ­
talliques, entre l’eau et le 1-octanol comportant de multiples équilibres dans 
ces phases, le P  OE est une constante conditionnelle qui dépend fortement de 
la composition électrolytique (7) (8). D’où la nécessité de contrôler le pH et la composition électrolytique lors de la détermination du P
 OE et de rapporter 
les valeurs de ces deux paramètres. L’évaluation de ces coefficients de 
partage doit être confiée à un expert. Il convient de sélectionner des 
valeurs de pH appropriées d’après la valeur de la ou des constantes de dissociation, afin d’établir un coefficient de partage pour chaque état d’io ­
nisation. Les composés organométalliques doivent être testés à l’aide de 
tampons non complexants (8). À la lumière des connaissances actuelles 
en matière de chimie en phase aqueuse (constantes de complexation et de dissociation), on choisira des conditions expérimentales permettant d’estimer la formation d’espèces par la substance d’essai en phase aqueuse. Il faut 
instaurer une force ionique identique dans toutes les expériences en 
employant un électrolyte de fond.
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13. Les substances peu solubles dans l’eau ou présentant un P  OE élevé peuvent 
engendrer des problèmes dus au fait que leurs concentrations dans l’eau sont 
si faibles qu’il devient difficile de les déterminer avec exactitude. La présente méthode d’essai livre des indications sur la manière de traiter ce problème.
 
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
14. Le degré de pureté des réactifs chimiques doit au moins correspondre à celui 
de la qualité pour analyse. Il est recommandé d’utiliser des substances d’essai non marquées de composition chimique connue et d’une pureté 
d’au moins 99 % ou des substances d’essai radiomarquées de composition 
chimique et pureté radiochimique connues. S’il s’agit de traceurs à demi-vie courte, on appliquera des corrections pour tenir compte de la désintégration. Si la substance d’essai est radiomarquée, il y a lieu d’employer une méthode 
analytique spécifique à la substance de telle sorte que la radioactivité 
mesurée se rapporte directement à la substance d’essai.
 
15. Il est possible d’estimer le log P  OE avec les logiciels vendus dans le 
commerce à cet effet, ou en s’appuyant sur le rapport des solubilités dans les deux solvants.
 
16. Avant de déterminer le P  OE par la méthode du brassage lent, il faut disposer 
des informations suivantes sur la substance d’essai:  
a) formule structurale;  
b) méthodes analytiques appropriées à la détermination de la concentration 
de la substance dans l’eau et dans le 1-octanol;  
c) constante(s) de dissociation des substances ionisables [ligne directrice 
112 de l’OCDE (9)];  
d) solubilité dans l’eau (10);  
e) hydrolyse abiotique (11);  
f) biodégradabilité immédiate (12);  
g) pression de vapeur (13).  
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Matériel et appareillage  
17. Cette expérience nécessite du matériel courant de laboratoire, et en particu ­
lier: 
— des agitateurs magnétiques et des barres d’agitation magnétiques recou ­
vertes de Teflon pour agiter la phase aqueuse,  
— des instruments d’analyse permettant de déterminer la concentration de 
la substance d’essai aux concentrations attendues,  
— une bouteille à agiter munie d’un robinet à sa base. Suivant l’estimation 
du log P  OE et le seuil de détection de la substance d’essai, on envisagera 
d’utiliser un réacteur d’un volume supérieur à un litre, de la même 
géométrie, de manière à obtenir un volume d’eau suffisant pour l’ex ­
traction et l’analyse chimiques de la substance d’essai. La concentration de la substance d’essai dans l’extrait aqueux sera donc plus élevée, ce qui rendra la détermination analytique plus fiable. Un tableau reprodui ­
sant des estimations du volume minimal requis, le seuil de détection de 
la substance, l’estimation de son log P
 OE et de sa solubilité dans l’eau 
figure en appendice 1. Ce tableau se fonde sur la relation entre le log P
 OE et le rapport des solubilités dans l’octanol et dans l’eau, telle que 
présentée par Pinsuwan  et al.  (14):  
log P  OE ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 163
 
avec 
SR ¼ S oct=S eau (en molarité),  
et sur la relation donnée par Lyman (15) pour prédire la solubilité dans 
l’eau. Les solubilités dans l’eau calculées avec l’équation donnée à l’appendice 1 sont à considérer comme une première estimation. 
Notons que l’utilisateur est libre d’estimer la solubilité dans l’eau à 
l’aide de n’importe quelle autre relation jugée mieux représenter la relation entre l’hydrophobie et la solubilité. S’agissant des substances solides, l’inclusion du point de fusion dans la prédiction de la solubilité 
est par exemple recommandée. Si l’on utilise une équation modifiée, il 
faut vérifier que l’équation permettant de calculer la solubilité dans l’octanol est toujours valable. Une bouteille à agiter recouverte d’une enveloppe de verre et d’une capacité d’environ un litre est schématisée 
en appendice 2. Les proportions de la bouteille représentée en 
appendice 2 se sont avérées propices et doivent être conservées si la dimension de l’appareil est modifiée,
 
— il est essentiel de maintenir la température constante durant le brassage 
lent, à l’aide d’un dispositif adéquat.  
18. Les récipients doivent être composés d’un matériau inerte rendant négli ­
geable l’adsorption à la surface des récipients.  
Préparation des solutions expérimentales  
19. La détermination du P  OE requiert un 1-octanol de la qualité la plus pure qui 
puisse se trouver dans le commerce (au moins 99 %). Il est recommandé de 
purifier le 1-octanol par une extraction réalisée avec un acide, une base et de l’eau, suivie d’un séchage. Le 1-octanol peut, en plus, être purifié par distillation. Les solutions étalons des substances d’essai doivent être prépa ­
rées avec du 1-octanol purifié. L’eau destinée à la détermination du P
 OE doit 
être distillée à l’aide d’un dispositif en verre ou en quartz, ou traitée par un système de purification, ou encore être de qualité HPLC. Il convient de filtrer l’eau distillée à travers des mailles de 0,22 μm et d’inclure des 
blancs afin de s’assurer que les extraits concentrés ne renferment pas d’im ­
puretés susceptibles d’interférer avec la substance d’essai. Si l’on emploie un filtre en fibres de verre, il faut le nettoyer en le laissant au moins trois heures dans un four à 400 °C.
 
20. Afin de saturer chaque solvant par l’autre avant l’expérience, on les équi ­
libre dans un récipient suffisamment grand. Pour ce faire, le système à deux phases est soumis à un brassage lent durant deux jours.
 
21. Une concentration appropriée de la substance d’essai est choisie et dissoute 
dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau). Il y a lieu de déterminer le coef ­
ficient de partage 1-octanol/eau dans des solutions diluées dans du 1-octanol et de l’eau. Aussi la concentration de la substance d’essai ne doit-elle pas 
excéder 70 % de sa solubilité avec une concentration maximale de 0,1 M 
dans chaque phase (1). Les solutions de 1-octanol utilisées pour l’expérience seront exemptes de substance d’essai en suspension à l’état solide.
 
22. La quantité appropriée de substance d’essai est dissoute dans du 1-octanol 
(saturé avec de l’eau). Si l’estimation du log P  OE est supérieure à 5, il faut 
s’assurer que les solutions de 1-octanol utilisées pour l’expérience ne renfer ­
ment pas de substance d’essai en suspension à l’état solide. À cette fin, la procédure suivante est appliquée pour les substances chimiques dont la 
valeur estimée de log P
 OE > 5: 
— la substance d’essai est dissoute dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau),  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 164
 
— on laisse reposer la solution suffisamment longtemps pour que la subs ­
tance suspendue à l’état solide se dépose. Durant la décantation, la 
concentration de la substance d’essai est mesurée en continu,  
— une fois que les concentrations mesurées dans la solution de 1-octanol 
ont atteint une valeur stable, la solution mère est diluée avec un volume approprié de 1-octanol,
 
— la concentration de la solution mère diluée est mesurée. Si la concen ­
tration mesurée concorde avec la dilution, la solution mère diluée peut 
être utilisée dans le processus expérimental du brassage lent.  
Extraction et analyse des échantillons  
23. Le dosage de la substance d’essai s’effectue par une méthode analytique 
validée. Les chercheurs doivent prouver que, durant l’essai, les concentra ­
tions dans le 1-octanol saturé avec de l’eau et dans la phase aqueuse saturée 
avec du 1-octanol sont supérieures au seuil de quantification du procédé analytique employé. Il y a lieu d’établir avant l’essai le taux de récupération par l’analyse de la substance d’essai en phase aqueuse et en phase 1-octanol, 
dans les cas où des méthodes d’extraction s’avèrent nécessaires. Le signal 
analytique doit être corrigé en fonction des blancs et l’on veillera à éviter tout transfert de la substance à analyser d’un échantillon à l’autre.
 
24. Les concentrations des substances d’essai hydrophobes étant plutôt faibles 
en phase aqueuse, il faudra probablement extraire la substance de la phase 
aqueuse à l’aide d’un solvant organique et préconcentrer l’extrait avant 
analyse. Pour la même raison, il est nécessaire de réduire les éventuelles concentrations du blanc. À cette fin, on emploie des solvants très purs, de préférence des solvants pour l’analyse des résidus. En outre, un nettoyage 
soigneux (par exemple lavage au solvant ou cuisson à haute température) de 
la verrerie avant l’expérience peut diminuer le risque de contamination croisée.
 
25. Il est possible d’estimer le log P  OE à l’aide d’un programme d’estimation ou 
en faisant appel à un expert. Si sa valeur est supérieure à six, d’une part il convient d’être très attentif aux corrections en fonction du blanc et à tout 
transfert de la substance à analyser d’un échantillon à l’autre et, d’autre part, 
il est impératif d’utiliser un étalon de substitution pour corriger le taux de récupération, de façon à pouvoir atteindre des facteurs de préconcentration élevés. Plusieurs logiciels d’estimation du log P
 OE se trouvent dans le 
commerce (  1 ), par exemple Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) et 
ACD logP (19). Les références (20-22) décrivent les différents procédés d’estimation.
 
26. Les seuils de quantification pour la détermination de la substance d’essai 
dans le 1-octanol et dans l’eau sont établis suivant des méthodes acceptées. 
Comme principe de base, le seuil de quantification de la méthode employée 
peut être considéré comme étant la concentration dans l’eau ou le 1-octanol qui produit un rapport signal/bruit de dix. Il convient de choisir des méthodes d’extraction et de préconcentration appropriées et de spécifier le 
taux de récupération de l’analyse. Le facteur de préconcentration doit être 
choisi de façon à produire un signal de l’intensité requise lors de la déter ­
mination analytique.
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( 1 ) Cette information n’est fournie qu’à titre indicatif. D’autres logiciels équivalents peuvent 
être utilisés s’il est démontré qu’ils produisent les mêmes résultats.
 27. En fonction des paramètres de la méthode analytique et des concentrations 
escomptées, on détermine le volume de l’échantillon qui permettra de déter ­
miner avec exactitude la concentration de la substance d’essai. L’utilisation d’échantillons aqueux trop petits pour obtenir un signal analytique suffisant est à éviter. Les échantillons aqueux ne doivent pas non plus être trop 
grands, car le volume d’eau restant risquerait d’être insuffisant pour le 
nombre minimal d’analyses requises (n = 5). L’appendice 1 indique les volumes minimaux des échantillons en fonction du volume du récipient, du seuil de détection de la substance d’essai et de sa solubilité.
 
28. La quantification des substances d’essai s’effectue par comparaison avec les 
courbes d’étalonnage des substances d’essai. Les concentrations des étalons 
doivent figurer entre parenthèses à côté des concentrations relevées dans les échantillons analysées.
 
29. Pour les substances d’essai dont le log P  OE estimé est supérieur à six, on 
verse un étalon de substitution dans l’échantillon aqueux avant l’extraction 
afin de relever les pertes survenues durant l’extraction et la préconcentration des échantillons aqueux. Pour que la correction du taux de récupération soit correcte, les étalons de substitution doivent avoir des propriétés très sembla ­
bles ou identiques à celles de la substance d’essai. À cette fin, on utilise de 
préférence des analogues isotopiques (stables) marqués de la substance d’essai (perdeutériés ou marqués au
 13 C, par exemple). Si l’utilisation 
d’un isotope marqué stable, c’est-à-dire marqué au  13 C ou au  2 H, est impos ­
sible, il faut démontrer, en s’appuyant sur des données fiables tirées de 
publications, que les propriétés physico-chimiques de l’étalon de substitution sont très proches de celles de la substance d’essai. Des émulsions peuvent se former au cours de l’extraction liquide-liquide de la phase aqueuse. Pour 
réduire ce phénomène, on peut ajouter du sel et laisser reposer l’émulsion 
toute une nuit. Les méthodes utilisées pour extraire et préconcentrer les échantillons doivent être mentionnées.
 
30. Les échantillons prélevés dans la phase 1-octanol peuvent, si nécessaire, être 
dilués avec un solvant adéquat avant l’analyse. De plus, l’utilisation d’éta ­
lons de substitution pour corriger la récupération est recommandée pour les substances qui se sont avérées présenter un degré de variation élevé lors des essais de récupération (écart-type relatif supérieur à 10 %).
 
31. Les détails de la méthode analytique devront figurer dans le rapport. Ceux-ci 
incluent la méthode d’extraction, les facteurs de préconcentration et de 
dilution, les paramètres des instruments, le processus d’étalonnage, la gamme d’étalonnage, la récupération de la substance d’essai présente dans l’eau par un procédé analytique, l’ajout d’étalons de substitution pour 
corriger le taux de récupération, les valeurs des blancs, les seuils de détec ­
tion et les seuils de quantification.
 
Déroulement de l’essai  
Rapports volumiques 1-octanol/eau optimaux  
32. Les volumes d’eau et de 1-octanol sont choisis en fonction du seuil de 
quantification dans le 1-octanol et dans l’eau, des facteurs de préconcen ­
tration appliqués aux échantillons aqueux, des volumes prélevés dans le 1- octanol et dans l’eau et des concentrations prévues. Pour des raisons expé ­
rimentales, le volume de 1-octanol employé dans le système de brassage lent 
doit être choisi de telle sorte que la couche de 1-octanol soit suffisamment épaisse (> 0,5 cm) pour qu’un prélèvement puisse s’effectuer dans la phase 1-octanol sans la perturber.
 
33. Les rapports volumiques utilisés couramment pour analyser des substances 
dont le log P  OE est supérieur ou égal à 4,5 sont de 20 à 50 ml de 1-octanol 
et de 950 à 980 ml d’eau dans un récipient d’un litre.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 166
 
Conditions expérimentales  
34. Durant l’essai, le réacteur est thermostaté de manière à limiter la variation de 
température à moins de 1 °C. L’essai doit être conduit à 25 °C.  
35. On protège le système expérimental de la lumière du jour en effectuant 
l’essai dans une pièce obscure ou en recouvrant le réacteur d’une feuille 
d’aluminium.  
36. L’essai doit être mené dans un environnement aussi dépoussiéré que 
possible.  
37. Le système 1-octanol/eau est agité jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint. Le 
temps requis pour atteindre l’équilibre est évalué au moyen d’un essai pilote 
de brassage lent au cours duquel on prélève de l’eau et de l’octanol pério ­
diquement. Les temps de prélèvement doivent être espacés d’au moins cinq heures.
 
38. Chaque détermination du P  OE doit s’effectuer sur la base d’au moins trois 
essais de brassage lent indépendants.  
Détermination du temps requis pour parvenir à l’équilibre  
39. On admet que l’équilibre est atteint lorsque la régression du rapport des 
concentrations dans le 1-octanol et dans l’eau en fonction du temps (la 
variable temps comprenant quatre point s) se traduit par une pente ne 
s’écartant pas de manière significative de zéro pour une valeur de p égale à 0,05. Le temps minimal requis pour atteindre l’équilibre avant de pouvoir commencer les prélèvements est d’un jour. En principe, le prélèvement des 
substances dont le log P
 OE estimé est inférieur à cinq peut s’effectuer au 
cours des deuxième et troisième jours. Il est possible que le temps pour parvenir à l’équilibre soit plus long pour les substances plus hydrophobes. Pour une substance ayant un log P
 OE égal à 8,23 (décachlorobiphényle), 144 
heures ont été suffisantes pour atteindre l’équilibre. L’équilibre est évalué 
par une série de prélèvements effectués dans le même récipient.  
Début de l’essai  
40. On commence par remplir le réacteur avec de l’eau saturée en 1-octanol. 
Ensuite, on attend que le système atteigne la température requise par le thermostat.
 
41. La quantité voulue de substance d’essai (dissoute dans le volume requis de 
1-octanol saturé en eau) est ajoutée soigneusement au réacteur. Il s’agit 
d’une étape critique de l’essai car il faut éviter le mélange turbulent des 
deux phases. À cette fin, la phase 1-octanol peut être versée doucement à l’aide d’une pipette sur la paroi du récipient d’essai, à proximité de la surface de l’eau. Elle ruissellera ainsi le long de la paroi et formera un 
film au dessus de la phase aqueuse. Il faut toujours éviter de décanter le 
1-octanol directement dans la bouteille; on ne peut pas faire tomber des gouttes de 1-octanol directement dans l’eau.
 
42. Une fois l’agitation lancée, on augmente lentement sa vitesse. Si les moteurs 
de l’agitateur ne peuvent être réglés correctement, on envisagera d’utiliser 
un transformateur. La vitesse d’agitation doit être réglée de manière à créer 
un vortex à l’interface entre l’eau et le 1-octanol d’une profondeur de 0,5 à 2,5 cm au maximum. Il faut diminuer la vitesse d’agitation si la profondeur du vortex dépasse 2,5 cm, sinon des micro-gouttelettes de 1-octanol peuvent 
se former dans la phase aqueuse et donner lieu à une surestimation de la 
concentration de la substance d’essai dans l’eau. D’après les résultats d’un essai tournant de validation (5), on recommande d’appliquer une vitesse maximale d’agitation de 2,5 cm. Elle représente un compromis permettant 
de parvenir rapidement à l’équilibre tout en limitant la formation de micro ­
gouttelettes de 1-octanol.
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Prélèvement et traitement des échantillons  
43. Il convient d’arrêter l’agitateur avant d’effectuer les prélèvements et d’at ­
tendre que les liquides s’immobilisent. Lorsque le prélèvement est terminé, l’agitateur est remis en marche doucement, comme décrit plus haut; après 
quoi on augmente la vitesse d’agitation progressivement.
 
44. La phase aqueuse est prélevée à un robinet situé à la base du réacteur. Il faut 
toujours éliminer le volume mort d’eau contenu dans les robinets (environ 5 ml pour le récipient illustré à l’appendice 2). L’eau retenue dans les robinets 
n’est pas agitée et donc pas en équilibre avec l’ensemble. On note le volume 
des échantillons aqueux et on vérifie que la quantité de substance d’essai présente dans l’eau éliminée est prise en compte dans l’établissement du bilan massique. Il y a lieu de réduire au minimum les pertes par évaporation 
en permettant à l’eau de s’écouler doucement dans l’entonnoir séparateur de 
façon à ne pas perturber la couche eau/1-octanol.
 
45. On prélève les échantillons de 1-octanol en aspirant une petite aliquote 
(environ 100 μl) de la couche 1-octanol au moyen d’une seringue de 100 
microlitres en verre et métal. Il faut veiller à ne pas perturber l’interface. Le 
volume de liquide prélevé est consigné. Une petite aliquote suffit, étant donné que l’échantillon de 1-octanol sera dilué.
 
46. Les étapes inutiles de transfert d’échantillons sont à éviter. Aussi le volume 
des échantillons est-il déterminé par gravimétrie. Dans le cas des échan ­
tillons aqueux, cette détermination s’effectue par la collecte de l’échantillon aqueux dans un entonnoir séparateur contenant déjà le volume de solvant 
requis.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
47. La méthode d’essai prescrit de déterminer le P  OE en conduisant trois essais à 
brassage lent (trois unités expérimentales) dans des conditions expérimen ­
tales identiques. La régression utilisée pour démontrer que l’équilibre a été atteint doit s’appuyer sur les résultats d’au moins quatre déterminations du rapport C
 O /C E effectuées à quatre moments ponctuels successifs. La 
variance ainsi calculée correspond à une mesure de l’incertitude de la 
valeur moyenne obtenue pour chaque unité expérimentale.  
48. Le P  OE peut être caractérisé par la variance des données recueillies pour 
chaque unité expérimentale. Cette information est employée pour calculer le 
P OE en considérant qu’il équivaut à la moyenne pondérée des résultats de 
chaque unité expérimentale. Pour ce faire, l’inverse de la variance des résultats des unités expérimentales est employé comme coefficient pondéra ­
teur. Ainsi, les données accusant une forte variation (exprimée par la 
variance), qui sont donc moins fiables, ont moins d’influence sur le résultat 
que les données offrant une variance faible.
 
49. L’écart-type pondéré est calculé d’une manière analogue. Il caractérise la 
répétabilité de la mesure du P  OE . Un écart-type pondéré faible traduit une 
répétabilité élevée de la détermination du P  OE au sein d’un même labora ­
toire. Le traitement statistique formel des données est résumé ci-dessous.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 168
 
Traitement des résultats  
Démonstration de la réalisation de l’équilibre  
50. Le logarithme du rapport des concentrations de la substance d’essai dans le 
1-octanol et dans l’eau (log C  O /C E ) est calculé pour chaque instant de 
prélèvement. On démontre que l’équilibre chimique est atteint en traçant une courbe de ce rapport en fonction du temps. L’apparition d’un plateau 
sur ce tracé, établi à partir d’au moins quatre points consécutifs sur l’axe du 
temps, indique que l’équilibre a été atteint et que le composé est complè ­
tement dissous dans le 1-octanol. Dans le cas contraire, il faut poursuivre l’essai jusqu’à ce que quatre points de temps successifs présentent une pente 
qui n’est pas significativement différente de zéro, pour une valeur de p = 
0,05, montrant ainsi que le log C
 O /C E est indépendant du temps.  
Calcul du log P  OE 
51. La valeur du log P  OE de l’unité expérimentale correspond à la moyenne 
pondérée du log C  O /C E pour la partie de la courbe du log C  O /C E en fonction 
du temps, pour laquelle l’état d’équilibre a été démontré. On calcule la 
moyenne pondérée en pondérant les données avec l’inverse de la variance de telle sorte que l’influence des données sur le résultat final est inversement proportionnelle à l’incertitude des données.
 
Moyenne des log P  OE 
52. La valeur moyenne du log P  OE de différentes unités expérimentales corres ­
pond à la moyenne des résultats de chaque unité expérimentale pondérés avec leurs variances respectives.
 
Le calcul répond à la formule suivante:  
log P  OE;moy ¼ ðΣw i Ü log P  OE;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
où: 
log P  OE,i = est la valeur du log P  OE de chaque unité expérimentale i;  
log P  OE moy  = est la moyenne pondérée de tous les log P  OE ; 
w i = est le poids statistique attribué à la valeur log P  OE de 
l’unité expérimentale i.  
L’inverse de la variance de log P  OE,i est représentée par w  i 
(w i ¼ varðlog P  OE;i Þ –1 ). 
53. L’estimation de l’erreur de la moyenne de log P  OE correspond à la répéta ­
bilité des log C  O /C E déterminés durant la phase d’équilibre dans chaque 
unité expérimentale. Elle se traduit par l’écart-type pondéré du log P  OE 
moy (σ log Poe moy  ) qui mesure l’erreur associée au log P  OE moy  . L’écart-type 
pondéré peut être calculé à partir de la variance pondérée (var  log Poe moy  ) de 
la façon suivante:  
var log Poe ;moy ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OE;i Ä log P  OE;moy Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Poe ;moy ¼ ðvar log Poe ;moy Þ 0;5 
où n représente le nombre d’unités expérimentales.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 169
 
Rapport d’essai  
54. Le rapport d’essai doit mentionner les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— nom courant, nom chimique, numéro CAS, formule structurale (montrant 
la position du radiomarqueur, le cas échéant) et propriétés physico-chimiques pertinentes (voir paragraphe 17),
 
— pureté (impuretés) de la substance d’essai,  
— pureté radiochimique des substances marquées et activité molaire (s’il y 
a lieu),  
— estimation préliminaire du log P  OE et méthode utilisée pour ce calcul.  
Conditions expérimentales:  
— dates de la réalisation des études,  
— température à laquelle s’est déroulé l’essai,  
— volumes de 1-octanol et d’eau au début de l’essai,  
— volumes des échantillons de 1-octanol et d’eau prélevés,  
— volumes de 1-octanol et d’eau restant dans les récipients expérimentaux;  
— description des récipients expérimentaux et des conditions d’agitation 
utilisées (géométrie de la barre d’agitation et du récipient expérimental, 
hauteur du vortex en mm et vitesse d’agitation si elle est connue),  
— méthodes analytiques utilisées pour déterminer la substance d’essai et 
seuil de quantification de la méthode,  
— heures de prélèvement,  
— pH de la phase aqueuse et tampons utilisés, lorsqu’on a ajusté le pH 
pour des molécules ionisables,  
— nombre d’expériences identiques.  
Résultats:  
— répétabilité et sensibilité des méthodes analytiques employées,  
— concentrations de la substance d’essai déterminées dans le 1-octanol et 
dans l’eau en fonction du temps,  
— démonstration du bilan massique,  
— température et écart-type ou gamme de températures appliquée durant 
l’essai,  
— régression du rapport des concentrations en fonction du temps,  
— valeur moyenne de P  OE moy  et son écart-type,  
— analyse et interprétation des résultats,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 170
 
— exemples de données brutes d’une analyse représentative (toutes les 
données brutes doivent être conservées conformément aux bonnes 
pratiques de laboratoire), notamment le taux de récupération des produits de substitution, le nombre de niveaux appliqué à l’étalonnage (ainsi que les critères régissant le coefficient de corrélation de la courbe d’étalon ­
nage) et résultats de l’assurance qualité/contrôle qualité (AQ/CQ),
 
— s’il est disponible: rapport de validation du protocole expérimental (à 
mentionner parmi les références).  
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(3) Chapter A.8 de la présente annexe, Coefficient de partition.  
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(9) OCDE (1981) Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits 
chimiques: 112 – Constantes de dissociation dans l’eau. Paris.  
(10) Chapitre A.6 de la présente annexe, Solubilité dans l’eau.  
(11) Chapitre C.7 de la présente annexe, Dégradation – Dégradation abiotique: 
hydrolyse en fonction du pH.  
(12) Chapitre C.4 – Parties II à VII (Méthode A à F) de la présente annexe, 
Détermination de la biodégradabilité immédiate.  
(13) Chapitre A.4 de la présente annexe, Pression de vapeur.  
(14) Pinsuwan S., Li A. and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/ 
water solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 
623-626.  
(15) Lyman W.J. (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic 
Compounds, Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H., Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
 
(16) Leo A., Weininger D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
(17) Meylan W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 171
 
(20) Lyman W.J. (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman W.J., 
Reehl W.F., Rosenblatt D.H., eds,  Handbook of chemical property estima ­
tion, American Chemical Society, Washington, DC.  
(21) Rekker R.F., de Kort H.M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: 
An extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488.  
(22) Jübermann O. (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386-390.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 172
 
Appendice 1  
Tables permettant de calculer les volumes d’eau minimaux requis pour 
détecter des substances d’essai ayant différentes valeurs de log P  OE en 
phase aqueuse  
Hypothèses:  
— Volume maximal de chaque aliquote = 10 % du volume total; 5 aliquotes = 
50 % du volume total.  
— Concentration des substances d’essai  ¼ 0; 7 Ü solubilité dans chaque phase. 
Si les concentrations sont inférieures, il faudra utiliser de plus grands 
volumes.  
— Volume utilisé pour la détermination du seuil de détection = 100 ml.  
— Log P  OE en fonction du log S  E et le log P  OE en fonction de SR (S  oct /S e ) sont 
des représentations raisonnables de relations pour les substances d’essai.  
Estimation de S  e 
log P  OE équation log S  e S e (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192 6,427E-04  
Estimation de S  oct 
log P  OE équation S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 173
 
Masse totale de la 
substance d’essai 
(mg) Masse  oct /Masse  eau Masse  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Masse  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Calcul des volumes  
Volume minimal requis pour la phase H  2 O à chaque concentration du seuil de détection  
log K  OE Seuil de détection 
(microgrammes/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volume utilisé 
pour le seuil de 
détection (L) 0,1 
Légende pour les calculs  
Représente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, récipient d’équilibrage 
de 1 litre.  
Représente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, récipient d’équilibrage 
de 2 litres.  
Représente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, récipient d’équilibrage 
de 5 litres.  
Représente < 10 % du volume total de la phase aqueuse, récipient d’équilibrage 
de 10 litres.  
Dépasse 10 % y compris du récipient d’équilibrage de 10 litres.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 174
 
Vue d’ensemble des volumes requis en fonction de la solubilité dans l’eau et du log P  OE 
Volume minimal requis pour la phase H  2 O à chaque concentration du seuil de détection (ml)  
log P  OE S e (mg/l) Seuil de détection 
(microgrammes/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 175
 
log P  OE S e (mg/l) Seuil de détection 
(microgrammes/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volume utilisé pour le 
seuil de détection (L) 0,1 
Appendice 2  
Exemple de récipient expérimental à enveloppe de verre destiné à la 
détermination du P  OE par la méthode du brassage lent
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 176
 
PARTIE B: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE LA TOXICITÉ ET 
DES AUTRES EFFETS SUR LA SANTÉ  
TABLE DES MATIÈRES 
INTRODUCTION GÉNÉRALE 
B.1 bis. TOXICITÉ ORALE AIGUË — MÉTHODE DE LA DOSE 
PRÉDÉTERMINÉE 
B.1 ter. TOXICITÉ ORALE AIGUË — MÉTHODE DE LA CLASSE DE 
TOXICITÉ AIGUË 
B.2. TOXICITÉ AIGUË PAR INHALATION B.3. TOXICITÉ AIGUË (CUTANÉE) B.4. TOXICITÉ AIGUË: IRRITATION/CORROSION CUTANÉE B.5. TOXICITÉ AIGUË: IRRITATION/CORROSION OCULAIRE B.6. SENSIBILISATION CUTANÉE B.7. ÉTUDE DE TOXICITÉ ORALE À DOSE RÉPÉTÉE PENDANT 
28 JOURS SUR LES RONGEURS 
B.8. TOXICITÉ SUBAIGUË PAR INHALATION: ÉTUDE SUR 28 
JOURS 
B.9. TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES (28 JOURS) (ADMINISTRA ­
TION CUTANÉE) 
B.10. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VITRO D'ABERRATION 
CHROMOSOMIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE 
B.11. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VIVO D'ABERRATION CHRO ­
MOSOMIQUE SUR MOELLE OSSEUSE DE MAMMIFÈRE 
B.12. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VIVO DU MICRONOYAU 
SUR ÉRYTHROCYTES DE MAMMIFÈRE 
B.13/14. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI DE MUTATION RÉVERSE SUR 
BACTÉRIES 
B.15. TESTS DE MUTAGENÈSE ET DE DÉPISTAGE DE CANCÉ ­
ROGENÈSE MUTATION GÉNIQUE —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
B.16. RECOMBINAISON MITOTIQUE —  SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
B.17. MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VITRO DE MUTATION 
GÉNIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE 
B.18. LÉSION ET RÉPARATION D'ADN — SYNTHÈSE NON 
PROGRAMMÉE DE L'ADN (UDS) — CELLULES DE MAMMIFÈRE IN VITRO 
B.19. ESSAI IN VITRO D'ÉCHANGE DE CHROMATIDES-SŒURS B.20. TEST DE LÉTALITÉ RÉCESSIVE LIÉE AU SEXE SUR  
DROSOPHILA MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 177
 
B.21. TESTS DE TRANSFORMATION SUR CELLULES DE 
MAMMIFÈRE IN VITRO 
B.22. TEST DE LÉTALITÉ DOMINANTE CHEZ LE RONGEUR 
B.23. ESSAI D'ABERRATION CHROMOSOMIQUE SUR SPERMA ­
TOGONIES DE MAMMIFÈRE 
B.24. SPOT TEST CHEZ LA SOURIS 
B.25. TRANSLOCATION HÉRÉDITAIRE CHEZ LA SOURIS 
B.26. ESSAI DE TOXICITÉ SUBCHRONIQUE PAR VOIE ORALE 
— TOXICITÉ ORALE À DOSES RÉPÉTÉES — RONGEURS: 
90 JOURS 
B.27. ESSAI DE TOXICITÉ SUBCHRONIQUE PAR VOIE ORALE 
— TOXICITÉ ORALE À DOSES RÉPÉTÉES — NON- RONGEURS: 90 JOURS 
B.28. TOXICITÉ DERMIQUE SUBCHRONIQUE — ÉPREUVE DE 
90 JOURS SUR DES RONGEURS 
B.29. TOXICITÉ SUBCHRONIQUE PAR INHALATION: ÉTUDE 
SUR 90 JOURS 
B.30. ÉTUDES DE TOXICITÉ CHRONIQUE B.31. ÉTUDE DE LA TOXICITÉ POUR LE DÉVELOPPEMENT 
PRÉNATAL 
B.32. ÉTUDES DE CANCÉROGENÈSE B.33. ÉTUDES COMBINÉES DE TOXICITÉ CHRONIQUE ET DE 
CANCÉROGENÈSE 
B.34. TEST DE REPRODUCTION SUR UNE GÉNÉRATION B.35. ÉTUDE DE TOXICITÉ POUR LA REPRODUCTION SUR 
DEUX GÉNÉRATIONS 
B.36. TOXICOCINÉTIQUE B.37. NEUROTOXICITÉ RETARDÉE DES SUBSTANCES ORGA ­
NOPHOSPORÉES APRÈS EXPOSITION AIGUË 
B.38. NEUROTOXICITÉ RETARDÉE DES SUBSTANCES ORGA ­
NOPHOSPHORÉES — ÉTUDE PAR ADMINISTRATION RÉITÉRÉE SUR 28 JOURS 
B.39. ESSAI IN VIVO DE SYNTHÈSE NON PROGRAMMÉE DE 
L'ADN (UDS) SUR CELLULES HÉPATIQUES DE MAMMI ­
FÈRE 
B.40. CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI DE RÉSISTANCE 
ÉLECTRIQUE TRANSCUTANÉE (RET) 
B.40 bis. CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE DE 
PEAU HUMAINE
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 178
 
B.41. ESSAI DE PHOTOTOXICITÉ IN VITRO 3T3 NRU 
B.42. SENSIBILISATION CUTANÉE: ESSAI DE STIMULATION 
LOCALE DES GANGLIONS LYMPHATIQUES 
B.43. ÉTUDE DE NEUROTOXICITÉ CHEZ LES RONGEURS 
B.44. ABSORPTION CUTANÉE: MÉTHODE IN VIVO 
B.45. ABSORPTION CUTANÉE: MÉTHODE IN VITRO B.46. IRRITATION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR ÉPIDERME 
HUMAIN RECONSTITUÉ 
B.47. MÉTHODE D'ESSAI D'OPACITÉ ET DE PERMÉABILITÉ DE 
LA CORNÉE BOVINE POUR LA MISE EN ÉVIDENCE DES SUBSTANCES CORROSIVES ET FORTEMENT IRRITANTES POUR L'ŒIL 
B.48. MÉTHODE D'ESSAI SUR ŒIL DE POULET ISOLÉ POUR LA 
MISE EN ÉVIDENCE DES SUBSTANCES CORROSIVES ET 
FORTEMENT IRRITANTES POUR L'ŒIL 
B.49. ESSAI IN VITRO DE MICRONOYAUX SUR CELLULES DE 
MAMMIFÈRES 
B.50. SENSIBILISATION CUTANÉE: ESSAI DE STIMULATION 
LOCALE DES GANGLIONS LYMPHATIQUES: DA 
B.51. SENSIBILISATION CUTANÉE: ESSAI DE STIMULATION 
LOCALE DES GANGLIONS LYMPHATIQUES: BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. TOXICITÉ AIGUË PAR INHALATION – MÉTHODE PAR 
CLASSE DE TOXICITÉ AIGUË  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 179
 
INTRODUCTION GÉNÉRALE  
A. CARACTÉRISATION DE LA SUBSTANCE À TESTER  
Avant d'entreprendre toute étude de toxicité, il faut connaître la 
composition de la substance à tester, y compris les principales impu ­
retés, ainsi que ses propriétés physico-chimiques dont sa stabilité.  
Les propriétés physico-chimiques de la substance fournissent des 
informations importantes pour le choix de la voie d'administration, 
pour la conception des différentes études, ainsi que pour la manipu ­
lation et le stockage de la substance.  
La mise au point d'une méthode d'analyse permettant une évaluation 
qualitative et quantitative de la substance à tester (y compris, si 
possible, de ses principales impuretés) dans le véhicule d'adminis ­
tration et dans le matériel biologique doit précéder la mise en œuvre de l'étude.
 
Toutes les informations concernant l'identification, les propriétés 
physico-chimiques, la pureté et le comportement de la substance à tester doivent être consignées dans le procès-verbal d'essai.
 
B. SOIN DES ANIMAUX  
Lors des essais de toxicité, il est essentiel de procéder à des contrôles 
stricts des conditions ambiantes et d'utiliser des techniques appro ­
priées de soin des animaux.  
i) Conditions d'hébergement  
Les conditions ambiantes dans les locaux ou enceintes réservés aux 
animaux d'expérience doivent être adaptées à l'espèce utilisée pour l'essai. Pour les rats, les souris et les cobayes, la température ambiante doit être de 22
 o C ± 3  o C et l'humidité relative de 30 à 
70 %; pour les lapins, la température doit être de 20  o C ± 3  o C et 
l'humidité relative de 30 à 70 %.  
Certaines techniques expérimentales sont particulièrement sensibles 
aux effets thermiques et, dans de tels cas, des indications précises 
concernant les conditions adéquates figurent dans la description de la méthode d'essai. Dans tous les essais de toxicité, la température et l'humidité doivent être contrôlées et consignées, et doivent figurer 
dans le rapport final d'étude.
 
Un éclairage artificiel doit garantir l'alternance de 12 heures de 
lumière et 12 heures d'obscurité. Les détails concernant les condi ­
tions d'éclairage doivent être consignés dans le rapport final d'étude.  
Sauf si la méthode prévoit d'autres conditions, les animaux doivent 
être hébergés individuellement ou mis en cage par petits groupes de 
même sexe. Les cages collectives ne doivent pas contenir plus de 
cinq animaux.  
Il est important que les comptes rendus d'expérimentation animale 
précisent le type de cage utilisé et le nombre d'animaux par cage lors 
de l'exposition à la substance chimique et pendant toute période 
d'observation qui suit.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 180
 
ii) Conditions d'alimentation  
Le régime alimentaire doit répondre à tous les besoins nutritionnels 
de l'espèce soumise à l'expérience. Lorsque les substances à tester sont administrées dans la nourriture, il se peut que la valeur nutri ­
tionnelle de cette dernière soit amoindrie par une interaction entre la 
substance et un ingrédient de l'alimentation. Cette éventualité doit être prise en compte lors de l'interprétation des résultats de l'essai. Les régimes alimentaires classiquement utilisés en laboratoire sont 
acceptables, l'eau de boisson étant fournie à satiété. Le choix du 
régime alimentaire peut être guidé par la nécessité de garantir une proportion appropriée de substance en cas d'administration par cette 
méthode.
 
Les contaminants alimentaires qui agissent sur la toxicité ne doivent 
pas être présents à des concentrations susceptibles d'influencer les résultats.
 
C. MÉTHODES ALTERNATIVES  
L'UE attache une grande importance à la mise au point et à la 
validation de méthodes alternatives qui fournissent autant d'informa ­
tions que les expérimentations animales actuelles, mais qui néces ­
sitent moins d'animaux, minimisent leurs souffrances et permettent d'éviter leur sacrifice.
 
Dès que de telles méthodes sont disponibles, elles doivent être envi ­
sagées, chaque fois que cela est possible, pour la caractérisation des 
dangers et pour la classification et l'étiquetage des substances en 
fonction des dangers intrinsèques.  
D. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
L'extrapolation directe à l'homme des résultats des expériences sur 
les animaux et des essais in vitro n'est possible que dans certaines limites; il faut en tenir compte lors de l'évaluation et de l'interpréta ­
tion des essais; aussi, lorsque des effets indésirables ont été mis en 
évidence chez l'homme, ces données peuvent être utilisées pour confirmer les résultats expérimentaux.
 
E. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES  
La plupart des méthodes présentées ici sont élaborées dans le cadre 
du programme de lignes directrices de l'OCDE en matière d'essais. 
Ces méthodes doivent être mises en œuvre conformément aux 
bonnes pratiques de laboratoire, afin de garantir l'acceptation mutuelle des données.
 
De plus amples informations peuvent être obtenues dans les réfé ­
rences citées dans les lignes directrices de l'OCDE et dans d'autres 
publications pertinentes.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 181
 
B.1 bis.  TOXICITÉ ORALE AIGUË — MÉTHODE DE LA DOSE 
PRÉDÉTERMINÉE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 420 (2001) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Les méthodes traditionnelles pour évaluer la toxicité aiguë utilisent 
comme effet observé la mort des animaux. En 1984, la British Toxicology Society (BTS) a proposé une nouvelle approche pour les essais de toxicité aiguë, utilisant des doses prédéterminées (1). 
Cette méthode évitait d'utiliser la mort des animaux comme effet 
observé et s'appuyait plutôt sur l'observation de signes manifestes de toxicité apparaissant après traitement à une dose prédéterminée. 
À la suite des études de validation in vivo au Royaume-Uni (2) et au 
niveau international (3), cette procédure a été adoptée comme ligne directrice en 1992. Après cela, les propriétés statistiques de la méthode de la dose prédéterminée ont été évaluées dans une série 
d'études utilisant des modèles mathématiques (4) (5) (6). Ensemble, 
les études in vivo et celles fondées sur des modèles mathématiques ont démontré que la procédure était reproductible et utilisait moins d'animaux auxquels elle occasionnait moins de souffrance que les 
méthodes traditionnelles. Elle permet de classer les substances par 
ordre de toxicité, de la même manière que les autres méthodes d'essai de toxicité aiguë.
 
Des indications permettant de choisir la méthode d'essai la plus 
appropriée pour un but donné sont présentées dans le document 
d'orientation sur les essais de toxicité orale aiguë (7). Ce document 
contient également de plus amples informations sur la conduite et l'interprétation de la méthode d'essai B.1 bis.
 
La méthode de la dose prédéterminée a comme principe de n'utiliser, 
pour l'étude principale, que des doses modérément toxiques et 
d'éviter d'administrer des doses qui peuvent s'avérer létales. De même, il n'est pas nécessaire d'administrer des doses dont on sait qu'elles provoquent des douleurs et une détresse importante du fait 
de propriétés corrosives ou sévèrement irritantes. Au cours de l'essai, 
les animaux moribonds et les animaux souffrant de façon manifeste ou montrant des signes de détresse grave devront être euthanasiés. Ces animaux devront être pris en compte dans l'interprétation des 
résultats au même titre que les animaux morts au cours de l'essai. 
Les critères pour décider d'euthanasier les animaux moribonds et ceux qui souffrent de façon manifeste, ainsi que les orientations pour reconnaître une mort prévisible ou imminente, font l'objet 
d'un autre document d'orientation (8).
 
La méthode fournit des informations qui permettent à la fois l'éva ­
luation des dangers et le classement des substances selon le système général harmonisé de classification (SGH) des substances ayant une 
toxicité aiguë (9).
 
Le laboratoire doit rassembler toutes les informations disponibles sur 
la substance d'essai avant de procéder à l'essai. Ces informations comprennent l'identité et la structure chimique de la substance, ses propriétés physico-chimiques, les résultats obtenus dans tous les 
autres essais de toxicité in vitro et in vivo, les données toxicolo ­
giques concernant des substances structurellement apparentées, ainsi que le ou les usages escomptés de la substance. Ces informations sont nécessaires pour rassurer les personnes concernées quant à la 
pertinence de l'essai pour la protection de la santé humaine et elles 
seront utiles dans le choix de la dose initiale appropriée.
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1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Toxicité orale aiguë : effets défavorables apparaissant après l'admi ­
nistration par voie orale d'une dose unique de substance ou de plusieurs doses données sur une période de 24 heures.
 
Mort différée : l'animal ne meurt ni n'apparaît moribond en l'espace 
de 48 heures, mais meurt ultérieurement au cours de la période 
d'observation de 14 jours.  
Dose : la quantité de substance d'essai administrée. La dose s'exprime 
en poids de substance d'essai par unité de poids de l'animal d'expé ­
rience (par exemple mg/kg).  
Toxicité manifeste : terme général désignant des signes évidents de 
toxicité qui surviennent à la suite de l'administration d'une substance 
d'essai [voir (3)]. Ces signes doivent être tels que l'on puisse s'at ­
tendre à ce qu'une augmentation de la dose administrée entraîne l'apparition de douleurs importantes et des signes persistants de détresse profonde, un état moribond [pour les critères, voir (8)] et 
probablement de la mortalité pour la plupart des animaux.
 
SGH : système général harmonisé de classification et d'étiquetage. 
Une activité conjointe de l'OCDE (santé humaine et environnement), 
du comité d'experts sur le transport des matières dangereuses (pro ­
priétés physico-chimiques) et du BIT (communication des dangers) et coordonnée par l'IOMC (Interorganisation Programme for the 
Sound Management of Chemicals).
 
Mort imminente : il y a mort imminente lorsqu'on s'attend à ce qu'un 
état moribond ou la mort interviennent avant le prochain moment 
d'observation prévu. Les signes indicatifs de cet état chez les 
rongeurs comprennent les convulsions, la position latérale, la posi ­
tion couchée et les tremblements [voir (8) pour plus de détails].  
DL 50 (dose létale 50 %):  dose unique d'une substance d'essai, 
obtenue par calcul statistique, susceptible d'entraîner la mort de 50 % des animaux lorsqu'elle est administrée par voie orale. La 
valeur de la DL
 50 est exprimée en poids de la substance par unité 
de poids corporel de l'animal d'expérience (mg/kg).  
Dose limite : désigne une dose qui est la limite supérieure pour l'essai 
(2 000 ou 5 000 mg/kg).  
État moribond : désigne l'état précédant la mort ou l'incapacité à 
survivre, même si un traitement est donné [pour de plus amples 
détails, voir (8)].  
Mort prévisible : présence de signes cliniques indiquant que la mort 
va intervenir à un moment déterminé dans le futur, avant la fin 
projetée de l'expérience, par exemple incapacité à atteindre l'eau ou 
la nourriture [pour plus de détails, voir (8)].  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 183
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Des groupes d'animaux du même sexe reçoivent des doses prédéter ­
minées de 5, 50, 300 et 2 000 mg/kg selon une procédure séquen ­
tielle. Exceptionnellement, une dose additionnelle de 5 000 mg/kg 
peut être envisagée (voir section 1.6.2). La dose initiale, choisie sur 
la base d'une étude d'orientation, est celle qui est susceptible de faire apparaître certains signes de toxicité, sans toutefois provoquer des effets toxiques graves ou la mort. Les manifestations cliniques et les 
effets associés à la douleur, à la souffrance et à une mort imminente 
sont décrits dans un document d'orientation de l'OCDE (8). D'autres groupes d'animaux reçoivent des doses plus fortes ou moins fortes en 
fonction de l'absence ou de la présence d'effets toxiques ou de 
mortalité. On continue la procédure jusqu'à ce que l'on identifie la dose qui occasionne un effet toxique évident ou la mort d'un seul animal. La procédure est également interrompue lorsque la dose la 
plus forte ne donne lieu à aucun effet observé ou lorsque la mort 
survient à la dose la plus faible.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Choix de l'espèce animale  
Le rat est l'espèce préférée, mais d'autres espèces peuvent être utili ­
sées. Normalement, on utilise des femelles (7). L'étude de la littéra ­
ture sur les essais traditionnels de DL  50 permet de conclure qu'il y a 
peu de différences de sensibilité entre sexes et que, lorsqu'il y a une 
différence, les femelles sont en général légèrement plus sensibles (10). Si, toutefois, compte tenu des propriétés toxicologiques et toxi ­
cocinétiques de composés structurellement voisins, il apparaît que les 
mâles sont probablement plus sensibles, il convient d'employer des 
mâles. Dans ce cas, il faut fournir une justification adéquate.
 
On utilise de jeunes animaux adultes sains issus de souches couram ­
ment utilisées en laboratoire. Les femelles doivent être nullipares et 
non gravides. Au début de l'essai, chaque animal doit être âgé de 8 à 
12 semaines et son poids doit se situer dans un intervalle de ± 20 % du poids moyen des animaux précédemment exposés.
 
1.4.2.  Conditions d'hébergement et d'alimentation  
La température du local des animaux d'expérience doit être main ­
tenue à 22  o C (± 3  o C). L'humidité relative doit atteindre au moins 
30 % et rester de préférence inférieure à 70 %, mais en dehors des 
heures de nettoyage du local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Pour l'ali ­
mentation des animaux, on peut utiliser la nourriture classique de 
laboratoire avec de l'eau potable à satiété. Les animaux peuvent être groupés par dose. Toutefois, le nombre d'animaux par cage ne doit pas faire obstacle à une observation précise de chaque animal.
 
1.4.3.  Préparation des animaux  
Les animaux sont choisis au hasard, marqués pour permettre une 
identification individuelle et gardés dans leurs cages pour les accli ­
mater aux conditions de laboratoire pendant au moins cinq jours 
avant l'expérience.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 184
 
1.4.4.  Préparation des doses  
En général, il convient d'administrer la substance d'essai à volume 
constant quelle que soit la dose testée, en faisant varier la concen ­
tration de la préparation. Lorsqu'un produit liquide ou un mélange 
font l'objet de l'essai, l'utilisation du produit non dilué, donc à 
concentration constante, peut être plus appropriée pour l'évaluation du risque de cette substance. Certaines autorités réglementaires l'exi ­
gent. Dans tous les cas, il ne faut pas dépasser le volume de dose 
maximal. Le volume maximal de liquide qui peut être administré en 
une seule fois dépend de la taille de l'animal d'essai. Chez les rongeurs, ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids 
corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses pour lesquelles on 
peut utiliser 2 ml/100 g de poids corporel. Il est recommandé d'uti ­
liser une solution aqueuse chaque fois que cela est possible, sinon on peut utiliser une solution dans de l'huile (par exemple de l'huile de 
maïs) et éventuellement une solution dans d'autres véhicules. En ce 
qui concerne les véhicules non aqueux, leur toxicité doit être connue. Les doses doivent être préparées juste avant l'administration, sauf si la stabilité de la préparation pendant la durée de la période d'utili ­
sation est connue et jugée acceptable.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Administration des doses  
La substance d'essai est administrée en une seule dose par gavage à 
l'aide d'une sonde gastrique ou de toute autre canule pour intubation appropriée. Lorsqu'il n'est pas possible d'administrer la dose en une 
seule fois, celle-ci peut être fractionnée sur une période n'excédant 
pas 24 heures.
 
Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la subs ­
tance (on supprimera la nourriture, mais pas l'eau, pendant toute une 
nuit pour les rats et pendant 3 à 4 heures pour les souris). Après la 
période de jeûne, les animaux doivent être pesés; la substance d'essai leur est ensuite administrée. Après l'administration de la substance, les animaux peuvent être à nouveau privés de nourriture, pendant 3 à 
4 heures pour les rats et pendant 1 à 2 heures pour les souris. Si la 
dose est administrée par fractions sur un certain laps de temps, il peut s'avérer nécessaire, en fonction de la durée du traitement, d'ali ­
menter et de faire boire les animaux.
 
1.5.2.  Étude d'orientation  
Le but de l'étude d'orientation est de permettre la sélection d'une 
dose initiale appropriée pour l'étude principale. L'administration des 
doses se fait de façon séquentielle aux animaux individuellement selon les schémas de l'annexe 1. L'étude d'orientation prend fin lorsqu'une décision au sujet de la dose initiale de l'étude principale 
peut être prise (ou lorsqu'une mortalité est observée à la dose prédé ­
terminée la plus faible).
 
Pour la dose initiale de l'étude d'orientation, on choisit un niveau 
parmi les suivants: 5, 50, 300 et 2 000 mg/kg. Le niveau choisi est 
celui pour lequel on peut s'attendre à observer des signes de toxicité 
évidente, si possible sur la base d'indications obtenues à partir de données in vivo et in vitro sur la même substance et sur des subs ­
tances structurellement voisines. En l'absence de telles informations, 
la dose initiale sera de 300 mg/kg.
 
Les animaux sont traités à 24 heures d'intervalle au moins. Tous les 
animaux sont observés pendant au moins quatorze jours.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 185
 
Exceptionnellement, et uniquement lorsque cela est nécessaire pour 
satisfaire à une exigence réglementaire particulière, l'utilisation d'une 
dose maximale prédéterminée supplémentaire de 5 000 mg/kg peut être envisagée (voir annexe 3). Par souci de protection des animaux, l'essai de substances en catégorie 5 du SGH (2 000 - 5 000 mg/kg) 
est déconseillé et ne doit être envisagé que lorsqu'il est très probable 
qu'il donnera des résultats qui présenteront un intérêt direct pour la protection de la santé des hommes et des animaux ou de l'environ ­
nement.
 
Dans le cas où un animal ayant reçu la dose prédéterminée la plus 
faible (5 mg/kg) mourrait au cours de l'étude d'orientation, la procé ­
dure normale est de terminer l'étude et de classer la substance en catégorie 1 du SGH (voir l'annexe 1). Cependant, il peut s'avérer 
nécessaire de confirmer la classification, et la procédure facultative 
supplémentaire ci-après est alors proposée. Un deuxième animal reçoit une dose de 5 mg/kg. Si ce deuxième animal meurt, la clas ­
sification en catégorie 1 du SGH est confirmée et l'étude prend fin 
immédiatement. Si le deuxième animal survit, un maximum de trois 
animaux supplémentaires reçoivent chacun 5 mg/kg. Étant donné le risque de mortalité élevé, il convient de procéder de manière séquen ­
tielle par souci de protection des animaux. L'intervalle de temps entre 
chaque administration doit être suffisant afin de pouvoir démontrer 
que l'animal précédent a des chances de survivre. Si un deuxième animal meurt, l'administration séquentielle sera immédiatement arrêtée et aucun autre animal ne recevra de dose. Avec la mort 
d'un deuxième animal (indépendamment du nombre d'animaux 
soumis à l'essai au moment où celui-ci est arrêté), le résultat est A (2 morts ou plus), et la règle de classification présentée à l'annexe 2 pour la dose prédéterminée de 5 rng/kg s'applique: catégorie 1 s'il y 
a 2 morts ou plus, et catégorie 2 s'il y a seulement 1 mort. En outre, 
l'annexe 4 propose une méthode de classification selon le système communautaire en attendant la mise en place du nouveau SGH.
 
1.5.3.  Étude principale  
1.5.3.1.  Nombre d'animaux et niveaux des doses  
Les schémas de l'annexe 2 indiquent la marche à suivre après admi ­
nistration de la dose initiale. Il y a trois possibilités: arrêter l'essai et attribuer la classification appropriée, administrer la dose prédéter ­
minée supérieure ou administrer la dose inférieure. Cependant, par 
souci de protection des animaux, les doses ayant entraîné la mort au 
cours de l'étude d'orientation ne sont pas réappliquées lors de l'étude principale (voir annexe 2). L'expérience démontre que le résultat le plus probable à la dose initiale est que la substance pourra être 
classée et qu'il sera inutile de prolonger l'essai.
 
En général, on utilise au total cinq animaux du même sexe à chaque 
niveau de dose étudié. Ce groupe de cinq animaux est constitué de 
l'animal utilisé dans l'étude d'orientation, auquel est administrée la 
dose sélectionnée, et de quatre animaux supplémentaires (sauf dans les rares cas où une dose utilisée dans l'étude principale n'a pas été utilisée dans l'étude d'orientation).
 
L'intervalle de temps à respecter entre l'administration de chaque 
niveau de dose dépend du moment où se manifestent les effets toxiques, de leur durée et de leur gravité. L'administration de la dose suivante doit être retardée jusqu'à ce que l'on ait obtenu la 
certitude que les animaux précédemment soumis au traitement vont 
survivre. Un laps de temps de 3 ou 4 jours entre les administrations à chaque niveau de dose est recommandé, si nécessaire, pour permettre l'observation de signes de toxicité différée. Cet intervalle peut être 
ajusté selon qu'il convient, par exemple, en cas de réponse peu 
concluante.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 186
 
Lorsque l'on envisage d'utiliser une dose prédéterminée maximale de 
5 000 mg/kg, il y a lieu de suivre la procédure présentée à l'annexe 3 
(voir également section 1.6.2).  
1.5.3.2.  Essai limite  
L'essai limite est utilisé principalement lorsque l'expérimentateur 
dispose d'informations indiquant que la substance d'essai n'est proba ­
blement pas toxique, c'est-à-dire que sa toxicité ne se manifeste qu'au-delà des doses limites réglementaires. Des informations concer ­
nant la toxicité de la substance d'essai peuvent être déduites des 
connaissances acquises sur des substances, produits ou mélanges similaires déjà testés, compte tenu de l'identité et du pourcentage des composants importants sur le plan toxicologique. Quand on ne 
dispose pas d'informations concernant la toxicité de la substance, ou 
lorsqu'on s'attend à une substance toxique, il faut effectuer l'essai principal.
 
Selon la procédure normale, une étude d'orientation à la dose initiale 
de 2 000 mg/kg (exceptionnellement 5 000 mg/kg), suivie du traite ­
ment de quatre animaux supplémentaires à cette même dose, sert d'essai limite dans cette ligne directrice.
 
1.6. OBSERVATIONS  
Les animaux doivent être observés individuellement au moins une 
fois pendant les 30 premières minutes suivant l'administration de la substance et régulièrement pendant les premières 24 heures, avec une 
attention particulière au cours des 4 premières heures; l'observation 
doit ensuite être quotidienne, pendant 14 jours en tout, sauf dans le cas des animaux qui meurent en cours d'étude ou qui doivent être retirés de l'étude et euthanasiés pour leur épargner des souffrances 
excessives. Toutefois, la durée d'observation ne doit pas être fixée de 
manière rigide. Elle doit être fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récu ­
pération. Elle peut donc être prolongée si nécessaire. Les moments 
où les signes de toxicité apparaissent et disparaissent sont importants, 
surtout si les effets toxiques ont tendance à être différés (11). Toutes les observations sont enregistrées de façon systématique, une fiche individuelle étant établie pour chaque animal.
 
D'autres observations peuvent s'avérer nécessaires lorsque les 
animaux continuent à manifester des signes de toxicité. Les obser ­
vations doivent porter sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, ainsi que de l'appareil respiratoire, du 
système circulatoire, du système nerveux central et autonome, de 
l'activité somatomotrice et du comportement. L'attention portera en particulier sur l'observation des diverses manifestations de tremble ­
ment, convulsions, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. 
Les principes et critères résumés dans le document d'orientation sur 
les effets sur l'homme doivent être pris en considération (8). Les animaux moribonds et les animaux souffrant manifestement ou présentant des signes graves de détresse doivent être euthanasiés. 
Qu'il s'agisse d'animaux euthanasiés pour raisons éthiques ou d'ani ­
maux retrouvés morts, le moment de la mort doit être enregistré de façon aussi précise que possible.
 
1.6.1.  Poids corporel  
Le poids de chaque animal doit être déterminé peu de temps avant 
l'administration de la substance d'essai et au moins une fois par semaine ensuite. Les variations de poids doivent être calculées et 
enregistrées. À la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés 
puis euthanasiés.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 187
 
1.6.2.  Pathologie  
Tous les animaux d'essai (y compris ceux qui sont morts au cours de 
l'essai ou ceux qui ont été retirés de l'étude pour des raisons éthiques) doivent être soumis à une autopsie à l'échelle macrosco ­
pique. Pour chaque animal, toutes les altérations pathologiques 
macroscopiques doivent être enregistrées. Chez les animaux qui survivent 24 heures ou plus après administration de la dose initiale, l'examen microscopique des organes présentant des signes évidents 
de pathologie doit également être envisagé, car il peut fournir des 
renseignements utiles.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats obtenus pour chaque animal doivent être présentés. 
Toutes les données doivent être résumées dans un tableau indiquant, pour chaque groupe d'essai, le nombre d'animaux utilisés, le nombre 
d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux 
retrouvés morts pendant l'essai ou sacrifiés pour des raisons éthiques, et pour chaque animal, le moment de la mort, la description des effets toxiques et leur évolution dans le temps ainsi que leur réver ­
sibilité éventuelle et les résultats de l'autopsie.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir, s'il y a lieu, les renseignements 
suivants:  
Substance d'essai:  
— état physique, pureté et, s'il y a lieu, propriétés physico- 
chimiques (compris isomérisation),  
— données relatives à l'identification, y compris numéro CAS.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix du véhicule, s'il ne s'agit pas d'eau.  
Animaux d'essai:  
— espèce/souche utilisée,  
— état microbiologique des animaux, s'il est connu,  
— nombre, âge et sexe des animaux (le cas échéant, justification du 
choix de mâles à la place de femelles),  
— origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.  
Conditions de l'essai:  
— détails sur la formulation de la substance d'essai, notamment état 
physique du produit administré,  
— détails sur le mode d'administration, notamment volume des 
doses et moment de l'administration,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau (y compris le 
type de régime et sa provenance ainsi que celle de l'eau),  
— justification du choix de la dose initiale.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 188
 
Résultats:  
— tableau des réactions aux différentes doses pour chaque animal 
(c'est-à-dire nombre d'animaux montrant des signes de toxicité, y compris mortalité, nature, gravité et durée des effets),
 
— tableau des poids corporels et des variations du poids,  
— poids individuel des animaux le jour du traitement, et ensuite à 
intervalles d'une semaine, et au moment de la mort ou du sacri ­
fice, 
— date et heure de la mort si celle-ci intervient avant le moment 
prévu du sacrifice,  
— pour chaque animal, moment d'apparition et évolution des signes 
de toxicité et réversibilité éventuelle,  
— pour chaque animal, résultats de l'autopsie et observations 
histopathologiques.  
Discussion et interprétation des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of subs ­
tances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, p. 85-92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of subs ­
tances and preparations for their acute toxicity. Human Toxi ­
col., 6, p. 279-291.  
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, 
A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD  50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, p. 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313- 324.
 
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 
323. Human Exptl. Toxicol.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statis ­
tical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. 
Toxicol., 21, p. 183-196.  
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No 24. Paris  
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No 19.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L, Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231.  
(11) Chan, P.K and A.W. Hayes (1994). Chapter 16 Acute Toxi ­
city and Eye Irritation in: Principles and Methods of Toxi ­
cology. 3  rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. 
New York, USA.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 190
 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 191
 ▼B 
ANNEXE 1  
SCHÉMA POUR L'ÉTUDE D'ORIENTATION

 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 193
 ▼B 
ANNEXE 2  
SCHÉMA POUR L'ÉTUDE PRINCIPALE

 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 194
 ▼B

 
ANNEXE 3  
CRITÈRES POUR LA CLASSIFICATION DE SUBSTANCES 
D'ESSAI DONT ON PRÉSUME QUE LA DL  50 EST SUPÉRIEURE À 
2 000 mg/kg, SANS RECOURIR À L'ESSAI  
Les critères pour la catégorie de danger 5 sont destinés à permettre l'identification 
de substances qui ont une toxicité aiguë relativement faible mais qui, dans 
certaines conditions, peuvent se révéler dangereuses pour des populations vulné ­
rables. Ces substances sont présumées avoir une DL  50 orale ou cutanée comprise 
dans la plage 2 000 - 5 000 mg/kg ou correspondant à des doses équivalentes par 
d'autres voies. Des substances d'essai peuvent être classées dans la catégorie SGH 
de danger 5, définie par 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg, dans les cas 
suivants:  
a) lorsque, en fonction de la mortalité, l'un des schémas de l'annexe 2 oriente la 
substance vers cette catégorie;  
b) lorsque l'on est déjà en possession de données fiables indiquant que la DL  50 
se situera dans la plage des valeurs de la catégorie 5; ou lorsque d'autres 
études sur des animaux ou l'observation d'effets toxiques chez l'homme 
suscitent de sérieuses inquiétudes pour la santé humaine;  
c) par extrapolation, évaluation ou mesure de données, lorsque la classification 
dans une catégorie de plus grand danger n'est pas justifiée, et  
— il existe des informations fiables faisant état d'effets toxiques significatifs 
chez l'homme, ou  
— une certaine mortalité est observée en testant par voie orale jusqu'aux 
valeurs de la catégorie 4, ou  
— lorsqu'un jugement d'expert confirme l'existence de signes cliniques signi ­
ficatifs de toxicité lors d'un essai mené jusqu'aux valeurs de la catégorie 4, 
hormis diarrhée, hérissement des poils ou aspect mal soigné, ou  
— quand un jugement d'expert confirme l'existence d'informations fiables 
indiquant la possibilité d'effets aigus significatifs d'après les résultats des autres études sur animaux.
 
ESSAIS À DOSES SUPÉRIEURES À 2 000 mg/kg  
Exceptionnellement, et uniquement lorsque cela est nécessaire pour satisfaire à 
une exigence réglementaire particulière, l'utilisation d'une dose maximale supplé ­
mentaire de 5 000 mg/kg peut être envisagée. Par souci de protection des animaux, l'essai de substances à la dose de 5 000 mg/kg est déconseillé et ne 
devrait être envisagé que lorsqu'il est fort probable que les résultats d'un tel essai 
présenteront un intérêt direct pour la protection de la santé des hommes et des animaux (9).
 
Étude d'orientation  
Les critères de décision de la procédure séquentielle présentée à l'annexe 1 sont 
étendus de manière à s'appliquer également à une dose de 5 000 mg/kg. Ainsi, 
lorsqu'une dose initiale de 5 000 mg/kg est utilisée dans l'étude d'orientation et que le résultat A (mortalité) est obtenu, il faut tester un deuxième animal à 2 000 mg/kg; si le premier résultat est B ou C (toxicité évidente ou pas de toxicité), on 
pourra choisir 5 000 mg/kg comme dose initiale dans l'étude principale. De 
même, si on choisit une dose initiale différente de 5 000 mg/kg, l'essai se pour ­
suivra à la dose de 5 000 mg/kg en cas d'obtention d'un résultat B ou C à 2 000 mg/kg. L'obtention d'un nouveau résultat A à 5 000 mg/kg imposera une dose 
initiale de 2 000 mg/kg pour l'étude principale, alors qu'un résultat B ou C 
imposera 5 000 mg/kg comme dose initiale pour cette étude.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 195
 
Étude principale  
Les critères de décision de la procédure séquentielle présentée à l'annexe 2 sont 
étendus de manière à s'appliquer également à une dose de 5 000 mg/kg. Ainsi, 
lorsqu'une dose initiale de 5 000 mg/kg est utilisée dans l'étude principale et que le résultat A (> 2 morts) est obtenu, il faut tester un second groupe à 2 000 mg/kg. Si le premier résultat est B (toxicité évidente et/ou ≤ 1 mort) ou C (pas de toxicité), la 
substance ne sera pas classée dans le cadre du SGH. De façon similaire, si une 
dose initiale différente de 5 000 mg/kg est choisie, l'essai se poursuivra à la dose de 5 000 mg/kg en cas d'obtention d'un résultat C à 2 000 mg/kg. L'obtention d'un nouveau résultat A à 5 000 mg/kg entraînera la classification de la substance dans 
la catégorie 5 du SGH; si le résultat obtenu est B ou C, la substance ne sera pas 
classée dans le cadre du SGH.
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 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 197
 ▼B 
ANNEXE 4  
MÉTHODE D'ESSAI B.1  bis 
Conseils pour une classification selon le système de l'UE en attendant la mise en place effective du système général harmonisé de classification (SGH) [voir référence (8)]

 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 198
 ▼B

 
B.1 ter.  TOXICITÉ ORALE AIGUË — MÉTHODE DE LA CLASSE 
DE TOXICITÉ AIGUË  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 423 (2001) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La méthode de la classe de toxicité aiguë (1) décrite dans cet essai 
est une procédure séquentielle qui utilise trois animaux de même sexe à chaque étape. Suivant la mortalité et/ou l'état moribond des 
animaux, deux à quatre étapes sont en moyenne nécessaires pour 
évaluer la toxicité aiguë de la substance d'essai. Cette procédure est reproductible, utilise très peu d'animaux et permet de classer des substances par ordre de toxicité de la même manière que les 
autres méthodes de toxicité aiguë. La méthode par classe de toxicité 
aiguë est fondée sur des évaluations biométriques (2) (3) (4) (5) avec des doses prédéterminées, convenablement espacées de manière à permettre le classement des substances les unes par rapport aux 
autres aux fins de l'évaluation des dangers. La méthode, telle 
qu'elle a été adoptée en 1996, a été largement validée in vivo par rapport aux données de DL
 50 issues de la littérature, tant sur le plan 
national (6) que sur le plan international (7).  
Des indications permettant de choisir la méthode d'essai la plus 
appropriée pour un but donné sont présentées dans le document d'orientation sur les essais de toxicité orale aiguë (8). Ce document contient également de plus amples informations sur la conduite et 
l'interprétation de la méthode d'essai B.l  ter.
 
Il n'est pas nécessaire d'administrer des substances d'essai à des 
niveaux de dose dont on sait qu'elles provoquent des douleurs et une détresse importante du fait des propriétés corrosives ou sévère ­
ment irritantes. Au cours de l'essai, les animaux moribonds et les 
animaux souffrant de façon manifeste ou montrant des signes de détresse grave devront être euthanasiés. Ces animaux devront être pris en compte dans l'interprétation des résultats, au même titre que 
les animaux morts pendant l'essai. Les critères pour décider de tuer 
les animaux moribonds et ceux qui souffrent de façon manifeste ainsi que des orientations pour reconnaître une mort prévisible ou immi ­
nente font l'objet d'un autre document d'orientation (9).
 
La méthode utilise des doses prédéterminées et donne des résultats 
qui permettent le classement des substances selon le système général harmonisé de classification (SGH) des substances ayant une toxicité aiguë (10).
 
En principe, la méthode ne vise pas à calculer une valeur précise de 
DL 50 , mais elle permet de déterminer dans quelle gamme de doses la 
substance doit être considérée comme létale, puisque la mort d'une partie des animaux reste le principal effet observé dans cet essai. La 
méthode permet de déterminer une DL
 50 uniquement dans le cas où 
au moins deux doses donnent une mortalité supérieure à 0 % et inférieure à 100 %. Grâce à l'utilisation d'un choix de doses prédé ­
terminées, indépendamment de la substance d'essai, et au lien expli ­
cite entre classification et nombre d'animaux dans différents états 
observés, la cohérence entre laboratoires est favorisée.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 199
 
Le laboratoire doit rassembler toutes les informations disponibles sur 
la substance d'essai avant de procéder à l'essai. Ces informations 
comprennent l'identité et la structure chimique de la substance, ses propriétés physico-chimiques, le résultat de tout autre essai de toxi ­
cité réalisé in vivo ou in vitro sur la substance, les données toxico ­
logiques concernant des substances structurellement apparentées, 
ainsi que le ou les usages escomptés de la substance. Ces informa ­
tions sont nécessaires pour rassurer les personnes concernées quant à la pertinence de l'essai pour la protection de la santé humaine et elles 
seront utiles dans le choix de la dose initiale appropriée.
 
1.2. DÉFINITIONS  
Toxicité orale aiguë : effets défavorables apparaissant après l'admi ­
nistration par voie orale d'une dose unique de substance ou de 
plusieurs doses données sur une période de 24 heures.  
Mort différée : l'animal ne meurt ni n'apparaît moribond en l'espace 
de 48 heures, mais meurt ultérieurement au cours de la période d'observation de 14 jours.
 
Dose : la quantité de substance d'essai administrée. La dose s'exprime 
en poids de substance d'essai par unité de poids de l'animal d'expé ­
rience (par exemple mg/kg).  
SGH : système général harmonisé de classification et d'étiquetage. 
Une activité conjointe de l'OCDE (santé humaine et environnement), du comité d'experts sur le transport des matières dangereuses (pro ­
priétés physico-chimiques) et du BIT (communication des dangers) 
et coordonnée par l'IOMC (Interorganisation Program for the Sound 
Management of Chemicals).
 
Mort imminente : il y a mort imminente lorsqu'on s'attend à ce qu'un 
état moribond ou la mort interviennent avant le prochain moment d'observation prévu. Parmi les signes qui sont indicatifs de cet état 
chez les rongeurs, il y a les convulsions, la position latérale, la 
position couchée et les tremblements [pour de plus amples détails, voir (9)].
 
DL 50 (dose orale létale 50 %) : dose unique d'une substance d'essai, 
obtenue par calcul statistique, susceptible d'entraîner la mort de 50 % des animaux lorsqu'elle est administrée par voie orale. La valeur de 
la DL
 50 est exprimée en poids de la substance d'essai par unité de 
poids corporel de l'animal d'expérience (mg/kg).  
Dose limite : désigne une dose qui est la limite supérieure pour l'essai 
(2 000 ou 5 000 mg/kg).  
État moribond : l'état avant la mort ou l'incapacité à survivre, même 
si un traitement est donné [pour de plus amples détails, voir (9)].  
Mort prévisible : présence de signes cliniques indiquant que la mort 
va intervenir à un moment déterminé dans le futur, avant la fin 
projetée de l'expérience, par exemple incapacité à atteindre l'eau ou 
la nourriture [pour plus de détails, voir (9)].  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 200
 
1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI  
Le principe de cet essai est que, avec un processus séquentiel et un 
nombre minimal d'animaux par étape, il est possible d'obtenir des informations sur la toxicité aiguë de la substance d'essai qui sont 
suffisantes aux fins de sa classification. Une dose déterminée de la 
substance est administrée par voie orale à un groupe d'animaux. La substance est testée selon une procédure séquentielle utilisant trois animaux de même sexe (généralement des femelles) à chaque étape. 
L'absence ou la manifestation de mortalité liée à la substance dans 
un groupe ayant reçu une dose à une étape donnée détermine l'étape suivante, c'est-à-dire:
 
— arrêt de l'essai,  
— administration de la même dose à trois animaux supplémentaires,  
— administration de la dose immédiatement supérieure ou immédia ­
tement inférieure à trois animaux supplémentaires.  
Des détails concernant le mode opératoire sont décrits à 
l'annexe 1. La méthode permet de se prononcer sur la classification de la substance d'essai dans une classe de toxicité délimitée par des 
valeurs préalablement fixées de DL
 50 . 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.4.1.  Choix de l'espèce animale  
Le rat est l'espèce préférée mais d'autres espèces de rongeurs peuvent 
être utilisées. Normalement, on utilise des femelles (9). L'étude de la 
littérature sur les essais traditionnels de DL  50 montre en effet qu'il y 
a peu de différence de sensibilité entre sexes et que, lorsqu'il y a des différences, les femelles sont en général légèrement plus sensibles (11). Si, toutefois, compte tenu des propriétés toxicologiques et toxi ­
cocinétiques de composés structurellement voisins, il apparaît que les 
mâles sont probablement plus sensibles, il convient d'employer des mâles. Dans ce cas, il faut fournir une justification adéquate.
 
On utilise de jeunes animaux adultes sains, issus de souches couram ­
ment utilisées en laboratoire. Les femelles doivent être nullipares et 
non gravides. Au début de l'essai, chaque animal doit être âgé de 8 à 12 semaines et son poids doit se situer dans un intervalle de ± 20 % du poids moyen des animaux précédemment exposés.
 
1.4.2.  Conditions d'hébergement et d'alimentation  
La température du local des animaux d'expérience doit être de 22  o C 
(± 3  o C). L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester 
de préférence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de nettoyage du local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité 
autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel alternant 
12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Pour l'alimentation des animaux, on peut utiliser la nourriture classique de laboratoire avec de l'eau potable à satiété. Les animaux peuvent être groupés par 
dose. Toutefois, le nombre d'animaux par cage ne doit pas faire 
obstacle à une observation précise de chaque animal.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 201
 
1.4.3.  Préparation des animaux  
Les animaux sont choisis au hasard, marqués pour permettre une 
identification individuelle et gardés dans leurs cages pour les accli ­
mater aux conditions de laboratoire pendant au moins cinq jours 
avant l'expérience.  
1.4.4.  Préparation des doses  
En général, il convient d'administrer la substance d'essai à volume 
constant quelle que soit la dose testée, en faisant varier la concen ­
tration de la préparation. Lorsqu'un produit liquide ou un mélange 
font l'objet de l'essai, l'utilisation du produit non dilué, donc à concentration constante, peut être plus appropriée pour l'évaluation du risque de cette substance. Certaines autorités réglementaires l'exi ­
gent. Dans tous les cas, il ne faut pas dépasser le volume de dose 
maximal. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une seule fois dépend de la taille de l'animal d'essai. Chez les rongeurs, ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids 
corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses pour lesquelles on 
peut utiliser 2 ml/100 g de poids corporel. Il est recommandé d'uti ­
liser une solution aqueuse chaque fois que cela est possible, sinon on peut utiliser une solution dans de l'huile (par exemple de l'huile de 
mais) et éventuellement une solution dans d'autres véhicules. En ce 
qui concerne les véhicules non aqueux, leur toxicité doit être connue. Les doses doivent être préparées juste avant l'administration, sauf si la stabilité de la préparation pendant la durée de la période d'utili ­
sation est connue et jugée acceptable.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Administration des doses  
La substance d'essai est administrée en une seule dose en utilisant 
une sonde gastrique ou toute autre canule pour intubation appropriée. 
Lorsqu'il n'est pas possible d'administrer la dose en une seule fois, 
celle-ci peut être fractionnée sur une période n'excédant pas 24 heures.
 
Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la subs ­
tance (on supprimera la nourriture, mais pas l'eau, pendant toute une nuit pour les rats et pendant 3 à 4 heures pour les souris). Après la période de jeûne, les animaux doivent être pesés; la substance d'essai 
leur est ensuite administrée. Après l'administration de la substance, 
les animaux peuvent être à nouveau privés de nourriture, pendant 3 à 4 heures pour les rats et pendant 1 à 2 heures pour les souris. Si la dose est administrée par fractions sur un certain laps de temps, il 
peut s'avérer nécessaire, en fonction de la durée du traitement, d'ali ­
menter et de faire boire les animaux.
 
1.5.2.  Nombre d'animaux et niveaux des doses  
Trois animaux sont utilisés à chaque étape. Pour la dose initiale, on 
choisit un niveau parmi les quatre suivants: 5, 50, 300 et 2 000 
mg/kg de poids corporel. Le niveau choisi est celui pour lequel on 
peut s'attendre à observer une mortalité chez les animaux traités. Les schémas de l'annexe 1 décrivent la marche à suivre pour chacune des doses initiales. En outre, l'annexe 4 propose une méthode de clas ­
sification selon le système communautaire en attendant la mise en 
place du nouveau SGH.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 202
 
Lorsque certaines informations donnent à penser qu'il est peu 
probable que la dose initiale la plus élevée (2 000 mg/kg de poids 
corporel) provoque une mortalité, il convient de procéder à un essai limite. En l'absence de telles informations sur la substance d'essai, la dose initiale qui est recommandée par souci de protection des 
animaux est 300 mg/kg de poids corporel.
 
L'intervalle de temps à respecter entre l'administration de chaque 
niveau de dose dépend du moment où se manifestent les effets 
toxiques, de leur durée et de leur gravité. L'administration de la 
dose suivante doit être retardée jusqu'à ce que l'on ait obtenu la certitude que les animaux précédemment soumis au traitement vont survivre.
 
Exceptionnellement, et uniquement lorsque cela est nécessaire pour 
satisfaire une exigence réglementaire particulière, l'utilisation d'une dose maximale prédéterminée supplémentaire de 5 000 mg/kg peut 
être envisagée (voir annexe 2). Par souci de protection des animaux, 
l'essai de substances en catégorie 5 du SGH (2 000 - 5 000 mg/kg) est déconseillé et ne doit être envisagé que lorsqu'il est très probable qu'il donnera des résultats qui présenteront un intérêt direct pour la 
protection de la santé des hommes et des animaux ou de l'environ ­
nement.
 
1.5.3.  Essai limite  
L'essai limite est utilisé principalement lorsque l'expérimentateur 
dispose d'informations indiquant que la substance d'essai n'est proba ­
blement pas toxique, c'est-à-dire que sa toxicité ne se manifeste qu'au-delà des doses limites réglementaires. Des informations concer ­
nant la toxicité de la substance d'essai peuvent être déduites des 
connaissances acquises sur des substances, produits ou mélanges 
similaires déjà testés, compte tenu de l'identité et du pourcentage des composants importants sur le plan toxicologique. Quand on ne dispose pas d'informations concernant la toxicité de la substance, ou 
lorsqu'on s'attend à une substance toxique, il faut effectuer l'essai 
principal.
 
Un essai limite à la dose de 2 000 mg/kg peut être effectué sur six 
animaux (trois animaux par étape). Exceptionnellement, un essai 
limite à la dose de 5 000 mg/kg peut être réalisé sur trois animaux (voir annexe 2). Si une mortalité liée à la substance est observée, il peut s'avérer nécessaire de poursuivre l'essai à la dose immédiate ­
ment inférieure.
 
1.6. OBSERVATIONS  
Les animaux doivent être observés individuellement au moins une 
fois pendant les 30 premières minutes suivant l'administration de la 
substance et régulièrement pendant les premières 24 heures, avec une 
attention particulière au cours des 4 premières heures; l'observation doit ensuite être quotidienne, pendant 14 jours en tout, sauf dans le cas des animaux qui meurent en cours d'étude ou qui doivent être 
retirés de l'étude et euthanasiés pour leur épargner des souffrances 
excessives. Toutefois, la durée d'observation ne doit pas être fixée de manière rigide. Elle doit être fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récu ­
pération. Elle peut donc être prolongée, si nécessaire. Les moments 
où apparaissent et disparaissent les signes de toxicité sont importants, particulièrement quand on constate un certain retard dans l'apparition de ces signes (12). Toutes les observations sont enregistrées de façon 
systématique, une fiche individuelle étant établie pour chaque 
animal.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 203
 
D'autres observations peuvent s'avérer nécessaires lorsque les 
animaux continuent à manifester des signes de toxicité. Les obser ­
vations doivent porter sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, ainsi que de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux central et autonome, de 
l'activité somato-motrice et du comportement. L'attention portera en 
particulier sur l'observation des diverses manifestations de tremble ­
ment, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Les principes et critères résumés dans le document d'orientation sur 
les effets sur l'homme doivent être pris en considération (9). Les 
animaux moribonds et les animaux souffrant manifestement ou présentant des signes graves de détresse doivent être euthanasiés. Qu'il s'agisse d'animaux euthanasiés pour raisons éthiques ou d'ani ­
maux retrouvés morts, le moment de la mort doit être enregistré de 
façon aussi précise que possible.
 
1.6.1.  Poids corporel  
Le poids de chaque animal doit être déterminé peu de temps avant 
l'administration de la substance d'essai, et au moins une fois par 
semaine ensuite. Les variations de poids doivent être calculées et enregistrées. À la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés puis euthanasiés.
 
1.6.2.  Pathologie  
Tous les animaux (y compris ceux qui sont morts au cours de l'essai 
ou ceux qui ont été retirés de l'étude pour des raisons éthiques) doivent être soumis à une autopsie à l'échelle macroscopique. Pour 
chaque animal, toutes les altérations pathologiques macroscopiques 
doivent être enregistrées. Chez les animaux qui survivent 24 heures ou plus à l'administration de la dose initiale, l'examen microscopique des organes présentant des signes évidents de pathologie doit égale ­
ment être envisagé, car il peut fournir des renseignements utiles.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats obtenus pour chaque animal doivent être présentés. 
Toutes les données doivent être résumées dans un tableau indiquant, pour chaque groupe d'essai, le nombre d'animaux utilisés, le nombre 
d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux 
retrouvés morts pendant l'essai ou sacrifiés pour des raisons éthiques, et, pour chaque animal, le moment de la mort, la description des effets toxiques et leur évolution dans le temps ainsi que leur réver ­
sibilité éventuelle et les résultats de l'autopsie.
 
3. RAPPORT  
3.1. Rapport d'essai  
Le rapport d'essai doit contenir, s'il y a lieu, les renseignements 
suivants:  
Substance d'essai:  
— état physique, pureté et, s'il y a lieu, propriétés physico- 
chimiques (compris isomérisation),  
— données relatives à l'identification, y compris numéro CAS.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix du véhicule, s'il ne s'agit pas d'eau.  
Animaux d'essai:  
— espèce/souche utilisée,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 204
 
— état microbiologique des animaux, s'il est connu,  
— nombre, âge et sexe des animaux (le cas échéant, justification du 
choix de mâles à la place de femelles),  
— origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.  
Conditions de l'essai:  
— détails sur la formulation de la substance d'essai, notamment état 
physique du produit administré,  
— détails sur le mode d'administration, notamment volume des 
doses et moment de l'administration,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau (y compris le 
type de régime et sa provenance ainsi que celle de l'eau),  
— justification du choix de la dose initiale.  
Résultats:  
— tableau des réactions aux différentes doses pour chaque animal 
(c'est-à-dire nombre d'animaux montrant des signes de toxicité, y compris mortalité; nature, gravité et durée des effets),
 
— tableau des poids corporels et des variations de poids,  
— poids individuels des animaux le jour du traitement, et ensuite à 
intervalles d'une semaine, ainsi qu'au moment de la mort ou du 
sacrifice,  
— date et heure de la mort si celle-ci intervient avant le moment 
prévu du sacrifice,  
— pour chaque animal, moment d'apparition et évolution des signes 
de toxicité et réversibilité éventuelle,  
— pour chaque animal, résultats de l'autopsie et observations 
histopathologiques le cas échéant.  
Discussion et interprétation des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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logy.  Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, 
New York, USA.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 206
 
ANNEXE 1  
MARCHE À SUIVRE POUR CHACUNE DES DOSES INITIALES  
REMARQUES GÉNÉRALES  
Les divers schémas d'essai présentés dans la présente annexe indiquent la marche 
à suivre pour chaque dose initiale.  
— Annexe 1 A: dose initiale de 5 mg/kg de poids corporel  
— Annexe 1 B: dose initiale de 50 mg/kg de poids corporel  
— Annexe 1 C: dose initiale de 300 mg/kg de poids corporel  
— Annexe 1 D: dose initiale de 2 000 mg/kg de poids corporel  
En fonction du nombre d'animaux trouvés morts ou euthanasiés, la marche à 
suivre est indiquée par les flèches.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 207
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 ▼B 
ANNEXE 1 A  
MODE OPÉRATOIRE POUR UNE DOSE INITIALE DE 5 MG/KG DE POIDS CORPOREL

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 ▼B 
ANNEXE 1 B  
MODE OPÉRATOIRE POUR UNE DOSE INITIALE DE 50 MG/KG DE POIDS CORPOREL

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 ▼B 
ANNEXE 1 C  
MODE OPÉRATOIRE POUR UNE DOSE INITIALE DE 300 MG/KG DE POIDS CORPOREL

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 ▼B 
ANNEXE 1 D  
MODE OPÉRATOIRE POUR UNE DOSE INITIALE DE 2 000 MG/KG DE POIDS CORPOREL

ANNEXE 2  
CRITÈRES POUR LA CLASSIFICATION DE SUBSTANCES D'ESSAI 
DONT ON PRÉSUME QUE LA DL  50 EST SUPÉRIEURE À 2 000 
MG/KG, SANS RECOURIR À L'ESSAI  
Les critères pour la catégorie de danger 5 sont destinés à permettre l'identification 
de substances qui ont une toxicité aiguë relativement faible mais qui, dans 
certaines conditions, peuvent se révéler dangereuses pour des populations vulné ­
rables. Ces substances sont présumées avoir une DL  50 orale ou cutanée comprise 
dans la plage 2 000 - 5 000 mg/kg ou correspondant à des doses équivalentes par 
d'autres voies. Les substances d'essai devraient être classées dans la catégorie 
SGH de danger 5, définie par 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg, dans les cas 
suivants:  
a) lorsque, en fonction de la mortalité, l'un des schémas des annexes 1A à 1 D 
oriente la substance vers cette catégorie;  
b) lorsque l'on est déjà en possession de données fiables indiquant que la DL  50 
se situera dans la plage des valeurs de la catégorie 5; ou lorsque d'autres 
études sur des animaux ou l'observation d'effets toxiques chez l'homme suscitent de sérieuses inquiétudes pour la santé humaine;
 
c) par extrapolation, évaluation ou mesure de données, lorsque la classification 
dans une catégorie de plus grand danger n'est pas justifiée, et  
— il existe des informations fiables faisant état d'effets toxiques significatifs 
chez l'homme, ou  
— une certaine mortalité est observée en testant par voie orale jusqu'aux 
valeurs de la catégorie 4, ou  
— lorsqu'un jugement d'expert confirme l'existence de signes cliniques signi ­
ficatifs de toxicité lors d'un essai mené jusqu'aux valeurs de la catégorie 4, 
hormis diarrhée, hérissement des poils ou aspect mal soigné, ou  
— quand un jugement d'expert confirme l'existence d'informations fiables 
indiquant la possibilité d'effets aigus significatifs d'après les résultats des autres études sur animaux.
 
ESSAIS À DOSES SUPÉRIEURES À 2 000 MG/KG  
Par souci de protection des animaux, l'essai de substances à la dose de 5 000 
mg/kg est déconseillé et ne devrait être envisagé que lorsqu'il est fort probable 
que les résultats d'un tel essai présenteront un intérêt direct pour la protection de 
la santé des hommes et des animaux (10). Aucun essai ne doit être effectué à des doses plus élevées.
 
Lorsqu'un essai à 5 000 mg/kg est nécessaire, une seule étape suffit (c'est-à-dire 
trois animaux). Si le premier animal traité meurt, l'essai se poursuit à la dose de 
2 000 mg/kg comme indiqué dans les schémas de l'annexe 1. Si le premier 
animal traité survit, deux autres animaux sont traités. Si un seul des trois animaux meurt, la DL
 50 est présumée supérieure à 5 000 mg/kg. Si les deux 
animaux meurent, l'essai se poursuit à la dose de 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 212
 
ANNEXE 3  
MÉTHODE D'ESSAI B.1 tris Conseils pour une classification selon le système de l'UE en 
attendant la mise en place effective du système général harmonisé de classification (SGH) [voir 
référence (8)]
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B.2. TOXICITÉ AIGUË PAR INHALATION  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 403 (2009) 
de l’OCDE (1) pour les essais de produits chimiques. Une première ligne directrice 403 pour les essais de toxicité aiguë par inhalation a été adoptée 
en 1981. La présente méthode d’essai B.2 (équivalente à la ligne directrice 
403 révisée a été conçue afin d’offrir une plus grande souplesse, de réduire l’utilisation d’animaux et de répondre aux exigences règlementaires. Elle décrit deux types d’études: un protocole traditionnel de détermination de 
la CL
 50 et un protocole «concentration × temps» (C × t). Les principales 
caractéristiques de cette ligne directrice tiennent au fait qu’elle permet d’ob ­
tenir une relation concentration-réponse pour les effets non létaux à létaux, afin d’en déduire une concentration létale médiane (CL
 50 ), une concentration 
seuil non létale (comme la CL  01 ) et une pente, ainsi que de déterminer si un 
des sexes est plus sensible à la substance d’essai. Le protocole C × t est utilisé lorsque s’applique une réglementation particulière ou pour un besoin scientifique qui nécessite un essai sur des animaux pour plusieurs durées 
d’exposition différentes, par exemple à des fins d’aménagement du territoire 
ou de planification des interventions d’urgence: calcul des niveaux guides d’exposition aiguë, recommandations pour la planification des mesures d’ur ­
gence, niveaux seuil d’exposition aiguë, etc.
 
2. On trouvera dans le document d’orientation n  o 39 sur les essais de toxicité 
aiguë par inhalation (document d’orientation 39) des indications sur la 
conduite et l’interprétation des études liées à la présente méthode d’essai (2).  
3. Le document d’orientation 39 (2) regroupe les définitions utilisées dans le 
contexte de la présente méthode d’essai.  
4. La présente méthode d’essai permet de caractériser les substances d’essai, de 
les soumettre à une évaluation quantitative des risques, et de classer confor ­
mément au règlement (CE) n  o 1272/2008 (3). Le document d’orientation 39 
(2) fournit des indications sur le choix de la méthode d’essai appropriée 
pour les essais de toxicité aiguë. Lorsque seules sont requises des informa ­
tions sur la classification et l’étiquetage, le chapitre B.52 de la présente 
annexe (4) est généralement recommandé [voir document d’orientation 39 
(2)]. La méthode d’essai B.2 n’est pas spécifiquement destinée à tester des matériaux spéciaux comme les substances isométriques ou fibreuses faible ­
ment solubles ou les nanomatériaux manufacturés.
 
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
5. Avant d’entreprendre un essai conformément à la présente méthode d’essai, 
le laboratoire d’essai devra prendre en compte toutes les informations disponibles sur la substance d’essai, y compris les études existantes [par 
exemple, le chapitre B.52 de la présente annexe (4)] dont les résultats 
éviteraient des essais supplémentaires, afin de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les informations utiles pour la détermination de l’es ­
pèce, de la souche, du sexe, du mode d’exposition et des concentrations 
d’essai appropriés, citons: l’identité, la structure chimique et les propriétés 
physico-chimiques de la substance d’essai, les résultats de tous les essais de toxicité in vitro ou in vivo auxquels elle a été soumise, son (ses) utilisa ­
tion(s) escomptée(s) et les risques d’exposition humaine, les 
données (Q)SAR disponibles et les données toxicologiques sur les subs ­
tances structurellement apparentées, voir document d’orientation 39 (2).
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6. Il convient d’éviter autant que possible de tester des substances corrosives 
et/ou irritantes à des concentrations susceptibles d’engendrer une souffrance 
sévère et/ou une détresse. Pour déterminer s’il est possible de renoncer à des essais complémentaires, le potentiel de corrosion/d’irritation fait l’objet d’une évaluation reposant sur un jugement d’expert basé sur les éléments 
suivants: données expérimentales sur l’homme et l’animal (provenant, par 
exemple, d’essais à doses répétées réalisés à des concentrations non corro ­
sives ou irritantes), données in vitro existantes [par exemple chapitres B.40 (5), B.40  bis (6) de la présente annexe, ou ligne directrice 435 de l’OCDE 
(7)], valeurs du pH, informations concernant des substances analogues ou 
toute autre donnée pertinente. À des fins règlementaires spécifiques (par exemple pour l’établissement de plans d’urgence), la présente méthode d’essai peut être utilisée pour exposer des animaux à ces substances car 
elle donne au directeur de l’étude ou à l’investigateur principal la maîtrise 
du choix des concentrations cibles. Celles-ci ne doivent cependant pas induire d’effets corrosifs/irritants importants, mais elles sont suffisantes pour prolonger la courbe de concentration-réponse jusqu’à des niveaux 
correspondant à l’objectif scientifique et règlementaire de l’essai. Ces 
concentrations sont choisies au cas par cas et une justification du choix des concentrations est apportée, voir document d’orientation 39 (2).
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
7. La présente méthode d’essai B.2 révisée doit en principe permettre d’obtenir 
des informations suffisantes sur la toxicité aiguë d’une substance d’essai 
pour procéder à son classement, et fournir les données sur sa létalité néces ­
saires aux évaluations quantitatives des risques (CL  50 , CL  01 et pente, par 
exemple) pour l’un des sexes ou les deux. Cette méthode d’essai propose 
deux méthodes. La première suit un protocole traditionnel dans lequel des 
groupes d’animaux sont exposés à une concentration limite (essai limite) ou à une série de concentrations suivant un processus séquentiel pendant une durée prédéterminée de quatre heures en général. Des objectifs règlemen ­
taires spécifiques peuvent nécessiter de recourir à d’autres durées d’exposi ­
tion. La seconde méthode suit un protocole «concentration x temps» (C × t) dans lequel des groupes d’animaux sont exposés à une concentration (concentration limite) ou à une série de concentrations différentes sur des 
durées différentes.
 
8. Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou 
de détresse sévère et persistante sont euthanasiés. Ils sont pris en compte 
dans l’interprétation des résultats de l’essai au même titre que ceux qui succombent au cours de l’essai. Le document d’orientation n
 o 19 de 
l’OCDE sur les effets mesurés éthiquement acceptables détaille les critères 
orientant la décision d’euthanasier les animaux moribonds ou en grande 
souffrance, et aide à reconnaître une mort prévisible ou imminente (8).  
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Choix des espèces animales  
9. Le choix s’orientera vers de jeunes rongeurs en bonne santé, de souches 
communément utilisées en laboratoire. Le rat étant l’espèce la plus utilisée, il faudra justifier l’emploi d’autres espèces.
 
Préparation des animaux  
10. Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de leur exposition, les 
animaux sélectionnés sont de jeunes adultes âgés de 8 à 12 semaines. Leur poids corporel n’excède pas, pour chaque sexe, ± 20 % du poids moyen des animaux du même âge précédemment exposés. Sélectionnés au hasard, les 
animaux sont marqués pour être identifiés individuellement. En vue de leur 
acclimatation aux conditions de laboratoire, ils sont conservés dans leur cage pour une période d’au minimum 5 jours avant le début de l’essai. Les animaux sont également acclimatés aux appareils d’essai, pendant une 
courte période précédant l’essai, afin d’atténuer le stress causé par leur 
introduction dans un nouvel environnement.
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Conditions d’élevage des animaux  
11. La température du local expérimental où les animaux sont conservés est de 
22 ± 3 °C. Le taux d’humidité relative est idéalement maintenu entre 30 et 70 %, encore qu’il ne soit pas toujours possible de le faire si l’eau est 
utilisée comme véhicule. Avant et après exposition, les animaux sont géné ­
ralement mis en cage en groupes par sexe et par concentration, mais le nombre d’animaux par cage ne doit pas faire obstacle à une observation précise de chaque animal, et ne doit engendrer qu’un minimum de pertes 
dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposés «nez 
seul», il peut être nécessaire de les acclimater aux tubes de contention. Ceux-ci ne doivent pas provoquer chez les animaux de stress excessif, 
qu’il soit de nature physique, thermique ou dû à leur immobilisation. Les 
contraintes qu’ils subissent peuvent en effet modifier les paramètres physio ­
logiques mesurés de l’animal, comme sa température corporelle (hyperther ­
mie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si l’on dispose de données 
génériques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de 
façon appréciable, alors la période d’adaptation préalable aux tubes de contention n’est pas nécessaire. Les animaux exposés «corps entier» à un aérosol sont enfermés individuellement pendant l’exposition pour empêcher 
la filtration de l’aérosol d’essai par la fourrure des congénères. À l’exception 
des périodes d’exposition, le régime alimentaire des animaux est le régime classique et certifié de laboratoire, avec eau potable à satiété. L’éclairage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures 
d’obscurité.
 
Chambre d’inhalation  
12. Le choix de la chambre d’inhalation prend en compte la nature de la subs ­
tance d’essai et l’objet de l’essai. Le mode d’exposition «nez seul» (qui inclut les dispositifs «tête seule», «nez seul» et «museau seul») est privilé ­
gié. Le mode d’exposition «nez seul» est généralement choisi pour les 
études d’aérosols liquides ou solides et pour les vapeurs susceptibles de se condenser en aérosols. L’utilisation d’un mode d’exposition «corps entier» peut être préférable pour les besoins spécifiques de l’étude, mais 
cela est alors justifié dans le rapport d’étude. Pour assurer la stabilité de 
l’atmosphère d’une chambre d’exposition «corps entier», on veille à ce que le volume total des animaux d’expérience ne dépasse pas 5 % du volume de la chambre. Le document d’orientation 39 (2) décrit les principes des tech ­
niques d’exposition «corps entier» ou «nez seul», ainsi que leurs avantages 
et inconvénients spécifiques.
 
CONDITIONS D’EXPOSITION  
Administration des concentrations  
13. Les expositions «nez seul» peuvent durer jusqu’à 6 heures pour les rats. 
Pour les souris, les expositions «nez seul» ne dépassent pas 4 heures en général. Si des essais d’une durée plus longue sont nécessaires, une justifi ­
cation est apportée, voir document d’orientation 39 (2). Les animaux 
exposés «corps entier» à des aérosols demeurent seuls dans la chambre 
afin d’éviter l’ingestion de la substance d’essai par le toilettage de leurs compagnons. Les animaux sont privés de nourriture pendant la période d’exposition. Dans une exposition «corps entier», les animaux peuvent 
boire de l’eau.
 
14. Les animaux sont exposés à la substance d’essai présentée sous forme de 
gaz, de vapeur, d’aérosol ou sous une forme mixte. L’état physique à tester 
dépend des propriétés physico-chimiques de la substance, de la concentra ­
tion choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable qu’elle se présente lors de sa manipulation et de son utilisation. Les subs ­
tances d’essai chimiquement réactives ou hygroscopiques sont testées sous 
air sec. On prendra soin d’éviter les concentrations susceptibles de provo ­
quer une explosion.
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Répartition granulométrique  
15. Une mesure de la taille des particules est réalisée pour tous les aérosols et 
les vapeurs susceptibles de se condenser pour former des aérosols. Pour que toutes les régions pertinentes de l’appareil respiratoire soient exposées, il est 
recommandé d’utiliser des aérosols dont le diamètre aérodynamique médian 
de masse (DAMM) se situe entre 1 et 4 μm, avec un écart type géométrique 
(σg) compris entre 1,5 et 3,0 (2) (9) (10). Un effort raisonnable est fourni 
pour remplir ces conditions, mais si tel n’est pas le cas, un jugement d’ex ­
pert est nécessaire. Par exemple, les particules des fumées métalliques 
peuvent avoir une taille inférieure à cette norme, tandis que les particules chargées, les fibres et les substances hygroscopiques (dont la taille augmente 
dans l’environnement humide de l’appareil respiratoire) peuvent avoir une 
taille supérieure.
 
Préparation de la substance d’essai dans un véhicule  
16. Pour atteindre la concentration et la taille granulométrique appropriées de la 
substance d’essai, il est possible d’avoir recours à un véhicule; en règle 
générale, l’eau est choisie de préférence. Les substances particulaires peuvent être soumises à des procédés mécaniques afin d’atteindre la répar ­
tition granulométrique requise, mais un soin particulier devra être pris de ne 
pas décomposer ou altérer la substance d’essai. Lorsque les procédés méca ­
niques sont suspectés d’avoir altéré la composition de la substance d’essai (température extrême due aux frictions d’un broyage excessif, par exemple), 
la composition de la substance d’essai devra être vérifiée analytiquement. 
On prendra soin de ne pas contaminer la substance d’essai. Il n’est pas nécessaire de tester les substances granulaires non friables qui sont élaborées précisément pour ne pas être inhalables. Un test d’usure de surface est 
réalisé pour démontrer que la manipulation de la substance granulaire ne 
produit pas de particules respirables. Dans le cas contraire, un essai de toxicité par inhalation est réalisé.
 
Animaux témoins  
17. Un groupe témoin négatif (air) n’est pas nécessaire. Lorsqu’un véhicule 
autre que l’eau est utilisé pour produire l’atmosphère d’essai, un groupe témoin du véhicule est utilisé seulement quand on ne dispose pas de 
données historiques sur la toxicité. Si aucune toxicité n’a été détectée lors 
de l’étude d’une substance d’essai préparée dans un véhicule, ce dernier est considéré comme non toxique à la concentration testée; il n’y a donc pas lieu d’utiliser de témoin du véhicule.
 
CONTRÔLE DES CONDITIONS D’EXPOSITION  
Débit d’air dans la chambre d’exposition  
18. Le débit d’air dans la chambre est contrôlé avec soin, surveillé en continu et 
enregistré au moins toutes les heures pendant chaque exposition. Le suivi de la concentration de l’atmosphère d’essai (ou stabilité temporelle) constitue une mesure complète de tous les paramètres dynamiques et fournit un 
moyen indirect de contrôler tous les paramètres dynamiques pertinents de 
production de l’atmosphère d’essai. On prendra particulièrement soin d’éviter toute re-respiration dans les chambres d’exposition «nez seul» lorsque le débit d’air à travers le système d’exposition ne permet pas de 
produire une circulation dynamique de l’atmosphère contenant la substance 
d’essai. Des méthodologies sont prévues pour démontrer l’absence de re-respiration dans les conditions expérimentales choisies (2) (11). La concentration d’oxygène est d’au moins 19 % et celle de dioxyde de 
carbone ne dépasse pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent être respectées, 
les concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone sont mesurées.
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Température et humidité relative de la chambre d’exposition  
19. La température de la chambre d’exposition est maintenue à 22 ± 3 °C. Dans 
les cas d’exposition «nez seul» et «corps entier» l’humidité relative dans la zone où respire l’animal est surveillée et enregistrée trois fois au minimum 
pour les durées allant jusqu’à 4 heures, et toutes les heures pour des durées 
plus courtes. L’humidité relative est de préférence comprise entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse être atteint (par exemple lorsque la substance d’essai se présente sous forme de solution aqueuse), 
ou qu’il ne puisse être mesuré en raison d’interférences de la substance 
d’essai avec la méthode d’essai.
 
Substance d’essai: concentration nominale  
20. Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre 
d’exposition est calculée et enregistrée. La concentration nominale est la 
masse de la substance d’essai divisée par le volume d’air total qui passe dans le circuit de la chambre d’inhalation. La concentration nominale ne sert pas à caractériser l’exposition des animaux, mais une comparaison de la 
concentration nominale avec la concentration réelle donne une indication 
de la capacité de production du système d’essai, et peut donc permettre de mettre en évidence des problèmes de production.
 
Substance d’essai: concentration réelle  
21. La concentration réelle est la concentration de la substance d’essai dans la 
zone de la chambre d’inhalation où les animaux respirent. Les concentra ­
tions réelles peuvent être obtenues par des méthodes spécifiques (par exem ­
ple, échantillonnage direct, méthodes d’adsorption ou de réaction chimique, 
et caractérisation analytique ultérieure) ou par des méthodes non spécifiques 
comme la gravimétrie sur filtre. Le recours à l’analyse gravimétrique n’est acceptable que pour des aérosols ne contenant qu’un seul composant en poudre ou pour des aérosols de liquides peu volatils, et des caractérisations 
spécifiques à la substance d’essai sont également effectuées par une préétude 
appropriée. Il est aussi possible d’avoir recours à la gravimétrie pour déter ­
miner la concentration d’un aérosol contenant plusieurs composants en poudre, mais des données analytiques sont alors nécessaires, afin de démon ­
trer que la composition du produit en suspension dans l’air est analogue à 
celle du produit de départ. Faute de cette information, il peut s’avérer nécessaire de soumettre la substance d’essai (idéalement en suspension dans l’air) à une nouvelle analyse à intervalles réguliers tout au long de 
l’étude. Pour des agents aérosolisés susceptibles de s’évaporer ou de se 
sublimer, il faut démontrer que toutes les phases ont été recueillies selon la méthode choisie. Les concentrations cibles, nominales et réelles sont fournies dans le rapport d’étude, mais seules les concentrations réelles 
sont utilisées dans les analyses statistiques pour calculer la valeur des 
concentrations létales.
 
22. Un seul lot de la substance d’essai est utilisé, si possible, et l’échantillon est 
conservé dans des conditions préservant sa pureté, son homogénéité et sa stabilité. Avant le début de l’étude, il convient de réaliser une caractérisation de la substance d’essai afin de déterminer sa pureté et, si cela est techni ­
quement possible, son identité et les quantités de contaminants et d’impu ­
retés identifiés. Pour cela, on pourra recueillir les données suivantes: temps de rétention et surface relative du pic, poids moléculaire obtenu par spec ­
troscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres estima ­
tions. Bien que le laboratoire d’essai ne soit pas responsable de l’identifi ­
cation de la substance d’essai, il peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractéristiques fournies par le donneur d’ordre (couleur, nature physique, etc.).
 
23. L’atmosphère d’exposition est maintenue aussi constante que possible et 
suivie soit en continu, soit de façon intermittente suivant la méthode d’ana ­
lyse. Lorsque l’injection s’effectue de façon intermittente, les échantillons 
d’atmosphère de la chambre sont prélevés au moins deux fois sur une étude 
de quatre heures. En cas d’impossibilité en raison de débits d’air limités ou de faibles concentrations, le recueil d’un échantillon pour toute la période d’exposition est acceptable. Si des fluctuations nettes apparaissent d’un 
échantillon à un autre, on a recours à quatre échantillons par exposition 
pour les concentrations d’essai suivantes. Les écarts entre la concentration
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dans chaque chambre et la concentration moyenne n’excèdent pas ± 10 % 
pour les gaz et vapeurs ou ± 20 % pour les aérosols liquides ou solides. Il 
convient de calculer et de noter le temps d’équilibre dans la chambre d’ex ­
position (t  95 ). La durée d’une exposition couvre le temps de production de la 
substance d’essai, y compris le temps nécessaire pour l’égalisation des 
concentrations dans la chambre d’exposition t  95 . Des indications pour l’es ­
timation de t  95 sont fournies dans le document d’orientation 39 (2).  
24. Pour des systèmes très complexes constitués de gaz ou vapeurs et d’aérosols 
(atmosphères de combustion ou substances d’essai propulsées à partir de 
produits/dispositifs spécialisés, par exemple), chaque phase peut se 
comporter différemment dans la chambre d’inhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et aérosol), on choisit donc au moins une substance indicatrice (analyte), en général la substance active principale dans le 
mélange. Quand la substance d’essai est un mélange, la concentration analy ­
tique devra être indiquée pour le mélange et pas uniquement pour la subs ­
tance active ou le composant (analyte). Pour plus d’informations sur les concentrations réelles, se reporter au document d’orientation 39 (2).
 
Substance d’essai: répartition granulométrique  
25. La répartition granulométrique des aérosols est déterminée au minimum 
deux fois pour chaque exposition de 4 heures à l’aide d’un impacteur en 
cascade ou d’un autre instrument, comme un spectromètre de mesure de la taille des particules aérodynamiques. Si les résultats obtenus avec l’impac ­
teur en cascade et l’autre instrument se révèlent équivalents, ce dernier peut 
être utilisé tout au long de l’étude. Pour confirmer la capacité de recueil des 
particules de l’outil principal, un second instrument devra être utilisé en parallèle, par exemple un filtre gravimétrique ou un barboteur à gaz/impac ­
teur. La concentration massique obtenue par l’analyse granulométrique se 
rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par l’analyse sur 
filtre, voir document d’orientation 39 (2). Si cette équivalence est établie au début de la phase d’étude, il n’est pas nécessaire d’effectuer des mesures de confirmation dans la suite de l’étude. Pour le bien-être des animaux, il 
convient de réduire au minimum les données douteuses qui nécessiteraient 
de répéter une exposition. Une répartition granulométrique est effectuée dans le cas des vapeurs, s’il est possible qu’une condensation de la vapeur conduise à la formation d’un aérosol, ou si des particules sont détectées 
dans une atmosphère de vapeur susceptible de présenter des phases mixtes 
(voir paragraphe 15).
 
MODE OPÉRATOIRE  
26. Les deux types d’études décrits ci-dessous sont le protocole traditionnel et le 
protocole C × t. Tous deux peuvent comprendre une étude préliminaire, une étude principale et/ou un essai limite (protocole traditionnel) ou un essai à 
une concentration limite (C × t). Si l’un des sexes est connu pour être plus 
sensible à la substance d’essai, le directeur de l’étude peut choisir de réaliser ces essais avec seulement des animaux de ce sexe. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées «nez seul», il est possible d’ajuster 
la durée maximale d’exposition en fonction du stress propre à ces espèces. 
Avant le début de l’étude, toutes les données disponibles sont examinées afin de réduire l’usage des animaux. Par exemple, les données obtenues selon le chapitre B.52 de la présente annexe (4) peuvent supprimer la néces ­
sité d’une étude préliminaire et aussi démontrer si l’un des sexes est plus 
sensible à la substance d’essai, voir document d’orientation 39 (2).
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PROTOCOLE TRADITIONNEL  
Considérations générales sur le protocole traditionnel  
27. Dans une étude traditionnelle, des groupes d’animaux sont exposés à une 
substance d’essai pendant une période de temps fixée (généralement 4 heures) dans une chambre d’exposition «nez seul» ou «corps entier». Les animaux sont exposés soit à une concentration limite (essai limite), soit à 
trois concentrations au minimum selon une procédure séquentielle (étude 
principale). Une étude préliminaire peut précéder l’étude principale, sauf s’il existe déjà des informations concernant la substance d’essai, provenant par exemple d’une étude précédente effectuée selon l’étude B.52, voir docu ­
ment d’orientation 39 (2).
 
Étude préliminaire pour le protocole traditionnel  
28. Une étude préliminaire permet d’estimer l’activité de la substance d’essai, 
d’identifier des différences entre les sexes quant à la sensibilité à cette 
substance, et de choisir plus facilement les niveaux de concentration pour 
l’étude principale ou l’essai limite. Lors du choix des niveaux de concen ­
tration pour l’étude préliminaire, toutes les informations disponibles sont prises en compte, y compris les données (Q)SAR et les données corres ­
pondant à des produits chimiques analogues. Pour chaque concentration, on 
exposera au maximum trois mâles et trois femelles (il peut être nécessaire d’utiliser 3 animaux par sexe pour établir une différence de sensibilité entre les sexes). Une étude préliminaire peut être effectuée avec une seule concen ­
tration, ou plusieurs si nécessaire. Elle ne porte pas sur un nombre d’ani ­
maux ou de concentrations tel qu’elle ressemblerait à une étude principale. Il est possible d’utiliser les résultats d’une étude B.52 (4) précédente au lieu de réaliser une étude préliminaire, voir document d’orientation 39 (2).
 
Essai limite pour le protocole traditionnel  
29. L’essai limite est utilisé si l’on sait ou si l’on prévoit que la substance 
d’essai sera virtuellement non toxique, c'est-à-dire qu’elle ne suscitera une réponse de toxicité qu’au-delà de la concentration limite réglementaire. Dans un essai limite, un seul groupe de trois mâles et trois femelles est exposé à 
la substance d’essai à une concentration limite. Des informations sur la 
toxicité de la substance d’essai peuvent être tirées d’essais déjà pratiqués sur des substances analogues, en tenant compte de l’identité et du pourcen ­
tage des composants dont la toxicité est avérée. Si l’on manque d’informa ­
tions sur la toxicité de la substance d’essai, ou si l’on s’attend à ce qu’elle 
soit toxique, l’essai principal est réalisé.
 
30. Le choix des concentrations limites dépend généralement des exigences 
règlementaires. Lorsqu’on applique le règlement (CE) n  o 1272/2008, les 
concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les aérosols sont respec ­
tivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l (ou, à défaut, la concentration 
maximale pouvant être atteinte) (3). Il peut s’avérer techniquement difficile 
d’atteindre les concentrations limites de certaines substances d’essai, en particulier pour les vapeurs et les aérosols. Pour les essais d’aérosols, le principal objectif est d’atteindre une taille de particule qui soit respirable 
(c’est-à-dire d’un DAMM de 1 à 4 μm), ce qui est possible avec la plupart 
des substances d’essai à des concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des aérosols à des concentrations supérieures à 2 mg/l ne sont tentés que si l’on peut obtenir des particules de taille respirable, voir document d’orientation 
39 (2). Selon le règlement (CE) n
 o 1272/2008, il est déconseillé de réaliser 
des essais au-delà des concentrations limites pour des raisons de bien-être des animaux (3). Les essais aux concentrations limites ne sont envisagés que s’il est très probable que leurs résultats présenteront un intérêt direct pour la 
protection de la santé humaine (3), et une justification est fournie dans le 
rapport d’étude. En cas de substance potentiellement explosive, on prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin d’éviter le recours inutile à des animaux, un essai sans animaux est effectué 
avant l’essai limite pour s’assurer qu’il est possible d’atteindre dans la 
chambre les conditions expérimentales d’un essai limite.
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31. Si une mortalité ou un état moribond sont observés à la concentration limite, 
les résultats de l’essai limite peuvent servir d’étude préliminaire pour les 
essais suivants à d’autres concentrations (voir étude principale). Si la concentration limite est impossible à atteindre du fait des propriétés physiques ou chimiques de la substance d’essai, c’est la concentration maxi ­
male pouvant être atteinte qui devra être testée. Si la létalité à cette concen ­
tration est inférieure à 50 %, il n’y a pas lieu de poursuivre l’essai. Si la concentration limite n’a pas pu être atteinte, une explication, étayée par des données, est fournie dans le rapport d’étude. Si la concentration maximale 
pouvant être atteinte pour une vapeur ne provoque pas de toxicité, il peut 
être nécessaire de produire la substance d’essai sous la forme d’un aérosol liquide.
 
Étude principale pour le protocole traditionnel  
32. Une étude principale fait en général appel à cinq mâles et cinq femelles (ou 
cinq animaux du sexe le plus sensible, s’il est connu) par niveau de concen ­
tration, avec au minimum trois niveaux de concentration. Les niveaux de 
concentration sont suffisamment nombreux pour que l’on puisse obtenir une analyse statistique fiable. L’intervalle de temps entre l’exposition des diffé ­
rents groupes est déterminé par le moment d’apparition, la durée et la 
gravité des signes de toxicité observés. L’exposition au niveau de concen ­
tration supérieur est retardée jusqu’à ce que l’on soit raisonnablement sûr que les animaux précédemment soumis au traitement ont survécu. Le direc ­
teur de l’étude peut alors ajuster la concentration cible pour le groupe 
suivant. Pour les essais de toxicité par inhalation, qui nécessitent des tech ­
nologies sophistiquées, il ne sera pas toujours possible de procéder ainsi, c’est pourquoi l’exposition des animaux à la concentration supérieure devra 
se baser sur l’expérience acquise et un jugement scientifique. Pour les essais 
portant sur des mélanges, il convient de se référer au document d’orientation 39 (2).
 
PROTOCOLE «CONCENTRATION × TEMPS» (C × T)  
Considérations générales sur le protocole C × t  
33. Une étude séquentielle «concentration × temps» (C × t) peut constituer une 
alternative au protocole traditionnel lorsqu’il s’agit d’évaluer la toxicité par inhalation (12) (13) (14). Avec cette approche, les animaux sont exposés à 
la substance d’essai à plusieurs niveaux de concentration et pour des durées 
d’exposition variables. Tous les essais sont réalisés dans des chambres d’exposition «nez seul», les chambres «corps entier» ne se prêtant pas à ce protocole. Un exemple de procédure séquentielle illustrant ce protocole 
est présenté à l’appendice 1. Une analyse de simulation a montré que le 
protocole traditionnel et le protocole C × t étaient tous les deux capables de donner des valeurs fiables de la CL
 50 , mais que le protocole C × t permettait 
en général d’obtenir des valeurs plus sûres pour la CL  01 et la CL  10 (15).  
34. Une analyse de simulation a démontré qu’il convient généralement d’utiliser 
deux animaux par intervalle de C × t (un animal de chaque sexe ou deux animaux du sexe le plus sensible) pour tester 4 concentrations et 5 durées 
d’exposition lors de l’étude principale. Le directeur de l’étude peut choisir, 
dans certaines circonstances, d’utiliser deux rats de chaque sexe par inter ­
valle de C × t (15), de manière à réduire le biais et la variabilité des estimations, augmenter le taux de succès de l’estimation et améliorer la 
couverture de l’intervalle de confiance. Cependant, en cas d’ajustement 
insuffisant aux données (en utilisant un animal par sexe ou deux animaux du sexe le plus sensible), une cinquième concentration d’exposition peut également suffire. Pour plus d’informations sur le nombre d’animaux et 
les concentrations à utiliser pour une étude C × t, se reporter au document 
d’orientation 39 (2).
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Étude préliminaire pour le protocole C × t  
35. Une étude préliminaire permet d’estimer l’activité de la substance d’essai et 
facilite le choix des niveaux de concentration pour l’étude principale. Une étude préliminaire avec au maximum trois animaux par sexe et par concen ­
tration (pour plus de détails, voir l’appendice III du document d’orientation 
39) (2) peut être utilisée afin de sélectionner une concentration de départ appropriée pour l’étude principale et de réduire le nombre d’animaux utili ­
sés. Il peut en effet être nécessaire de recourir à trois animaux par sexe pour 
établir une différence selon le sexe. Ces animaux sont soumis à une expo ­
sition unique, d’une durée de 240 minutes en général. Pour évaluer la faisabilité de la production d’atmosphères d’essai appropriées, des essais 
techniques préliminaires sans animaux sont réalisés. Il n’est généralement 
pas nécessaire de procéder à une étude préliminaire si l’on dispose de données de mortalité provenant d’une étude effectuée suivant la méthode B.52 (4). Pour choisir la concentration cible initiale dans une étude B.2, le 
directeur de l’étude tient compte des profils de mortalité observés dans 
n’importe quelle étude B.52 (4) disponible, pour les deux sexes et pour toutes les concentrations testées, voir document d’orientation 39 (2).
 
Concentration initiale pour le protocole C × t  
36. La concentration initiale (Session d’exposition I) (voir appendice 1) est soit 
une concentration limite, soit une concentration choisie par le directeur de l’étude sur la base d’une étude préliminaire. Des groupes constitués d’un 
animal de chaque sexe sont exposés à cette concentration pendant des 
périodes de durée variable (15, 30, 60, 120 ou 240 minutes, par exemple), soit un total de 10 animaux, pour ce qu’on appelle la Session d’exposition I (voir appendice 1).
 
37. Le choix des concentrations limites dépend généralement des exigences 
règlementaires. Lorsqu’on applique le règlement (CE) n  o 1272/2008, les 
concentrations limites pour les gaz, les vapeurs et les aérosols sont respec ­
tivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l (ou, à défaut, la concentration maximale pouvant être atteinte) (3). Il peut s’avérer techniquement difficile 
d’atteindre les concentrations limites de certaines substances d’essai, en 
particulier pour les vapeurs et les aérosols. Pour les essais d’aérosols, l’ob ­
jectif est d’atteindre une taille de particule qui soit respirable (c’est-à- dire 
un DAMM de 1 à 4 μm), ce qui est possible avec la plupart des substances 
d’essai à des concentrations de 2 mg/l. Les essais sur des aérosols à des concentrations supérieures à 2 mg/l ne sont tentés que si l’on peut obtenir des particules de taille respirable, voir document d’orientation 39 (2). Selon 
le règlement (CE) n
 o 1272/2008, il est déconseillé de réaliser des essais 
au-delà des concentrations limites pour des raisons de bien-être des animaux (3). Les essais au-delà de la concentration limite ne sont envisagés que s’il est très probable que leurs résultats présenteront un intérêt direct 
pour la protection de la santé humaine (3), et une justification est alors 
fournie dans le rapport d’étude. En cas de substance potentiellement explo ­
sive, on prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin d’éviter le recours inutile à des animaux, un essai sans 
animaux est effectué avant l’essai à la concentration initiale pour s’assurer 
qu’il est possible d’atteindre dans la chambre les conditions expérimentales d’un essai à cette concentration.
 
38. Si une mortalité ou un état moribond sont observés à la concentration 
initiale, les résultats obtenus à cette concentration peuvent servir de 
point de départ pour les essais suivants à d’autres concentrations (voir 
étude principale). Si la concentration limite est impossible à atteindre du fait des propriétés physiques ou chimiques de la substance d’essai, c’est la concentration maximale pouvant être atteinte qui est testée. Si la létalité à 
cette concentration est inférieure à 50 %, il n’y a pas lieu de poursuivre 
l’essai. Si la concentration limite n’a pas pu être atteinte, une explication, étayée par des données, est fournie dans le rapport d’étude. Si la concen ­
tration maximale pouvant être atteinte pour une vapeur ne provoque pas de 
toxicité, il peut être nécessaire de produire la substance d’essai sous la forme 
d’un aérosol liquide.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 225
 
Étude principale pour le protocole C × t  
39. La concentration initiale (session d’exposition I) (voir appendice 1) testée 
dans l’étude principale est soit une concentration limite, soit une concen ­
tration choisie par le directeur de l’étude sur la base d’une étude prélimi ­
naire. Si une mortalité a été observée pendant ou après la session I, l’ex ­
position minimale (C × t) qui a provoqué la mortalité sert de guide pour déterminer la concentration et les périodes d’exposition pour la session II. Chaque session d’exposition suivante dépendra de la session précédente 
(voir appendice 1).
 
40. Pour de nombreuses substances d’essai, les résultats obtenus à la concen ­
tration initiale, plus ceux obtenus lors de trois sessions d’exposition supplé ­
mentaires sur une échelle de temps plus courte (la durée des périodes 
d’exposition successives suivant une progression géométrique de facteur 
√2), sont suffisants pour établir la relation de mortalité C × t (15). Nonobs ­
tant, il peut être utile de recourir à une cinquième concentration d’exposition [voir appendice 1 et document d’orientation 39 (2)]. Pour le traitement 
mathématique des résultats concernant le protocole C × t, voir appendice 1.
 
OBSERVATIONS  
41. Un examen clinique des animaux est pratiqué régulièrement pendant la 
période d’exposition. Après l’exposition, des examens cliniques sont réalisés au minimum deux fois le jour de l’exposition, ou plus fréquemment suivant la réponse des animaux au traitement, et au minimum une fois par jour par 
la suite pendant une période de 14 jours. La durée de la période d’obser ­
vation n’est pas fixée, mais est déterminée par la nature et le moment d’apparition des signes cliniques, ainsi que par la durée de la période de récupération. Les moments d’apparition et de disparition des signes de 
toxicité sont importants, en particulier quand on constate un certain retard 
dans l’apparition de ces signes. Toutes les observations sont systématique ­
ment enregistrées individuellement pour chaque animal. Les animaux mori ­
bonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou de détresse 
sévère et persistante sont euthanasiés pour des raisons de bien-être animal. 
Lors de l’examen clinique des signes de toxicité, il convient de veiller à ne pas confondre une piètre apparence initiale et des troubles respiratoires 
passagers, imputables à la procédure d’exposition, avec une toxicité de la 
substance d’essai qui impliquerait d’euthanasier les animaux plus tôt. Les principes et critères résumés dans le document d’orientation sur les effets mesurés éthiquement acceptables sont pris en considération, voir document 
d’orientation 19 (7). Quand des animaux sont retrouvés morts ou sont 
euthanasiés, l’heure de la mort est consignée le plus précisément possible.
 
42. Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la 
peau et des poils, des yeux et des muqueuses, mais aussi sur les change ­
ments affectant l’appareil respiratoire, le système circulatoire, les systèmes 
nerveux autonome et central, ainsi que l’activité somatomotrice et le comportement. Toute différentiation entre les effets locaux et systémiques est consignée autant que possible. Les tremblements, les convulsions, la 
salivation, les diarrhées, la léthargie, le sommeil et le coma doivent 
retenir l’attention. La mesure de la température rectale peut aider à mettre en évidence une bradypnée réflexe ou une hypo/hyperthermie liée au trai ­
tement ou au confinement.
 
Poids corporel  
43. Le poids corporel de chacun des animaux est enregistré une fois lors de la 
période d’acclimatation, le jour de l’exposition (jour 0) juste avant celle-ci et 
au moins les jours 1, 3, et 7 (puis de façon hebdomadaire par la suite), ainsi 
qu’au moment de la mort ou de l’euthanasie, s’il est postérieur au jour 1. Le poids corporel est un indicateur critique reconnu de la toxicité, on surveille donc attentivement les animaux, dont le poids reste constamment inférieur 
de 20 %, ou plus à celui précédant l’étude. Les animaux survivants sont 
pesés et euthanasiés à la fin de la période postexposition.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 226
 
Pathologie  
44. Tous les animaux d’expérience, y compris ceux morts au cours de l’essai ou 
euthanasiés et écartés de l’étude pour des raisons de bien-être animal, subis ­
sent une autopsie macroscopique. Lorsqu’un animal est découvert mort et 
que son autopsie n’est pas réalisable immédiatement, l’animal est réfrigéré 
(mais non congelé) à une température suffisamment basse pour minimiser l’autolyse. Les autopsies sont réalisées le plus tôt possible, en général dans un délai d’un à deux jours. Tous les changements macropathologiques sont 
enregistrés pour chaque animal en prêtant particulièrement attention aux 
voies respiratoires.
 
45. D’autres observations, ajoutées a priori à dessein, peuvent être envisagées 
afin d’élargir l’interprétation de l’étude, comme la mesure du poids pulmo ­
naire des rats survivants et/ou la mise en évidence d’une irritation par examen de l’appareil respiratoire au microscope. Peuvent aussi être 
examinés les organes montrant une pathologie macroscopique chez les 
animaux survivant au moins 24 heures, et ceux pour lesquels une réaction au traitement est connue ou attendue. Un examen microscopique de l’inté ­
gralité de l’appareil respiratoire peut fournir des informations utiles pour les 
substances d’essai réactives à l’eau, comme les acides et les substances 
hygroscopiques.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
46. Pour chacun des animaux, le poids corporel et les conclusions de l’autopsie 
sont fournis. Les résultats des observations cliniques sont résumés sous la 
forme de tableaux et indiquer pour chaque groupe d’essai: le nombre d’ani ­
maux utilisés, le nombre d’animaux présentant des signes spécifiques de toxicité, le nombre d’animaux retrouvés morts au cours de l’essai ou eutha ­
nasiés, l’heure de la mort de chacun des animaux, la description et l’évo ­
lution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur réversibilité, et les 
conclusions de l’autopsie.
 
Rapport d’essai  
47. Le rapport d’essai contient, s’il y a lieu, les renseignements suivants:  
Animaux d’expérience et conditions d’élevage:  
— description des conditions d’encagement, y compris: nombre (ou évolu ­
tion du nombre) d’animaux par cage, matériel de litière, température ambiante et taux d’humidité relative, photopériode et identification du 
régime alimentaire,
 
— espèces/souches utilisées et justification éventuelle de l’utilisation d’une 
espèce autre que le rat,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— méthode de randomisation,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau (notamment origine/type 
de régime alimentaire, origine de l’eau),  
— description d’un éventuel conditionnement préalable à l’essai, tel que 
régime alimentaire, quarantaine ou traitement de maladie.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 227
 
Substance d’essai:  
— nature physique, pureté et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (y 
compris isomérisation),  
— données d’identification et numéro CAS (Chemical Abstract Services) 
s’il est connu.  
Véhicule:  
— justification de l’emploi d’un véhicule et justification de son choix (s’il 
ne s’agit pas de l’eau),  
— données historiques ou concordantes démontrant que le véhicule n’inter ­
fère pas avec les résultats de l’étude.  
Chambre d’inhalation:  
— description de la chambre d’inhalation avec ses dimensions et son 
volume,  
— source et description de l’équipement utilisé pour l’exposition des 
animaux et pour la production de l’atmosphère,  
— équipement utilisé pour mesurer la température, l’humidité, la granulo ­
métrie et la concentration réelle,  
— source de l’air, traitement de l’air fourni/évacué et système de climati ­
sation utilisé,  
— méthodes utilisées pour étalonner l’équipement afin d’assurer l’homogé ­
néité de l’atmosphère d’essai,  
— différence de pression (positive ou négative),  
— orifices d’exposition par chambre («nez seul») ou emplacement des 
animaux dans la chambre («corps entier»),  
— homogénéité/stabilité temporelle de l’atmosphère d’essai,  
— situation des capteurs thermiques et hygrométriques et échantillonnage 
de l’atmosphère d’essai dans la chambre d’exposition,  
— débits d’air, débit d’air par orifice d’exposition («nez seul») ou rapport 
du volume de l’animal à la chambre («corps entier»),  
— informations sur l’équipement utilisé, le cas échéant, pour mesurer l’oxy ­
gène et le dioxyde de carbone,  
— temps nécessaire pour atteindre l’équilibre dans la chambre d’exposition 
(t 95 ), 
— nombre de changements de volume par heure,  
— doseurs (s’il y en a).  
Données concernant l’exposition:  
— justification du choix de la concentration cible dans l’étude principale,  
— concentrations nominales (masse totale de la substance d’essai produite 
dans la chambre d’inhalation, divisée par le volume d’air traversant la chambre),
 
— concentrations réelles de la substance d’essai obtenues dans la zone où 
respirent les animaux; pour les mélanges à tester produisant des formes 
physiques hétérogènes (gaz, vapeurs, aérosols), chacun des constituants 
peut être analysé séparément,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 228
 
— toutes les concentrations atmosphériques sont rapportées en unités de 
masse (mg/l, mg/m  3 , etc.); les unités de volume (ppm, ppb, etc.) 
peuvent aussi être indiquées entre parenthèses;  
— répartition granulométrique des particules, diamètre aérodynamique 
médian de masse (DAMM) et écart type géométrique σ(g), ainsi que 
leur méthode de calcul. Les autres analyses de la taille de particules sont 
consignées.  
Conditions expérimentales:  
— détails sur la préparation de la substance d’essai, y compris sur les 
procédures utilisées pour réduire la taille des particules des matériaux solides ou pour préparer les solutions de la substance d’essai. Lorsque des procédés mécaniques sont susceptibles d’avoir altéré la composition 
de la substance d’essai, inclure les résultats des analyses effectuées pour 
vérifier la composition de la substance d’essai,
 
— description (si possible avec schéma) de l’équipement utilisé pour 
produire l’atmosphère d’essai et pour exposer les animaux à celle-ci,  
— détails sur la méthode de chimie analytique utilisée et la méthode de 
validation (notamment rendement de récupération de la substance d’essai 
à partir du milieu d’échantillonnage),  
— jutification du choix des concentrations d’essai.  
Résultats:  
— tableau présentant la température, le taux d’humidité et le débit d’air 
dans la chambre d’inhalation,  
— tableau de données sur les concentrations nominales et réelles dans la 
chambre d’inhalation,  
— tableau de données sur la taille des particules, notamment données 
analytiques sur le prélèvement d’échantillons, la répartition granulomé ­
trique et les calculs du DAMM et de σ g , 
— tableau de données sur les réponses et le niveau de concentration pour 
chaque animal (c’est-à-dire nombre d’animaux montrant des signes de toxicité, y compris de mortalité, et nature, sévérité, moment d’apparition 
et durée des effets),
 
— poids corporel de chacun des animaux enregistrés lors de l’essai, date et 
heure de leur mort si celle-ci intervient avant l’euthanasie prévue; 
moment d’apparition et évolution des signes de toxicité et, le cas 
échéant, leur réversibilité,  
— pour chaque animal, résultats de l’autopsie et observations histopatholo ­
giques disponibles,  
— estimations de la létalité (CL  50 , DL  01 par exemple), notamment limites 
de confiance à 95 % et pente (si elle est fournie par la méthode d’éva ­
luation),  
— relation statistique, y compris l’estimation du facteur n (pour le protocole 
C × t). Le nom du logiciel de statistiques utilisé est indiqué.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 229
 
Discussion et interprétation des résultats:  
— un effort particulier est consacré à la description des méthodes utilisées 
pour répondre aux critères de la présente méthode d’essai, par exemple en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules,
 
— la respirabilité des particules est abordée à la lumière des résultats d’en ­
semble, en particulier si les critères de taille des particules n’ont pu être remplis,
 
— une explication est apportée s’il a fallu euthanasier des animaux qui 
souffraient ou montraient des signes de détresse sévère et persistante, en se basant sur les critères du document d’orientation de l’OCDE sur les effets mesurés éthiquement acceptables (8),
 
— si un essai suivant le chapitre B.52 de la présente annexe (4) a dû être 
interrompu en faveur de la présente méthode d’essai B.2, les justifica ­
tions sont fournies,  
— la cohérence des méthodes utilisées pour déterminer les concentrations 
nominales et réelles, et la relation entre la concentration réelle et la concentration nominale, sont incluses dans l’appréciation d’ensemble 
de l’étude,
 
— la cause probable de la mort et le mode d’action prédominant (sys ­
témique ou local) sont abordés.  
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(JO L 353 du 31.12.2008, p. 1).  
(4) Chapitre B.52 de la présente annexe, Toxicité aiguë par inhalation – 
Méthode par classe de toxicité aiguë (ATC).  
(5) Chapitre B.40 de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai de 
résistance électrique transcutanée (RET).  
(6) Chapter B.40  bis de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai 
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London/New York.  
DÉFINITION  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 231
 
Appendice 1  
Protocole C × t  
1. Une étude séquentielle «Concentration × Temps» (C × t) peut constituer une 
alternative au protocole traditionnel lorsqu’il s’agit d’évaluer la toxicité par inhalation (12) (13) (14). Elle est privilégiée lorsqu’une réglementation particulière s’applique ou pour un besoin scientifique nécessitant des 
essais sur animaux portant sur des durées d’exposition multiples, par 
exemple à des fins d’établissement de plans d’intervention d’urgence ou d’aménagement du territoire. Cette approche débute en général avec un essai à la concentration limite (session d’exposition I) au cours duquel les 
animaux sont exposés à la substance d’essai pendant cinq périodes de durées 
différentes (15, 30, 60, 120 et 240 minutes par exemple) de façon à obtenir plusieurs durées d’exposition pour une même séance (voir figure 1). Lorsqu’on applique le règlement (CE) n
 o 1272/2008, les concentrations 
limites pour les gaz, les vapeurs et les aérosols sont respectivement de 
20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l. Ces niveaux ne peuvent être dépassés que s’il est indispensable de réaliser des essais à ces niveaux de concen ­
tration pour des raisons règlementaires ou scientifiques (voir le paragraphe 
37 de la méthode B.2).
 
2. Si l’on manque d’informations sur la toxicité de la substance d’essai, une 
étude préliminaire peut être réalisée, au cours de laquelle des groupes d’au 
maximum 3 animaux par sexe sont exposés à des concentrations cibles 
sélectionnées par le directeur de l’étude, en général sur une durée de 240 minutes.
 
3. Si une concentration limite est testée lors de la session d’exposition I et que 
l’on observe une mortalité inférieure à 50 %, il n’est pas nécessaire d’ef ­
fectuer des essais supplémentaires. Si, pour des raisons règlementaires ou scientifiques, il est indispensable d’établir la relation concentration/temps/ réponse pour des niveaux plus élevés que la concentration limite indiquée, 
l’exposition suivante est réalisée, par exemple, au double de la concentration 
limite (c’est-à-dire 2L dans la figure 1).
 
4. Si une toxicité est observée à la concentration limite, des essais supplémen ­
taires (étude principale) sont nécessaires. Ces expositions supplémentaires 
sont réalisées soit à des concentrations plus faibles (dans la figure 1: 
sessions d’exposition II, III ou IV’), soit à des concentrations plus fortes sur des durées plus courtes (dans la figure 1, session d’exposition IV) qui 
sont adaptées et moins espacées.
 
5. L’essai (concentration initiale et concentrations supplémentaires) est réalisé 
avec l’animal de chaque sexe par point concentration/temps, ou avec 2 animaux du sexe le plus sensible à la substance d’essai par 
point concentration/temps. Le directeur de l’étude peut choisir, dans 
certaines circonstances, d’utiliser 2 rats de chaque sexe par point concentration/temps, ou 4 animaux du sexe le plus sensible à la subs ­
tance d’essai par point concentration/temps (15). L’utilisation de 2 animaux 
par point concentration/temps réduit en général le biais et la variabilité des 
estimations, augmente le taux de succès de l’estimation et améliore la couverture de l’intervalle de confiance lié à ce protocole. Pour plus de détails, se reporter au document d’orientation 39 (2).
 
6. Idéalement, chaque session d’exposition est exécutée sur une seule journée, 
ce qui donne la possibilité de retarder l’exposition suivante jusqu’à ce qu’on soit raisonnablement sûr de la survie des animaux, et permet au directeur de l’étude d’ajuster la concentration cible et les durées pour la prochaine séance 
d’exposition. Il est recommandé de commencer chaque séance d’exposition 
avec le groupe qui sera exposé le plus longtemps, 240 minutes par exemple, suivi du groupe qui sera exposé 120 minutes, et ainsi de suite. Si, par exemple, les animaux du groupe exposé 240 minutes meurent après 90 
minutes d’exposition ou montrent des signes importants de toxicité (par 
exemple, modifications considérables de la respiration, notamment diffi ­
cultés respiratoires), il est inutile d’exposer un groupe pendant 120 minutes car la mortalité serait très vraisemblablement de 100 %. Le direc ­
teur de l’étude choisit alors des durées d’exposition plus courtes pour cette 
concentration (90, 65, 45, 33 et 25 minutes par exemple).
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7. La concentration dans la chambre d’exposition est mesurée régulièrement 
pour déterminer la concentration moyenne pondérée en fonction du temps 
pour chaque durée d’exposition. Autant que possible, c’est l’heure de la mort de chaque animal qui est utilisée dans l’analyse statistique (et non la durée d’exposition).
 
8. Il convient d’examiner les résultats des quatre premières sessions d’exposi ­
tion pour repérer les éventuelles données manquantes dans la courbe concentration-temps (voir figure 1). S’il manque effectivement des données, 
une exposition supplémentaire (5
 e concentration) peut être réalisée. La 
concentration et les durées d’exposition de cette 5  e exposition sont choisies 
de manière à combler cette lacune.  
9. Toutes les sessions d’exposition (y compris la première) seront utilisées pour 
calculer la relation concentration-temps-réponse au moyen d’une analyse statistique (16). On utilisera si possible, pour chaque intervalle C × t, la concentration moyenne pondérée en fonction du temps et la durée d’expo ­
sition jusqu’à la mort (si celle-ci intervient durant l’exposition).
 
Figure 1  
Illustration hypothétique d’une relation concentration-temps-mortalité chez 
des rats
  
Symboles vides = survivants; symboles pleins = animaux morts  
Triangles = femelles; cercles = mâles  
Ligne pleine = valeurs de CL  50 (de 7,5 à 240 minutes) pour les mâles, n = 1  
Ligne tiretée = valeurs de CL  50 (de 7,5 à 240 minutes) pour les femelles, 
n = 1  
Lignes pointillées = valeurs de CL  50 hypothétique pour les mâles et les 
femelles si n avait été égal à 2 (12).  
Glossaire  
concentration limite.  
durée d’exposition.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 233
 
10. On trouvera ci-dessous un exemple de la procédure séquentielle:  
Session d’exposition I –  Essai à la concentration limite (voir figure 1)  
— 1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total (  a ) 
— Concentration cible (  b ) = concentration limite  
— Exposer cinq groupes d’animaux à cette concentration cible pendant 
respectivement 15, 30, 60, 120 et 240 minutes.  
↓ 
Session d’exposition II  ( c ) – Étude principale  
— 1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total.  
— Exposer cinq groupes d’animaux à une concentration plus faible (  d ) 
(1/2L) pendant des durées légèrement plus longues (d’un facteur √2, 
voir figure 1).  
↓ 
Session d’exposition III –  Étude principale  
— 1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total.  
— Exposer cinq groupes d’animaux à une concentration plus faible (  d ) 
(1/4L) pendant des durées légèrement plus longues (d’un facteur √2, 
voir figure 1).  
↓ 
Session d’exposition IV’ –  Étude principale  
— 1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total.  
— Exposer cinq groupes d’animaux à une concentration plus faible (  d ) 
(1/8L) pendant des durées légèrement plus longues (d’un facteur √2, 
voir figure 1).  
↓ ou ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 234  
( a ) Si aucune information n’est disponible sur la sensibilité de chaque sexe à la substance 
d’essai, des rats des deux sexes seront utilisés, soit 1 animal de chaque sexe par concen ­
tration. À partir d’informations existantes ou s’il apparaît au cours de cette session 
d’exposition qu’un des sexes est plus sensible, 10 animaux de ce sexe seront utilisés 
(2 animaux par point concentration/temps) à chaque niveau de concentration pour les 
essais suivants. 
( b ) Lorsqu’on applique le règlement (CE) n  o 1272/2008, les concentrations limites pour les 
gaz, les vapeurs et les aérosols sont respectivement de 20 000 ppm, 20 mg/l et 5 mg/l. Si 
l’on s’attend à une toxicité ou en raison des résultats de l’étude préliminaire, on choisit 
des concentrations de départ plus faibles. Pour des besoins règlementaires ou scienti ­
fiques, des concentrations plus fortes peuvent être utilisées. 
( c ) Idéalement, l’exposition des animaux au niveau de concentration suivant est retardée 
jusqu’à ce qu’on soit raisonnablement sûr que les animaux précédemment soumis au 
traitement ont survécu. Le directeur de l’étude peut alors ajuster la concentration cible et 
les durées pour la session d’exposition suivante. 
( d ) La dose minimale (concentration × temps) qui provoque la mortalité au cours de l’essai à 
la concentration initiale (première session d’exposition) servira de guide pour déterminer 
la prochaine combinaison de concentrations et de durées d’exposition. Généralement, la 
concentration diminuera de moitié (1/2L) et les animaux seront exposés sur une échelle 
de temps plus courte, les périodes d’exposition étant réparties selon une progression 
géométrique de facteur 1,4 ( √2, voir référence 11) centrée sur le temps correspondant 
au niveau de la dose létale minimale (temps × concentration) observé lors de la première exposition. Dans la figure 1, la mortalité au cours de la Session d’exposition I a d’abord 
été observée au bout de 15 minutes; les durées de la Session II ont donc été centrées 
autour de 30 minutes et sont de 15, 21, 30, 42 et 60 minutes. Après les deux premières 
expositions, il est fortement recommandé de tracer les résultats dans un graphique simi ­
laire, comme indiqué ci-dessus, et de vérifier si la relation entre la concentration et le 
temps définit un angle de 45 degrés (n = 1) ou si la pente de la relation 
concentration-temps-réponse est moins forte (n = 2 par exemple) ou plus forte (n = 
0,8 par exemple). Dans ces derniers cas, il est fortement recommandé d’adapter en 
conséquence les concentrations et les durées suivantes.
 Session d’exposition IV –  Étude principale  
— 1 animal/sexe par point concentration/temps; 10 animaux au total.  
— Exposer cinq groupes d’animaux à une concentration plus forte (  e ) (2L) 
pendant des durées légèrement plus longues (d’un facteur √2; voir figure 1).  
Traitement mathématique des résultats pour le protocole C × t  
11. Une procédure C × t constituée de 4 ou 5 concentrations d’exposition et de 
5 durées d’exposition génère respectivement 20 ou 25 points de données. 
Avec ces points de données, la relation C × t peut être calculée à l’aide 
d’une analyse statistique (16):  
Équation 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
où C = concentration; t = durée d’exposition, ou  
Équation 2:  
Response ¼ ƒðC n tÞ 
où n ¼ b 1=b 2: 
Avec l’équation 1, la valeur de la CL  50 peut être calculée pour une période 
de temps donnée (par exemple, 4 heures, 1 heure, 30 minutes ou n’importe quelle période de temps comprise dans la plage des périodes de temps testées) avec P = 5 (50 % de réponse). À noter que la règle de Haber ne 
s’applique que lorsque n = 1. La CL
 01 est calculée avec P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 235  
( e ) Dans certains cas, il peut être nécessaire d’augmenter la concentration (2L) sur une 
échelle de temps plus courte, les périodes d’exposition étant réparties selon une progres ­
sion géométrique de facteur 1,4 ( √2) centrée sur le temps correspondant au niveau de 
dose létale minimale observé lors de la première exposition. La durée minimale d’expo ­
sition est de préférence supérieure à 5 minutes et la durée maximale d’exposition ne 
dépasse pas 8 heures.
 B.3. TOXICITÉ AIGUË (CUTANÉE)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B (point A).  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B (point B).  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Aucune.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Des doses croissantes de la substance à tester sont appliquées sur la 
peau à plusieurs lots d'animaux d'expérience, une seule dose étant 
utilisée par lot. On observe ensuite les effets et la mortalité. Les 
animaux qui meurent pendant l'essai sont autopsiés ainsi que ceux qui survivent à la fin de l'expérience.
 
Si des animaux montrent des signes de détresse et de douleur 
intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai lorsque l'on sait que l'administration 
de la substance à étudier entraîne une détresse ou des douleurs 
intenses du fait de ses propriétés corrosives ou irritantes.
 
1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Préparation  
Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et 
d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours 
qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux adultes jeunes et 
sains sont distribués selon les règles du hasard dans les différents lots d'expérience. Vingt-quatre heures environ avant l'épreuve, on tond ou l'on rase les poils de la région dorsale du tronc des animaux en 
évitant toute lésion de la peau susceptible de modifier sa perméabi ­
lité. La surface à préparer pour l'application de la substance ne doit pas être inférieure à 10 % de la surface corporelle. Lorsque le test concerne des substances solides qui, le cas échéant, peuvent être 
pulvérisées, la substance à tester doit être suffisamment humectée 
au moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à assurer un bon contact avec la peau. Si l'on utilise un véhicule, son influence sur la pénétration de la substance dans la peau doit être 
prise en considération. Les substances liquides sont généralement 
appliquées non diluées.
 
1.6.2.  Conditions de l'essai  
1.6.2.1.  Animaux d'expérience  
On peut utiliser des rats ou des lapins adultes. On peut également 
utiliser d'autres espèces, mais il faut dans ce cas en justifier l'utili ­
sation. Il faut utiliser des souches courantes d'animaux de laboratoire. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation du 
poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la 
valeur moyenne requise.
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1.6.2.2.  Nombre et sexe  
Cinq animaux au moins sont utilisés pour chaque dose. Ils doivent 
être de même sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides. Si l'on dispose d'informations qui 
montrent qu'un sexe est nettement plus sensible, les essais seront 
pratiqués sur des animaux de ce sexe.
 
Note:  Il faut essayer d'utiliser un nombre plus restreint d'animaux 
lorsque les tests de toxicité aiguë sont effectués sur des animaux appartenant à un ordre plus élevé que celui des rongeurs. Les doses doivent être soigneusement choisies, en s'efforçant au 
maximum de ne pas dépasser des doses modérément toxiques. Il 
faut éviter dans ce type d'essais d'administrer des doses létales de la substance à tester.
 
1.6.2.3.  Doses  
Les doses doivent être en nombre suffisant, au moins trois, et 
espacées de manière à produire des lots présentant une gamme d'effets toxiques et de taux de mortalité. Tout effet irritant ou corrosif doit être pris en considération lors du choix des doses. 
Les données doivent être suffisantes pour permettre de tracer une 
courbe doses/réponses et, si possible, permettre une détermination acceptable de la DL
 50 . 
1.6.2.4.  Essai de limite  
Un essai de limite peut être effectué en administrant une dose au 
moins égale à 2 000 mg/kg de poids corporel à un lot de 5 mâles et 5 femelles, en suivant le mode opératoire décrit ci-après. Si l'on observe une mortalité due à la substance, il peut être nécessaire de 
réaliser une étude complète.
 
1.6.2.5.  Période d'observation  
La période d'observation doit s'étendre au moins sur 14 jours. Cepen ­
dant, sa durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être 
déterminée en fonction des réactions de toxicité, de leur vitesse 
d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée en cas de besoin. Le moment où les signes de toxicité apparaissent et disparaissent, leur durée ainsi que le moment 
de la mort sont importants, surtout en cas de tendance à une morta ­
lité retardée.
 
1.6.3.  Mode opératoire  
Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. La 
substance d'essai doit être appliquée uniformément sur une surface 
à peu près égale à 10 % de la surface totale du corps. Dans le cas de substances hautement toxiques, la surface traitée peut être moindre, mais la substance d'essai doit être appliquée de manière à former un 
film aussi mince et uniforme que possible.
 
Les substances d'essai doivent être maintenues en contact avec la 
peau au moyen d'un pansement de gaze poreux et d'un sparadrap non 
irritant pendant une période de 24 heures. La partie traitée doit, en 
outre, être convenablement couverte, de manière à maintenir en place le pansement de gaze et la substance d'essai et à éviter que les animaux puissent ingérer cette dernière. On peut utiliser des appa ­
reils de contention pour empêcher les animaux d'ingérer la substance 
d'essai mais une immobilisation complète n'est pas recommandée.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 237
 
À la fin de la période d'application, la substance d'essai résiduelle 
doit être éliminée, si possible, avec de l'eau, ou au moyen d'un autre 
procédé de nettoyage de la peau.  
Les observations doivent être consignées systématiquement au fur et 
à mesure qu'elles sont effectuées, en établissant une fiche indivi ­
duelle pour chaque animal. Les animaux doivent être observés fréquemment le premier jour. Un examen clinique attentif doit être 
pratiqué au moins une fois par jour ouvrable, d'autres observations 
doivent être faites quotidiennement, en prenant des mesures de façon à réduire le nombre d'animaux perdus pour l'étude, par exemple autopsie ou conservation au froid des animaux trouvés morts, ainsi 
qu'en isolant et sacrifiant les animaux faibles ou moribonds.
 
Les observations doivent concerner les modifications des poils, de la 
peau traitée, des yeux, des muqueuses ainsi que de l'appareil respira ­
toire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux auto ­
nome et central, et enfin de l'activité somato-motrice et du compor ­
tement. Une attention particulière sera apportée aux tremblements, 
convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Le moment de la mort doit être enregistré avec autant de précision que possible. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et 
ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés. Toutes 
les modifications pathologiques macroscopiques doivent être enregis ­
trées. Si nécessaire, des tissus doivent être prélevés pour un examen histopathologique.
 
Estimation de la toxicité pour l'autre sexe  
Après avoir mené à terme l'étude portant sur des animaux apparte ­
nant à un sexe, la substance est administrée au moins à un lot de 5 animaux de l'autre sexe, afin de déterminer si les animaux de ce sexe ne sont pas nettement plus sensibles à la substance à tester. L'utili ­
sation d'un plus petit nombre d'animaux peut être justifiée dans des 
circonstances particulières. Si l'on dispose d'informations appropriées qui montrent que les animaux du sexe testé sont considérablement plus sensibles, on peut se dispenser d'effectuer des essais sur les 
animaux de l'autre sexe.
 
2. DONNÉES  
Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux 
indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le moment de la mort de chaque animal, le nombre d'animaux présentant d'autres signes d'intoxication, la 
description des effets toxiques et les résultats de l'autopsie. Le 
poids de chaque animal doit être déterminé et noté peu de temps avant l'application de la substance d'essai, puis une fois par semaine et au moment de la mort; les modifications du 
poids doivent être calculées et enregistrées lorsque la survie 
dépasse une journée. Les animaux qui sont euthanasiés à cause des souffrances et de l'inconfort dus à la substance sont enregistrés comme s'ils étaient morts du fait du composé étudié. La DL
 50 doit 
être déterminée par application d'une méthode reconnue.  
L'évaluation des données doit inclure une évaluation de la relation, si 
elle existe, entre l'exposition des animaux à la substance à tester et 
l'apparition ainsi que la sévérité de toutes les anomalies, y compris les anomalies de comportement et les anomalies cliniques, les lésions macroscopiques, les modifications de poids corporel, la mortalité et 
tout autre effet toxique éventuel.
 
3. RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 238
 
— espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimen ­
taire, etc.,  
— conditions expérimentales (y compris le procédé de nettoyage de 
la peau et le type de pansement: occlusif ou non),  
— doses (avec indication du véhicule le cas échéant, et des concen ­
trations),  
— sexe des animaux sur lesquels l'essai a été réalisé,  
— tableau de données de réponses par sexe et par dose (à savoir 
nombre d'animaux morts ou sacrifiés au cours de l'essai, nombre 
d'animaux présentant des symptômes d'intoxication, nombre d'animaux exposés),
 
— moment de la mort après administration, raisons et critères 
justifiant l'euthanasie des animaux,  
— toutes les observations,  
— valeur de la DL  50 pour le sexe soumis à une étude complète, 
déterminée à 14 jours (en précisant la méthode de calcul),  
— intervalle de confiance de 95 % pour la DL  50 , lorsque le calcul 
est possible,  
— courbe dose/mortalité et pente de cette courbe (lorsque la 
méthode de calcul le permet),  
— résultats d'autopsie,  
— toutes les constatations histopathologiques,  
— résultats de tout essai réalisé sur l'autre sexe,  
— discussion des résultats (en tenant compte, en particulier, de 
l'effet que peuvent avoir sur la valeur de la DL  50 calculée les 
animaux euthanasiés au cours de l'essai),  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B (point D).  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B (point E).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 239
 
B.4. TOXICITÉ AIGUË: IRRITATION/CORROSION CUTANÉE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 404 (2002) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La mise à jour de cette méthode a porté plus particulièrement sur les 
possibilités d'améliorer le traitement des animaux de laboratoire et sur l'évaluation de toutes les informations existantes se rapportant 
aux substances d'essai en vue d'éviter les tests inutiles sur animaux. 
La présente méthode recommande d'analyser la valeur probante des résultats pertinents déjà disponibles avant de procéder à l'essai in vivo de corrosion/irritation décrit ci-après. Les données manquantes 
pourront être comblées par des essais séquentiels (1). La démarche 
expérimentale, décrite en annexe, inclut la réalisation d'essais in vitro validés et acceptés. Il est également recommandé d'opter, le cas 
échéant, pour une application successive plutôt que simultanée des 
trois timbres sur l'animal dans l'essai in vivo initial.
 
Pour assurer à la fois la fiabilité des résultats scientifiques et le bien- 
être animal, on ne procédera pas aux essais in vivo tant que la valeur 
probante de toutes les données relatives au caractère éventuellement corrosif ou irritant pour la peau de la substance n'aura pas été analysée. Ces données comprendront les résultats d'études menées 
sur des humains et/ou des animaux, des données relatives à l'effet 
corrosif ou irritant d'une ou plusieurs substances structurellement proches de la substance d'essai ou de mélanges de ces substances, des données démontrant la forte acidité ou alcalinité de la substance 
(2) (3), et des résultats d'essais in vitro ou ex vivo validés et acceptés 
(4) (5) (5a). Cette analyse devrait réduire la nécessité de tester in vivo l'effet corrosif ou irritant sur la peau des substances pour lesquelles des études antérieures ont déjà livré suffisamment d'infor ­
mations quant à ces deux aspects.
 
La démarche expérimentale préconisée, de type séquentiel, comporte 
des essais de corrosion et d'irritation  in vitro  ou ex vivo validés et 
acceptés, et est décrite dans l'annexe de la présente méthode. Cette démarche, élaborée au cours d'un atelier de l'OCDE (6) et recom ­
mandée à l'unanimité par les participants à cet atelier, a été adoptée à 
titre de recommandation dans le cadre du Globally Harmonized 
System for the Classification of Chemical Substances (GHS) (sys ­
tème de classification des substances chimiques harmonisé à l'échelon mondial) (7). Bien que cette stratégie séquentielle ne 
fasse pas partie intégrante de la méthode d'essai B.4, elle constitue 
cependant la procédure recommandée avant d'entreprendre les essais in vivo. S'agissant de nouvelles substances, on préconise de suivre une démarche expérimentale par étapes pour obtenir des résultats 
scientifiques fiables sur l'effet corrosif ou irritant de la substance. 
En ce qui concerne les substances existantes dont les données sur l'effet corrosif ou irritant sont insuffisantes, on suppléera à ces dernières en appliquant cette stratégie. Le choix d'une autre 
démarche expérimentale ou la décision de ne pas procéder par 
étapes doivent être justifiés.
 
Si l'analyse de la valeur probante des résultats ne permet pas de 
déterminer l'effet corrosif ou irritant, on envisagera un essai in 
vivo compatible avec la démarche séquentielle (voir annexe).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 240
 
1.2. DÉFINITIONS  
L'irritation cutanée  désigne l'apparition de lésions cutanées réversi ­
bles consécutives à l'application d'une substance d'essai durant une période de quatre heures au maximum.
 
La corrosion cutanée  désigne la survenue de lésions cutanées irré ­
versibles, et plus précisément d'une nécrose visible à travers l'épi ­
derme et dans le derme, à la suite de l'application d'une substance 
d'essai durant une période de quatre heures au maximum. La corro ­
sion cutanée se manifeste par des ulcères, des saignements, des croûtes saignantes et, au terme de la période d'observation de 14 jours, par une décoloration due au pâlissement de la peau, des 
zones d'alopécie totale et des escarres. Un examen histopathologique 
sera envisagé en cas de lésions douteuses.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Une seule dose de la substance d'essai est appliquée sur la peau 
de l'animal choisi pour l'expérience, les zones non traitées de la 
peau de l'animal servant de témoin. L'expérimentateur observe et 
note selon une échelle de valeurs le degré d'irritation ou de corro ­
sion à intervalles déterminés, et le décrit de façon plus détaillée afin de fournir une évaluation complète des effets. La durée de 
l'étude doit être suffisante pour permettre d'évaluer la réversibilité 
des effets observés.
 
Les animaux qui manifestent des signes persistants de détresse et/ou 
de douleur aiguës à n'importe quel stade de l'essai doivent être 
euthanasiés, et ces symptômes seront pris en compte dans l'évalua ­
tion de la substance. Les critères régissant la décision d'euthanasier les animaux moribonds et souffrant fortement sont définis dans un 
document cité en référence (8).
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparation de l'essai in vivo  
1.4.1.1.  Sélection de l'espèce animale  
On choisira de préférence de jeunes adultes sains parmi les lapins 
albinos. L'utilisation d'une autre espèce sera justifiée, le cas échéant.  
1.4.1.2.  Préparation des animaux  
Environ 24 heures avant l'essai, la région dorsale du tronc des 
animaux sera tondue à ras. On prendra soin de ne pas égratigner leur peau et seuls des animaux présentant une peau saine et intacte 
seront utilisés.
 
La fourrure de certaines souches de lapins est plus touffue par 
endroits et ce phénomène est plus marqué à certaines périodes de l'année. Ces plages à forte pilosité ne doivent pas recevoir la subs ­
tance d'essai.
 
1.4.1.3.  Conditions d'hébergement et d'alimentation  
Les animaux sont placés dans des cages individuelles. La tempéra ­
ture du local expérimental est réglée à 20  o C (± 3  o C) pour les lapins. 
L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester de préfé ­
rence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de nettoyage du 
local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les lapins seront nourris avec un 
mélange classique pour animaux de laboratoire et boiront de l'eau 
potable à volonté.
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1.4.2.  Mode opératoire  
1.4.2.1.  Application de la substance d'essai  
La substance d'essai est appliquée sur une petite zone (environ 
6 cm  2 ) de la peau et recouverte par une compresse de gaze, main ­
tenue en place à l'aide d'un sparadrap non irritant. Si l'application 
directe est impossible (dans le cas de liquides ou de certaines pâtes, par exemple), la substance d'essai est d'abord appliquée sur la compresse de gaze, laquelle est ensuite placée sur la peau. La 
compresse doit être maintenue en contact souple avec la peau à 
l'aide d'un pansement semi-occlusif durant la période d'exposition. Si la substance d'essai est déposée sur la compresse, celle-ci doit être 
fixée sur la peau de façon que la substance y soit répartie uniformé ­
ment et entre bien en contact avec celle-ci. On fera en sorte que l'animal n'ait pas accès à la compresse et ne puisse ingérer ou inhaler la substance d'essai.
 
Les substances liquides sont généralement testées à l'état non dilué. 
Si la substance d'essai est solide (elle peut être pulvérisée si néces ­
saire), il y a lieu de l'humidifier avec la plus petite quantité d'eau (ou 
au besoin avec un autre véhicule approprié) nécessaire à assurer un 
bon contact avec la peau. Lorsqu'on utilise un véhicule autre que l'eau, l'influence éventuelle du véhicule sur l'irritation de la peau par la substance d'essai doit être minimale.
 
À la fin de la période d'exposition, qui dure normalement 4 heures, 
on enlève ce qui peut l'être de la substance d'essai restante, avec de 
l'eau ou un solvant approprié sans interférer avec la réaction ni 
altérer l'intégrité de l'épiderme.  
1.4.2.2.  Dose  
Une dose de 0,5 ml de liquide ou de 0,5 g de solide ou de pâte est 
appliquée sur la plage à tester.  
1.4.2.3.  Essai initial (essai d'irritation/corrosion cutanée in vivo sur un seul 
animal)  
Il est fortement recommandé de commencer par pratiquer l'essai in 
vivo sur un seul animal, surtout lorsqu'on pense que la substance risque d'être corrosive. Cette précaution obéit à la démarche expéri ­
mentale séquentielle (voir annexe 1).
 
Dès lors qu'une substance est jugée corrosive d'après l'analyse de la 
valeur probante des résultats, tout essai sur animal s'avère superflu. Pour la plupart des substances risquant d'être corrosives, il n'est 
généralement pas nécessaire de procéder à un essai in vivo. Toute ­
fois, si l'on estime que les données disponibles ne sont pas assez convaincantes, on peut réaliser un essai limité sur un animal en 
suivant la procédure décrite ci-après. Jusqu'à trois timbres d'essai 
sont appliqués successivement sur l'animal. Le premier timbre est enlevé après trois minutes. Si aucune réaction cutanée grave n'est constatée, un deuxième timbre est appliqué et retiré après une heure. 
Si les observations effectuées à ce stade indiquent que l'exposition 
peut être étendue à quatre heures sans que cela fasse trop souffrir l'animal, l'expérimentateur appliquera un troisième timbre durant quatre heures et attribuera une cote à la réaction.
 
Si un effet corrosif est détecté à l'issue d'une des trois expositions 
séquentielles, l'essai s'achève immédiatement. Si aucun effet corrosif n'est relevé après l'enlèvement du troisième timbre, l'animal est gardé 
en observation durant 14 jours, à moins qu'un effet corrosif se 
déclare avant.
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Dans les cas où l'on s'attend à ce que la substance d'essai soit peut- 
être irritante, mais pas corrosive, un seul timbre sera appliqué sur un 
animal durant quatre heures.  
1.4.2.4.  Essai confirmatoire (essai d'irritation cutanée in vivo sur des 
animaux supplémentaires)  
Si l'essai initial ne révèle aucun effet corrosif, il convient de 
confirmer la réaction irritante ou négative sur deux animaux supplé ­
mentaires, traités chacun avec un timbre maintenu durant quatre heures. Si l'essai initial produit un effet irritant, l'essai confirmatoire peut être conduit en mode séquentiel ou par l'exposition simultanée 
de deux animaux supplémentaires. Au cas exceptionnel où l'essai 
initial ne serait pas pratiqué, deux ou trois animaux peuvent être traités au moyen d'un seul timbre appliqué durant quatre heures. Si l'on utilise deux animaux et qu'ils expriment la même réaction, il 
n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Dans le cas contraire, le 
troisième animal est également testé. L'utilisation d'animaux supplé ­
mentaires pourra être requise si les réactions sont équivoques.
 
1.4.2.5.  Période d'observation  
La durée de la période d'observation devrait être suffisante pour 
permettre d'évaluer complètement la réversibilité des effets observés. Il faudra cependant mettre fin à l'expérience dès que l'animal montre des signes persistants de douleur ou de détresse aiguës. La réversi ­
bilité des effets est déterminée par l'observation des animaux sur une 
période s'étendant jusqu'à 14 jours après l'enlèvement des timbres. Si la réaction s'avère réversible avant le quatorzième jour, l'expérience s'achève à ce moment-là.
 
1.4.2.6.  Observations cliniques et cotation des réactions cutanées  
L'observation des signes d'érythème et d'œdème chez tous les 
animaux et la cotation des réactions s'effectuent au bout de 60 minutes et ensuite 24, 48 et 72 heures après l'enlèvement du 
timbre. S'agissant de l'animal du test initial, la plage soumise à 
l'épreuve est aussi examinée immédiatement après l'enlèvement du timbre. Les réactions cutanées sont cotées et consignées conformé ­
ment à l'échelle figurant dans le tableau ci-après. Si la peau présente 
des lésions qui ne caractérisent pas une irritation ou une corrosion 
après 72 heures, il pourra être nécessaire d'observer l'animal jusqu'au quatorzième jour afin de déterminer la réversibilité des effets. En plus de l'observation de l'irritation, tous les effets toxiques locaux, 
tels qu'un dessèchement de la peau, et tout effet systémique nocif 
(par exemple des effets se manifestant par des signes cliniques de toxicité et sur le poids corporel) doivent être relevés et décrits en détail. L'examen histopathologiques est à envisager en cas de réac ­
tions équivoques.
 
La cotation des réactions cutanées est forcément subjective. L'har ­
monisation de la cotation des réactions cutanées et l'appui aux labo ­
ratoires d'essai ainsi qu'au personnel chargé d'effectuer et d'inter ­
préter les observations passent par une formation adéquate des expé ­
rimentateurs au système de cotation utilisé (voir tableau ci-après). Un manuel illustré sur la cotation de l'irritation cutanée et d'autres 
lésions pourrait être utile (9). La cotation des réactions cutanées 
devrait faire l'objet d'une évaluation à l'aveugle.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS  
Les résultats de l'étude devraient être récapitulés dans un tableau 
joint au rapport d'essai final et couvrir tous les aspects énumérés 
au paragraphe 3.1.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 243
 
2.2. ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Le degré d'irritation cutanée devrait être évalué en considération de 
la gravité des lésions et de leur caractère réversible ou non. Les cotes individuelles ne fournissent pas une valeur absolue des propriétés 
irritantes d'une substance, celles-ci étant évaluées parallèlement à 
d'autres effets de la substance. Ces cotes individuelles doivent plutôt être considérées comme des valeurs de référence, à évaluer en association avec toutes les autres observations effectuées au cours 
de l'étude.
 
L'évaluation des réactions d'irritation doit tenir compte de la réver ­
sibilité des lésions cutanées. Si des réactions, telles qu'une alopécie (sur une aire limitée), une hyperkératose, une hyperplasie et une 
desquamation, persistent jusqu'à la fin de la période d'observation 
de 14 jours, il y a lieu de considérer la substance d'essai comme irritante.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Justification de l'essai in vivo: analyse de la valeur probante des 
résultats disponibles avant l'essai, notamment des résultats de la 
démarche expérimentale séquentielle:  
— description des données pertinentes livrées par des essais précé ­
dents,  
— données obtenues à chaque étape de la démarche expérimentale,  
— description des essais in vitro effectués, exposant le détail des 
procédures et les résultats obtenus avec les substances d'essai et de référence,
 
— justification de l'étude in vivo après analyse de la valeur probante 
des résultats disponibles.  
Substance d'essai:  
— données d'identification (par exemple, numéro CAS, source, 
pureté, impuretés connues, numéro de lot),  
— état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple, pH, 
volatilité, solubilité, stabilité),  
— s'il s'agit d'un mélange: composition et pourcentages relatifs des 
constituants.  
Véhicule:  
— identification, concentration (s'il y a lieu), volume utilisé,  
— justification du choix du véhicule.  
Animaux d'expérience:  
— espèce/souche utilisée, justification de l'utilisation éventuelle d'un 
animal autre que le lapin albinos,  
— nombre d'animaux de chaque sexe,  
— poids de chaque animal au début et à la fin de l'essai,  
— âge des animaux au début de l'essai,  
— source des animaux, conditions d'encagement, régime alimen ­
taire, etc.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 244
 
Conditions expérimentales:  
— technique de préparation du site d'application,  
— détails concernant la composition du timbre et la technique d'ap ­
plication de ce dernier,  
— détails sur la préparation, l'application et l'enlèvement de la subs ­
tance d'essai.  
Résultats:  
— tableau faisant apparaître, pour chaque animal et à chaque relevé, 
les cotes attribuées aux réactions d'irritation/corrosion observées,  
— description de toutes les lésions observées,  
— description circonstanciée de la nature et du degré d'irritation ou 
de corrosion observé, et de tout effet histopathologique,  
— description de tout autre effet local néfaste (par exemple 
dessèchement de la peau) et des effets systémiques.  
Discussion des résultats  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In  Vitro,  2, p. 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
 
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, «Skin Irritation», Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.
 
(5a) Méthode d'essai B.40. Corrosion cutanée.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 24 January 1996 (http:// 
wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/ 
monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
[peut être obtenu sur demande auprès du secrétariat de 
l'OCDE].  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 246
 
Tableau I  
COTATION DES RÉACTIONS CUTANÉES  
Formation d'érythème et d'escarres  
Pas d'érythème . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Érythème très léger (à peine perceptible) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Érythème bien défini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Érythème modéré à grave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Érythème grave (rouge violacé) à formation d'escarres empêchant la 
cotation de l'érythème . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Maximum possible: 4  
Formation d'œdème  
Pas d'œdème . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Œdème très léger (à peine perceptible) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Œdème léger (pourtour de la zone œdémateuse bien délimité par une 
enflure nette) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Œdème modéré (enflure d'environ 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Œdème grave (enflure de plus de 1 mm s'étendant au-delà de l'aire 
exposée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Maximum possible: 4  
Un examen histopathologique pourra être réalisé en cas de réaction équivoque.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 247
 
ANNEXE  
Démarche expérimentale séquentielle pour les essais d'irritation et de 
corrosion cutanées  
CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES  
Pour concilier la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être animal, il 
importe d'éviter l'utilisation inutile d'animaux d'expérience et de réduire au 
minimum toute procédure expérimentale susceptible de déclencher des effets graves chez les animaux. Avant d'envisager un essai in vivo, on évaluera toutes les informations relatives à l'éventuel pouvoir corrosif/irritant d'une subs ­
tance sur la peau. Il se peut que les données disponibles suffisent à classer une 
substance d'essai quant à son pouvoir irritant ou corrosif, sans qu'il soit néces ­
saire d'effectuer des essais sur animaux. Ainsi, le recours à une analyse de la valeur probante des résultats et l'adoption d'une démarche expérimentale séquen ­
tielle limiteront au maximum la nécessité de pratiquer des essais in vivo, surtout 
lorsqu'il est probable que la substance va engendrer de graves effets.
 
Il est recommandé d'évaluer les informations existantes concernant le pouvoir irri ­
tant ou corrosif des substances à l'aide d'une analyse de la valeur probante des résultats, afin d'établir la nécessité de réaliser des études supplémentaires, autres 
que des études cutanées in vivo, pour contribuer à caractériser ce pouvoir. Si cette 
nécessité se confirme, une démarche expérimentale séquentielle est préconisée pour produire les données expérimentales pertinentes. S'agissant des substances qui n'ont pas encore fait l'objet d'essais, il convient d'obtenir l'ensemble des données permet ­
tant d'évaluer le pouvoir corrosif ou irritant de la substance par une démarche 
séquentielle. La démarche expérimentale exposée dans cette annexe a été élaborée au cours d'un atelier de l'OCDE (1) avant d'être entérinée et complétée dans le cadre du système harmonisé de classification intégrée des risques pour la santé humaine et 
l'environnement liés aux substances chimiques (Harmonized Integrated Hazard 
Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), adopté par la vingt-huitième réunion conjointe du comité sur les produits chimiques et du groupe de travail sur les produits chimiques, les pesticides 
et la biotechnologie, en novembre 1998 (2).
 
Si cette démarche expérimentale séquentielle ne fait pas partie intégrante de la 
méthode d'essai B.4, elle constitue cependant la procédure recommandée pour déterminer l'effet irritant ou corrosif sur la peau. Cette procédure représente à la fois la meilleure pratique et une référence éthique dans ce domaine. La méthode 
d'essai décrit le mode opératoire de l'essai in vivo et récapitule les facteurs à 
prendre en considération avant d'entamer l'essai. La démarche indique comment évaluer les données existantes relatives aux propriétés irritantes ou corrosives des substances et présente les différentes étapes permettant d'obtenir des données 
pertinentes sur les substances qui réclament d'autres études ou qui n'ont pas 
encore été étudiées. Elle recommande également, dans certaines circonstances, la réalisation d'essais in vitro ou ex vivo d'irritation et de corrosion cutanées, validés et acceptés.
 
DESCRIPTION DE LA STRATÉGIE D'ÉVALUATION ET D'ESSAI  
Avant d'entreprendre les essais inscrits dans la démarche expérimentale séquen ­
tielle (figure), il faut évaluer toutes les informations disponibles afin d'établir la nécessité d'effectuer des essais cutanés in vivo. Bien que l'évaluation de certains 
paramètres particuliers puisse livrer des informations significatives (par exemple 
un pH extrême), la totalité des informations existantes doit être prise en consi ­
dération. L'analyse de la valeur probante des résultats portera sur toutes les données pertinentes concernant les effets de la substance en question, ou de 
ses analogues; elle débouchera sur une décision qui devra être justifiée. Il 
conviendra d'accorder une place prépondérante aux données se rapportant aux humains et aux animaux, et d'examiner ensuite les résultats des essais in vitro ou ex vivo sur la substance. Les essais in vivo de substances corrosives devront être 
évités chaque fois que cela est possible. Les facteurs pris en compte dans la 
démarche expérimentale sont repris ci-après:
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Évaluation des données existantes sur les humains et les animaux (étape 1).  Les 
données existantes sur l'être humain, par exemple des études cliniques ou sur les 
conditions de travail et des rapports sur des cas relevant de ces disciplines, et/ou les résultats d'essais sur animaux, par exemple des essais de toxicité par expo ­
sition cutanée unique ou répétée, sont à examiner en premier, car ils livrent des 
informations directement liées aux effets sur la peau. Les substances dont le 
pouvoir irritant ou corrosif est avéré et celles dont le caractère non corrosif et non irritant a été clairement démontré ne doivent pas faire l'objet d'études in vivo.
 
Analyse des relations structure-activité  (RSA) (étape 2). Le cas échéant, les 
résultats d'essais sur des substances structurellement proches doivent être pris en considération. S'il existe suffisamment de données relatives aux humains et/ou aux animaux sur des substances structurellement proches ou sur des 
mélanges de ces substances pour attester leur pouvoir corrosif ou irritant, on 
peut supposer que la substance étudiée provoquera les mêmes réactions. Auquel cas, il n'est plus forcément nécessaire de tester la substance. Des résultats négatifs lors d'études de substances structurellement proches ou de mélanges de 
ces substances ne constituent pas une preuve suffisante de l'effet non corrosif ou 
non irritant d'une substance dans le cadre de la démarche expérimentale séquen ­
tielle. On déterminera le pouvoir corrosif ou irritant pour la peau en appliquant une méthode d'analyse RSA validée et acceptée.
 
Propriétés physico-chimiques et réactivité chimique (étape 3).  Les substances 
présentant des valeurs de pH extrêmes, par exemple < 2,0 ou > 11,5, sont 
susceptibles d'induire de fortes réactions locales. Si une valeur de pH extrême 
est un indice décisif quant au caractère corrosif d'une substance, son pouvoir tampon doit également entrer en ligne de compte (3) (4). Si le pouvoir tampon donne à penser que la substance peut ne pas être corrosive pour la peau, cette 
hypothèse demande à être confirmée par un autre essai, de préférence un essai in 
vitro ou ex vivo validé et accepté (voir étapes 5 et 6).
 
Toxicité cutanée (étape 4).  S'il est prouvé qu'une substance chimique est très 
toxique par voie cutanée, une étude d'irritation ou de corrosion cutanée risque d'être impossible à réaliser in vivo, la quantité de substance d'essai normalement appliquée pouvant dépasser la dose très toxique et entraîner ainsi la mort des 
animaux ou les faire terriblement souffrir. En outre, lorsque des études de toxicité 
cutanée ont déjà été menées sur des lapins albinos jusqu'à la dose limite de 2 000 mg/kg de poids corporel, ou au-delà, et qu'aucune irritation ou corrosion cutanées n'ont été constatées, il n'est plus forcément nécessaire d'effectuer un essai supplé ­
mentaire d'irritation ou de corrosion cutanée. Il convient de faire attention à 
plusieurs aspects lorsqu'on évalue la toxicité cutanée aiguë à partir d'études anté ­
rieures. À titre d'exemple, les informations rapportées sur les lésions cutanées peuvent être incomplètes. Il se peut que les essais et les observations aient été 
effectués sur une autre espèce que le lapin, or, la sensibilité aux substances est 
très variable d'une espèce à l'autre. De même, la forme sous laquelle la substance d'essai a été appliquée sur les animaux peut ne pas convenir à l'évaluation de l'irritation et de la corrosion cutanées [par exemple la dilution des substances (5)]. 
Néanmoins, lorsque des études bien conçues de toxicité cutanée ont été correc ­
tement menées sur le lapin, leurs résultats négatifs peuvent être considérés comme une démonstration suffisante du caractère non irritant ni corrosif de la substance.
 
Résultats des essais in vitro ou ex vivo (étapes 5 et 6).  Les substances dont le 
pouvoir fortement irritant ou corrosif a été mis en évidence par un essai in vitro ou ex vivo validé et accepté (6) (7), conçu pour évaluer ces effets particuliers, ne 
doivent pas être testées sur des animaux. Il est en effet très vraisemblable que ces 
substances produiront des effets semblables in vivo.
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Essai in vivo sur des lapins (étapes 7 et 8).  Si la décision d'effectuer une étude in 
vivo a été prise sur la base d'une analyse de la valeur des résultats, celle-ci doit 
débuter par un essai initial réalisé sur un seul animal. Si les résultats de cet essai indiquent que la substance est corrosive pour la peau, il ne faut pas poursuivre les essais. Si l'essai initial ne montre aucun effet corrosif, il y a lieu de confirmer 
l'absence de réaction ou une réaction d'irritation sur un ou deux animaux supplé ­
mentaires exposés à la substance durant quatre heures. Lorsque l'essai initial fait apparaître un effet irritant, l'essai confirmatoire doit être conduit sur un mode séquentiel, ou par l'exposition simultanée des deux animaux supplémentaires.
 
BIBLIOGRAPHIE  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22 - 
24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdail, D.J., Liebsch, M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1), p. 19-26.
 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 
56032-356-6, Chapter 31, p. 411-436.  
(6) Méthode d'essai B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., 
Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The 
ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi ­
vity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.
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Figure  
PROCÉDURE D'ESSAI ET D'ÉVALUATION DE L'IRRITATION ET DE LA 
CORROSION CUTANÉES
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B.5. TOXICITÉ AIGUË: IRRITATION/CORROSION OCULAIRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 405 (2002) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La révision de la présente méthode a porté plus particulièrement sur 
l'évaluation préalable de toutes les informations existantes se rappor ­
tant aux substances d'essai, afin d'éviter les essais inutiles sur les 
animaux de laboratoire et contribuer ainsi à préserver le bien-être animal. Cette méthode préconise d'analyser la valeur probante des résultats pertinents déjà disponibles (1) avant de procéder à l'essai in 
vivo de corrosion/irritation oculaire décrit ci-après. Il est conseillé de 
combler le manque de données par des essais séquentiels (2) (3). La démarche expérimentale décrite à l'annexe de la présente méthode inclut la réalisation d'essais in vitro validés et acceptés. Il est en 
outre recommandé d'effectuer un essai d'irritation/corrosion cutanée 
in vivo, afin de prédire le pouvoir corrosif pour les yeux avant d'envisager un essai oculaire in vivo.
 
Afin de concilier la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être 
animal, on ne procédera pas aux essais in vivo avant d'avoir analysé la valeur probante de toutes les données relatives au caractère éven ­
tuellement corrosif ou irritant de la substance pour les yeux. Ces 
données comprendront les résultats d'études menées sur des humains et/ou des animaux de laboratoire, des données relatives à l'effet corrosif ou irritant d'une ou plusieurs substances structurelle ­
ment proches de la substance d'essai ou de mélanges de ces subs ­
tances, des données démontrant la forte acidité ou alcalinité de la substance (4) (5), et des résultats d'essais in vitro et ex vivo d'irri ­
tation et de corrosion cutanées validés et acceptés (6) (6a). Ces 
études pourront être effectuées avant ou après l'analyse de la 
valeur probante des résultats.
 
Pour certaines substances, une telle analyse peut faire ressortir la 
nécessité de mener des études in vivo afin de déterminer le pouvoir corrosif/irritant de la substance pour les yeux. Dans de tels cas, il est préférable, avant d'envisager un essai oculaire in 
vivo, de commencer par tester in vivo les effets cutanés de la subs ­
tance et de les évaluer conformément à la méthode d'essai B.4 (7). L'analyse de la valeur probante des résultats, couplée à la stratégie d'essai séquentielle, devrait réduire la nécessité de tester in vivo 
l'effet corrosif ou irritant sur les yeux des substances pour lesquelles 
des études antérieures ont déjà livré suffisamment d'informations quant à ces deux aspects. Si le pouvoir corrosif ou irritant pour les yeux est impossible à déterminer par la démarche séquentielle, même 
après réalisation d'un essai in vivo d'irritation/corrosion cutanée, on 
peut tester in vivo l'effet corrosif ou irritant sur les yeux.
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La démarche expérimentale préconisée, de type séquentiel, comporte 
des essais de corrosion et d'irritation in vitro ou ex vivo validés, et 
est décrite dans l'annexe de la présente méthode. Cette démarche, élaborée au cours d'un atelier de l'OCDE (8) et recommandée à l'unanimité par les participants à cet atelier, a été adoptée à titre 
de recommandation dans le cadre du système de classification des 
substances chimiques harmonisé à l'échelon mondial (Globally Harmonized System for the Classification of Chemical Substances — GHS) (9). Bien que cette stratégie séquentielle ne fasse pas partie 
intégrante de la méthode d'essai B.4, elle constitue cependant la 
procédure recommandée avant d'entreprendre les essais in vivo. S'agissant de nouvelles substances, cette démarche expérimentale par étapes est préconisée pour obtenir des résultats scientifiques 
fiables sur l'effet corrosif ou irritant de la substance. En ce qui 
concerne les substances existantes dont les données sur l'effet corrosif ou irritant sur la peau et les yeux sont insuffisantes, on suppléera à ces dernières en appliquant cette stratégie. Le choix 
d'une autre démarche expérimentale ou la décision de ne pas 
procéder par étapes doivent être justifiés.
 
1.2. DÉFINITIONS  
L'irritation oculaire  désigne des altérations oculaires qui survien ­
nent à la suite de l'application d'une substance d'essai sur la surface antérieure de l'œil, et qui sont totalement réversibles dans les 21 jours suivant le traitement.
 
La corrosion oculaire  désigne la survenue de lésions tissulaires de 
l'œil ou une grave détérioration de la vision, qui sont provoqués par 
l'application d'une substance d'essai sur la surface antérieure de l'œil, et qui ne sont pas totalement réversibles dans les 21 jours suivant le 
traitement.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance d'essai est appliquée en une seule dose sur l'un des 
yeux de l'animal d'expérience, l'œil non traité servant de témoin. On 
évalue le degré de l'irritation ou de la corrosion oculaires en cotant la gravité des lésions affectant la conjonctive, la cornée et l'iris, à intervalles déterminés. Les autres réactions de l'œil et les troubles 
systémiques sont également décrits de manière à fournir une évalua ­
tion complète des effets. La durée de l'étude doit être suffisante pour permettre d'évaluer la réversibilité des effets.
 
Les animaux qui manifestent des signes persistants de détresse et/ou 
de douleur aiguës à n'importe quel stade de l'essai doivent être 
euthanasiés, et ces symptômes seront pris en compte dans l'évalua ­
tion de la substance. Les critères régissant la décision d'euthanasier les animaux moribonds et souffrant fortement sont définis dans un document cité en référence (10).
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparation de l'essai in vivo  
1.4.1.1.  Sélection de l'espèce animale  
On choisira de préférence de jeunes adultes sains parmi les lapins 
albinos. L'utilisation d'une autre espèce ou souche sera justifiée, le cas échéant.
 
1.4.1.2.  Préparation des animaux  
Les deux yeux de chaque animal susceptible de participer à l'essai 
doivent être examinés dans les 24 heures précédant le début de 
l'essai. Les animaux qui présentent des signes d'irritation oculaire, 
des défauts oculaires ou une lésion de la cornée seront écartés.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 253
 
1.4.1.3.  Conditions d'hébergement et d'alimentation  
Les animaux sont placés dans des cages individuelles. La tempéra ­
ture du local expérimental est réglée à 20  o C (± 3  o C) pour les lapins. 
L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester de préfé ­
rence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de nettoyage du 
local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les lapins seront nourris avec un 
mélange classique pour animaux de laboratoire et boiront de l'eau 
potable à volonté.
 
1.4.2.  Mode opératoire  
1.4.2.1.  Application de la substance d'essai  
L'expérimentateur introduit la substance d'essai dans le sac conjonc ­
tival de l'un des yeux de chaque animal, après avoir délicatement 
écarté la paupière inférieure du globe oculaire. Il ramène ensuite doucement les deux paupières l'une contre l'autre et les maintient dans cette position pendant environ une seconde afin d'éviter toute 
perte de substance. L'autre œil, qui ne subit pas de traitement, sert de 
témoin.
 
1.4.2.2.  Irrigation  
Il ne faut pas laver les yeux des animaux traités pendant au moins 24 
heures après l'instillation de la substance d'essai, à moins que celle-ci 
soit à l'état solide (voir paragraphe 1.4.2.3.2) ou déclenche immédia ­
tement des effets corrosifs ou irritants. Au besoin, un lavage pourra être effectué à l'issue de ce délai.
 
L'utilisation d'un groupe d'animaux satellite pour étudier l'influence 
du lavage n'est pas indiquée, à moins qu'elle ne se justifie d'un point 
de vue scientifique. Le cas échéant, on utilisera deux lapins. Les conditions du lavage doivent être décrites minutieusement en indi ­
quant, par exemple, le moment du lavage, la composition et la 
température de la solution ophtalmique, la durée, le volume et la 
vitesse d'application.
 
1.4.2.3.  Dose  
1.4.2.3.1.  Essai de liquides  
Pour les liquides, on utilise une dose de 0,1 ml. Il faut éviter d'ins ­
tiller la substance directement dans l'œil avec un vaporisateur à pres ­
sion; il est préférable d'en expulser d'abord le contenu, de prélever 0,1 ml de celui-ci dans une fiole et de l'instiller dans l'œil.
 
1.4.2.3.2.  Essai de solides  
Dans le cas des solides, pâtes ou substances particulaires, la quantité 
utilisée doit avoir un volume de 0,1 ml ou un poids ne dépassant pas 100 mg. La substance d'essai sera broyée finement. Il convient de 
mesurer le volume de la substance solide après l'avoir légèrement 
tassée, par exemple en tapotant le récipient de mesure. Si la subs ­
tance d'essai solide n'a pas encore été évacuée de l'œil de l'animal par des mécanismes physiologiques au premier moment d'observation, à 
savoir une heure après le traitement, l'œil peut être rincé à l'aide 
d'une solution saline ou à l'eau distillée.
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1.4.2.3.3.  Essai des aérosols  
Il est recommandé de prélever une dose du contenu de tous les 
vaporisateurs à pression et aérosols avant de l'instiller dans l'œil. 
La seule exception concerne les substances conditionnées en bombes aérosol sous pression, qui sont impossibles à recueillir préa ­
lablement à l'instillation car elles se vaporisent. Dans ce cas, l'expé ­
rimentateur maintient l'œil de l'animal ouvert et administre la subs ­
tance à tester en un seul jet d'environ une seconde, émis à 10 cm et directement en face de l'œil. Cette distance peut être modulée en fonction de la pression du jet et de sa composition. Il faut veiller 
à ce que la pression du jet n'endommage pas l'œil. Dans certains cas, 
il pourra être nécessaire d'évaluer l'ampleur des dégâts «mécaniques» risquant d'être causés à l'œil par la force du jet.
 
La dose d'aérosol peut être estimée grâce à une simulation de l'ap ­
plication menée comme suit: la substance est projetée à travers une ouverture de la taille d'un œil de lapin placée directement devant un papier. L'augmentation de poids du papier donne une idée approxi ­
mative de la quantité administrée dans l'œil du lapin. Pour une subs ­
tance volatile, la dose peut être estimée à partir du poids du récipient (dans lequel elle est recueillie) avant et après utilisation.
 
1.4.2.4.  Essai initial (essai in vivo de l'effet irritant/corrosif sur les yeux 
mené sur un seul animal)  
Conformément à la démarche expérimentale séquentielle (voir 
annexe 1), il est fortement recommandé de commencer par pratiquer l'essai in vivo sur un seul animal.
 
Si les résultats de cet essai, mené selon la procédure décrite, indi ­
quent que la substance est corrosive ou fortement irritante pour l'œil, il n'y a pas lieu de mener d'autres essais d'irritation oculaire.
 
1.4.2.5.  Anesthésie locale  
L'anesthésie locale se pratique cas par cas. Si l'analyse de la valeur 
probante des résultats montre que la substance risque de provoquer 
une douleur, ou si l'essai initial révèle que l'animal souffrira, un anesthésique local peut être administré avant l'instillation de la subs ­
tance d'essai. Le type, la concentration et la dose d'anesthésique 
doivent être choisis avec soin pour éviter que son utilisation n'influe 
sur la réaction à la substance d'essai. L'œil témoin subira une anes ­
thésie identique.
 
1.4.2.6.  Essai confirmatoire (essai d'irritation oculaire in vivo sur des 
animaux supplémentaires)  
Si l'essai initial ne fait apparaître aucun effet corrosif, la réaction 
négative ou d'irritation demande à être confirmée sur un ou deux animaux supplémentaires. Si l'essai initial provoque une forte irrita ­
tion, indiquant que l'essai confirmatoire pourrait donner lieu à un 
effet très marqué (irréversible), on recommande de conduire l'essai 
confirmatoire sur un mode séquentiel en n'utilisant qu'un seul animal à la fois, plutôt que d'exposer les deux animaux simultanément. Si le deuxième animal manifeste des signes de corrosion ou d'irritation 
grave, l'essai s'arrête là. On pourra utiliser d'autres animaux s'il y a 
lieu de confirmer des réactions d'irritation faibles à modérées.
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1.4.2.7.  Période d'observation  
La durée de la période d'observation doit être suffisante pour 
permettre d'évaluer à fond l'ampleur et la réversibilité des effets observés. Il faut cependant mettre un terme à l'expérience dès 
qu'un animal manifeste des signes persistants de détresse ou de 
douleur aiguës (9). Pour déterminer la réversibilité des effets, les animaux doivent normalement être observés durant 21 jours après l'administration de la substance d'essai. Si la réversibilité est 
constatée avant ce délai, l'expérience prend fin à ce moment-là.
 
1.4.2.7.1.  Observations cliniques et cotation de la gravité des réactions 
oculaires  
On examine les yeux 1, 24, 48 et 72 heures après l'application de la 
substance d'essai. Les animaux ne seront maintenus à l'épreuve que 
le temps nécessaire pour obtenir un résultat concluant. Les animaux 
manifestant des signes persistants de douleur ou de détresse aiguës doivent être euthanasiés rapidement, et ces symptômes sont à prendre en compte dans l'évaluation de la substance d'essai. Il faudra égale ­
ment euthanasier les animaux qui présentent les lésions oculaires 
suivantes à la suite de l'instillation: perforation de la cornée ou ulcération profonde de la cornée associée à un staphylome; présence de sang dans la chambre antérieure de l'œil; opacité cornéenne de 
niveau 4 persistant durant 48 heures; absence de réflexe protomoteur 
(réaction indienne de niveau 2) durant 72 heures; ulcération de la membrane conjonctivale; nécrose des conjonctives ou de la membrane nictitante, ou décollement du tissu nécrosé. L'euthanasie 
s'impose parce que ces lésions sont généralement irréversibles.
 
Les animaux qui ne présentent pas de lésions oculaires peuvent être 
écartés, mais seulement à partir du quatrième jour suivant l'instilla ­
tion. Les animaux affectés de lésions légères à modérées doivent être gardés en observation jusqu'à ce que ces lésions disparaissent, ou 
durant 21 jours, soit jusqu'au terme de l'étude. L'expérimentateur 
déterminera la nature et la gravité des lésions ainsi que leur réversi ­
bilité en observant les animaux aux septième, quatorzième et vingt et unième jours.
 
L'intensité des réactions oculaires (conjonctives, cornée et iris) doit 
être consignée à chaque examen (tableau I). Toute autre lésion 
oculaire (par exemple un pannus, une coloration) et les troubles systémiques doivent également être signalés.
 
Pour examiner les réactions, on peut s'aider d'une loupe binoculaire, 
d'une lampe à fente portative, d'un biomicroscope ou d'un autre appareil approprié. Après l'enregistrement des observations effectuées 
à la vingt-quatrième heure, l'examen des yeux peut se poursuivre à la 
fluorescéine.
 
La cotation des réactions oculaires est forcément subjective. L'har ­
monisation de la cotation des réactions oculaires et l'appui aux labo ­
ratoires d'essai ainsi qu'au personnel chargé d'effectuer et d'inter ­
préter les observations passent par une formation adéquate des expé ­
rimentateurs au système de cotation utilisé. La cotation des réactions cutanées devrait faire l'objet d'une évaluation à l'aveugle.
 
2. RÉSULTATS  
2.2. ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Le degré d'irritation oculaire devrait être évalué en considération de 
la gravité des lésions et de leur caractère réversible ou non. Les cotes 
individuelles ne fournissent pas une valeur absolue des propriétés 
irritantes d'une substance, celles-ci étant évaluées parallèlement à d'autres effets de la substance. En revanche, les cotes individuelles ont une valeur de référence et ne sont significatives que lorsqu'elles 
sont appuyées par une description et une évaluation complètes de 
toutes les observations.
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3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Justification de l'essai in vivo: analyse de la valeur probante des 
résultats d'essais préexistants, notamment ceux qui procèdent de la 
démarche expérimentale séquentielle:  
— description des données pertinentes livrées par des essais précé ­
dents,  
— données obtenues à chaque étape de la démarche expérimentale,  
— description des essais effectués in vitro, détaillant les procédures 
utilisées et mentionnant les résultats obtenus avec les substances 
d'essai et avec les substances de référence,  
— description de l'étude d'irritation/corrosion cutanée menée in 
vivo, mentionnant les résultats obtenus,  
— justification de l'étude in vivo après analyse de la valeur probante 
des résultats disponibles.  
Substance d'essai:  
— données d'identification (par exemple, numéro CAS, source, 
pureté, impuretés connues, numéro de lot),  
— état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple, pH, 
volatilité, solubilité, stabilité, réactivité avec l'eau),  
— s'il s'agit d'un mélange: composition et pourcentages relatifs des 
constituants,  
— si on a eu recours à une anesthésie locale: identification, pureté, 
type, dose et interaction potentielle avec la substance d'essai.  
Véhicule:  
— identification, concentration (s'il y a lieu), volume utilisé,  
— justification du choix du véhicule.  
Animaux, d'expérience:  
— espèce/souche utilisée, justification de l'utilisation éventuelle d'un 
animal autre que le lapin albinos,  
— âge de chaque animal au début de l'essai,  
— nombre d'animaux de chaque sexe dans les groupes d'essai et 
témoin (le cas échéant),  
— poids de chaque animal au début et à la fin de l'essai,  
— source des animaux, conditions d'encagement, régime alimen ­
taire, etc.  
Résultats:  
— description de la méthode utilisée pour coter l'irritation à chaque 
moment d'observation (par exemple lampe à fente portative, 
biomicroscope, fluorescéine),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 257
 
— présentation sous forme de tableaux des réactions d'irritation ou 
de corrosion relevées chez chaque animal et à chaque moment 
d'observation jusqu'à la fin de la participation de chaque animal à l'essai,
 
— description circonstanciée du degré et de la nature de l'irritation 
ou de la corrosion observées,  
— description de toute autre lésion oculaire observée (par exemple 
vascularisation, formation d'un pannus, adhérences, coloration),  
— description des effets non oculaires locaux et des troubles 
systémiques, ainsi que des observations histopathologiques, le 
cas échéant.  
Discussion des résultats.  
3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
L'extrapolation à l'humain des résultats d'études d'irritation oculaire 
menées sur des animaux de laboratoire n'est valable que dans une 
certaine mesure. Dans bien des cas, le lapin albinos est plus sensible 
que l'espèce humaine aux substances irritantes ou corrosives pour l'œil.
 
Lors de l'interprétation des résultats, il faut savoir reconnaître une 
irritation consécutive à une infection secondaire, laquelle ne doit pas être prise en compte.
 
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
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Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410- 429.
 
(2) De Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Cerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
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(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
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(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
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Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.
 
(6a) Méthode d'essai B.40. Corrosion cutanée.  
(7) Méthode d'essai B.4. Toxicité aiguë: irritation/corrosion 
cutanée.  
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
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Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 24 January 1996 (http:// 
www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
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Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
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HCL6.htm).
 
(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
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Tableau I  
Cotation des réactions oculaires  
Cornée  
Opacité: degré de densité (les observations porteront sur les zones les plus 
denses) (*) 
Pas d'ulcération ni d'opacité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Zones d'opacité (autres qu'un léger ternissement de l'éclat normal) 
dispersées ou diffuses; détails de l'iris nettement visibles . . . . . . . . . . . . 1 
Zone translucide aisément discernable; détails de l'iris légèrement 
masqués . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  2 
Zone nacrée; détails de l'iris complètement invisibles; dimension de la 
pupille à peine discernable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Cornée opaque; iris non discernable à travers l'opacité . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Maximum possible: 4  
NOTES  
(*) L'étendue de l'opacité cornéenne doit être précisée.  
Iris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Plis nettement plus profonds, congestion, tuméfaction, hyperhémie péri ­
cornéenne modérée ou conjonctives injectées; iris réactif à la lumière 
(une réaction lente est positive) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Hémorragie, destruction marquée, ou absence de réaction à la lumière 2  
Maximum possible: 2  
Conjonctives  
Rougeur (s'applique aux conjonctives palpébrale et bulbaire, mais pas à la cornée 
ni à l'iris) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Hyperhémie de certains vaisseaux sanguins (yeux injectés) . . . . . . . . . . 1 Coloration pourpre diffuse, vaisseaux sanguins difficilement discerna ­
bles les uns des autres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Coloration rouge soutenu diffuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
 
Maximum possible: 3  
Chémosis  
Tuméfaction (s'applique aux paupières et/ou aux membranes nictitantes) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Tuméfaction légèrement supérieure à la normale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Tuméfaction patente avec éversion partielle des paupières . . . . . . . . . . . 2 Tuméfaction avec paupières à demi closes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Tuméfaction avec paupières plus qu'à demi closes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Maximum possible: 4  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 260
 
ANNEXE  
Démarche expérimentale séquentielle pour les essais d'irritation et de 
corrosion oculaires  
CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES  
Pour concilier la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être animal, il 
importe d'éviter l'utilisation inutile d'animaux d'expérience et de réduire au 
minimum toute procédure expérimentale susceptible de déclencher des effets graves chez les animaux. Avant d'envisager un essai in vivo, on évaluera toutes les informations disponibles concernant l'éventuel pouvoir corrosif/irritant 
d'une substance sur les yeux. Il se peut que les données disponibles suffisent à 
classer une substance d'essai quant à son pouvoir d'irritation ou de corrosion oculaire, sans qu'il soit nécessaire d'effectuer des essais sur animaux. Ainsi, le recours à une analyse de la valeur probante des résultats et l'adoption d'une 
démarche expérimentale séquentielle limiteront au maximum la nécessité de 
pratiquer des essais in vivo, surtout si la substance risque d'engendrer des réac ­
tions violentes.
 
Il est recommandé d'évaluer les informations existantes concernant le pouvoir 
irritant ou corrosif des substances sur les yeux, à l'aide d'une analyse de la valeur 
probante des résultats, afin d'établir la nécessité de réaliser des études supplé ­
mentaires, autres que des études in vivo sur l'œil, pour contribuer à caractériser ce pouvoir. Si cette nécessité se confirme, une démarche expérimentale séquen ­
tielle est préconisée pour produire les données expérimentales nécessaires. S'agis ­
sant des substances qui n'ont pas encore fait l'objet d'essais, il convient d'obtenir 
l'ensemble des données permettant d'évaluer le pouvoir corrosif ou irritant de la substance par une démarche séquentielle. La démarche expérimentale exposée dans la présente annexe a été élaborée au cours d'un atelier de l'OCDE (1). Elle a 
par la suite été entérinée et complétée dans le cadre du système harmonisé de 
classification intégrée des risques pour la santé humaine et l'environnement liés aux substances chimiques (Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), adopté 
par la vingt-huitième réunion conjointe du comité sur les produits chimiques et 
du groupe de travail sur les produits chimiques, les pesticides et la biotechnolo ­
gie, en novembre 1998 (2).
 
Si cette démarche expérimentale séquentielle ne fait pas partie intégrante de la 
méthode d'essai B.5, elle constitue cependant la procédure recommandée pour 
déterminer l'effet irritant ou corrosif sur les yeux. Cette procédure représente à la 
fois la meilleure pratique et une référence éthique dans ce domaine. La méthode d'essai décrit le mode opératoire de l'essai in vivo et récapitule les facteurs à prendre en considération avant d'envisager un tel essai. La démarche séquentielle 
préconise une analyse de la valeur probante des données existantes concernant les 
propriétés d'irritation ou de corrosion oculaires des substances et présente les différentes étapes permettant d'obtenir des données pertinentes sur les substances qui nécessitent d'autres études ou qui n'ont pas encore été étudiées. Elle préco ­
nise, dans un premier temps, la réalisation des essais in vivo ou ex vivo validés 
et acceptés, et ensuite, dans certaines circonstances, la mise en œuvre des études d'irritation/corrosion cutanée de la méthode d'essai B.4 (3) (4).
 
DESCRIPTION DE LA DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE SÉQUEN ­
TIELLE  
Avant d'entreprendre les essais inscrits dans la démarche expérimentale séquen ­
tielle (figure), il faut évaluer toutes les informations disponibles afin d'établir la nécessité d'effectuer des essais oculaires in vivo. Bien que l'évaluation de certains 
paramètres particuliers puisse livrer des informations significatives (par exemple 
un pH extrême), la totalité des informations existantes doit être prise en consi ­
dération. L'analyse de la valeur probante des résultats portera sur toutes les données pertinentes concernant les effets de la substance en question et de ses 
analogues; elle débouchera sur une décision qui devra être justifiée. Il conviendra 
d'accorder une place prépondérante aux données se rapportant aux humains et aux animaux, et d'examiner ensuite les résultats des essais in vitro ou ex vivo sur la substance. Les essais in vivo de substances corrosives devront être évités 
chaque fois que cela est possible. Les facteurs pris en compte dans la démarche 
expérimentale sont repris ci-après:
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Évaluation des données existantes sur les humains et les animaux (étape 1).  Les 
données existantes sur l'être humain, notamment études cliniques, études sur les 
conditions de travail et rapports se rapportant à ces études, et/ou les résultats d'essais réalisés sur des animaux dans le cadre d'études oculaires sont à examiner en premier, car ils livrent des informations directement liées aux effets sur les 
yeux. Il convient ensuite d'évaluer les résultats des études d'irritation/corrosion 
cutanée menées sur l'homme et/ou l'animal. Les substances ayant un pouvoir avéré d'irritation ou de corrosion oculaires, de même que les substances qui provoquent une irritation ou corrosion cutanées ne doivent pas être instillées 
dans les yeux des animaux; ces dernières substances sont à considérer comme 
étant également corrosives et/ou irritantes pour les yeux. Les substances dont le caractère non corrosif et non irritant a été démontré de manière suffisante par des études oculaires antérieures ne doivent pas non plus faire l'objet d'essais in vivo 
sur l'œil.
 
Analyse des relations structure-activité (RSA) (étape 2).  Le cas échéant, les 
résultats d'essais sur des substances structurellement proches doivent être pris en considération. S'il existe suffisamment de données relatives aux humains 
et/ou aux animaux sur des substances structurellement proches ou sur des 
mélanges de ces substances pour attester leur pouvoir corrosif ou irritant sur les yeux, on peut supposer que la substance étudiée provoquera les mêmes réactions. Auquel cas, il n'est plus forcément nécessaire de tester la substance. 
Des résultats négatifs lors d'études de substances structurellement proches ou de 
mélanges de ces substances ne constituent pas une preuve suffisante de l'effet non corrosif ou non irritant d'une substance dans le cadre de la démarche expé ­
rimentale séquentielle. On déterminera le pouvoir corrosif ou irritant pour la peau 
et pour l'œil en appliquant une méthode d'analyse RSA validée et acceptée.
 
Propriétés physico-chimiques et réactivité chimique (étape 3).  Les substances 
présentant des valeurs de pH extrêmes, par exemple < 2,0 ou ≥ 11,5, sont 
susceptibles d'induire de fortes réactions locales. Si une valeur de pH extrême 
est un indice décisif quant au caractère corrosif ou irritant d'une substance pour 
l'œil, son pouvoir tampon doit également entrer en ligne de compte (3) (4). Si le pouvoir tampon donne à penser que la substance peut ne pas être corrosive pour l'œil, cette hypothèse demande à être confirmée par un autre essai, de préférence 
un essai in vitro ou ex vivo validé et accepté (voir étapes 5 et 6).
 
Prise en compte des autres informations existantes (étape 4).  Toutes les infor ­
mations disponibles concernant la toxicité systémique par voie cutanée doivent être évaluées à ce stade. Il convient également d'évaluer la toxicité cutanée aiguë 
de la substance d'essai. Si la substance d'essai s'est révélée très toxique par voie 
cutanée, il n'est pas nécessaire de la tester sur les yeux. Même s'il n'y a pas nécessairement de lien entre la toxicité cutanée aiguë et l'irritation/corrosion oculaire, on peut considérer que, si un agent est très toxique par voie cutanée, 
il entraînera également une toxicité élevée en cas d'instillation dans l'œil. Ces 
données peuvent aussi être prises en considération entre les étapes 2 et 3.
 
Résultats des essais in vitro ou ex vivo (étapes 5 et 6).  Il est inutile de tester sur 
des animaux les substances dont le pouvoir fortement irritant ou corrosif a été mis en évidence par un essai in vitro ou ex vivo validé et accepté (7) (8) pour 
l'évaluation spécifique de l'irritation/corrosion oculaire ou cutanée. Il est en effet 
très vraisemblable que ces substances produiront des effets semblables in vivo. S'il n'existe pas d'essais in vitro/ex vivo validés et acceptés, il convient de passer 
directement à l'étape 7 en ignorant les étapes 5 et 6.
 
Évaluation in vivo du pouvoir irritant ou corrosif de la substance sur la peau 
(étape 7).  S'il n'existe pas suffisamment d'éléments pour déterminer de façon 
concluante le pouvoir d'irritation/corrosion oculaire d'une substance à partir des résultats des études susmentionnées, ce pouvoir doit être évalué en premier lieu 
in vivo, suivant la méthode d'essai B.4 (4) et son annexe (9). S'il apparaît que la 
substance provoque une corrosion ou une forte irritation cutanée, il y a lieu de la considérer comme corrosive ou irritante pour l'œil, à moins que d'autres éléments ne tendent à prouver le contraire. Auquel cas, un essai oculaire in vivo ne serait 
pas nécessaire. Si la substance n'est pas corrosive ni très irritante pour la peau, il 
y a lieu de pratiquer un essai oculaire in vivo.
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Essai in vivo sur des lapins (étapes 8 et 9):  l'étude oculaire in vivo doit débuter 
par un essai initial réalisé sur un seul animal. Si les résultats de cet essai 
indiquent que la substance est très irritante ou corrosive pour l'œil, il ne faut pas poursuivre les essais. Si cet essai ne fait apparaître aucun effet de corrosion ni d'irritation marquée, un essai confirmatoire est pratiqué sur deux animaux 
supplémentaires.
 
BIBLIOGRAPHIE  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 
24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161- 177.  
(4) Méthode d'essai B.4. Toxicité aiguë: irritation/corrosion cutanée.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
p. 227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, PA, Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in 
Vitro 12, p. 483-524.
 
(8) Méthode d'essai B.40. Corrosion cutanée.  
(9) Annexe à la méthode d'essai B.4. Démarche expérimentale séquentielle pour 
les essais d'irritation et de corrosion cutanées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 263
 
Figure  
PROCÉDURE D'ESSAI ET D'ÉVALUATION DE L'IRRITATION ET DE LA 
CORROSION OCULAIRES
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 265
 
B.6. SENSIBILISATION CUTANÉE  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Remarques  
La sensibilité des essais et leur capacité à détecter les substances 
susceptibles d'entraîner une sensibilisation cutanée chez l'homme sont des critères importants dans un système de classification de la 
toxicité établi à des fins de santé publique.
 
Il n'existe pas de méthode d'essai unique qui permette d'identifier de 
manière adéquate toutes les substances ayant un potentiel de sensi ­
bilisation cutanée pour l'homme et qui puisse être appliquée à toutes 
les substances.  
Divers facteurs tels que les caractéristiques physiques d'une subs ­
tance, y compris son pouvoir de pénétration cutanée, doivent être pris en considération lors du choix de l'essai.
 
Deux types d'essai utilisant des cobayes ont été développés: d'une 
part, les essais avec adjuvant dans lesquels l'état est potentialisé par la dissolution ou la mise en suspension dans de l'adjuvant complet de Freund (ACF) de la substance à tester, et d'autre part les essais sans 
adjuvant.
 
Les essais avec adjuvant ont généralement un meilleur pouvoir 
prédictif du potentiel sensibilisant cutanée de la substance testée 
avec plus de précision que les méthodes qui n'utilisent pas l'adjuvant 
complet de Freund. C'est la raison pour laquelle leur utilisation est préférable.
 
L'essai de maximalisation chez le cobaye (GPMT: Guinea Pig Maxi ­
misation Test) est un essai avec adjuvant très répandu. Bien qu'il 
existe plusieurs autres méthodes pour détecter le potentiel de sensi ­
bilisation cutanée, le GPMT est l'essai avec adjuvant de prédilection.  
Les essais sans adjuvant (l'essai de Buehler étant préférable) sont 
considérés comme moins sensibles vis-à-vis de nombreuses classes 
de produits chimiques.  
Dans certains cas, l'essai de Buehler qui consiste en une application 
topique, peut s'avérer préférable à l'essai de maximalisation qui 
nécessite une injection intradermique. L'utilisation de l'essai de Buehler doit être scientifiquement justifiée.
 
L'essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT) et l'essai de 
Buehler sont décrits dans cette méthode. D'autres méthodes 
peuvent être utilisées, à condition qu'elles soient correctement vali ­
dées et que leur utilisation soit scientifiquement justifiée.  
Si un résultat positif est obtenu dans un test de dépistage reconnu, 
une substance peut être considérée comme un sensibilisant potentiel 
et il peut ne pas être nécessaire de réaliser un essai complémentaire sur le cobaye. Cependant si un résultat négatif est obtenu dans un tel test de dépistage, un essai sur le cobaye doit être effectué en utilisant 
la procédure décrite dans la présente méthode d'essai.
 
Voir également introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 266
 
1.2. DÉFINITIONS  
La sensibilisation cutanée  (dermite allergique de contact) est une 
réaction immunologique cutanée à une substance. Chez l'homme, la réaction peut se caractériser par un prurit, un érythème, un 
œdème, des vésicules, des bulles ou une association de ces manifes ­
tations. Dans les autres espèces, la réaction peut différer et prendre uniquement la forme d'un érythème ou d'un œdème.
 
Exposition d'induction : exposition expérimentale d'un sujet à une 
substance dans le but d'induire une hypersensibilité.  
Période d'induction : période d'au moins une semaine consécutive à 
l'exposition d'induction, au cours de laquelle une hypersensibilité peut s'installer.
 
Exposition de déclenchement : exposition expérimentale, après 
période d'induction, d'un sujet préalablement exposé à la substance, dans le but de vérifier si le sujet présente une réaction d'hypersen ­
sibilité.
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
La sensibilité et la fiabilité de la technique expérimentale utilisée 
doivent être vérifiées tous les six mois à l'aide de substances ayant 
des propriétés connues de sensibilisation cutanée faible à modérée.  
Pour un essai conduit selon les règles, les substances faiblement ou 
moyennement sensibilisantes provoquent normalement une réaction d'au moins 30 % dans les méthodes avec adjuvant et 15 % dans les 
méthodes sans adjuvant.
 
Les substances suivantes seront de préférence utilisées:  
Numéro CAS Numéro EINECS Dénomination EINECS Dénomination usuelle  
101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldéhyde α-hexylcinnamaldéhyde 
149-30-4 205-736-8 benzothiazole-2-thiol (mercap ­
tobenzothiazole) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzocaïne nordcaïne  
Dans certaines circonstances dûment justifiées, il est possible d'uti ­
liser d'autres substances répondant aux critères ci-dessus.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Les animaux d'expérience sont dans un premier temps exposés à la 
substance à tester par une injection intradermique et/ou une applica ­
tion épidermique (exposition d'induction). Après une période de repos de 10 à 14 jours (période d'induction) au cours de laquelle 
une réaction immunitaire peut se produire, les animaux sont exposés 
à une dose de déclenchement. L'étendue et le degré de la réaction cutanée des animaux sont alors comparées à celles de la réaction observée chez les animaux témoins qui ont reçu un placebo lors de 1 
induction et qui ont été soumis à l'exposition de déclenchement.
 
1.5. DESCRIPTION DES MÉTHODES D'ESSAI  
Si l'élimination de la substance à tester s'avère nécessaire, ceci doit 
être fait en utilisant de l'eau ou un solvant approprié afin de ne pas 
modifier la réaction existante ou l'intégrité de l'épiderme.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 267
 
1.5.1.  Essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT)  
1.5.1.1. P r é p a r a t i o n  
De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du 
laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai. 
Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et 
lots témoins. Les poils sont tondus, rasés ou épilés chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas érafler la peau. Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai.
 
1.5.1.2. C o n d i t i o n s d e l ' e s s a i  
1.5.1.2.1. Animaux d'expérience  
Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire.  
1.5.1.2.2. Nombre et sexe  
On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise 
des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides.  
Le lot traité comprend au minimum 10 animaux et le lot témoin, au 
moins 5. Si le lot traité comprend moins de 20 animaux et le lot 
témoin moins de 10, et qu'il n'est pas possible de conclure que la 
substance à tester est un agent sensibilisant. Dans ce cas, il est fortement recommandé d'utiliser d'autres animaux afin d'arriver à un total d'au moins 20 animaux d'essai et 10 animaux témoins.
 
1.5.1.2.3. Doses  
La concentration de substance utilisée pour chaque exposition d'in ­
duction doit être bien tolérée par l'organisme des animaux et doit 
correspondre à la concentration maximale entraînant une irritation cutanée légère à modérée. La concentration utilisée pour l'exposition 
de déclenchement doit correspondre à la concentration maximale 
n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appro ­
priées peuvent être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois animaux. À cet effet, il convient d'utiliser des animaux 
traités par l'adjuvant complet de Freund.
 
1.5.1.3. M o d e o p é r a t o i r e  
1.5.1.3.1. Induction  
Jour 0 — lot traité  
Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml 
chacune sont pratiquées dans la région scapulaire préalablement débarrassée de ses poils, de part et d'autre de la ligne médiane.
 
Injection 1: mélange 1:1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou 
sérum physiologique  
Injection 2: la substance à tester dans un véhicule adéquat, à la 
concentration sélectionnée  
Injection 3: la substance à tester à la concentration voulue, mélangée 
dans un rapport 1:1 (v/v) à de l'adjuvant complet de Freund ou du 
sérum physiologique.  
Pour l'injection 3, les substances hydrosolubles sont dissoutes dans la 
phase aqueuse avant d'être mélangées avec l'adjuvant complet de Freund. Les substances liposolubles ou insolubles sont d'abord mises en suspension dans 1 adjuvant complet de Freund, puis 
mises en phase aqueuse. La concentration finale de la substance à 
tester doit être égale à celle utilisée pour l'injection 2.
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Les injections 1 et 2 sont pratiquées à proximité l'une de l'autre et le 
plus près possible de la tête, tandis que l'injection 3 est effectuée vers 
la partie caudale de la zone d'essai.  
Jour 0 — lot témoin  
Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml 
chacune sont réalisées aux mêmes endroits que chez les animaux 
traités.  
Injection 1: mélange 1:1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou 
sérum physiologique  
Injection 2: le véhicule non dilué  
Injection 3: formulation à 50 % du véhicule dans un mélange 1:1 
d'adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique.  
5 e — 7  e jour — lot traité et lot témoin  
Environ 24 heures avant l'application topique d'induction et si la 
substance ne provoque pas d'irritation cutanée, la zone d'essai 
rasée et/ou tondue est badigeonnée avec 0,5 ml de lauryl sulfate 
de sodium à 10 % dans de la vaseline, afin de créer une irritation locale.
 
6 e — 8  e jour — lot traité  
La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Un papier 
filtre (2 x 4 cm) imprégné de la substance dans le véhicule approprié est appliqué sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau à l'aide d'un pansement occlusif pendant 48 heures. Le choix du véhi ­
cule doit être justifié. Les substances solides sont réduites en poudre 
fine et incorporées dans un véhicule approprié; les substances liquides peuvent éventuellement être appliquées directement.
 
6 e — 8  e jour — lot témoin  
La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Le véhicule 
seul est appliqué comme indiqué précédemment sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau pendant 48 heures à l'aide d'un pansement occlusif.
 
1.5.1.3.2. Déclenchement  
20 e — 22  ème jour — lot traité et lot témoin  
Les flancs des animaux traités et des animaux témoins sont débar ­
rassés de leurs poils. Un patch ou une cupule chargés de la substance 
à tester est appliquée sur un des flancs des animaux et, s'il y a lieu, 
un patch ou une cupule imprégnés uniquement du véhicule est appli ­
quée sur l'autre flanc. Les pastilles sont maintenues en contact avec la peau pendant 24 heures à l'aide d'un pansement occlusif.
 
1.5.1.3.3. Observation et cotation: lot traité et lot témoin  
— Environ 21 heures après le retrait de la pastille, la zone étudiée 
est nettoyée et rasée et/ou tondue et épilée si nécessaire;  
— 3 heures plus tard environ (à peu près 48 heures après le début 
de l'application de déclenchement), la réaction cutanée est 
observée et cotée d'après l'échelle indiquée en annexe;  
— environ 24 heures après cette observation, on procède à 
une seconde observation (72 heures) et à une nouvelle cotation.  
Il est recommandé de procéder à une lecture en aveugle chez les 
animaux traités et les animaux témoins.  
S'il est nécessaire de préciser les résultats obtenus lors de la première 
exposition de déclenchement, une seconde exposition de déclenche ­
ment (c'est-à-dire redéclenchement), si nécessaire avec un nouveau lot témoin, sera envisagée environ une semaine après la première 
exposition. La nouvelle exposition de déclenchement peut également 
être effectuée sur le lot témoin initial.
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Toutes les réactions cutanées et toutes les observations inhabituelles, 
y compris les réactions systémiques, résultant d'une exposition d'in ­
duction ou de déclenchement, doivent être observées et cotées d'après l'échelle de Magnusson/Kligman (voir annexe). D'autres tech ­
niques telles qu'un examen histopathologique ou la mesure de 
l'épaisseur du pli cutané peuvent être utilisées pour préciser les réac ­
tions douteuses.
 
1.5.2.  Essai de Buehler  
1.5.2.1. P r é p a r a t i o n  
De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du 
laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai. Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et lots témoins. Les poils sont coupés, rasés ou éventuellement épilés 
chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas 
érafler la peau. Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai.
 
1.5.2.2. C o n d i t i o n s d e l ' e s s a i  
1.5.2.2.1. Animaux d'expérience  
Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire.  
1.5.2.2.2. Nombre et sexe  
On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise 
des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides.  
Le lot traité comprend au minimum 20 animaux et le lot témoin, au 
moins 10.  
1.5.2.2.3. Doses  
Pour chaque exposition d'induction, la concentration de substance à 
utiliser est la concentration maximale entraînant une irritation 
modérée mais non excessive. Pour l'exposition de déclenchement, la concentration à utiliser est la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appropriées peuvent 
être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois 
animaux.
 
Pour les substances hydrosolubles, il convient d'utiliser comme véhi ­
cule de l'eau ou une solution diluée non irritante de surfactant. Pour les autres substances, il est préférable d'utiliser un mélange d'éthanol à 80 % dans de l'eau pour l'induction, et de l'acétone pour le déclen ­
chement.
 
1.5.2.3. M o d e o p é r a t o i r e  
1.5.2.3.1. Induction  
Jour 0 — lot traité  
Un des flancs des animaux est rasé. La compresse servant à réaliser 
le test est imprégnée de la substance à tester incorporée dans un 
véhicule approprié (le choix du véhicule doit être justifié; les subs ­
tances liquides peuvent au besoin être appliquées directement). La compresse est appliquée sur la zone d'essai et maintenue en contact 
avec la peau pendant 6 heures à l'aide d'un pansement occlusif ou 
d'une cupule et d'un pansement approprié.
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Le système doit être occlusif. Un tampon de ouate rond ou carré de 4 
à 6 cm  2 convient. Il est préférable d'utiliser un dispositif de conten ­
tion approprié pour garantir l'occlusion. Si l'on utilise des bandages, des expositions supplémentaires peuvent s'avérer nécessaires.
 
Jour 0 — lot témoin  
Un des flancs des animaux est rasé. Le véhicule seul est appliqué de 
la façon décrite pour les animaux traités. La compresse servant à 
réaliser le test est maintenue en contact avec la peau pendant 6 
heures à l'aide d'un pansement occlusif ou d'une cupule et d'un pansement approprié. S'il peut être prouvé qu'il n'est pas nécessaire de simuler le traitement sur le lot témoin, cette étape peut être omise, 
un contrôle ne recevant rien peut être utilisé.
 
6 e — 8  e jour et 13  e — 15  e jour — lot traité et lot témoin  
La même application que celle décrite au jour 0 est réalisée sur la 
même zone (débarrassée de ses poils si nécessaire) du même flanc au 6
 e — 8  e jour, puis à nouveau au 13  e — 15  e jour. 
1.5.2.3.2. Déclenchement  
27 e — 29  e jour — lot traité et lot témoin  
Le flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin est rasé. 
Une compresse occlusive ou une cupule contenant la quantité appro ­
priée de la substance à tester, à la concentration maximale n'entraî ­
nant pas d'irritation, est appliquée sur la partie postérieure du flanc 
non traité des animaux du lot traité et du lot témoin.  
S'il y a lieu, on appliquera également une compresse occlusive ou 
une cupule ne contenant que le véhicule sur la partie antérieure du 
flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin. Les 
compresses ou cupules sont maintenues en contact avec la peau à l'aide d'un pansement approprié pendant 6 heures.
 
1.5.2.3.3. Observations et cotation  
— Environ 21 heures après le retrait de la compresse, la zone d'essai 
est débarrassée de ses poils;  
— environ trois heures plus tard (à peu près 30 heures après le 
début de l'exposition de déclenchement), la réaction cutanée est observée et cotée d'après l'échelle indiquée en annexe;
 
— environ 24 heures après cette observation (soit environ 54 heures 
après l'exposition de déclenchement), la réaction cutanée est à nouveau observée et cotée.
 
Il est recommandé d'effectuer une lecture en aveugle de la réaction 
dans le lot traité et le lot témoin.  
S'il est nécessaire de préciser les résultats obtenus lors de la première 
exposition de déclenchement, une seconde exposition de déclenche ­
ment, si nécessaire avec un nouveau lot témoin, sera envisagée environ une semaine après la première exposition. La nouvelle expo ­
sition de déclenchement peut également être effectuée sur le lot 
témoin initial.
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Toutes les réactions cutanées et toutes les observations inhabituelles, 
y compris les réactions systémiques, résultant d'une exposition d'in ­
duction ou de déclenchement (c'est-à-dire de redéclenchement), doivent être consignées et cotées d'après l'échelle de Magnusson/ Kligman (voir annexe). D'autres techniques telles qu'un examen 
histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané 
peuvent être utilisées pour préciser les réactions douteuses.
 
2. RÉSULTATS (GMPT ET ESSAI DE BUEHLER)  
Les résultats sont récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour 
chaque animal, la réaction cutanée lors de chaque observation.  
3. COMPTE RENDU (GMPT ET ESSAI DE BUEHLER)  
Lorsqu'un test de dépistage [par exemple essai local sur ganglions 
lymphatiques (LLNA), essai de gonflement de l'oreille de souris 
(MEST)], est effectué préalablement à l'essai sur le cobaye, il 
convient d'en fournir la description ou la référence, ainsi que les détails du mode opératoire et les résultats obtenus avec la substance à tester et les substances de référence.
 
Procès-verbal d'essai (GMPT et essai de Buehler)  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
Animaux d'expérience:  
— souche de cobayes utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'essai.  
Conditions expérimentales:  
— technique de préparation du site d'application,  
— détails sur les matériaux utilisés pour l'application et la technique 
d'application,  
— résultats de l'étude pilote et conclusions concernant les concen ­
trations d'induction et de déclenchement à utiliser dans l'essai,  
— détails concernant la préparation, l'application et l'élimination de 
la substance à tester,  
— justification du choix du véhicule,  
— concentrations du véhicule et de la substance à tester utilisées 
pour les expositions d'induction et de déclenchement, et quantité 
totale de substance appliquée pour l'induction et le déclenche ­
ment.  
Résultats:  
— résumé des résultats du dernier contrôle de sensibilité et de fiabi ­
lité (voir 1.3), y compris informations sur la substance, la 
concentration et le véhicule utilisés,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 272
 
— toute observation effectuée sur chaque animal, cotations 
comprises,  
— description de la nature et de la gravité des effets observés,  
— toute observation histopathologique.  
Discussion des résultats  
Conclusions  
4. RÉFÉRENCES  
Cette méthode reprend la ligne directrice 406 de l'OCDE.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 273
 
Appendice  
TABLEAU  
échelle de Magnusson et Kligman pour la cotation des réactions cutanées à 
une exposition de déclenchement  
0 = pas de modification apparente  
1 = érythème discret ou localisé  
2 = érythème modéré et confluent  
3 = érythème intense avec gonflement  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 274
 
B.7. ÉTUDE DE TOXICITÉ ORALE À DOSE RÉPÉTÉE PENDANT 28 
JOURS SUR LES RONGEURS  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 407 (2008) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La ligne directrice 407 
originale avait été adoptée en 1981. Des modifications y ont été apportées 
en 1995 afin de tirer davantage d’informations des animaux utilisés dans l’étude, en particulier en matière de neurotoxicité et d’immunotoxicité.
 
2. L’OCDE a lancé en 1998 une activité prioritaire destinée à réviser les lignes 
directrices existantes et à en élaborer de nouvelles pour les essais et le dépistage des perturbateurs endocriniens (8). L’un des objectifs était de mettre à jour la ligne directrice de l’OCDE relative à l’«étude de toxicité 
orale à dose répétée pendant 28 jours sur les rongeurs» (407), en y intro ­
duisant des paramètres capables de détecter l’activité endocrinienne des substances d’essai. Le protocole a alors fait l’objet d’un programme inter ­
national approfondi chargé d’évaluer la pertinence et la praticabilité de ces 
paramètres additionnels, leur performance pour des produits chimiques à activité (anti)œstrogénique, (anti)androgénique et (anti)thyroïdienne, leur reproductibilité intra- et inter-laboratoires et leur interférence avec les para ­
mètres requis par la version antérieure de la ligne directrice. Les très 
nombreuses données ainsi recueillies ont été rassemblées et évaluées en détail dans un rapport très complet de l’OCDE (9). La présente mise à jour de la méthode B.7 est le fruit de l’expérience et des résultats accumulés 
durant le programme international d’essais. Elle permet de mettre certains 
effets à médiation endocrinienne en perspective avec d’autres effets toxico ­
logiques.
 
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITATIVES  
3. Lors de l’appréciation et de l’évaluation des caractéristiques toxiques d’un 
produit chimique, la détermination de la toxicité orale à doses répétées peut 
s’effectuer après avoir obtenu des informations préliminaires sur la toxicité à partir d’essais de toxicité aiguë. La présente méthode d’essai vise à étudier les effets toxiques des produits chimiques sur un large spectre de cibles de 
toxicité. Elle fournit des informations sur les risques pour la santé que peut 
entraîner une exposition répétée durant une période de temps relativement limitée, notamment pour le système nerveux, le système immunitaire et le système endocrinien. Concernant ces critères d’effet précis, elle devrait 
permettre d’identifier des produits chimiques potentiellement neurotoxiques, 
pouvant justifier des études plus approfondies de cet aspect, etdes produits chimiques qui interfèrent avec la physiologie de la thyroïde. Elle pourrait 
également fournir des données sur les produits chimiques qui affectent les 
organes reproducteurs mâles et/ou femelles des jeunes animaux adultes et donner des indications sur leurs effets immunologiques.
 
4. Les résultats de la présente méthode d’essai B.7 devraient servir à l’identi ­
fication des dangers et à l’évaluation des risques. Les résultats obtenus concernant les paramètres endocriniens devraient être interprétés à la lumière du «Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation 
des produits chimiques perturbant le système endocrinien» (11). La méthode 
prévoit une étude basique de toxicité à dose répétée, pouvant être utilisée sur les produits chimiques pour lesquels une étude de 90 jours n’est pas justifiée (par exemple quand le volume de production ne dépasse pas certaines 
limites) ou préalablement à une étude à long terme. La durée d’exposition 
doit être de 28 jours.
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5. Le programme international mené afin de valider les paramètres susceptibles 
de détecter l’activité endocrinienne d’une substance d’essai a montré que la 
qualité des données obtenues grâce à cette méthode d’essai B.7 dépendra beaucoup de l’expérience du laboratoire pratiquant les essais. Ce constat concerne spécifiquement la détermination histopathologique de changements 
cycliques dans les organes reproducteurs femelles et la détermination du 
poids des petits organes hormono-dépendants, difficiles à disséquer. Un document d’orientation a été élaboré en matière d’histopathologie (19). Il est disponible sur le site de l’OCDE à la rubrique consacrée aux lignes 
directrices pour les essais de produits chimiques. Il vise à aider les patho ­
logistes dans leurs investigations et à améliorer la sensibilité des essais. Un certain nombre de paramètres ont été identifiés comme indicateurs de toxi ­
cité endocrinienne et ont été ajoutés à la méthode d’essai. D’autres, dont 
l’utilité n’a pu être prouvée faute de données suffisantes ou dont la capacité 
à détecter les perturbateurs endocriniens a été insuffisamment démontrée par le programme de validation, sont proposés comme paramètres facultatifs (voir appendice 2).
 
6. Sur la base des données produites par le processus de validation, il convient 
de souligner que la sensibilité de cet essai est insuffisante pour identifier 
toutes les substances présentant une action (anti)androgénique ou (anti)œs ­
trogénique (9). La présente méhtode d’essai ne s’applique pas à un stade de vie très sensible aux perturbations endocriniennes. Elle a pourtant permis, pendant le processus de validation, d’identifier des substances affectant 
faiblement ou fortement la fonction thyroïdienne, ainsi que des substances 
agissant fortement ou modérément sur le système endocrinien par le biais des récepteurs aux œstrogènes et aux androgènes, mais dans la plupart des cas, n’est pas parvenue à identifier les substances agissant sur le système 
endocrinien en affectant faiblement ces récepteurs. Ainsi ne peut-elle être 
décrite comme un essai de dépistage de l’activité endocrinienne.
 
7. Par conséquent, l’absence d’effet lié à ces modes d’action ne peut constituer 
une preuve de l’absence d’effet sur le système endocrinien. En ce qui 
concerne les effets à médiation endocrinienne, la caractérisation des subs ­
tances ne doit donc pas s’appuyer uniquement sur les résultats de la présente méthode d’essai, mais doit être utilisée dans le cadre d’une démarche fondée 
sur le «poids de la preuve», combinant toutes les données existant sur un 
produit chimique pour caractériser son action potentielle sur le système endocrinien. C’est pourquoi la prise de décision réglementaire sur l’activité endocrinienne des produits chimiques (caractérisation des substances) doit 
adopter une méthode large ne s’appuyant pas sur les résultats de cette seule 
méthode d’essai.
 
8. Il est entendu que toutes les procédures d’essai utilisant des animaux obéi ­
ront aux normes locales en vigueur sur le traitement à leur réserver; la description des soins et traitements prodigués aux animaux utilisés dans le présent essai correspond donc à des normes de performance minimales qui 
seront le cas échéant adaptées à la législation locale si celle-ci est plus 
stricte. D’autres recommandations sur l’humanité du traitement à réserver aux animaux ont été formulées par l’OCDE (14).
 
9. L’appendice 1 présente les définitions utilisées.  
PRINCIPE DE L’ESSAI  
10. La substance à tester est administrée quotidiennement par voie orale à 
différents niveaux de dose à plusieurs groupes d’animaux, à raison d’un 
niveau de dose par groupe, pendant une période de 28 jours. Chaque jour 
au cours de cette période, les animaux sont examinés soigneusement afin de déceler tout signe de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont eutha ­
nasiés au cours de l’essai sont autopsiés et, au terme de l’essai, les animaux 
survivants sont également euthanasiés et autopsiés. Une étude de 28 jours 
fournit des informations sur les effets d’une exposition répétée par voix
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 276
 
orale et peut indiquer la nécessité d’études ultérieures plus longues. Elle 
peut également apporter des informations sur la sélection des concentrations 
en vue d’études plus poussées. Les données tirées de l’application de la méthode d’essai devraient permettre de caractériser la toxicité de la subs ­
tance d’essai, d’avoir une indication sur la relation dose réponse et de 
déterminer la concentration sans effet nocif observé (CSENO).
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Sélection de l’espèce animale  
11. L’espèce de rongeur préférée est le rat, bien que d’autres espèces de 
rongeurs puissent être utilisées. Si les paramètres spécifiés dans la méthode d’essai B.7 sont étudiés sur une autre espèce de rongeur, une 
justification détaillée devra être donnée. Bien qu’il soit biologiquement 
plausible que d’autres espèces répondent aux produits toxiques de manière similaire au rat, l’utilisation d’espèces plus petites peut provoquer une varia ­
bilité accrue compte tenu de la difficulté technique à disséquer des organes 
de plus petite taille. Le rat a été la seule espèce utilisée lors du programme 
international de validation des paramètres pour la détection des perturbateurs endocriniens. Il convient d’employer de jeunes animaux adultes sains issus de souches de laboratoire courantes. Les femelles doivent être nullipares et 
non gravides. L’administration doit commencer dès que possible après le 
sevrage et, dans tous les cas, avant l’âge de neuf semaines. Au début de l’étude, les différences de poids entre les animaux utilisés doivent être 
minimales et ne pas excéder ± 20 % de la moyenne du poids pour 
chaque sexe. Lorsque l’essai est conduit à titre d’étude préliminaire à une étude de toxicité à long terme, il est préférable d’utiliser des animaux issus de la même souche et de la même source dans les deux études.
 
Encagement et alimentation  
12. Toutes les procédures doivent respecter les normes locales en vigueur sur le 
traitement des animaux de laboratoire. La température dans le local d’expé ­
rimentation doit être de 22 °C (± 3 °C). L’humidité relative doit être d’au 
moins 30 % et si possible ne pas dépasser 70 %, excepté pendant le 
nettoyage de la pièce, l’idéal étant 50-60 %. Pour l’éclairage, on doit utiliser la lumière artificielle et respecter une séquence de 12 heures d’éclairement et 
12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire peut être un régime classique 
de laboratoire avec eau potable à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être influencé par la nécessité d’assurer un mélange convenable de la substance d’essai, lorsqu’elle est administrée dans la nourriture. Les 
animaux doivent être encagés par petits groupes du même sexe; ils 
peuvent être encagés individuellement si une nécessité scientifique le justifie. Pour l’encagement de groupe, il convient de ne pas dépasser cinq animaux par cage.
 
13. La nourriture doit être analysée régulièrement à la recherche de contami ­
nants. Un échantillon en sera conservé jusqu’à la finalisation du rapport.  
Préparation des animaux  
14. De jeunes animaux adultes sains sont répartis au hasard entre le groupe 
témoin et les groupes traités. Les cages doivent être placées de façon à 
réduire au minimum l’influence éventuelle de leur disposition sur les résul ­
tats. Les animaux sont identifiés individuellement et placés dans les cages au moins cinq jours avant le début de l’étude, pour leur permettre de s’accli ­
mater aux conditions du laboratoire.
 
Préparation des doses  
15. La substance d’essai est administrée par gavage ou dans la nourriture ou 
l’eau de boisson, la méthode étant choisie en fonction de l’objectif de 
l’étude et des propriétés physico-chimiques, toxiques et cinétiques de la 
substance d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 277
 
16. Lorsque cela s’avère nécessaire, la substance d’essai est dissoute ou mise en 
suspension dans un véhicule adéquat. On recommande, de privilégier, dans 
la mesure du possible, l’utilisation d’une solution ou d’une suspension aqueuse. À défaut, on peut utiliser une solution ou une suspension dans l’huile (par exemple l’huile de maïs) et finalement une solution dans d’au ­
tres véhicules. La toxicité des véhicules autres que l’eau doit être connue. La 
stabilité de la substance d’essai dans le véhicule doit être déterminée.
 
PROTOCOLE  
Nombre et sexe des animaux  
17. Au moins 10 animaux (5 femelles et 5 mâles) doivent être utilisés pour 
chaque dose. Si on envisage d’euthanasier des animaux au cours de l’essai, il faut accroître le nombre d’animaux d’expérience du nombre d’animaux euthanasiés avant la fin de l’épreuve. On envisagera d’inclure un groupe 
satellite supplémentaire de 10 animaux (5 par sexe) dans le groupe témoin et 
dans le groupe traité à la plus forte dose, afin d’observer la réversibilité, la persistance, ou l’apparition tardive des effets toxiques, au moins 14 jours après le traitement.
 
Dosage  
18. De manière générale, au moins trois groupes d’essai et un groupe témoin 
doivent être utilisés, mais si d’après l’évaluation des autres données aucun 
effet n’est attendu à la dose de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, un essai limite peut être réalisé. S’il n’existe aucune donnée préalable, une étude préliminaire (animaux de la même souche et de la même provenance) 
peut être menée pour faciliter la détermination des doses à utiliser. Excep ­
tion faite de l’exposition avec la substance à tester, les animaux du groupe témoin doivent être traités d’une manière identique à ceux des groupes d’essai. Si un véhicule est employé pour administrer la substance d’essai, 
on administrera au groupe témoin le plus grand volume de véhicule utilisé.
 
19. Les niveaux de dose doivent être déterminés en tenant compte de toutes les 
informations disponibles concernant les propriétés toxiques ou 
toxico-cinétiques de la substance d’essai ou de substances analogues. La 
dose la plus élevée doit provoquer des effets toxiques, sans être létale ou causer de sévères souffrances. Une séquence de doses décroissantes doit ensuite être sélectionnée en vue de mettre en évidence tout effet lié à la 
dose ainsi qu’une concentration sans effet nocif observé (CSENO) à la dose 
la plus faible. Des intervalles correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropriés entre les doses décroissantes et l’inclusion d’un quatrième groupe d’essai est souvent préférable à la fixation de très 
grands intervalles (par exemple un facteur supérieur à 10) entre les doses.
 
20. En cas d’observation d’une toxicité générale (par exemple réduction du 
poids corporel, effets sur le foie, le cœur, les poumons ou les reins, etc.) 
ou d’autres modifications susceptibles de ne pas constituer une réponse 
toxique (par exemple diminution de la prise de nourriture, grossissement du foie), les effets observés sur les paramètres neurologiques, endocriniens ou liés au système immunitaire, devront être interprétés avec précaution.
 
Essai limite  
21. Si un essai pratiqué avec une seule dose d’au moins 1 000 mg/kg de poids 
corporel/jour, ou, pour une administration par le biais de la nourriture ou de 
l’eau, d’un pourcentage équivalent de cette nourriture ou de cette eau (en fonction de la détermination du poids corporel), en suivant le mode opéra ­
toire décrit pour cette étude, ne produit aucun effet toxique observable et s’il 
n’y a pas de raison de penser que la substance soit toxique compte tenu des 
données dont on dispose au sujet de substances ayant une structure analogue, on peut considérer qu’il n’est pas nécessaire de réaliser une étude complète avec trois niveaux de dose. L’essai limite s’applique, sauf 
lorsque les données d’exposition humaine indiquent la nécessité d’utiliser 
une dose plus élevée.
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Administration des doses  
22. La substance d’essai est administrée aux animaux quotidiennement, sept 
jours sur sept, sur une période de 28 jours. Lorsque la substance d’essai est administrée par gavage, les animaux doivent recevoir une dose unique, 
introduite au moyen d’une sonde gastrique ou d’une canule d’intubation 
appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l’animal d’expérience. Ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas des solutions 
aqueuses où il peut aller jusqu’à 2 ml/100 g de poids corporel. Exception 
faite des substances irritantes ou corrosives, qui provoqueront normalement des effets exacerbés aux concentrations plus élevées, il convient de réduire 
au minimum la variabilité du volume d’essai en ajustant la concentration 
pour obtenir un volume constant à toutes les doses.
 
23. Si la substance d’essai est administrée dans les aliments ou l’eau de boisson, 
il importe de s’assurer que sa quantité n’interfère ni avec la nutrition 
normale ni avec l’équilibre hydrique. Lorsque la substance d’essai est incor ­
porée aux aliments, deux possibilités sont offertes: soit le maintien d’une concentration constante dans les aliments (ppm), soit le maintien d’un 
niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux; il y a 
lieu de préciser l’option choisie. Si la substance est administrée par gavage, la dose doit être administrée à la même heure chaque jour et ajustée si nécessaire pour rester constante par rapport au poids corporel de l’animal. 
Lorsqu’une étude à doses répétées sert de d’étude préliminaire à une étude 
de toxicité à long terme, il faut applique le même régime alimentaire dans les deux études.
 
Observations  
24. La période d’observation doit durer 28 jours. Les animaux d’un groupe 
satellite destinés à des observations ultérieures ne doivent recevoir aucun 
traitement pendant au moins 14 jours en vue de détecter d’éventuels effets toxiques différés ou persistants, ou de mettre en évidence le rétablissement 
des animaux traités.
 
25. Les animaux doivent faire l’objet d’un examen clinique général au moins 
une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considé ­
ration la période où les effets prévus devraient être les plus marqués après 
l’administration. L’état de santé des animaux doit être consigné. Au moins deux fois par jour, l’ensemble des animaux fait l’objet d’un constat de morbidité et de mortalité.
 
26. Tous les animaux doivent faire l’objet d’un examen clinique détaillé, une 
fois avant la première exposition (pour pouvoir effectuer des comparaisons 
sur un même individu), et ensuite au moins une fois par semaine. Ces 
observations doivent être effectuées hors de la cage habituelle, sur une aire standard, de préférence toujours au même moment de la journée. Elles doivent être soigneusement consignées, de préférence en utilisant un 
système de cotation, explicitement défini par le laboratoire qui réalise l’es ­
sai. Il faudrait s’efforcer de minimiser les variations des conditions d’essai et prendre les dispositions nécessaires pour que les examens soient effectués par des observateurs n’ayant pas connaissance du traitement. Les symptômes 
relevés devraient couvrir les observations suivantes (sans que cette liste soit 
exhaustive): modifications de l’état de la peau, de la fourrure, des yeux, des muqueuses, apparition de sécrétions et d’excrétions, et de réactions neuro-végétatives (par exemple, sécrétion de larmes, horripilation, dimension 
de la pupille, respiration anormale). Il convient également de consigner les 
changements dans la démarche, la posture et les réactions à la manipulation ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, des comporte ­
ments stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, parcours circulaires répé ­
titifs) ou comportements bizarres (par exemple, automutilation, marche à 
reculons) (2).
 
27. Lors de la quatrième semaine d’exposition, il faut vérifier la réactivité 
sensorielle à différents types de stimuli (2) (stimuli auditifs, visuels et 
proprioceptifs, par exemple) (3) (4) (5), et évaluer la force de préhension (6) et l’activité motrice (7). On trouvera dans les références bibliographiques susmentionnées une description plus détaillée des modes opératoires. Toute ­
fois, on peut également utiliser d’autres modes opératoires que ceux qui 
figurent dans les références.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 279
 
28. Les observations fonctionnelles réalisées au cours de la quatrième semaine 
d’exposition peuvent être omises lorsque l’essai sert d’étude préliminaire à 
une étude subchronique ultérieure (90 jours). Dans ce cas, les observations fonctionnelles devront être menées au cours de la seconde étude. Cela étant, les données tirées des observations fonctionnelles de l’étude à doses répétées 
peuvent faciliter la sélection des doses retenues pour l’étude subchronique 
ultérieure.
 
29. À titre exceptionnel, les observations fonctionnelles peuvent aussi être 
omises pour des groupes qui par ailleurs présentent des symptômes de 
toxicité à un degré tel qu’ils interféreraient sensiblement avec le déroule ­
ment de l’essai fonctionnel.  
30. Lors de l’autopsie, le cycle œstral de l’ensemble des femelles peut être 
déterminé (facultatif) par frottis vaginal. Ces observations fourniront des informations sur le stade du cycle œstral atteint au moment de l’euthanasie 
et faciliteront l’évaluation histologique des tissus sensibles aux œstrogènes 
[voir le guide d’orientations sur l’histopathologie (19)].
 
Poids corporel et consommation de nourriture et d’eau  
31. Tous les animaux doivent être pesés au moins une fois par semaine. La 
consommation de nourriture doit également être mesurée au moins une fois par semaine. Si la substance d’essai est administrée dans l’eau de boisson, la 
consommation d’eau doit aussi être mesurée au moins une fois par semaine.
 
Hématologie  
32. À la fin de la période d’essai, il faut procéder aux examens hématologiques 
suivants: hématocrite, concentration d’hémoglobine, numération des érythro ­
cytes, reticulocytes, numération et formule leucocytaire, numération des plaquettes et mesure du temps et potentiel de coagulation. D’autres analyses 
devant être menées si la substance d’essai ou ses métabolites supposés ont 
ou sont susceptibles d’avoir des propriétés oxydantes portent notamment sur la concentration de méthémoglobine et les corps de Heinz.
 
33. Des échantillons de sang doivent être prélevés à un endroit spécifié juste 
avant ou pendant la procédure d’euthanasie des animaux, et stockés dans des 
conditions appropriées. Les animaux doivent avoir jeûné la nuit précédant l’euthanasie (
 1 ). 
Biochimie clinique  
34. Les analyses de biochimie clinique destinées à étudier les principaux effets 
toxiques sur les tissus, et en particulier sur le rein et le foie, devraient être 
pratiquées sur des échantillons de sang prélevés sur tous les animaux juste 
avant ou pendant leur euthanasie (à l’exception des animaux trouvés mori ­
bonds et/ou euthanasiés avant la fin de l’essai). Les analyses du plasma ou du sérum doivent porter sur le sodium, le potassium, le glucose, le choles ­
térol total, l’urée, la créatinine, la concentration totale de protéines et d’al ­
bumine, au moins deux enzymes indicatrices des effets hépatocellulaires (telles que l’alanine aminotransférase, l’aspartate aminotransférase, la phos ­
phatase alcaline, la gamma glutamyle transpeptidase et la glutamate 
déshydrogénase), ainsi que sur les acides biliaires. Le dosage d’autres 
enzymes (d’origine hépatique ou autre) et de la bilirubine, peut fournir des informations utiles dans certaines circonstances.
 
35. À titre facultatif, on peut effectuer les analyses d’urine suivantes au cours de 
la dernière semaine de l’étude sur des échantillons d’urine prélevés à des 
moments déterminés: apparence, volume, osmolalité ou poids spécifique, pH, protéines, glucose, sang et cellules sanguines.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 280  
( 1 ) Il est préférable de faire jeûner les animaux durant la nuit qui précède la prise de sang 
pour un certain nombre de dosages dans le sérum et le plasma, surtout pour le dosage du glucose. Cette recommandation est principalement motivée par l’accroissement de varia ­
bilité qui découlerait inévitablement d’une non- observation du jeûne et qui tendrait à 
masquer des effets plus subtils, rendant de ce fait l’interprétation des résultats plus 
difficile. En revanche, l’observation du jeûne durant une nuit entière risque de perturber 
le métabolisme général des animaux et, notamment lors d’études où la substance d’essai 
est administrée dans la nourriture, risque de perturber l’exposition quotidienne à la 
substance d’essai. Si la pratique du jeûne durant la nuit est adoptée, les analyses de 
biochimie clinique doivent être réalisées après les observations fonctionnelles faites au 
cours de la quatrième semaine de l’étude.
 36. Il faudrait envisager par ailleurs de rechercher dans le plasma ou le sérum 
des marqueurs de lésions générales des tissus. Si les propriétés connues de 
la substance d’essai risquent ou sont soupçonnées d’affecter certaines voies métaboliques, on devrait procéder à d’autres analyses, notamment celles du calcium, du phosphate, des triglycérides, d’hormones spécifiques et de la 
cholinestérase. La nécessité de ces analyses doit être déterminée pour 
certaines classes de produits chimiques ou au cas par cas.
 
37. Bien que l’évaluation internationale des paramètres liés au système endocri ­
nien n’ait pas pu établir de façon claire l’intérêt de l’analyse des hormones thyroïdiennes (T3, T4) et de la TSH, il peut être utile de conserver des échantillons de plasma ou de sérum pour mesurer la T3, la T4 et la TSH 
(facultatif) s’il semble qu’un effet sur l’axe hypophyso-thyroïdien puisse 
exister. Ces échantillons pourront être congelés à - 20 °C pour être stockés. Les facteurs suivants peuvent influencer la variabilité et les concentrations absolues lors de l’analyse hormonale:
 
— moment de l’euthanasie, en raison de la variation diurne des concen ­
trations hormonales,  
— méthode d’euthanasie, évitant de stresser inutilement les animaux, ce qui 
pourrait affecter leurs concentrations hormonales,  
— kits d’analyse hormonale pouvant différer par leurs courbes standards.  
L’identification définitive des substances chimiques actives sur le système 
thyroïdien s’appuiera de manière plus fiable sur l’analyse histopathologique 
que sur les niveaux hormonaux.  
38. Les échantillons de plasma destinés spécifiquement à l’analyse hormonale 
doivent être prélevés aux mêmes heures de la journée. Il est recommandé de prendre en considération les taux de T3, T4 et TSH provoqués par des altérations de l’histopathologie de la thyroïde. Les valeurs numériques obte ­
nues lors de l’analyse des concentrations hormonales diffèrent selon les kits 
d’essai du commerce utilisés. Il peut ainsi ne pas être possible de fournir des critères de performance fondés sur des données historiques homogènes. Pour pallier cet inconvénient, les laboratoires s’efforceront de maintenir les coef ­
ficients de variation en dessous de 25 pour la T3 et pour la T4 et de 35 pour 
la TSH. Toutes les concentrations doivent être exprimées en ng/ml.
 
39. Si les données de référence historiques sont inappropriées, il conviendra de 
prendre en compte les variables d’hématologie et de biochimie clinique avant le début du dosage ou de préférence sur un groupe d’animaux distincts des groupes d’essai.
 
PATHOLOGIE  
Autopsie générale  
40. Tous les animaux utilisés dans l’étude feront l’objet d’une autopsie générale, 
complète et détaillée, qui comporte un examen approfondi de la surface externe du corps, de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thora ­
cique et abdominale et de leur contenu. Le
 foie, les  reins, les  glandes  
surrénales, les  testicules, les  épididymes,  l’ensemble formé par la prostate,  
les vésicules séminales et les glandes coagulantes, le  thymus, la  rate, le  
cerveau et le  cœur de tous les animaux (à l’exception des animaux mori ­
bonds et/ou euthanasiés avant la fin de l’essai) doivent être débarrassés, le 
cas échéant, de tout tissu adhérent et pesés à l’état frais dès que possible 
après la dissection, afin d’éviter leur dessiccation. Il convient d’enlever très soigneusement les tissus adhérents de l’ensemble de la prostate, de façon à éviter toute ponction de la vésicule séminale remplies de liquide. Une alter ­
native consistera à débarrasser la vésicule séminale et la prostate des tissus 
adhérents et de les peser après fixation.
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41. De manière facultative, deux autres organes peuvent aussi être pesés dès que 
possible après la dissection, afin d’éviter leur dessiccation: les deux ovaires 
(poids frais) et l’utérus, y compris le col de l’utérus [des orientations sur l’ablation et la préparation des tissus utérins pour leur pesée sont données par la ligne directrice 440 de l’OCDE (18)].
 
42. Le poids de la thyroïde (facultatif) peut être déterminé après la fixation. 
L’élimination des tissus adhérents doit également s’opérer avec beaucoup de soin et seulement après la fixation pour éviter d’abîmer les tissus, et par là 
de compromettre l’analyse d’histopathologie.
 
43. Les tissus suivants doivent être conservés dans le milieu de fixation le plus 
approprié compte tenu à la fois du type de tissu et des examens histopa ­
thologiques prévus (voir paragraphe 47): toutes les  lésions macroscopiques, 
l’encéphale (les régions représentatives du cerveau comprenant les hémi ­
sphères cérébraux, le cervelet et la protubérance annulaire), la  moelle  
épinière, les  yeux, l’ estomac, l’ intestin grêle, le  gros intestin (y compris 
les plaques de Peyer), le  foie, les  reins, les  glandes surrénales, la  rate, le  
cœur, le  thymus, la  thyroïde, la  trachée et les  poumons (préservés par 
injection de fixateur, puis immergés), les  gonades ( testicules et ovaires), 
les organes génitaux auxiliaires (utérus et col de l’utérus, épididymes, pros ­
tate + vésicules séminales et glandes coagulantes), le  vagin, la  vessie, les  
ganglions lymphatiques [le ganglion lymphatique le plus proximal et un autre, en fonction de l’expérience du laboratoire (15)], un
 nerf périphérique 
(sciatique ou poplité interne), de préférence tout près du muscle, un  muscle  
squelettique et un  os, avec la  moelle osseuse (coupe ou à défaut une ponc ­
tion examinée immédiatement). Il est recommandé de fixer les testicules par immersion dans un fixateur de Bouin ou de Davidson modifié (16) (17). 
L’albuginée du testicule doit être ponctionnée délicatement et superficielle ­
ment aux deux pôles de l’organe avec une aiguille pour permettre la péné ­
tration rapide du fixateur. Les résultats des observations cliniques et autres peuvent conduire à l’examen de tissus supplémentaires. En outre, il y a lieu 
de conserver tout organe qui pourrait être considéré comme un organe cible 
possible, eu égard aux propriétés connues de la substance d’essai.
 
44. Les tissus suivants peuvent apporter des informations utiles sur les effets 
endocriniens: gonades (ovaires et testicules), organes génitaux auxiliaires 
(utérus et col de l’utérus, épididymes, vésicules séminales et glande coagu ­
lante, prostate dorsolatérale et ventrale), vagin, hypophyse, glande mammaire mâle, glande thyroïdienne et glande surrénale. Les changements 
survenant dans les glandes mammaires mâles n’ont pas encore été insuffi ­
samment documentés, mais ce paramètre peut s’avérer très sensible aux substances à action œstrogénique. L’observation des organes/tissus non cités au paragraphe 43 est facultative (voir appendice 2).
 
45. Le document d’orientation sur l’histopathologie (19) fournit des informa ­
tions supplémentaires sur la dissection, la fixation, le prélèvement et l’his ­
topathologie des tissus endocriniens.  
46. Au cours du programme d’essais international, des éléments de preuve ont 
été apportés montrant que des effets subtils sur le système endocrinien de 
substances chimiques susceptibles de faiblement déséquilibrer l’homéostasie 
des hormones sexuelles peuvent être identifiés par leur capacité à perturber la synchronisation du cycle œstral dans différents tissus plutôt que par une nette altération histopathologique des organes sexuels femelles. Bien qu’au ­
cune preuve définitive n’ait été apportée sur ces effets, il est recommandé 
que les preuves d’une asynchronie possible du cycle oestral soient prises en compte dans l’interprétation de l’examen histopathlogique des ovaires (cel ­
lules folliculaires, thécales et de la granulosa), de l’utérus, du col de l’utérus 
et du vagin. Si elle est évaluée (facultatif), la période du cycle déterminée 
par les frottis vaginaux peut également être incluse dans cette comparaison
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Histopathologie  
47. Un examen histopathologique complet doit être pratiqué sur les tissus et 
organes conservés de tous les animaux appartenant au groupe témoin et au groupe traité à la dose la plus élevée. Ces examens devront être étendus aux 
animaux de tous les autres groupes de dosage dès lors qu’on observe des 
modifications liées au traitement dans le groupe traité à la dose la plus élevée.
 
48. Toutes les lésions macroscopiques seront examinées.  
49. Si un groupe satellite est inclus, les tissus et organes sur lesquels des effets 
ont été observés dans les groupes traités doivent faire l’objet d’un examen histopathologique.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
50. Il faut présenter les résultats correspondant à chaque animal. En outre, toutes 
les données doivent être résumés sous forme de tableaux faisant apparaître, 
pour chaque groupe d’essai, le nombre d’animaux au début de l’essai, le 
nombre d’animaux trouvés morts au cours de l’essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou de l’euthanasie, le nombre d’animaux présentant des signes de toxicité, et une description des ces signes, notamment le 
moment de leur apparition, leur durée et leur gravité, le nombre d’animaux 
présentant des lésions, les types de lésions, leur gravité et le pourcentage d’animaux affecté par chaque type de lésion.
 
51. Dans la mesure du possible, les résultats numériques devraient être évalués 
par une méthode statistique appropriée et largement reconnue. La compa ­
raison des effets au sein d’une même fourchette de dosage devrait éviter 
d’avoir à recourir à des tests de t multiples. Les méthodes statistiques 
devront être sélectionnées au stade de la conception de l’étude.  
52. À des fins de contrôle de la qualité, il est suggéré de recueillir des données 
de contrôle historiques et de calculer les coefficients de variation pour les données numériques, en particulier pour les paramètres liés à la détection des perturbateurs endocriniens. Ces données peuvent être utilisées à des fins 
comparatives lorsque des études réelles sont évaluées.
 
Rapport d’essai  
53. Le rapport d’essai doit inclure les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— état physique, pureté et propriétés physico-chimiques,  
— données permettant l’identification chimique.  
Véhicule, le cas échéant:  
— justification du choix du véhicule, s’il est autre que l’eau.  
Animaux d’essai:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l’essai,  
— justification du choix de l’espèce s’il ne s’agit pas de rat.  
Conditions d’essai:  
— justification du choix des doses,  
— description détaillée de la préparation de la substance à tester et/ou de 
son incorporation dans la nourriture, la concentration obtenue, la stabilité 
et l’homogénéité de la préparation,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 283
 
— détails relatifs à l’administration de la substance d’essai,  
— conversion de la concentration de la substance d’essai dans la nourriture 
ou l’eau de boisson (en ppm) en dose réelle (mg/kg de poids corporel/ 
jour), s’il y a lieu,  
— détails concernant la qualité de la nourriture et de l’eau.  
Paramètres optionnels étudiés:  
— liste des paramètres facultatifs étudiés.  
Résultats:  
— poids corporel/variation du poids corporel,  
— consommation de nourriture et d’eau, le cas échéant,  
— données sur la réponse toxique par sexe et par dose et description des 
symptômes de toxicité,  
— nature, gravité et durée des observations cliniques (réversibles ou non),  
— évaluations de l’activité sensorielle, de la force de préhension et de 
l’activité motrice,  
— analyses de sang et valeurs normales de référence,  
— analyses de biochimie clinique et valeurs normales de référence,  
— poids corporel lors de l’euthanasie et poids des organes,  
— résultats d’autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats des examens histopatholo ­
giques,  
— données relatives à l’absorption, si elles sont disponibles,  
— traitement statistique des résultats, s’il y a lieu.  
Discussion des résultats  
Conclusions  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 284
 
Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Activité antiandrogénique:  capacité d’un produit chimique à supprimer l’action 
d’une hormone androgénique naturelle (par exemple la testostérone) chez un mammifère.
 
Activité antiœstrogénique:  capacité d’un produit chimique à supprimer l’action 
d’une hormone œstrogénique naturelle (par exemple l’œstradiol 17ß) chez un 
mammifère.  
Activité antithyroïdienne:  capacité d’un produit chimique à supprimer l’action 
d’une hormone thyroïdienne naturelle (par exemple la T3) chez un mammifère.  
Activité thyroïdienne:  capacité d’un produit chimique à agir comme une 
hormone thyroïdienne naturelle (par exemple la T3) chez un mammifère.  
Androgénicité:  capacité d’un produit chimique à agir comme une hormone 
androgénique naturelle (par exemple la testostérone) chez un mammifère.  
CSENO:  sigle pour «concentration (maximale) sans effet nocif observé», c’est-à- 
dire la dose la plus élevée à laquelle aucun effet nocif lié au traitement n’est observé.
 
Dosage:  terme général recouvrant la dose, sa fréquence et la durée de l’adminis ­
tration  
Dose:  quantité de substance d’essai administrée. La dose est exprimée en poids 
de substance d’essai par unité de poids de l’animal d’expérience par jour (par exemple en mg/kg de poids corporel/jour), ou en concentration constante dans la 
nourriture.
 
Œstrogénicité:  capacité d’un produit chimique à agir comme une hormone 
œstrogénique naturelle (par exemple l’œstradiol 17ß) chez un mammifère.  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  
Toxicité manifeste:  terme général désignant des signes évidents de toxicité qui 
surviennent à la suite de l’administration d’une substance d’essai. Ces signes 
doivent être suffisants pour permettre l’évaluation des dangers et doivent être tels qu’on puisse s’attendre à ce qu’une augmentation de la dose administrée entraîne l’apparition de signes de toxicité grave et probablement la mort.
 
Validation:  processus scientifique destiné à caractériser les impératifs opération ­
nels et les limites d’une méthode d’essai et à démontrer sa fiabilité et sa perti ­
nence pour un objectif particulier.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 285
 
Appendice 2  
Paramètres recommandés dans la méthode d’essai B.7 pour la détection des 
perturbateurs endocriniens  
Paramètres obligatoires Paramètres facultatifs 
Poids  
— Testicules 
— Épididymes 
— Glandes surrénales 
— Prostate + vésicules séminales et 
glandes coagulantes — Ovaires 
— Utérus, y compris col de l’utérus 
— Thyroïde  
Histopathologie  
— Gonades: 
— Testicules et — Ovaires 
— Organes sexuels auxiliaires: 
— Épididymes, — Prostate + vésicules séminales 
et glandes coagulantes 
— Utérus, y compris col de 
l’utérus 
— Glandes surrénales 
— Thyroïde 
— Vagin — Frottis vaginaux 
— Glandes mammaires mâles — Hypophyse
 
Dosages hormonaux  
— Niveaux circulants de T3 et de T4 
— Niveaux circulants de TSH  
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(19) OCDE. (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
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B.8. TOXICITÉ SUBAIGUË PAR INHALATION: ÉTUDE SUR 28 
JOURS  
RÉSUMÉ  
La présente méthode d’essai B.8 révisée a été conçue afin de caractériser plei ­
nement la toxicité par inhalation de la substance d’essai, à la suite d’une expo ­
sition répétée sur une période de temps limitée (28 jours), et de fournir des données pour les estimations quantitatives des risques liés à l’inhalation. Des groupes de rongeurs, composés d’au minimum 5 mâles et 5 femelles, sont 
exposés 6 heures par jour, pendant 28 jours: a) à la substance d’essai à trois 
niveaux de concentration ou plus, b) à de l’air filtré (témoin négatif), et/ou c) au véhicule (groupe témoin du véhicule). Les animaux sont exposés en général 5 jours par semaine, mais il est aussi permis de les exposer 7 jours par semaine. 
Des mâles et des femelles sont toujours utilisés, mais peuvent être exposés à des 
niveaux de concentration différents si l’un des sexes est connu pour être plus sensible à une substance d’essai donnée. Afin de mieux caractériser la toxicité de la substance d’essai, la présente méthode d’essai laisse la possibilité au directeur 
de l’étude d’inclure des groupes satellites (réversibilité), des lavages 
broncho-alvéolaires (LBA), des tests neurologiques et des évaluations histopa ­
thologiques ou de pathologie clinique supplémentaires.
 
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 412 (2009) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Le texte original de la ligne directrice 412 sur la toxicité subaiguë par inhalation avait été adopté en 1981 (1). La présente méthode d’essai B.8 (équivalente à la ligne direc ­
trice 412) a été révisée pour prendre en compte l’état de la science et 
répondre aux exigences règlementaires actuelles et futures.
 
2. La présente méthode permet de caractériser les effets nocifs résultant d’une 
exposition quotidienne répétée, par inhalation, à une substance d’essai pendant 28 jours. Les données issues d’une étude sur la toxicité subaiguë 
par inhalation sur 28 jours peuvent être utilisées pour des estimations quan ­
titatives de risques (si l’étude n’est pas suivie d’un essai de toxicité subchro ­
nique par inhalation sur une période de 90 jours, voir chapitre B.29 de la présente annexe). Ces données peuvent également fournir des informations 
permettant la détermination des concentrations pour des études à plus long 
terme comme l’essai de toxicité subchronique par inhalation sur une période de 90 jours. La présente méthode d’essai n’est pas spécifiquement destinée à tester les nanomatériaux. Le document d’orientation n
 o 39 (2) regroupe les 
définitions utilisées dans le contexte de cette méthode d’essai.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
3. Avant toute étude, le laboratoire d’essai devra prendre en compte toutes les 
informations disponibles sur la substance d’essai afin d’améliorer la qualité 
de l’étude et de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les infor ­
mations utiles pour la détermination des concentrations d’essai appropriées, citons: l’identité, la structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la substance d’essai; les résultats de tous les essais de toxicité in vitro ou 
in vivo auxquels elle a été soumise; son (ses) utilisation(s) escomptée(s) et 
les risques d’exposition humaine; les données (Q)SAR disponibles et les données toxicologiques sur les substances structurellement apparentées; ainsi que les données issues des essais de toxicité aiguë par inhalation. En cas de 
neurotoxicité, connue ou observée au cours de l’étude, le directeur de 
l’étude pourra décider d’inclure les évaluations jugées nécessaires, comme une batterie d’observations fonctionnelles (FOB) et des mesures de l’activité motrice. Bien que la durée des expositions par rapport à des examens 
spécifiques puisse être critique, l’exécution de ces activités supplémentaires 
n’interfère pas avec la conception de l’étude principale.
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4. Les dilutions de substances corrosives ou irritantes peuvent être testées à des 
concentrations qui permettront d’atteindre le degré de toxicité désiré, voir 
document d’orientation 39 (2). Lors de l’exposition des animaux à ces substances, les concentrations cibles sont assez faibles pour ne causer ni souffrance manifeste ni détresse, mais suffisantes pour prolonger la courbe 
concentration-réponse jusqu’à des niveaux correspondant à l’objectif scien ­
tifique et règlementaire de l’essai. Le choix de ces concentrations est fait au cas par cas, de préférence sur la base d’une étude préliminaire de détermi ­
nation des concentrations, conçue de façon appropriée, et qui fournit des 
informations sur l’effet critique mesuré, un éventuel seuil d’irritation et le 
moment de son apparition (voir paragraphes 11-13). La justification du choix des concentrations est fournie.
 
5. Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou 
de détresse sévère et persistante sont euthanasiés. Les animaux moribonds sont pris en compte au même titre que ceux qui succombent au cours de l’essai. Le document d’orientation de l’OCDE sur les effets mesurés éthi ­
quement acceptables (3) détaille les critères orientant la décision d’euthana ­
sier les animaux moribonds ou en grande souffrance, et aide à reconnaître une mort prévisible ou imminente.
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Sélection des espèces animales  
6. Le choix s’orientera vers de jeunes rongeurs adultes en bonne santé, de 
souches communément utilisées en laboratoire. Le rat étant l’espèce la 
plus utilisée, il faudra justifier l’emploi d’autres espèces.  
Préparation des animaux  
7. Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de la randomisation, les 
animaux sélectionnés sont de jeunes adultes âgés de 7 à 9 semaines. Leur 
poids corporel ne devra pas excéder ± 20 % du poids moyen pour chaque 
sexe. Sélectionnés au hasard, les animaux seront marqués pour être identifiés individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils seront conservés dans leur cage pour une période d’au minimum 5 jours 
avant le début de l’essai.
 
Conditions d’élevage des animaux  
8. Les animaux sont identifiés de façon individuelle, de préférence à l’aide de 
dispositifs sous-cutanés, afin de faciliter leur observation et d’éviter toute confusion. La température du local expérimental où les animaux sont 
conservés est maintenue à 22 ± 3 °C. Le taux d’humidité relative est idéa ­
lement maintenu entre 30 et 70 %, encore qu’il ne soit pas toujours possible de le faire si l’eau est utilisée comme véhicule. Avant et après exposition, les animaux sont généralement mis en cage en groupes par sexe et par 
concentration, mais le nombre d’animaux par cage ne fait pas obstacle à 
une observation précise de chaque animal, et n’engendrer qu’un minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposés «nez seul», il peut être nécessaire de les acclimater aux tubes de contention. 
Ceux-ci ne provoquent pas chez les animaux de stress excessif, qu’il soit de 
nature physique, thermique ou dû à leur immobilisation. Les contraintes qu’ils subissent peuvent en effet modifier les paramètres physiologiques mesurés de l’animal, comme sa température corporelle (hyperthermie) 
et/ou son volume respiratoire par minute. Si l’on dispose de données géné ­
riques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de façon appréciable, alors la période d’adaptation préalable aux tubes de contention n’est pas nécessaire. Les animaux exposés «corps entier» à un aérosol sont 
enfermés individuellement pendant l’exposition pour les empêcher de filtrer 
l’aérosol d’essai grâce à la fourrure de leurs congénères. À l’exception des périodes d’exposition, le régime alimentaire des animaux est le régime clas ­
sique et certifié de laboratoire, avec eau potable à satiété. L’éclairage est 
artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures 
d’obscurité.
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Chambres d’inhalation  
9. Le choix de la chambre d’inhalation prend en compte la nature de la subs ­
tance d’essai et l’objet de l’essai. Le mode d’exposition «nez seul» (qui inclut les dispositifs «tête seule», «nez seul» et «museau seul») est privilé ­
gié. Le mode d’exposition «nez seul» est généralement choisi pour les 
études d’aérosols liquides ou solides et pour les vapeurs susceptibles de se condenser en aérosols. L’utilisation d’un mode d’exposition «corps entier» peut être préférable pour les besoins spécifiques de l’étude, mais 
cela est justifié dans le rapport de l’étude. Pour assurer la stabilité de 
l’atmosphère d’une chambre d’exposition «corps entier», on veillera à ce que le «volume» total des animaux d’expérience ne dépasse pas 5 % du 
volume de la chambre. Le document d’orientation 39 (2) décrit les principes 
des techniques d’exposition «corps entier» ou «nez seul», ainsi que leurs avantages et inconvénients spécifiques.
 
ÉTUDES DE TOXICITÉ  
Concentrations limites  
10. Contrairement aux études de toxicité aiguë, aucune concentration limite 
n’est définie pour les études de toxicité subaiguë par inhalation sur 28 
jours. La concentration maximale testée prend en compte: 1) la concentra ­
tion maximale pouvant être atteinte, 2) le niveau d’exposition humaine correspondant au «pire des cas», 3) la nécessité de maintenir une alimenta ­
tion adéquate en oxygène, et/ou 4) le bien-être des animaux. En l’absence de 
limites fondées sur des données, les valeurs limites pour la toxicité aiguë du règlement (CE) n
 o 1272/2008 (13) peuvent être utilisées (c’est-à-dire jusqu’à 
une concentration maximale de 5 mg/l pour les aérosols, 20 mg/l pour les 
vapeurs et 20 000 ppm pour les gaz); voir document d’orientation 39 (2). 
S’il est nécessaire de dépasser ces limites lors d’essais de gaz ou de subs ­
tances d’essai hautement volatiles (comme les réfrigérants), une justification est produite. La concentration limite permet d’obtenir une toxicité sans 
équivoque, sans causer de stress excessif chez les animaux ni affecter leur 
longévité (3).
 
Étude préliminaire de détermination des concentrations  
11. Avant le début de l’étude principale, une étude préliminaire de détermina ­
tion des concentrations peut s’avérer nécessaire. Plus complète qu’une étude 
d’observation, elle n’est pas limitée au choix des concentrations. Les connaissances acquises grâce à une étude préliminaire de détermination des concentrations peuvent conduire à la réussite de l’étude principale. En 
effet, une telle étude peut fournir des informations techniques sur les 
méthodes d’analyse, la taille des particules, la découverte de mécanismes de toxicité, les données histopathologiques et de pathologie clinique, et les estimations de la concentration sans effet nocif observé (CSENO) et de la 
concentration maximale acceptable (CMA) dans une étude principale. Le 
directeur d’étude peut décider de s’appuyer sur une étude préliminaire de détermination des concentrations pour identifier: le seuil d’irritation de l’ap ­
pareil respiratoire (par exemple avec une histopathologie de l’appareil 
respiratoire, des tests de la fonction pulmonaire ou des lavages bronchoal ­
véolaires), la concentration la plus élevée tolérée par les animaux sans provoquer de stress excessif, et les paramètres qui permettront de caracté ­
riser au mieux la toxicité de la substance d’essai.
 
12. Une étude préliminaire de détermination des concentrations peut comporter 
un ou plusieurs niveaux de concentration. Pour chaque niveau de concen ­
tration, on exposera au maximum trois mâles et trois femelles. La durée 
d’une étude préliminaire de détermination des concentrations est d’au minimum 5 jours et ne pas excéder 14 jours en général. Il convient d’ex ­
poser dans le rapport d’étude les raisons du choix des concentrations rete ­
nues pour l’étude principale, dont l’objet est de démontrer une relation 
concentration-réponse basée sur l’effet mesuré le plus sensible auquel on s’attend. La concentration la plus faible n’engendre en principe aucune manifestation de toxicité, tandis que la concentration la plus élevée 
permet d’obtenir une toxicité sans équivoque, sans causer de stress excessif 
chez les animaux ni affecter leur longévité (3).
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13. Lors du choix des niveaux de concentration pour l’étude préliminaire de 
détermination des concentrations, toutes les informations disponibles sont 
prises en compte, y compris les relations structure-activité et les données correspondant à des produits chimiques analogues (voir paragraphe 3). Une étude préliminaire de détermination des concentrations peut confirmer ou 
réfuter le choix des effets mesurés les plus sensibles selon des critères 
mécanistiques, comme l’inhibition de la cholinestérase par des composés organophosphorés, la formation de méthémoglobine par des agents cyto ­
toxiques d’isomérie érythro, les hormones thyroïdiennes (T3, T4) dans le 
cas de thyrotoxiques, les protéines, la LDH, ou les neutrophiles dans les 
lavages bronchoalvéolaires dans le cas de particules inoffensives faiblement solubles ou d’aérosols irritants pour les poumons.
 
Étude principale  
14. L’étude principale de toxicité subaiguë comporte en général trois niveaux de 
concentration ainsi qu’un témoin négatif (air) et/ou un témoin du véhicule, s’il y a lieu (voir paragraphe 17). L’ensemble des informations disponibles doit permettre de déterminer les niveaux d’exposition appropriés, y compris 
les résultats des études systémiques de toxicité, le métabolisme et la ciné ­
tique (on prendra garde d’éviter les niveaux de concentration élevée avec des processus cinétiques de saturation). Chaque groupe d’essai comprend au moins 10 rongeurs (5 mâles et 5 femelles) exposés à la substance d’essai 6 
heures par jour, 5 jours par semaine pendant 4 semaines (soit une durée 
totale de l’étude de 28 jours). Les animaux peuvent aussi être exposés 7 jours par semaine (par exemple dans le cas d’essais sur des produits phar ­
maceutiques inhalés). S’il est connu qu’un des sexes est plus réactif à la 
substance d’essai, les niveaux de concentration peuvent différer selon le sexe afin d’optimiser la concentration-réponse telle que décrite au para ­
graphe 15. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées 
«nez seul», il est possible d’ajuster la durée maximale d’exposition en 
fonction du stress propre à ces espèces. Lorsque la durée d’exposition est inférieure à 6 heures par jour ou qu’il est nécessaire de mener une étude d’exposition «corps entier» de longue durée (par exemple de 22 heures par 
jour), des justifications sont fournies, voir document d’orientation 39 (2). 
Les animaux sont privés de nourriture pendant l’exposition sauf si sa durée dépasse 6 heures. Dans une exposition «corps entier», les animaux peuvent boire de l’eau.
 
15. Les concentrations cibles choisies permettent d’identifier le(s) organe(s) 
cible(s) et de mettre en évidence une concentration-réponse claire:  
— le niveau de concentration élevé produit des effets toxiques sans engen ­
drer de signes persistants ou la mort, ce qui empêcherait une évaluation 
valable des résultats,  
— le(s) niveau(x) de concentration intermédiaire(s) doi(ven)t être espacé(s) 
de manière à produire une gradation dans les effets toxiques observés avec une concentration faible et avec une concentration élevée,
 
— le niveau de concentration faible ne produit quasiment aucune manifes ­
tation de toxicité.  
Étude satellite (étude de réversibilité)  
16. Une étude de réversibilité peut être utilisée pour mettre en évidence le 
caractère réversible, persistant ou retardé de la toxicité, pour une période 
post-traitement d’une durée appropriée d’au minimum 14 jours. Les groupes 
satellites sont constitués de cinq mâles et de cinq femelles exposés en même temps que les animaux d’expérience de l’étude principale. Ils sont exposés à la concentration la plus élevée de la substance d’essai. Il convient également 
de faire appel à un témoin concurrent (air) et, le cas échéant, à un témoin du 
véhicule (voir paragraphe 17).
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Animaux témoins  
17. Les animaux du groupe témoin négatif (air) sont traités d’une manière 
identique à ceux du groupe d’animaux d’essai, mais au lieu de la substance d’essai, ils sont exposés à de l’air filtré. Lorsque de l’eau ou une autre 
substance est utilisée pour produire l’atmosphère d’essai, un groupe 
témoin du véhicule est inclus dans l’étude, à la place du groupe témoin négatif exposé à l’air seulement. Autant que possible, l’eau est le véhicule utilisé. Dans ce cas, les animaux témoins sont exposés à un air dont le taux 
d’humidité relative est le même que pour les groupes exposés à la substance 
d’essai. Le choix du véhicule s’opère sur la base d’une étude préliminaire appropriée ou de données historiques. Si la toxicité d’un véhicule est mal 
connue, le directeur de l’étude peut choisir d’utiliser un témoin négatif (air) 
et un témoin du véhicule, mais cela est toutefois fortement déconseillé. Si les données historiques montrent qu’un véhicule n’est pas toxique, le groupe témoin à l’air n’est pas nécessaire et seul un témoin du véhicule est utilisé. 
Si aucune toxicité n’a été détectée lors de l’étude préliminaire d’une subs ­
tance d’essai préparée dans un véhicule, ce véhicule est considéré comme non toxique à la concentration testée et ce véhicule témoin est utilisé.
 
CONDITIONS D’EXPOSITION  
Administration des concentrations  
18. Les animaux sont exposés à la substance d’essai présenté sous forme de gaz, 
de vapeur, d’aérosol ou d’un mélange des deux. L’état physique à tester dépend des propriétés physico-chimiques de la substance, de la concentra ­
tion choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable 
qu’elle se présente lors de sa manipulation et de son utilisation. Les subs ­
tances d’essai chimiquement réactives ou hygroscopiques sont testées sous air sec. On prendra soin d’éviter les concentrations susceptibles de provo ­
quer une explosion. Les substances particulaires peuvent être soumises à des 
procédés mécaniques afin de réduire la taille des particules. Pour plus d’in ­
formations, se reporter au document d’orientation 39 (2).
 
Répartition granulométrique  
19. Une mesure de la taille des particules est réalisée pour tous les aérosols et 
les vapeurs susceptibles se condenser pour former des aérosols. Pour que 
toutes les régions pertinentes de l’appareil respiratoire soient exposées, il est 
recommandé d’utiliser (4) des aérosols dont le diamètre aérodynamique médian de masse (DAMM) se situe entre 1 et 3 μm, avec un écart type 
géométrique ( σ
 g ) compris entre 1,5 et 3,0. Un effort raisonnable est fourni 
pour remplir ces conditions, mais si tel n’est pas le cas, un jugement d’ex ­
pert est nécessaire. Par exemple, les particules des fumées métalliques peuvent avoir une taille inférieure à cette norme, et les particules chargées 
ou les fibres une taille supérieure.
 
Préparation de la substance d’essai dans un véhicule  
20. La substance d’essai est idéalement testée sans véhicule. S’il est nécessaire 
d’avoir recours à un véhicule pour atteindre la concentration et la taille particulaire voulues de la substance d’essai, l’eau est choisie de préférence. Chaque fois qu’une substance d’essai est dissoute dans un véhicule, sa 
stabilité est démontrée.
 
CONTRÔLE DES CONDITIONS D’EXPOSITION  
Débit d’air dans la chambre d’exposition  
21. Le débit d’air dans la chambre d’exposition est contrôlé avec soin, surveillé 
en continu et enregistré au moins toutes les heures pendant chaque exposi ­
tion. Le suivi en temps réel de la concentration de l’atmosphère d’essai (ou stabilité temporelle) constitue une mesure complète de tous les paramètres dynamiques et fournit un moyen indirect de contrôler tous les paramètres 
d’inhalation dynamiques pertinents. Si la concentration est suivie en temps 
réel, la fréquence peut être ramenée à une seule mesure du débit de l’air par
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exposition et par jour. Un soin particulier est apporté à éviter toute reres ­
piration dans les chambres d’exposition «nez seul». La concentration d’oxy ­
gène est d’au moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne dépasser pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent être respectées, les concentrations d’oxy ­
gène et de dioxyde de carbone sont mesurées. Si les mesures du premier 
jour d’exposition montrent que la concentration de ces gaz est appropriée, 
aucune mesure complémentaire ne devrait être nécessaire.
 
Température et humidité relative de la chambre d’exposition  
22. La température de la chambre d’exposition est maintenue à 22 ± 3 °C. Dans 
les cas d’exposition «nez seul» et «corps entier», l’humidité relative dans la zone où respire l’animal est autant que possible surveillée en continu et enregistrée toutes les heures pendant chaque exposition. L’humidité relative 
est de préférence comprise entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne 
puisse être atteint (par exemple lorsque la substance d’essai se présente sous forme de solution aqueuse), ou qu’il ne puisse être mesuré en raison d’inter ­
férences de la substance d’essai avec la méthode d’essai.
 
Substance d’essai: concentration nominale  
23. Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre 
d’exposition est calculée et enregistrée. La concentration nominale est la 
masse de la substance d’essai divisée par le volume d’air total qui passe dans le circuit de la chambre d’inhalation. La concentration nominale ne sert pas à caractériser l’exposition des animaux, mais une comparaison de la 
concentration nominale avec la concentration réelle donne une indication 
de la capacité de production du système d’essai, et peut donc permettre de mettre en évidence des problèmes de production.
 
Substance d’essai: concentration réelle  
24. La concentration réelle est la concentration de la substance d’essai prélevée 
dans la zone de la chambre d’inhalation où les animaux respirent. Les 
concentrations réelles peuvent être obtenues par des méthodes spécifiques 
(par exemple, échantillonnage direct, méthodes d’adsorption ou de réaction chimique, et caractérisation analytique ultérieure) ou par des méthodes non spécifiques comme la gravimétrie sur filtre. Le recours à l’analyse gravimé ­
trique n’est acceptable que pour des aérosols ne contenant qu’un seul 
composant en poudre ou pour des aérosols de liquides peu volatils, et des caractérisations spécifiques à la substance d’essai sont également effectuées par une pré-étude appropriée. Il est aussi possible d’avoir recours à la 
gravimétrie pour déterminer la concentration d’un aérosol contenant 
plusieurs composants en poudre, mais des données analytiques sont alors nécessaires, afin de démontrer que la composition du produit en suspension dans l’air est analogue à celle du produit de départ. Faute de cette informa ­
tion, il peut s’avérer nécessaire de soumettre le produit à tester (idéalement 
en suspension dans l’air) à une nouvelle analyse à intervalles réguliers tout au long de l’étude. Pour des agents aérosolisés susceptibles de s’évaporer ou de se sublimer, il faut démontrer que toutes les phases ont été recueillies 
selon la méthode choisie.
 
25. Pendant toute la durée de l’étude, il est recommandé de n’employer si 
possible qu’un seul lot de la substance d’essai, et l’échantillon de la subs ­
tance est conservé dans des conditions préservant sa pureté, son homogé ­
néité et sa stabilité. Avant le début de l’étude, il conviendrait de réaliser une 
caractérisation de la substance d’essai afin de déterminer sa pureté et, si cela est techniquement possible, son identité et les quantités de contaminants et d’impuretés identifiés. Pour cela, on pourra recueillir les données suivantes: 
temps de rétention et surface relative du pic, poids moléculaire obtenu par 
spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres estimations. Bien que le laboratoire d’essai ne soit pas responsable de l’identification de la substance d’essai, il peut, par prudence, confirmer au 
moins une partie des caractéristiques fournies par le donneur d’ordre (cou ­
leur, nature physique, etc.).
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26. L’atmosphère d’exposition est maintenue constante autant que possible. Un 
dispositif de suivi en temps réel, tel qu’un photomètre à aérosol pour les 
aérosols ou un analyseur d’hydrocarbures totaux pour les vapeurs, peut être utilisé pour démontrer la stabilité des conditions d’exposition. La concen ­
tration réelle dans la chambre est mesurée au moins 3 fois chaque jour 
d’exposition et pour chaque niveau d’exposition. En cas d’impossibilité en 
raison de débits d’air limités ou de faibles concentrations, l’utilisation d’un échantillon par période d’exposition est acceptée. En principe, cet échan ­
tillon est alors recueilli pendant la totalité de la période d’exposition. Les 
écarts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration 
moyenne n’excèdent pas ± 10 % pour les gaz et vapeurs et ± 20 % pour les aérosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps d’équilibre dans la chambre d’exposition (t
 95 ). La durée d’une exposition 
couvre le temps de production de la substance d’essai, y compris le temps 
nécessaire pour l’égalisation des concentrations dans la chambre d’exposi ­
tion (t  95 ) et leur déclin. Des indications pour l’estimation de t  95 sont fournies 
dans le document d’orientation 39 (2).  
27. Pour des systèmes très complexes constitués de gaz ou de vapeurs et d’aé ­
rosols (atmosphères de combustion et substances d’essai propulsées à partir 
de produits/dispositifs spécialisés, par exemple), chaque phase peut se 
comporter différemment dans la chambre d’inhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et aérosol), on choisira donc au moins une substance indicatrice (analyte), en général la principale substance active du mélange. 
Quand la substance d’essai est un mélange, la concentration analytique 
devra être indiquée pour le mélange global et pas uniquement pour le principe actif ou la substance indicatrice (analyte). Pour plus d’informations sur les concentrations réelles, se reporter au document d’orientation 39 (2).
 
Substance d’essai: répartition granulométrique  
28. La répartition granulométrique des aérosols est déterminée au minimum 
chaque semaine pour chaque niveau de concentration, à l’aide d’un impac ­
teur en cascade ou d’un autre instrument, comme un spectromètre de mesure 
de la taille des particules aérodynamiques (APS). Si les résultats obtenus 
avec l’impacteur en cascade et l’autre instrument se révèlent équivalents, ce dernier peut être utilisé tout au long de l’étude.
 
29. Pour confirmer la capacité de recueil des particules de l’outil principal, 
un second instrument devra être utilisé en parallèle, par exemple un filtre gravimétrique ou un barboteur à gaz/impacteur. La concentration massique 
obtenue par l’analyse granulométrique se rapproche, dans des limites raison ­
nables, de celle obtenue par l’analyse sur filtre, voir document d’orientation 39 (2). Si pour toutes les concentrations testées, cette équivalence est établie au début de la phase d’étude, il n’est pas nécessaire d’effectuer des mesures 
de confirmation dans la suite de l’étude. Pour le bien-être des animaux, il 
convient de réduire au minimum les données douteuses qui nécessiteraient de répéter l’essai.
 
30. Une répartition granulométrique est effectuée dans le cas des vapeurs, s’il 
est possible qu’une condensation de la vapeur conduise à la formation d’un aérosol, ou si des particules sont détectées dans une atmosphère de vapeur 
susceptible de présenter des phases mixtes.
 
OBSERVATIONS  
31. Un examen clinique attentif des animaux est pratiqué avant, pendant, et 
après la période d’exposition. Des observations plus fréquentes peuvent être réalisées en fonction de la réponse des animaux pendant l’exposition. 
Lorsque l’observation des animaux s’avère difficile en raison des tubes de 
contention, du mauvais éclairage des chambres d’exposition «corps entier» ou d’atmosphères opaques, les animaux seront observés attentivement après l’exposition. Les observations effectuées avant l’exposition du lendemain 
peuvent permettre d’estimer une éventuelle réversibilité ou exacerbation 
des effets toxiques.
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32. Toutes les observations sont enregistrées individuellement pour chaque 
animal. Quand des animaux sont retrouvés morts ou sont euthanasiés, 
l’heure de la mort est consignée le plus précisément possible.  
33. Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la 
peau et des poils, des yeux et des muqueuses, de l’appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux, ainsi que de l’activité somatomo ­
trice et du comportement. Les tremblements, les convulsions, la salivation, 
les diarrhées, la léthargie, le sommeil et le coma retiennent l’attention. La mesure de la température rectale peut aider à mettre en évidence une bradypnée réflexe ou une hypo/hyperthermie liée au traitement ou au confi ­
nement. Il est possible d’enrichir le protocole d’étude par des estimations 
complémentaires telles que: cinétique, surveillance biologique, fonction pulmonaire, rétention de produits peu solubles qui s’accumulent dans les tissus pulmonaires et changements comportementaux.
 
POIDS CORPOREL  
34. Le poids de chacun des animaux est enregistré individuellement: juste avant 
la première exposition (jour 0), deux fois par semaine par la suite (par 
exemple les vendredis et lundis, afin de mettre en évidence leur rétablis ­
sement après un week-end sans exposition, ou dans un délai permettant l’évaluation de la toxicité systémique), et au moment de leur mort ou de leur euthanasie. Si aucun effet n’est observé les 2 premières semaines, le 
poids corporel peut n’être mesuré qu’une fois par semaine pendant le reste 
de l’étude. Les animaux du groupe satellite (étude de réversibilité) sont toujours pesés de façon hebdomadaire tout au long de la période de récu ­
pération. Au terme de l’étude, tous les animaux sont pesés juste avant leur 
sacrifice pour ne pas fausser le calcul des rapports du poids des organes au 
poids du corps.
 
CONSOMMATION D’EAU ET DE NOURRITURE  
35. La quantité de nourriture consommée est mesurée une fois par semaine. La 
consommation d’eau peut également l’être.  
PATHOLOGIE CLINIQUE  
36. Tous les animaux, y compris ceux des groupes témoins et satellites, quand 
ils sont sacrifiés, subissent des examens cliniques. Le délai entre la fin de 
l’exposition et la prise de sang est enregistré, en particulier quand la recons ­
titution de l’effet visé est rapide. À la fin de l’exposition, un échantillonnage est recommandé pour les paramètres ayant une courte demi-vie plasmatique 
(HbCO, ChE et MetHb, par exemple).
 
37. Le tableau 1 énumère les paramètres de pathologie clinique généralement 
requis pour toutes les études toxicologiques. Une analyse d’urine n’est pas nécessaire en règle générale, mais peut être réalisée si on l’estime utile d’après la toxicité probable ou observée. Afin de mieux caractériser la 
toxicité de la substance d’essai, le directeur de l’étude peut faire appel à 
d’autres paramètres (cholinestérase, lipides, hormones, équilibre acido-basique, méthémoglobine ou corps de Heinz, créatine kinase, rapport myéloïde/érythroïde, troponines, gaz du sang, lactate déshydrogé ­
nase, sorbitol déshydrogénase, glutamate déshydrogénase, gamma glutamyl 
transpeptidase, etc.).
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Tableau 1  
Paramètres standards de pathologie clinique  
Hématologie  
Nombre d’érythrocytes 
Hématocrite 
Concentration d’hémoglobine 
Teneur corpusculaire moyenne en 
hémoglobine 
Volume corpusculaire moyen 
Concentration corpusculaire moyenne 
d’hémoglobine 
Réticulocytes Nombre total de leucocytes 
Différentiel leucocytaire 
Nombre de plaquettes sanguines 
Potentiel de coagulation (en 
choisir un): 
— Temps de prothrombine 
— Temps de coagulation 
— Temps de thromboplastine 
partielle  
Chimie clinique  
Glucose (*) 
Cholestérol total 
Triglycérides 
Azote uréique dans le sang Bilirubine totale Créatinine 
Protéines totales 
Albumine Globuline Alanine aminotransférase 
Aspartate aminotransferase 
Phosphatase alcaline 
Potassium Sodium Calcium 
Phosphore 
Chlore
 
Analyse d’urines (facultative)  
Apparence (couleur et turbidité) 
Volume Densité ou osmolarité 
pH Protéines totales 
Glucose Sang/cellules sanguines
 
(*) Le directeur d’étude décidera si une période de jeûne est nécessaire ou non pour 
les animaux, une longue période de jeûne pouvant conduire à des mesures de 
glucose partiellement erronées pour les animaux traités par rapport aux animaux 
témoins. La période de jeûne est appropriée à l’espèce utilisée: pour le rat, elle 
peut être de 16 heures environ (jeûne pendant sa nuit). La détermination de la 
glycémie à jeun peut être effectuée après la période de jeûne de la nuit, pendant la dernière semaine d’exposition, ou après la période de jeûne de la nuit précédant 
l’autopsie (avec, dans ce dernier cas, tous les autres paramètres de pathologie 
clinique).
 
38. Quand il est prouvé que les voies respiratoires basses (c’est-à-dire les 
alvéoles pulmonaires) sont le principal site de dépôt et de rétention, le lavage broncho-alvéolaire (LBA) peut alors être la technique de choix pour effectuer une analyse quantitative les paramètres de la relation 
dose-effet basée sur les hypothèses, en se concentrant sur l’alvéolite, l’in ­
flammation pulmonaire et la phospholipidose. Ceci permet d’étudier conve ­
nablement l’évolution de la relation dose-effet et du décours temporel d’une lésion alvéolaire. Le fluide du LBA peut être analysé en se basant sur le 
nombre total et différentiel de leucocytes, les protéines totales et la lactate 
déshydrogénase. D’autres paramètres peuvent également être considérés, comme ceux mettant en évidence une lésion lysosomale, une phospholipi ­
dose, une fibrose, une inflammation allergique ou irritante, laquelle peut 
inclure la détermination de cytokines ou de chimiokines pro-inflammatoires. Les mesures liées au LBA complètent souvent les résul ­
tats des examens histopathologiques sans toutefois s’y substituer. Des indi ­
cations sur la manière de réaliser un lavage de poumon sont disponibles 
dans le document d’orientation 39 (2).
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MACROPATHOLOGIE ET POIDS DES ORGANES  
39. Tous les animaux d’expérience, y compris ceux morts au cours de l’essai et 
ceux écartés de l’étude pour des raisons de bien-être animal, subissent une exsanguination complète (si cela est possible) et une autopsie macrosco ­
pique. Il convient d’enregistrer le délai entre la fin de la dernière exposition 
de chaque animal et leur sacrifice. Lorsqu’un animal est découvert mort et que son autopsie n’est pas réalisable immédiatement, l’animal est réfrigéré (mais non congelé) à une température suffisamment basse pour minimiser 
l’autolyse. Les autopsies sont réalisées le plus tôt possible, en général dans 
un délai d’un à deux jours. Tous les changements macropathologiques sont enregistrés pour chaque animal en prêtant particulièrement attention aux 
voies respiratoires.
 
40. Le tableau 2 énumère les organes et tissus devant être conservés dans un 
milieu approprié lors de l’autopsie macroscopique en vue d’un examen histopathologique. La conservation des organes et tissus [entre crochets], 
et de tous les autres organes et tissus, est à la discrétion du directeur 
d’étude. Les organes indiqués  en gras  sont découpés et pesés à l’état 
humide, le plus tôt possible après la dissection, pour éviter leur dessiccation. La thyroïde et les épididymes ne sont pesés que si cela est nécessaire car 
leur découpe peut gêner l’évaluation histopathologique. Les organes et tissus 
sont fixés à l’aide de formol tamponné à 10 %, ou d’un autre fixateur approprié, dès que l’autopsie est effectuée, et pas moins de 24 à 48 heures avant le découpage, en fonction du fixateur utilisé.
 
Tableau 2  
Organes et Tissus à Conserver Pendant L’autopsie Macroscopique  
[Bulbe olfactif]  
Capsules surrénales  
Cerveau  (y compris les tronçons du cortex 
cérébral et de la moelle/du pont)  
Cœur  
Estomac  
Foie 
Ganglions lymphatiques depuis la région 
hilaire du poumon, spécialement pour les substances d’essai particulaires peu solubles. 
Pour des examens plus approfondis et/ou des 
études à but immunologique, d’autres ganglions lymphatiques peuvent être envisa ­
gés, comme ceux des régions médiastinale, 
cervicale/submandibulaire et/ou auriculaire.
 
Larynx (3 niveaux, dont 1 niveau qui 
comprend la base de l’épiglotte)  
Moelle épinière (niveau cervical, au milieu du 
thorax et lombaire)  
Moelle osseuse (et/ou un aspirat frais)  
Œsophage  
Ovaires  
Poumons  (tous les lobes sur un niveau, y 
compris les bronches principales)  
Rate  Reins  
Testicules  
Testicules  
Thymus  
Thyroïde  
Tissus nasopharyngés [au moins 4 niveaux; 
1 niveau comprenant le conduit du nasopha ­
rynx et le tissu lymphoïde associé à la 
muqueuse nasale (NALT)]  
Trachée (au moins 2 niveaux comprenant 1 
coupe longitudinale le long de la carène et 1 
coupe transversale)  
Utérus  
Vésicules séminales  
[Vessie]  
[Yeux (rétine, nerf optique) et paupières]  
Toutes lésions macroscopiques  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 297
 
41. Les poumons sont retirés intacts, pesés et perfusés avec un fixateur appro ­
prié à une pression de 20 à 30 cm d’eau pour veiller à ce que l’architecture 
pulmonaire soit préservée (5). Les coupes sont recueillies pour tous les lobes sur un niveau, comprenant les bronches principales. Si un lavage du poumon est réalisé, le lobe qui n’a pas été lavé est sectionné sur trois niveaux (pas de 
coupe en série).
 
42. Au moins 4 niveaux des tissus nasopharyngés sont examinés, dont un 
devant comporter le conduit du nasopharynx (5) (6) (7) (8) (9) pour permettre un examen adéquat de l’épithélium squameux, transitionnel (res ­
piratoire non-cilié), respiratoire (respiratoire cilié) et olfactif, ainsi que du 
tissu lymphatique (NALT) (10) (11). Trois niveaux du larynx sont examinés, 
dont un comprenant la base de l’épiglotte (12). Au moins deux niveaux de la trachée sont examinés, y compris une coupe longitudinale le long de la carène de la bifurcation des bronches extrapulmonaires et une coupe trans ­
versale.
 
HISTOPATHOLOGIE  
43. Une évaluation histopathologique de tous les organes et tissus du tableau 2 
est réalisée pour les animaux des groupes témoins et des groupes exposés à une concentration élevée de la substance d’essai, ainsi que pour les animaux qui meurent ou sont sacrifiés au cours de l’étude. On portera une attention 
particulière aux voies respiratoires, aux organes cibles et aux lésions macro ­
scopiques. Les organes et tissus présentant des lésions dans le groupe exposé à une concentration élevée sont examinés pour tous les groupes. Le directeur de l’étude peut choisir de réaliser des évaluations histopatho ­
logiques pour d’autres groupes afin de mettre en évidence une relation 
concentration-réponse claire. Lorsqu’un groupe satellite (étude de réversibi ­
lité) est utilisé, il y a lieu d’effectuer un examen histopathologique pour tous les tissus et organes ayant laissé apparaître des effets dans les groupes 
traités. Lorsqu’un trop grand nombre de morts précoces ou d’autres 
problèmes survenant dans le groupe exposé à une concentration élevée compromettent la portée des résultats, le groupe exposé à la concentration immédiatement inférieure subit un examen histopathologique. On tentera de 
corréler les observations macroscopiques et les constatations au niveau 
microscopique.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
44. Pour chacun des animaux, les données suivantes sont fournies: poids corpo ­
rel, consommation de nourriture, pathologie clinique, pathologie macrosco ­
pique, poids des organes et histopathologie. Les résultats des observations cliniques sont résumés sous la forme de tableaux et indiquent pour chaque 
groupe d’essai: le nombre d’animaux utilisés, le nombre d’animaux présen ­
tant des signes spécifiques de toxicité, le nombre d’animaux retrouvés morts au cours de l’essai ou euthanasiés, l’heure de la mort de chacun des animaux, la description et l’évolution dans le temps des effets toxiques 
ainsi que leur réversibilité, et les conclusions de l’autopsie. Tous les résul ­
tats, quantitatifs et fortuits, sont évalués à l’aide d’une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique généralement reconnue peut être utili ­
sée; il y a lieu de sélectionner les méthodes statistiques au stade de la 
conception de l’étude.
 
Rapport d’essai  
45. Le rapport d’essai contient les renseignements suivants:  
Animaux d’expérience et conditions d’élevage  
— Description des conditions d’encagement, y compris: nombre (ou évolu ­
tion du nombre) d’animaux par cage, matériel de litière, température 
ambiante et taux d’humidité relative, photopériode et identification du 
régime alimentaire.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 298
 
— Espèces/souches utilisées et justification éventuelle de l’utilisation d’une 
espèce autre que le rat. Des données sources et historiques peuvent être 
fournies si elles proviennent d’animaux exposés à des conditions d’ex ­
position, d’encagement et de jeûne similaires.  
— Nombre, âge et sexe des animaux.  
— Méthode de randomisation.  
— Description d’un éventuel conditionnement préalable à l’essai, tel que 
régime alimentaire, quarantaine ou traitement de maladie.  
Substance d’essai  
— Nature physique, pureté et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (y 
compris isomérisation).  
— Données d’identification et numéro CAS (Chemical Abstract Services) 
s’il est connu.  
Véhicule  
— Justification de l’emploi d’un véhicule et justification de son choix (s’il 
ne s’agit pas de l’eau).  
— Données historiques ou concordantes démontrant que le véhicule n’inter ­
fère pas avec les résultats de l’étude.  
Chambre d’inhalation  
— Description détaillée de la chambre d’inhalation, y compris son volume 
et son schéma.  
— Source et description de l’équipement utilisé pour l’exposition des 
animaux et pour la production de l’atmosphère.  
— Équipement utilisé pour mesurer la température, l’humidité, la granulo ­
métrie et la concentration réelle.  
— Source d’air et système de climatisation utilisé.  
— Méthodes utilisées pour étalonner l’équipement afin d’assurer l’homogé ­
néité de l’atmosphère d’essai.  
— Différence de pression (positive ou négative).  
— Orifices d’exposition par chambre («nez seul») ou emplacement des 
animaux dans la chambre («corps entier»).  
— Stabilité de l’atmosphère d’essai.  
— Situation des capteurs thermiques et hygrométriques et échantillonnage 
de l’atmosphère d’essai dans la chambre d’exposition.  
— Traitement de l’air fourni/évacué.  
— Débits d’air, débit d’air/orifice d’exposition («nez seul») ou rapport du 
volume de l’animal à la chambre («corps entier»).  
— Temps nécessaire pour atteindre l’équilibre dans la chambre d’exposition 
(t 95 ). 
— Nombre de changements de volume par heure.  
— Doseurs (s’il y en a).  
Données concernant l’exposition  
— Justification du choix de la concentration cible dans l’étude principale.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 299
 
— Concentrations nominales (masse totale de substance d’essai produite 
dans la chambre d’inhalation, divisée par le volume d’air traversant la 
chambre).  
— Concentrations réelles de la substance d’essai obtenues dans la zone où 
respirent les animaux; pour les mélanges d’essai produisant des formes 
physiques hétérogènes (gaz, vapeurs, aérosols), chacun des constituants peut être analysé séparément.
 
— Toutes les concentrations d’air sont rapportées en unités de masse (mg/l, 
mg/m  3 , etc.) plutôt qu’en unités de volume (ppm, ppb, etc.).  
— Répartition granulométrique des particules, diamètre aérodynamique 
médian de masse (DAMM) et écart type géométrique ( σg), ainsi que 
leur méthode de calcul. Les autres analyses de la taille de particules sont consignées.
 
Conditions expérimentales  
— Détails sur la préparation de la substance d’essai, y compris sur les 
procédures utilisées pour réduire la taille des particules des solides ou 
pour préparer les solutions de la substance d’essai.  
— Description (si possible avec schéma) de l’équipement utilisé pour 
produire l’atmosphère d’essai et pour exposer les animaux à celle-ci.  
— Détails sur l’équipement utilisé pour contrôler la température et le taux 
d’humidité de la chambre ainsi que le débit d’air dans chambre (réali ­
sation d’une courbe d’étalonnage).  
— Détails sur l’équipement utilisé pour recueillir les échantillons servant à 
déterminer les concentrations dans la chambre et la répartition granulo ­
métrique.  
— Détails sur la méthode de chimie analytique utilisée et la méthode de 
validation (notamment rendement de récupération de la substance d’essai 
à partir du milieu d’échantillonnage).  
— Méthode de randomisation utilisée pour l’assignation des animaux aux 
groupes d’essai et aux groupes témoins.  
— Détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau (notamment origine/type 
de régime alimentaire, origine de l’eau).  
— Justification du choix des concentrations d’essai.  
Résultats  
— Tableau présentant la température, le taux d’humidité et le débit d’air 
dans la chambre d’inhalation.  
— Tableau de données sur les concentrations nominales et réelles dans la 
chambre d’inhalation.  
— Tableau de données sur la taille des particules, notamment données 
analytiques sur le prélèvement d’échantillons, la répartition granulomé ­
trique et les calculs du DAMM et de σ g . 
— Tableau de données sur les réponses et le niveau de concentration pour 
chaque animal (pour les animaux montrant des signes de toxicité, notam ­
ment mortalité, nature, sévérité, moment d’apparition et durée des 
effets).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 300
 
— Tableau du poids de chacun des animaux.  
— Tableau de la consommation de nourriture.  
— Tableau des résultats de pathologie clinique.  
— Résultats de l’autopsie et observations histopathologiques pour chaque 
animal, s’ils sont disponibles.  
— Tableau de tous les autres paramètres mesurés.  
Discussion et interprétation des résultats  
— Un effort particulier est consacré à la description des méthodes utilisées 
pour répondre aux critères de la présente méthode d’essai, par exemple en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules.
 
— La respirabilité des particules est abordée à la lumière des résultats 
d’ensemble, en particulier si les critères de taille des particules n’ont 
pu être remplis.  
— La cohérence des méthodes utilisées pour déterminer les concentrations 
nominales et réelles, et la relation entre la concentration réelle et la 
concentration nominale, sont incluses dans l’appréciation d’ensemble de l’étude.
 
— La cause probable de la mort et le mode d’action prédominant (sys ­
témique ou local) sont abordés.  
— Une explication est apportée s’il a fallu euthanasier des animaux qui 
souffraient ou montraient des signes de détresse sévère et persistante, en se basant sur les critères du document d’orientation de l’OCDE sur les 
effets mesurés éthiquement acceptables (3).
 
— Le ou les organes cibles sont identifiés.  
— La concentration sans effet nocif observé (CSENO) et la concentration 
minimale avec effet nocif observé (CMENO) sont déterminées.  
BIBLIOGRAPHIE:  
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n o 412 d’origine, direction de l’environnement, OCDE, Paris.  
(2) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations n
 o 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OCDE, Paris.  
(3) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Évaluation, Publications Hygiène et Sécurité de l’environ ­
nement – Série sur les essais et évaluations n  o 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OCDE, Paris.  
(4) Whalan J.E. et Redden J.C. (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
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ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 301
 
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(9) Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
 
(10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J, Spit B.J., 
Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992). The 
role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis D.J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Règlement (CE) n  o 1272/2008 du Parlement européen et du Conseil du 
16 décembre 2008 relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage 
des substances et des mélanges, modifiant et abrogeant les directives 
67/548/CEE et 1999/45/CE et modifiant le règlement (CE) n  o 1907/2006 
(JO L 353 du 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 302
 
Appendice 1  
DÉFINITION  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 303
 
B.9. TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES (28 JOURS) (ADMINISTRA ­
TION CUTANÉE)  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B (point A).  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B (point B).  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Aucune.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance à tester est appliquée quotidiennement, à doses crois ­
santes, sur la peau de plusieurs lots d'animaux d'expérience pendant une période déterminée, à raison d'une seule dose par lot, pendant 
une durée de 28 jours. Durant la période d'application, les animaux 
sont observés quotidiennement afin de déceler les signes de toxicité. Les animaux qui meurent en cours d'expérience ainsi que ceux qui sont encore en vie à l'issue de l'expérience sont autopsiés.
 
1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Préparation  
Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et 
d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux jeunes et sains 
sont répartis selon les règles du hasard entre les différents lots 
témoins et traités. Peu de temps avant l'essai, on tond la région dorsale du tronc des animaux. On peut avoir recours au rasage mais, dans ce cas, l'opération doit être effectuée 24 heures environ 
avant l'essai. Il est en général nécessaire de répéter les opérations de 
tonte ou de rasage à des intervalles d'une semaine environ, en évitant toute lésion de la peau. La surface à préparer pour l'application de la substance ne doit pas être inférieure à 10 % de la surface corporelle. 
Le poids de l'animal doit être pris en considération pour décider de la 
taille de la zone à épiler, et de la dimension de la surface à traiter. Lorsque le test concerne des substances solides qui, le cas échéant, 
peuvent être pulvérisées, la substance à tester doit être humectée au 
moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à garantir un bon contact avec la peau. Les substances liquides sont généralement appliquées non diluées. On procède à une application 
quotidienne à raison de 5 à 7 jours par semaine.
 
1.6.2.  Conditions de l'essai  
1.6.2.1.  Animaux d'expérience  
On peut utiliser des rats, des lapins ou des cobayes adultes. On peut 
également utiliser d'autres espèces, mais il faut dans ce cas en 
justifier l'utilisation.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 304
 
Au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux 
utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise.  
1.6.2.2.  Nombre et sexe  
Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles), à la peau saine, 
sont utilisés pour chaque dose. Les femelles doivent être nullipares et 
non-gravides. S'il est prévu dans le protocole expérimental des sacri ­
fices intermédiaires en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter la quantité d'animaux nécessaire pour ces sacrifices. De plus, un lot satellite de 10 animaux (5 par sexe) peut être traité à la dose la 
plus élevée pendant 28 jours et faire l'objet d'une observation relative 
à la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive d'effets toxiques durant les 14 jours qui suivent l'arrêt du traitement. On utilise aussi un lot satellite témoin de 10 animaux (cinq animaux 
par sexe).
 
1.6.2.3.  Doses  
On utilise au moins trois doses ainsi qu'un lot témoin ou, le cas 
échéant, un lot témoin traité avec le véhicule. La période d'exposition 
devra être d'au moins 6 heures par jour. La substance à tester doit être appliquée chaque jour au même moment et les quantités à administrer doivent faire l'objet d'une adaptation régulière (hebdoma ­
daire ou bihebdomadaire) afin de conserver un niveau de dose 
constant par rapport au poids corporel des animaux. Excepté l'admi ­
nistration de substance d'essai, les animaux du lot témoin doivent être traités de la même manière que les animaux des lots d'expé ­
rience. Lorsqu'un véhicule est utilisé pour faciliter l'administration, 
celui-ci sera administré au lot témoin dans les mêmes conditions qu'aux lots traités et la quantité de véhicule correspondra à celle reçue par le groupe traité avec la dose de substance d'essai la plus 
élevée. La dose la plus élevée doit être suffisamment forte pour 
produire des effets toxiques mais sans toutefois entraîner la mort (ou rarement). La dose la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet toxique. Lorsque l'on dispose d'une estimation concernant l'ex ­
position de l'homme, la dose la plus faible doit être supérieure à cette 
valeur. Dans les conditions idéales, la concentration intermédiaire doit produire des effets toxiques minimaux observables. Si l'on utilise plusieurs concentrations intermédiaires, celles-ci doivent être 
espacées de façon à entraîner une gradation des effets toxiques. En 
cas de mortalité dans les lots recevant les doses faibles et inter ­
médiaires, ainsi que dans les lots témoins, celle-ci devra être minime pour que l'évaluation des résultats soit valable.
 
Si l'application de la substance d'essai provoque une irritation 
cutanée grave, les concentrations doivent être réduites, ce qui peut entraîner une diminution, voire une disparition, des autres effets 
toxiques à la dose la plus élevée. De plus, si les lésions cutanées 
sont très graves, il peut se révéler nécessaire d'arrêter l'expérience et de la recommencer avec des concentrations plus faibles.
 
1.6.2.4.  Essai «limite»  
Si une expérience préliminaire réalisée avec une dose de 1 000 
mg/kg de poids corporel ou avec une dose plus élevée en fonction de l'exposition possible pour l'homme, n'a provoqué aucun effet 
toxique, il peut s'avérer inutile de poursuivre l'expérience.
 
1.6.2.5.  Période d'observation  
Les animaux d'expérience doivent faire l'objet d'une observation 
quotidienne afin de déceler les symptômes d'intoxication. Le 
moment où les symptômes d'intoxication apparaissent et disparais ­
sent ainsi que le moment de la mort doivent être consignés.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 305
 
1.6.3.  Mode opératoire  
Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. Dans 
les conditions idéales, la substance d'essai est administrée aux animaux 7 jours sur 7, pendant une période de 28 jours. Les 
animaux de tous les lots satellites destinés à des observations 
complémentaires doivent être gardés en vie pendant 14 jours encore, sans traitement, afin de constater la régression ou la persis ­
tance des effets toxiques. La durée de l'exposition doit être au moins 
de 6 heures par jour.
 
La substance d'essai doit être appliquée uniformément sur une 
surface représentant environ 10 % de la surface corporelle totale 
mais lorsqu'il s'agit de substances hautement toxiques, la surface 
couverte peut être réduite. La couche de substance doit être aussi mince et uniforme que possible.
 
Durant l'exposition, la substance d'essai est maintenue en contact 
avec la peau au moyen d'une compresse de gaze poreuse et d'un sparadrap non irritant. La surface traitée doit, en outre, être convena ­
blement couverte de manière à maintenir en place le pansement de 
gaze et la substance d'essai et de manière à éviter que les animaux 
puissent ingérer la substance à tester. Des appareils de contention peuvent être utilisés pour empêcher l'ingestion de la substance mais une immobilisation complète n'est pas recommandée. Il est égale ­
ment possible d'utiliser la technique du «collier de protection».
 
À l'issue de la période d'exposition, il faut, si possible, éliminer la 
substance résiduelle avec de l'eau ou par tout autre procédé adéquat de nettoyage de la peau.
 
Tous les animaux doivent être observés quotidiennement et les 
signes de toxicité ainsi que le moment de leur apparition, leur inten ­
sité et leur durée doivent être notés. Les observations doivent 
concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des 
muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato ­
motrice et du comportement. Les animaux doivent être pesés chaque 
semaine. Il est également recommandé d'effectuer des mesures 
hebdomadaires sur la consommation alimentaire des animaux. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin de veiller à ce que, dans la mesure du possible, ceux-ci ne soient pas perdus 
pour l'expérience pour des raisons telles que cannibalisme, autolyse 
des tissus au cours des remises en cages. A l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants appartenant aux lots traités, non satel ­
lites, sont autopsiés. Les animaux moribonds et les animaux dans un 
état de détresse ou de douleur intenses doivent être immédiatement 
retirés, euthanasiés et autopsiés.
 
Les examens figurant ci-après seront effectués à l'issue de la période 
d'essai sur tous les animaux (y compris les témoins):  
1. examen hématologique comprenant au moins l'hématocrite, la 
concentration en hémoglobine, le dénombre ment des érythrocytes et des leucocytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la 
coagulation;
 
2. examen biochimique clinique du sang comprenant au moins un 
paramètre des fonctions hépatiques et rénales: alanine aminotrans ­
férase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase 
glutamopyru-vique), aspartate aminotransférase sérique (ancienne ­
ment connue sous le nom de transaminase glutano-oxalo- acétique), urée, albumine, créatinine, bilirubine totale et protéines 
sériques totales.
 
D'autres déterminations éventuellement nécessaires à une évaluation 
toxicologique adéquate concernent le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, la glycémie à jeun, l'analyse 
des lipides, les hormones, l'équilibre acido-basique, la méthémoglo ­
bine, l'activité cholinestérasique.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 306
 
D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si nécessaire, être 
effectuées pour approfondir l'étude des effets observés.  
1.6.4.  Autopsie  
Tous les animaux soumis à l'essai doivent faire l'objet d'une autopsie 
macroscopique. Au moins le foie, les reins, les glandes surrénales et 
les testicules doivent être pesés à l'état humide le plus rapidement 
possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Organes et tissus, à savoir, peau normale et traitée, foie, reins, rate, testicules, glandes surrénales, cœur et les organes-cibles (c'est-à-dire ceux qui 
présentent des lésions importantes ou des modifications de leur 
volume) doivent être conservés dans un milieu approprié en vue d'éventuels examens histopathologiques ultérieurs.
 
1.6.5.  Examen histopathologique  
Pour le lot exposé à la dose la plus élevée et le lot témoin, il faut 
pratiquer un examen histologique systématique de tous les organes et des tissus conservés. Les organes et tissus qui auront présenté des 
lésions attribuables à la substance à tester à la dose la plus élevée 
devront être examinés dans tous les lots ayant été exposés à des doses plus faibles. Les animaux de tout lot satellite devront faire l'objet d'un examen histologique particulièrement axé sur les 
organes et les tissus pour lesquels les lésions ont été constatées 
dans les lots traités.
 
2. DONNÉES  
Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indi ­
quant, pour chaque lot d'expérience, nombre d'animaux au début de l'essai et le nombre d'animaux présentant chaque type de lésion.
 
Tous les résultats observés doivent être évalués au moyen d'une 
méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée.
 
3. RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— données concernant les animaux (espèce, souche, origine, condi ­
tions ambiantes, régime alimentaire, etc.),  
— conditions de l'essai, (y compris le type de pansement: occlusif 
ou non-occlusif),  
— doses (avec, le cas échéant, le véhicule) et concentrations,  
— dose sans effet, lorsque c'est possible,  
— données relatives à la réponse toxique par sexe et par dose,  
— indication du moment de la mort en cours d'expérience ou des 
survies au terme de l'expérience,  
— effets toxiques ou autres,  
— moment de l'observation de tout symptôme anormal et évolution 
de celui-ci,  
— données relatives à la prise de nourriture et à l'évolution du poids 
corporel,  
— examens hématologiques pratiqués et résultats complets,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 307
 
— examens biochimiques cliniques pratiqués et résultats complets,  
— résultats d'autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques,  
— traitement statistique des résultats, si possible,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B (point D).  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B (point E).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 308
 
B.10.  MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VITRO D'ABERRATION 
CHROMOSOMIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
473, Essai d'aberration chromosomique in vitro chez les mammi ­
fères (1997).  
1.1. INTRODUCTION  
L'essai d'aberration chromosomique in vitro est destiné à détecter les 
agents qui provoquent des aberrations chromosomiques de structure 
dans des cellules de mammifère en culture (1) (2) (3). Les aberra ­
tions de structure peuvent être de deux types: chromosomiques ou chromatidiennes. La majorité des mutagènes chimiques induisent des 
aberrations de type chromatidien, mais parfois de type chromoso ­
mique. Une augmentation de la fréquence de polyploïdie peut indi ­
quer qu'une substance chimique possède la faculté de provoquer des aberrations du nombre des chromosomes. Cet essai n'est cependant 
pas conçu pour évaluer les aberrations de nombre et il n'est généra ­
lement pas utilisé à cette fin. Les mutations chromosomiques et les événements liés sont à l'origine de beaucoup de maladies génétiques humaines et on a de bonnes raisons de penser que les mutations 
chromosomiques et événements liés, touchant les oncogènes et les 
gènes suppresseurs de tumeurs des cellules somatiques, jouent un rôle dans l'induction de cancers chez l'homme et chez les animaux de laboratoire.
 
L'essai d'aberration chromosomique in vitro peut être pratiqué sur 
des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Les cellules utilisées sont choisies en fonction de leur potentiel de croissance en culture, de la stabilité 
de leur caryotype, du nombre et de la diversité des chromosomes et 
de la fréquence des aberrations chromosomiques spontanées.
 
Les essais in vitro requièrent généralement l'utilisation d'une source 
exogène d'activation métabolique. Ce système d'activation métabolique 
est incapable de reproduire parfaitement les conditions présentes in 
vitro chez les mammifères. Il faut éviter absolument d'introduire des conditions qui conduiraient à des résultats positifs ne reflétant pas une mutagénicité intrinsèque et pouvant provenir de modification du pli, 
de l'osmolalité, ou d'une forte cytotoxicité (4) (5).
 
Cet essai est utilisé pour le dépistage de substances pouvant être 
mutagènes et cancérigènes pour les mammifères. Bien que de 
nombreux composés donnant un résultat positif lors de cet essai 
soient cancérigènes pour les mammifères, il n'y a pas de corrélation parfaite entre cet essai et la cancérogénicité. La corrélation dépend de la classe chimique mais d'autre part, de plus en plus d'arguments 
laissent penser qu'il existe des agents cancérigènes que cet essai ne 
permet pas de détecter parce qu'ils agissent par des mécanismes qui n'impliquent pas des lésions directes de l'ADN.
 
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Aberration de type chromatidien:  lésion chromosomique de struc ­
ture se traduisant par une cassure d'une seule chromatide ou par une cassure et une réunion entre chromatides.
 
Aberration de type chromosomique:  lésion chromosomique de 
structure se traduisant par une cassure, ou par une cassure et une 
réunion, des deux chromatides sur le même site.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 309
 
Endoreduplication:  processus dans lequel le noyau, après une phase 
S de implication, n'entre pas en mitose mais commence une autre 
phase S. Il en résulte des chromosomes avec 4, 8, 16, ... chroma ­
tides.  
Lacune  («gap»): lésion achromatique plus petite que la largeur d'une 
chromatide, avec un défaut d'alignement minimal des chromatides.  
Index mitotique:  nombre de cellules en métaphase divisé par le 
nombre total de cellules dans une population une indication de la 
vitesse de prolifération de cette population.  
Aberration de nombre:  modification du nombre de chromosomes 
par rapport au nombre normal caractéristique des cellules employées.  
Polyploïde:  état multiple du nombre de chromosomes haploïdes ( n), 
autre que la diploïdie (c'est-à-dire 3 n, 4n, etc.).  
Aberration de structure:  modification de la structure des chromo ­
somes, détectable par un examen au microscope au stade de la 
métaphase et se présentant sous la forme de délétions, de cassures, de modifications intrachromosomiques ou interchromosomiques.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Des cultures de cellules sont exposées à la substance d'essai avec et 
sans activation métabolique. Après avoir été exposées à la substance d'essai, les cultures de cellules sont, à intervalles préétablis, traitées par une substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple 
de la clochicine ou du Colcemid
 ® ), récoltées et teintées. Les cellules 
en métaphase sont soumises à un examen microscopique afin de déceler les aberrations chromosomiques.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparations  
1.4.1.1.  Cellules  
Diverses lignées cellulaires, souches cellulaires ou cultures de 
cellules primaires, y compris des cellules humaines, peuvent être 
utilisées (par exemple les fibroblastes de hamster chinois, les 
lymphocytes du sang périphérique de l'homme ou d'autres mammi ­
fères).  
1.4.1.2.  Milieu et conditions de culture  
Il convient d'utiliser un milieu de croissance et des conditions d'in ­
cubation (récipients de culture, concentration de CO  2 , température 
et degré d'humidité) appropriés pour la croissance cellulaire. La stabilité du nombre modal de chromosomes et l'absence de contami ­
nation par des mycoplasmes doivent être vérifiées régulièrement dans 
les lignées cellulaires établies et les souches cellulaires. En cas de contamination, elles ne doivent pas être utilisées. La durée normale du cycle cellulaire de la lignée cellulaire et les conditions de culture 
utilisées doivent être connues.
 
1.4.1.3.  Préparation des cultures  
Lignées et souches cellulaires établies: les cellules sont multipliées à 
partir de stocks cellulaires, ensemencées dans un milieu de culture à 
une densité telle que les cultures ne confluent pas avant la récolte, et 
incubées à 37  o C. ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 310
 
Lymphocytes: du sang complet traité avec un anticoagulant (hépa ­
rine, par exemple) ou des lymphocytes isolés issus de donneurs sains 
sont ajoutés à un milieu de culture contenant un mitogène (par exemple la phytohémagglutinine) et sont incubés à 37
 o C. 
1.4.1.4.  Activation métabolique  
Les cellules doivent être exposées à la substance d'essai en présence 
et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le 
système le plus couramment utilisé est une fraction postmitochon ­
driale enrichie en cofacteurs (S9), préparée à partir de foie de rongeur traité avec des inducteurs enzymatiques, tels que de l'Aroclor 
1254 (6) (7) (8) (9) ou un mélange de phénobarbitone et de ß-naph ­
thoflavone (10) (11) (12).
 
La fraction postmitochondriale est généralement utilisée à des 
concentrations allant de 1 a 10 % v/v dans le milieu de culture final. Le choix du système d'activation métabolique peut dépendre 
de la classe chimique de la substance d'essai. Dans certains cas il 
peut être préférable d'utiliser plus d'une concentration de la fraction postmitochondriale.
 
Plusieurs procédés nouveaux, comme la création par génie génétique 
de lignées cellulaires exprimant des enzymes activantes spécifiques, 
sont susceptibles de fournir une activation endogène. Le choix des lignées cellulaires utilisées doit être justifié scientifiquement (par exemple par l'importance de l'isoenzyme du cytochrome P450 pour 
le métabolisme de la substance d'essai).
 
1.4.1.5.  Substances d'essai/préparation  
Les substances d'essai solides sont préparées par dissolution ou 
suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, puis éventuel ­
lement diluées avant le traitement des cellules. Les substances d'essai 
liquides peuvent être ajoutées directement au système d'essai et/ou 
diluées avant traitement. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.
 
1.4.2.  Conditions expérimentales  
1.4.2.1.  Solvant/véhicule  
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir chimiquement avec la 
substance d'essai ni altérer la survie des cellules et l'activité du mélange S9. L'emploi d'un solvant/véhicule inhabituel doit être 
justifié par des données faisant état de sa compatibilité. On préconise 
d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible. Dans le cas d'essais conduits avec des substances instables dans l'eau, on utilisera des solvants organiques 
exempts d'eau. L'eau peut être enlevée par addition d'un tamis molé ­
culaire.
 
1.4.2.2.  Concentrations d'exposition  
La cytotoxicité, la solubilité dans le système d'essai et les modifica ­
tions de pH et d'osmolalité sont des critères à prendre en considé ­
ration pour déterminer la dose la plus élevée à utiliser.  
La cytotoxicité est mesurée, avec et sans système d'activation méta ­
bolique, dans l'expérience principale par un indicateur approprié de l'intégrité et de la croissance cellulaires, tel que le degré de confluence des colonies cellulaires, le nombre de cellules viables 
ou l'index mitotique. Il peut être utile de déterminer la cytotoxicité 
et la solubilité lors d'un essai préliminaire.
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Il convient d'utiliser au moins trois concentrations analysables. Dans 
le cas d'une substance cytotoxique, on utilisera des concentrations 
qui couvrent un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale, ce qui signifie en général des concentrations sépa ­
rées par un facteur compris entre 2 et √10 au maximum. La concen ­
tration la plus élevée doit entraîner au moment de la récolte, une 
réduction significative (au moins 50 %) du degré de confluence, du nombre de cellules ou de l'index mitotique. Ce dernier varie dans le temps après le traitement et fournit seulement une mesure indirecte 
des effets cytotoxiques et cytostatiques. Cependant, l'index mitotique 
est une mesure acceptable pour des cultures en suspension pour lesquelles d'autres mesures de toxicité peuvent être incommodes ou irréalisables. Des données sur la cinétique du cycle cellulaire, par 
exemple le temps de génération moyen (TGM), peuvent fournir des 
compléments d'information. Toutefois, le TGM est une moyenne générale qui ne révèle pas toujours l'existence de «sous-populations en retard»; même de faibles augmentations du temps de génération 
moyen peuvent conduire à un retard très important du moment où le 
nombre d'aberrations est optimal.
 
En ce qui concerne les substances relativement non cytotoxiques, la 
concentration maximale doit être la plus basse des trois concentra ­
tions suivantes: 5 μl/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M.  
Pour les substances relativement insolubles qui ne sont pas toxiques 
aux concentrations solubles, la dose la plus élevée à tester doit être 
une concentration supérieure à la limite de solubilité dans le milieu de culture à la fin de la période de traitement. Dans certains cas (par exemple si la toxicité n'apparaît qu'à des concentrations supérieures à 
la plus faible concentration insoluble), il est recommandé de tester 
plusieurs concentrations auxquelles une précipitation est visible. Il peut être utile d'évaluer la solubilité au début et à la fin du traite ­
ment, celle-ci pouvant varier au cours de l'exposition dans le système 
d'essai en raison de la présence de cellules, de S9, de sérum, etc. On 
conclut à l'insolubilité lorsqu'une précipitation est observée à l'œil nu. Le précipité ne doit pas interférer avec l'évaluation des résultats.
 
1.4.2.3.  Témoins négatifs et positifs  
Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule), avec et sans 
activation métabolique, doivent être inclus simultanément dans chaque expérience. En présence d'un système d'activation métabo ­
lique, la substance utilisée comme témoin positif doit être celle qui 
exige l'activation pour donner une réponse mutagène.
 
On utilise comme témoin positif un clastogène connu à des niveaux 
d'exposition qui conduisent à un accroissement détectable et repro ­
ductible par rapport au bruit de fond, démontrant la sensibilité du 
système d'essai.  
Les doses des témoins positifs doivent être choisies de manière que 
les effets soient nets et que l'identité des lames codées ne soit pas 
évidente. Quelques exemples de témoins positifs figurent dans le tableau ci-dessous.
 
Condition d'activation métabolique Substances Numéro CAS Numéro EINECS  
En l'absence d'activation méta ­
bolique exogène Méthanesulfonate de méthyle 66-27-3 200-625-0 
Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 312
 
Condition d'activation métabolique Substances Numéro CAS Numéro EINECS  
Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 
N-oxyde de 4-nitroquinoléine 56-57-5 200-281-1 
En présence d'activation méta ­
bolique exogène Benzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 
Cyclophosphamide 
Monohydrate de cyclophos ­
phamidée 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
D'autres témoins positifs appropriés peuvent être utilisés. De plus, 
l'emploi de témoins positifs appartenant à la même classe chimique sera envisagé, s'ils sont disponibles.
 
Le solvant ou le véhicule doit être utilisé seul en tant que témoin 
négatif dans le même milieu de culture, dans les mêmes conditions que la substance d'essai et pour chaque temps de prélèvement. On 
utilisera également des témoins non traités, à moins que des essais 
antérieurs n'aient démontré que le solvant/véhicule choisi n'a pas d'effet délétère ou mutagène.
 
1.4.3.  Mode opératoire  
1.4.3.1.  Traitement avec la substance d'essai  
Les cellules en prolifération sont traitées avec la substance d'essai en 
présence et en l'absence de système d'activation métabolique. Le 
traitement des lymphocytes doit débuter environ 48 heures après la 
simulation mitogénique.  
1.4.3.2. On réalise normalement des cultures dupliquées à chaque niveau de 
dose. Des cultures dupliquées sont aussi vivement recommandées 
pour les témoins négatifs (solvant). Si des essais antérieurs ont 
démontré que la variation entre cultures dupliquées est minime (13) (14), l'utilisation d'une seule culture pour chaque concentration peut être envisagée.
 
Les substances gazeuses ou volatiles doivent être testées en utilisant 
des méthodes appropriées, par exemple dans des récipients de culture 
hermétiquement fermés (15) (16).  
1.4.3.3.  Récolte des cultures  
Pour la première expérience, les cellules sont exposées à la substance 
d'essai pendant 3 à 6 heures, en présence et en l'absence d'activation 
métabolique. On prélève ensuite des échantillons après un temps correspondant à environ 1,5 fois la durée du cycle cellulaire normal après le début du traitement (12). Si l'essai s'avère négatif, 
que ce soit avec ou sans activation métabolique, on effectue un essai 
supplémentaire sans activation. le traitement se poursuivant jusqu'au prélèvement d'échantillons après une période équivalente à environ 1,5 fois la durée du cycle cellulaire normal. Certaines substances 
peuvent être détectées plus facilement en prolongeant le temps de 
traitement et de prélèvement au-delà de 1,5 fois la durée du cycle cellulaire. Les résultats négatifs obtenus avec activation métabolique demandent à être confirmés cas par cas. Si la confirmation des 
résultats négatifs n'est pas jugée nécessaire, une justification doit 
être fournie.
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1.4.3.4.  Préparation des chromosomes  
Les cultures de cellules sont traitées avec du Colcemid  ® ou de la 
colchicine pendant 1 à 3 heures avant la récolte. Chaque culture est récoltée et traitée séparément en vue de la préparation des chromo ­
somes. Celle-ci consiste en un traitement hypotonique, une fixation 
et une coloration des cellules.
 
1.4.3.5.  Analyse  
Toutes les lames, y compris celles des témoins positifs et négatifs, 
doivent être codées individuellement avant l'analyse au microscope. 
Le procédé de fixation provoque souvent la rupture d'une certaine 
fraction des cellules en métaphase, ce qui entraîne une perte des chromosomes. Pour cette raison, toutes les cellules examinées doivent contenir un nombre de centromères égal au nombre modal 
± 2. Pour chaque dose et chaque témoin, il y a lieu d'examiner au 
moins 200 cellules en métaphase bien étalées et, le cas échéant, réparties de façon égale entre les cultures en double exemplaire. Ce nombre peut être réduit lorsqu'un grand nombre d'aberrations 
sont observées.
 
Bien que l'essai soit destiné à détecter les aberrations chromoso ­
miques de structure, il est important de signaler d'éventuels cas de polyploidie et d'endoreduplication.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
L'unité expérimentale étant la cellule, on détermine le pourcentage de 
cellules présentant une ou plusieurs aberrations de structure. Une liste des différents types d'aberrations chromosomiques de structure doit être établie avec leur nombre et leur fréquence dans les cultures 
traitées et les cultures témoins. Les lacunes sont enregistrées séparé ­
ment et rapportées mais ne sont généralement pas incluses dans la fréquence totale des aberrations.
 
On indiquera aussi les résultats des mesures concomitantes de 
cytoxicité pour toutes les cultures traitées et les témoins négatifs 
dans les principaux essais d'aberration chromosomique.  
Les données seront présentées séparément pour chaque culture. En 
outre, toutes les données doivent être résumées sous tonne de tableaux.
 
Il n'est pas obligatoire de vérifier une réponse nettement positive. Par 
contre, les résultats équivoques doivent être clarifiés par un ou des 
essais supplémentaires, de préférence dans des conditions expérimen ­
tales modifiées. La nécessité de confirmer les résultats négatifs est discutée au point 1.4.3.3. Lors des expériences complémentaires, il 
faut envisager la modification des paramètres de l'étude afin d'élargir 
l'éventail des conditions évaluées. Les paramètres susceptibles d'être modifiés comprennent l'intervalle entre les niveaux de dose et les conditions d'activation métabolique.
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, 
notamment un accroissement lié à la dose ou un accroissement 
reproductible du nombre de cellules présentant des aberrations. En premier lieu, il s'agir de prendre en considération la pertinence biolo ­
gique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des 
méthodes statistiques (3) (13) mais la signification statistique ne doit 
pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 314
 
Une augmentation du nombre de cellules polyploïdes peut signifier 
que la substance d'essai est capable d'inhiber les processus mitotiques 
et d'induire des aberrations de nombre. Une augmentation du nombre de cellules ayant des chromosomes endoredupliqués peut indiquer que la substance d'essai est capable d'inhiber la progression du 
cycle cellulaire (17) (18).
 
Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas 
aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en 
question n'est pas mutagène dans cet essai.  
Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement 
positifs ou négatifs, dans de rares cas l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas de conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou 
discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Des résultats positifs à l'essai d'aberration chromosomique in vitro 
indiquent que la substance d'essai induit des aberrations chromoso ­
miques de structure dans des cellules somatiques de mammifère en culture. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions expérimentales, la substance d'essai n'induit pas d'aberration chromo ­
somique dans des cellules somatiques de mammifère en culture.
 
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Cellules:  
— type et source des cellules,  
— données sur le caryotype et raisons du choix du type cellulaire 
utilisé,  
— absence de mycoplasme, le cas échéant,  
— données concernant le cycle cellulaire,  
— sexe des donneurs de sang, sang complet ou lymphocytes isolés, 
mitogène utilisé,  
— nombre de repiquages, le cas échéant,  
— méthodes d'entretien des cultures cellulaires, le cas échéant,  
— nombre modal de chromosomes.  
Conditions de l'essai:  
— identité de l'inhibiteur de 1a métaphase, sa concentration et la 
durée d'exposition des cellules,  
— justification du choix des concentrations et du nombre de 
cultures, y compris des données relatives à la cytotoxicité et 
aux limites de solubilité, si elles sont disponibles,  
— composition du milieu et, le cas échéant, la concentration 
de CO  2 , ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 315
 
— concentration de la substance d'essai,  
— volume de véhicule et de substances d'essai ajouté,  
— température d'incubation,  
— temps d'incubation,  
— durée du traitement,  
— densité cellulaire au moment de l'ensemencement, si nécessaire,  
— type et composition du système d'activation métabolique, y 
compris les critères d'acceptabilité,  
— témoins positifs et négatifs,  
— méthodes de préparation des lames,  
— critères de dénombrement des aberrations,  
— nombre de métaphases analysées,  
— méthodes de mesure de la toxicité,  
— critères pour conclure que l'étude est positive, négative ou équi ­
voque.  
Résultats:  
— signes de toxicité (degré de confluence, données sur le cycle 
cellulaire, comptage des cellules, index mitotique),  
— signes de précipitation,  
— données sur le pH et l'osmolalité du milieu de traitement, si elles 
ont été déterminées,  
— définition appliquée aux aberrations, y compris les lacunes,  
— nombre de cellules présentant des aberrations chromosomiques et 
type d'aberration, séparément pour chaque culture traitée et 
culture témoin,  
— changements de la ploïdie, le cas échéant,  
— relation dose-réponse, si possible.  
— analyses statistiques, le cas échéant,  
— données concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et 
positifs concomitants,  
— données historiques concernant les témoins négatifs (solvant/vé ­
hicule) et positifs (étendues, moyennes, écarts-types).  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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B.11.  MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VIVO D'ABERRATION CHRO ­
MOSOMIQUE SUR MOELLE OSSEUSE DE MAMMIFÈRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
475, Essai d'aberration chromosomique sur moelle osseuse de 
mammifères (1997).  
1.1. INTRODUCTION  
L'essai in vivo d'aberration chromosomique est destiné à identifier 
les agents qui provoquent des aberrations chromosomiques de struc ­
ture dans des cellules de moelle osseuse d'animaux, généralement des rongeurs (1, 2, 3, 4). Les aberrations de structure peuvent être de deux types: chromosomiques ou chromatidiennes. Une augmen ­
tation de la fréquence de polyploïdie peut indiquer qu'une substance 
chimique possède la faculté de provoquer des aberrations du nombre des chromosomes. La majorité des mutagènes chimiques induisent des aberrations de type chromatidien, mais parfois de type chromo ­
somique. Les mutations chromosomiques et les événements connexes 
sont à l'origine de beaucoup de maladies génétiques humaines et on a de bonnes raisons de penser que les mutations chromosomiques et événements connexes, touchant les oncogènes et les gènes suppres ­
seurs de tumeurs des cellules somatiques, jouent un rôle dans l'in ­
duction de cancers chez l'homme et chez les animaux de laboratoire.
 
Les rongeurs sont couramment utilisés dans cet essai. Cet essai se 
pratique sur la moelle osseuse parce que c'est un tissu très vascula ­
risé, formé d'une population de cellules au cycle rapide et faciles à prélever et traiter. D'autres espèces et tissus cibles ne font pas l'objet de cette méthode.
 
Cet essai d'aberration chromosomique se prête particulièrement bien 
à l'évaluation du risque mutagène, en ce sens qu'il permet de prendre en compte des facteurs de métabolisme in vivo, de pharmacociné ­
tique et de processus de réparation de l'ADN. Ces facteurs peuvent 
cependant varier d'un animal à un autre et d'un tissu à un autre. Un 
essai in vivo est aussi utile pour vérifier un effet mutagène détecté par un essai in vitro.
 
On n'aura pas recours à cet essai s'il est manifeste que la substance 
d'essai ou un métabolite réactif n'atteindra pas le tissu cible.  
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Aberration de type chromatinien:  lésion chromosomique de struc ­
ture se traduisant par une cassure d'une seule chromatide ou par une 
cassure et une réunion entre chromatides.  
Aberration de type chromosomique:  lésion chromosomique de 
structure se traduisant par une cassure, ou par une cassure et une 
réunion, des deux chromatides sur le même site.  
Endoreduplication:  processus dans lequel le noyau, après une phase 
S de réplication, n'entre pas en mitose mais commence une autre 
phase S. Il en résulte des chromosomes avec 4, 8, 16, ... chroma ­
tides.  
Lacune:  lésion achromatique inférieur à la largeur d'une chromatide 
avec un défaut d'alignement minimal des chromatides.  
Aberration de nombre:  modification du nombre de chromosomes 
par rapport au nombre normal caractéristique des cellules employées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 319
 
Polyploïdie:  état multiple du nombre de chromosomes haploïdes ( n), 
autre que la diploïdie (c'est-à-dire 3 n, 4n, etc.).  
Aberration de structure:  modification de la structure des chromo ­
somes, détectable par un examen au microscope au stade de la métastase et se présentant sous la forma de délétions, de cassure, 
de modifications intrachromosomiques ou interchromosomiques.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d'ex ­
position appropriée et sont sacrifiés à des moments appropriés après 
le traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec une substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple de la colchicine ou du Colcemid
 ® ). Ensuite, les préparations chromoso ­
miques réalisées à partir des cellules de moelle osseuse sont colorées, 
et les cellules en métaphase sont examinées en vue de la mise en évidence d'aberrations chromosomiques.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparations  
1.4.1.1.  Sélection des espèces, animales  
Bien que le rat, la souris et le hamster chinois soient habituellement 
utilisés, n'importe quelle espèce de mammifère appropriée peut être 
utilisée. Il convient d'utiliser des animaux adultes, jeunes et sains 
issus de souches couramment utilisées en laboratoire. Au début de l'étude, la différence pondérale entre les animaux doit être minimale et ne pas dépasser ± 20 % du poids moyen de chaque sexe.
 
1.4.1.2.  Conditions d'encagement et régime alimentaire  
Les conditions générales décrites dans l'introduction générale de la 
partie B sont appliquées mais le taux d'humidité devrait se situer aux environs de 50-60 %.
 
1.4.1.3.  Préparation des animaux  
Les animaux sont répartis par randomisation entre les groupes 
témoins et les groupes traités. Les cages doivent être disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effet dû à leur emplacement. Les 
animaux sont identifiés individuellement. Ils sont acclimatés aux 
conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours.
 
1.4.1.4.  Préparation des doses  
Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension 
dans un véhicule ou un solvant approprié, puis si nécessaire diluées 
avant d'être administrées aux animaux. Les substances d'essai liquides peuvent être administrées directement ou après dilution. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de 
données qui démontrent la stabilité des préparations dans les condi ­
tions du stockage.
 
1.4.2.  Conditions expérimentales  
1.4.2.1.  Solvant/véhicule  
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas avoir d'effet toxique aux doses 
utilisées ni présenter de réaction chimique avec la substance d'essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données sur leur compatibilité. On préconise d'envisager d'abord 
l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est 
possible.
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1.4.2.2.  Témoins  
Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent être 
inclus pour chaque sexe et dans chaque essai. Les animaux des groupes témoins doivent être manipulés exactement comme ceux 
des groupes traités, mise à part l'administration de la substance 
d'essai.
 
Les témoins positifs doivent produire des aberrations chromoso ­
miques de structure in vivo à des niveaux d'exposition supposés 
provoquer un accroissement détectable par rapport au bruit de 
fond. Les doses de témoin positif doivent être choisies afin que les effets soient évidents mais que l'identité des lames codées ne soit pas révélée immédiatement à l'examinateur. Le témoin positif peut être 
administré par une voie différente de celle utilisée pour la substance 
d'essai et un seul prélèvement d'échantillon peut suffire. L'emploi de témoins positifs appartenant à la même classe chimique peut être envisagé, s'ils sont disponibles. Les substances indiquées dans le 
tableau ci-dessous sont des exemples de témoins positifs.
 
Substance Numéro CAS Numéro Einecs  
Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 
Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamide 
Monohydrate de cyclophosphamide 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Triéthylènemélamine 51-18-3 200-083-5
 
Lors de chaque prélèvement, il faut inclure un lot d'animaux témoins 
négatifs traités seulement avec le solvant ou le véhicule et par ailleurs manipulés de la même façon que les groupes traités. Ceci 
peut être évité si l'on dispose de données acceptables sur la variabi ­
lité interindividuelle et la fréquence spontanée de cellules comportant des aberrations chromosomiques provenant de témoins historiques. Dans le cas où un seul prélèvement est effectué pour les témoins 
négatifs, le premier temps de prélèvement est le plus approprié. En 
outre, des témoins non traités doivent aussi être inclus, à moins que des données historiques ne démontrent que le solvant/véhicule choisi n'induit aucun effet délétère ou mutagène.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Nombre et sexe des animaux  
Chaque groupe traité et groupe témoin doit comprendre au moins 
cinq animaux analysables par sexe. Si, au moment de l'étude, on dispose de données historiques sur la même espèce et avec la 
même voie d'administration démontrant l'absence de différence 
notable de toxicité entre les sexes, la réalisation de l'essai sur un seul sexe est acceptable. Si l'exposition humaine est spécifique du sexe, par exemple dans le cas de certains produits pharmaceutiques, 
des animaux du sexe approprié doivent être utilisés pour l'essai.
 
1.5.2.  Modalité de traitement  
Il est préférable d'administrer la substance d'essai en une seule fois. 
Elle peut aussi être administrée en doses fractionnées (deux doses le même jour avec un intervalle de quelques heures au maximum) afin que l'administration d'un grand volume soit plus aisée. D'autres 
modalités de traitement sont acceptables s'ils sont scientifiquement 
justifiés.
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Les échantillons sont prélevés après le traitement à deux moments 
différents de la même journée. Pour les rongeurs, le premier prélè ­
vement après le traitement est effectué après une période de 1,5 fois la durée normale du cycle cellulaire (généralement de 12 à 18 heures). Étant donné que le temps requis par l'absorption et le méta ­
bolisme de la substance d'essai ainsi que l'effet de celle-ci sur la 
cinétique du cycle cellulaire peuvent influer sur le moment optimal de détection des aberrations, on recommande d'effectuer un autre prélèvement 24 heures après le premier. Si le traitement s'étend sur 
plus d'une journée, le prélèvement doit avoir lieu après une période 
de 1,5 fois la durée normale du cycle cellulaire après la dernière administration.
 
Avant d'être sacrifiés, les animaux reçoivent une dose appropriée 
d'une substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple du Colcemid
 ® ou de la colchicine) par injection intrapéritonéale. Les 
prélèvements sont effectués après une période appropriée, qui est de 
3 à 5 heures pour la souris et de 4 à 5 heures pour le hamster 
chinois. Les cellules sont prélevées de la moelle osseuse et analysées en vue de la détection d'aberrations chromosomiques.
 
1.5.3.  Niveaux de dose  
Si une étude préliminaire est réalisée afin d'évaluer les niveaux de 
dose requis, cette étude doit être effectuée dans le même laboratoire en utilisant la même espèce, la même souche, des animaux du même 
sexe et la même modalité de traitement que ceux de l'étude princi ­
pale (5). En cas de toxicité, on utilise trois niveaux de dose pour le premier prélèvement. Ces niveaux de dose doivent couvrir un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale. 
Pour les prélèvements suivants, seule la dose la plus élevée est 
utilisée. Celle-ci est définie comme la dose qui produit des signes de toxicité tels qu'ils font supposer que des doses plus fortes, admi ­
nistrées selon les mêmes modalités, seraient létales. Les substances 
possédant une activité biologique spécifique à des doses faibles et 
non toxiques (comme les hormones et les mitogènes) peuvent faire exception aux critères d'établissement des doses et doivent être évaluées cas par cas. La dose la plus élevée peut aussi être définie 
comme étant celle qui produit certains indices de toxicité dans la 
moelle osseuse (par exemple une diminution de plus de 50 % de l'index mitotique).
 
1.5.4.  Test limite  
Si un essai réalisé avec au moins 2 000 mg/kg de poids corporel, en 
une seule dose ou en deux doses administrées le même jour, n'en ­
gendre aucun effet toxique observable et si une génotoxicité est 
improbable d'après les données relatives à des substances de struc ­
ture voisine, on peut considérer qu'une étude complète avec trois niveaux de doses n'est pas nécessaire. Pour les études de plus longue durée, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel 
par jour dans le cas d'un traitement d'une durée allant jusqu'à 14 
jours et de 1 000 mg/kg de poids corporel par jour pour les études plus longues. Suivant l'importance de l'exposition humaine probable, on peut envisager d'utiliser des doses plus fortes dans l'essai de dose 
limite.
 
1.5.5.  Voies d'administration  
La substance d'essai est généralement administrée par gavage à 
l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation adaptée, 
ou par injection intrapéritonéale. D'autres voies d'exposition sont 
acceptables lorsqu'elles peuvent être justifiées. Le volume maximal de liquide administré en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne devrait pas dépasser 
2 ml/100g de poids corporel. Une justification doit être fournie si 
des volumes plus importants sont administrés. Il convient de réduire au minimum la variation du volume administré en ajustant la concentration à tous les niveaux de doses, sauf pour les 
produits irritants ou corrosifs dont les effets sont généralement 
exacerbés lorsqu'on augmente la concentration.
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1.5.6.  Préparation des chromosomes  
La moelle osseuse est extraite immédiatement après le sacrifice, 
exposée à une solution hypotonique et fixée. Les cellules sont alors étalées sur des lames et colorées.
 
1.5.7.  Analyse  
L'index mitotique sert de mesure de la cytotoxicité et doit être 
déterminé sur un minimum de 1 000 cellules pour chaque animal 
traité (y compris les témoins positifs) et pour chaque témoin 
négatif non traité.  
L'analyse des aberrations chromosomiques doit porter sur au moins 
100 cellules de chaque animal. Ce nombre peut être réduit lorsque 
les aberrations observées sont nombreuses. Toutes les lames, y compris celles des témoins négatifs et positifs, doivent être codées indépendamment avant l'analyse au microscope. Comme le procédé 
de fixation provoque souvent la rupture d'une certaine fraction des 
cellules en métaphase, entraînant une perte de chromosomes, toutes les cellules examinées doivent contenir un nombre de centromères égal à 2n ± 2.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les résultats individuels pour chaque animal doivent être présentés 
sous forme de tableaux. L'unité expérimentale est l'animal. Pour 
chaque animal, on indiquera le nombre de cellules examinées et on évaluera le nombre d'aberrations par cellule ainsi que le pourcen ­
tage de cellules présentant une ou plusieurs aberrations de structure. 
Les différents types d'aberrations chromosomiques de structure 
doivent être consignés avec leur nombre et leur fréquence pour les groupes traités et les groupes témoins. Les lacunes sont enregistrées séparément et rapportées mais ne sont généralement pas incluses 
dans la fréquence totale des aberrations. S'il n'y a pas de différence 
de réponse entre sexes, les données des deux sexes peuvent être combinées dans l'analyse statistique.
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, 
notamment un accroissement dose-dépendant du nombre relatif de cellules présentant des aberrations ou une augmentation nette du 
nombre de cellules présentant des aberrations dans un seul groupe 
traité à un seul temps de prélèvement. En premier lieu, il s'agit de déterminer la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques (6) mais la 
signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour 
conclure à une réponse positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées.
 
Une augmentation du nombre de cellules polyploïdes peut signifier 
que la substance d'essai est capable d'induire des aberrations de nombre. Une augmentation du nombre de cellules présentant des 
chromosomes endoredupliqués peut indiquer que la substance 
d'essai est capable d'inhiber la progression du cycle cellulaire (7) (8).
 
Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas 
aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en 
question n'est pas mutagène dans cet essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 323
 
Bien que la plupart des essais donneront des résultats manifestement 
positifs ou négatifs, dans de rares cas l'ensemble des résultats d'un 
essai n'autorise pas de conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Des résultats positifs obtenus dans cet essai in vivo d'aberration 
chromosomique indiquent qu'une substance induit des aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse de l'espèce testée. Des résul ­
tats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai, la subs ­
tance testée n'induit pas d'aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse de l'espèce testée.
 
Le fait que la substance d'essai ou ses métabolites atteignent la 
circulation générale ou spécifiquement le tissu cible (toxicité systémique) doit être discuté.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Animaux d'expérience:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids individuel des animaux au début de l'essai, y compris 
l'intervalle des poids, la moyenne et l'écart-type dans chaque groupe.
 
Conditions expérimentales:  
— données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhi ­
cule),  
— résultats de l'étude de détermination des doses utiles, si elle a été 
réalisée,  
— justification du choix des doses employées,  
— détails concernant la préparation de la substance d'essai,  
— détails concernant l'administration de la substance d'essai,  
— justification du choix de la voie d'administration,  
— méthodes pour vérifier que la substance a atteint la grande circu ­
lation ou le tissu cible, le cas échéant,  
— conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans 
l'eau de boisson ou la nourriture en dose réelle (mg/kg de poids 
corporel/jour), s'il y a lieu,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau,  
— description détaillée des modalités de traitement et de prélève ­
ment,  
— méthodes de mesure de la toxicité,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 324
 
— nature et concentration de l'inhibiteur du fuseau mitotique et 
durée du traitement,  
— méthodes de préparation des lames,  
— critères de dénombrement des aberrations,  
— nombre de cellules analysées par animal,  
— critères de décision concernant les résultats positifs, négatifs et 
équivoques.  
Résultats:  
— signes de toxicité,  
— index mitotique,  
— type et nombre d'aberrations, séparément pour chaque animal,  
— nombre total d'aberrations par groupe, moyennes et écarts-types,  
— nombre de cellules présentant des aberrations par groupe, 
moyennes et écarts-types,  
— changements de la ploïdie, le cas échéant,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— analyses statistiques, le cas échéant,  
— données concernant les témoins négatifs concomitants,  
— données concernant les témoins négatifs antérieurs (étendues, 
moyennes et écarts-types),  
— données concernant les témoins positifs concomitants.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
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B.12.  MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VIVO DU MICRONOYAU SUR 
ÉRYTHROCYTES DE MAMMIFÈRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
474, Test du micronoyau sur les érythrocytes de mammifère (1997).  
1.1. INTRODUCTION  
L'essai du micronoyau in vivo sur des cellules de mammifère est 
pratiqué en vue de détecter des lésions des chromosomes ou de 
l'appareil mitotique d'érythroblastes résultant de l'action d'une subs ­
tance d'essai. Il repose sur l'analyse d'érythrocytes prélevés dans la moelle osseuse et/ou dans le sang périphérique d'animaux, générale ­
ment des rongeurs.
 
L'essai du micronoyau est destiné à identifier les substances qui 
provoquent les lésions cytogénétiques se traduisant par la formation 
de micronoyaux contenant des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers.
 
Lorsqu'un érythroblaste de moelle osseuse se transforme en érythro ­
cyte polychromatique, le noyau principal est expulsé et chaque 
micronoyau qui s'est formé peut subsister dans le cytoplasme anucléé. La visualisation des micronoyaux est facilitée par l'absence du noyau principal. Un accroissement de la fréquence des micro ­
noyaux dans les érythrocytes polychromatiques des animaux traités 
est le signe d'une lésion chromosomique induite.
 
La moelle osseuse des rongeurs est couramment utilisée dans cet 
essai, les érythrocytes polychromatiques étant produits dans ce 
tissu. Le comptage des érythrocytes (polychromatiques) immatures 
micronucléés dans le sang périphérique est également acceptable chez toute espèce où l'on a démontré l'incapacité de la rate à éliminer les érythrocytes micronucléés ou qui présente une sensibilité suffi ­
sante pour permettre la détection des agents provoquant des aberra ­
tions chromosomiques de structure ou de nombre. Plusieurs critères permettent de distinguer les micronoyaux. Un de ces critères est la 
détection de la présence ou de l'absence dans les micronoyaux d'un 
centromère ou d'ADN centromérique. La fréquence des érythrocytes immatures (polychromatiques) micronucléés est le principal critère. Quand les animaux sont traités en continu pendant quatre semaines 
ou plus, on peut également rechercher dans le sang périphérique la 
proportion des érythrocytes matures (normochromatiques) contenant des micronoyaux par rapport à un nombre donné d'érythrocytes matures.
 
Cet essai in vivo du micronoyau pratiqué sur des érythrocytes de 
mammifère se prête particulièrement bien à l'évaluation des risques mutagènes, en ce sens qu'il permet de prendre en compte des facteurs du métabolisme in vivo, de pharmacocinétique et des processus de 
réparation de l'ADN, malgré la variabilité de ces facteurs en fonction 
de l'espèce, du tissu et de l'effet génétique recherché. Un essai in vivo sert aussi à vérifier un effet mutagène détecté dans un système in vitro.
 
On n'aura pas recours à cet essai s'il est manifeste que la substance 
d'essai ou un métabolite réactif n'atteindra pas le tissu cible.  
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 327
 
1.2. DÉFINITIONS  
Centromère:  portion d'un chromosome qui au cours de la division 
cellulaire est lié aux fibres du fuseau mitotique permettant un mouvement ordonné des chromosomes filles vers les pôles des 
cellules filles.
 
Micronoyau:  petit noyau, présent en plus du noyau principal des 
cellules et séparé de celui-ci, produit pendant la télophase de la 
mitose (méiose) par des chromosomes ou des fragments de chromo ­
somes retardataires.  
Érythrocyte normochromatique:  érythrocyte mature dépourvu de 
ribosomes et pouvant être distingué des érythrocytes immatures poly ­
chromatiques à l'aide de substances colorant sélectivement les ribo ­
somes.  
Érythrocyte polychromatique:  érythrocyte immature se trouvant à 
un stade de développement intermédiaire, qui renferme encore des ribosomes et peut ainsi être distingué des érythrocytes matures 
normochromatiques à l'aide de substances colorant sélectivement 
les ribosomes.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d'ex ­
position appropriée. Si on utilise la moelle osseuse, les animaux sont 
sacrifiés à des moments appropriés après le traitement, la moelle est extraite, préparée sur des lames et colorée (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Lorsqu'on utilise le sang périphérique, ce dernier est prélevé à des 
moments appropriés après le traitement, les cellules sanguines sont 
étalées sur des lames et colorées (4) (8) (9) (10). En cas d'essai sur cellules du sang périphérique, il faut recueillir les cellules aussi rapidement que possible après la dernière exposition. Les lames 
préparées sont soumises à une analyse en vue de la détection de 
micronoyaux.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparations  
1.4.1.1.  Sélection des espèces animales  
L'utilisation de souris ou de rats est recommandée en cas d'essai sur 
moelle osseuse, bien que n'importe quelle espèce de mammifère 
appropriée puisse être employée. Si l'essai porte sur le sang périphé ­
rique, on recommande d'utiliser des souris. Il est toutefois possible d'utiliser n'importe quelle espèce de mammifère appropriée, à condi ­
tion que sa rate n'élimine pas les érythrocytes micronucléés ou que 
sa sensibilité soit suffisante pour permettre la détection d'agents qui 
provoquent des aberrations chromosomiques de structure ou de nombre. Il convient d'utiliser des animaux adultes, jeunes et sains issus de souches couramment utilisées en laboratoire. Au début de 
l'étude, la différence pondérale entre les animaux ne doit pas 
dépasser ± 20 % du poids moyen de chaque sexe.
 
1.4.1.2.  Conditions d'encagement et régime alimentaire  
Les conditions générales décrites dans l'introduction générale de la 
partie B sont appliquées mais le taux d'humidité devrait se situer aux 
environs de 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 328
 
1.4.1.3.  Préparations des animaux  
Les animaux sont répartis par randomisation entre les groupes 
témoins et les groupes traités. Les animaux sont identifiés indivi ­
duellement. Ils sont gardés dans leur cage pendant au moins cinq 
jours avant le début de l'étude, de façon à les acclimater aux condi ­
tions du laboratoire. Les cages doivent être disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effet dû à leur emplacement.
 
1.4.1.4.  Préparation des doses  
Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension 
dans un véhicule ou un solvant approprié, puis éventuellement diluées avant d'être administrées aux animaux. Les substances 
d'essai liquides peuvent être administrées directement ou après dilu ­
tion. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage.
 
1.4.2.  Conditions expérimentales  
1.4.2.1.  Solvant/véhicule  
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas avoir d'effet toxique aux doses 
utilisées ni présenter de réaction chimique avec la substance d'essai. 
Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données faisant état de leur compatibilité. On préconise d'envi ­
sager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois 
que cela est possible.
 
1.4.2.2.  Témoins  
Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent être 
inclus pour chaque sexe et chaque essai. Les animaux des groupes 
témoins sont manipulés exactement comme ceux des groupes traités, 
mise à part l'administration de la substance d'essai.  
Les témoins positifs doivent produire des micronoyaux in vivo à des 
niveaux d'exposition supposés conduire à un accroissement détec ­
table par rapport au bruit de fond. Les doses de témoin positif doivent être choisies de façon que les effets soient nets et que 
l'identité des lames codées ne soit pas révélée immédiatement à 
l'examinateur. Le témoin positif peut être administré par une voie différente de celle utilisée pour la substance d'essai et un seul prélè ­
vement d'échantillon peut suffire. En outre, l'emploi de témoins 
positifs appartenant à la même classe chimique peut être envisagé, 
s'ils sont disponibles. Les substances indiquées dans le tableau ci- dessous sont des exemples de témoins positifs.
 
Substance Numéro CAS Numéro Einecs  
Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 
N-éthyl N-nitrosourée 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamide 
Monohydrate de cyclophosphamide 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Triéthylènemélamine 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 329
 
Lors de chaque prélèvement, il faut inclure un lot d'animaux témoins 
négatifs traités seulement avec le solvant ou le véhicule et par 
ailleurs manipulés de la même façon que les groupes traités. Ceci peut être évité si l'on dispose de données acceptables sur la variabi ­
lité interindividuelle et la fréquence spontanée de cellules comportant 
des micronoyaux provenant de témoins historiques. Dans le cas où 
un seul prélèvement est effectué pour les témoins négatifs, le premier temps de prélèvement est le plus approprié. En outre, des témoins non traités doivent aussi être inclus, à moins que des données 
historiques ne démontrent que le solvant/véhicule choisi n'induit 
aucun effet délétère ou mutagène.
 
Si le sang périphérique est utilisé, un échantillon prélevé avant le 
traitement peut aussi tenir lieu de témoin négatif, mais uniquement dans les études de courte durée sur sang périphérique (par exemple 1 
à 3 traitements) lorsque les résultats se situent dans l'intervalle auquel 
on peut s'attendre sur la base de données historiques.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Nombre et sexe des animaux  
Chaque groupe traité et groupe témoin doit comprendre au moins 
cinq animaux analysables par sexe (11). Si, au moment de l'étude, on 
dispose de données d'études antérieures effectuées avec la même 
espèce et ayant utilisé la même voie d'administration, qui démontrent l'absence de différence importante de toxicité entre les sexes, il suffit d'effectuer l'essai avec des animaux d'un seul sexe. Si l'exposition 
humaine est spécifique du sexe, par exemple dans le cas de certains 
produits pharmaceutiques, des animaux du sexe approprié doivent être utilisés pour l'essai.
 
1.5.2.  Modalité de traitement  
Aucune modalité particulière de traitement (un, deux ou davantage 
de traitements à intervalles de 24 heures) ne peut être recommandée. 
Les prélèvements qui proviennent d'une étude avec des procédures d'administration prolongées sont acceptables si l'essai est positif ou, pour les essais négatifs, si un effet toxique est observé ou que la 
dose limite a été employée et que la substance a été administrée 
jusqu'au moment du prélèvement. La substance d'essai peut aussi être administrée en doses fractionnées (deux doses le même jour avec un intervalle de quelques heures au maximum) afin que l'ad ­
ministration d'un grand volume soit plus aisée.
 
L'essai peut être effectué de deux façons:  
a) La substance d'essai est administrée en une seule fois aux 
animaux. Des échantillons de moelle osseuse sont prélevés au moins deux fois, jamais avant 24 heures et pas au-delà de 48 heures après le traitement et à un intervalle approprié. Des prélè ­
vements effectués moins de 24 heures après le traitement doivent 
avoir une justification. Les échantillons de sang périphérique sont prélevés au moins deux fois jamais avant 36 heures et pas au-delà de 72 heures après le traitement et à un intervalle approprié. Si 
une réponse positive est observée lors d'un prélèvement, il n'est 
pas nécessaire de procéder à un autre prélèvement.
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b) Dans le cas où deux doses ou plus sont administrées (par 
exemple deux doses ou plus à intervalle de 24 heures), les 
échantillons de moelle osseuse doivent être prélevés une seule fois entre 18 et 24 heures après le dernier traitement, et ceux de sang périphérique une seule fois entre 36 et 48 heures après 
le dernier traitement (12).
 
Des temps de prélèvements supplémentaires peuvent être envisagés 
si nécessaire.  
1.3.3.  Niveaux de dose  
Si une étude préliminaire est réalisée afin d'évaluer les niveaux de 
dose requis, cette étude doit être effectuée dans le même laboratoire 
en utilisant la même espèce, la même souche, des animaux du même sexe et la même modalité de traitement que ceux de l'étude princi ­
pale (13). En cas de toxicité, on utilise trois niveaux de dose pour le 
premier prélèvement. Ces niveaux de doses doivent couvrir un 
domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale. Pour les prélèvements suivants, seule la dose la plus élevée est utilisée. Celle-ci est définie comme la dose qui produit des signes 
de toxicité tels qu'ils font supposer que des doses plus fortes, admi ­
nistrées selon les mêmes modalités, seraient létales. Les substances possédant une activité biologique spécifique à des doses faibles et non toxiques (comme les hormones et les mitogènes) peuvent faire 
exception aux critères d'établissement des doses et doivent être 
évaluées cas par cas. La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui produit certains indices de toxicité dans la moelle osseuse (par exemple une diminution de la proportion d'éry ­
throcytes immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes dans 
la moelle osseuse ou le sang périphérique).
 
1.5.4.  Test limite  
Si un essai réalisé avec au moins 2 000 mg/kg de poids corporel, 
en une seule dose ou en deux doses administrées le même jour, n'engendre aucun effet toxique observable et si une génotoxicité est improbable d'après les données relatives à des substances de 
structure voisine, on peut considérer qu'une étude complète avec 
trois niveaux de doses n'est pas nécessaire. Pour les études de plus longue durée, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel par jour dans le cas d'un traitement d'une durée allant jusqu'à 14 
jours et de 1 000 mg/kg de poids corporel par jour pour les études 
plus longues. Suivant l'importance de l'exposition humaine proba ­
ble, on peut envisager d'utiliser des doses plus fortes dans l'essai de dose limite.
 
1.5.5.  Voie d'administration  
La substance d'essai est généralement administrée par gavage à l'aide 
dune sonde gastrique ou d'une canule d'intubation adaptée, ou par 
injection intrapéritonéale. D'autres voies d'exposition sont accepta ­
bles lorsqu'elles peuvent être justifiées. Le volume maximal de liquide administré en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne devrait pas dépasser 
2 ml/100 g de poids corporel. Une justification doit être fournie si 
des volumes plus importants sont administrés. Il convient de réduire au minimum la variation du volume administré en ajustant la concen ­
tration à tous les niveaux de doses, sauf pour les produits irritants ou 
corrosifs dont les effets sont généralement exacerbés lorsqu'on 
augmente la concentration.
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1.5.6.  Préparation de la moelle osseuse et du sang  
Les cellules de moelle osseuse sont généralement prélevées dans le 
fémur ou le tibia immédiatement après le sacrifice. Les cellules sont extraites, préparées et colorées suivant des méthodes bien établies. 
Le sang périphérique est prélevé dans la veine caudale ou un autre 
vaisseau sanguin approprié. On effectue immédiatement une colora ­
tion supravitale des cellules sanguines (8) (9) (10) ou des frottis qui sont ensuite colorés. L'emploi d'un colorant spécifique de l'ADN [par 
exemple, l'organe d'acridine (14) ou Hoechst 33258 plus pyronine-Y 
(15)] peut éliminer une partie des artefacts dus à l'utilisation d'un colorant non spécifique de l'ADN. Cet avantage n'exclut pas l'emploi 
de colorants classiques (Giemsa, par exemple). D'autres méthodes, 
telles que celle basée sur l'emploi de colonnes de cellulose pour enlever les cellules nucléées (16), peuvent être utilisées à condition que leur efficacité pour la préparation de micronoyaux dans le labo ­
ratoire ait été prouvée.
 
1.5.7.  Analyse  
Le pourcentage d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total 
d'érythrocytes (immatures + matures) est déterminé pour chaque 
animal en comptant au moins 200 érythrocytes dans le cas de la 
moelle osseuse et 1 000 érythrocytes dans le cas du sang périphé ­
rique (17). Toutes les lames, y compris celles des témoins positifs et négatifs, doivent êtres codées indépendamment avant l'analyse au 
microscope. L'incidence des érythrocytes immatures micronucléés 
est déterminée sur la base de l'examen d'au moins 2 000 érythrocytes immatures par animal. On peut obtenir des informations supplémen ­
taires en recherchant la présence de micronoyaux dans les érythro ­
cytes matures. A l'examen des lames, le pourcentage d'érythrocytes 
immatures par rapport au nombre total d'érythrocytes ne doit pas être inférieur à 20 % de la valeur des témoins. Lorsque les animaux sont 
traités en continu pendant 4 semaines ou davantage, on peut aussi 
examiner au moins 2 000 érythrocytes matures par animal pour déterminer l'incidence des érythrocytes matures micronucléés. Des systèmes d'analyse automatisée (analyse d'images et cytométrie de 
flux pour cellules en suspension) peuvent remplacer des techniques 
manuelles s'ils sont justifiés et validés.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les résultats individuels pour chaque animal doivent être présentés 
sous forme de tableaux. L'unité expérimentale est l'animal. Le nombre d'érythrocytes immatures examinés, le nombre d'érythrocytes immatures micronucléés et le nombre d'érythrocytes immatures par 
rapport au nombre total d'érythrocytes doivent être présentés séparé ­
ment pour chaque animal analysé. Lorsque les animaux sont traités en continu pendant quatre semaines ou davantage, il convient de fournir également les données relatives aux érythrocytes matures, 
si elles ont été recueillies. Le pourcentage d'érythrocytes immatures 
par rapport au nombre total d'érythrocytes et, si cela est jugé perti ­
nent, le pourcentage d'érythrocytes micronucléés seront indiqués pour chaque animal. S'il n'y a pas de différence de réponse entre 
sexes, les données des deux sexes peuvent être combinées dans 
l'analyse statistique.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 332
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, 
notamment une augmentation, dose-dépendante, du nombre de cellules micronucléées ou une augmentation nette du nombre de 
cellules micronucléées dans un seul groupe traité à un seul temps 
de prélèvement. En premier lieu, il s'agit de déterminer la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statistiques (18) (19) mais la signification statistique ne 
doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse 
positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions 
expérimentales modifiées.
 
Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas 
aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en 
question n'est pas mutagène dans cet essai.  
Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement 
positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas un jugement catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou 
discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Des résultats positifs obtenus dans cet essai in vivo du micronoyau 
indiquent que la substance induit la formation de micronoyaux qui 
résultent de lésions des chromosomes ou de l'appareil mitotique dans les érythroblastes de l'espèce testée. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai la substance testée n'induit pas la 
formation de micronoyaux dans les érythrocytes immatures de l'es ­
pèce testée.
 
Le fait que la substance d'essai ou ses métabolites atteignent la 
circulation générale ou spécifiquement le tissu cible (toxicité systématique) doit être discute.
 
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Animaux d'expérience:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids individuel des animaux au début de l'essai, y compris 
l'intervalle des poids, la moyenne et l'écart-type dans chaque groupe.
 
Conditions expérimentales:  
— données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhi ­
cule),  
— résultats de l'étude de détermination des doses utiles, si elle a été 
réalisée,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 333
 
— justification du choix des doses employées,  
— détails concernant la préparation de la substance d'essai,  
— détails concernant l'administration de la substance d'essai,  
— justification du choix de la voie d'administration,  
— méthodes pour vérifier que la substance a atteint la circulation 
générale ou le tissu cible, le cas échéant,  
— conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans 
l'eau de boisson ou la nourriture en dose réelle (mg/kg de poids 
corporel/jour), s'il y a lieu,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau,  
— description détaillée des modalités de traitement et de prélève ­
ment,  
— méthodes de préparation des lames,  
— méthodes de mesure de la toxicité,  
— critères de dénombrement des érythrocytes immatures micronu ­
clées,  
— nombre de cellules analysées par animal,  
— critères de décision concernant les résultats positifs, négatifs et 
équivoques.  
Résultats:  
— signes de toxicité,  
— proportion d'érythrocytes immatures par rapport au nombre total 
d'érythrocytes,  
— nombre d'érythrocytes immatures micronuclées, donné séparé ­
ment pour chaque animal,  
— moyenne ± écart-type des érythrocytes micronuclées immatures 
par groupe,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— analyses et méthodes statistiques appliquées,  
— données concernant les témoins négatifs concomitants et anté ­
rieurs,  
— données concernant les témoins positifs concomitants.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test,  Mutation Res. , 31, 
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(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
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(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchie ­
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Mutation Res. , 312, pp. 293-304.  
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(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
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(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
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marrow micronucleus test,  Mutation Res. , 211, pp. 91-104.  
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ratio in the bone marrow micronucleus test.  Mutation Res. , 
347, pp. 97-99.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
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Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.  
(19) Lovell. D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
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University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGÉNICITÉ — ESSAI DE MUTATION RÉVERSE SUR 
BACTÉRIES  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
471, Essai de mutation réverse sur des bactéries (1997).  
1.1. INTRODUCTION  
L'essai bactérien de mutation réverse est pratiqué sur des souches de  
Salmonella typhimurium  et d' Escherichia coït  auxotrophes à l'égard 
d'un acide aminé. Il sert à détecter des mutations ponctuelles résul ­
tant de la substitution, de l'addition ou de la délétion d'une ou de plusieurs paires de base de l'ADN (1) (2) (3). Le principe de cet essai repose sur la détection de mutations qui inversent des mutations 
présentes dans la souche d'essai et rétablissent ainsi la capacité fonc ­
tionnelle des bactéries de synthétiser un acide aminé essentiel. Les bactéries révertantes sont détectées d'après leur capacité de se déve ­
lopper en l'absence de l'acide aminé requis par la souche d'essai 
parentale.
 
Les mutations ponctuelles sont à l'origine de beaucoup de maladies 
génétiques humaines et de nombreuses données tendent à démontrer 
que des mutations ponctuelles frappant les oncogènes et les gènes 
suppresseurs de tumeurs dans des cellules somatiques jouent un rôle dans le développement de tumeurs tant chez l'homme que chez les animaux de laboratoire. L'essai bactérien de mutation réverse est 
rapide, peu coûteux et relativement facile à effectuer. Beaucoup de 
souches utilisées possèdent entre autres particularités, celles de les rendre plus sensibles aux mutations: séquences d'ADN plus sensibles aux mutations au niveau des sites de réversion, augmentation de 
perméabilité cellulaire pour les grosses molécules, élimination des 
systèmes de réparation de l'ADN ou favorisation (augmentation) des processus induisant des erreurs lors de la réparation de l'ADN. La spécificité des souches d'essai peut fournir des informations utiles 
sur les types de mutations induites par les agents génotoxiques. On 
dispose pour les essais bactériens de mutation réverse de très nombreux résultats pour une grande variété de structures et d'une méthodologie d'essai qui est bien au point et qui peut être appliquée 
à des substances ayant des propriétés physico-chimiques très 
diverses, y compris les composés volatils.
 
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Un essai de mutation réverse  chez  Salmonella typhimurium  ou 
Escherichia coli  détecte, chez une souche dont la croissance requiert 
la présence d'un acide aminé (respectivement histidine ou tryto ­
phane), des mutations qui transforment cette souche en une souche 
dont la croissance s'effectue indépendamment d'un rapport extérieur 
de cet acide aminé.  
Les mutagènes provoquant la substitution de paires de base  sont 
des agents qui entraînent le remplacement d'une base de l'ADN. Lors 
d'un essai de réversion, cette modification peut avoir lieu sur le site de la mutation initiale ou sur un autre site du génome bactérien.
 
Les mutagènes décalant le cadre de lecture  sont des agents qui 
provoquent l'addition ou la délétion d'une ou de plusieurs paires de 
base dans l'ADN, modifiant ainsi le cadre de lecture dans l'ARN.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 337
 
1.3. CONSIDÉRATIONS PRÉLIMINAIRES  
L'essai bactérien de mutation réverse porte sur des cellules proca ­
ryotes qui différent des cellules de mammifère notamment du point de vue de l'absorption, du métabolisme, de la structure des chromo ­
somes et des processus de répartition de l'ADN. Les essais in vitro 
nécessitent généralement une activation métabolique exogène. Comme les systèmes d'activation métabolique in vitro ne peuvent pas reproduire parfaitement le métabolisme de cellules de mammifère 
in vivo, les essais ne fournissent pas directement des informations 
sur le pouvoir mutagène et carcinogène d'une substance chez les mammifères.
 
L'essai de mutation réverse sur bactéries est couramment employé 
comme première étape pour la détection de l'activité génotoxique en 
général et des mutations ponctuelles en particulier. De nombreuses données démontrent que beaucoup de substances chimiques qui se révèlent positives dans cet essai présentent aussi une activité muta ­
gène dans d'autres essais. Certains agents mutagènes ne sont pas 
décelés par ces systèmes d'essai. Ces défaillances peuvent tenir à la nature particulière de l'effet détecté, à des différences sur le plan de l'activation métabolique ou à des différences de biodisponi ­
bilité. D'autre part, les facteurs qui amplifient la sensibilité de l'essai 
de mutation réverse sur bactéries peuvent conduire à une surestima ­
tion de l'activité mutagène.
 
L'essai de mutation réverse sur bactéries peut ne pas convenir pour 
l'évaluation de certaines classes de substances chimiques, par 
exemple les composés fortement bactéricides (certains antibio ­
tiques, par exemple) et ceux dont on soupçonne (ou on sait) qu'ils interfèrent spécifiquement avec le système de réplication des cellules de mammifère (par exemple les inhibiteurs de la 
topoisomérase ou certains analogues de nucléosides). Dans de 
tels cas, des essais de mutation sur des cellules de mammifère peuvent s'avérer plus appropriés.
 
Bien que de nombreux composés qui donnent un résultat positif à cet 
essai soient cancérogènes pour les mammifères, la corrélation n'est 
pas parfaite. Celle-ci dépend de la classe chimique et il existe des 
substances cancérogènes qui ne sont pas détectées par cet essai parce qu'elles agissent par des mécanismes non génotoxiques ou par des 
mécanismes qui sont absents des cellules bactériennes.
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Des bactéries en suspension sont exposées à la substance d'essai en 
présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène. Dans le cas de la méthode d'incorporation directe (méthode par étalement), ces suspensions sont mélangées avec la gélose de 
surface et déposées immédiatement sur le milieu minimal. Dans le 
cas de la méthode avec préincubation, le mélange de bactéries en suspension-substance testée est incubé et ensuite mélangé avec un couche de gélose de surface avant d'être étalé sur le milieu minimal. 
Dans les deux techniques, après deux ou trois jours d'incubation, les 
colonies révertantes sont comptées et leur nombre est comparé à celui des revenants spontanés dans les boîtes témoins traitées avec le solvant.
 
Plusieurs méthodes permettant de réaliser l'essai de mutation réverse 
sur bactéries ont été décrites. Parmi celles qui sont communément 
utilisées figure la méthode par incorporation directe (1) (2) (3) (4), la méthode de la préincubation (2) (3) (5) (6) (7) (8), la méthode de la fluctuation (9) (10) et la méthode par suspension (11). Des méthodes 
modifiées pour les essais avec des gaz ou des vapeurs ont été 
décrites (12).
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Les modes opératoires décrits se réfèrent principalement aux 
méthodes d'incorporation directe et de préincubation. Chacune de 
ces méthodes peut être utilisée avec et sans activation métabolique. L'utilisation de la méthode avec préincubation permet de détecter plus efficacement l'effet mutagène de certaines substances. Ces subs ­
tances appartiennent à des classes chimiques qui comprennent les 
nitrosamines aliphatiques à chaînes courtes, les métaux bivalents, les aldéhydes, les colorants azoïques et les composés diazoïques, les alcaloïdes pyrollizidiniques, les composés allyliques et nitrés 
(3). Il est également admis que certaines classes de mutagènes ne 
sont pas toujours détectées par les méthodes conventionnelles telles que l'incorporation directe ou la préincubation. Ces substances doivent être considérées comme des cas particuliers et il est forte ­
ment recommandé d'utiliser d'autres méthodes de détection. On a pu 
mettre en évidence les cas particuliers suivants (ainsi que des exem ­
ples de méthodes qui pourraient servir à leur détection): colorants azoïques et composés diazoïques (3) (5) (6) (13), gaz et substances 
chimiques volatiles (12) (14) (15) (16), glycosides (17) (18). Tout 
écart par rapport au mode opératoire standard demande à être scien ­
tifiquement justifié.
 
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.5.1.  Préparations  
1.5.1.1.  Bactéries  
On laisse des cultures fraîches de bactéries se développer jusqu'à la 
fin de la phase exponentielle ou jusqu'au début de la phase station ­
naire de croissance (environ 10  9 cellules par ml). Des cultures en fin 
de phase stationnaire ne doivent pas être utilisées. Il est essentiel que les cultures utilisées pour cet essai présentent une concentration 
élevée de bactéries viables. La concentration peut être déterminée 
à partir des données historiques sur les courbes de croissance des souches bactériennes utilisées ou, lors de chaque essai, par la déter ­
mination du nombre de cellules viables à l'aide de la méthode par 
étalement.
 
La température d'incubation recommandée est de 37  o C. 
Au moins cinq souches de bactéries doivent être employées. Celles- 
ci doivent comprendre quatre souches de  S. typhimurium  (TA1535, 
TA1537 ou TA97a ou TA97, TA98 et TA100) pour lesquelles des comparaisons entres laboratoires ont démontré la fiabilité et la repro ­
ductibilité de la réponse. Ces souches, qui comportent des paires de 
bases GC sur les sites primaires de réversion, risquent toutefois de ne pas déceler certains mutagènes oxydants, des agents de réticulation et des hydrazines. Ces substances mutagènes peuvent être détectées à 
l'aide de souches d' E. coli  WP2 ou de  S. typhimurium  TA102 (19) 
qui ont une paire de base AT sur le site primaire de réversion. Par conséquent, il est recommandé de mettre en œuvre la combinaison de souches suivante:
 
— S. typhimurium  TA1535, et  
— S. typhimurium  TA1537 ou TA97 ou TA97a, et  
— S. typhimurium  TA98, et  
— S. typhimurium  TA100, et  
— E. coli  WP2 uvrA ou  E. coli  WP2 uvrA (pKM101) ou  S. typhi­
murium  TA102.  
Pour les mutagènes à pouvoir réticulant, il peut être préférable d'in ­
clure la souche TA102 ou d'ajouter une souche d' E. coli  pourvue 
d'un mécanisme de réparation de l'ADN [ E. coli  WP2 ou  E. coli  
WP2 (pKM101), par exemple].  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 339
 
La préparation des cultures souches, la vérification des marqueurs et 
le stockage doivent s'effectuer suivant des méthodes reconnues. Pour 
chaque culture souche congelée, il faut démontrer que la croissance exige la présence d'un acide aminé (histidine pour  S. typhimurium  et 
tryptophane pour  E. coli ). D'autres caractéristiques phénotypiques 
demandent également à être vérifiées, à savoir la présence ou l'ab ­
sence de plasmides de résistance, s'il y a lieu [résistance à l'ampicil ­
line des souches TA98, TA100 et TA97a ou TA97, WP2 uvrA et WP2 uvrA (pKM101), et résistance à l'association ampicilline/tétra ­
cycline de la souche TA102], ainsi que la présence de mutations 
caractéristiques (à savoir la mutation rfa chez  S. typhimurium  
d'après la sensibilité au cristal violet et la mutation uvrA chez  E. 
coli ou uvrB chez  S. typhimurium  d'après la sensibilité aux UV) (2) 
(3). D'autre part, les souches doivent produire un nombre de colonies 
de révertants spontanés par boîte qui se situe dans la gamme de fréquence prévue sur la base des données historiques du laboratoire et de préférence être comparable aux valeurs citées dans la littérature.
 
1.5.1.2.  Milieu  
On utilise une gélose minimale appropriée (composée, par exemple, 
de milieu minimal E de Vogel-Bonner et de glucose) et une gélose 
de recouvrement contenant de l'histidine et de la biotine ou du tryp ­
tophane pour permettre quelques divisions cellulaires (1) (2) (9).  
1.5.1.3.  Activation métabolique  
Les bactéries sont exposées à la substance d'essai en présence et en 
l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le 
système le plus communément utilisé est une fraction post-mitochon ­
driale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foie de rongeur traité avec des indicateurs enzymatiques comme Aroclor 1254 (1) (2) 
ou une combinaison de phénobarbital et de β-naphthoflavone (18) 
(20) (21). La fraction post-mitochondriale est généralement utilisée à une concentration comprise entre 5 et 30 % v/v dans le mélange S9. Le choix et la composition du système d'activation métabolique 
peuvent varier suivant la classe chimique de la substance d'essai. 
Dans certains cas, il peut être intéressant d'utiliser plusieurs concen ­
trations de la fraction post-mitochondriale. Dans le cas de composés azoïques et diazoïques, un système d'activation métabolique réduc ­
teur peut s'avérer plus approprié (6) (13).
 
1.5.1.4.  Substance d'essai/préparation  
Les substances d'essai solides sont préparées par dissolution ou 
suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, plus éventuel ­
lement diluées avant le traitement des bactéries. Les substances d'essai liquides peuvent être ajoutées au système d'essai directement 
ou après dilution. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf 
si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des prépara ­
tions dans les conditions du stockage.
 
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir chimiquement avec la 
substance d'essai ni altérer la survie des bactéries et l'activité du 
mélange S9 (22). L'emploi d'un solvant/véhicule inhabituel doit 
être justifié par des données faisant état de sa compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible. Dans les essais de subs ­
tances qui sont instables dans l'eau, on utilisera des solvants orga ­
niques exempts d'eau.
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1.5.2.  Conditions expérimentales  
1.5.2.1.  Souches utilisées (voir point 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Concentration d'exposition  
La cytotoxicité et la solubilité dans le mélange d'essai final sont des 
critères à prendre en considération pour déterminer la dose la plus 
élevée à mettre en œuvre.  
Un essai préliminaire destiné à déterminer la toxicité et les 
caractéristiques de solubilité peut être utile. La cytotoxicité peut être détectée par une réduction du nombre de révertants, 
un éclaircissement ou une diminution du tapis bactérien ou une 
diminution du taux de survie des cultures traitées. Les systèmes d'activation métabolique peuvent avoir une influence sur la cyto ­
toxicité d'une substance. On conclut à l'insolubilité lorsqu'une 
précipitation dans le mélange final est observée à l'œil nu 
dans les conditions réelles de l'essai.
 
Pour les substances d'essai solubles et non cytotoxiques, on recom ­
mande une concentration maximale de 5 mg ou 5 μl par boîte. Pour 
les substances d'essai non cytotoxiques qui sont insolubles à 5 mg ou 
5 μl par boîte, l'essai doit comprendre une ou plusieurs concentra ­
tions auxquelles on observe une insolubilité. Pour les substances qui sont déjà cytotoxiques à une concentration inférieure à 5 mg ou 
5μl/boîte, l'essai doit être effectué jusqu'à une concentration cyto ­
toxique. Le précipité ne doit pas interférer avec l'évaluation des résultats.
 
Pour un premier essai, il convient de tester au moins cinq concen ­
trations analysables différentes de la substance d'essai, avec des 
intervalles d'environ une demi-unité logarithmique, c'est-à-dire 
√10. Pour établir une relation dose-réponse, il peut s'avérer néces ­
saire de réduire ces intervalles. Dans le cas de substances d'essai contenant des quantités substantielles d'impuretés potentiellement 
mutagènes, il peut être utile d'effectuer des essais avec des concen ­
trations supérieures à 5 mg ou 5 μl/boîte.
 
1.5.2.3.  Témoins négatifs et positifs  
Des témoins positifs spécifiques de la souche, et des témoins négatifs 
(solvant ou véhicule), doivent être inclus dans chaque essai, avec ou sans activation métabolique. Dans le cas des témoins positifs, on 
utilisera une concentration permettant de démontrer l'efficacité de 
chaque essai.
 
Pour les essais avec système d'activation métabolique, le ou les 
témoins positifs de référence doivent être choisis en fonction du type de souche bactérienne utilisé.
 
Les substances suivantes sont des exemples de témoins positifs pour 
les essais avec activation métabolique:  
Substance Numéro CAS Numéro Einecs  
Diméthyl-9,10 anthracène 781-43-1 212-308-4 
Diméthyl-7,12 benz[a]anthra ­
cène 57-97-6 200-359-5 
3enzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 
Amino-2 anthracène 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 341
 
Substance Numéro CAS Numéro Einecs  
Cyclophosphamide 50-18-0 200-015-4 
Monohydrate de cyclophospha ­
mide 6055-19-2  
La substance suivante convient comme témoin positif pour la 
méthode d'activation métabolique réductrice:  
Substance Numéro CAS Numéro Einecs  
Rouge Congo 573-58-0 209-358-4  
L'amino-2 anthracène ne peut être utilisé comme indicateur unique 
de l'efficacité du mélange S9. S'il est utilisé, il faut également carac ­
tériser chaque lot de S9 avec un mutagène qui requiert une activation métabolique par des enzymes microsomalcs, benzo[a]pyrène et dimé ­
thylbenzanthracène par exemple.
 
Les substances suivantes sont des exemples de témoins positifs 
spécifiques de souches pour les essais sans activation métabolique 
exogène:  
Substance Numéro CAS Numéro Ëinecs Souche  
Azoture de 
sodium 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 et TA 100 
Nitro-2 fluorène 607-57-8 210-138-5 TA 98 
Amino-9 acridine 90-45-9 201-995-6 TA 15 37, TA 97 et TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 et TA 97a Hydropéroxyde 
de cumène 80-15-9 201-254-7 TA 102 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA et TA 102 
N-éthyl-N-nitro- 
N-nitrosoguani ­
dine 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA et WP2 uvrA 
(pKM101) 
1-oxyde de 4- 
nitroquinoléine 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA et WP2 uvrA 
(pKM101) 
Furylfuramide 
(AF2) 3688-53-7 Souches contenant des plas ­
mides
 
D'autres témoins positifs appropriés peuvent être utilisés comme 
référence. L'utilisation de témoins positifs appartenant à la même 
classe chimique doit être envisagée, s'ils sont disponibles.  
L'essai doit comprendre des témoins négatifs constitués de solvant ou 
véhicule sans substances d'essai, auxquels sont appliquées les mêmes conditions expérimentales qu'à la substance d'essai. Il faut également inclure des témoins non traités, à moins que des essais antérieurs 
n'aient démontré que le solvant choisi n'a pas d'effet délétère ou 
mutagène.
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1.5.3.  Mode opératoire  
Pour la méthode par étalement (1) (2) (3) (4) sans activation méta ­
bolique, on ajoute généralement 0,05 ml ou 0,1 ml de la solution à tester, 0,1 ml de culture bactérienne fraîche (contenant environ 10
 8 
cellules viables) et 0,5 ml de tampon stérile à 2,0 ml de gélose de 
recouvrement. Pour l'essai avec activation métabolique, on mélange habituellement 0,5 ml du mélange d'activation métabolique contenant une quantité adéquate de fraction post-mitochondriaie (entre 5 et 
30 % v/v), les bactéries et la substance d'essai, ou une solution de 
celle-ci, avec 2,0 ml de gélose de recouvrement. Le contenu de chaque tube est mélangé et versé sur la surface d'un milieu 
minimal gélosé. On laisse la gélose de recouvrement se solidifier 
avant incubation.
 
Dans la méthode de la préincubation (2) (3) (5) (6), la substance 
d'essai, ou une solution de celle-ci, est préincubée avec la souche 
d'essai (environ 10  8 cellules viables) et un tampon stérile ou 0,5 ml 
du système d'activation métabolique généralement pendant 20 minutes ou plus à 30-37
 o C. On ajoute ensuite la gélose de 
recouvrement et on verse le tout sur la surface d'un milieu 
minimal gélosé. On mélange généralement 0,05 ou 0,1 ml de la substance d'essai, ou d'une solution de celle-ci, 0,1 ml de bactéries et 0,5 ml de mélange S9 ou de tampon stérile avec 2,0 ml de gélose 
de recouvrement. Pendant la préincubation, les tubes doivent être 
aérés par agitation.
 
Pour une bonne estimation de la variation, chaque concentration doit 
être testée dans trois boîtes de Petri. Le nombre de boîtes peut être 
limité à deux si cela se justifie scientifiquement. La perte accidentelle d'une boîte n'invalide pas nécessairement l'essai.
 
Les substances gazeuses ou volatiles doivent être testées en utilisant 
des méthodes appropriées, par exemple dans des récipients herméti ­
quement fermés (12) (14) (15) (16).  
1.5.4.  Incubation  
Toutes les boîtes d'un essai donné doivent être incubées à 37  o C 
pendant 48-72 heures. À la fin de la période d'incubation, on compte dans chaque boîte le nombre de colonies révertantes.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les données doivent être présentées sous la forme du nombre de 
colonies révertantes par boîte. Le nombre de colonies révertantes 
dans les boîtes de témoins négatifs (témoins traités avec le solvant 
et, le cas échéant, témoins non traités) et positifs doit également être mentionné. Le dénombrement par boîte, le nombre moyen de colo ­
nies révertantes par boîte et l'écart-type doivent être indiqués pour la 
substance d'essai ainsi que pour les témoins positifs et négatifs (non 
traités et/ou traités au solvant).
 
Il n'est pas nécessaire de vérifier une réponse nettement positive. Les 
résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémen ­
taires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. Les résultats négatifs demandent à être confirmés cas par cas. Si la confirmation de résultats négatifs n'est pas jugée néces ­
saire, une justification doit être fournie. Pour les essais de confirma ­
tion, il convient d'envisager une modification des conditions expéri ­
mentales, afin d'élargir la gamme des conditions évaluées. Les para ­
mètres susceptibles d'être modifiés comprennent l'écart entre les 
doses, la méthode de traitement (étalement ou préincubation en 
milieu liquide) et les conditions d'activation métabolique.
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2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, 
notamment un accroissement, dose-dépendant, du nombre de réver ­
tants ou une augmentation reproductible du nombre de colonies de 
revenants par boîte à une ou plusieurs concentrations pour au moins 
une souche, avec ou sans activation métabolique (23). En premier lieu, il s'agit de prendre en considération la signification biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des 
méthodes statistiques (24) mais la signification statistique ne doit 
pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive.
 
Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas 
aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai.
 
Bien que la plupart des essais donneront des résultats manifestement 
positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats 
d'un essai n'autorise pas de conclusion catégorique sur l'activité de la 
substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Des résultats positifs obtenus à l'essai de mutation réverse sur bacté ­
ries indiquent que la substance induit des mutations ponctuelles par substitution de bases ou décalage du cadre de lecture dans le génome 
de Salmonella typhimurium  et/ou  Escherichia coli . Un résultat 
négatif signifie que, dans les conditions de l'essai, la substance n'est pas mutagène pour l'espèce utilisée dans l'essai.
 
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du solvant/véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Souches:  
— souches utilisées,  
— nombre de cellules par culture,  
— caractéristiques des souches.  
Conditions expérimentales:  
— quantité de substance d'essai par boite (mg/boîte ou μl/boîte) et 
justification du choix des doses et du nombre de boîtes par concentration,
 
— milieux utilisés,  
— type et composition du système d'activation métabolique, y 
compris les critères d'acceptabilité,  
— procédés de traitement.  
Résultats:  
— signes de toxicité,  
— signes de précipitation,  
— dénombrement par boîte,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 344
 
— nombre moyen de colonies révertantes par boîte et écart-type,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— analyses statistiques, le cas échéant,  
— données concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et 
positifs concomitants (étendues, moyennes et écarts-types),  
— données concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et 
positifs antérieurs (étendues, moyennes et écarts-types).  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
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Mutagens by Intestinal Flora,  Proc. Nail. Acad. Sri, USA , 
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Cambridge University Press, pp. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 347
 
B.15.  TESTS DE MUTAGENÈSE ET DE DÉPISTAGE DE CANCÉ ­
ROGENÈSE MUTATION GÉNIQUE —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Diverses souches haploïdes et diploïdes de la levure  Saccharomyces 
cerevisiae  peuvent être utilisées pour mesurer la production de muta ­
tions géniques induites par des agents chimiques en présence et en 
l'absence d'activation métabolique.  
La mesure de mutation en avant dans les souches haploïdes peut être 
réalisée notamment par la mesure du passage des mutants rouges exigeant l'adénine ( ade-1, ade -2) à une forme blanche doublement 
exigeante pour l'adénine ainsi que des systèmes sélectifs tels que 
l'induction de la résistance à la canavanine et la cydoheximide.
 
La méthode de mutation reverse la plus largement utilisée implique 
l'utilisation de la souche haploïde XV 185-14C qui porte les muta ­
tions non-sens ochre  ade 2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 et  trp 5-48, lesquelles 
sont réversibles par des mutagènes provoquant des substitutions de bases qui induisent des mutations à un site spécifique ou des muta ­
tions suppressives ochre. La souche XV 185-14C porte également le 
marqueur  his 1-7, une mutation contresens principalement révertée 
par des mutations de second site et le marqueur  hom  3-10 qui est 
réverté par des mutagènes conduisant au décalage du cadre de lecture du code génétique ( frameshift mutagens ).
 
La seule souche diploïde de  S. cerevisiae  largement validée est la 
souche D  7 , homozygote pour  ilv 1-92.  
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Les solutions des substances d'essai ainsi que celles des substances 
témoins seront préparées, immédiatement avant l'essai, à l'aide d'un 
véhicule approprié. Lorsqu'il s'agit de substances organiques non 
solubles dans l'eau, les solvants organiques tels que l'éthanol, l'acé ­
tone ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) devraient être utilisés à une concentration ne dépassant pas 2 % v/v. La concentration finale du 
véhicule ne doit pas affecter de manière significative la viabilité des 
cellules ni les caractéristiques de croissance.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 348
 
A c t i v a t i o n m é t a b o l i q u e  
Les cellules devraient être exposées aux substances d'essai en 
présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène approprié.
 
La méthode la plus fréquemment utilisée consiste à ajouter la 
fraction post-mitochondriale préparée à partir de foies de 
rongeurs prétraités par des inducteurs enzymatiques additionnée 
de co-facteurs. L'usage d'autres espèces, tissus, fractions post- mitochondriales, ou méthodes peut aussi convenir pour l'activa ­
tion métabolique.
 
Conditions d'essai  
S o u c h e s d ' e x p é r i e n c e  
La souche haploïde XV 185-14C et la souche diploïde D  7 sont les 
plus fréquemment utilisées dans les études de mutation génique. D'autres souches peuvent également convenir.
 
M i l i e u x  
Des milieux de culture appropriés sont utilisés pour déterminer la 
survie cellulaire et le nombre de mutants.  
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s n é g a t i f s e t p o s i t i f s  
Des témoins positifs, des témoins non traités et des témoins en 
présence de solvant devraient être simultanément réalisés. Des subs ­
tances chimiques témoins positives appropriées devraient être utili ­
sées pour concrétiser chaque effet mutagène spécifique.  
C o n c e n t r a t i o n d ' e x p o s i t i o n  
Au moins 55 concentrations convenablement espacées devraient être 
utilisées. Dans le cas de substances toxiques, la concentration maxi ­
male testée ne fera pas descendre le taux de survie en dessous de 5 à 10 %. Les substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. 
En ce qui concerne les substances non toxiques très solubles dans 
l'eau, la concentration la plus élevée sera déterminée cas par cas.
 
C o n d i t i o n s d ' i n c u b a t i o n  
Les boîtes sont incubées dans l'obscurité à une température de 28 à 
30 o C pendant 4 à 7 jours.  
F r é q u e n c e s d e m u t a t i o n s p o n t a n é e  
On utilisera des subcultures dont les fréquences de mutations spon ­
tanées se situent dans les limites normales admises.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 349
 
N o m b r e d e r é p é t i t i o n s  
Trois boîtes au moins seront utilisées par concentration, en vue de 
déterminer les prototrophes produits par mutation génique et d'ob ­
server la viabilité des cellules. Dans le cas d'expériences utilisant des marqueurs tels que  hom  3-10 à faible taux de mutation, le nombre 
des boîtes utilisées peut être augmenté afin de fournir des données 
statistiquement pertinentes.
 
Conduite de l'essai  
Les souches de  S. cerevisiae  sont habituellement traitées au cours 
d'un essai en milieu liquide impliquant l'utilisation de cellules en 
phase stationnaire ou de croissance. Les expériences initiales devraient être faites sur des cellules en croissance. 1 — 5 × 10
 7 
cellules/ml sont exposées à la substance d'essai pendant une 
période allant jusqu'à 18 heures, à une température de 28 à 37  o C, 
le mélange étant agité; une quantité adéquate d'un système d'activa ­
tion métabolique est ajoutée pendant le traitement. Si la première expérience fournit des résultats négatifs, une deuxième expérience 
devrait être réalisée en utilisant des cellules en phase stationnaire. 
Si la première expérience fournit des résultats positifs, ceux-ci sont confirmés par une expérience indépendante. À l'issue du traitement, les cellules sont centrifugées, lavées et ensemencées sur un milieu de 
culture approprié. Après incubation, les boîtes sont examinées afin 
de déterminer le taux de survie et l'induction de mutations géniques.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats devraient être présentés sous forme de tableaux indi ­
quant le nombre de colonies comptées, le nombre de mutants, le taux de survie et la fréquence de mutants. Tous les résultats devraient être 
confirmés au cours d'une expérience indépendante. Les résultats 
devraient être évalués par des méthodes statistiques adéquates.
 
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— souche utilisée,  
— conditions d'essai: cellules en phases stationnaire ou de crois ­
sance; composition des milieux; température d'incubation et 
durée de celle-ci; système d'activation métabolique,  
— conditions de traitement: concentration d'exposition; méthode et 
durée de traitement; température de traitement; témoins positifs et négatifs,
 
— nombre de colonies comptées; nombre de mutants; taux de survie 
et fréquence de mutants; relation dose-réponse, si possible; évaluation statistique des résultats,
 
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 350
 
B.16.  RECOMBINAISON MITOTIQUE —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Chez  Saccharomyces cerevisiae , on peut déceler la recombinaison 
mitotique intergénique (ou plus généralement, entre un gène et son 
centromère) et intragénique. Dans le premier cas, on parle de  crois­
sing-over  mitotique lequel donne naissance à des échanges réci ­
proques, tandis que, dans le second cas, les échanges sont le plus souvent non réciproques et l'on parle de conversion génique.  Le 
crossing-over  est généralement déterminé par la production de colo ­
nies ou de secteurs récessifs homozygotes à partir d'une souche hétérozygote, tandis que la conversion génique est déterminée par la production de revertants prototrophes dans une souche auxotrophe 
hétéroallélique portant deux allèles défectueux différents du même 
gène. Les souches les plus couramment utilisées pour déceler une conversion génique mitotique sont D
 4 (hétéroallélique pour  ade 2 et  
trp 5), D  7 (hétéroallélique pour  trp 5), BZ  34 (hétéroallélique pour  arg 
4) et JD1 (hétéroallélique pour  his 4 et  trp S). croissing-over  mito­
tique produisant des secteurs homozygotes de couleur rouge et rose peut être déterminé dans D
 5 ou dans D  7 (qui mesure aussi la conver ­
sion génique mitotique et la mutation reverse pour  ilv 1-92), ces 
deux souches étant hétéroalléliques complémentaires pour les 
allèles  ade 2. 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Les solutions des substances d'essai ainsi que celles des substances 
témoins ou de référence devraient être préparées, immédiatement 
avant l'essai, à l'aide d'un véhicule approprié. Dans le cas de subs ­
tances organiques insolubles dans l'eau, on utilisera des solvants organiques, tels que l'éthanol, l'acétone et le Diméthylsulfoxyde (DMSO), a une concentration ne dépassant pas 2 % v/v. La concen ­
tration finale du véhicule ne devrait pas affecter de manière signifi ­
cative la viabilité des cellules ni les caractéristiques de croissance.
 
A c t i v a t i o n m é t a b o l i q u e  
Les cellules seront exposées aux substances d'essai en présence et en 
l'absence d'un système d'activation métabolique exogène. La 
méthode la plus fréquemment utilisée consiste à ajouter la fraction post-mitochondriale préparée à partir de foies de rongeurs prétraités par des inducteurs enzymatiques additionnée de co-facteurs. L'usage 
d'autres espèces, tissus, fractions post-mitochondriales, ou méthodes 
peut aussi convenir pour l'activation métabolique.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 351
 
Conditions d'essai  
S o u c h e s d ' e x p é r i e n c e  
Les souches les plus fréquemment utilisées sont les diploïdes D  4 , D 5 , 
D 7 et JD1. D'autres souches peuvent convenir.  
M i l i e u x  
Des milieux de culture adéquats sont utilisés en vue de déterminer le 
taux de survie et la fréquence de recombinaisons mitotiques.  
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s n é g a t i f s e t p o s i t i f s  
Des témoins positifs, des témoins non traités et des témoins en 
présence de solvant seront simultanément réalisés. Des substances chimiques témoins positives appropriées seront utilisées pour 
chaque type spécifique de recombinaison.
 
C o n c e n t r a t i o n d ' e x p o s i t i o n  
Au moins cinq concentrations convenablement espacées de subs ­
tance d'essai seront utilisées. La cytotoxicité et la solubilité sont au 
nombre des facteurs à prendre en considération. La concentration 
la plus faible ne doit avoir aucun effet sur la viabilité des cellules. Dans le cas de produits chimiques toxiques, la concentration maxi ­
male testée ne diminuera pas le taux de survie en dessous de 5 à 
10 %. Les produits chimiques relativement insolubles dans l'eau 
seront testés jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. Dans le cas de produits chimiques non toxiques fran ­
chement solubles dans l'eau, la concentration d'essai maximale sera 
déterminée cas par cas.
 
Les cellules peuvent être exposées aux substances d'essai en phase 
stationnaire ou en phase de croissance pendant des périodes allant 
jusqu'à 18 heures. Toutefois, dans le cas d'un traitement de longue durée, les cultures seront examinées au microscope afin de déceler la formation de spores; la présence de celles-ci rendant l'essai nul.
 
C o n d i t i o n s d ' i n c u b a t i o n  
Les boîtes sont incubées, dans l'obscurité, à une température de 28 à 
30 o C, pendant 4 à 7 jours. Les boîtes utilisées pour la détermination 
des secteurs homozygotes rouge et rose produits par  croissing-over  
mitotique seront conservées dans un réfrigérateur à ± 4  o C pendant 1 
à 2 jours encore avant le dénombrement de manière à ce que la 
pigmentation des colonies concernées puisse s'intensifier.  
F r é q u e n c e s d e r e c o m b i n a i s o n s m i t o t i q u e s s p o n ­
t a n é e s  
On utilisera des subcultures dont les fréquences de recombinaisons 
mitotiques spontanées se situeront dans la gamme normalement 
admise.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 352
 
N o m b r e d e r é p é t i t i o n s  
Trois boîtes au moins seront ensemencées par concentration afin de 
déterminer la viabilité ainsi que le nombre de prototrophes produits par conversion génique mitotique. Dans le cas de la détermination d'homozygotie récessive produite par  croissing-over  mitotique, le 
nombre des boîtes sera augmenté pour obtenir un nombre adéquat 
de colonies.
 
Conduite de l'essai  
Les souches de  S. cerevisiae  sont habituellement traitées au cours 
d'un essai en milieu liquide impliquant l'utilisation de cellules en 
phase stationnaire ou de croissance. Les expériences initiales devraient être faites sur des cellules en croissance. 1 — 5 × 10
 7 
cellules/ml sont exposées à la substance d'essai pendant une 
période allant jusqu'à 18 heures à des températures de 28 à 37  o C, 
le mélange étant agité; une quantité adéquate d'un système d'activa ­
tion métabolique est ajoutée pendant le traitement. Si la première expérience fournit des résultats négatifs, une deuxième expérience 
devrait être réalisée en utilisant des cellules en phase stationnaire. 
Si la première expérience fournit des résultats positifs, ceux-ci sont confirmés par une expérience indépendante appropriée. À l'issue du traitement, les cellules sont centrifugées, lavées et ensemencées sur 
un milieu de culture adéquat. Après incubation, les boîtes sont 
examinées afin de déterminer le taux de survie et l'induction de recombinaison mitotique.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats devraient être présentés sous forme de tableaux indi ­
quant le nombre de colonies comptées, le nombre de recombinants, 
le taux de survie et la fréquence de recombinants.  
Tous les résultats devraient être confirmés au cours d'une expérience 
indépendante.  
Les résultats devraient être évalués par des méthodes statistiques 
adéquates.  
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— souche utilisée,  
— conditions d'essai: cellules en phase stationnaire ou en phase de 
croissance; composition des milieux; température d'incubation et durée d'incubation; système d'activation métabolique,
 
— conditions de traitement: concentration d'exposition; méthode et 
durée de traitement; température de traitement; témoins positifs et 
négatifs,  
— nombre de colonies comptées; nombre de recombinants; taux de 
survie et fréquence de recombinaison: relation dose-réponse, si possible; évaluation statistique des résultats,
 
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 353
 
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 354
 
B. 17.  MUTAGÉNICITÉ — ESSAI IN VITRO DE MUTATION 
GÉNIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
476, Essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifères 
(1997).  
1.1. INTRODUCTION  
L'essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifères 
permet de détecter des mutations géniques induites par des subs ­
tances chimiques. Les lignées cellulaires appropriées comprennent 
des cellules de lymphome de souris L5178Y, les lignées CHO- 
AS52 et V79 de cellules de hamster chinois et les cellules lympho ­
blastoïdes humaines TK6 (1). Dans ces lignées cellulaires, les critères génétiques les plus couramment utilisés sont une mutation 
sur les loci de la thymidine kinase (TK) et de l'hypoxanthine-guanine 
phosphoribosyl transférase (HPRT), ainsi qu'un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transférasc (XPRT). Les essais de mutation TK, HPRT et XPRT détectent des gammes différentes 
d'effet génétiques. L'emplacement autosomique de TK et XPRT 
peut permettre de détecter des effets génétiques (par exemple des délétions importantes) qui ne sont pas détectés sur le locus HPRT de chromosomes X (2, 3, 4, 5, 6).
 
L'essai in vitro de mutation génique sur cellules de mammifère peut 
être pratiqué sur des cultures de lignées cellulaires établies ou de 
souches cellulaires. Les cellules employées sont choisies en fonction de leur potentiel de croissance en culture et de la stabilité de la fréquence de mutation spontanée.
 
Les essais in vitro requièrent généralement une source exogène d'ac ­
tivation métabolique qui ne peut pas reproduire parfaitement les 
conditions présentes in vivo chez les mammifères. Il faut éviter 
absolument d'introduire des conditions qui conduiraient à des résul ­
tats positifs ne reflétant pas une mutagénicité intrinsèque et pouvant 
provenir de modifications du pH ou de l'osmolalité ou d'une forte 
cytotoxicité (7).  
Cet essai est utilisé pour le dépistage de substances pouvant être 
mutagènes et cancérigènes pour les mammifères. Bien que de nombreux composés donnant un résultat positif à cet essai soient cancérigènes pour les mammifères, il n'y a pas de corrélation 
parfaite entre cet essai et la cancérogénicité. La corrélation 
dépend de la classe chimique et de plus en plus d'éléments laissent penser qu'il existe des agents cancérigènes que cet essai ne permet pas de détecter parce qu'ils agissent par des mécanismes non géno ­
toxiques ou par des mécanismes qui sont absents des cellules de 
mammifères (6).
 
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Mutation directe:  mutation génique de la forme parentale en une 
forme mutante, qui engendre une modification ou une perte de l'ac ­
tivité enzymatique de la fonction de la protéine codée.  
Mutagènes provoquant la substitution de paires de bases:  subs­
tances qui entraînent le remplacement d'une ou de plusieurs bases de 
l'ADN.  
Mutagènes décalant le cadre de lecture:  substances qui entraînent 
l'addition ou la délétion d'une ou de plusieurs paires de bases dans la 
molécule d'ADN.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 355
 
Temps d'expression du phénotype:  période pendant laquelle des 
produits géniques non modifiés disparaissent des cellules qui vien ­
nent de subir une mutation.  
Fréquence de mutants:  rapport cellules mutantes observées/cellules 
viables.  
Croissance totale relative:  augmentation du nombre de cellules 
dans le temps par rapport à une population témoin; elle est calculée comme le produit de la croissance en suspension par rapport au témoin négatif et de l'efficacité de clonage par rapport au témoin 
négatif.
 
Croissance relative en suspension:  augmentation du nombre de 
cellules pendant la période d'expression par rapport au témoin 
négatif.  
Viabilité:  efficacité de clonage des cellules traitées au moment de 
l'étalement dans des conditions sélectives après la période d'expres ­
sion.  
Taux de survie:  efficacité de clonage des cellules traitées au 
moment de l'étalement à la fin de la période de traitement; le taux de survie est généralement exprimé par rapport au taux de survie de 
la population cellulaire témoin.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Les cellules déficientes en thymidine kinase (TK) par suite de la 
mutation directe TK  -/- —> TK-/- sont résistantes aux effets cyto ­
toxiques de la trifluorothymidinc (TFT), un analogue de la pyrimi ­
dine. Les cellules non déficientes en TK sont sensibles à la TFT, ce 
qui entraîne une inhibition du métabolisme cellulaire et l'arrêt de la division cellulaire. Ainsi, les cellules mutantes peuvent proliférer en présence de TFT, tandis que les cellules normales, qui contiennent de 
la TK, ne le peuvent pas. De la même façon, des cellules déficientes 
en HPRT ou XPRT sont sélectionnées par leur résistance à la thio-6 guanine (TG) ou à l'aza-8 guanine (AG). Lorsqu'un analogue d'une 
base ou une substance apparentée à l'agent sélectif est soumis à un 
essai de mutation génique sur des cellules de mammifère, il convient d'en étudier soigneusement les propriétés. Il faut, par exemple, examiner toute toxicité sélective soupçonnée de la substance 
d'essai vis-à-vis de cellules mutantes et non mutantes. Par consé ­
quent, la performance du système ou de l'agent de sélection doit être confirmée lors de l'essai de substances ayant une similitude de structure avec l'agent de sélection (8).
 
Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées 
à la substance d'essai, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Les cellules sont repiquées afin de déter ­
miner la cytotoxicité et de laisser le phénotype s'exprimer avant la 
sélection des mutants (9, 10, 11, 12, 13). On détermine la cytotoxi ­
citc en mesurant l'efficacité de clonage relative (taux de survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans un milieu de croissance 
pendant une période de temps suffisante, caractéristique de chaque 
locus et du type de cellule choisi, afin de permettre une expression phénotypique presque optimale des mutations induites. On détermine la proportion de mutants en mettant en culture un nombre connu de 
cellules dans un milieu contenant l'agent sélectif pour détecter les 
cellules mutantes et dans un milieu exempt d'agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Les colonies sont comptées après une durée d'incubation appropriée. On compare le 
nombre de colonies mutantes en milieu sélectif au nombre de colo ­
nies en milieu non sélectif pour obtenir la proportion de mutants.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 356
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparations  
1.4.1.1.  Cellules  
Divers types de cellules conviennent pour ce test, entre autres: sous- 
clones de L5178Y, CHO, AS52, V79 ou TK6. Les cellules utilisées 
doivent avoir une sensibilité prouvée aux mutagènes chimiques, une efficacité de clonage élevée et une fréquence de mutation spontanée stable. On doit veiller à ce que les cellules ne soient pas contaminées 
par des mycoplasmes. Des cellules contaminées ne doivent pas être 
utilisées.
 
L'essai doit être conçu de façon à avoir une sensibilité et une puis ­
sance prédéterminées. Le nombre de cellules, de cultures et de 
concentrations de la substance d'essai utilisées doit refléter ces para ­
mètres définis à l'avance (14). À chaque stade de l'essai, le nombre minimal de cellules viables survivant au traitement doit être basé sur la fréquence de mutation spontanée. Une règle générale consiste à 
utiliser un nombre de cellules au moins égal à dix fois l'inverse de 
cette fréquence. Cependant, il est recommandé d'utiliser au moins 10
 6 cellules. Pour s'assurer de la performance constante de l'essai, 
il faut disposer de données antérieures adéquates relatives au système 
cellulaire utilisé.  
1.4.1.2.  Milieux et conditions de culture  
On doit utiliser des milieux de culture et des conditions d'incubation 
appropriés (récipients de culture, température, concentration de CO  2 
et humidité). Les milieux doivent être choisis en fonction des 
systèmes sélectifs et du type de cellules utilisés dans l'essai. Il est 
particulièrement important de choisir des conditions de culture qui assurent une croissance optimale des cellules pendant la période 
d'expression, ainsi que la capacité des cellules, tant mutantes que 
non mutantes, à former des colonies.
 
1.4.1.3.  Préparation des cultures  
Les cellules sont multipliées à partir de cultures souches, ensemen ­
cées dans le milieu de culture et incubées à 37  o C. Avant l'emploi 
des cultures pour l'essai, il peut être nécessaire de les débarrasser des 
cellules mutantes qu'elles contiennent.  
1.4.1.4.  Activation métabolique  
Les cellules doivent être exposées à la substance d'essai en présence 
et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le 
système le plus couramment utilisé est une fraction post-mitochon ­
driale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foie de rongeur traité avec des inducteurs enzymatiques, par exemple Aroclor 1254 (15, 16, 17, 18) ou un mélange de phénobarbital et de β-naphtho­
flavone (19, 20).
 
La fraction post-mitochondriale est généralement utilisée à une 
concentration comprise entre 1 et 10 % v/v dans le milieu final. Le choix du système d'activation métabolique peut dépendre de la classe chimique de la substance d'essai. Dans certains cas il peut y 
avoir avantage à utiliser plus d'une concentration de la fraction post- 
mitochondriale.
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Plusieurs procédés nouveaux, comme la création de lignées cellu ­
laires génétiquement modifiées exprimant des enzymes activantes 
spécifiques, sont susceptibles de fournir une activation endogène. Le choix des lignées cellulaires utilisées doit être justifié scientifi ­
quement (par exemple par la pertinence de l'isoenzyme du cyto ­
chrome P4 50 pour le métabolisme de la substance d'essai).
 
1.4.1.5.  Substance d'essai/préparation  
Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension 
dans un solvant ou un véhicule approprié, puis éventuellement 
diluées avant le traitement des cellules. Les substances d'essai liquides peuvent être ajoutées directement ou après dilution au système d'essai. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf 
si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des prépara ­
tions dans les conditions du stockage.
 
1.4.2.  Conditions expérimentales  
1.4.2.1.  Solvant/véhicule  
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir chimiquement avec la 
substance d'essai ni altérer la survie des cellules et l'activité du 
mélange S9. L'emploi d'un solvant/véhicule inhabituel doit être 
justifié par des données faisant état de sa compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela est possible. Dans les essais de substances qui sont 
instables dans l'eau, on utilisera des solvants organiques exempts 
d'eau. L'eau peut être enlevée à l'aide d'un tamis moléculaire.
 
1.4.2.2.  Concentration d'exposition  
La cytotoxicité, la solubilité dans le mélange d'essai final et les 
modifications de pH et d'osmolalité sont des critères à prendre en considération pour déterminer la dose la plus élevée à mettre en 
œuvre.
 
La cytotoxicité doit être mesurée, avec et sans système d'activation 
métabolique, dans l'expérience principale par un indicateur pertinent 
de l'intégrité et de la croissance cellulaire, tel que l'efficacité de clonage relative (taux de survie) ou la croissance totale relative. Il peut être utile de déterminer la cytotoxicité et la solubilité dans un 
essai préliminaire.
 
Il convient d'utiliser au moins quatre concentrations analysables. 
Dans le cas d'une substance cytotoxique, ces concentrations 
doivent couvrir un domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale, ce qui signifie généralement des concentrations séparées par un facteur compris entre 2 et √10 au maximum. Si la 
concentration la plus forte est basée sur la cytotoxicité, elle devrait 
donner un taux de survie relatif (efficacité de clonage relative) ou une croissance totale relative d'environ 10 à 20 % (mais non infé ­
rieure à 10 %). En ce qui concerne les substances relativement non 
cytotoxiques, la concentration maximale doit être la plus basse des 
trois concentrations suivantes: 5 μl/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 358
 
Les substances relativement insolubles doivent être testées jusqu'à 
des concentrations égales ou supérieures à la limite de solubilité 
dans les conditions de culture. L'insolubilité doit être mise en évidence dans le milieu de traitement final auquel les cellules sont exposées. Il peut être utile d'évaluer la solubilité au début et à la fin 
du traitement, celle-ci pouvant varier au cours de l'exposition dans le 
système d'essai en raison de la présence de cellules, de S9, de sérum, etc. On conclut à l'insolubilité lorsqu'une précipitation est observée à l'exil nu. Le précipité ne doit pas interférer avec l'évaluation des 
résultats.
 
1.4.2.3.  Témoins  
Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent être 
inclus dans chaque expérience avec et sans activation métabolique. Quand l'essai est effectué avec activation métabolique, la substance utilisée comme témoin doit être celle qui exige l'activation pour 
donner une réponse mutagène.
 
Des exemples de substances pouvant servir comme témoins positifs 
figurent dans le tableau ci-dessous.  
Condition d'activa ­
tion métabolique Locus Substance N  o CAS N  o Einecs  
Absence d'activa ­
tion métabolique exogène HPRT Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 
Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 
TK (petites et 
grandes colo ­
nies) Méthanesulfonate de méthyle 66-27-3 200-625-0 
XPRT Méthanesulfonate d'éthyle 62-50-0 200-536-7 
Éthylnitrosourée 759-73-9 212-072-2 
Présence d'activa ­
tion métabolique exogène HPRT Méthyl-3 cholanthrène 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodiméthylaminc 62-75-9 200-549-8 
Diméthyl-7,12 benzanthracène 57-97-6 200-359-5 
TK (petites et 
grandes colo ­
nies) Cvclophosphamide 50-18-0 200-015-4 
Monohydrate de cyclophospha ­
mide 6055-19-2 
Benzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5 
Méthyl-3 cholanthrène 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrosodiméthylamine (pour 
des niveaux élevés de S9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]pyrène 50-32-8 200-028-5
 
D'autres substances de référence appropriées peuvent être utilisées 
comme témoins positifs, par exemple la 5-bromo 2'-désoxyuridine (n
 o CAS 59-14-3, n  o Einecs 200-415-9) si le laboratoire possède des 
contrôles historiques relatifs à cette substance. L'emploi de témoins 
positifs appartenant à la même classe chimique doit être envisagé, 
s'ils sont disponibles.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 359
 
Des témoins négatifs, constitués uniquement du solvant ou du véhi ­
cule dans le milieu de traitement et traités de la même façon que la 
substance d'essai, doivent être inclus. Il faut également inclure des témoins non traités, à moins que des essais antérieurs n'aient démontré que le solvant choisi n'a pas d'action délétère ou mutagène.
 
1.4.3.  Mode opératoire  
1.4.3.1.  Traitement avec la substance d'essai  
Les cellules en prolifération sont traitées avec la substance d'essai en 
présence et en l'absence d'activation métabolique. La durée d'expo ­
sition doit être suffisante (une durée de trois à six heures est géné ­
ralement efficace) et peut s'étendre sur un ou plusieurs cycles cellu ­
laires.  
On peut réaliser les cultures en un seul ou en double exemplaire pour 
chaque concentration testée. Dans le cas des cultures en un seul 
exemplaire, il faut augmenter le nombre des concentrations afin d'assurer un nombre adéquat de cultures à analyser (par exemple, au moins huit concentrations analysables). Les cultures servant de 
témoins négatifs (solvant) sont faites en double.
 
Les substances gazeuses ou volatiles doivent être testées en utilisant 
des méthodes appropriées, par exemple dans des récipients de culture hermétiquement fermés (21, 22).
 
1.4.3.2.  Détermination du taux de survie, de la viabilité et de la proportion 
de mutants  
À la fin de la période d'exposition, les cellules sont lavées et mises 
en culture en vue de la détermination de leur taux de survie et de 
l'expression du phénotype mutant. La détermination de la cytotoxi ­
cité commence généralement après la période de traitement par la mesure de l'efficacité de clonage relative (taux de survie) ou de la 
croissance totale relative des cultures.
 
À chaque locus correspond un temps bien défini qui est nécessaire à 
l'expression presque optimale du phénotype des mutants nouvelle ­
ment induits (HPRT et XPRT ont besoin d'au moins 6 à 8 jours et TK d'au moins 2 jours). Pour déterminer le nombre de mutants et 
l'efficacité de clonage, les cellules sont placées dans un milieu en 
présence et en l'absence d'agent(s) sélectif(s). On commence à mesurer la viabilité, qui permet de calculer la proportion de mutants, à la fin de la période d'expression en déposant les cultures dans un 
milieu non sélectif.
 
Si la substance d'essai est positive à l'essai sur L5178Y TK  -/- , la 
taille des colonies doit être déterminée dans au moins une des 
cultures traitées (à la concentration positive la plus élevée) et dans les témoins négatifs et positifs. Si la substance d'essai est négative à l'essai sur L5178Y TK
 +/- , la taille des colonies doit être déterminée 
dans les témoins négatifs et positifs. Dans le cas des essais sur 
TK6TK  +/- , on peut également déterminer la taille des colonies.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 360
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les données doivent comprendre la détermination de la cytotoxicité 
et de la viabilité, le nombre de colonies et la proportion de mutants 
dans les cultures traitées et les cultures témoins. Dans le cas d'une 
réponse positive à l'essai sur L5178Y TK  +/- , on dénombre les colo ­
nies en distinguant les petites des grandes colonies pour au moins une concentration de la substance d'essai (concentration positive la 
plus élevée) et pour les témoins négatifs et positifs. La nature molé ­
culaire et cytogénétique des deux sortes de colonies de mutants (petites et grandes) a été étudiée en détail (23, 24). Dans l'essai 
TK
 +/- , les colonies sont recensées sur la base du critère de croissance 
normale (grandes colonies) et de croissance faible (petites colonies) (25). Les cellules mutantes qui ont subi les altérations génétiques les plus importantes ont un temps de duplication plus long et forment 
donc de petites colonies. Ces altérations vont de la perte du gène 
entier à des aberrations chromosomiques se manifestant dans le caryotype. L'induction de petites colonies de mutants a été mise en rapport avec des substances chimiques qui engendrent des aberra ­
tions chromosomiques importantes (26). Les cellules mutantes moins 
affectées croissent à des vitesses semblables à celles des cellules parentales et forment de grandes colonies.
 
Il convient d'indiquer le taux de survie (efficacité de clonage rela ­
tive) ou la croissance totale relative. La proportion de mutants doit 
être exprimée comme le nombre de cellules mutantes divisé par le 
nombre de cellules survivantes.  
Les données individuelles concernant chaque culture doivent être 
indiquées. En outre, toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux.
 
Il n'est pas nécessaire de vérifier une réponse manifestement positive. 
Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplé ­
mentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées. Les résultats négatifs demandent à être confirmés cas par cas. Si la confirmation de résultats négatifs n'est pas jugée néces ­
saire, une justification doit être fournie. Pour les essais de confirma ­
tion effectués en cas de résultats négatifs ou équivoques, il convient d'envisager une modification des paramètres de l'étude, afin d'élargir la gamme des conditions évaluées. Les paramètres susceptibles d'être 
modifiés comprennent l'écart entre les doses et les conditions d'acti ­
vation métabolique.
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, 
notamment un accroissement dose-dépendant ou un accroissement reproductible de la proportion de mutants. En premier lieu, il s'agit 
de prendre en considération la pertinence biologique des résultats. 
L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statis ­
tiques mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse positive.
 
Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas 
aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en 
question n'est pas mutagène dans cet essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 361
 
Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement 
positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats 
d'un essai n'autorise pas une conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Des résultats positifs d'un essai in vitro de mutation génique sur 
cellules de mammifère indiquent que la substance d'essai induit 
des mutations géniques dans les cellules de mammifère des cultures 
utilisées. Une relation dose-réponse positive, si elle est reproductible, est des plus significatives. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai, la substance testée n'induit pas de mutation 
génique dans les cellules de mammifère des cultures utilisées.
 
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du véhicule/solvant,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Cellules:  
— type et source des cellules,  
— nombre de cultures,  
— données concernant le cycle cellulaire,  
— nombre de repiquages, le cas échéant,  
— méthodes d'entretien des cultures cellulaires, le cas échéant,  
— absence de mycoplasme, le cas échéant.  
Conditions de l'essai:  
— justification du choix des concentrations et du nombre de 
cultures, y compris des données relatives à la cytotoxicité et 
aux limites de solubilité, si elles sont disponibles,  
— composition du milieu, concentration de CO  2 , 
— concentration de la substance d'essai,  
— volume de véhicule et de substance d'essai ajouté,  
— température d'incubation,  
— temps d'incubation,  
— durée du traitement,  
— densité cellulaire pendant le traitement,  
— type et composition du système d'activation métabolique, y 
compris les critères d'acceptabilité,  
— témoins positifs et négatifs,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 362
 
— durée de la période d'expression,  
— agents sélectifs,  
— critères pour conclure que les résultats des essais sont positifs, 
négatifs ou équivoques,  
— méthodes utilisées pour compter le nombre de cellules viables et 
de cellules mutantes,  
— définition de colonies qui sont prises en compte pour le type et 
pour la taille, y compris les critères pour les «petites» et 
«grandes» colonies.  
Résultats:  
— signes de toxicité,  
— signes de précipitation,  
— données sur le pH et l'osmolalité pendant l'exposition à la subs ­
tance d'essai, si elles ont été déterminées,  
— taille des colonies si elle a été déterminée pour au moins les 
témoins négatifs et positifs,  
— aptitude du laboratoire à déceler des mutants en petites colonies 
avec le système L5178Y TK  +/- , le cas échéant,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— analyses statistiques, le cas échéant,  
— données concernant les témoins négatifs (solvant ou véhicule) et 
positifs concomitants,  
— données concernant les témoins négatifs (solvant ou véhicule) et 
positifs antérieurs (étendues, moyennes, écarts-types).  
— proportion de mutants.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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B.18.  LÉSION ET RÉPARATION D'ADN — SYNTHÈSE NON 
PROGRAMMÉE DE L'ADN (UDS) — CELLULES DE 
MAMMIFÈRE — IN VITRO  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
L'essai de synthèse non programmée de l'acide désoxyribonucléique 
(ADN) (UDS) mesure la synthèse de réparation de l'ADN après 
excision et élimination d'un fragment d'ADN contenant la région 
lésée par des agents chimiques et physiques. L'essai est basé sur l'incorporation de thymidine tritiée (
 3 H-TdR) dans l'ADN de cellules 
de mammifère ne se trouvant pas en phase S du cycle cellulaire. On 
peut déterminer l'incorporation de  3 H-TdR en examinant par autora ­
diographie ou par comptage en scintillation liquide (LSC) l'ADN provenant de cellules traitées. Les cellules de mammifère en culture, à moins que des hépatocytes primaires de rat ne soient utilisés, sont 
traitées avec la substance d'essai en présence et en l'absence d'un 
système d'activation métabolique exogène. L'UDS peut également être mesurée par des méthodes in vivo.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Les substances d'essai ainsi que les substances témoins ou de réfé ­
rence seront, soit préparées en milieu de culture, soit dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés, puis diluées en milieu de culture avant d'être utilisées dans l'essai. La concentration 
finale du véhicule ne devrait pas affecter la viabilité cellulaire.
 
Des cultures primaires d'hépatocytes de rats, de lymphocytes 
humains ou des lignées cellulaires établies (par exemple fibroblastes 
humains diploïdes) peuvent être utilisées pour cet essai.  
Les cellules seront exposées à la substance d'essai en présence et en 
l'absence d'un système d'activation métabolique approprié.  
Conditions d'essai  
N o m b r e d e c u l t u r e s  
Au moins deux cultures cellulaires pour l'autoradiographie et six 
cultures cellulaires (ou moins si justifié scientifiquement) pour le 
comptage en scintillation liquide sont nécessaires pour chaque pont 
expérimental.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 366
 
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s n é g a t i f s e t p o s i t i f s  
Des témoins simultanés positifs et négatifs (non traités et/ou véhi ­
cule), avec et sans activation métabolique, devraient être inclus dans chaque expérience. Pour l'essai sur hépatocytes de rat, on peut, par exemple, utiliser le 7,12-DMBA (7,12-diméthylbenzanthracène) ou le 
2-AAF (2-acétylaminofluorène). Dans le cas de lignées cellulaires 
établies, on peut, pour les essais par autoradiographie et LSC réalisés sans activation métabolique, utiliser comme témoin positif par exemple le 4-NQO (4-nitroquinoline-N-oxyde); lorsqu'on a recours 
à des systèmes d'activation métaboliques, la N-diméthylnitrosamine 
est un des composés témoins positifs utilisables.
 
C o n c e n t r a t i o n d ' e x p o s i t i o n  
Une gamme de concentrations de la substance d'essai devrait être 
utilisée afin de permettre de déterminer au mieux la réponse. La 
concentration maximale devrait produire certains effets cytotoxiques. 
Les substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité. En ce qui concerne les substances 
non toxiques franchement solubles dans l'eau, la concentration maxi ­
male à tester devrait être déterminée cas par cas.
 
C e l l u l e s  
Pour l'entretien des cultures on aura recours à des milieux de culture, 
une concentration en CO  2 , une température et une humidité appro ­
priées. Les lignées cellulaires établies devraient être périodiquement 
contrôlées du point de vue de la contamination par  Mycoplasme . 
A c t i v a t i o n m é t a b o l i q u e  
Aucun système d'activation métabolique n'est utilisé pour des 
cultures primaires d'hépatocytes. Les lignées cellulaires établies et 
les lymphocytes sont exposés à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié.
 
Conduite de l'essai  
P r é p a r a t i o n d e s c u l t u r e s  
Des lignées cellulaires établies sont obtenues à partir de cultures 
souches (par exemple par trypsinisation ou par agitation), ensemen ­
cées dans des récipients de culture à une densité adéquate et incu ­
bées à 37  o C. 
Des cultures à court terme d'hépatocytes de rat sont établies en 
permettant aux hépatocytes récemment dissociés dans un milieu 
approprié de s'attacher à la surface de croissance.  
Les cultures de lymphocytes humains sont réalisées par des tech ­
niques appropriées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 367
 
T r a i t e m e n t d e s c u l t u r e s a v e c l a s u b s t a n c e d ' e s s a i  
Hépatocytes primaires de rat:  
Des hépatocytes primaires de rat récemment isolés sont traités au 
moyen de la substance d'essai dans un milieu contenant  3 H-TdR, 
pendant un laps de temps adéquat. À l'issue de la période de traite ­
ment, le milieu sera éliminé, les cellules seront rincées, fixées et 
séchées. Les lames sont plongées dans une émulsion autoradiogra ­
phique [alternativement une pellicule photographique ( stripping film ) 
peut être utilisée], exposées, développées, colorées et comptées.  
Lignées cellulaires établies et lymphocytes:  
Techniques autoradiograpbiques : Les cultures cellulaires sont expo ­
sées à la substance d'essai pendant des périodes de temps adéquates, 
puis traitées à la  3 H-TdR. La durée de l'exposition sera fonction de la 
nature de la substance, de l'activité du système métabolique et du type de cellules. Pour déceler l'acmé de «UDS», la
 3 H-TdR sera 
ajoutée soit en même temps que la substance d'essai, soit dans les 
quelques minutes qui suivent l'exposition à la substance d'essai. Le 
choix de l'une ou l'autre de ces techniques sera déterminé par d'éven ­
tuelles interactions entre la substance d'essai et la  3 H-TdR. Afin de 
pouvoir faire la distinction entre l'UDS et la réplication semi-conser ­
vatrice de l'ADN, on peut inhiber cette dernière en utilisant, par 
exemple, un milieu déficient en arginine, une faible teneur en sérum ou en ajoutant de l'hydroxyurée dans le milieu de culture.
 
Mesures l'USC de l'UDS : Avant de procéder au traitement avec la 
substance d'essai, l'entrée des cellules en phase S sera bloquée de la manière décrite ci-dessus; les cellules sont ensuite exposées à la 
substance d'essai comme décrit pour l'autoradiographie. À l'issue 
de la période d'incubation, l'ADN est extrait des cellules et la teneur totale en ADN ainsi que la quantité de
 3 H-TdR incorporée 
sont déterminées.  
Il faut noter que lorsque des lymphocytes humains sont utilisés, il 
n'est pas nécessaire de supprimer la réplication semi-conservative de l'ADN dans des cultures non stimulées.
 
Analyse  
D é t e r m i n a t i o n s a u t o r a d i o g r a p h i q u e s  
Pour déterminer l'UDS dans des cellules en culture, on ne compte 
pas les noyaux en phase S. Au moins 50 cellules par concentration 
seront comptées. Les James seront codées avant comptage. Plusieurs champs choisis au hasard suffisamment éloignés les uns des autres seront comptés sur chaque lame. On déterminera la quantité de
 3 H- 
TdR incorporée dans le cytoplasme en comptant trois surfaces de la 
taille du noyau dans le cytoplasme de chaque cellule comptée.  
D é t e r m i n a t i o n L S C  
On devrait utiliser un nombre adéquat de cultures pour chaque 
concentration et pour les témoins lors des déterminations LSC-UDS.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 368
 
Tous les résultats sont confirmés au cours d'une expérience indépen ­
dante.  
2. RÉSULTATS  
Les résultats sont présentés sous la forme de tableaux.  
2.1. DÉTERMINATIONS AUTORADIOGRAPHIQUES  
La quantité de  3 H-TdR incorporée dans le cytoplasme ainsi que le 
nombre de grains comptés par noyau cellulaire seront enregistrés séparément.
 
La moyenne, la médiane et le mode peuvent être utilisés pour décrire 
la distribution de la quantité de  3 H-TdR incorporée dans le cyto ­
plasme ainsi que le nombre de grains par noyau.  
2.2. DÉTERMINATIONS LSC  
Pour les déterminations LSC, l'incorporation de  3 H-TdR sera indi ­
quée sous la forme de dpm/ μg d'ADN. La moyenne des dpm/ μg 
d'ADN moyen avec son écart type peut être utilisé pour décrire la distribution de l'incorporation.
 
Les données devraient être évaluées par des méthodes statistiques 
appropriées.  
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— cellules utilisées, densité et nombre de passages au moment du 
traitement, nombre de cultures cellulaires,  
— méthodes utilisées pour l'entretien des cultures cellulaires, y 
compris milieu, température et concentration en CO  2 , 
— substance d'essai, véhicule, concentration et justification du choix 
des concentrations utilisées dans l'essai,  
— détails relatifs aux systèmes d'activation métabolique,  
— schéma du traitement,  
— témoins positifs et négatifs,  
— technique autoradiographique utilisée,  
— méthodes utilisées pour bloquer l'entrée des cellules en phase S,  
— techniques utilisées pour extraire l'ADN et déterminer la quantité 
totale d'ADN dans les déterminations LSC,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— évaluation statistique,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 369
 
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 370
 
B.19.  ESSAI IN VITRO D'ÉCHANGE DE CHROMATIDES-SŒURS  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
L'essai d'échange des chromatides-sœurs (SCE) constitue un test à 
court terme destiné à déceler les échanges réciproques d'ADN entre deux chromatides-sœurs d'un chromosome se dédoublant. Les SCE-s 
représentent l'échange réciproque de produits de réplication de 
l'ADN à des loci apparemment homologues. Le processus d'échange implique probablement une cassure et une réunion de l'ADN, bien que l'on sache peu de choses de sa base moléculaire. Pour déceler 
des SCE-s, il est nécessaire de pouvoir marquer différemment les 
chromatides-sœurs; ceci est rendu possible par l'incorporation de bromodésoxyuridine (BrdU) dans l'ADN chromosomique pendant deux cycles cellulaires.
 
Les cellules de mammifère in vitro sont exposées à la substance 
d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation méta ­
bolique exogène de mammifère, le cas échéant, et mises en culture 
pendant deux cycles de réplication dans un milieu contenant de la BrdU. Après traitement avec un inhibiteur du fuseau (par exemple colchicine) afin d'accumuler les cellules en phase de mitose de type 
métaphasique (c-métaphase), les cellules sont récoltées et des prépa ­
rations de chromosomes sont réalisées.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
— Des cultures primaires (lymphocytes humains) ou des lignées 
cellulaires établies (par exemple cellules ovariennes de hamsters 
chinois) peuvent être utilisées pour l'essai. Les 'lignées cellulaires seront contrôlées du point de vue de la contamination par des  
Mycoplasmes .
 
— Des milieux de culture et des conditions d'incubation appropriés 
(par exemple température, récipients de culture, concentration en 
CO 2 et humidité) seront utilisés.  
— Les substances d'essai peuvent être soit préparées dans des 
milieux de culture soit dissoutes ou mises en suspension dans 
des véhicules appropriés avant le traitement des cellules. La concentration finale d'un véhicule dans le milieu de culture ne devrait pas affecter significativement la viabilité des cellules ou 
le taux de croissance et les effets sur la fréquence de SCE seront 
contrôlés à l'aide d'un solvant témoin.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 371
 
— Les cellules seront exposées à la substance d'essai en présence et 
en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène de 
mammifère. Lorsqu'on utilise des types de cellules ayant une activité métabolique intrinsèque, le taux et la nature de l'activité devraient être appropriés à la classe chimique testée.
 
Conditions d'essai  
N o m b r e d e c u l t u r e s  
Deux cultures séparées au moins seront utilisées pour chaque point 
expérimental.  
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s p o s i t i f s e t n é g a t i f s  
Des témoins positifs utilisant une substance à action directe et une 
substance nécessitant une activation métabolique devraient être inclus 
dans chaque expérience: un témoin devrait être également utilisé 
pour le véhicule.  
Les substances ci-après peuvent par exemple, être utilisées comme 
témoins positifs:  
— substance à action directe:  
— méthanesulfonaté d'éthyle,  
— substance à action indirecte:  
— cyclophosphamide.  
Le cas échant, un témoin positif supplémentaire appartenant à la 
même classe chimique que la substance d'essai peut être inclus.  
C o n c e n t r a t i o n d ' e x p o s i t i o n  
Au moins trois concentrations de la substance d'essai, convenable ­
ment espacées, devraient être utilisées. La concentration maximale produira un effet toxique significatif mais permettra encore une répli ­
cation cellulaire adéquate. Des substances relativement insolubles 
dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. Dans le cas de substances non toxiques fran ­
chement solubles dans l'eau, la concentration maximale de la subs ­
tance d'essai devrait être déterminée cas par cas.
 
Conduite de l'essai  
P r é p a r a t i o n d e s c u l t u r e s  
Des lignées cellulaires établies sont obtenues à partir de cultures 
souches (par exemple par trypsinisation ou par agitation), ensemen ­
cées dans des récipients de culture à une densité adéquate et incu ­
bées à 37  o C. Dans le cas de cultures en couche monocellulaire, le 
nombre de cellules par récipient de culture devrait être ajusté de 
manière à ce que les cultures ne soient pas confluentes à plus de 50 % au moment de la récolte. Les cellules peuvent également être utilisées sous une forme de culture en suspension. Les cultures de 
lymphocytes humains sont préparées à partir de sang hépariné, en 
utilisant des techniques appropriées, et incubées à 37
 o C. ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 372
 
T r a i t e m e n t  
Des cellules en phase exponentielle de croissance sont exposées à la 
substance d'essai pendant un laps de temps adéquat, dans la plupart des cas une à deux heures peuvent suffire, mais, dans certains cas, le traitement peut être prolongé pour couvrir jusqu'à deux cycles cellu ­
laires complets. Les cellules n'ayant pas une activité métabolique 
intrinsèque suffisante devraient être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. À l'issue de la période d'exposition, les cellules sont 
lavées de manière à éliminer la substance d'essai et mises en culture, 
en présence de BrdU pendant deux cycles de réplication. Une autre méthode consiste à exposer simultanément les cellules à la substance d'essai et à la BrdU pendant deux cycles cellulaires complets.
 
Les cultures de lymphocytes humains sont traitées pendant qu'elles 
se trouvent dans un état semi-synchrone.  
Les cellules sont analysées au cours de leur seconde division après 
traitement, garantissant ainsi l'exposition des phases les plus sensi ­
bles du cycle cellulaire à la substance d'essai. Toutes les cultures additionnées de BrdU seront manipulées dans l'obscurité ou sous un 
faible éclairage provenant de lampes incandescentes jusqu'au 
moment de la récolte des cellules, afin de réduire la photolyse de l'ADN contenant de la BrdU.
 
R é c o l t e d e s c e l l u l e s  
Les cultures cellulaires sont traitées au moyen d'un inhibiteur du 
fuseau (par exemple colchicine) une à quatre heures avant leur récolte. Chaque culture est récoltée et traitée séparément pour la 
préparation des chromosomes.
 
P r é p a r a t i o n d e s c h r o m o s o m e s e t c o l o r a t i o n  
Les préparations de chromosomes sont effectuées par des méthodes 
cytogénétiques standard. Plusieurs techniques peuvent être utilisées 
pour colorer les lames de manière à faire apparaître les SCE (par exemple la méthode par fluorescence plus Giemsa).
 
A n a l y s e  
Le nombre de cellules analysées sera fonction de la fréquence spon ­
tanée témoin de SCE. Habituellement, on analyse au moins 25 métaphases bien étalées par culture afin de compter les SCE. 
Les lames sont codées avant l'analyse. Pour les lymphocytes 
humains, seules les métaphases contenant 46 centromères sont analy ­
sées. Pour les lignées cellulaires établies, seules les métaphases contenant ± 2 centromères du nombre modal sont analysées. Il 
sera précisé si une inversion de coloration au niveau de centromère 
est considérée comme un SCE ou non. Les résultats sont confirmés au cours d'une expérience indépendante.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats devraient être présentés sous la forme de tableaux. Le 
nombre de SCE par métaphase et le nombre de SCE par chromo ­
some sont donnés séparément pour toutes les cultures traitées et 
témoins.  
Les résultats seront analysés par des méthodes statistiques adéquates.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 373
 
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— cellules utilisées, méthodes d'entretien de la culture cellulaire,  
— conditions d'essai: composition des milieux, concentration en 
CO 2 , concentration de la substance d'essai, véhicule utilisé, 
température d'incubation, temps de traitement, inhibiteur du fuseau utilisé, concentration et durée du traitement avec celui- ci, type de système d'activation de mammifère utilisé, témoins 
positifs et négatifs,
 
— nombre de cultures cellulaires par point expérimental,  
— détails relatifs à la technique utilisée pour la préparation des 
lames,  
— nombre de métaphases analysées (données indiquées séparément 
pour chaque culture),  
— nombre de SCE par cellule et par chromosome (données indi ­
quées séparément pour chaque culture),  
— critère de comptage des SCE,  
— justification du choix des doses,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— évaluation statistique,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 374
 
B.20.  TEST DE LÉTALITÉ RÉCESSIVE LIÉE AU SEXE SUR  
DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Le test de létalité récessive liée au sexe ( Sex-linked recessive lethal 
test: SLRL) utilisant  Drosophila melanogaster  décèle l'apparition de 
mutations (mutations ponctuelles ainsi que petites délétions), dans la lignée germinale de l'insecte. Cette épreuve constitue un essai de mutation en avant permettant de déceler des mutations à environ 
800 loci du chromosome X, soit environ 80 % de tous les loci du 
chromosome X. Le chromosome X représente approximativement un cinquième du génome haploïde complet.
 
Les mutations du chromosome X de  Drosophila melanogaster  sont 
phénotypiquement exprimées chez les mâles porteurs du gène mutant. Lorsque la mutation est létale à l'état hémizygote, sa présence est déduite de l'absence d'un des groupes de descendance 
mâle sur les deux normalement produits par une femelle hétérozy ­
gote. L'épreuve SLRL exploite cette caractéristique en utilisant des chromosomes spécifiquement marqués et possédant des réarrange ­
ments de structure.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
S t o c k s  
Des mâles d'une lignée de type sauvage bien définie ainsi que des 
femelles contenant le chromosome Muller-5 peuvent être utilisés. D'autres lignées de femelles adéquatement marquées et porteuses de chromosomes X inversés de façon multiple peuvent également 
être utilisées.
 
S u b s t a n c e d ' e s s a i  
Les substances d'essai sont dissoutes dans l'eau. Les substances inso ­
lubles dans l'eau peuvent être dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés (par exemple un mélange d'éthanol et de Tween-60 ou 80), puis être diluées dans de l'eau ou dans une solu ­
tion saline avant d'être administrées. L'utilisation de diméthylsul ­
foxyde comme véhicule devrait être évitée.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 375
 
N o m b r e d ' a n i m a u x  
La sensibilité et la signification de l'essai seront prédéterminées. La 
fréquence de mutants spontanés observée dans le témoin approprié influencera fortement le nombre de chromosomes traités à analyser.
 
V o i e d ' a d m i n i s t r a t i o n  
L'administration peut être orale, par injection ou par exposition à des 
gaz ou des vapeurs. L'ingestion de la substance d'essai peut se faire 
par l'intermédiaire d'une solution sucrée. Si nécessaire, les substances peuvent être dissoutes dans une solution à 0,7 % de NaCl et injectées dans le thorax ou l'abdomen.
 
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s n é g a t i f s e t p o s i t i f s  
Des témoins négatifs (véhicule) et positifs seront inclus. Toutefois, si 
le laboratoire dispose de données de contrôles historiques adéquats, des témoins simultanés ne sont pas nécessaires.
 
N i v e a u d ' e x p o s i t i o n  
Trois niveaux d'exposition seront utilisés. Pour une première évalua ­
tion, on peut utiliser un seul niveau d'exposition de la substance d'essai, à savoir, soit la concentration maximale tolérée soit la 
concentration produisant certains signes de toxicité. Dans le cas de 
substances non toxiques, on devrait avoir recours à l'exposition à la concentration maximale praticable.
 
C o n d u i t e d e l ' e s s a i  
Des mâles de phénotype sauvage (âgés de 3 à 5 jours) sont traités 
avec la substance d'essai et individuellement accouplés à plusieurs 
femelles vierges de la lignée Muller-5 ou d'une autre porteuse d'un marqueur adéquat (à chromosomes X inversés de façon multiple). Tous les deux à trois jours, ces femelles sont remplacées par d'autres 
femelles vierges afin de couvrir le cycle germinal complet. La 
descendance de ces femelles est examinée afin de relever les effets létaux correspondant aux effets sur le sperme mature, les spermatides 
à des stades précoces, moyens ou tardifs, les spermatocytes et les 
spermatogonies au moment du traitement.
 
Les femelles F  1 hétérozygotes provenant des croisements susmen ­
tionnés sont accouplées individuellement (c'est-à-dire une femelle par flacon) avec leurs frères. À la génération F
 2 , chaque culture 
est examinée afin de déceler l'absence de mâles du type sauvage. 
Si une culture s'avère provenir d'une femelle F  1 porteuse d'un gène 
létal sur le chromosome X parental (c'est-à-dire qu'aucun mâle porteur du chromosome traité n'est observé), les filles de cette femelle présentant le même génotype seront testées afin de vérifier 
si la létalité se répète dans la génération suivante.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats devraient être présentés sous forme de tableaux afin de 
montrer le nombre de chromosomes testés, le nombre de mâles 
infertiles et le nombre de chromosomes létaux à chaque concentra ­
tion d'exposition et à chaque période d'accouplement pour chaque mâle traité. Le nombre de groupes de tailles différentes par mâle est 
indiqué. Les résultats de l'essai seront confirmés au cours d'une 
expérience séparée.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 376
 
Des méthodes statistiques appropriées seront utilisées pour évaluer le 
test de létalité récessive liée au sexe. Le regroupement de gènes 
létaux récessifs provenant d'un seul mâle sera pris en considération et évalué par une méthode statistique adéquate.
 
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— lignée: lignées ou souches de drosophiles utilisées, âge des 
insectes, nombre de mâles traités, nombre de mâles stériles, 
nombre de cultures F  2 établies, nombre de cultures F  2 sans 
progéniture, nombre de chromosomes porteurs d'un gène létal décelé à chaque stade de la cellule germinale
 
— critères retenus pour déterminer la taille des groupes traité,  
— conditions d'essai: description détaillée du programme de traite ­
ment et de prélèvement, niveau d'exposition, données relatives à 
la toxicité, témoins négatifs (solvant) et positifs, si nécessaire,  
— critères de comptage des mutations létales,  
— relation exposition/effet, si possible,  
— évaluation des données,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 377
 
B.21.  TESTS DE TRANSFORMATION SUR CELLULES DE 
MAMMIFÈRE IN VITRO  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Des systèmes de culture de cellules de mammifère peuvent être 
utilisés pour déceler des modifications phénotypiques  in vitro  
induites par des substances chimiques associées à une transformation maligne  in vivo . Parmi les cellules les plus fréquemment utilisées 
figurent C3H10T'
 1 / 2 , 3T3, SHE, rat Fisher; les tests sont fondés sur 
des modifications de la morphologie cellulaire, la formation des foyers ou des modifications liées à la croissance ou non dans un agar semi-solide. Il existe des systèmes moins fréquemment utilisés 
qui décèlent d'autres modifications physiologiques ou morpholo ­
giques dans les cellules a l'issue d'une exposition à des cancérogènes chimiques. Aucun des critères analysés dans ces tests  in vitro  n'a de 
relation mécanistique établie avec le cancer. Certains systèmes de 
tests sont capables de déceler des promoteurs de tumeur. On peut 
déterminer la cytotoxicité en mesurant l'effet de la substance d'essai sur les aptitudes à former une colonie (efficacité de clonage) ou sur les taux de croissance des cultures. La mesure de la cytotoxicité a 
pour but de déterminer si l'exposition à la substance d'essai a été 
toxicologiquement significative mais ne peut servir à calculer la fréquence des transformations dans toutes les épreuves, étant donné que certaines de celles-ci peuvent nécessiter une incubation 
prolongée et/ou un réensemencement.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
C e l l u l e s  
Suivant l'épreuve de transformation effectuée, diverses lignées cellu ­
laires ou cellules primaires peuvent être utilisées. L'investigateur 
veillera à ce que les cellules utilisées pour l'épreuve présentent la modification phénotypique adéquate après exposition à des cancéro ­
gènes connus et à ce que la preuve de la validité et de la fiabilité de 
l'essai effectué dans le laboratoire de l'investigateur soient étayées 
par des documents.
 
M i l i e u  
On utilisera des milieux et des conditions d'essai convenant à la 
méthode de transformation utilisée.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 378
 
S u b s t a n c e d ' e s s a i  
Les substances d'essai peuvent être soit préparées dans des milieux 
de culture, soit dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés avant le traitement des cellules. La concentration finale du véhicule dans le milieu de culture n'affectera ni la viabilité des 
cellules, ni le taux de croissance, ni l'incidence de transformation.
 
A c t i v a t i o n m é t a b o l i q u e  
Les cellules sont exposées à la substance d'essai en présence et en 
l'absence d'un système approprié d'activation métabolique de 
mammifère. Si l'on utilise des types de cellules ayant une activité 
métabolique intrinsèque, la nature de l'activité sera reconnue comme appropriée à la classe chimique testée.
 
Conditions d'essai  
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s p o s i t i f s e t n é g a t i f s  
Des témoins positifs utilisant une substance à action directe et une 
substance nécessitant une activation métabolique seront inclus dans 
chaque expérience: un témoin négatif (véhicule) sera également 
utilisé.  
Les substances ci-après peuvent, par exemple, être utilisées comme 
témoins positifs:  
— substances chimiques à action directe:  
— méthanesulfonate d'éthyle,  
— μ-propiolactone,  
— substances nécessitant une activation métabolique:  
— 2-acétylaminofluorène,  
— 4-diméthylaminoazobenzène,  
— 7,12-diméthylbenzo(a)anthracène.  
Si cela se justifie, un témoin positif supplémentaire appartenant à la 
même classe chimique que la substance testée devrait être inclus.  
C o n c e n t r a t i o n s d ' e x p o s i t i o n  
Plusieurs concentrations de la substance d'essai devraient être utili ­
sées. Ces concentrations devraient produire un effet toxique en rapport avec la concentration, la concentration maximale produira 
un faible taux de survie, la concentration minimale un taux de 
survie voisin de celui observé pour le témoin négatif. Les substances relativement insolubles dans l'eau seront testées jusqu'à leur limite de solubilité par des méthodes appropriées. Dans le cas de substances 
non toxiques très solubles dans l'eau, la concentration maximale 
devrait être déterminée cas par cas.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 379
 
Conduite de l'essai  
Les cellules sont exposées pendant un laps de temps adéquat dépen ­
dant du système cellulaire utilisé, et ceci peut impliquer un nouveau traitement assorti d'un changement de milieu (et si nécessaire, un nouveau mélange d'activation métabolique) si l'exposition est prolon ­
gée. Les cellules n'ayant pas une activité métabolique intrinsèque 
suffisante devraient être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. À l'issue de la période d'exposition, les cellules sont lavées de manière 
à éliminer la substance testée et mises en culture dans des conditions 
permettant l'apparition du phénotype transformé étudié et l'incidence de cette transformation est déterminée. Tous les résultats sont confirmés au cours d'une expérience indépendante.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats devraient être présentés sous la forme de tableaux et 
peuvent être combinés différemment suivant la méthode utilisée, par 
exemple comptage par boîte, boîtes positives ou nombre de cellules transformées. Le cas échéant, le taux de survie sera exprimé en pourcentage des taux témoins; la fréquence de transformation corres ­
pondra au nombre de cellules transformées par nombre de 
survivantes. Les résultats devraient être évalués par des méthodes statistiques appropriées.
 
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— type de cellule utilisée, nombre de cultures cellulaires, méthodes 
d'entretien des cultures cellulaires,  
— conditions d'essai: concentration de la substance d'essai, véhicule 
utilisé, temps d'incubation, durée et fréquence du traitement, densité cellulaire durant le traitement, type de système d'activa ­
tion métabolique exogène utilisé, témoins positifs et négatifs, 
spécification du phénotype étudié, système sélectif utilisé (le 
cas échéant), justification du choix des doses,
 
— méthode utilisée pouf compter les cellules viables et transfor ­
mées,  
— évaluation statistique,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 380
 
B.22.  TEST DE LÉTALITÉ DOMINANTE CHEZ LE RONGEUR  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La létalité dominante provoque la mort de l'embryon ou du fœtus. 
L'induction de létalité dominante par exposition à une substance chimique indique que la substance a altéré le tissu germinal de 
l'espèce étudiée. Il est généralement admis que la létalité dominante 
est imputable à une lésion chromosomique (anomalies structurelles et numériques). Si les animaux traités sont des femelles, la mort de l'embryon peut également être due à des effets toxiques.
 
En général, les mâles sont exposés à la substance d'essai et accouplés 
avec des femelles vierges non traitées. Les différents stades des cellules germinales peuvent être testés séparément grâce à l'utilisation 
de périodes d'accouplement séquentielles. L'accroissement du nombre 
d'implants morts par femelle dans le groupe traité par rapport au nombre d'implants morts par femelle dans le groupe témoin reflète les pertes après implantation. Les pertes avant implantation peuvent 
être estimées par comptage des corps jaunes ou en comparant le 
nombre total d'implants par femelle dans le groupe traité et dans le groupe témoin. L'effet total de létalité dominante est égal à la somme des pertes avant et après implantation. Le calcul de l'effet total de la 
létalité dominante est basé sur la comparaison entre le nombre d'im ­
plants vivants par femelle dans le groupe testé et celui enregistré pour le groupe témoin. Une réduction du nombre des implants à certaines périodes peut être due à la destruction de cellules (c'est- 
à-dire de spermatocytes et/ou de spermatogonies).
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Lorsque c'est possible, les substances d'essai sont dissoutes ou mises 
en suspension dans une solution saline isotonique. Les substances 
chimiques insolubles dans l'eau peuvent être dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés. Le véhicule utilisé ne devrait pas interférer avec la substance d'essai et ne devrait pas 
produire d'effets toxiques. Des préparations fraîchement réalisées 
de la substance d'essai sont utilisées.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 381
 
Conditions d'essai  
V o i e d ' a d m i n i s t r a t i o n  
La substance d'essai ne devrait être généralement administrée qu'une 
seule fois. En fonction des informations toxicologiques disponibles, un programme de traitement répété peut être utilisé. Les voies d'ad ­
ministration habituelles sont l'intubation orale ou l'injection intrapé ­
ritonéale. D'autres voies d'administration peuvent être appropriées.
 
A n i m a u x d ' e x p é r i e n c e  
Il est recommandé d'utiliser des rats ou des souris. De jeunes 
animaux ayant atteint leur pleine maturité sexuelle sont répartis au hasard entre les groupes traités et témoins.
 
N o m b r e e t s e x e  
Un nombre adéquat de mâles traités est utilisé compte tenu de la 
variabilité spontanée du caractère biologique étudié. Le nombre retenu devrait être fondé sur la sensibilité de détection et le degré de signification qui ont été prédéterminés. Par exemple, dans une 
expérience type, le nombre de mâles retenus pour chaque groupe de 
dose devrait être suffisant pour obtenir environ 30 à 50 femelles gravides par période d'accouplement.
 
U t i l i s a t i o n d e t é m o i n s n é g a t i f s e t p o s i t i f s  
Généralement des témoins positifs et négatifs (véhicule) seront inclus 
simultanément dans chaque expérience. Si des expériences récentes 
effectuées dans le même laboratoire ont donné des résultats accepta ­
bles pour des témoins positifs, ces résultats peuvent être utilisés à la place d'un témoin positif simultané. En ce qui concerne les subs ­
tances témoins positives, on utilisera une dose faible appropriée (par 
exemple MMS, i.p., 10 mg/kg), afin de démontrer la sensibilité du test.
 
D o s e s  
Normalement trois niveaux de dose sont utilisés. La dose élevée 
produira des signes de toxicité ou réduira la fécondité des animaux 
traités. Dans certains cas, un seul niveau de dose élevé peut suffire.  
É p r e u v e l i m i t e  
Les substances non toxiques sont testées à raison de 5 g/kg en cas 
d'administration unique et de 1 g/kg/jour en cas d'administration multiple.
 
Conduite de l'essai  
Plusieurs schémas de traitement sont possibles. La méthode la plus 
fréquente est celle de l'administration unique. D'autres schémas de traitement peuvent être utilisés.
 
Chaque mâle est accouplé séquentiellement à 1 ou 2 femelles vierges 
non traitées à des intervalles de temps appropriés après le traitement. Les femelles devraient être laissées avec les mâles pendant au moins un cycle œstral complet ou jusqu'à ce que l'accouplement soit 
constaté par la présence de sperme dans le vagin ou la présence 
d'un bouchon vaginal.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 382
 
Le nombre d'accouplements après traitement est déterminé par le 
programme de traitement et sera tel que tous les stades des cellules 
germinates traitées soient impliqués.  
Les femelles sont sacrifiées durant la seconde moitié de leur 
gestation et le contenu de leur utérus est examiné, afin de déterminer le nombre d'implants vivants et morts. Les ovaires peuvent être examinés afin de déterminer le nombre de corps jaunes.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats devraient être présentés sous la forme de tableaux indi ­
quant le nombre de mâles, le nombre de femelles gravides ainsi que 
le nombre de femelles non gravides. Les résultats de chaque accou ­
plement, y compris l'identité de chaque mâle et de chaque femelle, sont présentés séparément. Pour chaque femelle, la semaine d'accou ­
plement et la dose reçue par les mâles ainsi que les fréquences 
d'implants vivants et morts sont rapportés.
 
Le calcul de l'effet total de la létalité dominante est basé sur une 
comparaison du nombre d'implants vivants par femelle dans le groupe testé avec le nombre d'implants vivants par femelle dans le groupe témoin. Le rapport entre implants vivants et implants morts 
dans le groupe traité comparé avec le rapport correspondant dans le 
groupe témoin est analysé en vue d'indiquer la perte après implan ­
tation.
 
Si les résultats sont enregistrés sous la forme de mortalité précoce et 
de mortalité tardive, les tableaux devraient faire clairement ressortir cette différence. Si la perte avant implantation est évaluée, il y a lieu 
d'en présenter les résultats. Cette perte peut être exprimée par la 
différence entre le nombre de corps jaunes et le nombre d'implants ou par la réduction du nombre moyen d'implants par femelle par rapport aux accouplements témoins.
 
Les résultats sont évalués par des méthodes statistiques appropriées.  
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— espèces, souche, âge et poids des animaux utilisés, nombre d'ani ­
maux de chaque sexe dans les groupes traités et témoins,  
— substance d'essai, véhicule, niveaux de dose testés et justification 
du choix des doses, témoins négatifs et positifs, données relatives à la toxicité,
 
— voie et programme de traitement,  
— programme d'accouplement,  
— méthode utilisée pour constater l'accouplement,  
— moment du sacrifice,  
— critères de comptage des effets de la létalité dominante,  
— relation dose-réponse, si possible,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 383
 
— évaluation statistique,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 384
 
B.23.  ESSAI D'ABERRATION CHROMOSOMIQUE SUR 
SPERMATOGONIES DE MAMMIFÈRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
483, Essai d'aberration chromosomique sur des spermatogonies de 
mammifères (1997).  
1.1. INTRODUCTION  
L'essai in vivo d'aberration chromosomique sur spermatogonies de 
mammifère est destiné à détecter les substances qui causent des aberrations de structure dans les spermatogonies de mammifère (1, 
2, 3, 4, 5). Les aberrations de structure peuvent être de deux types: 
chromosomiques ou chromatidiennes. La majorité des mutagènes chimiques induisent des mutations chromatidiennes, mais des aber ­
rations chromosomiques se produisent également. Cet essai n'est pas 
conçu pour évaluer les aberrations de nombre et n'est pas utilisé 
systématiquement dans ce but. Les mutations chromosomiques et les événements liés sont à l'origine de nombreuses maladies géné ­
tiques humaines.
 
Cet essai évalue des atteintes chromosomiques qui surviennent dans 
tes spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir 
l'introduction de mutations transmissibles à la descendance dans les 
cellules germinales.  
Pour cet essai, on utilise généralement des rongeurs. Cet essai cyto ­
génétique in vivo détecte des aberrations chromosomiques dans les spermatogonies en mitose. D'autres cellules cibles ne font pas l'objet de cette méthode.
 
Afin de détecter des aberrations chromatidiennes dans les spermato ­
gonies, il faut examiner la première division cellulaire mitotique 
après le traitement, avant que ces aberrations ne disparaissent lors 
des divisions cellulaires ultérieures. L'analyse de chromosomes méio ­
tiques peut fournir des informations complémentaires utiles; elle est 
destinée à mettre en évidence des aberrations de type chromoso ­
mique aux stades de la diacinèse-métaphase I, lorsque les cellules traitées se transforment en spermatocytes.
 
Cet essai in vivo est conçu pour vérifier si les mutagènes actifs sur 
les cellules somatiques le sont également sur les cellules germinales. L'essai sur spermatogonies se prête particulièrement bien à l'évalua ­
tion du risque mutagène, puisqu'il permet de tenir compte de facteurs 
de métabolisme in vivo, de pharmacocinétique et de processus de réparation de l'ADN.
 
Les testicules contiennent plusieurs générations de spermatogonies 
présentant des sensibilités diverses au traitement chimique. De ce fait, les aberrations détectées représentent une réponse globale des 
populations de spermatogonies traitées, dans lesquelles les cellules 
différenciées, plus nombreuses, prédominent. En fonction de leur position dans le testicule, les différentes générations de spermatogo ­
nies sont ou non exposées aux substances présentes dans la circula ­
tion générale en raison de la barrière physique et physiologique des 
cellules de Sertoli et de la barrière sang-testicule.
 
L'utilisation de cet essai ne convient pas s'il est manifeste que 
la substance d'essai ou un métabolite réactif n'atteindra pas le tissu cible.
 
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 385
 
1.2. DÉFINITIONS  
Aberration de type chromatidien:  lésion chromosomique de struc ­
ture se traduisant par une cassure d'une seule chromatide ou par une cassure et une réunion entre chromatides.
 
Aberration de type chromosomique:  lésion chromosomique de 
structure se traduisant par une cassure, ou par une cassure et une réunion, des deux chromatides sur le même site.
 
Lacune:  une lésion achromatique inférieure à la largeur d'une chro ­
matide, avec un défaut d'alignement minimal des chromatides.  
Aberration de nombre:  une modification du nombre de chromo ­
somes par rapport au nombre normal caractéristique des cellules 
employées.  
Polyploïdie:  état multiple du nombre de chromosomes haploïdes ( n), 
autre que la diploïdie (c'est-à-dire 3 n, 4n, etc.)  
Aberration de structure:  modification de la structure des chromo ­
somes, détectable par un examen au microscope au stade de la métaphase et se présentant sous la forme de délétions, de cassures, de modifications intrachromosomiques ou interchromosomiques.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d'ex ­
position appropriée et sont sacrifiés à des moments appropriés après le traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec une 
substance qui bloque les cellules en métaphase (par exemple la 
colchicine ou Colcemid®). Ensuite, les préparations chromosomiques réalisées à partir des cellules germinales sont colorées et les cellules en métaphase sont examinées pour mettre en évidence les aberrations 
chromosomiques.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparations  
1.4.1.1.  Sélection des espèces animales  
On utilise communément des hamsters chinois et des souris. Des 
mâles d'autres espèces de mammifères appropriées peuvent cepen ­
dant être employés. Il convient d'utiliser des animaux adultes jeunes et sains, issus de souches de laboratoire courantes. Au début de l'étude, la variation pondérale des animaux doit être minimale et 
ne doit pas excéder ± 20 % du poids moyen.
 
1.4.1.2.  Conditions d'encagement et régime alimentaire  
Les conditions générales décrites dans l'introduction générale de la 
partie B sont appliquées mais le taux d'humidité devrait se situer aux 
environs de 50-60 %.  
1.4.1.3.  Préparation des animaux  
De jeunes mâles sains sont répartis par randomisation entre les 
groupes témoins et les groupes traités. Les cages doivent être disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effet dû à leur empla ­
cement. Les animaux sont identifiés individuellement. Ils sont accli ­
matés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 386
 
1.4.1.4.  Préparation des doses  
Les substances d'essai solides sont dissoutes ou mises en suspension 
dans un véhicule ou un solvant approprié, puis éventuellement diluées avant l'administration aux animaux. Les substances d'essai 
liquides peuvent être administrées directement ou après dilution. Il 
convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les condi ­
tions du stockage.
 
1.4.2.  Conditions expérimentales  
1.4.2.1.  Solvant/véhicule  
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas avoir d'effet toxique aux doses 
utilisées ni présenter de réaction chimique avec la substance d'essai. 
Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par 
des données sur leur compatibilité. On préconise d'envisager d'abord l'utilisation d'un véhicule/solvant aqueux, chaque fois que cela et possible.
 
1.4.2.2.  Témoins  
Des témoins positifs et négatifs (solvant ou véhicule) doivent accom ­
pagner chaque essai. Les animaux des groupes témoins doivent être manipulés exactement comme ceux des groupes traités, mise à part l'administration de la substance d'essai.
 
Les témoins positifs doivent produire des aberrations chromoso ­
miques de structure in vivo dans les spermatogonies lorsqu'ils sont administrés à des niveaux d'exposition supposés produire un accrois ­
sement détectable par rapport au bruit de fond.
 
Les doses de témoin positif doivent être choisies afin que les effets 
soient nets mais que l'identité des lames codées ne soit pas révélée immédiatement à l'examinateur. Le témoin positif peut être admi ­
nistré par une voie différente de celle utilisée pour la substance 
d'essai et un seul prélèvement d'échantillon peut suffire. L'emploi 
de témoins positifs appartenant à la même classe chimique peut être envisagé, s'ils sont disponibles. Les substances indiquées dans le tableau ci-dessous sont des exemples de témoins positifs.
 
Substance N  o CAS N  o Einecs  
Cyclophosphamide 
Monohydrate de cyclophosphamide 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cyclohexylamine 108-91-8 203-629-0 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 
Acrylamide monomère 79-06-1 201-173-7 Triéthylènemélamine 51-18-3 200-083-5
 
Lors de chaque prélèvement, il faut inclure un lot d'animaux témoins 
négatifs traités seulement avec le solvant ou le véhicule et par ailleurs manipulés de la même façon que les groupes traités. Ceci 
peut être évité si l'on dispose de données acceptables sur la variabi ­
lité interindividuelle et la fréquence spontanée de cellules comportant des aberrations chromosomiques provenant de témoins historiques. En outre, des témoins non traités doivent aussi être inclus, à moins 
que des données historiques ne démontrent que le solvant/véhicule 
choisi n'induit aucun effet délétère ou mutagène.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 387
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Nombre d'animaux  
Chaque groupe traité et groupe témoin doit comporter au moins cinq 
mâles analysables.  
1.5.2.  Modalités de traitement  
La substance d'essai est de préférence administrée en une seule fois 
ou en deux fois (c'est-à-dire en un seul ou deux traitements). Elle 
peut aussi être administrée en doses fractionnées (deux doses le 
même jour avec un intervalle de quelques heures au maximum) afin que l'administration d'un grand volume soit plus aisée. D'autres modalités de traitement doivent être scientifiquement justifiées.
 
Dans le groupe qui reçoit la dose la plus forte, deux prélèvements 
d'échantillons sont effectués après le traitement. La cinétique cellu ­
laire pouvant être influencée par la substance d'essai, le premier et le 
deuxième prélèvement ont lieu respectivement environ 24 heures et 48 heures après le traitement. Pour les autres doses, le prélèvement est effectué après 24 heures ou 1,5 cycle cellulaire après le traite ­
ment, à moins que l'on sache qu'il existe un autre délai de prélève ­
ment plus propice à la détection des effets (6).
 
D'autres temps de prélèvement peuvent être employés. Par exemple, 
dans le cas de substances chimiques qui pourraient induire des 
chromosomes retardataires ou d'avoir des effets indépendants de la phase S, il peut être judicieux d'effectuer des prélèvements plus précoces (1).
 
La pertinence d'un traitement répété doit être évaluée au cas par cas. 
Après un traitement répété, les animaux doivent être sacrifiés 24 
heures (1,5 cycle cellulaire) après le dernier traitement. De plus, 
d'autres temps de prélèvements peuvent être employés si nécessaire.  
Avant d'être sacrifiés, les animaux reçoivent une dose appropriée 
d'un agent bloquant la métaphase (par exemple du Colcemid® ou 
de la colchicine) par injection intrapéritonéale. Les échantillons sont prélevés après des délais appropriés. Ce délai est d'environ 3-5 heures pour la souris et de 4-5 heures environ pour le hamster 
chinois.
 
1.5.3.  Niveaux de dose  
Si une étude préliminaire est réalisée afin d'évaluer les niveaux de 
dose requis, cette étude doit être effectuée dans le même laboratoire 
en utilisant la même espèce, la même souche, des animaux du même sexe et les mêmes modalités de traitement que ceux de l'étude prin ­
cipale (7). En cas de toxicité, on utilise trois niveaux de dose pour le 
premier prélèvement. Ces niveaux de dose doivent couvrir un 
domaine allant d'une toxicité nulle ou légère à la toxicité maximale. Pour les prélèvements suivants, seule la dose la plus élevée est utilisée. Celle-ci est définie comme la dose qui produit des signes 
de toxicité tels qu'ils font supposer que des doses plus fortes, admi ­
nistrées suivant la même modalité de traitement, seraient létales.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 388
 
Les substances possédant une activité biologique spécifique à des 
doses faibles et non toxiques (comme les hormones et les mitogènes) 
peuvent faire exception aux critères d'établissement des doses et doivent être évaluées cas par cas. La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui produit certains indices de 
toxicité dans les spermatogonies (par exemple une diminution des 
mitoses des spermatogonies par rapport à la première et la deuxième métaphase méiotique; cette diminution ne devrait pas dépasser 50 %).
 
1.5.4.  Test limite  
Si un essai réalisé avec au moins 2 000 mg/kg de poids corporel, en 
une seule dose ou en deux doses administrées le même jour, n'en ­
gendre aucun effet toxique observable et si une génotoxicité est improbable d'après les données relatives à des substances de struc ­
ture voisine, on peut considérer qu'une étude complète avec trois 
niveaux de doses n'est pas nécessaire. Suivant l'importance de l'ex ­
position humaine probable, on peut envisager d'utiliser des doses plus fortes dans le test limite.
 
1.5.5.  Voies d'administration  
La substance d'essai est généralement administrée par gavage à l'aide 
d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation adaptée, ou par 
injection intrapéritonéale. D'autres voies d'exposition sont accepta ­
bles lorsqu'elles peuvent être justifiées. Le volume maximal de liquide administré en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne devrait pas dépasser 
2 ml/100 g de poids corporel. Une justification doit être fournie si 
des volumes plus importants sont administrés. Il convient de réduire au minimum la variation du volume administré en ajustant la concen ­
tration à tous les niveaux de doses, sauf pour les produits irritants ou 
corrosifs dont les effets sont généralement exacerbés lorsqu'on 
augmente la concentration.
 
1.5.6.  Préparation des chromosomes  
Des suspensions cellulaires obtenues à partir d'un ou des deux 
testicules immédiatement après le sacrifice sont exposées à une solu ­
tion hypotonique et fixées. Les cellules sont ensuite étalées sur des 
lames et colorées.  
1.5.7.  Analyse  
Au moins 100 cellules en métaphase bien étalées sont analysées par 
animal (soit un minimum de 500 métaphases par groupe d'essai). Ce nombre peut être réduit lorsque les aberrations observées sont nombreuses. Toutes les lames, y compris celles des témoins positifs 
et négatifs, doivent être codées indépendamment avant l'analyse au 
microscope. Le procédé de fixation provoquant souvent la rupture d'une certaine fraction des cellules en métaphase, ce qui entraîne une perte de chromosomes, les cellules examinées doivent contenir un 
nombre de centromères égal à 2n ± 2.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les résultats individuels pour chaque animal doivent être présentés 
sous forme de tableaux. L'unité expérimentale est l'animal. Le nombre de cellules présentant une ou plusieurs aberrations de struc ­
ture et le nombre d'aberrations par cellule doivent être évalués pour 
chaque animal. Les différents types d'aberrations chromosomiques de structure doivent être consignés avec leur nombre et leur fréquence pour les groupes traités et témoins. Les lacunes sont enregistrées 
séparément et rapportées mais ne sont généralement pas incluses 
dans la fréquence totale des aberrations.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 389
 
Pour les cellules en méiose, il conviendra de prendre comme élément 
de cytotoxicité le rapport du nombre de spermatogonies en méta ­
phase de première mitose/nombre de spermatogonies en métaphase de seconde mitose. Cette analyse sera réalisée à la fois chez les animaux traités et les contrôles négatifs sur un échantillon de 100 
cellules en division pour chaque animal. Dans le cas où seules des 
mitoses sont observées, l'index mitotique doit être déterminé dans au moins 1 000 cellules de chaque animal.
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, 
notamment un accroissement, dose-dépendant, du nombre relatif de cellules présentant des aberrations ou une augmentation nette du nombre de cellules présentant des aberrations dans un seul groupe 
traité à un seul moment de prélèvement. En premier lieu, il s'agit de 
prendre en considération la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peut s'appuyer sur des méthodes statis ­
tiques (8) mais la signification statistique ne doit pas être le seul 
facteur décisif pour conclure à une réponse positive. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des essais supplémentaires réalisés de préférence dans des conditions expérimentales modifiées.
 
Si les résultats obtenus avec une substance d'essai ne répondent pas 
aux critères indiqués ci-dessus, on peut conclure que la substance en question n'est pas mutagène dans cet essai.
 
Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement 
positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats 
d'un essai n'autorise pas un jugement catégorique sur l'activité de la 
substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Des résultats positifs obtenus dans cet essai in vivo d'aberration 
chromosomique sur spermatogonies indiquent que la substance induit des aberrations chromosomiques dans les cellules germinales de l'espèce testée. Des résultats négatifs signifient que, dans les 
conditions de l'essai, la substance testée n'induit pas d'aberrations 
chromosomiques dans les cellules germinales de l'espèce testée.
 
Le fait que la substance d'essai ou ses métabolites n'atteignent pas le 
tissu cible devrait être discuté.  
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Animaux d'expérience:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre et âge des animaux,  
— source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids individuels des animaux au début de l'essai, y compris 
l'intervalle des poids, la moyenne et l'écart-type dans chaque 
groupe.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 390
 
Conditions expérimentales:  
— résultats de l'étude de détermination des doses utiles, si elle a été 
réalisée,  
— justification du choix des doses employées,  
— justification du choix de la voie d'administration,  
— détails concernant la préparation de la substance d'essai,  
— détails concernant l'administration de la substance d'essai,  
— justification du choix des moments de sacrifice,  
— conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans 
l'eau de boisson ou la nourriture en dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour), s'il y a lieu,
 
— détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau,  
— description détaillée des modalités de traitement et de prélève ­
ment,  
— méthodes de mesure de la toxicité,  
— nature et concentration de l'inhibiteur du fuseau mitotique et 
durée du traitement,  
— méthodes de préparation des lames,  
— critères de dénombrement des aberrations,  
— nombre de cellules analysées par animal,  
— critères de décision concernant les résultats positifs, négatifs et 
équivoques.  
Résultats:  
— signes de toxicité,  
— index mitotique,  
— taux de mitoses des spermatogonies par rapport à la première et 
la deuxième métaphase méiotique,  
— type et nombre d'aberrations, séparément pour chaque animal,  
— nombre total d'aberrations par groupe,  
— nombre de cellules présentant des aberrations par groupe,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— analyses statistiques, le cas échéant,  
— données sur les témoins négatifs concomitants,  
— données sur les témoins négatifs antérieurs (étendues, moyennes 
et écarts-types),  
— données sur les témoins positifs concomitants,  
— changements de la ploïdie, le cas échéant.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 391
 
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications, in:  Genetic Toxicology of Environmental Chemicals. 
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Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York. pp. 477-484.
 
(2) Adler, I. D. (1984), Cytogenic tests in Mammals, in:  Mutage­
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Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.  
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Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes,  Cytogenetics and Cell Genetics . 3, pp. 289-294.
 
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.),  Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
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(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes,  
Mutation Res. , 52. pp. 207-209.  
(6) Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman,]., Favor, j., Generoso, 
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national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test 
Procedures. Summary Report of the Working Group on 
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Society Working group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity 
Assays,  Mutagenesis , 7, pp. 313-319.
 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cyto ­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.),  Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mulagenicity Testing, report. Part III , Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 392
 
B.24.  SPOT TEST CHEZ LA SOURIS  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Il s'agit d'une épreuve in vivo effectuée sur souris dont les embryons 
en développement sont exposés à la substance d'essai. Les cellules visées des embryons en développement sont des mélanoblastes et les gènes cibles sont ceux responsables de la pigmentation des poils. Les 
embryons en développement sont hétérozygotes pour un certain 
nombre de ces gènes. Une mutation au niveau de l'allèle dominant ou la perte de l'allèle dominant (suite à divers événements géné ­
tiques) d'un tel gène dans un mélanoblaste se traduit par l'expression 
du phénotype récessif dans les cellules qui en sont issues, ce qui 
entraîne l'apparition d'une tache d'une autre couleur dans le pelage de la souris nouveau-née. Le nombre de descendants porteurs de taches (mutations) est compté et la fréquence de celles-ci est comparée à 
celle observée pour la descendance issue des embryons traités 
uniquement avec le solvant. Le  spot test  chez la souris décèle des 
mutations présumées somatiques au niveau des cellules fœtales.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Lorsque c'est possible, les substances d'essai sont dissoutes ou mises 
en suspension dans une solution saline isotonique. Les substances insolubles dans l'eau sont dissoutes ou mises en suspension dans des 
véhicules appropriés. Le véhicule utilisé ne devrait pas interférer 
avec la substance d'essai et ne devrait pas produire d'effets toxiques. Des préparations de la substance d'essai fraîchement réalisées seront utilisées.
 
A n i m a u x d ' e x p é r i e n c e  
Des souris de la souche T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, 
c ch p/c ch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d; piebald spotting, 
s/s) sont accouplées soit avec la souche HT (pallid, nonagouti, 
brachypodie, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, In fz/ln fz; pearl pe/pe) ou avec C57 BL (nonagouti, a/a). D'autres croisements appro ­
priés tels que NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) et DBA (nonagouti, 
a/a; brown, b/b; dilute d/d) peuvent être utilisés à condition de 
donner une descendance nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 393
 
N o m b r e e t s e x e  
On traite un nombre suffisant de femelles gravides de manière à 
obtenir un nombre adéquat de descendants vivants pour chaque dose utilisée. La taille de l'échantillon dépend du nombre de taches observées chez les souris traitées ainsi que l'importance du nombre 
de données témoins. Un résultat négatif ne peut être accepté que si 
au moins 300 descendants de femelles traitées avec la dose maximale ont été examinés.
 
T é m o i n s n é g a t i f s e t p o s i t i f s  
Simultanément, on devrait disposer de résultats de souris traitées 
uniquement avec le véhicule (témoins négatifs). Des données témoins historiques provenant du même laboratoire peuvent être 
rassemblées afin d'améliorer la sensibilité de l'essai, à condition 
que ces données soient homogènes, à l'issue d'un traitement avec un produit chimique réputé mutagène dans cet essai. Si la substance d'essai ne se révèle pas mutagène, des données obtenues récemment 
par le même laboratoire pour un contrôle positif connu pour être 
mutagène dans cette épreuve devraient être disponibles.
 
V o i e d ' a d m i n i s t r a t i o n  
Les voies d'administration habituelles sont l'intubation orale et l'in ­
jection péritonéale des femelles gravides. Le traitement par inhalation ou d'autres voies d'administration est utilisé, le cas échéant.
 
D o s e s  
On utilise au moins deux doses dont une faisant apparaître des signes 
de toxicité ou réduisant le taille des portées. Dans le cas de subs ­
tances non toxiques, on aura recours à un traitement à la dose maximale utilisable.
 
Conduite de l'épreuve  
Un traitement unique est normalement administré aux huitième, 
neuvième et dixième jours de gestation, le jour 1 étant le jour où 
l'on observe pour la première fois la présence d'un bouchon vaginal. 
Ces jours correspondent à 7,25, 8,25 et 9,25 jours après la concep ­
tion. Des traitements successifs peuvent être effectués pendant ces jours.
 
A n a l y s e  
Trois à quatre semaines après la naissance, la descendance est codée 
et examinée pour la présence de taches. On distingue trois classes de 
taches:  
a) les taches blanches situées à moins de 5 mm de la ligne médio- 
ventrale présumées résulter de mort cellulaire (WMVS);  
b) les taches jaunes, de type agouti, associées aux mamelles, aux 
organes sexuels, à la gorge, aux régions axillaire et inguinale ainsi qu'au milieu du front, présumées être dues à un manque de différenciation (MDS)
 
c) les taches pigmentées et blanches, réparties au hasard sur le 
pelage, présumées être dues à des mutations somatiques (RS).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 394
 
Les trois classes sont comptées mais seule la dernière c'est-à-dire RS, 
a une signification génétique. Les problèmes que pose la distinction 
entre les types MDS et RS peuvent être résolus en examinant des échantillons de poils au microscope à fluorescence.
 
Les anomalies morphologiques macroscopiques évidentes observées 
sur la descendance seront notées.  
2. RÉSULTATS  
Les résultats sont présentés en donnant le nombre total de jeunes 
examinés et le nombre de jeunes présentant une ou plusieurs taches 
présumées être dues à une mutation somatique. Les résultats sont 
également présentés en se référant à la portée comme unité. Les résultats relatifs aux animaux traités et aux témoins négatifs sont comparés par des méthodes statistiques appropriées.
 
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— souches utilisées dans le croisement,  
— nombre de femelles gravides dans les groupes traités et témoins,  
— taille moyenne des portées dans les groupes traités et témoins à 
la naissance et au sevrage,  
— doses de la substance d'essai,  
— solvant utilisé,  
— jour de la gestation auquel le traitement est administré,  
— voie d'administration,  
— nombre total de jeunes examinés ainsi que le nombre de ceux 
présentant une WMVS, MDS et RS dans les groupes traités et 
témoins,  
— anomalies morphologiques macroscopiques,  
— relation dose/effet de RS si possible,  
— évaluation statistique,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 395
 
B.25.  TRANSLOCATION HÉRÉDITAIRE CHEZ LA SOURIS  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPES DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
L'épreuve de translocation héréditaire chez la souris décèle des chan ­
gements chromosomiques structurels et numériques dans les cellules 
germinales de mammifères tels qu'ils sont mis en évidence dans la descendance de première génération. Les types de changements chro ­
mosomiques détectés sont des translocations réciproques et, si la 
descendance femelle est incluse, la perte du chromosome X. Les 
porteurs de translocations et les femelles XO présentent une fertilité réduite permettant la sélection d'une descendance F
 1 en vue d'une 
analyse cytogénétique. Une stérilité totale est due à certains types de 
translocations (autosome X et type c-t). Les translocations sont 
observées cytogénétiquement dans les cellules méiotiques en diaci ­
nèse-métaphase I des individus mâles, qu'il s'agisse de mâles F, ou de fils de femelles F
 1 . Les femelles XO sont identifiées cytogénéti ­
quement par la présence de 39 chromosomes seulement dans des 
mitoses de la moelle osseuse.  
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Les substances d'essai sont dissoutes dans une solution saline isoto ­
nique. Si elles sont insolubles dans l'eau, elles sont dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés. On utilise des solutions fraîchement préparées de la substance d'essai. Si un véhi ­
cule est utilisé pour faciliter le traitement, il ne doit pas interférer 
avec la substance d'essai et ne pas produire d'effets toxiques.
 
V o i e d ' a d m i n i s t r a t i o n  
Les voies d'administration sont habituellement l'intubation orale ou 
l'injection intrapéritonéale. D'autres voies d'administration peuvent 
être appropriées.  
A n i m a u x d ' e x p é r i e n c e  
Pour faciliter l'élevage et la vérification cytologique, ces expériences 
sont effectuées avec des souris. Aucune souche spécifique de souris 
n'est requise. Toutefois, la taille moyenne d'une portée de la souche utilisée devra être supérieure à 8 et être relativement constante.
 
Des animaux sains ayant atteint leur maturité sexuelle seront utilisés.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 396
 
N o m b r e d ' a n i m a u x  
Le nombre d'animaux nécessaires dépend de la fréquence de trans ­
locations spontanées ainsi que du taux minimal d'induction requis pour un résultat positif.
 
L'essai consiste habituellement en une analyse de la descendance 
mâle F  1 . Au moins 500 descendants mâles F  1 sont testés par 
groupe de dose. Si la descendance femelle F  1 est incluse, 
300 mâles et 300 femelles sont nécessaires.  
C o n t r ô l e s  
Des résultats de contrôles adéquats provenant d'épreuves réalisées 
simultanément et de contrôles historiques doivent exister. S'il 
existe des résultats acceptables de contrôles positifs provenant d'ex ­
périences récemment effectuées dans le même laboratoire, ces résul ­
tats peuvent être utilisés à la place de contrôles positifs simultanés.  
D o s e s  
Une dose est testée, il s'agit habituellement de la dose maximale 
associée à la production d'effets toxiques minimaux mais n'affectant pas le comportement reproducteur ou la survie. Pour établir une 
relation dose/réponse, deux autres doses plus faibles sont nécessaires. 
Dans le cas de substances non toxiques, on devrait avoir recours à une exposition à la dose maximale possible.
 
Conduite de l'essai  
T r a i t e m e n t e t a c c o u p l e m e n t  
Deux programmes de traitement existent. L'administration unique de 
la substance d'essai est la méthode la plus fréquente. La substance d'essai peut également être administrée 7 jours sur 7 pendant 35 
jours. Le nombre d'accouplements après traitement est déterminé 
par le programme de traitement et sera tel que tous les stades des cellules germinales traitées soient impliqués. À l'issue de la période d'accouplement, les femelles sont placées dans des cages indivi ­
duelles. Lorsqu'elles ont mis bas, la date, la taille de la portée et 
le sexe des jeunes sont enregistrés. Toute la descendance mâle est sevrée et toute la descendance femelle est écartée à moins d'être incluse dans l'expérience.
 
R e c h e r c h e d e s h é t é r o z y g o t e s d e t r a n s l o c a t i o n  
On utilise une des deux méthodes disponibles:  
— analyse de la fécondité de la descendance F  1 et vérification ulté ­
rieure d'éventuels porteurs de translocations par analyse cytogé ­
nétique,  
— analyse cytogénétique de tous les mâles F  1 sans sélection préa ­
lable par vérification de la fécondité.  
a) Analyse de la fécondité:  
La fécondité réduite d'un individu F  1 peut être déterminée en 
observant la taille de la portée et/ou en analysant le contenu 
utérin des partenaires femelles.  
Il y a lieu de fixer les critères de détermination de la fécondité 
normale et réduite de la souche de souris utilisée.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 397
 
Observation de la taille de la portée : Les mâles F  1 à tester sont 
placés dans des cages individuelles avec des femelles provenant 
soit de la même expérience soit de la colonie. Les cages sont inspectées quotidiennement à partir du dix-huitième jour qui suit l'accouplement. La taille de la portée et te sexe de la descendance 
F
 2 sont enregistrés au moment de la naissance et les jeunes sont 
ensuite éliminés. Si la descendance femelle F  1 est testée, les 
descendants F  2 provenant de petites portées sont conservés en 
vue d'une analyse plus approfondie. Les femelles porteuses de 
translocation font l'objet d'une vérification par analyse cytogéné ­
tique d'une translocation dans n'importe lequel de leurs descen ­
dants mâles. Les femelles XO sont identifiées par la modification du rapport des sexes dans leur descendance, rapport qui passe de 
1:1 à 1:2 mâles/femelles. Dans une méthode séquentielle, les 
animaux F
 1 normaux ne font pas l'objet d'une autre vérification 
si la première portée F  2 atteint ou dépasse une valeur normale 
prédéterminée, sinon une deuxième ou une troisième portée F  2 
sont observées. Les animaux F  1 qui ne peuvent pas être classés 
comme normaux après observation de jusqu'à trois portées F  2 
maximum sont soit soumis à un nouveau contrôle par le biais 
d'une analyse du contenu utérin de leurs partenaires femelles soit 
directement soumis à une analyse cytogénétique.  
Analyse du contenu utérin : La réduction de la taille des portées 
chez les porteurs de translocation est due à la mort des 
embryons, de sorte qu'un grand nombre d'implants morts 
indique la présence d'une translocation chez l'animal soumis au test. Chaque mâle F
 1 à tester est accouplé à 2 ou 3 femelles. On 
constate la conception en examinant les femelles tous les matins 
afin de déceler la présence de bouchons vaginaux. Les femelles sont sacrifiées 14 à 16 jours plus tard et le nombre d'implants vivants et morts présents dans leur utérus est enregistré.
 
b) Analyse cytogénétique:  
Les préparations de testicules sont effectuées par la méthode de 
séchage à l'air. Les porteurs de translocations sont identifiés par la présence de configurations multivalentes en diacinèse méta ­
phase I dans les spermatocytes primaires. L'observation d'au 
moins 2 cellules présentant une association multivalente constitue la preuve nécessaire que l'animal testé est porteur d'une trans ­
location.
 
Si aucune sélection par analyse de fécondité n'a été effectuée, 
tous les mâles F  1 sont soumis à un examen cytogénétique. Un 
minimum de 25 diacinèses métaphases I par mâle doivent être analysées au microscope. L'examen des métaphases mitotiques, 
des spermatogonies ou de la moelle osseuse est requise pour les 
mâles F
 1 ayant de petits testicules et présentant un arrêt méio ­
tique avant diacinèse ou pour les femelles F  1 suspectées d'être 
XO. La présence inhabituelle d'un chromosome long et/ou court 
dans 10 cellules est la preuve d'une translocation particulière 
entraînant la stérilité du mâle (type c-t). Quelques translocations X autosomes provoquant la stérilité du mâle peuvent uniquement être identifiées par une analyse des bandes de chromosomes 
mitotiques. La présence de 39 chromosomes dans 10 mitoses 
sur 10 est la preuve d'un état XO chez une femelle.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats sont présentés sous forme de tableaux.  
La taille moyenne des portées et le rapport entre les sexes sont 
enregistrés à la naissance et au sevrage pour chaque période d'accou ­
plement.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 398
 
Lors de l'évaluation de la fécondité des animaux de F  1 , la taille 
moyenne des portées issues de tous les accouplements normaux 
ainsi que la taille individuelle des portées issues d'animaux F  1 
porteurs de translocation sont présentées. En ce qui concerne l'ana ­
lyse du contenu utérin, le nombre moyen d'implants vivants et morts 
issus d'accouplements normaux et le nombre d'implants vivants et 
morts pour chaque accouplement de porteurs de translocation F  1 sont 
notés.  
Lors de l'analyse cytogénétique de la diacinèse-métaphase I, le 
nombre des différents types de configurations multivalentes et le 
nombre total de cellules sont relevés pour chaque porteur de trans ­
location.  
Pour les individus stériles F  1 , le nombre total d'accouplements et la 
durée de la période d'accouplement sont indiqués. Le poids des 
testicules et les détails de l'analyse cytogénétique sont indiqués.  
Pour les femelles XO, on indique la taille moyenne de la portée, le 
rapport entre les sexes dans la descendance F  2 ainsi que les résultats 
de l'analyse cytogénétique.  
Si d'éventuels porteurs de translocation F  1 sont présélectionnés par 
des tests de fécondité, les tableaux mentionneront combien parmi eux ont été confirmés comme étant des hétérozygotes de translocation.
 
Les données relatives aux témoins négatifs ainsi que les expériences 
témoins positives sont présentées.  
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— souche de souris, âge des animaux, poids des animaux traités,  
— nombre d'animaux parents de chaque sexe dans les groupes 
traités et témoins,  
— conditions d'essai, description détaillée du traitement, doses, 
solvants, programme d'accouplement,  
— nombre et sexe des jeunes par femelle, nombre et sexe des jeunes 
élevés en vue d'une analyse de translocation,  
— moment et critères de l'analyse de translocation,  
— nombre et description détaillée des porteurs de translocation, y 
compris données relatives à l'élevage et au contenu utérin, si 
possible,  
— méthodes cytogénétiques et détails de l'analyse microscopique, de 
préférence avec clichés,  
— évaluation statistique,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 399
 
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 400
 
B.26.  ESSAI DE TOXICITÉ SUBCHRONIQUE PAR VOIE ORALE 
TOXICITÉ ORALE À DOSES RÉPÉTÉES — RONGEURS: 
90 JOURS  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de toxicité orale subchronique 
reprend la ligne directrice n  o 408 de l'OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCTION  
Lors de l'appréciation et de l'évaluation des caractéristiques toxiques 
d'un produit chimique, la détermination de la toxicité subchronique par voie orale à doses répétées peut s'effectuer après avoir obtenu des 
informations préliminaires sur la toxicité à partir d'essais de toxicité 
aigué ou à doses répétées sur 28 jours. L'étude sur 90 jours fournit des informations sur les dangers que peut entraîner pour la santé une exposition réitérée durant une période prolongée, période qui s'étend 
du sevrage jusqu'à l'état adulte. L'étude fournira des informations sur 
les principaux effets toxiques, indiquera les organes cibles et les possibilités d'accumulation et pourra donner une estimation de la dose sans effet toxique (NOAEL) qui pourra être utilisée pour sélec ­
tionner des doses en vue d'études chroniques et pour établir les 
critères de sécurité concernant l'exposition humaine.
 
La méthode accorde davantage d'importance aux effets neurologiques 
et donne des indications relatives aux effets sur le système immuni ­
taire et sur la reproduction. Elle insiste également sur la nécessité d'observer très attentivement les animaux sur le plan clinique, en vue 
d'obtenir le plus d'informations possible. Cette étude devrait 
permettre de repérer les produits chimiques susceptibles d'avoir une action neurotoxique ou des effets sur le système immunitaire ou les organes reproducteurs, pouvant justifier des études plus appro ­
fondies.
 
Voir également introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Dose:  quantité de substance d'essai administrée. La dose est 
exprimée en poids (g, mg), en poids de substance d'essai par unité 
de poids corporel de l'animal d'expérience (par exemple, mg/kg) ou en concentration constante dans la nourriture (ppm).
 
Dosage:  terme général recouvrant la dose, sa fréquence et la durée 
de l'administration.  
DSET:  abréviation de dose sans effet toxique (NOAEL: 
No Observable Adverse Effect Level}, c'est-à-dire la dose la plus élevée à laquelle aucun effet nocif lié au traitement n'est observé.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Différentes doses de la substance d'essai sont administrées quotidien ­
nement par voie orale à plusieurs groupes d'animaux de laboratoire, à 
raison d'un niveau de dose par groupe et ce pendant une période de 
90 jours. Les animaux sont observés attentivement pendant la période d'administration afin de déceler d'éventuels signes de toxi ­
cité. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifiés au cours de 
l'essai sont autopsiés: au terme de l'essai, les animaux suivants 
sont également sacrifiés et autopsiés.
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1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.4.1.  Préparation des animaux  
Il convient d'utiliser des animaux en bonne santé, ayant été accli ­
matés aux conditions du laboratoire pendant au moins 5 jours et qui 
n'ont pas encore été sujets d'expériences. L'espèce, la race, la source, 
le sexe, le poids et/ou l'âge des animaux d'expérience doivent être précisés. Les animaux seront répartis au hasard entre les groupes traités et les groupes témoins. Les cages doivent être placées de 
façon telle que l'influence éventuelle de leur disposition sur les 
résultats de l'étude soit réduite au minimum. Un numéro d'identifi ­
cation unique est attribué à chaque animal.
 
1.4.2.  Préparation des doses  
La substance d'essai est administrée par gavage ou dans les aliments 
ou dans l'eau de boisson. Le mode d'administration par voie orale dépend de l'objectif de l'étude et des propriétés physico-chimiques de 
la substance d'essai.
 
S'il y a lieu, la substance d'essai est dissoute ou mise en suspension 
dans un véhicule approprié. On recommande, chaque fois que les 
circonstances le permettent, d'envisager d'abord l'utilisation d'une solution ou d'une suspension aqueuse, ensuite une solution ou une émulsion dans une huile (par exemple l'huile de maïs) et en dernier 
lieu une solution dans d'autres véhicules. La toxicité des véhicules 
autres que l'eau doit être connue. La stabilité de la substance d'essai dans les conditions d'administration doit être déterminée.
 
1.4.3.  Conditions d'essai  
1.4.3.1.  Animaux d'expérience  
L'espèce préférée est le rat, bien que d'autres espèces de rongeurs, 
notamment la souris, puissent être utilisées. Il convient d'employer 
de jeunes animaux adultes, sains, issus de souches de laboratoire 
courantes. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. L'ad ­
ministration doit commencer dès que possible après le sevrage et en aucun cas au-delà de l'âge de 9 semaines. Au début de l'étude, les 
différences de poids entre les animaux utilisés doivent être minimales 
et ne pas excéder ± 20 % de la moyenne du poids de chaque sexe. Lorsque l'essai est conduit à titre d'étude préliminaire à une étude de toxicité chronique à long terme, il faut utiliser des animaux issus de 
la même souche et de la même source dans les deux études.
 
1.4.3.2.  Nombre et sexe  
Au moins 20 animaux (10 femelles et 10 mâles) doivent être utilisés 
pour chaque dose. Si on a prévu de sacrifier des animaux en cours 
d'essai, il convient d'accroître ce nombre du nombre d'animaux qui doivent être sacrifiés en cours d'essai. En fonction des connaissances dont on dispose au préalable sur le produit chimique ou sur un 
produit de structure très proche, on pourra envisager d'inclure un 
groupe satellite supplémentaire de 10 animaux (5 par sexe) dans le groupe témoin et dans le groupe traité à la plus forte dose, afin d'observer, une fois la période de traitement terminée, la persistance 
ou la réversibilité de tout effet toxique. La durée de cette période 
post-traitement devrait être fixée en fonction des effets observés.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 402
 
1.4.3.3.  Niveaux de dose  
Il faut utiliser au minimum trois doses et un groupe témoin, sauf si 
un essai limite est pratiqué (voir paragraphe 1.4.3.4). Les niveaux de dose peuvent être établis en fonction des résultats obtenus lors 
d'études à doses répétées ou d'études préliminaires et doivent tenir 
compte de toutes les données toxicologiques et toxicocinétiques disponibles sur la substance d'essai ou de substances apparentées. Sauf contraintes dues aux propriétés physico-chimiques de la subs ­
tance ou à ses effets biologiques, la dose la plus élevée doit être 
choisie en vue de provoquer un effet toxique, mais ni la mort ni d'intenses souffrances. Une série de doses décroissantes doit être 
sélectionnée en vue de mettre en évidence tout effet lié à la dose 
ainsi qu'une dose sans effet toxique (DSET) à la dose la plus faible. Des intervalles correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropriés entre les doses décroissantes et l'inclusion d'un 
quatrième groupe d'essai est souvent préférable à la fixation de 
très grands intervalles (par exemple séparés par un facteur supérieur à 6-10) entre les doses.
 
Le groupe témoin sera un groupe non traité ou un groupe recevant le 
véhicule si la substance est administrée dans un véhicule. Exception faite de l'administration de la substance à tester, les animaux du groupe témoin doivent être traités de la même manière que ceux 
des groupes d'essai. Si un véhicule est employé, on administrera 
au groupe témoin le plus grand volume de véhicule utilisé. Si la substance d'essai est incorporée aux aliments et qu'elle entraîne une diminution de la prise de nourriture, il peut être utile d'utiliser un 
groupe témoin nourri en parallèle afin de déterminer si la diminution 
est due aux caractéristiques organoleptiques ou à des altérations toxicologiques du modèle d'essai.
 
Il convient également d'être attentif aux caractéristiques suivantes du 
véhicule ou d'autres additifs, selon le cas: effets sur l'absorption, la distribution, le métabolisme ou la rétention de la substance d'essai; 
effets sur les propriétés chimiques de la substance d'essai suscepti ­
bles de modifier sa toxicité; et effets sur la consommation alimen ­
taire et hydrique ou sur l'état nutritionnel des animaux.
 
1.4.3.4.  Essai limite  
Si un essai pratiqué avec une seule dose équivalant à au moins 1 000 
mg/kg de poids corporel/jour, en suivant le mode opératoire décrit pour cette étude, ne produit aucun effet nocif observé et s'il n'y a pas de raison de penser que la substance soit toxique compte tenu des 
données dont on dispose au sujet de substances ayant une structure 
analogue, on peut considérer qu'il n'est pas nécessaire de réaliser une étude complète avec trois niveaux de dose. L'essai limite est valable 
sauf dans le cas où l'exposition humaine puisse advenir à des doses 
plus élevées.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Administration des doses  
Les animaux reçoivent une administration quotidienne de la subs ­
tance d'essai, sept jours sur sept, durant 90 jours. Tout autre régime d'administration, par exemple cinq jours par semaine, doit être justifié. Lorsque la substance d'essai est administrée par gavage, 
une dose unique devrait être dispensée aux animaux par une sonde 
gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Le volume maximal de liquide administrable en une fois dépend de la taille de l'animal. Le volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf 
dans le cas des solutions aqueuses où il peut aller jusqu'à 2 ml/100 g 
de poids corporel. Sauf pour les substances irritantes ou corrosives, qui provoqueront normalement des effets exacerbés aux concentra ­
tions plus élevées, il convient de réduire au minimum la variabilité 
du volume d'essai en ajustant la concentration pour obtenir un 
volume constant à toutes les doses.
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Si la substance d'essai est administrée dans les aliments ou l'eau de 
boisson, il importe de s'assurer que sa quantité n'interfère pas avec la 
nutrition normale ni avec l'équilibre hydrique. Lorsque la substance d'essai est incorporée aux aliments, on peut soit appliquer une concentration constante dans les aliments (ppm), soit une dose 
constante par rapport au poids corporel de l'animal; il y a lieu de 
spécifier la méthode utilisée. Si la substance est administrée par gavage, la dose doit être administrée à la même heure chaque jour et ajustée si nécessaire pour rester constante par rapport au poids 
corporel de l'animal. Lorsqu'une étude sur 90 jours sert de prélimi ­
naire à une étude de toxicité chronique à long terme, un régime alimentaire semblable doit être utilisé dans les deux études.
 
1.5.2.  Observations  
La période d'observation doit durer au moins 90 jours. Les animaux 
d'un groupe satellite destinés à des observations ultérieures ne doivent recevoir aucun traitement pendant une période appropriée 
pour que l'on puisse constater la persistance ou la disparition des 
effets toxiques.
 
Il faudra effectuer un examen clinique général au moins une fois par 
jour, de préférence aux mêmes heures, en tenant compte de la période après l'administration pour laquelle des effets observables 
les plus marqués sont prévisibles. L'état clinique des animaux doit 
être noté. Deux fois par jour au minimum, généralement au début et à la fin de chaque journée, tous les animaux doivent être examinés afin de déceler des symptômes de morbidité et de mortalité.
 
Un examen clinique détaillé doit être pratiqué sur tous les animaux 
au moins une fois avant la première exposition (pour pouvoir effec ­
tuer des comparaisons sur un même individu), et ensuite une fois par 
semaine. Ces examens doivent être effectués hors de la cage, de préférence dans une enceinte normalisée, et à heure fixe. Ils doivent être soigneusement consignés, de préférence en utilisant un 
système de notation explicitement défini par le laboratoire qui réalise 
l'essai. Les conditions d'observation doivent demeurer aussi constantes que possible. Les symptômes relevés devraient inclure, de façon non limitative, les changements affectant la peau, la four ­
rure, les yeux, les muqueuses, la fréquence des sécrétions et des 
excrétions ainsi que l'activité autonome (sécrétion de larmes, horri ­
pilation, diamètre de la pupille, respiration anormale). Il convient également de noter les changements dans la démarche, le maintien 
et les réactions à la manipulation ainsi que la présence de mouve ­
ments cloniques ou toniques, de stéréotypes (par exemple, soins corporels excessifs, animaux tournant en rond de façon répétitive) et de comportements bizarres (par exemple, automutilation, marche à 
reculons) (1).
 
À l'aide d'un ophtalmoscope ou d'un appareillage approprié équiva ­
lent, il y a lieu d'effectuer, avant l'administration de la substance à tester et au terme de l'étude, un examen ophtalmologique, de préfé ­
rence sur tous les animaux mais au minimum sur le groupe d'ani ­
maux exposés à la dose la plus élevée et sur le groupe témoin. Si on 
décèle des changements dans les yeux de ces animaux, tous les autres animaux doivent être examinés.
 
Vers la fin de la période d'exposition, mais en aucun cas avant la 
onzième semaine, il faut vérifier la réactivité sensorielle à différents types de stimuli (1) (auditifs, visuels et proprioceptifs, par exemple) 
(2) (3) (4), et évaluer la force de préhension (5) et l'activité motrice 
(6). Des détails supplémentaires sur les méthodes utilisables figurent dans les références respectives. Des méthodes non décrites dans les références peuvent aussi être appliquées.
 
Les observations fonctionnelles préconisées vers la fin de l'étude ne 
sont pas indispensables si on dispose d'observations fonctionnelles 
provenant d'autres études et que les examens cliniques quotidiens 
n'ont pas révélé de troubles fonctionnels.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 404
 
Exceptionnellement, les observations fonctionnelles peuvent aussi 
être omises pour des groupes qui par ailleurs présentent des symp ­
tômes de toxicité à un degré tel qu'ils interféreraient sensiblement avec le déroulement de l'essai fonctionnel.
 
1.5.2.1.  Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau  
Tous les animaux doivent être pesés au moins une fois par semaine. 
On mesurera la consommation de nourriture au moins une fois par 
semaine. Si la substance d'essai est administrée dans l'eau de bois ­
son, la consommations d'eau doit aussi être mesurée au moins une fois par semaine. Il est également recommandé de mesurer la consommation d'eau, dans le cas d'étude où la substance d'essai est 
administrée dans les aliments ou par gavage, si celle-ci risque d'être 
modifiée.
 
1.5.2.2.  Hématologie et biochimie clinique  
Des prélèvements de sang doivent être pratiqués à des sites déter ­
minés et les échantillons, stockés, s'il y a lieu, dans des conditions 
appropriées. À la fin de la période d'essai, des prélèvements sont 
réalisés juste avant le sacrifice des animaux ou au cours de celui-ci.  
On procédera aux examens hématologiques suivants au terme de la 
période d'essai et sur les prises de sang effectuées en cours d'essai, le cas échéant: hématocrite, concentration d'hémoglobine, numération 
des érythrocytes et des leucocytes, formule leucocytaire, numération 
des plaquettes et mesure du temps de coagulation.
 
Les analyses de biochimie clinique destinées à étudier les principaux 
effets toxiques sur les tissus, et en particulier sur les reins et le foie, devraient être pratiquées sur des échantillons de sang prélevés sur 
chaque animal juste avant son sacrifice ou au cours de celui-ci (à 
l'exception des animaux trouvés moribonds et/ou sacrifiés avant la fin de l'essai). A l'instar des examens hématologiques, les analyses 
de biochimie clinique peuvent être conduites sur des échantillons de 
sang prélevés en cours d'essai. Il est recommandé de faire jeûner les animaux durant la nuit qui précède la prise de sang (
 1 ). Les analyses 
effectuées sur le plasma ou le sérum devraient comprendre le 
sodium, le potassium, le glucose, le cholestérol total, l'urée, l'azote 
uréique du sang, la créatinine, les concentrations totales de protéines et d'albumine et plus de deux enzymes indicatrices des effets hépa ­
tocellulaires (telles que l'alanine aminotransférase, l'aspartate amino ­
transférase, la phosphatage alcaline, la gamma glutarmyle transpep ­
tidase et la sorbitol déshydrogenase). Des mesures d'activités enzy ­
matiques supplémentaires (d'origine hépatique ou autre) et des acides biliaires, susceptibles de fournir des informations utiles dans 
certaines circonstances, peuvent également être incluses.
 
Les analyses d'urine suivantes peuvent être réalisées, à titre facultatif, 
au cours de la dernière semaine de l'étude sur des échantillons d'urine prélevés à des moments déterminés: apparence, volume, osmolalité ou densité, pH, protéines, glucose, sang et cellules 
sanguines.
 
Il faut envisager par ailleurs de rechercher les indicateurs sériques de 
lésions générales des tissus. Si les propriétés connues de la substance d'essai risquent ou sont soupçonnées d'affecter des courbes métabo ­
liques connexes, d'autres analyses devraient être pratiquées, notam ­
ment celles du calcium, du phosphore, des triglycérides à jeun, 
d'hormones spécifiques, de la méthémoglobine et de la cholines ­
térase. Ces analyses doivent être définies pour certaines classes de produits chimiques ou au cas par cas.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 405  
( 1 ) Pour un certain nombre de paramètres mesurés dans le sérum ou le plasma, et particu ­
lièrement pour le glucose, il est préférable de faire jeûner les animaux durant la nuit qui 
précède la prise de sang, et ce essentiellement afin d'éviter l'accroissement de variabilité 
qui découlerait inévitablement de la prise de nourriture et qui aurait tendance à masquer 
des effets plus subtils, rendant de ce fait l'interprétation difficile. Cependant, le jeûne des 
animaux durant une nuit entière peut influer sur leur métabolisme général et risque, 
notamment dans les études où la substance d'essai est administrée dans la nourriture, 
de perturber l'exposition quotidienne à la substance d'essai. Si on a choisi de faire jeûner 
les animaux toute la nuit, les analyses de biochimie clinique doivent être réalisées après 
les observations fonctionnelles de l'étude.
 Il convient d'une façon générale de suivre une démarche souple, 
adaptée à l'espèce et aux effets observés et/ou escomptés d'une subs ­
tance donnée.  
Si les données historiques sont insuffisantes, il y a lieu d'envisager la 
détermination de paramètres d'hématologie et de biochimie clinique avant de commencer l'étude; il est généralement déconseillé d'obtenir ces données avant le traitement (7).
 
1.5.2.3.  Autopsie  
Tous les animaux de l'étude feront l'objet d'une autopsie complète et 
détaillée, comportant l'examen attentif de la surface externe du corps, 
de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Le foie, les reins, les glandes surrénales, les testicules, les épididymes, l'utérus, les ovaires, le 
thymus, la rate, le cerveau et le cœur de tous les animaux (à l'ex ­
ception des animaux moribonds et/ou sacrifiés avant la fin de l'essai) doivent être disséqués et pesés à l'état frais dès que possible afin d'éviter leur dessiccation.
 
Les tissus suivants doivent être conservés dans le milieu de fixation 
le plus approprié, à la fois pour le type de tissu et pour l'examen 
histopathologique prévu: tous les organes présentant des lésions macroscopiques, l'encéphale (les régions représentatives du cerveau, du cervelet, de la moelle et du pont), la moelle épinière (à trois 
niveaux: cervical, médio-thoracique et lombaire), l'hypophyse, la 
thyroïde, les glandes parathyroïdes, le thymus, l'œsophage, les glandes salivaires, l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin (y compris les plaques de Peyer), le foie, le pancréas, les reins, les 
glandes surrénales, la rate, le cœur, la trachée et les poumons (traités 
par gonflement avec un fixateur, puis immergés), l'aorte, les gonades, l'utérus, les organes génitaux auxiliaires, les glandes mammaires des femelles, la prostate, la vessie, la vésicule biliaire (souris), les 
ganglions lymphatiques (de préférence un ganglion lymphatique 
faisant partie du territoire de drainage dont dépend la voie d'adminis ­
tration et un autre faisant partie d'un autre territoire de drainage afin de détecter les éventuels effets systémiques), les nerfs périphériques 
(sciatique ou poplité interne) de préférence proche du muscle, un 
prélèvement de moelle osseuse (et/ou ponction de moelle osseuse examinée directement), la peau et les yeux (si des changements ont été relevés au cours des examens ophtalmologiques). Les obser ­
vations cliniques et les observations macroscopiques peuvent 
conduire à l'examen de tissus supplémentaires. Tous les organes considérés comme des cibles vraisemblables de la substance d'essai, compte tenu de ses propriétés, devraient également être conservés.
 
1.5.2.4.  Histopathologie  
Un examen histopathologique complet doit être pratiqué sur les 
tissus et organes conservés de tous les animaux appartenant au 
groupe témoin et au groupe traité à la dose la plus élevée. Si des changements liés au traitement sont constatés dans le groupe traité à la dose la plus élevée, il faudra étendre cet examen aux animaux de 
tous les groupes traités.
 
Toutes les lésions macroscopiques doivent être examinées.  
Si un groupe satellite est inclus, les tissus et organes sur lesquels des 
effets ont été observés dans les groupes traités doivent faire l'objet 
d'un examen histopathologique.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 406
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. RÉSULTATS  
Les résultats correspondant à chaque animal doivent être fournis. En 
outre, tous les résultats doivent être résumés sous forme de tableaux 
faisant apparaître, pour chaque groupe d'essai, le nombre d'animaux 
au début de l'essai, le nombre d'animaux trouvés morts au cours de l'essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité et une descrip ­
tion des symptômes de toxicité observés, notamment le moment de 
leur apparition, leur durée et leur gravité, le nombre d'animaux présentant des lésions, les types de lésions et le pourcentage d'ani ­
maux affecté par chaque type de lésion.
 
S'il y a lieu, les résultats numériques doivent être évalués par une 
méthode statistique appropriée et largement reconnue. Le choix des 
méthodes statistiques et des résultats à analyser doit intervenir au stade de rédaction du protocole d'étude.
 
2.2. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
2.2.1.  Substance d'essai  
— État physique, pureté et propriétés physico-chimiques,  
— données permettant l'identification chimique,  
— véhicule (le cas échéant) justification du choix du véhicule, s'il 
est autre que l'eau.  
2.2.2.  Animaux d'expérience  
— Espèce et souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux.  
— source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'essai.  
2.2.3.  Conditions d'essai  
— Justification du choix des doses,  
— détails concernant la préparation contenant la substance d'essai, 
son incorporation dans la nourriture, la concentration obtenue, la stabilité et l'homogénéité de la préparation,
 
— détails relatifs à l'administration de la substance d'essai,  
— doses réelles (mg/kg de poids corporel/jour) et facteur de conver ­
sion de la concentration de la substance d'essai dans la nourriture ou l'eau de boisson (en ppm) en dose réelle, s'il y a lieu,
 
— détails concernant la qualité de la nourriture et de l'eau.  
2.2.4.  Résultats  
— Poids corporel et variation de poids corporel,  
— consommation de nourriture et d'eau, le cas échéant,  
— données sur la réponse toxique par sexe et par dose et description 
des signes de toxicité,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 407
 
— nature, gravité et durée des observations cliniques (réversibles ou 
non),  
— résultats de l'examen ophtalmologique,  
— évaluations de l'activité sensorielle, la force de préhension et 
l'activité motrice (le cas échéant),  
— paramètres hématologiques et valeurs normales de référence,  
— paramètres de biochimie clinique et valeurs normales de réfé ­
rence,  
— poids du corps et des organes des animaux à leur mort et 
rapports poids de l'organe/poids corporel,  
— résultats d'autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques,  
— données relatives à l'absorption, le cas échéant,  
— traitement statistique des résultats, s'il y a lieu.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003.  
(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use m Indus ­
trial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704.  
(4) Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. 
Pharmacol, 10S, pp. 267-283.
 
(5) Meyer O. A, Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). 
A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hindlimb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.
 
(6) Crofton K. M., Howard J. L, Moser V. C, Gill M. W., Reiter L. 
W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599-609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996). «Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety 
Studies», Fundam. & Appl. Toxicol, 29, pp. 198-201.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 408
 
B.27.  ESSAI DE TOXICITÉ SUBCHRONIQUE PAR VOIE ORALE 
TOXICITÉ ORALE À DOSES RÉPÉTÉES NON-RONGEURS: 
90 JOURS  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de toxicité orale subchronique 
reprend la ligne directrice n  o 409 de l'OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCTION  
Lors de l'appréciation et de l'évaluation des caractéristiques toxiques 
d'un produit chimique, la détermination de la toxicité subchronique 
par voie orale à doses répétées peut s'effectuer après avoir obtenu des informations préliminaires sur la toxicité à partir d'essais de toxicité aiguë ou à doses répétées sur 28 jours. L'étude sur 90 jours fournit 
des informations sur les dangers que peut entraîner pour la santé une 
exposition réitérée durant une période de croissance rapide jusqu'au début de l'âge adulte. L'étude fournira des informations sur les prin ­
cipaux effets toxiques, indiquera les organes cibles et les possibilités 
d'accumulation et pourra donner une estimation de la dose sans effet 
toxique (NOAEL) qui pourra être utilisée pour sélectionner des doses en vue d'études chroniques et pour établir les critères de sécurité concernant l'exposition humaine.
 
La méthode d'essai permet de mettre en évidence les effets nocifs de 
l'exposition aux produits chimiques chez des non-rongeurs; elle ne doit être utilisée que dans les cas suivants:
 
— lorsque les effets observés dans d'autres études font ressortir la 
nécessité d'éclaircir et de préciser certains points chez une deuxième espèce non-rongeurs, ou
 
— lorsque les études toxicocinétiques montrent que l'utilisation 
d'une espèce particulière de non-rongeur constitue le choix le plus pertinent en tant qu'animal d'expérience, ou
 
— lorsque d'autres raisons précises justifient l'utilisation d'une 
espèce de non-rongeur.  
Voir également introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Dose:  quantité de substance d'essai administrée. La dose est 
exprimée en poids (g, mg), en poids de substance d'essai par unité de poids corporel de l'animal d'expérience (par exemple, mg/kg) ou en concentration constante dans la nourriture (ppm).
 
Dosage:  terme général recouvrant la dose, sa fréquence et la durée 
de l'administration.  
DSET:  abréviation de dose sans effet toxique (NOAEL: 
No Observable Adverse Effect Level), c'est-à-dire la dose la plus 
élevée à laquelle aucun effet nocif lié au traitement n'est observé.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Différentes doses de la substance d'essai sont administrées quotidien ­
nement par voie orale à plusieurs groupes d'animaux de laboratoire, à 
raison d'une valeur de dose par groupe et ce pendant une période de 
90 jours. Pendant la période d'administration, les animaux sont observés attentivement afin de déceler d'éventuels symptômes de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifiés en cours 
d'essai sont autopsiés et, au terme de l'essai, les animaux survivants 
sont également sacrifiés et autopsiés.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 409
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.4.1.  Sélection de l'espèce animale  
L'espèce non-rongeur couramment utilisée est le chien, dont la race 
doit être définie; on se sert fréquemment du beagle. D'autres espèces, 
par exemple le porc ou le porc nain (mini porc), peuvent aussi être 
utilisées. Les primates ne sont pas recommandés et leur utilisation doit être justifiée. Il convient d'employer de jeunes animaux en bonne santé et, dans le cas du chien, l'administration de la substance 
à tester devrait commencer de préférence à l'âge de 4-6 mois, et 
jamais au delà de 9 mois. Lorsque l'étude est préliminaire à une étude de toxicité chronique à long terme, il faut utiliser la même 
espèce et la même race dans les deux études.
 
1.4.2.  Préparation des animaux  
Il convient d'utiliser de jeunes animaux, en bonne santé, acclimatés 
aux conditions du laboratoire et n'ayant pas encore été sujets d'ex ­
périence. La durée de l'acclimatation dépendra de l'espèce d'essai sélectionnée et de sa provenance. Il est recommandé de compter au moins 5 jours pour les chiens ou les porcs élevés à cette fin 
dans une animalerie résidente et au moins deux semaines pour ces 
mêmes animaux s'ils proviennent de sources extérieures. L'espèce, la race, la source, le sexe, le poids et/ou l'âge des animaux d'expérience doivent être précisés. Les animaux seront répartis au hasard entre les 
groupes traités et le groupe témoin. Les cages doivent être placées de 
façon telle que l'influence éventuelle de leur disposition sur les résultats soit réduite au minimum. Un numéro d'identification distinct doit être attribué à chaque animal.
 
1.4.3.  Préparation des doses  
La substance à tester peut être administrée dans la nourriture ou dans 
l'eau de boisson, par gavage ou dans des capsules. Le mode d'admi ­
nistration par voie orale dépend de l'objectif de l'étude et des propriétés physicochimiques de la substance d'essai.
 
S'il y a lieu, la substance d'essai est dissoute ou mise en suspension 
dans un véhicule approprié. On recommande, chaque fois que les circonstances le permettent, d'envisager d'abord l'utilisation d'une 
solution ou d'une suspension aqueuse, ensuite une solution ou une 
émulsion dans une huile (par exemple l'huile de maïs) et en dernier lieu une solution dans d'autres véhicules. La toxicité des véhicules autres que l'eau doit être connue. La stabilité de la substance d'essai 
dans les conditions d'administration doit être déterminée.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Nombre et sexe des animaux  
Il faut employer au moins 8 animaux (4 femelles et 4 mâles) à 
chaque dose. Si on a prévu de sacrifier des animaux en cours d'essai, il convient d'accroître ce nombre du nombre d'animaux qui doivent être sacrifiés en cours d'essai. Le nombre d'animaux survivants au 
terme de l'étude doit être suffisant pour permettre une évaluation 
significative des effets toxiques. En fonction des connaissances dont on dispose au préalable sur le produit chimique ou sur une substance de structure très proche, on envisagera d'inclure un 
groupe satellite supplémentaire de 8 animaux (4 par sexe) dans le 
groupe témoin et dans le groupe traité à la concentration la plus élevée, en vue d'observer, une fois la période de traitement écoulée, la réversibilité ou la persistance de tout effet toxique. La durée de 
cette période post-traitement doit être fixée en fonction des effets 
observés.
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1.5.2.  Dosage  
Il faut utiliser au minimum 3 doses et un groupe témoin, sauf si un 
essai limite est pratiqué (voir paragraphe 1.5.3). Les niveaux de dose peuvent être établis en fonction des résultats obtenus lors d'études à 
doses répétées d'études préliminaires et doivent tenir compte de 
toutes les données toxicologiques et toxicocinétiques disponibles sur la substance d'essai ou de substances apparentées. Sauf contraintes dues aux propriétés physico-chimiques de la substance 
d'essai ou par ses effets biologiques, la dose la plus élevée doit être 
choisie en vue de provoquer un effet toxique, mais ni la mort ni d'intenses souffrances. Une série de doses décroissantes doit être 
sélectionnée en vue de mettre en évidence tout effet lié à la dose 
ainsi qu'une dose sans effet toxique (DSET) à la dose la plus faible. Des intervalles correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropriés entre les doses décroissantes et l'inclusion d'un 
quatrième groupe d'essai est souvent préférable à la fixation de 
très grands intervalles (par exemple séparés par un facteur supérieur à 6-10) entre les doses.
 
Le groupe témoin sera un groupe non traité ou un groupe recevant le 
véhicule si la substance est administrée dans un véhicule. Exception faite de l'administration de la substance à tester, les animaux du 
groupe témoin doivent être traités de la même manière que ceux 
des groupes d'essai. Si un véhicule est employé, on administrera au groupe témoin le plus grand volume de véhicule utilisé. Si la substance d'essai est incorporée aux aliments et qu'elle entraîne une 
diminution de la prise de nourriture, il peut être utile d'utiliser un 
groupe témoin nourri en parallèle afin de déterminer si la diminution est duc aux caractéristiques organoleptiques ou à des altérations lexicologiques du modèle d'essai.
 
Il convient également d'être attentif aux caractéristiques suivantes du 
véhicule ou d'autres additifs, selon le cas effets sur l'absorption, la 
distribution, le métabolisme ou la rétention de la substance d'essai, 
effets sur les propriétés chimiques de la substance d'essai suscepti ­
bles de modifier sa toxicité, et effets sur la consommation alimen ­
taire et hydrique ou sur l'état nutritionnel des animaux.  
1.5.3.  Essai limite  
Si un essai pratiqué avec une seule dose équivalant à au moins 1 000 
mg/kg de poids corporel/jour, en suivant le mode opératoire décrit 
pour cette étude, ne produit aucun effet nocif observé et s'il n'y a pas 
de raison de penser que la substance soit toxique compte tenu des données dont on dispose au sujet de substances ayant une structure analogue, on peut considérer qu'il n'est pas nécessaire de réaliser une 
étude complète avec trois niveaux de dose. L'essai limite est valable 
sauf dans le cas où l'exposition humaine puisse advenir à des doses plus élevées.
 
1.5.4.  Administration des doses  
Les animaux reçoivent une administration quotidienne de la subs ­
tance d'essai, sept jours sur sept, durant 90 jours. Tout autre régime d'administration, par exemple 5 jours par semaine, doit être justifié. 
Lorsque la substance d'essai est administrée par gavage, une dose 
unique devrait être dispensée aux animaux par une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Le volume maximal de liquide administrable en une fois dépend de la taille de l'animal. 
Le volume devrait normalement être le plus petit possible. Sauf 
pour les substances irritantes ou corrosives, qui provoqueront norma ­
lement des effets exacerbés aux concentrations plus élevées, il convient de réduire au minimum la variabilité du volume d'essai 
en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant à 
toutes les doses.
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Si la substance d'essai est administrée dans les aliments ou l'eau de 
boisson, il importe de s'assurer que sa quantité n'interfère pas avec la 
nutrition normale ni avec l'équilibre hydrique. Lorsque la substance d'essai est incorporée aux aliments, on peut soit appliquer une concentration constante dans les aliments (ppm), soit une dose 
constante par rapport au poids corporel de l'animal; il y a lieu de 
spécifier la méthode utilisée. Si la substance est administrée par gavage ou dans une capsule, la dose doit être administrée aux mêmes heures chaque jour et ajustée si nécessaire pour rester 
constante par rapport au poids corporel de l'animal. Lorsqu'une 
étude sur 90 jours sert de préliminaire à une étude de toxicité chro ­
nique à long terme, un régime alimentaire semblable doit être utilisé dans les deux études.
 
1.5.5.  Observations  
La période d'observation doit durer au moins 90 jours. Les animaux 
d'un groupe satellite destinés à des observations ultérieures ne 
doivent recevoir aucun traitement pendant une période appropriée 
pour que l'on puisse constater la persistance ou la disparition des effets toxiques.
 
Il faudra effectuer un examen clinique général au moins une fois par 
jour, de préférence aux mêmes heures, en tenant compte de la période après l'administration pour laquelle des effets observables 
les plus marqués sont prévisibles. L'état clinique des animaux doit 
être noté. Au moins deux fois par jour, généralement au début et à la fin de chaque journée, tous les animaux doivent être examinés afin de déceler des symptômes de morbidité et de mortalité.
 
Un examen clinique détaillé doit être pratiqué sur tous les animaux 
au moins une fois avant la première exposition (pour pouvoir effec ­
tuer des comparaisons sur un même individu), et ensuite une fois par 
semaine. Ces examens doivent être effectués, si possible, hors de la 
cage, de préférence dans une enceinte normalisée, et à heure fixe. Les conditions d'observation doivent demeurer aussi constantes que possible. Les symptômes de toxicité doivent être soigneusement 
notés, notamment le moment de leur apparition, leur durée et leur 
gravité. Les observations devraient inclure, de façon non limitative, les changements affectant la peau, la fourrure, les yeux, les muqueuses, la fréquence des sécrétions et des excrétions ainsi que 
l'activité autonome (par exemple, sécrétion de larmes, horripilation, 
diamètre de la pupille, respiration anormale). Il convient également de noter les changements dans la démarche, le maintien et les réac ­
tions à la manipulation ainsi que la présence de mouvements 
cloniques ou toniques, de stéréotypes (par exemple, soins corporels excessifs, animaux tournant en rond de façon répétitive) et de comportements bizarres.
 
À l'aide d'un ophtalmoscope ou d'un appareillage approprié équiva ­
lent, il y a lieu d'effectuer, avant l'administration de la substance à tester et au terme de l'étude, un examen ophtalmologique, de préfé ­
rence sur tous les animaux mais au minimum sur le groupe d'ani ­
maux exposés à la dose la plus élevée et sur le groupe témoin. Si on décèle des changements liés au traitement dans les yeux de ces animaux, tous les autres animaux doivent être examinés.
 
1.5.5.1.  Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau  
Tous les animaux doivent être pesés au moins une fois par semaine. 
On mesurera la consommation de nourriture au moins une fois par 
semaine. Si la substance d'essai est administrée dans l'eau de bois ­
son, la consommation d'eau doit aussi être mesurée au moins une fois par semaine. Il est également recommandé de mesurer la consommation d'eau, dans le cas d'étude où la substance d'essai est 
administrée dans les aliments ou par gavage, si celle-ci risque d'être 
modifiée.
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1.5.5.2.  Hématologie et biochimie clinique  
Des prélèvements de sang doivent être pratiqués à des sites déter ­
minés et les échantillons, stockés, s'il y a lieu, dans des conditions appropriées. À la fin de la période d'essai, des échantillons sont 
prélevés juste avant le sacrifice des animaux ou au cours de celui-ci.
 
Au début de l'essai et, par la suite, soit tous les mois, soit à partir du 
milieu de la période d'essai et à la fin de celle-ci, il y a lieu d'ef ­
fectuer un examen hématologique en mesurant l'hématocrite, la concentration d'hémoglobine, la numération des érythrocytes et des 
leucocytes, la formule leucocytaire, la numération des plaquettes et 
l'étude de paramètres de la coagulation tels que le temps de coagu ­
lation, le temps de prothrombine ou le temps de thromboplastine.
 
Des analyses de biochimie clinique destinées à l'étude des principaux 
effets toxiques sur les tissus, et en particulier sur les reins et le foie, 
devraient être pratiquées sur des échantillons de sang prélevés sur tous les animaux, au début de l'essai et ensuite soit tous les mois, soit au milieu et à la fin de l'essai. Les paramètres qui doivent être 
analysés comprennent l'équilibre électrolytique, le métabolisme des 
glucides et les fonctions hépatiques et rénales. Le choix de certaines analyses dépendra des observations sur le mode d'action de la subs ­
tance d'essai. Les animaux doivent être mis à jeun durant une 
période dépendant de l'espèce la prise de sang. Les analyses propo ­
sées comprennent le calcium, le phosphore, le chlore, le sodium, le potassium, le glucose à jeun, l'alanine aminotransférase, l'aspartate aminotransférase, l'ornithine décarboxylase, la gamma glutamyle 
transpeptidase, l'azote uréique, l'albumine, la créatinine sanguine et 
les concentrations totales de bilirubine et de protéines sériques.
 
Les analyses d'urine doivent être pratiquées au moins au début, au 
milieu et en fin d'essai, sur des échantillons d'urine prélevés à des moments déterminés. Les paramètres à relever sont l'apparence, le 
volume, l'osmolalité ou la densité, le pH, les protéines, le glucose, le 
sang et les cellules sanguines. Des paramètres supplémentaires peuvent être étudiés, s'il y a lieu, afin d'élargir le champ des effets observés.
 
Il faudrait envisager par ailleurs de rechercher des indicateurs de 
lésions générales des tissus. D'autres déterminations pourraient être 
nécessaires à une évaluation toxicologique adéquate: l'analyse des lipides, des hormones, de l'équilibre acido-basique, de la méthémo ­
globine et de l'inhibition de la cholinestérase. Des analyses de 
biochimie clinique supplémentaires peuvent être pratiquées, s'il y a 
lieu, afin d'élargir le champ des effets observés. Celles-ci doivent être définies pour certaines classes de produits chimiques ou cas par cas.
 
Il convient d'une façon générale de suivre une démarche souple, 
adaptée à l'espèce et aux effets observés et/ou escomptés d'une subs ­
tance donnée.  
1.5.5.3.  Autopsie  
Tous les animaux de l'étude feront l'objet d'une autopsie complète et 
détaillée, comportant l'examen attentif de la surface externe du corps, de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Le foie et la vésicule biliaire, les 
reins, les glandes surrénales, les testicules, les épididymes, les 
ovaires, l'utérus, la thyroïde (et les glandes parathyroïdes) le thymus, la rate, le cerveau et le cœur de tous les animaux (à l'ex ­
ception des animaux moribonds et/ou sacrifiés avant la fin de l'essai) 
doivent être disséqués et pesés à l'état frais dès que possible afin 
d'éviter leur dessiccation.
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Les tissus suivants doivent être conservés dans le milieu de fixation 
le plus approprié, à la fois pour le type de tissu et pour l'examen 
histopathologique prévu: tous les organes présentant des lésions macroscopiques l'encéphale (les régions représentatives du cerveau, du cervelet, de la moelle et du pont), la moelle épinière (à trois 
niveaux: cervical, médiothoracique et lombaire), l'hypophyse, les 
yeux, la thyroïde, les glandes parathyroïdes, le thymus, l'œsophage, les glandes salivaires, l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin (y compris les plaques de Peyer), le foie, la vésicule biliaire, le 
pancréas, les reins, les glandes surrénales, la rate, le cœur, la 
trachée et les poumons, l'aorte, les gonades, l'utérus, les organes génitaux auxiliaires, les glandes mammaires des femelles, la prostate, la vessie, les ganglions lymphatiques (de préférence un ganglion 
lymphatique faisant partie du territoire de drainage dont dépend la 
voie d'administration et un autre faisant partie d'un autre territoire de drainage afin de détecter les éventuels effets systémiques), les nerfs périphériques (sciatiques ou tibiaux), de préférence proches du 
muscle, un prélèvement de moelle osseuse (et/ou une ponction de 
moelle osseuse examinée directement) et la peau. Les observations cliniques et les observations macroscopiques peuvent conduire à l'examen de tissus supplémentaires. Tous les organes considérés 
comme des organes cibles vraisemblables de la substance d'essai, 
compte tenu de ses propriétés, devraient également être conservés.
 
1.5.5.4.  Histopathologie  
Un examen histopathologique complet doit être pratiqué sur les 
tissus et organes conservés de tous les animaux appartenant au moins au groupe témoin et au groupe traité à la dose la plus élevée. Si des changements liés au traitement sont constatés dans 
le groupe traité à la dose la plus élevée, il faudra étendre cet 
examen aux animaux de tous les groupes traités.
 
Toutes les lésions macroscopiques doivent être examinées.  
Si un groupe satellite est inclus, les tissus et organes sur lesquels des 
effets ont été observés dans les groupes traités doivent faire l'objet 
d'un examen histopathologique.  
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. RÉSULTATS  
Les résultats correspondant à chaque animal doivent être fournis. En 
outre, tous les résultats doivent être résumés sous forme de tableaux faisant apparaître pour chaque groupe d'essai, le nombre d'animaux au début de l'essai, le nombre d'animaux trouvés morts au cours de 
l'essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou du sacrifice, le 
nombre d'animaux présentant des symptômes de toxicité et une description des signes de toxicité observés, notamment le moment de leur apparition, leur durée et leur gravité, le nombre d'animaux 
présentant des lésions, les types de lésions et le pourcentage d'ani ­
maux affectés par chaque type de lésion.
 
S'il y a lieu, les résultats numériques devraient être évalues par une 
méthode statistique appropriée et largement reconnue. Le choix des méthodes statistiques et des résultats à analyser devrait intervenir au stade de la rédaction du protocole d'étude.
 
2.2. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 414
 
2.2.1.  Substance d'essai  
— État physique, pureté et propriétés physico-chimiques,  
— données permettant l'identification chimique,  
— véhicule (le cas échéant), justification du choix si autre que l'eau.  
2.2.2.  Animaux d'expérience  
— Espèce et souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'essai.  
2.2.3.  Conditions d'essai  
— Justification du choix des doses,  
— détails concernant la préparation contenant la substance d'essai, 
son incorporation dans la nourriture, la concentration obtenue, la 
stabilité et l'homogénéité de la préparation.  
— détails relatifs à l'administration de la substance d'essai,  
— doses réelles (mg/kg de poids corporel/jour) et facteur de conver ­
sion de la concentration de la substance d'essai dans la nourriture ou l'eau de boisson (en ppm) en dose réelle, s'il y a lieu,
 
— détails concernant la qualité de la nourriture et de l'eau.  
2.2.4.  Résultats  
— Poids corporel et variation de poids corporel,  
— consommation de nourriture et d'eau, le cas échéant,  
— données sur la réponse toxique par sexe et par dose et description 
des signes de toxicité,  
— nature, gravité et durée des observations cliniques (réversibles ou 
non),  
— résultats de l'examen ophtalmologique,  
— paramètres hématologiques et valeurs normales de référence,  
— paramètres de biochimie clinique et valeurs normales de réfé ­
rence,  
— poids du corps et des organes des animaux à leur mort et 
rapports poids de l'organe/poids corporel,  
— résultats d'autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques,  
— données relatives à l'absorption, le cas échéant,  
— traitement statistique des résultats, s'il y a lieu.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 415
 
B.28.  TOXICITÉ DERMIQUE SUBCHRONIQUE ÉPREUVE DE 90 
JOURS SUR DES RONGEURS  
1. MÉTHODE  
1.1 INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Les doses croissantes de la substance d'essai sont appliquées quoti ­
diennement, sur la peau des animaux de plusieurs lots d'expérience, à 
raison d'une dose par lot durant une période de 90 jours. Durant la période d'application, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler les manifestations de toxicité. Les animaux qui 
meurent en cours d'expérience de même que ceux encore en vie à 
l'issue de celle-ci sont autopsiés.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Préparations  
Les animaux sont maintenus dans les conditions d'hébergement et 
d'alimentation propres à l'expérience pendant au moins les 5 jours qui la précèdent. Avant de commencer l'essai, les jeunes animaux 
sains sont répartis au hasard en lots traités et lots témoins. Peu de 
temps avant l'essai, on tond la fourrure de la région dorsale des animaux. On peut avoir recours au rasage, mais l'opération doit alors être effectuée 24 heures environ avant l'essai. Il est habituelle ­
ment nécessaire de répéter ces opérations toutes les semaines environ 
et il faut prendre grand soin d'éviter toute lésion de la peau pendant ces opérations. La surface à dégager pour l'application de la subs ­
tance à tester ne sera pas inférieure à 10 % de la surface corporelle. 
Le poids de l'animal sera pris en compte pour décider de la zone à 
dégager et des dimensions de la surface à traiter. Lorsque l'essai porte sur des substances solides qui, le cas échéant, peuvent être pulvérisées, la substance à tester doit être humectée au moyen 
d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié de manière à garantir 
un bon contact avec la peau. Les substances liquides sont générale ­
ment testées sans dilution préalable. On procède à une application quotidienne à raison de 5 à 7 jours par semaine.
 
1.6.2.  Conditions expérimentales  
1.6.2.1. A n i m a u x d ' e x p é r i e n c e  
Le rat, le lapin ou le cochon d'Inde adultes peuvent être utilisés; 
d'autres espèces aussi, mais il faut alors en justifier l'emploi. Au 
commencement de l'expérience, la différence de poids entre les animaux ne dépassera pas ± 20 % de la valeur moyenne. Si une étude dermique subchronique constitue la phase préparatoire d'une 
étude à long terme, la même espèce et la même souche seront 
utilisées pour les deux études.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 416
 
1.6.2.2. N o m b r e e t s e x e  
20 animaux au moins (10 femelles et 10 mâles) à la peau saine 
seront utilisés pour chaque niveau de dose. Les femelles seront nullipares et non gravides. Si l'on prévoit de sacrifier certains 
animaux en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter à ce nombre 
celui des animaux qu'il est prévu de sacrifier avant la fin de l'expé ­
rience. De plus, un groupe satellite de 20 animaux (10 par sexe) peut être traité avec la dose la plus élevée pendant 90 jours et faire l'objet 
d'une observation quant à la réversibilité, la persistance ou l'appari ­
tion tardive des effets toxiques durant les 28 jours qui suivent le traitement.
 
1.6.2.3. D o s e s  
On utilisera au moins trois doses ainsi qu'un lot témoin ou, le cas 
échéant, un lot témoin pour le véhicule. La période d'exposition sera 
d'au moins six heures par jour. La substance à tester sera appliquée chaque jour à la même heure et sa quantité fera l'objet d'un ajus ­
tement hebdomadaire ou bi-hebdomadaire afin de conserver une dose 
constante en rapport avec le poids corporel de l'animal. À l'exception 
de l'application de la substance à tester, les animaux du lot témoin seront traités de la même façon que les sujets des lots traités. Si un véhicule est utilisé pour faciliter l'application, il sera administré au 
lot témoin dans les mêmes conditions que pour les lots traités et la 
dose reçue correspondra à celle du lot traité par la dose la plus élevée. La dose la plus élevée doit être déterminée de manière à produire des effets toxiques mais pas, ou rarement, la mort de l'ani ­
mal; la dose la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet 
toxique. Si l'on dispose d'informations sur le niveau de l'exposition humaine, la dose la plus faible dépassera cette valeur. L'idéal serait que la dose intermédiaire produise l'effet toxique minimal observa ­
ble. Si l'on utilise plusieurs doses intermédiaires, l'écart entre les 
doses sera calculé de manière à entraîner une gradation des effets toxiques. Dans les lots correspondant aux doses faible et inter ­
médiaire ainsi que chez les témoins, le nombre de décès sera 
faible, afin de permettre une évaluation significative des résultats.
 
Si l'application de la substance à tester provoque une grave irritation 
cutanée, les concentrations seront réduites; ceci peut entraîner une diminution, voire une disparition, des autres effets toxiques à la dose 
la plus élevée. Si les lésions cutanées sont très graves, il peut s'avérer 
nécessaire d'arrêter l'expérience et de la recommencer avec des concentrations plus faibles.
 
1.6.3.  Essai de limite  
Si une expérience préliminaire réalisée avec une dose de 1 000 
mg/kg ou avec une dose plus élevée en fonction de la possibilité 
d'une exposition humaine — pour autant que celle-ci soit connue — 
n'a provoqué aucun effet toxique, on peut juger inutile de poursuivre l'expérience.
 
1.6.4.  Période d'observation  
Les animaux d'expérience feront l'objet d'observations quotidiennes 
afin de déceler les manifestations de toxicité. Le moment de la mort 
ainsi que le moment auquel les manifestations de toxicité apparais ­
sent et disparaissent seront notés.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 417
 
1.6.5.  Mode opératoire  
Les animaux seront placés dans des cages individuelles. Dans les 
conditions idéales, la substance d'essai est administrée aux animaux 7 jours sur 7 pendant une période de 90 jours.
 
Les animaux de tous les groupes satellites devant faire l'objet d'ob ­
servations complémentaires seront gardés en vie pendant 28 jours 
encore, sans traitement, afin de constater la guérison ou la persis ­
tance des effets toxiques. La durée d'exposition sera de 6 heures par jour.
 
La substance d'essai sera appliquée uniformément sur une surface à 
peu près égale à 10 % de la surface totale du corps. Dans le cas de 
substances hautement toxiques, la surface couverte peut être moins 
importante mais la couche doit être aussi mince et aussi uniforme que possible.
 
Durant l'exposition, la substance d'essai est maintenue en contact 
avec la peau au moyen d'un carré de gaze poreux et d'un sparadrap non irritant. La surface traitée sera, en outre, convenablement 
couverte de manière à maintenir en place le pansement de gaze et 
la substance d'essai et à éviter que les animaux puissent ingérer ladite substance. Des appareils de contention peuvent être utilisés pour empêcher l'ingestion de la substance mais une immobilisation 
complète n'est pas recommandée.
 
À l'issue de la période d'exposition, il faut, si possible, éliminer tout 
résidu de substance avec de l'eau ou par tout autre procédé adéquat 
de nettoyage de la peau.  
Tous les animaux seront observés quotidiennement et les manifes ­
tations de toxicité ainsi que le moment de leur apparition, leur intensité et leur durée seront enregistrés. Pendant la période d'enca ­
gement, on observera notamment les modifications du poil et de la 
peau, des yeux et des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux autonome et central ainsi que de l'activité somatomotrice et du comportement. La consomma ­
tion alimentaire et le poids des animaux seront déterminés chaque 
semaine. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin d'éviter toute perte par cannibalisme, autolyse des tissus ou erreur de mise en place. À l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants 
des lots traités non satellites seront autopsiés. Les animaux mori ­
bonds seront immédiatement retirés et autopsiés.
 
Les examens ci-après sont habituellement effectués pour tous les 
animaux, y compris ceux du lot témoin:  
a) Un examen ophtalmologique sera pratiqué à l'aide d'un ophtalmo ­
scope ou d'un appareil équivalent avant d'administrer la substance à tester ainsi qu'au terme de l'expérience, de préférence pour tous les animaux mais au moins pour le lot traité par la dose la plus 
élevée ainsi que pour le lot témoin. Si des modifications oculaires 
sont observées tous les animaux seront examinés.
 
b) Un examen hématologique comprenant l'hématocrite, la concen ­
tration en hémoglobine, la numération des hématies et des leuco ­
cytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la coagulation par des épreuves telles que temps de coagulation, temps de 
Quick, temps de thromboplastine ou numération des plaquettes 
sanguines sera effectué au terme de l'expérience.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 418
 
c) Des déterminations biochimiques cliniques dans le sang seront 
effectuées à l'issue de l'expérience. L'équilibre électrolytique, le 
métabolisme glucidique, les fonctions hépatique et rénale présen ­
tent un intérêt général pour toutes les études. Le choix d'épreuves spécifiques sera influencé par les observations relatives au mode 
d'action de la substance. Il est suggéré de doser les substances 
suivantes: le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, le glucose à jeun (la période de jeûne étant adaptée à l'espèce), les transaminases glutamo-pyruvique (
 1 ) et glutamo- 
oxaloacétique (  2 ), l'ornithine-décarboxylase, la gamma-glutamyl 
transpeptidase, l'azote uréique, l'albumine, la créatinine plas ­
matique, la bilirubine totale et les protéines sériques totales. Les autres analyses éventuellement nécessaires à une évaluation toxi ­
cologique adéquate concernent les lipides, les hormones, l'équi ­
libre acido-basique, la méthémoglobine, l'activité cholinestéra ­
sique. D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si néces ­
saire, être effectuées pour approfondir l'étude des effets observés.
 
d) Un examen régulier des urines n'est pas nécessaire; un tel examen 
n'est indiqué qu'en cas de toxicité probable ou manifeste.  
Si les informations recueillies dans le passé ne sont pas appropriées, 
les paramètres hématologiques et biochimiques cliniques seront déterminés avant le commencement de l'expérience.
 
1.6.6.  Autopsie  
Tous les animaux seront soumis à une autopsie complète comprenant 
l'examen de la surface externe du corps, de tous les orifices, ainsi 
que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leur 
contenu. Le foie, les reins, les glandes surrénales et les testicules seront pesés, à l'état humide, le plus rapidement possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Les organes et tissus ci- 
après seront conservés dans un milieu approprié dans l'éventualité 
d'examens histopathologiques ultérieurs: toute lésion macroscopique, encéphale — y compris section de la moelle/du pont de Varole, cortex cérébelleux et cortex cérébral, hypophyse, thyroïde/parathy ­
roïde, tout tissu thymique, (trachée), poumons, cœur, aorte, glandes 
salivaires, foie, rate, reins, glandes surrénales, pancréas, gonades, organes génitaux annexes, vésicule biliaire (si présente), œsophage, estomac, duodénum, jéjunum, iléon, cæcum, colon, rectum, vessie 
urinaire, ganglion lymphatique représentatif, (femelle: glande 
mammaire), (musculature de la cuisse), nerf périphérique, (yeux), (sternum avec moelle osseuse), (fémur — y compris surface articu ­
laire), (moelle épinière à trois niveaux — cervical, médiothoracique 
et lombaire) et (glandes lacrymales). Les tissus mentionnés entre 
parenthèses ne seront examinés que sur indication des signes de toxicité ou en cas d'atteinte de l'organe.
 
1.6.7.  Examen histopathologique  
a) La peau normale et la peau traitée ainsi que les organes et tissus 
de tous les animaux du lot témoin et du lot exposé à la dose la 
plus élevée doivent faire l'objet d'un examen histopathologique complet.
 
b) Toutes les lésions macroscopiques seront examinées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 419  
( 1 ) Connue actuellement sous le nom d'alanine transaminase serique. 
( 2 ) Connue actuellement sous le nom d'aspartate transaminase sérique.
 c) Les organes-cibles des animaux appartenant aux autres lots traités 
seront examinés.  
d) Si l'on utilise des rats, les poumons des animaux appartenant aux 
lots exposés aux doses faible et intermédiaire seront soumis à un 
examen histopathologique afin de déceler tout signe d'infection qui permette de juger facilement de l'état de santé des animaux. 
D'autres examens histopathologiques systématiques peuvent ne 
pas être nécessaires pour les animaux de ces lots mais doivent toujours être effectués pour les organes présentant des lésions dans le groupe traité par la dose la plus élevée.
 
e) Lorsqu'un lot satellite est utilisé, un examen histopathologique 
sera pratiqué sur les tissus et organes présentant des signes de 
toxicité dans les lots traités.  
2. RÉSULTATS  
Les résultats seront résumés sous la forme de tableaux indiquant, 
pour chaque expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le nombre d'animaux atteints de lésions, le type de lésions et le 
pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion. Les résul ­
tats seront évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée.
 
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— espèce, souche, origine, milieu ambiant, régime alimentaire, etc.,  
— conditions expérimentales,  
— doses (y compris, le cas échéant, véhicule) et concentrations,  
— dose dépourvue d'effet, si possible,  
— réponse toxique par sexe et par dose,  
— moment de la mort en cours d'expérience ou indication que 
l'animal était encore en vie au terme de l'expérience,  
— description des effets toxiques ou autres,  
— moment de l'observation de tout symptôme et évolution de 
celui-ci,  
— quantité de nourriture et poids corporel,  
— observations ophtalmologiques,  
— examens hématologiques pratiqués et résultats,  
— épreuves biochimiques cliniques pratiquées et résultats (y 
compris, résultats de l'examen des urines),  
— résultats d'autopsie,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 420
 
— description détaillée de toutes les observations histopatholo ­
giques,  
— traitement statistique des résultats, si possible,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 421
 
B.29.  TOXICITÉ SUBCHRONIQUE PAR INHALATION: ÉTUDE SUR 90 
JOURS  
RÉSUMÉ  
La présente méthode d’essai B.29 révisée a été conçue afin de caractériser 
pleinement la toxicité par inhalation d’une substance d’essai à la suite d’une 
exposition subchronique (90 jours), et de fournir des données fiables en vue 
d’estimations quantitatives des risques liés à l’inhalation. Des groupes de rongeurs (10 mâles et 10 femelles) sont exposés 6 heures par jour pendant une période de 90 jours (13 semaines) a) à la substance d’essai à trois niveaux de 
concentration ou plus, b) à de l’air filtré (témoin négatif), et/ou c) au véhicule 
(groupe témoin du véhicule). Les animaux sont exposés en général 5 jours par semaine, mais il est aussi permis de les exposer 7 jours par semaine. Des mâles et des femelles sont toujours utilisés, mais peuvent être exposés à des niveaux de 
concentration différents si l’un des sexes est connu pour être plus sensible à une 
substance d’essai donnée. Afin de mieux caractériser la toxicité de la substance d’essai, la présente méthode laisse la possibilité au directeur de l’étude d’inclure des groupes satellites (étude de réversibilité), des sacrifices en cours d’essai, des 
lavages broncho-alvéolaires (LBA), des tests neurologiques et des évaluations 
histopathologiques ou de pathologie clinique supplémentaires.
 
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 413 de 
l’OCDE pour les essais de produits chimiques (2009). Le texte original de la ligne directrice 413 sur la toxicité subchronique par inhalation avait été adopté en 1981 (1). La présente méthode d’essai B.29 [équivalente à la 
ligne directrice 413 révisée (2009)] a été mise à jour pour prendre en 
compte l’état de la science et répondre aux exigences règlementaires actuelles et futures.
 
2. Les études de toxicité subchronique par inhalation sont principalement utili ­
sées pour calculer des concentrations réglementaires en vue d’évaluer les 
risques pour les travailleurs en milieu professionnel. Elles servent aussi à 
estimer les risques liés à l’exposition humaine dans les lieux d’habitation, les transports et l’environnement. La présente méthode d’essai permet de caractériser les effets nocifs résultant d’une exposition quotidienne répétée, 
par inhalation, à une substance d’essai pendant 90 jours (approximativement 
10 % de la durée de vie d’un rat). Les données dérivées des études de toxicité subchronique par inhalation peuvent être utilisées pour procéder à des estimations quantitatives des risques et pour choisir les concentrations 
dans les études de toxicité chronique. La présente méthode d’essai n’est pas 
spécifiquement destinée à tester les nanomatériaux. Le document d’orienta ­
tion n
 o 39 regroupe les définitions utilisées dans le contexte de cette 
méthode d’essai (2).  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
3. Avant toute étude, le laboratoire d’essai devra prendre en compte toutes les 
informations disponibles sur la substance à tester afin d’améliorer la qualité 
de l’étude et de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les infor ­
mations utiles pour la détermination des concentrations d’essai appropriées, citons: l’identité, la structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la substance d’essai; les résultats de tous les essais de toxicité in vitro ou 
in vivo auxquels elle a été soumise; son (ses) utilisation(s) escomptée(s) et 
les risques d’exposition humaine; les données (Q)SAR disponibles et les données toxicologiques sur les substances structurellement apparentées; ainsi que les données issues d’autres études sur l’exposition répétée. En cas de 
neurotoxicité, connue ou observée au cours de l’étude, le directeur de 
l’étude pourra décider d’inclure les évaluations jugées nécessaires, comme une batterie d’observations fonctionnelles (FOB) et des mesures de l’activité motrice. Bien que la durée des expositions par rapport à des examens 
spécifiques puisse être critique, l’exécution de ces activités supplémentaires 
n’interfère pas avec la conception de l’étude principale.
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4. Les dilutions de substances corrosives ou irritantes peuvent être testées à des 
concentrations qui permettront d’atteindre le degré de toxicité désiré. Le 
document d’orientation n  o 39 (2) fournit de plus amples informations. 
Lors de l’exposition des animaux à ces substances, les concentrations cibles sont assez faibles pour ne causer ni souffrance manifeste ni détresse, 
mais suffisantes pour prolonger la courbe concentration-réponse jusqu’à des 
niveaux correspondant à l’objectif scientifique et règlementaire de l’essai. Le choix de ces concentrations est fait au cas par cas, de préférence sur la base d’une étude préliminaire de détermination des concentrations, conçue de 
façon appropriée, et qui fournit des informations sur l’effet critique 
mesuré, un éventuel seuil d’irritation et le moment de son apparition (voir paragraphes 11-13). La justification du choix des concentrations est fournie.
 
5. Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou 
de détresse sévère et persistante sont euthanasiés. Les animaux moribonds sont pris en compte au même titre que ceux qui succombent au cours de l’essai. Le document d’orientation de l’OCDE sur les effets mesurés éthi ­
quement acceptables (3) détaille les critères orientant la décision d’euthana ­
sier les animaux moribonds ou en grande souffrance, et aide à reconnaître une mort prévisible ou imminente.
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Sélection des espèces animales  
6. Le choix s’orientera vers de jeunes rongeurs adultes en bonne santé, de 
souches communément utilisées en laboratoire. Le rat étant l’espèce la 
plus utilisée, il faudra justifier l’emploi d’autres espèces.  
Préparation des animaux  
7. Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de la randomisation, les 
animaux sélectionnés sont de jeunes adultes âgés de 7 à 9 semaines. Leur 
poids corporel n’excède pas ± 20 % du poids moyen pour chaque sexe. 
Sélectionnés au hasard, les animaux sont marqués pour être identifiés indi ­
viduellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils sont conservés dans leur cage pour une période d’au minimum 5 jours avant 
le début de l’essai.
 
Conditions d’élevage des animaux  
8. Les animaux sont identifiés de façon individuelle, de préférence à l’aide de 
dispositifs sous-cutanés, afin de faciliter leur observation et d’éviter toute confusion. La température du local expérimental où les animaux sont 
conservés est maintenue à 22 ± 3 °C. Le taux d’humidité relative est idéa ­
lement maintenu entre 30 et 70 %, encore qu’il ne soit pas toujours possible de le faire si l’eau est utilisée comme véhicule. Avant et après exposition, les animaux sont généralement être mis en cage en groupes par sexe et par 
concentration, mais le nombre d’animaux par cage ne fait pas obstacle à une 
observation précise de chaque animal, et n’engendre qu’un minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposés «nez seul», il peut être nécessaire de les acclimater aux tubes de contention. 
Ceux-ci ne doivent pas provoquer chez les animaux de stress excessif, qu’il 
soit de nature physique, thermique ou dû à leur immobilisation. Les contraintes qu’ils subissent peuvent en effet modifier les paramètres physio ­
logiques mesurés de l’animal, comme sa température corporelle (hyperther ­
mie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si l’on dispose de données 
génériques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de façon appréciable, alors la période d’adaptation préalable aux tubes de contention n’est pas nécessaire. Les animaux exposés «corps entier» à un 
aérosol sont enfermés individuellement pendant l’exposition pour empêcher 
la filtration de l’aérosol d’essai par à la fourrure des congénères. À l’ex ­
ception des périodes d’exposition, le régime alimentaire des animaux est le régime classique et certifié de laboratoire, avec eau potable à satiété. L’éclai ­
rage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 
heures d’obscurité.
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Chambre d’inhalation  
9. Le choix de la chambre d’inhalation prend en compte la nature de la subs ­
tance d’essai et l’objet de l’essai. Le mode d’exposition «nez seul» (qui inclut les dispositifs «tête seule», «nez seul» et «museau seul») est privilé ­
gié. Le mode d’exposition «nez seul» est généralement choisi pour les 
études d’aérosols liquides ou solides et pour les vapeurs susceptibles de se condenser en aérosols. L’utilisation d’un mode d’exposition «corps entier» peut être préférable pour les besoins spécifiques de l’étude, mais 
cela est justifié dans le rapport de l’étude. Pour assurer la stabilité de 
l’atmosphère d’une chambre d’exposition «corps entier», on veillera à ce que le «volume» total des animaux d’expérience ne dépasse pas 5 % du 
volume de la chambre. Le document d’orientation 39 (2) décrit les principes 
des techniques d’exposition «corps entier» ou «nez seul», ainsi que leurs avantages et inconvénients spécifiques.
 
ÉTUDES DE TOXICITÉ  
Concentrations limites  
10. Contrairement aux études de toxicité aiguë, aucune concentration limite 
n’est définie dans les études de toxicité subchronique par inhalation. La 
concentration maximale testée prend en compte: 1) la concentration maxi ­
male pouvant être atteinte, 2) le niveau d’exposition humaine correspondant au «pire des cas», 3) la nécessité de maintenir une alimentation adéquate en 
oxygène, et/ou 4) le bien- être des animaux. En l’absence de limites fondées 
sur des données, les valeurs limites pour la toxicité aiguë du règlement (CE) n
 o 1272/2008 (13) peuvent être utilisées (c’est-à-dire jusqu’à une concen ­
tration maximale de 5 mg/l pour les aérosols, 20 mg/l pour les vapeurs et 
20 000 ppm pour les gaz); voir document d’orientation 39 (2). S’il est 
nécessaire de dépasser ces limites lors d’essais de gaz ou de substances d’essai hautement volatils (comme les réfrigérants), une justification est produite. La concentration limite doit permettre d’obtenir une toxicité sans 
équivoque, sans causer de stress excessif chez les animaux ni affecter leur 
longévité (3).
 
Étude préliminaire de détermination des concentrations  
11. Avant le début de l’étude principale, une étude préliminaire de détermina ­
tion des concentrations est généralement nécessaire. Plus complète qu’une 
étude d’observation, elle n’est pas limitée par le choix des concentrations. Les connaissances acquises grâce à une étude préliminaire de détermination des concentrations peuvent conduire à la réussite de l’étude principale. En 
effet, une telle étude peut fournir des informations techniques sur les 
méthodes d’analyse, la taille des particules, la découverte de mécanismes de toxicité, les données histopathologiques et de pathologie clinique, et les estimations de la concentration sans effet nocif observé (CSENO) et de la 
concentration maximale acceptable (CMA) dans une étude principale. Le 
directeur d’étude peut décider de s’appuyer sur une étude préliminaire de détermination des concentrations pour identifier: le seuil d’irritation de l’ap ­
pareil respiratoire (par exemple avec une histopathologie de l’appareil 
respiratoire, des tests de la fonction pulmonaire ou des lavages bronchoal ­
véolaires), la concentration la plus élevée tolérée par les animaux sans provoquer de stress excessif, et les paramètres qui permettront de caracté ­
riser au mieux la toxicité de la substance d’essai.
 
12. Une étude préliminaire de détermination des concentrations peut comporter 
un ou plusieurs niveaux de concentration. Selon les effets à mesurer retenus, 
trois à six mâles et trois à six femelles sont exposés à chaque niveau de 
concentration. La durée d’une étude préliminaire de détermination des concentrations est d’au minimum 5 jours et ne pas excéder 28 jours en général. Il convient d’exposer dans le rapport d’étude les raisons du choix 
des concentrations retenues pour l’étude principale, dont l’objet est de 
démontrer une relation concentration-réponse basée sur l’effet mesuré le plus sensible auquel on s’attend. La concentration la plus faible n’engendre en principe aucune manifestation de toxicité, tandis que la concentration la 
plus élevée permet d’obtenir une toxicité sans équivoque, sans causer de 
stress excessif chez les animaux ni affecter leur longévité (3).
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13. Lors du choix des niveaux de concentration pour l’étude préliminaire de 
détermination des concentrations, toutes les informations disponibles sont 
prises en compte, y compris les relations structure-activité et les données correspondant à des produits chimiques analogues (voir paragraphe 3). Une étude préliminaire de détermination des concentrations peut confirmer ou 
réfuter le choix des effets mesurés les plus sensibles selon des critères 
mécanistiques, comme l’inhibition de la cholinestérase par des composés organophosphorés, la formation de méthémoglobine par des agents cyto ­
toxiques d’isomérie érythro, les hormones thyroïdiennes (T
 3 , T 4 ) dans le 
cas de thyrotoxiques, les protéines, la LDH, ou les neutrophiles dans les 
lavages bronchoalvéolaires dans le cas de particules inoffensives faiblement solubles ou d’aérosols irritants pour les poumons.
 
Étude principale  
14. L’étude principale de toxicité subchronique comporte en général trois 
niveaux de concentration ainsi qu’un témoin négatif (air) et/ou un témoin 
du véhicule, s’il y a lieu (voir paragraphe 18). L’ensemble des informations disponibles doit permettre de déterminer les niveaux d’exposition appro ­
priés, y compris les résultats des études systémiques de toxicité, le métabo ­
lisme et la cinétique (on prendra garde d’éviter les niveaux de concentration 
élevée avec des processus cinétiques de saturation). Chaque groupe d’essai comprend au moins 10 rongeurs mâles et 10 rongeurs femelles exposés à la substance d’essai 6 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 13 
semaines (soit une durée totale de l’étude d’au moins 90 jours). Les 
animaux peuvent aussi être exposés 7 jours par semaine (par exemple dans le cas d’essais sur des produits pharmaceutiques inhalés). S’il est connu qu’un des sexes est plus réactif à la substance d’essai, les niveaux 
de concentration peuvent différer selon le sexe afin d’optimiser la 
concentration-réponse telle que décrite au paragraphe 15. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées «nez seul», il est possible d’ajuster la durée maximale d’exposition en fonction du stress propre à 
ces espèces. Lorsque la durée d’exposition est inférieure à 6 heures par 
jour ou qu’il est nécessaire de mener une étude d’exposition «corps entier» de longue durée (par exemple de 22 heures par jour), des justifica ­
tions sont fournies, voir document d’orientation 39 (2). Les animaux sont 
privés de nourriture pendant l’exposition sauf si sa durée dépasse 6 heures. 
Dans une exposition «corps entier», les animaux peuvent boire de l’eau.
 
15. Les concentrations cibles choisies permettent d’identifier le(s) organe(s) 
cible(s) et de mettre en évidence une concentration-réponse claire:  
— le niveau de concentration élevé produit des effets toxiques sans engen ­
drer de signes persistants ou la mort, ce qui empêcherait une évaluation 
valable des résultats,  
— le(s) niveau(x) de concentration intermédiaire(s) est (sont) espacé(s) de 
manière à produire une gradation dans les effets toxiques observés avec 
une concentration faible et avec une concentration élevée,  
— le niveau de concentration faible ne produit quasiment aucune manifes ­
tation de toxicité.  
Sacrifices en cours d’essai  
16. Si l’on envisage le sacrifice d’animaux en cours d’essai, il faut accroître le 
nombre d’animaux exposés à chaque niveau de concentration du nombre prévu d’animaux sacrifiés avant la fin de l’épreuve. Le recours aux sacri ­
fices en cours d’essai est justifié, et les analyses statistiques en tiennent 
dûment compte.
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Étude satellite (étude de réversibilité)  
17. Une étude de réversibilité peut être utilisée pour mettre en évidence le 
caractère réversible, persistant ou retardé de la toxicité, pour une période post-traitement d’une durée appropriée d’au minimum 14 jours. Les groupes 
satellites sont constitués de dix mâles et de dix femelles exposés en même 
temps que les animaux d’expérience de l’étude principale. Ils sont exposés à la concentration la plus élevée de la substance d’essai. Il convient également de faire appel à un témoin parallèle (air) et, le cas échéant, à un témoin du 
véhicule (voir paragraphe 18).
 
Animaux témoins  
18. Les animaux du groupe témoin négatif (air) sont traités d’une manière 
identique à ceux du groupe d’animaux d’essai, mais au lieu de la substance d’essai, ils sont exposés à de l’air filtré. Lorsque de l’eau ou une autre substance est utilisée pour produire l’atmosphère d’essai, un groupe 
témoin du véhicule est inclus dans l’étude, à la place du groupe témoin 
négatif exposé à l’air seulement. Autant que possible, l’eau est le véhicule utilisé. Dans ce cas, les animaux témoins sont exposés à un air dont le taux d’humidité relative est le même que pour les groupes exposés à la substance 
d’essai. Le choix du véhicule s’opère sur la base d’une étude préliminaire 
appropriée ou de données historiques. Si la toxicité d’un véhicule est mal connue, le directeur de l’étude peut choisir d’utiliser un témoin négatif (air) 
et un témoin du véhicule, mais cela est toutefois fortement déconseillé. Si 
les données historiques montrent qu’un véhicule n’est pas toxique, le groupe témoin à l’air n’est pas nécessaire et seul un témoin du véhicule est utilisé. Si aucune toxicité n’a été détectée lors de l’étude préliminaire d’une subs ­
tance d’essai préparée dans un véhicule, ce véhicule est considéré comme 
non toxique à la concentration testée et est utilisé comme véhicule témoin.
 
CONDITIONS D’EXPOSITION  
Administration des concentrations  
19. Les animaux sont exposés à la substance d’essai présentée sous forme de 
gaz, de vapeur, d’aérosol ou sous une forme mixte. L’état physique à tester 
dépend des propriétés physico-chimiques de la substance, des concentrations choisies, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable qu’elle se présente lors de sa manipulation et de son utilisation. Les subs ­
tances d’essai chimiquement réactives ou hygroscopiques sont testées sous 
air sec. On prendra soin d’éviter les concentrations susceptibles de provo ­
quer une explosion. Les matières particulaires peuvent être soumises à des procédés mécaniques afin de réduire la taille des particules. Pour plus d’in ­
formations, se reporter au document d’orientation 39 (2).
 
Répartition granulométrique  
20. Une mesure de la taille des particules est réalisée pour tous les aérosols et 
les vapeurs susceptibles se condenser pour former des aérosols. Pour que toutes les régions pertinentes de l’appareil respiratoire soient exposées, il est recommandé d’utiliser des aérosols dont le diamètre aérodynamique médian 
de masse (DAMM) se situe entre 1 et 3 μm, avec un écart type géométrique 
(σg) compris entre 1,5 et 3,0 (4). Un effort raisonnable est fourni pour 
remplir ces conditions, mais si tel n’est pas le cas, un jugement d’expert est nécessaire. Par exemple, les particules des fumées métalliques auront une 
taille inférieure à cette norme, et les particules chargées ou les fibres 
peuvent avoir une taille supérieure.
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Préparation de la substance d’essai dans un véhicule  
21. La substance d’essai est idéalement testée sans véhicule. S’il est nécessaire 
d’avoir recours à un véhicule pour atteindre la concentration et la taille particulaire voulues de la substance d’essai, l’eau est choisie de préférence. 
Chaque fois qu’une substance d’essai est dissoute dans un véhicule, sa 
stabilité est démontrée.
 
CONTRÔLE DES CONDITIONS D’EXPOSITION  
Débit d’air dans la chambre d’exposition  
22. Le débit d’air dans la chambre d’exposition est contrôlé avec soin, surveillé 
en continu et enregistré au moins toutes les heures pendant chaque exposi ­
tion. Le suivi en temps réel de la concentration de l’atmosphère d’essai (ou stabilité temporelle) constitue une mesure complète de tous les paramètres 
dynamiques et fournit un moyen indirect de contrôler tous les paramètres 
d’inhalation dynamiques pertinents. Si la concentration est suivie en temps réel, la fréquence peut être ramenée à une seule mesure du débit de l’air par exposition et par jour. On prendra particulièrement soin d’éviter toute 
re-respiration dans les chambres d’exposition «nez seul». La concentration 
d’oxygène est d’au moins 19 % et celle de dioxyde de carbone ne dépasse pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent être respectées, les concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone sont mesurées. Si les mesures du 
premier jour d’exposition montrent que la concentration de ces gaz est 
appropriée, aucune mesure complémentaire ne devrait être nécessaire.
 
Température et humidité relative de la chambre d’exposition  
23. La température de la chambre d’exposition est maintenue à 22 ± 3 °C. Dans 
les cas d’exposition «nez seul» et «corps entier», l’humidité relative dans la zone où respire l’animal est autant que possible surveillée en continu et 
enregistrée toutes les heures pendant chaque exposition. L’humidité relative 
est de préférence comprise entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse être atteint (par exemple lorsque la substance d’essai se présente sous forme de solution aqueuse), ou qu’il ne puisse être mesuré en raison d’inter ­
férences de la substance avec la méthode d’essai.
 
Substance d’essai: concentration nominale  
24. Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre 
d’exposition est calculée et enregistrée. La concentration nominale est la masse de la substance d’essai divisée par le volume d’air total qui passe dans le circuit de la chambre d’inhalation. La concentration nominale ne sert 
pas à caractériser l’exposition des animaux, mais une comparaison de la 
concentration nominale avec la concentration réelle donne une indication de la capacité de production du système d’essai, et peut donc permettre de mettre en évidence des problèmes de production.
 
Substance d’essai: concentration réelle  
25. La concentration réelle est la concentration de la substance d’essai prélevée 
dans la zone de la chambre d’inhalation où les animaux respirent. Les 
concentrations réelles peuvent être obtenues par des méthodes spécifiques (par exemple, échantillonnage direct, méthodes d’adsorption ou de réaction chimique, et caractérisation analytique ultérieure) ou par des méthodes non 
spécifiques comme la gravimétrie sur filtre. Le recours à l’analyse gravimé ­
trique n’est acceptable que pour des aérosols ne contenant qu’un seul composant en poudre ou pour des aérosols de liquides peu volatils, et des caractérisations spécifiques à la substance d’essai sont également effectuées 
par une pré-étude appropriée. Il est aussi possible d’avoir recours à la 
gravimétrie pour déterminer la concentration d’un aérosol contenant
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plusieurs composants en poudre, mais des données analytiques sont alors 
nécessaires, afin de démontrer que la composition du produit en suspension 
dans l’air est analogue à celle du produit de départ. Faute de cette informa ­
tion, il peut s’avérer nécessaire de soumettre le produit à tester (idéalement en suspension dans l’air) à une nouvelle analyse à intervalles réguliers tout 
au long de l’étude. Pour des agents aérosolisés susceptibles de s’évaporer ou 
de se sublimer, il faut démontrer que toutes les phases ont été recueillies selon la méthode choisie.
 
26. Pendant toute la durée de l’étude, il est recommandé de n’employer si 
possible qu’un seul lot de la substance d’essai, et l’échantillon de la subs ­
tance est conservé dans des conditions préservant sa pureté, son homogé ­
néité et sa stabilité. Avant le début de l’étude, il convient de réaliser une caractérisation de la substance d’essai afin de déterminer sa pureté et, si cela 
est techniquement possible, son identité et les quantités de contaminants et 
d’impuretés identifiés. Pour cela, on pourra recueillir les données suivantes: temps de rétention et surface relative du pic, poids moléculaire obtenu par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres 
estimations. Bien que le laboratoire d’essai ne soit pas responsable de 
l’identification de la substance d’essai, il peut, par prudence, confirmer au moins une partie des caractéristiques fournies par le donneur d’ordre (cou ­
leur, nature physique, etc.).
 
27. L’atmosphère d’exposition est maintenue constante autant que possible. Un 
dispositif de suivi en temps réel, tel qu’un photomètre à aérosol pour les aérosols ou un analyseur d’hydrocarbures totaux pour les vapeurs, peut être 
utilisé pour démontrer la stabilité des conditions d’exposition. La concen ­
tration réelle dans la chambre est mesurée au moins 3 fois chaque jour d’exposition et pour chaque niveau d’exposition. En cas d’impossibilité en raison de débits d’air limités ou de faibles concentrations, l’utilisation d’un 
échantillon par période d’exposition est acceptable. En principe, cet échan ­
tillon est alors recueilli pendant la totalité de la période d’exposition. Les écarts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne n’excédent pas ± 10 % pour les gaz et vapeurs et ± 20 % pour 
les aérosols liquides ou solides. Il convient de calculer et de noter le temps 
d’équilibre dans la chambre d’exposition (t
 95 ). La durée d’une exposition 
couvre le temps de production de la substance d’essai, y compris le temps nécessaire pour l’égalisation des concentrations dans la chambre d’exposi ­
tion (t
 95 ) et leur déclin. Des indications pour l’estimation de t  95 sont fournies 
dans le document d’orientation 39 (2).  
28. Pour des systèmes très complexes constitués de gaz ou vapeurs et d’aérosols 
(atmosphères de combustion ou substance d’essai propulsés à partir de 
produits/dispositifs spécialisés, par exemple), chaque phase peut se comporter différemment dans la chambre d’inhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et aérosol), on choisira donc au moins une substance 
indicatrice (analyte), en général le principal principe actif du mélange. 
Quand la substance d’essai est un mélange, la concentration analytique devra être indiquée pour la préparation totale et pas uniquement pour le principe actif ou la substance indicatrice (analyte). Pour plus d’informations 
sur les concentrations réelles, se reporter au document d’orientation 39 (2).
 
Substance d’essai: répartition granulométrique  
29. La répartition granulométrique des aérosols est déterminée au minimum 
chaque semaine pour chaque niveau de concentration, à l’aide d’un impac ­
teur en cascade ou d’un autre instrument, comme un spectromètre de mesure de la taille des particules aérodynamiques (APS). Si les résultats obtenus 
avec l’impacteur en cascade et l’autre instrument se révèlent équivalents, ce 
dernier peut être utilisé tout au long de l’étude.
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30. Pour confirmer la capacité de recueil des particules de l’outil principal, 
un second instrument devra être utilisé en parallèle, par exemple un filtre 
gravimétrique ou un barboteur à gaz/impacteur. La concentration massique obtenue par l’analyse granulométrique se rapproche, dans des limites raison ­
nables, de celle obtenue par l’analyse sur filtre, voir document d’orientation 
39 (2). Si pour toutes les concentrations testées, cette équivalence est établie 
au début de la phase d’étude, il n’est pas nécessaire d’effectuer des mesures de confirmation dans la suite de l’étude. Pour le bien-être des animaux, il convient de réduire au minimum les données douteuses qui nécessiteraient 
de répéter l’essai.
 
31. Une répartition granulométrique est effectuée dans le cas des vapeurs, s’il 
est possible qu’une condensation de la vapeur conduise à la formation d’un aérosol, ou si des particules sont détectées dans une atmosphère de vapeur susceptible de présenter des phases mixtes.
 
OBSERVATIONS  
32. Un examen clinique attentif des animaux est pratiqué avant, pendant, et 
après la période d’exposition. Des observations plus fréquentes peuvent 
être réalisées en fonction de la réponse des animaux pendant l’exposition. 
Lorsque l’observation des animaux s’avère difficile en raison des tubes de contention, du mauvais éclairage des chambres d’exposition «corps entier» ou d’atmosphères opaques, les animaux seront observés attentivement après 
l’exposition. Les observations effectuées avant l’exposition du lendemain 
peuvent permettre d’estimer une éventuelle réversibilité ou exacerbation des effets toxiques.
 
33. Toutes les observations sont enregistrées individuellement pour chaque 
animal. Quand des animaux sont retrouvés morts ou sont euthanasiés, 
l’heure de la mort est consignée le plus précisément possible.  
34. Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la 
peau et des poils, des yeux et des muqueuses, de l’appareil respiratoire, du système circulatoire, du système nerveux, ainsi que de l’activité somatomo ­
trice et du comportement. Les tremblements, les convulsions, la salivation, 
les diarrhées, la léthargie, le sommeil et le coma retiennent l’attention. La mesure de la température rectale peut aider à mettre en évidence une bradypnée réflexe ou une hypo/hyperthermie liée au traitement ou au confi ­
nement. Il est possible d’enrichir le protocole d’étude par des estimations 
complémentaires telles que: cinétique, surveillance biologique, fonction pulmonaire, rétention de produits peu solubles qui s’accumulent dans les tissus pulmonaires et changements comportementaux.
 
POIDS CORPOREL  
35. Le poids de chacun des animaux est enregistré individuellement: juste avant 
la première exposition (jour 0), deux fois par semaine par la suite (par 
exemple les vendredis et lundis, afin de mettre en évidence leur rétablis ­
sement après un week-end sans exposition, ou dans un délai permettant l’évaluation de la toxicité systémique), et au moment de leur mort ou de leur euthanasie. Si aucun effet n’est observé les 4 premières semaines, le 
poids corporel peut n’être mesuré qu’une fois par semaine pendant le reste 
de l’étude. Les animaux du groupe satellite (étude de réversibilité) sont toujours pesés de façon hebdomadaire tout au long de la période de récu ­
pération. Au terme de l’étude, tous les animaux sont pesés juste avant leur 
sacrifice pour ne pas fausser le calcul des rapports du poids des organes au 
poids du corps.
 
CONSOMMATION DE NOURRITURE ET D’EAU  
36. La quantité de nourriture consommée est mesurée une fois par semaine. La 
consommation d’eau peut également l’être.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 429
 
PATHOLOGIE CLINIQUE  
37. Tous les animaux, y compris ceux des groupes témoins et satellites, quand 
ils sont sacrifiés, subissent des examens cliniques. Le délai entre la fin de l’exposition et la prise de sang est enregistré, en particulier quand la recons ­
titution de l’effet visé est rapide. À la fin de l’exposition, un échantillonnage 
est recommandé pour les paramètres ayant une courte demi-vie plasmatique (HbCO, ChE et MetHb, par exemple).
 
38. Le tableau 1 énumère les paramètres de pathologie clinique généralement 
requis pour toutes les études toxicologiques. Une analyse d’urine n’est pas nécessaire en règle générale, mais peut être réalisée si on l’estime utile 
d’après la toxicité probable ou observée. Afin de mieux caractériser la 
toxicité de la substance d’essai, le directeur de l’étude peut faire appel à d’autres paramètres (cholinestérase, lipides, hormones, équilibre 
acido-basique, méthémoglobine ou corps de Heinz, créatine kinase, 
rapport myéloïde/érythroïde, troponines, gaz du sang, lactate déshydrogé ­
nase, sorbitol déshydrogénase, glutamate déshydrogénase, gamma glutamyl transpeptidase, etc.).
 
Tableau 1  
Paramètres standards de pathologie clinique  
Hématologie  
Nombre d’érythrocytes 
Hématocrite 
Concentration d’hémoglobine 
Teneur corpusculaire moyenne en 
hémoglobine 
Volume corpusculaire moyen 
Concentration corpusculaire moyenne 
d’hémoglobine 
Réticulocytes Nombre total de leucocytes 
Différentiel leucocytaire 
Nombre de plaquettes sanguines 
Potentiel de coagulation (en 
choisir un): 
— Temps de prothrombine 
— Temps de coagulation 
— Temps de thromboplastine 
partielle  
Chimie clinique  
Glucose (*) 
Cholestérol total Triglycérides 
Azote uréique dans le sang 
Bilirubine totale Créatinine 
Protéines totales 
Albumine Globuline Alanine aminotransférase 
Aspartate aminotransférase Phosphatase alcaline 
Potassium 
Sodium Calcium 
Phosphore 
Chlorure
 
Analyse d’urine (facultative)  
Apparence (couleur et turbidité) 
Volume 
Densité ou osmolarité pH Protéines totales 
Glucose 
Sang/cellules sanguines
 
(*) Le directeur d’étude décidera si une période de jeûne est nécessaire ou non pour 
les animaux, une longue période de jeûne pouvant conduire à des mesures de 
glucose partiellement erronées pour les animaux traités par rapport aux animaux 
témoins. La période de jeûne est appropriée à l’espèce utilisée: pour le rat, elle 
peut être de 16 heures environ (jeûne pendant la nuit). La détermination de la 
glycémie à jeun peut être effectuée après la période de jeûne de la nuit, pendant la 
dernière semaine d’exposition, ou après la période de jeûne de la nuit précédant 
l’autopsie (avec, dans ce dernier cas, tous les autres paramètres de pathologie 
clinique).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 430
 
39. Quand il est prouvé que les voies respiratoires basses (c’est-à-dire les 
alvéoles pulmonaires) sont le principal site de dépôt et de rétention, le 
lavage broncho-alvéolaire (LBA) peut alors être la technique de choix pour effectuer une analyse quantitative des paramètres de la relation dose-effet basée sur les hypothèses, en se concentrant sur l’alvéolite, l’in ­
flammation pulmonaire et la phospholipidose. Ceci permet d’étudier conve ­
nablement l’évolution de la relation dose-effet et du décours temporel d’une lésion alvéolaire. Le fluide du LBA peut être analysé en se basant sur le nombre total et différentiel de leucocytes, les protéines totales et la lactate 
déshydrogénase. D’autres paramètres peuvent également être considérés, 
comme ceux mettant en évidence une lésion lysosomale, une phospholipi ­
dose, une fibrose, une inflammation allergique ou irritante, laquelle peut inclure la détermination de cytokines ou de chimiokines 
pro-inflammatoires. Les mesures liées au LBA complètent souvent les résul ­
tats des examens histopathologiques sans toutefois s’y substituer. Des indi ­
cations sur la manière de réaliser un lavage de poumon sont disponibles dans le document d’orientation 39 (2).
 
EXAMEN OPHTALMOLOGIQUE  
40. À l’aide d’un ophthalmoscope ou d’un dispositif équivalent, un examen 
ophthalmologique du fond d’œil, des milieux de réfraction, de l’iris et de la conjonctivite est effectué avant l’administration de la substance d’essai pour tous les animaux, et au terme de l’étude pour tous les groupes témoins 
et groupes exposés à la concentration élevée. Si des changements dans les 
yeux sont décelés, tous les animaux des autres groupes sont examinés, y compris le groupe satellite (étude de réversibilité).
 
MACROPATHOLOGIE ET POIDS DES ORGANES  
41. Tous les animaux d’expérience, y compris ceux morts au cours de l’essai et 
ceux écartés de l’étude pour des raisons de bien-être animal, subissent une 
exsanguination complète (si cela est possible) et une autopsie macrosco ­
pique. Il convient d’enregistrer le délai entre la fin de la dernière exposition de chaque animal et leur sacrifice. Lorsqu’un animal est découvert mort et 
que son autopsie n’est pas réalisable immédiatement, l’animal est réfrigéré 
(mais non congelé) à une température suffisamment basse pour minimiser l’autolyse. Les autopsies sont réalisées le plus tôt possible, en général dans un délai d’un à deux jours. Tous les changements macropathologiques sont 
enregistrés pour chaque animal en prêtant particulièrement attention aux 
voies respiratoires.
 
42. Le tableau 2 énumère les organes et tissus devant être conservés dans un 
milieu approprié lors de l’autopsie macroscopique en vue d’un examen 
histopathologique. La conservation des organes et tissus [entre crochets], et de tous les autres organes et tissus, est à la discrétion du directeur d’étude. Les organes indiqués  en gras  sont découpés et pesés à l’état 
humide, le plus tôt possible après la dissection, pour éviter leur dessiccation. 
La thyroïde et les épididymes ne sont pesés que si cela est nécessaire car leur découpe peut gêner l’évaluation histopathologique. Les organes et tissus sont fixés à l’aide de formol tamponné à 10 %, ou d’un autre fixateur 
approprié, dès que l’autopsie est effectuée, et pas moins de 24 à 48 
heures avant le découpage, en fonction du fixateur utilisé.
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Tableau 2  
Organes et tissus à conserver lors de l’autopsie macroscopique  
Aorte  
[Bulbe olfactif]  
Cæcum  
Capsules surrénales  
Cerveau  (y compris segments d’hémisphères, 
cervelet et bulbe rachidien/pont)  
Cœur  
Côlon  
Dents  
Duodénum  
[Épididymes]  
Fémur avec articulation  
Foie 
Ganglions lymphatiques (distaux par rapport 
au site d’entrée)  
Ganglions lymphatiques depuis la région 
hilaire du poumon, en particulier pour les substances particulaires peu solubles. Pour 
des examens plus approfondis et/ou des 
études à but immunologique, d’autres ganglions lymphatiques peuvent être envisa ­
gés, comme ceux des régions médiastinale, 
cervicale/submandibulaire et/ou auriculaire.
 
[Glandes de Harder]  
[Glandes lacrymales (extraorbitales)]  
Estomac  
Glande mammaire (femelles)  
Glandes salivaires  
Hypophyse  
Iléon  
Jénunum  
[Langue]  
Larynx (3 niveaux, dont la base de l’épi ­
glotte)  
Moelle épinière (niveaux cervical, mésothora ­
cique et lombaire)  Moelle osseuse (et/ou un aspirat frais)  
Muscle (cuisse)  
Nerf périphérique (sciatique ou tibial, de 
préférence proche du muscle)  
Œsophage  
Ovaires  
Pancréas  
Parathyroïdes  
Peau  
Poumons  (tous les lobes sur un niveau, y 
compris les bronches principales)  
Prostate  
Rate  
Rectum  
Reins  
Sternum  
Testicules  
Thymus  
Thyroïde  
Tissus nasopharyngés [au moins 4 niveaux; 
1 niveau comprenant le conduit nasopharyn ­
gien et le tissu lymphoïde associé à la muqueuse nasale (NALT)]
 
Trachée (au moins 2 niveaux comprenant 1 
coupe longitudinale le long de la carène et 1 coupe transversale)
 
[Uretère]  
[Urètre]  
Utérus  
Vésicule biliaire (si présente)  
Vésicules séminales  
Vessie  
[Yeux (rétine, nerf optique) et paupières]  
Organes cibles  
Toutes les masses et lésions macroscopiques  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 432
 
43. Les poumons sont retirés intacts, pesés et perfusés avec un fixateur appro ­
prié à une pression de 20 à 30 cm d’eau pour veiller à ce que l’architecture 
pulmonaire soit préservée (5). Les coupes sont recueillies pour tous les lobes sur un niveau comprenant les bronches principales. Si un lavage du poumon est réalisé, le lobe qui n’a pas été lavé est sectionné sur trois niveaux (pas de 
coupe en série).
 
44. Au moins 4 niveaux des tissus nasopharyngés sont examinés, dont un 
devant comporter le conduit nasopharyngien (5) (6) (7) (8) (9) pour permettre un examen adéquat de l’épithélium squameux, transitionnel (res ­
piratoire non-cilié), respiratoire (respiratoire cilié) et olfactif, ainsi que du 
tissu lymphatique (NALT) (10) (11). Trois niveaux du larynx sont examinés, 
dont un comprenant la base de l’épiglotte (12). Au moins deux niveaux de la trachée sont examinés, y compris une coupe longitudinale le long de la carène de la bifurcation des bronches extrapulmonaires et une coupe trans ­
versale.
 
HISTOPATHOLOGIE  
45. Une évaluation histopathologique de tous les organes et tissus du tableau 2 
est réalisée pour les animaux des groupes témoins et des groupes exposés à 
une concentration élevée de la substance d’essai, ainsi que pour les animaux qui meurent ou sont sacrifiés au cours de l’étude. On portera une attention particulière aux voies respiratoires, aux organes cibles et aux lésions macro ­
scopiques. Les organes et tissus présentant des lésions dans le groupe 
exposé à une concentration élevée sont examinés pour tous les groupes. Le directeur de l’étude peut choisir de réaliser des évaluations histopatho ­
logiques pour d’autres groupes afin de mettre en évidence une relation 
concentration-réponse claire. Lorsqu’un groupe satellite (étude de réversibi ­
lité) est utilisé, il y a lieu d’effectuer un examen histopathologique pour tous les tissus et organes ayant laissé apparaître des effets dans les groupes traités. Lorsqu’un trop grand nombre de morts précoces ou d’autres 
problèmes survenant dans le groupe exposé à une concentration élevée 
compromettent la portée des résultats, le groupe exposé à la concentration immédiatement inférieure subit un examen histopathologique. On tentera de corréler les observations macroscopiques et les constatations au niveau 
microscopique.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Données  
46. Pour chacun des animaux, les données suivantes sont fournies: poids corpo ­
rel, consommation de nourriture, pathologie clinique, pathologie macrosco ­
pique, poids des organes et histopathologie. Les résultats des observations 
cliniques sont résumés sous la forme de tableaux et indiquent pour chaque groupe d’essai: le nombre d’animaux utilisés, le nombre d’animaux présen ­
tant des signes spécifiques de toxicité, le nombre d’animaux retrouvés morts 
au cours de l’essai ou euthanasiés, l’heure de la mort de chacun des 
animaux, la description et l’évolution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur réversibilité, et les conclusions de l’autopsie. Tous les résul ­
tats, quantitatifs et fortuits, sont évalués à l’aide d’une méthode statistique 
appropriée. Toute méthode statistique généralement reconnue peut être utili ­
sée; il y a lieu de sélectionner les méthodes statistiques au stade de la conception de l’étude.
 
Rapport d’essai  
47. Le rapport d’essai contient, s’il y a lieu, les renseignements suivants:  
Animaux d’expérience et conditions d’élevage  
— Description des conditions d’encagement, y compris: nombre (ou évolu ­
tion du nombre) d’animaux par cage, matériel de litière, température 
ambiante et taux d’humidité relative, photopériode et identification du 
régime alimentaire.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 433
 
— Espèces/souches utilisées et justification éventuelle de l’utilisation d’une 
espèce autre que le rat. Des données sources et historiques peuvent être 
fournies si elles correspondent à des animaux soumis à des conditions d’exposition, d’encagement et de jeûne similaires.
 
— Nombre, âge et sexe des animaux.  
— Méthode de randomisation.  
— Description d’un éventuel conditionnement préalable à l’essai, tel que 
régime alimentaire, quarantaine ou traitement de maladie.  
Substance d’essai  
— Nature physique, pureté et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (y 
compris isomérisation).  
— Données d’identification et numéro CAS (Chemical Abstract Services) 
s’il est connu.  
Véhicule  
— Justification de l’emploi d’un véhicule et justification de son choix (s’il 
ne s’agit pas de l’eau).  
— Données historiques ou concordantes démontrant que le véhicule n’inter ­
fère pas avec les résultats de l’étude.  
Chambre d’inhalation  
— Description détaillée de la chambre d’inhalation, y compris son volume 
et son schéma.  
— Source et description de l’équipement utilisé pour l’exposition des 
animaux et pour la production de l’atmosphère.  
— Équipement utilisé pour mesurer la température, l’humidité, la granulo ­
métrie et la concentration réelle.  
— Source d’air et système de climatisation utilisé.  
— Méthodes utilisées pour étalonner l’équipement afin d’assurer l’homogé ­
néité de l’atmosphère d’essai.  
— Différence de pression (positive ou négative).  
— Orifices d’exposition par chambre («nez seul») ou emplacement des 
animaux dans la chambre («corps entier»).  
— Stabilité de l’atmosphère d’essai.  
— Situation des capteurs thermiques et hygrométriques et échantillonnage 
de l’atmosphère d’essai dans la chambre d’exposition.  
— Traitement de l’air fourni/évacué.  
— Débits d’air, débit d’air/orifice d’exposition («nez seul») ou rapport du 
volume de l’animal à la chambre («corps entier»).  
— Temps nécessaire pour atteindre l’équilibre dans la chambre d’exposition 
(t 95 ). 
— Nombre de changements de volume par heure.  
— Doseurs (s’il y en a).  
Données concernant l’exposition  
— Justification du choix de la concentration cible dans l’étude principale.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 434
 
— Concentrations nominales (masse totale de la substance d’essai produite 
dans la chambre d’inhalation, divisée par le volume d’air traversant la 
chambre).  
— Concentrations réelles de la substance d’essai obtenues dans la zone où 
respirent les animaux; pour les mélanges à tester produisant des formes 
physiques hétérogènes (gaz, vapeurs, aérosols), chacun des constituants peut être analysé séparément.
 
— Toutes les concentrations atmosphériques sont rapportées en unités de 
masse (mg/l, mg/m  3 , etc.) plutôt qu’en unités de volume (ppm, ppb, 
etc.).  
— Répartition granulométrique des particules, diamètre aérodynamique 
médian de masse (DAMM) et écart type géométrique ( σ g ), ainsi que 
leur méthode de calcul. Les autres analyses de la taille de particules 
sont consignées.  
Conditions expérimentales  
— Détails sur la préparation de la substance d’essai, y compris sur les 
procédures utilisées pour réduire la taille des particules des matériaux solides ou pour préparer les solutions de la substance d’essai.
 
— Description (si possible avec schéma) de l’équipement utilisé pour 
produire l’atmosphère d’essai et pour exposer les animaux à celle-ci.  
— Détails sur l’équipement utilisé pour contrôler la température et le taux 
d’humidité de la chambre ainsi que le débit d’air dans la chambre (réalisation d’une courbe d’étalonnage).
 
— Détails sur l’équipement utilisé pour recueillir les échantillons servant à 
déterminer les concentrations dans la chambre et la répartition granulo ­
métrique.  
— Détails sur la méthode de chimie analytique utilisée et la méthode de 
validation (notamment rendement de récupération de la substance d’essai à partir du milieu d’échantillonnage).
 
— Méthode de randomisation utilisée pour l’assignation des animaux aux 
groupes d’essai et aux groupes témoins.  
— Détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau (notamment origine/type 
de régime alimentaire, origine de l’eau).  
— Justification du choix des concentrations d’essai.  
Résultats  
— Tableau présentant la température, le taux d’humidité et le débit d’air 
dans la chambre d’inhalation.  
— Tableau de données sur les concentrations nominales et réelles dans la 
chambre d’inhalation.  
— Tableau de données sur la taille des particules, notamment données 
analytiques sur le prélèvement d’échantillons, la répartition granulomé ­
trique et les calculs du DAMM et de σ g . 
— Tableau de données sur les réponses et le niveau de concentration pour 
chaque animal (c’est-à-dire nombre d’animaux montrant des signes de 
toxicité, y compris de mortalité, et nature, sévérité, moment d’apparition 
et durée des effets).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 435
 
— Tableau du poids de chacun des animaux.  
— Tableau de la consommation de nourriture.  
— Tableau des résultats de pathologie clinique.  
— Pour chaque animal, résultats de l’autopsie et observations histopatho ­
logiques disponibles.  
Discussion et interprétation des résultats  
— Un effort particulier est consacré à la description des méthodes utilisées 
pour répondre aux critères de la présente méthode d’essai, par exemple 
en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules.  
— La respirabilité des particules est abordée à la lumière des résultats 
d’ensemble, en particulier si les critères de taille des particules n’ont pu être remplis.
 
— La cohérence des méthodes utilisées pour déterminer les concentrations 
nominales et réelles, et la relation entre la concentration réelle et la 
concentration nominale, sont incluses dans l’appréciation d’ensemble de l’étude.
 
— La cause probable de la mort et le mode d’action prédominant (sys ­
témique ou local) sont abordés.  
— Une explication est apportée s’il a fallu euthanasier des animaux qui 
souffraient ou montraient des signes de détresse sévère et persistante, en 
se basant sur les critères du document d’orientation de l’OCDE sur les effets mesurés éthiquement acceptables (3).
 
— Le ou les organes cibles sont identifiés.  
— La concentration sans effet nocif observé (CSENO) et la concentration 
minimale avec effet nocif observé (CMENO) sont déterminées.  
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(10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., 
Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
 
(11) Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis D.J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Règlement (CE) n  o 1272/2008 du Parlement européen et du Conseil du 
16 décembre 2008 relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage 
des substances et des mélanges, modifiant et abrogeant les directives 
67/548/CEE et 1999/45/CE et modifiant le règlement (CE) n  o 1907/2006 
(JO L 353 du 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 437
 
Appendice 1  
DÉFINITION  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 438
 
B.30.  ÉTUDES DE TOXICITÉ CHRONIQUE  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 452 de 
l’OCDE pour les essais de produits chimiques (2009). La ligne directrice 
452 initiale avait été adoptée en 1981. La révision de cette méthode B.30 a 
été jugée nécessaire afin de tenir compte des évolutions récentes dans le domaine du bien-être animal, ainsi que des nouvelles exigences réglemen ­
taires (1) (2) (3) (4). La mise à jour de la méthode d’essai B.30 a été 
effectuée en parallèle avec la révision des chapitres B.32 (Études de cancé ­
rogenèse) et B.33 (Études combinées de toxicité chronique et de cancéro ­
genèse) de la présente annexe, dans le but d’obtenir des informations addi ­
tionnelles à partir des animaux utilisés dans l’étude, et de fournir des préci ­
sions concernant le choix des doses. La présente méthode d’essai vise les 
essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des produits chimiques industriels.
 
2. La plupart des études de toxicité chronique étant menées sur des espèces de 
rongeurs, la présente méthode d’essai est destinée à s’appliquer principale ­
ment à des études réalisées avec ces espèces. S’il s’avérait nécessaire de 
mener de telles études avec des non-rongeurs, les principes et procédures 
décrits dans la présente méthode d’essai et dans le chapitre B.27 de la présente annexe (Toxicité orale à doses répétées – non-rongeurs: 90 jours) (5) pourront aussi être appliqués, moyennant des modifications appropriées, 
comme indiqué dans le document d’orientation de l’OCDE n
 o 116 sur 
l’élaboration et la conduite des études de toxicité chronique et de cancéro ­
genèse (6).  
3. Les trois principales voies d’administration utilisées dans les études de 
toxicité chronique sont la voie orale, la voie cutanée et l’inhalation. Le 
choix de la voie d’administration dépend des caractéristiques physiques et 
chimiques de la substance d’essai, et de la voie d’exposition prédominante chez l’homme. Des informations complémentaires sur le choix de la voie d’exposition sont fournies dans le document d’orientation n
 o 116 (6).  
4. La présente méthode d’essai porte essentiellement sur l’exposition par voie 
orale, la voie la plus communément utilisée dans les études de toxicité 
chronique. Bien que des études de toxicité chronique à long terme utilisant 
l’exposition par voie cutanée ou par inhalation puissent aussi être néces ­
saires pour évaluer le risque pour la santé humaine et/ou exigées en vertu de certains régimes réglementaires, ces deux voies d’exposition nécessitent des 
dispositifs techniques d’une grande complexité. De telles études devront être 
conçues au cas par cas, encore que la présente méthode d’essai, qui porte sur la caractérisation et l’évaluation de la toxicité chronique par voie orale, puisse fournir les bases d’un protocole d’étude par voie cutanée et/ou l’inha ­
lation, notamment en ce qui concerne les recommandations relatives aux 
durées de traitement, aux paramètres cliniques et pathologiques, etc. Il existe des documents d’orientation de l’OCDE sur l’administration expérimentale de substances d’essai par inhalation (6) (7) et par voie cutanée (6). Les 
chapitres B.8 (8) et B.29 (9) de la présente annexe, ainsi que le document 
d’orientation de l’OCDE sur les essais de toxicité aiguë par inhalation (7) doivent en particulier être consultés lors de la conception d’études à plus long terme portant sur une exposition par inhalation. Le chapitre B.9 de la 
présente annexe (10) doit être consulté dans le cas d’un essai par voie 
cutanée.
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5. L’étude de toxicité chronique donne des éléments d’information sur les 
risques pour la santé susceptibles de découler d’une exposition répétée sur 
une portion considérable de la durée de vie des espèces employées. L’étude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance d’essai, et indiquera les organes cibles et la possibilité d’accumulation dans ces 
organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif 
observé, qui permet d’établir les critères de sécurité concernant l’exposition humaine. De plus, il convient d’accorder une attention particulière à l’ob ­
servation clinique des animaux afin d’obtenir le plus d’informations 
possible.
 
6. Les objectifs des études couvertes par la présente méthode d’essai sont les 
suivants:  
— identification de la toxicité chronique d’une substance d’essai,  
— identification des organes cibles,  
— caractérisation de la relation dose-effet,  
— identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé (DSENO) ou 
du point de départ pour l’établissement d’une dose de référence (DR),  
— prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux représentatifs de 
l’exposition humaine,  
— obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le 
mode d’action (6).  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
7. Lors de l’évaluation des caractéristiques toxicologiques d’une substance 
chimique d’essai, le laboratoire chargé de l’étude prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance d’essai avant de réaliser 
l’étude, afin de pouvoir orienter celle-ci de manière à tester plus efficace ­
ment le potentiel de toxicité chronique, et faire le moins possible appel aux animaux. Les informations utiles pour concevoir l’étude sont notamment: l’identité, la structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la 
substance d’essai; les informations éventuelles sur son mode d’action; les 
résultats d’éventuelles études de toxicité in vitro ou in vivo; l’utilisation (les utilisations) prévue(s) et le potentiel d’exposition humaine; les données Q(SAR) disponibles et les données toxicologiques relatives aux substances 
chimiques structurellement apparentées; les données toxicocinétiques 
disponibles (dose unique et doses répétées, si ces données existent) et les résultats d’autres études à doses répétées. La détermination de la toxicité chronique n’est effectuée qu’après obtention des premiers résultats d’essais 
de toxicité à doses répétées sur 28 jours et/ou 90 jours. Il convient d’en ­
visager l’adoption d’une approche par étapes pour les essais de toxicité chronique entrepris dans le cadre de l’évaluation globale des effets nocifs potentiels d’une substance d’essai particulière (11) (12) (13) (14).
 
8. Les méthodes statistiques les plus appropriées pour l’analyse des résultats, 
compte tenu du plan expérimental et des objectifs de l’étude, sont identifiées avant le début de l’étude. Il convient notamment de déterminer si les statis ­
tiques doivent prendre en compte l’ajustement en fonction de la survie et 
l’analyse effectuée en cas de mort prématurée des animaux d’un ou 
plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant les analyses statis ­
tiques appropriées, ainsi que des références clés à des méthodes statistiques reconnues au plan international, dans le document d’orientation n
 o 116 (6) 
ainsi que dans le document d’orientation n  o 35 sur l’analyse et l’évaluation 
des études de toxicité chronique et de cancérogenèse (15).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 440
 
9. Lors de la réalisation d’une étude de toxicité chronique, il est recommandé 
de toujours suivre les principes et considérations énoncés dans le document 
d’orientation n  o 19 de l’OCDE sur la reconnaissance, l’évaluation et l’uti ­
lisation des signes cliniques en tant qu’effets mesurés éthiquement accepta ­
bles dans les expérimentations animales menées à des fins d’évaluation de la 
sécurité (16). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier, stipule ce qui 
suit: « Dans les études comportant l’administration de doses répétées, 
lorsqu'un animal présente des signes cliniques progressifs de détérioration de son état, une décision d’euthanasier ou non l’animal est prise en 
connaissance de cause. Cette décision met en balance des facteurs tels 
que la valeur des informations pouvant être obtenues en maintenant l’animal dans l’étude d’une part, et l’état général de celui-ci d’autre part. Si la décision est prise de poursuivre l’essai sur cet animal, la 
fréquence des observations est augmentée selon les besoins. Il est aussi 
possible, sans toutefois nuire à l’objectif de l’essai, d’interrompre l’adminis ­
tration de la substance d’essai pour soulager la douleur ou la détresse de l’animal, ou de réduire la dose testée .»
 
10. On trouvera des informations détaillées et une discussion sur les principes 
déterminant le choix des doses pour les études de toxicité chronique et de 
cancérogenèse dans le document d’orientation n  o 116 (6) ainsi que dans 
deux publications de l’Institut international des sciences de la vie (17) (18). La stratégie de base pour le choix des doses dépend du ou des objec ­
tifs principaux de l’étude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de dose 
appropriés, il convient de trouver un équilibre entre, d’une part, l’identifi ­
cation des dangers et, d’autre part, la caractérisation des réponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet équilibre est particulièrement nécessaire dans le cas où une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse (cha ­
pitre B.33 de la présente annexe) est menée (paragraphe 11).
 
11. Il convient d’examiner l’opportunité de réaliser une étude combinée de 
toxicité chronique et de cancérogenèse (chapitre B.33 de la présente annexe), plutôt que de réaliser séparément une étude de toxicité chronique (la présente méthode d’essai B.30) et une étude de cancérogenèse (chapitre 
B.32 de la présente annexe). L’essai combiné permet une meilleure effica ­
cité en temps et en coûts, par rapport à la conduite de deux essais séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la phase de cancérogenèse. Toutefois, les principes déterminant le choix de la 
dose (paragraphes 9 et 20-25) sont respectés rigoureusement lors de la 
réalisation d’une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse (chapitre B.33 de la présente annexe); il est reconnu également que certains cadres réglementaires peuvent imposer la conduite d’études séparées.
 
12. Les définitions utilisées dans le contexte de la présente méthode d’essai 
figurent dans le document d’orientation n  o 116 (6).  
PRINCIPE DE L’ESSAI  
13. La substance d’essai est administrée quotidiennement à plusieurs groupes 
d’animaux d’expérience à des doses progressives, en général pendant une période de 12 mois, bien que des durées plus longues ou plus courtes 
puissent aussi être choisies, en fonction des exigences réglementaires (voir 
paragraphe 33). Cette durée est assez longue pour permettre aux effets de toxicité cumulée de se manifester, tout en évitant les effets perturbateurs des changements liés au vieillissement. Les déviations par rapport à une durée 
d’exposition de 12 mois sont justifiées, surtout dans le cas de durées plus 
courtes. La substance d’essai est normalement administrée par voie orale, mais la voie inhalatoire ou la voie cutanée peut aussi être appropriée. Un ou plusieurs sacrifices en cours d’étude peuvent aussi être prévus, par exemple 
à 3 et 6 mois, auquel cas des groupes d’animaux supplémentaires pourront 
être enrôlés (voir paragraphe 19). Au cours de la période d’administration, les animaux sont examinés soigneusement afin de déceler tout signe de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifiés en cours d’essai 
sont autopsiés et, au terme de l’essai, les animaux survivants sont sacrifiés et 
autopsiés.
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DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Choix des espèces animales  
14. La présente méthode d’essai traite principalement de la caractérisation et de 
l’évaluation de la toxicité chronique chez les rongeurs (voir paragraphe 2), bien que certains régimes réglementaires puissent exiger la réalisation d’études similaires chez des non-rongeurs. Dans ce cas, le choix de l’espèce 
est justifié. S’il s’avérait nécessaire de réaliser des études de toxicité chro ­
nique avec des non- rongeurs, le plan et la conduite de l’étude devraient être conformes aux principes décrits dans la présente méthode d’essai ainsi qu’au chapitre B.27 de la présente annexe (Toxicité orale à doses répétées – 
non-rongeurs: 90 jours) (5). Des informations additionnelles sur le choix 
des espèces et des souches sont disponibles dans le document d’orientation n
 o 116 (6).  
15. La présente méthode d’essai se rapporte essentiellement au rat, mais d’autres 
espèces de rongeurs, comme la souris, peuvent être utilisées. Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de 
leur courte durée de vie, de leur utilisation fréquente dans les études phar ­
macologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l’induction de tumeurs, et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéris ­
tiques permettent d’obtenir une grande quantité d’informations sur la physio ­
logie et la pathologie de ces animaux. Il convient d’employer de jeunes 
animaux adultes sains, de souches communément utilisées dans les labora ­
toires. L’étude de toxicité chronique sera effectuée de préférence sur des animaux de même souche et de même provenance que ceux utilisés dans 
l’étude (les études) de toxicité préliminaire(s) de plus courte durée. Les 
femelles sont nullipares et non gravides.
 
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
16. Les animaux peuvent être logés individuellement ou réunis dans des cages 
en petits groupes du même sexe, l’hébergement individuel n’étant à envi ­
sager que dans des cas scientifiquement justifiés (19) (20) (21). Les cages sont placées de façon telle que l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats soit réduite au minimum. La température du local des animaux 
d’expérience est de 22 °C (± 3 °C). L’humidité relative est d’au moins 30 % 
et n’excède pas de préférence 70 % en dehors des moments où le local est nettoyé, l’idéal étant qu’elle soit comprise entre 50 et 60 %. L’éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Le régime 
alimentaire peut être un régime classique de laboratoire, avec eau potable à 
satiété. Il satisfait tous les besoins nutritionnels de l’espèce étudiée, et la teneur en contaminants alimentaires susceptibles d’influer sur les résultats de l’essai (résidus de pesticides, polluants organiques persistants, 
phyto-œstrogènes, métaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi 
faible que possible. Des données analytiques sur les teneurs en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies régulièrement, au moins au début de l’étude et lors des changements de lots; ces données figurent dans 
le rapport final. Des données analytiques sur l’eau de boisson utilisée dans 
le cadre de l’étude sont de même fournies. Le choix du régime alimentaire peut être influencé par la nécessité d’assurer un mélange convenable de la substance d’essai, et de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux 
lorsque la substance d’essai est administrée dans la nourriture.
 
Préparation des animaux  
17. Il convient d’utiliser des animaux sains, acclimatés aux conditions de labo ­
ratoire depuis au moins 7 jours, et n’ayant jamais été soumis auparavant à des protocoles expérimentaux. Dans le cas des rongeurs, l’administration de 
la substance commence dès que possible après le sevrage et l’acclimatation, 
et de préférence avant l’âge de 8 semaines. L’espèce, la souche, la prove ­
nance, le sexe, le poids et l’âge des animaux d’expérience sont précisés. Au début de l’étude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est 
minimale, et n’excède pas ± 20 % du poids moyen de tous les animaux 
étudiés, et ce pour chaque sexe séparément. Les animaux sont affectés de
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manière aléatoire aux différents groupes (témoins et traités). Après la rando ­
misation, les poids moyens des groupes de chaque sexe ne présentent pas de 
différences significatives. En cas de différences statistiquement significa ­
tives, la phase de randomisation est répétée dans la mesure du possible. Chaque animal reçoit un numéro d’identification unique et en est marqué 
de manière permanente par tatouage, implant de micro-puce ou toute autre 
méthode appropriée.
 
PROTOCOLE  
Nombre et sexe des animaux  
18. Il convient d’utiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant 
pour qu’à la fin de l’étude, chaque groupe contienne un nombre de sujets permettant d’effectuer une évaluation statistique et biologique complète. 
Pour les rongeurs, il convient normalement d’employer au moins 20 
animaux de chaque sexe à chaque niveau de dose, tandis que pour les non-rongeurs, un minimum de 4 animaux de chaque sexe par groupe est recommandé. Dans les études utilisant des souris, il peut être nécessaire de 
prévoir des animaux supplémentaires dans chaque groupe de dose pour 
pouvoir effectuer tous les examens hématologiques requis.
 
Sacrifices en cours d’étude, groupes satellites et animaux sentinelles  
19. L’étude peut prévoir le sacrifice d’animaux en cours d’étude (au moins 10 
animaux de chaque sexe par groupe), par exemple à 6 mois, afin de 
recueillir des données sur la progression des changements toxicologiques 
et des informations mécanistiques, si cela est scientifiquement justifié. Si l’on dispose déjà de ces données, obtenues antérieurement lors d’études de toxicité à doses répétées sur la substance d’essai, les sacrifices en cours 
d’étude peuvent ne pas être scientifiquement justifiés. Des groupes satellites 
peuvent également être constitués, afin de contrôler la réversibilité des éven ­
tuelles altérations toxicologiques induites par la substance chimique étudiée. En général, ces investigations portent uniquement sur les doses maximales 
de l’étude et sur le groupe témoin. Un groupe supplémentaire d’animaux 
sentinelles (généralement 5 animaux de chaque sexe) peut être inclus si nécessaire pour le suivi de l’état pathologique au cours de l’étude (22). Si des sacrifices en cours d’étude ou l’inclusion de groupes sentinelles ou 
satellites sont prévus, le nombre d’animaux utilisés dans l’étude est 
augmenté du nombre d’animaux que l’on prévoit de sacrifier avant l’achè ­
vement de l’étude. Ces animaux sont normalement sujets aux mêmes obser ­
vations que ceux soumis à la phase de toxicité chronique de l’étude princi ­
pale, notamment en ce qui concerne le poids corporel, la prise d’aliments et 
d’eau, les mesures hématologiques et de biochimie clinique et les examens pathologiques. Toutefois, des dispositions peuvent aussi être prises (dans les groupes d’animaux sacrifiés en cours d’étude) pour limiter ces observations 
à des mesures essentielles spécifiques telles que la neurotoxicité ou l’immu ­
notoxicité.
 
Groupes de dose et dosage  
20. Le document d’orientation n  o 116 (6), donne des indications sur tous les 
aspects du choix des doses et des écarts entre les doses. Il convient d’utiliser 
au moins trois doses et un groupe témoin, sauf si un essai limite est pratiqué 
(voir paragraphe 27). Les niveaux de doses seront généralement basés sur les résultats d’études à plus court terme à doses répétées, ou d’études préli ­
minaires de détermination des concentrations, et prennent en compte toutes 
les données toxicologiques et toxicocinétiques existantes relatives à la subs ­
tance d’essai ou aux substances chimiques apparentées.
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21. À moins de contraintes dues à la nature physico-chimique ou aux effets 
biologiques de la substance d’essai, le niveau de dose le plus élevé est 
choisi de manière à permettre d’identifier les principaux organes cibles et les effets toxiques de la substance, tout en évitant la souffrance, une toxicité sévère ou une forte morbidité ou létalité chez les animaux testés. Compte 
tenu des facteurs présentés au paragraphe 22 ci-dessous, le niveau de dose le 
plus élevé est choisi pour provoquer une manifestation de toxicité, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (d’environ 10 %).
 
22. Toutefois, en fonction des objectifs de l’étude (voir paragraphe 6), on pourra 
choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicité; par exemple une dose entraînant un effet indésirable 
préoccupant, mais dont l’impact sur l’espérance de vie ou le poids corporel 
reste faible. La dose maximale ne dépasse pas 1 000 mg/kg de poids corporel (dose limite, voir paragraphe 27).
 
23. Les niveaux de dose et les intervalles entre les doses peuvent être choisis de 
manière à pouvoir établir une relation dose-réponse et une DSENO ou tout autre résultat escompté de l’étude, notamment une DR (voir paragraphe 25) 
au plus bas niveau de dose. Les facteurs à prendre en compte dans le choix 
des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-réponse, les doses qui provoquent des changements métaboliques 
importants ou qui modifient notablement le mode d’action toxique, le 
niveau auquel on peut prévoir un seuil, ou celui auquel on peut prévoir de fixer un point de départ pour une extrapolation aux faibles doses.
 
24. Les intervalles entre les doses dépendront des caractéristiques de la subs ­
tance d’essai, et ne peuvent donc pas être prescrits dans la présente méthode d’essai, mais des intervalles correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent 
les plus appropriés entre les doses décroissantes, et l’inclusion d’un 
quatrième groupe d’essai est souvent préférable à la fixation de très grands intervalles (correspondant par exemple à un facteur de plus de 6 à 10) entre les doses. En général, les facteurs supérieurs à 10 sont évités, et 
leur utilisation fait l’objet d’une justification.
 
25. Comme le précise le document d’orientation n  o 116 (6), les facteurs à 
prendre en compte dans le choix des doses sont notamment les suivants:  
— non-linéarités ou points d’inflexion connus ou supposés de la courbe 
dose-réponse,  
— toxicocinétique et gammes de doses auxquelles l’induction métabolique, 
la saturation ou la non-linéarité entre des doses externes et internes surviennent ou non,
 
— lésions précurseurs, marqueurs d’effets ou indicateurs du déroulement de 
processus biologiques clés sous-jacents,  
— aspects principaux (ou présumés) du mode d’action, par exemple doses 
auxquelles une cytotoxicité commence à se manifester, les dosages 
hormonaux sont perturbés, les mécanismes homéostatiques sont dépas ­
sés, etc.,  
— régions de la courbe dose-réponse nécessitant une estimation particuliè ­
rement précise, par exemple dans le domaine de la DR prévue ou d’un seuil présumé,
 
— prise en compte des niveaux prévus d’exposition humaine.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 444
 
26. Le groupe témoin est un groupe non-traité ou un groupe recevant le véhicule 
si la substance d’essai est administrée dans un véhicule. Exception faite de 
l’administration de la substance d’essai, les animaux du groupe témoin sont traités de la même manière que ceux des groupes d’essai. Si un véhicule est employé, on administrera au groupe témoin le plus grand volume de véhi ­
cule utilisé pour les groupes traités. Si la substance d’essai est incorporée 
aux aliments et entraîne une diminution sensible de la prise de nourriture liée à une moindre appétence de celle-ci, il pourra être utile d’utiliser un groupe témoin supplémentaire nourri en parallèle, qui constituerait un 
témoin plus approprié.
 
27. S’il est possible d’anticiper, en se basant sur les résultats d’études prélimi ­
naires, qu’un essai à dose unique, équivalant au moins à 1 000 mg/kg poids 
corporel/jour, réalisé en suivant les procédures décrites pour la présente 
étude, ne produira probablement pas d’effets indésirables, et si la toxicité est improbable compte tenu des données disponibles sur les substances chimiques structurellement apparentées, on peut considérer qu’une étude 
complète à trois niveaux de dose n’est pas indispensable. Une limite de 
1 000 mg/kg poids corporel/jour peut s’appliquer sauf si l’exposition humaine indique qu’il est nécessaire de recourir à un niveau de dose plus élevé.
 
Préparation des doses et administration de la substance d’essai  
28. La substance d’essai est normalement administrée par voie orale, soit dans la 
nourriture ou l’eau de boisson, soit par gavage. Des informations complé ­
mentaires sur les voies et méthodes d’administration figurent dans le docu ­
ment d’orientation n  o 116 (6). La voie et le mode d’administration dépen ­
dent de la finalité de l’étude, des propriétés physico-chimiques de la subs ­
tance d’essai, de sa biodisponibilité, ainsi que de la voie et du mode prédo ­
minants d’exposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode d’administration. Dans l’intérêt des animaux, le gavage oral n’est 
normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie et ce 
mode d’administration correspondent à une voie d’exposition potentielle raisonnable chez l’homme (produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux, notamment 
les pesticides, l’administration se fait d’ordinaire via le régime alimentaire 
ou l’eau de boisson. Toutefois, dans certains contextes, tels que l’exposition professionnelle, l’administration par d’autres voies peut être plus appropriée.
 
29. Si nécessaire, la substance d’essai est dissoute ou mise en suspension dans 
un véhicule approprié. Il convient de prendre en compte les caractéristiques suivantes du véhicule et des autres additifs, s’il y a lieu: effets sur l’absorp ­
tion, la répartition, le métabolisme ou la rétention de la substance d’essai; 
effets sur les propriétés chimiques de la substance d’essai susceptibles de 
modifier sa toxicité; et effets sur la prise d’aliments ou d’eau, ou sur l’état nutritionnel des animaux. Il est recommandé, chaque fois que les circons ­
tances le permettent, d’envisager en premier lieu l’utilisation d’une solution 
ou d’une suspension aqueuse, puis celle d’une solution ou d’une émulsion 
dans une huile (par exemple huile de maïs), et en dernier lieu celle d’une solution dans d’autres véhicules. Les caractéristiques de toxicité des véhi ­
cules autres que l’eau sont connues. Il convient de disposer d’informations 
sur la stabilité de la substance d’essai et sur l’homogénéité des solutions ou 
rations contenant les différentes doses (selon les cas) dans les conditions d’administration (nourriture, par exemple).
 
30. Il importe de veiller à ce que les quantités de substances administrées dans 
les aliments ou l’eau de boisson n’interfèrent pas avec la nutrition ou avec l’équilibre hydrique. Dans les études de toxicité à long terme faisant inter ­
venir une administration par voie alimentaire, la concentration de la subs ­
tance d’essai dans les aliments ne dépasse pas normalement 5 % de la ration 
totale, afin d’éviter les déséquilibres nutritionnels. Si la substance d’essai est incorporée à la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg d’aliment ou ppm), soit un niveau de dose constant par 
rapport au poids corporel de l’animal (mg/kg de poids corporel), calculé sur 
une base hebdomadaire. La solution choisie est spécifiée.
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31. En cas d’administration par voie orale, les animaux reçoivent une dose 
quotidienne de la substance d’essai (à raison de sept jours par semaine), 
et ce normalement pendant une période de 12 mois (voir également le paragraphe 33) encore qu’une durée plus longue puisse être requise selon les prescriptions réglementaires. Tout autre régime de dosage, par exemple 
une administration cinq jours par semaine, fait l’objet d’une justification. En 
cas d’administration par voie cutanée, les animaux reçoivent normalement le traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le précise le chapitre B.9 de la présente annexe (10), et ce pendant une 
période de 12 mois. L’exposition par inhalation est réalisée pendant 6 heures 
par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter l’exposition à 5 jours par semaine. La période d’exposition est normalement de 12 mois. Si des espèces de rongeurs autres que le rat 
sont exposées «nez seul», il est possible d’ajuster la durée maximale d’ex ­
position en fonction du stress propre à ces espèces. Le choix d’une durée d’exposition inférieure à 6 heures par jour devra être justifié. Voir également le chapitre B.8 de la présente annexe (8).
 
32. Lorsque la substance d’essai est administrée aux animaux par gavage, l’opé ­
ration est pratiquée aux mêmes moments de la journée au moyen d’une 
sonde gastrique ou d’une canule d’intubation appropriée. Normalement, une dose unique sera administrée une fois par jour mais lorsque, par exem ­
ple, la substance chimique est un irritant local, il pourra être envisagé de 
maintenir la dose quotidienne en la fractionnant (deux fois par jour). Le 
volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l’animal d’expérience. Le volume est maintenu aussi faible que possible et ne dépasse pas normalement 1 ml/100 g de poids corporel 
pour les rongeurs (22). Il convient de minimiser la variabilité du volume 
testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant à tous les niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes sont l’exception et leur dilution permet d’éviter tout effet local sévère. Il 
convient d’éviter les concentrations d’essai susceptibles d’être corrosives ou 
irritantes pour le tube digestif.
 
Durée de l’étude  
33. Bien que la présente méthode d’essai concerne principalement des essais de 
toxicité chronique d’une durée de 12 mois, le plan de l’étude permet une application de durée plus courte (6 à 9 mois par exemple) ou plus longue (18 à 24 mois), pour répondre aux exigences de régimes réglementaires 
particuliers ou obtenir des données mécanistiques spécifiques. Les déviations 
par rapport à une durée d’exposition de 12 mois font l’objet de justifica ­
tions, surtout dans le cas de durées plus courtes. Les groupes satellites inclus pour contrôler la réversibilité des éventuelles altérations toxicologiques 
induites par la substance d’essai sont maintenus sans traitement, pendant 
une période d’au moins 4 semaines et d’au plus un tiers de la durée totale de l’étude, après la cessation de l’exposition. Le document d’orientation n
 o 116 
(6) fournit des indications supplémentaires, notamment en ce qui concerne la 
survie des animaux d’expérience.  
OBSERVATIONS  
34. Tous les animaux sont soumis à un examen quotidien, généralement en 
début et en fin de journée, fins de semaine et jours fériés compris, pour 
déterminer la morbidité et la mortalité. Des observations cliniques sont effectuées au moins une fois par jour, de préférence au(x) même(s) moment(s) de la journée, en tenant compte du moment où l’on prévoit 
que les effets des différentes doses atteindront leur intensité maximale 
après administration par gavage.
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35. Tous les animaux font l’objet d’observations cliniques détaillées au moins 
une fois avant la première exposition (pour permettre des comparaisons 
intra-individuelles), à la fin de la première semaine de l’étude, et une fois par mois ensuite. Les observations respectent un protocole qui réduit au minimum les variations entre observateurs, et les rend indépendantes du 
groupe testé. Ces observations sont effectuées hors de la cage où sont 
logés les animaux, de préférence dans une enceinte normalisée et à heures fixes. Elles sont soigneusement consignées, de préférence en utilisant un système de cotation explicitement défini par le laboratoire qui réalise l’essai. 
Les conditions d’observation demeurent aussi constantes que possible. Les 
observations portent notamment porter sur les symptômes suivants (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de l’état de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses, apparition de sécrétions et d’excrétions, et 
réactions neurovégétatives (par exemple, sécrétion de larmes, horripilation, 
variation du diamètre pupillaire, respiration anormale). Il convient également de consigner les changements dans la démarche, la posture et les réactions à la manipulation, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques 
et les comportements stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, parcours 
circulaires répétitifs) ou bizarres (par exemple, automutilation, marche à reculons) (24).
 
36. Avant la première administration de la substance d’essai, tous les animaux 
font l’objet d’un examen ophtalmologique effectué à l’aide d’un ophtalmo ­
scope ou de tout autre appareil approprié. À l’issue de l’étude, cet examen 
est réalisé de préférence sur tous les animaux, mais au moins sur ceux du groupe traités à la dose la plus élevée et du groupe témoin. Si des altérations oculaires liées au traitement sont détectées, tous les animaux sont examinés. 
Si l’analyse structurale ou d’autres données suggèrent une toxicité oculaire, 
il faut augmenter la fréquence des examens oculaires.
 
37. Dans le cas de substances ayant présenté un potentiel d’induction d’effets 
neurotoxiques lors d’essais antérieurs de toxicité à doses répétées sur 28 jours et/ou 90 jours, une vérification de la réactivité sensorielle à différents 
types de stimuli (24) (stimuli auditifs, visuels ou proprioceptifs, par exem ­
ple) (25) (26) (27), et une évaluation de la force de préhension (28) ainsi que de l’activité motrice (29) pourront être menées en option. Elles seront réalisées avant le début de l’étude et tous les 3 mois par la suite, jusqu’à 12 
mois inclusivement, ainsi qu’à la fin de l’étude (si celle-ci dure plus de 12 
mois). On trouvera dans les références bibliographiques susmentionnées une description plus détaillée des modes opératoires. Toutefois, d’autres modes opératoires que ceux figurant dans ces références sont également utilisables.
 
38. Dans le cas de substances ayant présenté un potentiel d’induction d’effets 
immunotoxiques lors d’essais antérieurs de toxicité à doses répétées sur 28 
jours et/ou 90 jours, d’autres examens sur cet effet peuvent être menés en option à la fin de l’étude.
 
Poids corporel, prise d’aliments et d’eau, et efficacité nutritionnelle  
39. Tous les animaux sont pesés au début du traitement, au moins une fois par 
semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par mois. La prise d’aliments et l’efficacité alimentaire sont aussi mesurées au 
moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au 
moins une fois par mois. Lorsque la substance d’essai est administrée dans l’eau de boisson, la prise d’eau est mesurée au moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par 
mois. Il peut également être utile de mesurer la prise d’eau dans les 
études où celle-ci est modifiée.
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Hématologie et biochimie clinique  
40. Dans les études faisant intervenir des rongeurs, des examens hématologiques 
sont effectués sur au moins 10 mâles et 10 femelles de chaque groupe, à 3, 6 et 12 mois, ainsi qu’à la fin de l’étude (si celle-ci dure plus de 12 mois), 
en utilisant les mêmes animaux tout au long de l’étude. Si des souris sont 
utilisées, il peut être nécessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer tous les examens hématologiques requis (voir paragraphe 18). Dans les études faisant intervenir des non- rongeurs, les échantillons 
seront prélevés sur un plus petit nombre d’animaux (par exemple, 4 animaux 
de chaque sexe par groupe dans les études chez le chien) à des stades intermédiaires et à la fin de l’étude, de la même manière que chez les 
rongeurs. Il ne sera pas nécessaire d’effectuer des examens à 3 mois, 
chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les paramètres hématologiques n’a été observé lors d’une étude antérieure menée sur 90 jours à des niveaux de doses comparables. Les échantillons 
de sang sont prélevés en un point déterminé, par exemple par ponction 
cardiaque ou au niveau du sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie.
 
41. Les investigations portent sur les paramètres suivants (30): numération 
leucocytaire totale et différentielle, numération érythrocytaire et plaquettaire, 
concentration d’hémoglobine, hématocrite (volume cellulaire sanguin après 
centrifugation), volume corpusculaire moyen (VCM), hémoglobine corpus ­
culaire moyenne (HCM), concentration d’hémoglobine corpusculaire moyenne (CHCM), temps de prothrombine et temps de thromboplastine 
partielle activée. D’autres paramètres hématologiques tels que les corps de 
Heinz et autres anomalies morphologiques érythrocytaires ou la méthémo ­
globine peuvent être étudiés si nécessaire en fonction de la toxicité de la substance d’essai. Dans l’ensemble, il convient d’adapter l’approche suivie à 
l’effet observé et/ou attendu d’une substance d’essai donnée. Si la substance 
d’essai exerce un effet sur le système hématopoïétique, des numérations réticulocytaires et une cytologie médullaire peuvent également être indiquées mais n’ont pas à être pratiquées de manière systématique.
 
42. Des analyses de biochimie clinique visant à étudier les principaux effets 
toxiques sur les tissus, et en particulier sur le rein et le foie, sont effectuées à partir d’échantillons de sang prélevés sur au moins 10 mâles et 10 
femelles de chaque groupe, à des intervalles de temps semblables à ceux 
spécifiés pour les examens hématologiques, et en utilisant les mêmes animaux tout au long de l’étude. Si des souris sont utilisées, il peut être nécessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer 
toutes les analyses de biochimie clinique nécessaires. Dans les études 
faisant intervenir des non-rongeurs, les échantillons seront prélevés sur un plus petit nombre d’animaux (par exemple, 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les études chez le chien) à des stades intermédiaires et à la fin 
de l’étude, de la même manière que chez les rongeurs. Il ne sera pas néces ­
saire d’effectuer des examens à 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les paramètres de biochimie clinique n’a été observé lors d’une étude antérieure menée sur 90 jours à des niveaux de 
doses comparables. Il est recommandé de faire jeûner les animaux (à l’ex ­
ception des souris) pendant la nuit qui précède la prise de sang. Les inves ­
tigations portent sur les paramètres suivants (30): glucose, urée (azote uréique), créatinine, protéines totales, albumine, calcium, sodium, potassium, 
cholestérol total, au moins deux enzymes révélatrices des effets hépatocel ­
lulaires (alanine aminotransférase, aspartate aminotransférase, glutamate déshydrogénase, acides biliaires totaux) (31) et au moins deux enzymes révélatrices des effets hépatobiliaires (phosphatase alcaline, 
gamma-glutamyl transférase, 5’- nucléotidase, bilirubine totale, acides 
biliaires totaux) (31). D’autres paramètres de chimie clinique, tels que les triglycérides à jeun, des hormones spécifiques et la cholinestérase peuvent être mesurés si nécessaire en fonction en fonction de la toxicité de la subs ­
tance d’essai. Dans l’ensemble, il convient d’adapter l’approche suivie à 
l’effet observé et/ou attendu d’une substance d’essai donnée.
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43. Des analyses d’urine sont effectuées à partir d’échantillons prélevés sur au 
moins 10 mâles et 10 femelles de chaque groupe, à des intervalles de temps 
semblables à ceux spécifiés pour les examens hématologiques et de chimie clinique. Il ne sera pas nécessaire d’effectuer des dosages à 3 mois si les analyses d’urine pratiquées dans le cadre d’une étude antérieure menée sur 
90 jours à des niveaux de doses comparables n’ont révélé aucun effet. La 
liste suivante de paramètres à étudier fait partie d’une recommandation d’experts relative aux études de pathologie clinique (30): aspect, volume, osmolalité ou poids spécifique, pH, protéines totales et glucose. D’autres 
mesures, notamment la recherche de corps cétoniques, d’urobilinogène, de 
bilirubine et de sang occulte, peuvent aussi être réalisées. L’étude d’autres paramètres peut aussi s’avérer nécessaire pour élargir les recherches sur l’effet ou les effets observés.
 
44. On considère généralement que dans les études portant sur des chiens, il 
convient de déterminer les variables hématologiques et de biochimie 
clinique de base avant le début du traitement, mais que ce n’est pas indis ­
pensable dans les études portant sur des rongeurs (30). Toutefois, si l’on ne dispose pas de données historiques de base appropriées (voir paragraphe 
50), il convient d’envisager d’en obtenir
 
Pathologie  
Autopsie macroscopique  
45. Tous les animaux de l’étude font normalement l’objet d’une autopsie macro ­
scopique complète et détaillée, comprenant un examen attentif de la surface 
externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, 
thoracique et abdominale et de leur contenu. Toutefois, des dispositions peuvent aussi être prises (dans les groupes d’animaux sacrifiés en cours d’étude ou les groupes satellites) pour limiter ces observations à des 
mesures essentielles telles que la neurotoxicité ou l’immunotoxicité (voir 
paragraphe 19). Il n’est pas nécessaire que ces animaux fassent l’objet d’une autopsie, ni des procédures ultérieures décrites dans les paragraphes qui suivent. L’autopsie des animaux sentinelles peut devoir être effectuée au 
cas par cas, à la discrétion du directeur d’étude.
 
46. Il convient de déterminer le poids des organes de tous les animaux hormis 
ceux mentionnés dans la dernière partie du paragraphe 45. Les glandes surrénales, le cerveau, les épididymes, le cœur, les reins, le foie, les ovaires, la rate, les testicules, la thyroïde (pesée après fixation, avec les glandes 
parathyroïdes) et l’utérus de tous les animaux (excepté ceux trouvés mori ­
bonds et/ou ayant été sacrifiés en cours d’étude) sont débarrassés, le cas échéant, de tout tissu adhérent et pesés à l’état frais dès que possible après la dissection, pour prévenir la dessiccation. Dans les études chez la souris, la 
pesée des glandes surrénales est facultative.
 
47. Les tissus suivants sont conservés dans le milieu de fixation le plus appro ­
prié, à la fois pour le type de tissu et pour l’examen histopathologique prévu (32) (l’examen des tissus indiqués entre crochets est facultatif): 
toutes les lésions macrosco ­
piques ganglions lymphatiques 
(superficiels et profonds) muscle squelettique rein 
aorte glande coagulante nerf périphérique [sternum] 
[bulbe olfactif] glande de Harder [voies respiratoires 
supérieures dont nez, 
cornets et sinus parana ­
saux] testicule 
cæcum glande lacrymale (exor ­
bitale) œil (dont rétine) thymus 
cerveau (y compris 
segments d’encéphale, de cervelet et de bulbe rachi ­
dien/pont) glande mammaire (obli ­
gatoire pour les femelles et, si visible à la dissec ­
tion, aussi pour les 
mâles) œsophage thyroïde 
cœur glande salivaire ovaire trachée
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col utérin glande surrénale pancréas [uretère] 
côlon hypophyse parathyroïde [urètre] [dents] iléon peau utérus (col inclus) duodénum jéjunum poumon vagin 
épididyme [langue] prostate vésicule biliaire (pour les 
espèces autres que le rat) 
estomac (pré-estomac, 
estomac glandulaire) moelle épinière (niveaux 
cervical, mésothoracique 
et lombaire) rate vésicule séminale 
[fémur avec articulation] segment de moelle 
osseuse et/ou moelle osseuse fraîchement 
ponctionnée rectum vessie 
foie
 
Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les 
glandes surrénales, les deux organes sont préservés. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener à examiner d’autres tissus. Tous les 
organes considérés comme des organes cibles potentiels du fait des 
propriétés connues de la substance d’essai sont aussi conservés. Dans les études portant sur une administration par la voie cutanée, il y a lieu de conserver les organes figurant sur la liste établie pour la voie orale, et de 
procéder à un prélèvement et une conservation spécifiques de la peau prove ­
nant du site d’application. Pour les études par inhalation, la liste des tissus des voies respiratoires conservés et examinés est conforme aux recomman ­
dations des chapitres B.8 (8) et B.29 (9) de la présente annexe. Pour les 
autres organes et tissus (outre les tissus de l’appareil respiratoire spécifique ­
ment conservés), il convient d’examiner les organes de la liste établie pour la voie orale.
 
Histopathologie  
48. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matière de 
conduite des études de pathologie toxicologique (32). Au minimum, les 
examens histopathologiques devront porter sur les tissus suivants:  
— tous les tissus prélevés dans le groupe à dose élevée et le groupe témoin,  
— tous les tissus prélevés sur les animaux morts ou sacrifiés au cours de 
l’étude,  
— tous les tissus présentant des anomalies macroscopiques,  
— tissus des organes cibles, ou tissus présentant des altérations dues au 
traitement dans le groupe à dose élevée, prélevés sur tous les animaux 
de tous les autres groupes de doses,  
— dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes 
surrénales, les deux organes sont examinés.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 450
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
49. Des données sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramètres 
évalués. En outre, toutes les données sont résumées sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe expérimental, le nombre d’ani ­
maux au début de l’essai, le nombre d’animaux trouvés morts au cours de 
l’essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre 
d’animaux présentant des signes de toxicité, la description des signes de toxicité observés, ainsi que le moment de l’apparition, la durée et la gravité de tous les effets toxiques observés, le nombre d’animaux présentant des 
lésions, les types de lésions et le pourcentage d’animaux présentant chaque 
type de lésion. Les tableaux récapitulatifs présentent les moyennes et les écarts types (pour les données recueillies en continu) pour les animaux présentant des effets toxiques ou des lésions, ainsi qu’une cotation des 
lésions.
 
50. Les données de contrôle historiques peuvent faciliter l’interprétation des 
résultats de l’étude, par exemple lorsque les données provenant des 
témoins concurrents semblent diverger de manière significative de données récentes obtenues sur des animaux témoins issus de la même installation d’essai/colonie d’élevage. Si elles sont évaluées, les données de contrôle 
historiques émanent du même laboratoire et porter sur des animaux du 
même âge et de la même souche, produits dans les cinq ans précédant l’étude en question.
 
51. Si possible, les résultats numériques devront être évalués à l’aide d’une 
méthode statistique appropriée et largement reconnue. Les méthodes statis ­
tiques et les données à analyser sont choisies au moment de la conception de l’étude (paragraphe 8). Ce choix permet d’opérer des ajustements en 
fonction de la survie, si nécessaire.
 
Rapport d’essai  
52. Le rapport d’essai mentionne les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— état physique, pureté et propriétés physico-chimiques,  
— données d’identification,  
— provenance de la substance d’essai,  
— numéro de lot,  
— certificat d’analyse chimique.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix de véhicule (s’il est autre que l’eau).  
Animaux d’expérience:  
— espèce/souche utilisée et justification du choix opéré,  
— nombre, âge et sexe des animaux au début de l’essai,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 451
 
— provenance, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l’essai.  
Conditions expérimentales:  
— justification de la voie d’administration et du choix des doses,  
— le cas échéant, méthodes statistiques utilisées pour analyser les données,  
— détails concernant la formulation de la substance d’essai ou son incor ­
poration dans les aliments,  
— données analytiques sur la concentration obtenue, la stabilité et l’homo ­
généité de la préparation,  
— voie d’administration et détails concernant l’administration de la subs ­
tance d’essai,  
— pour les études par inhalation, mention de la voie d’entrée (nez seul ou 
corps entier),  
— doses réelles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas échéant, facteur de 
conversion en dose réelle de la concentration de la substance d’essai (en mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou l’eau de boisson,
 
— détails concernant la qualité de l’alimentation et de l’eau de boisson.  
Résultats (les résultats comprendront des données générales sous forme de 
tableaux synoptiques et des données propres à chaque animal):  
— données sur la survie,  
— poids corporel/variations du poids corporel,  
— prise d’aliments, calculs de l’efficacité alimentaire, si effectués, et prise 
d’eau, le cas échéant,  
— réponse toxique par sexe et dose, y compris signes de toxicité,  
— nature, incidence (et, si elle est évaluée, sévérité), et durée des observa ­
tions cliniques (transitoires ou permanentes),  
— examen ophtalmologique,  
— examens hématologiques,  
— épreuves de biochimie clinique,  
— examens d’urine,  
— résultats des recherches de neurotoxicité ou d’immunotoxicité,  
— poids corporel à l’issue de l’essai,  
— poids des organes (et leur rapport au poids corporel, le cas échéant),  
— résultats d’autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques liés au trai ­
tement,  
— données relatives à l’absorption, le cas échéant.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 452
 
Traitement statistique des résultats, le cas échéant  
Discussion des résultats, notamment:  
— relations dose-réponse,  
— examen de toutes les informations concernant le mode d’action,  
— examen de toutes les approches de modélisation,  
— détermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet 
nocif observé),  
— données de contrôle historiques,  
— applicabilité des résultats à l’être humain.  
Conclusions  
BIBLIOGRAPHIE:  
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Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
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Paris.  
(8) Chapitre B.8 de la présente annexe, Toxicité subaiguë par inhalation: étude 
sur 28 jours.  
(9) Chapitre B.29 de la présente annexe, Toxicité subchronique par inhalation: 
étude sur 90 jours.  
(10) Chapitre B.9 de la présente annexe, Toxicité cutanée à doses répétées – 
étude sur 28 jours.  
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logy. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(27) Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
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(28) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for 
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Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
(29) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson 
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Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxi ­
col. Teratol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 454
 
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Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(31) EMEA (draft) document «Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
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(32) Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K.  et al.  (2004). Best Prac ­
tices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126-131.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 455
 
Appendice 1  
DÉFINITION  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 456
 
B.31.  ÉTUDE DE LA TOXICITÉ POUR LE DÉVELOPPEMENT 
PRÉNATAL  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est calquée sur la ligne directrice d'essai n  o 414 
(2001) de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode d'essai relative à la toxicité pour le développe ­
ment est destinée à livrer des informations générales concernant les 
effets d'une exposition prénatale sur la femelle gravide et sur l'orga ­
nisme en développement qu'elle porte en elle; cela recouvre notam ­
ment l'évaluation des effets sur la mère, ainsi que la mortalité fœtale, 
les anomalies structurelles ou les altérations de croissance du fœtus. 
Les déficits fonctionnels, qui représentent pourtant un aspect impor ­
tant du développement, ne sont pas étudiés dans le cadre de la présente méthode d'essai. Ces déficits peuvent être étudiés séparé ­
ment ou en complément à la présente méthode dans le cadre de la 
méthode d'essai relative à la neurotoxicité pour le développement. Cette dernière méthode ainsi que la méthode relative à la toxicité pour la reproduction sur deux générations indiquent comment 
dépister les déficits fonctionnels et d'autres effets postnataux.
 
Il est possible que la présente méthode d'essai nécessite certaines 
adaptations dans des cas particuliers, compte tenu, par exemple, des propriétés physico-chimiques ou toxicologiques spécifiques de la substance d'essai. Ces adaptations sont acceptables lorsque des 
données scientifiques convaincantes donnent à penser qu'elles 
rendront l'essai plus informant. Le cas échéant, ces données scienti ­
fiques devront être soigneusement consignées dans le rapport d'essai.
 
1.2 DÉFINITIONS  
Toxicologie du développement:  l'étude des effets nocifs sur un 
organisme en développement, qui peuvent résulter d'une exposition antérieure à la conception, contemporaine au développement prénatal ou postnatale, jusqu'à la maturation sexuelle. La toxicité pour le 
développement se manifeste principalement par 1) la mort de l'orga ­
nisme; 2) une anomalie structurelle; 3) une altération de croissance; 4) un déficit fonctionnel. Autrefois, la toxicologie du développement était souvent dénommée «tératologie».
 
Effet nocif:  toute altération liée au traitement par rapport à une 
situation de référence, qui diminue la capacité d'un organisme à 
survivre, se reproduire ou s'adapter à l'environnement. La toxicologie du développement, prise dans son sens le plus large, inclut tous les effets qui interfèrent avec le développement normal du produit de 
conception, avant et après la naissance.
 
Altération de croissance:  une altération qui touche les organes ou le 
poids corporel ou la taille de la progéniture.  
Altérations (anomalies):  altérations structurelles du développement 
qui comprennent les malformations et les variations (28).  
Malformation/Anomalie majeure:  changement structurel considéré 
comme préjudiciable à l'animal (peut aussi être létal) et générale ­
ment rare.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 457
 
Variation/Anomalie mineure:  changement structurel considéré 
comme peu ou pas préjudiciable à pour l'animal; peut être transitoire 
et peut survenir fréquemment dans la population témoin.  
Produit de conception:  l'ensemble des produits de la fécondation 
d'un œuf, à n'importe quel stade du développement entre la fécon ­
dation et la naissance, comprenant les membranes extra-embryon ­
naires et l'embryon ou le fœtus.  
Implantation (nidation):  la fixation du blastocyste à la muqueuse 
épithéliale de l'utérus, y compris la pénétration du blastocyste dans l'épithélium utérin et la nidation dans l'endomètre.
 
Embryon:  le premier stade de développement d'un organisme, plus 
précisément la phase de développement d'un œuf fécondé qui 
commence après l'apparition du grand axe et s'achève quand toutes 
les structures principales sont présentes.  
Embryotoxicité:  nocivité pour la structure, le développement, la 
croissance et/ou la viabilité d'un embryon.  
Fœtus:  produit de conception, durant la période post-embryonnaire.  
Fœtotoxicité:  nocivité pour la structure, le développement, la crois ­
sance et/ou la viabilité d'un fœtus.  
Avortement:  expulsion prématurée hors de l'utérus des produits de 
conception: embryon ou fœtus non viable.  
Résorption:  phénomène par lequel un produit de conception qui 
meurt après l'implantation se résorbe ou a été résorbé.  
Résorption précoce:  trace d'implantation non accompagnée d'un 
embryon ou d'un fœtus reconnaissable.  
Résorption tardive:  embryon ou fœtus mort qui présente des chan ­
gements dégénératifs externes.  
DSET:  dose sans effet toxique (correspond à la NOAEL: 
No Observed Adverse Effect Level)  
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Aucune  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Normalement, la substance d'essai est administrée aux femelles 
gravides, au moins à partir de la nidation et jusqu'à la veille du sacrifice, lequel devrait être programmé à une date aussi proche 
que possible du jour probable de mise bas, sans être trop tardif 
pour éviter la perte de données en cas de mise bas prématurée. La méthode d'essai ne porte pas uniquement sur la période de l'organo ­
genèse (comprise, par exemple entre le 5ème et le 15
 e jour chez les 
rongeurs et entre le 6  e et le 18  e jour chez le lapin), mais étudie aussi 
les effets survenus tout au long de la gestation, depuis le stade pré- implantatoire, selon les besoins, jusqu'à la veille de la césarienne. Les femelles sont sacrifiées peu avant la césarienne, le contenu utérin 
est examiné et les fœtus étudiés pour détecter les anomalies externes 
visibles ainsi que les modifications des tissus mous et du squelette.
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1.5. DESCRIPTION DE LÀ MÉTHODE D'ESSAI  
1.5.1.  Choix de l'espèce animale  
Il est recommandé de pratiquer l'essai sur l'espèce la plus appropriée 
et d'employer les espèces et les souches de laboratoire couramment 
utilisées dans les essais de toxicité prénatale pour le développement. 
L'espèce de rongeur préféré est le rat et l'espèce non-rongeur préféré est le lapin. Le cas échéant, l'emploi d'une autre espèce doit être justifié.
 
1.5.2.  Conditions d'encagement et d'alimentation  
L'animalerie doit être à 22  o C (± 3  o ) pour les rongeurs et à 18  o C (± 
3 o ) pour les lapins, avec un taux d'humidité relative d'au moins 30 % 
et de préférence inférieur à 70 % sauf durant le nettoyage de la salle, 
l'idéal se situant entre 50 et 60 %. On appliquera un éclairage arti ­
ficiel, avec un cycle de 12 heures de clarté et 12 heures d'obscurité. Un régime alimentaire classique pour animaux de laboratoire, avec eau potable à satiété, conviendra.
 
L'accouplement doit se dérouler dans des cages appropriées. Bien 
qu'il soit préférable de placer les animaux s'étant accouplés dans des 
cages individuelles, l'encagement par petits groupes est aussi accep ­
table.  
1.5.3  Préparation des animaux  
Il convient d'utiliser des animaux sains, acclimatés aux conditions du 
laboratoire pendant au moins 5 jours et n'ayant pas été soumis à 
d'autres essais. On indiquera l'espèce, la souche, la source, le sexe, 
le poids et/ou l'âge des animaux d'expérience. Les animaux de tous les groupes d'essai devraient, dans toute la mesure du possible, être du même âge et du même poids. On emploiera de jeunes femelles 
adultes et nullipares pour chaque dose. On accouplera les femelles 
avec des mâles de la même espèce et de la même souche, sans accoupler les membres d'une même fratrie. Dans le cas des rongeurs, le jour 0 de la gestation est celui où l'on observe un bouchon vaginal 
et/ou la présence de sperme; s'agissant des lapins, le jour 0 est 
ordinairement celui du coït ou de l'insémination artificielle si cette technique est utilisée. Les femelles accouplées seront réparties au 
hasard entre groupes traités et groupes témoins. On installera les 
cages de façon à réduire au minimum les éventuels effets liés à leur emplacement. Chaque animal sera désigné par un numéro d'identification propre. En cas d'accouplement par lots, les animaux 
d'un même lot seront répartis uniformément entre les groupes. De la 
même façon, les femelles inséminées par un même mâle seront réparties uniformément entre les groupes.
 
1.6 MODE OPÉRATOIRE  
1.6.1  Nombre et sexe des animaux  
Chaque groupe traité et témoin doit contenir un nombre de femelles 
suffisant pour qu'une autopsie puisse être pratiquée sur environ 20 femelles présentant un point d'implantation. Des groupes comptant moins de 16 femelles présentant un point d'implantation risquent 
d'être inadéquats. La mortalité maternelle n'invalide pas nécessaire ­
ment l'étude, tant qu'elle demeure inférieure à 10 pour cent environ.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 459
 
1.6.2  Préparation des doses  
Si on emploie un véhicule ou un autre additif pour faciliter l'adminis ­
tration des doses, il convient d'être attentif aux effets sur l'absorption, la distribution, le métabolisme et la rétention ou l'excrétion de la 
substance d'essai, aux effets sur les propriétés chimiques de la subs ­
tance d'essai, lesquels sont susceptibles de modifier sa toxicité ainsi qu'aux effets sur la consommation de nourriture ou d'eau et sur l'état nutritionnel des animaux. Le véhicule ne doit pas être toxique pour 
le développement ni influer sur la reproduction.
 
1.6.3  Dosage  
Normalement, la substance d'essai est administrée quotidiennement 
depuis la nidation (par exemple 5 jours après l'accouplement) jusqu'à 
la veille du jour où la césarienne est prévue. Si des études prélimi ­
naires, le cas échéant, ne font pas état d'un risque élevé de pertes pré-implantatoires, il est possible d'administrer le traitement pendant toute la durée de la gestation, depuis l'accouplement jusqu'à la veille 
de la césarienne. Nul n'ignore que le stress ou des erreurs de mani ­
pulation pendant la gestation peuvent engendrer des pertes préna ­
tales. Afin de prévenir des pertes fœtales non liées au traitement, on évitera de manipuler inutilement les femelles gravides ou de les 
soumettre à des facteurs de stress externes comme le bruit.
 
On utilise au moins trois doses différentes et un groupe témoin en 
parallèle. Des animaux sains sont répartis au hasard entre les groupes 
traités et témoins. Les doses doivent être espacées de façon à 
produire une gradation des effets toxiques. Sauf limitations imposées par les propriétés physiques, chimiques ou biologiques de la subs ­
tance d'essai, la dose la plus élevée devrait avoir une certaine toxicité 
pour le développement et/ou la mère (signes cliniques ou diminution 
du poids corporel), sans entraîner la mort ni provoquer des souf ­
frances importantes. Au moins une dose intermédiaire devrait donner lieu à la plus faible manifestation observable de toxicité. 
La dose la plus faible ne devrait produire aucun signe de toxicité 
pour la mère ou pour le développement. Il convient de choisir une série décroissante doses afin de mettre en évidence une éventuelle relation dose-effet et une concentration maximale sans effet nocif 
observé (DSET). L'écart optimal entre les doses d'une série décrois ­
sante est généralement d'un facteur deux ou quatre et l'adjonction d'un quatrième groupe d'essai est souvent préférable à la fixation d'écarts trop importants (par exemple, supérieurs à un facteur dix). 
Bien que le but soit d'établir une DSET maternelle, les études qui 
n'aboutissent pas à la détermination de cette valeur sont également acceptables (1).
 
Les doses doivent être choisies en tenant compte de toutes les 
données de toxicité disponibles ainsi que des informations complé ­
mentaires sur le métabolisme et la toxicocinétique de la substance d'essai ou de substances apparentées. Ces informations seront aussi 
utiles pour justifier l'échelle des doses.
 
On incorporera un groupe témoin en parallèle. La substance d'essai 
n'est pas administrée à ce groupe qui n'est traité que par le véhicule, 
le cas échéant. Tous les groupes doivent recevoir le même volume de 
substance d'essai ou de véhicule. Les animaux du ou des groupes témoins seront manipulés de la même façon que les animaux du groupe d'essai. Les groupes témoins auxquels on administre le véhi ­
cule doivent recevoir la plus grande quantité utilisée de ce dernier 
(celle que reçoit le groupe traité à la dose la plus faible).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 460
 
1.6.4  Essai limite  
Si un essai réalisé à une dose d'au moins 1 000 mg/kg de poids 
corporel/jour, administrée par voie orale, selon la méthode décrite dans cette étude, n'entraîne aucune toxicité apparente chez les 
femelles gravides ou dans leur progéniture, et qu'aucun effet n'est 
escompté au vu des données disponibles (concernant, par exemple, des composés présentant une structure et/ou une action métabolique analogues) il n'est pas indispensable de mener une étude complète 
sur trois doses différentes. Suivant le niveau d'exposition humaine 
prévu, il peut être nécessaire d'appliquer une dose orale plus élevée dans l'essai limite. Pour d'autres modes d'administration, tels que 
l'inhalation ou l'application cutanée, ce sont souvent les propriétés 
physicochimiques de la substance d'essai qui définissent et limitent le niveau maximal d'exposition pouvant être atteint (par exemple, l'ap ­
plication cutanée ne doit faire apparaître aucune toxicité locale 
grave).
 
1.6.5  Administration des doses  
La substance d'essai ou le véhicule sont habituellement administrés 
oralement par intubation. Si l'expérimentateur opte pour un autre 
mode d'administration, il devra motiver sa décision et justifier son 
choix, et procéder aux modifications nécessaires (2) (3) (4). La substance d'essai doit être administrée à peu près à la même heure chaque jour.
 
Normalement, on calcule la dose destinée à chaque animal d'après la 
pesée la plus récente de ce dernier. Il convient toutefois d'être 
prudent lorsqu'on adapte la dose au cours du dernier tiers de la 
gestation. On s'appuiera sur les données existantes pour sélectionner la dose de façon à prévenir un excès de toxicité pour la mère. Néanmoins, si on constate une toxicité excessive chez les mères 
traitées, il faudra les euthanasier. Si plusieurs femelles gravides 
manifestent des signes de toxicité excessive, on envisagera de sacri ­
fier le groupe traité à cette dose. Si on recourt au gavage, il faudrait de préférence administrer la substance en une seule fois à l'aide d'une 
sonde gastrique ou d'une canule appropriée. Le volume maximal de 
liquide administrable en une seule fois dépend de la taille de l'ani ­
mal. Ce volume ne devrait pas dépasser 1 ml/100 g de poids corpo ­
rel, sauf dans le cas des solutions aqueuses où l'on peut aller jusqu'à 
2 ml/100 g de poids corporel. Lorsqu'on utilise de l'huile de maïs 
comme véhicule, le volume ne devrait pas excéder 0,4 ml/100 g de poids corporel. On réduira au minimum la variabilité du volume d'essai en adaptant les concentrations de façon à obtenir un 
volume constant à toutes les doses.
 
1.6.6  Observation des mères  
Les observations cliniques sont effectuées et notées au moins une 
fois par jour, de préférence à la ou aux mêmes heures, en tenant 
compte de la période durant laquelle on prévoit que les effets attein ­
dront leur intensité maximale. On consignera l'état des animaux, notamment, les animaux morts ou moribonds, les changements comportementaux pertinents et tous les signes de toxicité apparents.
 
1.6.7  Poids corporel et consommation de nourriture  
Les animaux sont pesés au jour 0 de gestation ou au plus tard au 
jour 3 si des animaux déjà accouplés sont fournis par un éleveur extérieur, puis au premier jour de traitement et au moins tous les 
trois jours durant la période d'administration et enfin le jour du 
sacrifice.
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Le relevé de la consommation d'aliments doit être effectué tous les 
trois jours et coïncider avec les jours de pesée des animaux.  
1.6.8  Autopsie  
On sacrifiera les femelles un jour avant la date prévue de mise bas. 
Les femelles qui présentent des signes d'avortement ou de mise bas prématurée avant la date prévue du sacrifice doivent être sacrifiées et 
faire l'objet d'un examen macroscopique complet.
 
Juste après le sacrifice ou la mort en cours de l'étude, les mères sont 
soumises à un examen macroscopique destiné à mettre en évidence d'éventuels changements pathologiques ou anomalies structurelles. 
Pour demeurer objectif, il est préférable que l'expérimentateur 
ignore la dose administrée au groupe lors de l'observation des mères au cours de la césarienne et de l'examen subséquent des fœtus.
 
1.6.9  Examen du contenu utérin  
Il y a lieu d'enlever l'utérus juste après le sacrifice ou dès que 
possible après la mort pour s'assurer de l'état de gravidité des 
femelles. On examinera aussi les utérus apparemment non gravides (par exemple, par coloration au sulfure d'ammonium chez les rongeurs et par la coloration de Salewski ou par une méthode 
équivalente appropriée chez les lapins) pour confirmer la non-gravi ­
dité (5).
 
Les utérus gravides sont pesés, col inclus. Les poids des utérus 
gravides de femelles mortes en cours d'essai ne sont pas déterminés.  
On compte le nombre de corps jaunes chez les femelles gravides.  
Le contenu utérin est examiné afin de relever le nombre d'embryons 
ou de fœtus morts et le nombre de fœtus viables. Il est nécessaire de 
décrire le degré de résorption pour évaluer la date approximative de la mort du produit de conception (voir paragraphe 1.2).
 
1.6.10  Examen des fœtus  
Il convient de déterminer le sexe et le poids corporel de chaque 
fœtus.  
On recherche la présence d'altérations externes sur chaque fœtus.  
On examine les fœtus pour voir s'ils présentent des altérations du 
squelette ou des tissus mous (par exemple des variations et des malformations ou des anomalies) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). La catégori ­
sation des altérations fœtales est préférable, mais facultative. Si on 
procède à une catégorisation, il faut stipuler clairement les critères qui définissent chaque catégorie. On vérifiera avec une attention particulière si le développement du tractus génital n'a pas été altéré.
 
Pour les rongeurs, on prépare environ la moitié de chaque portée en 
vue de l'examen des altérations squelettiques. Le restant sera préparé en vue de l'examen des altérations des tissus mous, lequel sera conduit au moyen de coupes sériées réalisées suivant des méthodes 
reconnues ou appropriées ou de techniques soignées de dissection 
macroscopique.
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S'agissant des non-rongeurs, par exemple les lapins, les éventuelles 
altérations des tissus mous et du squelette doivent être recherchées 
sur tous les fœtus. On examine les corps de ces fœtus en les disséquant soigneusement pour repérer des altérations des tissus mous; cette opération peut faire appel à une technique permettant 
d'effectuer un examen plus approfondi de la structure cardiaque 
interne (25). Les tètes de la moitié des fœtus examinés de cette manière doivent être prélevées et préparées en vue de l'évaluation des altérations des tissus mous (notamment les yeux, le cerveau, les 
conduits nasaux et la langue), selon des techniques classiques de 
coupes sériées (26) ou une méthode ayant la même sensibilité. Les corps de ces fœtus et ceux des fœtus intacts restants sont préparés puis examinés pour établir s'ils présentent des altérations squelet ­
tiques, à l'aide des mêmes méthodes que pour les rongeurs.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les résultats sont consignés séparément pour chaque femelle et sa 
progéniture, et résumés sous forme de tableaux, reprenant pour chaque groupe d'essai et chaque génération, le nombre d'animaux 
présents au début de l'essai, le nombre d'animaux morts durant 
l'essai ou euthanasiés, la date de chaque mort ou euthanasie, le nombre de femelles gravides, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité, la description des signes de toxicité observés, 
notamment le moment où ils ont débuté, leur durée et leur gravité, 
les types d'observations pratiquées sur les embryons ou fœtus et toutes les données pertinentes sur la portée.
 
On évaluera les résultats numériques par une méthode statistique 
appropriée, en prenant la portée comme unité pour l'analyse des 
résultats. Il convient d'utiliser une méthode statistique reconnue; le choix de la méthode doit intervenir au stade de la conception de l'étude et doit être justifié. Les résultats concernant les animaux qui 
n'ont pas survécu jusqu'à la date programmée du sacrifice doivent 
aussi être consignés. Ces résultats peuvent être inclus dans les moyennes des groupes, s'il y a lieu. La pertinence des résultats obtenus pour ces animaux et partant, la décision de les inclure ou 
non dans une moyenne de groupe, doit être appréciée au cas par cas.
 
2.2. ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Les résultats de l'étude de toxicité pour le développement prénatal 
doivent être évalués du point de vue des effets observés. L'évaluation doit comprendre les informations suivantes:
 
— les résultats des essais maternels et fœtaux, incluant une évalua ­
tion de la relation, ou de l'absence de relation, entre l'exposition des animaux à la substance d'essai et la fréquence et la gravité de tous les effets observés,
 
— les critères appliqués pour catégoriser, le cas échéant, les altéra ­
tions externes des fœtus, et les altérations de leurs tissus mous ou 
de leur squelette,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 463
 
— selon les besoins, les données antérieures relatives aux témoins 
pour affiner l'interprétation des résultats de l'étude,  
— les nombres utilisés pour calculer tous les pourcentages ou 
indices,  
— l'analyse statistique appropriée des résultats de l'étude; il convient 
de fournir suffisamment d'informations sur la méthode d'analyse, 
pour qu'un réviseur ou un statisticien indépendant puisse rééva ­
luer et reconstruire l'analyse.  
Pour toute étude ne révélant aucun effet toxique, il y a lieu d'en ­
visager des expériences complémentaires destinées à déterminer l'ab ­
sorption et la biodisponibilité de la substance d'essai.  
2.3. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Une étude de la toxicité pour le développement prénatal fournit des 
informations sur les effets de l'exposition répétée à une substance administrée durant la gestation sur les mères et sur le développement 
intra-utérin de leur progéniture. Les résultats de cette étude doivent 
être interprétés à la lumière de ceux des études de toxicité subchro ­
nique, de reproduction, des études toxicocinétiques et autres. Comme l'étude est centrée à la fois sur la toxicité générale du point de vue de 
la mère et sur la toxicité pour le développement, ses résultats permet ­
tront dans une certaine mesure de distinguer les effets sur le déve ­
loppement qui surviennent en l'absence d'une toxicité générale, des effets qui n'apparaissent qu'à des doses qui sont également toxiques 
pour la mère (27).
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit inclure les informations particulières énumé ­
rées ci-dessous:  
Substance d'essai:  
— état physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques,  
— identification, y compris le numéro du CAS s'il est connu,  
— pureté.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix du véhicule s'il diffère de l'eau.  
Animaux d'expérience:  
— espèce et souche utilisée,  
— nombre et sexe des animaux,  
— origine, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'essai.  
Conditions d'essai:  
— justification du choix des doses appliquées,  
— détails concernant la préparation de la substance d'essai ou son 
incorporation aux aliments, la concentration obtenue, la stabilité 
et l'homogénéité de la préparation,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 464
 
— détails sur l'administration de la substance d'essai,  
— conversion de la concentration de la substance d'essai (ppm) dans 
la nourriture ou l'eau de boisson en dose administrée (mg/kg de poids corporel/jour), s'il y a lieu,
 
— conditions ambiantes,  
— détails concernant la qualité de l'alimentation et de l'eau de bois ­
son. 
Résultats:  
Données relatives à la toxicité pour la mère en fonction des doses, 
précisant entre autres:  
— le nombre d'animaux au début de l'essai, le nombre de 
survivants, le nombre de femelles gravides, le nombre d'avorte ­
ments et de mises bas prématurées,  
— le jour de la mort si celle-ci est intervenue en cours d'essai et le 
nombre des animaux ayant survécu jusqu'au jour du sacrifice,  
— les résultats concernant les animaux qui n'ont pas survécu jusqu'à 
la date du sacrifice doivent être consignés, mais non inclus dans 
les comparaisons statistiques entre les groupes,  
— le jour de l'observation de chaque signe clinique anormal et son 
évolution ultérieure,  
— le poids corporel, sa variation et le poids de l'utérus gravide, y 
compris, si on le souhaite, la variation du poids corporel corrigée 
en fonction du poids de l'utérus gravide,  
— la consommation de nourriture, et d'eau si elle a été mesurée,  
— les résultats de l'autopsie, y compris le poids de l'utérus,  
— les valeurs de la DSET se rapportant aux effets sur la mère et sur 
le développement.  
Données concernant les effets sur le développement en fonction des 
doses, pour les portées attestées par des implantations, notamment:  
— nombre de corps jaunes,  
— nombre d'implantations, nombre et pourcentage de fœtus vivants 
et morts et nombre de résorptions,  
— nombre et pourcentage de pertes pré- et postimplantatoires.  
Données concernant les effets sur le développement en fonction des 
doses, pour les portées comportant des fœtus vivants, notamment:  
— nombre et pourcentage de descendants vivants,  
— proportion de mâles et de femelles,  
— poids corporel des fœtus, de préférence par sexe et pour les deux 
sexes confondus;  
— malformations externes, des tissus mous et du squelette et autres 
altérations pertinentes,  
— critères de catégorisation, le cas échéant,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 465
 
— nombre total et pourcentage de fœtus et de portées présentant une 
quelconque altération externe, des tissus mous ou du squelette; 
types et fréquence des différentes anomalies et autres altérations pertinentes.
 
Discussion  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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B.32.  ÉTUDES DE CANCÉROGENÈSE  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 451 (2009) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La ligne directrice 451 initiale sur les études de cancérogenèse a été adoptée en 1981. Sa révision a 
été jugée nécessaire afin de tenir compte des évolutions récentes dans le 
domaine du bien-être animal, ainsi que des nouvelles exigences réglemen ­
taires (2) (3) (4) (5) (6). La mise à jour de la présente méthode d’essai B.32 a été effectuée en parallèle avec la révision des chapitres B.30 (études de 
toxicité chronique) et B.33 (études combinées de toxicité chronique et de 
cancérogenèse) de la présente annexe, dans le but d’obtenir des informations additionnelles à partir des animaux utilisés dans l’étude, et de fournir des précisions concernant le choix des doses. La présente méthode d’essai B.32 
vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des 
pesticides et des produits chimiques industriels. Il convient toutefois de noter que certains aspects et certaines dispositions peuvent différer pour les produits pharmaceutiques (voir la Conférence internationale sur l’harmo ­
nisation, thème S1B: évaluation de la cancérogénicité des produits pharma ­
ceutiques).
 
2. La plupart des études de cancérogenèse étant menées sur des espèces de 
rongeurs, la présente méthode d’essai est destinée à s’appliquer principale ­
ment à des études réalisées avec ces espèces. S’il s’avérait nécessaire de mener de telles études avec des non-rongeurs, il conviendrait d’appliquer, moyennant des modifications appropriées, les principes et procédures décrits 
dans la présente méthode d’essai et au chapitre B.27 – Toxicité orale à 
doses répétées – non-rongeurs: 90 jours – de la présente annexe (6). Des informations complémentaires peuvent aussi être trouvées dans le document d’orientation de l’OCDE n
 o 116 sur l’élaboration et la conduite des études 
de toxicité chronique et de cancérogenèse (7).  
3. Les trois principales voies d’administration utilisées dans les études de 
cancérogenèse sont la voie orale, la voie cutanée et l’inhalation. Le choix 
de la voie d’administration dépend des caractéristiques physiques et chimiques de la substance d’essai et de la voie d’exposition prédominante chez l’homme. Des informations complémentaires sur le choix de la voie 
d’exposition sont fournies dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
4. La présente méthode d’essai porte principalement sur l’exposition par voie 
orale, la voie la plus communément utilisée dans les études de cancéroge ­
nèse. Bien que des études de cancérogenèse utilisant l’exposition par voie 
cutanée ou par inhalation puissent aussi être nécessaires pour évaluer le risque pour la santé humaine et/ou exigées en vertu de certains régimes réglementaires, ces deux voies d’exposition nécessitent des dispositifs tech ­
niques d’une grande complexité. De telles études devront être conçues au 
cas par cas, encore que la présente méthode d’essai, qui porte sur la carac ­
térisation et l’évaluation de la cancérogénicité par voie orale, puisse fournir les bases d’un protocole d’étude par voie cutanée ou par inhalation, notam ­
ment en ce qui concerne les recommandations relatives aux durées de trai ­
tement, aux paramètres cliniques et pathologiques, etc. Il existe des docu ­
ments d’orientation de l’OCDE sur l’administration expérimentale de subs ­
tances d’essai par voie cutanée (7) et par inhalation (7) (8). Les chapitres 
B.8 (9) et B.29 (10) de la présente annexe, ainsi que le document d’orien ­
tation de l’OCDE sur l’essai de toxicité aiguë par inhalation (8), méritent tout particulièrement d’être consultés lors de la conception d’études à long terme portant sur une exposition par inhalation. Le chapitre B.9 de la 
présente annexe (11) doit être consulté dans le cas d’un essai portant sur 
la voie cutanée.
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5. L’étude de cancérogenèse donne des éléments d’information sur les risques 
pour la santé susceptibles de découler d’une exposition répétée pendant une 
période pouvant couvrir la vie entière de l’espèce considérée. L’étude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance d’essai, y compris sur son pouvoir cancérogène, et peut indiquer les organes cibles et 
la possibilité d’accumulation dans ces organes. Elle peut aussi donner une 
estimation de la dose sans effet nocif observé pour ce qui est des effets toxiques et, dans le cas des substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Cette estimation permet d’établir les critères de sécurité 
concernant l’exposition humaine. De plus, il convient d’accorder une atten ­
tion particulière à l’observation clinique des animaux afin d’obtenir le plus d’informations possibles.
 
6. Les objectifs des études de cancérogenèse couvertes par la présente méthode 
d’essai sont les suivants:  
— identification des propriétés cancérogènes d’une substance d’essai 
susceptibles d’augmenter les risques de néoplasmes, la fréquence de 
survenue de néoplasmes malins ou la diminution du temps nécessaire 
à leur apparition, par rapport aux groupes témoins concurrents,  
— identification d’un ou de plusieurs organes cibles de la cancérogenèse,  
— identification du temps d’apparition des néoplasmes,  
— caractérisation de la relation entre la dose administrée et la réponse 
tumorale,  
— identification du niveau de dose sans effet nocif observé (DSENO) ou 
du point de départ pour l’établissement d’une dose de référence (DR),  
— extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine 
correspondant à de faibles doses,  
— obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le 
mode d’action (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
7. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle d’un produit 
chimique, le laboratoire chargé de l’étude prend en compte toutes les infor ­
mations disponibles sur la substance d’essai avant de réaliser l’étude, afin de 
pouvoir orienter celle-ci de manière à tester plus efficacement le potentiel cancérogène de la substance, et faire le moins possible appel aux animaux. La connaissance du mode d’action d’un agent cancérogène suspecté et sa 
prise en compte (2) (7) (12) (13) (14) (15) sont particulièrement importantes 
puisque la conception optimale de l’essai peut différer selon que la subs ­
tance d’essai est ou n’est pas un agent cancérogène génotoxique connu ou 
suspecté. Des informations complémentaires sur certains aspects du mode 
d’action peuvent être trouvées dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
8. Les informations utiles pour concevoir l’étude sont notamment: l’identité, la 
structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la substance d’es ­
sai; les résultats de toutes les études de toxicité in vitro ou in vivo menées et notamment des essais de génotoxicité; l’utilisation (les utilisations) prévue(s) 
et le potentiel d’exposition humaine; les données (Q)SAR disponibles et les 
données toxicologiques (par exemple mutagénicité, génotoxicité et pouvoir cancérogène) relatives aux substances chimiques structurellement apparen ­
tées; les données toxicocinétiques disponibles (dose unique et doses répé ­
tées, si ces données existent) et les résultats d’autres études à doses répétées. 
La caractérisation du pouvoir cancérogène est effectuée après obtention des
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premiers résultats d’essais de toxicité à doses répétées menés sur 28 jours 
et/ou 90 jours. Les essais d’initiation-promotion de cancers à court terme 
peuvent aussi livrer des informations utiles. Il convient d’envisager l’adop ­
tion d’une approche par étapes pour l’étude expérimentale de la cancéroge ­
nèse entreprise dans le cadre de l’évaluation globale des effets nocifs poten ­
tiels d’une substance d’essai (16) (17) (18) (19).  
9. Les méthodes statistiques les plus appropriées pour l’analyse des résultats, 
compte tenu du plan expérimental et des objectifs de l’étude, sont identifiées avant le début de l’étude. Il convient notamment de déterminer si les statis ­
tiques doivent prendre en compte l’ajustement en fonction de la survie, 
l’analyse des risques de tumeurs cumulées liés à la durée de survie, l’ana ­
lyse du temps nécessaire à l’apparition d’une tumeur et l’analyse effectuée en cas de mort prématurée des animaux d’un ou de plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant les analyses statistiques appropriées, 
ainsi que des références clés à des méthodes statistiques reconnues au 
plan international, dans le document d’orientation n
 o 116 (7), ainsi que 
dans le document d’orientation n  o 35 sur l’analyse et l’évaluation des 
études de toxicité chronique et de cancérogenèse (20).  
10. Lors de la réalisation d’une étude de cancérogenèse, il est recommandé de 
toujours suivre les principes et considérations énoncés dans le document 
d’orientation n  o 19 de l’OCDE sur la reconnaissance, l’évaluation et l’uti ­
lisation des signes cliniques comme effets observés éthiquement acceptables dans les expérimentations animales menées à des fins d’évaluation de la 
sécurité (21). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier, stipule ce qui 
suit: « Dans les études comportant l’administration de doses répétées, 
lorsqu’un animal présente des signes cliniques progressifs de détérioration de son état, une décision d’euthanasier ou non l’animal est prise en 
connaissance de cause. Cette décision met en balance des facteurs tels 
que la valeur des informations pouvant être obtenues en maintenant l’animal dans l’étude d’une part, et l’état général de celui-ci d’autre 
part. Si la décision est prise de poursuivre l’essai sur cet animal, la 
fréquence des observations est augmentée selon les besoins. Il est aussi possible, sans toutefois nuire à l’objectif de l’essai, d’interrompre l’adminis ­
tration de la substance d’essai pour soulager la douleur ou la détresse de 
l’animal, ou de réduire la dose testée. »
 
11. On trouvera des informations détaillées et une discussion sur les principes 
déterminant le choix des doses pour les études de toxicité chronique et de cancérogenèse dans le document d’orientation n
 o 116 (7), ainsi que dans 
deux publications de l’Institut international des sciences de la vie (22) (23). 
La stratégie de base pour le choix des doses dépend du ou des principaux 
objectifs de l’étude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de doses appropriés, il convient de trouver un équilibre entre, d’une part, l’identifi ­
cation des dangers et, d’autre part, la caractérisation des réponses aux faibles 
doses et leur pertinence. Cet équilibre est particulièrement nécessaire dans le 
cas où une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse (cha ­
pitre B.33 de la présente annexe) est menée (paragraphe 12).
 
12. Il convient d’examiner l’opportunité de réaliser une étude combinée de 
toxicité chronique et de cancérogenèse (chapitre B.33 de la présente 
annexe) plutôt que de réaliser séparément une étude de toxicité chronique 
(chapitre B.30 de la présente annexe) et une étude de cancérogenèse (la présente méthode d’essai B.32). L’essai combiné permet une meilleure effi ­
cacité en temps et en coûts par rapport à la conduite de deux essais séparés, 
et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la 
phase de cancérogenèse. Lors de la réalisation d’une étude combinée (cha ­
pitre B.33 de la présente annexe), il convient toutefois de respecter les principes déterminant le choix de la dose (paragraphes 11 et 22 à 25) et 
il est également reconnu que certains cadres réglementaires peuvent imposer 
la conduite d’études séparées.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 470
 
13. Les définitions utilisées dans le contexte de la présente méthode d’essai 
figurent à la fin du présent chapitre et dans le document d’orientation 
n o 116 (7).  
PRINCIPE DE L’ESSAI  
14. La substance d’essai est administrée quotidiennement à différents groupes 
d’animaux, pendant la plus grande partie de leur vie, à des doses progres ­
sives et habituellement par la voie orale. Les essais par inhalation ou par la voie cutanée peuvent aussi être appropriés. Les animaux sont observés 
attentivement pendant la période d’administration afin de déceler d’éventuels 
signes de toxicité et le développement de lésions néoplasiques. Les animaux qui meurent ou sont sacrifiés en cours d’essai sont autopsiés et, au terme de l’essai, les animaux survivants sont sacrifiés et autopsiés.
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Choix des espèces animales  
15. La présente méthode d’essai traite principalement de la caractérisation et de 
l’évaluation de la cancérogénicité chez les rongeurs (paragraphe 2). Le 
recours à des espèces autres que des rongeurs peut être envisagé si les 
données disponibles laissent escompter une meilleure prédiction des effets de la substance sur la santé humaine. Dans ce cas, le choix de l’espèce est justifié. L’espèce de rongeur préférée est le rat, mais d’autres rongeurs 
comme la souris peuvent être utilisés. Bien que le recours à la souris 
dans les études de cancérogenèse puisse ne présenter qu’un intérêt limité (24) (25) (26), certains programmes réglementaires actuels exigent tout de même la conduite d’essais de cancérogenèse sur la souris, sauf lorsqu’il est 
établi qu’une telle étude n’est pas nécessaire sur le plan scientifique. Les rats 
et les souris sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l’induc ­
tion de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. 
Ces caractéristiques permettent d’obtenir une grande quantité d’informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des informations addi ­
tionnelles sur le choix des espèces et des souches sont disponibles dans le 
document d’orientation n
 o 116 (7).  
16. Il convient d’employer des animaux adultes sains, de souches communé ­
ment utilisées dans les laboratoires. L’étude de cancérogenèse sera effectuée de préférence sur des animaux de même souche et de même provenance que 
ceux utilisés dans l’étude (les études) de toxicité préliminaire(s) de plus 
courte durée. Si toutefois ces animaux sont réputés ne pas répondre aux critères de survie généralement admis dans les études à long terme [voir le document d’orientation n
 o 116 (7)], il convient d’envisager d’utiliser une 
souche d’un animal dont le taux de survie permette de réaliser une étude à 
long terme. Les femelles sont nullipares et non gravides.  
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
17. Les animaux peuvent être logés individuellement ou réunis dans des cages 
en petits groupes du même sexe, l’hébergement individuel n’étant à envi ­
sager que dans des cas scientifiquement justifiés (27) (28) (29). Les cages sont placées de façon telle que l’influence éventuelle de leur disposition sur 
les résultats de l’étude soit réduite au minimum. La température du local des 
animaux d’expérience est de 22 °C (± 3 °C). L’humidité relative est d’au moins 30 % et n’excède pas de préférence 70 % en dehors des moments où le local est nettoyé, l’idéal étant qu’elle soit comprise entre 50 et 60 %. 
L’éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obs ­
curité. Le régime alimentaire peut être un régime classique de laboratoire
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avec eau potable à satiété. Il satisfait tous les besoins nutritionnels de l’es ­
pèce étudiée, et la teneur en contaminants alimentaires susceptibles d’influer 
sur les résultats de l’essai (résidus de pesticides, polluants organiques persis ­
tants, phyto-œstrogènes, métaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des données analytiques sur les teneurs en nutri ­
ments et en contaminants alimentaires sont recueillies régulièrement, au 
moins au début de l’étude et lors des changements de lots; ces données figurent dans le rapport final. Des données analytiques sur l’eau de boisson utilisée lors de l’étude sont de même fournies. Le choix du régime alimen ­
taire peut être influencé par la nécessité d’assurer un mélange convenable de 
la substance d’essai et de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux lorsque la substance d’essai est administrée dans la nourriture.
 
Préparation des animaux  
18. Il convient d’utiliser des animaux sains, acclimatés aux conditions de labo ­
ratoire depuis au moins 7 jours et n’ayant jamais été soumis auparavant à 
des protocoles expérimentaux. Dans le cas des rongeurs, l’administration de la substance commence dès que possible après le sevrage et l’acclimatation, et de préférence avant l’âge de 8 semaines. L’espèce, la souche, la prove ­
nance, le sexe, le poids et l’âge des animaux d’expérience sont précisés. Au 
début de l’étude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale et n’excède pas ± 20 % du poids moyen de tous les animaux étudiés, et ce pour chaque sexe séparément. Les animaux sont affectés de 
manière aléatoire aux différents groupes (témoins et traités). Après la rando ­
misation, les poids moyens des groupes de chaque sexe ne présentent pas de différences significatives. En cas de différences statistiquement significa ­
tives, la phase de randomisation est répétée dans la mesure du possible. 
Chaque animal reçoit un numéro d’identification unique et en est marqué 
de manière permanente par tatouage, implant de micropuce ou toute autre méthode appropriée.
 
PROTOCOLE  
Nombre et sexe des animaux  
19. Il convient d’utiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant 
pour permettre une évaluation biologique et statistique complète. Chaque 
groupe de dose, de même que chaque groupe témoin correspondant, comprend au moins 50 animaux de chaque sexe. Selon le but de l’étude, il est possible d’augmenter la puissance statistique des principales estima ­
tions en répartissant les animaux de manière différenciée entre les groupes 
de doses, avec plus de 50 animaux dans les groupes à faibles doses pour estimer par exemple la cancérogénicité aux faibles doses. Il convient toute ­
fois de noter qu’une augmentation modérée de la taille d’un groupe entraî ­
nera une augmentation relativement faible de la puissance statistique de 
l’étude. On trouvera des données complémentaires sur la conception statis ­
tique de l’étude, et sur le choix de niveaux de doses permettant d’optimiser la puissance statistique, dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
Sacrifices en cours d’étude et groupes satellites (sentinelles)  
20. L’étude peut prévoir le sacrifice d’animaux en cours d’étude, par exemple à 
12 mois, afin de recueillir des données sur la progression des altérations néoplasiques et des données mécanistiques, si cela est scientifiquement justifié. Si l’on dispose déjà de ces données, obtenues antérieurement lors 
d’études de toxicité à doses répétées sur la substance d’essai, les sacrifices 
en cours d’étude peuvent ne pas être scientifiquement justifiés. S’ils sont néanmoins inclus dans l’étude, les groupes d’animaux traités destinés à être sacrifiés en cours d’étude comptent normalement 10 animaux de chaque 
sexe, et le nombre total d’animaux utilisés dans l’étude est augmenté du 
nombre d’animaux que l’on prévoit de sacrifier avant l’achèvement de l’étude. Un groupe supplémentaire d’animaux sentinelles (généralement 5 animaux de chaque sexe) peut être inclus si nécessaire pour le suivi de l’état 
pathologique au cours de l’étude (30). Des informations complémentaires 
figurent dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 472
 
Groupes de dose et dosage  
21. Le document d’orientation n  o 116 (7) donne des indications sur tous les 
aspects du choix des doses et des écarts entre les doses. Il convient d’utiliser au moins trois doses et un groupe témoin. Les niveaux de doses seront 
généralement basés sur les résultats d’études à plus court terme à doses 
répétées, ou d’études préliminaires de détermination des concentrations, et prennent en compte toutes les données toxicologiques et toxicocinétiques existantes relatives à la substance d’essai ou aux substances chimiques 
apparentées.
 
22. À moins de contraintes dues à la nature physico-chimique ou aux effets 
biologiques de la substance d’essai, le niveau de dose le plus élevé est 
choisi de manière à permettre d’identifier les principaux organes cibles et les effets toxiques de la substance tout en évitant la souffrance, une toxicité sévère ou une forte morbidité ou létalité chez les animaux testés. Compte 
tenu des facteurs mentionnés au paragraphe 23 ci-dessous, la plus forte dose 
est normalement choisie pour provoquer une manifestation de toxicité, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (d’environ 10 %). Toutefois, en fonction des objectifs de l’étude (voir paragraphe 6), on pourra 
choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des 
signes de toxicité, par exemple une dose entraînant un effet négatif préoc ­
cupant mais dont l’impact sur l’espérance de vie ou le poids corporel reste faible.
 
23. Les niveaux de doses et les intervalles entre les doses peuvent être choisis 
de manière à pouvoir établir une relation dose-réponse et, selon le mode 
d’action de la substance d’essai, une DSENO ou tout autre résultat escompté 
de l’étude, notamment une DR (voir paragraphe 25) au plus bas niveau de dose. Les facteurs à prendre en compte dans le choix des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-réponse, les doses qui 
provoquent des changements métaboliques importants ou qui modifient 
notablement le mode d’action toxique, le niveau auquel on peut prévoir un seuil, ou celui auquel on peut prévoir de fixer un point de départ pour une extrapolation aux faibles doses.
 
24. Les intervalles entre les doses dépendront des caractéristiques de la subs ­
tance d’essai, et ne peuvent donc pas être prescrits dans la présente méthode 
d’essai, mais des intervalles correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent 
les plus appropriés entre les doses décroissantes, et l’inclusion d’un quatrième groupe d’essai est souvent préférable à la fixation de très grands intervalles (correspondant par exemple à un facteur de plus de 6 à 
10) entre les doses. En général, les facteurs supérieurs à 10 sont évités, et 
leur utilisation est justifiée.
 
25. Comme le précise le document d’orientation n  o 116 (7), les facteurs à 
prendre en compte dans le choix des doses sont notamment les suivants:  
— non-linéarités ou points d’inflexion connus ou supposés de la courbe 
dose-réponse,  
— toxicocinétique et gammes de doses auxquelles l’induction métabolique, 
la saturation ou la non-linéarité entre les doses internes et externes 
surviennent ou non,  
— lésions précurseurs, marqueurs d’effets ou indicateurs du déroulement de 
processus biologiques clés sous-jacents,  
— aspects principaux (ou présumés) du mode d’action, par exemple doses 
auxquelles une cytotoxicité commence à se manifester, les dosages 
hormonaux sont modifiés, les mécanismes homéostatiques sont dépassés, 
etc., ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 473
 
— régions de la courbe dose-réponse nécessitant une estimation particuliè ­
rement précise, par exemple dans le domaine de la DR prévue ou d’un 
seuil présumé,  
— prise en compte des niveaux prévus d’exposition humaine.  
26. Le groupe témoin sera un groupe non traité ou un groupe recevant le 
véhicule si la substance est administrée dans un véhicule. Exception faite 
de l’administration de la substance d’essai, les animaux du groupe sont traités de la même manière que ceux des groupes d’essai. Si un véhicule est employé, on administrera au groupe témoin le plus grand volume de 
véhicule utilisé pour les groupes traités. Si la substance d’essai est incor ­
porée aux aliments et entraîne une diminution sensible de la prise de nour ­
riture liée à une moindre appétence de celle-ci, il pourra être utile d’utiliser 
un groupe témoin supplémentaire nourri en parallèle, qui constituerait un 
témoin plus approprié.
 
Préparation des doses et administration de la substance d’essai  
27. La substance d’essai est normalement administrée par voie orale, soit dans la 
nourriture ou l’eau de boisson, soit par gavage. Des informations complé ­
mentaires sur les voies et méthodes d’administration figurent dans le docu ­
ment d’orientation n  o 116 (7). La voie et le mode d’administration dépen ­
dent de la finalité de l’étude, des propriétés physico-chimiques de la subs ­
tance d’essai, de sa biodisponibilité ainsi que de la voie et du mode prédo ­
minants d’exposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et 
du mode d’administration. Dans l’intérêt des animaux, le gavage oral n’est 
normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie et ce mode d’administration correspondent à une voie d’exposition potentielle raisonnable chez l’homme (produits pharmaceutiques, par exemple). Dans 
le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux, notamment 
les pesticides, l’administration se fait d’ordinaire via le régime alimentaire ou l’eau de boisson. Toutefois, dans certains contextes, tels que l’exposition professionnelle, l’administration par d’autres voies peut être plus appropriée.
 
28. Si nécessaire, la substance d’essai est dissoute ou mise en suspension dans 
un véhicule approprié. Il convient de prendre en compte les caractéristiques suivantes du véhicule et des autres additifs, s’il y a lieu: effets sur l’absorp ­
tion, la répartition, le métabolisme ou la rétention de la substance d’essai; 
effets sur les propriétés chimiques de la substance d’essai susceptibles de modifier sa toxicité; et effets sur la consommation d’aliments ou d’eau, ou sur l’état nutritionnel des animaux. Il est recommandé, dans la mesure du 
possible, d’envisager en premier lieu une solution ou une suspension 
aqueuse, puis celle d’une solution ou d’une émulsion dans une huile (par exemple huile de maïs), et en dernier lieu celle d’une solution dans d’autres véhicules. Les caractéristiques de toxicité des véhicules autres que l’eau sont 
connues. Il convient de disposer de données sur la stabilité de la substance 
d’essai et sur l’homogénéité des solutions ou rations contenant les diffé ­
rentes doses (selon les cas) dans les conditions d’administration (nourriture, par exemple).
 
29. Il importe de veiller à ce que les quantités de substances administrées dans 
les aliments ou l’eau de boisson n’interfèrent pas avec la nutrition ou l’équilibre hydrique. Dans les études de toxicité à long terme faisant inter ­
venir une administration par voie alimentaire, la concentration de la subs ­
tance d’essai dans les aliments ne dépasse pas normalement 5 % de la ration 
totale, afin d’éviter les déséquilibres nutritionnels. Si la substance d’essai est incorporée à la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg d’aliment ou ppm) soit un niveau de dose constant par 
rapport au poids corporel de l’animal (mg/kg de poids corporel), calculé sur 
une base hebdomadaire. La solution choisie est spécifiée.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 474
 
30. En cas d’administration par voie orale, les animaux reçoivent une dose 
quotidienne de la substance d’essai (à raison de 7 jours par semaine) et 
ce normalement pendant une période de 24 mois pour les rongeurs (voir aussi le paragraphe 32). Tout autre régime de dosage, par exemple une administration 5 jours par semaine, fait l’objet d’une justification. En cas 
d’administration par voie cutanée, les animaux reçoivent normalement le 
traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le spécifie le chapitre B.9 de la présente annexe (11), et ce pendant une période de 24 mois. L’exposition par inhalation est réalisée 
pendant 6 heures par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela 
se justifie, de limiter l’exposition à 5 jours par semaine. La période d’ex ­
position est normalement de 24 mois. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées «nez seul», il est possible d’ajuster la durée maximale 
d’exposition en fonction du stress propre à ces espèces. Le choix d’une 
durée d’exposition inférieure à 6 heures par jour devra être justifié. Voir aussi à ce sujet le chapitre B.8 de la présente annexe (9).
 
31. Lorsque la substance d’essai est administrée aux animaux par gavage, l’opé ­
ration est pratiquée aux mêmes moments de la journée au moyen d’une sonde gastrique ou d’une canule d’intubation appropriée. Normalement, une dose unique sera administrée une fois par jour mais lorsque, par exem ­
ple, la substance chimique est un irritant local, il pourra être envisagé de 
maintenir la dose journalière en la fractionnant (deux fois par jour). Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend 
de la taille de l’animal d’expérience. Le volume est maintenu aussi faible 
que possible et n’excède pas normalement 1 ml/100 g de poids corporel pour les rongeurs (31). Il convient de minimiser la variabilité du volume testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant à tous les 
niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes 
sont l’exception et leur dilution permettra d’éviter tout effet local sévère. L’essai n’est donc pas mené à des concentrations susceptibles d’être corro ­
sives ou irritantes pour le tube digestif.
 
Durée de l’étude  
32. La durée de l’étude sera normalement de 24 mois pour les rongeurs, ce qui 
correspond à la majeure partie de la durée de vie normale des animaux utilisés. Elle pourra être allongée ou raccourcie selon la durée de vie de la souche de l’espèce animale utilisée, mais cette décision fait l’objet d’une 
justification. Pour certaines souches particulières de souris, par exemple 
AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J, une durée de 18 mois peut être plus appro ­
priée. On trouvera ci-après des informations sur la durée, la clôture de l’étude et la survie; d’autres considérations, relatives notamment à l’accep ­
tabilité d’une étude de cancérogenèse estimée négative du fait de la survie 
des animaux, figurent dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
— La clôture de l’étude est envisagée lorsque le nombre de survivants des 
groupes soumis aux plus faibles doses ou du groupe témoin tombe en dessous de 25 pour cent.
 
— La clôture de l’étude n’est pas déclenchée par la mort prématurée des 
animaux du seul groupe ayant reçu la dose la plus élevée.  
— La survie des animaux est prise en considération séparément pour 
chaque sexe.  
— L’étude n’est pas prolongée au-delà du point où les données pouvant 
être tirées de l’étude ne sont plus suffisantes pour permettre une évalua ­
tion statistiquement valable.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 475
 
OBSERVATIONS  
33. Un examen de la morbidité ou de la mortalité est effectué quotidiennement 
chez tous les animaux, généralement en début et en fin de journée, fins de semaine et jours fériés compris. Une recherche de signes spécifiques signi ­
ficatifs sur le plan toxicologique devra aussi être effectuée une fois par jour 
en tenant compte du moment où l’on prévoit que les effets des différentes doses atteindront leur intensité maximale après administration par gavage. Une attention particulière est accordée au développement de tumeurs, et le 
moment d’apparition, la localisation, les dimensions, l’aspect et la progres ­
sion de chaque tumeur nettement visible ou palpable sont consignés.
 
Poids corporel, consommation de nourriture et d’eau, et efficacité alimen ­
taire  
34. Tous les animaux sont pesés au début du traitement, au moins une fois par 
semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par mois. La consommation de nourriture et l’efficacité alimentaire sont aussi mesurées au moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, 
puis au moins une fois par mois. Lorsque la substance d’essai est adminis ­
trée dans l’eau de boisson, la consommation d’eau est aussi mesurée au moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut également être utile de mesurer la consom ­
mation d’eau dans les études où la prise d’eau est modifiée.
 
Hématologie, biochimie clinique et autres mesures  
35. Afin d’obtenir le plus possible d’informations de l’étude, surtout en ce qui 
concerne le mode d’action de la substance, il peut être utile d’effectuer des 
prélèvements sanguins afin de procéder à des analyses hématologiques et de 
biochimie clinique, mais la décision appartient au directeur de l’étude. Des analyses d’urine peuvent être aussi appropriées. On trouvera des informa ­
tions complémentaires sur l’intérêt de tels prélèvements pour une étude de 
cancérogenèse dans le document d’orientation n
 o 116 (7). S’il y a lieu, des 
prélèvements sanguins en vue d’analyses hématologiques et de chimie clinique et des analyses d’urines peuvent être effectués dans le cadre de sacrifices réalisés en cours d’étude (paragraphe 20) et à la fin de l’étude sur 
un minimum de 10 animaux de chaque sexe par groupe. Les échantillons de 
sang sont prélevés en un point déterminé, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie, et seront 
conservés si nécessaire dans des conditions appropriées. Des étalements 
sanguins peuvent aussi être préparés en vue d’un examen, notamment si la moelle osseuse semble être l’organe cible, bien que l’utilité d’un tel examen pour l’évaluation du potentiel cancérogène/oncogène ait été mise 
en question (32).
 
PATHOLOGIE  
Autopsie macroscopique  
36. Tous les animaux de l’étude à l’exception des sentinelles et autres animaux 
satellites (voir paragraphe 20) font l’objet d’une autopsie macroscopique complète et détaillée, comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et 
abdominale et de leurs contenus. L’autopsie des sentinelles et autres 
animaux satellites peut devoir être effectuée au cas par cas, à la discrétion du directeur de l’étude. La pesée des organes ne fait normalement pas partie d’une étude de cancérogenèse car les changements liés à l’âge ou, dans des 
phases plus avancées, au développement de tumeurs rendent superflues les 
données relatives au poids des organes. Ces données peuvent toutefois présenter un grand intérêt pour les évaluations fondées sur le poids de la preuve, notamment en ce qui concerne le mode d’action. Si ces données font 
partie d’une étude satellite, elles ne sont pas collectées au-delà d’un an après 
le début de l’étude.
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37. Les tissus suivants sont conservés dans le milieu de fixation le plus appro ­
prié, à la fois pour le type de tissu et pour l’examen histopathologique prévu 
(33) (l’examen des tissus indiqués entre crochets est facultatif): 
toutes les lésions macrosco ­
piques cœur pancréas estomac (pré-estomac, 
estomac glandulaire) 
glande surrénale iléon glande parathyroïde [dents] aorte jéjunum nerf périphérique testicule cerveau (segments d’encé ­
phale, de cervelet et de bulbe rachidien/pont) rein hypophyse thymus 
cæcum glande lacrymale (exor ­
bital) prostate thyroïde 
col utérin foie rectum [langue] 
glande coagulante poumon glande salivaire trachée côlon ganglions lymphatiques 
(superficiels et profonds) vésicule séminale vessie 
duodénum glande mammaire (obli ­
gatoire pour les femelles 
et, si visible à la dissec ­
tion, aussi pour les mâles) muscle squelettique utérus (col inclus) 
épididyme [voies respiratoires supé ­
rieures dont nez, cornets 
et sinus paranasaux] peau [uretère] 
œil (y compris rétine) œsophage moelle épinière 
(niveaux cervical, mésothoracique et lombaire) [urètre] 
[fémur avec articulation] [bulbe olfactif] rate vagin 
vésicule biliaire (pour les 
espèces autres que le rat) ovaire [sternum] segment de moelle osseuse 
et/ou moelle osseuse fraîche ­
ment ponctionnée 
glande de Harder
 
Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les 
glandes surrénales, les deux organes sont préservés. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener à examiner d’autres tissus. Tous les organes considérés comme des organes cibles potentiels du fait des 
propriétés connues de la substance d’essai sont aussi conservés. Dans les 
études portant sur une administration par la voie cutanée, il y a lieu de conserver les organes figurant sur la liste établie pour la voie orale, et de procéder à un prélèvement et une conservation spécifiques de la peau prove ­
nant du site d’application. Dans les études par inhalation, la liste des tissus 
des voies respiratoires conservés et examinés est conforme aux recomman ­
dations des chapitres B.8 et B.29 de la présente annexe. Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spécifiquement 
conservés), il convient d’examiner les organes de la liste établie pour la 
voie orale.
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Histopathologie  
38. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matière de 
conduite des études de pathologie toxicologique (33). Au minimum, les examens devront porter sur les tissus suivants:
 
— tous les tissus prélevés dans le groupe à dose élevée et le groupe témoin,  
— tous les tissus prélevés sur les animaux morts ou sacrifiés au cours de 
l’étude,  
— tous les tissus présentant des anomalies macroscopiques, notamment des 
tumeurs,  
— lorsque des altérations histopathologiques dues au traitement sont obser ­
vées dans le groupe à dose élevée, ces mêmes tissus sont examinés chez 
tous les animaux de tous les autres groupes de doses,  
— dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes 
surrénales, les deux organes sont examinés.  
RÉSULTATS ET RAPPORTS  
Données  
39. Des données sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramètres 
évalués. En outre, toutes les données sont résumées sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe expérimental, le nombre d’ani ­
maux au début de l’essai, le nombre d’animaux trouvés morts au cours de 
l’essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre 
d’animaux présentant des signes de toxicité, la description des signes de toxicité observés ainsi que le moment de l’apparition, la durée et la gravité de tous les effets toxiques observés, le nombre d’animaux présentant des 
lésions, les types de lésions et le pourcentage d’animaux présentant chaque 
type de lésion. Les tableaux synoptiques présentent les moyennes et les écarts-types (pour les données recueillies en continu) pour les animaux 
présentant des effets toxiques ou des lésions, ainsi qu’une cotation des 
lésions.
 
40. Les données de contrôle historiques peuvent faciliter l’interprétation des 
résultats de l’étude, par exemple lorsque les données provenant des 
témoins concurrents semblent diverger de manière significative de données récentes obtenues sur des animaux témoins issus de la même installation d’essai/colonie d’élevage. Si elles sont évaluées, les données de contrôle 
historiques émanent du même laboratoire et portent sur des animaux du 
même âge et de la même souche, produits dans les cinq ans précédant l’étude en question.
 
41. Si possible, les résultats numériques devront être évalués à l’aide d’une 
méthode statistique appropriée et largement reconnue. Les méthodes statis ­
tiques et les données à analyser sont choisies au moment de la conception de l’étude (paragraphe 9). Ce choix permet d’opérer des ajustements en 
fonction de la survie, si nécessaire.
 
Rapport d’essai  
42. Le rapport d’essai mentionne les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— état physique, pureté et propriétés physico-chimiques,  
— données d’identification,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 478
 
— provenance de la substance chimique,  
— numéro de lot,  
— certificat d’analyse chimique.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix du véhicule (s’il est autre que l’eau).  
Animaux d’expérience:  
— espèce/souche utilisée et justification du choix fait,  
— nombre, âge et sexe des animaux au début de l’essai,  
— provenance, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l’essai.  
Conditions expérimentales:  
— justification de la voie d’administration et du choix des doses,  
— le cas échéant, méthodes statistiques utilisées pour analyser les données,  
— détails concernant la formulation de la substance d’essai ou son incor ­
poration dans les aliments,  
— données analytiques sur la concentration obtenue, la stabilité et l’homo ­
généité de la préparation,  
— voie d’administration et détails concernant l’administration de la subs ­
tance d’essai,  
— pour les études par inhalation, mention de la voie d’entrée (nez seul ou 
corps entier),  
— doses réelles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas échéant, facteur de 
conversion en dose réelle de la concentration de la substance d’essai (en 
mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou l’eau de boisson,  
— détails concernant la qualité de l’alimentation et de l’eau de boisson.  
Résultats (les résultats comprendront des données générales sous forme de 
tableaux synoptiques et des données propres à chaque animal)  
Résultats généraux:  
— données sur la survie,  
— poids corporel/variations du poids corporel,  
— prise d’aliments, calculs de l’efficacité alimentaire, si effectués, et prise 
d’eau, le cas échéant,  
— données toxicocinétiques (si disponibles),  
— ophtalmoscopie (si disponible),  
— hématologie (si disponible),  
— chimie clinique (si disponible).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 479
 
Résultats cliniques:  
— signes de toxicité,  
— incidence (et, si elle est évaluée, sévérité) de toute anomalie observée,  
— nature, sévérité et durée des observations cliniques (transitoires ou 
permanentes).  
Données relatives aux autopsies:  
— poids corporel à l’issue de l’essai,  
— poids des organes et leur rapport au poids corporel, le cas échéant,  
— résultats d’autopsie; incidence et sévérité des anomalies.  
Histopathologie:  
— observations d’effets histopathologiques non néoplasiques,  
— observations d’effets histopathologiques néoplasiques,  
— corrélation entre les observations macroscopiques et microscopiques,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques liés au trai ­
tement et échelle d’évaluation de la sévérité,  
— rapport sur l’analyse éventuelle des lames par des pairs.  
Traitement statistique des résultats, le cas échéant  
Discussion des résultats, notamment:  
— examen de toutes les approches de modélisation,  
— relations dose-réponse,  
— données de contrôle historiques,  
— examen de toutes les informations concernant le mode d’action,  
— détermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet 
nocif observé),  
— applicabilité des résultats à l’être humain;  
Conclusions  
BIBLIOGRAPHIE:  
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orale à doses répétées – non-rongeurs: 90 jours.  
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(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
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Paris.  
(9) Chapitre B.8 de la présente annexe – Toxicité subaiguë par inhalation: 
étude sur 28 jours.  
(10) Chapitre B.29 de la présente annexe – Toxicité subchronique par inhala ­
tion: étude sur 90 jours.  
(11) Chapitre B.9 de la présente annexe – Toxicité cutanée à doses répétées (28 
jours).  
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(27) Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 
22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (JO L 276 du 20.10.2010, p. 33).
 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, DC, US Dept. of Health 
and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 
906255-04-2.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
(31) Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., 
Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
(32) Weingand K.  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(33) Crissman J., Goodman D., Hildebrandt P.  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
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DEFINITION  
Test chemical:  Any substance or mixture tested using this Test Method.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 483
 
B. 33.  ÉTUDES COMBINÉES DE TOXICITÉ CHRONIQUE ET DE 
CANCÉROGENÈSE  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 453 (2009) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La ligne directrice 453 
originale avait été adoptée en 1981. La présente méthode d’essai B.33 actualisée a été jugée nécessaire afin de tenir compte des évolutions récentes dans le domaine du bien- être animal, ainsi que des nouvelles exigences 
réglementaires (1) (2) (3) (4) (5). La mise à jour de la présente méthode 
d’essai B.33 a été effectuée en parallèle avec la révision des chapitres B.32 (Études de cancérogenèse) et B.30 (Études de toxicité chronique) de la présente annexe, dans le but d’obtenir des informations additionnelles à 
partir des animaux utilisés dans l’étude, et de fournir des précisions concer ­
nant le choix des doses. La présente méthode d’essai vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des produits chimiques industriels. Il convient toutefois de noter que certains 
aspects et certaines dispositions peuvent différer pour les produits pharma ­
ceutiques (voir la Conférence internationale sur l’harmonisation, thème S1B: évaluation de la cancérogénicité des produits pharmaceutiques).
 
2. La plupart des études de toxicité chronique et de cancérogenèse étant 
menées sur des espèces de rongeurs, la présente méthode d’essai est destinée à s’appliquer principalement à des études réalisées avec ces espèces. S’il 
s’avérait nécessaire de mener de telles études avec des non-rongeurs, il 
conviendrait d’appliquer, moyennant des modifications appropriées, les prin ­
cipes et procédures décrits dans la présente méthode d’essai et dans le chapitre B.27 – Toxicité orale à doses répétées – non-rongeurs: 90 jours 
(6) de la présente annexe, comme indiqué dans le document d’orientation 
n
 o 116 de l’OCDE sur l’élaboration et la conduite des études de toxicité 
chronique et de cancérogenèse (7).  
3. Les trois principales voies d’administration utilisées dans les études de 
toxicité chronique et de cancérogenèse sont la voie orale, la voie cutanée et l’inhalation. Le choix de la voie d’administration dépend des caractéris ­
tiques physiques et chimiques de la substance d’essai et de la voie d’expo ­
sition prédominante chez l’homme. Des informations complémentaires sur le choix de la voie d’exposition sont fournies dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
4. La présente méthode d’essai porte principalement sur l’exposition par voie 
orale, la voie la plus communément utilisée dans les études de toxicité 
chronique et de cancérogenèse. Bien que des études à long terme utilisant 
l’exposition par voie cutanée ou par inhalation puissent aussi être néces ­
saires pour évaluer le risque pour la santé humaine et/ou exigées en vertu de certains régimes réglementaires, ces deux voies d’exposition nécessitent des 
dispositifs techniques d’une grande complexité. De telles études devront être 
conçues au cas par cas, encore que la présente méthode d’essai, qui porte sur la caractérisation et l’évaluation de la toxicité chronique et de la cancé ­
rogénicité par voie orale, puisse fournir les bases d’un protocole d’étude par 
voie cutanée et/ou inhalation, notamment en ce qui concerne les recomman ­
dations relatives aux durées de traitement, aux paramètres cliniques et patho ­
logiques, etc. Il existe des documents d’orientation de l’OCDE sur l’admi ­
nistration expérimentale de substances d’essai par inhalation (7) (8) et par 
voie cutanée (7). Les chapitres B.8 (9) et B.29 (10) de la présente annexe, 
ainsi que le document d’orientation de l’OCDE sur les essais de toxicité aiguë par inhalation (8), méritent tout particulièrement d’être consultés lors de la conception d’études à long terme portant sur une exposition par 
inhalation. Le chapitre B.9 de la présente annexe (11) doit être consulté 
dans le cas d’un essai portant sur la voie cutanée.
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5. L’étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse donne des 
éléments d’information sur les risques pour la santé susceptibles de découler 
d’une exposition répétée pendant une période pouvant couvrir la vie entière de l’espèce considérée. L’étude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance d’essai, y compris sur son pouvoir cancérogène, 
et peut indiquer les organes cibles et la possibilité d’accumulation dans ces 
organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif observé pour ce qui est des effets toxiques et, dans le cas de substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Cette estimation 
permet d’établir les critères de sécurité concernant l’exposition humaine. De 
plus, il convient d’accorder une attention particulière à l’observation clinique des animaux afin d’obtenir le plus d’informations possibles.
 
6. Les objectifs des études de toxicité chronique et de cancérogenèse couvertes 
par la présente méthode d’essai sont les suivants:  
— identification des propriétés cancérogènes d’un produit chimique suscep ­
tibles d’augmenter les risques de néoplasmes, la fréquence de survenue 
de néoplasmes malins ou la diminution du temps nécessaire à leur 
apparition, par rapport aux groupes témoins concurrents,  
— identification du temps d’apparition de néoplasmes,  
— identification de la toxicité chronique d’une substance d’essai,  
— identification d’un ou de plusieurs organes cibles de la toxicité chro ­
nique et de la cancérogenèse,  
— caractérisation de la relation dose-effet,  
— identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé (DSENO) ou 
du point de départ pour l’établissement d’une dose de référence (DR),  
— extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine 
correspondant à de faibles doses,  
— prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux représentatifs de 
l’exposition humaine,  
— obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le 
mode d’action (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
7. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle et la toxicité chro ­
nique d’une substance d’essai, le laboratoire chargé de l’étude prend en 
compte toutes les informations disponibles sur la substance d’essai avant de réaliser l’étude, afin de pouvoir orienter celle-ci de manière à tester plus efficacement les propriétés toxicologiques de la substance, et faire le moins 
possible appel aux animaux. La connaissance du mode d’action d’un agent 
cancérogène suspecté et sa prise en compte (2) (7) (12) (13) (14) (15) sont particulièrement importantes puisque la conception optimale de l’essai peut différer selon que la substance est ou n’est pas un agent cancérogène géno ­
toxique connu ou suspecté. Des informations complémentaires sur certains 
aspects du mode d’action peuvent être trouvées dans le document d’orien ­
tation n
 o 116 (7).  
8. Les informations utiles pour concevoir l’étude sont notamment: l’identité, la 
structure chimique et les propriétés physico-chimiques de la substance d’es ­
sai; les informations éventuelles sur son mode d’action; les résultats de 
toutes les études de toxicité in vitro ou in vivo menées et notamment des 
essais de génotoxicité; l’utilisation (les utilisations) prévue(s) et le potentiel d’exposition humaine; les données (Q)SAR disponibles et les données toxi ­
cologiques (par exemple mutagénicité, génotoxicité et pouvoir cancérogène) 
relatives aux substances structurellement apparentées; les données toxicoci ­
nétiques disponibles (dose unique et doses répétées, si ces données existent)
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et les résultats d’autres études à doses répétées. La détermination de la 
toxicité chronique et du pouvoir cancérogène n’est effectuée qu’après obten ­
tion des premiers résultats d’essais de toxicité à doses répétées menés sur 28 jours et/ou 90 jours. Les essais d’initiation-promotion de cancers à court terme peuvent aussi livrer des informations utiles. Il convient d’envisager 
l’adoption d’une approche par étapes pour l’étude expérimentale de cancé ­
rogenèse entreprise dans le cadre de l’évaluation globale des effets nocifs potentiels d’une substance chimique (16) (17) (18) (19).
 
9. Les méthodes statistiques les plus appropriées pour l’analyse des résultats, 
compte tenu du plan expérimental et des objectifs de l’étude, sont identifiées 
avant le début de l’étude. Il convient notamment de déterminer si les statis ­
tiques doivent prendre en compte l’ajustement en fonction de la survie, l’analyse des risques de tumeurs cumulées liés à la durée de survie, l’ana ­
lyse du temps nécessaire à l’apparition d’une tumeur et l’analyse effectuée 
en cas de mort prématurée des animaux d’un ou de plusieurs groupes. On 
trouvera des indications concernant les analyses statistiques appropriées, ainsi que des références clés à des méthodes statistiques reconnues au 
plan international, dans le document d’orientation n
 o 116 (7), ainsi que 
dans le document d’orientation n  o 35 sur l’analyse et l’évaluation des 
études de toxicité chronique et de cancérogenèse (20).  
10. Lors de la réalisation d’une étude de cancérogenèse, il est recommandé de 
toujours suivre les principes et considérations énoncés dans le document 
d’orientation de l’OCDE n  o 19 sur la reconnaissance, l’évaluation et l’uti ­
lisation des signes cliniques comme effets observés éthiquement acceptables dans les expérimentations animales menées à des fins d’évaluation de la sécurité (21). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier, stipule ce qui 
suit: « Dans les études comportant l’administration de doses répétées, 
lorsqu’un animal présente des signes cliniques progressifs de détérioration de son état, une décision d’euthanasier ou non l’animal est prise en connaissance de cause. Cette décision met en balance des facteurs tels 
que la valeur des informations pouvant être obtenues en maintenant 
l’animal dans l’étude d’une part, et l’état général de celui-ci d’autre part. Si la décision est prise de poursuivre l’essai sur cet animal, la 
fréquence des observations est augmentée selon les besoins. Il est aussi 
possible, sans toutefois nuire à l’objectif de l’essai, d’interrompre l’adminis ­
tration de la substance d’essai pour soulager la douleur ou la détresse de l’animal, ou de réduire la dose testée .»
 
11. On trouvera des informations détaillées et une discussion sur les principes 
déterminant le choix des doses pour les études de toxicité chronique et de 
cancérogenèse dans le document d’orientation n  o 116 (7), ainsi que dans 
deux publications de l’Institut international des sciences de la vie (22) (23). La stratégie de base pour le choix des doses dépend du ou des principaux 
objectifs de l’étude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de doses 
appropriés, il convient de trouver un équilibre, entre d’une part, l’identifi ­
cation des dangers et, d’autre part, la caractérisation des réponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet équilibre est particulièrement nécessaire dans le 
cas de l’étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse consi ­
dérée ici.
 
12. Il convient d’examiner l’opportunité de réaliser la présente étude combinée 
de toxicité chronique et de cancérogenèse plutôt que de réaliser séparément 
une étude de toxicité chronique (chapitre B.30 de la présente annexe) et une 
étude de cancérogenèse (chapitre B.32 de la présente annexe). L’essai combiné permet une meilleure efficacité en temps et en coûts, et un moindre recours aux animaux, par rapport à la conduite de deux essais 
séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique 
ou de la phase de cancérogenèse. Lors de la réalisation d’une telle étude combinée, il convient toutefois de respecter les principes déterminant le choix de la dose (paragraphes 11 et 22 à 26) et il est également reconnu 
que certains cadres réglementaires peuvent imposer la conduite d’études 
séparées. On trouvera dans le document d’orientation n
 o 116 (7) des indi ­
cations supplémentaires sur les moyens de concevoir de manière optimale l’étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse afin de réduire 
le nombre d’animaux utilisés et en rationalisant les diverses procédures 
expérimentales.
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13. Les définitions utilisées dans le contexte de la présente méthode d’essai 
figurent à la fin du présent chapitre et dans le document d’orientation 
n o 116 (7).  
PRINCIPE DE L’ESSAI  
14. L’étude comprend deux phases parallèles: une phase chronique et une phase 
de cancérogenèse (dont les durées respectives font l’objet des paragraphes 
34 et 35). La substance d’essai est normalement administrée par la voie orale, mais la voie inhalatoire ou la voie cutanée peuvent aussi être appro ­
priées. Durant la phase chronique, la substance d’essai est administrée quoti ­
diennement à plusieurs groupes d’animaux d’expérience à des doses 
progressives, à raison d’un niveau de dose par groupe, en général pendant une période de 12 mois, bien que des durées plus longues ou plus courtes puissent aussi être choisies en fonction des exigences réglementaires (voir 
paragraphe 34). Cette durée est suffisamment longue pour permettre aux 
effets de toxicité cumulée de se manifester, tout en évitant les effets pertur ­
bateurs des changements liés au vieillissement. Un ou plusieurs sacrifices en cours d’étude peuvent aussi être prévus, par exemple à 3 et 6 mois, auquel 
cas des groupes d’animaux supplémentaires pourront être inclus dans l’étude 
(voir paragraphe 20). Durant la phase de cancérogenèse, la substance d’essai est administrée quotidiennement à différents groupes d’animaux pendant la 
plus grande partie de leur vie. Au cours des deux phases, les animaux sont 
observés attentivement pour déceler d’éventuels signes de toxicité et le développement de lésions néoplasiques. Les animaux qui meurent ou sont sacrifiés en cours d’essai sont autopsiés et, au terme de l’essai, les animaux 
survivants sont sacrifiés et autopsiés.
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Choix des espèces animales  
15. La présente méthode d’essai traite principalement de la caractérisation et de 
l’évaluation de la toxicité chronique et de la cancérogénicité chez les rongeurs (paragraphe 2). Le recours à des espèces autres que des rongeurs 
peut être envisagé si les données disponibles laissent escompter une meil ­
leure prédiction des effets de la substance sur la santé humaine. Dans ce cas, le choix de l’espèce est justifié. L’espèce de rongeur préférée est le rat, mais d’autres rongeurs comme la souris peuvent être utilisés. Bien que le recours 
à la souris dans les études de cancérogenèse puisse ne présenter qu’un 
intérêt limité (24) (25) (26), certains programmes réglementaires actuels exigent tout de même la conduite d’essais de cancérogenèse sur la souris, sauf lorsqu’il est établi que de tels essais ne sont pas nécessaires sur le plan 
scientifique. Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis de 
préférence, en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l’induction de tumeurs et de la disponibilité de 
souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d’ob ­
tenir une grande quantité d’informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. S’il s’avérait nécessaire de réaliser des études de toxicité chronique et de cancérogenèse avec des espèces de non- rongeurs, le plan et 
la conduite de l’étude devraient suivre les principes décrits dans la présente 
méthode d’essai ainsi que dans le chapitre B.27 de la présente annexe – Toxicité orale à doses répétées – non-rongeurs: 90 jours (6). Des informa ­
tions additionnelles sur le choix des espèces et des souches sont disponibles 
dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
16. Il convient d’employer des animaux adultes sains, de souches communé ­
ment utilisées dans les laboratoires. L’étude combinée de toxicité chronique et de cancérogenèse sera effectuée de préférence sur des animaux de même souche et de même provenance que ceux utilisés dans l’étude (les études) de 
toxicité préliminaire(s) de plus courte durée. Si toutefois ces animaux sont 
réputés ne pas répondre aux critères de survie généralement admis dans les études à long terme [voir le document d’orientation n
 o 116 (7)], il convient 
d’envisager d’utiliser une souche d’un animal dont le taux de survie 
permette de réaliser une étude à long terme. Les femelles sont nullipares 
et non gravides.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 487
 
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
17. Les animaux peuvent être logés individuellement ou dans des cages en petits 
groupes du même sexe, l’hébergement individuel n’étant à envisager que dans des cas scientifiquement justifiés (27) (28) (29). Les cages sont placées 
de façon telle que l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats 
de l’étude soit réduite au minimum. La température du local des animaux d’expérience est de 22 °C (± 3 °C). L’humidité relative est d’au moins 30 % et n’excède pas de préférence 70 % en dehors des moments où le local est 
nettoyé, l’idéal étant qu’elle soit comprise entre 50 et 60 %. L’éclairage est 
artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire peut être un régime classique de laboratoire avec eau potable à 
satiété. Il satisfait tous les besoins nutritionnels de l’espèce étudiée, et la 
teneur en contaminants alimentaires susceptibles d’influer sur les résultats de l’essai (résidus de pesticides, polluants organiques persistants, phyto-œstrogènes, métaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi 
faible que possible. Des données analytiques sur les teneurs en nutriments 
et en contaminants alimentaires sont recueillies régulièrement, au moins au début de l’étude et lors des changements de lots; ces données figurent dans le rapport final. Des données analytiques sur l’eau de boisson utilisée lors de 
l’étude sont de même fournies. Le choix du régime alimentaire peut être 
influencé par la nécessité d’assurer un mélange convenable de la substance d’essai et de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux lorsque la substance est administrée dans la nourriture.
 
Préparation des animaux  
18. Il convient d’utiliser des animaux sains, acclimatés aux conditions de labo ­
ratoire depuis au moins 7 jours et n’ayant jamais été soumis auparavant à des protocoles expérimentaux. Dans le cas des rongeurs, l’administration de la substance commence dès que possible après le sevrage et l’acclimatation, 
et de préférence avant l’âge de 8 semaines. L’espèce, la souche, la prove ­
nance, le sexe, le poids et l’âge des animaux d’expérience sont précisés. Au début de l’étude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale et n’excède pas ± 20 % du poids moyen de tous les animaux 
étudiés, et ce pour chaque sexe séparément. Les animaux sont affectés de 
manière aléatoire aux différents groupes (témoins et traités). Après la rando ­
misation, les poids moyens des groupes de chaque sexe ne présentent pas de différences significatives. En cas de différences statistiquement significa ­
tives, la phase de randomisation est répétée dans la mesure du possible. 
Chaque animal reçoit un numéro d’identification unique et en est marqué de manière permanente par tatouage, implant de micropuce ou toute autre méthode appropriée.
 
PROTOCOLE  
Nombre et sexe des animaux  
19. Il convient d’utiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant 
pour permettre une évaluation biologique et statistique complète. Pour les 
rongeurs, chaque groupe de dose (comme défini au paragraphe 22) et chaque groupe témoin concurrent prévu pour participer à la phase de cancé ­
rogenèse de l’étude comprend donc au moins 50 animaux de chaque sexe. 
Selon le but de l’étude, il sera possible d’augmenter la puissance statistique 
des principales estimations en répartissant les animaux de manière différen ­
ciée et non égale en nombre dans les divers groupes de dose, avec plus de 50 animaux dans les groupes à faibles doses pour estimer par exemple la 
cancérogénicité aux faibles doses. Il convient toutefois de noter qu’une 
augmentation modérée de la taille d’un groupe entraînera une augmentation relativement faible de la puissance statistique de l’étude. Chaque groupe de dose (comme défini au paragraphe 22), et chaque groupe témoin concurrent 
prévu pour participer à la phase de toxicité chronique de l’étude, comprend 
au moins, dans le cas des rongeurs, 10 animaux de chaque sexe. On notera
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que ce nombre est plus faible que celui préconisé dans l’étude de toxicité 
chronique (chapitre B.30 de la présente annexe). L’interprétation des 
données obtenues à partir de ce nombre réduit d’animaux par groupe dans la phase de toxicité chronique de la présente étude combinée s’appuie cependant sur les données provenant des animaux plus nombreux étudiés 
lors de la phase de cancérogenèse de l’étude. Dans les études utilisant des 
souris, il peut être nécessaire de prévoir des animaux supplémentaires dans chaque groupe traité lors de la phase de toxicité chronique pour pouvoir effectuer tous les examens hématologiques requis. On trouvera des données 
complémentaires sur la conception statistique de l’étude et le choix de 
niveaux de doses permettant d’optimiser la puissance statistique dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
Sacrifices en cours d’étude, groupes satellites et animaux sentinelles  
20. L’étude peut prévoir le sacrifice d’animaux en cours d’étude, par exemple à 
6 mois pour la phase de toxicité chronique, afin de recueillir des données sur la progression des altérations non néoplasiques et des données mécanis ­
tiques, si cela est scientifiquement justifié. Si l’on dispose déjà de ces 
données, obtenues antérieurement lors d’études de toxicité à doses répétées sur la substance d’essai, les sacrifices en cours d’étude peuvent ne pas être scientifiquement justifiés. Les animaux étudiés pendant la phase de toxicité 
chronique de l’étude, normalement sur une durée de 12 mois (paragraphe 
34), fournissent les données correspondant aux sacrifices en cours d’étude pour la phase de cancérogenèse, ce qui réduit le nombre total d’animaux 
étudiés. Des groupes satellites peuvent aussi être constitués pour la phase de 
toxicité chronique afin de contrôler la réversibilité des éventuelles altérations toxicologiques induites par la substance d’essai. Ces investigations pourront ne porter que sur les doses maximales de l’étude et sur le groupe témoin. Un 
groupe supplémentaire d’animaux sentinelles (généralement 5 animaux de 
chaque sexe) peut être inclus si nécessaire pour le suivi de l’état patholo ­
gique au cours de l’étude (30). On trouvera des indications supplémentaires sur les sacrifices en cours d’étude et sur le recours à des animaux satellites 
et sentinelles, ainsi que sur la limitation du nombre total d’animaux étudiés, 
dans le document d’orientation n
 o 116 (7).  
21. Si l’inclusion d’animaux satellites et/ou des sacrifices en cours d’essai sont 
prévus, le nombre d’animaux dans chaque groupe de dose prévu à cet effet 
sera normalement de 10 animaux de chaque sexe, et le nombre total d’ani ­
maux étudiés devra être augmenté du nombre d’animaux devant être sacri ­
fiés avant l’achèvement de l’étude. Les animaux destinés à être sacrifiés en cours d’étude et les animaux satellites sont normalement sujets aux mêmes 
observations que ceux soumis à la phase de toxicité chronique de l’étude 
principale, notamment en ce qui concerne le poids corporel, la prise d’ali ­
ments et d’eau, les mesures hématologiques et de biochimie clinique, et les examens pathologiques. Toutefois, des dispositions peuvent aussi être prises 
(dans les groupes d’animaux sacrifiés en cours d’étude) pour limiter ces 
observations à des mesures essentielles spécifiques telles que la neurotoxi ­
cité ou l’immunotoxicité.
 
Groupes de dose et dosages  
22. Le document d’orientation n  o 116 (7) donne des indications sur tous les 
aspects du choix des doses et des écarts entre les doses. Il convient d’utiliser au moins trois doses et un groupe témoin, aussi bien pour la phase de 
toxicité chronique que pour la phase de cancérogenèse. Les niveaux de 
doses seront généralement basés sur les résultats d’études à plus court terme à doses répétées, ou d’études préliminaires de détermination des concentrations, et devront prendre en compte toutes les données toxicolo ­
giques et toxicocinétiques existantes relatives à la substance d’essai ou aux 
substances chimiques apparentées.
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23. Pour la phase de toxicité chronique de l’étude, une étude complète portant 
sur trois niveaux de doses peut ne pas être considérée comme indispensable 
s’il est possible d’anticiper qu’un essai à dose unique, équivalant au moins à 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, ne produira probablement pas d’effets indésirables. La décision est fondée sur les résultats d’études préliminaires et 
sur l’absence probable de toxicité de la substance d’essai, compte tenu des 
données disponibles sur des substances structurellement apparentées. Une limite de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour peut s’appliquer sauf si l’ex ­
position humaine indique qu’il est nécessaire de recourir à un niveau de 
dose plus élevé.
 
24. À moins de contraintes dues à la nature physico-chimique ou aux effets 
biologiques de la substance d’essai, le niveau de dose le plus élevé est choisi de manière à permettre d’identifier les principaux organes cibles et 
les effets toxiques de la substance tout en évitant la souffrance, une toxicité 
sévère ou une forte morbidité ou létalité chez les animaux testés. La plus forte dose est normalement choisie pour provoquer une manifestation de toxicité, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (d’en ­
viron 10 %). Toutefois, en fonction des objectifs de l’étude (voir paragraphe 
6), on pourra choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicité, par exemple une dose entraînant un effet négatif préoccupant mais dont l’impact sur l’espérance de vie ou le poids 
corporel reste faible.
 
25. Les niveaux de doses et les intervalles entre les doses peuvent être choisis 
de manière à pouvoir établir une relation dose-réponse et, selon le mode d’action de la substance d’essai, une DSENO ou tout autre résultat escompté 
de l’étude, notamment une DR (voir le paragraphe 27). Les facteurs à 
prendre en compte dans le choix des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-réponse, les doses qui provoquent des changements métaboliques importants ou qui modifient notablement le 
mode d’action toxique, le niveau auquel on peut prévoir un seuil, ou 
celui auquel on peut prévoir de fixer un point de départ pour une extrapo ­
lation aux faibles doses. Le principal objectif lors de la réalisation d’une étude combinée de cancérogenèse et de toxicité chronique sera la collecte 
d’informations à des fins d’évaluation des risques de cancérogenèse, et les 
données sur la toxicité chronique seront normalement un objectif subsidiaire. Il conviendra de s’en souvenir lors du choix des niveaux de doses et des intervalles entre les doses pour l’étude.
 
26. Les intervalles entre les doses dépendront des objectifs de l’étude et des 
caractéristiques de la substance d’essai, et ne peuvent donc pas être prescrits de manière détaillée dans la présente méthode d’essai, mais des intervalles 
correspondant à un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropriés entre les 
doses décroissantes, et l’inclusion d’un quatrième groupe d’essai est souvent préférable à la fixation de très grands intervalles (correspondant par exemple à un facteur de plus de 6 à 10) entre les doses. En général, les facteurs 
supérieurs à 10 sont évités, et leur utilisation est justifiée.
 
27. Comme le précise le document d’orientation n  o 116 (7), les facteurs à 
prendre en compte dans le choix des doses sont notamment les suivants:  
— non-linéarités ou points d’inflexion connus ou supposés de la courbe 
dose-réponse,  
— toxicocinétique et gammes de doses auxquelles l’induction métabolique, 
la saturation ou la non-linéarité entre les doses internes et externes surviennent ou non,
 
— lésions précurseurs, marqueurs d’effets ou indicateurs du déroulement de 
processus biologiques clés sous-jacents,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 490
 
— aspects principaux (ou présumés) du mode d’action, par exemple doses 
auxquelles une cytotoxicité commence à se manifester, les dosages 
hormonaux sont perturbés, les mécanismes homéostatiques sont dépas ­
sés, etc.,  
— régions de la courbe dose-réponse nécessitant une estimation particuliè ­
rement précise, par exemple dans le domaine de la DR prévue ou d’un seuil présumé,
 
— prise en compte des niveaux prévus d’exposition humaine, en particulier 
lors du choix des doses moyennes et faibles . 
28. Le groupe témoin sera un groupe non traité ou un groupe recevant le 
véhicule si la substance est administrée dans un véhicule. Exception faite de l’administration de la substance d’essai, les animaux du groupe témoin sont traités de la même manière que ceux des groupes d’essai. Si un véhi ­
cule est employé, on administrera au groupe témoin le plus grand volume de 
véhicule utilisé pour les groupes traités. Si la substance d’essai est incor ­
porée aux aliments et entraîne une diminution sensible de la prise de nour ­
riture liée à une moindre appétence de celle-ci, il pourra être utile d’utiliser 
un groupe témoin supplémentaire nourri en parallèle, qui constituerait un 
témoin plus approprié.
 
Préparation des doses et administration de la substance d’essai  
29. La substance d’essai est normalement administrée par voie orale, soit dans la 
nourriture ou l’eau de boisson, soit par gavage. Des informations complé ­
mentaires sur les voies et méthodes d’administration figurent dans le docu ­
ment d’orientation n  o 116 (7). La voie et le mode d’administration dépen ­
dent de la finalité de l’étude, des propriétés physico-chimiques de la subs ­
tance d’essai, de sa biodisponibilité ainsi que de la voie et du mode prédo ­
minants d’exposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode d’administration. Dans l’intérêt des animaux, le gavage oral n’est 
normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie et ce 
mode d’administration correspondent à une voie d’exposition potentielle raisonnable chez l’homme (produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux, notamment 
les pesticides, l’administration se fait d’ordinaire via le régime alimentaire 
ou l’eau de boisson. Toutefois, dans certains contextes, tels que l’exposition professionnelle, l’administration par d’autres voies peut être plus appropriée.
 
30. Si nécessaire, la substance d’essai est dissoute ou mise en suspension dans 
un véhicule approprié. Il convient de prendre en compte les caractéristiques 
suivantes du véhicule et des autres additifs, s’il y a lieu: effets sur l’absorp ­
tion, la répartition, le métabolisme ou la rétention de la substance d’essai; effets sur les propriétés chimiques de la substance d’essai susceptibles de modifier sa toxicité; et effets sur la prise d’aliments ou d’eau, ou sur l’état 
nutritionnel des animaux. Il est recommandé, chaque fois que les circons ­
tances le permettent, d’envisager en premier lieu l’utilisation d’une solution ou d’une suspension aqueuse, puis celle d’une solution ou d’une émulsion dans une huile (par exemple huile de maïs), et en dernier lieu celle d’une 
solution dans d’autres véhicules. Les caractéristiques de toxicité des véhi ­
cules autres que l’eau sont connues. Il convient de disposer de données sur la stabilité de la substance d’essai et sur l’homogénéité des solutions ou rations contenant les différentes doses (selon les cas) dans les conditions 
d’administration (nourriture, par exemple).
 
31. Il importe de veiller à ce que les quantités de substances d’essai adminis ­
trées dans les aliments ou l’eau de boisson n’interfèrent pas avec la nutrition ou avec l’équilibre hydrique. Dans les études de toxicité à long terme faisant intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration de la 
substance d’essai dans les aliments ne dépasse normalement pas 5 % de 
la ration totale, afin d’éviter les déséquilibres nutritionnels. Si la substance d’essai est incorporée à la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg d’aliment ou ppm) soit un niveau de dose 
constant par rapport au poids corporel de l’animal (mg/kg de poids corpo ­
rel), calculé sur une base hebdomadaire. La solution choisie est spécifiée.
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32. En cas d’administration par voie orale, les animaux reçoivent une dose 
quotidienne de la substance d’essai (à raison de 7 jours par semaine) et 
ce pendant une période de 12 mois (phase chronique) ou de 24 mois (phase de cancérogenèse) pour les rongeurs (voir aussi les paragraphes 33 et 34). Tout autre régime de dosage, par exemple une administration 5 jours par 
semaine, donne lieu à une justification. En cas d’administration par voie 
cutanée, les animaux reçoivent normalement le traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le spécifie le chapitre B.9 de la présente annexe (11), et ce pendant une période de 12 mois (phase 
chronique) ou de 24 mois (phase de cancérogenèse). L’exposition par inha ­
lation est réalisée pendant 6 heures par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter l’exposition à 5 jours par semaine. La période d’exposition est normalement de 12 mois (phase chronique) ou de 
24 mois (phase de cancérogenèse). Si des espèces de rongeurs autres que le 
rat sont exposées «nez seul», il est possible d’ajuster la durée maximale d’exposition en fonction du stress propre à ces espèces. Le choix d’une durée d’exposition inférieure à 6 heures par jour fait l’objet d’une justifica ­
tion. Voir aussi à ce sujet le chapitre B.8 de la présente annexe (9).
 
33. Lorsque la substance d’essai est administrée aux animaux par gavage, l’opé ­
ration est pratiquée aux mêmes moments de la journée au moyen d’une sonde gastrique ou d’une canule d’intubation appropriée. Normalement, une dose unique sera administrée une fois par jour mais lorsque, par exem ­
ple, la substance chimique est un irritant local, il pourra être envisagé de 
maintenir la dose journalière en la fractionnant (deux fois par jour). Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l’animal d’expérience. Le volume est maintenu aussi faible 
que possible et n’excède normalement pas 1 ml/100 g de poids corporel 
pour les rongeurs (31). Il convient de minimiser la variabilité du volume testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant à tous les niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes 
sont l’exception et leur dilution permettra d’éviter tout effet local sévère. 
L’essai n’est pas mené à des concentrations susceptibles d’être corrosives ou irritantes pour le tube digestif.
 
Durée de l’étude  
34. Si la période d’administration et la durée de la phase chronique de cette 
étude sont normalement de 12 mois, le plan de l’étude permet une applica ­
tion à des essais de durée plus courte (6 à 9 mois par exemple) ou plus 
longue (18 à 24 mois), pour répondre aux exigences de régimes réglemen ­
taires particuliers ou obtenir des données mécanistiques spécifiques. Les déviations par rapport à une durée d’exposition de 12 mois font l’objet de 
justifications, surtout dans le cas de durées plus courtes. Le traitement de 
tous les groupes de doses affectés à cette phase est interrompu au moment prévu pour l’évaluation de la toxicité chronique et de lésions pathologiques non néoplasiques. Les groupes satellites inclus pour contrôler la réversibilité 
des éventuelles altérations toxicologiques induites par la substance d’essai 
sont maintenus sans traitement, pendant une période d’au moins 4 semaines et d’au plus un tiers de la durée totale de l’étude, après la cessation de l’exposition.
 
35. La durée de la phase de cancérogenèse de cette étude sera normalement de 
24 mois pour les rongeurs, ce qui correspond à la majeure partie de la durée 
de vie normale des animaux utilisés. Elle peut être allongée ou raccourcie selon la durée de vie de la souche de l’espèce animale utilisée, mais ce changement de durée fait l’objet d’une justification. Pour certaines souches 
particulières de souris, par exemple AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J, une durée 
de 18 mois peut être plus appropriée. On trouvera ci- après des informations sur la durée, la clôture de l’étude et la survie; d’autres considérations, relatives notamment à l’acceptabilité d’une étude de cancérogenèse 
estimée négative du fait de la survie des animaux, figurent dans le document 
d’orientation n
 o 116 (7):  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 492
 
— la clôture de l’étude est envisagée lorsque le nombre de survivants des 
groupes soumis aux plus faibles doses ou du groupe témoin tombe en 
dessous de 25 pour cent,  
— la clôture de l’étude n’est pas déclenchée par la mort prématurée des 
animaux du seul groupe ayant reçu la dose la plus élevée,  
— la survie des animaux est prise en considération séparément pour chaque 
sexe,  
— l’étude n’est pas prolongée au-delà du point où les données pouvant être 
tirées de l’étude ne sont plus suffisantes pour permettre une évaluation 
statistiquement valable.  
OBSERVATIONS (PHASE DE TOXICITÉ CHRONIQUE)  
36. Tous les animaux sont soumis à un examen quotidien, généralement en 
début et en fin de journée, fins de semaine et jours fériés compris, pour déterminer la morbidité et la mortalité. Des observations cliniques générales sont effectuées au moins une fois par jour, de préférence au(x) même(s) 
moment(s) de la journée, en tenant compte du moment où l’on prévoit que 
les effets des différentes doses atteindront leur intensité maximale après administration par gavage.
 
37. Tous les animaux font l’objet d’observations cliniques détaillées au moins 
une fois avant la première exposition (pour permettre des comparaisons 
intra-individuelles), à la fin de la première semaine de l’étude, et une fois par mois ensuite. Les observations respectent un protocole qui réduit au minimum les variations entre observateurs et les rend indépendantes du 
groupe testé. Ces observations sont effectuées hors de la cage où sont 
logés les animaux, de préférence dans une enceinte normalisée et à heures fixes. Elles sont soigneusement consignées, de préférence en utilisant un système de cotation explicitement défini par le laboratoire qui réalise l’essai. 
Les conditions d’observation demeurent aussi constantes que possible. Les 
observations portent notamment sur les symptômes suivants (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de l’état de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses, apparition de sécrétions et d’excrétions, et réactions 
neurovégétatives (par exemple, sécrétion de larmes, horripilation, variation 
du diamètre pupillaire, respiration anormale). Il convient également de consigner les changements dans la démarche, la posture et les réactions à la manipulation, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques 
et les comportements stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, parcours 
circulaires répétitifs) ou bizarres (par exemple, automutilation, marche à reculons) (32).
 
38. Avant la première administration de la substance d’essai, tous les animaux 
font l’objet d’un examen ophtalmologique effectué à l’aide d’un ophtalmo ­
scope ou d’un autre appareil approprié. À l’issue de l’étude, cet examen est réalisé de préférence sur tous les animaux, mais au moins sur ceux du groupe traité à la dose la plus élevée et du groupe témoin. Si des altérations 
oculaires liées au traitement sont détectées, tous les animaux sont examinés. 
Si l’analyse structurale ou d’autres observations suggèrent une toxicité oculaire, il faut augmenter la fréquence des examens oculaires.
 
39. Dans le cas de substances ayant présenté un potentiel d’induction d’effets 
neurotoxiques lors d’essais antérieurs de toxicité à doses répétées sur 28 
et/ou 90 jours, une vérification de la réactivité sensorielle à différents types de stimuli (32) (stimuli auditifs, visuels ou proprioceptifs, par exemple) (33) (34) (35) et une évaluation de la force de préhension (36) ainsi que de 
l’activité motrice (37) pourront être menées en option. Elles seront réalisées 
avant le début de l’étude et tous les 3 mois par la suite, jusqu’à 12 mois inclusivement, ainsi qu’à la fin de l’étude (si celle-ci dure plus de 12 mois). On trouvera dans les références bibliographiques susmentionnées une 
description plus détaillée des modes opératoires. Toutefois, d’autres modes 
opératoires que ceux figurant dans ces références sont également utilisables.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 493
 
40. Dans le cas de substances ayant présenté un potentiel d’induction d’effets 
immunotoxiques lors d’essais antérieurs de toxicité à doses répétées sur 28 
et/ou 90 jours, d’autres examens sur cet effet peuvent être menés en option à la fin de l’étude.
 
Poids corporel, prise d’aliments et d’eau, et efficacité alimentaire  
41. Tous les animaux sont pesés au début du traitement, au moins une fois par 
semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par mois. La prise d’aliments et l’efficacité alimentaire sont aussi mesurées au 
moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au 
moins une fois par mois. Lorsque la substance d’essai est administrée dans l’eau de boisson, la prise d’eau est aussi mesurée au moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par 
mois. Il peut également être utile de mesurer la prise d’eau dans les études 
où celle- ci est modifiée.
 
Hématologie et biologie clinique  
42. Dans les études faisant intervenir des rongeurs, des examens hématologiques 
sont effectués sur tous les animaux d’expérience (10 mâles et 10 femelles par groupe) à 3, 6 et 12 mois, ainsi qu’à la fin de l’étude (si celle-ci dure 
plus de 12 mois). Si des souris sont utilisées, il peut être nécessaire de 
constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer tous les examens hématologiques requis (voir paragraphe 19). Dans les études faisant intervenir des non-rongeurs, les échantillons seront prélevés sur un 
plus petit nombre d’animaux (par exemple 4 animaux de chaque sexe par 
groupe dans les études chez le chien), à des stades intermédiaires et à la fin de l’étude, de la même manière que chez les rongeurs. Il ne sera pas néces ­
saire d’effectuer des examens à 3 mois, chez les rongeurs comme chez les 
autres animaux, si aucun effet sur les paramètres hématologiques n’a été 
observé lors d’une étude antérieure menée sur 90 jours à des niveaux de doses comparables. Les échantillons de sang sont prélevés en un point déterminé, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du 
sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie.
 
43. Les investigations portent sur les paramètres suivants (38): numération 
leucocytaire totale et différentielle, numération érythrocytaire et plaquettaire, concentration d’hémoglobine, hématocrite (volume cellulaire sanguin après centrifugation), volume corpusculaire moyen (VCM), hémoglobine corpus ­
culaire moyenne (HCM), concentration d’hémoglobine corpusculaire 
moyenne (CHCM), temps de prothrombine et temps de thromboplastine partielle activée. D’autres paramètres hématologiques tels que les corps de 
Heinz et autres anomalies morphologiques érythrocytaires ou la méthémo ­
globine peuvent être étudiés si nécessaire en fonction de la toxicité de la substance d’essai. Dans l’ensemble, il convient d’adapter l’approche suivie à l’effet observé et/ou attendu d’une substance d’essai donnée. Si la substance 
d’essai exerce un effet sur le système hématopoïétique, des numérations 
réticulocytaires et une cytologie médullaire peuvent être également indiquées mais n’ont pas à être pratiquées de manière systématique.
 
44. Des analyses de biochimie clinique, visant à étudier les principaux effets 
toxiques sur les tissus, et en particulier sur le rein et le foie, sont effectuées 
à partir d’échantillons de sang prélevés sur tous les animaux étudiés (10 
mâles et 10 femelles par groupe) à des intervalles de temps semblables à ceux spécifiés pour les examens hématologiques. Si des souris sont utilisées, il peut être nécessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir 
effectuer toutes les analyses de biochimie clinique nécessaires. Dans les 
études faisant intervenir des non-rongeurs, les échantillons seront prélevés sur un plus petit nombre d’animaux (par exemple 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les études chez le chien), à des stades intermédiaires et à la 
fin de l’étude, de la même manière que chez les rongeurs. Des examens à 3 
mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, sont superflus si
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 494
 
aucun effet sur les paramètres de biochimie clinique n’a été observé lors 
d’une étude antérieure menée sur 90 jours à des niveaux de doses compara ­
bles. Il est recommandé de faire jeûner les animaux (à l’exception des souris) pendant la nuit qui précède la prise de sang (
 1 ). Les investigations 
portent sur les paramètres suivants (38): glucose, urée (azote uréique), créa ­
tinine, protéines totales, albumine, calcium, sodium, potassium, cholestérol 
total, au moins deux enzymes révélatrices des effets hépatocellulaires (ala ­
nine aminotransférase, aspartate aminotransférase, glutamate déshydrogé ­
nase, acides biliaires totaux) (39) et au moins deux enzymes révélatrices 
des effets hépatobiliaires (phosphatase alcaline, gamma- glutamyl trans ­
férase, 5’-nucléotidase, bilirubine totale, acides biliaires totaux) (39). D’au ­
tres paramètres de chimie clinique, tels que les triglycérides à jeun, des hormones spécifiques et la cholinestérase peuvent être mesurés si nécessaire 
en fonction de la toxicité de la substance d’essai. Dans l’ensemble, il 
convient d’adapter l’approche suivie à l’effet observé et/ou attendu d’une substance d’essai donnée.
 
45. Des analyses d’urine sont effectuées à partir d’échantillons prélevés sur tous 
les animaux étudiés (10 mâles et 10 femelles par groupe) à des intervalles de temps semblables à ceux spécifiés pour les examens hématologiques et 
de chimie clinique. Il ne sera pas nécessaire d’effectuer des dosages à 3 
mois si les analyses d’urine pratiquées dans le cadre d’une étude antérieure menée sur 90 jours à des niveaux de doses comparables n’ont révélé aucun effet. La liste suivante de paramètres à étudier fait partie d’une recomman ­
dation d’experts relative aux études de pathologie clinique (38): aspect, 
volume, osmolalité ou poids spécifique, pH, protéines totales et glucose. D’autres mesures, notamment la recherche de corps cétoniques, d’urobilino ­
gène, de bilirubine et de sang occulte, peuvent aussi être réalisées. L’étude 
d’autres paramètres peut aussi s’avérer nécessaire pour élargir les recherches 
sur l’effet ou les effets observés.
 
46. On considère généralement que dans les études portant sur des chiens, il est 
nécessaire de déterminer les variables hématologiques et de biochimie clinique de base avant le début du traitement, mais que ce n’est pas indis ­
pensable dans les études portant sur des rongeurs (38). Toutefois, si l’on ne 
dispose pas de données historiques de base appropriées (voir paragraphe 58), il convient d’envisager d’en obtenir.
 
PATHOLOGIE  
Autopsie macroscopique  
47. Tous les animaux de l’étude font normalement l’objet d’une autopsie macro ­
scopique complète et détaillée, comprenant un examen attentif de la surface 
externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus. Toutefois, des dispositions peuvent aussi être prises (dans les groupes d’animaux sacrifiés en cours 
d’étude ou les groupes satellites) pour limiter ces observations à des 
mesures essentielles spécifiques telles que la neurotoxicité ou l’immunotoxi ­
cité (voir paragraphe 21). Il n’est pas nécessaire que ces animaux fassent l’objet d’une autopsie, ni des procédures ultérieures décrites dans les para ­
graphes qui suivent. L’autopsie des animaux sentinelles pourra devoir être 
effectuée au cas par cas, à la discrétion du directeur de l’étude.
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( 1 ) Pour un certain nombre de dosages effectués sur le sérum ou le plasma, et plus parti ­
culièrement pour le dosage du glucose, il est préférable de faire jeûner les animaux 
durant la nuit qui précède la prise de sang. En l’absence de jeûne, la variabilité des 
résultats est en effet plus grande, et risque de masquer des effets plus subtils ainsi que de 
rendre l’interprétation plus difficile. En revanche, le jeûne peut modifier le métabolisme 
général des animaux et, en particulier dans les études d’alimentation, perturber l’expo ­
sition quotidienne à la substance d’essai. Tous les animaux sont évalués dans le même 
état physiologique et il sera donc préférable de programmer les évaluations détaillées ou 
neurologiques pour un autre jour que celui des prélèvements de biochimie clinique.
 48. Il convient de déterminer le poids des organes de tous les animaux hormis 
ceux mentionnés dans la dernière partie du paragraphe 47. Les glandes 
surrénales, le cerveau, les épididymes, le cœur, les reins, le foie, les ovaires, la rate, les testicules, la thyroïde (pesée après fixation, avec les glandes parathyroïdes) et l’utérus de tous les animaux (excepté ceux trouvés mori ­
bonds et/ou ayant été sacrifiés en cours d’étude) sont débarrassés, le cas 
échéant, de tout tissu adhérent et pesés à l’état frais dès que possible après la dissection, pour prévenir la dessiccation.
 
49. Les tissus suivants sont conservés dans le milieu de fixation le plus appro ­
prié, à la fois pour le type de tissu et pour l’examen histopathologique prévu (40) (l’examen des tissus indiqués entre crochets est facultatif): 
toutes les lésions macroscopiques ganglions lymphatiques (superficiels et profonds) 
muscle squelettique rein aorte glande coagulante 
nerf périphérique [sternum] [bulbe olfactif] glande de Harder 
[voies respiratoires supé ­
rieures dont nez, cornets et 
sinus paranasaux] testicule cæcum glande lacrymale (exorbitale) 
œil (dont rétine) thymus cerveau (segments d’en ­
céphale, de cervelet et 
de bulbe rachidien/pont) glande mammaire (obliga ­
toire pour les femelles et, si 
visible à la dissection, aussi pour les mâles) 
œsophage thyroïde cœur glande salivaire 
ovaire trachée col utérin glande surrénale 
pancréas [uretère] côlon hypophyse parathyroïde [urètre] [dents] iléon 
peau utérus (col inclus) duodénum jéjunum 
poumon vagin épididyme [langue] prostate vésicule biliaire (pour les 
espèces autres que le rat) estomac (pré-estomac, 
moelle épinière rate vésicule séminale 
estomac glandulaire) (niveaux cervical, mésothora ­
cique et lombaire) 
[fémur avec articulation] segment de moelle 
osseuse et/ou moelle 
osseuse fraîchement 
ponctionnée rectum vessie 
foie
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Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les 
glandes surrénales, les deux organes sont préservés. Les observations, 
notamment cliniques, peuvent amener à examiner d’autres tissus. Tous les organes considérés comme des organes cibles potentiels du fait des propriétés connues de la substance d’essai sont aussi conservés. Dans les 
études portant sur une administration par la voie cutanée, il y a lieu d’exa ­
miner les organes figurant sur la liste établie pour la voie orale et de procéder à un prélèvement et une conservation spécifiques de la peau prove ­
nant du site d’application. Dans les études par inhalation, la liste des tissus 
des voies respiratoires conservés et examinés est conforme aux recomman ­
dations des chapitres B.8 (9) et B.29 (10) de la présente annexe. Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spécifique ­
ment conservés), il convient d’examiner les organes de la liste établie pour 
la voie orale.
 
Histopathologie  
50. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matière de 
conduite des études de pathologie toxicologique (40). Au minimum, les 
examens devront porter sur les tissus suivants:  
— tous les tissus prélevés dans le groupe à dose élevée et le groupe témoin,  
— tous les tissus prélevés sur les animaux morts ou sacrifiés au cours de 
l’étude,  
— tous les tissus présentant des anomalies macroscopiques,  
— tissus des organes cibles, ou tissus présentant des altérations dues au 
traitement dans le groupe à dose élevée, prélevés sur tous les animaux de tous les autres groupes de doses,
 
— dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes 
surrénales, les deux organes sont examinés.  
OBSERVATIONS (PHASE DE CANCÉROGENÈSE)  
51. Un examen de la morbidité ou de la mortalité est effectué quotidiennement 
chez tous les animaux, généralement en début et en fin de journée, fins de semaine et jours fériés compris. Une recherche de signes spécifiques signi ­
ficatifs sur le plan toxicologique est aussi effectuée une fois par jour. Dans 
le cas d’une étude par gavage, les animaux sont examinés immédiatement après l’administration de la dose. Une attention particulière devra être 
accordée au développement de tumeurs, et le moment d’apparition, la loca ­
lisation, les dimensions, l’aspect et la progression de chaque tumeur nette ­
ment visible ou palpable sont consignés.
 
52. Tous les animaux sont pesés au début du traitement, au moins une fois par 
semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par mois. La prise d’aliments et l’efficacité alimentaire sont aussi mesurées au 
moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au 
moins une fois par mois. Lorsque la substance d’essai est administrée dans l’eau de boisson, la prise d’eau est aussi mesurée au moins une fois par semaine pendant les 13 premières semaines, puis au moins une fois par 
mois. Il peut également être utile de mesurer la prise d’eau dans les études 
où celle- ci est modifiée.
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Hématologie, biochimie clinique et autres mesures  
53. Afin d’obtenir le plus possible d’informations de l’étude, surtout en ce qui 
concerne le mode d’action de la substance, il peut être utile d’effectuer des prélèvements sanguins afin de procéder à des analyses hématologiques et de 
biochimie clinique, mais la décision concernant ces prélèvements appartient 
au directeur de l’étude. Des analyses d’urine peuvent être aussi appropriées. Les données obtenues sur les animaux étudiés dans la phase de toxicité chronique, normalement d’une durée de 12 mois (voir paragraphe 34), 
renseignent sur ces paramètres. On trouvera des informations complémen ­
taires sur l’intérêt de tels prélèvements pour une étude de cancérogenèse dans le document d’orientation n
 o 116 (7). Les éventuels prélèvements 
sanguins sont à recueillir à la fin de l’étude, juste avant ou pendant le 
sacrifice des animaux. Ils sont effectués en un point déterminé, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie. Des étalements sanguins peuvent aussi être préparés en vue d’un 
examen, notamment si la moelle osseuse semble être l’organe cible, bien 
que l’utilité d’un tel examen pour l’évaluation du potentiel cancérogène/on ­
cogène pendant la phase de cancérogenèse ait été mise en question (38).
 
PATHOLOGIE  
Autopsie macroscopique  
54. Tous les animaux de l’étude à l’exception des sentinelles et autres animaux 
satellites (voir paragraphe 20), font l’objet d’une autopsie macroscopique complète et détaillée, comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et 
abdominale et de leurs contenus. L’autopsie des sentinelles et autres 
animaux satellites peut être effectuée au cas par cas, à la discrétion du directeur de l’étude. La pesée des organes ne fait normalement pas partie d’une étude de cancérogenèse car les changements liés à l’âge ou, dans des 
phases plus avancées, au développement de tumeurs rendent superflues les 
données relatives au poids des organes. Ces données peuvent toutefois présenter un grand intérêt pour les évaluations fondées sur le poids de la 
preuve, notamment en ce qui concerne le mode d’action. Si ces données font 
partie d’une étude satellite, elles sont collectées dans l’année suivant le début de l’étude.
 
55. Les tissus suivants sont conservés dans le milieu de fixation le plus appro ­
prié, à la fois pour le type de tissu et pour l’examen histopathologique prévu 
(40) (l’examen des tissus indiqués entre crochets est facultatif): 
toutes les lésions macrosco ­
piques ganglions lymphatiques (superficiels et 
profonds) muscle squelettique 
rein aorte glande coagulante nerf périphérique 
[sternum] [bulbe olfactif] glande de Harder [voies respiratoires supé ­
rieures dont nez, cornets et 
sinus paranasaux] 
testicule cæcum glande lacrymale (exor ­
bitale) œil (dont rétine) 
thymus cerveau (segments d’en ­
céphale, de cervelet et de bulbe rachidien/pont) glande mammaire (obli ­
gatoire pour les femelles et, si visible à la dissection, aussi pour 
les mâles) œsophage 
thyroïde cœur glande salivaire ovaire 
trachée col utérin glande surrénale pancréas [uretère] côlon hypophyse parathyroïde
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 498
 
[urètre] [dents] iléon peau 
utérus (col inclus) duodénum jéjunum poumon vagin épididyme [langue] prostate vésicule biliaire (pour les 
espèces autres que le rat) estomac (pré-estomac, 
moelle épinière rate vési ­
cule séminale estomac glandulaire) (niveaux cervical, mésothora ­
cique et lombaire) 
[fémur avec articulation] segment de moelle 
osseuse et/ou aspirat 
frais rectum vessie 
foie
 
Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les 
glandes surrénales, les deux organes sont préservés. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener à examiner d’autres tissus. Tous les organes considérés comme des organes cibles potentiels du fait des 
propriétés connues de la substance d’essai sont aussi conservés. Dans les 
études portant sur une administration par la voie cutanée, il y a lieu d’exa ­
miner les organes figurant sur la liste établie pour la voie orale et de procéder à un prélèvement et une conservation spécifiques de la peau prove ­
nant du site d’application. Dans les études par inhalation, la liste des tissus 
des voies respiratoires conservés et examinés est conforme aux recomman ­
dations des chapitres B.8 (8) et B.29 (9) de la présente annexe. Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spécifique ­
ment conservés), il convient d’examiner les organes de la liste établie pour 
la voie orale.
 
Histopathologie  
56. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matière de 
conduite des études de pathologie toxicologique (40). Au minimum, les 
examens histopathologiques devront porter sur les tissus suivants:  
— tous les tissus prélevés dans le groupe à dose élevée et le groupe témoin,  
— tous les tissus prélevés sur les animaux morts ou sacrifiés au cours de 
l’étude,  
— tous les tissus présentant des anomalies macroscopiques, notamment des 
tumeurs,  
— lorsque des altérations histopathologiques dues au traitement sont obser ­
vées dans le groupe à dose élevée, ces mêmes tissus sont examinés chez 
tous les animaux de tous les autres groupes de doses,  
— dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes 
surrénales, les deux organes sont examinés.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 499
 
RÉSULTATS ET RAPPORT (CANCÉROGENÈSE ET TOXICITÉ CHRO ­
NIQUE)  
Résultats  
57. Des données sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramètres 
évalués. En outre, toutes les données sont résumées sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe expérimental, le nombre d’ani ­
maux au début de l’essai, le nombre d’animaux trouvés morts au cours de 
l’essai ou euthanasiés, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d’animaux présentant des signes de toxicité, la description des signes de toxicité observés, ainsi que le moment de l’apparition, la durée et la gravité 
de tous les effets toxiques observés, le nombre d’animaux présentant des 
lésions, les types de lésions et le pourcentage d’animaux présentant chaque type de lésion. Les tableaux récapitulatifs présentent les moyennes et les écarts-types (pour les données recueillies en continu) pour les animaux 
présentant des effets toxiques ou des lésions, ainsi qu’une cotation des 
lésions.
 
58. Les données de contrôle historiques peuvent faciliter l’interprétation des 
résultats de l’étude, par exemple lorsque les données provenant des témoins concurrents semblent diverger de manière significative de données 
récentes obtenues sur des animaux témoins issus de la même installation 
d’essai/colonie d’élevage. Si elles sont évaluées, les données de contrôle historiques émanent du même laboratoire, portent sur des animaux du même âge et de la même souche, produits dans les cinq ans précédant 
l’étude en question.
 
59. Si possible, les résultats numériques sont évalués à l’aide d’une méthode 
statistique appropriée et largement reconnue. Les méthodes statistiques et les données à analyser sont choisies au moment de la conception de l’étude (paragraphe 9). Ce choix permet d’opérer des ajustements en fonction de la 
survie, si nécessaire.
 
60. Le rapport d’essai mentionne les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— état physique, pureté et propriétés physico-chimiques,  
— données d’identification,  
— provenance de la substance,  
— numéro de lot,  
— certificat d’analyse chimique.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix du véhicule (s’il est autre que l’eau).  
Animaux d’expérience:  
— espèce/souche utilisée et justification du choix fait,  
— nombre, âge et sexe des animaux au début de l’essai,  
— provenance, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 500
 
Conditions expérimentales:  
— justification de la voie d’administration et du choix des doses,  
— le cas échéant, méthodes statistiques utilisées pour analyser les données,  
— détails concernant la formulation de la substance d’essai ou son incor ­
poration dans les aliments,  
— données analytiques sur la concentration obtenue, la stabilité et l’homo ­
généité de la préparation,  
— voie d’administration et détails concernant l’administration de la subs ­
tance d’essai,  
— pour les études par inhalation, mention de la voie d’entrée (nez seul ou 
corps entier),  
— doses réelles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas échéant, facteur de 
conversion en dose réelle de la concentration de la substance d’essai (en 
mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou l’eau de boisson,  
— détails concernant la qualité de l’alimentation et de l’eau de boisson.  
Résultats (les résultats comprendront des données générales sous forme de 
tableaux synoptiques et des données propres à chaque animal)  
Résultats généraux:  
— données sur la survie,  
— poids corporel/variations du poids corporel,  
— prise d’aliments, calculs de l’efficacité alimentaire, si effectués, et prise 
d’eau, le cas échéant,  
— données toxicocinétiques (si disponibles),  
— ophtalmoscopie (si disponible),  
— hématologie (si disponible),  
— chimie clinique (si disponible).  
Résultats cliniques:  
— signes de toxicité,  
— incidence (et, si elle est évaluée, sévérité) de toute anomalie observée,  
— nature, sévérité et durée des observations cliniques (transitoires ou 
permanentes).  
Données relatives aux autopsies:  
— poids corporel à l’issue de l’essai,  
— poids des organes et leur rapport au poids corporel, le cas échéant,  
— résultats d’autopsie; incidence et sévérité des anomalies.  
Histopathologie:  
— observations d’effets histopathologiques non néoplasiques,  
— observations d’effets histopathologiques néoplasiques,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 501
 
— corrélation entre les observations macroscopiques et microscopiques,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques liés au trai ­
tement et échelle d’évaluation de la sévérité,  
— apport sur l’analyse éventuelle des lames par des pairs.  
Traitement statistique des résultats, le cas échéant  
Discussion des résultats, notamment:  
— examen de toutes les approches de modélisation,  
— relations dose-réponse,  
— données de contrôle historiques,  
— examen de toutes les informations concernant le mode d’action,  
— détermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet 
nocif observé),  
— applicabilité des résultats à l’être humain.  
Conclusions  
BIBLIOGRAPHIE:  
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voie orale – Toxicité orale à doses répétes – non rongeurs: 90 jours.  
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(9) Chapitre B.8 de la présente annexe. Toxicité subaiguë par inhalation: étude 
sur 28 jours.  
(10) Chapitre B.29 de la présente annexe, Toxicité subchronique par inhalation: 
étude sur 90 jours.  
(11) Chapitre B.9 de la présente annexe, Toxicité à doses répétées (28 jours) 
(administration cutanée).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 502
 
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126-131.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 504
 
Appendice 1  
DÉFINITION  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 505
 
B.34  TEST DE REPRODUCTION SUR UNE GÉNÉRATION  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Voir introduction générale, partie B.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Néant.  
1.4. PRINCIPES DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance à tester est administrée à des doses croissantes à 
plusieurs groupes d'animaux mâles et femelles. Les mâles devraient 
être traités durant leur croissance et pendant au moins un cycle complet de spermatogenèse (environ 56 jours chez la souris et 70 jours chez le rat) afin de permettre à la substance de produire 
quelques effets nocifs sur la spermatogenèse.
 
Les femelles de la génération P seront traitées pendant au moins 
deux cycles œstraux complets afin de permettre a la substance testée de produire quelques effets nocifs sur l'œstrus. Les animaux sont ensuite accouplés. La substance testée est administrée aux 
animaux des deux sexes pendant la période d'accouplement, puis 
uniquement aux femelles durant la période de gestion et d'allaite ­
ment. Si l'on veut administrer la substance par voie respiratoire (inhalation), la méthode nécessite des adaptations.
 
1.5. CRITÈRE QUALITATIF  
Néant.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparations  
Avant l'essai, de jeunes animaux adultes et sains sont randomisés et 
répartis par groupes traités et témoins. Les animaux sont maintenus 
dans les conditions expérimentales de stabulation et d'alimentation pendant au moins 5 jours avant l'expérience. Il est recommandé d'administrer la substance à tester dans la nourriture ou dans l'eau 
de boisson. D'autres voies d'administration sont également accepta ­
bles. La même méthode d'administration sera utilisée pour tous les animaux durant la période expérimentale appropriée. Si un véhicule ou d'autres additifs sont utilisés pour faciliter le traitement, ils 
devraient être reconnus sans effet toxique. Le traitement devrait 
être effectué pendant les 7 jours de la semaine.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 506
 
A n i m a u x d ' e x p é r i e n c e  
Choix de l'espèce:  
L'espèce convenant le mieux est celle du rat ou de la souris. Des 
souches à faible taux de fécondité ne devraient pas être utilisées. Des animaux sains n'ayant pas été déjà utilisés dans une expérimentation 
devraient être utilisés. L'espèce, la souche, le sexe, le poids et/ou 
l'âge des animaux d'expérience seront spécifiés.
 
Pour évaluer de façon adéquate la fécondité, mâles et femelles 
devraient tous deux être étudiés. Tous les animaux traités et 
témoins devraient être sevrés avant le début du traitement.  
Nombre et sexe:  
Chaque groupe traité et chaque groupe témoin devrait comporter un 
nombre d'animaux suffisant pour obtenir environ 20 femelles gravides arrivées à terme ou proches de celui-ci.
 
L'objectif est d'obtenir un nombre de gestations et de portées suffi ­
sant pour permettre une évaluation valable de l'influence de la subs ­
tance sur la fertilité, la gestation, le comportement maternel des 
animaux de la génération P ainsi que l'allaitement, la croissance et 
le développement de la génération F  1 , de la conception au sevrage.  
C o n d i t i o n s d ' e s s a i  
La nourriture et l'eau devraient être fournies à satiété. Lorsqu'elles 
seront proches du terme, les femelles gravides devraient être placées dans des cages individuelles de mise bas ou de maternité et il peut 
leur être fourni les matériaux de nidification nécessaires.
 
D o s e s  
Au moins trois groupes traités et un groupe témoin seront utilisés. Si 
un véhicule est utilisé pour administrer la substance testée, le groupe témoin recevra le volume maximal de véhicule ayant été utilisé. Si une substance à tester entraîne une réduction de la consommation 
alimentaire ou de l'assimilation, il peut être nécessaire d'utiliser un 
groupe témoin apparié. Dans les conditions idéales et à moins que la nature physique/chimique ou les effets biologiques de la substance testée ne s'y opposent dans une certaine mesure, le niveau de dose le 
plus élevé produira un effet toxique sans toutefois entraîner la mort 
des animaux parentaux (P). La(les) dose(s) intermédiaire(s) devrait(ent) produire des effets toxiques minima attribuables à la substance testée, et la dose faible ne devrait produire aucun effet 
nocif observable sur les parents ou leur progéniture. Lorsque la 
substance est administrée par gavage ou en capsule, la dose adminis ­
trée à chaque animal devrait être établie en fonction du poids corporel de chaque animal et fera l'objet d'un ajustement hebdoma ­
daire afin de tenir compte des modifications de poids corporel. Pour 
les femelles pendant la gestation, le traitement peut, si on le souhaite, être établi en fonction du poids corporel au jour 0 ou au jour 6 de la gestation.
 
E s s a i d e l i m i t e  
Dans le cas de substances faiblement toxiques, si un niveau de dose 
d'au moins 1 000 mg/kg n'entraîne aucune interférence sur les capa ­
cités de reproduction, des études à d'autres niveaux de doses peuvent être considérées non nécessaires. Si une étude préliminaire effectuée avec le niveau de dose élevé, avec une toxicité évidente chez la 
mère, n'a aucun effet nocif sur la fertilité, on peut juger inutile 
d'effectuer des études avec d'autres niveaux de doses.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 507
 
Mode opératoire  
P l a n d ' e x p é r i e n c e  
On devrait commencer à administrer quotidiennement la substance 
aux mâles géniteurs (P) lorsqu'ils auront atteints l'âge de 5 à 9 semaines, après qu'ils auront été sevrés et acclimatés pendant au 
moins 5 jours. Chez les rats, le traitement est poursuivi pendant 
10 semaines, avant la période d'accouplement (pour les souris, 8 semaines). Les mâles devraient être sacrifiés et examinés soit à la fin de la période d'accouplement soit alternativement maintenus en 
vie avec poursuite de l'administration de la substance dans la nour ­
riture, en vue de la production éventuelle d'une seconde portée, et devraient être sacrifiés et examinés à un moment avant la fin de l'étude. Dans le cas des femelles (P), le traitement devra commencer 
après au moins 5 jours d'acclimatation et se poursuivre pendant au 
moins 2 semaines avant l'accouplement. Les femelles P devraient continuer à recevoir leur traitement quotidien durant les 3 semaines de la période d'accouplement, durant la gestation et jusqu'au sevrage 
des petits F
 1 . Des modifications du schéma de traitement peuvent 
être envisagées au cas où l'on disposerait d'autres informations sur la substance étudiée, comme l'induction du métabolisme ou la bio-accu ­
mulation.
 
P r o c é d u r e d ' a c c o u p l e m e n t  
Dans les études de toxicité sur la fonction de reproduction, les 
accouplements peuvent se faire soit 1:1(1 mâle, 1 femelle) soit 1:2 
(1 mâle, 2 femelles).  
Dans le cas d'un accouplement 1:1, une femelle sera placée avec le 
même mâle jusqu'à ce qu'elle soit gravide ou que les 3 semaines se soient écoulées. On examinera les femelles chaque matin afin de 
relever la présence de sperme ou de bouchon vaginal. Le jour 0 
de la gestation est défini comme le jour où l'on constate la présence de bouchon vaginal ou de sperme.
 
Tous les couples ayant failli à l'accouplement devraient être 
examinés afin de déterminer la cause de l'apparente stérilité.  
Ceci peut impliquer des procédures qui permettent des conditions 
d'accouplement avec des mâles ou des femelles ayant déjà procréé, de procéder à un examen microscopique des organes de reproduction 
ou à un examen du cycle œstral ou de la spermatogenèse.
 
T a i l l e d e l a p o r t é e  
On laisse les animaux traités durant l'étude de fertilité mettre bas 
naturellement et élever librement leurs petits jusqu'au sevrage.  
Quand une méthode d'homogénéisation des portées est effectuée, il 
est suggéré d'appliquer le programme suivant: entre le jour 1 et le jour 4 après la naissance, la taille de chaque portée peut être adaptée 
en éliminant, par sélection, des petits afin d'obtenir, dans toute la 
mesure du possible, 4 mâles et 4 femelles par portée.
 
Si le nombre de mâles ou de femelles ne permet pas d'obtenir 4 
petits de chaque sexe par portée, un ajustement partiel peut être 
accepté (par exemple 5 mâles et 3 femelles). Des ajustements ne 
sont pas possibles pour les portées de moins de 8 petits.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 508
 
O b s e r v a t i o n s  
Pendant toute la période d'essai, chaque animal devrait être observé 
au moins une fois par jour. Des modifications comportementales significatives, des signes de parturition difficile ou prolongée ainsi que tous les signes de toxicité, y compris la mortalité, devraient être 
enregistrés. Pendant les périodes de pré-accouplement et d'accouple ­
ment, la consommation alimentaire sera déterminée quotidiennement. Après la parturition et durant la lactation, la consommation alimen ­
taire ainsi que la consommation d'eau lorsque la substance à tester 
est administrée dans l'eau de boisson devraient être déterminées le 
jour de la pesée des petits. Les mâles et les femelles P devraient être pesés le premier jour du traitement, puis toutes les semaines. Ces observations devraient être notées individuellement pour chaque 
animal adulte.
 
La durée de la gestation devrait être calculée à partir du jour 0 de la 
gravidité. Chaque portée devrait être examinée dès que possible après la naissance afin de déterminer le nombre et le sexe des petits, les mort-nés, les nouveau-nés vivants et la présence d'anoma ­
lies macroscopiques.
 
Les petits morts et les petits sacrifiés le quatrième jour devraient être 
conservés et examinés en vue de déceler d'éventuelles anomalies. Les petits vivants devraient être comptés et les portées pesées le matin qui suit la naissance ainsi que le quatrième et le septième jour, puis 
chaque semaine jusqu'au terme de l'étude, où les animaux devraient 
être alors pesés individuellement.
 
Les anomalies physiques ou comportementales observées chez les 
mères ou les petits seront enregistrées.  
Pathologie  
A u t o p s i e  
Au moment du sacrifice ou de la mort en cours d'étude, les animaux 
de la génération P devraient être soumis à un examen macroscopique afin de déceler toute anomalie structurelle ou toute modification 
pathologique; une attention particulière étant accordée aux organes 
de l'appareil de reproduction. Les petits, morts ou moribonds, seront examinés du point de vue des malformations.
 
H i s t o p a t h o l o g i e  
Les ovaires, l'utérus, le col utérin, le vagin, les testicules, l'épidi ­
dyme, les vésicules séminales, la prostate, la glande coagulante, l'hypophyse et l'(les) organe(s) cible(s) de tous les animaux P seront conservés en vue d'un examen microscopique. Au cas où 
ces organes n'ont pas été examinés au cours d'autres études à dose 
multiple, ils devraient être soumis à l'examen histologique pour tous les animaux traités à la dose élevée, tous les animaux témoins ainsi que ceux morts en cours d'expérience, lorsque c'est faisable.
 
Les organes présentant des anomalies chez ces animaux devraient 
alors être examinés chez tous les autres animaux P. Dans ce cas, 
l'examen microscopique sera effectué pour tous les tissus présentant des modifications pathologiques macroscopiques. Comme suggéré dans les procédures d'accouplement, les organes reproducteurs des 
animaux soupçonnés de stérilité seront soumis à un examen micro ­
scopique.
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2. RÉSULTATS  
Les résultats peuvent être résumés sous forme de tableaux indiquant, 
pour chaque groupe d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le nombre de mâles féconds, le nombre de femelles gravides, 
le type de modifications et le pourcentage d'animaux présentant 
chaque type de modification.
 
Lorsque c'est possible, les résultats numériques devraient être évalués 
au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode 
statistique reconnue peut être utilisée.  
3. RAPPORT  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— espèce/souche utilisée,  
— réponse toxique par sexe et par dose, y compris fécondité, 
gestation et viabilité,  
— moment de la mort en cours d'expérience ou indication si 
l'animal était encore en vie au moment prévu pour le sacrifier à l'issue de l'étude,
 
— tableau présentant les poids de chaque portée, les poids moyens 
des petits et les poids individuels des petits à l'issue de l'étude,  
— effet toxique ou autre sur la reproduction, la descendance, la 
croissance post-natale,  
— jour de l'observation de tout signe anormal et évolution subsé ­
quente,  
— poids corporel des animaux P,  
— résultats d'autopsie,  
— description détaillée des observations microscopiques,  
— traitement statistique des résultats, quand cela est nécessaire,  
— discussion des résultats,  
— interprétation des résultats.  
3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION  
Voir introduction générale, partie B.  
4. RÉFÉRENCES  
Voir introduction générale, partie B.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 510
 
B.35  ÉTUDE DE TOXICITÉ POUR LA REPRODUCTION SUR DEUX 
GÉNÉRATIONS  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est calquée sur la ligne directrice d'essai n  o 416 
(2001) de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode d'essai relative à la toxicité pour la reproduction 
sur deux générations est destinée à livrer des informations générales 
concernant les effets d'une substance d'essai sur l'intégrité et le fonc ­
tionnement des appareils reproducteurs mâle et femelle, notamment la fonction gonadique, le cycle œstral, le comportement à l'égard de 
l'accouplement, la conception, la gestation, la mise-bas, la lactation, 
le sevrage ainsi que la croissance et le développement de la descen ­
dance. L'étude peut aussi montrer les effets de la substance d'essai sur la morbidité et la mortalité néonatales, fournir des données préli ­
minaires sur la toxicité prénatale et postnatale pour le développement 
et orienter des essais ultérieurs. Cette méthode étudie non seulement la croissance et le développement de la génération F1, mais évalue 
aussi l'intégrité et le fonctionnement des appareils reproducteurs mâle 
et femelle, ainsi que la croissance et le développement de la géné ­
ration F2. Il est possible d'obtenir des informations supplémentaires sur la toxicité pour le développement et les déficits fonctionnels en 
complétant le présent protocole par des études décrites dans les 
méthodes d'essai relatives à la toxicité pour le développement et/ou à la neurotoxicité pour le développement, ou en procédant à des études séparées à l'aide de méthodes d'essai appropriées.
 
1.2 PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance d'essai est administrée à différentes doses échelonnées 
suivant une gradation à plusieurs groupes de mâles et de femelles. 
On administre la substance aux mâles de la génération P (génération 
parentale) durant leur croissance et pendant au moins un cycle sper ­
matogène complet (environ 56 jours chez la souris et 70 jours chez le rat) afin de mettre en évidence tous ses effets nocifs sur la sper ­
matogenèse. Les effets sur le sperme sont déterminés d'après 
plusieurs paramètres, comme la morphologie et la motilité des sper ­
matozoïdes, sur des préparations de tissus et au cours d'un examen histopathologique détaillé. Si l'on dispose de données sur la sperma ­
togenèse provenant d'une précédente étude à doses répétées de durée 
suffisante, par exemple 90 jours, il n'est pas nécessaire d'inclure les mâles de la génération P dans l'évaluation. Il est toutefois recom ­
mandé de conserver des échantillons ou des enregistrements numé ­
riques du sperme de la génération P, en vue d'une évaluation ulté ­
rieure. Les femelles de la génération P doivent être traitées durant la croissance et pendant plusieurs cycles œstraux complets de manière à pouvoir détecter tous les effets nocifs de la substance d'essai sur le 
cycle œstral. La substance d'essai est administrée aux animaux de la 
génération P durant la période d'accouplement, pendant les gestations qui en résultent et jusqu'au sevrage de la descendance F1. Après le sevrage, la descendance F1 continue de recevoir la substance durant 
toute sa croissance et l'administration se poursuit au cours de l'ac ­
couplement et de la production de la génération F2, jusqu'au sevrage de cette dernière.
 
Tous les animaux subissent un examen clinique et pathologique 
destiné à mettre en évidence des signes de toxicité; cet examen s'attache en particulier à l'évaluation des effets sur l'intégrité et le 
fonctionnement des appareils reproducteurs mâle et femelle, ainsi 
que sur la croissance et le développement de la descendance.
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1.3 DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.3.1  Choix des espèces  
Le rat est l'espèce qui convient le mieux à cet essai. Si on utilise une 
autre espèce, il faut justifier ce choix et effectuer les adaptations qui 
s'imposent. Les souches à faible taux de fécondité ou chez lesquelles 
l'incidence des anomalies du développement est notoirement élevée sont à proscrire. Au début de l'étude, la variation pondérale des animaux utilisés doit être minimale et ne doit pas dépasser 20 % 
du poids moyen des représentants de chaque sexe.
 
1.3.2  Conditions d'encagement et d'alimentation  
L'animalerie doit être à 22  o C (+ 3  o C), avec un taux d'humidité 
relative d'au moins 30 % et de préférence inférieur à 70 %, sauf pendant le nettoyage de la salle, l'idéal se situant entre 50 et 60 %. 
On appliquera un éclairage artificiel, avec un cycle de 12 heures de 
clarté et 12 heures d'obscurité. Un régime alimentaire classique pour animaux de laboratoire, avec eau potable à satiété, conviendra. Le choix des aliments sera guidé par la nécessité d'y incorporer la subs ­
tance d'essai, si elle est administrée par cette voie.
 
Les animaux peuvent être encagés individuellement ou par petits 
groupes du même sexe. L'accouplement doit se dérouler dans des cages appropriées. Après constatation de la copulation, les femelles 
s'étant accouplées seront placées dans des cages individuelles aména ­
gées pour la mise-bas ou la maternité. Les rates s'étant accouplées peuvent aussi être encagées par petits groupes et séparées un ou deux jours avant la mise-bas. À l'approche de la mise-bas, on leur fournira 
des matériaux de nidification appropriés et déterminés.
 
1.3.3  Préparation des animaux  
Il convient d'utiliser de jeunes animaux sains, acclimatés aux condi ­
tions du laboratoire pendant au moins 5 jours et n'ayant pas été soumis à d'autres essais. On indiquera l'espèce, la souche, la 
source, le sexe, le poids et/ou l'âge des animaux d'expérience. Il 
importe de connaître les liens collatéraux entre les animaux, afin de ne pas accoupler les membres d'une même fratrie. Les animaux sont répartis au hasard entre les groupes témoins et les groupes 
traités (il est recommandé de les regrouper par tranche de poids 
corporel). Les cages sont placées de manière à réduire au minimum les éventuels effets liés à leur disposition. Chaque animal est désigné par un numéro d'identification propre. Les 
animaux de la génération P doivent être identifiés avant le début 
du traitement; ceux de la génération F1 qui sont sélectionnés pour l'accouplement seront identifiés au moment du sevrage. On notera la portée d'origine de tous les animaux de la génération F1 sélectionnés. 
Il est également recommandé d'identifier chaque petit dès que 
possible après la naissance, si on envisage de les peser individuel ­
lement ou d'effectuer des essais fonctionnels.
 
Les animaux de la génération P seront âgés de 5 à 9 semaines au 
début du traitement. Tous les groupes d'essai doivent être aussi 
homogènes que possible quant au poids et à l'âge des animaux.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 512
 
1.4. MODE OPÉRATOIRE  
1.4.1.  Nombre et sexe des animaux  
Chaque groupe d'essai ou témoin doit comporter un nombre d'ani ­
maux suffisant pour que l'on puisse disposer en fin d'essai d'au 
moins 20 femelles gravides à terme ou presque. Pour les substances 
qui occasionnent des effets indésirables (stérilité, toxicité excessive à la dose élevée, par exemple), cela risque d'être impossible. Le but est d'obtenir suffisamment de femelles gravides pour pouvoir procéder à 
une évaluation significative de l'action de la substance étudiée sur la 
fertilité, la gestation, le comportement maternel et la période d'allai ­
tement, la croissance et le développement de la descendance F1, 
depuis la conception jusqu'à la maturité, et sur le développement 
de leur descendance F2 jusqu'au sevrage. En conséquence, le fait de ne pas avoir obtenu le nombre souhaité de femelles gravides (c'est-à-dire 20) n'invalide pas nécessairement l'étude, et la situation 
doit être évaluée au cas par cas.
 
1.4.2.  Préparation des doses  
Il est recommandé d'administrer la substance d'essai par voie orale 
(dans la nourriture, l'eau de boisson ou par gavage) à moins qu'une 
autre voie (cutanée ou par inhalation) ne soit jugée plus adéquate.  
S'il y a lieu, la substance d'essai est dissoute ou mise en suspension 
dans un véhicule approprié. On recommande, si possible, d'envisager 
d'abord l'utilisation d'une solution ou d'une suspension aqueuse, puis 
d'une solution ou d'une émulsion dans l'huile (par exemple l'huile de maïs) et en dernier lieu d'une solution dans d'autres véhicules. Si le véhicule n'est pas aqueux, sa toxicité doit être connue. Il faut déter ­
miner la stabilité de la substance d'essai dans le véhicule.
 
1.4.3.  Dosage  
On utilise au moins trois doses différentes et un témoin en parallèle. 
Sauf limitations imposées par les propriétés physiques, chimiques ou 
biologiques de la substance d'essai, la dose la plus élevée doit faire 
apparaître une certaine toxicité, sans entraîner la mort ni provoquer de souffrances aiguës. En cas de mortalité inattendue, si le taux de mortalité de la génération parentale est inférieur à environ 10 pour 
cent, l'étude reste en générale acceptable. Il convient de choisir une 
série décroissante de doses afin de mettre en évidence une éventuelle relation dose-effet ainsi qu'une dose sans effets toxiques (DSET). L'écart optimal entre chaque dose de la série décroissante est géné ­
ralement d'un facteur deux ou quatre, et l'adjonction d'un quatrième 
groupe d'essai est souvent préférable à la fixation d'écarts trop impor ­
tants (par exemple, supérieurs à un facteur dix). Si la substance d'essai est incorporée à la nourriture, l'écart entre les doses ne doit 
pas être supérieur à un facteur trois. Le choix des doses sera orienté 
par toutes les données existantes sur la toxicité, en particulier les résultats des études à doses répétées. Toute information sur le méta ­
bolisme et la cinétique de la substance d'essai ou d'un composé 
apparenté doit également être prise en considération. Ces informa ­
tions serviront aussi à justifier l'échelle des doses.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 513
 
Le groupe témoin sera un groupe non traité ou un groupe recevant le 
véhicule si la substance est administrée dans un véhicule. Exception 
faite de l'administration de la substance d'essai, les animaux du groupe témoin seront traités de la même manière que les animaux des groupes d'essai. Si un véhicule est employé, on administrera au 
groupe témoin le plus grand volume de véhicule utilisé. Lorsque la 
substance d'essai est administrée mélangée aux aliments et qu'il en résulte une diminution de la prise ou la consommation de nourriture, il peut s'avérer nécessaire d'adjoindre un groupe témoin nourri en 
parallèle. Les résultats d'études contrôlées destinées à évaluer les 
effets d'une diminution de la consommation de nourriture sur les paramètres de la reproduction peuvent remplacer l'utilisation d'un groupe témoin nourri en parallèle.
 
Il convient d'être attentif, le cas échéant, aux effets du véhicule ou 
des autres additifs sur l'absorption, la distribution, le métabolisme ou la rétention de la substance d'essai, aux effets sur les propriétés 
chimiques de la substance d'essai, susceptibles de modifier sa toxi ­
cité, ainsi qu'aux effets sur la consommation de nourriture ou d'eau et sur l'état nutritionnel des animaux.
 
1.4.4.  Essai limite  
Si un essai réalisé à une dose d'au moins 1 000 mg/kg de poids 
corporel/jour administrée par voie orale ou incorporée dans la nour ­
riture ou l'eau de boisson selon un pourcentage équivalent, confor ­
mément à la méthode décrite dans cette étude, n'entraîne pas de signes de toxicité observables chez les parents ou dans leur progé ­
niture et qu'aucun effet toxique n'est escompté au vu des données 
disponibles concernant des composés présentant une structure et/ou une action métabolique analogues, il n'est pas indispensable de mener une étude complète sur plusieurs doses différentes. L'essai 
limite n'a pas de raison d'être lorsque le niveau d'exposition 
humaine implique l'utilisation d'une dose orale plus élevée. Pour d'autres modes d'administration, tels que l'inhalation ou l'application 
cutanée, les propriétés physico-chimiques de la substance d'essai, 
comme sa solubilité, limitent souvent la concentration maximale applicable.
 
1.4.5.  Administration des doses  
Les animaux reçoivent la substance d'essai quotidiennement, sept 
jours sur sept. L'administration par voie orale (dans la nourriture, 
l'eau de boisson ou par gavage) est préférable. Si l'on opte pour un autre mode d'administration, il convient de justifier ce choix et d'apporter les modifications nécessaires, le cas échéant. On appli ­
quera le même mode d'administration à tous les animaux, durant la 
période expérimentale adéquate. Si la substance d'essai est adminis ­
trée par gavage, on procédera à l'aide d'une sonde gastrique. Le volume maximal de liquide administré en une seule fois ne doit 
pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel (0,4 ml/100 g de poids 
pour l'huile de maïs), sauf dans le cas des solutions aqueuses où l'on peut aller jusqu'à 2 ml/100 g de poids corporel. Sauf dans le cas de substances irritantes ou corrosives dont les effets s'intensifient géné ­
ralement aux concentrations supérieures, il y a lieu de réduire au 
minimum la variabilité du volume d'essai en adaptant les concen ­
trations de façon à obtenir un volume constant à toutes les doses. Dans les études par gavage, les petits ne reçoivent normalement la 
substance d'essai qu'indirectement, par le lait maternel, jusqu'à ce que 
l'administration directe débute pour eux, à partir du sevrage. Lorsque la substance d'essai est mélangée à la nourriture ou à l'eau de bois ­
son, les petits reçoivent aussi la substance d'essai directement dès 
qu'ils commencent à s'alimenter seuls, lors de la dernière semaine 
d'allaitement.
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Il est important de s'assurer que les quantités de substances adminis ­
trées dans la nourriture ou l'eau de boisson n'interfèrent pas avec la 
nutrition ou l'équilibre hydrique. Si la substance d'essai est ajoutée à la nourriture, elle peut être administrée à concentration constante dans cette dernière (ppm) ou à dose constante par rapport au poids 
de l'animal; il y a lieu de préciser l'option retenue. Si l'on recourt au 
gavage, il faut toujours administrer la substance d'essai à peu près à la même heure chaque jour et ajuster la dose au moins une fois par semaine pour qu'elle demeure constante par rapport au poids de 
l'animal. Cet ajustement devra tenir compte de la diffusion placen ­
taire.
 
1.4.6.  Programmes expérimentaux  
L'administration quotidienne de la substance d'essai aux mâles et aux 
femelles de la génération P doit débuter quand ils sont âgés de 5 à 9 semaines. Pour les mâles et les femelles de la génération F1, elle 
débutera au sevrage; il faut tenir compte du fait que, lorsque la 
substance d'essai est administrée dans la nourriture ou l'eau de bois ­
son, il est possible que les petits de la génération F1 soient déjà exposés directement à la substance durant la période d'allaitement. 
Les deux sexes des générations P et F1 continueront à recevoir la 
substance pendant au moins 10 semaines avant la période d'accou ­
plement. Le traitement sera poursuivi pour les deux sexes durant les deux semaines de la période d'accouplement. Les mâles qui ne servi ­
ront pas à l'évaluation des effets sur la reproduction seront euthana ­
siés et examinés. Les femelles de la génération P continueront à recevoir la substance d'essai tout au long de la gestation et jusqu'au sevrage de leur descendance F1. Il sera peut-être nécessaire de modi ­
fier le programme d'administration des doses à la lumière des infor ­
mations disponibles sur la substance d'essai, notamment en ce qui concerne la toxicité, l'induction métabolique ou la bioaccumulation. La dose administrée à chaque animal est normalement calculée 
d'après les résultats de la dernière pesée de l'animal. Toutefois, la 
prudence s'impose lors de l'ajustement de la dose au cours du dernier tiers de la gestation.
 
Le traitement des mâles et des femelles P et F1 se poursuit jusqu'à 
leur sacrifice. Tous les adultes mâles et femelles P et F1 qui ne sont 
plus nécessaires pour l'évaluation des effets sur la reproduction 
doivent être euthanasiés. Les descendants F1 qui n'ont pas été sélec ­
tionnés pour l'accouplement et tous les descendants F2 seront eutha ­
nasiés après le sevrage.  
1.4.7  Accouplement  
1.4.7.1  Accouplement de la génération parentale (P)  
Pour chaque accouplement, on réunira une femelle et un mâle traités 
à la même dose (accouplement 1:1) jusqu'à ce qu'ils aient copulé ou durant deux semaines. Les femelles subiront un examen quotidien destiné à détecter la présence de sperme ou d'un bouchon vaginal. Le 
jour 0 de la gestation est défini comme étant celui où l'on observe du 
sperme ou un bouchon vaginal. Si l'accouplement n'a pas lieu, on peut envisager de faire une deuxième tentative en réunissant les femelles avec des mâles du même groupe ayant fait leurs preuves. 
Les couples doivent être clairement identifiés dans les résultats. On 
évitera d'accoupler des membres d'une même fratrie.
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1.4.7.2  Accouplement de la génération F1  
S'agissant de l'accouplement de la génération F1, on sélectionne au 
moins un mâle et une femelle de chaque portée, au moment du sevrage, en vue de les accoupler avec d'autres descendants traités à 
la même dose, mais issus d'une autre portée, afin d'obtenir la géné ­
ration F2. La sélection des petits au sein d'une même portée doit se faire au hasard s'ils ne diffèrent pas de façon significative quant au poids corporel ou à l'apparence. Si l'on constate de telles différences, 
on sélectionnera les meilleurs représentants de chaque portée. D'un 
point de vue pragmatique, il est plus facile d'opérer cette sélection en fonction du poids corporel, mais il pourrait être plus pertinent de se 
fonder sur l'apparence. Les descendants F1 ne doivent pas être 
accouplés avant d'avoir atteint leur pleine maturité sexuelle.
 
On évaluera les couples sans descendance afin de déterminer la 
cause apparente de leur stérilité. À cet effet, on pourra donner aux 
animaux d'autres occasions de s'accoupler avec d'autres mâles ou femelles ayant fait leurs preuves, effectuer un examen microscopique des organes reproducteurs, ou analyser les cycles œstraux ou la 
spermatogenèse.
 
1.4.7.3.  Deuxième accouplement  
Dans certains cas, notamment lorsque la taille de la portée est modi ­
fiée par le traitement ou lorsqu'un effet équivoque est observé dans 
le premier accouplement, on préconise d'accoupler une deuxième fois les adultes P ou F1, afin d'obtenir une deuxième portée. Il est recom ­
mandé d'accoupler une deuxième fois les mâles ou les femelles qui 
n'ont pas engendré de portée avec un reproducteur ou une reproduc ­
trice ayant fait ses preuves. Si la production d'une deuxième portée est jugée nécessaire, le deuxième accouplement doit avoir lieu environ une semaine après le sevrage de la dernière portée.
 
1.4.7.4.  Taille de la portée  
On laisse les animaux mettre bas normalement et élever leur progé ­
niture jusqu'au sevrage. La normalisation de la taille des portées est facultative; si l'on y recourt, il faut décrire en détail la méthode 
utilisée.
 
1.5. OBSERVATIONS  
1.5.1.  Observations cliniques  
Une observation clinique générale est réalisée chaque jour; en cas 
d'administration par gavage, l'heure à laquelle cette observation est 
réalisée doit tenir compte du moment où l'on prévoit que les effets atteindront leur intensité maximale après administration. On notera les changements de comportement, les signes de mise-bas prolongée 
ou difficile et tous les symptômes de toxicité. En outre, au moins une 
fois par semaine, chaque animal devra faire l'objet d'un examen plus détaillé qui pourrait être aisément réalisé à l'occasion d'une pesée de l'animal. Deux fois par jour et une fois par jour pendant le week-end, 
selon les besoins, on recherchera des signes de morbidité et de 
mortalité sur tous les animaux.
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1.5.2.  Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau des 
animaux parents  
Les animaux parents (P et F1) sont pesés le jour de la première 
administration et ensuite au moins une fois par semaine. Les 
mères (P et F1) sont pesées au minimum aux jours 0, 7, 14, et 20 
ou 21 de la gestation, puis aux mêmes jours que leurs petits durant l'allaitement, et enfin le jour de leur sacrifice. Les résultats sont consignés individuellement pour chaque animal adulte. Durant la 
période qui précède l'accouplement et pendant la gestation, la 
consommation de nourriture est mesurée au moins une fois par semaine. La consommation d'eau est relevée au moins une fois par 
semaine si la substance d'essai est administrée dans l'eau.
 
1.5.3.  Cycle œstral  
La durée et la normalité du cycle œstral sont évaluées chez les 
femelles P et Fl à l'aide de frottis vaginaux, avant l'accouplement, et facultativement pendant la période d'accouplement, jusqu'à consta ­
tation de preuves d'accouplement. Les cellules vaginales ou cervi ­
cales seront prélevées avec soin pour éviter d'agresser la muqueuse et d'induire ainsi une pseudogestation (1).
 
1.5.4.  Paramètres d'évaluation du sperme  
On note le poids des testicules et des épididymes de tous les mâles P 
ou F1 sacrifiés, en conservant un exemplaire de chaque organe pour 
l'examen histopathologique (voir paragraphes 1.5.7, 1.5.8.1). On réservera les testicules et les épididymes d'un sous-lot composé d'au moins dix mâles de chaque génération (P et F1) pour la numé ­
ration des spermatides résistantes à l'homogénéisation et des sperma ­
tozoïdes stockés dans la queue de l'épididyme. Dans ce même sous- lot de mâles, on recueillera le contenu de la queue de l'épididyme ou du canal déférent en vue d'évaluer la motilité et la morphologie des 
spermatozoïdes. Si des effets liés au traitement sont observés ou si 
d'autres études révèlent que la substance peut avoir des effets sur la spermatogénèse, l'évaluation du sperme sera réalisée sur tous les mâles traités aux différentes doses; dans le cas contraire, on pourra 
limiter la numération aux mâles P et F1 du groupe témoin et du 
groupe traité à la dose la plus élevée.
 
Il convient de dénombrer la totalité des spermatides testiculaires 
résistantes à l'homogénéisation et des spermatozoïdes de la queue 
de l'épididyme (2) (3). Le nombre de spermatozoïdes mis en réserve dans la queue de l'épididyme peut être déduit de la concen ­
tration et du volume des spermatozoïdes dans la suspension utilisée 
pour compléter les évaluations qualitatives, et du nombre de sper ­
matozoïdes récupérés après le broyage et/ou l'homogénéisation ulté ­
rieurs du tissu caudal restant. La numération doit être effectuée au sein du sous-lot de mâles sélectionnés dans les groupes traités aux 
différentes doses, immédiatement après le sacrifice, à moins qu'on ne 
réalise des enregistrements vidéo ou numériques ou qu'on ne congèle des échantillons en vue d'une analyse ultérieure. Dans ces circons ­
tances, le groupe témoin et le groupe traité à la dose la plus élevée 
peuvent être analysés en premier. Si l'on n'observe pas d'effets liés 
au traitement (révélés par exemple par la numération, la morphologie ou la motilité des spermatozoïdes), il n'est pas nécessaire d'analyser les groupes traités aux autres doses. Si des effets liés au traitement 
apparaissent dans le groupe traité à la dose la plus élevée, on 
évaluera aussi les groupes traités aux doses plus faibles.
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La motilité des spermatozoïdes dans l'épididyme ou le canal déférent 
est évaluée ou enregistrée sur support vidéo immédiatement après le 
sacrifice. Le sperme, prélevé de façon à éviter autant que possible de léser les organes, est dilué en vue de l'analyse de la motilité selon une méthode acceptable (4). Il convient d'évaluer subjectivement ou 
objectivement le pourcentage de spermatozoïdes devenant progres ­
sivement mobiles. Si l'on pratique une analyse du mouvement assistée par ordinateur (5) (6) (7) (8) (9) (10), la motilité progressive est évaluée d'après les seuils définis par l'utilisateur pour la vitesse 
moyenne de trajectoire, la rectilignité ou l'index linéaire. Si les 
échantillons sont enregistrés en vidéo (11) ou si les images sont enregistrées d'une autre manière au moment de l'autopsie, l'analyse subséquente pourra se limiter aux mâles P et F1 du groupe témoin et 
du groupe traité à la dose la plus élevée, à moins que des effets liés 
au traitement n'aient été observés, auquel cas il faudra aussi évaluer les groupes traités aux doses plus faibles. En l'absence d'une image vidéo ou numérique, tous les échantillons de tous les groupes traités 
devront être analysés lors de l'autopsie.
 
On procédera à une évaluation morphologique d'un échantillon de 
sperme de l'épididyme ou du canal déférent. Les spermatozoïdes (au moins 200 par échantillon) doivent être examinés dans des prépara ­
tions fixées et en milieu liquide (12), puis classés en tant que spéci ­
mens normaux ou anormaux. Les anomalies morphologiques des 
spermatozoïdes comprennent, par exemple, la fusion, des têtes isolées et des têtes et/ou des queues déformées. L'évaluation doit être réalisée au sein du sous-lot de mâles sélectionnés dans les 
groupes traités aux différentes doses, immédiatement après le sacri ­
fice ou ultérieurement à partir des enregistrements vidéo ou numé ­
riques. Les frottis, une fois fixés, peuvent aussi être analysés à une date ultérieure. Dans ces circonstances, le groupe témoin et le groupe 
traité à la dose la plus élevée peuvent être analysés en premier. Si 
l'on n'observe pas d'effets liés au traitement (sur la morphologie des spermatozoïdes, par exemple), l'analyse des groupes traités aux autres doses devient superflue. Si des effets liés au traitement appa ­
raissent dans le groupe traité à la plus dose élevée, il convient 
d'évaluer également les groupes traités aux doses plus faibles.
 
Si l'un des paramètres d'évaluation du sperme mentionnés plus haut a 
déjà été examiné dans le cadre d'une étude de toxicité systémique 
d'au moins 90 jours, il ne doit pas nécessairement être réévalué au 
cours de l'étude de la toxicité sur deux générations. Il est cependant recommandé de conserver des échantillons ou des enregistrements vidéo du sperme de la génération P, pour permettre une évaluation 
ultérieure si nécessaire.
 
1.5.5.  Descendance  
On examine chaque portée dès que possible après la mise-bas (jour 0 
de l'allaitement), afin d'établir le nombre et le sexe des petits, la 
mortinatalité, le nombre de naissances vivantes et la présence d'ano ­
malies macroscopiques. Les petits trouvés morts au jour 0 seront de préférence examinés, s'ils ne sont pas macérés, afin de mettre en 
évidence d'éventuelles anomalies et de déterminer la cause de la 
mort, et conservés. Les petits vivants doivent être comptés et pesés individuellement à la naissance (jour 0 de l'allaitement) ou le jour 1, et pesés régulièrement par la suite, par exemple les jours 4, 7, 14 et 
21 de l'allaitement. On notera les anomalies physiques et comporte ­
mentales observées chez les mères ou les petits.
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Le développement physique de la descendance est consigné essen ­
tiellement sous la forme du gain de poids corporel. D'autres paramè ­
tres physiques (ouverture des oreilles et des yeux, sortie des dents, développement de la pilosité, par exemple) peuvent fournir des infor ­
mations supplémentaires, mais ces observations sont de préférence 
réservées à l'évaluation de la maturité sexuelle (âge et poids corporel 
au moment de l'ouverture vaginale ou de la séparation balano-prépu ­
tiale, par exemple) (13). Il est recommandé de réaliser des explora ­
tions fonctionnelles (l'activité motrice, les fonctions sensorielles, l'on ­
togenèse des réflexes, par exemple) de la descendance F1 avant et/ou 
après le sevrage, notamment celles qui se rapportent à la maturation sexuelle, si elles ne sont pas explorées dans d'autres études. On détermine l'âge auquel sont survenus l'ouverture vaginale ou la sépa ­
ration balano-préputiale chez les descendants F1 tout juste sevrés qui 
ont été sélectionnés en vue de l'accouplement. Il convient de mesurer la distance ano-génitale chez les petits F2, le jour de leur naissance, si l'on a constaté une modification de la proportion de mâles et de 
femelles ou de l'âge de maturation sexuelle dans la génération F1.
 
Les observations fonctionnelles ne s'imposent plus pour les groupes 
présentant des signes évidents de toxicité (diminution sensible de la 
prise de poids, etc., par exemple). Les explorations fonctionnelles, le cas échéant, seront réalisées sur les petits non sélectionnés pour l'accouplement.
 
1.5.6.  Examen macroscopique  
Juste après le sacrifice ou la mort si celle-ci survient en cours 
d'étude, tous les animaux parents (P et F1), tous les petits qui présen ­
tent des anomalies externes ou des signes cliniques, ainsi qu'un 
petit/un sexe/une portée choisi(e) au hasard dans chaque génération (F1 et F2) sont soumis à un examen macroscopique destiné à révéler d'éventuels changements pathologiques ou anomalies structurelles. 
L'examen des organes reproducteurs doit faire l'objet d'une attention 
particulière. Il y a lieu d'examiner les petits moribonds qui ont été euthanasiés ainsi que les petits morts, s'ils ne sont pas macérés, afin de détecter d'éventuelles anomalies et/ou établir la cause de la mort, 
et de les conserver.
 
On examinera les utérus de toutes les femelles primipares, sans 
compromettre l'évaluation histopathologique, pour voir s'ils présen ­
tent des points d'implantation et les dénombrer.  
1.5.7.  Pesée des organes  
Juste après le sacrifice, on détermine le poids corporel de tous les 
parents P et F1 ainsi que le poids des organes suivants (les deux 
exemplaire des organes qui vont par paires doivent être pesés sépa ­
rément):  
— utérus, ovaires,  
— testicules, épididymes (entiers et queues),  
— prostate,  
— vésicules séminales avec glandes coagulantes et leurs liquides, et 
prostate (ensemble),  
— cerveau, foie, reins, rate, hypophyse, glande thyroïde, glandes 
surrénales et organes cibles connus.  
Les poids corporels des petits F1 et F2 retenus pour l'autopsie sont 
déterminés après le sacrifice, de même que le poids du cerveau, de la 
rate et du thymus d'un petit/un sexe/une portée choisi(e) au hasard 
(voir paragraphe 1.5.6).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 519
 
Si possible, les résultats de l'autopsie et de la pesée des organes 
doivent être interprétés à la lumière des observations effectuées 
dans d'autres études à doses répétées.  
1.5.8.  Histopathologie  
1.5.8.1.  Animaux parents  
Les organes et tissus ci-après des animaux parents (P et F1), ou des 
échantillons représentatifs de ces derniers, sont fixés et conservés dans un milieu approprié en vue de l'examen histopathologique.
 
— vagin, utérus avec col, et ovaires (conservés dans un fixateur 
approprié),  
— un testicule (conservé dans un fixateur approprié), un épididyme, 
les vésicules séminales, la prostate et une glande coagulante,  
— organe(s) cible(s) précédemment identifié(s) de tous les animaux 
P et F1 sélectionnés pour l'accouplement.  
Tous les animaux P et F1 du groupe témoin et du groupe traité à la 
dose la plus élevée, qui ont été sélectionnés pour l'accouplement, doivent faire l'objet d'un examen histopathologique complet des 
organes et tissus susmentionnés. L'examen des ovaires des femelles 
P est facultatif. Il convient également d'examiner les organes présen ­
tant des altérations liées au traitement dans les groupes traités à la dose la plus faible et à la dose intermédiaire, afin de faciliter la 
détermination de la DSET. De plus, une évaluation histopathologique 
sera pratiquée sur les organes reproducteurs des animaux traités aux doses faibles et moyennes, chez lesquels on soupçonne une diminu ­
tion de la fertilité, par exemple, ceux qui ne se sont pas accouplés, 
qui n'ont pas conçu, n'ont pas engendré ou n'ont pas donné naissance 
à des descendants sains, ou ceux chez qui on a constaté des modi ­
fications du cycle œstral ou du nombre, de la motilité ou de la morphologie des spermatozoïdes. Toutes les lésions macroscopiques 
telles qu'atrophies ou tumeurs doivent être examinées.
 
Un examen histopathologique détaillé des testicules doit être effectué 
(par exemple, fixation dans du liquide de Bouin, inclusion dans la paraffine et coupes transversales de 4-5 μm d'épaisseur) afin de 
mettre en évidence des effets liés au traitement, notamment une 
rétention de spermatides, l'absence de certaines couches ou types 
de cellules germinales, la présence de cellules géantes multinucléées ou le décollement des cellules spermatogènes dans la lumière des tubules séminifères (14). L'examen d'un épididyme intact doit porter 
sur la tête, le corps et la queue, ce qui peut être effectué sur une 
section longitudinale. On observera l'épididyme pour voir s'il ne s'y produit pas d'infiltration de leucocytes, de changement dans la fréquence des types cellulaires et de phagocytose des spermato ­
zoïdes, et s'il ne renferme pas de cellules aberrantes. L'examen des 
organes reproducteurs mâles peut être effectué à l'aide d'une colora ­
tion à l'acide périodique-Schiff ou à l'hématoxyline.
 
Après la lactation, l'ovaire devrait contenir des follicules primordiaux 
et des follicules en croissance ainsi que les grands corps jaunes de la 
lactation. L'examen histopathologique doit révéler une déplétion 
qualitative de la population de follicules primordiaux. Les follicules primordiaux des femelles F1 feront l'objet d'une évaluation quantita ­
tive; le nombre d'animaux, le choix de la section ovarienne et la 
taille des échantillons de sections doivent être statistiquement vala ­
bles pour la méthode d'évaluation employée. L'examen comprend la numération des follicules primordiaux, lesquels peuvent être combinés à de petits follicules en croissance, aux fins de la compa ­
raison entre les ovaires des femelles traitées et témoins (15) (16) (17) 
(18) (19).
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1.5.8.2.  Petits sevrés  
Les tissus présentant des anomalies macroscopiques et les organes 
cibles de tous les petits qui présentent des anomalies externes ou des signes cliniques ainsi que ceux du petit/du sexe/de la portée choisi(e) 
au hasard dans chaque génération (F1 et F2) et non retenu(e) pour 
l'accouplement seront fixés et conservés dans un milieu approprié en vue de l'examen histopathologique. La description histopathologique complète des tissus conservés sera plus particulièrement axée sur les 
organes reproducteurs.
 
2. RÉSULTATS  
2.1 TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les résultats obtenus sur chaque animal seront consignés et résumés 
sous forme de tableaux, reprenant pour chaque groupe d'essai et 
chaque génération, le nombre d'animaux présents au début de l'essai, le nombre d'animaux morts durant l'essai ou euthanasiés, la date de la mort ou de l'euthanasie, le nombre d'animaux fertiles, le nombre 
de femelles gravides, le nombre d'animaux manifestant des signes de 
toxicité, la description des signes de toxicité observés, notamment le moment où ils ont débuté, leur durée et leur gravité, les types d'al ­
térations histopathologiques et toutes les données pertinentes sur la 
portée.
 
Les résultats numériques seront évalués à l'aide d'une méthode statis ­
tique appropriée et reconnue; le choix des méthodes statistiques doit 
intervenir lors de la conception de l'étude et doit être justifié. Les modèles statistiques s'appliquant aux relations «dose-effet» peuvent être utiles à l'analyse des résultats. Le rapport doit fournir suffisam ­
ment d'informations sur la méthode d'analyse et le logiciel employés, 
pour qu'un réviseur ou un statisticien indépendant puisse réévaluer et reconstruire l'analyse.
 
2.2 ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Les résultats de cette étude de toxicité pour la reproduction sur deux 
générations doivent être évalués en fonction des effets observés, notamment à l'autopsie et lors des examens microscopiques. L'éva ­
luation portera sur la relation, ou l'absence de relation, entre la dose 
administrée de substance d'essai et la présence, la fréquence et la 
gravité des anomalies, notamment lésions macroscopiques, organes cibles identifiés, altération de la fertilité, anomalies cliniques, altéra ­
tion de la capacité de reproduction et des performances de la portée, 
modifications du poids corporel, effets sur la mortalité et tout autre 
effet toxique. Les propriétés physicochimiques de la substance d'essai et, le cas échéant, les données toxicocinétiques doivent être prises en considération lors de l'évaluation des résultats.
 
Une étude de toxicité pour la reproduction correctement menée doit 
fournir une estimation satisfaisante de la dose sans effet et permettre de comprendre les effets nocifs de la substance étudiée sur la repro ­
duction, là parturition, l'allaitement et le développement postnatal, 
notamment la croissance et la maturation sexuelle.
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2.3 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Une étude de toxicité pour la reproduction sur deux générations 
fournit des informations sur les effets d'une l'exposition répétée à une substance durant toutes les phases du cycle de reproduction. 
L'étude livre notamment des informations sur les paramètres de la 
reproduction ainsi que sur le développement, la croissance et la survie des descendants. Les résultats de l'étude doivent être inter ­
prétés à la lumière des résultats des études subchroniques, préna ­
tales, de développement, toxicocinétiques et autres disponibles. Les 
résultats de la présente étude peuvent servir à apprécier la néces ­
sité de réaliser d'autres essais sur une substance chimique. L'ex ­
trapolation des résultats de l'étude à l'homme présente un intérêt 
limité. Ces résultats se prêtent davantage à la détermination des concentrations sans effet et des niveaux d'exposition humaine acceptables (20) (21) (22) (23).
 
3. RAPPORT  
3.1 RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport doit contenir les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— nature physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques  
— identification  
— degré de pureté  
Véhicule, le cas échéant:  
— justification du choix du véhicule s'il diffère de l'eau  
Animaux d'expérience:  
— espèce et souche  
— nombre, âge et sexe des animaux  
— origine, conditions d'encagement, régime alimentaire, matériaux 
de nidification, etc.  
— poids de chaque animal au début de l'essai  
Conditions d'essai:  
— justification du choix des doses  
— détails concernant la formulation de la substance d'essai/son 
incorporation aux aliments, la concentration obtenue  
— stabilité et homogénéité de la préparation;  
— détails concernant l'administration de la substance d'essai;  
— conversion de la concentration de la substance d'essai (ppm) dans 
la nourriture ou l'eau de boisson en dose administrée (mg/kg de poids corporel/jour), s'il y a lieu;
 
— détails concernant la qualité de l'alimentation et de l'eau de 
boisson.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 522
 
Résultats:  
— consommation de nourriture, et d'eau si elle a été enregistrée, 
efficacité alimentaire (gain de poids corporel par gramme d'ali ­
ments consommés), et consommation de la substance d'essai par 
les animaux P et F1, sauf pendant la cohabitation et durant au moins le dernier tiers de la période d'allaitement;
 
— données sur l'absorption, le cas échéant;  
— poids corporel des animaux P et F1 sélectionnés pour l'accou ­
plement;  
— données relatives aux portées et au poids des petits;  
— poids corporel au moment du sacrifice et poids absolu et relatif 
des organes des animaux parents  
— nature, gravité et durée des signes cliniques (qu'ils soient réversi ­
bles ou non);  
— date de mort en cours d'étude ou animaux ayant survécu jusqu'au 
sacrifice;  
— manifestation de la toxicité par sexe et par dose, y compris 
indices d'accouplement, de fécondité, de gestation, de natalité, 
de viabilité et d'allaitement; le rapport doit mentionner les chif ­
fres ayant servi au calcul de ces indices;  
— effets toxiques ou autres sur la reproduction, la descendance, la 
croissance postnatale, etc.;  
— observations à l'autopsie;  
— description détaillée de toutes les observations histopatholo ­
giques;  
— nombre de femelles P et F1 ayant un cycle normal et durée du 
cycle;  
— nombre total de spermatozoïdes dans la queue de l'épididyme, 
pourcentage de spermatozoïdes progressivement mobiles, pour ­
centage de spermatozoïdes à morphologie normale et pourcen ­
tage de spermatozoïdes par anomalie identifiée;  
— temps écoulé jusqu'à l'accouplement, exprimé en nombre de 
jours;  
— durée de la gestation;  
— nombre d'implantations, de corps jaunes, taille de la portée;  
— nombre de naissances vivantes et de pertes postimplantatoires;  
— nombre de petits affectés d'anomalies macroscopiques; nombre 
de rabougris s'il a été déterminé;  
— paramètres physiques évalués sur les petits et autres données sur 
le développement postnatal; il y a lieu de justifier les paramètres 
physiques évalués;  
— observations fonctionnelles réalisées sur les petits et sur les 
adultes, suivant le cas;  
— traitement statistique des résultats, le cas échéant.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 523
 
Discussion  
Conclusions, y compris valeurs de la DSET pour les effets sur la 
mère et sur les petits.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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B.36.  TOXICOCINÉTIQUE  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 417 (2010) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Les études portant sur la toxicocinétique d’une substance chimique d’essai ont pour objet de fournir 
des informations adéquates sur l’absorption, la distribution, la biotransfor ­
mation (c’est-à-dire le métabolisme) et l’excrétion de cette substance, de faciliter l’établissement d’une relation entre la concentration ou la dose et la toxicité observée, et d’aider à comprendre le mécanisme de toxicité. La 
toxicocinétique peut aider à comprendre les études de toxicologie en démon ­
trant que l’exposition des animaux d’expérience à la substance d’essai est de nature systémique, et en révélant quels sont les éléments circulants (subs ­
tance mère/métabolites). Les principaux paramètres toxicocinétiques tirés de 
ces études fourniront également des renseignements sur le potentiel d’accu ­
mulation de la substance d’essai dans les tissus et/ou organes, et sur le risque d’induction d’une biotransformation sous l’effet d’une exposition à cette substance.
 
2. Les données toxicocinétiques peuvent aider à évaluer l’adéquation et la 
pertinence des données de toxicité animale, à des fins d’extrapolation des dangers pour l’homme et/ou d’évaluation des risques. De plus, les études de 
toxicocinétique peuvent apporter des informations utiles pour déterminer les 
doses à utiliser dans les études de toxicité (cinétique linéaire vs non linéaire), et les effets liés à la voie d’administration, la biodisponibilité et autres aspects relatifs à la conception de l’étude. Certains types de données 
toxicocinétiques peuvent servir à élaborer des modèles toxicocinétiques à 
base physiologique (TCBP).
 
3. Les données sur la toxicocinétique et le métabolisme présentent de l’intérêt à 
plusieurs titres. Elles peuvent notamment indiquer les toxicités et modes 
d’action éventuels, ainsi que leur relation aux doses et à la voie d’exposi ­
tion. En outre, les données sur le métabolisme peuvent apporter des infor ­
mations utiles pour évaluer l’importance, sur le plan toxicologique, de l’ex ­
position à des métabolites exogènes de la substance d’essai.  
4. Des données toxicocinétiques adéquates aideront à confirmer l’acceptabilité 
et l’applicabilité des méthodes fondées sur les relations quantitatives 
structure-activité, les prévisions à partir de données croisées sur de subs ­
tances analogues ou le regroupement des substances pour évaluer la sécurité des substances chimiques. Les données de cinétique peuvent aussi servir à évaluer la pertinence toxicologique d’autres études (par exemple in vivo/in 
vitro).
 
5. Sauf mention contraire (voir en particulier les paragraphes 74 à 78), la 
présente méthode d’essai suppose l’administration orale de la substance 
d’essai.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
6. Les régimes réglementaires ont des exigences et des besoins différents quant 
aux effets et paramètres toxicocinétiques à mesurer pour différentes classes de produits chimiques (par exemple pesticides, biocides, produits indus ­
triels). Contrairement à la plupart des autres, la présente méthode d’essai 
décrit des essais de toxicocinétique impliquant des mesures et des effets 
observés multiples. À l’avenir, plusieurs nouvelles méthodes d’essai et/ou document(s) d’orientation pourraient être élaborés pour décrire séparément et plus en détail chaque effet mesuré. Dans le cas de la présente méthode 
d’essai, ce sont les exigences et/ou besoins de chaque dispositif réglemen ­
taire qui déterminent les essais ou l’évaluation à mettre en œuvre.
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7. De nombreuses études peuvent être réalisées pour évaluer à des fins régle ­
mentaires le comportement toxicocinétique d’une substance d’essai. Néan ­
moins, en fonction des besoins ou des situations réglementaires particulières, toutes ces études ne sont pas nécessaires à l’évaluation d’un produit. Dans la conduite des études de toxicocinétique, il faut faire preuve de souplesse et 
prendre en considération les caractéristiques de la substance d’essai. Dans 
certains cas, l’étude d’une série précise de questions peut suffire à cerner les dangers et les risques associés à la substance d’essai. Parfois, les données toxicocinétiques peuvent être collectées dans le cadre d’une évaluation rele ­
vant d’autres études toxicologiques. Dans d’autres cas, il peut être nécessaire 
de réaliser des études de toxicocinétique supplémentaires et/ou plus appro ­
fondies, si la réglementation en vigueur l’exige et/ou lorsque l’évaluation de la substance d’essai soulève de nouvelles interrogations.
 
8. Avant de lancer une étude, et pour en améliorer la qualité et éviter une 
utilisation non nécessaire d’animaux, le laboratoire d’essai prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance d’essai et sur ses méta ­
bolites et analogues pertinents. Parmi ces informations pourront figurer des 
données obtenues grâce à d’autres méthodes d’essai appropriées (études in 
vivo, in vitro, et/ou évaluations in silico). Les propriétés physico-chimiques, comme le coefficient de partage octanol-eau (log P
 OE ), le pKa, l’hydroso ­
lubilité, la pression de vapeur et le poids moléculaire d’un produit chimique, 
peuvent être utiles pour planifier l’étude et interpréter ses résultats. Les méthodes décrites à cet effet dans les différentes méthodes d’essai permet ­
tront de les déterminer
 
LIMITATIONS  
9. La présente méthode d’essai ne vise pas les cas particuliers, comme les 
femelles gravides ou en lactation et leur progéniture, ni l’évaluation de la 
présence éventuelle de résidus chez des animaux exposés servant à l’ali ­
mentation. Néanmoins, les données obtenues à l’issue d’une étude menée selon la méthode B.36 peuvent fournir des informations susceptibles 
d’orienter la conception d’études spécifiques sur ces sujets. La présente 
méthode d’essai n’est pas destinée aux essais de nanomatériaux. L’examen préliminaire des Lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques en vue d’évaluer leur applicabilité aux nanomatériaux indique en 
effet que la ligne directrice 417 (équivalente à la présente méthode d’essai) 
peut ne pas s’appliquer à ces derniers (1).
 
DÉFINITIONS  
10. Les définitions utilisées aux fins de la présente méthode d’essai figurent en 
appendice.  
CONSIDÉRATIONS RELATIVES AU BIEN-ÊTRE DES ANIMAUX  
11. On trouvera dans le document d’orientation de l’OCDE n  o 19 (2) des 
indications concernant le traitement éthiquement acceptable des animaux. 
La consultation de ce document est recommandée pour toutes les études in vivo et in vitro décrites dans la présente méthode d’essai.
 
DESCRIPTION DES MÉTHODES  
Études pilotes  
12. Pour le choix des paramètres expérimentaux s’appliquant aux études de 
toxicocinétique (par exemple métabolisme, bilan massique, protocoles analy ­
tiques, dosage, exhalation de CO  2 , etc.), il est recommandé et conseillé de 
recourir à des études pilotes. La caractérisation de ces paramètres ne néces ­
site pas systématiquement l’emploi de substances radiomarquées.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 527
 
Sélection des animaux  
Espèces  
13. Les espèces (et souches) animales utilisées pour les essais de toxicocinétique 
sont de préférence les mêmes que celles employées dans d’autres études toxicologiques réalisées avec la substance d’essai concernée. C’est norma ­
lement le rat qui est retenu, puisque les études toxicologiques l’utilisent 
massivement. Le recours à d’autres espèces, à la place ou en complément, 
est légitime si des études toxicologiques majeures indiquent des effets toxiques significatifs sur ces espèces, ou s’il est démontré que le compor ­
tement de ces dernières en termes de toxicité/toxicocinétique est plus perti ­
nent pour l’homme. Il conviendra de justifier le choix de l’espèce animale et 
de la souche.
 
14. Sauf mention contraire, la présente méthode d’essai suppose le rat comme 
espèce d’essai. Certains aspects de cette méthode d’essai pourraient devoir être modifiés en cas de recours à une autre espèce.
 
Âge et souche  
15. Il convient d’employer de jeunes animaux adultes en bonne santé, âgés 
normalement de 6 à 12 semaines au moment de l’administration de la 
dose (voir également les paragraphes 13 et 14). L’utilisation d’animaux autres que des jeunes adultes fait l’objet de justification. Tous les animaux ont à peu près le même âge au début de l’étude. Les écarts de 
poids entre individus ne dépassent pas ± 20 % du poids moyen du groupe 
d’essai. Idéalement, la souche utilisée est la même que celle employée pour constituer la base de données toxicologiques concernant la substance d’essai.
 
Nombre et sexe des animaux  
16. Pour chaque dose testée, au minimum quatre animaux de même sexe sont 
utilisés. Il convient de justifier le sexe des animaux employés. L’utilisation 
d’animaux des deux sexes (quatre mâles et quatre femelles) est envisagée s’il existe des éléments attestant de différences de toxicité notables en fonc ­
tion du sexe.
 
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
17. Les animaux sont en général placés dans des cages individuelles pendant la 
période d’essai. L’encagement collectif se justifie dans des circonstances particulières. L’éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. La température de l’animalerie d’expérience est de 22 °C 
(± 3 °C) et l’humidité relative de 30 à 70 %. L’alimentation pourra 
comporter une nourriture classique de laboratoire et de l’eau à satiété.
 
Substance d’essai  
18. Une substance d’essai radiomarquée au  14 C est utilisée pour tous les aspects 
de l’étude concernant le bilan massique et l’identification des métabolites; 
néanmoins, s’il peut être démontré:  
— qu’il est possible d’évaluer correctement le bilan massique et de 
procéder à l’identification des métabolites à l’aide d’une substance 
d’essai non marquée, et  
— que la spécificité et la sensibilité analytiques de la méthode utilisant une 
substance d’essai non radioactive sont égales ou supérieures à celles 
qu’on obtiendrait avec une substance radiomarquée,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 528
 
alors il n’est pas nécessaire de recourir à une substance d’essai radiomar ­
quée. Par ailleurs, d’autres isotopes radioactifs et stables peuvent être 
employés, en particulier si l’élément en question cause la toxicité ou fait partie de la portion toxique de la substance d’essai. Si possible, le marqueur radioactif se situe dans une portion centrale métaboliquement stable (c’est-à- 
dire qui n’est pas échangeable, n’est pas éliminée par métabolisme sous 
forme de CO
 2 , et n’est pas incorporée dans l’ensemble des radicaux mono ­
carbonés de l’organisme) de la molécule. Le marquage de sites multiples ou de régions spécifiques de la molécule peut être nécessaire pour suivre le 
devenir métabolique de la substance d’essai.
 
19. Les substances d’essai radiomarquées et non radiomarquées sont analysées à 
l’aide de méthodes appropriées permettant d’établir leur pureté et leur iden ­
tité. La radiopureté de la substance d’essai radioactive est la meilleure qu’on 
puisse obtenir pour une substance donnée (dans l’idéal, elle est supérieure à 95 %) et un effort raisonnable est fourni pour identifier les impuretés présentes à hauteur de 2 % ou plus. La pureté ainsi que l’identité et la 
proportion des éventuelles impuretés identifiées sont incluses dans le 
rapport d’essai. Certains programmes réglementaires peuvent choisir de fournir des orientations supplémentaires pour aider à définir et à spécifier les substances d’essai composées de mélanges, ainsi que les méthodes de 
détermination de la pureté.
 
Choix des doses  
Étude pilote  
20. Le plus souvent, une dose orale unique suffit pour l’étude pilote. La dose est 
non toxique, mais suffisamment élevée pour permettre l’identification des 
métabolites dans les excréta (et, le cas échéant, dans le plasma), ainsi que pour remplir l’objectif assigné à l’étude pilote au paragraphe 12 de la présente méthode d’essai.
 
Études principales  
21. Pour les études principales, il est préférable d’administrer un minimum de 
deux doses, car les informations réunies à partir d’au moins deux groupes de dose peuvent faciliter la détermination des doses pour d’autres études de toxicité, ainsi que l’évaluation de la relation dose-effet d’essais de toxicité 
déjà disponibles.
 
22. Lorsque deux doses sont administrées, elles sont toutes deux suffisamment 
élevées pour permettre l’identification des métabolites dans les excréta (et, le 
cas échéant, dans le plasma). Les informations tirées des études de toxicité 
disponibles sont prises en compte pour le dosage. Si l’on ne dispose pas d’informations (provenant, par exemple, d’études de toxicité orale aiguë indiquant des signes cliniques de toxicité, ou d’études de toxicité par 
doses répétées), on peut envisager pour la dose la plus élevée une valeur 
inférieure à l’estimation de la DL
 50 (voies orale et cutanée) ou de la CL  50 
(voie par inhalation), ou inférieure à la valeur basse de la plage des estima ­
tions de toxicité aiguë. La dose la plus faible correspondra à une fraction de 
la dose la plus élevée.  
23. Si un seul dosage est utilisé, la dose est idéalement suffisamment élevée 
pour permettre l’identification des métabolites dans les excréta (et, le cas 
échéant, dans le plasma), sans pour autant produire de toxicité apparente. Il 
convient de justifier la décision de ne pas inclure un second niveau de dose.  
24. Si l’on a besoin de déterminer l’effet de la dose sur les processus cinétiques, 
deux doses peuvent ne pas suffire et il convient qu’au moins une dose soit 
assez élevée pour saturer ces processus. Si l’aire sous la courbe des concen ­
trations plasmatiques en fonction du temps [ area under the plasma 
concentration- time curve ] (AUC) ne varie pas de façon linéaire entre 
deux niveaux de dose utilisés dans l’étude principale, on peut en déduire 
que la saturation d’un ou de plusieurs des processus cinétiques s’opère 
quelque part entre ces deux niveaux de dose.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 529
 
25. Pour les substances d’essai faiblement toxiques, il convient d’employer une 
dose maximale de 1 000 mg/kg de poids corporel (voies orale et cutanée) – 
si l’administration se fait par inhalation, se référer au chapitre B.2 de la présente annexe; généralement la dose n’excédera pas 2 mg/l. Des considé ­
rations spécifiques au produit peuvent rendre nécessaire une dose supérieure, 
en fonction des besoins réglementaires. Le choix des doses fait toujours 
l’objet d’une justification.
 
26. Les données relatives à la toxicocinétique ou à la distribution tissulaire 
fondées sur une dose unique peuvent convenir pour déterminer le potentiel 
d’accumulation et/ou de persistance. Néanmoins, dans certaines circons ­
tances, l’administration de doses répétées peut être nécessaire i) pour 
mieux évaluer le potentiel d’accumulation et/ou de persistance, ou l’évolu ­
tion des paramètres toxicocinétiques (par exemple induction et inhibition enzymatiques), ou ii) pour répondre aux exigences du dispositif réglemen ­
taire en vigueur. Dans les études à doses répétées, si l’administration de 
doses faibles suffit généralement, il peut parfois s’avérer nécessaire d’admi ­
nistrer des doses élevées (voir également le paragraphe 57).
 
Administration de la substance d’essai  
27. La substance d’essai est dissoute ou mise en suspension homogène dans le 
même véhicule que celui employé pour les autres études de toxicité par 
gavage oral réalisées avec la substance d’essai, si des informations sont 
disponibles à ce sujet. Le choix du véhicule fait l’objet d’une justification. Le choix du véhicule et le volume de dosage sont pris en compte lors de la conception de l’étude. La méthode d’administration classique est le gavage; 
néanmoins, l’administration de la substance dans une capsule de gélatine ou 
mélangée à la nourriture peut être avantageuse dans certaines situations (dans les deux cas, le choix fait l’objet d’une justification). Il convient en outre de vérifier la dose effectivement administrée à chaque animal.
 
28. Le volume maximal de liquide à administrer par gavage oral en une seule 
fois dépend de la taille des animaux d’expérience, du type de véhicule de 
dosage, et de la suppression ou du maintien de la nourriture avant l’adminis ­
tration de la substance d’essai. La décision de maintenir ou de restreindre l’alimentation avant l’administration de la dose fait l’objet d’une justifica ­
tion. Normalement, le volume est aussi faible que possible, que le véhicule 
employé soit aqueux ou non. Pour les rongeurs, le volume de dose ne 
dépasse pas normalement 10 ml/kg de poids corporel. Dans le cas de subs ­
tances d’essai plus lipophiles, les volumes de véhicule utilisés peuvent être de 4 ml/kg de poids corporel ou plus. En cas de doses répétées, si le jeûne 
quotidien est contre-indiqué, il faut envisager des volumes de dose plus 
faibles (par exemple de 2 à 4 ml/kg de poids corporel). Si possible, l’uti ­
lisation de volumes de dose en accord avec ceux utilisés pour la substance d’essai dans des études orales par gavage est envisagée.
 
29. L’administration de la substance d’essai en intraveineuse (IV) et sa mesure 
dans le sang et/ou les excréta peuvent servir à déterminer la biodisponibilité 
ou l’absorption orale relative. Pour ce type d’étude, une dose unique de la 
substance d’essai (généralement équivalente, mais non supérieure, à la dose orale la plus faible – voir «Choix des doses») est administrée à l’aide d’un véhicule approprié. Cette dose est administrée dans un volume idoine (par 
exemple 1 ml/kg de poids corporel) et au site choisi, à au moins quatre 
animaux du sexe approprié (des animaux des deux sexes peuvent être employés s’il y a lieu, voir paragraphe 16). L’administration intraveineuse de la substance d’essai suppose de préparer une dose intégralement dissoute 
ou mise en suspension. On fera en sorte que le véhicule choisi pour cette 
administration n’interfère pas avec le flux sanguin ou l’intégrité des cellules
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sanguines. Si la substance d’essai est perfusée, la vitesse de perfusion est 
consignée et normalisée pour tous les animaux, à condition qu’une pompe à 
perfusion soit utilisée. Il convient de recourir à l’anesthésie en cas de canu ­
lation de la veine jugulaire (pour administrer la substance d’essai et/ou faire un prélèvement sanguin) ou si l’on utilise l’artère fémorale pour l’adminis ­
tration. Le type d’anesthésie est mûrement réfléchi, car il peut avoir des 
conséquences toxicocinétiques. Les animaux doivent pouvoir se rétablir avant que la substance d’essai et le véhicule leur soient injectés.
 
30. D’autres voies d’administration, comme la voie cutanée et l’inhalation (voir 
paragraphes 74 à 78) peuvent également convenir pour certaines substances d’essai, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques et des conditions 
d’utilisation ou de la voie d’exposition humaine prévisibles.
 
Mesures  
Bilan massique  
31. Le bilan massique est déterminé par la somme du pourcentage de la dose 
(radioactive) administrée excrétés dans l’urine, les fèces et l’air expiré, et du pourcentage présent dans les tissus, la carcasse résiduelle, et le liquide de 
lavage de la cage (voir paragraphe 46). En général, une récupération totale 
de plus de 90 % de la substance d’essai (radioactivité) administrée est considérée comme satisfaisante.
 
Absorption  
32. Une estimation initiale de l’absorption peut être réalisée en excluant du bilan 
massique le pourcentage de la dose retrouvé dans le tractus gastro-intestinal et/ou dans les fèces. Pour le calcul du pourcentage d’absorption, voir le 
paragraphe 33. Pour l’analyse des excréta, voir les paragraphes 44 à 49. 
Si l’importance exacte de l’absorption faisant suite à l’administration d’une dose orale ne peut être établie à partir des études de bilan massique (par exemple, lorsque plus de 20 % de la dose administrée est présente dans les 
fèces), des explorations plus poussées peuvent être nécessaires. Elles 
peuvent comprendre soit 1) l’administration orale de la substance d’essai et la mesure de sa présence dans la bile, soit 2) l’administration orale et intraveineuse de la substance d’essai, et la mesure de la quantité nette de 
substance présente dans l’urine, plus dans l’air expiré, plus dans la carcasse 
pour chacune de ces deux voies. Dans les deux cas, la mesure de la radioac ­
tivité est utilisée comme méthode de substitution à l’analyse spécifique de la substance d’essai et de ses métabolites.
 
33. Pour étudier l’excrétion biliaire, on administre généralement la substance 
d’essai par voie orale. Dans ce type d’étude, les voies biliaires d’au 
moins quatre animaux du sexe approprié (ou des deux sexes le cas échéant) sont canulées et une dose unique de la substance d’essai est administrée. Après l’administration, il convient de surveiller aussi longtemps que néces ­
saire l’excrétion de radioactivité/substance d’essai dans la bile, afin d’es ­
timer le pourcentage de la dose administrée excrété par cette voie, ce qui peut ensuite servir à calculer l’ampleur de l’absorption orale, de la manière suivante:
 
Pourcentage d’absorption  ¼ ðquantités présentes dans la bile  þ l’urine þ l’airexpiré 
þ la carcasse hors tractus gastro  Ä intestinalÞ= 
quantité administrée  Ü 100 
34. Pour certaines classes de substances d’essai, une sécrétion directe de la dose 
absorbée peut avoir lieu au travers des membranes intestinales. Dans ce cas, 
la mesure du pourcentage de la dose présent dans les fèces après adminis ­
tration orale chez un rat aux voies biliaires canulées n’est pas jugée repré ­
sentative de la dose non absorbée. Il est recommandé, si on prévoit une sécrétion intestinale, de calculer le pourcentage de la dose absorbé en 
estimant l’absorption par comparaison de l’excrétion après administration 
par voie orale et par voie intraveineuse (rat intact ou à voies biliaires canulées) (voir paragraphe 35). Il est également conseillé, quand la quanti ­
fication de la sécrétion intestinale est jugée nécessaire, de mesurer l’excré ­
tion chez le rat à voies biliaires canulées après administration intraveineuse 
de la dose.
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Biodisponibilité  
35. Il est possible de déterminer la biodisponibilité à partir de la cinétique 
plasmatique/sanguine des groupes oraux et IV, comme décrit aux para ­
graphes 50 à 52, par une analyse spécifique de la substance d’essai et/ou 
de son (ses) métabolite(s) pertinent(s), c’est-à-dire sans qu’il soit besoin de 
recourir à une substance d’essai radiomarquée. Le calcul de la biodisponibilité (F) de la substance d’essai ou de son (ses) métabolite(s) pertinents s’effectue alors comme suit:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDose  IV=Dose  exp Þ 
où AUC est l’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonc ­
tion du temps et exp la voie d’administration (orale, cutanée ou par inhala ­
tion).  
36. Afin d’évaluer les risques liés aux effets systémiques, on préfère générale ­
ment utiliser la biodisponibilité du composant toxique plutôt que le pour ­
centage d’absorption pour comparer les concentrations systémiques prove ­
nant d’études animales avec des données analogues de surveillance biolo ­
gique tirées d’études sur l’exposition des travailleurs. La situation peut se 
complexifier si les doses se situent dans la plage non linéaire, aussi 
importe-t-il que l’étude de toxicocinétique détermine des doses dans la plage linéaire.
 
Distribution tissulaire  
37. Connaître la distribution tissulaire d’une substance d’essai et/ou de ses 
métabolites est important pour identifier les tissus cibles, comprendre les 
mécanismes de toxicité à l’œuvre et obtenir des informations sur le potentiel d’accumulation et de persistance de la substance d’essai et de ses métabo ­
lites. Le pourcentage de dose (radioactive) totale dans les tissus et dans la 
carcasse résiduelle est mesuré au minimum à la fin de l’étude d’excrétion 
(par exemple normalement 7 jours après le dosage ou moins en fonction du comportement spécifique de la substance d’essai). Lorsque aucune substance d’essai n’est détectée dans les tissus à la fin de l’étude (par exemple parce 
que la substance peut avoir été éliminée avant la fin de l’étude en raison 
d’une courte demi-vie), il convient de prendre soin de ne pas mal interpréter les données. Dans ce type de situation, la distribution tissulaire est examinée au moment du pic de concentration plasmatique/sanguine (T
 max ) ou au 
maximum du taux d’excrétion urinaire de la substance d’essai (et/ou de 
ses métabolites) selon le cas, (voir paragraphe 38). De plus, il se peut que la collecte de tissues à d’autres moments soit nécessaire pour évaluer la variation de la distribution en fonction du temps (s’il y a lieu), pour aider 
à établir le bilan massique, et/ou si une autorité compétente l’exige. Parmi 
les tissus à prélever figurent le foie, la graisse, le tractus gastro-intestinal, le rein, la rate, le sang total, la carcasse résiduelle, les tissus des organes cibles et tout autre tissu potentiellement intéressant pour l’évaluation toxicologique 
de la substance d’essai, par exemple thyroïde, hématies, organes reproduc ­
teurs, peau, œil (en particulier pour les animaux pigmentés). On envisagera d’analyser un plus large éventail de tissus aux mêmes moments afin d’op ­
timiser l’utilisation des animaux et si des études de toxicité chronique ou 
subchronique mettent en évidence une toxicité pour certains organes cibles. 
Il convient également de consigner la concentration du résidu (radioactif) et les ratios tissu-plasma (sanguin).
 
38. Il est possible que l’évaluation de la distribution tissulaire à d’autres 
moments, tels qu’aux moments du pic de concentration plasmatique/san ­
guine (par exemple T  max ) ou au maximum du taux d’excrétion urinaire, 
obtenue à partir des études de cinétique plasmatique/sanguine ou d’excrétion 
respectivement, soit aussi nécessaire ou exigée par une autorité compétente. 
Cette information peut être utile pour comprendre la toxicité et le potentiel d’accumulation et de persistance de la substance d’essai et des métabolites. Le choix des éléments à prélever fait l’objet d’une justification; les prélè ­
vements destinés à être analysés sont généralement les mêmes que ceux 
énumérés au paragraphe 37.
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39. Pour les études sur la distribution tissulaire, il est possible de quantifier la 
radioactivité en procédant à la dissection, l’homogénéisation, la combustion 
et/ou la solubilisation des organes, puis à un comptage par scintillation liquide des résidus piégés. Certaines techniques, actuellement à différents stades de développement, notamment l’autoradiographie quantitative du 
corps entier et l’autoradiographie microscopique des récepteurs, peuvent 
s’avérer utiles pour déterminer la distribution d’une substance d’essai dans les organes et/ou les tissus (3) (4).
 
40. Pour les voies d’administration autres que la voie orale, on prélève et 
analyse des tissus spécifiques, comme les poumons dans les études par 
inhalation ou la peau dans les études par voie cutanée. Voir les paragraphes 74 à 78.
 
Métabolisme  
41. On recueille les excréta (et, le cas échéant, le plasma) afin d’identifier et de 
quantifier la substance d’essai et ses métabolites, non modifiés, selon la 
méthode indiquée aux paragraphes 44 à 49. Il est acceptable de regrouper les excréta pour faciliter l’identification des métabolites au sein d’un groupe de dose donné. Il est recommandé d’établir le profil des métabolites à 
chaque période de l’étude. Néanmoins, si l’absence d’échantillons ou de 
radioactivité empêche de le faire, il est acceptable de regrouper l’urine et les fèces recueillies à différents moments, mais provenant uniquement d’ani ­
maux du même sexe ayant reçu la même dose. Des méthodes qualitatives et 
quantitatives appropriées sont mises en œuvre pour étudier l’urine, les fèces 
et la radioactivité expirée par les animaux traités, ainsi que la bile, le cas échéant.
 
42. Un effort raisonnable est fait pour identifier tous les métabolites présents à 
hauteur de 5 % ou plus de la dose administrée et pour fournir un schéma métabolique de la substance d’essai. Il convient d’identifier les substances d’essai ayant été caractérisées, dans les excréta, comme comprenant 5 % ou 
plus de la dose administrée. L’identification équivaut à la détermination 
exacte de la structure des composants. Habituellement, l’identification est réalisée en soumettant simultanément à une chromatographie le métabolite et des étalons connus, en utilisant deux systèmes différents, ou grâce à des 
techniques à même de fournir une identification structurale positive, par 
exemple spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire (RMN), etc. Dans le cas d’une co-chromatographie, il faut éviter d’utiliser des tech ­
niques chromatographiques employant la même phase stationnaire avec deux 
systèmes de solvants différents pour vérifier l’identité de métabolites, car 
alors les méthodes ne sont pas indépendantes. L’identification par co-chromatographie fait usage de deux systèmes dissemblables, analytique ­
ment indépendants, par exemple une chromatographie sur couche 
mince (CCM) à phase inversée et une CCM à phase normale, ou une 
CCM et une chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Du moment que la qualité de la séparation chromatographique est acceptable, aucune confirmation supplémentaire par spectroscopie n’est demandée. Les 
méthodes qui apportent des informations structurales, telles que la chroma ­
tographie gazeuse/spectrométrie de masse (CG-SM), la chromatographie liquide/spectrométrie de masse (CL-SM), ou la chromatographie liquide/ 
spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM) et la spectrométrie par 
RMN, peuvent également fournir une identification non ambiguë.
 
43. S’il est impossible d’identifier les métabolites présents à hauteur de 5 % ou 
plus de la dose administrée, il convient de le justifier ou de l’expliquer dans 
le rapport final. Il peut être avisé d’identifier les métabolites représentant 
moins de 5 % de la dose administrée, afin de mieux comprendre la voie métabolique en vue d’évaluer les dangers et/ou les risques liés à la substance d’essai. Une confirmation de la structure de ces métabolites est autant que 
possible fournie. Pour cela, il pourra être nécessaire d’établir leur profil dans 
le plasma, le sang ou d’autres tissus.
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Excrétion  
44. Le taux et l’importance de l’excrétion de la dose administrée sont déter ­
minés par la mesure du pourcentage de la dose (radioactive) retrouvé dans l’urine, les fèces et l’air expiré. Ces données aideront également à établir le 
bilan massique. Les quantités de substance d’essai (radioactivité) éliminées 
dans l’urine, les fèces et l’air expiré sont évaluées à des intervalles de temps appropriés (voir les paragraphes 47 à 49). Les expériences à doses répétées sont conçues de manière à permettre d’obtenir des données sur l’excrétion, 
afin de remplir les objectifs définis au paragraphe 26. On pourra ainsi 
effectuer des comparaisons avec les expériences à dose unique.
 
45. Si une étude pilote montre que la substance d’essai (radioactivité) n’est pas 
excrétée en quantités significatives (voir paragraphe 49) dans l’air expiré, il ne sera pas nécessaire de collecter celui-ci dans le cadre de l’étude défini ­
tive.
 
46. Chaque animal est placé, pour la collecte des excréta (urine, fèces et air 
expiré), dans une unité individuelle d’étude du métabolisme. À la fin de 
chaque période de collecte (voir paragraphes 47 à 49), ces unités sont rincées à l’aide d’un solvant approprié (lavage de la cage) pour assurer une récupération maximale de la substance d’essai (radioactivité). La 
collecte des excréta s’achève au bout de 7 jours, ou après récupération, 
avant ce délai, d’au moins 90 % de la dose administrée.
 
47. La quantité totale de substance d’essai (radioactivité) dans l’urine est déter ­
minée à deux moments au moins de la première journée de collecte, dont une fois 24 h après l’administration de la dose, puis quotidiennement jusqu’à la fin de l’étude. Il est recommandé de retenir plus de deux 
points d’échantillonnage pendant la première journée (par exemple, 6 h, 
12 h et 24 h après l’administration de la dose). Les résultats des études pilotes sont analysés afin d’obtenir des informations sur les moments de collecte alternatifs ou supplémentaires à mettre en œuvre. Le calendrier de 
collecte fait l’objet d’une justification.
 
48. La quantité totale de substance d’essai (radioactivité) dans les fèces est 
déterminée quotidiennement, 24 h après l’administration de la dose et jusqu’à la fin de l’étude, sauf si les études pilotes suggèrent d’effectuer des prélèvements plus fréquents ou à d’autres moments. Dans ce cas, une 
justification est fournie.
 
49. La collecte du CO  2 expiré et d’autres produits volatils peut être interrompue 
dans une étude donnée quand on retrouve moins de 1 % de la dose adminis ­
trée dans l’air exhalé pendant 24 h de collecte.  
Études en fonction du temps  
Cinétique sanguine/plasmatique  
50. Ces études visent à estimer les principaux paramètres toxicocinétiques [par 
exemple C  max , T max , demi-vie (t  1/2 ), AUC] concernant la substance d’essai. 
Elles peuvent se mener à dose unique, mais impliquent généralement deux 
doses ou plus. Le dosage est à définir en fonction de la nature de l’expé ­
rience et/ou de la question étudiée. Des données cinétiques peuvent être nécessaires pour résoudre des questions comme la biodisponibilité de la 
substance d’essai et/ou déterminer l’effet de la dose sur l’élimination 
(c’est-à-dire pour établir si la saturation de l’élimination dépend ou non de la dose).
 
51. Pour ce type d’étude, il convient d’utiliser au moins quatre animaux du 
même sexe par groupe de dose. Le choix du sexe des animaux employés fait l’objet d’une justification. L’utilisation d’animaux des deux sexes 
(quatre mâles et quatre femelles) est envisagée s’il existe des éléments attes ­
tant de différences de toxicité notables en fonction du sexe.
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52. Après l’administration de la substance d’essai (radiomarquée), il convient de 
prélever des échantillons de sang sur chaque animal, à des moments et selon 
une méthode appropriés. Le volume et le nombre des échantillons sanguins prélevés par animal sont susceptibles d’être limités par les effets éventuels de prélèvements répétés sur la santé/la physiologie des animaux et/ou par la 
sensibilité de la méthode analytique. Les échantillons seront analysés sépa ­
rément pour chaque animal. Dans certaines circonstances (par exemple caractérisation des métabolites), il peut être nécessaire de regrouper les échantillons prélevés sur plusieurs animaux. Ces échantillons regroupés 
sont clairement identifiés, et le regroupement fait l’objet d’une explication. 
Si une substance d’essai radiomarquée est utilisée, il peut y avoir lieu d’analyser la radioactivité totale. Dans ce cas, l’analyse est effectuée dans le sang total et le plasma, ou dans le plasma et les globules rouges, pour 
permettre de calculer le rapport sang/plasma. Dans d’autres circonstances, il 
peut être nécessaire de procéder à une étude plus approfondie requérant l’identification du composé parent et/ou de ses métabolites, ou d’évaluer la fixation aux protéines.
 
Autres études de cinétique tissulaire  
53. Ces études ont pour objet d’obtenir des informations sur l’évolution dans le 
temps afin de répondre à des questions liées notamment au mode d’action 
toxique, à la bioaccumulation et à la biopersistance en déterminant la 
concentration de la substance d’essai dans différents tissus. Le choix des tissus et le nombre de points temporels évalués dépendront de l’aspect étudié et de la base de données toxicologiques disponible sur la substance 
d’essai. Pour concevoir ces études de cinétique tissulaire complémentaires, il 
convient de tenir compte des informations recueillies décrites aux para ­
graphes 37 à 40. Ces études peuvent nécessiter un dosage unique ou un dosage répété. La méthode retenue fait l’objet d’une justification détaillée.
 
54. Des études de cinétique tissulaire complémentaires peuvent être entreprises:  
— lorsqu’on constate une demi-vie sanguine allongée, suggérant la possibi ­
lité d’une accumulation de la substance d’essai dans différents tissus, ou  
— pour voir si un niveau d’état stationnaire a été atteint dans des tissus 
particuliers (dans des études à doses répétées, par exemple, même quand 
un niveau d’état stationnaire a apparemment été atteint dans le sang, il 
peut être utile de s’assurer qu’il en est de même dans les tissus cibles).  
55. Pour ce type d’étude en fonction du temps, il convient d’administrer une 
dose orale appropriée de la substance d’essai à au moins quatre animaux par 
dose et par point temporel, et de surveiller l’évolution dans le temps de la 
distribution dans les tissus choisis. À moins qu’une toxicité spécifique liée au sexe ait été observée, on emploiera des animaux d’un seul sexe. La question de savoir si l’analyse doit porter sur la radioactivité totale ou sur 
la substance mère et/ou ses métabolites dépendra du problème traité. La 
distribution tissulaire est évaluée à l’aide des techniques appropriées.
 
Induction/inhibition enzymatique  
56. Des études sur les effets possibles de l’induction/inhibition enzymatique ou 
sur la biotransformation de la substance d’essai concernée peuvent être nécessaires dans l’un ou plusieurs des cas suivants:
 
1) lorsque des éléments indiquent une relation entre la biotransformation de 
la substance d’essai et l’augmentation de la toxicité;  
2) lorsque les données de toxicité disponibles indiquent une relation non 
linéaire entre la dose et le métabolisme;  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 535
 
3) si les études sur l’identification des métabolites révèlent un métabolite 
potentiellement toxique qui pourrait être le produit d’une voie enzyma ­
tique induite par la substance d’essai;  
4) pour expliquer des effets a priori liés à des phénomènes d’induction 
enzymatique;  
5) si l’on observe des modifications toxicologiques importantes dans le 
profil métabolique de la substance d’essai, dans le cadre d’expériences 
in vitro ou in vivo menées sur différentes espèces ou dans différentes conditions, il peut être nécessaire de caractériser l’enzyme ou les enzymes impliquées (par exemple, des enzymes de phase I comme les 
isoenzymes constituant le système des mono-oxygénases à cytochrome P 
450, des enzymes de phase II comme les isoenzymes de la sulfotrans ­
férase ou de l’uridine diphosphate glucuronosyltransférase, ou tout autre enzyme pertinente). Ces informations peuvent servir à évaluer la perti ­
nence des extrapolations interespèces.
 
57. Pour évaluer les variations toxicocinétiques liées à la substance d’essai, il 
convient de mettre en œuvre des protocoles d’étude adéquats, convenable ­
ment validés et justifiés. Ces études peuvent par exemple consister à admi ­
nistrer des doses répétées d’une substance d’essai non marquée, puis une 
dose unique radiomarquée le 14  e jour, ou des doses répétées d’une substance 
d’essai radiomarquée et des échantillonnages les 1  er , 7 e et 14  e jours pour 
déterminer le profil des métabolites. L’administration de doses répétées d’une substance d’essai radiomarquée peut également fournir des renseigne ­
ments sur la bioaccumulation (voir paragraphe 26).
 
MÉTHODES COMPLÉMENTAIRES  
58. Outre les expériences in vivo décrites dans la présente méthode d’essai, des 
méthodes complémentaires peuvent fournir des informations sur l’absorp ­
tion, la distribution, le métabolisme ou l’élimination d’une substance d’essai chez certaines espèces.
 
Utilisation d’informations in vitro  
59. Plusieurs aspects concernant le métabolisme de la substance d’essai peuvent 
être étudiés dans le cadre d’études in vitro faisant appel à des systèmes 
d’essai appropriés. Des hépatocytes fraîchement isolés ou en culture et des 
fractions subcellulaires (par exemple microsomes et cytosol ou fraction S9) du foie peuvent servir à étudier les métabolites possibles. Le métabolisme local dans l’organe cible, par exemple le poumon, peut être intéressant pour 
l’évaluation des risques. À cette fin, les fractions microsomales des tissus 
cibles peuvent être utiles. Les études sur microsomes peuvent permettre de traiter les différences potentielles entre les sexes et selon les stades de la vie, et de caractériser les paramètres enzymatiques (K
 m et V  max ) qui peuvent 
aider à évaluer la dose-dépendance du métabolisme en lien avec les niveaux 
d’exposition. En outre, les microsomes peuvent permettre d’identifier les enzymes microsomales impliquées dans le métabolisme de la substance d’essai qui peuvent servir pour l’extrapolation inter-espèces (voir aussi para ­
graphe 56). On peut également examiner le potentiel d’induction de la 
biotransformation à l’aide de fractions subcellulaires du foie (par exemple, microsomes et cytosol) d’animaux prétraités par la substance d’essai concer ­
née, par le biais d’études in vitro d’induction sur les hépatocytes, ou à partir 
de lignées cellulaires spécifiques exprimant des enzymes pertinentes. Dans 
certaines circonstances et certaines conditions, on peut envisager d’utiliser des fractions subcellulaires provenant de tissus humains, afin de déterminer les éventuelles différences entre espèces en matière de biotransformation. 
Les résultats d’études in vitro peuvent également servir à l’élaboration de 
modèles toxicocinétiques à base physiologique (TCBP) (5).
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60. Les études d’absorption cutanée in vitro peuvent fournir des renseignements 
supplémentaires pour caractériser l’absorption (6).  
61. Des cultures primaires de cellules hépatiques et des coupes de tissus frais 
peuvent être utilisées pour répondre aux mêmes questions que les micro ­
somes hépatiques. Dans certains cas, il est possible de répondre à certaines questions en utilisant des lignées cellulaires exprimant spécifiquement l’en ­
zyme pertinente ou des lignées cellulaires génétiquement modifiées. Il peut 
aussi être utile d’étudier l’inhibition et l’induction d’isoenzymes particulières du cytochrome P450 (par exemple CYP1A1, 2E1, 1A2, etc.) et/ou d’en ­
zymes de phase II par le composé parent dans le cadre d’essais in vitro. Les 
informations obtenues peuvent présenter de l’intérêt pour des composés de 
structure proche.
 
Utilisation des données toxicocinétiques provenant d’études de toxicité  
62. L’analyse des échantillons de sang, de tissus et/ou d’excréta obtenus au 
cours d’autres études de toxicité peut fournir des données sur la biodis ­
ponibilité, l’évolution de la concentration plasmatique dans le temps 
(AUC, C  max ), le potentiel de bioaccumulation, les taux d’élimination et 
les variations métaboliques et cinétiques liées au sexe ou au stade de vie.  
63. Le plan d’étude peut aussi être adapté pour répondre à des questions concer ­
nant la saturation de l’absorption, les voies de biotransformation ou d’ex ­
crétion à des doses plus élevées, l’emprunt de nouvelles voies métaboliques 
à des doses plus élevées, ou la limitation des métabolites toxiques à des 
doses plus élevées.  
64. D’autres aspects liés à l’évaluation des dangers peuvent aussi être abordés, 
notamment:  
— la sensibilité en fonction de l’âge, qui dépend de l’état de la barrière 
hémato-encéphalique, des reins et/ou des capacités de détoxication,  
— la sensibilité de certaines sous-populations due à des différences de 
capacité de biotransformation ou à d’autres différences toxicocinétiques,  
— l’ampleur de l’exposition du fœtus par transfert transplacentaire des 
produits chimiques ou de celle du nouveau-né par le biais de la lactation.  
Utilisation de modèles toxicocinétiques  
65. Les modèles toxicocinétiques peuvent contribuer à différents aspects de 
l’évaluation des dangers et des risques, par exemple à la prévision de 
l’exposition systémique et de la dose délivrée aux tissus internes. En outre, pour aborder des questions particulières portant sur le mode d’action, ces modèles peuvent servir de base à l’extrapolation entre espèces, entre 
voies d’exposition, entre dosages, et à des fins d’évaluation des risques pour 
l’homme. Les données utiles à l’élaboration de modèles TCBP pour une substance d’essai sur une espèce quelconque sont 1) les coefficients de partage, 2) les constantes biochimiques et paramètres physiologiques, 3) 
les paramètres d’absorption des différentes voies d’exposition et 4) les 
données cinétiques in vivo pour l’évaluation des modèles [par exemple paramètres d’élimination pour les voies d’excrétion pertinentes (> 10 %), K
 m et V  max pour le métabolisme]. Les données expérimentales utilisées pour 
élaborer le modèle sont obtenues par des méthodes scientifiquement vala ­
bles, et les résultats du modèle sont validés. Les paramètres spécifiques à la substance d’essai ou à l’espèce, comme le taux d’absorption, le coefficient de partage sang-tissu et les constantes de vitesse métabolique, sont souvent 
déterminés pour faciliter l’élaboration de modèles non compartimentaux ou 
à base physiologique (7).
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RÉSULTATS ET RAPPORT  
66. Il est recommandé de faire figurer une table des matières dans le rapport 
d’essai.  
Corps du rapport  
67. Le corps du rapport présente les informations décrites par la présente 
méthode d’essai, organisées en sections et paragraphes de la manière 
suivante:  
Résumé  
68. Cette section du rapport d’étude résume la conception de l’étude et décrit les 
méthodes utilisées. Elle met également en relief les principaux résultats concernant le bilan massique, la nature et l’importance des métabolites, 
les résidus tissulaires, le taux d’élimination, le potentiel de bioaccumulation, 
les différences liées au sexe, etc. Ce résumé est suffisamment détaillé pour permettre une évaluation des résultats.
 
Introduction  
69. Cette section du rapport présente les objectifs de l’étude, les raisons l’ayant 
motivée et les principes de sa conception, ainsi que les références utiles et 
un historique permettant de la resituer.  
Matériels et méthodes  
70. Cette section du rapport décrit en détail toutes les informations pertinentes, 
notamment:  
a) Substance d’essai  
Cette sous-section porte sur l’identification de la substance d’essai: nom 
chimique, structure moléculaire, détermination qualitative et quantitative 
de sa composition chimique, pureté chimique et, si possible, type et 
quantité des éventuelles impuretés. Elle comprend également des infor ­
mations sur les propriétés physico-chimiques de la substance, notam ­
ment: état physique, couleur, coefficient de solubilité et/ou de partage 
brut, stabilité et, éventuellement, corrosivité. Le cas échéant, des infor ­
mations sont également données sur les isomères. Si la substance d’essai est radiomarquée, cette sous-section renseigne sur le type de radionu ­
cléide, la position du marqueur, l’activité spécifique et la pureté radio ­
chimique.
 
Il convient d’indiquer le type de véhicule, diluant, agent de suspension, 
émulsifiant ou autre matériau utilisé pour administrer la substance d’es ­
sai, ou d’en donner une description.  
b) Animaux d’expérience  
Cette sous-section renseigne sur les animaux d’expérience, notamment: 
choix de l’espèce et de la souche et justification de ce choix, âge au 
début de l’étude, sexe, poids corporel, état de santé et conditions d’éle ­
vage.  
c) Méthodes  
Cette sous-section décrit en détail la conception de l’étude et la méthode 
utilisée. Elle comprend les éléments suivants:  
1) justification des éventuelles modifications apportées à la voie ou aux 
conditions d’exposition, s’il y a lieu;  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 538
 
2) justification du choix des niveaux de dose;  
3) description des éventuelles études pilotes utilisées pour la conception 
expérimentale des études de suivi. Les données à l’appui des études 
pilotes sont jointes;  
4) mode de préparation de la solution administrée et, le cas échéant, 
type de solvant ou de véhicule;  
5) nombre de groupes de traitement et nombre d’animaux par groupe;  
6) niveaux et volume des doses (et, si la radioactivité est utilisée, 
activité spécifique de la dose);  
7) voie(s) et méthodes d’administration;  
8) fréquence d’administration;  
9) période de jeûne (le cas échéant);  
10) radioactivité totale par animal;  
11) manipulation des animaux;  
12) collecte et traitement des échantillons;  
13) méthodes d’analyse utilisées pour la séparation, la quantification et 
l’identification des métabolites;  
14) limites de détection des méthodes employées;  
15) autres mesures et protocoles expérimentaux utilisés (notamment vali ­
dation des méthodes d’analyse des métabolites).  
d) Analyse statistique  
Si on recourt à l’analyse statistique pour dépouiller les résultats de 
l’étude, il convient d’apporter suffisamment d’informations sur la méthode d’analyse et le logiciel employés pour qu’un examinateur/statis ­
ticien indépendant puisse réévaluer et reconstruire l’analyse.
 
Si on recourt à une modélisation systémique (par exemple à un modèle 
TCBP), la présentation du modèle employé comporte une description 
complète du modèle, afin qu’un expert indépendant puisse reconstruire 
et valider celui-ci (voir le paragraphe 65 et l’appendice des définitions).  
Résultats  
71. Toutes les données sont récapitulées et présentées sous forme de tableaux 
accompagnés d’une évaluation statistique appropriée, comme décrit dans la présente section. Les données résultant du comptage de la radioactivité sont récapitulées et présentées de manière appropriée à l’étude, généralement en 
microgrammes ou milligrammes d’équivalents par masse d’échantillon, mais 
d’autres unités peuvent être utilisées. Cette section comporte des graphiques illustrant les résultats, reproduit les données chromatographiques et spectro ­
métriques représentatives, identifie/quantifie les métabolites et présente les 
voies métaboliques proposées, y compris la structure moléculaire des méta ­
bolites. En outre, les renseignements suivants figurent, le cas échéant, dans cette section:
 
1) quantité et pourcentage de récupération de la radioactivité dans l’urine, 
les fèces, l’air expiré, ainsi que dans l’urine et les fèces récupérées lors 
du nettoyage de la cage.  
— Pour les études par voie cutanée, inclure également les données 
relatives à la récupération de la substance d’essai sur la peau 
traitée et lors du nettoyage cutané, les données sur la radioactivité résiduelle présente dans le dispositif couvrant la peau et l’unité d’étude du métabolisme, ainsi que les résultats de l’étude de 
nettoyage cutané; pour plus de précisions, voir les paragraphes 74 
à 77.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 539
 
— Pour les études par inhalation, inclure également des données sur la 
récupération de la substance d’essai dans les poumons et dans les 
tissus nasaux (8); pour plus de précisions, voir le paragraphe 78;  
2) distribution tissulaire, en pourcentage de la dose administrée et en 
concentration (microgrammes d’équivalents par gramme de tissu) et ratios tissu/sang et tissu/plasma;
 
3) bilan-matière élaboré pour chaque étude impliquant l’analyse des tissus 
et des excréta;  
4) concentrations plasmatiques et paramètres toxicocinétiques (biodisponi ­
bilité, AUC, C  max , T max , élimination, demi-vie) après administration de la 
substance par la ou les voies d’exposition pertinentes;  
5) vitesse et importance de l’absorption de la substance d’essai après admi ­
nistration par la ou les voies d’exposition pertinentes;  
6) quantités de substance d’essai et de métabolites (en pourcentage de la 
dose administrée) collectées dans les excréta;  
7) référence aux données présentées en annexe, qui comprennent les 
données par animal pour tous les critères de mesure (par exemple admi ­
nistration de la dose, pourcentage de récupération, concentrations, para ­
mètres toxicocinétiques, etc.);  
8) graphique représentant les voies métaboliques proposées et la structure 
moléculaire des métabolites.  
Discussion et conclusions  
72. Dans cette section, il convient pour le ou les auteurs de:  
1) proposer une voie métabolique, en s’appuyant sur les résultats concernant 
le métabolisme et l’élimination de la substance d’essai;  
2) examiner les éventuelles différences potentielles liées à l’espèce ou au 
sexe concernant l’élimination et/ou la biotransformation de la substance d’essai;
 
3) présenter dans un tableau et examiner l’identité et l’importance des 
métabolites, les taux d’élimination, le potentiel de bioaccumulation et 
le niveau des résidus tissulaires de la substance mère et/ou de ses méta ­
bolites, ainsi que les éventuelles modifications dose-dépendantes des paramètres toxicocinétiques, s’il y a lieu;
 
4) intégrer à cette section toute donnée toxicocinétique pertinente obtenue 
au cours d’études de toxicité;  
5) formuler une conclusion succincte pouvant être étayée par les résultats de 
l’étude;  
6) ajouter des sections supplémentaires (si nécessaire ou opportun).  
73. Les sections supplémentaires serviront à présenter des informations biblio ­
graphiques, tableaux, graphiques, annexes, etc.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 540
 
AUTRES VOIES D’EXPOSITION  
Voie cutanée  
Traitement cutané  
74. Cette section fournit des renseignements spécifiques sur les études de toxi ­
cocinétique par voie cutanée. Pour l’absorption cutanée, il convient de 
consulter le chapitre B.44 [Absorption cutanée: méthode in vivo (9)] de la présente annexe. Pour d’autres effets observés, tels que la distribution et le métabolisme, la présente méthode d’essai B.36 peut être utilisée. Pour le 
traitement par voie cutanée, on peut utiliser un ou plusieurs niveaux de dose. 
La substance d’essai (c’est-à-dire la préparation pure, diluée ou le mélange contenant la substance d’essai à appliquer sur la peau) est identique (ou représente un substitut réaliste) aux produits auxquels pourraient être 
exposés l’homme ou les autres espèces cibles potentielles. Le choix du ou 
des niveaux de dose s’effectue conformément aux indications des para ­
graphes 20 à 26 de la présente méthode d’essai. Parmi les facteurs à prendre en considération figurent l’exposition humaine potentielle et/ou les 
doses auxquelles une toxicité a été observée au cours d’autres études de 
toxicité cutanée. Si nécessaire, il convient de dissoudre la ou les doses cutanées dans un véhicule adéquat et de les appliquer dans un volume adapté à leur administration. Peu de temps avant l’essai, la fourrure de la 
région dorsale du tronc des animaux à tester est tondue. Le rasage peut être 
employé mais il est effectué environ 24 heures avant l’essai. Lorsque la fourrure est rasée ou tondue, cette opération s’effectue en évitant toute lésion de la peau qui pourrait entraîner une modification de sa perméabilité. 
Environ 10 % de la superficie corporelle sont dégagés pour application de la 
substance d’essai. Dans le cas de substances d’essai hautement toxiques, la zone couverte peut être plus petite, mais il convient de recouvrir une surface aussi large que possible d’une pellicule mince et uniforme. La surface de 
traitement utilisée est la même pour tous les groupes d’essai par voie cuta ­
née. Les zones traitées sont recouvertes à l’aide d’une protection adaptée maintenue en place. Les animaux sont encagés séparément.
 
75. Une étude de nettoyage cutané est menée afin d’évaluer la quantité de la 
dose appliquée susceptible d’être retirée de la peau lors d’un lavage de la 
zone traitée au savon doux et à l’eau. Cette étude peut également aider à 
établir le bilan massique quand la substance d’essai est administrée par voie cutanée. Pour ce type d’étude, il convient d’appliquer une dose unique de la substance d’essai à deux animaux. Le niveau de dose est choisi conformé ­
ment aux indications du paragraphe 23 de la présente méthode d’essai (voir 
également le paragraphe 76 à propos du temps de contact avec la peau). La quantité de substance d’essai récupérée lors de ce lavage permet d’évaluer l’efficacité d’élimination de la substance d’essai par la procédure de 
nettoyage.
 
76. Sauf si sa corrosivité l’empêche, la substance d’essai est appliquée et main ­
tenue sur la peau pendant un minimum de 6 heures. Une fois la protection retirée, la zone traitée est lavée selon la procédure décrite pour l’étude de nettoyage cutané (voir paragraphe 75). La protection et la solution ayant 
servi au nettoyage sont analysées à la recherche de résidus de la substance 
d’essai. À la fin de l’étude, les animaux sont euthanasiés conformément à (2), et la peau traitée est prélevée. Une section appropriée de la peau traitée est analysée pour déterminer la présence résiduelle de la substance d’essai 
(radioactivité).
 
77. Pour l’évaluation toxicocinétique des produits pharmaceutiques, des procé ­
dures différentes peuvent être nécessaires, en accord avec les dispositions 
réglementaires.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 541
 
Inhalation  
78. Pour ce type d’étude, on utilise une concentration unique de la substance 
d’essai, ou davantage si nécessaire. Le choix de la ou des concentrations s’effectue conformément aux indications des paragraphes 20 à 26 de la 
présente méthode d’essai. Les traitements par inhalation seront menés à 
l’aide d’un appareillage de type «cône nasal» ou «tête seule» pour empêcher l’absorption par d’autres voies d’exposition (8). Si d’autres méthodes d’ex ­
position par inhalation sont retenues, il convient de justifier et de docu ­
menter ce choix. La durée d’exposition par inhalation est définie; elle est 
généralement comprise entre 4 et 6 heures.
 
BIBLIOGRAPHIE:  
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The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
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Série sur les essais et évaluations n  o 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OCDE, 
Paris.  
(9) Chapitre B.44 de la présente annexe, Absorption cutanée: méthode in vivo.  
(10) Barton H.A.  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
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Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
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Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 542
 
Appendice  
DÉFINITIONS  
Absorption orale : pourcentage de la dose de substance d’essai absorbé à partir 
du site d’administration (à savoir le tractus gastro-intestinal). Ce paramètre essen ­
tiel peut permettre de comprendre quelle proportion de la substance d’essai administrée atteint la veine porte, et par la suite le foie.
 
Absorption : processus par le(s)quel(s) une substance chimique pénètre dans, ou 
traverse, des tissus. L’absorption se réfère au composé parent et à tous ses métabolites. À ne pas confondre avec la «biodisponibilité».
 
Accumulation  (bioaccumulation): augmentation dans le temps de la quantité 
d’une substance d’essai présente dans les tissus (généralement les tissus adipeux, 
à la suite d’une exposition répétée); si une substance d’essai pénètre dans le corps à une vitesse supérieure à son taux d’élimination, cette substance s’accumule dans l’organisme et peut atteindre des concentrations toxiques.
 
ADME : acronyme de «Absorption, Distribution, Métabolisme et Excrétion».  
AUC  (aire sous la courbe des concentrations plasmatiques): aire sous la courbe 
dans un diagramme représentant l’évolution dans le temps de la concentration 
d’une substance d’essai dans le plasma. Cette aire correspond à la quantité totale 
de substance d’essai absorbée par le corps pendant une période de temps prédé ­
finie. Dans des conditions de linéarité, l’AUC (du temps zéro à l’infini) est proportionnelle à la quantité totale de substance d’essai absorbée par le corps, 
indépendamment du taux d’absorption.
 
Autoradiographie microscopique des récepteurs (microautoradiographie des 
récepteurs) : cette technique peut servir à étudier l’interaction xénobiotique avec 
des sites tissulaires ou des populations cellulaires spécifiques, par exemple dans 
le cadre d’études sur la fixation au récepteur ou le mode d’action spécifique qui 
peuvent nécessiter une qualité de résolution et de sensibilité impossible à obtenir par d’autres techniques comme l’autoradiographie du corps entier.
 
Autoradiographie  (autoradiographie du corps entier): cette technique, qui sert à 
déterminer qualitativement et/ou quantitativement la localisation tissulaire d’une substance d’essai radioactive, utilise l’imagerie par rayons X ou, innovation plus récente, l’imagerie numérique par plaque au phosphore pour visualiser les molé ­
cules ou fragments de molécules radiomarqués en enregistrant le rayonnement 
émis au sein de l’objet étudié. Par rapport à la dissection des organes, l’autora ­
diographie quantitative du corps entier peut présenter des avantages pour évaluer la distribution de la substance d’essai, la récupération globale et la résolution du 
matériau radioactif dans les tissus. Par exemple, on peut utiliser cette technique 
sur un modèle animal pigmenté, afin d’évaluer l’association possible de la subs ­
tance d’essai avec la mélanine, qui peut se lier à certaines molécules. Cependant, tout en offrant un moyen commode de visualiser l’ensemble des sites de fixation 
de grande capacité et de faible affinité dans le corps entier, cette technique est 
probablement moins performante pour identifier des sites cibles spécifiques tels que les sites de liaison au récepteur, dont la détection nécessite une résolution et une sensibilité relativement élevées. Lorsqu’on recourt à l’autoradiographie, les 
expériences visant à déterminer le bilan massique du composé administré sont 
menées sur un groupe séparé ou dans le cadre d’une étude distincte de l’étude de distribution tissulaire, dans laquelle tous les excréta (qui peuvent inclure égale ­
ment l’air expiré) et toutes les carcasses sont homogénéisés et analysés par 
comptage à scintillation liquide.
 
Bilan massique : comptabilité des entrées de la substance d’essai dans le système, 
et de ses sorties de celui- ci.  
Bilan matière : voir «bilan massique».  
Bioaccumulation : voir «Accumulation».  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 543
 
Biodisponibilité : fraction d’une dose administrée qui atteint la circulation 
systémique ou est rendue disponible sur le site de l’activité physiologique. Géné ­
ralement, la biodisponibilité d’une substance d’essai se réfère au composé parent, mais elle peut également se référer à ses métabolites. Elle ne tient compte que d’une seule forme chimique.  Nota bene  biodisponibilité et absorption ne sont pas 
synonymes. La différence, par exemple, entre l’absorption orale (c’est-à-dire la 
présence dans la paroi intestinale et la veine porte) et la biodisponibilité (c’est-à- dire la présence dans le sang systémique et dans les tissus) peut, entre autres facteurs, provenir de la dégradation chimique liée au métabolisme de la paroi 
intestinale, à l’efflux vers la lumière intestinale ou encore au métabolisme présys ­
témique dans le foie (10). La biodisponibilité du composant toxique (composé parent ou métabolite) est un paramètre essentiel, dans l’évaluation des risques pour la santé humaine (extrapolation de dose élevée à faible, extrapolation de 
voie à voie), pour dériver une valeur interne de la dose sans effet nocif 
observé (DSENO) ou de la dose de référence (BMD) externes (dose appliquée). Pour étudier les effets sur le foie en cas d’administration orale, l’absorption orale suffit. Néanmoins, pour évaluer tout autre effet que l’effet à la porte d’entrée, la 
biodisponibilité est généralement un paramètre plus fiable pour l’évaluation des 
risques.
 
Biopersistance : voir «Persistance».  
Biotransformation : conversion chimique (généralement enzymatique), dans l’or ­
ganisme, d’une substance d’essai donnée en une autre. Synonyme de «métabo ­
lisme».  
C max : concentration maximale (pic de concentration) dans le sang (plasma/sé ­
rum) après l’administration, ou excrétion maximale (pic d’excrétion) urinaire ou fécale après l’administration.
 
Coefficient de partage : également appelé coefficient de distribution, il mesure la 
solubilité différentielle d’une substance chimique dans deux solvants.  
Compartiment : portion (ou unité) structurelle ou biochimique d’un corps, d’un 
tissu ou d’une cellule séparée du reste de ce corps, de ce tissu ou de cette cellule.  
Concentration sanguine (plasmatique) à l’état stationnaire : état hors équilibre 
d’un système ouvert dans lequel toutes les forces agissant sur le système sont exactement contrebalancées par des forces opposées, de sorte que tous les 
composants du système ont une concentration stationnaire, bien que de la 
matière s’écoule au travers de ce système.
 
Concentration sanguine (plasmatique/sérique) maximale : concentration maxi ­
male (pic de concentration) dans le sang (plasma/sérum) après l’administration (voir aussi «C
 max »). 
Demi-vie (t  1/2 ): temps nécessaire pour que la concentration de la substance 
d’essai diminue de moitié dans un compartiment. Elle se réfère généralement à 
la concentration plasmatique ou à la quantité de substance d’essai présente dans l’ensemble du corps.
 
Distribution : dispersion d’une substance d’essai et de ses dérivés au travers d’un 
organisme.  
Distribution tissulaire : déplacement réversible d’une substance d’essai d’un 
endroit du corps à un autre. La distribution tissulaire peut s’étudier par dissection, homogénéisation, combustion et comptage par scintillation liquide des organes ou par autoradiographie qualitative et/ou quantitative du corps entier. La première 
méthode est utile pour obtenir la concentration et le pourcentage de récupération 
dans les tissus et la carcasse des mêmes animaux, mais peut avoir une résolution trop faible pour tous les tissus et atteindre une récupération globale inférieure à l’optimum (< 90 %). Voir la définition de l’autoradiographie.
 
Enzymes/Isoenzymes : protéines qui catalysent des réactions chimiques. Les 
isoenzymes sont des enzymes qui catalysent des réactions chimiques similaires 
mais diffèrent par leur séquence d’acides aminés.  
Excrétion biliaire : excrétion par les voies biliaires.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 544
 
Excrétion : processus par le(s)quel(s) une substance d’essai administrée et/ou ses 
métabolites sont éliminés du corps.  
Exogène : d’origine extérieure à l’organisme ou au système, ou produit à l’exté ­
rieur de lui.  
Extrapolation : inférence d’une ou de plusieurs valeurs inconnues à partir de ce 
qui est connu ou a été observé.  
Induction/induction enzymatique : synthèse d’enzymes en réponse à un stimulus 
environnemental ou à une molécule inductrice.  
Linéarité/cinétique linéaire : en cinétique, un processus est linéaire quand tous 
les taux de transfert entre compartiments sont proportionnels aux quantités ou aux concentrations présentes, c’est-à-dire de premier ordre. En conséquence, les 
volumes d’élimination et de distribution sont constants, de même que les 
demi-vies. Les concentrations obtenues sont proportionnelles au taux d’adminis ­
tration (exposition), et l’accumulation est plus aisément prévisible. On peut juger de la linéarité/non-linéarité en comparant les paramètres pertinents, par exemple 
l’AUC, après administration de différentes doses ou après exposition unique et 
exposition répétée. L’absence de dose-dépendance peut indiquer la saturation des enzymes participant au métabolisme du composé; une augmentation de l’AUC après exposition répétée par rapport à une exposition unique peut indiquer une 
inhibition du métabolisme, et une diminution de l’AUC peut signaler une induc ­
tion du métabolisme [voir aussi (11)].
 
Mécanisme (mode) de toxicité/d’action : le mécanisme d’action se réfère aux 
interactions biochimiques spécifiques par lesquelles une substance d’essai produit 
son effet. Le mode d’action se rapporte aux phénomènes plus généraux condui ­
sant à la toxicité d’une substance d’essai.  
Métabolisme : synonyme de «biotransformation».  
Métabolites : produits du métabolisme ou des processus métaboliques.  
Modélisation systémique  (modèle toxicocinétique à base physiologique, à base 
pharmacocinétique, pharmacocinétique à base physiologique, à base biologique, 
etc.): modèle abstrait utilisant le langage mathématique pour décrire le compor ­
tement d’un système.  
Paramètres enzymatiques : K  m , constante de Michaelis et V  max , vitesse maxi ­
male.  
Persistance (biopersistance) : présence à long terme d’une substance chimique 
(dans un système biologique) s’expliquant par sa résistance à la dégradation/ l’élimination.
 
Prévision à partir de données croisées : les informations sur les effets mesurés 
pour une ou plusieurs substances chimiques sont utilisées pour prédire l’effet 
observé pour la substance chimique cible.  
Saturation : état dans lequel un ou plusieurs processus cinétiques (par exemple, 
absorption, métabolisme ou élimination) sont à leur maximum (c’est-à-dire «satu ­
rés»).  
Sensibilité : capacité d’une méthode ou d’un instrument de mesure à distinguer 
entre des réponses correspondant à différents niveaux d’une variable d’intérêt.  
Substance d’essai : toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  
Tissu cible : tissu sur lequel se manifeste un effet indésirable majeur d’une 
susbtance toxique.  
T max : temps nécessaire pour atteindre C  max . ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 545
 
Toxicocinétique  (pharmacocinétique): étude de l’absorption, de la distribution, 
du métabolisme et de l’excrétion des substances chimiques au cours du temps.  
Validation des modèles : processus destiné à évaluer si un modèle décrit conve ­
nablement les données toxicocinétiques disponibles. Les modèles peuvent être évalués par comparaison statistique ou visuelle de leurs prévisions avec les valeurs expérimentales, en fonction d’une variable indépendante commune (par 
exemple le temps). L’ampleur de l’évaluation est justifiée en fonction de l’usage 
escompté du modèle.
 
Vitesse d’élimination : mesure quantitative de la vitesse à laquelle une substance 
d’essai est éliminée du sang, du plasma ou d’un tissu donné, par unité de temps.  
Voie d’administration  (orale, intraveineuse, cutanée, par inhalation, etc.): se 
rapporte aux moyens par lesquels une substance chimique est administrée dans 
le corps (par exemple, par gavage oral, oralement mélangée à la nourriture, par voie cutanée, par inhalation, en intraveineuse, etc.).
 
Voies de détoxication : série d’étapes conduisant à l’élimination des substances 
chimiques toxiques du corps, que ce soit par transformation métabolique ou par 
excrétion.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 546
 
B.37  NEUROTOXICITÉ RETARDÉE DES SUBSTANCES 
ORGANOPHOSPORÉES APRÈS EXPOSITION AIGUË  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Lorsqu'on évalue les effets toxiques des substances, il est important 
d'étudier la capacité qu'ont certaines substances à entraîner certains types de neurotoxicité que les autres études de toxicité pourraient ne pas mettre en évidence. Certains composés organophosphorés ont 
une neurotoxicité différée et doivent faire l'objet de telles études.
 
Des essais de dépistage in vitro peuvent être utilisés pour identifier 
les substances susceptibles d'entraîner une polyneuropathie différée; toutefois, des résultats négatifs à l'issue d'essais in vitro ne suffisent 
pas à prouver que la substance testée n'est pas neurotoxique.
 
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Les substances organophosphorées  comprennent les esters, thioesters 
organophosphorés non chargés ou anhydrides des acides organo ­
phosphoriques, organophosphoniques ou organophos-phoramidiques ou des acides phosphorothioïques, phosphonothioïques ou phospho ­
rothioamidiques apparentés ou d'autres substances pouvant entraîner 
la neurotoxicité différée parfois observée pour les substances de cette classe.
 
La neurotoxicité retardée  est un syndrome associé à l'installation 
prolongée et d'ataxie retardée, associée à des axonopathies distales 
au niveau de la moelle épinière et des nerfs périphériques, et à une inhibition et un vieillissement de l'estérase caractéristique des neuro ­
pathies (neuropathy taret esterase — NTE) dans les tissus nerveux.
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Une substance de référence peut être testée sur un lot témoin positif, 
afin de démontrer que, dans les conditions de l'essai, la réaction de 
l'espèce testée n'est pas modifiée de façon significative.  
Le tri-o-tolyi phosphate est un exemple de produit neurotoxique 
couramment utilisé [n  o CAS 78-30-8, n  o EINECS 201-103-5, 
nomenclature CAS: acide phosphorique, tris(2-méthylphényl)es-ter]; 
il est également connu sous le nom de tns-o-crésylphosphate.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance à tester est administrée oralement, en une prise unique, 
à des poules domestiques qui ont été protégées, le cas échéant, contre des effets cholinergiques aigus. Les animaux sont observés pendant 21 jours pour détecter des troubles du comportement, une 
ataxie et une paralysie. Des analyses biochimiques sont réalisées, en 
particulier pour mettre en évidence l'inhibition de l'estérase NTE, sur des poules sélectionnées au hasard dans chaque lot, en général 24 et 48 heures après administration. 21 jours après l'exposition, les poules 
restantes sont sacrifiées et un examen histopathologique est effectué 
sur des tissus nerveux choisis.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 547
 
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.5.1.  Préparation  
De jeunes poules adultes exemptes d'affections virales, ne faisant 
l'objet d'aucune médication susceptible d'interférer et ne présentant 
pas de troubles de la démarche sont réparties au hasard en lots 
d'expérience et lots témoins, et sont acclimatées aux conditions du laboratoire pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude.
 
Les cages ou enclos utilisés doivent être suffisamment grands pour 
que les poules puissent se mouvoir librement et pour que leur 
démarche puisse être aisément observée.  
La substance à tester est généralement administrée oralement, par 
gavage ou dans des capsules de gélatine, ou par une méthode compa ­
rable. Les substances liquides peuvent être administrées directement 
ou dissoutes dans un véhicule approprié tel que l'huile de maïs; les 
substances solides doivent si possible être dissoutes car il se peut que d'importantes quantités de solides administrées dans des capsules de gélatine ne soient pas bien absorbées. Si le véhicule est autre que de 
l'eau, ses caractéristiques toxiques doivent être connues et, dans le 
cas contraire, déterminées avant le début de l'essai.
 
1.5.2.  Conditions de l'essai  
1.5.2.1.  Animaux d'expérience  
L'espèce recommandée est la poule pondeuse domestique adulte 
jeune âgée de 8-12 mois  (Gallus gallus domesticus) . Il convient 
d'utiliser des races et souches de taille standard; les poules doivent 
normalement avoir été élevées dans des conditions leur permettant de se mouvoir librement.
 
1.5.2.2.  Nombre et sexe  
Outre le lot d'expérience, il faut prévoir un lot témoin recevant le 
véhicule seul et un lot témoin positif. Le lot recevant le véhicule seul 
doit être traité de la même façon que le lot d'expérience, exception 
faite de l'administration de la substance à tester.  
Il faut prévoir suffisamment d'animaux dans chaque lot pour que l'on 
puisse en sacrifier au moins six pour effectuer les déterminations 
biochimiques (trois à chacun des deux temps de prélèvement) et 
qu'il en survive six après la période d'observation de 21 jours.  
Le lot témoin positif peut être réalisé en parallèle ou provenir d'expé ­
riences antérieures récentes. Il doit se composer d'au moins six poules traitées par un produit neurotoxique connu à effet retardé; 
trois poules seront réservées aux examens biochimiques et trois à 
la recherche de signes pathologiques. La mise à jour périodique des données historiques recueillies antérieurement est recommandée. De nouveaux lots positifs devront être réalisés si une des conditions 
essentielles de l'expérience (par exemple souches, alimentation, 
hébergement) a été modifiée par le laboratoire chargé de l'essai.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 548
 
1.5.2.3.  Niveau de doses  
Il convient d'effectuer une étude préliminaire sur un nombre appro ­
prié de poules réparties dans des lots traités à différentes doses, afin de déterminer la dose à utiliser pour l'étude principale. Un certain 
taux de mortalité est inévitable dans cette étude préliminaire. Toute ­
fois, pour éviter la mort consécutive à des effets cholinergiques aigus, il est possible d'utiliser de l'atropine ou un autre agent protec ­
teur ne perturbant pas la réaction neurotoxique différée. Diverses 
méthodes d'essai peuvent être utilisées pour évaluer la dose non 
létale maximale d'une substance (voir méthode B.1  bis).  Les 
données recueillies antérieurement sur les poules ou d'autres infor ­
mations toxicologiques peuvent également être utiles pour déterminer 
la dose.
 
La dose utilisée dans l'étude principale doit être aussi élevée que 
possible, compte tenu des résultats de l'étude préliminaire et de la 
limite supérieure de 2 000 mg/kg poids corporel. Quel que soit le taux de mortalité, il doit subsister un nombre suffisant d'animaux pour effectuer les analyses biochimiques (six) et l'examen histolo ­
gique (six) au 21
 e jour. Il convient d'utiliser de l'atropine ou un autre 
agent qui ne perturbe pas les réactions neurotoxiques différées, afin d'éviter la mort par effets cholinergiques aigus.
 
1.5.2.4.  Essai limite  
Lorsqu'un essai réalisé selon le mode opératoire décrit ci-après, à une 
dose d'au moins 2 000 mg/kg p.c/jour, n'entraîne pas d'effets toxiques observables et que les données relatives aux substances 
de structure voisine ne laissent pas supposer une toxicité, il n'est 
pas nécessaire d'effectuer une étude à une dose plus élevée. L'essai limite est applicable, sauf lorsqu'une exposition humaine fait appa ­
raître la nécessité d'utiliser une dose plus élevée.
 
1.5.2.5.  Période d'observation  
La période d'observation doit s'étendre sur 21 jours.  
1.5.3.  Mode opératoire  
Après administration d'un agent protecteur pour éviter que des effets 
cholinergiques aigus n'entraînent la mort, la substance à tester est 
administrée en une prise unique.  
1.5.3.1.  Observation générale  
L'observation doit débuter immédiatement après l'exposition. Toutes 
les poules sont observées soigneusement plusieurs fois au cours des 
deux premiers jours, puis au moins une fois par jour, pendant 21 jours ou jusqu'à la date prévue du sacrifice. Tous les signes de toxicité doivent être notés, ainsi que la date d'apparition des troubles 
du comportement, leur type, leur gravité et leur durée. L'ataxie doit 
être mesurée à l'aide d'une échelle d'évaluation ordinale comportant au moins quatre niveaux; la paralysie doit être notée. Au moins deux fois par semaine, les poules destinées à la recherche des signes 
pathologiques doivent être sorties de leurs cages et soumises à une 
épreuve d'activité motrice forcée, d'escalade d'échelles par exemple, afin de faciliter l'observation de faibles manifestations de toxicité. Les animaux moribonds ou présentant des signes de détresse ou de 
souffrance intense doivent être immédiatement retirés de l'étude, 
euthanasiés et autopsiés.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 549
 
1.5.3.2.  Poids corporel  
Toutes les poules sont pesées juste avant l'administration de la subs ­
tance, et au moins une fois par semaine par la suite.  
1.5.3.3.  Biochimie  
Six poules choisies au hasard dans chacun des lots d'expérience et 
des lots témoins négatifs, ainsi que trois poules prélevées dans le lot témoin positif (si l'essai est réalisé en parallèle sur ce dernier) sont sacrifiées quelques jours après administration; le cerveau et la moelle 
épinière lombaire sont préparés et analysés pour détecter l'inhibition 
de l'estérase caractéristique des neuropathies. Il peut en outre s'avérer utile d'analyser l'inhibition de cette estérase sur du nerf sciatique. En 
règle générale, trois poules du lot témoin et de chaque lot d'expé ­
rience sont sacrifiées après 24 heures et trois autres après 48 heures, tandis que les trois poules du lot témoin positif sont sacrifiées après 24 heures. Si l'observation des signes cliniques d'intoxication (sou ­
vent estimés par le moment d'apparition des effets cholinergiques) 
indique que la substance toxique est éliminée très lentement, il peut s'avérer préférable de prélever les tissus sur trois poules à deux autres temps compris entre 24 heures et au plus tard 72 heures 
après administration.
 
S'il y a lieu, il est également possible d'effectuer des déterminations 
de l'acétylcholinestérase (AChE) sur des échantillons. Toutefois, il 
peut y avoir réactivation spontanée de l'acétylcholinestérase in vivo, 
ce qui pourrait faire sous-estimer l'activité de la substance en tant qu'inhibiteur de l'AChE.
 
1.5.3.4.  Autopsie  
L'autopsie de tous les animaux (sacrifices prévus ou exigés par l'état 
de l'animal) doit comporter un examen de l'aspect du cerveau et de la moelle épinière.
 
1.5.3.5.  Examen histopathologique  
Les tissus nerveux des animaux survivants après la période d'obser ­
vation et non utilisés pour les études biochimiques doivent faire l'objet d'un examen microscopique. Les tissus doivent être fixés in situ par des techniques de perfusion. Les coupes doivent être prati ­
quées au niveau du cervelet (plan longitudinal moyen), du bulbe 
rachidien, de la moelle épinière et des nerfs périphériques. Les coupes de la moelle épinière seront pratiquées dans la partie cervi ­
cale supérieure, dans la région thoracique moyenne et dans la région 
lombo-sacrée. Des coupes devront également être réalisées dans la partie distale du nerf tibial et au niveau de ses ramifications vers les muscles gastroenémiens, ainsi qu'au niveau du nerf sciatique. Les 
coupes seront colorées à l'aide de colorants appropriés, spécifiques 
de la myéline et des axones.
 
2. RÉSULTATS  
En règle générale, si les résultats obtenus pour les différents points 
d'évaluation retenus (biochimie, histopathologie et observation du 
comportement) sont négatifs, il n'est normalement pas nécessaire de poursuivre les essais de neurotoxicité différée. Les résultats équi ­
voques ou non concluants peuvent nécessiter une poursuite de 
l'étude.
 
Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuel ­
lement. En outre, tous les résultats doivent être présentés sous forme 
de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'ani ­
maux présents au début de l'essai, le nombre d'animaux présentant des lésions, des troubles du comportement ou des modifications biochimiques, le type et la gravité de ces lésions ou troubles, ainsi 
que le pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion ou 
trouble aux différents niveaux de gravité.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 550
 
Les résultats de cette étude doivent être évalués du point de vue de 
l'incidence, de la gravité et de la corrélation entre les effets compor ­
tementaux, biochimiques et histopathologiques et tout autre effet observé dans les lots traités et les lots témoins.
 
Les résultats numériques seront évalués par des méthodes statistiques 
appropriées et reconnues. Ces méthodes statistiques doivent être 
choisies lors de la conception de l'étude.  
3. COMPTE RENDU  
PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
Animaux d'expérience:  
— souche utilisée,  
— nombre d'animaux et âge,  
— origine, conditions d'hébergement, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'expérience.  
Conditions expérimentales:  
— détails concernant la préparation de la substance à tester, sa 
stabilité et son homogénéité, s'il y a lieu,  
— justification du choix du véhicule,  
— détails concernant l'administration de la substance à tester,  
— détails concernant la qualité de la nourriture et de l'eau,  
— justification du choix de la dose,  
— spécification des doses administrées, avec indications détaillées 
concernant le véhicule, le volume et la forme physique de la substance administrée,
 
— identité de l'agent protecteur éventuel et détails concernant son 
administration.  
Résultats:  
— données relatives au poids corporel,  
— données concernant la réaction toxique par groupe, y compris la 
mortalité,  
— nature, gravité et durée des effets cliniques observés (réversibilité 
éventuelle),  
— description détaillée des méthodes biochimiques et de leurs résul ­
tats, 
— résultats de l'autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques,  
— le cas échéant, traitement statistique des résultats.  
Discussion des résultats  
Conclusion  
4. RÉFÉRENCES  
Cette méthode reprend la ligne directrice 418 de l'OCDE.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 551
 
B.38  NEUROTOXICITÉ RETARDÉE DES SUBSTANCES 
ORGANOPHOSPHORÉES ÉTUDE PAR ADMINISTRATION 
RÉITÉRÉE SUR 28 JOURS  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Lorsqu'on évalue les effets toxiques des substances, il est important 
d'étudier la capacité qu'ont certaines substances à entraîner certains types de neurotoxicité que les autres études de toxicité pourraient ne 
pas mettre en évidence. Certains composés organophosphorés ont 
une neurotoxicité différée et doivent faire l'objet de telles études.
 
Des essais de dépistage in vitro peuvent être utilisés pour identifier 
les substances susceptibles d'entraîner une polyneuropathie différée; 
toutefois, des résultats négatifs à l'issue d'études in vitro ne suffisent 
pas à prouver que la substance testée n'est pas neurotoxique.  
Cet essai de neurotoxicité retardée sur 28 jours fournit des informa ­
tions sur d'éventuels dangers pour la santé pouvant découler d'expo ­
sitions répétées au cours d'une période déterminée. Il donnera des 
informations sur la relation dose-effet et pourra fournir une estima ­
tion du niveau de dose sans effet néfaste observé, pouvant être utile à l'établissement des critères de sécurité pour l'exposition.
 
Voir introduction générale, partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Les substances organophosphorées  comprennent les esters, thioesters 
organophosphorés non chargés ou anhydrides des acides organo ­
phosphoriques, organophosphoniques ou organophos-phoramidiques ou des acides phosphorothioïques, phosphonothioïques ou phospho ­
rothioamidiques apparentés ou d'autres substances pouvant entraîner 
la neurotoxicité différée parfois observée pour les substances de cette classe.
 
La neurotoxicité retardée  est un syndrome associé à l'installation 
prolongée et d'ataxie retardée, associée à des axonopathies distales 
au niveau de la moelle épinière et des nerfs périphériques, et à une inhibition et un vieillissement de l'estérase caractéristique des neuro ­
pathies (neuropathy target esterase — NTE) dans les tissus nerveux.
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance à tester est administrée quotidiennement par voie orale 
à des poules domestiques pendant 28 jours. Les animaux sont 
observés au moins une fois par jour pour rechercher des troubles du comportement, une ataxie et une paralysie, et ce jusqu'au 14
 e jour 
après administration de la dernière dose. Des analyses biochimiques 
sont réalisées, en particulier pour mettre en évidence l'inhibition de 
l'estérase NTE, sur des poules sélectionnées au hasard dans chaque lot, en général 24 et 48 heures après la dernière administration. Deux semaines après la dernière administration, les poules restantes sont 
sacrifiées et un examen histopathologique est effectué sur certains 
tissus nerveux.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 552
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Préparation  
De jeunes poules adultes exemptes d'affections virales, ne faisant 
l'objet d'aucune médication susceptible d'interférer et ne présentant 
pas de troubles de la démarche sont réparties au hasard entre les lots 
d'expérience et les lots témoins, et sont acclimatées aux conditions du laboratoire pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude.
 
Les cages ou enclos utilisés doivent être suffisamment grands pour 
que les poules puissent se déplacer librement et pour que leur démarche puisse être aisément observée.
 
La substance à tester doit être administrée par voie orale chaque jour, 
sept jours sur sept, de préférence par gavage ou dans des capsules de 
gélatine. Les substances liquides peuvent être administrées directe ­
ment ou dissoutes dans un véhicule approprié tel que l'huile de maïs; les substances solides doivent si possible être dissoutes car il se peut 
que d'importantes quantités de solides administrées dans des capsules 
de gélatine ne soient pas bien absorbées. Si le véhicule est autre que de l'eau, ses caractéristiques toxiques doivent être connues et, dans le cas contraire, déterminées avant le début de l'essai.
 
1.4.2.  Conditions de l'essai  
1.4.2.1.  Animaux d'expérience  
Il est recommandé d'utiliser de jeunes poules pondeuses adultes  
(Gallus quitus domesticus)  âgées de 8 à 12 mois. Il convient d'uti ­
liser des races et souches de taille standard; les poules doivent 
normalement avoir été élevées dans des conditions leur permettant de se déplacer librement.
 
1.4.2.2.  Nombre et sexe  
En règle générale, il faut prévoir au moins trois lots d'expérience et 
un lot témoin recevant uniquement le véhicule. Le lot recevant le véhicule seul doit être traité de la même façon que le lot d'expé ­
rience, exception faite de l'administration de la substance à tester.
 
Il faut prévoir suffisamment d'animaux dans chaque lot pour que l'on 
puisse en sacrifier au moins six pour effectuer les analyses biochi ­
miques (trois lors de chacun des deux temps de prélèvement) et qu'il en survive six après la période d'observation post-traitement de 14 jours.
 
1.4.2.3.  Doses  
Les doses doivent être sélectionnées en tenant compte des résultats 
d'un essai de neurotoxicité retardée après exposition aigué et de toute autre information disponible concernant la toxicité ou la cinétique de 
la substance à tester. La dose la plus élevée doit être choisie dans le 
but de produire des effets toxiques et de préférence une neurotoxicité différée, sans entraîner la mort ni des souffrances manifestes. Il convient ensuite de définir une série décroissante de doses afin de 
mettre en évidence une éventuelle relation dose-effet et une dose 
minimale n'entraînant aucun effet observable.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 553
 
1.4.2.4.  Essai limite  
Lorsqu'un essai réalisé selon le mode opératoire décrit ci-après, à une 
dose d'au moins 1 000 mg/kg p.c./jour, n'entraîne pas d'effets toxiques observables et que les données relatives aux substances 
de structure apparentée ne laissent pas supposer une toxicité, il 
n'est pas nécessaire d'effectuer une étude à une dose plus élevée. L'essai limite est applicable, sauf lorsqu'une exposition humaine fait apparaître la nécessité d'utiliser une dose plus élevée.
 
1.4.2.5.  Période d'observation  
Tous les animaux doivent être observés au moins une fois par jour 
pendant la période d'exposition et pendant les 14 jours suivants, sauf si une autopsie est prévue.
 
1.4.3.  Mode opératoire  
La substance à tester est administrée tous les jours, sept jours sur 
sept, pendant 28 jours.  
1.4.3.1.  Observation générale  
L'observation doit débuter immédiatement après l'exposition. Toutes 
les poules sont observées attentivement au moins une fois par jour 
pendant les 28 jours de traitement et pendant les 14 jours suivants ou jusqu'à la date prévue de leur sacrifice. Tous les signes de toxicité doivent être consignés, ainsi que leur date d'apparition, leur type, 
leur gravité et leur durée. L'observation doit porter sur les troubles 
du comportement, sans toutefois s'y limiter. L'ataxie doit être mesurée à l'aide d'une échelle d'évaluation ordinale comportant au 
moins quatre niveaux; la paralysie doit être consignée. Au moins 
deux fois par semaine, les poules doivent être sorties de leurs cages et soumises à une épreuve d'activité motrice forcée, d'escalade d'échelles, par exemple, afin de faciliter l'observation des effets 
toxiques minimaux. Les animaux moribonds ou présentant des 
signes de détresse ou de souffrance intense doivent être immédiate ­
ment retirés de l'étude, euthanasiés et autopsiés.
 
1.4.3.2.  Poids corporel  
Toutes les poules sont pesées juste avant la première administration 
de la substance, et au moins une fois par semaine par la suite.  
1.4.3.3.  Biochimie  
Six poules prélevées au hasard dans chacun des lots d'expérience et 
des lots témoins recevant le véhicule seul sont sacrifiées quelques 
jours après la dernière administration; le cerveau et la moelle 
épinière lombaire sont préparés et analysés pour détecter l'inhibition de l'estérase caractéristique des neuropathies (NTE). Il peut en outre s'avérer utile de rechercher l'inhibition de cette estérase sur le nerf 
sciatique. En règle générale, trois poules du lot témoin et de chaque 
lot d'expérience sont sacrifiées 24 heures après la dernière adminis ­
tration et trois autres 24 heures plus tard, soit 48 heures après la dernière administration; si les résultats de l'étude par exposition aigué 
ou d'autres études (étude toxicocinétique, par exemple) indiquent 
qu'il est préférable de choisir d'autres temps de sacrifice, les temps de sacrifices seront modifiés en conséquence et les documents justifi ­
catifs seront fournis.
 
S'il y a lieu, il est également possible d'effectuer des déterminations 
de l'acétylcholinestérase (AChE) sur ces échantillons. Toutefois, il peut y avoir réactivation spontanée de l'acétylcholinestérase in vivo, 
ce qui pourrait faire sous-estimer l'activité de la substance en tant 
qu'inhibiteur de l'AChE.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 554
 
1.4.3.4.  Autopsie  
L autopsie de tous les animaux (sacrifice programmé ou imposé par 
l'état des animaux) doit comporter un examen de l'aspect du cerveau et de la moelle épinière.
 
1.4.3.5.  Examen histopathologique  
Les tissus nerveux des animaux survivants après la période d'obser ­
vation et non utilisés pour les études biochimiques doivent faire l'objet d'un examen microscopique. Les tissus doivent être fixés in 
situ par des techniques de perfusion. Les coupes doivent être prati ­
quées au niveau du cervelet (plan longitudinal moyen), du bulbe rachidien, de la moelle épinière et des nerfs périphériques. Les coupes de la moelle épinière seront pratiquées dans la partie cervi ­
cale supérieure, dans la région thoracique moyenne et dans la région 
sacro-lombaire. Des coupes devront également être réalisées dans la région distale du nerf tibial et au niveau de ses ramifications vers les muscles jumeaux du triceps, ainsi qu'au niveau du nerf sciatique. Les 
coupes seront colorées à l'aide de colorants appropriés, spécifiques 
de la myéline et des axones. Dans un premier temps, l'examen micro ­
scopique sera effectué sur les tissus conservés de tous les animaux du lot traité à la dose la plus élevée et du lot témoin. Si des effets sont mis 
en évidence dans le lot traité à la dose la plus élevée, l'examen micro ­
scopique devra également porter sur les tissus des animaux des lots traités à la dose intermédiaire et à la dose faible.
 
2. RÉSULTATS  
En règle générale, si les résultats obtenus pour les différents critères 
d'évaluation retenus dans cette méthode (biochimie, histopathologie et observation du comportement) sont négatifs, il n'est pas nécessaire de poursuivre les essais de neurotoxicité différée. Les résultats équivoques 
ou non concluants peuvent nécessiter une poursuite de l'étude.
 
Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuel ­
lement. En outre, tous les résultats doivent être récapitulés dans un 
tableau indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux présents au début de l'essai, le nombre d'animaux présentant des lésions, des troubles du comportement ou des modifications biochi ­
miques, le type et la gravité de ces lésions ou symptômes, ainsi que 
le pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion ou symp ­
tôme aux différents niveaux de gravité.
 
Les résultats de cette étude doivent être évalués du point de vue de 
l'incidence, de la gravité et de la corrélation entre les effets compor ­
tementaux, biochimiques et histopathologiques et tout autre effet observé dans les lots traités et les lots témoins.
 
Les résultats numériques seront évalués par des méthodes appro ­
priées et reconnues. Ces méthodes statistiques doivent être choisies 
lors de la conception de l'étude.  
3. COMPTE RENDU  
PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
Animaux d'expérience:  
— souche utilisée,  
— nombre d'animaux et âge,  
— origine, conditions d'hébergement, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'expérience.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 555
 
Conditions expérimentales:  
— détails concernant la préparation de la substance à tester, sa 
stabilité et son homogénéité, s'il y a lieu,  
— justification du choix du véhicule,  
— détails concernant l'administration de la substance à tester,  
— détails concernant la qualité de la nourriture et de l'eau,  
— justification du choix de la dose,  
— spécification des doses administrées, avec indications détaillées 
concernant le véhicule, le volume et la forme physique de la 
substance administrée,  
— si les déterminations biochimiques ne sont pas pratiquées 24 et 
48 heures après la dernière administration, justification du choix d'autres temps.
 
Résultats:  
— données relatives au poids corporel,  
— données concernant la réaction toxique par groupe, y compris la 
mortalité,  
— niveau de dose sans effet néfaste observé,  
— nature, gravité et durée des effets cliniques observés (réversibilité 
éventuelle),  
— description détaillée des méthodes biochimiques et de leurs 
résultats,  
— résultats de l'autopsie,  
— description détaillée de tous les résultats histopathologiques,  
— le cas échéant, traitement statistique des résultats.  
Discussion des résultats  
Conclusion  
4. RÉFÉRENCES  
Cette méthode reprend la ligne directive 419 de l'OCDE.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 556
 
B.39.  ESSAI IN VIVO DE SYNTHÈSE NON PROGRAMMÉE DE 
L'ADN (UDS) SUR CELLULES HÉPATIQUES DE 
MAMMIFÈRE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est une adaptation de la ligne directrice OCDE TG 
486, Essai in vivo de synthèse non programmée de l'ADN (UDS) sur cellules hépatiques de mammifères (1997).
 
1.1. INTRODUCTION  
L'essai in vivo de synthèse non programmée de l'ADN (unscheduled 
DNA synthesis, UDS) sur cellules hépatiques de mammifère est 
destiné à identifier les substances qui induisent la réparation de 
l'ADN dans les cellules hépatiques des animaux traités (1, 2, 3, 4).  
Cet essai in vivo constitue une méthode d'étude des effets géno ­
toxiques des substances chimiques dans le foie. L'effet mesuré témoigne de l'altération de l'ADN et de la réparation qui en résulte 
dans les cellules hépatiques. Comme le foie est généralement le 
principal site du métabolisme des substances absorbées, il constitue un site approprié pour la détermination in vivo des altérations de l'ADN.
 
Il ne faut pas avoir recours à cet essai s'il est manifeste que la 
substance d'essai ou un métabolite réactif n'atteindra pas le tissu 
cible.  
La synthèse non programmée de l'ADN (UDS) est mesurée en déter ­
minant l'incorporation de nucléosides marqués dans les cellules qui ne subissent pas une synthèse programmée (phase S) de l'ADN. La 
technique la plus couramment utilisée est la détermination par auto ­
radiographie de l'incorporation de thymidine marquée au tritium (
 3 H- 
TdR). On utilise de préférence le foie de rat pour les essais UDS  in 
vivo. D'autres tissus peuvent être utilisés mais ne font pas l'objet de 
cette méthode.  
La détection d'une UDS dépend du nombre de bases d'ADN excisées 
et remplacées au site de l'altération. Ainsi, l'essai UDS est particu ­
lièrement utile pour détecter la réparation de longues séquences (20- 
30 bases) induite par la substance. Par contre, la réparation de 
courtes séquences (1-3 bases) est détectée avec une sensibilité beau ­
coup plus faible. En outre, des événements mutagènes peuvent résulter d'une non-réparation, d'une réparation erronée d'altérations 
de l'ADN ou d'une réplication erronée. L'ampleur de l'UDS ne 
fournit aucune indication quant à la fidélité du processus de répara ­
tion. D'autre part, il est possible qu'un mutagène réagisse avec l'ADN sans que l'altération de celui-ci soit réparée par un processus de 
réparation par excision. Le fait que l'essai UDS ne fournit pas d'in ­
formations spécifiques sur l'activité mutagène est compensé par la sensibilité potentielle de ce critère parce qu'il est mesuré dans la totalité du génome.
 
Voir aussi l'introduction générale de la partie B.  
1.2. DÉFINITIONS  
Cellules en réparation:  nombre net de grains (NNG) supérieur à 
une valeur préétablie à justifier par le laboratoire effectuant l'essai.  
Nombre net de grains (NNG):  mesure quantitative de l'activité 
UDS de cellules lors d'essais UDS autoradiographiques; calculé en 
soustrayant du nombre de grains nucléaires (GN) le nombre moyen de grains cytoplasmiques dans des zones cytoplasmiques équiva ­
lentes au noyau (GC): NNG = GN -GG. Les NNG sont calculés 
pour les cellules individuelles, puis regroupés pour les cellules d'une 
culture, de cultures parallèles, etc.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 557
 
Synthèse réparatrice de l'ADN (UDS):  synthèse de réparation de 
l'ADN après excision et élimination d'un fragment d'ADN contenant 
une région lésée par des substances chimiques ou physiques.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
L'essai UDS in vivo sur cellules hépatiques de mammifère indique 
une synthèse de réparation de l'ADN après excision et élimination 
d'un fragment d'ADN contenant une région altérée par des subs ­
tances chimiques ou physiques. L'essai repose généralement sur l'in ­
corporation de  3 H-TdR dans l'ADN de cellules hépatiques qui 
présentent une faible fréquence de cellules dans la phase S du 
cycle cellulaire. L'incorporation de  3 H-TdR est généralement déter ­
minée par autoradiographie dans la mesure où cette technique n'est pas sensible aux interférences dues aux cellules en phase S comme c'est le cas du comptage en scintillation liquide, par exemple.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.4.1.  Préparations  
1.4.1.1.  Sélection de l'espèce animale  
Le rat est communément utilisé, bien que n'importe quelle espèce de 
mammifère appropriée puisse être employée. Il convient d'utiliser des 
animaux adultes, jeunes et sains issus de souches couramment utili ­
sées en laboratoire. Au début de l'étude, la différence pondérale des animaux doit être minimale et ne pas dépasser ± 20 % du poids 
moyen de chaque sexe.
 
1.4.1.2.  Conditions d'encagement et régime alimentaire  
Les conditions générales décrites dans l'introduction générale de la 
partie B sont appliquées mais le taux d'humidité devrait se situer aux 
environs de 50-60 %.  
1.4.1.3.  Préparation des animaux  
De jeunes adultes sains sont répartis par randomisation entre les 
groupes des animaux témoins et traités. Les cages doivent être disposées de telle manière qu'il n'y ait pas d'effet dû à leur empla ­
cement. Ils sont identifiés individuellement. Ils sont gardés dans leur 
cage pendant au moins cinq jours avant le début de l'étude, de façon à les acclimater aux conditions du laboratoire.
 
1.4.1.4.  Substance d'essai/préparation  
Les substances d'essai solides sont préparées par dissolution ou 
suspension dans un véhicule ou un solvant approprié, puis éventuel ­
lement diluées avant l'administration aux animaux. Les substances d'essai liquides peuvent être administrées directement ou après dilu ­
tion. Il convient d'utiliser des préparations fraîches, sauf si l'on 
dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les domaines du stockage.
 
1.4.2.  Conditions expérimentales  
1.4.2.1.  Solvant/véhicule  
Le solvant/véhicule choisi ne doit pas avoir d'effet toxique aux doses 
utilisées ni présenter de réaction chimique avec la substance d'essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données faisant état de leur compatibilité. On préconise d'envi ­
sager d'abord l'utilisation d'un solvant/véhicule aqueux, chaque fois 
que cela est possible.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 558
 
1.4.2.2.  Témoins  
Des témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule) doivent être inclus 
dans chaque partie indépendante de l'expérience. Les animaux des groupes témoins sont traités exactement comme ceux des groupes 
traités, mise à part l'administration de la substance d'essai.
 
Les témoins positifs doivent être  des substances dont on sait qu'elles 
produisent une UDS à des niveaux d'exposition supposés conduire à un accroissement détectable par rapport au bruit de fond. Les témoins positifs pour lesquels une activation métabolique est néces ­
saire doivent être utilisés à des doses qui donnent lieu à une réponse 
modérée (4). Les doses peuvent être choisies de façon que les effets soient évidents et que l'identité des lames codées ne soit pas révélée immédiatement à l'examinateur. Les substances indiquées dans le 
tableau ci-dessous sont des exemples de témoins positifs.
 
Moment de prélèvement Substance № CAS N  o Einecs  
Précoce (2-4 heures) N-nitrosodiméthylamine 62-75-9 200-249-8 
Tardif (12-16 heures) N-2-fluorénylacétamide (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
D'autres témoins positifs appropriés peuvent être utilisés. Le témoin 
positif doit être administré par une voie différente de celle utilisée pour la substance d'essai.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Nombre et sexe des animaux  
Il convient d'utiliser un nombre adéquat d'animaux afin de tenir 
compte de variations interindividuelles de la réponse à l'essai. Il 
doit y avoir au moins 3 animaux analysables par groupe. Lorsqu'on 
dispose d'une importante quantité de données historiques, les groupes témoins négatifs et positifs peuvent ne comprendre que 1 ou 2 animaux.
 
Si, au moment de l'étude, on dispose de données historiques effec ­
tuées avec la même espèce et ayant utilisé la même voie d'adminis ­
tration, qui démontrent l'absence de différence importante de toxicité entre sexes, on peut effectuer l'essai avec des animaux d'un seul sexe, de préférence des mâles. Si l'exposition humaine est spécifique 
du sexe, par exemple dans le cas de certains produits pharmaceu ­
tiques, des animaux du sexe approprié doivent être utilisés pour l'essai.
 
1.5.2.  Modalité de traitement  
Les substances d'essai sont généralement administrées en une seule 
fois. 
1.5.3.  Niveaux de dose  
Normalement, on utilise au moins deux niveaux de dose. La dose la 
plus élevée est définie comme la dose qui produit des signes de toxicité tels qu'ils font supposer que des doses plus fortes, adminis ­
trées suivant les mêmes modalités, seraient létales. En général, la 
dose la plus faible est comprise entre la moitié et le quart de la 
dose la plus forte.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 559
 
Les substances possédant une activité biologique spécifique à des 
doses faibles et non toxiques (comme les hormones et les mitogènes) 
peuvent faire exception à ces critères d'établissement de doses et doivent être évaluées cas par cas. Si une étude préliminaire est réalisée afin d'évaluer les niveaux de dose, cette étude doit être 
effectuée dans le même laboratoire en utilisant la même espèce, la 
même souche, des animaux du même sexe et la même modalité de traitement que ceux de l'étude principale.
 
La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui 
produit certains indices de toxicité dans le foie (noyaux pyenotiques, par exemple).
 
1.5.4.  Test limite  
Si un essai réalisé avec au moins 2 000 mg/kg de poids corporel, en 
une seule dose ou en deux doses administrées le même jour, n'en ­
gendre aucun effet toxique observable et si une génotoxicité est 
improbable d'après les données relatives à des substances de struc ­
ture voisine, on peut considérer qu'une étude complète n'est pas nécessaire. Suivant l'importance de l'exposition humaine probable, 
on peut envisager d'utiliser des doses plus fortes dans l'essai de 
dose limite.
 
1.5.5.  Voies d'administration  
La substance d'essai est généralement administrée par gavage à l'aide 
d'une sonde gastrique  ou d'une  canule d'intubation adaptée. D'autres 
voies d'exposition sont acceptables lorsqu'elles peuvent être justifiées. La voie péritonéale n'est toutefois pas recommandée, 
étant donné qu'elle peut conduire à une exposition directe du foie 
à la substance d'essai plutôt que par l'intermédiaire du système circu ­
latoire. Le volume maximal de liquide administre en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne 
devrait pas dépasser 2 ml/100 g de poids corporel. Une justification 
doit être fournie si des volumes plus importants sont administrés. Il convient de réduire au minimum la variation du volume administré 
en ajustant la concentration à tous les niveaux de doses, sauf pour les 
produits irritants ou corrosifs dont les effets sont généralement exacerbés lorsqu'on augmente la concentration.
 
1.5.6.  Préparation des cellules hépatiques  
Les cellules hépatiques des animaux traités sont normalement prépa ­
rées 12-16 heures après le traitement. Un prélèvement supplémen ­
taire effectué plus tôt (normalement 2-4 heures après le traitement) 
est en général nécessaire, à moins qu'il y ait une réponse manifes ­
tement positive après 12-16 heures. Toutefois, d'autres délais de prélèvement peuvent être utilisés s'ils sont justifiés sur la base de données toxicocinétiques.
 
Les cultures à court terme de cellules hépatiques de mammifère sont 
habituellement établies en perfusant le foie in situ avec la collagé ­
nase et en laissant les cellules fraîchement dissociées se fixer sur une 
surface appropriée. Les cellules hépatiques des témoins négatifs doivent présenter une viabilité (5) d'au moins 50 pour cent.
 
1.5.7.  Détermination de l'UDS  
Les cellules hépatiques de mammifère fraîchement isolées sont géné ­
ralement incubées dans un milieu contenant du  3 H-TdR pendant une 
durée appropriée (3-8 heures, par exemple). A la fin de la période 
d'incubation, le milieu est enlevé des cellules, qui peuvent ensuite 
être incubées avec un milieu contenant un excès de thymidine non marquée, afin de réduire la radioactivité non incorporée ( cold chase ). 
Les cellules sont ensuite rincées, fixées et séchées. Pour les périodes 
d'incubation plus longues, la  cold chase  n'est pas absolument néces ­
saire. Les lames sont plongées dans une émulsion autoradiogra ­
phique, maintenues dans l'obscurité (réfrigérées pendant 7-14 jours, par exemple), développées et colorées. On procède ensuite au 
comptage des grains d'argent. On prépare deux à trois lames pour 
chaque animal.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 560
 
1.5.8.  Analyse  
Les préparations sur lame doivent contenir un nombre suffisant de 
cellules de morphologie normale pour qu'une évaluation probante de l'UDS soit possible. Les préparations sont examinées au microscope 
en vue de la recherche de signes de cytotoxirité manifeste (pyenose, 
diminution du niveau de marquage radioactif, par exemple).
 
Les lames doivent être codées avant le comptage des grains. On 
analyse normalement 100 cellules de chaque animal sur au moins deux lames; l'analyse d'un nombre inférieur à 100 cellules/animal doit être justifié. Le nombre de grains n'est pas déterminé pour les 
noyaux en phase S, mais la proportion de cellules en phase S peut 
être enregistrée.
 
Le niveau d'incorporation de  3 H-TdR dans le noyau et le cytoplasme 
des cellules morphologiquement normales, tel qu'il est mis en 
évidence par le dépôt de grains d'argent, doit être déterminé à l'aide de méthodes appropriées.
 
Le nombre de grains est déterminé au niveau du noyau (grains 
nucléaires, GN) et des zones du cytoplasme équivalentes au noyau (grains cytoplasmiques, GC). Le nombre de GC est déterminé sur la 
base soit de la région du cytoplasme la plus fortement marquée, soit 
de la moyenne de deux ou trois régions proches du noyau choisies au hasard. D'autres méthodes de comptage (cellules entières, par exemple) peuvent être utilisées si on peut les justifier (6).
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les données doivent être indiquées individuellement pour chaque 
culture. En outre, toutes les données doivent être résumées sous 
forme de tableaux. Le nombre net de grains (NNG) doit être déter ­
miné pour chaque cellule, chaque animal, chaque dose et chaque temps de prélèvement en soustrayant le nombre de GC du nombre de GN. Si des «cellules en réparation» sont comptées, les critères 
pour définir les «cellules en réparation» doivent être justifiés et se 
fonder sur des données historiques ou sur des témoins négatifs concomitants. Les résultats numériques peuvent être évalués à l'aide de méthodes statistiques. Dans ce cas, il faut choisir et justifier 
les tests statistiques avant la réalisation de l'étude.
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Exemples de critères permettant de conclure à une réponse positive 
ou négative: 
positive i) valeur NNG supérieure à un seuil préétabli 
justifié sur la base des données historiques 
du laboratoire, ou 
ii) valeur NNG significativement supérieure à 
celle du témoin concomitant, 
négative i) valeur NNG inférieure ou égale au seuil des 
contrôles historiques, ou 
ii) valeur NNG non significativement supérieure 
à celle du témoin concomitant.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 561
 
Il convient de prendre en considération la pertinence biologique des 
données (paramètres tels que la variation interindividuelle, la relation 
dose-réponse et la cytotoxicité). L'évaluation des résultats peut s'ap ­
puyer sur des méthodes statistiques mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteur décisif pour conclure à une réponse 
positive.
 
Bien que la plupart des essais donneront des résultats nettement 
positifs ou négatifs, dans certains cas rares l'ensemble des résultats 
d'un essai n'autorise pas une conclusion catégorique sur l'activité de la substance étudiée. Les résultats peuvent rester équivoques ou discutables indépendamment du nombre de répétitions de l'essai.
 
Un résultat positif à l'essai UDS in vivo sur cellules hépatiques de 
mammifère indique que la substance d'essai induit des altérations de 
l'ADN dans les cellules hépatiques de mammifère in vivo qui peuvent être réparées par la synthèse non programmée de l'ADN in vitro. Un résultat négatif signifie que, dans les conditions de 
l'essai, la substance d'essai n'induit pas d'altération de l'ADN détec ­
table par cet essai.
 
Le fait que la substance d'essai atteint la circulation générale ou 
spécifiquement le tissu cible (toxicité systémique) devrait être discutée.
 
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d'essai dans le solvant/vé ­
hicule, si elles sont connues.  
Animaux d'expérience:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— source, conditions d'encagement, régime alimentaire, etc.,  
— poids individuels des animaux au début de l'essai, y compris 
l'intervalle des poids, la moyenne et l'écart-type dans chaque groupe.
 
Conditions expérimentales:  
— données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhi ­
cule),  
— résultats de l'étude de détermination des doses utiles, si elle a été 
réalisée,  
— justification du choix des doses employées,  
— détails concernant la préparation de la substance d'essai,  
— détails concernant l'administration de la substance d'essai,  
— justification du choix de la voie d'administration,  
— méthodes pour vérifier que la substance a atteint ta circulation 
générale ou le tissu cible, le cas échéant,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 562
 
— conversion de la concentration (ppm) de la substance d'essai dans 
l'eau de boisson ou la nourriture en dose réelle (mg/kg de poids 
corporel/jour), s'il y a lieu,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau,  
— description détaillée des modalités de traitement et de prélève ­
ment,  
— méthodes de mesure de la toxicité,  
— méthode de préparation et de culture des cellules hépatiques,  
— technique autoradiographique utilisée,  
— nombre de lames préparées et nombre de cellules analysées,  
— critères d'évaluation,  
— critères de décision concernant les résultats positifs, négatifs et 
équivoques.  
Résultats:  
— valeurs moyennes du nombre de grains nucléaires, du nombre de 
grains cytoplasmiques et du nombre net de grains pour chaque 
lame, animal et groupe,  
— relation dose-réponse, si possible,  
— évaluation statistique, le cas échéant,  
— signes de toxicité,  
— données sur les témoins négatifs (solvant/véhicule) et positifs 
concomitants,  
— données sur les témoins négatifs (solvant/véhicule) et positifs 
antérieurs (étendues, moyennes et écarts-types),  
— nombre de «cellules en réparation», s'il a été déterminé,  
— nombre de cellules en phase S, s'il a été déterminé,  
— viabilité des cellules.  
Discussion des résultats.  
Conclusions.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay,  Mutation Res.,  156, pp. 1 — 18.
 
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay,  Mutation Res.,  189, pp. 123 — 133.
 
(3) Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby. J., Lefevre, P. A., Burlinson 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell I. de G. (1993), In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M, 
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Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mulage ­
nicity Testing Report. Part II revised,  Cambridge University 
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Sydney, pp. 52 — 77.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 563
 
(4) Madle. S., Dean. S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo,  Mutations Res.,  312, 
pp. 263 — 285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initital 
Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepato ­
cytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS),  
Mutation Res. 291.  pp. 21 — 27.  
(6) Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
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Hepafocyte HNA Repair Assay,  Environ Mutagen,  4, 
pp. 553 — 562.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 564
 
B.40.  CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI DE RESISTANCE 
ÉLECTRIQUE TRANSCUTANÉE (RET)  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 430 (2004) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de 
la peau après l'application d'un matériel d'essai [selon la définition du 
système général harmonisé de classification et d'étiquetage des 
produits chimiques (SGH)] (1). La présente méthode propose une évaluation de la corrosivité qui n'est pas réalisée sur des animaux vivants.
 
Traditionnellement, l'évaluation de la corrosivité cutanée impliquait 
le recours à des animaux de laboratoire (2). Dans le souci d'éviter les douleurs et les souffrances ainsi infligées aux animaux, la méthode 
d'essai B.4 a été révisée afin de permettre la détermination de la 
corrosion cutanée par la mise en œuvre de méthodes de substitution in vitro.
 
La conduite d'études de pré-validation a néanmoins été une première 
étape dans la définition d'essais de substitution susceptibles d'être 
utilisés pour des essais de corrosivité cutanée menés à des fins réglementaires (3). Par la suite, une étude formelle de validation 
des méthodes in vitro d'évaluation de la corrosion cutanée (4) (5) 
a été conduite (6) (7) (8). Sur la base des résultats de ces études et d'autres publications, il est maintenant recommandé d'évaluer la corrosivité cutanée in vivo à l'aide des essais suivants (9) (10) 
(11): l'essai utilisant un modèle de peau humaine (voir méthode 
d'essai B.40  bis) et l'essai de résistance électrique transcutanée (la 
présente méthode).
 
Selon une étude de validation et d'autres études publiées, l'essai de 
résistance électrique transcutanée (RET) sur peau de rat (12) (13) 
permet de faire la distinction de manière fiable entre substances corrosives et non corrosives pour la peau (5) (9).
 
L'essai décrit dans cette méthode permet d'identifier les substances et 
mélanges chimiques corrosifs. Appuyé par d'autres éléments de détermination fondés sur d'autres informations existantes (pH, rela ­
tions structure-activité, données humaines et/ou animales, par exem ­
ple), il permet également d'identifier les substances et mélanges non 
corrosifs (1) (2) (11) (14). En revanche, il ne fournit pas d'informa ­
tion sur l'irritation cutanée, et contrairement au système général harmonisé de classification (SGH) (1), il ne permet pas non plus 
la sous-catégorisation des substances corrosives.
 
Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux après une 
exposition unique, il est recommandé de suivre la démarche expéri ­
mentale séquentielle présentée en supplément à la méthode d'essai 
B.4(2) et proposée dans le système général harmonisé (1). Cette démarche expérimentale prévoit la conduite d'essais in vitro de corro ­
sion cutanée (tel que celui décrit dans la présente méthode) et d'ir ­
ritation cutanées avant d'envisager des essais sur des animaux 
vivants.
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1.2. DÉFINITIONS  
Corrosion cutanée in vivo:  survenue de lésions irréversibles de la 
peau. En l'occurrence, il s'agit de nécrose visible, à travers l'épiderme et jusque dans le derme, suite à l'application d'une substance d'essai 
pendant une durée allant jusqu'à quatre heures. Les réactions corro ­
sives se traduisent généralement par des ulcères, des saignements, des croûtes sanguinolentes et, à la fin de la période d'observation, soit à 14 jours, par une décoloration due au blanchissement de la 
peau, des zones complètes d'alopécie, et des cicatrices. Un examen 
histopathologique peut être envisagé pour évaluer les lésions douteuses.
 
Résistance électrique transcutanée (RET):  mesure de l'impédance 
électrique de la peau, exprimée par une valeur de résistance en kilo- 
Ohms. Il s'agit d'une méthode simple et fiable permettant d'évaluer la 
fonction de barrière de la peau, par l'enregistrement du passage des ions à travers la peau à l'aide d'un pont de mesure de Wheatstone.
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Tableau 1  
Substances chimiques de référence  
Nom N  o EINECS N  o CAS 
Diamino-1,2 propane 201-155-9 78-90-0 Gravement corrosif 
Acide acrylique 201-177-9 79-10-7 Gravement corrosif O-tert. Butylphénol 201-807-2 88-18-6 Corrosif 
Hydroxyde de potassium (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosif 
Acide sulfurique (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosif Acide octanoïque (acide capry ­
lique) 204-677-5 124-07-02 Corrosif 
4-amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 Non corrosif 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Non corrosif Bromure de phénétyle 203-130-8 103-63-9 Non corrosif Perchloroéthylène 204-825-9 27-18-4 Non corrosif Acide isostéarique 250-178-0 30399-84-9 Non corrosif 
4-(méthylthio)-benzaldéhyde 222-365-7 3446-89-7 Non corrosif
 
La plupart des substances chimiques données ici proviennent de la 
liste des substances chimiques sélectionnées par le CEVMA dans son 
étude de validation internationale (4). Les choix du CEVMA sont fondés sur les critères suivants:
 
i) nombre égal de substances corrosives et non corrosives;  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 566
 
ii) substances disponibles dans le commerce et couvrant la plupart 
des classes chimiques pertinentes;  
iii) insertion de substances extrêmement corrosives et moins corro ­
sives, de façon à permettre une distinction basée sur le pouvoir de corrosion;
 
iv) substances chimiques manipulables en laboratoire sans présenter 
d'autres risques majeurs que la corrosivité.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Le matériel d'essai est appliqué pour une durée n'excédant pas 24 
heures sur la surface épidermique de disques de peau, placés dans un 
système d'essai à deux compartiments pour lequel les disques de peau font office de séparation entre les compartiments. Ces disques cutanés sont prélevés sur la peau de jeunes rats âgés de 28 à 30 jours 
et humainement euthanasiés. Les matières corrosives sont identifiées 
sur la base de leur capacité à provoquer la perte de l'intégrité du stratum corneum normal et de la fonction de barrière, cette perte étant mesurée comme une diminution de la RET en deçà d'une 
valeur seuil (12). Dans le cas des rats, une valeur de seuil de la 
RET de 5 k Ω. a été retenue, sur la base de nombreuses données 
relatives à un large éventail de substances chimiques, desquelles il ressortait que l'immense majorité des valeurs étaient soit très supé ­
rieures (souvent > 10 k Ω), soit très inférieures (souvent < 3 k Ω,) à 
cette valeur de seuil (12). De manière générale, les matériels non corrosifs sur les animaux, mais irritants ou non irritants, ne font pas baisser la RET en dessous de ce seuil. Par ailleurs, l'utilisation 
d'autres préparations de peau ou d'autres équipements est susceptible 
de modifier la valeur de seuil, ce qui impose de procéder à une validation supplémentaire.
 
Une étape de fixation d'un colorant est incorporée dans la procédure 
d'essai pour confirmer les résultats positifs de la RET présentant des 
valeurs autour de 5 k Ω. Cette étape de fixation d'un colorant déter ­
mine en effet si l'accroissement de la perméabilité ionique est impu ­
table à la destruction physique du stratum corneum. Dans la pratique, 
la méthode de l'essai RET sur peau de rat prédit très bien la corro ­
sivité in vivo chez le lapin évaluée par la méthode d'essai B.4 (2). A cet égard, il convient de noter que l'essai in vivo sur des lapins est extrêmement prudent concernant la corrosivité et l'irritation cutanées 
par rapport à l'essai sur modèle de peau humaine (15).
 
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.5.1.  Animaux  
Les rats sont l'espèce la mieux adaptée pour cet essai dans la mesure 
où la sensibilité de leur peau aux substances chimiques employées a déjà été démontrée (10). L'âge (au moment du prélèvement de la peau) et la souche utilisée sont des critères déterminants, puisqu'il est 
essentiel que les follicules pileux soient en phase dormante avant le 
début de la pousse de la fourrure adulte.
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Les poils du dos et des flancs des jeunes rats (Wistar ou souche 
comparable) mâles ou femelles, âgés approximativement de 22 
jours, sont soigneusement coupés à l'aide d'une petite tondeuse. Les animaux sont ensuite nettoyés soigneusement avec un linge humide, la zone tondue étant plongée dans une solution antibio ­
tique (contenant, par exemple, de la streptomycine, de la pénicil ­
line, du chloramphénicol et de l'amphotéricine à des concentrations efficaces pour inhiber la croissance bactérienne). Les animaux sont lavés une nouvelle fois avec des antibiotiques le troisième ou le 
quatrième jours après le premier lavage, et doivent ensuite être 
utilisés dans un délai de 3 jours, lorsque le stratum corneum a récupéré de la tonte.
 
1.5.2.  Préparation des disques cutanés  
Les animaux, âgés de 28 à 30 jours (cet âge est particulièrement 
important) sont euthanasiés de façon humaine. On prélève la peau dorso-latérale de chaque animal et on la débarrasse soigneusement du tissu adipeux en excès. Des disques cutanés, d'un diamètre 
approximatif de 20 mm chacun sont prélevés. La peau peut être 
stockée avant d'utiliser les disques lorsqu'il est établi que les données de contrôle positives et négatives sont équivalentes à celles obtenues avec de la peau fraîche.
 
Chaque disque cutané est placé sur l'extrémité d'un tube PTFE (poly ­
tétrafluoroéthylène) en veillant à ce que la surface épidermique soit 
en contact avec le tube. Après avoir ajusté de force un joint torique 
en caoutchouc sur l'extrémité du tube pour maintenir la peau en place, on coupe le tissu excédentaire. Les dimensions du tube et du joint torique sont indiquées à la Figure 2. Le joint torique en 
caoutchouc est ensuite soigneusement fixé à l'extrémité du tube 
PTFE de manière étanche à l'aide de vaseline. Le tube est introduit dans une chambre réceptrice contenant une solution de sulfate de magnésium (154 mM) dans lequel il est maintenu par une pince à 
ressort (Figure 1). Le disque cutané doit être complètement immergé 
dans la solution de sulfate de magnésium (MgSO4). Entre 10 et 15 disques cutanés peuvent être prélevés de la peau d'un rat.
 
Avant le début de l'essai, on mesure, pour chaque peau de rat, la 
résistance électrique de deux disques cutanés, à titre de contrôle de la qualité. Pour que les autres disques d'une même peau soit valables 
pour l'essai, il faut que les deux disques donnent des valeurs de 
résistance supérieures à 10 k Ω. Si la résistance est inférieure à 10 
kΩ, les disques restants provenant de la même peau doivent être 
éliminés.
 
1.5.3.  Application des substances d'essai et de contrôle  
Pour chaque étude, des substances de contrôle positif et négatif 
doivent être utilisées parallèlement à la substance d'essai, de façon à garantir la qualité des résultats du modèle expérimental. Dans ce 
contexte, les disques cutanés employés doivent provenir d'un même 
animal. Les substances de contrôle positif et négatif recommandées sont respectivement l'acide hydrochlorique 10 M et l'eau distillée.
 
Les substances d'essai liquides (150 μl) sont appliquées sur la surface 
épidermique à l'intérieur du tube. Pour l'essai de substances solides, une quantité suffisante du solide est appliquée uniformément sur le 
disque de peau, de façon à ce que la totalité de la surface de l'épi ­
derme soit couverte. Après avoir ajouté de l'eau désionisée (150 μl) 
sur les solides, on agite le tube doucement. Afin d'optimiser le contact avec la peau, certains solides doivent être chauffés à 30
 o C 
pour dissoudre la substance d'essai ou être broyés pour obtenir des 
grains ou une poudre.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 568
 
On utilise trois disques cutanés pour chaque substance d'essai. Ces 
substances sont appliquées pendant 24 heures à une température de 
20 à 23  o C, puis éliminées complètement par lavage sous l'eau du 
robinet à 30  o C maximum.  
1.5.4.  Mesures de la RET  
L'impédance de la peau, c'est-à-dire la RET, est mesurée à l'aide d'un 
pont de mesure de Wheatstone en courant alternatif basse tension (13), présentant les caractéristiques suivantes: tension de 1 à 3 Volts, courant alternatif de forme sinusoïdale ou rectangulaire compris entre 
50 et 1000 Hz, et une plage de mesure au moins comprise entre 0,1 
et 30 kΩ Le pont de mesure utilisé dans l'étude de validation permet ­
tait de mesurer l'inductance, la capacitance et la résistance jusqu'à des valeurs de 2 000 H, 2 000 μF et 2 M respectivement, à des 
fréquences de 100 Hz ou 1 kHz, en utilisant des valeurs en parallèle 
ou en série. Pour les besoins de l'essai RET de corrosivité, les mesures sont enregistrées en résistance, à une fréquence de 100 Hz et à l'aide de valeurs en série. Avant la mesure de la résis ­
tance électrique, on réduit la tension de surface de la peau en ajou ­
tant un volume suffisant d'éthanol à 70 % pour couvrir l'épiderme. Après quelques secondes, on enlève l'éthanol du tube, puis on hydrate le tissu par l'addition de 3 ml d'une solution de sulfate de 
magnésium (154 mM). Les électrodes du pont de mesure sont 
placées de part et d'autre du disque cutané pour prendre la mesure de la résistance en k Ω/disque cutané (Figure 1). Les dimensions des 
électrodes et la longueur d'électrode en dessous des pinces crocodiles 
sont indiquées dans la Figure 2. La pince maintenant l'électrode 
intérieure repose sur la partie supérieure du tube PTFE pendant la mesure de la résistance, afin que la longueur d'électrode immergée dans la solution de sulfate de magnésium reste constante. L'électrode 
extérieure est introduite dans le compartiment receveur de telle 
manière qu'elle repose sur le fond de celui-ci. La distance entre la pince à ressort et la partie inférieure du tube PTFE est maintenue constante (Figure 2), cette distance influençant la valeur de résistance 
obtenue. Par conséquent, la distance entre l'électrode intérieure et le 
disque cutané doit être constante et minimale (1 à 2 mm).
 
Il convient de noter que si la valeur de résistance mesurée est supé ­
rieure à 20 k Ω, ceci peut être dû au fait que des restes de la subs ­
tance d'essai couvrent la surface épidermique du disque de peau. On peut essayer de retirer davantage de substance d'essai, par exemple 
en fermant de façon étanche le tube PTFE avec le pouce revêtu d'un 
gant et en l'agitant pendant 10 secondes environ. On élimine ensuite la solution de sulfate de magnésium et on répète la mesure de la résistance avec une nouvelle solution de sulfate de magnésium.
 
Les caractéristiques et dimensions de l'appareil d'essai et de la procé ­
dure expérimentale peuvent avoir une incidence sur les valeurs de RET obtenues. Le seuil de corrosivité de 5 k Ω. a été défini sur la 
base des données obtenues à partir de l'appareil et de la procédure 
spécifiques décrits dans cette méthode. Avec un autre équipement ou dans des conditions d'essai différentes, les valeurs de seuil et de contrôle peuvent être différentes. Par conséquent, il est nécessaire 
d'étalonner la méthodologie et la valeur de seuil de résistance en 
testant différentes substances de référence étalons, choisies parmi celles utilisées dans l'étude de validation (4) (5), ou dans des classes chimiques équivalentes à celles des substances étudiées. Le 
Tableau 1 présente un ensemble de substances de référence qui 
conviennent.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 569
 
1.5.5.  Méthodes avec fixation d'un colorant  
L'exposition à certains matériels non corrosifs peut entraîner une 
réduction de la résistance sous la valeur de seuil de 5 k Ω, permet­
tant ainsi le passage d'ions à travers le stratum corneum, ce qui 
réduit ainsi la résistance électrique (5). Par exemple, les substances 
organiques neutres et les substances tensio-actives (détergents, émulsifiants et autres agents de surface) peuvent évacuer les lipides de la peau et accroître la perméabilité aux ions de la 
barrière cutanée. Par conséquent, si les valeurs de RET des subs ­
tances d'essai sont inférieures à, ou proches de, 5 k Ω, en l'absence 
de toute lésion visible, une étude de pénétration d'un colorant doit 
être menée sur les tissus traités et de contrôle, afin de déterminer 
si ces valeurs de RET résultent d'une perméabilité accrue ou d'une corrosion de la peau (3) (5). S'il s'agit d'une corrosion, autrement dit si le stratum corneum est rompu, le colorant sulforhodamine B 
appliqué à la surface de la peau pénètre rapidement et teinte les 
tissus sous-jacents. Ce colorant reste stable au contact d'un large éventail de substances chimiques et n'est pas affecté par la procé ­
dure d'extraction décrite ci-après.
 
1.5.5.1.  Application et élimination du colorant Sulforhodamine B  
Après l'essai de RET, le sulfate de magnésium est évacué du tube et 
la peau est soigneusement examinée. Si aucune lésion majeure n'est visible, 150 μl d'une dilution à 10 pour cent (p/v) de sulforhodamine 
B (Acid Red 52; CI. 45100; numéro EINECS 222-529-8; numéro 
CAS 3520-42-1) dans de l'eau distillée sont appliqués sur la surface épidermique de chaque disque cutané pendant 2 heures. Les disques cutanés sont lavés ensuite sous un jet d'eau courante à la température 
ambiante pendant environ 10 secondes pour éliminer le colorant 
excédentaire ou non fixé. Chaque disque cutané est soigneusement enlevé du tube PTFE et placé dans un flacon (par exemple un flacon à scintillation en verre de 20 ml) contenant de l'eau désionisée 
(8 ml). Les flacons sont agités doucement pendant 5 minutes pour 
éliminer complètement tout colorant excédentaire ou non fixé. Après avoir répété l'opération de rinçage, on enlève les disques cutané et on les place dans des flacons contenant 5 ml de dodécylsulfate de 
sodium (SDS) à 30 pour cent (p/v) dans de l'eau distillée, puis on 
les incube pendant une nuit à 60
 o C. 
Après incubation, chaque disque de peau est enlevé et jeté et la 
solution restante est centrifugée pendant 8 minutes à 21  o C (force 
centrifuge relative ~175 x g). Un échantillon de 1 ml de surnageant est ensuite dilué dans un rapport de 1 à 5 (v/v) [soit 1 ml + 4 ml] 
avec du SDS à 30 pour cent (p/v) dans de l'eau distillée. La densité 
optique (DO) de la solution est mesurée à environ 565 nm.
 
1.5.5.2.  Calcul de la teneur en colorant  
La teneur de chaque disque en colorant sulforhodamine B est 
calculée sur la base des valeurs de DO (5) (coefficient d'extinction molaire de la sulforhodamine B à 565 nm = 8,7 × 104; poids moléculaire = 580). La teneur en sulforhodamine B est déterminée 
pour chaque disque de peau à l'aide d'une courbe étalon appropriée 
et on calcule ensuite une teneur moyenne en colorant pour les essais répétés.
 
2. RÉSULTATS  
Les valeurs de résistance (k Ω) et de teneur moyenne en colorant 
(μg/disque), le cas échéant, pour le matériel d'essai et pour les 
contrôles positifs et négatifs doivent être présentées sous forme de tableau (données individuelles et moyennes ± écart-type), y compris 
les données des essais répétés/répliqués, les valeurs moyennes et 
individuelles.
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2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Les valeurs moyennes de la RET sont acceptées à condition que les 
valeurs des contrôles positifs et négatifs effectués parallèlement se situent dans les fourchettes acceptables pour la méthode en labora ­
toire d'essai. Les fourchettes acceptables de valeur de résistance pour 
la méthodologie et l'appareillage décrits ci-avant sont les suivantes:
 
Contrôle Substance Plage de résis ­
tance (kΩ) 
Positif Acide hydrochlorique 10 M 0,5 – 1,0 
Négatif Eau distillée 10 – 25  
Les valeurs moyennes de la fixation du colorant sont acceptées à 
condition que les valeurs des contrôles effectués parallèlement se 
situent dans la fourchette acceptable pour la méthode. Les four ­
chettes acceptables de teneur en colorant pour les substances de contrôle proposées pour la méthodologie et l'appareillage décrits 
ci-avant sont les suivantes:
 
Contrôle Substance Plage de teneur 
en colorant ( μg/ 
disque)  
Positif Acide hydrochlorique 10 M 40 – 100 
Négatif Eau distillée 15 – 35  
On considère que la substance d'essai est non corrosive pour la peau:  
i) si la valeur moyenne de la RET pour la substance d'essai est 
supérieure à 5 k Ω, ou 
ii) si la valeur moyenne de la RET est inférieure ou égale à 5 k Ω, et 
— que le disque cutané ne présente aucune lésion visible, et  
— que la teneur moyenne en colorant du disque est bien infé ­
rieure à la teneur moyenne en colorant du disque de contrôle positif (acide hydrochlorique 10 M) obtenue parallèlement.
 
On considère que la substance d'essai est corrosive pour la peau:  
i) si la valeur moyenne de la RET est inférieure ou égale à 5 k Ω et 
si le disque cutané est visiblement lésé, ou  
ii) si la valeur moyenne de la RET est inférieure ou égale à 5 k Ω, et 
— que le disque cutané ne présente aucune lésion visible, et  
— que la teneur moyenne en colorant du disque est bien infé ­
rieure à la teneur moyenne en colorant du disque de contrôle 
positif (acide hydrochlorique 10 M) obtenue parallèlement.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 571
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes:  
Substances d'essai et de contrôle:  
— nom(s) chimique(s), tels que le nom IUPAC ou CAS, et le cas 
échéant le numéro CAS;  
— pureté et composition de la substance ou de la préparation [en 
pourcentage(s) en poids] et état physique;  
— propriétés physico-chimiques (telles que l'état physique, le pH, la 
stabilité, l'hydrosolubilité) utiles pour la conduite de l'étude;  
— le cas échéant, traitement des substances d'essai et de contrôle 
avant l'essai (par exemple, chauffage, réduction en poudre);  
— stabilité (si connue)  
Animaux d'essai:  
— souche et sexe  
— âge au moment du prélèvement de peau  
— source, conditions d'hébergement, alimentation, etc.  
— détails de la préparation de la peau  
Conditions d'essai:  
— courbes d'étalonnage de l'appareil d'essai;  
— courbes d'étalonnage des performances de l'essai de fixation d'un 
colorant;  
— détails de la procédure d'essai utilisée pour les mesures de la 
RET;  
— détails de la procédure d'essai utilisée pour l'évaluation de la 
fixation d'un colorant, le cas échéant;  
— description de toute modification de la procédure d'essai descrip ­
tion des critères d'évaluation utilisés.  
Résultats:  
— présentation sous forme de tableau des valeurs de RET et des 
résultats de l'essai de fixation d'un colorant (le cas échéant), pour 
chaque animal et chaque échantillon de peau  
— description de tous les effets observés  
Discussion des résultats  
Conclusions  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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tances and Mixtures. Série de l'OCDE sur les essais et évalua ­
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sivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., 
Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM inter ­
national validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic, in 
Vitro 12, 471-482.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic, in Vitro 12, 483- 524.
 
(6) OCDE (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
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(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
(8) CEVMA (Comité de coordination interagences sur la valida ­
tion des méthodes alternatives). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
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(9) CEVMA (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
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(10) CEVMA (Comité de coordination interagences sur la valida ­
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 TM , EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin 
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test methods for assessing dermal corrosivity potential of 
chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/episbrd.pdf.
 
(11) OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
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Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an inter ­
laboratory trial. Toxic, in Vitro 6, 191-194.  
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
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(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
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 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 574
 
Figure 1  
Appareil pour l'essai de RET sur peau de rat
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 575
 
Figure 2  
Dimensions du tube PFTE (polytétrafluoroéthylène), des tubes receveurs et des 
électrodes utilisés
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 576
 
Facteurs importants pour l'appareil ci-dessus:  
— diamètre intérieur du tube PTFE,  
— longueur des électrodes par rapport au tube PTFE et au tube 
receveur: le disque cutané ne doit pas être en contact avec les 
électrodes, et une longueur standard d'électrode doit être en contact avec la solution de sulfate de magnésium,
 
— quantité de solution de sulfate de magnésium dans le tube rece ­
veur: la profondeur de liquide, par rapport au niveau dans le tube 
PFTE, doit être telle qu'indiquée dans la figure 1,  
— fixation du disque cutané sur le tube PFTE: la résistance élec ­
trique doit être véritablement une mesure des propriétés de la peau.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 577
 
B.40 bis.  CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE 
DE PEAU HUMAINE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 431 (2004) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de 
la peau après application d'un matériel d'essai [selon la définition du système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH)] (1). La présente méthode d'essai ne 
nécessite pas l'utilisation d'animaux vivants ou de tissus animaux 
pour l'évaluation la corrosivité cutanée.
 
Traditionnellement, l'évaluation de la corrosivité cutanée impliquait 
le recours à des animaux de laboratoire (2). Dans le souci d'éviter les douleurs et les souffrances ainsi infligées aux animaux, la méthode 
d'essai B.4 a été révisée afin de permettre la détermination de la 
corrosion cutanée par la mise en œuvre de méthodes de substitution in vitro.
 
La conduite d'études de pré-validation a néanmoins été une 
première étape dans la définition d'essais de substitution suscepti ­
bles d'être utilisés pour des essais de corrosivité cutanée menés à 
des fins réglementaires (3). Par la suite, une étude formelle de validation des méthodes in vitro d'évaluation de la corrosion 
cutanée (4)(5) a été conduite (6) (7) (8). Sur la base des résultats 
de ces études et d'autres publications (9), il est maintenant recom ­
mandé d'évaluer la corrosivité cutanée in vivo à l'aide des essais suivants (10) (11) (12) (13): l'essai sur modèle de peau humaine 
(la présente méthode) et l'essai de résistance électrique transcutanée 
(voir méthode d'essai B.40).
 
Selon les études de validation, les essais sur modèles de peau 
humaine (3)(4)(5)(9) permettent de faire la distinction de manière fiable entre substances corrosives et non corrosives pour la peau. 
Le protocole d'essai peut aussi fournir des indications permettant 
de distinguer les substances extrêmement corrosives pour la peau de celles qui le sont moins.
 
L'essai décrit dans cette méthode permet d'identifier les substances et 
mélanges chimiques corrosifs. Appuyé par d'autres éléments de 
détermination fondés sur d'autres informations existantes (pH, rela ­
tions structure-activité, données humaines et/ou animales, par exem ­
ple), il permet également d'identifier les substances et mélanges non corrosifs (1) (2) (13) (14). En revanche, il ne fournit pas d'informa ­
tion sur l'irritation cutanée, et contrairement au système général 
harmonisé de classification (SGH) (1), il ne permet pas non plus la sous-catégorisation des substances corrosives.
 
Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux après une 
exposition unique, il est recommandé de suivre la démarche expéri ­
mentale séquentielle présentée en supplément à la méthode d'essai 
B.4 (2) et proposée dans le système général harmonisé (SGH) (1). Cette démarche expérimentale prévoit la conduite d'essais in vitro de corrosion cutanée (tel que celui décrit dans la présente méthode) et 
d'irritation cutanées avant d'envisager des essais sur des animaux 
vivants.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 578
 
1.2. DÉFINITIONS  
Corrosion cutanée in vivo:  survenue de lésions irréversibles de la 
peau. En l'occurrence, il s'agit de nécrose visible, à travers l'épiderme et jusque dans le derme, suite à l'application d'une substance d'essai 
pendant une durée allant jusqu'à quatre heures. Les réactions corro ­
sives se traduisent généralement par des ulcères, des saignements, des croûtes sanguinolentes et, à la fin de la période d'observation, soit à 14 jours, par une décoloration due au blanchissement de la 
peau, des zones complètes d'alopécie, et des cicatrices. Un examen 
histopathologique peut être envisagé pour évaluer les lésions douteuses.
 
Viabilité cellulaire:  le paramètre mesurant l'activité totale d'une 
population cellulaire (par exemple, capacité des déshydrogénases mitochondriales cellulaires à réduire le colorant vital MTT), qui, 
selon l'effet mesuré et le protocole utilisé pour l'essai, est en corré ­
lation avec le nombre total et/ou la vitalité des cellules.
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Tableau 1  
Substances chimiques de référence  
Nom N  o EINECS N  o CAS 
Diamino-1,2 propane 201-155-9 78-90-0 Gravement corrosif 
Acide acrylique 201-177-9 79-10-7 Gravement corrosif O-tert. butylphénol 201-807-2 88-18-6 Corrosif Hydroxyde de potassium (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosif Acide sulfurique (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosif 
Acide octanoïque (acide capry ­
lique) 204-677-5 124-07-02 Corrosif 
4-amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 Non corrosif 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Non corrosif 
Bromure de phénétyle 203-130-8 103-63-9 Non corrosif Perchloroéthylène 204-825-9 27-18-4 Non corrosif Acide isostéarique 250-178-0 30399-84-9 Non corrosif 4-(méthylthio)-benzaldéhyde 222-365-7 3446-89-7 Non corrosif
 
La plupart des substances chimiques données ici proviennent de la 
liste des substances chimiques sélectionnées par le CEVMA dans son étude de validation internationale (4). Les choix du CEVMA sont fondés sur les critères suivants:
 
(i) nombre égal de substances corrosives et non corrosives;  
(ii) substances disponibles dans le commerce et couvrant la plupart 
des classes chimiques pertinentes;  
(iii) insertion de substances extrêmement corrosives et moins corro ­
sives, de façon à permettre une distinction sur la base du 
pouvoir de corrosion;  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 579
 
(iv) substances chimiques manipulables en laboratoire sans présenter 
d'autres risques majeurs que la corrosivité.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance d'essai est généralement appliquée sur un modèle tridi ­
mensionnel de peau humaine, comprenant au moins un épiderme reconstitué avec un stratum corneum fonctionnel. Les matières corro ­
sives sont identifiées sur la base de leur aptitude à réduire la viabilité 
cellulaire [déterminée, par exemple, à l'aide de l'essai de réduction du MTT (15)] en dessous de valeurs seuils définies pour des périodes d'exposition déterminées. Le principe de l'essai sur modèle de peau 
humaine s'appuie sur l'hypothèse selon laquelle les substances 
chimiques corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum par diffusion ou érosion, et sont suffisamment cytotoxiques pour les couches cellulaires sous-jacentes.
 
1.4.1.  Procédure  
1.4.1.1.  Modèles de peau humaine  
Les modèles de peau humaine peuvent être constitués pour l'étude, 
obtenus dans le commerce (par exemple, les modèles EpiDerm™ et EPISKIN™) (16) (17) (18) (19), ou encore mis au point et constitués 
dans le laboratoire d'essai (20) (21). Il est entendu que l'utilisation de 
la peau humaine est soumise à des conditions et considérations d'éthique admises d'ordre national et international. Tout nouveau modèle doit être validé (au moins dans la mesure indiquée au 
point 1.4.1.1.2). Les modèles de peau humaine utilisés pour cet 
essai doivent répondre aux conditions et critères suivants:
 
1.4.1.1.1 C o n d i t i o n s g é n é r a l e s a p p l i c a b l e s a u m o d è l e :  
L'épithélium doit être constitué à partir de kératinocytes humains. Le 
modèle doit avoir un stratum corneum fonctionnel avec plusieurs couches sous-jacente de cellules épithéliales vivantes, et comporter le cas échéant une couche stromale. Le stratum corneum doit 
comporter plusieurs couches, avec un profil lipidique suffisant pour 
assurer une fonction de barrière offrant une résistance à la pénétra ­
tion rapide des marqueurs cytotoxiques. Par ailleurs, il est essentiel que le modèle présente des propriétés d'isolement afin que la subs ­
tance d'essai ne puisse pas contourner le stratum corneum pour 
pénétrer dans les tissus vivants. En effet, une telle possibilité de contournement diminue la qualité de la modélisation de l'exposition de la peau. Enfin, le modèle de peau ne doit présenter aucune forme 
de contamination bactérienne (y compris par le mycoplasme) ou 
mycosique.
 
1.4.1.1.2 C o n d i t i o n s a p p l i c a b l e s a u m o d è l e f o n c t i o n n e l :  
L'amplitude de la viabilité cellulaire est généralement mesurée par le 
niveau MTT, ou autres colorants vitaux métaboliquement transfor ­
més. Dans ces cas, la densité optique (DO) du colorant (solubilisé) extrait du tissu de contrôle négatif doit être au moins 20 fois supé ­
rieure à la DO du solvant d'extraction seul [pour une présentation, 
voir la référence (22)]. Le tissu de contrôle négatif doit être stable en culture (c'est-à-dire qu'il doit présenter des mesures de viabilité comparables) pendant la durée de la période d'exposition. Le 
stratum corneum doit être suffisamment solide pour résister à la 
pénétration rapide de certains produits chimiques marqueurs cyto ­
toxiques (par exemple, Triton X-100 à 1 %). Cette propriété peut être évaluée en fonction du temps d'exposition nécessaire pour 
réduire de moitié la viabilité cellulaire (TE
 50 ) (par exemple, pour 
les modèles EpiDerm™ et EPISKIN™, cette période est > 2 heures). Par ailleurs, le tissu doit pouvoir être reproduit dans le temps et, de préférence, par différents laboratoires. Enfin, utilisé dans le protocole 
d'essai choisi, il doit permettre de prévoir le potentiel corrosif des 
substance chimiques de référence (voir le Tableau 1).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 580
 
1.4.1.2.  Application des substances d'essai et de contrôle  
Deux tissus (répliques) sont utilisées pour chaque traitement (c'est-à- 
dire chaque durée d'exposition), y compris les contrôles. Pour les substances liquides, il faut appliquer une quantité suffisante de subs ­
tance d'essai pour couvrir uniformément la surface cutanée (25 
μl/cm
 2 au minimum). Pour les substances solides, il faut appliquer 
une quantité suffisante de substance d'essai pour couvrir régulière ­
ment la peau et ensuite l'humidifier avec de l'eau désionisée ou 
distillée pour assurer un bon contact avec la peau; si nécessaire, 
les substances solides doivent être réduites en poudre avant leur application. La méthode d'application doit convenir à la substance 
chimique mise à l'essai (5). À la fin de la période d'exposition, la 
surface cutanée doit être nettoyée avec soin afin d'éliminer la subs ­
tance d'essai à l'aide d'une une solution tampon appropriée ou de NaCl à 0,9 pour cent.
 
Pour chaque étude, des contrôles positifs et négatifs doivent être 
utilisés parallèlement à la substance d'essai, de façon à garantir la 
qualité des résultats du modèle expérimental. Pour cet essai, les 
substances suggérées pour les contrôles positifs sont l'acide acétique glacial ou l'hydroxyde de potassium 8 N, et pour les contrôles néga ­
tifs, l'eau ou une solution NaCl à 0,9 pour cent.
 
1.4.1.3.  Mesures de la viabilité cellulaire  
Seules les méthodes quantitatives, validées peuvent être utilisées 
pour mesurer la viabilité cellulaire. En outre, la mesure de la viabilité 
doit être compatible avec une application sur un tissu tridimension ­
nel. La fixation de colorant non spécifique ne doit pas interférer avec la mesure de la viabilité. Par conséquent, les colorants dont la fixa ­
tion utilise une protéine et ceux qui ne passent pas par une conver ­
sion métabolique (par exemple, le rouge neutre) sont à proscrire. 
L'essai le plus fréquemment employé est l'essai de réduction du MTT [Bromure de 3-(4,5-diméthylthiazole-2-yl)-2,5-diphényltétrazo ­
lium, bleu de thiazole; numéro EINECS: 206-069-5, numéro CAS 
298-93-1)], qui donne des résultats précis et reproductibles (5), mais 
d'autres peuvent aussi être utilisés. L'échantillon de peau est placé dans une solution MTT à la concentration appropriée (par exemple, 
0,3 - 1 mg/ml) à la température d'incubation voulue et pour une 
durée de 3 heures. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l'aide d'un solvant (isopropanol), puis on mesure la concen ­
tration du formazan en déterminant sa DO à une longueur d'onde 
comprise entre 540 et 595 nm.
 
L'action chimique de la substance d'essai sur le colorant vital est 
susceptible d'imiter celle du métabolisme cellulaire et, partant, de 
conduire à estimation erronée de la viabilité. Il a été montré que cela survient lorsque la substance d'essai n'est pas complètement éliminée par rinçage (9). Si la substance d'essai agit directement 
sur colorant vital, des contrôles supplémentaires doivent être prati ­
qués pour détecter et corriger les interférences de la substance avec la mesure de viabilité (9) (23).
 
2. RÉSULTATS  
Pour chaque tissu, les valeurs de DO et les pourcentages calculés de 
viabilité cellulaire obtenus pour chaque substance d'essai, ainsi que pour les contrôles positifs et négatifs, sont présentés sous forme de 
tableau, y compris les données des essais répétés, le cas échéant les 
valeurs moyennes et individuelles.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 581
 
2.1. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
La valeur de la DO du contrôle négatif représente une viabilité 
cellulaire arbitrairement fixée à 100 pour cent. Par conséquent, les valeurs de la DO obtenues pour chaque échantillon d'essai peuvent 
être utilisées pour calculer un pourcentage de viabilité par rapport au 
contrôle négatif. La valeur seuil du pourcentage de viabilité cellulaire qui établit la distinction entre les matières corrosives et les matières non corrosives (ou entre différentes classes de substances corrosives), 
ou encore la ou les procédures statistiques utilisées pour évaluer les 
résultats et identifier les substances corrosives, doivent être claire ­
ment définies et documentées. De même, il doit être démontré 
qu'elles sont appropriées. De manière générale, ces valeurs de seuil 
sont établies au cours de la phase d'optimisation de l'essai, testées dans une phase de pré-validation, puis confirmées ensuite dans une étude de validation. A titre d'exemple, l'évaluation de la corrosivité 
associée au modèle EpiDerm™ est la suivante (9):
 
La substance d'essai est considérée comme étant corrosive pour la 
peau:  
(i) si la viabilité après 3 minutes d'exposition est inférieure à 50 
pour cent, ou  
(ii) si la viabilité après 3 minutes d'exposition est supérieure ou 
égale à 50 pour cent, et la viabilité après une heure d'exposition inférieure à 15 pour cent.
 
La substance d'essai est considérée comme étant non corrosive pour 
la peau:  
(i) si la viabilité après 3 minutes d'exposition est supérieure ou égale 
à 50 pour cent, et la viabilité après une heure d'exposition supé ­
rieure ou égale à 15 pour cent.  
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes:  
Substances d'essai et de contrôle:  
— nom(s) chimique(s), tels que le nom IUPAC ou CAS, et le cas 
échéant le numéro CAS;  
— pureté et composition de la substance ou la préparation (en pour ­
centage(s) en poids);  
— propriétés physico-chimiques (telles que l'état physique, le pH, la 
stabilité, l'hydrosolubilité) utiles pour la conduite de l'étude:  
— le cas échéant, traitement des substances d'essai et de contrôle 
avant l'essai (par exemple, chauffage, réduction en poudre);  
— stabilité (si connue)  
Justification du choix du modèle de peau et du protocole utilisé.  
Conditions d'essai:  
— système cellulaire utilisé  
— information sur l'étalonnage du dispositif utilisé pour la mesure 
de la viabilité cellulaire (un spectrophotomètre, par exemple)  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 582
 
— information complète à l'appui du modèle spécifique de peau 
humaine, et notamment sa validité  
— détails de la procédure d'essai utilisée  
— doses d'essai utilisées  
— description de toute modification éventuelle de la procédure 
d'essai  
— référence aux données historiques du modèle  
— description des critères d'évaluation utilisés  
Résultats:  
— présentation sous forme de tableau des résultats de chaque échan ­
tillon d'essai  
— description des autres effets observés.  
Discussion des résultats  
Conclusions  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. Série de l'OCDE sur les 
essais et évaluations, numéro 33, ENV/JM/MONO(2001)6, 
Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001 doc.nsf/LinkTo/env- jm-mono(2001)6.
 
(2) Méthode d'essai B.4. Toxicité aiguë: irritation/corrosion 
cutanée.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and 
Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corro ­
sivity testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., 
Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test 
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(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on in 
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(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
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(8) CEVMA (Comité de coordination interagences sur la valida ­
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(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp. 371-401.
 
(10) CEVMA (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275-280.  
(11) CEVMA (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.  
(12) CEVMA (Comité de coordination interagences sur la valida ­
tion des méthodes alternatives) (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemi ­
cals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology 
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vam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/episjird.pdf.
 
(13) OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat  
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709-720.  
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 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 585
 
B.41.  ESSAI DE PHOTOTOXICITE IN VITRO 3T3 NRU  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 432 (2004) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La phototoxicité est définie comme un effet toxique dû à l'applica ­
tion d'une substance sur le corps, qui est soit déclenché ou accentué (et visible à des niveaux de dose faibles) après une exposition ulté ­
rieure à la lumière, soit provoqué par l'irradiation de la peau après 
administration d'une substance par voie systémique.
 
Le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU permet de déterminer le 
potentiel phototoxique d'une substance d'essai induit par l'excitation du produit chimique après exposition à la lumière. Cet essai évalue 
la réduction relative de la viabilité des cellules exposées au produit 
chimique, en présence ou en l'absence de lumière. Les substances identifiées par cet essai sont susceptibles d'être phototoxiques in vivo après administration systémique et diffusion dans la peau, ou après 
application topique.
 
Des effets phototoxiques ont été signalés pour de nombreux types de 
produits chimiques (1) (2) (3) (4). Le point commun entre ces derniers est leur capacité à absorber l'énergie lumineuse dans la 
plage de la lumière solaire. D'après la première loi de photochimie 
(loi de Grotthaus-Draper), la photoréaction nécessite l'absorption d'un nombre suffisant de quanta de lumière. Aussi convient-il, avant d'en ­
visager un essai biologique, de déterminer le spectre d'absorption 
UV/lumière visible du produit chimique à tester suivant la ligne 
directrice 101 de l'OCDE. Si le coefficient d'extinction/d'absorption molaire est inférieur à 10 litres × mol
 -1 × cm  -1 , le produit chimique 
n'a pas de potentiel photoréactif et il est inutile de le soumettre à 
l'essai de phototoxicité in vitro 3T3 NRU ou à tout autre test biolo ­
gique visant à détecter des effets photochimiques indésirables (1) (5). Voir également l'annexe 1.
 
Les résultats de l'essai de phototoxicité in vitro 3T3 NRU récemment 
évalué (6) (7) (8) (9) ont été comparés aux effets de phototoxicité 
aiguë in vivo chez les animaux et chez les humains, et l'essai s'est révélé fiable pour la prévision de ces effets. L'essai n'est pas conçu pour prévoir d'autres effets nocifs susceptibles de résulter de l'action 
combinée d'un produit chimique et de la lumière, tels que la photo ­
génotoxicité, la photo-allergie, et la photocancérogénicité, et il ne permet pas non plus d'évaluer le pouvoir phototoxique. Par ailleurs, cet essai n'est pas conçu pour prendre en compte les mécanismes 
indirects de la phototoxicité, les effets des métabolites de la subs ­
tance d'essai, ou les effets des mélanges.
 
Alors que l'utilisation de systèmes d'activation métabolique est 
nécessaire en règle générale pour tous les tests in vitro de prédiction 
du potentiel génotoxique ou cancérogène, dans le cas de la photo ­
toxicologie, on ne dispose jusqu'à présent que de rares exemples de produits chimiques qui nécessitent une transformation métabolique pour agir comme une phototoxine in vivo ou in vitro. Par consé ­
quent, il ne paraît pas utile ni scientifiquement fondé de réaliser le 
présent essai en présence d'un système d'activation métabolique.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 586
 
1.2. DÉFINITIONS  
Irradiance : intensité du rayonnement ultraviolet (UV) ou visible 
incident sur une surface, mesurée en W/m  2 ou en mW/cm  2 . 
Dose de lumière : quantité (= intensité × temps) de rayonnement 
ultraviolet (UV) ou visible incident sur une surface, exprimée en Joules (= W × s) par unité de surface, par exemple, J/m
 2 ou J/cm  2 . 
Bandes de longueurs d'ondes de la lumière UV : les désignations 
recommandées par la CIE (Commission internationale de l'éclairage) 
sont: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) et UVC (100- 
280 nm). D'autres désignations sont également utilisées; la limite entre UVB et UVA est souvent placée à 320 nm, et les UVA peuvent être subdivisés en UV-A1 et UV-A2 avec une limite à 
environ 340 nm.
 
Viabilité cellulaire : paramètre mesurant l'activité totale d'une popu ­
lation cellulaire (par exemple, absorption du colorant vital rouge 
neutre dans les lysosomes cellulaires), qui, en fonction de l'effet mesuré et du type de test utilisé, correspond au nombre total et/ou 
à la vitalité des cellules.
 
Viabilité cellulaire relative : viabilité cellulaire exprimée par rapport 
aux témoins négatifs (solvant) qui ont été prélevés tout ou long de la 
procédure (soit +Irr soit -Irr), mais non traités par un produit chimique.
 
PIF (Photo Irritation Factor — Facteur de photo-irritation) : 
facteur obtenu en comparant deux concentrations cytotoxiques effi ­
caces (CE  50 ) de la substance chimique d'essai, obtenues en absence 
(-Irr) ou en présence (+Irr) d'une irradiation non cytotoxique par un 
rayonnement UVA/visible.  
CE 50 : concentration de la substance chimique d'essai à laquelle la 
viabilité cellulaire est réduite de 50 pour cent.  
MPE (Mean Photo Effect — Photo-effet moyen) : mesure dérivée 
d'une analyse mathématique du tracé de deux courbes concentration- effet obtenues avec (+Irr) ou sans (-Irr) irradiation non cytotoxique par un rayonnement UVA/visible.
 
Phototoxicité : réaction toxique aiguë apparaissant après une 
première exposition de la peau à certains produits chimiques et 
exposition subséquente à la lumière, ou déclenchée par l'irradiation 
de la peau après administration systémique d'un produit chimique.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU repose sur la comparaison 
de la cytotoxicité d'une substance chimique avec et sans exposition à 
une dose non cytotoxique de lumière solaire simulée. Dans cet essai, la cytotoxicité est exprimée comme la diminution, en fonction de la concentration, de la fixation du colorant vital rouge neutre [Neutral 
Red — NR] 24 heures après traitement par le produit chimique mis à 
l'essai et irradiation (10). Le rouge neutre est un colorant cationique faible qui pénètre facilement dans les membranes cellulaires par non- diffusion, et s'accumule au niveau intracellulaire dans les lysosomes. 
L'altération de la surface cellulaire de la membrane lysosomale 
sensible entraîne une fragilité lysosomale et d'autres modifications qui deviennent graduellement irréversibles. Ces modifications induites par l'action de xénobiotiques entraînent une diminution de 
la fixation du rouge neutre, sur la base de laquelle on peut distinguer 
les cellules vivantes, des cellules mortes ou abîmées.
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Des cellules Balb/c 3T3 sont maintenues en culture pendant 24 
heures jusqu'à formation de monocouches. Pour chaque substance 
chimique à tester, deux plaques à 96 puits sont alors préincubées pendant 1 heure avec 8 concentrations distinctes de la substance chimique. Ensuite, l'une des deux plaques est exposée à la dose 
d'irradiation non cytotoxique la plus élevée, tandis que l'autre 
plaque est maintenue à l'obscurité. Dans les deux plaques, le milieu de traitement est ensuite remplacé par un milieu de culture et, après une nouvelle période d'incubation de 24 heures, la viabilité 
cellulaire est déterminée par le test de fixation du rouge neutre 
(Neutral Red Uptake — NRU). La viabilité cellulaire relative, exprimée sous forme d'un pourcentage des témoins de solvant non traités, est calculée pour chaque concentration d'essai. Afin de 
prévoir le potentiel phototoxique, les réponses aux concentrations 
obtenues en présence et en absence d'irradiation sont comparées, généralement au niveau CE
 50 , c'est-à-dire la concentration inhibant 
la viabilité cellulaire de 50 pour cent par rapport aux témoins non 
traités.  
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1  Préparations  
1.4.1.1  Cellules  
Une lignée permanente de cellules de fibroblaste de souris, Balb/c 
3T3, clone 31, provenant de l'ATCC (American Type Culture 
Collection, Manassas, Virginie, Etats-Unis), ou de l'ECACC (Euro ­
pean Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, Royaume-Uni) a été utilisée dans l'étude de validation et il est donc recommandé 
que les cellules proviennent d'un dépositaire de cellules bien qualifié. 
D'autres cellules ou lignées cellulaires peuvent aussi donner de bons résultats avec le même protocole d'essai si les conditions de culture sont adaptées aux besoins spécifiques des cellules. Il convient toute ­
fois d'en démontrer l'équivalence.
 
Les cellules doivent être régulièrement contrôlées pour vérifier l'ab ­
sence de contamination par des mycoplasmes, et ne doivent être 
utilisées que si aucun n'est trouvé (11).  
Il importe de contrôler régulièrement la sensibilité aux UV des 
cellules Balb/c 3T3 selon la procédure de contrôle qualité décrite 
dans la présente méthode. Dans la mesure où la sensibilité aux 
UVA des cellules peut augmenter avec le nombre de passages, il convient d'utiliser des cellules Balb/c 3T3 ayant subi le moins de passages possibles, de préférence moins de 100 (voir point 1.4.2.2.2 
et annexe 2).
 
1.4.1.2.  Milieux et conditions de culture  
Des milieux de culture et des conditions d'incubation appropriés 
doivent être utilisés pour le passage systématique des cellules et 
pendant la procédure d'essai. Par exemple, pour les cellules Balb/c 
3T3, le milieu de culture est du DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) enrichi avec 10 pour cent de sérum de veau nouveau-né, de glutamine (4mM), de pénicilline (100 UI) et de streptomycine (100 
μg/ml), et incubé à 37
 o C en atmosphère humidifiée, avec une teneur 
en CO  2 de 5 à 7,5 pour cent selon le tampon (voir point 
1.4.1.4, second paragraphe). Il est particulièrement important que les conditions de culture cellulaire permettent de maintenir la durée 
du cycle cellulaire dans les limites normales historiques des cellules 
ou de la lignée cellulaire utilisées.
 
1.4.1.3  Préparation des cultures  
Des cellules provenant de cultures mères congelées sont mises en 
culture à une densité appropriée dans le milieu de culture, et sont 
repiquées au moins une fois avant d'être utilisées pour le test de 
phototoxicité in vitro 3T3 NRU.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 588
 
Pour le test de phototoxicité, le milieu de culture est ensemencé avec 
une densité de cellules telle que les cultures n'arrivent pas à 
confluence avant la fin de l'essai, c'est-à-dire au moment où la viabilité cellulaire est déterminée, 48 heures après la mise en culture des cellules. Pour les cellules Balb/c 3T3 cultivées sur des 
plaques à 96 puits, la densité cellulaire recommandée est de 1 x 10
 4 
cellules par puits.  
Pour chaque substance chimique testée, les cellules sont mises 
en culture de manière identique sur deux plaques à 96 puits 
distinctes, qui sont utilisées parallèlement pendant toute la 
procédure d'essai, dans les mêmes conditions de culture, sauf pendant la période où l'une des plaques est irradiée (+ Irr) et l'autre maintenue à l'obscurité (- Irr).
 
1.4.1.4  Préparation de la substance d'essai  
Les substances chimiques de l'essai doivent être fraîchement prépa ­
rées, juste avant utilisation, à moins que les données de stabilité ne démontrent qu'elles sont conservables. Il est recommandé de procéder à la manipulation des substances chimiques et au traitement 
initial des cellules dans des conditions d'éclairage permettant d'éviter 
la photoactivation ou la dégradation de la substance d'essai avant irradiation.
 
Les substances chimiques de l'essai doivent être dissoutes dans 
des solutions salines tamponnées, par exemple, solution saline équilibrée de Earl (Earl's Balanced Salt Solution — EBSS) ou d'autres solutions tamponnées physiologiquement équilibrées, 
exemptes de constituants protéiques qui absorbent la lumière 
(par exemple, indicateurs pH colorés et vitamines), afin d'éviter les interférences lors de l'irradiation. Sachant que, pendant l'ir ­
radiation, les cellules sont maintenues pendant 50 minutes 
environ en dehors de l'incubateur CO
 2 , des précautions 
doivent être prises pour éviter l'alcalinisation. Avec des solu ­
tions faiblement tamponnées, telles que l'EBSS, il convient alors d'incuber les cellules à 7,5 pour cent de CO
 2 . Si les 
cellules sont incubées à 5 pour de CO  2 seulement, un tampon 
plus fort doit être utilisé.  
Les substances chimiques ayant une solubilité limitée dans l'eau 
doivent être dissoutes dans des solvants appropriés. Si un solvant 
est utilisé, il doit être présent à un volume constant dans toutes les 
cultures, c'est-à-dire dans les témoins négatifs (solvant) et dans toutes les concentrations de la substance chimique d'essai, et être en outre non cytotoxique à la concentration utilisée. Les concentrations de la 
substance chimique doivent être sélectionnées de façon à éviter les 
précipités ou les solutions troubles.
 
Les solvants recommandés sont le diméthylsulfoxyde (DMSO) et 
l'éthanol (EtOH). D'autres solvants de faible cytotoxicité peuvent 
convenir, mais leurs propriétés spécifiques doivent être évaluées avant utilisation, notamment les risques de réaction avec la substance chimique d'essai, l'atténuation de l'effet phototoxique, les propriétés 
de fixation des radicaux, et/ou la stabilité du produit chimique dans 
le solvant.
 
Si nécessaire, on peut recourir à un mélangeur Vortex et/ou à la 
sonication et/ou à un chauffage à des températures appropriées 
pour faciliter la solubilisation, à moins qu'une telle manipulation 
n'affecte la stabilité de la substance chimique.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 589
 
1.4.1.5  Conditions d'irradiation  
1.4.1.5.1 S o u r c e d e l u m i è r e  
Le choix d'une source de lumière et d'un filtrage appropriés est le 
facteur déterminant dans les essais de phototoxicité. Les domaines des UVA et de la lumière visible sont généralement associés à des réactions phototoxiques in vivo (3) (12), tandis que les UVB sont 
moins pertinents, mais très cytotoxiques, avec une cytotoxicité qui 
augmente d'un facteur 1 000 entre 313 et 280 nm (13). Parmi les critères présidant au choix de la source de lumière appropriée, il est essentiel que la source de lumière émette des longueurs d'onde absor ­
bées par la substance chimique d'essai et que la dose de lumière 
(pouvant être obtenue dans un délai d'exposition raisonnable) soit suffisante pour détecter les substances photocytotoxiques connues. En outre, les longueurs d'onde et les doses employées ne doivent 
pas trop endommager le système d'essai, par exemple par l'émission 
de chaleur (domaine infrarouge).
 
La lumière solaire simulée par des simulateurs solaires est considérée 
comme la source optimale de lumière artificielle. La distribution du 
pouvoir d'irradiation du simulateur solaire filtré doit être proche de 
celle de la lumière du jour extérieure donnée dans le document (14). Des arcs au xénon ou des arcs aux halogénures de métal-mercure (dopé) peuvent être utilisés comme simulateurs solaires (15). Ces 
derniers ont l'avantage d'émettre moins de chaleur et d'être moins 
chers, mais ils reproduisent moins bien la lumière solaire que les simulateurs utilisant des arcs au xénon. Dans la mesure où tous les simulateurs solaires émettent d'importantes quantités d'UVB, ils 
doivent être équipés de filtres adéquats pour atténuer les longueurs 
d'onde UVB hautement cytotoxiques. Dans la mesure où les maté ­
riaux plastiques utilisés pour les cultures cellulaires contiennent des stabilisateurs UV, le spectre doit être mesuré à travers le même type 
de plaques à 96 puits que celui employé dans l'essai. Abstraction 
faite des mesures prises pour atténuer une part du spectre par filtra ­
tion, ou des effets de filtre inévitables liés aux appareils, le spectre enregistré sous ces filtres ne doit pas dévier de la norme de lumière 
du jour extérieure (14). Les documents (8) (16) donnent un exemple 
de distribution de l'irradiance spectrale du simulateur solaire équipé de filtres qui a été utilisé dans l'étude de validation du test in vitro 3T3 NRU. Voir également la Figure 1 de l'annexe 2.
 
1.4.1.5.2. D o s i m é t r i e  
L'intensité de lumière (irradiance) doit être régulièrement contrôlée 
avant chaque essai de phototoxicité, à l'aide d'un radiomètre UV à large bande approprié. L'intensité doit être mesurée à travers le 
même type de plaques à 96 puits que celui employé dans l'essai. 
Le radiomètre UV doit avoir été étalonné par rapport à la source. Les performances du radiomètre UV doivent être contrôlées. À cet effet, on recommande l'utilisation d'un second radiomètre UV de référence, 
du même type et étalonné de la même façon. Dans l'idéal, à inter ­
valles plus grands, il conviendrait d'utiliser un spectroradiomètre pour mesurer l'irradiance spectrale de la source de lumière filtrée et pour vérifier l'étalonnage du radiomètre UV à large bande.
 
Une dose de 5 J/cm  2 (dans la plage des UVA) est non cytotoxique 
pour les cellules Balb/c 3T3 et suffisamment puissante pour exciter 
les substances chimiques et déclencher des réactions phototoxiques (6) (17). Par exemple, pour obtenir 5 J/cm
 2 dans un délai de 
50 minutes, l'irradiance a été réglée à 1,7 mW/cm  2 . Voir la Figure 
2 de l'annexe 2. En cas d'utilisation d'une autre lignée cellulaire ou 
d'une source de lumière différente, il peut s'avérer nécessaire d'ajuster la dose d'irradiation en choisissant une dose qui ne soit pas nocive pour les cellules tout en étant suffisante pour exciter 
les phototoxines standard. La durée de l'exposition à la lumière se 
calcule de la façon suivante:
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 590
 
tðminÞ ¼ irradiation dose ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
irradiance ðmW=cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2  Conditions d'essai  
1.4.2.1  Concentrations de la substance d'essai  
Les plages de concentrations du produit chimique testé en présence 
(+Irr) et en absence (-Irr) de lumière doivent être déterminées de manière adéquate lors d'expériences préalables. Il peut être utile d'évaluer la solubilité au début puis après un délai de 60 minutes 
(ou à la durée employée dans l'essai), dans la mesure où celle-ci peut 
varier avec le temps ou au cours de l'exposition. Pour éviter toute toxicité induite par des conditions de culture inappropriées ou des substances chimiques hautement acides ou alcalines, il faut que le 
pH des cultures cellulaires, auxquelles la substance d'essai a été 
ajoutée, soit dans une plage comprise entre 6,5 et 7,8.
 
La concentration la plus élevée de la substance d'essai doit être dans 
les conditions d'essai physiologiques, par exemple le stress pH ou osmotique doit être évité. Selon la substance d'essai, il peut s'avérer nécessaire d'envisager d'autres propriétés physico-chimiques comme 
facteurs limitant la concentration d'essai la plus élevée. Pour les 
substances relativement insolubles, mais non toxiques à des concen ­
trations allant jusqu'au point de saturation, il y a lieu de procéder à des essais pour déterminer la concentration la plus élevée qui puisse 
être atteinte. De manière générale, il y a lieu d'éviter les effets de 
précipités de la substance chimique à toutes les concentrations d'es ­
sai. La concentration maximale d'une substance d'essai ne doit pas dépasser 1 000 μg/ml, et l'osmolarité ne doit pas dépasser 
10 milliosmoles. Il convient d'utiliser une série de dilutions en 
progression géométrique comprenant 8 concentrations de la subs ­
tance d'essai avec un facteur de dilution constant (voir point 2.1, second paragraphe).
 
Si les informations provenant d'expériences préalables établissent 
qu'une substance chimique n'est pas cytotoxique jusqu'à la concen ­
tration limite dans l'obscurité (-Irr), mais se révèle hautement cyto ­
toxique exposée à la lumière (+Irr), les plages de concentrations à choisir pour l'expérience (+Irr) peuvent être différentes de celles utilisées pour l'expérience (-Irr), de façon à garantir une qualité 
adéquate des résultats.
 
1.4.2.2  Contrôles/Témoins  
1.4.2.2.1. S e n s i b i l i t é d e s c e l l u l e s a u x r a d i a t i o n s , d o n n é e s 
h i s t o r i q u e s :  
la sensibilité des cellules à la source lumineuse doit être régulièrement 
contrôlée (tous les cinq passages environ), par évaluation de leur viabi ­
lité après une exposition à des doses croissantes d'irradiation. Pour cette 
évaluation, plusieurs doses d'irradiation doivent être utilisées, y 
compris des niveaux significativement supérieurs à ceux de l'essai de phototoxicité 3T3 NRU. La méthode la plus simple pour quantifier ces doses consiste à mesurer les UV à la source. Les cellules sont mises en 
culture à la densité utilisée dans l'essai de phototoxicité in vitro 3T3 
NRU. Elles sont irradiées le jour suivant, et la viabilité cellulaire est déterminée un jour plus tard à l'aide du test NRU. Il faut alors que la dose non cytotoxique la plus élevée (par exemple, 5 J/cm
 2 [UVA] dans 
l'étude de validation) soit suffisante pour classer correctement les subs ­
tances de référence (Tableau 1).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S e n s i b i l i t é a u x r a d i a t i o n s , c o n t r ô l e d e l ' e s s a i e n 
c o u r s :  
l'essai répond aux critères de qualité si les témoins de contrôle 
négatifs (solvant) irradiés ont une viabilité supérieure ou égale à 80 pour cent de celle des témoins de contrôle négatifs non irradiés.
 
1.4.2.2.3. V i a b i l i t é d e s t é m o i n s d e s o l v a n t  
la densité optique absolue (OD  540 NRU), mesurée dans l'extrait NR 
des témoins de solvant indique si les 1 × 10  4 cellules mises en 
culture par puits se sont développées avec un temps de doublement 
normal pendant les deux jours de l'essai. Un essai répond aux critères d'acceptation si la densité optique moyenne OD
 540 NRU 
des témoins non traités est > 0,4 (c'est-à-dire approximativement 
vingt fois l'absorbance de fond du solvant).  
1.4.2.2.4 T é m o i n p o s i t i f :  
Pour chaque essai de phototoxicité in vitro 3T3 NRU réalisé, un 
produit chimique phototoxique connu doit être testé concurremment. 
La chlorpromazine (CPZ) est recommandée. Dans le cas de la CPZ testée selon le protocole standard dans le test de phototoxicité in 
vitro 3T3 NRU, les critères d'acceptation suivants ont été définis: 
CPZ irradiée (+Irr): CE
 50 = 0,1 à 2,0 μg/ml; CPZ non irradiée (-Irr): 
CE 50 = 7,0 à 90,0 μg/ml. Le facteur de photo-irritation (PIF) doit 
être > 6. Les données historiques du témoin positif doivent être 
suivies.  
À la place de la CPZ, d'autres produits chimiques phototoxiques 
convenant à la classe chimique ou aux caractéristiques de solubilité 
de la substance chimique à tester, peuvent aussi être utilisés en tant 
que témoins positifs parallèles.  
1.4.3  Mode opératoire (6) (7) (8) (16) (17):  
1.4.3.1  Premier jour:  
Verser 100 μl de milieu de culture dans les puits périphériques d'une 
plaque de microtitrage de culture tissulaire à 96 puits (= essais à blanc). Dans les puits restants, verser 100 μl d'une suspension cellu ­
laire de 1 × 10
 5 cellules/ml en milieu de culture, (= 1 × 10  4 cellules/ 
puits). Préparer deux plaques pour chaque série des concentrations de la substance à tester, ainsi que pour les témoins négatifs (de solvant) et positifs.
 
Incuber les cellules pendant 24 heures (voir point 1.4.1.2) jusqu'à 
formation d'une monocouche semi-confluente. Cette période d'incu ­
bation permet la récupération et l'adhérence des cellules, et leur 
croissance exponentielle.  
1.4.3.2  Deuxième jour:  
Après incubation, décanter le milieu de culture pour le séparer des 
cellules et laver délicatement avec 150 μl de la solution tamponnée 
utilisée pour l'incubation. Ajouter 100 μl de la solution tamponnée 
contenant la concentration appropriée de la substance chimique à tester, ou uniquement du solvant (témoin négatif). Appliquer 8 
concentrations distinctes de la substance chimique à tester. Incuber 
les cellules avec la substance chimique à tester dans l'obscurité pendant 60 minutes (voir points 1.4.1.2 et 1.4.1.4, second para ­
graphe).
 
Sur les deux plaques préparées pour chaque série de concentrations, 
ainsi que pour les témoins, une plaque est sélectionnée, généralement au hasard, pour la détermination de la cytotoxicité (-Irr) (par exem ­
ple, la plaque témoin), et l'autre (la plaque de traitement) pour la 
détermination de la photocytotoxicité (+Irr).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 592
 
Pour réaliser la partie (+Irr) de l'essai, irradier les cellules à tempé ­
rature ambiante pendant 50 minutes environ à travers le couvercle de 
la plaque à 96 puits, à la dose maximale de radiations non cyto ­
toxique (voir également annexe 2). Conserver les plaques identiques non irradiées (-Irr) à température ambiante dans une boîte obscure 
pendant 50 minutes (= durée de l'exposition à la lumière).
 
Décanter la solution d'essai et laver deux fois avec 150 μl de la 
solution tamponnée utilisée pour l'incubation, mais ne contenant 
pas la substance d'essai. Remplacer le tampon par le milieu de culture et incuber (voir le point 1.4.1.2) jusqu'au lendemain (18-22 
heures).
 
1.4.3.3  Troisième jour:  
1.4.3.3.1 É v a l u a t i o n m i c r o s c o p i q u e  
Examiner les cellules au microscope à contraste de phase. Noter la 
croissance, la morphologie et l'intégrité de la monocouche. Les chan ­
gements morphologiques et les effets sur la croissance cellulaire 
doivent être enregistrés.  
1.4.3.3.2 T e s t d e f i x a t i o n d u r o u g e n e u t r e  
Laver les cellules avec 150 μl de la solution tamponnée préchauffée. 
Éliminer la solution de lavage en tapotant légèrement. Ajouter 100 μl 
d'un rouge neutre (3-amino-7-diméthylamino-2-méthylphénazine 
chlorhydrate, numéro EINECS 209-035-8; numéro CAS 553-24-2; 
CI. 50040) à 50 μg/ml dans un milieu sans sérum (16) et incuber 
comme décrit au point 1.4.1.2., pendant 3 heures. Après incubation, éliminer le milieu NR et laver les cellules avec 150 μl du tampon. 
Décanter et évacuer complètement le tampon en excès par absorption 
ou centrifugation.
 
Ajouter exactement 150 μl de solution de désorption NR (solution 
fraîchement préparée de 49 parts d'eau + 50 parts d'éthanol + 1 part d'acide acétique).
 
Passer rapidement la plaque de microtitrage à l'agitateur pendant 
10 minutes, jusqu'à ce que le NR soit extrait des cellules et forme 
une solution homogène.  
Mesurer la densité optique de l'extrait de NR à 540 nm dans un 
spectrophotomètre en utilisant les essais à blanc comme référence. Sauvegarder les données dans un format de fichier électronique 
approprié en vue d'une analyse ultérieure.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. QUALITÉ ET QUANTITÉ DES DONNÉES  
Les données d'essai doivent permettre une analyse significative des 
courbes concentration-effet obtenues avec et sans irradiation, et si possible de la concentration de la substance d'essai à laquelle la viabilité cellulaire est réduite de moitié (CE
 50 ). Si on constate une 
cytotoxicité, il y a lieu d'ajuster à la fois la gamme des concentra ­
tions et l'intervalle entre chaque concentration, afin qu'il y ait concor ­
dance entre la courbe et les données expérimentales.  
Pour les résultats clairement positifs ou clairement négatifs (voir 
point 2.3), l'expérience principale, étayée par une ou plusieurs expé ­
riences préliminaires de détermination des gammes de concentra ­
tions, est généralement suffisante.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 593
 
Les tests qui donnent des résultats équivoques, limites ou incertains 
doivent être vérifiés par un essai supplémentaire (voir également point 
2.4, second paragraphe). Si cet essai s'avère nécessaire, il peut être utile de faire varier les conditions expérimentales, et notamment la plage ou l'espacement des concentrations, le temps de préincubation, et le temps 
d'exposition à l'irradiation. Une réduction de cette durée d'exposition 
peut présenter un intérêt pour les produits chimiques instables dans l'eau.
 
2.2. ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Pour procéder à l'évaluation des données, il peut être nécessaire de 
calculer un facteur de photo-irritation (PIF) ou un photo-effet moyen 
(MPE).  
Pour le calcul des mesures de photocytotoxicité (voir ci-après), l'en ­
semble des valeurs discrètes de concentration-effet doit être déterminé par une courbe concentration-effet continue appropriée (modèle). On fait généralement concorder la courbe aux données en appliquant une 
méthode de régression non linéaire (18). Pour évaluer l'influence de la 
variabilité des données sur la courbe ajustée, il est recommandé d'em ­
ployer une procédure de type «bootstrap».
 
On calcule un facteur de photo-irritation (PIF) à l'aide de la formule 
suivante:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
S'il n'est pas possible de calculer une CE  50 en présence ou en l'ab ­
sence de lumière, il ne sera pas possible de déterminer un PIF pour 
la substance d'essai. Le photo-effet moyen (MPE) est une mesure 
basée sur une comparaison des courbes concentration-effet complètes (19). Il correspond à la moyenne pondérée d'un ensemble représen ­
tatif de valeurs du photo-effet:
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Le photo-effet PEc à une concentration C est défini comme le produit 
de la réponse-effet RE  C et de la dose-effet DE  C , soit PE  C = RE  C × DE  C . 
La réponse-effet RE  C correspond à la différence entre les réponses 
observées en absence et en présence de lumière, soit RE  C = R  C (-Irr) 
— R  C (+Irr). La dose-effet est donnée par la formule suivante  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
où C* représente la concentration équivalence, c'est-à-dire la concentra ­
tion à laquelle la réponse +Irr est équivalente à la réponse -Irr à la concentration C. S'il n'est pas possible de déterminer C* parce que les 
valeurs de la courbe +Irr sont systématiquement supérieures ou infé ­
rieures à RC (-Irr), la dose-effet est fixée à 1. Les facteurs de pondération w
 1 sont donnés par la valeur la plus élevée, soit w  i = MAX {R  i (+Irr), R  i 
(-Irr)}. La grille de concentration C  i est choisie de façon à ce que le 
même nombre de points figure dans chaque intervalle de concentration 
défini par les valeurs de concentration utilisées dans l'expérience. Le calcul du MPE est limité par la valeur de concentration maximale à laquelle au moins une des deux courbes montre une valeur de réponse 
d'au moins 10 pour cent. Si cette concentration maximale est supérieure à 
la concentration la plus élevée utilisée dans l'expérience +Irr, la partie résiduelle de la courbe +Irr est ajustée à la valeur de réponse «0». La substance chimique est ensuite classée ou non comme étant photo ­
toxique, selon que la valeur MPE est supérieure ou non à une valeur 
de seuil correctement choisie (MPE
 C = 0,15).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 594
 
Un logiciel de calcul du PIF et du MPE est disponible (20).  
2.3. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Sur la base de l'étude de validation (8), une substance d'essai dont le 
PIF est < 2 ou le MPE < 0,1 ne présente «aucune phototoxicité». Un 
PIF > 2 et < 5 ou un MPE > 0,1 et < 0,15 indique une «phototoxi ­
cité probable» et un PIF > 5 ou un MPE > 0,15 indique une «pho ­
totoxicité».  
Pour les laboratoires qui entreprennent cet essai pour la première 
fois, il est préconisé de procéder à un essai sur les substances de référence données dans le Tableau 1, avant d'entreprendre l'évalua ­
tion phototoxique de substances d'essai. Les valeurs PIF ou MPE 
doivent être proches des valeurs données dans le tableau 1.
 
Tableau 1  
Nom de la subs ­
tance chimique N o EINECS N  o CAS PIF MPE Pic d'absorption Solvant (  1 ) 
Amiodarone 
chlorhydrate 243-293-2 [19774-82-4] >3,25 0,27 - 0,54 242 nm 
300 nm 
(épaule­
ment) éthanol 
Chlorpromazine 
chlorhydrate 200-701-3 [69-09-0] >14,4 0,33 - 0,63 309 nm éthanol 
Norfloxacine 274-614-4 [70458-96-7] >71,6 0,34 - 0,90 316 nm acétonitrile 
Anthracène 204-371-1 [120-12-7] >18,5 0,19 - 0,81 356 nm acétonitrile Protoporphyrine 
IX, disodium 256-815-9 [50865-01-5] >45,3 0,54 - 0,74 402 nm éthanol 
L — Histidine [7006-35-1] pas de 
PIF 0,05 - 0,10 211 nm eau 
Hexachloro ­
phene 200-733-8 [70-30-4] 1,1 - 1,7 0,00 - 0,05 299 nm 
317nm 
(épaule­
ment) éthanol 
Sulfate de 
sodium et de 
dodécyle 205-788-1 [151-21-3] 1,0 - 1,9 0,00 - 0,05 pas d'ab ­
sorption eau
 
( 1 ) Solvant utilisé pour mesurer l'absorption.  
2.4. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Si des effets phototoxiques ne sont observés qu'à la concentration 
d'essai maximale (en particulier pour les substances d'essai solubles 
dans l'eau), d'autres investigations peuvent s'avérer nécessaires pour 
évaluer les risques. Il peut s'agir notamment d'étudier l'absorption cutanées et l'accumulation du produit chimique dans la peau, et/ou de soumettre le produit à un autre type d'essai, en recourant par 
exemple à des essais in vitro sur peau humaine ou animale, ou sur 
modèle de peau.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 595
 
En revanche, si aucune toxicité n'a été mise en évidence (+Irr et -Irr) 
et si la solubilité faible du produit dans l'eau a limité les concen ­
trations d'essai, il faut peut-être s'interroger sur l'adéquation du système d'essai pour la substance à tester, et envisager un essai de confirmation avec un autre modèle.
 
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir au minimum les informations 
suivantes:  
Substance d'essai:  
— données d'identification, nom générique commun et numéros 
IUPAC et CAS si connus  
— nature physique et pureté  
— propriétés physico-chimiques importantes pour la réalisation de 
l'étude  
— spectre d'absorption UV/lumière visible  
— stabilité et photostabilité si connues  
Solvant:  
— justification du choix du solvant  
— solubilité de la substance d'essai dans le solvant  
— pourcentage de solvant présent dans le milieu de traitement  
Cellules:  
— type et provenance des cellules  
— absence de mycoplasmes  
— nombre de passages cellulaires, si connu  
— sensibilité des cellules aux radiations, déterminée avec l'appareil 
d'irradiation utilisé dans l'essai de phototoxicité in vitro 3T3 
NRU.  
Conditions expérimentales (1)  incubation avant et après traitement:  
— type et composition du milieu de culture  
— conditions d'incubation (concentration de CO  2 , température, 
humidité)  
— durée de l'incubation (avant traitement et après traitement)  
Conditions expérimentales (2)  traitement par la substance chimique:  
— justification du choix des concentrations de substance d'essai 
utilisées, en présence et en absence de rayonnement  
— en cas de solubilité limitée du produit chimique et d'absence de 
cytotoxicité, justification de la concentration maximale utilisée  
— type et composition du milieu de traitement (solution saline 
tamponnée)  
— durée du traitement chimique.  
Conditions expérimentales (3)  Irradiation:  
— justification de la source de lumière utilisée  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 596
 
— fabricant et type de source de lumière et de radiomètre  
— caractéristiques d'irradiance spectrale de la source de lumière  
— caractéristiques de transmission/absorption du (des) filtre(s) 
utilisé(s)  
— caractéristiques du radiomètre et modalités d'étalonnage  
— distance entre la source de lumière et le système d'essai  
— irradiance UVA à cette distance, exprimée en mW/cm  2 
— durée de l'exposition UV/lumière visible  
— dose d'UVA (irradiance × temps), exprimée en J/cm  2 
— température appliquée aux cultures cellulaires durant l'irradiation 
et aux cultures cellulaires maintenues concurremment dans l'obs ­
curité.  
Conditions expérimentales (4)  test NRU:  
— composition du milieu de traitement NR  
— durée de l'incubation dans NR  
— conditions d'incubation (concentration de CO  2 , température, 
humidité)  
— d'extraction du NR (agent d'extraction, durée)  
— longueur d'ondes utilisée pour la lecture spectrophotomé ­
trique de la densité optique du NR  
— seconde longueur d'ondes (référence), le cas échéant  
— contenu de l'échantillon destiné à l'essai à blanc du spectro ­
photomètre, le cas échéant.  
Résultats:  
— viabilité cellulaire obtenue pour chaque concentration de la subs ­
tance d'essai, exprimée en pour cent de la viabilité moyenne des 
témoins de solvant  
— courbes de concentration-effet (concentration de la substance 
chimique — viabilité cellulaire relative) obtenues dans les expé ­
riences +Irr et -Irr parallèles  
— analyse des courbes concentration-effet: si possible, calcul/déter ­
mination des CE  50 (+Irr) et CE  50 (-Irr)  
— comparaison des deux courbes concentration-effet obtenues en 
présence et en l'absence de rayonnement, soit par le calcul du facteur de photo-irritation (PIF), soit par le calcul du photo-effet 
moyen (MPE)
 
— critères d'acceptation de l'essai, témoin négatif (solvant) simul ­
tané:  
— viabilité absolue (densité optique de l'extrait de NR) des cellules 
irradiées et des cellules non irradiées  
— données historiques sur les témoins négatif et de solvant, 
moyennes et écarts types  
— critères d'acceptation de l'essai, témoin positif simultané:  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 597
 
— CE  50 (+Irr) et CE  50 (-Irr) et PIF/MPE du produit chimique 
témoin positif  
— données historiques sur le produit chimique témoin positif: CE  50 
(+Irr) et CE  50 (-Irr) et PIF/MPE moyennes et écarts types.  
Discussion des résultats  
Conclusions  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM Workshop 
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Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3 November 1997, ATLA, 26, p. 7-8.  
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, 
P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., 
Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international 
EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, p. 305-327.
 
(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30
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Report, 15  th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon 
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(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
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(13) Tyrrell, R.M., Pidoux, M. (1987). Action spectra for human 
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ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
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(14) ISO 10977. (1993). Photography — Processed photographic 
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(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
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(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure: 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 
September, 1998, p. 18.  
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter 
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76/768/EEC,  in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. 
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(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
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(19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of in vitro photo ­
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(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34 377_ 
2349687_l_l_l_l,00.html  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 599
 
ANNEXE 1  
Rôle de l'essai de phototoxicité 3T3 NRU dans une approche séquentielle des essais de 
phototoxicité des substances chimiques
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 600
 
ANNEXE 2  
Figure 1  
Distribution spectrale énergétique d'un simulateur solaire équipé de filtres
  
(voir point 1.4.1.5, second paragraphe)  
La figure 1 donne un exemple de distribution acceptable de l'énergie spectrale d'un simulateur 
solaire équipé de filtres. Elle correspond à la source aux halogénures de métaux dopés utilisée dans l'essai de validation du test 3T3 NRU (6) (8) (17). Cette figure fait apparaître l'effet des deux filtres distincts, ainsi que l'effet de filtration de la plaque à 96 puits. Le filtre H2 est utilisé 
uniquement avec les systèmes d'essai qui peuvent supporter une quantité plus importante d'UVB 
(essai sur modèle de peau et essai de photo-hémolyse des globules rouges). Dans l'essai 3T3 NRU, le filtre H1 a été utilisé. La figure montre que l'effet de filtration supplémentaire de la plaque est principalement observé dans la plage des UVB, laissant néanmoins suffisamment d'UVB dans le 
spectre d'irradiation pour exciter les substances chimiques qui absorbent généralement la lumière 
dans la plage des UVB, telles que l'amiodarone (voir le tableau 1).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 601
 
Figure 2  
Sensibilité des cellules Balb/c 3T3 à l'irradiation (mesurée dans la plage des UVA)  
Viabilité cellulaire (% de fixation du rouge neutre des témoins dans l'obscurité)
  
Temps d'irradiation (minutes) (10 min = 1 joule UVA/cm  2 ) 
(voir point 1.4.1.5.2, second paragraphe, et points 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Sensibilité des cellules Balb/c 3T3 à l'irradiation avec le simulateur solaire utilisé dans l'essai de 
validation du test de phototoxicité 3T3 NRU, mesurée dans la plage des UVA. La figure montre les 
résultats obtenus dans sept laboratoires différents au cours de l'étude de prévalidation (1). Les deux 
courbes avec des symboles transparents ont été obtenues avec des cellules âgées (nombre de passages élevés) qu'il a fallu remplacer par de nouvelles cellules, tandis que les courbes aux symboles pleins sont associées à des cellules montrant une tolérance acceptable à l'irradiation.
 
C'est à partir de ces données qu'on a dérivé la dose maximale d'irradiation non cytotoxique de 5 
J/cm  2 (ligne discontinue verticale). La ligne de pointillés horizontale montre en outre l'effet maximal 
d'irradiation acceptable (point 1.4.2.2).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 602
 
B.42.  SENSIBILISATION CUTANÉE: ESSAI DE STIMULATION 
LOCALE DES GANGLIONS LYMPHATIQUES  
INTRODUCTION  
1. Les lignes directrices (LD) de l’OCDE pour les essais de produits 
chimiques et les méthodes d’essai de l’Union européenne qui sont 
fondées sur celles-ci sont régulièrement révisées à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences réglementaires et de considéra ­
tions relatives au bien-être des animaux. La méthode d’essai initiale visant à 
déterminer la sensibilisation cutanée chez la souris, c’est-à-dire l’essai de 
stimulation locale des ganglions lymphatiques (ELGL; LD 429 de l’OCDE, chapitre B.42 de la présente annexe), a été adoptée antérieurement (1). Les détails de la validation de l’ELGL et une synthèse des travaux qui y sont 
associés ont été publiés (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). La révision 
de l’ELGL s’appuie sur l’évaluation de l’expérience acquise et des données scientifiques (12). Il s’agit de la deuxième méthode d’essai permettant 
d’évaluer le pouvoir de sensibilisation cutanée de substances chimiques 
(substances et mélanges) chez les animaux. L’autre méthode d’essai (LD 406 de l’OCDE, chapitre B.6 de la présente annexe) fait appel à des essais sur cobayes, notamment l’essai de maximisation sur le cobaye et l’essai de 
Buehler (13). L’ELGL présente un avantage par rapport au chapitre B.6 et à 
la LD 406 de l’OCDE (13) en termes de bien-être des animaux. Cette mise à jour de la méthode d’essai sur l’ELGL comprend une série de normes de performance (appendice 1) pouvant servir à évaluer l’état de validation des 
méthodes d’essai modifiées et/ou nouvelles, dont le fonctionnement et le 
mécanisme sont similaires à ceux de l’ELGL, conformément aux principes énoncés dans le document d’orientation n
 o 34 de l’OCDE (14).  
2. L’ELGL s’intéresse à la phase d’induction de la sensibilisation cutanée et 
livre des données quantitatives permettant d’évaluer la relation dose-effet. Il convient de noter que les sensibilisants légers/modérés recommandés 
comme témoins positifs (TP) pour les essais sur cobayes (chapitre B.6, 
LD 406 de l’OCDE) (13) conviennent également à l’ELGL (6) (8) (15). La présente méthode d’essai décrit également une approche simplifiée de l’ELGL (ELGLs) optionnelle, qui pourrait nécessiter jusqu’à 40 % d’ani ­
maux en moins (16) (17) (18). Cet essai simplifié pourrait être utilisé en cas 
de besoin réglementaire de confirmer les prévisions négatives concernant le pouvoir de sensibilisation cutanée, à condition de rester en conformité avec toutes les autres dispositions du protocole ELGL décrit dans la présente 
méthode d’essai. La prédiction d’un résultat négatif s’appuie sur toutes les 
informations disponibles, comme cela est décrit au paragraphe 4. Tout recours à l’approche ELGL simplifiée est préalablement justifié, avec le détail des raisons scientifiques étayant ce choix. Si, en dépit des prévisions, 
l’ELGL simplifié donne une réponse positive ou équivoque, des essais 
supplémentaires peuvent s’avérer nécessaires pour interpréter ou clarifier le résultat. L’ELGLs ne convient pas pour identifier les substances 
d’essai sensibilisantes pour la peau lorsque des données sur la relation 
dose-effet sont nécessaires, comme pour la sous-catégorisation conformé ­
ment au règlement (CE) n
 o 1272/2008 relatif à la classification, à l’étique ­
tage et à l’emballage des substances et des mélanges, et à la classification 
du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits 
chimiques de l’Organisation des Nations-Unies.  
DÉFINITIONS  
3. Les définitions utilisées sont données à l’appendice 2.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES  
4. L’ELGL constitue une méthode de remplacement pour identifier les subs ­
tances et mélanges chimiques susceptibles d’exercer une action sensibili ­
sante sur la peau. Cela n’implique pas que l’ELGL doive systématiquement remplacer les essais sur cobayes (B.6, LD 406 de l’OCDE) (14) mais plutôt 
qu’il s’agit d’un outil d’une qualité égale pouvant se substituer à ces essais, 
et dont les résultats positifs ou négatifs n’ont généralement plus besoin de confirmation supplémentaire. Avant de procéder à l’essai, le laboratoire rassemble toutes les informations disponibles sur la substance d’essai, à 
savoir son identité et sa structure chimiques, ses propriétés 
physico-chimiques, les résultats de tous les autres essais de toxicité in
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vitro et in vivo, et les données toxicologiques sur des analogues de struc ­
ture. Ces informations servent à déterminer s’il est pertinent d’appliquer la 
méthode ELGL avec la substance considérée, étant donné l’incompatibilité de certains types de substances chimiques avec l’ELGL (voir paragraphe 5), et aident à choisir les doses appropriées.
 
5. La méthode ELGL, mise en œuvre in vivo, ne met donc pas un terme à 
l’utilisation d’animaux pour évaluer la sensibilisation allergique par contact. Elle est néanmoins susceptible de réduire le nombre d’animaux requis à ces 
fins. En outre, l’ELGL propose un raffinement important (réduction du 
stress et de la douleur) de l’utilisation des animaux pour évaluer la sensi ­
bilisation allergique par contact. L’ELGL se fonde sur les réactions immu ­
nologiques induites par les produits chimiques pendant la phase d’induction 
de la sensibilisation. Contrairement aux essais sur cobayes (chapitre B.6, 
LD 406 de l’OCDE) (13), l’ELGL ne s’appuie pas sur le déclenchement de réactions d’hypersensibilité cutanée par une exposition de déclenchement. De plus, l’ELGL ne requiert aucun adjuvant, contrairement à l’essai de 
maximisation sur le cobaye (13). C’est pourquoi l’ELGL réduit la souf ­
france et le stress chez les animaux. Malgré les avantages de l’ELGL par rapport au chapitre B.6 et à la LD 406 de l’OCDE, certaines limites peuvent imposer de privilégier l’utilisation du chapitre B.6 ou de la LD 406 de 
l’OCDE (13) [par exemple, résultats faussement négatifs avec certains 
métaux, résultats faussement positifs avec certaines substances irritantes pour la peau, en particulier des tensioactifs (19) (20), ou solubilité de la substance d’essai]. De surcroît, certaines substances chimiques ou familles 
de substances comprenant des groupements fonctionnels dont il est 
démontré qu’ils peuvent être des facteurs de confusion (21) peuvent aussi imposer le recours aux essais avec cobayes (chapitre B.6, LD 406 de l’OCDE) (13). Par ailleurs, en examinant la base de données de validation, 
limitée et essentiellement constituée de formulations de pesticides, on 
observe que l’ELGL donne plus de résultats positifs que l’essai sur cobayes pour ces types de substances (22). Concernant les formulations, il est cependant envisageable de tester des substances similaires aux effets 
connus en tant que substances étalons, afin de prouver que l’ELGL est 
efficace (voir paragraphe 16). Dans ces limites, l’ELGL est applicable à toute substance qui ne présente pas de propriétés susceptibles d’affecter la 
précision de l’essai.
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
6. L’ELGL repose sur le principe que les sensibilisants induisent une prolifé ­
ration de lymphocytes dans les ganglions lymphatiques drainant le site de 
l’application de la substance d’essai. Cette prolifération est proportionnelle à 
la dose appliquée et à la puissance de l’allergène, et permet d’obtenir facilement une mesure quantitative de la sensibilisation. Pour mesurer la prolifération, on compare la prolifération moyenne de chaque groupe d’essai 
à la prolifération moyenne du groupe témoin traité avec le véhicule (TV). 
On calcule le quotient de la prolifération moyenne dans chaque groupe traité sur celle du TV, pour obtenir l’indice de stimulation (IS); si cette valeur est supérieure ou égale à 3, il est justifié de classer la substance 
d’essai comme substance ayant un pouvoir de sensibilisation cutanée. Les 
procédures décrites ici mesurent la prolifération cellulaire dans les ganglions lymphatiques auriculaires de drainage à l’aide d’un marquage radioactif in vivo. Il est toutefois possible de faire appel à d’autres paramètres pour 
évaluer le nombre de cellules en prolifération, à condition de respecter 
strictement les normes de performance (appendice 1).
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DESCRIPTION DE L’ESSAI  
Choix des espèces animales  
7. L’espèce retenue pour cet essai est la souris. On utilise de jeunes femelles 
adultes, nullipares et non gravides, de souche CBA/Ca ou CBA/J. Au début 
de l’étude, les animaux sont âgés de 8 à 12 semaines et affichent une variation de poids minime entre eux n’excédant pas 20 % du poids moyen. Il est aussi possible d’utiliser d’autres souches ainsi que des 
mâles s’il existe suffisamment d’informations démontrant l’absence de 
différences significatives entre les souches et/ou les sexes en ce qui concerne la réaction à l’ELGL.
 
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
8. Les souris sont hébergées par groupes (23), sauf si une raison scientifique 
pertinente exige un encagement individuel. La température de l’animalerie est maintenue à 22 °C ± 3 °C. L’humidité relative atteint au moins 30 % et de préférence ne dépasse pas 70 % en dehors des moments où le local est 
nettoyé, l’idéal étant qu’elle soit maintenue aux alentours de 50-60 %. 
L’éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obs ­
curité. Les animaux peuvent être alimentés par un régime classique de laboratoire avec eau potable à satiété.
 
Préparation des animaux  
9. Les animaux sont sélectionnés au hasard, marqués pour permettre leur 
identification individuelle (mais jamais sur l’oreille) et gardés dans leurs cages pendant au moins cinq jours avant le commencement du traitement 
afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Avant de commencer 
le traitement, on examine tous les animaux pour vérifier qu’ils ne présentent pas de lésions cutanées observables.
 
Préparation des solutions d’essai  
10. Les substances et mélanges chimiques solides sont dissouts ou dispersés 
dans des solvants/véhicules puis dilués, s’il y a lieu, avant d’être appliqués sur l’oreille des souris. Les substances et mélanges chimiques liquides peuvent être appliqués purs ou préalablement dilués. Les substances et 
mélanges chimiques insolubles, comme ceux que l’on rencontre générale ­
ment dans les dispositifs médicaux, sont soumis à une extraction forcée à l’aide d’un solvant approprié pour faire ressortir tous les composants extrac ­
tibles qu’il est possible d’évaluer, avant l’application sur l’oreille des souris. 
Les substances d’essai sont préparées chaque jour à moins que les données 
concernant la stabilité ne démontrent qu’elles peuvent être stockées.
 
Contrôle de la fiabilité  
11. Les témoins positifs (TP) servent à démontrer le bon fonctionnement de 
l’essai en répondant de manière adéquate et reproductible à une substance 
d’essai sensibilisante pour lequel l’ordre de grandeur des effets est bien connu. Il est recommandé d’inclure un TP concurrent puisqu’il démontre la capacité du laboratoire à mener chaque essai correctement, et permet 
d’évaluer la comparabilité et la reproductibilité intra- et interlaboratoires. 
Par ailleurs, dans la mesure où certaines autorités réglementaires exigent un TP dans chaque essai, les expérimentateurs sont encouragés à consulter les autorités concernées avant de mener l’ELGL. De même, le recours systéma ­
tique à un TP concurrent est recommandé pour éviter d’avoir à réaliser des 
essais supplémentaires sur animaux, ce qui est parfois exigé lorsqu’un laboratoire se réfère à un TP testé périodiquement (voir paragraphe 12). Le TP doit réagir positivement à l’ELGL pour un niveau d’exposition 
supposé accroître l’indice de stimulation de plus. Le TP doit réagir positi ­
vement à l’ELGL pour un niveau d’exposition supposé accroître l’indice de
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stimulation de plus de 3 points par rapport au groupe témoin négatif (TN). 
La dose de TP est choisie de manière à ne pas entraîner d’irritation cutanée 
excessive ou de toxicité systémique, l’induction devant être reproductible sans être exagérée (un IS > 20 est considéré comme excessif, par exemple). Les substances utilisées en priorité comme TP sont l’hexyl cinnamaldéhyde 
à 25 % (N
 o CAS [Chemical Abstracts Service] 101-86-0) dans un mélange 
acétone/huile d’olive (4:1, v/v), ainsi que le mercaptobenzothiazole (N
 o CAS 149-30-4) à 5 % dans le N,N-diméthylformamide (voir 
appendice 1, tableau 1). Dans certains cas, d’autres substances d’essai 
répondant aux critères susmentionnés pourront être employées comme 
témoins positifs, à condition que ce choix soit correctement justifié.  
12. Si l’inclusion d’un groupe TP concurrent demeure recommandée, dans 
certaines circonstances des essais périodiques (c’est-à-dire à intervalles ≤ 6 mois) du TP peuvent convenir pour des laboratoires menant régulière ­
ment (c’est-à-dire au moins une fois par mois) des ELGL et disposant d’une 
base de données de référence montrant que le laboratoire est apte à obtenir des résultats précis et reproductibles avec les TP. La capacité d’un labora ­
toire à mener l’ELGL est efficacement démontrée quand le TP déclenche 
des résultats positifs cohérents à l’issue d’un minimum de 10 essais indé ­
pendants étalés sur une période raisonnable (c’est-à-dire inférieure à un an).
 
13. Il convient d’inclure un groupe TP concurrent à chaque fois que le proto ­
cole de l’ELGL est modifié (par exemple si des modifications interviennent au niveau du personnel qualifié, des composés et/ou réactifs utilisés pour la 
méthode d’essai, de l’équipement mis en œuvre ou de la source d’animaux 
d’expérience), et ces changements sont documentés dans les rapports de laboratoire. Il faudra tenir compte de l’impact de ces changements sur la validité des données de la base historique pour décider de l’opportunité 
d’établir une nouvelle base de données afin d’évaluer la cohérence des 
résultats relatifs au TP.
 
14. Les investigateurs gardent à l’esprit que faire une étude de TP périodique ­
ment plutôt que systématiquement comme concurrent pèse sur la précision et l’acceptabilité des résultats négatifs obtenus à l’issue d’un essai sans TP 
concurrent réalisé dans l’intervalle entre chaque essai périodique du TP. Par 
exemple, si un essai périodique du TP donne un faux négatif, l’ensemble des résultats négatifs obtenus avec la substance d’essai depuis le dernier essai de TP valable pourront être remis en question. Il faut donc soigneu ­
sement considérer les implications de telles retombées avant de décider si 
les TP seront des concurrents systématiques ou s’ils feront l’objet d’essais périodiques. Par ailleurs, le nombre d’animaux du groupe TP concurrent est réduit si cela se justifie du point de vue scientifique et si le laboratoire 
démontre, en s’appuyant sur ses propres données historiques, que l’on peut 
utiliser moins de souris (12).
 
15. Quoique le témoin positif doive être testé dans un véhicule déclenchant 
un effet constant (par exemple acétone/huile d’olive (4:1, v/v)], certaines situations réglementaires nécessitent aussi l’essai d’un véhicule moins 
courant (mélange cliniquement ou chimiquement pertinent) (24). Si le 
TP concurrent est testé avec un véhicule différent de celui de la subs ­
tance d’essai, il convient de mettre en place un essai témoin indépendant pour le véhicule du TP.
 
16. Lorsqu’il s’agit d’évaluer des substances d’essai appartenant à une classe 
chimique particulière ou donnant des résultats situés dans une certaine 
fourchette, des substances étalons peuvent s’avérer utiles pour montrer que la méthode d’essai fonctionne correctement et permet de détecter le pouvoir de sensibilisation cutanée de ces types de substances. Les subs ­
tances étalons présentent les propriétés suivantes:
 
— similitude structurale et fonctionnelle avec la catégorie des substances 
d’essai à tester,  
— caractéristiques physiques et chimiques connues,  
— données connues provenant de l’ELGL,  
— données connues provenant d’autres modèles animaux et/ou de l’être 
humain.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 606
 
MODE OPÉRATOIRE  
Nombre d’animaux et doses  
17. On utilise au moins quatre animaux par groupe de dose, et un minimum de 
trois concentrations de la substance d’essai, ainsi qu’un groupe témoin 
négatif concurrent ne recevant que le véhicule de cette substance d’essai et un témoin positif (concurrent ou récent selon les pratiques du laboratoire, voir paragraphes 11-14). On peut envisager de tester différentes doses du 
témoin positif, en particulier quand celui-ci ne fait l’objet que d’essais 
périodiques. Mis à part l’absence de traitement par la substance d’essai, les animaux des groupes témoins sont manipulés et traités de la même manière que les animaux des groupes d’essai.
 
18. La sélection des doses et du véhicule suit les recommandations données 
dans les références (3) et (5). Des doses successives sont normalement choisies dans une série de concentrations appropriée telle que 100 %, 
50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. Le choix de la série 
utilisée fait l’objet d’une justification scientifique. Le cas échéant, toutes les informations existantes d’ordre toxicologique (par exemple sur la toxi ­
cité aiguë et l’irritation cutanée), structural et physico-chimique sur la subs ­
tance d’essai en question (et/ou des analogues de structure) sont prises en 
compte pour choisir les trois concentrations successives de manière que la plus élevée d’entre elles offre une exposition maximale tout en évitant la toxicité systémique et/ou une irritation cutanée locale excessive (3) (25). En 
l’absence de telles informations, un essai préliminaire peut s’avérer néces ­
saire (voir paragraphes 21-24).
 
19. Le véhicule ne doit pas perturber ou introduire un biais dans les résultats du 
test. Il est choisi de manière à optimiser la solubilité pour obtenir la concen ­
tration la plus élevée possible dans la préparation d’une solution/suspension adaptée à l’application de la substance d’essai. Les véhicules recommandés sont le mélange acétone/huile d’olive (4:1, v/v), le N,N-diméthylformamide, 
la méthyléthylcétone, le propylène glycol et le diméthylsulfoxyde (19) mais 
d’autres véhicules pourront également être utilisés à condition que ce choix soit suffisamment étayé sur le plan scientifique. Certaines situations récla ­
meront un témoin supplémentaire, à savoir un solvant qui se justifie sur le 
plan clinique ou le mélange dans lequel la substance d’essai est commer ­
cialisée. L’expérimentateur veillera tout particulièrement à ce que les subs ­
tances d’essai hydrophiles soient incorporées à un véhicule qui mouille la peau et ne ruisselle pas immédiatement, ce qui peut nécessiter l’ajout de 
solubilisants appropriés (par exemple Pluronic® L92 à 1 %). Il convient 
donc d’éviter les véhicules totalement aqueux.
 
20. Le traitement des ganglions lymphatiques de chaque souris permet d’évaluer 
la variabilité entre individus et de comparer statistiquement les réponses 
induites par la substance d’essai et par le véhicule témoin (voir paragraphe 35). En outre, il est envisageable de réduire le nombre d’animaux du groupe TP en se fondant sur des données individuelles (12). Du reste, certaines 
autorités réglementaires exigent la collecte de données pour chaque animal. 
D’autres autorités sont toutefois susceptibles d’accepter des données par groupe d’animaux, auquel cas le choix d’un relevé des résultats par animal ou par groupe est laissé à la discrétion des expérimentateurs.
 
Essai préliminaire  
21. En l’absence d’informations permettant d’estimer la concentration d’essai 
maximale (voir paragraphe 18), il convient d’effectuer un essai préliminaire afin de déterminer le niveau des doses adaptées à l’ELGL. Cet essai préli ­
minaire aide à quantifier la dose maximale à mettre en œuvre dans l’ELGL 
lorsqu’on ne dispose pas d’informations sur la concentration induisant une toxicité systémique (voir paragraphe 24) et/ou une irritation cutanée locale excessive (voir paragraphe 23). Cette concentration maximum de la subs ­
tance d’essai est de 100 % pour les liquides, ou la plus élevée possible pour 
les solides et suspensions.
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22. Les conditions de l’essai préliminaire sont les mêmes que celles de l’ELGL, 
à ceci près qu’il n’y a pas d’évaluation de la prolifération dans les ganglions 
lymphatiques et que l’on peut inclure moins d’animaux par groupe de dose. En effet, on suggère d’utiliser seulement un à deux individus par groupe de dose. Il convient d’examiner toutes les souris quotidiennement afin de 
déceler d’éventuels signes cliniques de toxicité systémique ou d’irritation 
locale sur le site d’application. Les poids corporels sont consignés préala ­
blement à l’essai et juste avant la fin (sixième jour). On examine les deux oreilles de chaque souris pour détecter la présence d’un éventuel érythème, 
le résultat étant noté conformément à l’échelle figurant dans le tableau 1 
(25). L’épaisseur de l’oreille est mesurée à l’aide d’une jauge d’épaisseur (par exemple micromètre numérique ou jauge d’épaisseur Peacock Dial) le premier jour (avant toute application), le troisième jour (environ 48 heures 
après la première dose) et le sixième jour. De plus, le sixième jour, cette 
épaisseur peut être déterminée à partir du poids d’un échantillon d’oreille, prélevé après l’euthanasie des animaux. Les irritations cutanées locales excessives se traduisent par une cotation de l’érythème ≥ 3 et/ou un épais ­
sissement de l’oreille d’au moins 25 %, quel que soit le jour de la mesure 
(26) (27). La dose maximale choisie pour l’ELGL principal est la dose immédiatement inférieure dans la série de concentrations utilisée pour l’essai préliminaire (voir paragraphe 18) qui n’induit pas une toxicité 
systémique et/ou une irritation cutanée locale excessive.
 
Tableau 1  
Cotation de l’érythème  
Observation Résultat  
Pas d’érythème 0 
Érythème très léger (à peine perceptible) 1 
Érythème bien défini 2 
Érythème modéré à grave 3 Érythème grave (rouge violacé) à formation d’escarre empê ­
chant la cotation de l’érythème 4
 
23. Outre un épaississement de l’oreille de 25 % (26) (27), toute augmentation 
statistiquement significative de l’épaisseur de l’oreille chez les souris trai ­
tées par rapport aux individus témoins permet aussi d’identifier les produits irritants dans l’ELGL (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Cependant, les augmentations statistiquement significatives inférieures à 25 % ne sont pas 
systématiquement associées à une irritation excessive (30) (32) (33) (34).
 
24. Les observations cliniques suivantes peuvent indiquer une toxicité 
systémique (35) (36) dans le cadre d’une évaluation intégrée, et ainsi 
permettre d’estimer la dose maximale à utiliser dans l’ELGL principal: modifications des fonctions nerveuses (par exemple, piloérection, ataxie, tremblements et convulsions); changements du comportement (par exemple, 
agressivité, activités de toilettage modifiées, changement marqué d’intensité 
de l’activité); troubles respiratoires (en termes de fréquence et d’intensité de la respiration, sous forme de dyspnée, halètements ou râles), et modifica ­
tions de la consommation d’aliments et d’eau. En outre, l’évaluation 
prendra en compte les éléments suivants: signes de léthargie et/ou 
absence de réceptivité, et tout signe clinique autre qu’une douleur ou un stress légers et passagers; baisse du poids corporel > 5 % entre le premier et le sixième jour; mortalité. Les animaux moribonds ou présentant des signes 
de souffrance manifeste ou de détresse sévère et persistante sont euthanasiés 
(37).
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Programme expérimental de l’étude principale  
25. Le programme expérimental se déroule comme suit:  
— Premier jour:  Mesurer et consigner le poids de chaque animal ainsi que 
toute observation clinique. Appliquer 25 μl d’une dilution adaptée de la 
substance d’essai, du véhicule seul ou du TP (concurrent ou récent selon les pratiques du laboratoire, voir paragraphes 11-15) au dos de chaque oreille.
 
— Deuxième et troisième jours:  Répéter la procédure d’application prati ­
quée le premier jour.  
— Quatrième et cinquième jours:  Aucun traitement.  
— Sixième jour:  Noter le poids de chaque animal. Injecter 250 μl d’une 
solution tampon phosphate stérile [phosphate-buffered saline] (PBS) contenant 20 μCi (7,4 × 10
 5 Bq) de (  3 H)-méthylthymidine dans la 
veine caudale de toutes les souris traitées et témoins. Il est également 
possible d’injecter 250 μL de PBS stérile contenant 2 μCi (7,4 × 10  4 
Bq) de  125 I-iododésoxyuridine et de la fluorodésoxyuridine à 10  -5 M 
dans la veine caudale de toutes les souris. Euthanasier les animaux cinq 
heures (5 h) plus tard. Exciser les ganglions lymphatiques auriculaires de drainage de chaque oreille de souris, puis placer ceux d’un même individu dans une solution de PBS (approche par animal), ou placer 
tous les ganglions lymphatiques d’un même groupe de traitement dans 
la même solution PBS (approche par groupe). Les détails et diagrammes relatifs à l’identification et à la dissection des ganglions lymphatiques sont présentés dans la référence (12). Pour approfondir le suivi de la 
réponse cutanée locale dans l’essai principal, des paramètres supplémen ­
taires comme la cotation de l’érythème auriculaire ou les mesures de l’épaisseur de l’oreille (obtenues à l’aide d’une jauge d’épaisseur ou par pesée d’échantillons d’oreilles après nécropsie) peuvent être inclus dans 
le protocole d’étude.
 
Préparation des suspensions cellulaires  
26. Pour l’approche par animal comme pour l’approche par groupe, les cellules 
de ganglions lymphatiques (CGL) excisés bilatéralement sont dispersées par le biais d’une désagrégation mécanique douce à travers un tamis en acier 
inoxydable à 200 microns, ou de toute autre technique acceptable pour 
obtenir une suspension unicellulaire. Les CGL sont lavées deux fois avec un excès de PBS et l’ADN précipite par l’action d’acide trichloracétique à 5 % à 4 °C pendant 18 heures (3). Les granules sont soit remis en suspen ­
sion dans 1 mL d’acide trichloracétique et transférés dans des flacons à 
scintillation contenant 10 mL de scintillateur liquide pour le comptage des
 
3 H, soit transférés directement dans des tubes de comptage gamma pour le 
comptage de  125 I. 
Détermination de la prolifération cellulaire (radioactivité incorporée)  
27. L’incorporation de la  3 H-méthylthymidine se mesure par comptage à 
β-scintillation en désintégrations par minute (DPM). L’incorporation de  
125 I-iododésoxyuridine, mesurée par comptage de  125 I, s’exprime également 
en DPM. En fonction de l’approche adoptée, l’incorporation s’exprimera en 
DPM/souris (approche par animal) ou en DPM/groupe de traitement 
(approche par groupe).  
ELGL simplifié (ELGLs)  
28. Si la réglementation demande de confirmer les prévisions négatives quant 
au pouvoir de sensibilisation cutanée, il est possible de mettre en œuvre l’ELGLs (16) (17) (18), qui requiert moins d’animaux, à condition de rester 
en conformité avec toutes les autres dispositions du protocole ELGL décrit 
dans la présente méthode d’essai. Tout recours à l’approche ELGL simpli ­
fiée doit être préalablement justifié, avec le détail des raisons scientifiques étayant ce choix. Si l’ELGLs donne une réponse positive ou équivoque, des 
essais supplémentaires peuvent s’avérer nécessaires pour interpréter ou 
clarifier le résultat.
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29. La seule différence entre les méthodes ELGL et ELGLs est la réduction 
du nombre de groupes de dose; c’est pourquoi l’ELGLs ne livre pas 
d’informations sur la relation dose-effet. Par voie de conséquence, l’ELGLs ne saurait être appliqué lorsque des données sont nécessaires en la matière. Tout comme pour la méthode ELGL utilisant plusieurs 
doses, la concentration maximale de substance d’essai choisie pour 
l’ELGLs correspond à la concentration maximale n’induisant pas de toxi ­
cité systémique manifeste et/ou d’irritation cutanée locale excessive chez la souris (voir paragraphe 18).
 
OBSERVATIONS  
Observations cliniques  
30. Au moins une fois par jour, l’expérimentateur examinera attentivement 
chaque souris afin de déceler d’éventuels signes cliniques, se traduisant par une irritation locale sur le site d’application ou une toxicité systémique. Toutes les observations sont systématiquement consignées pour chaque 
souris. Les programmes de suivi intègrent les critères permettant d’identifier 
rapidement les souris montrant des signes de toxicité systémique, d’irritation cutanée locale excessive ou de corrosion de la peau, afin qu’elles puissent être euthanasiées (37).
 
Poids corporels  
31. Comme indiqué au paragraphe 25, le poids corporel de chaque animal est 
mesuré au début de l’essai et au moment programmé pour l’euthanasie.  
CALCUL DES RÉSULTATS  
32. Les résultats obtenus pour chaque groupe de traitement sont exprimés par 
un indice de stimulation (IS). Pour l’approche par animal, cet IS s’obtient 
en divisant la moyenne des DPM/souris dans chaque groupe ayant reçu la substance d’essai ou le TP par la moyenne des DPM/souris dans le groupe témoin traité avec le solvant/véhicule. L’indice de stimulation moyen pour 
les témoins traités avec le véhicule est alors égal à 1. Pour l’approche par 
groupe, l’IS s’obtient en divisant l’incorporation du produit radiomarqué dans chaque groupe de traitement par l’incorporation observée dans le groupe témoin traité avec le solvant/véhicule: on obtient alors un IS moyen.
 
33. Un résultat est considéré comme positif lorsque l’indice de stimulation est 
supérieur ou égal à 3. Toutefois, l’intensité de la relation dose-effet, la signification statistique et la cohérence des réponses obtenues avec le solvant/véhicule et le TP constituent autant de facteurs pour décider si un 
résultat limite est jugé positif (4) (5) (6).
 
34. Pour clarifier les résultats, diverses propriétés de la substance d’essai sont 
prises en compte, parmi lesquelles une éventuelle analogie structurelle avec des sensibilisants cutanés connus, le déclenchement d’une irritation cutanée 
excessive chez la souris, et la nature de la relation dose-effet observée. Ces 
considérations, ainsi que d’autres, sont examinées en détail dans un autre document (7).
 
35. Le relevé des données radioactives pour chaque souris permet de déterminer 
statistiquement l’existence et l’importance d’une relation dose-effet dans les 
résultats. Tout traitement statistique peut comprendre une évaluation de la relation dose-effet ainsi que des comparaisons des groupes d’essai convena ­
blement adaptées (par exemple comparaison par paires des groupes de dose 
avec le groupe solvant/véhicule témoin concurrent). Les analyses statis ­
tiques peuvent notamment inclure une régression linéaire ou le test de Williams pour étudier la fonction dose-effet, ainsi que le test de Dunnett pour les comparaisons par paires. Pour choisir une méthode appropriée 
d’analyse statistique, le chercheur doit être conscient du risque d’inégalité 
des variances et d’autres problèmes connexes qui pourraient nécessiter une transformation des données ou une analyse statistique non paramétrique. Quoi qu’il en soit, l’investigateur peut être amené à calculer les indices 
de stimulation et effectuer les traitements statistiques avec ou sans certains 
points de données (parfois appelés «valeurs aberrantes»).
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RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
36. Les résultats sont récapitulés sous forme de tableau. Avec l’approche par 
animal, indiquer les DPM relevées pour chaque individu, la moyenne des 
DPM/souris du groupe, la marge d’erreur associée (par exemple, écart type, erreur type de la moyenne) et l’indice de stimulation moyen pour chaque groupe de dose par rapport au groupe solvant/véhicule témoin concurrent. 
Avec l’approche par groupe, indiquer la moyenne et la médiane des DPM 
ainsi que la moyenne des IS de chaque groupe de dose par rapport au groupe solvant/véhicule témoin concurrent.
 
Rapport d’essai  
37. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:  
Substance d’essai et substances témoins:  
— données d’identification (par exemple numéro CAS et numéros CE, le 
cas échéant; source; pureté; impuretés connues; numéro de lot),  
— état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple volatilité, 
stabilité, solubilité),  
— s’il s’agit d’un mélange: composition et pourcentages relatifs des consti ­
tuants.  
Solvant/véhicule:  
— données d’identification (pureté; concentration, s’il y a lieu; volume 
utilisé),  
— justification du choix du véhicule.  
Animaux d’essai:  
— source des souris CBA,  
— état microbiologique des animaux, s’il est connu,  
— nombre et âge des animaux,  
— source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.  
Conditions d’essai:  
— détails concernant la préparation et l’application de la substance d’essai,  
— justification du choix des doses (y compris résultats de l’essai prélimi ­
naire, le cas échéant),  
— concentrations utilisées pour le véhicule et la substance d’essai, et quan ­
tité totale de substance d’essai appliquée,  
— détails concernant la nourriture et la qualité de l’eau (y compris type et 
source de nourriture, et provenance de l’eau),  
— détails concernant le programme de traitement et d’échantillonnage,  
— méthodes de détermination de la toxicité,  
— critères de décision concernant les études positives ou négatives,  
— détails concernant tout écart par rapport au protocole et explication de la 
manière dont l’écart modifie la conception de l’essai et ses résultats.  
Vérification de la fiabilité:  
— résumé des résultats du dernier test de fiabilité, notamment informations 
sur la substance d’essai, sa concentration et le véhicule utilisé,  
— résultats du laboratoire pour le TP concurrent et/ou historique ainsi que 
pour le TN concurrent,  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 611
 
— en l’absence d’un TP concurrent, date et rapport de laboratoire du 
dernier essai périodique du TP, et rapport détaillant les résultats 
historiques du TP spécifiques au laboratoire de manière à justifier pour ­
quoi aucun TP concurrent n’a été mis en œuvre.  
Résultats:  
— poids corporel de chaque souris au début du traitement et au moment 
programmé pour l’euthanasie; moyenne et marge d’erreur associée 
(par exemple, écart type, erreur type de la moyenne) pour chaque groupe de dose,
 
— moment du déclenchement des effets et signes de toxicité, y compris 
l’irritation cutanée sur le site d’administration, pour chaque animal,  
— tableau des DPM et IS pour chaque souris (approche par animal) ou 
moyenne et médiane des DPM et IS (approche par groupe) pour chaque groupe de traitement,
 
— moyenne et marge d’erreur associée (par exemple, écart type, erreur 
type de la moyenne) des DPM/souris pour chaque groupe de dose, et 
résultats de l’analyse des valeurs aberrantes au sein de chacun d’eux en cas d’approche par animal,
 
— indices de stimulation obtenus, et détermination appropriée de la varia ­
bilité prenant en compte les variations entre animaux à la fois dans les 
groupes ayant reçu la substance d’essai et dans les groupes témoins, en 
cas d’approche par groupe,  
— relation dose-effet,  
— analyses statistiques, s’il y a lieu.  
Discussion des résultats:  
— bref commentaire sur les résultats, analyse de la relation dose-effet et 
analyses statistiques, s’il y a lieu, et conclusion quant au fait de savoir si la substance d’essai doit être considérée comme un sensibilisant cutané.
 
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Appendice 1  
Normes de performance pour l’évaluation des méthodes d’ELGL similaires 
ou modifiées proposées pour les essais de sensibilisation cutanée  
INTRODUCTION  
1. L’objectif des normes de performance est d’indiquer sur quelles bases 
évaluer la précision et la fiabilité de nouvelles méthodes d’essai vis-à-vis 
d’objectifs définis, que ces méthodes soient protégées ou non (par des droits d’auteur, une marque déposée ou un enregistrement). Conçues à partir de méthodes d’essai validées et acceptées, ces normes peuvent également servir 
à évaluer la précision et la fiabilité de méthodes analogues (aussi appelées 
«répliques d’essais») fondées sur des principes scientifiques similaires et permettant de quantifier ou prévoir le même effet biologique ou toxique (14).
 
2. Avant d’adopter des méthodes modifiées, c’est-à-dire des améliorations 
proposées d’une méthode d’essai approuvée, il convient de déterminer 
quel peut être l’effet des modifications envisagées sur les performances de l’essai, et dans quelle mesure ces modifications influent sur les infor ­
mations disponibles pour les autres éléments du processus de validation. 
En fonction du nombre et de la nature des changements proposés, des 
données générées et des documents justificatifs associés, le processus de validation est le même que pour un nouvel essai ou, le cas échéant, limité à une évaluation de la fiabilité et de la pertinence sur la base des normes 
de performance établies (14).
 
3. La fiabilité et la précision des méthodes similaires ou modifiées proposées 
dans la présente méthode d’essai sont évaluées à l’aide de produits 
chimiques représentant l’éventail complet des résultats de l’ELGL. Afin 
d’éviter toute utilisation injustifiée d’animaux, il est fortement conseillé aux concepteurs de modèles de contacter les autorités appropriées avant d’entamer les études de validation conformément aux normes de perfor ­
mance et orientations fournies dans la présente méthode d’essai.
 
4. Ces normes de performance, qui sont fondées sur les normes harmonisées 
émanant du comité de coordination interagences pour la validation des méthodes alternatives (ICCVAM) aux États-Unis, du Centre européen pour 
la validation des méthodes alternatives (ECVAM) et du Centre japonais pour 
la validation des méthodes alternatives (JaCVAM) (12), permettent d’évaluer la validité de versions de l’ELGL similaires ou modifiées. Les normes de performance comprennent les éléments essentiels de la méthode d’essai, les 
produits chimiques de référence recommandés, et les minima requis en 
termes de précision et de fiabilité.
 
I. Éléments essentiels de la méthode d’essai  
5. Pour s’assurer qu’une méthode d’ELGL similaire ou modifiée est fonction ­
nellement et structurellement similaire à l’ELGL et qu’elle mesure le même 
effet biologique, il convient d’inclure les éléments suivants dans le protocole d’essai:
 
— la substance d’essai est appliquée localement sur les deux oreilles de la 
souris,  
— la prolifération des lymphocytes est quantifiée dans les ganglions 
lymphatiques qui drainent le site de l’application de la substance d’essai,  
— la prolifération des lymphocytes est mesurée pendant la phase d’induc ­
tion de la sensibilisation cutanée,  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 616
 
— la dose maximale choisie pour la substance d’essai est la concentration 
maximale ne provoquant pas de toxicité systémique et/ou d’irritation 
cutanée locale excessive chez la souris. Pour les produits chimiques de référence positifs, la dose maximale doit être supérieure ou égale aux CE3 de l’ELGL pour les produits chimiques de référence correspondants 
(voir tableau 1) sans pour autant induire de toxicité systémique et/ou 
d’irritation cutanée locale excessive chez la souris,
 
— chaque étude comprend un véhicule témoin concurrent et, s’il y a lieu, un 
témoin positif concurrent,  
— chaque groupe de dose comprend au moins quatre animaux,  
— les données peuvent être collectées par animal ou par groupe d’animaux.  
En cas de non-respect d’un de ces critères, les présentes normes de perfor ­
mance ne permettent pas de valider les méthodes similaires ou modifiées.  
II. Liste minimale de produits chimiques de référence  
6. On trouve dans les normes de performance harmonisées émanant du Comité 
de coordination interagences pour la validation des méthodes alternatives (ICCVAM) aux États-Unis, du Centre européen pour la valida ­
tion des méthodes alternatives (ECVAM) et du Centre japonais pour la 
validation des méthodes alternatives (JaCVAM) (12) un minimum de 18 produits chimiques de référence à utiliser, auxquelles s’ajoutent quatre autres substances de référence facultatives. Ces quatre substances donnent 
des faux positifs ou faux négatifs avec l’ELGL, ce qui n’arrive pas avec les 
essais sur l’homme ou le cobaye (chapitre B.6 ou LD 406 de l’OCDE) (13), et permet de démontrer une performance supérieure ou égale à celle de l’ELGL. Le choix de ces produits chimiques s’appuie sur les critères 
suivants:
 
— la liste de produits chimiques de référence représente, d’une part, les 
types de substances dont on teste généralement le pouvoir de sensibili ­
sation cutanée et, d’autre part, l’éventail des effets détectables ou prévi ­
sibles par l’ELGL,  
— ces substances présentent des structures chimiques bien définies,  
— des données ELGL provenant d’essais sur cobayes (d’après le 
chapitre B.6, LD 406 de l’OCDE) (13) et (si possible) sur l’homme sont disponibles pour chaque substance, et
 
— ces substances sont disponibles dans le commerce.  
La liste des produits chimiques de référence recommandés est présentée dans 
le tableau 1. Les études utilisant les produits chimiques de référence 
proposés sont mises en œuvre avec le véhicule correspondant indiqué sur la liste du tableau 1. Si l’une des substances de référence de la liste n’est pas disponible, il est possible de recourir à d’autres substances répondant aux 
critères de sélection susmentionnés, en justifiant la démarche de manière 
appropriée.
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 ▼M3 
Tableau 1  
Produits chimiques de référence recommandés pour les normes de performance ELGL  
Numéro Produit chimique (  1 ) N  o CAS État Véh (  2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x CE3 - 2,0 x 
CE3 Fourchette 
des CE3 
mesurées ELGL vs. 
cobaye ELGL vs. 
homme  
1 5-chloro-2-méthyl-4-isothiazolin-3-one (CMI)/2- 
méthyl-4-isothiazolin-3-one (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Liq DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sol AHO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-phénylènediamine 106-50-3 Sol AHO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 4 chlorure de cobalt 7646-79-9 Sol DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 isoeugénol 97-54-1 Liq AHO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 
6 2-mercaptobenzothiazole 149-30-4 Sol DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 
7 citral 5392-40-5 Liq AHO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Liq AHO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 9 eugénol 97-53-0 Liq AHO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 benzoate de phényle 93-99-2 Sol AHO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 alcool cinnamique 104-54-1 Sol AHO 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 
12 imidazolidinylurée 39236-46-9 Sol DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 
13 méthacrylate de méthyle 80-62-6 Liq AHO 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 14 chlorobenzène 108-90-7 Liq AHO 25 1 n.a. n.a. –/– –/ (*) 15 isopropanol 67-63-0 Liq AHO 50 1 n.a. n.a. –/– –/+
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 ▼M3 
Numéro Produit chimique (  1 ) N  o CAS État Véh (  2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x CE3 - 2,0 x 
CE3 Fourchette 
des CE3 
mesurées ELGL vs. 
cobaye ELGL vs. 
homme  
16 acide lactique 50-21-5 Liq DMSO 25 1 n.a. n.a. –/– –/ (*) 
17 salicylate de méthyle 119-36-8 Liq AHO 20 9 n.a. n.a. –/– –/– 18 acide salicylique 69-72-7 Sol AHO 25 1 n.a. n.a. –/– –/– 
Substances facultatives démontrant une amélioration des performances par rapport à l’ELGL 
19 sodium lauryl sulfate 151-21-3 Sol DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 diméthacrylate d’éthylène glycol 97-90-5 Liq MEC 28 1 14-56 NC +/– +/+ 
21 xylène 1330-20-7 Liq AHO 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 
22 chlorure de nickel 7718-54-9 Sol DMSO 5 2 n.a. n.a. –/+ –/+
 
Abréviations: AHO = acétone/huile d’olive (4:1, v/v); N  o CAS = Numéro attribué par le Chemical Abstracts Service; DMF = N,N-diméthylformamide; DMSO = diméthylsulfoxyde; DNCB = 2,4-dini trochlorobenzène; CE3 = 
concentration estimée nécessaire pour produire un indice de stimulation de 3; cobaye = résultats obtenus sur cobayes (d’après B .6 ou la LD 406 de l’OCDE) (13); HCA = hexyl cinnamaldéhyde; Liq = liquide; ELGL = résultats 
sur murins de l’essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques (d’après B.42 ou la LD 429 de l’OCDE) (1); MEC = méthylé thylcétone; n.a. = non applicable puisque l’indice de stimulation est inférieur à 3; NC = non 
calculée puisque les données proviennent d’une seule étude; Sol = solide; Véh = véhicule d’essai. 
(*) Supposé non sensibilisant chez l’homme, dans la mesure où: on ne repère aucun résultat d’essai clinique épicutané; le produ it n’est pas compris dans les kits de test épicutané des allergènes; on ne trouve aucun rapport de cas 
faisant état d’une sensibilisation chez l’homme. 
(**) Données sur cobayes indisponibles. 
( 1 ) Les produits chimiques sont préparés chaque jour à moins que les données concernant la stabilité ne démontrent qu’on peut les  stocker. 
( 2 ) En raison de l’impact éventuel des différents véhicules sur la performance de l’ELGL, il convient d’utiliser le véhicule reco mmandé pour chaque produit chimique de référence (24) (32). 
( 3 ) Il s’agit d’une valeur moyenne lorsque plusieurs CE3 sont disponibles. Pour les substances négatives (indice de stimulation <  3), la concentration maximale de l’essai est fournie. 
( 4 ) Nombre d’études ELGL dont découlent les données. 
( 5 ) Disponible dans le commerce sous forme de Kathon CG (N  o CAS 55965-84-9), un mélange de CMI et MI à 3:1. Les concentrations relatives de ces composés sont situées entre 1,1 % et 1,25 %  pour la CMI, 0,3 % et 
0,45 % pour la MI. Les composés inactifs sont des sels de magnésium (21,5 % à 24 %) et le nitrate de cuivre (0,15 % à 0,17 %), le reste de la formulation étant constitué de 74 % à 77 % d’eau. Le Kathon CG est 
disponible chez Sigma-Aldrich et Rohm and Haas (devenu Dow Chemical Corporation).
 III. Normes de fiabilité et de précision  
7. La précision d’une méthode d’ELGL similaire ou modifiée se doit d’égaler 
au moins les minima des normes ELGL dans le cadre d’une évaluation 
effectuée à l’aide des 18 produits chimiques de référence au minimum à utiliser. La méthode d’essai modifiée ou nouvelle devrait permettre de classer correctement les substances comme étant positives ou négatives. 
Cependant, elle ne devrait pas forcément permettre de classer comme il 
convient l’ensemble des 18 produits chimiques de référence au minimum à utiliser. Si, par exemple, l’un des sensibilisants légers est mal classé, l’essai pourra toutefois être considéré comme présentant des performances équiva ­
lentes à condition de fournir les raisons expliquant cette conclusion erronée, 
ainsi que des données supplémentaires pertinentes (par exemple des résultats corrects obtenus pour d’autres substances dont les propriétés physiques, chimiques et sensibilisantes sont analogues à celles du produit chimique 
de référence). Dans ces conditions, la validation d’une telle méthode 
d’ELGL modifiée ou nouvelle fera l’objet d’un examen au cas par cas.
 
Reproductibilité intralaboratoire  
8. La reproductibilité intralaboratoire d’une méthode d’ELGL modifiée ou 
nouvelle est déterminée à l’aide d’un sensibilisant bien caractérisé par 
ELGL. En conséquence, les normes de performance de l’ELGL s’appuient 
sur la variabilité des résultats obtenus lors d’essais répétés avec de l’hexyl cinnamaldéhyde (HCA). La reproductibilité intralaboratoire est évaluée par comparaison des concentrations estimées minimales (CEm) obtenues avec 
l’HCA lors de quatre essais répétés à intervalles d’une semaine au moins. 
Cette reproductibilité intralaboratoire est jugée acceptable lorsqu’un labora ­
toire parvient à obtenir des CEm situées entre 5 % et 20 % pour chaque essai avec l’HCA, ce qui correspond à 0,5-2,0 fois la CE3 moyenne spécifiée 
pour l’HCA (10 %) dans l’ELGL (voir tableau 1).
 
Reproductibilité interlaboratoires  
9. La reproductibilité interlaboratoires d’une méthode d’ELGL modifiée ou 
nouvelle est déterminée à l’aide de deux sensibilisants bien caractérisés par ELGL. Les normes ELGL s’appuient sur la variabilité des résultats 
d’essais effectués sur l’HCA et le 2,4-dinitrochlorobenzène (DNCB) dans 
différents laboratoires. Les CEm respectives découlent d’études individuelles menées dans au moins trois laboratoires séparés. La reproductibilité inter ­
laboratoires est jugée acceptable lorsque chaque laboratoire obtient des CEm 
situées entre 5 % et 20 % pour chaque essai avec l’HCA et entre 0,025 % et 
0,1 % pour le DNCB, ce qui correspond à 0,5-2,0 fois la CE3 moyenne spécifiée respectivement pour l’HCA (10 %) et le DCNB (0,05 %) dans l’ELGL (voir tableau 1).
 ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 620
 
Appendice 2  
Définitions  
Assurance qualité:  procédé de gestion dans lequel le respect des normes d’essai, 
des obligations du laboratoire et des procédures d’enregistrement des données, ainsi que la précision du transfert des données, sont évalués par des personnes 
indépendantes de celles qui réalisent les essais.
 
Concentration estimée minimale (CEm):  concentration estimée d’une substance 
d’essai nécessaire pour produire un indice de stimulation indiquant une réponse 
positive.  
Concentration estimée trois (CE3):  concentration estimée d’une substance d’essai 
nécessaire pour produire une réponse correspondant à un indice de stimulation égal à trois.
 
Faux négatif:  substance d’essai identifiée à tort comme négative ou inactive à 
l’issue de l’essai, alors qu’elle est en fait positive ou active (14).  
Faux positif:  substance d’essai identifiée à tort comme positive ou active à l’issue 
de l’essai, alors qu’elle est en fait négative ou inactive (14).  
Fiabilité:  mesure dans laquelle la mise en œuvre d’une méthode d’essai peut être 
reproduite au fil du temps par un même laboratoire ou par plusieurs laboratoires 
en utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité 
intralaboratoire et interlaboratoires (14).  
Indice de stimulation (IS):  paramètre d’évaluation du potentiel de sensibilisation 
cutanée d’une substance d’essai, calculé comme le quotient de la prolifération 
mesurée dans les groupes traités sur celle du groupe témoin concurrent recevant le véhicule.
 
Méthode d’essai protégée:  méthode d’essai dont la fabrication et la distribution 
sont protégées par des brevets, droits d’auteur, marques, etc.  
Méthode d’essai validée:  méthode d’essai ayant fait l’objet d’études de validation 
visant à déterminer sa pertinence (notamment sa précision) et sa fiabilité à des 
fins spécifiques. Il importe de noter que les performances d’une méthode d’essai 
validée peuvent être insuffisantes en termes de précision et de fiabilité pour qu’elle soit jugée acceptable pour les besoins envisagés (14).
 
Normes de performance:  normes, fondées sur une méthode d’essai validée, 
permettant d’évaluer la comparabilité d’une méthode d’essai proposée, structu ­
rellement et fonctionnellement similaire. Elles comprennent: i) les éléments essentiels de la méthode d’essai; ii) une liste minimale de produits chimiques 
de référence choisis parmi ceux utilisés pour démontrer les performances accep ­
tables de la méthode d’essai validée; et iii) les niveaux de précision et de fiabilité, similaires à ceux obtenus pour la méthode d’essai validée, que la méthode d’essai proposée doit présenter lorsqu’on l’évalue à l’aide des produits 
chimiques de référence de la liste minimale (14).
 
Pertinence:  description de la relation entre l’essai et l’effet étudié, et détermi ­
nation de son adéquation et de son utilité à des fins spécifiques. Elle définit 
le degré auquel l’essai mesure ou prédit correctement l’effet biologique d’in ­
térêt. La pertinence tient compte de la précision (concordance) d’une méthode d’essai (14).
 
Précision:  degré de conformité entre les résultats de la méthode d’essai et les 
valeurs de référence acceptées. Elle constitue une mesure de performance de la méthode d’essai et l’un des aspects de sa pertinence. Ce terme est souvent utilisé indifféremment à la place de «concordance» pour qualifier la proportion de 
résultats corrects d’une méthode d’essai (14).
 
Produits chimiques de référence:  produits chimiques choisis pour être utilisés 
dans le processus de validation, dont les réponses dans le système d’essai de référence in vitro ou in vivo ou sur l’espèce d’intérêt sont déjà connues. Ils 
doivent être représentatifs des classes de produits chimiques auxquelles il est 
prévu d’appliquer la méthode d’essai, et couvrir la gamme complète des réponses attendues des produits chimiques pour lesquels elle est conçue, qu’elles soient fortes, faibles ou négatives. Les différentes étapes du processus de validation, 
ainsi que différentes méthodes d’essai et utilisations d’essais, peuvent exiger des 
groupes de produits chimiques de référence différents (14).
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Réplique d’essai:  méthode d’essai structurellement et fonctionnellement similaire 
à une méthode de référence validée et acceptée. Une telle méthode d’essai peut 
éventuellement faire l’objet d’une validation accélérée. Synonyme de méthode d’essai similaire (14).
 
Reproductibilité interlaboratoires:  mesure du degré auquel différents laboratoires 
qualifiés qui emploient le même protocole et testent les mêmes substances d’essai 
peuvent produire des résultats similaires en termes de qualité et de quantité. La 
reproductibilité interlaboratoires est déterminée au cours des processus de préva ­
lidation et de validation, et indique dans quelle mesure un essai peut être trans ­
féré sans problème entre laboratoires. On parle aussi de reproductibilité entre 
laboratoires (14).  
Reproductibilité intralaboratoire:  détermination du degré auquel divers membres 
du personnel qualifié d’un même laboratoire réussissent à obtenir des résultats identiques en ayant recours à un protocole spécifique à des moments différents. On parle aussi de reproductibilité au sein du laboratoire (14).
 
Risque:  éventualité d’un effet indésirable sur la santé ou l’environnement. L’effet 
indésirable se manifeste uniquement lorsque le niveau d’exposition est suffisant.  
Sensibilisation cutanée:  processus immunologique résultant de l’exposition 
topique d’un sujet sensible à un allergène chimique inducteur, et qui se traduit par une réaction immunologique cutanée pouvant entraîner le développement 
d’une sensibilisation de contact.
 
Substance d’essai (également dénommée substance chimique d’essai):  toute subs ­
tance et tout mélange testés selon la présente méthode d’essai.  
Substance étalon:  substance sensibilisante ou non sensibilisante utilisée comme 
référence pour comparer les effets d’une substance d’essai. Une substance étalon 
doit posséder les propriétés suivantes: i) provenir d’une ou de plusieurs sources 
régulières et fiables; ii) présenter une similitude structurale et fonctionnelle avec la classe des substances testées; iii) posséder des caractéristiques physico-chimiques connues; iv) être accompagnée de données confirmant ses 
effets connus; et v) avoir une puissance connue dans l’intervalle de la réponse 
désirée.
 
Valeur aberrante:  une valeur aberrante est une valeur observée qui diffère nette ­
ment des autres valeurs dans un échantillon aléatoire d’une population.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 622
 
B.43.  ÉTUDE DE NEUROTOXICITÉ CHEZ LES RONGEURS  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 424 (1997) 
de l'OCDE.  
Cette méthode d'essai a été conçue dans le but de recueillir des 
données permettant de confirmer ou de mieux caractériser la neuro ­
toxicité potentielle d'une substance pour des animaux adultes. Elle 
peut être utilisée en association avec d'autres méthodes d'essai dans le cadre d'études de toxicité à dose répétée ou seule, en tant qu'étude indépendante. Il est recommandé de consulter le document d'orien ­
tation de l'OCDE sur les stratégies d'essais en matière de neurotoxi ­
cité (1). Cette recommandation est particulièrement importante lorsqu'on envisage de s'écarter des observations et des protocoles d'essai préconisés dans cette méthode. Le document d'orientation 
est également utile pour choisir un protocole d'essai adapté à un 
cas spécifique.
 
L'évaluation de la neurotoxicité développementale n'est pas l'objet de 
la présente méthode.  
1.1. INTRODUCTION  
Dans l'évaluation des propriétés toxiques d'un produit chimique, il 
est important de prendre en considération la possibilité d'effets 
neurotoxiques. La méthode d'essai concernant la toxicité systémique 
à dose répétée permet déjà un premier tri des substances potentiel ­
lement neurotoxiques. La présente méthode peut être utilisée pour obtenir des informations complémentaires sur les effets neuro ­
toxiques observés dans les études de toxicité systémique à dose 
répétée, et éventuellement pour confirmer ces effets. Cependant, la neurotoxicité potentielle de substances appartenant à certaines caté ­
gories pourra être évaluée de façon plus appropriée en appliquant 
directement la présente méthode, sans recueillir au préalable les indications qui peuvent être fournies par les études de toxicité systémique à dose répétée. Ce sera notamment le cas lorsque:
 
— des signes de neurotoxicité ou des lésions neuropathologiques 
sont observés dans des études de toxicité autres que des études de toxicité systémique à dose répétée, ou
 
— lorsque les substances présentent des similitudes de structure ou 
ont d'autres caractéristiques en commun avec des substances 
neurotoxiques connues.  
Cette méthode peut aussi être utile dans d'autres cas; voir référence 
(1) pour plus de détails.  
Cette méthode a été conçue de manière à pouvoir être adaptée, en 
fonction des besoins spécifiques, aussi bien pour confirmer la neuro ­
toxicité histopathologique d'une substance chimique ou sa neurotoxi ­
cité sur le plan du comportement que pour caractériser et quantifier 
les neurotoxiques.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 623
 
Autrefois, la neurotoxicité était assimilée à une forme de neuropathie 
englobant des lésions neuropathologiques ou des dysfonctionnements 
neurologiques tels que apoplexie, paralysie ou tremblements. Bien que la neuropathie soit une manifestation importante de la neurotoxi ­
cité, il apparaît aujourd'hui clairement qu'il existe de nombreux 
autres signes de toxicité pour le système nerveux (par exemple, 
perte de la coordination motrice, déficits sensoriels, diminution de la faculté d'apprentissage et de la mémoire) qui ne sont pas toujours mis en évidence par les études neuropathologiques ou autres.
 
La présente méthode d'essai de neurotoxicité vise à détecter, chez les 
rongeurs adultes, les effets importants sur le comportement et les effets neuropathologiques. Bien que des effets sur le comportement, 
même s'ils ne sont pas accompagnés de changements morpholo ­
giques, puissent révéler un impact néfaste sur l'organisme, les chan ­
gements de comportement ne sont pas tous spécifiques du système nerveux. Par conséquent, tout changement observé doit être évalué 
par rapport aux données histopathologiques, hématologiques ou 
biochimiques correspondantes et aux résultats d'autres études de toxi ­
cité systémique. Les essais préconisés par la présente méthode pour caractériser et quantifier les réponses neurotoxiques comprennent des 
procédures histopathologiques et des procédures spécifiquement 
axées sur le comportement, qui pourront être étayées par des études électrophysiologiques et/ou biochimiques (1) (2) (3) (4).
 
Les agents neurotoxiques peuvent agir sur différentes cibles dans le 
système nerveux, et cela par différents mécanismes. Comme il est impossible de concevoir une seule série d'essais permettant d'évaluer de manière approfondie le potentiel neurotoxique de toutes les subs ­
tances, il peut s'avérer nécessaire de mettre en œuvre d'autres essais 
in vivo ou in vitro spécifiques du type de neurotoxicité observé ou escompté.
 
La présente méthode d'essai peut également servir, en association 
avec le document d'orientation de l'OCDE sur les stratégies et les méthodes d'essais en matière de neurotoxicité, à concevoir des études destinées à mieux caractériser la relation dose-effet ou à en améliorer 
la sensibilité, en vue d'obtenir une meilleure estimation de la concen ­
tration sans effet nocif observé ou de mettre en évidence les dangers connus ou suspectés de la substance. On peut ainsi concevoir des études pour identifier et évaluer le ou les mécanisme(s) neuro ­
toxiques ou pour compléter des données déjà fournies par l'applica ­
tion de protocoles de base d'observations du comportement et d'ob ­
servations neuropathologiques. Lors de ces études, il est inutile de chercher à obtenir en double des données qui seraient de toute façon 
obtenues en suivant les protocoles préconisés par cette méthode, si 
ces données sont déjà disponibles et ne sont pas nécessaires pour l'interprétation des résultats de l'étude.
 
Les informations recueillies dans cette étude de neurotoxicité, qu'elle 
soit réalisée de façon indépendante ou couplée à d'autres études, permettent de:
 
— déterminer si les effets de la substance chimique sur le système 
nerveux sont permanents ou réversibles,  
— mieux caractériser les altérations du système nerveux qui sont 
liées à l'exposition à la substance et faciliter la compréhension 
du mécanisme sous-jacent,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 624
 
— déterminer les relations entre dose et effet et entre temps et effet 
afin de pouvoir estimer la concentration sans effet nocif observé 
(laquelle pourra servir à établir les critères de sécurité de la substance).
 
Dans cette méthode, la substance d'essai est administrée par voie 
orale. Si d'autres voies, comme la voie dermique ou l'inhalation, 
paraissent plus appropriées, des modifications des procédures recom ­
mandées s'imposent. Le choix de la voie d'administration est dicté par les circonstances de l'exposition humaine et par les informations 
toxicologiques ou cinétiques disponibles.
 
1.2. DÉFINITIONS  
Effet nocif : toute altération par rapport à une situation de référence, 
qui est due au traitement et qui diminue l'aptitude d'un organisme à survivre, à se reproduire ou à s'adapter à l'environnement.
 
Dose : la quantité de substance d'essai administrée. La dose s'exprime 
en poids (g, mg) de substance d'essai ou en poids de substance d'essai par unité de poids de l'animal d'expérience (par exemple mg/kg) ou en concentration dans le régime (ppm).
 
Dosage : un terme général qui comprend la dose, la fréquence et la 
durée de l'administration.  
Neurotoxicité : une altération de la structure ou de la fonction du 
système nerveux qui est la conséquence d'une exposition à un agent 
chimique, biologique ou physique.  
Agent neurotoxique : tout agent chimique, biologique ou physique 
capable d'induire une neurotoxicité.  
CSENO : concentration maximale dans effet nocif observé, c'est-à- 
dire la dose la plus élevée à laquelle aucun effet nocif imputable au 
traitement n'est observé.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance à tester est administrée par voie orale à différents 
niveaux de dose à plusieurs groupes de rongeurs. L'administration 
se fait généralement à doses répétées sur une période qui peut être de 
28 jours, de 90 jours (étude subchronique) ou d'une année ou plus (étude chronique). Les procédures décrites dans cette méthode peuvent également être appliquées dans le cas d'une étude de neuro ­
toxicité aiguë. Les animaux sont soumis à l'essai afin de détecter ou 
de caractériser des anomalies de comportement ou d'ordre neurolo ­
gique. Au cours de chaque période d'observation, différents aspects du comportement qui pourraient être indicatifs d'une atteinte neuro ­
toxique sont évalués. À la fin de l'essai, une partie des animaux de 
chaque groupe et de chaque sexe sont perfusés in situ et des coupes du cerveau, de la moelle épinière et des nerfs périphériques sont préparées et examinées.
 
Lorsque l'étude est conduite de façon indépendante pour dépister une 
neurotoxicité ou caractériser des effets neurotoxiques, les animaux de chaque groupe qui ne sont pas utilisés pour la perfusion et l'examen histopathologique (voir tableau 1) peuvent servir pour des examens 
du comportement et des examens neuropathologiques, neurochi ­
miques ou électrophysiologiques qui permettent de compléter les données recueillies dans les observations de base préconisées par la présente méthode (1). Ces examens complémentaires peuvent 
être particulièrement utiles lorsque des observations empiriques ou 
des effets escomptés laissent prévoir un type spécifique de neuro ­
toxicité ou une cible spécifique pour cette neurotoxicité. Une autre possibilité est d'utiliser les animaux restants dans des évaluations 
telles que celles qui sont préconisées par les méthodes d'essai de 
toxicité à doses répétées chez les rongeurs.
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Lorsque les procédures de la présente méthode d'essai sont combi ­
nées avec celles d'autres méthodes, il faut prévoir un nombre suffi ­
sant d'animaux pour pouvoir effectuer les observations requises par les deux études.
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Choix de l'espèce animale  
Le rat est l'espèce préférée, mais d'autres espèces de rongeurs 
peuvent être utilisées moyennant justification du choix. Il convient 
de recourir aux souches couramment utilisées en laboratoire. Les animaux doivent être adultes, jeunes et sains. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. L'administration des doses doit 
débuter aussitôt après le sevrage, de préférence avant que les 
animaux n'atteignent l'âge de six semaines et en tout état de cause avant neuf semaines. Cependant, lorsque la présente étude est couplée à d'autres études, cette limite d'âge peut faire l'objet d'un 
ajustement. Au début de l'étude, les variations de poids entre 
animaux ne doivent pas dépasser plus ou moins 20 % du poids moyen des animaux du même sexe. Si une étude de toxicité orale à dose répétée de faible durée est réalisée en tant qu'essai prélimi ­
naire avant une étude à long terme, il faut utiliser des animaux de 
même souche et de même provenance dans les deux études.
 
1.4.2.  Conditions d'hébergement et d'alimentation  
La température du local des animaux d'expérience doit être de 22  o C 
(± 3  o C). L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et rester 
de préférence inférieure à 70 %, mais en dehors des heures de 
nettoyage du local, on s'efforcera de maintenir le taux d'humidité 
autour de 50 à 60 %. On appliquera un éclairage artificiel alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les bruits forts inter ­
mittents doivent être réduits au minimum. Pour l'alimentation des 
animaux, on pourra utiliser la nourriture classique de laboratoire avec de l'eau potable à satiété. Le choix du régime peut être influencé par la nécessité d'assurer un mélange convenable de la 
substance d'essai lorsqu'elle est administrée dans la nourriture. Les 
animaux peuvent être placés dans des cages soit individuellement, soit par petits groupes du même sexe.
 
1.4.3.  Préparation des animaux  
Des animaux jeunes et sains sont choisis au hasard pour être répartis 
entre les groupes de contrôle et de traitement. Les cages sont 
disposées de manière à minimiser les effets possibles dus à l'agen ­
cement des cages. Les animaux sont marqués individuellement afin de permettre leur identification. Ils sont maintenus dans les cages pendant cinq jours au moins avant le début de l'étude pour leur 
permettre de s'acclimater aux conditions du laboratoire.
 
1.4.4.  Voies d'administration et préparation des doses  
Dans cette méthode, la substance d'essai est administrée par voie 
orale. La substance à tester peut être administrée par gavage ou en capsules ou incorporée dans la nourriture ou l'eau de boisson. D'au ­
tres voies d'administration (par exemple voie dermique ou inhalation) 
peuvent être utilisées, mais nécessiteront le cas échéant des modifi ­
cations du mode opératoire. Le choix de la voie d'administration est dicté par les circonstances de l'exposition humaine et par les infor ­
mations toxicologiques ou cinétiques disponibles. Le choix de la 
voie d'administration ainsi que les éventuelles modifications du 
mode opératoire doivent être justifiés.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 626
 
Si nécessaire, la substance d'essai peut être dissoute ou mise en 
suspension dans un véhicule approprié. Il est recommandé de privi ­
légier les solutions ou suspensions aqueuses. À défaut, on peut utiliser une solution dans l'huile (huile de maïs, par exemple) et, en dernier recours, une solution dans d'autres véhicules. Lorsque le 
véhicule n'est pas aqueux, il faut en connaître les propriétés toxiques. 
D'autres caractéristiques du véhicule peuvent avoir de l'importance, notamment des éventuels effets sur l'absorption, la distribution, le métabolisme ou la rétention de la substance d'essai, pouvant agir 
sur les propriétés toxiques de celle-ci, et des effets sur la consom ­
mation de nourriture ou d'eau ou sur l'état nutritionnel des animaux.
 
1.5. MODE OPÉRATOIRE  
1.5.1.  Nombre et sexe des animaux  
Lorsqu'il s'agit d'une étude indépendante, il faut utiliser au moins 
vingt animaux (dix femelles et dix mâles) dans chaque groupe de 
traitement et dans chaque groupe témoin pour les observations 
cliniques et fonctionnelles. À la fin de l'étude, au moins cinq mâles et cinq femelles sont prélevés parmi ces dix mâles et ces dix femelles pour être perfusés in situ et soumis à un examen neuro ­
histopathologique. Lorsque dans un groupe de dosage, les observa ­
tions visant à détecter les effets neurotoxiques ne sont réalisées que sur un nombre limité d'animaux, il convient que ces animaux fassent partie de ceux qui seront choisis pour être perfusés. Si l'étude est 
combinée avec une étude de toxicité à doses répétées, le nombre des 
animaux doit être suffisant pour que les objectifs des deux études puissent être atteints. Le tableau 1 donne les nombres minimaux d'animaux par groupe pour différentes combinaisons d'études. S'il 
est prévu de sacrifier des animaux avant le terme de l'étude ou de 
constituer des groupes pour observer la réversibilité des effets, leur persistance ou l'apparition différée d'effets toxiques après traitement, ou si des observations complémentaires sont envisagées, il faut 
augmenter le nombre d'animaux pour s'assurer que le nombre 
requis pour les observations et les examens histopathologiques sera disponible.
 
1.5.2.  Groupes de traitement et groupes témoins  
En règle générale, on doit disposer d'au moins trois groupes d'ani ­
maux traités et d'un groupe témoin. Cependant, s'il ressort de l'éva ­
luation d'autres données qu'aucun effet n'est à attendre d'une admi ­
nistration répétée à la dose de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, on peut procéder à un essai limite. Si l'on ne dispose pas de données 
adéquates, on peut mener une étude préliminaire visant à délimiter la 
gamme des niveaux de doses à utiliser. À l'exception de l'exposition à la substance à tester, les animaux du groupe témoin doivent être traités exactement de la même manière que les animaux des groupes 
de traitement. Si la substance à tester est incorporée dans un véhi ­
cule, le groupe témoin doit en recevoir un volume égal au plus grand volume utilisé dans les groupes de traitement.
 
1.5.3.  Contrôle de la fiabilité  
Le laboratoire chargé de l'étude doit présenter des données attestant 
de sa capacité à réaliser l'étude et prouvant la sensibilité des 
méthodes employées. Ces données doivent constituer une preuve 
évidente de la faculté du laboratoire à détecter et, le cas échéant, à quantifier les changements observés pour les différents critères d'éva ­
luation, notamment réactions neurovégétatives, réactivité sensorielle, 
force de préhension et activité motrice. Les références 2 à 9 contien ­
nent des informations sur les substances qui provoquent différents types de réponses neurotoxiques et qui peuvent servir de témoins positifs. Des données antérieures peuvent également être utilisées à 
condition que les principaux éléments des procédures expérimentales 
soient restés les mêmes. Des mises à jour périodiques de ce type de données sont recommandées. Chaque fois que le laboratoire modifie un élément essentiel du mode opératoire ou des méthodes 
employées, de nouvelles données doivent être réunies pour démon ­
trer que la sensibilité des procédures est maintenue.
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1.5.4.  Choix des doses  
Les niveaux de dose doivent être choisis en fonction des données 
disponibles concernant la toxicité et la toxico-cinétique de la subs ­
tance d'essai ou de substances apparentées. La dose la plus élevée est 
choisie dans le but de provoquer des effets neurotoxiques ou des 
effets de toxicité systémique manifeste. Il faut ensuite choisir une série de doses décroissantes de façon à mettre en évidence une éventuelle relation dose-effet et l'absence d'effets nocifs observables 
au niveau de la dose la plus faible (CSENO). En principe, les 
niveaux de doses doivent être choisis de telle manière que l'on puisse distinguer les effets neurotoxiques primaires des effets liés à 
la toxicité systémique. Deux à trois intervalles entre niveaux succes ­
sifs représentent fréquemment la meilleure solution et il est souvent préférable d'ajouter un quatrième groupe d'essai plutôt que de fixer des intervalles trop espacés (par exemple dépassant un facteur dix) 
entre les niveaux de dose. Lorsque des estimations réalistes de l'ex ­
position humaine existent, il faut en tenir compte.
 
1.5.5.  Essai limite  
Si une étude réalisée à une dose d'au moins 1 000 mg/kg de poids 
corporel/jour selon la méthode décrite ci-dessus ne provoque aucun effet toxique observable, et que d'après les données obtenues pour 
des composés de structure analogue il est peu probable que la subs ­
tance testée soit toxique, on peut considérer qu'il est inutile d'effec ­
tuer une étude complète sur trois niveaux de dose. En fonction de l'exposition humaine escomptée, il pourra s'avérer nécessaire d'admi ­
nistrer une dose plus forte par voie orale pour l'essai limite. Pour les 
autres voies d'administration, comme l'inhalation ou l'application cutanée, ce sont souvent les propriétés physiques et chimiques de la substance qui déterminent le niveau d'exposition maximal. Dans le 
cas d'une étude orale aiguë, la dose de l'essai limite doit être au 
moins 2 000 mg/kg.
 
1.5.6.  Administration des doses  
La substance à tester est administrée aux animaux quotidiennement, 
sept jours par semaine, sur une période d'au moins 28 jours. L'ad ­
ministration à raison de cinq jours par semaine ou l'adoption d'une 
période d'exposition plus courte demandent à être justifiées. Lorsque la substance est administrée par gavage, les animaux doivent recevoir une dose unique introduite au moyen d'une sonde gastrique ou d'une 
canule d'intubation appropriée. Le volume maximal de liquide 
pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel. Toutefois, dans le cas d'une solution aqueuse, il est possible d'utiliser 
jusqu'à 2 ml/100 g de poids corporel. Exception faite pour les subs ­
tances irritantes ou corrosives, qui donneraient normalement lieu à des effets fortement amplifiés à des concentrations plus élevées, il convient de minimiser les variations du volume administré en ajus ­
tant la concentration de façon à maintenir un volume constant à tous 
les niveaux de dose.
 
Lorsque la substance est administrée dans la nourriture ou l'eau de 
boisson, il importe que les quantités de substance utilisées ne modi ­
fient pas les bilans nutritionnels ou hydriques normaux. Lorsque la 
substance est administrée dans la nourriture, deux possibilités sont offertes: soit le maintien d'une concentration constante (exprimée en ppm), soit le maintien d'un niveau de dose constant par rapport au 
poids corporel de l'animal. L'option choisie doit être précisée. 
Lorsque la substance est administrée par gavage, la dose doit être administrée chaque jour à la même heure et la quantité doit être ajustée de manière à maintenir un niveau de dose constant par 
rapport au poids corporel de l'animal. Lorsqu'un essai à dose 
répétée sert d'étude préliminaire à une étude à long terme, il faut appliquer le même régime alimentaire dans les deux études. Pour les études de toxicité aiguë, si la dose ne peut être administrée en une 
seule fois, il est possible de la fractionner sur période n'excédant pas 
24 heures.
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1.6. OBSERVATIONS  
1.6.1.  Fréquence des observations et essais  
Dans les études à doses répétées la période d'observation doit 
s'étendre sur toute la période de traitement. Dans les études de toxi ­
cité aiguë, les observations sont poursuivies pendant 14 jours après 
le traitement. Les animaux de groupes satellites (qui ne sont pas exposés pendant une certaine période après le traitement) sont observés également pendant 14 jours.
 
Les observations doivent être suffisamment fréquentes pour favoriser 
la détection de toute anomalie de comportement ou d'ordre neurolo ­
gique. Les observations se font de préférence aux mêmes moments chaque jour, en tenant compte de la période au cours de laquelle les effets escomptés du traitement seront les plus marqués. Le tableau 2 
récapitule la fréquence des observations cliniques et des tests fonc ­
tionnels. Si des données de cinétique et autres, obtenues dans des études antérieures, indiquent que d'autres moments de la journée sont plus propices aux observations, essais ou observations après traite ­
ment, il y a lieu d'adopter un échéancier différent afin de recueillir le 
plus d'informations possible. Les modifications de l'échéancier doivent être justifiées.
 
1.6.1.1.  Surveillance de l'état de santé général et relevés de mortalité/mor ­
bidité  
Tous les animaux font l'objet d'un examen minutieux au moins 
une fois par jour pour vérifier leur état de santé, et des relevés de la morbidité et de la mortalité sont effectués au moins deux fois 
par jour.
 
1.6.1.2.  Observations cliniques détaillées  
Tous les animaux choisis pour être soumis à un examen clinique 
approfondi (voir tableau 1) subissent cet examen une fois avant la 
première exposition (pour permettre des comparaisons sur un même individu) et à divers intervalles par la suite, en fonction de la durée de l'étude (voir tableau 2). Les groupes satellites destinés à l'obser ­
vation de la réversibilité des effets sont examinés à la fin de la 
période de récupération. Ces examens doivent être effectués hors de la cage habituelle, sur une aire standard. Les résultats doivent être soigneusement consignés, de préférence à l'aide de systèmes 
de cotation utilisant des critères ou d'échelles de cotation, pour 
chaque mesure effectuée. Les critères ou échelles employés doivent être explicitement définis par le laboratoire. Il faut s'efforcer de minimiser les variations des conditions d'essai (mis à part celles 
qui sont liées au traitement) et prendre les dispositions nécessaires 
pour que les examens soient effectués par des observateurs expéri ­
mentés n'ayant pas connaissance du traitement administré.
 
Il est recommandé de procéder de manière structurée en appliquant 
systématiquement, pour chaque animal et à chaque moment d'obser ­
vation, des critères bien définis. Les données utilisées pour définir le 
niveau normal doivent être présentées. Tous les signes observés 
doivent être consignés. L'ampleur des signes observés est également consignée chaque fois que cela est possible. Les observations cliniques devraient notamment porter sur les modifications de l'état 
de la peau, de la fourrure, des yeux, des membranes muqueuses, 
l'apparition de sécrétions et d'excrétions et de réactions neurovégé ­
tatives (sécrétion de larmes, horripilation, variation du diamètre pupillaire, rythme respiratoire inhabituel, respiration par la bouche, 
tous signes inhabituels de miction ou défécation, urine décolorée, par 
exemple).
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Il convient également de consigner toute réaction inhabituelle en ce 
qui concerne la position du corps, le niveau d'activité (par exemple 
exploration accrue ou diminuée de l'aire standard) et la coordination des mouvements. Il convient également de consigner les modifica ­
tions dans la démarche (dandinement, ataxie, par exemple), dans la 
posture (dos arrondi, par exemple) et la réaction à la manipulation, 
au placement et autres stimuli, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, les convulsions et tremblements, les compor ­
tements stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, parcours circu ­
laires répétitifs) ou les comportements bizarres (par exemple, 
tendance à mordre, léchage excessif, automutilation, marche à recu ­
lons, vocalisation) ou l'agressivité.
 
1.6.1.3.  Tests fonctionnels  
Comme dans le cas des observations cliniques, les tests fonctionnels 
sont réalisés sur tous les animaux sélectionnés à cet effet (voir tableau 1) une fois avant l'exposition et fréquemment ensuite. La fréquence des tests fonctionnels dépend également de la durée de 
l'étude (voir tableau 2). En plus des périodes d'observation stipulées 
dans le tableau 2, des observations fonctionnelles sont réalisées sur des groupes satellites aussi près que possible du sacrifice final. Les tests fonctionnels explorent notamment la réactivité sensorielle à 
divers stimuli [par exemple, stimuli auditifs, visuels et proprioceptifs 
(5) (6) (7)], la force de préhension (8) et l'activité motrice (9). Cette dernière doit être mesurée à l'aide d'un dispositif automatique pouvant détecter aussi bien les hausses que les baisses d'activité. 
Si un autre système défini est utilisé, il doit être quantitatif et de 
sensibilité et de fiabilité démontrées. Chaque dispositif doit être testé afin de garantir sa fiabilité au cours du temps et la cohérence des résultats d'un dispositif à l'autre. On trouvera dans les références 
bibliographiques susmentionnées une description plus détaillée des 
modes opératoires. En l'absence d'informations sur le potentiel neuro ­
toxique (par exemple, informations sur la relation structure-activité, données épidémiologiques, autres études toxicologiques), il convient 
d'envisager des tests plus spécialisés d'exploration des fonctions 
sensorielles et motrices ou de la mémoire et de la faculté d'apprentis ­
sage. La référence (1) fournit de plus amples informations sur les tests plus spécialisés et leur utilisation.
 
Exceptionnellement, les animaux qui montrent des signes de toxicité 
marqués qui risqueraient de fausser considérablement les résultats du test fonctionnel peuvent ne pas être soumis à ce test. La décision 
d'écarter des animaux d'un test fonctionnel doit être justifiée.
 
1.6.2.  Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau  
Dans les études allant jusqu'à 90 jours, tous les animaux doivent être 
pesés au moins une fois par semaine. Il faut également mesurer la 
quantité de nourriture consommée (ou d'eau consommée, lorsque la 
substance est administrée par cette voie), au moins une fois par semaine. Dans les études à long terme, tous les animaux sont pesés au moins une fois par semaine pendant les treize premières 
semaines et au moins une fois toutes les quatre semaines par la suite. 
La quantité de nourriture consommée (ou d'eau, si la substance est administrée par cette voie) doit être mesurée au moins une fois par semaine pendant les treize premières semaines et à peu près tous les 
trois mois par la suite, à moins qu'une détérioration de l'état général 
ou un amaigrissement n'imposent d'autres conditions.
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1.6.3.  Ophtalmologie  
Dans les études de plus de 28 jours, un examen ophtalmologique à 
l'aide d'un ophtalmoscope ou d'un autre appareil approprié doit être effectué avant l'administration de la substance et au terme de l'étude. 
Cet examen est effectué de préférence sur tous les animaux et en tout 
état de cause au moins sur ceux du groupe ayant reçu la dose la plus forte ainsi que sur les animaux des groupes témoins. Si des altéra ­
tions sont détectées dans les yeux, ou si des signes cliniques y 
incitent, l'examen est étendu à tous les animaux. Dans les études à 
long terme, un examen ophtalmologique est prévu après treize semaines. Des examens ophtalmologiques ne sont pas nécessaires 
si les informations pertinentes ont déjà été fournies par d'autres 
études de durée similaire réalisées à des doses comparables.
 
1.6.4.  Hématologie et biochimie clinique  
Lorsque l'étude de neurotoxicité est conduite en combinaison avec 
une étude de toxicité systémique à doses répétées, les examens 
hématologiques et les déterminations de biochimie clinique doivent 
être effectués comme prescrit par la méthode correspondante de l'étude de toxicité systémique. Les échantillons sont à prélever de telle façon que les effets possibles sur le comportement neurologique 
soient réduits au minimum.
 
1.6.5.  Histopathologie  
L'examen neuropathologique doit être conçu dans le but de 
compléter et d'approfondir les observations faites pendant la phase in vivo de l'étude. Les tissus d'au moins cinq animaux de chaque 
sexe et de chaque groupe (voir le tableau 1 et le paragraphe suivant) 
doivent être fixés in situ à l'aide des techniques de perfusion et de fixation usuelles (voir le chapitre 5 de la référence 3 et le chapitre 50 de la référence 4). Tout changement important observable doit être 
consigné. S'il s'agit d'une étude indépendante, réalisée pour dépister 
une neurotoxicité ou pour caractériser des effets neurotoxiques, les animaux restants peuvent être utilisés pour des examens spécifiques du comportement neurologique (10) (11), des examens neuropatho ­
logiques (10) (11) (12) (13), neurochimiques (10) (11) (14) (15) ou 
électrophysiologiques (10) (11) (16) (17) pouvant éventuellement compléter les procédures et examens décrits ici, ou bien venir s'ajouter aux animaux soumis à l'examen histopathologique. Ces 
procédures complémentaires sont particulièrement utiles lorsque, à 
la suite d'observations empiriques ou sur la base des effets escomp ­
tés, on peut s'attendre à un type spécifique de neurotoxicité ou à une cible spécifique de celle-ci (2) (3). Ces animaux restants peuvent 
également servir dans les évaluations pathologiques de routine qui 
sont décrites dans la méthode à doses répétées.
 
Les échantillons de tissus sont colorés par une méthode usuelle, par 
exemple par de l'hématoxyline et de l'éosine, inclus dans de la 
paraffine et examinés sous le microscope. Si des signes de neuropa ­
thie périphérique sont observés ou en cas de suspicion de tels effets, il conviendra d'examiner des échantillons de tissu nerveux périphé ­
rique inclus dans du plastique. Certains signes cliniques peuvent 
également inciter à l'examen d'autres sites ou à l'utilisation de méthodes de coloration spéciales. Les références (3) et (4) fournis ­
sent des indications sur les sites supplémentaires à examiner. Des 
colorants spéciaux peuvent aussi être utiles pour mettre en évidence 
des types spécifiques d'altérations pathologiques (18).
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Un examen histologique doit être réalisé sur des coupes représenta ­
tives du système nerveux central et périphérique (voir le chapitre 5 
de la référence 3 et le chapitre 50 de la référence 4). Les sites examinés doivent normalement comprendre le cerveau antérieur, le centre des hémisphères cérébraux, comprenant une coupe de l'hippo ­
campe, le cerveau central, le cervelet, la protubérance annulaire, le 
bulbe rachidien, l'œil avec le nerf optique et la rétine, la moelle épinière et les renflements cervicaux et lombaires, les ganglions de la chaîne dorsale, les fibres de la chaîne dorsale et ventrale, le nerf 
sciatique proximal, le nerf tibial proximal (au genou) et les ramifi ­
cations du nerf tibial aux muscles du mollet. Les sections de la moelle épinière et des nerfs périphériques doivent comprendre des coupes transversales et longitudinales. Il faut accorder une attention 
particulière à la vascularisation du système nerveux. Un échantillon 
de muscles squelettiques, en particulier du mollet, devrait également être examiné. Une attention particulière devrait être accordée aux régions à structure cellulaire et fibreuse du système nerveux central 
et périphérique, qui sont connues pour être particulièrement sujettes 
aux attaques neurotoxiques.
 
Les références (3) et (4) fournissent des informations sur les altéra ­
tions neuropathologiques typiquement liées aux expositions à une 
substance neurotoxique. Il est recommandé de procéder par étapes 
pour l'examen des échantillons de tissus, en comparant d'abord des coupes du groupe ayant reçu la forte dose avec des coupes du groupe témoin. Si aucune altération neuropathologique n'est constatée dans 
les échantillons de ces groupes, il n'est pas nécessaire de poursuivre 
l'analyse. Si des altérations neuropathologiques apparaissent dans le groupe traité à la forte dose, il faut alors examiner successivement des échantillons de tous les tissus potentiellement affectés des 
groupes traités à la dose intermédiaire et à la dose faible.
 
Si l'examen qualitatif met en évidence des signes d'altérations neuro ­
pathologiques, il convient de procéder à un second examen de toutes les régions du système nerveux qui présentent ces altérations. Dans 
tous les groupes de dosage, il convient de réaliser des coupes de 
toutes les régions potentiellement affectées, qui seront ensuite codées, puis examinées à l'aveugle dans un ordre aléatoire. La fréquence et la gravité de chaque lésion sont consignées. Quand 
toutes les régions de tous les groupes ont été cotées, le code est 
cassé et une analyse statistique est faite afin de déterminer la relation dose-réponse. Il faut donner la description des différents degrés de 
gravité de chaque lésion.
 
Les résultats de l'examen neuropathologique doivent être évalués à la 
lumière des observations et déterminations fonctionnelles, ainsi que des résultats des études de toxicité systémique réalisées sur la subs ­
tance.
 
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Il faut présenter les résultats relatifs à chaque individu. En outre, 
toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux montrant pour chaque groupe d'essai ou groupe témoin le nombre 
d'animaux au début de l'essai, le nombre d'animaux trouvés morts ou 
euthanasiés au cours de l'essai, le moment de chaque décès ou sacri ­
fice, le nombre d'animaux manifestant des signes de toxicité, une description de ces signes, y compris le moment de leur apparition, 
leur durée, leur type et leur gravité, le nombre d'animaux présentant 
des lésions, le type de ces dernières et leur gravité.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 632
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Les résultats de l'étude doivent être évalués sur les plans de la 
fréquence, de la gravité et de la corrélation des effets neuropatholo ­
giques et de comportement (le cas échéant, neurochimiques et élec ­
trophysiologiques si des examens supplémentaires ont été pratiqués) 
avec d'autres effets nocifs observés. Dans la mesure du possible, les résultats numériques devraient être évalués au moyen d'une méthode statistique adéquate et communément acceptée. Les méthodes statis ­
tiques doivent être choisies au moment de la conception de l'étude.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit comporter les informations ci-après:  
Substance d'essai:  
— nature physique (y compris isomérisation, pureté et propriétés 
physico-chimiques),  
— données permettant l'identification.  
Véhicule (le cas échéant):  
— justification du choix du véhicule.  
Animaux d'expérience:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— source, conditions d'encagement, acclimatation, alimentation, 
etc., 
— source, conditions d'encagement, acclimatation, alimentation, etc.  
Conditions de l'essai:  
— description détaillée de la formulation de la substance à tester 
et/ou de la préparation alimentaire, concentration atteinte, stabi ­
lité et homogénéité de la préparation,  
— précisions sur les doses administrées, le véhicule, le volume et la 
forme physique du mélange administré,  
— précisions sur le mode d'administration de la substance à tester,  
— justification du choix des niveaux de dose,  
— justification du choix de la voie et de! a durée d'exposition,  
— conversion de la concentration (en ppm) de la substance à tester 
dans la nourriture ou dans l'eau de boisson en dose (en mg/kg de 
poids corporel/jour), le cas échéant,  
— précisions sur la qualité des aliments et de l'eau.  
Procédures d'observation et d'essais:  
— précisions sur l'affectation des animaux de chaque groupe aux 
sous-groupes de perfusion,  
— précisions sur les systèmes de cotation, les critères et les échelles 
utilisés pour chaque détermination lors des observations cliniques 
détaillées,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 633
 
— précisions sur les tests fonctionnels d'exploration de la réactivité 
sensorielle à divers stimuli (par exemple stimuli auditifs, visuels 
et proprioceptifs); précisions sur l'évaluation de la force de préhension; précisions sur l'évaluation de l'activité motrice (y compris détails sur les dispositifs automatiques de détection de 
l'activité) et sur les autres procédures,
 
— précisions sur les examens ophtalmologiques et, le cas échéant, 
hématologiques et sur les tests de biochimie clinique, avec indi ­
cation des valeurs de référence,  
— précisions sur les procédures spécifiques de recherche des modi ­
fications du comportement et des altérations neuropathologiques, 
neurochimiques et électrophysiologiques.  
Résultats:  
— poids corporel/variations du poids corporel et poids au moment 
du sacrifice,  
— consommation d'aliments et d'eau, le cas échéant,  
— informations sur les réactions de toxicité, par sexe et par niveau 
de dose, y compris les symptômes de toxicité ou mortalité,  
— nature, gravité et durée (moment du début et évolution observée) 
des observations cliniques détaillées (préciser si les effets sont réversibles ou non),
 
— description détaillée des résultats de tous les tests fonctionnels,  
— résultats de l'autopsie,  
— description détaillée de toutes les observations concernant le 
comportement, les modifications neuropathologiques, neurochi ­
miques et électrophysiologiques, le cas échéant,  
— données concernant l'absorption et le métabolisme, si disponibles,  
— traitement statistique des résultats, le cas échéant.  
Discussion des résultats:  
— informations concernant la relation dose-réponse,  
— rapport entre tout autre effet toxique et une conclusion quant au 
potentiel neurotoxique de la substance,  
— concentration sans effet nocif observé.  
Conclusions:  
— une appréciation sur la neurotoxicité globale de la substance est 
demandée.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris In Preparation.  
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OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
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Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
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(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
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(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
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(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
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(15) O'Callaghan, J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
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(16) Fox, D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, p. 299-335.
 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in Neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds, Williams and 
Wilkins Co., Baltimore/London, p. 726-742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological 
Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill 
Livingstone.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 635
 
Tableau 1  
Nombres minimaux d'animaux requis par groupe selon que l'étude de neurotoxicité est conduite séparément ou 
en combinaison avec d'autres études  
ÉTUDE DE NEUROTOXICITÉ CONDUITE COMME: 
Étude séparée Étude combinée avec 
une étude sur 28 jours Étude combinée avec 
une étude sur 90 jours Étude combinée avec 
une étude de toxicité 
chronique  
Nombre total d'animaux par 
groupe 10 mâles et 10 
femelles 10 mâles et 10 
femelles 15 mâles et 15 
femelles 25 mâles et 25 
femelles 
Nombre d'animaux sélec ­
tionnés pour les tests fonc ­
tionnels, y compris les observations cliniques 
détaillées 10 mâles et 10 
femelles 10 mâles et 10 
femelles 10 mâles et 10 
femelles 10 mâles et 10 
femelles 
Nombre d'animaux sélec ­
tionnés pour la perfusion in 
situ et l'examen neurohis ­
topathologique 5 mâles et 5 
femelles 5 mâles et 5 
femelles 5 mâles et 5 
femelles 5 mâles et 5 femelles 
Nombre d'animaux sélec ­
tionnés pour les essais de 
toxicité à dose répétée, de 
toxicité subchronique et chronique, les études héma ­
tologiques, de biochimie 
clinique, histopathologiques, 
etc., comme indiqué dans les lignes directrices corres ­
pondantes 5 mâles et 5 
femelles 10 mâles † et 10 
femelles † 20 mâles † et 20 
femelles † 
Observations complémen ­
taires, le cas échéant 5 mâles et 5 
femelles
 
† Ce nombre comprend cinq animaux sélectionnés pour les tests fonctionnels et les observations cliniques détaillées faisant par tie de 
l'étude de neurotoxicité.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 636
 
Tableau 2  
Fréquence des observations cliniques et périodicité des tests fonctionnels  
Type d'observation Durée de l'étude 
Étude de toxicité 
aiguë 28 jours 90 jours Étude de toxicité 
chronique  
Sur tous les 
animaux État de santé 
général quotidiennement quotidiennement quotidiennement quotidiennement 
Mortalité/morbi ­
dité deux fois par 
jour deux fois par 
jour deux fois par 
jour deux fois par jour 
Sur les animaux 
sélectionnés pour 
les observations 
fonctionnelles Observations 
cliniques détail ­
lées — avant la 
première 
exposition 
— dans les huit 
heures suivant l'ad ­
ministration, 
au moment où l'effet est censé être le 
plus 
prononcé 
— aux jours 7 
et 14 après 
administra ­
tion — avant la 
première 
exposition 
— une fois par 
semaine ensuite — avant la 
première 
exposition 
— une fois 
pendant la première ou 
la deuxième 
semaine d'exposition 
— une fois par 
mois ensuite — avant la 
première 
exposition 
— une fois à la 
fin du premier mois d'expo ­
sition 
— tous les trois 
mois ensuite 
Tests fonction ­
nels — avant la 
première exposition 
— dans les huit 
heures suivant l'ad ­
ministration, 
au moment 
où l'effet est censé être le plus 
prononcé 
— aux jours 7 
et 14 après administra ­
tion — avant la 
première exposition 
— pendant la 
quatrième semaine du traitement le 
plus près 
possible de la fin de la période d'ex ­
position — avant la 
première exposition 
— une fois 
pendant la première ou la deuxième 
semaine 
d'exposition 
— une fois par 
mois ensuite — avant la 
première exposition 
— une fois à la 
fin du premier mois d'expo ­
sition 
— tous les trois 
mois ensuite  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 637
 
B.44.  ABSORPTION CUTANÉE: MÉTHODE IN VIVO  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 427 (2004) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La voie d'exposition à de nombreux produits chimiques est essen ­
tiellement transcutanée, c'est-à-dire via la peau. Or, la majorité des 
études toxicologiques réalisées sur des animaux de laboratoire s'ap ­
puient sur une administration des produits par voie orale. L'étude d'absorption cutanée in vivo décrite dans la présente méthode offre 
donc les éléments nécessaires pour extrapoler les résultats des études 
par administration orale, lors des évaluations en matière de sécurité réalisées après exposition cutanée.
 
Avant de passer dans la circulation sanguine, une substance doit 
d'abord traverser un grand nombre de couches cellulaires de la 
peau. Pour la plupart des substances, c'est le stratum corneum, 
composé de cellules mortes, qui est la couche déterminante sur le plan cinétique. La perméabilité de la peau dépend à la fois de la lipophilicité de la substance et de l'épaisseur de la couche externe de 
l'épiderme, ainsi que d'autres facteurs tels que le poids moléculaire et 
la concentration de la substance. De manière générale, la peau des rats et des lapins est plus perméable que celle de l'homme, tandis que celle des cobayes, des porcs et des singes se rapproche de la peau 
humaine.
 
Les méthodes de mesure de l'absorption percutanée sont de deux 
types: in vivo et in vitro. La méthode in vivo fournit de bonnes informations sur l'absorption cutanée chez différentes espèces de laboratoire. Mises au point plus récemment, les méthodes in vitro 
se fondent sur le transport d'une substance à travers tout ou partie de 
l'épaisseur de la peau humaine ou animale jusqu'à un réservoir de fluide. La méthode in vitro est décrite dans une autre méthode d'essai (1). Pour choisir la méthode la mieux appropriée en fonction des 
situations données, il est recommandé de consulter le document 
d'orientation de l'OCDE pour la conduite des études d'absorption cutanée (2) qui examine en détails la pertinence respective des méthodes in vivo et in vitro.
 
La méthode  in vivo  décrite dans la présente méthode permet de 
déterminer que la substance d'essai a traversé la peau pour pénétrer 
dans le compartiment systémique. La technique est largement utilisée depuis de nombreuses années (3) (4) (5) (6) (7). Alors que les études in vitro d'absorption percutanée conviennent dans de nombreux cas, 
il existe certaines situations dans lesquelles seule une étude in vivo 
permet d'obtenir les données voulues.
 
Les avantages de la méthode  in vivo  sont les suivants: utilisation d'un 
système intact sur les plans physiologique et métabolique, utilisation d'une espèce commune à bon nombre d'études de toxicité, et possibi ­
lité de modification pour une utilisation sur d'autres espèces. En 
revanche, elle présente certains inconvénients: utilisation d'animaux vivants, utilisation de matière radiomarquée pour garantir la fiabilité des résultats, difficultés à déterminer la phase d'absorption précoce, 
et différences de perméabilité entre la peau humaine et celle des 
espèces les plus communément utilisées (rat). En effet, la peau animale est généralement plus perméable, ce qui peut conduire à une surestimation de l'absorption percutanée chez l'homme (6) (8) 
(9). Les substances caustiques et corrosives ne doivent pas être 
testées sur des animaux vivants.
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1.2. DÉFINITIONS  
Dose non absorbée : désigne la quantité de substance éliminée par le 
nettoyage de la surface de la peau après exposition, et toute quantité présente sur le pansement non occlusif, y compris toute quantité 
volatilisée au cours de l'exposition.
 
Dose absorbée  (in vivo): désigne les quantités de substance 
présentes dans l'urine, les résidus ramassés dans la cage après 
nettoyage, les fèces, l'air expiré (s'il est mesuré), le sang, les tissus (s'ils sont collectés) et la carcasse, après récupération de la peau du site d'application.
 
Dose absorbable : désigne la quantité de substance présente sur ou 
dans la peau après nettoyage.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance d'essai, de préférence radiomarquée, est appliquée sur 
la peau rasée des animaux, à la dose ou aux différentes doses appro ­
priée(s), sous la forme d'une préparation d'usage représentative. La 
préparation d'essai est maintenue au contact de la peau pendant une 
période donnée, sous un pansement adapté (non occlusif, semi- occlusif ou occlusif) de façon à prévenir l'ingestion de la préparation. Au terme de la période d'exposition, le pansement est retiré et la 
peau est nettoyée à l'aide d'un agent lavant approprié. Le pansement 
et le matériel utilisé pour appliquer l'agent lavant sont conservés pour analyse, et un nouveau pansement est appliqué. Avant, pendant et après la période d'exposition, les animaux sont hébergés dans des 
cages métaboliques individuelles, et les excrétions et l'air expiré au 
cours de ces périodes sont collectés pour analyse. Le cas échéant, si l'on dispose d'informations suffisantes confirmant l'absence ou la formation limitée de métabolites radioactifs volatils, la collecte de 
l'air expiré peut être omise. Normalement, chaque étude porte sur 
plusieurs groupes d'animaux exposés à la préparation d'essai. Un groupe est euthanasié à la fin de la période d'exposition, et les autres groupes sont euthanasiés par la suite à des intervalles déter ­
minés (2). À la fin de la période d'échantillonnage, les animaux 
restants sont euthanasiés, le sang est collecté pour analyse, la zone d'application est prélevée pour analyse, et la carcasse est analysée pour rechercher toute matière non excrétée. Les échantillons sont 
analysés selon les méthodes appropriées et on estime le degré d'ab ­
sorption percutanée (6) (8) (9).
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Sélection de l'espèce animale  
Le rat est l'espèce la plus communément utilisée, mais des souches et 
espèces sans poils présentant un taux d'absorption cutanée plus proche de celui de l'homme peuvent aussi être utilisées (3) (6) (7) (8) (9). Des jeunes adultes sains du même sexe (mâles par défaut) 
d'une souche communément utilisée en laboratoire sont utilisés. Au 
début de l'étude, les animaux retenus ne doivent pas présenter un écart de poids de ± 20 % par rapport au poids moyen. Par exemple, des rats mâles de 200 à 250 grammes conviennent tout à fait, en 
particulier ceux présentant un poids dans la moitié supérieure de 
cette plage.
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1.4.2.  Nombre et sexe des animaux  
Un groupe d'au moins quatre animaux du même sexe doit être utilisé 
pour chaque préparation d'essai et chaque durée programmée. Chacun des groupes est euthanasié à un intervalle de temps différent, 
par exemple à la fin de la période d'exposition (généralement de 6 à 
24 heures) et à différentes échéances suivantes (48 et 72 heures par exemple). Dans le cas où des données disponibles démontrent une différence importante de sensibilité toxicologique dermique entre les 
mâles et les femelles, c'est le sexe le plus sensible qu'il convient 
d'utiliser. En l'absence de telles données, l'un ou l'autre des sexes peut être utilisé.
 
1.4.3.  Conditions d'hébergement et d'alimentation  
La température du local expérimental doit être de 22  o C (± 3  o C). Si 
l'humidité relative doit atteindre au moins 30 % sans excéder de préférence 70 %, en dehors des heures de nettoyage du local, on 
s'efforce de maintenir le taux d'humidité autour de 50 à 60 %. On 
applique un éclairage artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les animaux sont nourris avec un mélange clas ­
sique pour animaux de laboratoire disponible à volonté et boivent de 
l'eau potable à volonté. Pendant l'étude, et de préférence également pendant la phase d'acclimatation, les animaux sont placés dans des cages métaboliques individuelles. Les déversements d'eau ou de 
nourriture étant susceptibles de compromettre les résultats de l'étude, 
les risques de tels incidents doivent être minimisés.
 
1.4.4.  Préparation des animaux  
Les animaux sont marqués pour permettre une identification indivi ­
duelle, et placés dans leurs cages cinq jours au moins avant le début de l'essai, pour qu'ils s'acclimatent aux conditions du laboratoire.
 
À l'issue de la période d'acclimatation et 24 heures environ avant 
l'application de la substance d'essai, la région dorsale des épaules de chaque animal est tondue à ras. La perméabilité d'une peau endom ­
magée étant différente de celle d'une peau saine, un soin tout parti ­
culier doit être apporté pour ne pas «égratigner» la peau. Après la tonte et 24 heures environ avant l'application de la substance d'essai sur la peau (voir point 1.4.7), la surface de la peau est délicatement 
nettoyée à l'acétone pour retirer le sébum. Il n'est pas recommandé 
de procéder à un nettoyage supplémentaire à l'eau et au savon dans la mesure où les résidus de savon sont susceptibles de favoriser l'absorption de la substance d'essai. La surface tondue doit être suffi ­
samment grande pour permettre un calcul fiable de la quantité de 
substance d'essai absorbée par centimètre carré de peau, soit de préférence au moins 10 centimètres carrés. Des rats de 200 à 250 grammes sont compatibles avec une telle surface. Après préparation, 
les animaux sont replacés dans leurs cages métaboliques.
 
1.4.5.  Substance d'essai  
La substance d'essai est le produit dont on étudie les caractéristiques 
de pénétration. Dans l'idéal, cette substance d'essai doit être radio ­
marquée.  
1.4.6.  Préparation de l'essai  
La préparation de la substance d'essai (c'est-à-dire la préparation 
pure, diluée ou le mélange contenant la substance d'essai à appliquer sur la peau) doit être identique (ou représenter un substitut réaliste) aux produits auxquels peuvent être exposés l'homme ou les autres 
espèces cibles. Toute modification par rapport à la préparation 
«d'usage» doit être justifiée. Le cas échéant, la substance d'essai est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule adapté. Lorsqu'un véhicule autre que l'eau est utilisé, ses caractéristiques 
d'absorption et son interaction potentielle avec la substance d'essai 
doivent être connues.
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1.4.7.  Application sur la peau  
Une zone (site) d'application d'une superficie spécifique est définie 
sur la surface de la peau. Une quantité connue de la préparation d'essai est ensuite uniformément appliquée sur ce site. Normalement, 
cette quantité doit correspondre à une exposition humaine potentielle, 
soit généralement 1 à 5 mg/cm
 2 pour une substance solide ou jusqu'à 
10 ml/cm  2 pour les liquides. L'application de toute autre quantité doit 
être justifiée par les conditions d'utilisation attendues, les objectifs 
fixés pour l'étude, ou les caractéristiques physiques de la préparation 
d'essai. Après l'application, le site doit être protégé contre les frot ­
tements. La figure 1 présente un exemple de dispositif classiquement 
employé dans ce contexte. Généralement, on protège le site d'appli ­
cation par un pansement non occlusif (par exemple une compresse de gaze nylon perméable). Cela étant, pour des applications infinies, le site d'application doit être recouvert d'un pansement occlusif. Dans 
les cas où l'évaporation d'une substance d'essai semi-volatile réduit 
dans une trop grande mesure le taux de récupération de la substance d'essai (voir également le point 1.4.10, premier paragraphe), il convient de piéger la substance évaporée dans un filtre à charbon 
monté sur le dispositif d'application (voir la figure 1). Il est essentiel 
que les dispositifs d'application utilisés n'endommagent pas la peau, et qu'ils n'absorbent pas non plus la préparation d'essai ni n'entrent en réaction avec elle. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs 
cages métaboliques individuelles pour la collecte de leurs excrétions.
 
1.4.8.  Durée de l'exposition et échantillonnage  
La durée de l'exposition correspond à l'intervalle de temps entre 
l'application de la préparation d'essai et son retrait par nettoyage de la peau. Une période d'exposition pertinente (généralement de 6 
à 24 heures) doit être retenue, en fonction de la durée éventuelle de 
l'exposition humaine. À l'issue de la période d'exposition, les animaux sont maintenus dans leurs cages métaboliques jusqu'au terme prévu. Pendant toute la durée de l'étude, il convient d'observer 
les animaux à intervalles réguliers, pour détecter tout signe de toxi ­
cité ou toute réaction anormale. Après la période d'exposition, les éventuels signes visibles d'irritation doivent être observés sur la peau traitée.
 
Les cages métaboliques doivent permettre la collecte séparée des 
fèces et de l'urine pendant toute la durée de l'étude, ainsi que la collecte du dioxyde de carbone marqué au C
 14 et des composés 
volatils C  14 qu'il convient d'analyser lorsqu'ils sont produits en quan ­
tité (> 5 %). L'urine, les fèces et autres fluides (par exemple, le 
dioxyde de carbone C  14 et les composés volatils C  l4 ) doivent être 
collectés individuellement pour chaque groupe et à chaque étape d'échantillonnage. Sur la base d'informations suffisantes confirmant 
l'absence ou la formation limitée de métabolites radioactifs volatils, 
on peut le cas échéant utiliser des cages ouvertes.
 
Les excrétions sont collectées pendant la période d'exposition, soit 
24 heures maximum après la première application sur la peau, puis 
ensuite chaque jour jusqu'à la fin de l'expérience. Si trois intervalles de collecte des excrétions suffisent normalement, des points de collecte supplémentaires ou plus appropriés peuvent être définis 
pour une étude, selon l'objectif envisagé pour la préparation d'essai 
ou en fonction de données cinétiques existantes.
 
À la fin de la période d'exposition, le dispositif de protection est 
retiré de chaque animal et conservé individuellement aux fins d'ana ­
lyse. La peau traitée de tous les animaux doit être nettoyée au moins 
trois fois à l'aide d'un agent et de tampons nettoyants appropriés. Un soin particulier doit être apporté de façon à ne pas contaminer d'au ­
tres zones du corps des animaux. L'agent lavant doit être représen ­
tatif des pratiques d'hygiène normales (par exemple une solution 
d'eau savonneuse). Enfin, la peau doit être séchée. Tous les tampons et matériel de nettoyage utilisés doivent être conservés pour analyse. Un nouveau pansement doit être appliqué sur le site 
traité des animaux formant les derniers groupes, avant leur retour 
dans les cages métaboliques individuelles.
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1.4.9.  Procédures terminales  
Pour chaque groupe, les animaux doivent être euthanasiés à 
l'échéance préétablie et leur sang collecté pour analyse. Le panse ­
ment ou dispositif de protection doit être retiré pour analyse. La peau 
du site d'application et une surface de peau équivalente mais prove ­
nant d'une zone rasée non traitée doivent être prélevées sur chaque animal, et des analyses distinctes doivent être conduites. Le cas échéant, le site d'application peut être fractionné pour séparer le 
stratum corneum de l'épiderme sous-jacent, de façon à fournir des 
informations supplémentaires sur l'évacuation et le comportement de la substance chimique d'essai. En effet, déterminer le comportement/ 
élimination du produit au cours d'un laps de temps donné après la 
période d'exposition donne une indication sur le devenir de n'importe quelle substance chimique dans le stratum corneum. Pour faciliter le fractionnement de la peau (après le dernier nettoyage et l'euthanasie 
des animaux), il faut d'abord retirer tous les dispositifs de protection. 
Ensuite, on prélève la peau du site d'application sur le rat, plus une bande circulaire autour du site, puis on épingle le tout sur une planche. On applique alors, par quelques pressions légères, une 
bande de ruban adhésif à la surface de la peau. Cette bande est 
ensuite retirée, avec une partie du stratum corneum. On renouvelle l'opération jusqu'à ce que la bande n'adhère plus à la surface de la peau, lorsque tout le stratum corneum a été retiré. Pour chaque 
animal, on peut combiner toutes les bandes d'adhésif dans un seul 
récipient, dans lequel on ajoute un digestif pour solubiliser le stratum corneum. Le cas échéant, on récupère tout éventuel tissu cible pour procéder à des mesures séparées, avant analyse de la carcasse rési ­
duelle et mesure de la dose absorbée par celle-ci. Les carcasses des 
animaux doivent être conservées pour analyse. En règle générale, l'analyse du contenu total de la carcasse est suffisante, mais certains organes peuvent être retirés pour des analyses séparées (par exemple 
si cela est indiqué par d'autres études). L'urine présente dans la 
vessie au moment de l'euthanasie doit être ajoutée à celle collectée auparavant. Après collecte des excrétions dans les cages métabo ­
liques au moment de l'euthanasie, les cages et leurs trappes 
doivent être nettoyées avec un solvant approprié. Les autres équipe ­
ments potentiellement contaminés doivent également être analysés.
 
1.4.10.  Analyse  
Dans toutes les études, un niveau de récupération approprié doit être 
atteint (à savoir une moyenne de 100 ± 10 % de la radioactivité). Les récupérations en dehors de cette plage doivent faire l'objet de justifi ­
cation. Le volume de la dose administrée dans chaque échantillon 
doit être analysé selon des procédures suffisamment validées.
 
L'analyse statistique doit inclure une mesure de la variance des essais 
répétés de chaque application.  
2. RÉSULTATS  
Les mesures suivantes de la substance d'essai et/ou des métabolites 
doivent être effectuées sur chaque animal et à chaque point d'échan ­
tillonnage. Tous les résultats doivent être présentés individuellement, mais aussi groupés par point d'échantillonnage sous forme de moyenne:
 
— quantité associée aux dispositifs de protection,  
— quantité pouvant être récupérée de la peau,  
— quantité présente sur ou dans la peau et impossible à retirer par 
nettoyage,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 642
 
— quantité dans les échantillons de sang,  
— quantité dans les excrétions et l'air expiré (le cas échéant),  
— quantité restant dans la carcasse et tout organe éventuellement 
retiré pour analyse.  
Les quantités de substance d'essai et/ou de métabolites trouvées dans 
les excrétions, l'air expiré, le sang et la carcasse permettent de déter ­
miner les quantités totales absorbées à chaque point. À partir de ces 
données, on peut calculer la quantité de substance d'essai absorbée par centimètre carré de peau exposée à la substance au cours de la période d'exposition.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit préciser les conditions établies dans le proto ­
cole, justifier le choix du système d'essai utilisé, et également contenir les informations suivantes:
 
Substance d'essai:  
— données d'identification [par exemple, numéro CAS si disponible; 
source; pureté (pureté radiochimique); impuretés connues; 
numéro du lot],  
— état physique; propriétés physico-chimiques (par exemple, pH, 
volatilité, solubilité, stabilité, poids moléculaire et log P  oe ). 
Préparation de l'essai:  
— formulation et justification de l'utilisation,  
— détails de la préparation d'essai, quantité appliquée, concentration 
atteinte, véhicule, stabilité et homogénéité.  
Animaux d'essai:  
— espèce/souche utilisée,  
— nombre, âge et sexe des animaux utilisés,  
— source des animaux, conditions d'encagement, régime alimen ­
taire, etc.,  
— poids de chaque animal au début de l'essai.  
Conditions d'essai:  
— détails concernant l'administration de la préparation d'essai (site 
d'application, méthodes d'essai, occlusion/non-occlusion, volume, 
extraction, détection),  
— détails concernant la qualité de l'eau et la nourriture.  
Résultats:  
— tout signe de toxicité,  
— tableau indiquant les données d'absorption (sous forme de taux, 
de quantités ou de pourcentage),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 643
 
— récupérations totales de l'expérience,  
— interprétation des résultats, avec comparaison avec toutes les 
autres données éventuellement disponibles concernant l'absorp ­
tion de la substance d'essai.  
Discussion des résultats  
Conclusions  
4. BIBLIOGRAPHIE  
1. Méthode d'essai B.45. Absorption cutanée: méthode in vitro.  
2. OCDE (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OCDE, Paris.  
3. ECETOC (1993). Percutaneous Absorption. Centre européen 
d'écotoxicologie et de toxicologie des produits chimiques, Mono ­
graphie No 20.  
4. Zendzian, RP (1989). Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll 
Toxicol.  8(5), p. 829-835.  
5. Kemppainen, BW, Reifenrath, WG (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6. EPA (1992). Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and Envi ­
ronmental Assessment.  
7. EPA (1998). Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
 
8. Bronaugh, RL, Wester, RC, Bucks, D, Maibach, HI and Sarason 
R (1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingre ­
dients in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 
p. 369-373.  
9. Feldman, RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  54. 
p. 399-404.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 644
 
Figure 1  
Exemple de dispositif classiquement utilisé pour délimiter et protéger un site 
d'application cutanée au cours d'études d'absorption percutanée in vivo
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 645
 
B.45.  ABSORPTION CUTANÉE: MÉTHODE IN VITRO  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 428 (2004) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Cette méthode a été élaborée pour fournir des informations sur l'ab ­
sorption d'une substance d'essai appliquée sur un échantillon de peau 
excisée. Elle peut être combinée à la méthode d'absorption cutanée: 
méthode in vivo (1), ou être menée séparément. Il est recommandé de consulter le document d'orientation de l'OCDE pour la conduite des études d'absorption cutanée (2) pour élaborer des études reposant 
sur cette méthode. Ce document d'orientation a été préparé pour 
faciliter la sélection des procédures in vitro appropriées, utilisables selon les circonstances spécifiques, et dans le but de garantir la fiabilité des résultats obtenus avec cette méthode.
 
Les méthodes de mesure de l'absorption cutanée se divisent en deux 
grandes catégories: in vivo et in vitro. Les méthodes  in vivo  d'étude 
de l'absorption cutanée sont bien connues et fournissent des infor ­
mations pharmacocinétiques sur un large éventail d'espèces animales. Une méthode  in vivo  est décrite dans une autre méthode d'essai (1). 
Les méthodes in vitro sont utilisées depuis de nombreuses années 
pour mesurer l'absorption cutanée. Même s'il n'y a pas eu d'étude de 
validation formelle des méthodes  in vitro  présentées dans cette 
méthode d'essai, les experts de l'OCDE ont estimé en 1999 que le 
volume des données évaluées suffisait pour étayer la méthode in 
vitro (3). Le document d'orientation de l'OCDE (2) présente des détails supplémentaires appuyant cette décision, dont un certain nombre de comparaisons directes des méthodes in vitro et in vivo. 
De même, de nombreuses monographies examinent cette question et 
offrent un contexte de référence détaillé sur l'utilisation de la méthode in vitro (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). Les méthodes in vitro mesurent la diffusion d'une substance dans et à travers la 
peau jusqu'à un réservoir de fluide; elles utilisent des échantillons de 
peau non viable pour mesurer la diffusion seule, ou des échantillons de peau fraîche et métaboliquement active pour mesurer simultané ­
ment la diffusion et le métabolisme cutané. Ces méthodes convien ­
nent particulièrement pour comparer l'absorption cutanée et percu ­
tanée de différentes formulations d'une substance chimique, mais elles proposent aussi des modèles utiles pour l'évaluation de l'absorp ­
tion percutanée chez l'homme.
 
La méthode in vitro ne convient pas nécessairement pour toutes 
les situations et classes de substances, mais on peut l'utiliser pour 
une première évaluation qualitative de la pénétration cutanée. Dans 
certains cas, il peut s'avérer nécessaire de compléter l'étude par des données in vivo. Pour des informations complémentaires sur les situations où la méthode in vitro conviendrait, il est recommandé 
de consulter le document d'orientation de l'OCDE (2). La référence 
(3) fournit d'autres précisions qui peuvent faciliter la prise de décision.
 
La présente méthode présente des principes généraux pour mesurer 
l'absorption cutanée et la diffusion d'une substance d'essai à partir d'un échantillon de peau excisée. Dans ce contexte, la peau de 
nombreuses espèces de mammifères, y compris l'homme, peut être 
utilisée. Les propriétés de perméabilité de la peau sont conservées après le prélèvement de l'échantillon de peau, dans la mesure où c'est le stratum corneum non viable qui constitue le principal obstacle à la 
diffusion; aucune forme de transport actif des substances chimiques à 
travers la peau n'a jamais été identifiée. En revanche, il a été établi que la peau pouvait métaboliser certaines substances au cours de l'absorption percutanée (6), mais ce processus ne limite pas la dose 
réellement absorbée, même si elle est susceptible d'affecter la nature 
du produit qui passe ensuite dans le sang.
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1.2. DÉFINITIONS  
Dose non absorbée : désigne la quantité retirée par nettoyage de la 
surface de la peau après exposition et toute quantité présente sur le timbre non occlusif, y compris toute quantité volatilisée au cours de 
l'exposition.
 
Dose absorbée  (in vitro): masse de substance d'essai atteignant le 
fluide receveur (ou la circulation systémique) dans une période de 
temps donnée.  
Dose absorbable  (in vitro): désigne la quantité présente sur ou dans 
la peau après nettoyage.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La substance d'essai, le cas échéant radiomarquée, est appliquée à la 
surface d'un échantillon de peau séparant les deux chambres d'une cellule à diffusion. La substance chimique reste sur la peau pendant 
un temps donné et dans des conditions spécifiques, avant d'être 
retirée selon une procédure de nettoyage appropriée. Au cours de l'étude, on échantillonne le fluide receveur à des moments donnés, puis on l'analyse pour y rechercher la substance d'essai et/ou des 
métabolites.
 
Lorsque des systèmes métaboliquement actifs sont utilisés, les éven ­
tuels métabolites de la substance d'essai peuvent être analysés selon 
les méthodes appropriées. À la fin de l'expérience, la distribution de 
la substance d'essai est déterminée et ses métabolites sont quantifiés, le cas échéant.
 
Dans les conditions appropriées, décrites dans cette méthode et dans 
le document d'orientation (2), on mesure l'absorption d'une substance d'essai au cours d'une période de temps donnée en analysant le fluide receveur et la peau traitée. La substance d'essai restant sur la peau 
doit être considérée comme étant absorbée, à moins qu'il soit 
démontré que l'on puisse déterminer l'absorption sur la seule base des valeurs relatives au fluide receveur. L'analyse des autres éléments (matières récupérées par nettoyage de la peau et matières 
restant à l'intérieur des couches dermiques) permet d'enrichir l'éva ­
luation des données, en précisant notamment l'évacuation totale de la substance d'essai et le pourcentage de récupération.
 
Pour démontrer les performances et la fiabilité du système d'essai 
dans le laboratoire chargé de l'étude, les résultats relatifs aux subs ­
tances chimiques de référence pertinentes doivent être tenus disponi ­
bles et être conformes à la littérature publiée pour la méthode utili ­
sée. Pour répondre à cette exigence, on peut procéder à un essai 
simultané de la substance d'essai et d'une substance de référence appropriée (présentant de préférence une lipophilicité proche de celle de la substance d'essai), ou proposer un historique approprié 
relatif à un certain nombre de substances de référence présentant une 
lipophilicité différente (par exemple, la caféine, l'acide benzoïque et la testostérone).
 
1.4. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.4.1.  Cellule à diffusion  
Une cellule à diffusion se compose d'un compartiment donneur et 
d'un compartiment receveur entre lesquels on place la peau (la figure 1 présente une cellule à diffusion de conception classique). La cellule doit répondre à plusieurs objectifs: assurer une bonne étanchéité sur 
le pourtour de la peau, permettre un échantillonnage aisé et un bon 
mélange de la solution dans le compartiment receveur en contact avec le dessous de la peau, et garantir le maintien de la température voulue au niveau de la cellule et de son contenu. Des cellules à 
diffusion statique ou dynamique peuvent indifféremment être utili ­
sées. Normalement, les compartiments donneurs sont laissés sans occlusion pendant l'exposition à une dose finie d'une préparation d'essai. Toutefois, pour les applications infinies et pour certains 
scénarios avec des doses finies, l'occlusion du compartiment 
donneur peut être envisagée.
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1.4.2.  Fluide receveur  
L'emploi d'un fluide receveur compatible avec des éléments physio ­
logiques doit être privilégié, mais d'autres fluides peuvent être utilisés à condition que ce choix soit justifié. La composition 
précise du fluide receveur doit être fournie. La bonne solubilité de 
la substance d'essai dans le fluide receveur doit être démontrée, de façon à garantir qu'il ne fait pas obstacle à l'absorption. En outre, le fluide receveur ne doit pas affecter l'intégrité de la préparation cuta ­
née. Dans un système dynamique, la vitesse de l'écoulement ne doit 
pas gêner la diffusion de la substance d'essai dans le fluide receveur. Dans une cellule statique, le fluide doit être remué en permanence et 
échantillonné régulièrement. Si le métabolisme entre également dans 
le cadre de l'étude, le fluide receveur doit garantir la viabilité de la peau pendant toute la durée de l'expérience.
 
1.4.3.  Préparations de peau  
On peut utiliser indifféremment de la peau d'origine humaine ou 
animale. Il est entendu que l'utilisation de la peau humaine est soumise à des conditions et considérations d'éthique admises d'ordre national et international. L'utilisation d'une peau viable est 
préférable, mais une peau non viable peut aussi être utilisée dès lors 
que son intégrité est démontrée. Des membranes d'épiderme (sépa ­
rées par procédé enzymatique, chimique ou à la chaleur) ou certaines strates de peau (d'une épaisseur généralement comprise entre 200 et 
400 μm) préparées avec un dermatome peuvent être utilisées. Des 
épaisseurs de peau complètes peuvent être utilisées, mais il convient d'éviter les épaisseurs excessives (environ > 1 mm), sauf si elles sont spécifiquement requises pour examiner la substance d'essai dans les 
couches de la peau. Les différents choix effectués (espèce retenue, 
site anatomique et technique de préparation) doivent être justifiés. Des données acceptables pour un minimum de quatre essais répétés par préparation d'essai doivent être fournies.
 
1.4.4.  Intégrité de la préparation cutanée  
Il est essentiel que la peau soit correctement préparée. Toute mani ­
pulation inappropriée peut endommager le stratum corneum; il 
convient donc de contrôler l'intégrité de la peau préparée. Si le 
champ de l'étude englobe le métabolisme de la peau, une peau fraîchement excisée doit être utilisée dans les plus courts délais, et dans des conditions propres à soutenir l'activité métabolique. De 
manière générale, la peau fraîchement excisée doit être utilisée 
dans les 24 heures, mais la période de stockage acceptable peut varier selon le système enzymatique impliqué dans la métabolisation et les températures de stockage (13). Lorsque les préparations de 
peau ont été stockées avant utilisation, des éléments établissant 
qu'elles ont conservé toutes leurs fonctions doivent être présentés.
 
1.4.5.  Substance d'essai  
La substance d'essai est le produit dont on étudie les caractéristiques 
de pénétration. Dans l'idéal, cette substance d'essai doit être radio ­
marquée.  
1.4.6.  Préparation d'essai  
La préparation de la substance d'essai (c'est-à-dire la préparation 
pure, diluée ou le mélange contenant la substance d'essai à appliquer sur la peau) doit être identique (ou représenter un substitut réaliste) aux produits auxquels peuvent être exposés l'homme ou les autres 
espèces cibles. Toute modification par rapport à la préparation 
«d'usage» doit être justifiée.
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1.4.7.  Concentrations et formulations des substances d'essai  
Normalement, plusieurs concentrations de la substance d'essai sont 
utilisées, de façon à couvrir le haut de la gamme des expositions humaines potentielles. De la même manière, on peut envisager 
d'étendre l'étude à un éventail de formulations classiques.
 
1.4.8.  Application sur la peau  
Dans les conditions normales de l'exposition humaine aux produits 
chimiques, des doses limites sont généralement rencontrées. Par conséquent, il convient d'utiliser des doses correspondant à l'exposi ­
tion humaine potentielle, soit généralement 1 à 5 mg/cm
 2 pour une 
substance solide et jusqu'à 10 μl/cm  2 pour les liquides. La quantité 
retenue doit être justifiée par les conditions d'utilisation attendues, les objectifs fixés pour l'étude, ou les caractéristiques physiques de la 
préparation d'essai. Par exemple, des applications infinies sur la 
surface de la peau peuvent être envisagées s'il s'agit d'étudier une exposition à des volumes importants par unité de surface.
 
1.4.9.  Température  
La température a une incidence sur la diffusion passive des produits 
chimiques (et ainsi sur leur absorption cutanée). Par conséquent, la 
cellule à diffusion et la peau doivent être maintenues à une tempé ­
rature constante proche de la température normale de la peau, soit 32 +/- 1
 o C. Selon la conception de la cellule, la température du bain ou 
du bloc de chauffage pourra varier, l'objectif étant de maintenir la 
peau et le compartiment receveur à leur norme physiologique. De préférence, l'humidité doit être maintenue entre 30 et 70 %.
 
1.4.10.  Durée de l'exposition et échantillonnage  
L'exposition de la peau à la préparation d'essai peut durer tout le 
temps de l'expérience, ou moins longtemps (par exemple pour imiter 
un type spécifique d'exposition humaine). La peau doit être lavée, à l'aide d'un agent lavant approprié, pour éliminer les excédents de la préparation d'essai, et les produits de rinçage utilisés doivent être 
collectés pour analyse. La procédure de retrait de la préparation, 
qui dépend des conditions d'utilisation envisagées, doit être justifiée. Normalement, une période d'échantillonnage de 24 heures est néces ­
saire pour permettre une caractérisation adéquate du profil d'absorp ­
tion. Sachant que l'intégrité de la peau peut commencer à se dété ­
riorer au-delà de 24 heures, la durée d'échantillonnage ne doit normalement pas excéder 24 heures. Cette durée n'est pas nécessaire pour les substances d'essai qui pénètrent rapidement la peau, mais 
pour celles qui pénètrent lentement, des temps plus importants 
peuvent se révéler nécessaires. La fréquence d'échantillonnage du fluide receveur doit permettre d'établir une représentation graphique 
du profil d'absorption de la substance d'essai.
 
1.4.11.  Procédures terminales  
Tous les éléments du système d'essai (compartiment donneur, 
produits de rinçage de la surface de la peau, préparation cutanée et compartiment/fluide receveur) doivent être analysés et le niveau de récupération déterminé. Dans certains cas, il peut être nécessaire de 
fractionner la peau en zone de peau exposée et zone de peau sous le 
rebord de la cellule, et en couches correspondant au stratum corneum, à l'épiderme et aux différentes strates du derme, pour 
procéder à des analyses séparées.
 
1.4.12.  Analyse  
Dans toutes les études, un niveau de récupération approprié doit être 
atteint (à savoir une moyenne de 100 +/- 10 % de la radioactivité, tous les écarts devant être justifiés). La quantité de substance d'essai dans le fluide receveur, la préparation cutanée, les produits de 
rinçage de la surface de la peau et des appareils doivent être analysés 
selon des procédures appropriées.
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2. RÉSULTATS  
L'analyse du fluide receveur, la distribution de la substance d'essai 
dans le système d'essai et le profil d'absorption dans le temps doivent être présentés. Dans des conditions d'exposition à une dose finie, la 
quantité de substance éliminée lors du nettoyage de la peau, la 
quantité présente dans la peau (et dans les différentes couches dermiques si celles-ci ont fait l'objet d'une analyse) et la quantité présente dans le fluide receveur (taux et quantité ou pourcentage de 
la dose appliquée) doivent être calculées. Parfois, l'absorption 
cutanée peut être exprimée à partir des seules données relatives au fluide receveur. Toutefois, lorsque de la substance d'essai reste dans 
la peau à la fin de l'étude, il peut être nécessaire de l'inclure dans la 
quantité totale absorbée [voir paragraphe 66 de la référence (3)]. Dans des conditions d'exposition à une dose infinie, les données peuvent permettre de calculer une constante de perméabilité (Kp). 
Dans ce dernier cas, le pourcentage absorbé n'est pas pertinent.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit préciser les conditions établies dans le proto ­
cole, justifier le choix du système d'essai utilisé, et également contenir les informations suivantes:
 
Substance d'essai:  
— état physique; propriétés physico-chimiques (au minimum, poids 
moléculaire et log P  oe ), pureté (pureté radiochimique),  
— informations d'identification (par exemple numéro de lot),  
— solubilité dans le fluide receveur.  
Préparation de la substance d'essai:  
— formulation et justification de l'utilisation,  
— homogénéité.  
Conditions d'essai:  
— sources et site de la peau, méthode de préparation, conditions de 
stockage avant utilisation, prétraitement éventuel (nettoyage, trai ­
tement antibiotique, etc.), mesures de l'intégrité de la peau, état 
métabolique, justification de l'utilisation,  
— conception de la cellule à diffusion, composition du fluide rece ­
veur, vitesse d'écoulement du fluide receveur ou temps et procé ­
dures d'échantillonnage,  
— détails de l'application de la préparation d'essai et quantification 
de la dose appliquée,  
— durée de l'exposition,  
— détails sur l'élimination de la préparation d'essai présente sur la 
peau (par exemple rinçage de la peau),  
— détails sur l'analyse de la peau et les techniques de fractionne ­
ment employées pour mettre en évidence la distribution dans la 
peau,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 650
 
— procédures de nettoyage de la cellule et du matériel,  
— méthodes d'essai, techniques d'extraction, seuils de détection et 
validation de la méthode analytique.  
Résultats:  
— récupération totale de l'expérience (dose appliquée = produits de 
rinçage de la peau + peau + fluide receveur + produits de rinçage 
de la cellule),  
— tableau indiquant la récupération de chaque cellule dans chaque 
compartiment,  
— profil d'absorption,  
— tableau indiquant les données relatives à l'absorption (sous forme 
de taux, de quantités ou de pourcentages).  
Discussion des résultats  
Conclusions  
4. BIBLIOGRAPHIE  
1. Méthode d'essai B.44. Absorption cutanée: méthode in vivo.  
2. OCDE (2002). Document d'orientation de l'OCDE pour la 
conduite des études d'absorption cutanée, OCDE, Paris.  
3. OCDE (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, 
Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OCDE, Paris.  
4. Kemppainen, BW and Reifenrath, WG. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5. Bronaugh, RL and Collier, SW. (1991). Protocol for In vitro 
Percutaneous Absorption Studies, in In vitro  Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237-241.
 
6. Bronaugh, RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton.  
7. Centre européen d'écotoxicologie et de toxicologie des produits 
chimiques (1993). Monograph No 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
 
8. Diembeck, W, Beck, H, Benech-Kieffer, F, Courtellemont, P, 
Dupuis, J, Lovell, W, Paye, M, Spengler, J, Steiling, W (1999). 
Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, p. 191-205.
 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No 65.  
10. Howes, D, Guy, R, Hadgraft, J, Heylings, JR  et al. (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 651
 
11. Schaefer, H and Redelmeier, TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12. Roberts, MS and Walters, KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13. Jewell, C, Heylings, JR., Clowes, HM. and Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene in vitro. Arch Toxicol 74, p. 356-365.  
Figure 1  
Exemple de cellule à diffusion statique classiquement utilisée pour la conduite 
d'études d'absorption percutanée in vitro
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 652
 
B.46. IRRITATION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR ÉPIDERME 
HUMAIN RECONSTITUÉ  
INTRODUCTION  
1. L’irritation cutanée désigne l’apparition sur la peau de lésions réversibles à 
la suite de l’application d’une substance d’essai pendant une période allant 
jusqu’à quatre heures [selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations unies (ONU) et le règlement (CE) n
 o 1272/2008 du Parlement européen 
et du Conseil du 16 décembre 2008 relatif à la classification, à l’étiquetage 
et à l’emballage des substances et des mélanges (1)(3)]. La présente méthode d’essai propose une procédure in vitro pouvant servir à identifier les dangers liés aux produits chimiques (substances et mélanges) irritants 
correspondant à la définition du SGH de l’ONU et à la catégorie 2 du 
règlement CLP de l’Union européenne (1) (2) (3). Dans l’Union européenne et les autres régions n’ayant pas adopté la catégorie 3 facultative (substances 
faiblement irritantes) selon le SGH de l’ONU, la présente méthode d’essai 
peut aussi servir à identifier des produits chimiques non classés, c’est-à-dire ne relevant d’aucune catégorie dans le SGH de l’ONU ou le règlement CLP de l’Union européenne (1) (3). Cette méthode d’essai peut être utilisée pour 
déterminer le pouvoir irritant pour la peau d’un produit chimique, en tant 
que méthode de substitution à part entière remplaçant l’essai d’irritation cutanée in vivo, dans le cadre d’une stratégie d’essai à plusieurs niveaux (4 et chapitre B.4 de la présente annexe).
 
2. Jusqu’à présent, l’évaluation de l’irritation cutanée impliquait généralement 
le recours à des animaux de laboratoire [LD 404 de l’OCDE, chapitre B.4 
de la présente annexe] (4). Par souci du bien-être animal, le chapitre B.4 a été révisé en 2004 afin que la corrosion/irritation cutanée puisse être déter ­
minée via une stratégie d’essai à plusieurs niveaux, faisant appel à des 
méthodes d’essai in vitro ou ex vivo validées, de manière à éviter d’infliger 
des souffrances aux animaux. Trois méthodes d’essai in vitro validées ont été adoptées: elles constituent respectivement les lignes directrices 430, 431 et 435 de l’OCDE (5) (6) (7) et deux d’entre elles les chapitres B.40 et B.40  
bis de la présente annexe, qui sont destinées au volet «corrosivité» de la 
stratégie d’essai à plusieurs niveaux proposée dans le chapitre B.4 de la présente annexe ou la LD 404 de l’OCDE (4).
 
3. La présente méthode d’essai porte sur le danger d’irritation cutanée pour la 
santé humaine. Elle fait appel à un épiderme humain reconstitué qui, par sa 
conception globale (utilisation de kératinocytes non transformés prélevés sur 
épiderme humain en tant que source cellulaire, ainsi que de tissus et archi ­
tectures cellulaires représentatifs), reproduit fidèlement les propriétés biochi ­
miques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine, 
c’est-à-dire l’épiderme. La présente méthode d’essai comprend également 
un ensemble de normes de performance (appendice 2) pour l’évaluation de méthodes d’essai sur épiderme humain reconstitué similaires ou modifiées, développées par le ECVAM-EC (8), conformément aux principes du docu ­
ment d’orientation n
 o 34 de l’OCDE (9).  
4. Il existe trois méthodes validées conformes à la présente méthode d’essai. 
Des études de prévalidation, d’optimisation et de validation ont été réalisées pour une méthode in vitro (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) utilisant un modèle d’épiderme humain reconstitué, disponible dans le 
commerce sous le nom d’EpiSkin
 TM (et désignée comme la méthode de 
référence validée, ou MRV). Deux autres méthodes d’irritation cutanée in vitro sur épiderme humain reconstitué, également disponibles dans le commerce, ont donné des résultats analogues à ceux de la MRV selon 
une validation fondée sur les normes de performance (21): il s’agit des 
méthodes EpiDerm
 TM SIT (EPI-200) et SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 653
 
5. Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode in vitro sur 
épiderme humain reconstitué similaire ou modifiée, autre que la MRV, 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ou SkinEthic  TM , il convient d’en déterminer la 
fiabilité, la pertinence (précision) et les limitations pour l’usage préconisé, de manière à s’assurer que ses caractéristiques sont comparables à celles de 
la MRV, conformément aux normes de performance figurant dans la 
présente méthode d’essai (appendice 2). En outre, il est recommandé de consulter le document explicatif accompagnant le projet de ligne directrice de l’OCDE sur l’essai d’irritation cutanée in vitro avant de développer et de 
valider une méthode in vitro sur épiderme humain reconstitué similaire ou 
modifiée et de la soumettre en vue d’une adoption réglementaire (23).
 
DÉFINITIONS  
6. Les définitions utilisées figurent à l’appendice 1.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES  
7. L’une des limites de la présente méthode d’essai, comme l’a démontré 
l’étude de validation (16), est qu’elle ne permet pas la classification des produits chimiques dans la catégorie facultative 3 du SGH de l’ONU (1). Lorsqu’elle est utilisée en tant que méthode d’essai partiellement substitu ­
tive, un essai ultérieur in vivo peut être nécessaire pour compléter la carac ­
térisation du potentiel d’irritation cutanée (4 et chapitre B.4 de la présente annexe). Il est entendu que l’utilisation de peau humaine est soumise à des conditions et considérations d’éthique nationales et internationales.
 
8. La présente méthode d’essai se rapporte au volet «irritation cutanée in 
vitro» de la stratégie d’essai à plusieurs niveaux proposée dans le chapitre B.4 (LD 404 de l’OCDE) pour les essais d’irritation/corrosion cutanée (4). Si elle ne fournit pas d’informations appropriées sur la corro ­
sion cutanée, on notera cependant que le chapitre B.40  bis (LD 431 de 
l’OCDE) relatif à la corrosion cutanée, bien que faisant appel à un protocole différent, est basée sur le même système d’essai sur épiderme humain reconstitué (chapitre B.40  bis). La présente méthode a recours à des 
modèles d’épiderme humain reconstitué utilisant des kératinocytes humains, 
et reproduisant donc in vitro l’organe cible de l’espèce étudiée. De plus, elle couvre directement l’étape initiale de la cascade inflammatoire/du méca ­
nisme d’action (lésions cellulaires et tissulaires causant un traumatisme 
localisé) survenant au cours de l’irritation in vivo. Les essais réalisés 
dans le cadre de l’étude de validation sous-tendant cette méthode d’essai ont porté sur un large éventail de produits chimiques; la base de données empiriques de cette étude totalisait 58 produits chimiques (16) (18) (23). La 
présente méthode d’essai peut être utilisée pour tester des solides, des 
liquides, des semi-solides et des cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Si possible, les solides sont moulus finement avant application; aucun autre 
prétraitement de l’échantillon n’est nécessaire. Les gaz et les aérosols n’ont 
pas encore fait l’objet d’une étude de validation (24). Bien qu’il soit envi ­
sageable de pouvoir tester des gaz et des aérosols en faisant appel à de l’épiderme humain reconstitué, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de 
tester les produits de ce type. Il convient aussi de noter que les produits 
chimiques fortement colorés peuvent interférer avec les mesures de la viabi ­
lité cellulaire et nécessitent l’utilisation de témoins adaptés pour corriger ces interférences (voir les paragraphes 24-26).
 
9. Une seule expérience réalisée à l’aide de trois réplicats de tissus identiques 
devrait suffire pour tester les substances dont la classification est sans équivoque. En revanche, dans le cas de résultats ambigus, tels que des mesures non concordantes pour les différents réplicats et/ou une viabilité 
moyenne égale à 50 ± 5 %, une seconde expérience est envisagée, voire 
une troisième en cas de résultats discordants entre les deux premières.
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PRINCIPE DE L’ESSAI  
10. La substance d’essai est appliquée localement sur un modèle tridimen ­
sionnel d’épiderme humain reconstitué, composé de kératinocytes non trans ­
formés prélevés sur épiderme humain et mis en culture pour former un modèle multicouche hautement différencié d’épiderme humain. Ce modèle se compose de couches organisées (basale, épineuse et granuleuse), ainsi 
que d’un  stratum corneum  multicouche contenant des couches lipidiques 
lamellaires intercellulaires représentant les principales classes de lipides, similaires à celles que l’on observe in vivo.
 
11. L’irritation cutanée consécutive à l’application d’un produit chimique, qui 
se manifeste par des érythèmes ou des œdèmes, résulte d’une cascade d’évènements débutant par la pénétration du  stratum corneum  et la lésion 
des couches sous-jacentes de kératinocytes. En mourant, les kératinocytes 
rejettent des médiateurs à l’origine de la cascade inflammatoire qui agit sur 
les cellules du derme, en particulier les cellules stromales et endothéliales. C’est la dilatation et la perméabilité accrue des cellules endothéliales qui sont responsables des érythèmes et des oedèmes observés (24). Les 
méthodes fondées sur l’utilisation d’épiderme humain reconstitué permettent 
de mesurer les événements déclencheurs de la cascade.
 
12. La viabilité cellulaire des modèles d’épiderme humain reconstitué est 
mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT [bromure 
de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, numéro CAS 298- 93-1] en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extrac ­
tion des tissus (25). Les produits chimiques irritants sont mis en évidence 
par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéter ­
miné (≤ 50 %, pour la catégorie 2 du SGH de l’ONU/règlement CLP de 
l’Union européenne). En fonction du cadre législatif dans lequel les résultats 
de la présente méthode d’essai sont utilisés, les produits chimiques produi ­
sant une viabilité cellulaire supérieure au seuil défini peuvent être consi ­
dérés comme non irritants (> 50 %, sans catégorie).
 
DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES  
13. Avant d’appliquer en routine l’une des trois méthodes validées conformes à 
la présente méthode d’essai, les laboratoires font la preuve de leur compé ­
tence technique en utilisant les 10 produits chimiques de référence énumérés au tableau 1. Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une 
méthode similaire développée conformément à cette méthode d’essai, ou 
une variante d’une des trois méthodes validées, il convient de répondre aux normes de performance décrites à l’appendice 2 de la présente méthode d’essai.
 
14. Dans le cadre de la démonstration des compétences, il est recommandé à 
l’utilisateur de contrôler les propriétés de barrière des tissus dès réception, 
comme précisé par le producteur du modèle d’épiderme humain recons ­
titué. Cette étape est particulièrement importante lorsque les tissus sont transportés sur de longues distances/durées. Lorsqu’une méthode a été établie avec succès, et que le laboratoire a démontré sa maîtrise de 
cette méthode, il ne sera plus nécessaire de procéder systématiquement 
à cette vérification. Toutefois, pour les méthodes utilisées en routine, il est recommandé de continuer à évaluer les propriétés de barrière des tissus à intervalles réguliers.
 
Tableau 1  
Produits chimiques de référence  ( 1 ) 
Produit chimique Numéro CAS Score in vivo (  2 ) État physique Catégorie du SGH de 
l’ONU/règlement 
CLP de l’Union 
européenne  
acide naphtylacétique 86-87-3 0 solide sans catégorie 
isopropanol 67-63-0 0,3 liquide sans catégorie  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 655
 
Produit chimique Numéro CAS Score in vivo (  2 ) État physique Catégorie du SGH de 
l’ONU/règlement 
CLP de l’Union 
européenne  
stéarate de méthyle 112-61-8 1 solide sans catégorie 
butyrate d’heptyle 5870-93-9 1,7 liquide sans catégorie  
(cat. 3 faculta ­
tive) ( 3 ), ( 4 ) 
salicylate d’hexyle 6259-76-3 2 liquide sans catégorie 
(cat. 3 faculta ­
tive) ( 3 ), ( 4 ) 
3-p-cuményl-2-méthylpropionaldéhyde 103-95-7 2,3 liquide catégorie 2 
1-bromohexane 111-25-1 2,7 liquide catégorie 2 hydroxyde de potassium (solution 
aqueuse à 5 %) 1310-58-3 3 liquide catégorie 2 
1-méthyl-3-phényl-1-pipérazine 5271-27-2 3,3 solide catégorie 2 
heptanal 111-71-7 3,4 liquide catégorie 2
 
( 1 ) Ces produits chimiques de référence constituent un sous-ensemble des produits chimiques de référence utilisés dans l’étude de  
validation. 
( 2 ) Score in vivo d’après B.4 et la ligne directrice 404 de l’OCDE (4). 
( 3 ) Dans cette méthode d’essai, les substances classées dans la catégorie facultative 3 du SGH de l’ONU (matières faiblement irri tantes) 
(1) sont considérées comme «sans catégorie». 
( 4 ) La catégorie 3 (facultative) du SGH de l’ONU n’est pas applicable dans le cadre du règlement CLP de l’Union européenne.  
PROTOCOLE  
15. Les éléments et le protocole d’une méthode d’irritation cutanée sur 
épiderme humain reconstitué sont décrits ci-après. Un modèle d’épiderme 
humain est reconstitué; le laboratoire peut le préparer lui-même ou l’obtenir dans le commerce. Il existe des modes opératoires normalisés pour les 
méthodes EpiSkin
 TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) et SkinEthic  TM RHE 
(26) (27) (28). Les essais se dérouler dans les conditions suivantes:  
Éléments de la méthode d’essai sur épiderme humain reconstitué  
Conditions générales  
16. L’épithélium est reconstruit à partir de kératinocytes humains non trans ­
formés. Plusieurs couches de cellules épithéliales viables (couche basale,  
stratum spinosum , stratum granulosum ) doivent être présentes sous un  
stratum corneum  fonctionnel. Le  stratum corneum  doit comporter plusieurs 
couches présentant le profil lipidique nécessaire pour constituer une barrière 
fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide des substances marqueurs cytotoxiques telles que le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-100. La fonction de barrière est démontrée 
et peut être évaluée soit en déterminant la concentration à laquelle une 
substance marqueur réduit la viabilité des tissus de 50 % (CI
 50 ) après un 
temps d’exposition donné, soit en définissant le temps d’exposition requis pour réduire la viabilité des cellules de 50 % (TE
 50 ) après application de la 
substance marqueur à une concentration fixe déterminée. Le modèle d’épi ­
derme humain reconstitué présente des propriétés de confinement suffisantes pour éviter que de la matière puisse contourner le  stratum corneum  pour 
atteindre les tissus viables, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de 
l’exposition cutanée. Enfin, le modèle est exempt de toute contamination 
bactérienne, virale, mycoplasmique ou mycosique.
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Conditions fonctionnelles  
Viabilité  
17. La viabilité est mesurée au moyen du colorant MTT (25). Les utilisateurs 
du modèle d’épiderme humain reconstitué font en sorte que chaque lot 
utilisé réponde aux critères définis pour le témoin négatif (TN). La densité optique (DO) du solvant d’extraction seul est suffisamment faible, c’est-à-dire < 0,1. Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et 
supérieure) pour le témoin négatif (dans les conditions de la méthode 
d’essai d’irritation cutanée) est établie par le développeur/fournisseur du modèle d’épiderme humain reconstitué. Les plages d’acceptabilité pour les trois méthodes validées sont indiquées dans le tableau 2. Il est démontré 
que les tissus traités par le témoin négatif sont stables en culture (c’est-à- 
dire qu’ils présentent des mesures de viabilité comparables) tout au long de la période d’exposition.
 
Tableau 2  
Plages d’acceptabilité pour la DO du témoin négatif  
Valeur limite inférieure 
d’acceptation Valeur limite supérieure 
d’acceptation  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Fonction de barrière  
18. Le  stratum corneum  et sa composition lipidique doivent être suffisants pour 
résister à la pénétration rapide de substances marqueurs cytotoxiques telles que le SDS ou le Triton X-100. Cette capacité est évaluée par la CI
 50 et le 
TE 50 (tableau 3).  
Morphologie  
19. L’examen histologique du modèle d’épiderme humain reconstitué doit 
mettre en évidence une structure semblable à celle de l’épiderme humain (comprenant notamment un  stratum corneum  multicouche).
 
Reproductibilité  
20. La reproductibilité dans le temps des résultats obtenus à l’aide des témoins 
positifs et négatifs est démontrée.  
Contrôle de qualité  
21. Il incombe au développeur/fournisseur du modèle d’épiderme humain 
reconstitué de garantir et de démontrer que chaque lot utilisé répond à des critères de fabrication définis, dont les plus pertinents sont ceux relatifs 
à la viabilité (paragraphe 17), à la fonction de barrière (paragraphe 18) et à 
la morphologie (paragraphe 19). Ces informations sont communiquées aux utilisateurs, afin qu’ils puissent les inclure dans le rapport d’essai. Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour les 
valeurs CI
 50 ou TE  50 est établie par le développeur/fournisseur d’épiderme 
humain (ou l’investigateur en cas d’utilisation d’un modèle «maison»). Seuls les résultats obtenus à l’aide de tissus répondant à ces critères pour ­
ront être retenus pour prédire de façon fiable les effets irritants des subs ­
tances testées. À titre d’exemple, les plages d’acceptabilité pour les trois 
méthodes validées sont indiquées dans le tableau 3.
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Tableau 3  
Exemples de critères de contrôle de qualité des lots  
Valeur limite inférieure 
d’acceptation Valeur limite supérieure 
d’acceptation  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 heures de traitement par 
SDS) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 h ET  50 = 8,7 hr 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 hr ET  50 = 9,0 h  
Application des substances et mélanges chimiques d’essai et des substances et 
mélanges chimiques témoins  
22. Il convient d’utiliser au minimum trois réplicats par essai pour chaque 
substance d’essai et pour les témoins. Pour les substances liquides comme pour les substances solides, il convient d’appliquer une quantité suffisante de substance et mélange chimiques d’essai pour recouvrir unifor ­
mément la surface de la peau, sans pour autant utiliser une dose infinie, 
c’est-à-dire au minimum 25 μL/cm2 ou 25 mg/cm2. Dans le cas de subs ­
tances ou mélanges solides, il convient d’humidifier la surface de l’épi ­
derme avec de l’eau déionisée ou distillée avant application, afin d’assurer 
un bon contact entre la substance et mélange chimique d’essai et la surface 
de l’épiderme. Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d’une poudre fine. À la fin de la période d’exposition, la surface de l’épiderme est nettoyée avec soin à l’aide d’un tampon aqueux 
ou de NaCl à 0.9 %, afin d’éliminer la substance d’essai. En fonction de la 
méthode validée utilisée, la période d’exposition peut varier entre 15 et 60 minutes et la température d’incubation entre 20 et 37 °C. Les durées et températures d’exposition sont optimisées pour chacune des méthodes sur 
épiderme humain reconstitué, et tiennent compte des propriétés intrinsèques 
de chaque méthode. Pour de plus amples informations, voir les modes opératoires normalisés des trois méthodes (26) (27) (28).
 
23. Des témoins négatifs (TN) et positifs (TP) sont utilisés simultanément pour 
chaque étude afin de démontrer que la viabilité (dans le cas du TN), la fonction de barrière et la sensibilité tissulaire qui en résulte (dans le cas du 
TP) se situent dans une fourchette historique définie de valeurs acceptables. 
La substance recommandée en tant que TP est une solution aqueuse de SDS à 5 %. Pour les TN, il est recommandé d’utiliser de l’eau ou une solution saline tamponnée au phosphate [phosphate buffered saline (PBS)].
 
Mesures de la viabilité cellulaire  
24. L’aspect le plus important du protocole est que les mesures de la viabilité 
ne sont pas réalisées immédiatement après l’exposition aux substances d’es ­
sai, mais après une période d’incubation posttraitement suffisamment longue des tissus rincés dans un milieu frais. Cette période permet aussi bien la disparition des effets faiblement cytotoxiques que l’apparition d’effets cyto ­
toxiques manifestes. Durant la phase d’optimisation de l’essai (11) (12) (13) 
(14) (15), une période d’incubation posttraitement de 42 heures s’est révélée optimale.
 
25. Le test du MTT est une méthode quantitative validée, recommandée pour 
mesurer la viabilité cellulaire dans le cadre de cette méthode d’essai. Elle est compatible avec une utilisation sur un modèle tissulaire tridimensionnel. 
L’échantillon de tissu est placé dans une solution MTT à la concentration 
appropriée (par exemple 0,3-1 mg/mL) pendant 3 heures. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l’aide d’un solvant (ex.: isopropanol, isopropanol acide), et l’on mesure la concentration du formazan en déter ­
minant sa DO à 570 nm à l’aide d’un filtre passe-bande de ± 30 nm au 
maximum.
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26. Les propriétés optiques de la substance d’essai ou son action chimique sur 
le MTT sont susceptibles d’interférer avec l’expérience et de conduire à une 
estimation erronée de la viabilité (la substance d’essai pouvant aussi bien inhiber ou faire disparaître la coloration que la provoquer). Cela peut se produire lorsque la substance d’essai n’a pas été totalement éliminée du 
tissu par rinçage ou lorsqu’elle a pénétré dans l’épiderme. Si une substance 
d’essai agit directement sur le MTT (agent réducteur du MTT), est naturel ­
lement colorée, ou si elle se colore durant le traitement du tissu, des contrôles supplémentaires sont pratiqués pour détecter et corriger les inter ­
férences de la substance d’essai avec la mesure de la viabilité. On trouvera 
une description détaillée de la manière de corriger la réduction directe du MTT ou les interférences dues aux agents colorants dans le mode opératoire normalisé des trois méthodes validées (26) (27) (28).
 
Critères d’acceptabilité  
27. Pour chaque méthode faisant appel à des lots valables d’épiderme humain 
reconstitué (voir paragraphe 21), les tissus traités par le témoin négatif (TN) 
présentent une DO rendant compte de la qualité des tissus ayant été soumis 
à toutes les étapes d’expédition et de réception ainsi qu’à l’intégralité du protocole. Les valeurs de DO des témoins ne sont pas inférieures aux limites historiques. De la même façon, les résultats obtenus pour les 
tissus traités par le témoin positif (TP), c’est-à-dire la solution aqueuse de 
SDS à 5 %, rendent compte de leur capacité à réagir à un produit chimique irritant dans les conditions de la méthode d’essai (26) (27) (28). Il y a lieu de définir les mesures associées et appropriées de la variabilité entre les 
réplicats de tissu (par exemple, si des écarts types sont utilisés, ils se situent 
dans l’intervalle unilatéral de tolérance à 95 % calculé à partir des données historiques; pour la MRV, l’écart type est ≤ 18 %).
 
Interprétation des résultats et modèle prédictif  
28. La valeur de DO obtenue pour chaque substance d’essai peut être utilisée 
pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire normalisé par rapport au 
témoin négatif, lequel correspond à une viabilité cellulaire arbitrairement 
fixée à 100 %. La valeur seuil du pourcentage de viabilité cellulaire, qui établit la distinction entre les substances d’essai irritantes et les substances d’essai non classées, de même que les procédures statistiques utilisées pour 
évaluer les résultats et identifier les substances irritantes, sont clairement 
définies et étayées par des données. Il conviendra par ailleurs de démontrer leur pertinence. Les valeurs seuils permettant de prédire les effets irritants sont indiquées ci-dessous:
 
— La substance d’essai est considérée comme irritante pour la peau confor ­
mément à la catégorie 2 du SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union 
européenne, si la viabilité du tissu après exposition et incubation post ­
traitement est inférieure ou égale ( ≤) à 50 %.  
— Selon le cadre législatif dans lequel les résultats de la présente méthode 
d’essai sont utilisés, la substance chimique d’essai peut être considérée comme non irritante pour la peau conformément à l’absence de caté ­
gorie du SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union européenne, si la 
viabilité du tissu après exposition et incubation posttraitement est supé ­
rieure (>) à 50 %.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
29. Pour chaque essai, il convient de présenter, sous forme de tableau, 
les résultats obtenus pour chaque réplicat de tissu (par exemple, les valeurs de DO et le pourcentage de viabilité cellulaire calculé pour 
chaque substance d’essai, ainsi que la classification correspondante), y 
compris les données obtenues, le cas échéant, en reproduisant les expériences. Il conviendra en outre de préciser les valeurs moyennes ± écart type correspondant à chaque essai. Les interactions observées 
avec le réactif MTT et les substances d’essai colorées seront signa ­
lées pour chaque substance testée.
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Rapport d’essai  
30. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:  
Produits chimiques d’essai et témoin:  
— nom(s) chimique(s), tels que le nom CAS, le numéro CAS, le nom et le 
numéro CE, s’ils sont connus,  
— pureté et composition du produit chimique (en pourcentage en poids),  
— propriétés physico-chimiques importantes pour l’exécution de l’essai 
(par exemple, état physique, stabilité, volatilité, pH et hydrosolubilité, s’ils sont connus),
 
— le cas échéant, traitement des produits chimiques d’essai/témoins avant 
l’essai (par exemple, chauffage, réduction en poudre),  
— conditions de stockage.  
Justification du choix du modèle d’épiderme humain reconstitué et du 
protocole utilisé  
Conditions de l’essai:  
— système cellulaire utilisé,  
— informations complètes sur le modèle spécifique d’épiderme humain 
reconstitué utilisé, et notamment sur ses performances, à savoir (liste non limitative):
 
i) viabilité,  
ii) fonction de barrière,  
iii) morphologie,  
iv) reproductibilité et valeur prédictive,  
v) contrôles de qualité (CQ) du modèle,  
— détails du protocole utilisé,  
— doses d’essai utilisées, durée de l’exposition et de la période d’incuba ­
tion posttraitement,  
— description de toute modification éventuelle du protocole,  
— référence aux données historiques du modèle, à savoir (liste non limi ­
tative):  
i) acceptabilité des données de CQ par rapport aux données historiques 
des lots,  
ii) acceptabilité des valeurs des témoins positifs et négatifs par rapport 
aux moyennes et aux fourchettes des témoins positifs et négatifs,  
— description des critères d’évaluation utilisés, notamment justification du 
choix des valeurs-seuils pour le modèle prédictif,  
— référence aux données témoins historiques.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 660
 
Résultats:  
— présentation sous forme de tableau des résultats de chaque produit 
chimique d’essai pour chaque essai et chaque mesure de réplicat,  
— indication des témoins utilisés pour les agents réducteurs directs du 
MTT et/ou pour les produits chimiques d’essai colorants,  
— description des autres effets observés.  
Discussion des résultats  
Conclusions  
BIBLIOGRAPHIE  
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 ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 663
 
Appendice 1  
Définitions  
CI 50 : valeur pouvant être estimée en déterminant la concentration d’une subs ­
tance marqueur qui réduit la viabilité des tissus de 50 % (CI  50 ) après un temps 
d’exposition déterminé. Voir également TE  50 . 
Concordance:  mesure de performance pour les méthodes d’essai produisant des 
résultats relatifs à des catégories. Elle constitue un des aspects de la pertinence. Ce terme est utilisé indifféremment à la place de «précision», et se définit comme la proportion de toutes les substances chimiques testées qui ont été correctement 
classées comme positives ou négatives (9).
 
Dose infinie:  quantité de substance d’essai appliquée sur la peau qui dépasse la 
quantité requise pour recouvrir entièrement et uniformément la surface de l’épi ­
derme.  
Essai substitutif:  essai conçu pour remplacer un essai utilisé en routine et accepté, 
servant à l’identification des dangers et/ou à l’évaluation de risques, et dont il a été démontré qu’il assure, par rapport à l’essai accepté, une protection équiva ­
lente ou accrue de la santé humaine ou animale ou de l’environnement, selon les 
cas, pour toutes les situations et substances chimiques d’essai possibles (9).
 
Fiabilité:  mesure dans laquelle une méthode d’essai peut être reproduite au fil du 
temps par un même laboratoire ou par plusieurs laboratoires en utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité intralaboratoire et 
interlaboratoires (9).
 
Irritation cutanée:  apparition sur la peau de lésions réversibles à la suite de 
l’application d’une substance d’essai pendant une durée pouvant aller jusqu’à quatre heures. L’irritation cutanée est une réaction locale, non immunogène, 
qui se manifeste peu après une stimulation (29). Elle se caractérise essentielle ­
ment par un processus réversible impliquant des réactions inflammatoires et la plupart des signes cliniques caractéristiques de l’irritation (érythème, œdème, démangeaisons et douleur) qui sont associés au processus inflammatoire.
 
Normes de performance:  normes, fondées sur une méthode d’essai validée, 
permettant d’évaluer la comparabilité d’une méthode d’essai proposée, structu ­
rellement et fonctionnellement similaire. Elles comprennent: i) les éléments essentiels de la méthode d’essai, ii) une liste minimale de produits chimiques 
de référence choisis parmi ceux utilisés pour démontrer les performances accep ­
tables de la méthode d’essai validée, et iii) les niveaux de précision et de fiabilité comparables à ceux obtenus pour la méthode d’essai validée, que la méthode d’essai proposée doit présenter lorsqu’on l’évalue à l’aide des produits chimiques 
de référence de la liste minimale (9).
 
Pertinence:  description de la relation entre l’essai et l’effet étudié, et détermina ­
tion de son adéquation et de son utilité à des fins spécifiques. Elle définit le degré auquel l’essai mesure ou prédit correctement l’effet biologique d’intérêt. La 
pertinence tient compte de la précision (concordance) d’une méthode d’essai (9).
 
Précision:  degré de conformité entre les résultats de la méthode d’essai et les 
valeurs de référence acceptées. Elle constitue une mesure de performance de la méthode d’essai et l’un des aspects de sa pertinence. Ce terme est souvent utilisé indifféremment à la place de «concordance» pour qualifier la proportion de 
résultats corrects d’une méthode d’essai (9).
 
Produits chimiques de référence:  produits chimiques choisis pour être utilisés 
dans le processus de validation, dont les réponses dans le système d’essai de référence in vitro ou in vivo ou sur l’espèce d’intérêt sont déjà connues. Ils 
doivent être représentatifs des classes de produits chimiques auxquelles il est 
prévu d’appliquer la méthode d’essai, et couvrir la gamme complète des réponses attendues des produits chimiques pour lesquels la méthode d’essai est conçue, qu’elles soient fortes, faibles, ou négatives. Les différentes étapes du processus 
de validation, ainsi que différentes méthodes d’essai et utilisations d’essais, 
peuvent exiger des groupes de produits chimiques de référence différents (9).
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Règlement CLP de l’Union européenne (règlement de la Commission européenne 
relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances 
chimiques et des mélanges):  vise la mise en œuvre dans l’Union 
européenne (UE) du SGH de l’ONU pour la classification des produits chimiques (substances et mélanges) (3).
 
Réplique d’essai:  méthode d’essai structurellement et fonctionnellement similaire 
à une méthode de référence validée et acceptée. Ce type d’essai peut éventuel ­
lement faire l’objet d’une validation accélérée. Synonyme de méthode d’essai similaire (9).
 
Sensibilité:  proportion des substances d’essai positives/actives qui sont correcte ­
ment classées par l’essai. Elle permet de mesurer la précision d’une méthode 
d’essai produisant des résultats relatifs à des catégories, et constitue un élément 
important à prendre en considération pour évaluer la pertinence d’une méthode d’essai (9).
 
SGH [Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits 
chimiques des Nations unies (ONU)]:  système proposant la classification des 
produits chimiques (substances et mélanges) conformément à des types et des niveaux normalisés de dangers physiques, sanitaires et environnementaux, ainsi que la communication des éléments d’information correspondants, notamment par 
des pictogrammes, mentions d’avertissement, mentions de danger, conseils de 
prudence et fiches de données de sécurité, afin de diffuser des informations sur leurs effets indésirables dans le but de protéger les personnes (en particulier les employeurs, employés, transporteurs, consommateurs et personnels des 
services d’urgence) et l’environnement (1).
 
Spécificité:  proportion des substances d’essai négatives/inactives qui sont correc ­
tement classées par l’essai. Elle permet de mesurer la précision d’une méthode d’essai produisant des résultats relatifs à des catégories, et constitue un élément important à prendre en considération pour évaluer la pertinence d’une méthode 
d’essai (9).
 
Stratégie d’essai à plusieurs niveaux:  essai faisant appel à plusieurs méthodes de 
manière séquentielle; les méthodes d’essai sélectionnées à chaque niveau sont déterminées par les résultats du niveau d’essai précédent (9).
 
Substance d’essai (également dénommée substance chimique d’essai):  toute subs ­
tance et tout mélange testés selon la présente méthode d’essai.  
TE 50 : valeur pouvant être estimée en déterminant le temps d’exposition néces ­
saire pour réduire la viabilité cellulaire de 50 % après application de la substance marqueur à une concentration fixe spécifiée. Voir également CI
 50 . 
Viabilité cellulaire:  paramètre mesurant l’activité totale d’une population cellu ­
laire, par exemple la capacité des déshydrogénases mitochondriales cellulaires à 
réduire le colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphé ­
nyltétrazolium], qui, selon l’effet mesuré et le protocole utilisé pour l’essai, est en corrélation avec le nombre total et/ou la vitalité des cellules vivantes.
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Appendice 2  
Normes de performance pour l’évaluation de méthodes similaires ou 
modifiées proposées pour les essais d’irritation cutanée in vitro sur 
épiderme humain reconstitué  
INTRODUCTION  
1. L’objectif des normes de performance est d’indiquer sur quelles bases 
évaluer la précision et la fiabilité de nouvelles méthodes d’essai vis-à-vis 
d’objectifs définis, que ces méthodes soient protégées (par des droits d’au ­
teur, une marque déposée ou un enregistrement) ou non. Conçues à partir de méthodes validées et acceptées, ces normes peuvent également servir à 
évaluer la fiabilité et la précision d’autres méthodes analogues (aussi appe ­
lées «essais répliques»), fondées sur des principes scientifiques et permet ­
tant de quantifier ou prévoir le même effet biologique ou toxique (9).
 
2. Avant d’adopter des méthodes modifiées, c’est-à-dire les améliorations 
proposées d’une méthode approuvée, il convient de déterminer quel peut être l’effet des modifications envisagées sur les performances de l’essai, et dans quelle mesure ces modifications influent sur les informa ­
tions disponibles pour les autres éléments du processus de validation. En 
fonction du nombre et de la nature des changements proposés, des données générées et des documents justificatifs associés, le processus de validation sera le même que pour un nouvel essai ou, le cas échéant, 
limité à une évaluation de la fiabilité et de la pertinence sur la base des 
normes de performance établies (9).
 
3. La fiabilité et la précision des méthodes d’essai similaires (répliques) ou des 
variantes de l’une des trois méthodes validées [EpiSkin  TM (méthode de 
référence validée, MRV), EpiDerm  TM SIT (EPI-200) et SkinEthic  TM 
RHE] proposées dans la présente méthode d’essai sont évaluées à l’aide 
de produits chimiques représentant l’éventail complet des scores d’irritation 
de Draize. Les valeurs de fiabilité et de précision obtenues, lors de l’éva ­
luation des méthodes similaires ou modifiées proposées, à l’aide des 20 produits chimiques de référence recommandés dans les normes de perfor ­
mance (tableau 1) sont comparables à celles obtenues par la MRV ou 
meilleures que celles-ci (tableau 2) (2) (16). Les valeurs de fiabilité et de 
précision à atteindre sont indiquées aux paragraphes 8 à 12 du présent appendice. Des substances non classées («sans catégorie» dans le SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union européenne) et classées (catégorie 2 du 
SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union européenne) (1) représentant 
différentes classes chimiques sont incluses afin que la fiabilité et la préci ­
sion (sensibilité, spécificité et précision globale) de la méthode d’essai proposée puissent être comparées à celles de la MRV. Avant d’appliquer 
une méthode pour tester de nouveaux produits chimiques, il convient de 
déterminer sa fiabilité et son aptitude à détecter correctement les substances chimiques irritantes de la catégorie 2 du SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union européenne ainsi que, selon le cadre réglementaire pour lequel les 
données sont produites, son aptitude à détecter correctement les substances 
chimiques ne relevant d’aucune catégorie du SGH.
 
4. Ces normes de performance sont fondées sur celles du ECVAM (8), mises à jour 
conformément aux systèmes SGH de l’ONU et CLP de l’Union européenne sur 
la classification et l’étiquetage (1) (3). Les normes de performance d’origine ont été définies à l’issue de l’étude de validation (21) et établies sur la base du système de classification de l’Union européenne tel que figurant dans la direc ­
tive 2001/59/CE de la Commission du 6 août 2001 portant vingt-huitième 
adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concer ­
nant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et adminis ­
tratives relatives à la classification, l’emballage et l’étiquetage des substances 
dangereuses (
 1 ). À la suite de l’adoption par l’Union européenne du système  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 666  
( 1 ) JO L 225 du 21.8.2001, p. 1.
 SGH de l’ONU pour la classification et l’étiquetage des substances chimiques 
(CLP de l’Union européenne) (3), intervenue entre la finalisation de l’étude de 
validation et l’achèvement de la présente méthode d’essai, les normes de perfor ­
mance ont été mises à jour (8). Les modifications portent principalement sur: i) l’ensemble de produits chimiques de référence utilisé dans les 
normes de performance; et ii) les valeurs définies pour la fiabilité et la 
précision (2) (23).
 
NORMES DE PERFORMANCE POUR LES MÉTHODES D’ESSAI D’IRRI ­
TATION CUTANÉE IN VITRO SUR ÉPIDERME HUMAIN RECONSTITUÉ  
5. Les normes de performance se composent des trois éléments suivants (9):  
I) les éléments essentiels de la méthode d’essai  
II) une liste minimale de produits chimiques de référence  
III) des valeurs définies de fiabilité et de précision  
I) Éléments essentiels de la méthode d’essai  
6. Il s’agit des éléments structurels, fonctionnels et procéduraux essentiels 
d’une méthode d’essai validée qui figurent dans le protocole de toute 
méthode structurellement et fonctionnellement similaire ou modifiée propo ­
sée. Ces éléments recouvrent les caractéristiques propres de la méthode, la description des points clés de la procédure et les mesures de contrôle de qualité. Le respect de ces éléments essentiels contribuera à garantir que les 
méthodes similaires ou modifiées proposées sont fondées sur les mêmes 
concepts que la MRV correspondante (9). Les éléments essentiels de la méthode d’essai sont décrits en détail aux paragraphes 16 à 21 de la 
présente méthode d’essai, et l’essai est réalisé de la manière suivante:
 
— conditions générales (paragraphe 16),  
— conditions fonctionnelles, comprenant:  
— viabilité (paragraphe 17),  
— fonction de barrière (paragraphe 18),  
— morphologie (paragraphe 19),  
— reproductibilité (paragraphe 20),  
— contrôle de qualité (paragraphe 21).  
II) Liste minimale de produits chimiques de référence  
7. Les produits chimiques de référence sont utilisés pour déterminer si la 
fiabilité et la précision d’une méthode proposée similaire ou modifiée, dont on a démontré qu’elle était suffisamment similaire à la MRV sur les plans structurel et fonctionnel ou qu’elle représentait une modification 
mineure par rapport à l’une des trois méthodes validées, sont comparables 
à celles de la MRV ou meilleures que celles-ci (2) (8) (16) (23). Les 20 produits chimiques de référence recommandés figurant dans le tableau 1 comprennent des substances représentant différentes classes chimiques 
(catégories chimiques basées sur des groupes fonctionnels) et représenta ­
tives de l’éventail complet des scores d’irritation de Draize (des substances non irritantes aux substances fortement irritantes). Le tableau comprend dix substances classées dans la catégorie 2 du SGH de l’ONU/règlement CLP 
de l’Union européenne et 10 substances non classées, parmi lesquelles trois 
relèvent de la catégorie 3 facultative du SGH de l’ONU. Aux fins de la présente méthode d’essai, la catégorie 3 facultative du SGH de l’ONU équivaut à «sans catégorie». Les produits chimiques figurant dans le 
tableau 1 sont sélectionnés parmi ceux qui sont utilisés lors de la phase 
d’optimisation consécutive à l’étude de prévalidation et de validation de
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la MRV, eu égard à leur fonction chimique et leur état physique (14) (18). 
Ces produits chimiques de référence représentent le nombre minimal de 
substances à utiliser pour évaluer la précision et la fiabilité d’une méthode proposée similaire ou modifiée, mais ne sont pas utilisés pour le développement de nouvelles méthodes. Si une substance du tableau n’est 
pas disponible, il est possible d’utiliser d’autres produits chimiques pour 
lesquels il existe des données de référence in vivo appropriées, choisis en premier lieu parmi ceux utilisés lors de la phase d’optimisation consécutive à l’étude de prévalidation ou de validation de la MRV. Si nécessaire, il est 
possible d’ajouter à cette liste minimale d’autres produits chimiques repré ­
sentant d’autres classes chimiques et pour lesquels on dispose de données de référence in vivo appropriées, afin d’évaluer plus avant la précision de la méthode proposée.
 
Tableau 1  
Liste minimale de produits chimiques de référence pour la détermination des valeurs de précision et de fiabilité 
de méthodes d’irritation cutanée sur épiderme humain reconstitué similaires ou modifiées  ( 1 ) 
Produit chimique Numéro CAS État physique Score in vivo Cat. MRV in 
vitro Cat. SGH/règlement 
CLP de l’Union 
européenne in vivo  
1-bromo-4-chlorobutane 6940-78-9 liquide 0 cat. 2 sans catégorie 
phtalate de diéthyle 84-66-2 liquide 0 sans catégorie sans catégorie 
acide naphtylacétique 86-87-3 solide 0 sans catégorie sans catégorie 
phénoxyacétate d’allyle 7493-74-5 liquide 0,3 sans catégorie sans catégorie 
isopropanol 67-63-0 liquide 0,3 sans catégorie sans catégorie 4-(méthylthio)-benzaldéhyde 3446-89-7 liquide 1 cat. 2 sans catégorie 
stéarate de méthyle 112-61-8 solide 1 sans catégorie sans catégorie 
butyrate d’heptyle 5870-93-9 liquide 1,7 sans catégorie sans catégorie 
salicylate d’hexyle 6259-76-3 liquide 2 sans catégorie sans catégorie 
cinnamaldéhyde 104-55-2 liquide 2 cat. 2 sans catégorie  
(cat. 3 faculta ­
tive) (
 3 ) 
décane-1-ol  ( 2 ) 112-30-1 liquide 2,3 cat. 2 cat. 2  
3-p-cuményl-2-méthylpropio ­
naldéhyde 103-95-7 liquide 2,3 cat. 2 cat. 2 
1-bromohexane 111-25-1 liquide 2,7 cat. 2 cat. 2 
hydrochlorure de 2-chloro ­
méthyl-4-méthoxy-3,5 dimé ­
thyl pyridine 86604-75-3 solide 2,7 cat. 2 cat. 2  
Disulfure de dipropyle  ( 2 ) 629-19-6 liquide 3  sans catégorie  cat. 2  
hydroxyde de potassium (sol. 
aqueuse à 5 %) 1310-58-3 liquide 3 cat. 2 cat. 2 
Méthyl-2 tert-butyle-5 thio ­
phénol; thio PTBT 7340-90-1 liquide 3,3 cat. 2 cat. 2 
1-méthyl-3-phényl-1-pipéra ­
zine 5271-27-2 solide 3,3 cat. 2 cat. 2  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 668
 
Produit chimique Numéro CAS État physique Score in vivo Cat. MRV in 
vitro Cat. SGH/règlement 
CLP de l’Union 
européenne in vivo  
heptanal 111-71-7 liquide 3,4 cat. 2 cat. 2 
tétrachloréthylène 127-18-4 liquide 4 cat. 2 cat. 2  
( 1 ) La sélection des produits chimiques se fonde sur les critères suivants: i) les substances sont disponibles dans le commerce; ii) elles 
sont représentatives de l’éventail complet des scores d’irritation de Draize (des substances non irritantes aux substances très  
irritantes); iii) elles ont une structure chimique bien définie; iv) elles sont représentatives de la fonctionnalité chimique u tilisée pour 
la validation; v) elles ne sont pas associées à un profil extrêmement toxique (cancérogène ou toxique pour la reproduction, par  
exemple) ni à des coûts d’élimination prohibitifs. 
( 2 ) Substances irritantes chez le lapin, mais pour lesquelles il existe des preuves fiables de leur caractère non irritant chez l ’homme (31) 
(32) (33). 
( 3 ) Dans le cadre du SGH de l’ONU, pas dans le cadre du règlement CLP de l’Union européenne.  
III) Valeurs définies de fiabilité et de précision  
8. Afin d’établir la fiabilité et la précision de méthodes similaires ou modifiées 
proposées destinées à des transferts entre laboratoires, les 20 produits chimiques de référence du tableau 1 sont testés dans au moins trois labo ­
ratoires différents. Cependant, si la méthode est destinée à être utilisée dans 
un seul laboratoire, un essai interlaboratoires n’est pas indispensable à la 
validation. Il est toutefois essentiel que ces études de validation soient évaluées de manière indépendante par des organismes de validation reconnus au niveau international, conformément aux lignes directrices inter ­
nationales en la matière (9). Dans chaque laboratoire, les 20 produits 
chimiques de référence font tous l’objet de trois essais indépendants les uns des autres, réalisés sur des lots de tissus différents et à des intervalles de temps suffisamment espacés. Chaque essai comporte au moins trois 
réplicats de tissus testés simultanément pour chaque produit chimique d’es ­
sai, TN et TP.
 
9. Le calcul des valeurs de la fiabilité et de la précision de la méthode 
proposée est effectué en tenant compte des quatre critères ci-dessous, afin 
de garantir qu’il est réalisé de manière prédéfinie et cohérente:  
1. Seules les données issues de séquences d’essais complètes peuvent être 
utilisées pour le calcul de la variabilité intralaboratoire ou interlabora ­
toires de la méthode et de la valeur prédictive (précision).  
2. La classification finale de chaque produit chimique de référence dans 
chaque laboratoire participant est obtenue en utilisant la valeur moyenne 
de la viabilité constatée lors des différents essais réalisés dans le cadre 
d’une séquence d’essais complète.  
3. Seules les données obtenues pour des produits chimiques dont les 
séquences d’essai ont été complétées dans tous les laboratoires partici ­
pants sont retenues pour le calcul de la variabilité interlaboratoires de la 
méthode.  
4. Le calcul des valeurs de précision est réalisé en utilisant les prévisions 
individuelles des laboratoires obtenues pour les 20 produits chimiques de 
référence par les différents laboratoires participants.  
Dans ce contexte, une  séquence d’essais  consiste en trois essais réalisés de 
manière indépendante dans un laboratoire pour un produit chimique d’essai 
donné. Une  séquence d’essais complète  est une séquence d’essais réalisée 
dans un laboratoire pour un produit chimique d’essai, et pour laquelle les trois essais sont recevables. Cela signifie que tout essai non recevable annule la séquence entière des trois essais.
 
Reproductibilité intralaboratoire  
10. L’évaluation de la répétabilité intralaboratoire doit faire apparaître une 
concordance des classifications (catégorie 2 du SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union européenne et «sans catégorie») obtenues par le biais de 
différents essais indépendants réalisés sur les 20 produits chimiques de 
référence par un même laboratoire qui soit supérieure ou égale ( ≥) à 90 %.
 ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 669
 
Reproductibilité interlaboratoire  
11. Il n’est pas indispensable d’évaluer la reproductibilité interlaboratoire si la 
méthode proposée n’est utilisée que dans un seul laboratoire. En ce qui 
concerne les méthodes destinées à être transférées d’un laboratoire à l’autre, la concordance des classifications (catégorie 2 du SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union européenne et «sans catégorie») obtenues par le biais de 
différents essais indépendants réalisés sur les 20 produits chimiques de 
référence par au moins trois laboratoires (de préférence), est supérieure ou égale ( ≥) à 80 %.
 
Valeur prédictive (précision)  
12. La précision (sensibilité, spécificité et précision globale) de la méthode 
similaire ou modifiée proposée est comparable ou supérieure à celle de la MRV, en tenant compte des informations supplémentaires relatives à sa 
pertinence pour les espèces étudiées (tableau 2). La sensibilité est supérieure 
ou égale ( ≥) à 80 % (2) (8) (23). Toutefois, une restriction spécifique 
supplémentaire s’applique à la sensibilité de la méthode in vitro proposée, à savoir que seules deux substances in vivo de catégorie 2, le décane-1-ol et 
le disulfure de dipropyle, peuvent être classées de manière erronée comme 
«sans catégorie» par plus d’un laboratoire participant. La spécificité de la méthode in vitro proposée est supérieure ou égale ( ≥) à 70 % (2) (8) (23). Il 
n’existe aucune restriction supplémentaire concernant la spécificité de la 
méthode d’essai in vitro proposée, c’est-à-dire que tout laboratoire partici ­
pant peut classer de manière erronée comme «sans catégorie» une substance in vivo, pourvu que la spécificité finale de la méthode d’essai reste dans la fourchette acceptable. La précision globale est supérieure ou égale ( ≥) à 
75 % (2) (8) (23). Bien que la sensibilité de la MRV calculée pour les 20 
produits chimiques de référence figurant dans le tableau 1 soit égale à 90 %, la valeur de sensibilité minimum nécessaire pour qu’une méthode similaire ou modifiée soit considérée comme valable est fixée à 80 %, étant 
donné que le décane-1-ol (substance à la limite entre deux catégories) et le 
disulfure de dipropyle (un faux négatif de la MRV) sont connus pour être des produits non irritants chez l’homme (31) (32) (33), même s’ils ont été identifiés comme irritants lors de l’essai chez le lapin. Les modèles d’épi ­
derme humain reconstitué étant construits à l’aide de cellules d’origine 
humaine, ils prédiront sans doute l’absence d’effets irritants de ces subs ­
tances («sans catégorie» dans le SGH de l’ONU/règlement CLP de l’Union 
européenne).
 
Tableau 2  
Valeurs prédictives requises pour la sensibilité, la spécificité et la précision globale pour 
qu’une méthode similaire ou modifiée soit considérée comme valable  
Sensibilité Spécificité Précision globale  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Critères d’acceptation de l’étude  
13. Il est possible qu’un ou plusieurs essai(s) relatif(s) à une ou plusieurs subs ­
tance(s) d’essai ne remplisse(nt) pas les critères d’acceptation pour les subs ­
tances d’essai et témoins, ou qu’il(s) ne soi(en)t pas acceptable(s) pour d’autres raisons. Afin de compléter les données manquantes, deux essais supplémentaires au maximum pour chaque substance d’essai sont autorisés 
(nouvel essai). Plus précisément, étant donné qu’en cas de nouvel essai, les 
TP et TN sont également testés simultanément, deux essais supplémentaires au maximum peuvent être réalisés pour chaque substance d’essai.
 
14. Il est possible que, même après un nouvel essai, le nombre minimum de 
trois essais valables nécessaire pour chaque substance testée ne soit pas atteint pour tous les produits chimiques de référence dans tous les labora ­
toires participants, et que par conséquent la matrice de données obtenue soit 
incomplète. Dans ce cas, il convient de respecter les trois critères suivants afin de pouvoir considérer les jeux de données comme acceptables:
 
1) les 20 produits chimiques de référence font l’objet d’au moins une 
séquence d’essais complète;  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 670
 
2) dans au moins trois laboratoires participants, au minimum 85 % des 
séquences d’essais sont complètes (pour 20 produits chimiques, cela 
signifie trois séquences d’essais non recevables autorisées dans un seul laboratoire);
 
3) au minimum 90 % de toutes les séquences d’essais possibles issues d’au 
moins trois laboratoires sont complètes (pour 20 produits chimiques 
testés dans trois laboratoires, cela signifie six séquences d’essais non 
recevables autorisées au total).  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 671
 
B. 47  MÉTHODE D'ESSAI D'OPACITÉ ET DE PERMÉABILITÉ DE LA 
CORNÉE BOVINE POUR LA MISE EN ÉVIDENCE DES SUBS ­
TANCES CORROSIVES ET FORTEMENT IRRITANTES POUR 
L'ŒIL  
INTRODUCTION  
1. La méthode d'essai d'opacité et de perméabilité de la cornée 
bovine (OPCB) est une méthode d'essai in vitro pouvant être utilisée, dans certaines circonstances, compte tenu de ses limites particulières, 
pour classer des substances et des mélanges dans la catégorie des produits 
«corrosifs et fortement irritants pour l’œil» (1) (2) (3). Aux fins de la présente méthode d'essai, les substances et mélanges fortement irritants sont définis comme ceux qui provoquent des lésions cutanées persistant, 
chez le lapin, au moins 21 jours après administration. Bien qu’elle n’ait 
pas été validée en tant que méthode remplaçant totalement l’essai oculaire in vivo chez le lapin, la méthode OPCB est néanmoins recommandée dans le cadre d’une stratégie d’essai séquentielle visant à établir une classifica ­
tion et un étiquetage réglementaires dans un champ spécifique d’applica ­
tion (4) (5). Les substances et mélanges d’essai (6) peuvent être classés corrosifs ou fortement irritants pour l’œil sans qu’il soit nécessaire de procéder à des essais supplémentaires chez le lapin. En revanche, une 
substance révélant un résultat négatif à l’issue de l’essai a besoin d’être 
testée sur des lapins selon une démarche expérimentale de type séquentiel, telle que celle décrite dans la ligne directrice de l’OCDE n
 o 405 (7) 
(chapitre B.5 de la présente annexe).  
2. L'objet de la présente méthode d'essai est de décrire les procédures utili ­
sées pour évaluer l'effet potentiel corrosif ou fortement irritant pour l'œil 
d'une substance d'essai. Cet effet est mesuré par la capacité de la substance 
à provoquer une opacité et une perméabilité cornéennes accrues sur une cornée bovine isolée. Les effets toxiques pour la cornée sont mesurés par: i) la diminution de la capacité de transmission de la lumière (opacité), et ii) 
l'augmentation du passage de la fluorescéine sodique (perméabilité). Les 
mesures de l'opacité et de la perméabilité de la cornée après exposition à la substance d'essai sont ensuite combinées pour établir le score d'irritation in vitro (SIIV), utilisé pour classer la substance d'essai en fonction de son 
pouvoir irritant.
 
3. Des substances irritantes pour l’œil qui provoquent des lésions se résorbant 
en moins de 21 jours et des substances non irritantes ont également été 
testées par la méthode OPCB. Toutefois, pour les substances entrant dans 
ces catégories, la précision et la fiabilité de cette méthode n'ont pas été évaluées de façon formelle.
 
4. Des définitions sont fournies dans l'appendice 1.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES DE LA MÉTHODE  
5. La présente méthode d'essai est fondée sur le protocole expérimental de la 
méthode OPCB (8) du Comité de coordination interagences pour la vali ­
dation des méthodes alternatives (ICCVAM), élaboré à la suite d’une étude 
de validation internationale (4)(5)(9) à laquelle ont participé le Centre européen pour la validation de méthodes alternatives (ECVAM) et le Centre japonais pour la validation de méthodes alternatives (JaCVAM). 
Ce protocole s’appuie sur des informations provenant de l’Institute for In 
Vitro Sciences (IIVS) et sur le protocole INVITTOX n
 o 124 (10), qui a été 
utilisé lors de l’étude de prévalidation de l’essai OPCB conduite en 1997- 1998 sous l’égide de la Communauté Européenne. Ces protocoles se 
fondent tous deux sur la méthode d’essai OPCB décrite pour la première 
fois par Gautheron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 672
 
6. Les limites connues de cette méthode d’essai concernent le taux élevé de 
faux positifs pour les alcools et les cétones, et le taux élevé de faux 
négatifs pour les substances solides, relevés dans la base de données de validation (voir paragraphe 44) (5). Si l’on exclut de la base de données les substances relevant de ces classes chimiques et physiques, la précision 
de la méthode OPCB au regard des systèmes de classifications de l’UE, de 
l’EPA et du SGH se trouve considérablement améliorée (5). Compte tenu de la finalité de cet essai (qui vise exclusivement à détecter les substances corrosives et fortement irritantes pour l’œil), les taux de faux négatifs ne 
sont pas préoccupants car les substances concernées feront ensuite l’objet 
d’essais chez le lapin ou d’autres essais in vitro dûment validés, confor ­
mément aux exigences de la réglementation, selon une démarche expéri ­
mentale séquentielle fondée sur la force probante des données. De surcroît, 
l’actuelle base de données de validation n’a pas permis de procéder à 
l’évaluation adéquate de certaines classes de substances chimiques ou de produits (par exemple, les mélanges). Les investigateurs peuvent néan ­
moins envisager d’avoir recours à cette méthode d’essai pour tous les 
types de matériel d’essai (y compris les mélanges), auquel cas un résultat 
positif pourrait être interprété comme révélateur d'un effet corrosif ou fortement irritant pour l’œil. Il convient toutefois d’interpréter avec prudence les résultats positifs obtenus avec des alcools ou des cétones 
en raison du risque de surestimation.
 
7. Tous les modes opératoires faisant intervenir des yeux et des cornées de 
bovins doivent être conformes aux réglementations et procédures appli ­
cables à l’installation d’essai en matière de manipulation des produits dérivés d’animaux qui englobent, sans s’y limiter, les tissus et fluides 
tissulaires. Le respect des précautions universelles de laboratoire est 
recommandé (12).
 
8. Bien qu’elle prenne en compte certains des effets oculaires évalués par la 
méthode d’essai d’irritation oculaire chez le lapin, et dans une certaine 
mesure leur degré de gravité, cette méthode d’essai présente toutefois 
l’inconvénient de ne pas prendre en considération les lésions de la conjonctive et de l’iris. De surcroît, même si la méthode OPCB ne permet pas en soi d'évaluer la réversibilité des lésions cornéennes, il a 
été proposé, sur la base d’études menées sur l’œil de lapin, d'utiliser une 
évaluation de la profondeur initiale de la lésion cornéenne pour distinguer les effets réversibles des effets irréversibles (13). Enfin, la méthode OPCB ne permet pas d'évaluer la toxicité systémique potentielle associée à l'ex ­
position oculaire.
 
9. Les travaux visant à mieux caractériser l’utilité et les limites de la méthode 
OPCB pour la mise en évidence des substances faiblement irritantes ou non irritantes se poursuivent (voir également le paragraphe 45). Les utili ­
sateurs sont également incités à fournir des spécimens et/ou des données 
aux organismes de validation à des fins d’évaluation formelle des utilisa ­
tions futures possibles de la méthode d’essai OPCB, notamment pour la mise en évidence des substances faiblement irritantes ou non irritantes.
 
10. Tout laboratoire conduisant cet essai pour la première fois doit utiliser les 
substances chimiques d'épreuve de compétence mentionnées à l'appendice 
2. Un laboratoire pourra faire valoir l’utilisation de ces substances pour démontrer sa compétence technique à conduire un essai selon la méthode OPCB avant de proposer les données issues de l’essai OPCB à des fins de 
classification réglementaire des dangers.
 
PRINCIPE DE L'ESSAI  
11. La méthode d'essai OPCB est un modèle organotypique qui permet de 
maintenir  in vitro  les fonctions physiologiques et biochimiques normales 
de la cornée bovine pendant une courte période. Selon cette méthode, les dommages causés par la substance d’essai sont évalués par des mesures 
quantitatives des modifications de l’opacité et de la perméabilité de la 
cornée réalisées, respectivement, à l’aide d’un opacitomètre et d’un spec ­
trophotomètre visible. Ces deux mesures entrent dans le calcul du SIIV, utilisé pour assigner une catégorie de classification de danger d’irritation  in 
vitro  permettant d’estimer le potentiel d’irritation oculaire  in vivo  d’une 
substance d’essai (voir «Critères de décision»).
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12. La méthode d’essai OPCB utilise des cornées isolées provenant d’yeux de 
bovins récemment abattus. L’opacité cornéenne est mesurée par la quantité 
de lumière traversant la cornée. La perméabilité est mesurée par la quantité de fluorescéine sodique traversant toute l’épaisseur de la cornée, et détectée dans le milieu de la chambre postérieure. Les substances d’essai, 
introduites dans la chambre antérieure du porte-cornée, sont appliquées sur 
la surface épithéliale de la cornée. L’appendice 3 présente une description et un schéma de porte-cornée utilisé dans la méthode OPCB. Ces appareils sont disponibles dans le commerce auprès de différents fabricants, ou 
peuvent être construits.
 
Provenance et âge des yeux de bovins et sélection des espèces animales  
13. Les bovins envoyés à l’abattoir sont généralement destinés à la consom ­
mation humaine ou à d’autres usages commerciaux. Seules les cornées de bêtes en bonne santé, considérées comme propres à intégrer la chaîne alimentaire humaine, sont prélevées pour la méthode OPCB. Le poids 
des bovins variant considérablement en fonction de la race, de l'âge et 
du sexe, il n’existe aucune recommandation spécifique en la matière au moment de l’abattage.
 
14. L’utilisation d’yeux provenant d’animaux d’âges différents peut entraîner 
des variations de dimension des cornées. Les cornées dont le diamètre horizontal est supérieur à 30,5 mm et l’épaisseur cornéenne 
centrale (ECC) supérieure ou égale à 1 100 μm ont généralement été 
prélevées sur des bovins de plus de huit ans, tandis que les cornées ayant un diamètre horizontal inférieur à 28,5 mm et une ECC inférieure à 900 μm proviennent plutôt de bêtes de moins de cinq ans (14). En 
conséquence, les yeux des bovins âgés de plus de 60 mois ne sont géné ­
ralement pas utilisés. En général, les yeux des bovins de moins de 12 mois ne sont pas non plus utilisés, car leur développement n’est pas terminé et 
l'épaisseur ainsi que le diamètre de la cornée sont nettement inférieurs à 
ceux des yeux provenant de bovins adultes. Toutefois, les cornées issues d’animaux jeunes (entre 6 et 12 mois) sont acceptables car elles présentent certains avantages, tels qu’une plus grande disponibilité, une fourchette 
d’âge plus restreinte, et des risques moins importants d'exposition poten ­
tielle à l'encéphalopathie spongiforme bovine (15) pour le personnel. Une évaluation plus poussée des effets de la taille ou de l’épaisseur cornéenne sur la sensibilité aux substances corrosives et irritantes serait d’une grande 
utilité, aussi les utilisateurs sont-ils encouragés à consigner l’âge et/ou le 
poids estimés des animaux ayant fourni les cornées utilisées dans l’étude.
 
Collecte et transport des yeux au laboratoire  
15. Les yeux sont prélevés par les employés des abattoirs. Afin de minimiser 
tout endommagement, mécanique ou autre, des yeux, ceux-ci sont énucléés dès que possible après la mort de l’animal. Pour éviter d’exposer les yeux 
à des substances potentiellement irritantes, les employés de l’abattoir n’uti ­
lisent pas de détergent lors du rinçage de la tête de l’animal.
 
16. Les yeux sont totalement immergés dans une solution saline équilibrée de 
Hank (HBSS), dans un récipient de taille adaptée, et transportés jusqu’au laboratoire en ayant soin de limiter le plus possible tout endommagement et/ou toute contamination bactérienne. Les yeux étant prélevés au cours de 
l'abattage, ils risquent d’entrer en contact avec du sang ou d’autres subs ­
tances biologiques, notamment des bactéries et autres microorganismes. Il importe donc de réduire au minimum le risque de contamination (par exemple en plaçant le récipient contenant les yeux sur de la glace mouil ­
lée, et en ajoutant des antibiotiques à la HBSS utilisée pour le transport 
[100 UI/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, par exemple]).
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17. Il faut limiter au maximum l’intervalle de temps entre le prélèvement des 
yeux et l’utilisation des cornées dans le cadre de l’essai OPCB (l'utilisation 
a en général lieu le jour même du prélèvement) et démontrer qu’il ne compromet pas les résultats de l’essai. Ces résultats dépendent des critères de sélection des yeux, ainsi que des réponses des témoins positifs et 
négatifs. Tous les yeux utilisés dans l'essai proviennent d'un lot d'yeux 
collectés le même jour.
 
Critères de sélection des yeux utilisés dans la méthode OPCB  
18. Une fois parvenus au laboratoire, les yeux sont examinés avec soin pour 
déceler d’éventuels défauts, tels qu'une opacité avancée, des éraflures ou 
une néovascularisation. Seules les cornées d’yeux exempts de tout défaut seront utilisées.
 
19. La qualité de chaque cornée est également évaluée à des stades ultérieurs 
de l’essai. Les cornées présentant une opacité supérieure à sept unités d’opacité (NB: l’opacitomètre est étalonné en fonction des normes d’opa ­
cité utilisées pour définir les unités d’opacité, voir appendice 3) après une 
période initiale d’équilibrage d’une heure sont écartées.
 
20. Chaque lot de traitement (substance d’essai et témoins négatifs et positifs) 
est composé de trois yeux au minimum. L’essai OPCB nécessite trois 
cornées servant de témoins négatifs. Toutes les cornées étant prélevées 
sur le globe oculaire entier puis placées dans les chambres du porte-cornée, les manipulations peuvent entraîner d’éventuels artefacts sur les valeurs de l'opacité et de la perméabilité cornéennes de chaque 
élément (y compris le témoin négatif). Aussi, les valeurs d’opacité et de 
perméabilité mesurées sur les cornées témoins négatives servent-elles à corriger les valeurs d’opacité et de perméabilité cornéennes des spécimens et des témoins traités positifs lors du calcul du score d’irritation in vitro.
 
MODE OPÉRATOIRE  
Préparation des yeux  
21. Des cornées exemptes de tout défaut sont découpées en conservant un 
bord de 2 à 3 mm de sclérotique destiné à faciliter les manipulations ultérieures, et en prenant soin de ne pas endommager l’épithélium et 
l’endothélium cornéens. Les cornées isolées sont placées dans des 
porte-cornées spécialement conçus à cet effet, qui se composent de deux compartiments, antérieur et postérieur, respectivement en contact avec les faces épithéliale et endothéliale de la cornée. Il convient de remplir jusqu’à 
débordement ces deux chambres d’un milieu essentiel minimum de 
Eagle (MEM) préalablement chauffé (en commençant par la chambre postérieure), en évitant toute formation de bulles d’air. L’appareil est ensuite équilibré à une température de 32 ± 1 °C pendant une heure au 
moins, afin que les cornées s’équilibrent avec le milieu et atteignent une 
activité métabolique aussi proche de la normale que possible (la tempéra ­
ture de la surface cornéenne in vivo est d’environ 32 °C).
 
22. Après la période d’équilibrage, un nouveau MEM préalablement chauffé 
est ajouté dans les deux chambres, et une première mesure d’opacité est effectuée pour chaque cornée. Les cornées présentant une altération macro ­
scopique des tissus (éraflures, pigmentation ou néovascularisation, par 
exemple) ou une opacité supérieure à 7 unités d'opacité sont écartées. 
L’opacité moyenne de toutes les cornées équilibrées est calculée. Au moins trois cornées présentant des valeurs d’opacité proches de la valeur médiane de toutes les cornées sont sélectionnées pour servir de témoins 
négatifs (ou témoins de solvant). Les cornées restantes sont ensuite répar ­
ties entre le lot de traitement et celui des témoins positifs.
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23. La capacité calorifique de l’eau étant supérieure à celle de l’air, l’eau 
procure des conditions de température plus stables pour l’incubation. 
Aussi est-il recommandé de plonger le porte-cornée dans un bain d’eau pour maintenir son contenu à 32 ± 1°C. Toutefois, il est également possible d’utiliser des incubateurs à air, à condition d’assurer la stabilité 
de la température (en chauffant au préalable les porte-cornées et le milieu, 
par exemple).
 
Application de la substance d'essai  
24. Deux protocoles d’application différents sont utilisés, l’un pour les liquides 
et les tensioactifs (solides ou liquides), et l’autre pour les solides non 
tensioactifs.  
25. Les liquides sont testés non dilués, tandis que les tensioactifs le sont à une 
concentration de 10 % en masse volumique dans une solution de chlorure 
de sodium à 0,9 %, d’eau distillée ou d’un autre solvant dont l’absence 
d’effets indésirables sur le système d’essai a été démontrée. Les semi-solides, crèmes et cires sont généralement testés en tant que liquides. Il conviendra de justifier de façon appropriée l’utilisation de tout autre taux 
de dilution. Les cornées sont ensuite exposées aux liquides ou tensioactifs 
pendant 10 minutes. L’utilisation d’une autre durée d’exposition devra être scientifiquement justifiée.
 
26. Les solides non tensioactifs sont généralement testés sous forme de solu ­
tions ou de suspensions à une concentration de 20 % dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, d’eau distillée ou d’un autre solvant dont l’absence d’effets indésirables sur le système d’essai a été démontrée. Dans 
certaines circonstances et uniquement si cela est justifié scientifiquement, 
les solides peuvent aussi être testés purs par application directe sur la surface cornéenne, selon la méthode en chambre ouverte (voir paragraphe 29). Les cornées sont exposées aux solides pendant quatre heures, mais 
comme pour les liquides et les tensioactifs, des durées d’exposition diffé ­
rentes sont possibles moyennant une justification scientifique appropriée.
 
27. Différentes méthodes d’application peuvent être utilisées, en fonction de la 
nature physique et des caractéristiques chimiques des substances d’essai 
(solides, liquides, liquides visqueux ou non visqueux, par exemple). Il est très important que la substance d’essai recouvre convenablement la surface épithéliale puis soit correctement retirée durant les étapes de rinçage. Il 
conviendra généralement d’utiliser la méthode en chambre fermée pour les 
substances d’essai liquides non visqueuses ou légèrement visqueuses, tandis que la méthode en chambre ouverte sera privilégiée pour les subs ­
tances d’essai semi-visqueuses et visqueuses et pour les solides purs.
 
28. Dans la méthode en chambre fermée, une quantité de substance d’essai 
suffisante pour recouvrir la face épithéliale de la cornée (750 μl) est 
introduite dans la chambre antérieure par les trous de dosage situés sur 
la face supérieure de celle-ci. Les trous sont ensuite occultés à l’aide de 
capuchons durant la durée d’exposition. Il importe de s’assurer que chaque cornée est exposée à la substance d’essai pendant la durée qui convient.
 
29. Dans la méthode en chambre ouverte, la goupille de fermeture et la fenêtre 
en verre de la chambre antérieure sont retirées avant l’application. La 
substance d’essai ou témoin (750 μl, ou une quantité suffisante pour 
recouvrir entièrement la cornée) est directement appliquée sur la surface épithéliale cornéenne à l’aide d’une micropipette. Si la substance d’essai 
est difficile à pipetter, il est possible d’utiliser une pipette à déplacement 
positif qui permet un dosage plus précis. L’embout de la pipette à dépla ­
cement positif est inséré dans l’embout distributeur de la seringue, de manière à ce que la substance puisse être chargée dans la pipette sous 
pression. Il convient ensuite de pousser le piston de la seringue tout en 
tirant simultanément celui de la pipette. Si des bulles d’air se forment dans l’embout de la pipette, il faut alors retirer la substance d’essai (en l’ex ­
pulsant) et répéter le processus jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air n’appa ­
raisse au moment du remplissage de la pipette. Il est possible d’utiliser si 
nécessaire une seringue normale (sans aiguille), ce qui permet de mesurer un volume précis de substance d’essai et de l’appliquer plus facilement sur la surface épithéliale de la cornée. Après le dosage, la fenêtre en verre est 
replacée sur l’ouverture de la chambre antérieure afin de recréer un 
système fermé.
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Incubation post-exposition  
30. Après la période d’exposition, la substance d’essai, ou la substance témoin 
négative ou positive, est retirée de la chambre antérieure et l’épithélium est 
rincé au moins trois fois (ou jusqu’à ce qu’aucune trace de la substance d’essai ne soit plus visible) au moyen d’un MEM contenant du rouge de phénol. Le rinçage est effectué à l’aide d’un milieu contenant du rouge de 
phénol, dont le changement de couleur permet de déterminer l’efficacité du 
rinçage des substances acides ou alcalines. Il convient de laver à nouveau les cornées si, après trois rinçages, le rouge de phénol est encore altéré (jaune ou violet) ou si la substance d’essai est toujours visible. Une fois le 
milieu débarrassé de la substance, les cornées subissent un dernier rinçage 
avec un MEM sans rouge de phénol, ce qui permet de s’assurer que la chambre antérieure est débarrassée de tout rouge de phénol avant la mesure d’opacité. La chambre antérieure est ensuite à nouveau remplie 
d’un MEM neuf sans rouge de phénol.
 
31. Pour les liquides et les tensioactifs, les cornées sont incubées après rinçage 
pendant deux heures supplémentaires à 32 ± 1 °C. Il peut être utile, dans certaines circonstances (déterminées au cas par cas), de prévoir une durée d’incubation post-exposition plus longue. Les cornées sur lesquelles des 
solides ont été appliqués sont soigneusement rincées après la période 
d’exposition de quatre heures, et ne requièrent pas d’incubation supplé ­
mentaire.
 
32. Au terme de la période d’incubation post-exposition pour les liquides et les 
tensioactifs, et au terme de la période d’exposition de quatre heures pour 
les solides non tensioactifs, les degrés d’opacité et de perméabilité de 
chaque cornée sont enregistrés. En outre, chaque cornée fait l'objet d'un examen visuel et les observations pertinentes sont consignées (exfoliation des tissus, résidus de substance d’essai ou opacité non uniforme, par 
exemple). Ces observations peuvent s’avérer importantes car elles 
peuvent se traduire par des variations de lecture de l’opacitomètre.
 
Substances témoins  
33. Des témoins négatifs ou des témoins de solvant/véhicule ainsi que des 
témoins positifs sont inclus en parallèle dans chaque expérience.  
34. Lorsqu’une substance liquide non diluée est soumise à l’essai, il convient 
d’inclure dans la méthode d’essai OPCB une substance témoin négatif 
concurrente (solution de chlorure de sodium à 0,9 % ou eau distillée, 
par exemple) afin de détecter des changements non intrinsèques au système d’essai et de fournir un point de référence pour les critères d’éva ­
luation de l’essai. Cette méthode permet également de garantir que les 
conditions de l’essai n’entraînent aucune réaction d’irritation indésirable.
 
35. Lorsqu’un liquide dilué, un tensioactif ou un solide est soumis à l’essai, il 
convient d’inclure dans la méthode d’essai OPCB un lot témoin de solvant/véhicule concurrent afin de détecter des changements non intrin ­
sèques au système d’essai et de fournir un point de référence pour les 
critères d’évaluation de l’essai. On utilisera uniquement des solvants/véhi ­
cules dont l’absence d’effets indésirables sur le système d’essai a été démontrée.
 
36. Chaque expérience comprend une substance irritante pour les yeux connue 
en tant que témoin positif, afin de vérifier l'induction d'une réponse appro ­
priée. La méthode d’essai OPCB étant utilisée ici pour mettre en évidence 
des substances corrosives ou fortement irritantes, le témoin positif servant de référence est idéalement une substance entraînant une réaction d’irrita ­
tion importante dans le cadre de cette méthode. Cependant, afin de pouvoir 
évaluer la variabilité des réponses du témoin positif dans le temps, l’am ­
pleur des effets irritants ne devra pas être excessive.
 
37. Pour les substances d’essai liquides, les témoins positifs peuvent être 
composés de diméthylformamide ou d’hydroxyde de sodium à 1 %, par exemple. Pour les substances d’essai solides, les témoins positifs peuvent 
être composés d’imidazole à 20 % (en masse volumique) dans une solu ­
tion de chlorure de sodium à 0,9 %, par exemple.
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38. Les substances étalons sont utiles pour évaluer le potentiel d'irritation 
oculaire de produits chimiques inconnus d'une classe chimique ou d'une 
catégorie de produits spécifique, ou pour évaluer le potentiel d'irritation relatif d'une substance irritante pour les yeux au sein d'une plage spéci ­
fique de réponses.
 
Effets mesurés  
39. L’opacité est déterminée par la quantité de lumière traversant la cornée. 
L’opacité de la cornée est mesurée de manière quantitative à l’aide d’un 
opacitomètre, qui donne des valeurs d’opacité situées sur une échelle 
continue.  
40. La perméabilité est déterminée par la quantité de fluorescéine sodique 
pénétrant la totalité des couches cellulaires de la cornée (de l’épithélium sur la face externe de la cornée à l’endothélium sur sa face interne). Un volume de 1 ml de solution de fluorescéine sodique (respectivement 4 ou 
5 mg/ml lors d’essais portant sur des liquides et des tensioactifs ou sur des 
solides non tensioactifs) est introduit dans la chambre antérieure du porte-cornée, en contact avec la face épithéliale de la cornée, tandis que la chambre postérieure, en contact avec la face endothéliale, est remplie 
d’un nouveau MEM. Le porte-cornée est ensuite incubé en position hori ­
zontale pendant 90 ± 5 min à une température de 32 ± 1 °C. La quantité de fluorescéine sodique passant dans la chambre postérieure est mesurée quantitativement par spectrophotométrie UV-visible. Les mesures spectro ­
photométriques évaluées à 490 nm sont enregistrées en tant que valeurs de 
densité optique (DO
 490 ) ou d’absorbance, mesurées sur une échelle conti ­
nue. La perméabilité à la fluorescéine est déterminée à l’aide des valeurs de DO
 490 données par un spectrophotomètre visible utilisant un trajet 
optique standard de 1 cm.  
41. Il est également possible d’utiliser un lecteur de plaques de microtitration à 
96 puits, à condition: i) de pouvoir définir l’intervalle linéaire du lecteur 
de plaque servant à déterminer les valeurs de la DO  490 de la fluorescéine; 
et ii) d’utiliser le bon volume d’échantillons de fluorescéine sur la plaque à 96 puits afin d’obtenir des valeurs de la DO
 490 équivalentes au trajet 
optique standard de 1 cm (ce qui peut nécessiter de remplir entièrement 
les puits [généralement 360 μl]). 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Évaluation des données  
42. Une fois que les valeurs d’opacité et de perméabilité moyenne (DO  490 ) ont 
été corrigées de l’opacité de fond et des valeurs DO  490 de perméabilité des 
témoins négatifs, l’opacité moyenne et les valeurs DO  490 de perméabilité 
moyenne pour chaque lot de traitement sont combinées dans une formule 
établie empiriquement pour calculer, comme suit, le score d’irritation in vitro (SIIV) de chaque lot de traitement:
 
SIIV = valeur moyenne d’opacité + (15 × valeur DO  490 de perméabilité 
moyenne)  
D’après Sina et al. (16), cette formule a été établie au cours d'études intra 
et interlaboratoires. Les données générées pour une série de 36 composés dans le cadre d’une étude interlaboratoires ont été soumises à une analyse 
à variables multiples afin de déterminer l'équation du meilleur ajustement 
entre les données in vivo et in vitro. Cette analyse a été réalisée par des scientifiques travaillant dans deux entreprises distinctes, qui ont obtenu des équations pratiquement identiques.
 
43. Les valeurs d’opacité et de perméabilité sont également évaluées de 
manière indépendante afin de déterminer si une substance d'essai a 
provoqué une corrosion ou une forte irritation pour un seul des deux 
critères (voir «Critères de décision»).  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 678
 
Critères de décision  
44. Une substance induisant un SIIV ≥ 55,1 est définie comme corrosive ou 
fortement irritante. Comme indiqué au paragraphe 1, s'il n'est pas démontré 
que la substance d'essai est corrosive ou fortement irritante pour l'œil, il convient de mener des essais complémentaires à des fins de classification et d'étiquetage. La méthode d’essai OPCB présente une précision d’en ­
semble comprise entre 79 % (113/143) et 81 % (119/147), un taux de faux 
positifs allant de 19 % (20/103) à 21 % (22/103) et un taux de faux négatifs allant de 16 % (7/43) à 25 % (10/40), en comparaison avec les données de la méthode d’essai in vivo sur les yeux de lapin classées selon 
les systèmes de classification de l’EPA (1), de l’UE (2) ou du SGH (3). Si 
l’on exclut de la base de données les substances relevant de certaines classes chimiques (alcools, cétones) ou physiques (substances solides), la précision de la méthode OPCB au regard des systèmes de classification de 
l’UE, de l’EPA et du SGH va de 87 % (72/83) à 92 % (78/85), le taux de 
faux positifs de 12 % (7/58) à 16 % (9/56), et le taux de faux négatifs de 0 % (0/27) à 12 % (3/26).
 
45. Même si une substance d’essai n’est pas classée comme corrosive ou 
fortement irritante pour l'œil, les données de la méthode d'essai OPCB 
peuvent servir, en association avec des résultats d’essais in vivo sur des yeux de lapin ou d’un autre test in vitro dûment validé, à évaluer plus en profondeur l’utilité et les limites de la méthode OPCB pour la détection 
des substances faiblement irritantes ou non irritantes (un document d'orien ­
tation sur l’utilisation de méthodes d’essai de toxicité oculaire in vitro est en cours d'élaboration).
 
Critères d'acceptation de l'étude  
46. Un essai est considéré comme acceptable si le témoin positif présente un 
SIIV compris dans un intervalle de deux écarts-types autour de la moyenne 
historique actuelle, qui est mise à jour au moins tous les trois mois, ou 
chaque fois qu’un essai acceptable est mené dans des laboratoires condui ­
sant peu fréquemment (c'est-à-dire moins d'une fois par mois) ce type d’étude. Les réponses du témoin négatif ou du témoin de solvant/véhicule 
doivent donner des valeurs d’opacité et de perméabilité situées en deçà des 
limites maximales établies pour les valeurs d’opacité et de perméabilité de fond des cornées bovines traitées avec les témoins négatifs ou les témoins de solvant/véhicule correspondants.
 
Rapport d'essai  
47. Le rapport d’essai contient les renseignements suivants, pour autant qu'ils 
présentent un intérêt pour l'étude:  
Substances d’essai et témoins  
Nom(s) chimique(s), par exemple nom de la structure chimique utilisé par 
le Chemical Abstracts Service (CAS), suivi d’autres noms, s’ils sont 
connus;  
Numéro d'enregistrement CAS (RN), s'il est connu;  
Pureté et composition de la substance ou du mélange (en pourcentage 
pondéral), dans la mesure où cette information est disponible;  
Propriétés physico-chimiques (telles que l’état physique, la volatilité, le 
pH, la stabilité, la classe chimique, l’hydrosolubilité) utiles pour la 
conduite de l’étude;  
Le cas échéant, traitement des substances d’essai et témoins avant l’essai 
(par exemple, chauffage, broyage);  
Stabilité (si elle est connue).  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 679
 
Renseignements relatifs au commanditaire et à l’installation d’essai:  
Nom et adresse du commanditaire, de l'installation d'essai et du directeur 
de l'étude;  
Provenance des yeux (c’est-à-dire de l’établissement auprès duquel ils ont 
été recueillis);  
Conditions de stockage et de transport des yeux (par ex., date et heure de 
la collecte des yeux, délai avant le début de l’essai, moyen de transport et conditions de température, antibiotiques utilisés le cas échéant);
 
Dans la mesure du possible, caractéristiques spécifiques des animaux sur 
lesquels les yeux ont été prélevés (par ex., âge, sexe et poids de l’animal 
donneur).  
Justification du choix de la méthode d'essai et du mode opératoire  
Intégrité de la méthode d'essai  
Mode opératoire utilisé pour assurer l'intégrité (précision et fiabilité) de la 
méthode d'essai au cours du temps (par exemple essai périodique des 
substances d’épreuve de compétence, utilisation de données antérieures de témoins positifs et négatifs).
 
Critères d'acceptabilité de l’essai  
Intervalles de valeurs acceptables pour les témoins positifs et négatifs 
concurrents, d’après les données historiques;  
Le cas échéant, intervalles de valeurs acceptables pour les témoins étalons 
concurrents, d’après les données historiques.  
Conditions de l'essai  
Description du système d'essai utilisé;  
Type de porte-cornée utilisé;  
Informations sur l’étalonnage des appareils utilisés pour mesurer l’opacité 
et la perméabilité (par ex., opacitomètre et spectrophotomètre);  
Informations sur les cornées bovines utilisées, notamment appréciation de 
leur qualité;  
Détails sur le mode opératoire d’essai utilisé;  
Concentration(s) des substances d'essai utilisées;  
Description de toutes les modifications du mode opératoire de l’essai;  
Référence aux données historiques du modèle (par exemple, témoins posi ­
tifs et négatifs, substances d’épreuves de compétence, substances étalons);  
Description des critères d’évaluation utilisés.  
Résultats  
Présentation sous forme de tableau des résultats de chaque échantillon 
d’essai (par ex., valeurs de l’opacité et de la DO  490 et SIIV calculé 
pour la substance d’essai et les témoins positifs, négatifs et étalons [si inclus], y compris les données des essais répétés, le cas échéant, et la 
moyenne ± écart type pour chaque essai);
 
Description des autres effets observés.  
Discussion des résultats  
Conclusion  
BIBLIOGRAPHIE  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
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péenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et 
abrogeant le règlement (CEE) n
 o 793/93 du Conseil et le 
règlement (CE) n  o 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 
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htm] ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 682
 
Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Précision:  degré de concordance entre les résultats de la méthode d'essai et les 
valeurs de référence acceptées. La précision constitue une mesure de la perfor ­
mance de la méthode d'essai et un aspect de sa «pertinence». Ce terme est souvent utilisé de façon interchangeable avec «concordance» pour désigner la proportion de résultats corrects d'une méthode d'essai.
 
Substance étalon:  substance utilisée en tant que référence, pour la comparaison 
avec une substance d'essai. Une substance étalon présente les propriétés suivantes: i) provient d'une ou de plusieurs sources constantes et fiables; ii) présente une similitude structurale et fonctionnelle avec la classe des substances 
soumises à l'essai; iii) possède des caractéristiques physiques/chimiques connues; 
iv) est accompagnée de données confirmant ses effets connus, et v) a une puis ­
sance connue dans la fourchette de réponses désirées.
 
Cornée:  partie transparente située à l’avant du globe oculaire, recouvrant l’iris et 
la pupille et laissant pénétrer la lumière vers l’intérieur de l’œil.  
Opacité cornéenne:  mesure de l’étendue du caractère opaque de la cornée suite 
à son exposition à une substance d’essai. Une augmentation de l'opacité cornéenne indique un endommagement de la cornée. L’opacité peut être 
évaluée de manière subjective, par exemple lors du test de Draize réalisé sur 
les yeux de lapin, ou de manière objective à l'aide d'un instrument de mesure tel qu'un «opacitomètre».
 
Perméabilité cornéenne:  Mesure quantitative de l’endommagement de l’épithé ­
lium cornéen via la détermination de la quantité de fluorescéine sodique traver ­
sant toutes les couches cellulaires de la cornée.  
Catégorie 1 de l'EPA:  effet corrosif (destruction irréversible du tissu oculaire) 
ou complication cornéenne ou irritation persistant plus de 21 jours (1).  
Catégorie R41 de l'UE:  lésion des tissus oculaires ou dégradation sévère de la 
vue, provoquée par l'application d'une substance d'essai sur la face antérieure 
de l'œil, et qui n'est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l'application (2).
 
Taux de faux négatifs:  proportion de substances positives faussement déclarées 
négatives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la 
méthode d'essai.  
Taux de faux positifs:  proportion des substances négatives faussement déclarées 
positives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la 
méthode d'essai.  
SGH (Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des 
produits chimiques):  système proposant la classification des produits chimiques 
(substances et mélanges) conformément à des types et des niveaux normalisés de dangers physiques, sanitaires et environnementaux, ainsi que la communication 
des éléments d'information correspondants, notamment par des pictogrammes, 
mentions d’avertissement, mentions de danger, conseils de prudence et fiches de données de sécurité, afin de diffuser des informations sur leurs effets indési ­
rables dans l'objectif de protéger les personnes (en particulier les employeurs, 
employés, transporteurs, consommateurs et personnels des services d'urgence) et 
l'environnement (3).
 ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 683
 
Catégorie 1 du SGH:  lésion des tissus oculaires ou dégradation sévère de la 
vue, provoquée par l'application d'une substance d'essai sur la face antérieure 
de l'œil, et qui n'est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l'application (3).
 
Danger:  propriété intrinsèque d'un agent ou situation susceptible de provoquer 
des effets néfastes lorsqu'un organisme, un système ou une (sous-)population est 
exposé(e) à cet agent.  
Score d'irritation  in vitro  (SIIV):  formule établie empiriquement et utilisée dans 
les essais OPCB, dans laquelle les valeurs d'opacité moyenne et de perméabilité 
moyenne pour chaque lot de traitement sont combinées pour obtenir le score in vitro unique de chaque lot de traitement. SIIV = valeur moyenne d’opacité + (15 x valeur moyenne de perméabilité).
 
Témoin négatif:  réplicat non traité contenant tous les composants d’un système 
d’essai. Cet échantillon subit les mêmes procédures que les échantillons traités avec la substance d'essai et les autres échantillons témoins afin de déterminer si 
le solvant interagit avec le système d’essai.
 
Substance non irritante:  substance qui n'est pas classée comme irritant oculaire 
dans la catégorie I, II ou III de l'EPA, la catégorie R41 ou R36 de l'UE, ou la 
catégorie 1, 2A ou 2B du SGH.  
Substance corrosive pour l'œil:  a) substance provoquant des lésions 
irréversibles des tissus oculaires; b) substance classée comme irritant 
oculaire dans la catégorie 1 du SGH, la catégorie 1 de l’EPA ou la 
catégorie R41 de l’UE (1) (2) (3).  
Substance irritante pour l'œil:  a) substance provoquant une modification réver ­
sible de l’œil suite à une application sur la face antérieure de l’œil; b) substance 
classée comme irritant oculaire dans la catégorie II ou III de l'EPA, la catégorie R36 de l'UE ou la catégorie 2A ou 2B du SGH (1) (2) (3).
 
Substance fortement irritante pour l'œil:  a) substance provoquant des lésions 
des tissus oculaires suite à une application sur la face antérieure de l’œil, qui ne sont pas résorbées dans les 21 jours suivant le traitement ou entraînent une dégradation sévère de la vue; b) substance classée comme irritant oculaire dans 
la catégorie 1 du SGH, la catégorie 1 de l’EPA ou la catégorie R41 de l’UE 
(1) (2) (3).
 
Opacitomètre:  Instrument servant à mesurer l’«opacité cornéenne» en évaluant 
la quantité de lumière transmise à travers la cornée. En général, cet instrument est 
composé de deux compartiments, chacun disposant de sa propre source lumi ­
neuse et d'une cellule photoélectrique. L’un des compartiments est utilisé pour la cornée traitée tandis que l'autre sert à étalonner l’instrument et à le mettre à zéro. 
La lumière d’une lampe halogène est dirigée à travers un compartiment témoin 
(chambre vide, sans vitre ni liquide) vers une cellule photoélectrique, et comparée à la lumière envoyée à travers le compartiment expérimental, qui abrite la chambre contenant la cornée, jusqu'à une cellule photoélectrique. La lumière 
transmise par les deux cellules photoélectriques est ensuite comparée, et une 
valeur chiffrée d'opacité s’affiche sur un écran numérique.
 
Témoin positif:  réplicat contenant tous les composants d’un système d’essai, et 
traité avec une substance induisant notoirement une réponse positive. Afin de 
pouvoir évaluer la variabilité des réponses du témoin positif dans le temps, la 
sévérité de la réponse ne devra pas être excessive.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 684
 
Fiabilité:  mesure de la reproductibilité de l'essai mis en œuvre, au sein d'un 
laboratoire et entre des laboratoires, au cours du temps, en utilisant le même 
mode opératoire. Elle est évaluée par calcul de la reproductibilité intralaboratoire et interlaboratoires et de la répétabilité intralaboratoire.
 
Témoin de solvant/véhicule:  échantillon non traité contenant tous les compo ­
sants d’un système d’essai, y compris le solvant ou véhicule utilisé pour tester les 
échantillons témoins traités ou non avec la substance d’essai afin de déterminer 
une réponse de référence pour les échantillons traités avec la substance d’essai dissoute dans le même solvant ou véhicule. Testé avec un témoin négatif concur ­
rent, cet échantillon indique également si le solvant ou véhicule interagit avec le 
système d'essai.
 
Stratégie d'essai séquentielle:  démarche expérimentale séquentielle consistant à 
examiner toutes les informations existantes sur une substance d'essai dans un ordre déterminé, en ayant recours à chaque étape à une procédure fondée sur la force probante des données pour déterminer si les informations disponibles 
sont suffisantes pour décider d'une classification des dangers, avant de passer à 
l'étape suivante. Si le potentiel d’irritation d’une substance d’essai peut être déterminé sur la base des informations existantes, aucun essai supplémentaire 
n’est nécessaire. Dans le cas contraire, une procédure expérimentale progressive 
de type séquentiel sur des animaux est alors lancée jusqu’à ce qu’une classifi ­
cation sans équivoque puisse être effectuée.
 
Méthode d'essai validée:  méthode d'essai ayant fait l'objet d'études de validation 
visant à déterminer sa pertinence (notamment sa précision) et sa fiabilité à des 
fins spécifiques. Il importe de noter que les performances d'une méthode d'essai 
validée peuvent être insuffisantes en termes de précision et de fiabilité pour qu'elle soit jugée acceptable pour les besoins envisagés.
 
Force probante des données:  prise en compte des forces et des faiblesses de 
divers éléments d’information en vue d'aboutir à une conclusion concernant le 
danger potentiel d’une substance et d’étayer cette conclusion.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 685
 
Appendice 2  
Substances d’épreuve de compétence pour la méthode d’essai OPCB  
Avant l'utilisation en routine d'une méthode d'essai conforme à la présente 
méthode, les laboratoires peuvent souhaiter faire la preuve de leurs compétences 
techniques en déterminant correctement la catégorie de corrosivité oculaire des 10 substances recommandées dans le tableau 1. Ces substances ont été sélection ­
nées de façon à représenter la gamme des réactions locales d'irritation/de corro ­
sion oculaire, sur la base des résultats de l’essai in vivo sur œil de lapin (LD 405) 
[c’est-à-dire les catégories 1, 2A, 2B ou Non classé du SGH des Nations Unies (3) (7)]. Toutefois, compte tenu de l’utilité validée de ces essais (uniquement mise en évidence des substances corrosives/fortement irritantes pour l'œil), seuls 
deux résultats expérimentaux obtenus à des fins de classification (substance 
corrosive/fortement irritante ou substance non corrosive/faiblement irritante) permettent de démontrer les compétences des laboratoires. Les autres critères de sélection retenus ont trait à la disponibilité des substances dans le 
commerce, à la disponibilité de données de référence in vivo de bonne qualité, 
et à l’existence de données de bonne qualité issues des deux méthodes d’essai in vitro qui font l’objet de lignes directrices. Pour cette raison, les substances 
irritantes ont été sélectionnées dans la liste recommandée par l'ICCVAM de 
122 substances de référence pour la validation de méthodes d'essai de toxicité oculaire in vitro [voir appendice H: Substances de référence recommandées par l'ICCVAM (5)]. Les données de référence sont disponibles dans les documents 
de l’ICCVAM ( Background Review Documents ) pour les méthodes OPCB et 
OPI (œil de poulet isolé) (17) (18).
 
Tableau 1  
Substances recommandées pour la démonstration des compétences techniques des laboratoires au regard de la méthode 
d'essai OPCB  
Substance N  o CAS Classe chimique (  1 ) Forme 
physique Classification  in 
vivo ( 2 ) Classification  in vitro  ( 3 ) 
Chlorure de 
benzalconium 
(5 %) 8001-54-5 Composé 
d'onium Liquide Catégorie 1 Corrosif/fortement irritant 
Chlorhexidine 55-56-1 Amine, Amidine Solide Catégorie 1 Corrosif/fortement irritant 
Acide 
dibenzoyl-L- 
tartrique 2743-38-6 Acide carboxy ­
lique, ester Solide Catégorie 1 Corrosif/fortement irritant 
Imidazole 288-32-4 Hétérocycle Solide Catégorie 1 Corrosif/fortement irritant 
Acide trichloroa ­
cétique (30 %) 76-03-9 Acide carboxy ­
lique Liquide Catégorie 1 Corrosif/fortement irritant 
Chlorure de 2,6- 
dichlorobenzoyle 4659-45-4 Halogénure 
d'acyle Liquide Catégorie 
2A Non corrosif/Faiblement irri ­
tant 
2-méthylacéto- 
acétate d'éthyle 609-14-3 Cétone, Ester Liquide Catégorie 
2B Non corrosif/Faiblement irri ­
tant 
Nitrate d'ammo ­
nium 6484-52-2 Sel inorganique Solide Catégorie 
2A Non corrosif/Faiblement irri ­
tant ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 686
 
Substance N  o CAS Classe chimique (  1 ) Forme 
physique Classification  in 
vivo ( 2 ) Classification  in vitro  ( 3 ) 
Glycérol 56-81-5 Alcool Liquide Non étiqueté Non corrosif/Faiblement irri ­
tant 
n-Hexane 110-54-3 Hydrocarbure 
(acyclique) Liquide Non étiqueté Non corrosif/Faiblement irri ­
tant 
Abréviations: N  o CAS = Numéro d'enregistrement au Chemical Abstract Service 
( 1 ) Les classes de produits chimiques ont été attribuées à chaque substance testée à l'aide d'un système de classification normal isé, 
fondé sur le système de classification du  Medical Subject Headings  (MeSH) de la Bibliothèque nationale de médecine des États- 
Unis d'Amérique (disponible sur http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) D'après les résultats de l'essai in vivo sur œil de lapin (Ligne directrice de l'OCDE n  o 405) et en utilisant le SGH des NU (3)(7). 
( 3 ) D'après les résultats des méthodes OPCB et OPI.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 687
 
Appendice 3  
PORTE-CORNÉE POUR LA MÉTHODE OPCB  
1. Les porte-cornées pour la méthode OPCB sont fabriqués à partir d’un 
matériau inerte (polypropylène par exemple). Ils se composent de deux 
parties (une chambre antérieure et une chambre postérieure) et possèdent deux chambres internes cylindriques identiques. Chaque chambre a une 
contenance de 5 ml et est fermée par une vitre, à travers laquelle les 
mesures d’opacité sont lues. Chacune des chambres internes mesure 1,7 cm de diamètre et 2,2 cm de profondeur (
 1 ). Un joint torique situé au 
niveau de la chambre postérieure empêche toute fuite. La cornée est placée 
face endothéliale dessous, sur le joint torique de la chambre postérieure, et 
la chambre antérieure est placée du côté épithélial de la cornée. Les cham ­
bres sont maintenues en place par trois vis en acier inoxydable situées sur les bordures extérieures du porte-cornée. Chaque chambre comporte à son 
extrémité une vitre amovible permettant d’accéder facilement à la cornée. 
Un joint torique placé entre la vitre et la chambre empêche toute fuite. L’introduction et le vidage du milieu et des composés d’essai se font par deux trous situés sur la face supérieure de chaque chambre. Pendant le 
traitement et les périodes d’incubation, ces trous sont obturés par des capu ­
chons en caoutchouc.
 
Glossaire  
Glass disc: Disque de verre  
PTFE-O-ring: Joint torique en PTFE  
Refill: Orifice de remplissage  
Hanger: Crochet  
Cap: Capuchon  
Nut: Écrou  
O-ring: Joint torique  
Posterior compartment: Compartiment postérieur  
Anterior compartment: Compartiment antérieur  
Fixing screws: Vis de fixation  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 688  
( 1 ) Les dimensions indiquées ici sont celles d’un porte-cornée utilisé pour des bovins âgés 
de 12 à 60 mois. Pour des animaux âgés de 6 à 12 mois, le porte-cornée est conçu de 
telle sorte que chaque chambre ait une contenance de 4 ml et que chacune des chambres 
internes mesure 1,5 cm de diamètre et 2,2 cm de profondeur. Pour tout porte-cornée 
nouvellement conçu, il est essentiel que le rapport entre la surface cornéenne exposée et 
le volume de la chambre postérieure soit le même que celui du porte-cornée classique. 
Cette condition est indispensable pour garantir que les valeurs de perméabilité sont 
correctement déterminées pour le calcul du SIIV par la formule donnée.
 L'OPACITOMÈTRE  
2. L’opacitomètre est un appareil permettant de mesurer la transmission de la 
lumière. La lumière d’une lampe halogène est dirigée à travers un compar ­
timent témoin (chambre vide, sans vitre ni liquide) vers une cellule photoé ­
lectrique, et comparée à la lumière envoyée à travers le compartiment expé ­
rimental, qui abrite la chambre contenant la cornée, jusqu'à une cellule 
photoélectrique. La lumière transmise par les deux cellules photoélectriques 
est ensuite comparée, et une valeur chiffrée d'opacité s’affiche sur un écran numérique. Les unités d’opacité sont alors définies.
 
3. L’opacitomètre fournit une réponse linéaire sous la forme d'une plage de 
mesures d’opacité couvrant les seuils utilisés pour les différentes classifica ­
tions décrites par le modèle de prévision (c’est-à-dire, jusqu’aux seuils 
déterminant le caractère corrosif/fortement irritant). Afin de garantir des mesures linéaires et précises jusqu’à 75-80 unités d’opacité, il est nécessaire d’étalonner l’opacitomètre à l’aide d’une série de calibreurs. Les calibreurs 
(plaques opaques de polyester) sont placés à l’intérieur de la chambre 
d’étalonnage (une chambre de porte-cornée destinée à contenir les cali ­
breurs) et une mesure des calibreurs est réalisée sur l'opacitomètre. La 
chambre d’étalonnage est conçue pour maintenir les calibreurs approxima ­
tivement à la même distance de la source lumineuse et de la cellule photoé ­
lectrique que celle où se trouveront les cornées lors des mesures d'opacité. L'opacitomètre est tout d'abord étalonné à 0 unité d'opacité en utilisant la 
chambre d’étalonnage sans calibreur. Trois calibreurs différents sont ensuite 
placés l’un après l’autre à l’intérieur de la chambre d’étalonnage, et l’opacité est mesurée. Les calibreurs 1, 2 et 3 présentent des mesures d’opacité égales à leur valeur de consigne, soit respectivement 75, 150 et 225 unités d’opa ­
cité, ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 689
 
B. 48  MÉTHODE D'ESSAI SUR ŒIL DE POULET ISOLÉ POUR LA 
MISE EN ÉVIDENCE DES SUBSTANCES CORROSIVES ET 
FORTEMENT IRRITANTES POUR L'ŒIL  
INTRODUCTION  
1. La méthode d'essai sur œil de poulet isolé (OPI) est une méthode d'essai in 
vitro pouvant être utilisée, dans certaines circonstances et compte tenu de ses limites particulières, pour classer des substances et des mélanges dans 
la catégorie des produits «corrosifs et fortement irritants pour l’œil» (1) (2) 
(3). Aux fins de la présente méthode d'essai, les substances et mélanges fortement irritants sont ceux qui induisent des lésions oculaires qui persis ­
tent pendant au moins 21 jours après administration chez le lapin. Le 
remplacement intégral par l'OPI de la méthode de l'essai sur œil de 
lapin in vivo n'a pas été validé, mais l’utilisation de l’OPI est recom ­
mandée dans le cadre d'une stratégie d'essai séquentielle visant à établir une classification et un étiquetage réglementaires dans un domaine d'ap ­
plication défini (4) (5). Les substances et mélanges d’essai (6) qui répon ­
dent positivement dans cet essai peuvent être classés dans la catégorie des produits corrosifs et fortement irritants pour l'œil sans qu'il soit nécessaire 
de procéder à des essais supplémentaires chez le lapin. En revanche, une 
substance révélant un résultat négatif à l’issue de l’essai a besoin d’être testée sur des lapins selon une démarche expérimentale de type séquentiel, telle que celle décrite dans la ligne directrice de l’OCDE n
 o 405 (7) 
(chapitre B.5 de la présente annexe).  
2. L'objectif de la présente méthode d'essai est de décrire les modes opéra ­
toires utilisés pour évaluer l'effet potentiel corrosif ou fortement irritant pour l'œil d'une substance d'essai. Cet effet est mesuré par la capacité du produit à induire une toxicité dans un œil de poulet énucléé. Les effets 
toxiques pour la cornée sont mesurés par i) une estimation qualitative de 
l'opacité, ii) une estimation qualitative des dommages subis par l'épithé ­
lium, fondée sur l'application de fluorescéine sur l'œil (rétention de fluores ­
céine), iii) une mesure quantitative de l'augmentation d'épaisseur (gonfle ­
ment), et iv) une évaluation qualitative des dommages morphologiques 
macroscopiques infligés en surface. L'opacité cornéenne, le gonflement et l'estimation des dommages après exposition à une substance d'essai sont évalués individuellement, puis combinés pour établir une classifica ­
tion d'effet irritant pour l'œil.
 
3. La méthode OPI a également été utilisée pour tester des substances irri ­
tantes pour l'œil qui induisent des lésions guéries en moins de 21 jours, ainsi que des substances non irritantes. Toutefois, la précision et la fiabilité de cette méthode n'ont pas été évaluées de façon formelle pour les subs ­
tances entrant dans ces catégories.
 
4. Des définitions sont fournies dans l'appendice 1.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES DE LA MÉTHODE  
5. La présente méthode d'essai est fondée sur le protocole expérimental de la 
méthode OPI du Comité de coordination inter-agences sur la validation des méthodes alternatives (ICCVAM) (8), élaboré à la suite d'une étude de validation internationale (4) (5) (9) à laquelle ont participé le Centre euro ­
péen pour la validation de méthodes alternatives (ECVAM), le Centre 
japonais pour la validation de méthodes alternatives, et le département de toxicologie et pharmacologie appliquée de TNO Quality of Life (Pays-Bas). Le protocole s'appuie sur des informations dérivées de proto ­
coles publiés et de celui qui est actuellement employé par TNO (10) (11) 
(12) (13) (14).
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6. Les limites connues de cette méthode d'essai concernent le taux de faux 
positifs obtenu pour les alcools, et les taux de faux négatifs obtenus pour 
les matières solides et les tensioactifs (voir paragraphe 47) (4). Si l’on exclut de la base de données les substances relevant de ces classes chimiques et physiques, la précision de la méthode OPI au regard des 
systèmes de classifications de l’UE, de l’EPA et du SGH se trouve consi ­
dérablement améliorée (4). Compte tenu de la finalité de cet essai (qui vise exclusivement à détecter les substances corrosives et fortement irritantes pour l’œil), les taux de faux négatifs ne sont pas préoccupants car les 
substances concernées feront ensuite l’objet d’essais chez le lapin ou d’au ­
tres essais in vitro dûment validés, conformément aux exigences de la réglementation, selon une démarche expérimentale séquentielle fondée sur la force probante des données. De surcroît, l’actuelle base de 
données de validation n’a pas permis de procéder à l’évaluation adéquate 
de certaines classes de substances chimiques ou de produits (par exemple, les mélanges). Les chercheurs peuvent cependant envisager l'utilisation de cette méthode d'essai pour tous les types de matériel d’essai (y compris les 
mélanges), auquel cas un résultat positif pourrait être interprété comme 
révélateur d'un effet corrosif ou fortement irritant pour l'œil. Toutefois, il convient d'interpréter avec précaution les résultats positifs obtenus avec des alcools, compte tenu du risque de surévaluation.
 
7. Tous les modes opératoires sur l'œil de poulet doivent respecter les régle ­
mentations applicables aux installations d'essai et les protocoles de mani ­
pulation de matériaux issus de l'homme et de l'animal, comprenant notam ­
ment, sans s'y limiter, les tissus et les fluides tissulaires. Le respect des précautions universelles de laboratoire est recommandé (15).
 
8. Bien qu’elle prenne en compte certains des effets oculaires évalués par la 
méthode d’essai d’irritation oculaire chez le lapin, et dans une certaine mesure leur degré de gravité, cette méthode d’essai présente toutefois l’inconvénient de ne pas prendre en considération les lésions de la 
conjonctive et de l’iris. De plus, même si la méthode OPI ne permet 
pas en soi d'évaluer la réversibilité des lésions cornéennes, il a été proposé, sur la base d’études menées sur l’œil de lapin, d'utiliser une évaluation de la profondeur initiale de la lésion cornéenne pour distinguer les effets 
réversibles des effets irréversibles (16). Enfin, la méthode d’essai OPI 
ne permet pas d'évaluer la toxicité systémique potentielle associée à l'ex ­
position oculaire.
 
9. Les travaux visant à mieux caractériser l'utilité et les limites de la méthode 
d'essai OPI pour la mise en évidence des substances faiblement irritantes 
ou non irritantes se poursuivent (voir également paragraphe 48). Les utili ­
sateurs sont également incités à fournir des spécimens et/ou des données aux organismes de validation à des fins d'évaluation formelle des utilisa ­
tions futures possibles de la méthode d'essai OPI, notamment pour la mise 
en évidence des substances faiblement irritantes ou non irritantes.
 
10. Tout laboratoire conduisant cet essai pour la première fois doit utiliser les 
substances chimiques d'épreuve de compétence mentionnées à l'appendice 2. Il peut utiliser ces substances pour démontrer sa compétence technique 
en matière d'application de la méthode d'essai OPI préalablement à la 
soumission des données obtenues avec cet essai à des fins de classification réglementaire des dangers.
 
PRINCIPE DE L'ESSAI  
11. La méthode d'essai OPI est un modèle organotypique qui permet de main ­
tenir à court terme des yeux de poulet in vitro. Dans cette méthode, les 
dommages provoqués par la substance d'essai sont évalués par détermina ­
tion du gonflement cornéen, de l'opacité de la cornée et de sa rétention de fluorescéine. L'observation des deux derniers paramètres est qualitative, alors que l'analyse du gonflement cornéen est quantitative. Chaque 
mesure est convertie en un score quantitatif qui est utilisé pour calculer 
un indice d'irritation général, ou fait l'objet d'une catégorisation qualitative qui sert à assigner une classification de substance corrosive et fortement irritante pour l'œil in vitro. L'un ou l'autre de ces résultats peut ensuite être 
utilisé pour prédire le potentiel d'effet corrosif et fortement irritant pour 
l'œil d'une substance d'essai in vivo (voir «Critères de décision»).
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Provenance et âge des yeux de poulet  
12. Habituellement, on utilise pour cet essai des yeux prélevés sur des poulets 
d'abattoir destinés à la consommation humaine, et les animaux de labora ­
toire sont de ce fait inutiles. Seuls sont utilisés les yeux d'animaux sains, considérés comme propres à intégrer la chaîne alimentaire humaine.
 
13. Aucune étude contrôlée visant à évaluer l'âge optimal des poulets n'a 
encore été menée, mais l'âge et le poids des poulets habituellement utilisés dans cette méthode d'essai sont ceux des petits poulets couramment traités 
dans un abattoir de volailles (à savoir, environ 7 semaines et 1,5 – 2,5 kg).
 
Collecte et transport des yeux au laboratoire  
14. Les têtes sont coupées immédiatement après sédation des poulets, généra ­
lement par choc électrique, et incision des cous pour la saignée. Il 
conviendra de repérer une source locale de poulets proche du laboratoire, afin que le transfert des têtes entre l'abattoir et le laboratoire soit suffi ­
samment rapide pour limiter autant que possible la détérioration et/ou la 
contamination bactérienne. Il faut réduire au minimum l'intervalle de temps qui sépare la collecte des têtes de poulets et l'utilisation des yeux dans la méthode d'essai OPI (généralement deux heures) et démontrer qu'il ne 
compromet pas les résultats de l'essai. Ces résultats dépendent des critères 
de sélection des yeux, ainsi que des réponses des témoins positifs et négatifs. Tous les yeux utilisés dans l'essai proviennent d'un lot d'yeux collectés le même jour.
 
15. Les yeux étant disséqués au laboratoire, les têtes sont transportées intactes 
depuis l'abattoir, à température ambiante, dans des boîtes en plastique 
humidifiées à l'aide de serviettes mouillées d'une solution saline isoto ­
nique.  
Critères de sélection des yeux utilisés dans la méthode OPI  
16. Les yeux dont la coloration initiale par la fluorescéine ou le score d'opacité 
cornéenne sont élevés après énucléation (> 0,5 dans les deux cas) sont rejetés.
 
17. Chaque lot de traitement et chaque lot témoin positif parallèle comprend 
au moins trois yeux. Le lot témoin négatif ou le témoin de solvant (si on utilise un solvant qui n'est pas une solution saline) comprend au 
moins un œil.
 
MODE OPÉRATOIRE  
Préparation des yeux  
18. Les paupières sont soigneusement excisées en veillant à ne pas endom ­
mager la cornée. Pour évaluer rapidement l'intégrité de celle-ci, on applique une goutte de fluorescéine sodique à 2 % (p/v) sur la surface cornéenne pendant quelques secondes, puis on rince avec une 
solution saline isotonique. Les yeux traités à la fluorescéine sont ensuite 
examinés au biomicroscope pour vérifier que la cornée n'est pas endom ­
magée (les scores de rétention de fluorescéine et d'opacité cornéenne doivent être ≤ 0,5).
 
19. S'il n'est pas endommagé, l'œil est ensuite énucléé, en veillant à ne pas 
léser la cornée. Le globe oculaire est tiré hors de l'orbite en maintenant 
fermement la membrane nictitante à l'aide de pinces chirurgicales, et les 
muscles de l'œil sont coupés avec des ciseaux courbes à pointes émous ­
sées. Il est important d'éviter d'endommager la cornée par une pression excessive (artéfacts de compression).
 
20. Lorsque l'œil est retiré de l'orbite, une portion visible du nerf optique doit 
rester attachée. Une fois retiré de l'orbite, l'œil est placé sur un tampon 
absorbant et la membrane nictitante et le reste des tissus conjonctifs sont 
disséqués.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 692
 
21. L'œil énucléé est monté dans un clamp en acier inoxydable, en plaçant la 
cornée verticalement. Le clamp est ensuite transféré dans une chambre de 
l'appareil de surfusion (16). Dans l'appareil de surfusion, les clamps sont placés de telle sorte que la totalité de la cornée soit alimentée par le goutte-à-goutte de solution saline isotonique. La température dans les 
chambres de l'appareil de surfusion est régulée à 32 ± 1,5 °C. L'appendice 
3 propose un schéma d'un appareil de surfusion classique et des clamps pour œil, disponibles dans le commerce ou à construire. L'appareil peut être modifié en fonction des besoins du laboratoire (par exemple, pour 
contenir un nombre d'yeux différent).
 
22. Une fois placés dans l'appareil de surfusion, les yeux sont à nouveau 
examinés au biomicroscope afin de s'assurer qu'ils n'ont pas été endom ­
magés lors de la dissection. Il est utile à ce stade de mesurer l'épaisseur de la cornée à son apex, au moyen du dispositif de mesure dont est muni le 
biomicroscope. Les yeux i) dont la rétention de fluorescéine est > 0,5, ii) 
dont l'opacité cornéenne est > 0,5 ou iii) qui présentent tout autre signe de lésion doivent être remplacés. Les yeux qui ne sont pas rejetés sur la base de ces critères, mais dont l'épaisseur cornéenne s'écarte de plus de 10 % de 
la valeur moyenne calculée pour l'ensemble des yeux doivent également 
être rejetés. La mesure de l'épaisseur cornéenne peut varier en fonction du réglage de la largeur de la fente du biomicroscope, et les examinateurs tiennent compte de cette contrainte en ajustant cette largeur à 0,095 mm.
 
23. Une fois tous les yeux examinés et admis dans l'étude, ils sont incubés 
pendant environ 45 à 60 minutes pour leur permettre de s'équilibrer dans le système d'essai avant administration de la substance d'essai. Cette période est suivie des mesures de l'épaisseur et de l'opacité cornéennes au temps 
zéro (t = 0), qui serviront de mesures de référence. Le score de rétention 
de la fluorescéine déterminé lors de la dissection sert de mesure de réfé ­
rence pour ce critère d'évaluation.
 
Application de la substance d'essai  
24. Immédiatement après les mesures de référence au temps zéro, l'œil (dans 
son support) est retiré de l'appareil de surfusion, placé en position hori ­
zontale et la substance d'essai est appliquée sur la cornée.  
25. Les substances d'essai liquides sont généralement testées sans dilution, 
mais elles peuvent au besoin être diluées (par exemple, lors d'une étape prévue dans la conception de l'étude). Il est préférable d'utiliser une solu ­
tion physiologique pour diluer les substances. Il est toutefois possible 
d'utiliser d'autres solvants en conditions contrôlées, sous réserve de démontrer le bien-fondé de leur utilisation au lieu de la solution physio ­
logique saline.
 
26. Les substances d'essai liquides sont appliquées sur la cornée de façon à 
couvrir uniformément la totalité de la surface; le volume habituel est de 
0,03 ml.  
27. De préférence, les substances solides sont broyées aussi finement que 
possible au moyen d'un mortier et d'un pilon, ou d'un outil de broyage comparable. La poudre est appliquée sur la cornée de façon à couvrir 
uniformément la totalité de la surface; la quantité habituelle est de 0,03 g.
 
28. La substance d'essai (liquide ou solide) est appliquée pendant 10 secondes, 
puis éliminée par rinçage de l'œil avec une solution saline isotonique (environ 20 ml) à température ambiante. L'œil (dans son support) est 
ensuite remis dans l'appareil de surfusion dans la position verticale initiale.
 
Substances témoins  
29. Il convient d'inclure des témoins négatifs ou de solvant/véhicule et des 
témoins positifs en parallèle dans chaque expérience.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 693
 
30. Dans le cas d'essais de liquides purs ou de solides, on utilise une solution 
saline physiologique comme témoin négatif parallèle dans la méthode 
d'essai OPI pour détecter des changements non spécifiques dans le système d'essai, et pour vérifier que les conditions de l'essai ne provoquent pas de réponse irritante indésirable.
 
31. Dans le cas d'essais de liquides dilués, un lot témoin parallèle de 
solvant/véhicule est inclus dans la méthode d'essai pour détecter des changements non spécifiques dans le système d'essai, et pour vérifier 
que les conditions de l'essai ne provoquent pas de réponse irritante 
inappropriée. Comme le mentionne le paragraphe 25, il ne faut utiliser que des solvants ou des véhicules dont l'absence d'effet néfaste sur le système d'essai a été démontrée.
 
32. Chaque expérience comprend une substance irritante pour les yeux connue 
en tant que témoin positif permettant de vérifier l'induction d'une réponse appropriée. La méthode d’essai OPI étant utilisée ici pour mettre en 
évidence des substances corrosives ou fortement irritantes, il convient 
que le témoin positif soit une substance de référence qui induit une réponse forte dans le cadre de cette méthode. Toutefois, pour pouvoir évaluer la variabilité de la réponse du témoin positif dans le temps, il 
ne faut pas que l'ampleur de cette réponse soit excessive. La quantité de 
données in vitro obtenues pour le témoin positif doit être suffisante pour permettre le calcul d'un intervalle acceptable défini statistiquement. En l'absence de données antérieures adéquates issues de la méthode d'essai 
OPI pour un témoin positif donné, il peut être nécessaire de mener des 
études pour obtenir ces informations.
 
33. L'acide acétique à 10 % ou le chlorure de benzalconium à 5 % sont des 
exemples de témoins positifs dans les essais de substances d'essai liquides, 
et l'hydroxyde de sodium ou l'imidazole peuvent jouer ce rôle pour les substances d'essai solides.
 
34. Les substances étalons sont utiles pour évaluer le potentiel d'irritation 
oculaire de produits chimiques inconnus d'une classe chimique ou d'une catégorie de produits spécifique, ou pour évaluer le potentiel d'irritation relatif d'une substance irritante pour les yeux au sein d'une plage spéci ­
fique de réponses.
 
Effets mesurés  
35. Les cornées traitées sont évaluées avant le traitement et 30, 75, 120, 180, 
et 240 minutes (± 5 minutes) après le rinçage suivant le traitement. Ces 
temps d'observation sont en nombre suffisant sur la période de traitement 
de 4 heures et les intervalles entre les mesures permettent d'effectuer les observations requises sur tous les yeux.
 
36. Les effets évalués sont l'opacité cornéenne, le gonflement de la cornée et 
la rétention de fluorescéine, ainsi que les effets morphologiques (par exem ­
ple, piqûres ou relâchement de l'épithélium). Tous les effets, à l'exception de la rétention de fluorescéine (qui n'est mesurée que lors du prétraitement 
et 30 minutes après l'exposition à la substance d'essai), sont mesurés à 
chacun des temps d'observation indiqués ci-dessus.
 
37. Il est conseillé de prendre des photographies pour attester l'opacité 
cornéenne, la rétention de fluorescéine, les effets morphologiques, et, le 
cas échéant, les observations histopathologiques.  
38. Après l'examen final à quatre heures, il est recommandé de conserver les 
yeux dans un fixateur approprié (par exemple, formol tamponné à pH 
neutre) en vue d'un éventuel examen histopathologique.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 694
 
39. Le gonflement cornéen est déterminé par des mesures d'épaisseur de la 
cornée réalisées au moyen d'un pachymètre optique monté sur un biomi ­
croscope. Il est exprimé en pourcentage et calculé à partir des mesures d'épaisseur de la cornée, selon la formule suivante:
 
" 
épaisseur de la cornée au temps t  Ä épaisseur de la cornée à t  ¼ 0 
épaisseur de la cornée à t  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Le pourcentage moyen de gonflement cornéen pour tous les yeux est 
calculé à chaque temps d'observation. À partir du score moyen de gonfle ­
ment cornéen le plus élevé obtenu sur l'ensemble des temps d'observation, 
un score général de catégorie est attribué à chaque substance d'essai.  
41. Le score d'opacité cornéenne est calculé sur la surface de cornée qui est la 
plus fortement opacifiée. La valeur moyenne d'opacité cornéenne pour tous les yeux est calculée à chaque temps d'observation. À partir du score moyen d'opacité cornéenne le plus élevé obtenu sur l'ensemble des 
temps d'observation, un score général de catégorie est attribué à chaque 
substance d'essai (Tableau 1).
 
Tableau 1  
Scores d'opacité cornéenne  
Score Observation  
0 Aucune opacité 
0,5 Très faible opacité 1 Zones éparses ou diffuses; les détails de l'iris sont nettement visibles 2 Zone translucide facilement discernable; les détails de l'iris sont légèrement 
occultés 
3 Forte opacité cornéenne; aucun détail spécifique de l'iris n'est visible; la taille de 
la pupille est à peine discernable 
4 Opacité cornéenne totale; l'iris est invisible
 
42. Pour tous les yeux examinés, la valeur moyenne de rétention de la fluores ­
céine n'est calculée qu'au temps d'observation de 30 minutes, qui est utilisé pour déterminer le score général de catégorie attribué à chaque substance d'essai (Tableau 2).
 
Tableau 2  
Scores de rétention de fluorescéine  
Score Observation  
0 Pas de rétention de fluorescéine 
0,5 Coloration très mineure de cellules individuelles 1 Coloration de cellules individuelles éparses dans toute la zone traitée de la 
cornée 
2 Coloration dense de foyers de cellules individuelles ou de cellules individuelles 
confluentes 
3 Grandes zones confluentes de cornée retenant la fluorescéine
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43. Les effets morphologiques comprennent le phénomène de «piqûre» des 
cellules épithéliales cornéennes, le «relâchement» de l'épithélium, la 
«rugosité» de la surface cornéenne et «l'adhérence» de la substance d'essai sur la cornée. La gravité de ces effets est variable et ils peuvent être observés simultanément. Leur classification est subjective et dépend 
de l'interprétation de l'observateur.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Évaluation des données  
44. Les résultats d'opacité cornéenne, de gonflement de la cornée et de réten ­
tion de fluorescéine sont évalués séparément et aboutissent à la détermi ­
nation d'une catégorie OPI par effet mesuré. Ces catégories sont ensuite combinées en une classification de l'effet irritant pour chaque substance d'essai.
 
Critères de décision  
45. Après évaluation de chacun des effets, des catégories OPI peuvent être 
assignées à la substance selon un barème prédéterminé. L'interprétation de 
l'épaisseur cornéenne (Tableau 3), de l'opacité de la cornée (Tableau 4) et 
de la rétention de fluorescéine (Tableau 5) au moyen de 4 catégories OPI, suit la progression suivante:
 
Tableau 3  
Critères de classification OPI pour l'épaisseur cornéenne  
Gonflement moyen de la cornée (%) (*) Catégorie OPI  
0 à 5 I 
> 5 à 12 II 
> 12 à 18 (> 75 min après traitement) II 
> 12 à 18 ( ≤ 75 min après traitement) III 
> 18 à 26 III > 26 à 32 (> 75 min après traitement) III > 26 à 32 ( ≤ 75 min après traitement) IV 
> 32 IV
 
(*) Les scores de gonflement cornéen ne sont applicables que si l'épaisseur est mesurée au moyen d'un 
biomicroscope Haag-Streit BP900 équipé d'un dispositif de mesure de profondeur n  o I avec un réglage 
de largeur de fente à 9½, soit 0,095 mm. Les utilisateurs tiennent compte du fait que les mesures 
d'épaisseur de cornée par un biomicroscope varient en fonction du réglage de la largeur de fente.  
Tableau 4  
Critères de classification OPI pour l'opacité.  
Score moyen maximal d'opacité (*) Catégorie OPI  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Voir tableau 1  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 696
 
Tableau 5  
Critères de classification OPI pour la rétention moyenne de fluorescéine  
Score de rétention moyenne de fluorescéine 30 
minutes après traitement (*) Catégorie OPI  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Voir tableau 2.  
46. La classification générale des effets irritants in vitro d'une substance d'essai 
est déterminée par la catégorie d'effet irritant qui correspond à la combi ­
naison des catégories obtenues pour le gonflement cornéen, l'opacité cornéenne et la rétention de fluorescéine, et par application du schéma présenté dans le tableau 6.
 
Tableau 6  
Classification générale des effets irritants  in vitro  
Classification Combinaison des 3 critères d'évaluation  
Substance corrosive/fortement irritante 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Opacité cornéenne > 3 à 30 min (dans au moins 
deux yeux) Opacité cornéenne = 4 à n'importe quel temps d'observation (dans au moins deux yeux) 
Relâchement important de l'épithélium (dans au 
moins un œil)
 
(*) Combinaisons moins probables.  
47. Comme indiqué au paragraphe 1, s'il n'est pas démontré que la substance 
d'essai est corrosive ou fortement irritante pour l'œil, il convient de mener 
des essais complémentaires à des fins de classification et d'étiquetage. Pour la mise en évidence des substances corrosives ou fortement irritantes pour l'œil, la méthode d'essai OPI présente une précision globale comprise entre 
83 % (120/144) et 87 % (134/154), un taux de faux positifs allant de 6 % 
(7/122) à 8 % (9/116), et un taux de faux négatifs allant de 41 % (13/32) à 50 % (15/30), en comparaison avec les résultats de la méthode d'essai sur œil de lapin in vivo, classés selon les systèmes de classification de l'EPA 
(1), de l'UE (2), ou du SGH (3). Lorsqu'on exclut de la base de données 
les substances de certaines catégories chimiques (à savoir, les alcools et les tensioactifs) et physiques (à savoir, les solides), la précision de l'OPI dans les systèmes de classification de l'EPA, de l'UE ou du SGH se situe entre 
91 % (75/82) et 92 % (69/75), les taux de faux positifs entre 5 % (4/73) et 
6 % (4/70), et les taux de faux négatifs entre 29 % (2/7) et 33 % (3/9) (4).
 
48. Même si une substance d’essai n’est pas classée comme corrosive ou 
fortement irritante pour l'œil, les données de la méthode d'essai OPI 
peuvent servir, en association avec des résultats d’essais in vivo sur œil 
de lapin ou d’un autre test in vitro dûment validé, à évaluer plus en profondeur l’utilité et les limites de la méthode OPI pour la détection des substances faiblement irritantes ou non irritantes (un document d'orien ­
tation sur l’utilisation de méthodes d’essai de toxicité oculaire in vitro est 
en cours d'élaboration).
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Critères d'acceptation de l'étude  
49. Un essai est considéré comme acceptable lorsque la classification de l'ir ­
ritation obtenue pour les témoins négatifs et de véhicule/solvant parallèles, 
d'une part, et pour les témoins positifs parallèles, d'autre part, situe les substances correspondantes respectivement dans les catégories «substances non irritantes» et «substances fortement irritantes/corrosives».
 
Rapport d'essai  
50. Le rapport d’essai contient les renseignements suivants, dès lors qu'ils 
s'appliquent à l'étude:  
Substances d’essai et témoins  
Nom(s) chimique(s), par exemple nom de la structure chimique utilisé par 
le Chemical Abstracts Service (CAS), suivi d’autres noms, s’ils sont connus;
 
Numéro d'enregistrement CAS (RN), s'il est connu;  
Pureté et composition de la substance ou du mélange (en pourcentage 
pondéral), dans la mesure où cette information est disponible;  
Propriétés physicochimiques, comme l'état physique, la volatilité, le pH, la 
stabilité, la classe chimique, la solubilité dans l'eau, pertinentes pour la 
conduite de l'étude;  
Le cas échéant, traitement des substances d’essai et témoins avant l’essai 
(par exemple, chauffage, broyage);  
Stabilité (si elle est connue);  
Renseignements relatifs au commanditaire et à l’installation d’essai:  
Nom et adresse du commanditaire, de l'installation d'essai et du directeur 
de l'étude;  
Provenance des yeux (par exemple, établissement auprès duquel ils ont été 
recueillis);  
Stockage et conditions de transport des yeux (par exemple, date et heure 
de la collecte, délai avant le début de l'essai);  
Dans la mesure du possible, caractéristiques spécifiques des animaux sur 
lesquels ont été prélevés les yeux (par exemple, âge, sexe, poids de l'animal donneur);
 
Justification du choix de la méthode d'essai et du mode opératoire  
Intégrité de la méthode d'essai  
Mode opératoire utilisé pour assurer l'intégrité (précision et fiabilité) de la 
méthode d'essai au cours du temps (par exemple essai périodique des 
substances d’épreuve de compétence, utilisation de données antérieures 
de témoins positifs et négatifs).  
Critères d'acceptabilité de l’essai  
Le cas échéant, gamme de témoins de référence parallèles acceptables 
selon des données antérieures;  
Conditions de l'essai  
Description du système d'essai utilisé;  
Biomicroscope (lampe à fente) utilisé (par exemple, modèle);  
Réglages du biomicroscope;  
Informations sur les yeux de poulet utilisés, notamment appréciation de 
leur qualité;  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 698
 
Détails sur le mode opératoire d’essai utilisé;  
Concentration(s) des substances d'essai utilisées;  
Description de toutes les modifications du mode opératoire de l’essai;  
Référence aux données historiques du modèle (par exemple, témoins posi ­
tifs et négatifs, substances d’épreuves de compétence, substances étalons);  
Description des critères d’évaluation utilisés;  
Résultats  
Description des autres effets observés;  
Le cas échéant, photographies de l'œil;  
Discussion des résultats  
Conclusion  
BIBLIOGRAPHIE  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) Règlement (CE) n  o 1272/2008 du Parlement européen et du Conseil 
du 16 décembre 2008 relatif à la classification, à l'étiquetage et à 
l'emballage des substances et des mélanges, modifiant et abrogeant les directives 67/548/CEE et 1999/45/CE et modifiant le règlement (CE) n
 o 1907/2006. JO L 353 du 31.12.2008, p. 1.  
(3) Nations unies (NU) (2007). Système général harmonisé de classifica ­
tion et d'étiquetage des produits chimiques (SGH), deuxième édition révisée, Nations unies, New York et Genève, 2007. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/ 
02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(6) Règlement (CE) n  o 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil 
du 18 décembre 2006 concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'au ­
torisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applica ­
bles à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des 
produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le 
règlement (CEE) n  o 793/93 du Conseil et le règlement (CE) 
n o 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du 
Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 
2000/21/CE de la Commission. JO L 396 du 30.12.2006, p. 1.  
(7) OCDE (2002). Ligne directrice 405. Ligne directrice de l'OCDE pour 
les essais de produits chimiques. Effet irritant/corrosif aigu sur les yeux. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_370513 
68_1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the 
enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alter ­
native to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.  
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Disponible à l'adresse suivante:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pre ­
diction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponible à l'adresse suivante:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 701
 
Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Précision:  degré de concordance entre les résultats de la méthode d'essai et les 
valeurs de référence acceptées. La précision constitue une mesure de la perfor ­
mance de la méthode d'essai et un aspect de sa «pertinence». Ce terme est souvent utilisé de façon interchangeable avec «concordance» pour désigner la proportion de résultats corrects d'une méthode d'essai.
 
Substance étalon:  substance utilisée en tant que référence, pour la comparaison 
avec une substance d'essai. Une substance étalon présente les propriétés 
suivantes: i) provient d'une ou de plusieurs sources constantes et fiables; ii) 
présente une similitude structurale et fonctionnelle avec la classe des substances soumises à l'essai; iii) possède des caractéristiques physiques/chimiques connues; iv) est accompagnée de données confirmant ses effets connus, et v) a une puis ­
sance connue dans la fourchette de réponses désirées.
 
Cornée:  partie transparente située à l’avant du globe oculaire, recouvrant l’iris et 
la pupille et laissant pénétrer la lumière vers l’intérieur de l’œil.  
Opacité cornéenne:  mesure de l’étendue du caractère opaque de la cornée suite 
à son exposition à une substance d’essai. Une augmentation de l'opacité cornéenne indique un endommagement de la cornée.
 
Gonflement cornéen:  mesure objective dans l'essai OPI de l'ampleur de la 
distension de la cornée après exposition à une substance d'essai. Elle est 
exprimée en pourcentage et est calculée au moyen des mesures initiales (avant 
administration de la dose) d'épaisseur cornéenne, et des mesures d'épaisseur relevées à intervalles réguliers après exposition à la substance d'essai dans l'essai OPI. Le degré de gonflement cornéen est un indicateur d'endommagement 
de la cornée.
 
Catégorie 1 de l'EPA:  effet corrosif (destruction irréversible du tissu oculaire) 
ou complication cornéenne ou irritation persistant plus de 21 jours (1).  
Catégorie R41 de l'UE:  lésion des tissus oculaires ou dégradation sévère de la 
vue, provoquée par l'application d'une substance d'essai sur la face antérieure de l'œil, et qui n'est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant 
l'application (2).
 
Taux de faux négatifs:  proportion de substances positives faussement déclarées 
négatives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la 
méthode d'essai.  
Taux de faux positifs:  proportion des substances négatives faussement déclarées 
positives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la 
méthode d'essai.  
Rétention de fluorescéine:  mesure subjective, dans l'essai OPI, de la quantité de 
fluorescéine sodique qui est retenue par les cellules épithéliales de la cornée après 
exposition à une substance d'essai. Le degré de rétention de fluorescéine est un indicateur d'endommagement de la cornée.
 
SGH (Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des 
produits chimiques):  système proposant la classification des produits chimiques 
(substances et mélanges) conformément à des types et des niveaux normalisés de dangers physiques, sanitaires et environnementaux, ainsi que la communication 
des éléments d'information correspondants, notamment par des pictogrammes, 
mentions d’avertissement, mentions de danger, conseils de prudence et fiches de données de sécurité, afin de diffuser des informations sur leurs effets indési ­
rables dans l'objectif de protéger les personnes (en particulier les employeurs, 
employés, transporteurs, consommateurs et personnels des services d'urgence) et 
l'environnement (3).
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Catégorie 1 du SGH:  lésion des tissus oculaires ou dégradation sévère de la vue, 
provoquée par l'application d'une substance d'essai sur la face antérieure de l'œil, et 
qui n'est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l'application (3).  
Danger:  propriété intrinsèque d'un agent ou situation susceptible de provoquer 
des effets néfastes lorsqu'un organisme, un système ou une (sous-)population est exposé(e) à cet agent.
 
Témoin négatif:  réplicat non traité contenant tous les composants d’un système 
d’essai. Cet échantillon subit les mêmes procédures que les échantillons traités avec la substance d'essai et les autres échantillons témoins afin de déterminer si 
le solvant interagit avec le système d’essai.
 
Substance non irritante:  substance qui n'est pas classée comme irritant oculaire 
dans la catégorie I, II ou III de l'EPA, la catégorie R41 ou R36 de l'UE, ou la 
catégorie 1, 2A ou 2B du SGH (1) (2) (3).  
Substance corrosive pour l'œil:  a) substance provoquant des lésions irréversibles 
des tissus oculaires; b) substance classée comme irritant oculaire dans la catégorie 1 du SGH, la catégorie 1 de l’EPA ou la catégorie R41 de l’UE (1) (2) (3).
 
Substance irritante pour l'œil:  a) substance provoquant une modification réver ­
sible de l’œil suite à une application sur la face antérieure de l’œil; b) substance classée comme irritant oculaire dans la catégorie II ou III de l'EPA, la catégorie 
R36 de l'UE ou la catégorie 2A ou 2B du SGH (1) (2) (3).
 
Substance fortement irritante pour l'œil:  a) substance provoquant des lésions 
des tissus oculaires suite à une application sur la face antérieure de l’œil, qui 
ne sont pas réversibles dans les 21 jours suivant l'application ou entraînent une dégradation sévère de la vue; b) substance classée comme irritant oculaire dans la catégorie 1 du SGH, la catégorie 1 de l’EPA ou la catégorie R41 de l’UE 
(1) (2) (3).
 
Témoin positif:  réplicat contenant tous les composants d’un système d’essai, et 
traité avec une substance induisant notoirement une réponse positive. Afin de 
pouvoir évaluer la variabilité des réponses du témoin positif dans le temps, la sévérité de la réponse ne devra pas être excessive.
 
Fiabilité:  mesure de la reproductibilité de l'essai mis en œuvre, au sein d'un 
laboratoire et entre des laboratoires, au cours du temps, en utilisant le même mode opératoire. Elle est évaluée par calcul de la reproductibilité intralaboratoire 
et interlaboratoires et de la répétabilité intralaboratoire.
 
Biomicroscope (lampe à fente):  instrument utilisé pour examiner directement 
l'œil sous le grossissement d'un microscope binoculaire en créant une image 
stéréoscopique droite. Dans la méthode d’essai OPI, cet instrument est utilisé pour visualiser les structures antérieures de l’œil de poulet et également pour mesurer objectivement l’épaisseur de la cornée au moyen d’un dispositif adjoint 
de mesure de la profondeur.
 
Témoin de solvant/véhicule:  échantillon non traité contenant tous les compo ­
sants d’un système d’essai, y compris le solvant ou véhicule utilisé pour tester les 
échantillons témoins traités ou non avec la substance d’essai afin de déterminer une réponse de référence pour les échantillons traités avec la substance d’essai dissoute dans le même solvant ou véhicule. Testé avec un témoin négatif concur ­
rent, cet échantillon indique également si le solvant ou véhicule interagit avec le 
système d'essai.
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Stratégie d'essai séquentielle:  démarche expérimentale séquentielle consistant à 
examiner toutes les informations existantes sur une substance d'essai dans un 
ordre déterminé, en ayant recours à chaque étape à une procédure fondée sur la force probante des données pour déterminer si les informations disponibles sont suffisantes pour décider d'une classification des dangers, avant de passer à 
l'étape suivante. Si le potentiel d’irritation d’une substance d’essai peut être 
déterminé sur la base des informations existantes, aucun essai supplémentaire n’est nécessaire. Dans le cas contraire, une procédure expérimentale progressive de type séquentiel sur des animaux est alors lancée jusqu’à ce qu’une classifi ­
cation sans équivoque puisse être effectuée.
 
Méthode d'essai validée:  méthode d'essai ayant fait l'objet d'études de validation 
visant à déterminer sa pertinence (notamment sa précision) et sa fiabilité à des fins spécifiques. Il importe de noter que les performances d'une méthode d'essai validée peuvent être insuffisantes en termes de précision et de fiabilité pour 
qu'elle soit jugée acceptable pour les besoins envisagés.
 
Force probante des données:  prise en compte des forces et des faiblesses de 
divers éléments d’information en vue d'aboutir à une conclusion concernant le danger potentiel d’une substance et d’étayer cette conclusion.
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Appendice 2  
SUBSTANCES D’ÉPREUVE DE COMPÉTENCE POUR LA MÉTHODE 
D'ESSAI OPI  
Avant d'utiliser en routine une méthode conforme à cette méthode d'essai, 
certains laboratoires peuvent estimer souhaitable de démontrer leurs compétences techniques en identifiant correctement la catégorie de corrosivité oculaire des 10 substances recommandées dans le tableau 1. Ces substances ont été sélectionnées 
de façon à représenter la gamme des réactions locales d'irritation/corrosion 
oculaire, sur la base des résultats de l'essai sur œil de lapin in vivo (TG 405) (à savoir, les catégories 1, 2A, 2B, ou non classées ou non étiquetées selon le SGH des Nations unies) (3) (7). Toutefois, compte tenu de l’utilité validée de ces 
essais (uniquement mise en évidence des substances corrosives/fortement irri ­
tantes pour l'œil), seuls deux résultats expérimentaux obtenus à des fins de clas ­
sification (substance corrosive/fortement irritante ou substance non corrosive/fai ­
blement irritante) permettent de démontrer les compétences des laboratoires. Les 
autres critères de sélection retenus ont trait à la disponibilité des substances dans 
le commerce, à la disponibilité de données de référence in vivo de bonne qualité, et à l’existence de données de bonne qualité issues des deux méthodes d’essai in 
vitro qui font l’objet de lignes directrices. Pour cette raison, les substances 
irritantes ont été sélectionnées dans la liste recommandée par l'ICCVAM de 122 substances de référence pour la validation de méthodes d'essai de toxicité oculaire in vitro (voir appendice H, ICCVAM Recommended Reference Subs ­
tances List)(4). Les données de référence sont disponibles dans les documents de 
l'ICCVAM (Background Review Documents) pour la méthode d’essai d’opacité et de perméabilité de la cornée bovine (OPCB) et la méthode OPI (18) (19).
 
Tableau 1  
Substances recommandées pour la démonstration des compétences techniques relatives à la méthode OPI  
Substance chimique N  o CAS Classe chimique (  1 ) Forme physique Classification in 
vivo (  2 ) Classification in vitro (  3 ) 
Chlorure de benzal ­
conium (5 %) 8001-54-5 Composé 
d'onium Liquide Catégorie 1 Corrosif/fortement 
irritant 
Chlorhexidine 55-56-1 Amine, 
Amidine Solide Catégorie 1 Corrosif/fortement 
irritant 
Acide dibenzoyl-L- 
tartrique 2743-38-6 Acide carboxy ­
lique, ester Solide Catégorie 1 Corrosif/fortement 
irritant 
Imidazole 288-32-4 Hétérocycle Solide Catégorie 1 Corrosif/fortement 
irritant 
Acide trichloroacé ­
tique (30 %) 76-03-9 Acide carboxy ­
lique Liquide Catégorie 1 Corrosif/fortement 
irritant 
Chlorure de 2,6- 
dichlorobenzoyle 4659-45-4 Halogénure 
d'acyle Liquide Catégorie 2A Non corrosif/Faible ­
ment irritant 
2-méthylacéto-acétate 
d'éthyle 609-14-3 Cétone, Ester Liquide Catégorie 2B Non corrosif/Faible ­
ment irritant 
Nitrate d'ammonium 6484-52-2 Sel inorganique Solide Catégorie 2A Non corrosif/Faible ­
ment irritant  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 705
 
Substance chimique N  o CAS Classe chimique (  1 ) Forme physique Classification in 
vivo (  2 ) Classification in vitro (  3 ) 
Glycérol 56-81-5 Alcool Liquide Non étiqueté Non corrosif/Faible ­
ment irritant 
n-Hexane 110-54-3 Hydrocarbure 
(acyclique) Liquide Non étiqueté Non corrosif/Faible ­
ment irritant  
Abréviations: N  o CAS = Numéro d'enregistrement au Chemical Abstract Service 
( 1 ) Les classes de produits chimiques ont été attribuées à chaque substance testée à l'aide d'un système de classification normal isé, 
fondé sur le système de classification du  Medical Subject Headings  (MeSH) de la Bibliothèque nationale de médecine des États- 
Unis d'Amérique (disponible sur http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) D'après les résultats de l'essai in vivo sur œil de lapin (Ligne directrice de l'OCDE n  o 405) et en utilisant le SGH des NU (3)(7). 
( 3 ) D'après les résultats des méthodes OPCB et OPI.  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 706
 
Appendice 3  
Schémas de l'appareil de surfusion et des clamps pour œil 
(méthode OPI)  
[Voir Burton et al. (17) pour d'autres descriptions génériques de 
l'appareil de surfusion et du clamp pour œil]
  ▼M2 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 707
 
B.49.  ESSAI IN VITRO DE MICRONOYAUX SUR CELLULES DE 
MAMMIFÈRES  
INTRODUCTION  
1. L’essai in vitro de micronoyaux (MNvit) est un essai de génotoxicité 
consistant à mettre en évidence d’éventuels micronoyaux (MN) dans le 
cytoplasme de cellules en interphase. Les micronoyaux peuvent avoir pour origine des fragments de chromosomes acentriques (c’est-à-dire dépourvus de centromère) ou des chromosomes entiers incapables de 
migrer vers les pôles de la cellule au cours de l’anaphase. L’essai permet 
de détecter l’activité de substances chimiques clastogènes et aneugènes (substances et mélanges) (1) (2) dans des cellules ayant effectué une mitose pendant ou après l’exposition à la substance d’essai. La présente 
méthode d’essai autorise l’utilisation de protocoles incluant ou non la cyto ­
chalasine B (cytoB), un inhibiteur de polymérisation de l’actine. Une adjonction de cytoB avant la mitose ciblée permet la détermination et 
l’analyse sélective de la fréquence des micronoyaux dans les cellules 
ayant effectué une mitose, ces cellules étant binucléées (3) (4). Cette méthode d’essai autorise également l’utilisation de protocoles ne mettant pas en jeu le blocage de la cytokinèse, à condition de pouvoir démontrer 
que la population cellulaire analysée a bien effectué une mitose.
 
2. Outre qu’il permet d’identifier des substances chimiques (substances et 
mélanges) induisant la formation de micronoyaux, l’essai MNvit, associé 
au blocage de la cytokinèse, au marquage immunochimique des kinéto ­
chores ou à l’hybridation avec sondes centromériques/télomériques [hybri ­
dation fluorescente in situ (FISH)], peut apporter des informations sur les 
mécanismes à l’origine des lésions chromosomiques et de la formation de 
micronoyaux (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Ces procédures de marquage et d’hybridation peuvent être suivies lorsqu’une augmentation de la formation de micronoyaux est constatée et que l’inves ­
tigateur souhaite déterminer si cette augmentation est le résultat d’événe ­
ments clastogènes et/ou aneugènes.
 
3. Contrairement aux aberrations chromosomiques observées dans les cellules 
en métaphase, qui ne sont pas forcément transmises, les micronoyaux sont des lésions transmises aux cellules-filles. Dans la mesure où les micro ­
noyaux présents dans les cellules en interphase peuvent être évalués de 
façon relativement objective, le personnel du laboratoire a seulement besoin de déterminer si les cellules ont effectué une mitose, et de dénom ­
brer les cellules contenant un micronoyau. L’examen des préparations est 
donc relativement rapide, et l’analyse peut être automatisée. Chaque traite ­
ment permettant l’examen non plus de centaines mais de milliers de cellules, la puissance de l’essai s’en trouve accrue. Enfin, étant donné que les micronoyaux peuvent être issus de chromosomes retardataires, 
l’essai peut permettre de détecter la présence d’agents inducteurs d’aneu ­
ploïdie, difficiles à étudier lors de tests d’aberration chromosomique clas ­
siques, tels que celui décrit dans la ligne directrice n
 o 473 de l’OCDE 
(chapitre B.10 de la présente annexe) (17). Toutefois, l’essai MNvit ne 
permet pas de différencier les substances chimiques induisant la polyploïdie 
de celles induisant la clastogénicité sans avoir recours à des techniques spécifiques, telles que la méthode FISH citée au paragraphe 2.
 
4. L’essai MNvit est une méthode d’essai in vitro utilisant généralement des 
cultures de cellules humaines ou de rongeur. Grâce à sa capacité de mise en 
évidence d’agents aneugènes et clastogènes, il constitue un outil de base 
complet pour l’étude in vitro du potentiel de lésions chromosomiques.  
5. L’essai MNvit est efficace et fiable sur plusieurs types de cellules, et en 
présence ou en l’absence de cytoB. La validité de l’essai MNvit est attestée par de nombreuses données, et ce avec l’utilisation de différentes lignées cellulaires issues de rongeurs (CHO, V79, CHL/IU et L5178Y) et de 
lymphocytes humains (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) 
(28) (29) (30) (31). Ces données proviennent notamment des études inter ­
nationales de validation coordonnées par la Société française de toxicologie génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) et des rapports de l’International 
Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Les données disponibles ont en 
outre fait l’objet d’une nouvelle évaluation lors d’une étude de validation
 ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 708
 
rétrospective fondée sur le poids de la preuve, réalisée par le Centre euro ­
péen pour la validation de méthodes alternatives (ECVAM) de la Commis ­
sion européenne. Cette méthode d’essai a été déclarée scientifiquement valable par le comité consultatif scientifique de l’ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). L’utilisation d’une lignée cellulaire lymphoblastoïde humaine 
TK6 (35), de cellules HepG2 (36) (37) et de cellules embryonnaires 
primaires de hamster syrien (38) a été décrite mais n’a pas été retenue dans les études de validation.
 
DÉFINITIONS  
6. Les définitions des termes employés sont présentées à l’appendice 1.  
CONSIDÉRATIONS INITIALES  
7. À moins que les cellules utilisées ne soient dotées d’un métabolisme 
compatible avec les substances d’essai, les essais conduits in vitro requiè ­
rent généralement une source exogène d’activation métabolique. Or, les systèmes d’activation métabolique exogène sont incapables de reproduire 
parfaitement les conditions in vivo. Il convient aussi d’éviter d’introduire 
des conditions qui conduiraient à de faux résultats positifs ne reflétant pas une mutagénicité intrinsèque, et pouvant provenir de facteurs tels que des modifications importantes du pH ou de l’osmolalité, ou une forte cytotoxi ­
cité (39) (40) (41). En cas de modification du pH du milieu par la substance 
chimique d’essai lors de son adjonction, il convient d’ajuster le pH, de préférence en tamponnant la solution mère de façon que tous les volumes restent identiques pour toutes les concentrations d’essai et tous les témoins.
 
8. Afin que l’analyse de l’induction de micronoyaux soit valable, il est essen ­
tiel que la mitose se soit produite aussi bien dans les cultures traitées et que 
dans les cultures non traitées. Pour que son intérêt soit maximal, la numé ­
ration des micronoyaux est effectuée dans les cellules ayant achevé une mitose durant ou après l’application de la substance d’essai.
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
9. Les cultures cellulaires d’origine humaine ou mammifère sont exposées à la 
substance d’essai, en présence et en l’absence d’une source exogène d’ac ­
tivation métabolique, à moins que les cellules utilisées ne soient dotées de 
capacités métaboliques idoines. Tous les essais prévoient l’utilisation de 
témoins parallèles de solvant/véhicule et de témoins positifs.  
10. Durant ou après l’exposition à la substance d’essai, les cellules sont mises 
en culture pendant une période suffisante pour que la lésion chromosomique 
ou fusoriale conduise à la formation de micronoyaux dans les cellules en interphase. La substance d’essai est normalement présente au cours de la mitose pour qu’il y ait induction d’une aneuploïdie. Les cellules récoltées 
en interphase sont teintées et soumises à analyse pour déceler la présence de 
micronoyaux. En principe, la numération des micronoyaux ne devrait être réalisée que dans les cellules ayant effectué une mitose durant l’exposition à la substance d’essai, ou pendant la période de postexposition, si l’essai la 
prévoit. Dans les cultures ayant été exposées à un agent de blocage de la 
cytokinèse, la numération n’est effectuée que sur les cellules binucléées. En l’absence d’agent de blocage de la cytokinèse, il importe de démontrer que les cellules analysées ont selon toute vraisemblance subi une mitose pendant 
ou après l’exposition à la substance d’essai. Pour tous les protocoles, il 
convient de démontrer qu’une prolifération cellulaire a eu lieu tant dans les cultures témoins que dans les cultures traitées. Le degré de cytotoxicité ou de cytostase induit par la substance d’essai est évalué pour les cultures 
(ou des cultures parallèles) dans lesquelles est réalisée la numération des 
micronoyaux.
 ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 709
 
DESCRIPTION DE L’ESSAI  
Préparations  
11. L’emploi de lymphocytes primaires du sang périphérique humain en culture 
(5) (19) (42) (43) et de plusieurs lignées cellulaires issues de rongeurs, telles 
que des cellules CHO, V79, CHL/IU et L5178Y, est possible dans le cadre de cet essai (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Tout recours à d’autres lignées cellulaires ou d’autres types de cellules est justifié via la 
démonstration de leur performance pour l’essai, ainsi qu’il est indiqué dans 
la section sur les critères d’acceptabilité. Dans la mesure où la fréquence des micronoyaux généralement constatée pour un type de cellule aura une influence sur la sensibilité de l’essai, il est recommandé d’utiliser des types 
de cellules pour lesquelles la fréquence habituelle de formation de micro ­
noyaux est faible et stable.
 
12. Les lymphocytes du sang périphérique humain utilisés sont issus de sujets 
jeunes (âgés de 18 à 35 ans environ), sains, non fumeurs et n’ayant pas subi 
récemment d’exposition connue à des rayonnements ou des substances chimiques génotoxiques. Si des cellules issues de plusieurs donneurs sont mises en commun, le nombre des donneurs est précisé. La fréquence des 
micronoyaux augmente avec l’âge, et cette tendance est plus marquée chez 
la femme que chez l’homme (44). Cela est pris en compte lors du choix des donneurs pour une mise en commun des cellules.
 
Milieu et conditions de culture  
13. Il convient d’utiliser un milieu de croissance et des conditions d’incubation 
(récipients de culture, concentration de CO  2 , température et humidité) 
appropriés pour les cultures. La stabilité du caryotype et l’absence de contamination par des mycoplasmes sont vérifiées régulièrement dans les 
lignées cellulaires établies et les souches cellulaires, qui sont écartées si une 
contamination ou une modification du caryotype sont constatées. La durée normale du cycle cellulaire dans les conditions de culture appliquées par le laboratoire d’essai doit être connue. En cas de recours à la méthode du 
blocage de la cytokinèse, la concentration de l’inhibiteur de la cytokinèse 
est adaptée au type de cellule utilisé, et preuve est faite de son aptitude à produire suffisamment de cellules binucléées pour pouvoir procéder à une numération.
 
Préparation des cultures  
14. Lignées cellulaires établies et souches cellulaires: les cellules sont multi ­
pliées à partir de cultures mères, placées dans le milieu de culture à une densité telle qu’elles ne recouvriront pas entièrement la surface du milieu, 
sur une seule couche, et que les cultures en suspension n’atteindront pas 
une densité excessive avant le moment de la récolte, et incubées à 37 °C.
 
15. Lymphocytes: un sang total traité avec un anticoagulant (ex.: héparine) ou 
des lymphocytes isolés sont mis en culture en présence d’un mitogène [ex: 
phytohémagglutinine (PHA)] avant l’exposition à la substance d’essai et à 
la cytoB.  
Activation métabolique  
16. Le recours à un système d’activation métabolique exogène est nécessaire en 
cas d’utilisation de cellules dotées d’une capacité métabolique endogène 
inadéquate. Le système le plus couramment utilisé est une fraction postmi ­
tochondriale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foies de rongeurs traités avec des inducteurs enzymatiques, par exemple l’Aroclor 
1254 (45) (46) ou un mélange de phénobarbitone et ß-naphthoflavone (46) 
(47) (48) (49). L’utilisation de ce mélange n’est pas contraire à la Conven ­
tion de Stockholm sur les polluants organiques persistants (50) ni au règlement (CE) n
 o 850/2004 concernant les polluants organiques persistants 
(66) et s’est révélée aussi efficace que celle de l’Arcolor 1254 pour l’in ­
duction d’oxydases à fonction mixte (46) (47) (48) (49). La fraction S9 est généralement utilisée à une concentration comprise entre 1 et 10 % v/v dans le milieu d’essai final. Le choix du système d’activation métabolique peut 
dépendre de la classe chimique de la substance d’essai. Dans certains cas, il 
peut y avoir avantage à utiliser plus d’une concentration de la fraction S9.
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17. Des lignées cellulaires génétiquement modifiées pour produire des enzymes 
activantes spécifiques, humaines ou de rongeur, peuvent éliminer le besoin 
de recourir à un système d’activation métabolique exogène, et peuvent être utilisées comme cellules d’essai. Dans ce cas, le choix des lignées cellu ­
laires utilisées est justifié scientifiquement, par exemple par la pertinence 
des oxydases à fonction mixte pour le métabolisme de la substance d’essai 
(51) et par leur réactivité aux clastogènes et aneugènes connus (voir la section sur les critères d’acceptabilité). Il convient de prendre en considé ­
ration le fait que la substance d’essai peut ne pas être métabolisée par la ou 
les oxydases à fonction mixte exprimées, auquel cas des résultats négatifs 
n’indiqueraient pas que la substance d’essai n’est pas un inducteur de micronoyaux.
 
Préparation de la substance d’essai  
18. Les substances chimiques solides sont dissoutes dans un véhicule ou un 
solvant approprié puis, le cas échéant, diluées avant application. Les subs ­
tances chimiques liquides peuvent être ajoutées telles quelles ou après dilu ­
tion au système d’essai. Les essais de substances chimiques gazeuses ou 
volatiles nécessitent une modification appropriée des protocoles standards, par exemple l’utilisation de récipients hermétiquement clos (52) (53). Il convient d’utiliser des préparations fraîches sauf si l’on dispose de 
données démontrant la stabilité des préparations dans les conditions du 
stockage.
 
Conditions expérimentales  
Solvants/véhicules  
19. Le solvant/véhicule choisi ne doit pas réagir avec la substance d’essai ni 
altérer la survie des cellules et l’activité du mélange S9 à la concentration employée. L’emploi d’un solvant/véhicule inhabituel (autre que l’eau, le 
milieu de culture cellulaire ou le diméthylsulfoxyde, notamment) est justifié 
par des données faisant état de sa compatibilité avec la substance d’essai et de son absence de génotoxicité. Il est recommandé, dans la mesure du possible, d’envisager en premier lieu l’utilisation d’un véhicule/solvant 
aqueux.
 
Utilisation de la cytoB comme agent de blocage de la cytokinèse  
20. Il est essentiel, pour garantir l’efficacité de la méthode d’essai MNvit, que 
les cellules faisant l’objet d’une numération aient bien effectué une mitose au cours de l’application ou pendant la période d’incubation qui suit le traitement, le cas échéant. La cytoB est l’agent le plus couramment utilisé 
pour bloquer la cytokinèse, car elle inhibe l’assemblage de l’actine, empê ­
chant la séparation des cellules-filles après la mitose, d’où la formation de cellules binucléées (5) (54) (55). Ainsi, la numération des micronoyaux peut être limitée aux cellules ayant effectué une mitose pendant ou après le 
traitement. L’effet de la substance d’essai sur la cinétique de prolifération 
cellulaire peut être mesuré de façon concomitante. L’usage de cytoB comme agent de blocage de la cytokinèse est indiqué lors de l’utilisation de lymphocytes humains car la durée du cycle cellulaire est variable selon 
les cultures et les donneurs, et car tous les lymphocytes ne réagissent pas 
à la PHA. D’autres méthodes existent pour déterminer si les cellules des lignées cellulaires utilisées et faisant l’objet d’une numération ont effectué une mitose; ces méthodes sont détaillées ci-dessous (voir paragraphe 26).
 
21. Pour chaque type de cellule, le laboratoire détermine la concentration de cytoB 
permettant d’obtenir la fréquence optimale de cellules binucléées dans les 
cultures témoins traitées uniquement au solvant/véhicule. La concentration 
appropriée de cytoB se situe habituellement entre 3 et 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 711
 
Mesure de la prolifération et de la cytotoxicité cellulaires et choix des 
concentrations d’exposition  
22. Lors de la détermination de la plus forte concentration de substance d’essai 
à tester, on évitera les concentrations susceptibles de produire de fausses réponses positives, notamment celles qui engendrent une cytotoxicité exces ­
sive, une précipitation dans le milieu de culture ou une modification 
marquée du pH ou de l’osmolalité (39) (40) (41).
 
23. Des mesures de la prolifération cellulaire sont effectuées pour s’assurer que 
les cellules traitées ont bien effectué une mitose au cours de l’essai et que les applications sont réalisées à des niveaux de cytotoxicité appropriés (voir 
paragraphe 29). La cytotoxicité est déterminée avec et sans activation méta ­
bolique dans les cellules nécessitant une telle activation, via la mesure de l’augmentation relative du nombre de cellules ou le doublement relatif de la population (voir les formules à l’appendice 2), sauf si l’on utilise la cytoB, 
auquel cas la cytotoxicité peut être déterminée grâce à l’indice de réplica ­
tion (voir la formule à l’appendice 2).
 
24. L’application de cytoB sur les cultures, et la mesure des fréquences relatives 
de cellules mononucléées, binucléées et multinucléées dans chaque culture, 
offrent un moyen précis de quantifier l’effet d’un traitement sur la prolifé ­
ration cellulaire et l’activité cytotoxique ou cytostatique (5), et d’assurer que seules les cellules ayant effectué une mitose pendant ou après l’application sont prises en compte.
 
25. Dans les études faisant appel à la cytoB, la cytostase/cytotoxicité peut être 
quantifiée au moyen de l’indice de prolifération des cellules dont la division cytoplasmique a été bloquée (cytokinesis-block proliferation index, ou CBPI) (5) (26) (56) ou déduite de l’indice de réplication (RI) à partir 
d’au moins 500 cellules par culture (voir les formules à l’appendice 2). 
Lorsque la cytoB est utilisée pour évaluer la prolifération cellulaire, un CBPI ou RI est défini à partir d’au moins 500 cellules par culture. Ces mesures peuvent servir, parmi d’autres, à estimer la cytotoxicité en compa ­
rant les valeurs obtenues pour les cultures traitées et les cultures témoins. 
L’évaluation d’autres marqueurs de cytotoxicité (ex.: degré de confluence, nombre de cellules, apoptose, nécrose, comptage des cellules en métaphase) peut fournir des informations utiles.
 
26. Dans les études sans cytoB, il est nécessaire de démontrer que les cellules 
faisant l’objet d’une numération ont effectué une division cellulaire durant ou après l’exposition à la substance d’essai, faute de quoi on risque de produire de fausses réponses négatives. Les méthodes utilisées pour garantir 
que les cellules évaluées ont bien été divisées comprennent l’incorporation 
puis la détection de bromodéoxyuridine (BrdU) afin d’identifier les cellules répliquées (57), la formation de clones lorsque des cellules provenant de lignées cellulaires permanentes sont traitées et dénombrées in situ sur une 
lame de microscope (Indice de prolifération PI) (25) (26) (27) (28), la 
mesure du doublement relatif de la population (RPD) ou de l’augmentation relative du nombre de cellules (RICC) ou encore d’autres méthodes validées (16) (56) (58) (59) (voir les formules à l’appendice 2). L’évaluation d’autres 
marqueurs de cytotoxicité ou de cytostase (ex.: degré de confluence, 
nombre de cellules, apoptose, nécrose, comptage des cellules en métaphase) peut fournir des informations utiles.
 
27. Il convient d’évaluer au moins trois concentrations analysables. À cette fin, 
il peut être nécessaire de réaliser l’expérience en utilisant un plus grand 
nombre de concentrations peu espacées, et d’analyser la formation des micronoyaux pour les concentrations présentant la fourchette de cytotoxicité appropriée. Il est également possible de réaliser un essai de cytotoxicité 
préliminaire afin de réduire le spectre de l’essai définitif.
 
28. La concentration maximale vise à produire un taux de cytotoxicité de 55 ± 
5 %. Des concentrations plus fortes peuvent induire des lésions chromoso ­
miques comme effet secondaire de la cytotoxicité (60). En présence d’une 
substance cytotoxique, les concentrations retenues couvrent un domaine 
allant d’une cytotoxicité nulle ou légère à une cytotoxicité de 55 ± 5 %.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 712
 
29. Quand aucune cytotoxicité ni précipité n’est observé, la concentration maxi ­
male est la plus basse des trois concentrations suivantes: 0,01 M, 5 mg/mL 
ou 5 μl/mL. Les concentrations retenues pour l’expérience sont générale ­
ment séparées par un facteur de 10 au maximum. Pour les substances d’essai présentant une courbe concentration-réponse caractérisée par une 
forte pente, il peut être nécessaire de réduire ce facteur de séparation de 
façon à pouvoir analyser les cultures des plages de toxicité inférieures et moyennes.
 
30. Lorsque la solubilité est un facteur limitant, la concentration maximale, si 
elle n’est pas limitée par la cytotoxicité, correspond à la concentration la plus faible permettant d’observer une précipitation minimale dans les condi ­
tions de culture, sous réserve que le précipité n’interfère pas avec la numé ­
ration. L’évaluation de la précipitation est réalisée selon des méthodes telles 
que la microscopie optique, en notant tout précipité persistant ou apparais ­
sant durant la période de culture (avant la fin du traitement).
 
Témoins  
31. Il convient d’inclure dans chaque expérience des témoins positifs et des 
témoins de solvant/véhicule, avec et sans activation métabolique.  
32. Des témoins positifs sont nécessaires pour démontrer que les cellules utili ­
sées, et le protocole d’essai, permettent bien d’identifier les agents clas ­
togènes et aneugènes, et prouver la capacité métabolique de la préparation S9. Les témoins positifs font appel à des inducteurs connus de formation de micronoyaux à des concentrations susceptibles d’entraîner une augmentation 
faible, mais reproductible, de la fréquence de fond, et de démontrer la 
sensibilité du système d’essai. Les concentrations des témoins positifs sont choisies de manière que les effets soient nets mais que l’identité des lames codées ne soit pas évidente pour celui qui les interprète.
 
33. Un clastogène nécessitant une activation métabolique (par exemple: cyclo ­
phosphamide; benzo[a]pyrène) est utilisé pour démontrer d’une part la compétence métabolique et d’autre part l’aptitude du système d’essai à 
détecter les clastogènes. D’autres témoins positifs peuvent être utilisés si 
cela est justifié. Certains témoins positifs qui nécessitent une activation métabolique étant parfois actifs sans activation métabolique exogène dans certaines conditions de traitement ou chez certaines lignées cellulaires, la 
nécessité d’avoir recours à une activation métabolique, ainsi que l’activité 
de la préparation S9, sont démontrées pour la lignée cellulaire retenue et pour les concentrations sélectionnées.
 
34. À l’heure actuelle, aucun aneugène connu ne nécessite une activation méta ­
bolique pour présenter une activité génotoxique (16). Les témoins positifs actuellement acceptés pour l’activité aneugénique sont, notamment, la colchicine et la vinblastine. D’autres substances et mélanges chimiques 
peuvent être utilisés si ils induisent des micronoyaux uniquement, ou prin ­
cipalement, via leur activité aneugénique. Pour éviter d’avoir recours à deux témoins positifs (pour la clastogénicité et l’aneugénicité) sans activation métabolique, le témoin d’aneugénicité peut servir de témoin positif sans 
S9, et le témoin de clastogénicité peut être utilisé pour éprouver le caractère 
approprié du système d’activation métabolique utilisé. Les témoins positifs tant pour la clastogénicité que pour l’aneugénicité sont utilisés pour des cellules ne nécessitant pas de préparation S9. Les témoins positifs suggérés 
sont indiqués à l’appendice 3.
 
35. Le recours à des témoins positifs appartenant à la même classe chimique 
peut être envisagé, si des substances chimiques appropriées sont disponi ­
bles. Tous les témoins positifs utilisés sont adaptés au type de cellule 
concerné et aux conditions d’activation.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 713
 
36. Des témoins de solvant/véhicule sont inclus au moment de chaque récolte. 
En outre, des témoins négatifs non traités (sans solvant/véhicule) sont aussi 
utilisés à moins que des données publiées ou issues d’essais témoins réalisés antérieurement par le laboratoire ne démontrent que le solvant choisi n’a pas d’action génotoxique ou d’autre effet délétère aux concentrations rete ­
nues.
 
MODE OPÉRATOIRE  
Déroulement du traitement  
37. Afin d’augmenter au maximum la probabilité de détecter une action aneu ­
gène ou clastogène à un stade précis du cycle cellulaire, il importe qu’un 
nombre suffisant de cellules reçoive une application de la substance d’essai à tous les stades du cycle cellulaire. Le déroulement du traitement pour les lignées cellulaires et les cultures de cellules primaires peut donc différer 
quelque peu de celui pour les lymphocytes qui nécessitent une stimulation 
mitogénique pour débuter leur cycle cellulaire, ce qui est détaillé aux para ­
graphes 41-43 (16).
 
38. Les études théoriques et les données publiées (18) indiquent que la plupart 
des aneugènes et clastogènes sont détectés à l’issue d’une application de courte durée, comprise entre 3 et 6 heures, en présence et en l’absence de préparation S9, suivie du retrait de la substance d’essai et d’une période de 
croissance équivalente à 1,5 à 2,0 cycles cellulaires (6). Les échantillons de 
cellules sont prélevés après un temps correspondant à 1,5 à 2,0 fois la durée du cycle cellulaire normal (c’est-à-dire sans traitement) après le début du traitement ou à la fin du traitement (voir tableau 1). Les durées d’échan ­
tillonnage ou de récupération peuvent être allongées s’il est connu ou 
supposé que la substance d’essai affecte la durée du cycle cellulaire (par exemple si l’essai porte sur des analogues de nucléosides).
 
39. En raison de la cytotoxicité potentielle des préparations S9 pour les cellules 
de mammifères cultivées, le traitement d’exposition prolongée correspon ­
dant à 1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux n’est utilisé qu’en l’absence de préparation S9. Dans les protocoles de traitement prolongé, différents choix 
sont possibles pour permettre l’application de la substance d’essai sur les 
cellules en présence ou en l’absence de cytoB. Ces différents choix sont à faire en fonction des craintes d’interaction entre la substance d’essai et la cytoB.
 
40. Le tableau 1 présente les différents déroulements proposés pour le traite ­
ment. Ces déroulements de traitement généraux peuvent être modifiés en fonction de la stabilité et de la réactivité de la substance d’essai, ou des 
caractéristiques de croissance des cellules utilisées. Toutes les applications 
débutent et s’achèvent pendant la phase de croissance exponentielle des cellules. Ces déroulements sont présentés plus en détail dans les para ­
graphes 41 à 47 ci-dessous.
 
Tableau 1  
Traitement des cellules et temps de récolte pour l’essai MNvit  
Lymphocytes, cellules primaires et lignées 
cellulaires traités avec application de cytoB + S9 Traiter pendant 3 à 6 heures en présence de S9; 
éliminer la préparation S9 et le milieu de trai ­
tement; 
ajouter du milieu frais et de la cytoB; 
récolter après 1,5 à 2,0 cycles cellulaires 
normaux. 
– S9 
Exposition courte Traiter pendant 3 à 6 heures; 
éliminer le milieu de traitement; 
ajouter du milieu frais et de la cytoB; récolter après 1,5 à 2,0 cycles cellulaires 
normaux.
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– S9 
Exposition prolongée  Option A:  traiter pendant 1,5 à 2 cycles cellu ­
laires normaux en présence de cytoB; 
récolter à la fin de la période d’exposition.  
Option B:  traiter pendant 1,5 à 2 cycles cellu ­
laires normaux; 
éliminer la substance d’essai; 
ajouter du milieu frais et de la cytoB; récolter après 1,5 à 2,0 cycles cellulaires 
normaux. 
Lignées cellulaires traitées sans application de cytoB 
(mode de traitement identique à celui décrit ci-dessus, sauf que l’on n’ajoute pas de cytoB)
 
Lymphocytes, cellules primaires et lignées cellulaires avec cytoB  
41. Pour les lymphocytes, la méthode la plus efficace consiste à démarrer 
l’exposition à la substance d’essai 44 à 48 heures après la stimulation par 
la PHA, une fois la synchronisation du cycle cellulaire disparue (5). Lors de 
l’essai initial, la substance d’essai est appliquée pendant 3 à 6 heures, en présence et en l’absence de S9. Le milieu de traitement est ensuite éliminé et remplacé par un milieu frais contenant de la cytoB, puis les cellules sont 
récoltées après un laps de temps correspondant à 1,5 à 2,0 fois le cycle 
cellulaire normal.
 
42. Si les résultats des deux essais initiaux de traitement court (3-6 heures) sont 
négatifs ou équivoques, un autre traitement plus long est appliqué par la suite (sans S9). Deux traitements différents, également acceptables, sont possibles. Toutefois, il peut s’avérer plus approprié de suivre l’option A 
pour les lymphocytes stimulés, dont la croissance exponentielle peut 
décliner 96 heures après la stimulation. Par ailleurs, il convient que les cultures de cellules ne recouvrent pas entièrement la surface du milieu avant l’échantillonnage final dans le cadre de l’option B:
 
— Option A: Les cellules sont traitées avec la substance d’essai pendant 
1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux, et récoltées à la fin du traitement.  
— Option B: Les cellules sont traitées avec la substance d’essai pendant 
1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux. Le milieu de traitement est ensuite éliminé et remplacé par un milieu frais, puis les cellules sont récoltées 
après 1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux supplémentaires.
 
43. Le traitement des cellules primaires et des lignées cellulaires est identique à 
celui des lymphocytes, à l’exception du fait que la stimulation par PHA 
pendant 44 à 48 heures n’est pas nécessaire. Les cellules autres que les lymphocytes sont exposées de telle sorte qu’à la fin de l’étude, elles n’aient pas dépassé la phase de croissance exponentielle.
 
Lignées cellulaires sans cytoB  
44. Les cellules sont traitées pendant 3 à 6 heures en présence et en l’absence 
de S9. Le milieu du traitement est ensuite éliminé et remplacé par un milieu 
frais, puis les cellules sont récoltées après 1,5 à 2,0 cycles cellulaires 
normaux.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 715
 
45. Si les résultats des deux essais initiaux de traitement court (3-6 heures) sont 
négatifs ou équivoques, un autre traitement plus long est appliqué par la 
suite (sans S9). Deux traitements différents, également acceptables, sont possibles:
 
— Option A: Les cellules sont traitées avec la substance d’essai pendant 
1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux, et récoltées à la fin du traitement.  
— Option B: Les cellules sont traitées avec la substance d’essai pendant 
1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux. Le milieu de traitement est ensuite éliminé et remplacé par un milieu frais, puis les cellules sont récoltées 
après 1,5 à 2,0 cycles cellulaires normaux supplémentaires.
 
46. Il est possible que les cultures monocouches présentent des cellules mito ­
tiques (reconnaissables à leur forme ronde et se détachant de la surface) à 
l’issue du traitement de 3 à 6 heures. Ces cellules se détachant facilement 
de la culture, elles risquent d’être emportées lors de l’élimination du milieu contenant la substance d’essai. Afin d’éviter la perte de cellules en mitose qui sont susceptibles de former des micronoyaux, il convient donc de les 
recueillir avec soin lors du lavage des cultures puis de les y réintroduire au 
moment de la récolte.
 
Nombre de cultures  
47. Il convient de réaliser des cultures dupliquées pour chaque concentration de 
la substance d’essai, ainsi que pour les véhicules/solvants et les témoins 
négatifs. Si des résultats de laboratoire antérieurs ont démontré que la variation entre les cultures dupliquées est minime, l’utilisation d’une seule culture pour chaque concentration peut être envisagée. En cas d’utilisation 
de cultures uniques, il est recommandé d’analyser un plus grand nombre de 
concentrations.
 
Récolte des cellules et préparation des lames  
48. Chaque culture fait l’objet d’une récolte et d’un traitement séparés. La 
préparation des cellules peut comporter un traitement hypotonique, mais 
cette étape n’est pas indispensable si les cellules sont correctement étalées par un autre biais. Différentes méthodes peuvent être employées pour la préparation des lames, à condition que les préparations cellulaires obtenues 
pour la numération soient de très bonne qualité. Le cytoplasme cellulaire est 
conservé pour permettre la détection d’éventuels micronoyaux et (dans la méthode du blocage de la cytokinèse) le repérage fiable des cellules binu ­
cléées.
 
49. Les lames peuvent être colorées par différentes méthodes, au Giemsa ou à 
l’aide de colorants fluorescents spécifiques de l’ADN, par exemple (59). L’emploi d’un colorant spécifique [tel que l’orange d’acridine (61) ou Hoechst 33258 plus pyronine-Y (62)] permet d’éliminer une partie des 
artefacts dus à l’utilisation d’un colorant non spécifique de l’ADN. Les 
anticorps anti-kinétochore, la méthode FISH associée à des sonde ADN pancentromériques ou encore le marquage in situ par amorçage à l’aide d’amorces pancentromériques, avec un colorant de contraste de l’ADN 
approprié, peuvent être utilisés pour identifier le contenu (chromosomes/ 
fragments chromosomiques) des micronoyaux si les informations d’ordre mécanistique concernant leur formation présentent de l’intérêt (15) (16). D’autres méthodes de discrimination des effets clastogènes et aneugènes 
peuvent être utilisées, à condition que leur efficacité ait été prouvée.
 
Analyse  
50. Toutes les lames, y compris celles du solvant/véhicule et des témoins, sont 
codées individuellement avant l’analyse au microscope. Il est également 
possible d’analyser des échantillons codés à l’aide d’un système automatisé 
et préalablement validé de cytométrie en flux ou d’analyse d’images.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 716
 
51. Dans les cultures traitées à la cytoB, la fréquence des micronoyaux est 
analysée dans au minimum 2 000 cellules binucléées par concentration 
(au moins 1 000 cellules binucléées par culture; deux cultures par concen ­
tration). Dans le cas de cultures en un seul exemplaire, il conviendra d’examiner au minimum 2 000 cellules binucléées par concentration. Si le 
nombre de cellules binucléées disponibles pour l’examen de chaque concen ­
tration est largement inférieur à 1 000 par culture, ou à 2 000 en cas de culture en un seul exemplaire, et si aucune augmentation significative du nombre de micronoyaux n’est détectée, l’essai devra être renouvelé sur un 
nombre plus important de cellules, ou à des concentrations moins élevées, 
suivant la situation. Il convient également de veiller à ne pas comptabiliser les cellules binucléées ayant une forme irrégulière ou dont les deux noyaux présentent une différence de taille trop importante. De même, les cellules 
binucléées ne doivent pas être confondues avec des cellules multinucléées 
mal étalées. Les cellules possédant plus de deux noyaux principaux ne sont pas analysées, car la fréquence de référence des micronoyaux est susceptible d’être plus élevée dans ce type de cellules (63) (64). La numération des 
cellules mononucléées peut être envisagée s’il s’avère que la substance 
d’essai interfère avec l’action de la cytoB.
 
52. Pour les lignées cellulaires n’ayant pas reçu de cytoB, il convient d’exa ­
miner les micronoyaux d’au moins 2 000 cellules par concentration (1 000 cellules au minimum par culture; deux cultures par concentration). Dans le cas d’une culture en un seul exemplaire par concentration, 2 000 cellules au 
moins sont examinées.
 
53. Lorsque l’essai est réalisé en présence de cytoB, il convient de déterminer 
un CBPI ou un indice de réplication (RI) afin d’évaluer la prolifération 
cellulaire (voir appendice 2), en utilisant 500 cellules au moins par culture. Lorsque les traitements sont effectués en l’absence de cytoB, il est essentiel de faire la preuve que les cellules analysées ont proliféré (voir paragraphes 
24 à 27).
 
Critères d’acceptabilité  
54. Tout laboratoire proposant de recourir à l’essai MNvit décrit dans la 
présente méthode d’essai démontre qu’il est à même de détecter de 
manière fiable et précise des substances et mélanges chimiques dont le pouvoir aneugène ou clastogène est connu, avec et sans activation métabo ­
lique, ainsi que des substances chimiques négatives connues, en employant 
les produits chimiques de référence indiqués à l’appendice 3. Pour attester 
de son aptitude à mettre en œuvre cette méthode d’essai correctement, le laboratoire démontre que les cellules dont les micronoyaux sont dénombrés ont bien effectué une division nucléaire si l’essai est réalisé sans cytoB.
 
55. Il est recommandé d’utiliser comme produits de référence les produits 
chimiques figurant à l’appendice 3. Des produits chimiques de substitution 
ou supplémentaires peuvent être utilisés si leur activité est connue, s’ils 
induisent la formation de micronoyaux via les mêmes mécanismes d’action et si leur pertinence est prouvée pour les substances d’essai dans le cadre de la procédure MNvit. La justification pourra inclure une étude de validation 
couvrant une grande diversité de substances ou axée sur un spectre plus 
étroit, limité à la classe chimique de la substance d’essai ou au mécanisme de lésion étudié.
 
56. Le témoin du solvant/véhicule et les cultures non traitées présentent des 
fréquences reproductibles de micronoyaux faibles et cohérentes (de l’ordre de 5 à 25 micronoyaux/1 000 cellules pour les types de cellules cités au 
paragraphe 11). D’autres types de cellules peuvent présenter des fourchettes 
de réponse différentes, qui devront être déterminées lors de leur validation pour l’essai MNvit. Il conviendra d’utiliser les données issues des témoins négatifs, du solvant, et positifs pour établir des fourchettes de référence. Ces 
données serviront à déterminer si les témoins négatifs/positifs sont appro ­
priés pour réaliser un essai.
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57. S’il est proposé d’apporter de légères modifications au protocole d’essai 
(par exemple l’utilisation de techniques de numération automatisées et non 
manuelles, ou le recours à un nouveau type de cellule), l’efficacité de ces changements est démontrée afin que le protocole modifié soit considéré comme acceptable. Il convient notamment de démontrer que les méca ­
nismes principaux de cassure, de perte ou de gain chromosomique 
peuvent être détectés, et que des résultats positifs et négatifs appropriés peuvent être obtenus pour la classe de la substance concernée, ou pour tout le spectre des substances à tester.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
58. Lorsque la technique du blocage de la cytokinèse est employée, seules les 
fréquences des cellules binucléées présentant des micronoyaux (indépen ­
damment du nombre de micronoyaux par cellule) sont utilisées pour 
évaluer l’induction de micronoyaux. La numération des cellules présentant un ou plusieurs micronoyaux est susceptible d’apporter des informations 
intéressantes, mais est optionnelle.
 
59. Il convient d’effectuer des mesures parallèles de cytotoxicité et/ou de cytos ­
tase pour toutes les cultures traitées et les cultures témoins traitées unique ­
ment avec le solvant/véhicule (58). Il faut également calculer le CBPI ou 
l’indice de réplication (RI) pour toutes les cultures traitées et témoins, afin de mesurer le retard du cycle cellulaire en cas de recours à la méthode de blocage de la cytokinèse. En l’absence de cytoB, il convient de mesurer le 
doublement relatif de la population (RPD), l’augmentation relative du 
nombre de cellules (RICC) ou l’indice de prolifération (PI) (voir appendice 2).
 
60. Les données sont indiquées individuellement pour chaque culture. En outre, 
toutes les données sont résumées sous forme de tableaux.  
61. Lorsque des produits chimiques induisent la formation de micronoyaux lors 
de l’essai MNvit, celle-ci est due soit à une cassure chromosomique, soit à une perte chromosomique, soit aux deux évènements combinés. D’autres 
analyses utilisant des anticorps anti-kinétochores, des sondes centromériques 
in situ ou d’autres méthodes permettent de déterminer si le mécanisme d’induction des micronoyaux est le résultat d’une activité clastogène et/ou aneugène.
 
Évaluation et interprétation des résultats  
62. Il n’est pas requis de vérifier par le biais d’expériences supplémentaires une 
réponse positive ou négative claire. Il est possible qu’un résultat ambigu 
soit clarifié en analysant 1 000 cellules supplémentaires issues de l’en ­
semble des cultures afin de conserver le caractère aveugle de l’essai. Si cette approche ne permet pas d’obtenir des résultats satisfaisants, des expé ­
riences supplémentaires sont réalisées. Dans le cadre des expériences 
supplémentaires ainsi réalisées, on envisagera de modifier les paramètres 
de l’étude, afin d’en élargir ou d’en restreindre les conditions, selon le cas. Les paramètres susceptibles d’être modifiés comprennent l’espacement des niveaux de concentration, le calendrier des traitements et de la récolte des 
cellules et/ou les conditions de l’activation métabolique.
 
63. Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notam ­
ment une augmentation liée à la concentration ou statistiquement significa ­
tive du nombre de cellules présentant des micronoyaux. Il convient en premier lieu de prendre en considération la pertinence biologique des résul ­
tats. Le fait que les valeurs observées soient ou non comprises dans la 
fourchette de référence peut fournir des indices utiles à l’évaluation de la 
signification biologique des résultats. L’évaluation des résultats peut s’ap ­
puyer sur des méthodes statistiques appropriées (65). Toutefois, les résultats des tests statistiques sont évalués en tenant compte de la relation 
dose-réponse. La reproductibilité et les données historiques sont également 
prises en compte.
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64. Bien que la plupart des expériences donnent des résultats clairement positifs 
ou négatifs, il arrive que l’ensemble des résultats d’un essai ne permette pas 
un jugement catégorique sur l’activité de la substance d’essai. Ces résultats équivoques ou discutables peuvent survenir indépendamment du nombre de répétitions de l’essai.
 
65. Des résultats positifs dans un essai MNvit indiquent que la substance 
d’essai induit une cassure ou une perte chromosomique dans des cellules de mammifère en culture. Des résultats négatifs indiquent que, dans les 
conditions de l’essai, la substance d’essai n’induit pas de cassure et/ou de 
gain ou de perte chromosomique dans des cellules de mammifère en culture.
 
Rapport d’essai  
66. Le rapport d’essai contient au minimum les informations suivantes, si elles 
sont pertinentes pour la conduite de l’étude:  
Substance chimique d’essai:  
— données d’identification et numéro CAS (Chemical Abstract Services) et 
numéro CE,  
— état physique et pureté,  
— propriétés physico-chimiques importantes pour l’exécution de l’essai,  
— réactivité de la substance chimique d’essai avec le solvant/véhicule ou le 
milieu de culture cellulaire.  
Solvant/véhicule:  
— justification du choix du solvant ou véhicule,  
— solubilité et stabilité de la substance d’essai dans le solvant ou véhicule.  
Cellules:  
— type et source des cellules utilisées,  
— raisons du choix du type cellulaire utilisé,  
— absence de mycoplasme, le cas échéant,  
— données sur la durée du cycle cellulaire, le temps de doublement ou 
l’indice de prolifération,  
— en cas d’utilisation de lymphocytes, sexe, âge et nombre de donneurs de 
sang, s’il y a lieu,  
— en cas d’utilisation de lymphocytes, préciser si du sang total ou des 
lymphocytes isolés sont exposés,  
— nombre de repiquages, le cas échéant,  
— méthodes d’entretien des cultures cellulaires, s’il y a lieu,  
— nombre modal de chromosomes,  
— durée normale du cycle cellulaire (témoin négatif).  
Conditions de l’essai:  
— identité de l’éventuel agent de blocage de la cytokinèse utilisé (cytoB, 
par exemple), sa concentration et la durée d’exposition des cellules,  
— justification du choix des concentrations et du nombre de cultures, y 
compris données concernant la cytotoxicité et les limites de solubilité, 
s’il y a lieu,  
— composition du milieu et, le cas échéant, concentration de CO  2 , 
— concentration de la substance d’essai,  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 719
 
— concentration (et/ou volume) de véhicule et de substance d’essai ajoutés,  
— température et temps d’incubation,  
— durée du traitement,  
— délai de récolte après application,  
— densité cellulaire au moment de l’ensemencement, le cas échéant,  
— type et composition du système d’activation métabolique, y compris les 
critères d’acceptabilité,  
— témoins positifs et négatifs,  
— méthodes de préparation des lames et techniques de coloration utilisées,  
— critères d’identification des micronoyaux,  
— nombre de cellules analysées,  
— méthodes de mesure de la cytotoxicité,  
— toute information supplémentaire concernant la cytotoxicité,  
— critères pour conclure que l’étude est positive, négative ou équivoque,  
— méthode(s) d’analyse statistique utilisée(s),  
— méthodes, telles que le recours aux anticorps anti-kinétochores, utilisées 
pour déterminer si les micronoyaux possèdent des chromosomes entiers ou fragmentés, le cas échéant.
 
Résultats:  
— mesure de cytotoxicité utilisée, par exemple CBPI ou RI dans le cas de 
la méthode de blocage de la cytokinèse; RICC, RPD ou PI lorsque la méthode de blocage de la cytokinèse n’est pas utilisée; autres observa ­
tions le cas échéant, telles que degré de confluence cellulaire, apoptose, 
nécrose, numération des cellules en métaphase, fréquence des cellules 
binucléées,
 
— signes de précipitation,  
— données sur le pH et l’osmolalité du milieu de traitement, si elles ont été 
déterminées,  
— définition des cellules acceptables pour l’analyse,  
— répartition des cellules mono-, bi- et multinucléées en cas d’utilisation 
d’une méthode de blocage de la cytokinèse,  
— nombre de cellules micronucléées, donné séparément pour chaque 
culture traitée et culture témoin, en précisant si elles proviennent de cellules binucléées ou mononucléées, s’il y a lieu,
 
— relation concentration-réponse, si possible,  
— données (concentrations et solvants) concernant les témoins négatifs 
(solvant ou véhicule) et positifs concomitants,  
— données historiques concernant les témoins négatifs (solvant/véhicule) et 
positifs, y compris ordres de grandeur, moyennes, écarts types et inter ­
valle de confiance (95 % par exemple),  
— analyse statistique; valeurs P le cas échéant.  
Discussion des résultats  
Conclusions  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 720
 
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56. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
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Appendice 1  
Définitions  
Aneugène:  Substance ou processus qui,  via des interactions avec les composants 
de la cellule mitotique ou méiotique lors de la division cellulaire, provoque la 
formation de cellules ou d’organismes aneuploïdes.  
Aneuploïdie:  Tout écart par rapport au nombre diploïde (ou haploïde) normal de 
chromosomes, d’un seul ou de plusieurs chromosomes, mais non d’un ou de plusieurs jeux de chromosomes (polyploïdie).
 
Apoptose:  Mort cellulaire programmée caractérisée par une succession d’étapes 
menant à la désintégration des cellules en particules membranaires qui sont 
ensuite éliminées par phagocytose ou par excrétion.  
Augmentation relative du nombre de cellules (Relative increase in cell count, 
RICC):  Méthode de mesure de la cytotoxicité lorsque la cytoB n’est pas utilisée 
(voir formule à l’appendice 2).  
Cellules en interphase:  Cellules qui ne sont pas en phase de mitose.  
Centromère:  Région de l’ADN d’un chromosome où les deux chromatides sont 
reliées entre elles et sur laquelle les deux kinétochores sont fixés côte à côte.  
Clastogène:  Substance ou processus induisant des aberrations chromosomiques 
structurelles dans des populations cellulaires ou des organismes.  
Cytokinèse:  Processus de division cellulaire survenant immédiatement après la 
mitose pour former deux cellules-filles, contenant chacune un noyau unique.  
Cytostase:  Inhibition de la croissance cellulaire (voir formule à l’appendice 2).  
Cytotoxicité:  Effets dommageables sur la structure ou les fonctions cellulaires, 
entraînant  in fine  la mort cellulaire.  
Doublement relatif de la population (Relative Population Doubling, RPD):  
Méthode de mesure de la cytotoxicité lorsque la cytoB n’est pas utilisée (voir 
formule à l’appendice 2).  
Génotoxique:  Terme générique qualifiant tous les types de lésions de l’ADN ou 
des chromosomes, tels que les cassures, adduits, remaniements, mutations, aber ­
rations chromosomiques et aneuploïdies. Tous les types d’effets génotoxiques 
n’entraînent pas nécessairement de mutations ou de lésions chromosomiques 
stables.  
Indice de prolifération (PI):  Méthode de mesure de la cytotoxicité lorsque la 
cytoB n’est pas utilisée (voir formule à l’appendice 2).  
Indice de prolifération des cellules dont la division cytoplasmique a été bloquée 
(Cytokinesis-Block Proliferation Index, CBPI):  Proportion de cellules issues de la 
deuxième division dans la population traitée par rapport au témoin non traité 
(voir formule à l’appendice 2).  
Indice de réplication (Replication Index, RI):  Rapport entre le nombre de cycles 
de division cellulaire achevés dans une culture traitée et ce même nombre dans le témoin non traité, au cours de la période d’exposition et de récupération (voir 
formule à l’appendice 2).
 
Indice mitotique:  Rapport entre le nombre de cellules en métaphase et le nombre 
total de cellules observées dans une population cellulaire; il donne une indication du degré de prolifération cellulaire de cette population.
 
Kinétochore:  Assemblage de protéines situé au niveau du centromère d’un chro ­
mosome, auquel sont associées les fibres fusoriales lors de la division cellulaire, 
permettant le mouvement ordonné des chromosomes-fils vers les pôles des 
cellules-filles.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 726
 
Micronoyau:  Petit noyau, venant s’ajouter au noyau principal de la cellule et 
séparé de celui-ci, formé lors de la télophase de la mitose ou de la méiose à partir 
de chromosomes entiers ou de fragments de chromosomes retardataires.  
Mitose:  Division du noyau cellulaire, généralement décomposée en prophase, 
prométaphase, métaphase, anaphase et télophase.  
Mutagène:  Se dit d’un agent produisant une modification héréditaire portant sur 
une ou plusieurs séquences de paires de bases d’ADN génique, ou sur la struc ­
ture de chromosomes (aberrations chromosomiques).  
Non-disjonction:  Non-séparation d’une paire de chromatides, qui ne parviennent 
donc pas à migrer correctement lors de la division cellulaire, ce qui entraîne la présence d’un nombre anormal de chromosomes dans les cellules-filles.
 
Polyploïdie:  Aberrations chromosomiques numériques dans des cellules ou des 
organismes, impliquant un ou plusieurs jeux de chromosomes et non un ou 
plusieurs chromosomes isolés (aneuploïdie).  
Prolifération cellulaire:  Augmentation du nombre de cellules résultant de la 
division cellulaire mitotique.  
Substance chimique d’essai (également dénommée substance d’essai):  toute subs ­
tance et tout mélange testés selon la présente méthode d’essai.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 727
 
Appendice 2  
Formules pour l’évaluation de la cytotoxicité  
1. En cas d’utilisation de la cytoB,  l’évaluation de la cytotoxicité se fonde sur 
l’indice de prolifération des cellules dont la division cytoplasmique a été 
bloquée (CBPI) ou sur l’indice de réplication (RI) (16) (58). Le CBPI indique 
le nombre moyen de cycles cellulaires par cellule effectués au cours de la période d’exposition à la cytoB, et peut servir au calcul de la prolifération cellulaire. Le RI indique le nombre relatif de noyaux présents dans les cultures traitées par 
rapport aux cultures témoin, et peut servir au calcul du pourcentage de cytostase:
 
% cytostase = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
Avec:  
T = culture traitée avec la substance chimique d’essai  
C = culture témoin véhicule  
Où: 
CBPI ¼ ððnb de cellules mononucléées Þ þ ð2 Ü nb de cellules binucléées Þ þ ð3 Ü nb de cellules multinucléées ÞÞ 
ðNombre total de cellules Þ 
Ainsi, un CBPI égal à 1 (toutes les cellules sont mononucléées) équivaut à une 
cytostase de 100 %.  
Cytostase = 100 – RI  
RI ¼ ððNb de cellules binucléées Þ þ ð2 Ü nb de cellules multinucléées ÞÞ ö ðNombre total de cellules Þ T 
ððNb de cellules binucléées Þ þ ð2 Ü nb de cellules multinucléées ÞÞ ö ðNombre total de cellules Þ C Ü 100  
T = cultures traitées  
C = cultures témoins  
2. Ainsi, un RI de 53 % signifie que, par rapport au nombre de cellules ayant 
effectué une division cellulaire pour former des cellules binucléées et multinu ­
cléées dans la culture témoin, 53 % seulement de ces cellules ont effectué une 
division dans la culture traitée, soit une cytostase de 47 %.  
3. En l’absence d’utilisation de cytoB,  l’évaluation de la cytotoxicité sur la 
base de l’augmentation relative du nombre de cellules (RICC) ou du doublement 
relatif de la population (RPD) est recommandée (58), ces deux mesures tenant compte de la proportion de cellules ayant effectué une division cellulaire.
 
RICC ¼ ðAugmentation du nombre de cellules dans les cultures traitées  ðfinal – initialÞÞ 
ðAugmentation du nombre de cellules dans les cultures téémoins  ðfinal – initialÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðNombre de doublements de population dans les cultures traitées Þ 
ðNombre de doublements de population dans les cultures téémoins Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 728
 
où: 
Doublement de population = [log (nombre de cellules postapplication ÷ nombre 
de cellules initial)] ÷ log 2  
4. Ainsi, un RICC ou un RDP de 53 % indique une cytotoxicité/cytostase de 
47 %.  
5. En utilisant l’Indice de prolifération (PI), la cytotoxicité peut être évaluée 
via le comptage du nombre de clones composés de 1 cellule (cl1), 2 cellules 
(cl2), 3 à 4 cellules (cl4) et 5 à 8 cellules (cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. Le PI est également un paramètre fiable et utile de cytotoxicité pour les lignées 
cellulaires cultivées in situ en l’absence de cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 729
 
Appendice 3  
Produits chimiques de référence recommandés pour évaluer l’efficacité  ( 1 ) 
Catégorie Produit chimique Numéro CAS N  o CE 
1. Clastogènes actifs sans activation métabolique 
Cytosine arabinoside 147-94-4 205-705-9 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 
2. Clastogènes nécessitant une activation métabolique 
Benzo(a)pyrène 50-32-8 200-028-5 
Cyclophosphamide 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugènes 
Colchicine 64-86-8 200-598-5 Vinblastine 143-67-9 205-606-0 
4. Témoins négatifs 
Di(2-éthylhexyl)phthalate 117-81-7 204-211-0 
Acide nalidixique 389-08-2 206-864-7 Pyrène 129-00-0 204-927-3 Chlorure de sodium 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Ces produits chimiques de référence sont ceux dont l’utilisation est recommandée. La substitution ou l’ajout de produits chim iques à 
cette liste de référence est possible si l’activité des produits en question est connue, s’ils induisent la formation de micron oyaux via 
les mêmes mécanismes d’action, et si leur pertinence est prouvée pour les substances d’essai dans le cadre de la procédure MNvi t. 
Suivant l’objectif visé, la justification pourra aussi inclure une étude de validation couvrant une grande diversité de substan ces ou 
axée sur un spectre plus étroit, limité à la classe chimique de la substance d’essai ou au mécanisme de lésion examiné.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 730
 
B.50.  SENSIBILISATION CUTANÉE: ESSAI DE STIMULATION 
LOCALE DES GANGLIONS LYMPHATIQUES: DA  
INTRODUCTION  
1. Les lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques et les 
méthodes d’essai de l’Union européenne sont régulièrement mises à jour à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences réglementaires 
et de considérations relatives au bien-être des animaux. La première méthode 
d’essai (B.42) visant à déterminer la sensibilisation cutanée chez la souris, c’est-à-dire l’essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques (ELGL, LD 429 de l’OCDE), a été mise à jour (1). Les détails de la validation de 
l’ELGL et une synthèse des travaux qui y sont associés ont été publiés (2) 
(3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). La méthode ELGL s’appuie un marquage radioi ­
sotopique par la thymidine ou l’iode pour mesurer la prolifération des lymphocytes, ce qui limite son application lorsque l’acquisition, l’utilisation 
et l’élimination de produits radioactifs posent problème. L’ELGL: DA (déve ­
loppé par Daicel Chemical Industries, Ltd.) est une variante non radioactive de l’ELGL, qui quantifie l’adénosine triphosphate (ATP) par biolumines ­
cence pour estimer la prolifération des lymphocytes. La méthode ELGL: 
DA a été validée, et évaluée et recommandée par un comité international 
d’examen, qui a reconnu son utilité pour identifier, dans certaines limites, les substances d’essai ayant ou non un effet sensibilisant sur la peau (10) (11) (12) (13). La présente méthode d’essai permet d’évaluer le pouvoir de sensi ­
bilisation cutanée de substances chimiques (substances et mélanges) chez les 
animaux. Le chapitre B.6 de la présente annexe et la LD 406 de l’OCDE font appel à des essais sur cobayes, notamment l’essai de maximisation sur le cobaye et l’essai de Buehler (14). L’ELGL (chapitre B.42 de la présente 
annexe, LD 429 de l’OCDE) et ses deux variantes non radioactives, ELGL: 
DA (chapitre B.50 de la présente annexe, LD 442 A de l’OCDE) et ELGL: BrdU-ELISA (chapitre B.51 de la présente annexe, LD 442 B de l’OCDE), sont toutes plus intéressantes que les essais sur cobayes décrits dans le 
chapitre B.6 et la LD 406 de l’OCDE (14) en termes de réduction et de 
raffinement de l’utilisation des animaux.
 
2. À l’instar de l’ELGL, la méthode ELGL: DA s’intéresse à la phase d’induc ­
tion de la sensibilisation cutanée et fournit des données quantitatives permet ­
tant d’évaluer la relation dose-effet. Par ailleurs, en détectant les sensibili ­
sants cutanés sans recourir au radiomarquage de l’ADN, cette technique évite les risques professionnels liés à l’exposition aux rayonnements et les problèmes de gestion des déchets. En revanche, elle pourrait se traduire 
par une hausse du nombre de souris utilisées pour détecter les sensibilisants 
cutanés, entraînant néanmoins la diminution du nombre de cobayes mis à contribution à ces mêmes fins (chapitre B.6, LD 406 de l’OCDE) (14).
 
DÉFINITIONS  
3. Les définitions utilisées sont données à l’appendice 1.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES  
4. La méthode ELGL: DA est une variante de l’ELGL visant à identifier les 
substances d’essai susceptibles d’induire une sensibilisation cutanée, dans des limites spécifiques. Cela n’implique pas que l’ELGL: DA doive systéma ­
tiquement remplacer l’ELGL ou les essais sur cobayes (chapitre B.6, LD 406 
de l’OCDE) (14), mais plutôt qu’il s’agit d’un outil d’une qualité égale 
pouvant se substituer à ces méthodes, et dont les résultats positifs et négatifs n’ont généralement plus besoin de confirmation supplémentaire (10) (11). 
Avant de procéder à l’essai, le laboratoire rassemble toutes les informations 
disponibles sur la substance d’essai, à savoir son identité et sa structure
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chimiques, ses propriétés physico-chimiques, les résultats de tous les autres 
essais de toxicité in vitro et in vivo, et les données toxicologiques sur des 
analogues de structure. Ces informations servent à déterminer s’il est perti ­
nent d’appliquer la méthode ELGL: DA avec la substance d’essai considérée, étant donné l’incompatibilité de certains types de substances chimiques avec 
l’ELGL: DA (voir paragraphe 5), et aider à choisir les doses appropriées.
 
5. La méthode ELGL: DA, mise en œuvre in vivo, ne met donc pas un terme à 
l’utilisation d’animaux pour évaluer la sensibilisation allergique par contact. 
Néanmoins, comparée aux essais avec cobayes (B.6, LD 406 de l’OCDE), 
elle est susceptible de réduire le nombre d’animaux utilisés à cette même fin (14). En outre, l’ELGL: DA propose un raffinement important (réduction du stress et de la douleur) de l’utilisation des animaux pour évaluer la sensibi ­
lisation allergique par contact, dans la mesure où, à la différence du 
chapitre B.6 et de la LD 406 de l’OCDE (51), l’ELGL: DA n’est pas fondé sur le déclenchement de réactions d’hypersensibilité cutanée par une exposition de déclenchement. Malgré les avantages de l’ELGL: DA par 
rapport au chapitre B.6 et à la LD 406 de l’OCDE (14), certaines limites 
peuvent imposer de privilégier le chapitre B.6 ou la LD 406 de l’OCDE [par exemple, essai de certains métaux, résultats faussement positifs avec 
certaines substances irritantes pour la peau, en particulier des tensioactifs 
(6) (1 et chapitre B.42 de la présente annexe), solubilité de la substance d’essai.] De surcroît, certaines substances chimiques ou familles de subs ­
tances d’essai comprenant des groupements fonctionnels dont il est démontré 
qu’ils peuvent être des facteurs de confusion (16) peuvent aussi imposer le 
recours aux essais avec cobayes (chapitre B.6, LD 406 de l’OCDE) (14). Il est recommandé de considérer les limites identifiées pour l’ELGL (1 et chapitre B.42 de la présente annexe) comme étant également valables pour 
l’ELGL: DA (10). Il se peut en outre que la méthode ELGL: DA ne 
convienne pas aux substances qui modifient les niveaux d’ATP (c’est-à- dire qui agissent comme inhibiteurs de l’ATP) ou perturbent la quantification précise de l’ATP intracellulaire (par exemple, présence d’enzymes dégradant 
l’ATP, présence d’ATP extracellulaire dans le ganglion lymphatique). Dans 
ces limites, l’ELGL: DA est applicable à toute substance d’essai qui ne présente pas de propriétés susceptibles d’affecter la précision de l’essai. De plus, il convient de prendre en compte l’éventualité de résultats positifs 
limites pour lesquels l’indice de stimulation (IS) est situé entre 1,8 et 2,5 
(voir paragraphes 31-32). En effet, d’après la base de données de validation portant sur 44 substances présentant un IS ≥ 1,8 (voir paragraphe 6), 
l’ELGL: DA a correctement identifié l’ensemble des 32 sensibilisants 
(d’après l’ELGL), mais a donné des résultats positifs pour trois des 12 
substances non sensibilisantes présentant des indices de stimulation compris entre 1,8 et 2,5 (c’est-à-dire des résultats positifs limites) (10). Cependant, comme le même ensemble de données a été utilisé pour établir 
les valeurs IS et pour calculer les propriétés prédictives de l’essai, les résul ­
tats indiqués pourraient surestimer les propriétés prédictives réelles.
 
PRINCIPE DE LA MÉTHODE D’ESSAI  
6. L’ELGL: DA repose sur le principe que les sensibilisants induisent une 
prolifération de lymphocytes dans les ganglions lymphatiques drainant le site de l’application de la substance d’essai. Cette prolifération est propor ­
tionnelle à la dose appliquée et à la puissance de l’allergène et permet 
d’obtenir facilement une mesure quantitative de la sensibilisation. Pour 
mesurer la prolifération, on compare la prolifération moyenne de chaque groupe d’essai à la prolifération moyenne du groupe témoin traité avec le véhicule (TV). On calcule le quotient de la prolifération moyenne dans 
chaque groupe traité sur celle du TV, pour obtenir l’indice de 
stimulation (IS); si cette valeur est supérieure ou égale à 1,8, on peut
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ensuite poursuivre l’évaluation du pouvoir de sensibilisation cutanée de la 
substance d’essai. Les procédures décrites ici s’appuient sur la quantification 
de l’ATP par bioluminescence (facteur connu pour être en corrélation avec le nombre de cellules vivantes) (17) pour indiquer l’augmentation du nombre de cellules en prolifération dans les ganglions lymphatiques auriculaires de 
drainage (18) (19). Cette technique par bioluminescence utilise l’enzyme 
luciférase pour catalyser la formation de lumière à partir d’ATP et de luci ­
férine selon la réaction suivante:
 
ATP + Luciférine  + O 2
 Oxyluciférine  + AMP  + PP  i + CO  2 + Lumière  
L’intensité de la lumière émise suit une pente linéaire en fonction de la 
concentration en ATP, et se mesure à l’aide d’un luminomètre. L’essai luciférine-luciférase constitue une méthode précise pour quantifier l’ATP et 
trouve de nombreuses applications (20).
 
DESCRIPTION DE L’ESSAI  
Choix des espèces animales  
7. L’espèce retenue pour cet essai est la souris. Les études de validation de 
l’ELGL: DA ont été menées exclusivement avec la souche CBA/J, qui sera donc privilégiée pour cet essai (12) (13). On utilise de jeunes femelles adultes, nullipares et non gravides. Au début de l’étude, les animaux sont 
âgés de 8 à 12 semaines et affichent une variation de poids minime entre eux 
n’excédant pas 20 pour cent du poids moyen. Il est aussi possible d’utiliser d’autres souches ainsi que des mâles s’il existe suffisamment d’informations 
démontrant l’absence de différences significatives entre les souches et/ou les 
sexes en ce qui concerne la réaction à l’ELGL: DA.
 
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
8. Les souris sont hébergées par groupes (21), sauf si une raison scientifique 
pertinente exige un encagement individuel. La température de l’animalerie d’expérience est maintenue à 22 °C ± 3 °C. L’humidité relative atteint au moins 30 % et de préférence ne dépasse pas 70 % en dehors des moments 
où le local est nettoyé, l’idéal étant qu’elle soit maintenue aux alentours de 
50-60 %. L’éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Les animaux peuvent être alimentés par un régime clas ­
sique de laboratoire avec eau potable à satiété.
 
Préparation des animaux  
9. Les animaux sont sélectionnés au hasard, marqués pour permettre leur iden ­
tification individuelle (mais jamais sur l’oreille) et gardés dans leurs cages 
pendant au moins cinq jours avant le commencement du traitement afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Avant de commencer le traitement, on examine tous les animaux pour vérifier qu’ils ne présentent 
pas de lésions cutanées observables.
 
Préparation des solutions d’essai  
10. Les substances d’essai solides sont dissoutes ou dispersées dans des solvants/ 
véhicules puis diluées, s’il y a lieu, avant d’être appliquées sur l’oreille des souris. Les substances d’essai liquides peuvent être appliquées pures ou préalablement diluées. Les substances d’essai insolubles, comme celles que 
l’on rencontre généralement dans les dispositifs médicaux, sont soumises à 
une extraction forcée à l’aide d’un solvant approprié pour faire ressortir tous les composants extractibles qu’il est possible d’évaluer, avant l’application sur l’oreille des souris. Les substances d’essai sont préparées chaque jour à 
moins que les données concernant la stabilité ne démontrent qu’elles peuvent 
être stockées.
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Contrôle de la fiabilité  
11. Les témoins positifs (TP) servent à démontrer le bon fonctionnement de 
l’essai en répondant de manière adéquate et reproductible aux sensibilisants 
pour lesquels l’ordre de grandeur des effets est bien connu. Il est recom ­
mandé d’inclure un TP concurrent puisqu’il démontre la capacité du labora ­
toire à mener chaque essai correctement, et permet d’évaluer la comparabilité 
et la reproductibilité intra- et interlaboratoires. Par ailleurs, dans la mesure où 
certaines autorités réglementaires exigent un TP dans chaque essai, les expé ­
rimentateurs sont encouragés à consulter les autorités concernées avant de mener l’ELGL: DA. En conséquence, le recours systématique à un TP 
concurrent est recommandé pour éviter d’avoir à réaliser des essais supplé ­
mentaires sur animaux, ce qui est parfois exigé lorsqu’un laboratoire se réfère à un TP testé périodiquement (voir paragraphe 12). Le TP doit réagir positivement à l’ELGL: DA pour un niveau d’exposition supposé 
accroître l’indice de stimulation d’au moins 1,8 point par rapport au 
groupe témoin négatif (TN). La dose de TP sera choisie de manière à ne pas entraîner d’irritation cutanée excessive ou de toxicité systémique, l’in ­
duction devant être reproductible sans être exagérée (un IS > 10 sera consi ­
déré comme excessif, par exemple). Les TP utilisés en priorité sont l’hexyl 
cinnamaldéhyde à 25 % (N
 o CAS [Chemical Abstracts Service] 101-86-0) et 
l’eugénol à 25 % (N  o CAS 97-53-0) dans un mélange acétone/huile d’olive 
(4:1, v/v). Dans certains cas, d’autres substances d’essai répondant aux 
critères susmentionnés pourront être employées comme témoins positifs, à 
condition que ce choix soit correctement justifié.  
12. Si l’inclusion d’un groupe TP concurrent demeure recommandée, des essais 
périodiques (c’est-à-dire à intervalles ≤ 6 mois) du TP peuvent dans certains 
cas convenir pour les laboratoires menant régulièrement (c’est-à-dire au moins une fois par mois) des ELGL: DA et disposant d’une base de 
données de référence montrant que le laboratoire est apte à obtenir des 
résultats précis et reproductibles avec les TP. La capacité d’un laboratoire à mener l’ELGL: DA est efficacement démontrée quand le TP déclenche des résultats positifs cohérents à l’issue d’un minimum de 10 essais indépendants 
étalés sur une période raisonnable (c’est-à-dire inférieure à un an).
 
13. Il convient d’inclure un groupe TP concurrent à chaque fois que le protocole 
de l’ELGL: DA est modifié (par exemple si des modifications interviennent 
au niveau du personnel qualifié, des composés et/ou réactifs utilisés pour la méthode d’essai, de l’équipement mis en œuvre, ou de la source d’animaux d’expérience), et ces changements sont documentés dans les rapports de 
laboratoire. Il faudra tenir compte de l’impact de ces changements sur la 
validité des données de la base historique pour décider de l’opportunité d’établir une nouvelle base de données afin d’évaluer la cohérence des résultats relatifs au TP.
 
14. Les investigateurs gardent à l’esprit que tester le TP périodiquement plutôt 
que systématiquement comme concurrent pèse sur la précision et l’accepta ­
bilité des résultats négatifs obtenus à l’issue d’un essai sans TP concurrent 
réalisé dans l’intervalle entre chaque essai périodique du TP. Par exemple, si un essai périodique du TP donne un faux négatif, l’ensemble des résultats négatifs obtenus depuis le dernier essai de TP valable pourront être remis en 
question. Il faut donc soigneusement considérer les implications de telles 
retombées avant de décider si les TP seront des concurrents systématiques ou s’ils feront l’objet d’essais périodiques. Par ailleurs, le nombre d’animaux du groupe TP concurrent sera réduit si cela se justifie du point de vue 
scientifique et si le laboratoire démontre, en s’appuyant sur ses propres 
données historiques, que l’on peut utiliser moins de souris (22).
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15. Quoique le témoin positif soit testé dans un véhicule produisant un effet 
constant (par exemple acétone: huile d’olive; 4:1, v/v), certaines situations 
réglementaires peuvent aussi nécessiter l’utilisation d’un véhicule moins courant (mélange cliniquement ou chimiquement pertinent) (23). Si le TP concurrent est testé avec un véhicule différent de celui de la substance 
d’essai, il convient de mettre en place un TV indépendant pour le TP 
concurrent.
 
16. Lorsqu’il s’agit d’évaluer des substances appartenant à une classe chimique 
particulière, ou donnant des résultats situés dans une certaine fourchette, des 
substances étalons peuvent s’avérer utiles pour montrer que la méthode 
d’essai fonctionne correctement et permet de détecter le pouvoir de sensibi ­
lisation cutanée de ces types de substance. Les substances étalons présentent les propriétés suivantes:
 
— similitude structurale et fonctionnelle avec la catégorie des substances à 
tester,  
— caractéristiques physiques et chimiques connues,  
— données obtenues avec l’ELGL: DA,  
— données obtenues avec d’autres modèles animaux et/ou l’être humain.  
MODE OPÉRATOIRE  
Nombre d’animaux et doses  
17. On utilise au moins quatre animaux par groupe de dose, et un minimum de 
trois concentrations de la substance d’essai, ainsi qu’un groupe TN concur ­
rent ne recevant que le véhicule de cette substance d’essai et un groupe TP 
(concurrent ou récent selon les pratiques du laboratoire, voir paragraphes 11- 15). On peut envisager de tester différentes doses de TP, en particulier quand celui-ci ne fait l’objet que d’essais périodiques. Mis à part l’absence de 
traitement par la substance d’essai, les animaux des groupes témoins sont 
manipulés et traités de la même manière que les animaux des groupes d’es ­
sai.
 
18. La sélection des doses et du véhicule suit les recommandations données dans 
les références (2) et (24). Les doses successives sont normalement choisies 
dans une série de concentrations appropriée telle que 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0,5 %, etc. Le choix de la série utilisée est scien ­
tifiquement justifié. Le cas échéant, toutes les informations existantes d’ordre 
toxicologique (par exemple sur la toxicité aiguë et l’irritation cutanée), struc ­
tural et physico-chimique sur la substance d’essai en question (et/ou ses analogues de structure) sont prises en compte pour choisir les trois concen ­
trations successives de manière que la plus élevée d’entre elles offre une 
exposition maximale tout en évitant la toxicité systémique et/ou une irritation 
cutanée locale excessive (24) (25). En l’absence de telles informations, un essai préliminaire peut s’avérer nécessaire (voir paragraphes 21-24).
 
19. Il convient que le véhicule ne perturbe pas et n’introduise pas un biais dans 
les résultats du test. Il est choisi de manière à optimiser la solubilité pour 
obtenir la concentration la plus élevée possible dans la préparation d’une solution/suspension adaptée à l’application de la substance d’essai. Les véhi ­
cules recommandés sont le mélange acétone/huile d’olive (4:1 v/v), le N,N- 
diméthylformamide, la méthyléthylcétone, le propylène glycol et le diméthyl ­
sulfoxyde (6) mais d’autres véhicules pourront également être utilisés à condition que ce choix soit suffisamment étayé sur le plan scientifique. Certaines situations réclament un témoin supplémentaire, à savoir un 
solvant qui se justifie sur le plan clinique ou le mélange dans lequel la 
substance d’essai est commercialisée. L’expérimentateur veille tout particu ­
lièrement à ce que les substances hydrophiles soient incorporées à un véhi ­
cule qui mouille la peau et ne ruisselle pas immédiatement, ce qui peut 
nécessiter l’ajout de solubilisants appropriés (par exemple Pluronic® L92 à 
1 %). Il convient donc d’éviter les véhicules totalement aqueux.
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20. Le traitement des ganglions lymphatiques de chaque souris permet d’évaluer 
la variabilité entre individus et de comparer statistiquement les réponses 
induites par la substance d’essai et par le véhicule témoin (voir paragraphe 33). En outre, il n’est envisageable de réduire le nombre d’animaux du groupe TP qu’en se fondant sur des données individuelles (22). Du reste, 
certaines autorités réglementaires exigent la collecte de données pour chaque 
animal. Relever régulièrement les données propres à chaque individu contribue au bien-être des animaux en évitant les essais dupliqués qui seraient nécessaires si les résultats obtenus d’une autre manière (par 
exemple avec des données par groupe d’animaux) devaient être soumis à 
des autorités réglementaires ayant d’autres exigences (en particulier la four ­
niture de données individuelles).
 
Essai préliminaire  
21. En l’absence d’informations permettant d’estimer la concentration d’essai 
maximale (voir paragraphe 18), il convient d’effectuer un essai préliminaire 
afin de déterminer le niveau des doses adaptées à l’ELGL: DA. Cet essai 
préliminaire aide à quantifier la dose maximale à mettre en œuvre dans l’ELGL: DA lorsqu’on ne dispose pas d’informations sur la concentration induisant une toxicité systémique (voir paragraphe 24) et/ou une irritation 
cutanée locale excessive (voir paragraphe 23). Cette concentration maximum 
de la substance d’essai est de 100 % pour les liquides, ou la plus élevée possible pour les solides et suspensions.
 
22. Les conditions de l’essai préliminaire sont les mêmes que celles de l’ELGL: 
DA, à ceci près qu’il n’y a pas d’évaluation de la prolifération dans les 
ganglions lymphatiques et que l’on peut inclure moins d’animaux par 
groupe de dose. En effet, on suggère d’utiliser seulement un à deux individus par groupe de dose. Il convient d’examiner toutes les souris quotidiennement afin de déceler d’éventuels signes cliniques de toxicité systémique ou d’ir ­
ritation locale sur le site d’application. Les poids corporels sont consignés 
préalablement à l’essai et juste avant la fin de l’essai (huitième jour). On examine les deux oreilles de chaque souris pour détecter la présence d’un éventuel érythème, le résultat étant noté conformément à l’échelle figurant 
dans le tableau 1 (25). L’épaisseur de l’oreille est mesurée à l’aide d’une 
jauge d’épaisseur (par exemple micromètre numérique ou jauge d’épaisseur Peacock Dial) le premier jour (avant toute application), le troisième jour (environ 48 heures après la première dose), le septième jour (24 heures 
avant la fin) et le huitième jour. De plus, au huitième jour cette épaisseur 
peut être déterminée à partir du poids d’un échantillon d’oreille, prélevé après l’euthanasie des animaux. Les irritations locales excessives se tradui ­
sent par une cotation de l’érythème ≥ 3 et/ou un épaississement de l’oreille 
d’au moins 25 %, quel que soit le jour de la mesure (26) (27). La dose maximale choisie pour l’étude ELGL: DA principale sera la dose immédia ­
tement inférieure dans la série de concentrations utilisée pour l’essai préli ­
minaire (voir paragraphe 18) qui n’induit pas une toxicité systémique et/ou 
une irritation cutanée locale excessive.
 
Tableau 1  
Cotation de l’érythème  
Observation Résultat  
Pas d’érythème 0 
Érythème très léger (à peine perceptible) 1 Érythème bien défini 2
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Observation Résultat  
Érythème modéré à grave 3 
Érythème grave (rouge violacé) à formation d’escarre empêchant la cota ­
tion de l’érythème 4 
23. Outre un épaississement de l’oreille de 25 % (26) (27), une augmentation 
statistiquement significative de l’épaisseur de l’oreille chez les souris traitées par rapport aux individus témoins a également été utilisée pour identifier des produits irritants dans l’ELGL (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Cependant, 
les augmentations statistiquement significatives inférieures à 25 % ne sont 
pas systématiquement associées à une irritation excessive (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Les observations cliniques suivantes peuvent indiquer une toxicité 
systémique (35) dans le cadre d’une évaluation intégrée, et ainsi permettre 
d’estimer la dose maximale à utiliser dans l’ELGL: DA principal: modifica ­
tions des fonctions nerveuses (par exemple, pilo-érection, ataxie, tremble ­
ments et convulsions); changements du comportement (par exemple, agres ­
sivité, activités de toilettage modifiées, changement marqué d’intensité de 
l’activité); troubles respiratoires (en termes de fréquence et d’intensité de 
la respiration, sous forme de dyspnée, halètements ou râles), et modifications de la consommation d’aliments et d’eau. En outre, l’évaluation prendra en compte les éléments suivants: signes de léthargie et/ou absence de récepti ­
vité, et tout signe clinique autre qu’une douleur et un stress légers ou 
passagers; baisse du poids corporel > 5 % entre le premier et le huitième jour; mortalité. Les animaux moribonds ou montrant des signes de douleur et de stress aigus sont euthanasiés (36).
 
Programme expérimental de l’étude principale  
25. Le programme expérimental se déroule comme suit:  
— Premier jour:  Mesurer et consigner le poids de chaque animal ainsi que 
toute observation clinique. Appliquer une solution aqueuse de sodium lauryl sulfate (SLS) à 1 % au dos de chaque oreille à l’aide d’un pinceau trempé dans la solution de SLS de manière à couvrir l’ensemble de la 
surface externe en quatre à cinq applications. Une heure après le traite ­
ment au SLS, appliquer 25 μL d’une dilution adaptée de la substance 
d’essai, du véhicule seul ou du TP (concurrent ou récent selon les pratiques du laboratoire, voir paragraphes 11-15), au dos de chaque 
oreille.
 
— Deuxième, troisième et septième jours:  Répéter le prétraitement avec la 
solution aqueuse de SLS à 1 % puis l’application de la substance d’essai en suivant la même procédure que le premier jour.
 
— Quatrième, cinquième et sixième jours:  Aucun traitement.  
— Huitième jour:  Noter le poids de chaque animal ainsi que toute obser ­
vation clinique. Environ 24 à 30 heures après le début des applications 
du septième jour, euthanasier les animaux. Exciser les ganglions lympha ­
tiques auriculaires de drainage de chaque oreille de souris et les placer séparément dans une solution saline tamponnée au phosphate [phosphate buffered saline] (PBS). Les détails et diagrammes relatifs à l’identifica ­
tion et à la dissection des ganglions lymphatiques sont présentés dans la 
référence (22). Pour approfondir le suivi de la réponse cutanée locale dans l’essai principal, des paramètres supplémentaires comme la cotation de l’érythème auriculaire ou les mesures de l’épaisseur de l’oreille (obte ­
nues à l’aide d’une jauge d’épaisseur ou par pesée d’échantillons 
d’oreilles après nécropsie) peuvent être inclus dans le protocole d’étude.
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Préparation des suspensions cellulaires  
26. Pour chaque souris, on prépare une suspension de cellules isolées provenant 
des ganglions lymphatiques (CGL) excisés bilatéralement en plaçant ces 
ganglions entre deux lames de verres sur lesquelles on exerce une légère pression pour écraser les échantillons. Après avoir vérifié que le tissu est bien étalé, séparer les deux lames. Pour disperser le tissu présent sur ces 
lames dans le PBS, incliner chacune d’elle au-dessus de la boîte de Pétri, 
puis racler le tissu avec un grattoir à cellules tout en rinçant avec la solution. Les ganglions lymphatiques des animaux TN étant petits, il convient de les traiter avec soin pour éviter tout artéfact sur les valeurs IS. Le volume total 
de PBS utilisé pour rincer les deux lames est de 1 mL. Homogénéiser 
doucement la suspension de CGL dans la boîte de Petri à l’aide du grattoir à cellules. Prélever alors une aliquote de 20 μL de suspension homogénéisée 
à l’aide d’une micropipette en prenant soin de ne pas capter la membrane, 
visible à l’œil nu, puis mélanger cette aliquote avec 1,98 mL de PBS pour 
obtenir un échantillon de 2 mL. Un second échantillon de 2 mL est ensuite préparé selon la même procédure de façon à en obtenir deux par animal.
 
Détermination de la prolifération cellulaire (quantification de l’ATP des 
lymphocytes)  
27. Les augmentations de la teneur en ATP des ganglions lymphatiques sont 
déterminées par la méthode luciférine/luciférase avec un kit de mesure de 
l’ATP qui calcule la bioluminescence, exprimée en unités relatives de lumi ­
nescence [relative luminescence unit] (RLU). Le temps écoulé entre la mise à 
mort de l’animal et la quantification de l’ATP pour chaque individu demeure 
uniforme, et ne dépasse pas environ 30 minutes, car la teneur en ATP est supposée diminuer progressivement à partir de l’euthanasie (12). Ainsi, l’en ­
semble des procédures entre l’excision des ganglions lymphatiques auricu ­
laires et les mesures d’ATP seront réalisées en 20 minutes d’après un 
programme préétabli valable pour tous les animaux. Il convient de déter ­
miner la luminescence due à l’ATP dans chacun des échantillons de 2 mL, soit deux mesures d’ATP par souris. La moyenne de ces résultats est alors 
établie et utilisée dans les calculs suivants (voir paragraphe 30).
 
OBSERVATIONS  
Observations cliniques  
28. Au moins une fois par jour, l’expérimentateur examine attentivement chaque 
souris afin de déceler d’éventuels signes cliniques, se traduisant par une irritation locale sur le site d’application ou une toxicité systémique. Toutes 
les observations sont systématiquement consignées pour chaque souris. Les 
programmes de suivi intègrent les critères permettant d’identifier rapidement les souris montrant des signes de toxicité systémique, d’irritation cutanée locale excessive ou de corrosion de la peau, afin qu’elles puissent être 
euthanasiées (36).
 
Poids corporels  
29. Comme indiqué au paragraphe 25, le poids corporel de chaque animal est 
mesuré au début de l’essai et au moment programmé pour l’euthanasie.  
CALCUL DES RÉSULTATS  
30. Les résultats obtenus pour chaque groupe de traitement sont exprimés par un 
indice de stimulation (IS) moyen. Cet IS s’obtient en divisant la moyenne des RLU/souris dans chaque groupe ayant reçu la substance d’essai ou le TP 
par la moyenne des RLU/souris dans le groupe témoin traité avec le 
solvant/TV. L’IS moyen pour les TV est alors égal à 1.
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31. Un résultat est considéré comme positif lorsque IS ≥ 1,8 (10). Toutefois, 
l’intensité de la relation dose-effet, la signification statistique et la cohérence 
des réponses obtenues avec le solvant/véhicule et le TP constituent autant de facteurs pour décider si un résultat limite (c’est-à-dire un IS situé entre 1,8 et 2,5) est jugé positif (2) (3) (37).
 
32. En cas de réponse positive limite (IS entre 1,8 et 2,5), les expérimentateurs 
sont invités à examiner des paramètres supplémentaires comme la relation 
dose-effet, les manifestations de toxicité systémique ou d’irritation excessive, et, le cas échéant, la signification statistique pour définitivement conclure à un résultat positif (10). Diverses propriétés de la substance d’essai sont aussi 
prises en compte, parmi lesquelles une éventuelle analogie structurelle avec 
des sensibilisants cutanés connus, le déclenchement d’une irritation cutanée excessive chez la souris, et la nature de la relation dose-effet observée. Ces considérations, ainsi que d’autres, sont examinées en détail dans un autre 
document (4).
 
33. Le relevé des données pour chaque souris permet de déterminer statistique ­
ment l’existence et l’intensité d’une relation dose-effet dans les résultats. Tout traitement statistique peut comprendre une évaluation de la relation dose-effet ainsi que des comparaisons des groupes d’essai convenablement 
adaptées (par exemple, comparaisons par paires des groupes de dose avec le 
groupe solvant/véhicule témoin concurrent). Les analyses statistiques peuvent notamment inclure une régression linéaire ou le test de William pour étudier la fonction dose-effet, ainsi que le test de Dunnett pour les comparaisons par 
paires. Pour choisir une méthode appropriée d’analyse statistique, il faut être 
conscient du risque d’inégalité des variances et d’autres problèmes connexes qui pourraient nécessiter une transformation des données ou une analyse statistique non paramétrique. Quoi qu’il en soit, on peut être amené à 
calculer les indices de stimulation et effectuer les traitements statistiques 
avec ou sans certains points de données (parfois appelés «valeurs aber ­
rantes»).
 
RÉSULTATS ET RAPPORTS  
Résultats  
34. Les résultats sont récapitulés sous forme de tableau présentant les RLU pour 
chaque animal, la moyenne des RLU/animal pour chaque groupe, la marge 
d’erreur associée (par exemple, écart type, erreur type de la moyenne) et l’indice de stimulation moyen pour chaque groupe de dose par rapport au groupe solvant/véhicule témoin concurrent.
 
Rapport d’essai  
35. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:  
Substance et mélanges chimique d’essai et substances et mélanges chimiques 
témoins:  
— données d’identification (par exemple numéro CAS et numéro CE, le cas 
échéant; source; pureté; impuretés connues; numéro de lot),  
— état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple volatilité, 
stabilité, solubilité),  
— s’il s’agit d’un mélange: composition et pourcentages relatifs des consti ­
tuants.  
Solvant/véhicule:  
— données d’identification (pureté; concentration, s’il y a lieu; volume 
utilisé),  
— justification du choix du véhicule.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 739
 
Animaux d’essai:  
— source des souris CBA,  
— état microbiologique des animaux, s’il est connu,  
— nombre et âge des animaux,  
— source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.  
Conditions d’essai:  
— source, numéro de lot, données fournies par le fabricant sur l’assurance 
qualité/le contrôle qualité du kit ATP,  
— détails concernant la préparation et l’application de la substance d’essai,  
— justification du choix des doses (y compris résultats de l’essai prélimi ­
naire, le cas échéant),  
— concentrations utilisées pour le véhicule et la substance d’essai, et quan ­
tité totale de substance d’essai appliquée,  
— détails concernant la nourriture et la qualité de l’eau (y compris type et 
source de nourriture et provenance de l’eau),  
— détails concernant le programme de traitement et d’échantillonnage,  
— méthodes de détermination de la toxicité,  
— critères de décision concernant les études positives ou négatives,  
— détails concernant tout écart par rapport au protocole et explication de la 
manière dont l’écart modifie la conception de l’essai et ses résultats.  
Vérification de la fiabilité:  
— résumé des résultats du plus récent test de fiabilité, notamment informa ­
tions sur la substance d’essai, sa concentration et le véhicule utilisé,  
— résultats des témoins spécifiques au laboratoire pour le TP concurrent 
et/ou historique ainsi que pour le TN concurrent (solvant/véhicule),  
— en l’absence d’un TP concurrent, date et rapport de laboratoire du dernier 
essai périodique du TP, et rapport détaillant les résultats historiques du 
TP spécifiques au laboratoire de manière à justifier pourquoi aucun TP 
concurrent n’a été mis en œuvre.  
Résultat:  
— poids corporel de chaque souris au lancement du traitement et au moment 
programmé pour l’euthanasie; moyenne et marge d’erreur associée (par exemple, écart type, erreur type de la moyenne) pour chaque groupe de dose,
 
— moment du déclenchement des effets et signes de toxicité, y compris 
l’irritation cutanée au site d’administration, pour chaque animal,  
— heure de la mise à mort de l’animal et heure de la mesure d’ATP pour 
chaque animal,  
— tableau des RLU et IS par souris pour chaque groupe de dose,  
— moyenne et marge d’erreur associée (par exemple, écart type, erreur type 
de la moyenne) des RLU/souris pour chaque groupe de dose, et résultats 
de l’analyse des valeurs aberrantes au sein de chacun d’eux,  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 740
 
— indices de stimulation obtenus, et détermination appropriée de la varia ­
bilité prenant en compte les variations entre animaux à la fois dans les 
groupes ayant reçu la substance d’essai et dans les groupes témoins,  
— relation dose-effet,  
— analyses statistiques, s’il y a lieu.  
Discussion des résultats:  
— bref commentaire sur les résultats, analyse de la relation dose-effet et 
analyses statistiques, s’il y a lieu, et conclusion quant au fait de savoir si 
la substance d’essai doit être considérée comme un sensibilisant cutané.  
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Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Assurance qualité:  procédé de gestion dans lequel le respect des normes d’essai, 
des obligations du laboratoire et des procédures d’enregistrement des données, 
ainsi que la précision du transfert des données, sont évalués par des personnes 
indépendantes de celles qui réalisent les essais.  
Faux négatif:  substance identifiée à tort comme négative ou inactive à l’issue de 
l’essai, alors qu’elle est en fait positive ou active.  
Faux positif:  substance identifiée à tort comme positive ou active à l’issue de 
l’essai, alors qu’elle est en fait négative ou inactive.  
Fiabilité:  mesure dans laquelle la mise en œuvre d’une méthode d’essai peut être 
reproduite au fil du temps par un même laboratoire ou par plusieurs laboratoires en utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité intralaboratoire et interlaboratoires (38).
 
Indice de stimulation (IS):  paramètre d’évaluation du pouvoir de sensibilisation 
cutanée d’une substance d’essai, calculé comme le quotient de la prolifération mesurée dans les groupes traités sur celle du groupe témoin concurrent recevant le véhicule.
 
Précision:  degré de conformité entre les résultats de la méthode d’essai et les 
valeurs de référence acceptées. Elle constitue une mesure de performance de la 
méthode d’essai et l’un des aspects de sa pertinence. Ce terme est souvent utilisé indifféremment à la place de «concordance» pour qualifier la proportion de résultats corrects d’une méthode d’essai (38).
 
Reproductibilité interlaboratoires:  mesure du degré auquel différents laboratoires 
qualifiés qui emploient le même protocole et testent les mêmes substances d’essai 
peuvent produire des résultats similaires en termes de qualité et de quantité. La reproductibilité interlaboratoires est déterminée au cours des processus de préva ­
lidation et de validation, et indique dans quelle mesure un essai peut être trans ­
féré sans problème entre laboratoires. On parle aussi de reproductibilité entre 
laboratoires (38).
 
Reproductibilité intralaboratoire:  détermination du degré auquel divers membres 
du personnel qualifié d’un même laboratoire réussissent à obtenir des résultats 
identiques en ayant recours à un protocole spécifique à des moments différents. 
On parle aussi de reproductibilité au sein du laboratoire (38).  
Risque:  éventualité d’un effet indésirable sur la santé ou l’environnement. L’effet 
indésirable se manifeste uniquement lorsque le niveau d’exposition est suffisant.  
Sensibilisation cutanée:  processus immunologique résultant de l’exposition 
topique d’un sujet sensible à un allergène chimique inducteur, et qui se traduit 
par une réaction immunologique cutanée pouvant entraîner le développement d’une sensibilisation de contact.
 
Substance d’essai (également dénommée substance chimique d’essai):  toute subs ­
tance et tout mélange testés selon la présente méthode d’essai.  
Substance étalon:  substance sensibilisante ou non sensibilisante utilisée comme 
référence pour comparer les effets d’une substance d’essai. Une substance étalon 
présente les propriétés suivantes: i) source(s) régulières et fiables; ii) similitude structurale et fonctionnelle avec la catégorie des substances à tester; iii) caracté ­
ristiques physico-chimiques connues; iv) données confirmant les effets connus; et 
v) puissance connue dans l’intervalle de la réponse désirée.
 
Valeur aberrante:  une valeur aberrante est une valeur observée qui diffère nette ­
ment des autres valeurs dans un échantillon aléatoire d’une population.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 744
 
B.51.  SENSIBILISATION CUTANÉE: ESSAI DE STIMULATION 
LOCALE DES GANGLIONS LYMPHATIQUES: BRDU-ELISA  
INTRODUCTION  
1. Les lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques et 
les méthodes d’essai de l’Union européenne sont régulièrement mises à jour à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences régle ­
mentaires et de considérations relatives au bien-être des animaux. La 
première méthode d’essai (B.42) visant à déterminer la sensibilisation cutanée chez la souris, c’est-à-dire l’essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques (ELGL, LD 429 de l’OCDE) a été révisée (1) et 
chapitre B.42 de la présente annexe). Les détails de la validation de l’ELGL 
et une synthèse des travaux qui y sont associés ont été publiés (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). La méthode ELGL s’appuie sur un marquage radioiso ­
topique par la thymidine ou l’iode pour mesurer la prolifération des 
lymphocytes, ce qui limite son application dans les régions où l’acquisition, 
l’utilisation et l’élimination de produits radioactifs posent problème. L’ELGL: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ou dosage d’immunoadsorption par enzyme liée] constitue une variante non 
radioactive de la méthode d’essai ELGL, qui fait appel à la 5-bromo-2- 
désoxyuridine (BrdU) (N
 o CAS [Chemical Abstracts Service] 59-14-3) non 
radiomarquée dans un essai de type ELISA pour mesurer la prolifération des lymphocytes. La méthode ELGL: BrdU-ELISA a été validée, puis 
évaluée et recommandée par un groupe international d’experts indépen ­
dants, qui a reconnu son utilité pour identifier, dans certaines limites, les substances ayant ou non un effet sensibilisant sur la peau (10) (11) (12). La présente méthode d’essai permet d’évaluer le pouvoir de sensibilisation 
cutanée de produits chimiques (substances et mélanges) chez les animaux. 
Le chapitre B.6 de la présente annexe et la LD 406 de l’OCDE font appel à des essais sur cobayes, notamment l’essai de maximisation sur le cobaye et l’essai de Buehler (13). L’ELGL (chapitre B.42 de la présente annexe, LD 
429 de l’OCDE) et ses deux variantes non radioactives, ELGL: 
BrdU-ELISA (chapitre B.51 de la présente annexe, LD 442 B de l’OCDE) et ELGL: DA (chapitre B.50 de la présente annexe, LD 442 A de l’OCDE), sont plus intéressantes que les essais sur cobayes décrits dans 
le chapitre B.6 et dans la LD 406 de l’OCDE (13) en termes de réduction et 
de raffinement de l’utilisation des animaux.
 
2. À l’instar de l’ELGL, la méthode ELGL: BrdU-ELISA s’intéresse à la 
phase d’induction de la sensibilisation cutanée et fournit des données quan ­
titatives permettant d’évaluer la relation dose-effet. Par ailleurs, en détectant les sensibilisants cutanés sans recourir au radiomarquage de l’ADN, cette 
technique évite les risques professionnels liés à l’exposition aux rayonne ­
ments et les problèmes de gestion des déchets. En contrepartie, elle pourrait se traduire par une hausse du nombre de souris utilisées pour repérer les sensibilisants cutanés, entraînant néanmoins la diminution du nombre de 
cobayes mis à contribution à ces mêmes fins (d’après le chapitre B.6, LD 
406 de l’OCDE) (13).
 
DÉFINITIONS  
3. Les définitions utilisées sont données à l’appendice 1.  
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES  
4. La méthode ELGL: BrdU-ELISA est une variante de l’ELGL visant à 
identifier les substances chimiques susceptibles d’induire une sensibilisation 
cutanée, dans un cadre précis. Cela n’implique pas que l’ELGL: 
BrdU-ELISA doive systématiquement remplacer l’ELGL classique ou les essais sur cobayes (chapitre B.6, LD 406 de l’OCDE) (13), mais plutôt qu’il s’agit d’un outil d’une qualité égale pouvant se substituer à ces méthodes, et 
dont les résultats positifs et négatifs n’ont généralement plus besoin de 
confirmation supplémentaire (10) (11). Avant de procéder à l’essai, le
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laboratoire rassemble toutes les informations disponibles sur la substance 
d’essai, à savoir son identité et sa structure chimiques, ses propriétés 
physico-chimiques, les résultats de tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, et les données toxicologiques sur des analogues de struc ­
ture. Ces informations servent à déterminer s’il est pertinent d’appliquer la 
méthode ELGL: BrdU-ELISA avec la substance d’essai considérée [étant 
donné l’incompatibilité de certains types de substances chimiques avec l’ELGL: BrdU-ELISA (voir paragraphe 5)], et aider à choisir les doses appropriées.
 
5. La méthode ELGL: BrdU-ELISA, mise en œuvre in vivo, ne met donc pas 
un terme à l’utilisation des animaux pour évaluer la sensibilisation aller ­
gique par contact. Néanmoins, comparée aux essais avec cobayes (chapitre 
B.6, LD 406 de l’OCDE), elle est susceptible de réduire le nombre d’ani ­
maux utilisés à cette même fin (13). En outre, l’ELGL: BrdU-ELISA propose un raffinement important de l’utilisation des animaux pour 
évaluer la sensibilisation allergique par contact, dans la mesure où, à la 
différence du chapitre B.6 et de la LD 406 de l’OCDE, l’ELGL: BrdU-ELISA n’est pas fondé sur le déclenchement de réactions d’hyper ­
sensibilité cutanée par une exposition de déclenchement. De plus, l’ELGL: 
BrdU-ELISA ne requiert aucun adjuvant, contrairement à l’essai de maxi ­
misation sur le cobaye (chapitre B.6 de la présente annexe, 13). Cette méthode permet donc de réduire le stress des animaux. Malgré les avan ­
tages de l’ELGL: BrdU-ELISA par rapport au chapitre B.6 et à la LD 406 
de l’OCDE (13), certaines limites peuvent imposer de privilégier l’utilisa ­
tion du chapitre B6 ou de la LD 406 de l’OCDE (13) [par exemple, essai de certains métaux, résultats faussement positifs avec certaines substances irri ­
tantes pour la peau, en particulier des tensioactifs (6) (1 et chapitre B.42 de 
la présente annexe), solubilité de la substance d’essai]. De surcroît, certaines 
substances chimiques ou familles de substances chimiques comprenant des groupements fonctionnels dont il est démontré qu’ils peuvent être des facteurs de confusion (15) peuvent aussi imposer le recours aux essais 
avec cobayes (B.6, LD 406 de l’OCDE) (13). Il est recommandé de consi ­
dérer les limites identifiées pour l’ELGL (1 et chapitre B.42 de la présente annexe) comme étant également valables pour l’ELGL: BrdU-ELISA (10). Dans ces limites, l’ELGL: BrdU-ELISA est applicable à tout produit 
chimique qui ne présente pas de propriétés susceptibles d’affecter la préci ­
sion de l’essai. De plus, il convient de prendre en compte l’éventualité de résultats positifs limites pour lesquels l’indice de stimulation (IS) est situé entre 1,6 et 1,9 (voir paragraphes 31-32). En effet, d’après la base de 
données de validation portant sur 43 substances présentant un IS ≥ 1,6 
(voir paragraphe 6), l’ELGL: BrdU-ELISA a correctement identifié l’en ­
semble des 32 sensibilisants (d’après l’ELGL), mais a donné des résultats positifs pour deux des 11 substances non sensibilisantes (d’après ELGL) 
présentant un indice de stimulation compris entre 1,6 et 1,9 (c’est-à-dire des 
résultats positifs limites) (10). Cependant, comme le même ensemble de données a été utilisé pour établir les valeurs IS et pour calculer les 
propriétés prédictives de l’essai, les résultats indiqués pourraient surestimer 
les propriétés prédictives réelles.
 
PRINCIPE DE LA MÉTHODE D’ESSAI  
6. L’ELGL: BrdU-ELISA repose sur le principe que les sensibilisants indui ­
sent une prolifération primaire de lymphocytes dans les ganglions lympha ­
tiques drainant le site de l’application de la substance d’essai. Cette proli ­
fération est proportionnelle à la dose appliquée et à la puissance de l’aller ­
gène et permet d’obtenir facilement une mesure quantitative de la sensibi ­
lisation. Pour mesurer la prolifération, on compare la prolifération moyenne de chaque groupe d’essai à la prolifération moyenne du groupe témoin traité avec le véhicule (TV). On calcule le quotient de la prolifération moyenne 
dans chaque groupe traité sur celle dans le groupe TV concurrent pour 
obtenir l’indice de stimulation (IS); si cette valeur est supérieure ou égale
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à 1,6, on peut ensuite poursuivre l’évaluation du pouvoir de sensibilisation 
cutanée de la substance d’essai. Les procédures décrites ici s’appuient sur la 
quantification de la BrdU pour indiquer l’augmentation du nombre de cellules en prolifération dans les ganglions lymphatiques auriculaires de drainage. La BrdU est un analogue de la thymidine qui s’incorpore de la 
même manière dans l’ADN de cellules en prolifération. L’incorporation de 
la BrdU est quantifiée par ELISA, grâce à un anticorps spécifique de la BrdU marqué par la peroxydase. Cette enzyme réagit ensuite avec un subs ­
trat ajouté spécialement pour produire un composé coloré, dosé avec un 
lecteur de plaque de microtitrage à une absorbance donnée.
 
DESCRIPTION DE L’ESSAI  
Choix des espèces animales  
7. L’espèce retenue pour cet essai est la souris. Les études de validation de 
l’ELGL: BrdU-ELISA ont été menées exclusivement avec la souche CBA/JN, qui sera donc privilégiée pour cet essai (10) (12). On utilise de jeunes femelles adultes, nullipares et non gravides. Au début de l’étude, les 
animaux sont âgés de 8 à 12 semaines et affichent une variation de poids 
minime entre eux n’excédant pas 20 pour cent du poids. Il est aussi possible d’utiliser d’autres souches ainsi que des mâles s’il existe suffisamment d’informations démontrant l’absence de différences significatives entre les 
souches et/ou les sexes en ce qui concerne la réaction à l’ELGL: 
BrdU-ELISA.
 
Conditions d’hébergement et d’alimentation  
8. Les souris sont hébergées par groupes (16), sauf si une raison scientifique 
pertinente exige un encagement individuel. La température de l’animalerie d’expérience est maintenue à 22 °C ± 3 °C. L’humidité relative atteint au 
moins 30 % et de préférence ne dépasse pas 70 % en dehors des moments 
où le local est nettoyé, l’idéal étant qu’elle soit maintenue aux alentours de 50-60 %. L’éclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Les animaux peuvent être alimentés par un régime clas ­
sique de laboratoire avec eau potable à satiété.
 
Préparation des animaux  
9. Les animaux sont sélectionnés au hasard, marqués pour permettre leur 
identification individuelle (mais jamais sur l’oreille) et gardés dans leurs cages pendant au moins cinq jours avant le commencement du traitement afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Avant de commencer 
le traitement, on examine tous les animaux pour vérifier qu’ils ne présentent 
pas de lésions cutanées observables.
 
Préparation des solutions d’essai  
10. Les substances chimiques solides sont dissoutes ou dispersées dans des 
solvants/véhicules puis diluées, s’il y a lieu, avant d’être appliquées sur l’oreille des souris. Les substances chimiques liquides peuvent être appli ­
quées pures ou préalablement diluées. Les substances chimiques insolubles, 
comme celles que l’on rencontre généralement dans les dispositifs médi ­
caux, sont soumises à une extraction forcée à l’aide d’un solvant approprié pour faire ressortir tous les composants extractibles qu’il est possible d’éva ­
luer, avant l’application sur l’oreille des souris. Les substances d’essai sont 
préparées chaque jour à moins que les données concernant la stabilité ne démontrent qu’elles peuvent être stockées.
 
Contrôle de la fiabilité  
11. Les témoins positifs (TP) servent à démontrer le bon fonctionnement de 
l’essai en répondant de manière adéquate et reproductible à une substance 
d’essai sensibilisante pour lequel l’ordre de grandeur des effets est bien 
connu. Il est recommandé d’inclure un TP concurrent puisqu’il démontre la capacité du laboratoire à mener chaque essai correctement, et permet d’évaluer la comparabilité et la reproductibilité intra- et interlaboratoires. 
Par ailleurs, dans la mesure où certaines autorités réglementaires exigent un 
TP dans chaque essai, les expérimentateurs sont encouragés à consulter les
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autorités concernées avant de mener l’ELGL: BrdU-ELISA. De même, le 
recours systématique à un TP concurrent est recommandé pour éviter 
d’avoir à réaliser des essais supplémentaires sur animaux, ce qui est parfois exigé lorsqu’un laboratoire se réfère à un TP testé périodiquement (voir paragraphe 12). Le TP doit réagir positivement à l’ELGL: 
BrdU-ELISA pour un niveau d’exposition supposé accroître l’indice de 
stimulation supérieur d’au moins 1,6 point par rapport au groupe témoin négatif (TN). La dose de TP sera choisie de manière à ne pas entraîner d’irritation cutanée excessive ou de toxicité systémique, l’induction devant 
être reproductible sans être exagérée (un IS > 14 sera considéré comme 
excessif, par exemple). Les TP utilisés en priorité sont l’hexyl cinnamaldé ­
hyde à 25 % (N
 o CAS 101-86-0) et l’eugénol à 25 % (N  o CAS 97-53-0) 
dans un mélange acétone/huile d’olive (4:1, v/v). Dans certains cas, d’autres 
témoins positifs répondant aux critères susmentionnés pourront être 
employés, à condition que ce choix soit correctement justifié.  
12. Si l’inclusion d’un groupe TP concurrent demeure recommandée, des essais 
périodiques (à intervalles ≤ 6 mois) du TP peuvent dans certains cas 
convenir pour les laboratoires menant régulièrement (c’est-à-dire au moins une fois par mois) des ELGL: BrdU-ELISA et disposant d’une base de données de référence montrant que le laboratoire est apte à obtenir des 
résultats précis et reproductibles avec les TP. La capacité d’un laboratoire 
à mener l’ELGL: BrdU-ELISA est efficacement démontrée quand le TP déclenche des résultats positifs cohérents à l’issue d’un minimum de 10 essais indépendants étalés sur une période raisonnable (c’est-à-dire infé ­
rieure à un an).
 
13. Il convient d’inclure un groupe TP concurrent à chaque fois que le proto ­
cole de l’ELGL: BrdU-ELISA est modifié (par exemple si des modifications 
interviennent au niveau du personnel qualifié, des composés et/ou des réac ­
tifs utilisés pour la méthode d’essai, de l’équipement mis à contribution, ou de la source d’animaux d’expérience), et ces changements seront docu ­
mentés dans les rapports de laboratoire. Il faudra tenir compte de l’impact 
de ces changements sur la validité des données de la base historique pour décider de l’opportunité d’établir une autre base de données afin d’évaluer la cohérence des nouveaux résultats relatives au TP.
 
14. Les investigateurs gardent à l’esprit que tester le TP périodiquement plutôt 
que systématiquement comme concurrent pèse sur la précision et l’accep ­
tabilité des résultats négatifs obtenus à l’issue d’un essai sans TP concurrent 
réalisé dans l’intervalle entre chaque essai périodique du TP. Par exemple, si un essai périodique du TP donne un faux négatif, l’ensemble des résultats négatifs obtenus depuis le dernier essai de TP valable pourront être remis en 
question. Il faut donc soigneusement considérer les implications de telles 
retombées avant de décider si les TP seront des concurrents systématiques ou s’ils feront l’objet d’essais périodiques. Par ailleurs, le nombre d’ani ­
maux du groupe du TP concurrent sera réduit si cela se justifie du point de 
vue scientifique et si le laboratoire démontre, en s’appuyant sur ses propres 
données historiques, que l’on peut utiliser moins de souris (17).
 
15. Quoique le témoin positif soit testé dans un véhicule produisant un effet 
constant (par exemple acétone: huile d’olive, 4:1, v/v), certaines situations 
réglementaires peuvent aussi nécessiter l’essai avec un véhicule moins courant (mélange cliniquement ou chimiquement pertinent) (18). Si le TP concurrent est testé avec un véhicule différent de celui de la substance 
d’essai, il convient de mettre en place un TV indépendant pour le TP 
concurrent.
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16. Lorsqu’il s’agit d’évaluer des substances d’essai appartenant à une classe 
chimique particulière ou donnant des résultats situés dans une certaine 
fourchette, des substances étalons peuvent s’avérer utiles pour montrer que la méthode d’essai fonctionne correctement et permet de détecter le pouvoir de sensibilisation cutanée de ces types de composés. Les substances 
étalons adaptées présentent les propriétés suivantes:
 
— similitude structurale et fonctionnelle avec la catégorie des substances à 
tester,  
— caractéristiques physiques et chimiques connues,  
— données obtenues avec l’ELGL: BrdU-ELISA,  
— données obtenues avec d’autres modèles animaux et/ou l’être humain.  
MODE OPÉRATOIRE  
Nombre d’animaux et doses  
17. On utilise au moins quatre animaux par groupe de dose, et un minimum de 
trois concentrations de la substance d’essai, ainsi qu’un groupe TN concur ­
rent ne recevant que le véhicule de cette substance et un TP (concurrent ou récent selon les pratiques du laboratoire, voir paragraphes 11-15). On peut envisager de tester différentes doses de TP, en particulier quand celui-ci ne 
fait l’objet que d’essais périodiques. Mis à part l’absence de traitement par 
la substance d’essai, les animaux des groupes témoins sont manipulés et traités de la même manière que les animaux des groupes d’essai.
 
18. La sélection des doses et du véhicule suit les recommandations données 
dans les références 2 et 19. Les doses successives sont normalement choi ­
sies dans une série de concentrations appropriées telles que 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0,5 %, etc. Le choix de la série utilisée est scientifiquement justifié. Le cas échéant, toutes les informations existantes 
d’ordre toxicologique (par exemple sur la toxicité aiguë et l’irritation cuta ­
née), structural et physico-chimique sur la substance d’essai en question (et/ou ses analogues de structure) sont prises en compte pour choisir les trois concentrations successives de manière que la plus élevée d’entre elles 
offre une exposition maximale tout en évitant la toxicité systémique et/ou 
une irritation cutanée locale excessive (19) (20 et chapitre B.4 de la présente annexe). En l’absence de telles informations, un essai préliminaire peut s’avérer nécessaire (voir paragraphes 21-24).
 
19. Il convient que le véhicule ne perturbe pas et n’introduise pas un biais dans 
les résultats du test. Il doit être choisi de manière à optimiser la solubilité 
pour obtenir la concentration la plus élevée possible dans la préparation d’une solution/suspension adaptée à l’application de la substance d’essai. Les véhicules recommandés sont le mélange acétone/huile d’olive (4:1, v/v), 
le N,N-diméthylformamide, la méthyléthylcétone, le propylèneglycol et le 
diméthylsulfoxyde (6) mais d’autres véhicules pourront également être utilisés à condition que ce choix soit suffisamment étayé sur le plan scien ­
tifique. Certaines situations réclament un témoin supplémentaire, à savoir un 
solvant qui se justifie sur le plan clinique ou le mélange dans lequel la 
substance d’essai est commercialisée. L’expérimentateur veille tout particu ­
lièrement à ce que les substances d’essai hydrophiles soient incorporées à un véhicule qui mouille la peau et ne ruisselle pas immédiatement, ce qui 
peut nécessiter l’ajout de solubilisants appropriés (par exemple Pluronic® 
L92 à 1 %). Il convient donc d’éviter les véhicules totalement aqueux.
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20. Le traitement des ganglions lymphatiques de chaque souris permet d’évaluer 
la variabilité entre individus et de comparer statistiquement les réponses 
induites par la substance d’essai et par le véhicule témoin (voir paragraphe 33). En outre, il n’est envisageable de réduire le nombre d’animaux du groupe TP qu’en se fondant sur des données individuelles (17). Du reste, 
certaines autorités réglementaires exigent la collecte de données pour 
chaque animal. Relever régulièrement les données propres à chaque indi ­
vidu contribue au bien-être des animaux en évitant les essais dupliqués qui seraient nécessaires si les résultats obtenus d’une autre manière (par 
exemple avec des données par groupe d’animaux) devaient être soumis à 
des autorités réglementaires ayant d’autres exigences (en particulier la four ­
niture de données individuelles).
 
Essai préliminaire  
21. En l’absence d’informations permettant d’estimer la concentration d’essai 
maximale (voir paragraphe 18), il convient d’effectuer un essai préliminaire 
afin de déterminer le niveau des doses adaptées à l’ELGL: BrdU-ELISA. 
Cet essai préliminaire aide à quantifier la dose maximale à mettre en œuvre dans l’ELGL: BrdU-ELISA lorsqu’on ne dispose pas d’informations sur la concentration induisant une toxicité systémique (voir paragraphe 24) et/ou 
une irritation cutanée locale excessive (voir paragraphe 23). Cette concen ­
tration maximum de la substance d’essai est de 100 % pour les liquides, ou la plus élevée possible pour les solides et les suspensions.
 
22. Les conditions de l’essai préliminaire sont les mêmes que celles de l’ELGL: 
BrdU-ELISA, à ceci près qu’il n’y a pas d’évaluation de la prolifération 
dans les ganglions lymphatiques et que l’on peut inclure moins d’animaux 
par groupe de dose. En effet, on suggère d’utiliser seulement un à deux individus par groupe de dose. Il convient d’examiner toutes les souris quotidiennement afin de déceler d’éventuels signes cliniques de toxicité 
systémique ou d’irritation locale sur le site d’application. Les poids corpo ­
rels sont consignés préalablement à l’essai et juste avant la fin de l’essai (sixième jour). On examine les deux oreilles de chaque souris pour détecter la présence d’un éventuel érythème, le résultat étant noté conformément à 
l’échelle figurant dans le tableau 1 (20 et chapitre B.4 de la présente 
annexe). L’épaisseur de l’oreille est mesurée à l’aide d’une jauge d’épais ­
seur (par exemple micromètre numérique ou jauge d’épaisseur Peacock Dial) le premier jour (avant toute application), le troisième jour (environ 
48 heures après la première dose) et le sixième jour. De plus, au sixième 
jour, cette épaisseur peut être déterminée à partir du poids d’un échantillon d’oreille, prélevé après l’euthanasie des animaux. Les irritations locales 
excessives se traduisent par une cotation de l’érythème ≥ 3 et/ou un épais ­
sissement de l’oreille d’au moins 25 %, quel que soit le jour de la mesure (21) (22). La dose maximale choisie pour l’étude ELGL: BrdU-ELISA principale sera la dose immédiatement inférieure dans la série de concen ­
trations utilisée pour l’essai préliminaire (voir paragraphe 18) qui n’induit 
pas une toxicité systémique et/ou une irritation cutanée locale excessive.
 
Tableau 1  
Cotation de l’érythème  
Observation Résultat  
Pas d’érythème 0 
Érythème très léger (à peine perceptible) 1 Érythème bien défini 2
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Observation Résultat  
Érythème modéré à grave 3 
Érythème grave (rouge violacé) à formation d’escarre empê ­
chant la cotation de l’érythème 4 
23. Outre un épaississement de l’oreille de 25 % (21) (22), une augmentation 
statistiquement significative de l’épaisseur de l’oreille chez les souris trai ­
tées par rapport aux individus témoins a également été utilisée pour iden ­
tifier des produits irritants dans l’ELGL (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). 
Cependant, les augmentations statistiquement significatives inférieures à 
25 % ne sont pas systématiquement associées à une irritation excessive (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Les observations cliniques suivantes peuvent indiquer une toxicité 
systémique (30) dans le cadre d’une évaluation intégrée, et ainsi permettre d’estimer la dose maximale à utiliser dans l’ELGL: BrdU-ELISA: modifi ­
cations des fonctions nerveuses (par exemple, piloérection, ataxie, tremble ­
ments et convulsions); changements du comportement (par exemple, agres ­
sivité, activités de toilettage modifiées, changement marqué d’intensité de l’activité); troubles respiratoires (en termes de fréquence et d’intensité de la respiration, sous forme de dyspnée, halètements ou râles), et modifications 
de la consommation d’aliments et d’eau. En outre, l’évaluation prendra en 
compte les éléments suivants: signes de léthargie et/ou absence de récepti ­
vité, et tout signe clinique autre qu’une douleur et un stress légers ou passagers; baisse du poids corporel > 5 % entre le premier et le sixième 
jour; mortalité. Les animaux moribonds ou montrant des signes de douleur 
et de stress aigus sont euthanasiés (31).
 
Programme expérimental de l’étude principale  
25. Le programme expérimental se déroule comme suit:  
— Premier jour:  Mesurer et consigner le poids de chaque animal ainsi que 
toute observation clinique. Appliquer 25 μL d’une dilution adaptée de 
la substance d’essai, du véhicule seul ou du TP (concurrent ou récent selon les pratiques du laboratoire, voir paragraphes 11-15) au dos de chaque oreille.
 
— Deuxième et troisième jours:  Répéter la procédure d’application prati ­
quée le premier jour.  
— Quatrième jour:  Aucun traitement.  
— Cinquième jour:  Injecter 0,5 mL (5 mg/souris) d’une solution de BrdU 
(10 mg/mL) par voie intrapéritonéale.  
— Sixième jour:  Noter le poids de chaque animal ainsi que toute obser ­
vation clinique. Euthanasier les animaux environ 24 heures (24 h) après 
l’injection de BrdU. Exciser les ganglions lymphatiques auriculaires de 
drainage de chaque oreille de souris et les placer séparément dans une solution saline tamponnée au phosphate [phosphate buffered saline] (PBS). Les détails et diagrammes relatifs à l’identification et à 
la dissection des ganglions lymphatiques sont présentés dans la réfé ­
rence (17). Pour approfondir le suivi de la réponse cutanée locale dans l’essai principal, des paramètres supplémentaires comme la cotation de l’érythème auriculaire ou les mesures de l’épaisseur de l’oreille (obte ­
nues à l’aide d’une jauge d’épaisseur ou par pesée d’échantillons 
d’oreilles après nécropsie) peuvent être inclus dans le protocole d’étude.
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Préparation des suspensions cellulaires  
26. Pour chaque souris, les cellules de ganglions lymphatiques (CGL) excisés 
bilatéralement sont dispersées par le biais d’une désagrégation mécanique 
douce à travers un tamis en acier inoxydable à 200 microns, ou de toute autre technique acceptable pour obtenir une suspension unicellulaire (par exemple en broyant les ganglions dans un mortier en plastique jetable avant 
de les passer dans un tamis en nylon de 70 microns). La procédure de 
dispersion des CGL constitue une étape cruciale de l’essai, et est maîtrisée préalablement par chaque opérateur. En outre, les ganglions lymphatiques des animaux du groupe TN étant petits, il importe de les manipuler avec 
précaution afin d’éviter toute perturbation des valeurs IS. Dans chaque cas, 
le volume de suspension de CGL visé correspond à un volume optimisé préétabli (environ 15 mL). Le volume optimisé est celui pour lequel l’ab ­
sorbance moyenne du groupe TN se situe entre 0,1 et 0,2.
 
Détermination de la prolifération cellulaire (quantification de la BrdU dans 
l’ADN des lymphocytes)  
27. La BrdU est quantifié à l’aide d’un kit de dosage ELISA commercial (par 
exemple Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne, référence 11 647 229 001). Placer rapidement 100 μL de suspension de CGL dans les puits 
d’une microplaque à fond plat, en triplicats. Après fixation et dénaturation 
des CGL, ajouter les anticorps anti-BrdU dans chaque puits et laisser réagir. 
Éliminer ensuite les anticorps anti-BrdU par lavage, puis ajouter la solution de substrat et laisser le chromogène être synthétisé. Mesurer l’absorbance à 370 nm, pour une longueur d’onde de référence fixée à 492 nm. Dans tous les cas, il 
convient d’optimiser les conditions de l’essai (voir paragraphe 26).
 
OBSERVATIONS  
Observations cliniques  
28. Au moins une fois par jour, l’expérimentateur examine attentivement 
chaque souris afin de déceler d’éventuels signes cliniques, se traduisant par une irritation locale sur le site d’application ou une toxicité systémique. 
Toutes les observations sont systématiquement consignées pour chaque 
souris. Les programmes de suivi intègrent les critères permettant d’identifier rapidement les souris montrant des signes de toxicité systémique, d’irritation excessive ou de corrosion locale de la peau, afin qu’elles puissent être 
euthanasiées (31).
 
Poids corporels  
29. Comme indiqué au paragraphe 25, le poids corporel de chaque animal est 
mesuré au début de l’essai et au moment programmé pour l’euthanasie.  
CALCUL DES RÉSULTATS  
30. Les résultats obtenus pour chaque groupe de traitement sont exprimés par 
un indice de stimulation (IS) moyen. Cet IS s’obtient en divisant l’indice de marquage BrdU moyen de chaque groupe ayant reçu la substance d’essai ou 
le TP par l’indice de marquage BrdU moyen du groupe témoin traité avec le 
solvant/TV. L’IS moyen pour les TV est alors égal à 1.
 
L’indice de marquage BrdU est calculé comme suit:  
Indice de marquage BrdU = (ABSem – ABS blancem) – (ABSréf – ABS 
blancréf)  
Où em = longueur d’onde d’émission et réf = longueur d’onde de référence.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 752
 
31. Un résultat est considéré comme positif lorsque IS ≥ 1,6 (10). Toutefois, 
l’intensité de la relation dose-effet, la signification statistique et la cohérence 
des réponses obtenues avec le solvant/véhicule et le TP constituent autant de facteurs pour décider si un résultat limite (c’est-à-dire un IS situé entre 1,6 et 1,9) est jugé positif (3) (6) (32).
 
32. En cas de réponse positive limite (IS entre 1,6 et 1,9), les expérimentateurs 
sont invités à examiner des paramètres supplémentaires comme la relation dose-effet, les manifestations de toxicité systémique ou d’irritation exces ­
sive, et, le cas échéant, la signification statistique pour définitivement 
conclure à un résultat positif (10). Diverses propriétés de la substance d’essai sont aussi prises en compte, parmi lesquelles une éventuelle analogie structurelle avec des sensibilisants cutanés connus, le déclenchement d’une 
irritation cutanée excessive chez la souris, et la nature de la relation 
dose-effet observée. Ces considérations, ainsi que d’autres, sont examinées en détail dans un autre document (4).
 
33. Le relevé des données pour chaque souris permet de déterminer statistique ­
ment l’existence et l’intensité d’une relation dose-effet dans les résultats. Tout traitement statistique peut comprendre une évaluation de la relation 
dose-effet ainsi que des comparaisons des groupes d’essai convenablement 
adaptées (par exemple, comparaisons par paires des groupes de dose avec le groupe solvant/véhicule témoin concurrent). Les analyses statistiques peuvent notamment inclure une régression linéaire ou le test de William 
pour étudier la fonction dose-effet, ainsi que le test de Dunnett pour les 
comparaisons par paires. Pour choisir une méthode appropriée d’analyse statistique, il faut être conscient du risque d’inégalité des variances et d’au ­
tres problèmes connexes qui pourraient nécessiter une transformation des 
données ou une analyse statistique non paramétrique. Quoi qu’il en soit, on 
peut être amené à calculer les indices de stimulation et effectuer les traite ­
ments statistiques avec ou sans certains points de données (parfois appelés «valeurs aberrantes»).
 
RÉSULTATS ET RAPPORTS  
Résultats  
34. Les résultats sont récapitulés sous forme de tableau présentant les indices de 
marquage BrdU pour chaque animal, la moyenne des indices de marquage 
BrdU/animal pour chaque groupe, la marge d’erreur associée (par exemple, 
écart type, erreur type de la moyenne) et l’indice de stimulation moyen pour chaque groupe de dose par rapport au groupe solvant/véhicule témoin 
concurrent.
 
Rapport d’essai  
35. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:  
Substance et mélanges chimique d’essai et substances et mélanges 
chimiques témoins:  
— données d’identification (par exemple numéro CAS et numéro CE, le 
cas échéant; source; pureté; impuretés connues; numéro de lot),  
— état physique et propriétés physico-chimiques (par exemple volatilité, 
stabilité, solubilité),  
— s’il s’agit d’un mélange: composition et pourcentages relatifs des consti ­
tuants.  
Solvant/véhicule:  
— données d’identification (pureté; concentration, s’il y a lieu; volume 
utilisé),  
— justification du choix du véhicule.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 753
 
Animaux d’essai:  
— source des souris CBA,  
— état microbiologique des animaux, s’il est connu,  
— nombre et âge des animaux,  
— source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.  
Conditions d’essai:  
— source, numéro de lot et données du fabricant en matière d’assurance et 
de contrôle qualité (sensibilité et spécificité des anticorps, limites de 
détection) pour le kit ELISA,  
— détails concernant la préparation et l’application de la substance d’essai,  
— justification du choix des doses (y compris résultats de l’essai prélimi ­
naire, le cas échéant),  
— concentrations utilisées pour le véhicule et la substance d’essai, et quan ­
tité totale de substance d’essai appliquée,  
— détails concernant la nourriture et la qualité de l’eau (y compris type et 
source de nourriture et provenance de l’eau),  
— détails concernant le programme de traitement et d’échantillonnage,  
— méthodes de détermination de la toxicité,  
— critères de décision concernant les études positives ou négatives,  
— détails concernant tout écart par rapport au protocole et explication de la 
manière dont l’écart modifie la conception de l’essai et ses résultats.  
Vérification de la fiabilité:  
— résumé des résultats du dernier test de fiabilité, notamment informations 
sur la substance d’essai, sa concentration et le véhicule utilisé,  
— résultats des témoins spécifiques au laboratoire pour le TP concurrent 
et/ou historique ainsi que pour le TN concurrent (solvant/véhicule),  
— en l’absence d’un TP concurrent, date et rapport de laboratoire du 
dernier essai périodique du TP, et rapport détaillant les résultats historiques du TP spécifiques au laboratoire de manière à justifier pour ­
quoi aucun TP concurrent n’a été mis en œuvre.
 
Résultats:  
— poids corporel de chaque souris au lancement du traitement et au 
moment programmé pour l’euthanasie; moyenne et marge d’erreur 
associée (par exemple, écart type, erreur type de la moyenne) pour 
chaque groupe de dose,  
— moment du déclenchement des effets et signes de toxicité, y compris 
l’irritation cutanée sur le site d’administration, pour chaque animal,  
— tableau des indices de marquage BrdU et IS par souris pour chaque 
groupe de traitement,  
— moyenne et marge d’erreur associée (par exemple, écart type, erreur 
type de la moyenne) des indices de marquage BrdU par souris pour 
chaque groupe de dose, et résultats de l’analyse des valeurs aberrantes 
au sein de chacun d’eux,  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 754
 
— indices de stimulation obtenus, et détermination appropriée de la varia ­
bilité prenant en compte les variations entre animaux à la fois dans les 
groupes ayant reçu la substance d’essai et dans les groupes témoins,  
— relation dose-effet,  
— analyses statistiques, s’il y a lieu.  
Discussion des résultats:  
— bref commentaire sur les résultats, analyse de la relation dose-effet et 
analyses statistiques, s’il y a lieu, et conclusion quant au fait de savoir si 
la substance d’essai doit être considérée comme un sensibilisant cutané.  
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(1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. Toxicol. 
Environ.l Health , 53, 563-79.  
33. OCDE (2005),  Guidance Document on The Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Série sur les essais et évaluations No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, 
OCDE, Paris. Disponible à l’adresse suivante: [http://www.oecd.org/env/li ­
gnesdirectrices]  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 757
 
Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Assurance qualité:  procédé de gestion dans lequel le respect des normes d’essai, 
des obligations du laboratoire et des procédures d’enregistrement des données, 
ainsi que la précision du transfert des données, sont évalués par des personnes 
indépendantes de celles qui réalisent les essais.  
Faux négatif:  substance d’essai identifiée à tort comme négative ou inactive à 
l’issue de l’essai, alors qu’elle est en fait positive ou active (33).  
Faux positif:  substance d’essai identifiée à tort comme positive ou active à l’issue 
de l’essai, alors qu’elle est en fait négative ou inactive (33).  
Fiabilité:  mesure dans laquelle la mise en œuvre d’une méthode d’essai peut être 
reproduite au fil du temps par un même laboratoire ou par plusieurs laboratoires en utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité intralaboratoire et interlaboratoires (33).
 
Indice de stimulation (IS):  paramètre d’évaluation du pouvoir de sensibilisation 
cutanée d’une substance d’essai, calculé comme le quotient de la prolifération mesurée dans les groupes traités sur celle du groupe témoin concurrent recevant le véhicule.
 
Précision:  degré de conformité entre les résultats de la méthode d’essai et les 
valeurs de référence acceptées. Elle constitue une mesure de performance de la 
méthode d’essai et l’un des aspects de sa pertinence. Ce terme est souvent utilisé indifféremment à la place de «concordance» pour qualifier la proportion de résultats corrects d’une méthode d’essai (33).
 
Reproductibilité interlaboratoires:  mesure du degré auquel différents laboratoires 
qualifiés qui emploient le même protocole et testent les mêmes substances d’essai 
peuvent produire des résultats similaires en termes de qualité et de quantité. La reproductibilité interlaboratoires est déterminée au cours des processus de préva ­
lidation et de validation, et indique dans quelle mesure un essai peut être trans ­
féré sans problème entre laboratoires. On parle aussi de reproductibilité entre 
laboratoires (33).
 
Reproductibilité intralaboratoire:  détermination du degré auquel divers membres 
du personnel qualifié d’un même laboratoire réussissent à obtenir des résultats 
identiques en ayant recours à un protocole spécifique à des moments différents. 
On parle aussi de reproductibilité au sein du laboratoire (33).  
Risque:  éventualité d’un effet indésirable sur la santé ou l’environnement. L’effet 
indésirable se manifeste uniquement lorsque le niveau d’exposition est suffisant.  
Sensibilisation cutanée:  processus immunologique résultant de l’exposition 
topique d’un sujet sensible à un allergène chimique, et qui se traduit par une 
réaction immunologique cutanée pouvant entraîner le développement d’une sensi ­
bilisation de contact.  
Substance d’essai (également dénommée substance chimique d’essai):  toute subs ­
tance et tout mélange testés selon la présente méthode d’essai.  
Substance étalon:  substance sensibilisante ou non sensibilisante utilisée comme 
référence pour comparer les effets d’une substance d’essai. Une substance étalon 
présente les propriétés suivantes: i) source(s) régulières et fiables; ii) similitude structurale et fonctionnelle avec la catégorie des substances à tester; iii) caracté ­
ristiques physiques et chimiques connues; iv) données confirmant les effets 
connus; et v) puissance connue dans l’intervalle de la réponse désirée.
 
Valeur aberrante:  une valeur aberrante est une valeur observée qui diffère nette ­
ment des autres valeurs dans un échantillon aléatoire d’une population.  ▼M3 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 758
 
B.52.  TOXICITÉ AIGUË PAR INHALATION – MÉTHODE PAR 
CLASSE DE TOXICITÉ AIGUË  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 436 (2009) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Une première ligne direc ­
trice pour les essais de toxicité aiguë par inhalation (403) avait été adoptée 
en 1981 et a été révisée depuis [voir chapitre B.2 de la présente annexe (1)]. À la suite de l’adoption, en 2001, de la méthode par classe de toxicité aiguë par voie orale [chapitre B.1  ter de la présente annexe (5)], il est apparu 
approprié de développer une méthode par classe de toxicité aiguë par inha ­
lation (2) (3) (4). Une évaluation rétrospective des performances de la méthode d’essai par classe de toxicité aiguë pour la toxicité aiguë par inhalation a montré que cette méthode était utilisable à des fins de clas ­
sification et d’étiquetage (6). La méthode d’essai pour les essais de toxicité 
par inhalation faisant appel à la méthode par classe de toxicité aiguë permettra l’utilisation d’étapes successives de concentrations cibles fixées pour déterminer la classe de toxicité de la substance d’essai. Bien que la 
létalité soit le principal effet mesuré, les animaux moribonds ou présentant 
des signes de souffrance ou de détresse sévère sont euthanasiés afin de minimiser leur souffrance. Des précisions concernant les effets mesurés éthiquement acceptables sont disponibles dans le document d’orientation 
n
 o 19 de l’OCDE (7).  
2. On trouvera dans le document d’orientation n  o 39 sur les essais de toxicité 
aiguë par inhalation des indications pour la conduite et l’interprétation de la présente méthode d’essai (8).
 
3. Les définitions utilisées dans la présente méthode d’essai figurent à l’appen ­
dice 1 et dans le document d’orientation n  o 39 (8).  
4. Cette méthode d’essai fournit des informations qui permettent à la fois 
l’évaluation des dangers et le classement de la substance d’essai conformé ­
ment au règlement (CE) n  o 1272/2008 relatif à la classification pour les 
substances présentant une toxicité aiguë (9). Si des estimations ponctuelles 
des valeurs de la CL  50 ou des analyses de la courbe concentration- réponse 
sont nécessaires, il convient de se reporter au chapitre B.2 de la présente annexe (1). Pour plus d’informations sur le choix des méthodes d’essai, il 
convient de se reporter au document d’orientation n
 o 39 (8). La présente 
méthode d’essai n’est pas spécifiquement destinée à tester des articles spéciaux comme les substances isométriques ou fibreuses faiblement solu ­
bles ou les nanomatériaux manufacturés.
 
REMARQUES PRÉLIMINAIRES  
5. Avant d’entreprendre un essai conformément à la présente méthode d’essai, 
le laboratoire d’essai devra prendre en compte toutes les informations 
disponibles sur la substance d’essai, y compris les études existantes dont 
les résultats éviteraient des essais supplémentaires, afin de recourir le moins possible aux animaux. Parmi les informations utiles pour la détermination de l’espèce, de la souche, du sexe, du mode d’exposition et des concentrations 
d’essai appropriés, citons: l’identité, la structure chimique et les propriétés 
physico-chimiques de la substance d’essai; les résultats de tous les essais de toxicité in vitro ou in vivo auxquels elle a été soumise; son (ses) utilisa ­
tion(s) escomptée(s) et les risques d’exposition humaine; les 
données (Q)SAR disponibles et les données toxicologiques sur les subs ­
tances structurellement apparentées. Les concentrations susceptibles d’en ­
gendrer une souffrance ou une détresse sévères, du fait de propriétés corrosives (
 1 ) ou fortement irritantes, ne sont pas testées à l’aide de cette 
méthode d’essai, voir document d’orientation 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 759  
( 1 ) L’évaluation de la corrosivité peut reposer sur un avis d’expert basé sur les éléments 
suivants: données expérimentales sur l’homme et l’animal, données (in vitro) existantes 
[voir, par exemple, le chapitre B.40 (11) de la présente annexe ou la ligne directrice 435 
de l’OCDE (12), valeurs du pH, informations concernant des substances analogues ou 
toute autre donnée pertinente].
 PRINCIPE DE L’ESSAI  
6. Le principe de cet essai est d’obtenir, avec un processus séquentiel, des 
informations suffisantes sur la toxicité aiguë par inhalation de la substance d’essai, pour parvenir à son classement avec une exposition de 4 heures. 
Des objectifs règlementaires spécifiques peuvent nécessiter de recourir à 
d’autres durées d’exposition. Les essais pour chacun des niveaux de concen ­
tration définis porteront sur 3 animaux de chaque sexe. En fonction de la mortalité et/ou de l’état moribond des animaux, 2 étapes peuvent suffire 
pour permettre de juger de la toxicité aiguë de la substance d’essai. S’il 
est prouvé que l’un des sexes est plus sensible à la substance d’essai, l’essai peut se poursuivre avec seulement les animaux de ce sexe. Le résultat de 
l’étape précédente détermine l’étape suivante, c’est-à-dire:
 
a) l’arrêt de l’essai;  
b) un essai sur trois animaux par sexe; ou  
c) un essai sur 6 animaux, tous du sexe le plus sensible à la substance 
d’essai, la limite inférieure de la classe de toxicité devant être déterminée à partir d’essais portant sur 6 animaux par groupe de concentration 
d’essai, indépendamment du sexe.
 
7. Les animaux moribonds ou présentant des signes de souffrance manifeste ou 
de détresse sévère et persistante sont euthanasiés, et sont pris en compte 
dans l’interprétation des résultats de l’essai au même titre que ceux qui 
succombent au cours de l’essai. Le document d’orientation de l’OCDE n
 o 19 sur les effets mesurés éthiquement acceptables détaille les critères 
orientant la décision d’euthanasier les animaux moribonds ou en grande 
souffrance, et aide à reconnaître une mort prévisible ou imminente (7).  
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Choix des espèces animales  
8. Le choix s’orientera vers de jeunes rongeurs en bonne santé, de souches 
communément utilisées en laboratoire. Le rat étant l’espèce la plus utilisée, il faudra justifier l’emploi d’autres espèces.
 
Préparation des animaux  
9. Les femelles sont nullipares et non gravides. Le jour de leur exposition, les 
animaux sélectionnés sont de jeunes adultes âgés de 8 à 12 semaines. Leur 
poids corporel ne devra pas excéder, pour chaque sexe, ± 20 % du poids 
moyen des animaux du même âge précédemment exposés. Sélectionnés au hasard, les animaux sont marqués pour être identifiés individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions de laboratoire, ils seront conservés 
dans leur cage pour une période d’au minimum 5 jours avant le début de 
l’essai. Les animaux sont également acclimatés aux appareils d’essai, pendant une courte période précédant l’essai, afin d’atténuer le stress 
causé par leur introduction dans un nouvel environnement.
 
Conditions d’élevage des animaux  
10. La température du local expérimental où les animaux sont conservés est de 
22 ± 3 °C. Le taux d’humidité relative est idéalement maintenu entre 30 et 70 %, encore qu’il ne soit pas toujours possible de le faire si l’eau est utilisée comme véhicule. Avant et après exposition, les animaux sont géné ­
ralement mis en cage en groupes par sexe et par concentration, mais le 
nombre d’animaux par cage ne doit pas faire obstacle à une observation précise de chaque animal, et ne doit engendrer qu’un minimum de pertes dues au cannibalisme et aux combats. Si les animaux sont exposés «nez 
seul», il peut être nécessaire de les acclimater aux tubes de contention. 
Ceux-ci ne doivent pas provoquer chez les animaux de stress excessif, qu’il soit de nature physique, thermique ou dû à leur immobilisation. Les contraintes qu’ils subissent peuvent en effet modifier les paramètres physio ­
logiques mesurés de l’animal, comme sa température corporelle (hyperther ­
mie) et/ou son volume respiratoire par minute. Si l’on dispose de données
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 760
 
génériques montrant que de telles modifications ne se produisent pas de 
façon appréciable, alors la période d’adaptation préalable aux tubes de 
contention n’est pas nécessaire. Les animaux exposés «corps entier» à un aérosol sont enfermés individuellement pendant l’exposition pour empêcher la filtration de l’aérosol par la fourrure de leurs congénères. À l’exception 
des périodes d’exposition, le régime alimentaire des animaux est le régime 
classique et certifié de laboratoire, avec eau potable à satiété. L’éclairage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures d’obscurité.
 
Chambres d’inhalation  
11. Le choix de la chambre d’inhalation prend en compte la nature de la subs ­
tance d’essai et l’objet de l’essai. Le mode d’exposition «nez seul» (qui inclut les dispositifs «tête seule», «nez seul» et «museau seul») est privilé ­
gié. Le mode d’exposition «nez seul» est généralement choisi pour les 
études d’aérosols liquides ou solides et pour les vapeurs susceptibles de 
se condenser en aérosols. L’utilisation d’un mode d’exposition «corps entier» peut être préférable pour les besoins spécifiques de l’étude, mais elle est justifiée dans le rapport de l’étude. Pour assurer la stabilité de 
l’atmosphère d’une chambre d’exposition «corps entier», on veillera à ce 
que le «volume» total des animaux d’expérience ne dépasse pas 5 % du volume de la chambre. Le document d’orientation 39 (8) décrit les principes des techniques d’exposition «corps entier» ou «nez seul», ainsi que leurs 
avantages et inconvénients spécifiques
 
CONDITIONS D’EXPOSITION  
Administration des concentrations  
12. Il est recommandé une durée fixe d’exposition de quatre heures, sans 
compter le temps d’équilibration. D’autres durées d’exposition sont possibles pour répondre à des besoins spécifiques, cependant une justifica ­
tion devra être apportée dans le rapport d’étude, voir document d’orientation 
39 (8). Les animaux exposés «corps entier» demeurent seuls dans la 
chambre afin d’éviter l’ingestion de la substance d’essai par le toilettage de leurs compagnons. Les animaux sont privés de nourriture pendant la période d’exposition. Dans une exposition «corps entier», les animaux 
peuvent boire de l’eau.
 
13. Les animaux sont exposés à la substance d’essai présentée sous forme de 
gaz, de vapeur, d’aérosol ou sous une forme mixte. L’état physique à tester 
dépend des propriétés physico-chimiques de la substance, de la concentra ­
tion choisie, et/ou de la forme physique sous laquelle il est le plus probable qu’elle se présente lors de sa manipulation et de son utilisation. Les subs ­
tances d’essai chimiquement réactives ou hygroscopiques sont testées sous 
air sec. On prendra soin d’éviter les concentrations susceptibles de provo ­
quer une explosion.
 
Répartition granulométrique  
14. Une mesure de la taille des particules est réalisée pour tous les aérosols et 
les vapeurs susceptibles de se condenser pour former des aérosols. Pour que 
toutes les régions pertinentes de l’appareil respiratoire soient exposées, il est 
recommandé d’utiliser des aérosols dont le diamètre aérodynamique médian de masse (DAMM) se situe entre 1 et 4 μm, avec un écart type géométrique 
(σ
 g ) compris entre 1,5 et 3,0 (8) (13) (14). Un effort raisonnable est fourni 
pour remplir ces conditions, mais si tel n’est pas le cas, un jugement d’ex ­
pert est nécessaire. Par exemple, les particules des fumées métalliques peuvent avoir une taille inférieure à cette norme, tandis que les particules chargées, les fibres et les substances hygroscopiques (dont la taille augmente 
dans l’environnement humide du tractus respiratoire) peuvent avoir une 
taille supérieure.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 761
 
Préparation de la substance d’essai dans un véhicule  
15. Pour atteindre la concentration et la taille granulométrique appropriées de la 
substance d’essai, il est possible d’avoir recours à un véhicule; en règle générale l’eau est choisie de préférence. Les substances particulaires 
peuvent être soumises à des procédés mécaniques afin d’atteindre la répar ­
tition granulométrique requise, mais un soin particulier devra être pris de ne pas décomposer ou altérer la substance d’essai. Lorsque les procédés méca ­
niques sont suspectés d’avoir altéré la composition de la substance d’essai 
(température extrême due aux frictions d’un broyage excessif, par exemple), 
la composition de la substance d’essai devra être vérifiée analytiquement. On prendra soin de ne pas contaminer la substance d’essai. Il n’est pas 
nécessaire de tester les substances granulaires non friables qui sont élaborées 
précisément pour ne pas être inhalables. Un test d’usure de surface est réalisé pour démontrer que la manipulation de la substance granulaire ne produit pas de particules respirables. Dans le cas contraire, un essai de 
toxicité par inhalation est réalisé.
 
Animaux témoins  
16. Un groupe témoin négatif (air) n’est pas nécessaire. Lorsqu’un véhicule 
autre que l’eau est utilisé pour produire l’atmosphère d’essai, un groupe témoin du véhicule est utilisé seulement quand on ne dispose pas de 
données historiques sur la toxicité. Si aucune toxicité n’a été détectée lors 
de l’étude de la substance d’essai préparée dans un véhicule, celui-ci est considéré comme non toxique à la concentration testée; il n’y a donc pas lieu d’utiliser de témoin du véhicule.
 
CONTRÔLE DES CONDITIONS D’EXPOSITION  
Débit d’air dans la chambre d’exposition  
17. Le débit d’air dans la chambre est contrôlé avec soin, suivi en continu et 
enregistré au moins toutes les heures pendant chaque exposition. Le suivi de la concentration de l’atmosphère d’essai (ou stabilité temporelle) constitue une mesure complète de tous les paramètres dynamiques et fournit un 
moyen indirect de contrôler tous les paramètres dynamiques pertinents de 
la production de l’atmosphère d’essai. On prendra particulièrement soin d’éviter toute re-respiration dans les chambres d’exposition «nez seul» lorsque le débit d’air à travers le système d’exposition ne permet pas de 
produire une circulation dynamique de l’atmosphère contenant la substance 
d’essai. Des méthodologies sont prévues pour démontrer l’absence de re-respiration dans les conditions expérimentales choisies (8) (15). La concentration d’oxygène est d’au moins 19 % et celle de dioxyde de 
carbone ne dépasse pas 1 %. Si ces conditions ne peuvent être respectées, 
les concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone sont mesurées.
 
Température et humidité relative de la chambre d’exposition  
18. La température de la chambre d’exposition est maintenue à 22 ± 3 °C. Dans 
les cas d’exposition «nez seul» et «corps entier» l’humidité relative dans la 
zone où respire l’animal est suivie et enregistrée trois fois au minimum pour 
les durées allant jusqu’à 4 heures, et toutes les heures pour les durées plus courtes. Le taux d’humidité relative est idéalement compris entre 30 et 70 %. Il est possible que ce taux ne puisse être atteint (par exemple, dans 
le cas d’un mélange à base d’eau), ou qu’il ne puisse être mesuré en raison 
d’interférences de la substance d’essai avec la méthode d’essai.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 762
 
Substance d’essai: concentration nominale  
19. Dans la mesure du possible, la concentration nominale dans la chambre 
d’exposition est calculée et enregistrée. La concentration nominale est la masse de la substance d’essai divisée par le volume d’air total qui passe 
dans le circuit de la chambre d’inhalation. La concentration nominale ne sert 
pas à caractériser l’exposition des animaux, mais une comparaison de la concentration nominale avec la concentration réelle donne une indication de la capacité de production du système d’essai, et peut donc permettre 
de mettre en évidence des problèmes de production.
 
Substance d’essai: concentration réelle  
20. La concentration réelle est la concentration de la substance d’essai dans la 
zone de la chambre d’inhalation où les animaux respirent. Les concentra ­
tions réelles peuvent être obtenues par des méthodes spécifiques (par exem ­
ple, échantillonnage direct, méthodes d’adsorption ou de réaction chimique, 
et caractérisation analytique ultérieure) ou par des méthodes non spécifiques 
comme la gravimétrie sur filtre. Le recours à l’analyse gravimétrique n’est acceptable que pour des aérosols ne contenant qu’un seul composant en poudre ou pour des aérosols de liquides peu volatils, et des caractérisations 
spécifiques à la substance d’essai sont également effectuées par une pré- 
étude appropriée. Il est aussi possible d’avoir recours à la gravimétrie pour déterminer la concentration d’un aérosol contenant plusieurs composants en poudre, mais des données analytiques sont alors nécessaires, afin de démon ­
trer que la composition du produit en suspension dans l’air est analogue à 
celle du produit de départ. Faute de cette information, il peut s’avérer nécessaire de soumettre la substance d’essai (idéalement en suspension dans l’air) à une nouvelle analyse à intervalles réguliers tout au long de 
l’étude. Pour des agents aérosolisés susceptibles de s’évaporer ou de se 
sublimer, il faut démontrer que toutes les phases ont été recueillies selon la méthode choisie. Les concentrations cibles, nominales et réelles sont fournies dans le rapport d’étude, mais seules les concentrations réelles 
sont utilisées dans les analyses statistiques pour calculer la valeur des 
concentrations létales.
 
21. Il est recommandé de n’employer si possible qu’un seul lot de la substance 
d’essai, et l’échantillon de la substance est conservé dans des conditions 
préservant sa pureté, son homogénéité et sa stabilité. Avant le début de 
l’étude, il convient de réaliser une caractérisation de la substance d’essai afin de déterminer sa pureté et, si cela est techniquement possible, son identité et les quantités de contaminants et d’impuretés identifiés. Pour 
cela, on pourra recueillir les données suivantes: temps de rétention et 
surface relative du pic, poids moléculaire obtenu par spectroscopie de masse ou chromatographie en phase gazeuse, ou autres estimations. Bien que le laboratoire d’essai ne soit pas responsable de l’identification de la 
substance d’essai, il peut, par prudence, confirmer au moins une partie des 
caractéristiques fournies par le donneur d’ordre (couleur, nature physique, etc.).
 
22. L’atmosphère d’exposition est maintenue aussi constante que possible, et 
suivie soit en continu, soit par intermittence en fonction de la méthode 
d’analyse. Lorsque l’injection s’effectue de façon intermittente, les échan ­
tillons d’atmosphère de la chambre sont prélevés au moins deux fois sur une étude de quatre heures. En cas d’impossibilité en raison de débits d’air limités ou de faibles concentrations, le recueil d’un échantillon pour toute 
la période d’exposition est acceptable. Si des fluctuations nettes apparaissent 
d’un échantillon à un autre, la prochaine concentration d’essai devra utiliser quatre échantillons par exposition. Les écarts entre la concentration dans chaque chambre et la concentration moyenne n’excèdent pas ± 10 % pour 
les gaz et vapeurs et ± 20 % pour les aérosols liquides ou solides. Il 
convient de calculer et de noter le temps d’équilibre dans la chambre d’ex ­
position (t
 95 ). La durée d’une exposition couvre le temps de production de la 
substance d’essai, y compris le temps nécessaire pour l’égalisation des 
concentrations dans la chambre d’exposition t  95 . Des indications pour l’es ­
timation de t  95 sont fournies dans le document d’orientation 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 763
 
23. Pour des mélanges très complexes constitués de gaz ou vapeurs et d’aérosols 
(atmosphères de combustion ou substances d’essai propulsées à partir de 
produits/dispositifs spécialisés, par exemple), chaque phase peut se comporter différemment dans la chambre d’inhalation. Pour chacune des phases (gaz ou vapeur et aérosol), on choisira donc au moins une substance 
indicatrice (analyte), en général le principe actif du mélange. Quand la 
substance d’essai est un mélange, la concentration analytique devra être indiquée pour le mélange global et pas uniquement pour le principe actif ou le composant (analyte). Pour plus d’informations sur les concentrations 
réelles, se reporter au document d’orientation 39 (8).
 
Substance d’essai: répartition granulométrique  
24. La répartition granulométrique des aérosols est déterminée au minimum 
deux fois pour chaque exposition de 4 heures, à l’aide d’un impacteur en 
cascade ou d’un autre instrument, comme un spectromètre de mesure de la taille des particules aérodynamiques. Si les résultats obtenus avec l’impac ­
teur en cascade ou un autre instrument se révèlent équivalents, ce dernier 
peut être utilisé tout au long de l’étude. Pour confirmer la capacité de recueil 
des particules de l’outil principal, un second instrument devra être utilisé en parallèle, par exemple un filtre gravimétrique ou un barboteur à gaz/impac ­
teur. La concentration massique obtenue par l’analyse granulométrique se 
rapproche, dans des limites raisonnables, de celle obtenue par l’analyse sur filtre, voir document d’orientation 39 (8). Si cette équivalence est établie au début de la phase d’étude, il n’est pas nécessaire d’effectuer des mesures de 
confirmation dans la suite de l’étude. Pour le bien-être des animaux, il 
convient de réduire au minimum les données douteuses qui nécessiteraient de répéter une exposition. Une répartition granulométrique est effectuée dans le cas des vapeurs, s’il est possible qu’une condensation de la vapeur 
conduise à la formation d’un aérosol, ou si des particules sont détectées 
dans une atmosphère de vapeur susceptible de présenter des phases mixtes (voir paragraphe 14).
 
MODE OPÉRATOIRE  
Essai principal  
25. Pour chaque étape, trois animaux de chaque sexe, ou six animaux du sexe le 
plus sensible à la substance d’essai, seront utilisés. Si des espèces de rongeurs autres que le rat sont exposées «nez seul», il est possible d’ajuster la durée maximale d’exposition en fonction du stress propre à ces espèces. 
Le niveau de concentration à utiliser comme dose initiale est choisi parmi 
les quatre niveaux fixés; le niveau de concentration initiale est celui le plus susceptible de présenter une toxicité pour certains des animaux traités. Les schémas d’essai pour les gaz, les vapeurs et les aérosols (présentés dans les 
appendices 2 à 4) correspondent aux essais effectués aux valeurs limites des 
catégories 1 à 4 du règlement relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage (9), pour les gaz (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (appendice 2), pour les vapeurs (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (appendice 3) et pour les 
aérosols (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (appendice 4). La catégorie 5, que ne 
prévoit pas le règlement (CE) n
 o 1272/2008 (9), se rapporte à des concen ­
trations dépassant les concentrations limites respectives. Chacune des concentrations de départ possède son propre schéma d’essai. En fonction 
du nombre d’animaux morts ou euthanasiés, le mode opératoire d’essai suit 
les flèches indiquées jusqu’à ce qu’une catégorisation puisse être établie.
 
26. L’intervalle de temps entre l’exposition des différents groupes est déterminé 
par le moment d’apparition, la durée et la gravité des signes de toxicité 
observés. L’exposition des animaux au niveau de concentration supérieur est 
retardée jusqu’à ce que l’on soit raisonnablement sûr que les animaux précédemment soumis au traitement ont survécu. Il est recommandé d’es ­
pacer de trois à quatre jours les expositions à chaque niveau de concen ­
tration afin de permettre l’observation d’une toxicité retardée. L’intervalle de 
temps peut être ajusté, par exemple en cas de réponses peu concluantes.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 764
 
Essai limite  
27. L’essai limite est utilisé si l’on sait ou si l’on prévoit que la substance 
d’essai sera virtuellement non toxique, c'est-à-dire qu’elle ne suscitera une réponse de toxicité qu’au-delà de la concentration limite réglementaire. Des 
informations sur la toxicité de la substance d’essai peuvent être tirées d’es ­
sais déjà pratiqués sur des substances ou mélanges analogues, en tenant compte de l’identité et du pourcentage des composants dont la toxicité est avérée. Si l’on manque d’informations sur la toxicité de la substance d’essai, 
ou si l’on s’attend à ce qu’elle soit toxique, l’essai principal est réalisé; 
le document d’orientation 39 fournit de plus amples informations à ce sujet (8).
 
28. Selon le mode opératoire normal, trois animaux par sexe, ou six animaux du 
sexe le plus sensible à la substance d’essai, sont exposés à des concentra ­
tions de 20 000 ppm pour les gaz, 20 mg/l pour les vapeurs et 5 mg/l pour 
les poussières/brouillards. Si elles sont atteintes, ces concentrations servent 
de limite d’essai pour la présente méthode d’essai. Pour les essais d’aéro ­
sols, le principal objectif est d’atteindre une taille de particule qui soit respirable (c’est-à-dire un DAMM de 1 à 4 μm), ce qui est possible avec 
la plupart des substances d’essai à des concentrations de 2 mg/l. Les essais 
sur des aérosols à des concentrations supérieures à 2 mg/l ne sont tentés que si l’on peut obtenir des particules de taille respirable, voir document d’orien ­
tation 39 (8). Selon le SGH (16), il est déconseillé de réaliser des essais 
au-delà des concentrations limites, pour des raisons de bien-être des 
animaux. Les essais en catégorie 5 du SGH (16), non prévue par le règlement (CE) n
 o 1272/2008 (9), ne sont envisagés que s’il est très 
probable que leurs résultats présenteront un intérêt direct pour la protection 
de la santé humaine, et une justification est alors fournie dans le rapport 
d’essai. En cas de substance potentiellement explosive, on prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de provoquer une explosion. Afin d’éviter le recours inutile à des animaux, un essai sans animaux est effectué 
avant l’essai limite pour s’assurer qu’il est possible d’atteindre dans la 
chambre les conditions expérimentales d’un essai limite.
 
OBSERVATIONS  
29. Un examen clinique des animaux est pratiqué régulièrement pendant la 
période d’exposition. Après l’exposition, des examens cliniques sont réalisés 
au minimum deux fois le jour de l’exposition, ou plus fréquemment suivant 
la réponse des animaux au traitement, et au minimum une fois par jour par la suite pendant une période de 14 jours. La durée de la période d’obser ­
vation n’est pas fixée, mais est déterminée par la nature et le moment 
d’apparition des signes cliniques, ainsi que par la durée de la période de 
récupération. Les moments d’apparition et de disparition des signes de toxicité sont importants, en particulier lorsque les signes de toxicité ont tendance à être retardés. Toutes les observations sont systématiquement 
enregistrées individuellement pour chaque animal. Les animaux moribonds 
ou présentant des signes de souffrance manifeste ou de détresse sévère et persistante sont euthanasiés pour des raisons de bien-être animal. Lors de l’examen clinique des signes de toxicité, il convient de veiller à ne pas 
confondre une piètre apparence initiale et des troubles respiratoires 
passagers, imputables à la procédure d’exposition, avec les effets liés au traitement. Les principes et critères résumés dans le document d’orientation sur les effets mesurés éthiquement acceptables sont pris en considération (7). 
Quand des animaux sont retrouvés morts ou sont euthanasiés, l’heure de la 
mort est consignée le plus précisément possible.
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30. Les observations quotidiennes portent notamment sur les modifications de la 
peau et des poils, des yeux et des muqueuses, mais aussi sur les change ­
ments affectant l’appareil respiratoire, le système circulatoire, les systèmes nerveux autonome et central, ainsi que l’activité somatomotrice et le comportement. Toute différentiation entre les effets locaux et systémiques 
est consignée autant que possible. Les tremblements, les convulsions, la 
salivation, les diarrhées, la léthargie, le sommeil et le coma doivent retenir l’attention. La mesure de la température rectale peut aider à mettre en évidence une bradypnée réflexe ou une hypo/hyperthermie liée au trai ­
tement ou au confinement.
 
Poids corporel  
31. Le poids corporel de chacun des animaux est enregistré une fois lors de la 
période d’acclimatation, le jour de l’exposition (jour 0) juste avant celle-ci, et au moins les jours 1, 3 et 7 (puis de façon hebdomadaire par la suite) ainsi qu’au moment de la mort ou de l’euthanasie, s’il est postérieur au jour 
1. Le poids corporel est un indicateur critique reconnu de la toxicité, on 
surveillera donc attentivement les animaux, dont le poids reste constamment inférieur de 20 % ou plus à celui précédant l’étude. Les animaux survivants sont pesés et euthanasiés à la fin de la période postexposition.
 
Pathologie  
32. Tous les animaux d’expérience, y compris ceux morts au cours de l’essai ou 
euthanasiés et écartés de l’étude pour des raisons de bien-être animal, subis ­
sent une autopsie macroscopique. Lorsqu’un animal est découvert mort et que son autopsie n’est pas réalisable immédiatement, l’animal est réfrigéré 
(mais non congelé) à une température suffisamment basse pour minimiser 
l’autolyse. Les autopsies sont réalisées le plus tôt possible, en général dans un délai d’un à deux jours. Tous les changements macropathologiques sont enregistrés pour chaque animal en prêtant particulièrement attention aux 
voies respiratoires.
 
33. D’autres observations, ajoutées a priori à dessein, peuvent être envisagées 
afin d’élargir l’interprétation de l’étude, comme la mesure du poids pulmo ­
naire des rats survivants et/ou la mise en évidence d’une irritation par 
examen de l’appareil respiratoire au microscope. Les organes examinés peuvent être ceux pour lesquels une réaction au traitement est connue ou attendue et ceux montrant une pathologie macroscopique chez les animaux 
survivant au moins 24 heures. Un examen microscopique de l’intégralité de 
l’appareil respiratoire peut fournir des informations utiles pour les subs ­
tances d’essai réactives à l’eau, comme les acides et les substances hygro ­
scopiques.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Résultats  
34. Pour chacun des animaux, le poids corporel et les conclusions de l’autopsie 
sont fournis. Les résultats des observations cliniques sont résumés sous la 
forme de tableaux et indiquer pour chaque groupe d’essai: le nombre d’ani ­
maux utilisés, le nombre d’animaux présentant des signes spécifiques de toxicité, le nombre d’animaux retrouvés morts au cours de l’essai ou eutha ­
nasiés, l’heure de la mort de chacun des animaux, la description et l’évo ­
lution dans le temps des effets toxiques ainsi que leur réversibilité, et les 
conclusions de l’autopsie.
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Rapport d’essai  
35. Le rapport d’essai contient, s’il y a lieu, les renseignements suivants:  
Animaux d’expérience et conditions d’élevage:  
— description des conditions d’encagement, y compris: nombre (ou évolu ­
tion du nombre) d’animaux par cage, matériel de litière, température 
ambiante et taux d’humidité relative, photopériode et identification du régime alimentaire,
 
— espèces/souches utilisées et justification éventuelle de l’utilisation d’une 
espèce autre que le rat,  
— nombre, âge et sexe des animaux,  
— méthode de randomisation,  
— détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau (notamment origine/type 
de régime alimentaire, origine de l’eau),  
— description d’un éventuel conditionnement préalable à l’essai, tel que 
régime alimentaire, quarantaine ou traitement de maladie.  
Substance d’essai:  
— nature physique, pureté et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (y 
compris isomérisation),  
— données d’identification et numéro CAS (Chemical Abstract Services) 
s’il est connu.  
Véhicule:  
— justification de l’emploi d’un véhicule et justification de son choix (s’il 
ne s’agit pas de l’eau),  
— données historiques ou concordantes démontrant que le véhicule n’inter ­
fère pas avec les résultats de l’étude.  
Chambre d’inhalation:  
— description de la chambre d’inhalation avec ses dimensions et son 
volume,  
— source et description de l’équipement utilisé pour l’exposition des 
animaux et pour la production de l’atmosphère,  
— équipement utilisé pour mesurer la température, l’humidité, la granulo ­
métrie et la concentration réelle,  
— source d’air, traitement de l’air fourni/évacué et système de climatisation 
utilisé,  
— méthodes utilisées pour étalonner l’équipement afin d’assurer l’homogé ­
néité de l’atmosphère d’essai,  
— différence de pression (positive ou négative),  
— orifices d’exposition par chambre («nez seul») ou emplacement des 
animaux dans le système («corps entier»),  
— homogénéité/stabilité temporelle de l’atmosphère d’essai,  
— situation des capteurs thermiques et hygrométriques et échantillonnage 
de l’atmosphère d’essai dans la chambre d’exposition,  
— débits d’air, débit d’air/orifice d’exposition («nez seul») ou rapport du 
volume de l’animal à la chambre («corps entier»),  
— informations sur l’équipement utilisé, le cas échéant, pour mesurer l’oxy ­
gène et le dioxyde de carbone,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 767
 
— temps nécessaire pour atteindre l’équilibre dans la chambre d’exposition 
(t 95 ), 
— nombre de changements de volume par heure,  
— doseurs (s’il y en a).  
Données concernant l’exposition:  
— justification du choix de la concentration cible dans l’étude principale,  
— concentrations nominales (masse totale de substance d’essai produite 
dans la chambre d’inhalation, divisée par le volume d’air traversant la 
chambre),  
— concentrations réelles de la substance d’essai obtenues dans la zone où 
respirent les animaux; pour les mélanges à tester produisant des formes 
physiques hétérogènes (gaz, vapeurs, aérosols), chacun des constituants peut être analysé séparément,
 
— toutes les concentrations atmosphériques sont rapportées en unités de 
masse (mg/l, mg/m  3 , etc.); les unités de volume (ppm, ppb) peuvent 
aussi être indiquées entre parenthèses,  
— répartition granulométrique des particules, diamètre aérodynamique 
médian de masse (DAMM) et écart type géométrique ( σ g ), ainsi que 
leur méthode de calcul. Les autres analyses de la taille de particules 
sont consignées.  
Conditions expérimentales  
— détails sur la préparation de la substance d’essai, y compris sur les 
procédures utilisées pour réduire la taille des particules des substances solides ou pour préparer les solutions de la substance d’essai. Lorsque des procédés mécaniques sont susceptibles d’avoir altéré la composition 
de la substance d’essai, inclure les résultats des analyses effectuées pour 
vérifier la composition de la substance d’essai,
 
— description (si possible avec schéma) de l’équipement utilisé pour 
produire l’atmosphère d’essai et pour exposer les animaux à celle-ci,  
— détails sur la méthode de chimie analytique utilisée et la méthode de 
validation (notamment rendement de récupération de la substance d’essai 
à partir du milieu d’échantillonnage),  
— justification du choix des concentrations d’essai.  
Résultats:  
— tableau présentant la température, le taux d’humidité et le débit d’air 
dans la chambre d’inhalation,  
— tableau de données sur les concentrations nominales et réelles dans la 
chambre d’inhalation,  
— tableau de données sur la taille des particules, notamment données 
analytiques sur le prélèvement d’échantillons, la répartition granulomé ­
trique et les calculs du DAMM et de σ g , 
— tableau de données sur les réponses et le niveau de concentration pour 
chaque animal (c’est-à-dire nombre d’animaux montrant des signes de 
toxicité, y compris de mortalité, et nature, sévérité et durée des effets),  
— poids corporel de chacun des animaux enregistrés lors de l’essai, date et 
heure de leur mort si celle-ci intervient avant l’euthanasie prévue; 
moment d’apparition et évolution des signes de toxicité et, le cas 
échéant, leur réversibilité,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 768
 
— pour chaque animal, résultats de l’autopsie et observations histopatholo ­
giques disponibles,  
— classement dans les catégories du règlement (CE) n  o 1272/2008 et valeur 
limite de la CL  50 . 
Discussion et interprétation des résultats:  
— un effort particulier est consacré à la description des méthodes utilisées 
pour répondre aux critères de la présente méthode d’essai, par exemple 
en ce qui concerne la concentration limite ou la taille des particules,  
— la respirabilité des particules est abordée à la lumière des résultats d’en ­
semble, en particulier si les critères de taille des particules n’ont pu être 
remplis,  
— la cohérence des méthodes utilisées pour déterminer les concentrations 
nominales et réelles, et la relation entre la concentration réelle et la concentration nominale, sont incluses dans l’appréciation d’ensemble 
de l’étude,
 
— la cause probable de la mort et le mode d’action prédominant (sys ­
témique ou local) sont abordés,  
— une explication est apportée s’il a fallu euthanasier des animaux qui 
souffraient ou montraient des signes de détresse sévère et persistante, en se basant sur les critères du document d’orientation de l’OCDE sur 
les effets mesurés éthiquement acceptables (7).
 
BIBLIOGRAPHIE:  
(1) Chapitre B.2 de la présente annexe, Toxicité aiguë (inhalation).  
(2) Holzhütter H.-G., Genschow E., Diener W., and Schlede E. (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biome ­
tric Évaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. 
Toxicol.  77: 243-254.  
(3) Diener W., Kayser D. and Schlede E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Évaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
(4) Diener W. and Schlede E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
(5) Chapitre B.1  ter de la présente annexe, Toxicité orale aiguë — méthode de 
la classe de toxicité aiguë.  
(6) OCDE (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur 
les essais et évaluations n
 o 105, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet 
(http://www.oecd.org/env/testguidelines).  
(7) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Évaluation. Publications Hygiène et Sécurité de l’environ ­
nement – Série sur les essais et évaluations n  o 19, OCDE, Paris. Disponible 
sur l'internet (http://www.oecd.org/env/testguidelines).  
(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Publications Hygiène et Sécurité de l’environnement – Série sur les essais et évaluations n
 o 39, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet 
(http://www.oecd.org/env/testguidelines).  
(9) Règlement (CE) n  o 1272/2008 du Parlement européen et du Conseil du 
16 décembre 2008 relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges, modifiant et abrogeant les directives 
67/548/CEE et 1999/45/CE et modifiant le règlement (CE) n
 o 1907/2006 
(JO L 353 du 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 769
 
(10) Chapitre B.40 de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: essai de 
résistance électrique transcutanée (RET).  
(11) Chapitre B.40  bis de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: essai 
sur modèle de peau humaine.  
(12) OCDE (2005). Méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité pour la 
corrosion cutanée. Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques n
 o 435, OCDE, Paris. Disponible sur l'internet (http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines).  
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321-327.  
(15) Pauluhn J. and Thiel A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167
 
(16) Nations unies (2007), Système général harmonisé de classification et d’éti ­
quetage des produits chimiques (SGH), ST/SG/AC.10/30, Nations unies, 
New York et Genève. Disponible sur l'internet (http://www.unece.org/trans/ danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html).
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 770
 
Appendice 1  
DÉFINITION  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 771
 
Appendice 2  
Procédure à suivre pour chacune des concentrations initiales dans le cas des 
gaz (ppm/4 h)  
Remarques générales (  1 ) 
Pour chaque concentration initiale, les schémas d’essai figurant dans le présent 
appendice indiquent la procédure à suivre.  
Appendice 2 bis: concentration initiale de 100 ppm.  
Appendice 2 ter: concentration initiale de 500 ppm.  
Appendice 2 quater: concentration initiale de 2 500 ppm.  
Appendice 2 quinquies: concentration initiale de 20 000 ppm.  
Selon le nombre d’animaux morts ou euthanasiés, la procédure d’essai se pour ­
suit en suivant les flèches indiquées.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 772  
( 1 ) Les tableaux ci-après renvoient au système général harmonisé de classification et d’éti ­
quetage des produits chimiques (SGH). L’équivalent de ce système au sein de l’Union 
européenne est le règlement (CE) n  o 1272/2008. Dans le cas de la toxicité aiguë par 
inhalation, le règlement (CE) n  o 1272/2008 (9) ne prévoit pas la catégorie 5.
 Appendice 2 bis  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d’essai avec une concentration initiale de 100 ppm/4 h pour les 
gaz
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 773
 
Appendice 2 ter  
Toxicité aiguë par inhalation:  
procédure d'essai avec une concentration initiale de 500 ppm/4h pour les 
gaz
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 774
 
Appendice 2 quater  
Toxicité aiguë par inhalation:  
procédure d'essai avec une concentration initiale de 2 500 ppm/4h pour les 
gaz
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 775
 
Appendice 2 quinquies  
Toxicité aiguë par inhalation:  
procédure d'essai avec une concentration initiale de 20 000 ppm/4h pour les gaz
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 776
 
Appendice 3  
Procédure à suivre pour chacune des concentrations initiales dans le cas des 
vapeurs (mg/l/4 h)  
Remarques générales (  1 ) 
Pour chaque concentration initiale, les schémas d’essai figurant dans le présent 
appendice indiquent la procédure à suivre.  
Appendice 3  bis: concentration initiale de 0,5 mg/l.  
Appendice 3  ter: concentration initiale de 2,0 mg/l.  
Appendice 3  quater : concentration initiale de 10 mg/l.  
Appendice 3  quinquies : concentration initiale de 20 mg/l.  
Selon le nombre d’animaux morts ou euthanasiés, la procédure d’essai se pour ­
suit en suivant les flèches indiquées.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 777  
( 1 ) Les tableaux ci-après renvoient au système général harmonisé de classification et d’éti ­
quetage des produits chimiques (SGH). L’équivalent de ce système au sein de l’Union 
européenne est le règlement (CE) n  o 1272/2008. Dans le cas de la toxicité aiguë par 
inhalation, le règlement (CE) n  o 1272/2008 (9) ne prévoit pas la catégorie 5.
 Appendice 3 bis  
Toxicité aiguë par inhalation:  
procédure d'essai avec une concentration initiale de 0,5 mg/l/4h pour les vapeurs
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 778
 
Appendice 3 ter  
Toxicité aiguë par inhalation:  
procédure d'essai avec une concentration initiale de 2 mg/l/4h pour les vapeurs
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 779
 
Appendice 3 quater  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d'essai avec une concentration initiale de 10 mg/l/4h pour les vapeurs
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 780
 
Appendice 3 quinquies  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d'essai avec une concentration initialede 20 mg/l/4h pour les vapeurs
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 781
 
Appendice 4  
Procédure à suivre pour chacune des concentrations initiales dans le cas des 
aérosols (mg/l/4 h)  
Remarques générales (  1 ) 
Pour chaque concentration initiale, les schémas d’essai figurant dans le présent 
appendice indiquent la procédure à suivre.  
Appendice 4  bis: concentration initiale de 0,05 mg/l.  
Appendice 4  ter: concentration initiale de 0,5 mg/l.  
Appendice 4  quater : concentration initiale de 1 mg/l.  
Appendice 4  quinquies : concentration initiale de 5 mg/l.  
Selon le nombre d’animaux morts ou euthanasiés, la procédure d’essai se pour ­
suit en suivant les flèches indiquées.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 782  
( 1 ) Les tableaux ci-après renvoient au système général harmonisé de classification et d’éti ­
quetage des produits chimiques (SGH). L’équivalent de ce système au sein de l’Union 
européenne est le règlement (CE) n  o 1272/2008. Dans le cas de la toxicité aiguë par 
inhalation, le règlement (CE) n  o 1272/2008 (9) ne prévoit pas la catégorie 5.
 Appendice 4 bis  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d'essai avec une concentration initiale de 0.05 mg/l/4h pour les 
vapeurs
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 783
 
Appendice 4 ter  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d’essai avec une concentration initiale de 0,5 mg/l/4h pour les 
aérosols
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 784
 
Appendice 4 quater  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d’essai avec une concentration initiale de 1 mg/l/4h pour les 
aérosols
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 785
 
Appendice 4 quinquies  
Toxicité aiguë par inhalation:  
Procédure d'essai avec une concentration initiale de 5 mg/l/4h pour les 
aérosols
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 786
 
PARTIE C: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE L'ÉCOTOXICITÉ  
TABLE DES MATIÈRES 
C.1. TOXICITÉ AIGUË VIS-À-VIS DES POISSONS 
C.2. DAPHNIA  SP., ESSAI D'IMMOBILISATION IMMÉDIATE 
C.3. ALGUES D'EAU DOUCE ET CYANOBACTÉRIES, ESSAI 
D'INHIBITION DE LA CROISSANCE 
C.4. DÉTERMINATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ «FACILE» 
PARTIE I. GÉNÉRALITÉS 
PARTIE II. ESSAI DE DISPARITION DU COD (Méthode C.4-A) PARTIE III. ESSAI DE SCREENING MODIFIÉ DE L'OCDE (Méthode 
C.4-B) 
PARTIE IV. ESSAI DE DÉGAGEMENT DE CO
 2 (Méthode C.4-C) 
PARTIE V. ESSAI DE RESPIROMÉTRIE MANOMÉTRIQUE (Méthode 
C.4-D) 
PARTIE VI. ESSAI EN FIOLES FERMÉES (Méthode C.4-E) PARTIEVII ­
. ESSAI MITI (Méthode C.4-F) 
C.5 DÉGRADATION — DEMANDE BIOCHIMIQUE EN 
OXYGÈNE 
C.6. DÉGRADATION — DEMANDE CHIMIQUE EN OXYGÈNE C.7. DÉGRADATION — DÉGRADATION ABIOTIQUE: HYDRO ­
LYSE EN FONCTION DU PH 
C. 8. TOXICITÉ POUR LES VERS DE TERRE C. 9. BIODÉGRADATION — ESSAI DE ZAHN ET WELLENS C. 10. ESSAI DE SIMULATION – TRAITEMENT AÉROBIE DES 
EAUX USÉES: C.10-A: UNITÉS DE TRAITEMENT PAR BOUES ACTIVÉES – C.10-B: BIOFILMS 
C.11. BIODÉGRADATION — BOUES ACTIVÉES: ESSAI D'INHIBI ­
TION DE LA RESPIRATION 
C. 12. BIODÉGRADATION — TEST S.C.A.S. MODIFIÉ C.13 BIOCONCENTRATION: ESSAI AVEC RENOUVELLEMENT 
CONTINU SUR LES POISSONS 
C. 14. POISSON, ESSAI SUR LA CROISSANCE DES JUVÉNILES 
C. 15. POISSON, ESSAI DE TOXICITÉ À COURT TERME AUX 
STADES DE L'EMBRYON ET DE L'ALEVIN 
C.16. ABEILLE DOMESTIQUE — ESSAI DE TOXICITÉ AIGUË 
PAR VOIE ORALE 
C.17. ABEILLE DOMESTIQUE — ESSAI DE TOXICITÉ AIGUË 
PAR CONTACT 
C. 18. DÉTERMINATION DE L'ADSORPTION/DÉSORPTION AU 
MOYEN DE LA MÉTHODE PAR AGITATION
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 787
 
C. 19. ESTIMATION DU COEFFICIENT D'ADSORPTION (K  OC ) SUR 
LE SOL ET LES BOUES D'ÉPURATION PAR CHROMATO ­
GRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) 
C.20  DAPHNIA MAGNA,  ESSAI DE REPRODUCTION 
C.21. MICRO-ORGANISMES DU SOL: ESSAI DE TRANSFORMA ­
TION DE L'AZOTE 
C.22. MICRO-ORGANISMES DU SOL: ESSAI DE TRANSFORMA ­
TION DU CARBONE 
C.23. TRANSFORMATION AÉROBIE ET ANAÉROBIE DANS LE 
SOL 
C.24. TRANSFORMATION AÉROBIE ET ANAÉROBIE DANS LES 
SYSTÈMES SÉDIMENTAIRES AQUATIQUES 
C.25. MINÉRALISATION AÉROBIE DANS LES EAUX SUPER ­
FICIELLES — ESSAI DE SIMULATION DE LA BIODÉGRA ­
DATION 
C.26.  LEMNA  SP. ESSAI D’INHIBITION DE LA CROISSANCE  
▼M4 
C.27. ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN 
SYSTÉME EAU-SÉDIMENT DOPÉ 
C.28. ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN 
SYSTÈME EAU CHARGÉE-SÉDIMENT 
C.29. BIODÉGRADABILITÉ FACILE – DÉGAGEMENT DE CO  2 
DANS DES FLACONS HERMÉTIQUEMENT CLOS (ESSAI 
DE L’ESPACE DE TÊTE AU-DESSUS DU LIQUIDE) 
C.30. BIOACCUMULATION CHEZ LES OLIGOCHÈTES TERRES ­
TRES  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 788
 
C.1. TOXICITÉ AIGUË VIS-À-VIS DES POISSONS  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Cet essai a pour objet de déterminer la toxicité aiguë létale d'une 
substance vis-à-vis des poissons en eau douce. Dans la mesure du 
possible, il est souhaitable de disposer d'informations sur l'hydroso ­
lubilité, la pression de vapeur, la stabilité chimique, les constantes de dissociation et la biodégradabilité de la substance d'essai en vue du 
choix de la méthode d'essai la plus appropriée (statique, semi- 
statique ou dynamique), permettant d'assurer des concentrations constantes satisfaisantes de la substance d'essai pendant la période 
expérimentale.
 
Des informations supplémentaires (par exemple, la formule dévelop ­
pée, le degré de pureté, la nature et le pourcentage des impuretés 
significatives, la présence et la quantité d'additifs, le coefficient de partage n-octanol/eau) doivent être prises en considération lors de la conception de l'essai et de l'interprétation des résultats.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La toxicité aiguë est l'effet préjudiciable et observable provoqué dans 
un organisme pendant une courte durée (jours) d'exposition à une 
substance donnée. Dans le présent essai, la toxicité aiguë est 
exprimée comme la concentration létale médiane (CL  50 ), c'est-à- 
dire la concentration qui, dans l'eau, est responsable de la mort de 50 % des poissons d'un lot soumis aux essais pendant une période 
d'exposition continue qui est à indiquer.
 
Toutes les concentrations de la substance d'essai sont indiquées en 
poids par volume (mg/l). Elles peuvent également être exprimées en poids par poids (mg/kg
 -1 ). 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
On pourra soumettre à essai une substance de référence afin de 
démontrer que, dans les conditions d'essai en laboratoire, la réponse de l'espèce utilisée pour l'essai n'a pas varié de façon signi ­
ficative.
 
Aucune substance de référence n'est indiquée pour cet essai.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Un essai limite peut être effectué à 100 mg/l afin de démontrer que 
la CL  50 est supérieure à cette concentration.  
Les poissons sont exposés à la substance d'essai ajoutée à l'eau, dans 
une série de concentrations pendant une période de 96 heures. Les 
mortalités sont notées au moins toutes les 24 heures et les concen ­
trations responsables de la mort de 50 % des poissons (CL  50 ) sont 
calculées si possible à chaque moment d'observation.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Les critères de qualité doivent s'appliquer à l'essai limite aussi bien 
qu'à l'essai complet.  
La mortalité des témoins ne doit pas dépasser 10 % (ou un poisson, 
si le nombre d'animaux utilisés pour l'essai est inférieur à 10) à la fin 
de l'essai.  
La concentration en oxygène doit être supérieure à 60 % de la 
concentration saturante pendant toute la durée de l'essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 789
 
La concentration de la substance d'essai sera maintenue au moins à 
80 % de la concentration initiale pendant toute la durée de l'essai.  
Pour les substances qui se dissolvent facilement dans le milieu 
d'essai et qui donnent des solutions stables, c'est-à-dire les substances 
qui ne se volatilisent pas, ne se dégradent pas, ne s'hydrolysent pas 
ou ne s'adsorbent pas en quantité significative, on peut considérer que la concentration initiale est la même que la concentration nomi ­
nale. Il faudra prouver que la concentration a été maintenue 
constante pendant la durée de l'essai et que les critères de qualité 
ont été respectés.
 
Pour les substances qui sont:  
i) peu solubles dans le milieu d'essai, ou  
ii) susceptibles de former des émulsions ou des dispersions stables, 
ou 
iii) instables en solution aqueuse,  
la concentration initiale retenue sera la concentration mesurée dans la 
solution (ou si cela s'avère techniquement impossible, mesurée dans la colonne d'eau) au début de l'essai. La concentration doit être mesurée après une période d'équilibrage mais avant l'introduction 
des organismes d'essai.
 
Dans tous les cas cités ci-dessus, il y a lieu d'effectuer des mesures 
supplémentaires au cours de l'essai pour confirmer les concentrations 
réelles d'exposition et que les critères de qualité ont été respectés.  
Le pH ne doit pas varier de plus d'une unité.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Trois types de systèmes peuvent être utilisés:  
Essai en statique:  
Essai de toxicité au cours duquel n'intervient pas de renouvellement 
de la solution à étudier (les solutions restent inchangées pendant toute la durée de l'essai.)
 
Essai en semi-statique:  
Essai sans renouvellement continu de la solution, mais avec un 
renouvellement régulier de la solution d'essai après des périodes prolongées (par exemple toutes les 24 heures).
 
Essai en dynamique:  
Essai de toxicité au cours duquel l'eau est constamment renouvelée 
dans les récipients d'essai, le produit chimique soumis à essai étant transporté par l'eau utilisée pour renouveler le milieu d'essai.
 
1.6.1.  Réactifs  
1.6.1.1.  Solutions de substance à tester  
Les solutions mères de concentration requise sont préparées par 
dissolution de la substance dans de l'eau désionisée, ou dans de l'eau répondant aux conditions fixées au point 1.6.1.2.
 
Les concentrations choisies pour l'essai sont préparées par dilution de 
la solution mère. Si l'on procède à des essais à concentrations 
élevées, la substance peut être dissoute directement dans l'eau de 
dilution.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 790
 
Les substances ne doivent normalement être testées que jusqu'à la 
limite de solubilité. Pour certaines substances (par exemple, les subs ­
tances qui sont peu hydrosolubles, ou qui ont un P  ow élevé, ou qui 
forment dans l'eau une dispersion stable plutôt qu'une véritable solu ­
tion), il est possible d'utiliser une concentration supérieure à la limite 
de solubilité de la substance pour être sûr que la concentration 
soluble/stable maximale a bien été atteinte. Il est toutefois important que cette concentration ne perturbe pas, par ailleurs, les conditions de l'essai (par exemple, formation d'un film de substance à la surface 
de l'eau empêchant l'oxygénation de l'eau, etc.).
 
Dans le cas de substances à faible hydrosolubilité, on peut avoir 
recours à la dispersion ultrasonique, à des solvants organiques, des 
émulsifiants ou des dispersants, pour préparer les solutions mères ou 
également pour faciliter la dispersion de ces substances dans le milieu d'essai. Quand des substances auxiliaires de ce type sont utilisées, toutes les concentrations d'essai doivent contenir la même 
quantité de substance auxiliaire, et un lot témoin supplémentaire de 
poissons doit être exposé à la même concentration de substance auxiliaire que celle qui est utilisée dans les séries d'essais. La concentration de tels auxiliaires doit être limitée et ne doit en 
aucun cas excéder 100 mg/l dans le milieu d'essai.
 
L'essai doit être effectué sans ajustement du pH. S'il apparaît un 
changement significatif du pH, il est souhaitable de répéter l'essai 
avec ajustement du pH et d'en consigner les résultats. Dans ce cas, la valeur du pH de la solution mère doit être ajustée à la valeur du pH de l'eau de dilution à moins que des raisons particulières ne s'y 
opposent. Pour ce faire, on utilisera de préférence HCl et NaOH. 
Cet ajustement doit être effectué de manière que la concentration de la substance d'essai dans la solution mère ne soit pas sensiblement modifiée. Si l'ajustement entraîne une réaction chimique ou une 
précipitation de la substance d'essai, il faut consigner ces observa ­
tions dans le procès-verbal.
 
1.6.1.2.  Eau d'élevage et de dilution  
On peut utiliser de l'eau potable (non contaminée par des concen ­
trations potentiellement nocives de chlore, de métaux lourds ou d'au ­
tres substances), de l'eau naturelle de bonne qualité ou de l'eau reconstituée (voir annexe 1). On utilisera de préférence des eaux dont la dureté totale est comprise entre 10 et 250 milligrammes 
par litre (en CaCO
 3 ), et dont le pH est compris entre 6,0 et 8,5.  
1.6.2.  Appareillage  
Tout l'appareillage doit être en matériau chimiquement inerte:  
— système de dilution automatique (pour essai en dynamique),  
— dispositif de mesure de l'oxygène,  
— équipement pour la détermination de la dureté de l'eau,  
— appareillage approprié pour le contrôle de la température,  
— pHmètre.  
1.6.3.  Poissons soumis à l'essai  
Les poissons doivent être en bonne santé et ne présenter aucune 
malformation apparente.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 791
 
Les espèces utilisées doivent être choisies sur la base de critères 
pratiques, tels que leur disponibilité toute l'année, leur facilité d'en ­
tretien, leur commodité pour l'essai, leur sensibilité relative aux produits chimiques et tous facteurs significatifs sur le plan écono ­
mique, biologique ou écologique. Dans le choix des espèces de pois ­
sons, il faut également prendre en considération la nécessité de 
pouvoir comparer les résultats et l'harmonisation internationale exis ­
tante (référence 1).
 
Une liste des espèces de poissons recommandées pour la réalisation 
de cet essai figure à l'annexe 2; le poisson zèbre et la truite arc-en- 
ciel sont les espèces à utiliser de préférence.  
1.6.3.1.  Élevage  
Les poissons soumis à l'essai doivent provenir de préférence d'un 
seul et même lot, dont les individus ont la même longueur et le même âge. Ils doivent être conservés pendant au moins 12 jours dans les conditions suivantes:
 
charge biologique:  
appropriée au système utilisé (avec recirculation ou en dynamique) et 
aux espèces de poissons,  
eau: 
voir point 1.6.1.2,  
lumière:  
photopériode de 12 à 16 heures par jour,  
concentration en oxygène dissous:  
au moins 80 % de la saturation en air,  
alimentation:  
quotidienne ou trois fois par semaine, avec arrêt de 24 heures avant 
le début de l'essai.  
1.6.3.2.  Mortalité  
Après une période d'adaptation de 48 heures, enregistrer les morts et 
appliquer les critères suivants:  
— mortalité en 7 jours supérieure à 10 % de la population:  
rejet de l'ensemble du lot,  
— mortalité en 7 jours comprise entre 5 et 10 % de la population:  
prolonger la période d'observation pendant 7 jours.  
Si l'on ne constate aucun autre cas de mortalité, le lot est accep ­
table, sinon, il doit être rejeté,  
— mortalité en 7 jours inférieure à 5 % de la population:  
acceptation du lot.  
1.6.4.  Adaptation  
Les poissons doivent être maintenus pendant au moins 7 jours avant 
leur utilisation dans les mêmes conditions que celles de l'essai (eau et 
température).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 792
 
1.6.5.  Mode opératoire  
Avant l'essai définitif, on pourra procéder à un essai visant à déter ­
miner l'intervalle de concentrations à utiliser lors de l'essai définitif.  
Procéder, en plus de la série d'essais, à un essai témoin sans subs ­
tance à étudier et, le cas échéant, à un essai témoin contenant le produit auxiliaire.
 
En fonction des propriétés physiques et chimiques de la substance à 
étudier, on choisira une méthode appropriée statique, semi-statique ou dynamique, qui réponde aux critères de qualité.
 
Les poissons sont exposés à la substance d'essai dans les conditions 
suivantes:  
— durée: 96 heures,  
— nombre d'animaux: au moins 7 par concentration,  
— récipients: d'une capacité appropriée, en fonction de la charge 
biologique recommandée,  
— charge biologique: charge maximale recommandée pour l'essai 
statique ou semi-statique: 1,0 gramme par litre; pour les essais dynamiques, une charge plus élevée peut être acceptable,
 
— concentrations d'essai: au moins cinq concentrations qui diffèrent 
d'un facteur constant n'excédant pas 2,2 et couvrent, dans la 
mesure du possible, l'intervalle de mortalité de 0 à 100 %,  
— eau: voir point 1.6.1.2,  
— lumière: photopériode de 12 à 16 heures par jour,  
— température: convenant à l'espèce choisie (annexe 2), mais 
constante à ± 1  o C près, quel que soit le système d'essai,  
— concentration en oxygène dissous: au moins 60 % de la concen ­
tration saturante en air à la température choisie,  
— nourriture: aucune.  
Les poissons sont examinés après les 2 à 4 premières heures et au 
moins à intervalles de 24 heures. Ils sont considérés comme morts si le fait de toucher le pédoncule caudal ne produit aucune réaction et 
si aucun mouvement respiratoire n'est visible. Les poissons morts 
sont éliminés à chaque observation et les mortalités enregistrées. Les anomalies visibles (par exemple, perte d'équilibre, perturbations au niveau de la nage, des fonctions respiratoires, de la pigmentation, 
etc.) seront consignées.
 
Les mesures du pH, de l'oxygène dissous et de la température 
doivent être effectuées quotidiennement.  
Essai limite  
Un essai limite peut être effectué à une concentration de 100 mg/l, 
en suivant les procédures décrites dans cette méthode d'essai, afin de 
montrer que la CL  50 est supérieure à cette concentration.  
Si la nature de la substance est telle qu'il est impossible d'obtenir une 
concentration de 100 mg/l dans l'eau d'essai, l'essai limite doit être effectué à une concentration égale à la solubilité de la substance (ou 
à la concentration maximale formant une dispersion stable) dans le 
milieu utilisé (voir également le point 1.6.1.1).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 793
 
L'essai limite doit être effectué avec 7 à 10 poissons, et avec un 
nombre identique dans le(s) lot(s) témoin(s). (Selon la théorie bino ­
miale, lorsque l'on utilise 10 poissons avec une mortalité nulle, il y a 99,9 % de chance que la CL
 50 soit supérieure à la concentration 
utilisée dans l'essai limite. Avec 7, 8 ou 9 poissons et une mortalité 
nulle, il y a 99 % de chance que la CL  50 soit supérieure à la 
concentration utilisée.)  
En cas de mortalité, il convient d'effectuer un essai complet. Si des 
effets sublétaux sont observés, ceux-ci doivent être consignés.  
2. ÉVALUATION DES DONNÉES  
Reporter, sur un papier log-probit, le pourcentage de mortalité pour 
chaque période d'exposition recommandée (24, 48, 72 et 96 heures) 
en fonction de la concentration.  
Pour chaque temps d'observation, estimer, lorsque cela est possible, 
la CL  50 et l'intervalle de confiance (p = 0,05) par les méthodes 
classiques; les valeurs obtenues doivent être arrondies à un ou deux (maximum) chiffres significatifs (exemples de nombres arrondis à deux chiffres: 170 pour 173,5; 0,13 pour 0,127; 1,2 pour 1,21).
 
Dans le cas où la pente de la courbe de pourcentage en fonction de 
la concentration est trop forte pour permettre de calculer la CL  50 , il 
suffit de procéder à une estimation graphique de cette valeur.  
Lorsque deux concentrations consécutives dans un rapport de 2,2 
donnent 0 et 100 % de mortalité, ces deux valeurs suffisent à indi ­
quer l'intervalle dans lequel se situe la CL  50 . 
Si l'on constate que la stabilité ou l'homogénéité de la substance 
d'essai ne peut pas être maintenue, cette observation doit être 
mentionnée et les résultats seront interprétés avec prudence.  
3. RÉSULTATS  
Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements 
suivants:  
— des informations sur les poissons soumis à essai (nom scienti ­
fique, souche, fournisseur, tout prétraitement, taille et nombre 
utilisé pour chaque concentration d'essai),  
— origine et principales caractéristiques de l'eau de dilution (pH, 
dureté, température),  
— dans le cas de substances faiblement hydrosolubles, méthode de 
préparation de la solution mère et de la solution d'essai,  
— concentration de tout produit auxiliaire,  
— liste des concentrations utilisées et toute information disponible 
sur la stabilité de la substance d'essai dans la solution d'essai à ces concentrations,
 
— si on procède à des analyses chimiques, méthodes utilisées et 
résultats,  
— éventuellement, résultats de l'essai limite,  
— motifs du choix et description détaillée de la méthode utilisée 
(par exemple système statique, semi-statique, taux d'administra ­
tion, taux de renouvellement, aération ou non, charge en poisson, 
etc.), ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 794
 
— description du matériel d'essai,  
— régime d'éclairement,  
— concentration en oxygène dissous, pH et température des solu ­
tions d'essai toutes les 24 heures,  
— preuves que les critères de qualité ont été respectés,  
— tableau contenant la mortalité cumulée pour chaque concentration 
et pour le témoin (et, au besoin, le témoin contenant la substance 
auxiliaire) à chaque temps d'observation recommandé,  
— représentation graphique du pourcentage de mortalité en fonction 
de la concentration à la fin de l'essai,  
— si possible, valeurs de la CL  50 pour chacun des temps d'obser ­
vation recommandés (avec l'intervalle de confiance à 95 %),  
— méthodes statistiques employées pour déterminer les valeurs de la 
CL 50 , 
— si une substance de référence est utilisée, les résultats obtenus,  
— la concentration d'essai la plus élevée qui ne cause pas de morta ­
lité pendant la durée de l'essai,  
— la concentration d'essai la plus basse qui cause une mortalité de 
100 % des poissons pendant la durée de l'essai.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) OCDE, Paris, 1981, ligne directrice n  o 203, décision du 
Conseil C(81) 30 final et mises à jours.  
(2) AFNOR — NFT 90-303, juin 1985 — Détermination de la 
toxicité aiguë d'une substance vis-à-vis du  Brachydanio rerio  
— Méthode statique et dynamique.  
(3) AFNOR — NFT 90-305, juin 1985 — Détermination de la 
toxicité aiguë d'une substance vis-à-vis du  Salmo gairdneri  — 
Méthode statique et dynamique.  
(4) ISO 7346/1/2 and/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan —  Teleostei, Cyprinidae).  
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- 
through method.  
(5) Eidgenôssisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungs ­
methoden — Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) 
und L(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata,  1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.  
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 795
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-Laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxiciry of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grund ­
lagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltche ­
mikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm. and Exp. Therap., 1949, vol 96, p. 99.
 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K, 1978.  
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, p. 793-821.
 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, p. 3-32.  
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hasard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. 
ASTM STP 634, 1977, p. 65-84.
 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W.A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 796
 
Annexe 1  
Eau reconstituée  
Exemple d'eau de dilution appropriée  
Tous les produits chimiques doivent être de qualité analytique.  
L'eau doit être une eau distillée de bonne qualité, ou de l'eau désionisée d'une 
conductivité inférieure à 5 μScm-1.  
L'appareillage pour la distillation de l'eau ne doit contenir aucun élément en 
cuivre.  
Solutions mères  
CaCl  2 . 2 H  2 O (chlorure de calcium dihydraté): 
dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre 11,76 g 
MgSO  4 . 7 H  2 O (sulfate de magnésium heptahydraté): 
dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre 4,93 g 
NaHCO  3 (hydrogénocarbonate de sodium): 
dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre 2,59 g 
KCI (chlorure de potassium): 
dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre 0,23 g  
Eau de dilution reconstituée  
Mélanger 25 ml de chacune des quatre solutions mères et compléter à 1 litre avec 
de l'eau.  
Aérer jusqu'à saturation en oxygène dissous 1qy.  
Le pH doit être de 7,8 ± 0,2.  
Si nécessaire, ajuster le pH avec NaOH (hydroxyde de sodium) ou HC1 (acide 
chlorhydrique).  
L'eau de dilution ainsi préparée est laissée au repos pendant environ 12 heures et 
ne doit pas être aérée ultérieurement.  
La somme des ions Ca et Mg dans cette solution est égale à 2,5 mmol/l. Le 
rapport des ions Ca:Mg est de 4:1, celui des ions Na:K de 10:1. L'alcalinité totale 
de cette solution est égale à 0,8 mmol/l.  
Les déviations éventuelles dans la préparation de l'eau de dilution ne doivent pas 
modifier la composition ou les propriétés de cette eau.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 797
 
Annexe 2  
Espèces de poissons recommandées pour l'essai  
Espèces recommandées Intervalles des 
températures 
d'essai recom ­
mandé (  o C) Longueur totale 
recommandée de 
l'animal soumis à 
l'essai (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Danio zébré 20 à 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Tête de boule 20 à 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae}  
(Linnaeus 1758) Carpe commune 20 à 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae) 
Cyprinodonti-dae  (Tomminck et Schlegel 
1850) Nedaka 20 à 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20 à 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  Rafinesque Linnaeus 1758) Crapet 
arlequin 20 à 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Truite arc-en-ciel 12 à 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
naeus 1758) Ide mélanote 20 à 24 6,0 ± 2,0  
Approvisionnement  
Les poissons mentionnés ci-dessus sont faciles à élever et/ou largement disponi ­
bles pendant toute l'année. Ils peuvent se reproduire et se développer soit dans des exploitations piscicoles, soit en laboratoire, dans des conditions sanitaires contrôlées. L'animal soumis à essai doit être sain et d'origine connue. Ces pois ­
sons sont disponibles partout dans le monde.
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Annexe 3  
Exemple de courbe de pourcentage de mortalité en fonction de la concentration  
Exemple de détermination de la CL  50 sur papier log-probit
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 799
 
C.2. DAPHNIA  SP., ESSAI D'IMMOBILISATION IMMÉDIATE  
1. MÉTHODE  
Cette méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice 202 (2004) 
de l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Cette méthode décrit un essai de toxicité aiguë visant à évaluer les 
effets des substances chimiques sur des daphnies. Les méthodes d'essai existantes ont été utilisées dans toute la mesure du possible (1) (2) (3).
 
1.2. DÉFINITIONS  
Les définitions suivantes sont utilisées aux fins de la présente 
méthode:  
CE 50 : estimation de la concentration capable d'immobiliser 50 % des 
daphnies après une période d'exposition définie. Si une autre défini ­
tion est utilisée, elle doit être indiquée avec sa référence.  
Immobilisation: les animaux incapables de nager au bout de 
15 secondes après agitation douce du récipient utilisé pour l'essai sont considérés comme immobiles (même s'ils sont toujours capables 
de bouger leurs antennes).
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
De jeunes daphnies, âgées de moins de 24 heures au début de l'essai, 
sont exposées à la substance d'essai à différentes concentrations pendant une période de 48 heures. L'immobilisation est enregistrée 
à 24 et à 48 heures, puis comparée à des valeurs de contrôle. Les 
résultats sont analysés pour calculer la CE
 50 à 48 heures (voir point 
1.2 pour les définitions). La détermination de la CE  50 à 24 heures est 
facultative.  
1.4. INFORMATION CONCERNANT LA SUBSTANCE D'ESSAI  
La solubilité dans l'eau et la pression de vapeur de la substance 
d'essai doivent être connues. De même, il faut disposer d'une méthode d'analyse fiable pour doser la substance dans les solutions d'essai dont le rendement de récupération et la limite de détermina ­
tion sont connus. Les informations utiles comprennent la formule 
structurale, la pureté de la substance, la stabilité dans l'eau ou à la lumière, le P
 oe et les résultats d'un essai de biodégradabilité immé ­
diate (voir méthode C.4).  
Remarque: Un document d'orientation (4) fournit des indications 
pour les substances qu'il est difficile de tester à cause de leurs propriétés physico-chimiques.
 
1.5. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Il est possible de déterminer la CE  50 d'une substance de référence, de 
manière à s'assurer que les conditions d'essai sont fiables. Les 
toxiques utilisés dans les essais tournants internationaux (1) (5) sont recommandés à cet effet (
 1 ). Les essais avec une substance de 
référence doivent être effectués de préférence tous les mois et au 
moins deux fois par an.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 800  
( 1 ) Les résultats de ces essais interlaboratoires, ainsi qu'un corrigendum technique à l'ISO 
6341, donnent une CE  50 24 h du dichromate de potassium (K  2 Cr 2 O 7 ) comprise entre 0,6 
mg/l et 1,7 mg/l.
 1.6. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Pour qu'un essai soit valide, les critères de performance suivants 
s'appliquent:  
— pas plus de 10 % des daphnies ne doivent être immobilisées dans 
le groupe témoin, y compris le témoin contenant l'agent solubi ­
lisant,  
— la concentration d'oxygène dissous à la fin de l'essai doit être ≥ 
3 mg/l dans les récipients d'essai et les récipients témoins.  
Remarque: Pour le premier critère, pas plus de 10 % des daphnies du 
témoin ne doivent être immobilisées ou montrer d'autres signes de 
défaillance ou de stress, tels qu'une décoloration ou un comporte ­
ment inhabituel (piégées à la surface de l'eau, par exemple).  
1.7. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.7.1.  Appareillage  
Les récipients et autres équipements qui sont amenés à entrer en 
contact avec les solutions d'essai doivent être intégralement en verre, ou en un autre matériau chimiquement inerte. Les récipients d'essai sont le plus souvent des éprouvettes ou des béchers en verre. 
Avant chaque usage, ils doivent être nettoyés selon les procédures de 
laboratoire standard. Afin de réduire la déperdition d'eau par évapo ­
ration et de prévenir l'entrée de poussière dans les solutions, les récipients d'essai doivent être couverts. Les essais sur les substances 
volatiles doivent être réalisés dans des récipients complètement 
remplis et fermés, suffisamment grands pour éviter que la concen ­
tration d'oxygène ne soit trop faible ou ne devienne un facteur limi ­
tant (voir point 1.6 et premier paragraphe du point 1.8.3).
 
Par ailleurs, tout ou partie des équipements suivants est nécessaire: 
un appareil pour mesurer la concentration de l'oxygène (à l'aide d'une 
microélectrode ou d'un autre dispositif destiné à mesurer l'oxygène 
dissous dans des échantillons de faible volume); un pH-mètre; un thermostat adéquat; un appareil pour déterminer la concentration de carbone organique totale (COT); un appareil pour déterminer la 
demande chimique en oxygène (DCO); un appareil pour déterminer 
la dureté de l'eau, etc.
 
1.7.2.  Organisme d'essai  
L'espèce à utiliser de préférence dans cet essai est  Daphnia magna  
Straus, mais d'autres espèces de  Daphnia  peuvent aussi être utilisées  
(Daphnia pulex,  par exemple). Au début de l'essai, les animaux 
doivent être âgés de 24 heures au maximum, et, pour réduire la variabilité, il est fortement recommandé qu'ils ne proviennent pas 
d'une première génération de descendants. Ils doivent être issus 
d'un lot sain (c'est-à-dire qui ne présente pas de signes de stress, tels qu'une mortalité élevée, la présence de mâles et d'éphippies, un retard dans la production des premiers descendants, des animaux 
décolorés, etc.). Tous les organismes utilisés dans un essai donné 
doivent provenir de cultures établies à partir d'un même lot de daphnies. Le lot d'animaux doit être maintenu dans des conditions de culture (lumière, température, milieu) semblables à celles qui 
seront appliquées au cours de l'essai. Si le milieu utilisé dans 
l'essai est différent de celui où sont normalement élevées les daph ­
nies, il convient de leur laisser une période d'acclimatation avant l'essai. En l'occurrence, il convient de les maintenir dans de l'eau 
de dilution à la température de l'essai pendant au moins 48 heures 
avant le début de l'essai.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 801
 
1.7.3.  Eau d'acclimatation et de dilution  
On peut utiliser, comme eau d'acclimatation et de dilution, de l'eau 
naturelle (eau de surface ou eau souterraine), de l'eau reconstituée ou de l'eau du robinet déchlorée, du moment que les daphnies y 
survivent sans montrer de signes de stress pendant toute la durée 
de l'élevage, de l'acclimatation et de l'essai. Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d'une eau de dilution acceptable données dans la liste de l'annexe 1 convient pour cet essai. Sa qualité doit 
rester constante tout au long de l'essai. Les eaux reconstituées 
peuvent être composées d'eau distillée ou désionisée auxquelles on ajoute certaines quantités spécifiques de réactifs de qualité pour 
analyse. Des exemples d'eau reconstituée sont donnés dans les docu ­
ments (1) (6) et dans l'annexe 2. Il convient de noter que les milieux contenant des agents chélatants connus, tels que les milieux M4 et M7 présentés dans l'annexe 2, doivent être évités pour les essais de 
substances contenant des métaux. Le pH doit être compris entre 6 et 
9. Une dureté comprise entre 140 et 250 mg/l (en CaCO
 3 ) est 
recommandée pour les  Daphnia magna,  mais des duretés inférieures 
conviennent également pour d'autres espèces de  Daphnia.  L'eau de 
dilution peut être aérée avant utilisation dans l'essai, de façon que la 
concentration de l'oxygène dissous atteigne la saturation.  
Lorsque de l'eau naturelle est utilisée, les paramètres de sa qualité 
doivent être mesurés au moins deux fois par an, ou chaque fois que 
ses caractéristiques sont susceptibles d'avoir été significativement modifiées (voir point précédent et annexe 1). Les métaux lourds (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni, par exemple) doivent être mesurés. Si de 
l'eau du robinet déchlorée est utilisée, il est souhaitable de procéder 
chaque jour à une analyse de sa teneur en chlore. Si l'eau de dilution provient d'une eau souterraine ou d'une eau de surface, sa conducti ­
vité et son carbone organique total (COT) ou sa demande chimique 
en oxygène (DCO) doivent être mesurés.
 
1.7.4.  Solutions d'essai  
Les solutions d'essai sont généralement amenées à la concentration 
voulue par dilution d'une solution mère. De préférence, les solutions 
mères doivent être préparées par dissolution de la substance d'essai 
dans l'eau de dilution. Le recours à des solvants, émulsifiants ou dispersants doit être évité dans toute la mesure du possible. Néan ­
moins, ces additifs sont parfois nécessaires pour obtenir une solution 
mère à la concentration voulue. Le document guide (4) donne des 
informations sur le choix des solvants, émulsifiants et dispersants appropriés. En tout cas, la substance d'essai dans la solution d'essai ne doit pas excéder sa limite de solubilité dans l'eau de 
dilution.
 
L'essai doit être mené sans ajustement du pH. Si le pH ne reste pas 
dans la plage comprise entre 6 et 9, alors il convient de procéder à 
un deuxième essai, en ajustant le pH de la solution mère à celui de 
l'eau de dilution avant d'ajouter la substance d'essai. Lors de l'ajus ­
tement du pH, il faut que la concentration de la solution mère ne soit quasiment pas modifiée, ni qu'aucune réaction chimique, ni précipi ­
tation de la substance d'essai ne soit provoquée. De préférence, il 
convient d'employer du HCl et du NaOH.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 802
 
1.8. PROCÉDURE  
1.8.1.  Conditions d'exposition  
1.8.1.1.  Témoins et groupes d'essai  
On remplit les récipients d'essai avec les volumes voulus d'eau de 
dilution et de solutions de la substance d'essai. Le rapport air/volume 
d'eau à l'intérieur des récipients doit être identique pour les groupes témoins et les groupes d'essai. On place ensuite les daphnies dans les récipients. Il faut utiliser, pour chaque concentration d'essai et pour 
les témoins, au moins 20 animaux, répartis de préférence en quatre 
groupes de cinq animaux. Un volume d'au moins 2 ml de solution d'essai doit être prévu pour chaque animal (soit un volume de 10 ml 
pour cinq daphnies par récipient). Si la concentration de la substance 
d'essai n'est pas stable, un système de renouvellement semi-statique ou continu peut être utilisé pour l'essai.
 
Parallèlement aux séries traitées, il faut tester une série de témoins de 
l'eau de dilution et, le cas échéant, une série de témoins contenant l'agent solubilisant (solvant) en quantité utilisée dans les séries trai ­
tées.
 
1.8.1.2.  Concentrations d'essai  
À moins qu'une information ne soit déjà disponible sur la toxicité de 
la substance d'essai, un essai peut le cas échéant être mené pour 
déterminer la plage des concentrations de l'essai définitif. À cette 
fin, les daphnies sont exposées à une série de concentrations de la substance d'essai largement espacées. Cinq daphnies sont exposées à chaque concentration pendant 48 heures ou moins. Aucun essai 
identique n'est nécessaire. La période d'exposition peut être 
raccourcie (24 heures ou moins, par exemple) s'il est possible d'ob ­
tenir plus rapidement les données voulues.
 
Il faut utiliser au moins cinq concentrations formant une série 
géométrique de concentrations successives séparées, de préférence, par un facteur inférieur ou égal à 2,2. L'utilisation de moins de cinq 
concentrations doit être justifiée. De préférence, la concentration la 
plus élevée doit provoquer 100 % d'immobilisation, et la moins élevée ne doit donner lieu à aucun effet observable.
 
1.8.1.3.  Conditions d'incubation  
La température doit être comprise entre 18 et 22  o C, et, pour chaque 
essai, elle doit être constante à ± 1  o C. Une alternance de 16 heures 
de lumière et 8 heures d'obscurité est recommandée. Une obscurité 
complète est également acceptable, en particulier pour les substances 
d'essai instables à la lumière.  
Les récipients d'essai ne doivent pas être aérés durant l'essai. L'essai 
est mené sans ajustement du pH. Les daphnies ne doivent pas être nourries pendant l'essai.
 
1.8.1.4.  Durée  
La durée de l'essai est de 48 heures.  
1.8.2.  Observations  
À échéances de 24 et 48 heures après le début de l'essai, la présence 
de daphnies immobiles doit être contrôlée dans chaque récipient 
d'essai (voir définitions au point 1.2). Outre l'immobilité, tout 
comportement ou signe anormal doit être signalé.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 803
 
1.8.3.  Mesures analytiques  
L'oxygène dissous et le pH sont mesurés au début et à la fin de 
l'essai dans les récipients témoins et dans ceux contenant la concen ­
tration de la substance d'essai la plus élevée. La concentration de 
l'oxygène dissous dans les témoins doit être conforme au critère de 
validité (voir le point 1.6). Normalement, le pH ne doit pas varier de plus de 1,5 unité au cours d'un essai. En règle générale, on mesure la température dans les récipients témoins ou la température ambiante, 
et de préférence il y a lieu de l'enregistrer en continu au cours de 
l'essai ou, au minimum, au début et à la fin de l'essai.
 
La concentration de la substance d'essai doit être mesurée, au mini ­
mum, dans les récipients contenant la concentration la plus élevée et la concentration la plus basse, au début et à la fin de l'essai (4). Il est recommandé de fonder les résultats sur les concentrations mesurées. 
Toutefois, si l'on peut démontrer de façon suffisamment convain ­
cante que la concentration de la substance d'essai a été maintenue tout au long de l'essai de manière satisfaisante dans un intervalle de ± 20 % de la concentration nominale ou de la concentration initiale 
mesurée, alors les résultats peuvent être fondés sur les valeurs nomi ­
nales ou les valeurs initiales mesurées.
 
1.9. ESSAI LIMITE  
Sur la base du mode opératoire décrit dans la présente méthode, un 
essai limite peut être conduit à 100 mg/l de substance d'essai ou 
jusqu'à sa limite de solubilité dans le milieu d'essai (selon la 
valeur la plus basse), de façon à démonter que la CE  50 est supérieure 
à cette concentration. L'essai limite doit être mené sur 20 daphnies 
(de préférence réparties en quatre groupes de cinq), avec un nombre 
équivalent d'animaux dans les récipients témoins. Si des daphnies sont immobilisées, il y a lieu de mener une étude complète. Tout comportement anormal observé doit être enregistré.
 
2. RÉSULTATS  
Les résultats doivent être synthétisés dans des tableaux mettant en 
évidence, pour chaque groupe d'essai et chaque témoin, le nombre de daphnies utilisées et l'immobilisation à chaque observation. En outre, une représentation graphique doit montrer les pourcentages immobi ­
lisés à 24 et 48 heures par concentration d'essai. Les résultats sont 
analysés au moyen des méthodes statistiques appropriées (analyse probit, par exemple) permettant de calculer les pentes des courbes et la CE
 50 avec des limites de confiance de 95 % (p = 0,05) (7) (8).  
Lorsque les données obtenues ne se prêtent pas au calcul de la CE  50 
par les méthodes standard, on doit utiliser la concentration la plus 
élevée qui ne donne aucune immobilisation et la concentration la 
plus faible qui donne 100 % d'immobilisation pour en déduire une 
valeur approximative de la CE  50 (en prenant la moyenne géomé ­
trique de ces deux concentrations).  
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit mentionner les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— état physique et propriétés physico-chimiques pertinentes,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 804
 
— données permettant l'identification chimique, y compris la pureté.  
Espèce d'essai:  
— source et espèce de  Daphnia,  fournisseur (s'il est connu) et 
conditions de culture appliquées (notamment source, type et 
quantités de nourriture, fréquence de l'alimentation).  
Conditions d'essai:  
— description des récipients d'essai: type et volume des récipients, 
volume de la solution, nombre de daphnies par récipient, nombre 
de récipients d'essai (essais identiques) par concentration,  
— méthodes de préparation des solutions mères et d'essai, et notam ­
ment utilisation éventuelle de tout solvant ou agent dispersant, et concentrations utilisées,
 
— détails concernant l'eau de dilution: source et caractéristiques 
(pH, dureté, rapport Ca/Mg, rapport Na/K, alcalinité, conducti ­
vité, etc.); le cas échéant, composition de l'eau reconstituée,  
— conditions d'incubation: température, intensité et périodicité de la 
lumière, oxygène dissous, pH, etc.  
Résultats:  
— nombre et pourcentage de daphnies immobilisées ou ayant mani ­
festé un effet adverse quelconque (y compris un comportement anormal) parmi les témoins et les groupes traités à chaque 
période d'observation, et une description de la nature des effets 
constatés,
 
— résultats et date de l'essai effectué avec une substance de réfé ­
rence, le cas échéant,  
— concentrations d'essai nominales et résultat de toutes les analyses 
visant à déterminer la concentration de la substance d'essai dans les récipients d'essai; l'efficacité de la méthode de récupération et 
la limite de détermination doivent également être précisées,
 
— toutes les mesures physico-chimiques (température, pH et 
oxygène dissous) effectuées au cours de l'essai,  
— CE  50 à 48 heures (immobilisation) avec les intervalles de 
confiance et les graphiques du modèle utilisé pour le calcul, les pentes des courbes dose-effet et leur erreur standard; procé ­
dures statistiques utilisées pour déterminer la CE
 50 (ces informa ­
tions doivent aussi être précisées pour l'immobilisation à 24 heures lorsque les mesures ont été effectuées),
 
— explication de tout écart par rapport à la méthode d'essai, et 
conséquences éventuelles sur les résultats de l'essai.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(21) ISO 6341 (1996). Qualité de l'eau — Détermination de l'inhi ­
bition de la mobilité de  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) — Essai de toxicité aiguë. Troisième édition, 1996.  
(22) EPA OPPTS 850.1010 (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 805
 
(23) Environnement Canada (1996). Méthode d'essai biologique. 
Essai de létalité aiguë sur  Daphnia  spp. EPS 1/RM/1 
1. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(24) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. 
No 23. Paris 2000.
 
(25) Commission des Communautés européennes. Étude D8369 
(1979). Programme d'essais interlaboratoires concernant l'étude de l'écotoxicité d'une substance chimique vis-à-vis de la Daphnia.
 
(26) OCDE, ligne directrice pour les essais de produits chimiques. 
Ligne directrice 211:  Daphnia magna,  essai de reproduction, 
adoptée en septembre 1998.  
(27) Stephan, C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. 
Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American 
Society for Testing and Materials, p. 65-84.  
(28) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
3 rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 806
 
Annexe 1  
QUELQUES CARACTÉRISTIQUES CHIMIQUES D'UNE EAU DE 
DILUTION ACCEPTABLE  
Substance Concentration  
Particules < 20 mg/l 
Carbone organique total < 2 mg/l 
Ammoniac non ionisé < 1 μg/l 
Chlore résiduel < 10 μg/l 
Total des pesticides organophosphorés < 50 ng/l Total des pesticides organochlorés plus biphényles poly ­
chlorés < 50 ng/l 
Chlore organique total < 25 ng/l
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Annexe 2  
EXEMPLES D'EAU D'ESSAI RECONSTITUÉE ACCEPTABLE  
Eau d'essai ISO (1)  
Solutions mères (substance unique) Pour préparer l'eau recons ­
tituée, ajouter les volumes 
suivants de solutions mères à 1 
litre d'eau (*) Substance Quantité ajoutée à 1 litre 
d'eau (*)  
Chlorure de calcium 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Sulfate de magnésium 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Bicarbonate de sodium 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Chlorure de potassium 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Eau de pureté adéquate, par exemple, eau désionisée, distillée ou obtenue par osmose 
inverse, de conductivité de préférence inférieure à 10 μS.cm-  1 . 
Milieux Elendt M7 et M4  
Acclimatation aux milieux Elendt M4 et M7  
Certains laboratoires ont rencontré des difficultés pour transférer directement les  
Daphnia  dans les milieux M4 et M7. Ils sont toutefois parvenus à un certain 
résultat en les acclimatant progressivement, c'est-à-dire en les transférant de leur milieu vers un milieu à 30 % d'Elendt, puis à 60 % d'Elendt et enfin à 100 % d'Elendt. Les périodes d'acclimatation peuvent prendre jusqu'à un mois.
 
Préparation  
Éléments en traces  
Différentes solutions mères (I), contenant chacune une seule substance en traces, 
sont tout d'abord préparées avec une eau d'une pureté adéquate, par exemple de 
l'eau désionisée, distillée ou obtenue par osmose inverse. À partir de ces diffé ­
rentes solutions mères (I), on prépare une deuxième solution mère unique (II) renfermant toutes les substances en traces (solution combinée), à savoir:
 
Solution(s) mère(s) I (substance 
unique) Quantité ajoutée à l'eau 
(mg/l) Concentration (par 
rapport au milieu M4) Pour préparer la solution mère combinée II, 
ajouter la quantité suivante de solution mère I à 
l'eau (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 fois 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000 fois 1,0 0,25 
LiC1 6 120 20 000 fois 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 808
 
Solution(s) mère(s) I (substance 
unique) Quantité ajoutée à l'eau 
(mg/l) Concentration (par 
rapport au milieu M4) Pour préparer la solution mère combinée II, 
ajouter la quantité suivante de solution mère I à 
l'eau (ml/l) 
M4 M7  
RbC1 1 420 20 000 fois 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000 fois 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 fois 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000 fois 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000 fois 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 fois 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000 fois 1,0 1,0 
KI 65 20 000 fois 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 fois 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 fois 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000 fois _ _ 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000 fois _ _ 
Les solutions de Na  2 EDTA et de FeSO  4 sont préparées séparément, puis mélangées et immédiatement autoclavées. 
Cela donne: 
2 1 solution Fe-EDT 1 000 fois 20,0 5,0  
Milieux M4 et M7  
Les milieux M4 et M7 sont préparés à partir de la solution mère II, de macronu ­
triments et de vitamines, de la façon suivante:  
Quantité ajoutée à l'eau 
(mg/l) Concentration (par 
rapport au milieu M4) Quantité de solution mère II ajoutée pour préparer 
le milieu (ml/l) 
M4 M7  
Solution mère II (combi ­
naison de substances en traces) 20 fois 50 50 
Solutions mères contenant 
les macronutriments (une substance par solution) 
CaCl
 2 .2H  2 0 293 800 1 000 fois 1,0 1,0 
MgSO  4. 7H 2 O 246 600 2 000 fois 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 fois 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 fois 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 .9H  2 O 50 000 5 000 fois 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 fois 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 fois 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 fois 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 809
 
Quantité ajoutée à l'eau 
(mg/l) Concentration (par 
rapport au milieu M4) Quantité de solution mère II ajoutée pour préparer 
le milieu (ml/l) 
M4 M7  
Solution mère de vitamines 
combinées _ 10 000 fois 0,1 0,1 
La solution mère de vitamines combinées est préparée en additionnant 3 vitamines à 1 litre d'eau, comme indiqué ci- 
dessous: 
Chlorhydrate de thiamine 750 10 000 fois 
Cyanocobalamine (B12) 10 10 000 fois Biotine 7,5 10 000 fois
 
La solution mère de vitamines combinées est congelée par petites parties 
aliquotes. Les vitamines sont ajoutées au milieu peu avant son utilisation.  
NB: Afin d'éviter que les sels ne se précipitent lorsqu'on prépare le milieu 
complet, il faut ajouter les parties aliquotes de solution mère à quelque 500 à 800 ml d'eau désionisée et amener le volume à 1 litre.
 
NB: La première publication relative au milieu M4 se trouve dans Elendt, B. 
P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to 
antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 810
 
C.3. ALGUES D'EAU DOUCE ET CYANOBACTÉRIES, ESSAI 
D'INHIBITION DE LA CROISSANCE  
1. MÉTHODE  
La présente méthode est équivalente à la ligne directrice TG 
201 (2006) (1) de l’OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Les méthodes d’essai sont régulièrement revues et mises à jour en 
fonction des progrès scientifiques. En ce qui concerne la méthode d’essai C.3, il s’est avéré nécessaire d’ajouter des espèces et de la 
remanier conformément aux exigences nouvelles en matière d’éva ­
luation des dangers et de classification des substances chimiques. Cette révision s'est appuyée sur la somme des informations recueil ­
lies, depuis l’adoption initiale, qui résultent d'une solide expérience 
concrète, des avancées scientifiques dans le domaine des études de 
toxicité sur les algues et d'une longue pratique réglementaire.
 
1.2. DÉFINITIONS  
Les définitions et abréviations suivantes sont utilisées aux fins de 
cette méthode d’essai.  
Biomasse : poids sec de la matière vivante présente dans une popu ­
lation, exprimé en fonction d'un volume donné, par exemple en mg d'algues/litre de solution d'essai. D'habitude la biomasse est définie 
comme une masse, mais dans cet essai, le terme «biomasse» fait 
référence à une masse par unité de volume. Remarquons également que, dans cet essai, la biomasse est en général mesurée indirecte ­
ment, par la numération des cellules, la fluorescence, etc., si bien que 
le terme «biomasse» recouvre également ces mesures de substitution.
 
Coefficient de variation : mesure sans dimension de la variabilité 
d'un paramètre, définie par le rapport de l'écart-type à la moyenne. Il 
s'exprime également en pourcentage. Le coefficient moyen de varia ­
tion du taux de croissance spécifique moyen des expériences iden ­
tiques du groupe témoin se calcule comme suit:  
1. calculer le coefficient de variation (en %) du taux de croissance 
spécifique moyen en fonction des taux de croissance quotidiens (section par section) pour chaque expérience identique;
 
2. calculer la valeur moyenne de toutes les valeurs calculées au 
point 1, afin d'obtenir le coefficient moyen de variation du taux de croissance spécifique quotidien (section par section) des cultures témoins identiques.
 
CE x : concentration de la substance d'essai dissoute dans le milieu 
d'essai entraînant une réduction de x % (par exemple 50 %) de la croissance des organismes d'essai durant une période d'exposition 
définie (à mentionner explicitement si elle s'écarte de la durée 
normale ou totale de l'essai). Afin de distinguer les valeurs de la CE mesurées en fonction du taux de croissance de celles mesurées en fonction du rendement, on utilise les abréviations CE
 t , s'agissant 
du taux de croissance, et CE  r , lorsqu’il s'agit du rendement.  
Milieu de croissance : milieu de culture synthétique complet dans 
lequel les algues se développent lorsqu'elles sont exposées à la subs ­
tance d'essai, celle-ci étant généralement dissoute dans le milieu 
d'essai.  
Taux de croissance (taux de croissance spécifique moyen) : 
accroissement logarithmique de la biomasse durant la période d'ex ­
position.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 811
 
Concentration minimale avec effet observé (CMEO) : concentra ­
tion d'essai la plus faible à laquelle on observe que la substance 
exerce un effet statistiquement significatif de réduction de la crois ­
sance (à p < 0,05) par comparaison avec le témoin, durant une période d'exposition donnée. Néanmoins, toutes les concentrations 
supérieures à la CMEO doivent avoir un effet néfaste supérieur ou 
égal à celui observé à la CMEO. Lorsque ces deux conditions ne peuvent pas être remplies, il faut expliquer en détail la façon dont la CMEO (et donc la CSEO) a été choisie.
 
Concentration sans effet observé (CSEO) : concentration d'essai 
immédiatement inférieure à la CMEO.  
Variable étudiée : variable permettant d'estimer la toxicité à partir de 
n’importe quelle variable mesurée décrivant la biomasse, selon diffé ­
rentes méthodes de calcul. Dans cette méthode d’essai, les taux de croissance et le rendement représentent les variables étudiées déduites de la mesure directe de la biomasse ou de sa mesure indi ­
recte d'après l'un des paramètres de substitution mentionnés précé ­
demment.
 
Taux de croissance spécifique : variable étudiée correspondant au 
quotient de la différence des logarithmes népériens d'un paramètre observé (la biomasse, dans cette méthode d’essai) par la période de 
temps respective.
 
Rendement : différence entre la valeur d'une variable mesurée à la 
fin de la période d'exposition et la valeur de cette variable mesurée au début de la période d'exposition, utilisée pour exprimer l'accrois ­
sement de biomasse durant l'essai.
 
1.3. APPLICABILITÉ DE L'ESSAI  
Cette méthode d’essai se prête mieux aux substances hydrosolubles 
qui, dans les conditions de l'essai, sont susceptibles de rester dans 
l'eau. Les substances volatiles, s'adsorbant fortement, colorées ou peu 
solubles dans l'eau ou les substances susceptibles d’influer sur la disponibilité des nutriments ou des minéraux dans le milieu d'essai appellent éventuellement certaines modifications du procédé décrit 
(par exemple, un système fermé, le conditionnement des récipients 
d'essai). Certaines modifications appropriées sont abordées dans les références (2), (3) et (4).
 
1.4. PRINCIPE DE L'ESSAI  
Cet essai vise à déterminer les effets d'une substance sur la crois ­
sance d'algues microscopiques dulcicoles et/ou de cyanobactéries. Des organismes d'essai en phase de croissance exponentielle sont 
exposés à la substance d'essai dans des cultures en lots sur une 
période durant normalement 72 heures. La relative brièveté de l'essai permet néanmoins d'évaluer les effets sur plusieurs généra ­
tions.
 
L'effet observé est la réduction de la croissance dans une série de 
cultures d'algues (unités expérimentales) exposées à différentes 
concentrations de la substance d'essai. L'effet est évalué en fonction de la concentration d'exposition, en comparaison avec la croissance moyenne d'une série de cultures témoins identiques et non traitées. 
Afin que les effets toxiques puissent pleinement s’exprimer (sensibi ­
lité optimale des cultures), les cultures d’algues sont placées dans des conditions propres à une croissance exponentielle non limitée: éléments nutritifs en suffisance et lumière continue, et ce, sur une 
période assez longue pour que la réduction du taux de croissance 
spécifique puisse être mesurée.
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La croissance et l’inhibition de la croissance sont quantifiées d’après 
des mesure de la biomasse algale en fonction du temps. La biomasse 
des algues est définie en poids sec par volume, par exemple des milligrammes d’algues par litre de solution expérimentale. Le poids sec étant difficile à mesurer, on recourt à d’autres paramètres 
tels que la numération cellulaire, qui est le plus souvent utilisée, ou 
encore le volume, la fluorescence et la densité optique cellulaires, etc. Le facteur de conversion du paramètre de substitution mesuré en biomasse doit être connu.
 
L'effet étudié est l'inhibition de la croissance, exprimée par l'accrois ­
sement logarithmique de la biomasse (taux de croissance spécifique moyen) durant la période d'exposition. La concentration entraînant un pourcentage x donné d'inhibition du taux de croissance (par 
exemple 50, %) est déterminée en fonction des taux de croissance 
spécifiques moyens relevés dans une série de solutions expérimen ­
tales, et exprimée sous la forme C
 x E t (par exemple, C  50 E t ). 
Pour l’application de cette méthode dans le cadre réglementaire de 
l’UE, le calcul des résultats doit être fondé sur un taux de croissance spécifique moyen, pour les raisons décrites au point 2.2 ci-dessous. La présente méthode d’essai comporte une variable étudiée supplé ­
mentaire, le rendement, requise par la réglementation de certains 
pays. Il est défini comme étant la différence entre la valeur de la biomasse à la fin de la période d'exposition et cette valeur au début de la période d'exposition. La concentration entraînant un pourcen ­
tage x donné d'inhibition du rendement (par exemple, 50 %) est 
calculée à partir du rendement enregistré dans une série de solutions expérimentales, et exprimée sous la forme C
 x E r (par exemple, 
C 50 E r ). 
En outre, la concentration minimale avec effet observé (CMEO) et la 
concentration sans effet observé (CSEO) peuvent être déterminées par un calcul statistique.
 
1.5. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Les informations sur la substance d'essai pouvant être utiles à l'éta ­
blissement des conditions expérimentales comprennent la formule structurale, la pureté, la stabilité à la lumière, la stabilité dans les conditions de l'essai, le pouvoir d'absorption lumineuse, le pKa et les 
résultats d'études de transformation, notamment la biodégradabilité 
dans l'eau.
 
Il faut connaître l'hydrosolubilité, le coefficient de partage octanol- 
eau (P  oe ) et la pression de vapeur de la substance d'essai, et disposer 
d'une méthode validée pour quantifier la substance dans les solutions 
expérimentales, méthode dont le rendement de récupération et le seuil de détection seront mentionnés dans le rapport.
 
1.6. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Le procédé expérimental peut être vérifié au moyen de substance(s) 
de référence telle(s) que le 3,5-dichlorphénol, utilisé dans l'essai 
tournant international (4). Le dichromate de potassium peut égale ­
ment servir de substance de référence pour les algues vertes. Il est recommandé de mettre une substance de référence à l'essai au moins 
deux fois par an.
 
1.7. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
La validité de l'essai repose sur les critères de performance suivants:  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 813
 
— l'accroissement exponentiel de la biomasse des cultures témoins 
doit être d'un facteur au moins égal à 16 en l'espace de 72 heures 
(durée de l'essai), ce qui correspond à un taux de croissance spécifique de 0,92/jour
 –1 . Le taux de croissance des espèces les 
plus fréquemment utilisées est généralement nettement supérieur 
(voir appendice 1). Ce critère ne sera pas forcément rempli avec 
les espèces à croissance plus lente que celles énumérées à l'appendice 1. Dans ce cas, il convient d'allonger la durée de l'essai, afin d'obtenir un facteur de multiplication de la croissance 
au moins égal à 16 dans les cultures témoins, la croissance 
devant être exponentielle tout au long de l'essai. La durée de l'essai peut être ramenée à au moins 48 heures pour maintenir une croissance exponentielle non limitée durant l'essai, pourvu 
que le facteur de multiplication minimal, à savoir 16, soit atteint,
 
— le coefficient de variation moyen des taux de croissance spéci ­
fiques section par section (jours 0-1, 1-2 et 2-3, pour les essais de 72 heures) dans les cultures témoins (voir «coefficient de varia ­
tion» au paragraphe 1.2) ne peut pas excéder 35 %. Voir le 
calcul du taux de croissance spécifique section par section au paragraphe 2.2.1, deuxième alinéa. Ce critère s'applique à la valeur moyenne des coefficients de variation calculés pour les 
expériences identiques du groupe témoin,
 
— le coefficient de variation des taux de croissance spécifiques 
moyens sur toute la durée de l'essai dans les cultures témoins identiques ne peut pas dépasser 7 % pour les essais menés sur  
Pseudokirchneriella subcapitata  et Desmodesmus subspicatus . 
S'agissant des autres espèces moins souvent testées, cette valeur ne doit pas dépasser 10 %.
 
1.8. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.8.1.  Appareillage  
Les récipients expérimentaux et les autres appareils entrant en 
contact avec les solutions d'essai doivent être composés uniquement de verre ou d'un autre matériau chimiquement inerte. Il convient de les nettoyer à fond afin qu'aucun contaminant organique ou minéral 
n'interfère avec la croissance des algues ou la composition des solu ­
tions expérimentales.
 
Généralement en verre, les récipients d'essai possèdent des dimen ­
sions autorisant un volume de culture suffisant pour les mesures à 
effectuer durant l'essai et un transfert massique suffisant de CO  2 
depuis l'atmosphère (voir paragraphe 1.8.9, deuxième alinéa). 
Notons que le volume de liquide doit être assez grand pour les 
déterminations analytiques (voir paragraphe 1.8.11, cinquième 
alinéa).  
Une partie ou la totalité du matériel suivant est également nécessaire:  
— appareillage destiné aux cultures: il est recommandé d'utiliser une 
armoire ou une enceinte dans laquelle la température d'incubation 
choisie peut être maintenue à ± 2 °C près,  
— instruments de mesure de la lumière: il est important de savoir 
que la méthode de mesure de l'intensité lumineuse, et en parti ­
culier le type de capteur (collecteur), aura une influence sur la 
valeur mesurée. Il est préférable d'effectuer les mesures à l'aide d'un capteur sphérique 4 π (sensible à la lumière directe et réflé ­
chie provenant de tous les angles situés au-dessus et en dessous 
du plan de mesure) ou d'un capteur 2 π (sensible à la lumière 
provenant de tous les angles situés au-dessus du plan de mesure),
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— dispositif permettant de déterminer la biomasse des algues: la 
numération cellulaire, qui est le paramètre de substitution le 
plus fréquemment utilisé pour déterminer la biomasse des algues, peut être effectuée avec un compteur électronique de particules, un microscope équipé d'une enceinte de comptage 
ou un cytomètre à flux. D'autres paramètres de substitution de 
la biomasse peuvent être mesurés au moyen d'un cytomètre à flux, d'un fluorimètre, d'un spectrophotomètre ou d'un colorimè ­
tre. Il est utile de calculer le facteur de conversion du nombre de 
cellules en poids sec de biomasse. Afin d'obtenir des mesures 
utiles pour les faibles concentrations de biomasse quand on utilise un spectrophotomètre, il peut s'avérer nécessaire d'em ­
ployer des cuves d’une longueur d'au moins 4 cm.
 
1.8.2.  Organismes d'essai  
Plusieurs espèces d'algues microscopiques et de cyanobactéries ne 
formant pas d'agrégats peuvent être utilisées. Il a été démontré que 
les souches énumérées à l'appendice 1 convenaient au protocole 
expérimental de cette méthode d’essai.  
Si l'on utilise d'autres espèces, il faut mentionner leur souche et/ou 
leur origine. Il y a lieu de confirmer que la croissance exponentielle des algues d'essai sélectionnées peut être maintenue tout au long de l'essai dans les conditions appliquées.
 
1.8.3.  Milieu de croissance  
Deux milieux de croissance possibles sont préconisés: celui de 
l'OCDE et le milieu AAP. Les compositions de ces milieux sont 
détaillées à l'appendice 2. Il faut noter que la valeur initiale du pH 
et le pouvoir tampon (régulation de l'augmentation du pH) de ces deux milieux sont différents. En conséquence, les résultats des essais 
risquent d'être différents suivant le milieu employé, notamment avec 
des substances d'essai ionisantes.
 
Il peut parfois s'avérer nécessaire de modifier le milieu de croissance, 
par exemple si la substance d'essai est un métal ou un agent chélatant ou si l'essai est mené à différents pH. L'utilisation d'un milieu modifié doit être décrite en détail et justifiée (3)(4).
 
1.8.4.  Concentration initiale de la biomasse  
La biomasse initiale doit être identique dans toutes les cultures de 
l'essai et suffisamment basse pour autoriser une croissance exponen ­
tielle tout au long de la période d'incubation sans risque d'épuisement 
des éléments nutritifs. La biomasse initiale ne dépassera pas 0,5 mg/l en poids sec. On recommande les concentrations cellulaires initiales suivantes:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10
 3 -10 4 cellules/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 × 10  3 cellules/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 cellules/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 cellules/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 -10 5 cellules/ml  
1.8.5.  Concentrations de la substance d'essai  
La gamme de concentrations dans laquelle des effets sont suscepti ­
bles de se produire peut être déterminée d'après les résultats d'essais de détermination de l'ordre de grandeur. L'essai proprement dit 
comprend au moins cinq concentrations formant une série géomé ­
trique et séparées par un facteur n'excédant pas 3,2. Un facteur supérieur peut se justifier pour les substances d'essai dont la courbe concentration-effet a une pente nulle. Il est préférable que 
la gamme de concentrations couvre des valeurs entraînant une inhi ­
bition de 5 à 75 % du taux de croissance des algues.
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1.8.6.  Expériences identiques et témoins  
L’essai comprend trois expériences identiques à chaque concentra ­
tion expérimentale. S'il n'est pas nécessaire de déterminer la CSEO, l'essai peut être modifié de manière à inclure un plus grand nombre 
de concentrations et un plus petit nombre d'expériences identiques 
par concentration. Le nombre d’expériences identiques pour le témoin doit être au moins trois et, idéalement, le double du nombre d'expériences identiques utilisées à chaque concentration 
expérimentale.
 
Un ensemble séparé de solutions d'essai peut être préparé pour les 
déterminations analytiques des concentrations de la substance d'essai 
(voir paragraphe 1.8.11, quatrième et sixième alinéas).  
Si la substance d'essai est solubilisée à l'aide d'un solvant, on inclura 
des témoins supplémentaires contenant le solvant à la même concen ­
tration que celle appliquée dans les cultures expérimentales.  
1.8.7.  Préparation de la culture de l'inoculum  
Afin que les algues soumises à l'essai soient adaptées aux conditions 
expérimentales et soient bien en phase de croissance exponentielle 
lorsqu'on les utilise pour ensemencer les solutions d'essai, on prépare une culture d'inoculum dans le milieu expérimental, deux à quatre jours avant le début de l'essai. La biomasse des algues doit 
être ajustée afin que la culture de l'inoculum présente une croissance 
exponentielle jusqu'au moment où l'essai débute. La culture de l'ino ­
culum est incubée dans les mêmes conditions que les cultures expé ­
rimentales. On mesure l'accroissement de la biomasse dans la culture 
de l'inoculum pour vérifier qu'elle présente une croissance normale 
pour la souche expérimentale en question dans les conditions de culture. Un exemple de méthode de culture des algues est décrit à l'appendice 3. Pour éviter des divisions cellulaires synchrones durant 
l'essai, il est parfois nécessaire de lancer une seconde étape de 
propagation de la culture de l'inoculum.
 
1.8.8.  Préparation des solutions expérimentales  
Toutes les solutions expérimentales doivent contenir les mêmes 
concentrations de milieu de croissance et la même biomasse initiale 
d'algues d'essai. On prépare généralement les solutions expérimen ­
tales aux concentrations choisies en mélangeant une solution mère de la substance d'essai avec le milieu de croissance et la culture de 
l'inoculum. Les solutions mères sont normalement préparées par 
dissolution de la substance dans le milieu d'essai.
 
Des solvants, par exemple de l'acétone, de l'alcool t-butylique et du 
diméthylformamide, peuvent être utilisés comme véhicules pour 
ajouter des substances peu solubles dans l'eau au milieu expérimental (2)(3). La concentration de solvant ne doit pas excéder 100 μl/l et 
doit être identique dans toutes les cultures (y compris les témoins) de 
l'essai.
 
1.8.9.  Incubation  
Les récipients expérimentaux sont munis de bouchons perméables à 
l'air. Les récipients sont agités et placés dans l'appareil destiné aux 
cultures. Durant l'essai, il est nécessaire de garder les algues en 
suspension et de faciliter le transfert de CO  2 . À cette fin, les réci ­
pients sont agités ou leur contenu remué en permanence. Les cultures doivent être maintenues à une température comprise entre 21 
et 24 °C, maintenue à ± 2 °C près. Des températures plus élevées 
peuvent être appliquées pour des espèces autres que celles reprises à l'appendice 1, par exemple des espèces tropicales, à condition que les critères de validité soient respectés. Il est recommandé de disposer 
les récipients de façon aléatoire et de modifier quotidiennement leur 
emplacement dans l'incubateur.
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Le pH du milieu témoin ne doit pas augmenter de plus de 1,5 unité 
durant l'essai. Dans le cas des métaux et des substances qui s'ionisent 
partiellement à un pH proche de celui de l'essai, il peut s'avérer nécessaire de limiter l'évolution du pH, afin d'obtenir des résultats reproductibles et bien définis. Il est techniquement possible de 
limiter l'évolution du pH à < 0,5 unité en induisant un taux 
adéquat de transfert massique de CO
 2 de l'air environnant à la solu ­
tion d'essai, par exemple en augmentant l'intensité de l'agitation. Une autre possibilité consiste à diminuer la demande en CO
 2 en réduisant 
la biomasse initiale ou la durée de l'essai.  
La surface sur laquelle les cultures sont incubées reçoit un éclairage 
continu, uniforme et fluorescent, par exemple de type «lumière 
blanche froide» ou «lumière naturelle». Les besoins lumineux 
varient selon les souches d'algues et de cyanobactéries. L'intensité lumineuse doit être choisie en fonction de l'organisme d'essai utilisé. Pour les espèces d'algues vertes recommandées, l'intensité lumineuse 
au niveau des solutions d'essai doit être choisie dans l'intervalle 60- 
120 μE·m
 –2 s –1 lorsqu'elle est mesurée dans le domaine de longueur 
d'onde autorisant la photosynthèse (400 à 700 nm) avec un capteur approprié. Certaines espèces, en particulier  Anabaena flos-aquae , se 
développent bien sous des intensités lumineuses plus faibles et 
peuvent être endommagées par des intensités plus fortes. Pour ces espèces, il convient d'appliquer une intensité lumineuse moyenne comprise dans la gamme 40-60 μE·m
 –2 s –1 (en ce qui concerne les 
instruments de mesure de la lumière étalonnés en lux, la gamme de 
4 440-8 880 lux pour la lumière blanche froide correspond approxi ­
mativement à l'intensité lumineuse recommandée de 60-120 μE·m  –2 
s –1 ). L'intensité lumineuse ne s'écartera pas de plus de ± 15 % de 
l'intensité lumineuse moyenne dans la zone de l'incubation.  
1.8.10.  Durée de l'essai  
L'essai dure normalement soixante-douze heures. Néanmoins, des 
durées plus ou moins longues peuvent être appliquées, à condition 
que tous les critères de validité mentionnés au paragraphe 1.7 soient respectés.
 
1.8.11.  Mesures et déterminations analytiques  
La biomasse des algues contenue dans chaque flacon est déterminée 
au moins une fois par jour durant la période d'essai. Si les mesures sont effectuées sur de petits volumes extraits de la solution d'essai avec une pipette, ceux-ci ne doivent pas être réintroduits dans le 
récipient d'essai.
 
La biomasse est mesurée par comptage manuel des cellules au 
microscope ou au moyen d'un compteur électronique de particules 
(dénombrement des cellules et/ou biovolume). D'autres techniques, 
par exemple la cytométrie à flux, la fluorescence chlorophyllienne in vitro ou in vivo (6)(7) ou la densité optique, peuvent être utilisées, à condition de pouvoir démontrer qu'il existe une corrélation satisfai ­
sante avec la biomasse dans la gamme de valeurs de la biomasse de 
l'essai.
 
Le pH des solutions est mesuré au début et à la fin de l'essai.  
Si l'on dispose d'une méthode permettant d'analyser la substance 
d'essai dans la gamme de concentrations appliquées, il faut analyser 
les solutions expérimentales afin de vérifier les concentrations 
initiales et le maintien des concentrations d'exposition durant l'essai.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 817
 
L'analyse de la concentration de la substance d'essai, au début et à la 
fin de l'essai, dans des récipients renfermant une concentration 
élevée, une concentration faible et une concentration proche de la CE
 50 escomptée peut suffire si les concentrations d'exposition ne 
sont pas censées s'écarter de plus de 20 % des valeurs nominales 
durant l'essai. Il est préconisé d'analyser toutes les concentrations 
d'essai au début et à la fin de l'essai si les concentrations ne sont pas supposées demeurer dans l'intervalle de 80-120 % de la concen ­
tration nominale. S'agissant des substances d'essai volatiles, instables 
ou s'adsorbant fortement, on recommande de prélever des échan ­
tillons à analyser toutes les vingt-quatre heures durant la période d'exposition, afin de préciser la perte de substance d'essai. Pour ces substances, le nombre d'expériences identiques devra être 
augmenté. Dans tous les cas, il suffira de déterminer la concentration 
de la substance d'essai dans un seul récipient traité de manière iden ­
tique pour chaque concentration expérimentale (ou dans le mélange du contenu de tous les récipients traités de manière identique).
 
Les milieux d'essai destinés spécialement à l'analyse des concentra ­
tions d'exposition durant l'essai doivent être traités de la même manière que les milieux utilisés pour l'essai: ils doivent être ense ­
mencés avec les algues et incubés dans des conditions identiques. Si 
l’on doit analyser la concentration de la substance d'essai dissoute, les algues devront peut-être être séparées du milieu. À cette fin, il est préférable de procéder par centrifugation à une faible force d'accé ­
lération, suffisante pour sédimenter les algues.
 
S'il s'avère que la concentration de la substance d'essai a pu se 
maintenir tout au long de l'essai dans un intervalle de ± 20 % de la concentration nominale ou mesurée initialement, l'analyse des 
résultats peut s'appuyer sur les valeurs nominales ou mesurées initia ­
lement. Si l'écart à la concentration nominale ou mesurée initiale ­
ment est supérieur à ± 20 %, l'analyse des résultats devra reposer sur la moyenne géométrique de la concentration relevée durant l'exposi ­
tion ou sur des modèles décrivant la baisse de la concentration de la 
substance d'essai (3)(8).
 
L'essai d'inhibition de la croissance des algues est un système expé ­
rimental plus dynamique que la plupart des autres essais de toxicité à 
court terme sur des organismes aquatiques. En conséquence, les concentrations d'exposition réelles risquent d'être difficiles à définir, en particulier pour les substances s'adsorbant testées à faibles 
concentrations. Dans ces circonstances, la disparition de la substance 
de la solution par adsorption sur la biomasse croissante des algues ne signifie pas que la substance d'essai a disparu du système d'essai. En analysant le résultat de l'essai, il y a lieu de vérifier si la diminution 
de la concentration de la substance d'essai au cours de l'essai s'est 
accompagnée d'une baisse de l'inhibition de la croissance. Si tel est le cas, on peut envisager d'appliquer un modèle décrivant convena ­
blement la baisse de la concentration de la substance d'essai (8). 
Dans le cas contraire, il sera peut-être pertinent de fonder l'analyse 
des résultats sur les concentrations initiales (nominales ou mesurées).
 
1.8.12.  Autres observations  
On observe au microscope la culture de l'inoculum pour vérifier si 
elle présente un aspect normal et sain ainsi que l'aspect des algues 
pour détecter la présence éventuelle d'anomalies (susceptibles de 
résulter de l'exposition à la substance d'essai) à la fin de l'essai.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 818
 
1.8.13.  Essai limite  
Dans certaines circonstances, par exemple lorsqu'un essai prélimi ­
naire indique que la substance d'essai n'exerce aucun effet toxique à des concentrations allant jusqu'à 100 mg/l ou à sa limite de solu ­
bilité dans le milieu d'essai (suivant celle qui est la plus basse), on 
peut réaliser un essai limite afin de comparer les réactions d'un groupe témoin avec celles d'un groupe traité (à 100 mg/l ou à une concentration égale à la limite de solubilité). Il est fortement recom ­
mandé d'étayer cet essai par une analyse de la concentration d'expo ­
sition. Tous les critères de validité et conditions expérimentales décrits précédemment s'appliquent à l'essai limite, si ce n'est que le 
nombre de récipients traités de manière identique doit être au moins 
égal à six. Les variables étudiées dans le groupe témoin et le groupe traité peuvent être analysées au moyen d'un test statistique permettant de comparer les moyennes, par exemple un test t de Student. Si les 
variances des deux groupes sont inégales, on effectue un test t ajusté 
en fonction des variances inégales.
 
1.8.14.  Modification pour les substances fortement colorées  
L’irradiation (intensité lumineuse) doit être réalisée dans le haut de 
l’intervalle imposé dans cette méthode d’essai: 120 μE m  –2 s –1 ou 
une valeur plus élevée.  
Le trajet des rayons lumineux doit être raccourci en réduisant le 
volume des solutions expérimentales (de l’ordre de 5-25 ml).  
Un mouvement suffisant (par exemple, par une agitation modérée) 
doit être assuré pour obtenir une fréquence d’exposition élevée des 
algues à une forte irradiation à la surface de la culture.  
2. RÉSULTATS  
2.1. TRACÉ DES COURBES DE CROISSANCE  
La biomasse des récipients d'essai peut être exprimée en unités du 
paramètre de substitution utilisé pour la mesurer (nombre de cellules, 
fluorescence, par exemple).  
Porter dans un tableau la concentration estimée de la biomasse dans 
les cultures expérimentales et les cultures témoins, les concentrations 
de la substance d'essai et les temps de mesure enregistrés avec une précision minimale de l'ordre de l'heure, afin d'obtenir les points des 
courbes de croissance. Les échelles tant logarithmiques que linéaires 
peuvent être utiles à ce premier stade, mais les échelles logarith ­
miques sont indispensables et représentent généralement mieux les variations du rythme de la croissance durant l'essai. Notons que la 
croissance exponentielle produit une droite lorsqu'elle est portée sur 
une échelle logarithmique et que la pente de cette droite indique le taux de croissance spécifique.
 
À l'aide des points portés sur le graphique, examiner si les cultures 
témoins se développent au rythme exponentiel prévu tout au long de l'essai. Étudier attentivement tous les points et l'allure des graphiques et vérifier si les données brutes et les méthodes employées ne sont 
entachées d'aucune erreur. Vérifier en particulier tous les points qui 
semblent s'écarter du tracé suivant une erreur systématique. Si, à l'évidence, la manière dont on a procédé comporte des erreurs iden ­
tifiables ou très probables, le point concerné est à signaler comme 
une valeur aberrante et ne doit pas être pris en compte dans l'analyse 
statistique ultérieure (une concentration nulle d'algues dans un des récipients traités de manière identique sur deux ou trois peut révéler que le récipient n'a pas été ensemencé correctement ou qu'il n'a pas 
été suffisamment bien nettoyé). Les raisons pour lesquelles on a 
décidé d'exclure un point parce qu'on le considère comme une valeur aberrante doivent être exposées clairement dans le rapport d’essai. Les raisons acceptées ne représentent que des erreurs métho ­
dologiques (rares) et non un manque de précision. Les méthodes 
statistiques d'identification des valeurs aberrantes sont d'un usage limité pour ce type de problème et ne peuvent remplacer le jugement d'un expert. Il est préférable de conserver les valeurs aberrantes 
(signalées comme telles) parmi les données présentées ultérieurement 
sur un graphique ou un tableau.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 819
 
2.2. VARIABLES ÉTUDIÉES  
Cet essai a pour but de déterminer les effets de la substance d'essai 
sur la croissance des algues. Cette méthode d’essai décrit deux varia ­
bles étudiées, de manière à répondre aux différentes préférences et 
exigences réglementaires des pays membres. Pour que les résultats 
de l'essai soient acceptables dans tous les pays membres, les effets doivent être évalués en fonction des deux variables étudiées (a) et (b) définies ci-dessous.
 
a) Taux de croissance spécifique moyen: cette variable étudiée est 
calculée d'après l'accroissement logarithmique de la biomasse pendant la durée de l'essai, exprimé par jour.
 
b) Rendement: cette variable étudiée correspond à la valeur de la 
biomasse à la fin de l'essai diminuée de la valeur de la biomasse au début de l'essai.
 
Pour l’application de cette méthode dans le cadre réglementaire de 
l’UE, le calcul des résultats doit être fondé sur un taux de croissance spécifique moyen, pour les raisons décrites ci-dessous. Notons que 
les valeurs de toxicité calculées avec ces deux variables étudiées ne 
sont pas comparables et qu'il faut tenir compte de cette différence lorsqu'on utilise les résultats de l'essai. Les valeurs de la CE
 x fondées 
sur le taux de croissance spécifique moyen (C  x E t ) seront générale ­
ment supérieures à celles fondées sur le rendement (C  x E r ) si les 
conditions expérimentales de cette méthode d’essai sont respectées, en raison de la base mathématique de chacune de ces approches. Cette différence n’est due qu'au calcul mathématique, il ne s'agit 
pas d'une différence de sensibilité entre les deux variables étudiées. 
Le concept du taux de croissance spécifique moyen repose sur le type général de croissance exponentielle des algues dans des cultures non limitées, où la toxicité est estimée d'après les effets sur le taux 
de croissance, sans tenir compte du niveau absolu du taux de crois ­
sance spécifique du témoin, de la pente de la courbe concentration- effet ni de la durée de l'essai. En revanche, les résultats fondés sur la variable de rendement dépendent de toutes ces autres variables. La 
C
 x E r dépend du taux de croissance spécifique de l'espèce d'algue 
utilisée dans chaque essai et du taux de croissance spécifique maxi ­
mal, susceptible de varier d’une espèce d’algue à une autre, voire d’une souche à une autre. Cette variable ne doit pas être utilisée pour 
comparer la sensibilité des espèces d’algues, voire de différentes 
souches d’algue, à des substances toxiques. S'il est préférable, du point de vue scientifique, d'estimer la toxicité d'après le taux de croissance spécifique moyen, la présente méthode propose également 
des estimations fondées sur le rendement afin de satisfaire à la 
réglementation en vigueur dans certains pays.
 
2.2.1.  Taux de croissance spécifique moyen  
Le taux de croissance spécifique moyen durant une période donnée 
est calculé comme l'accroissement logarithmique de la biomasse, 
pour chaque expérience identique des groupes traités et témoins, 
au moyen de l'équation présentée ci-dessous:  
μ i-j ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (jour  –1 ) 
où: 
μ i-j est le taux de croissance spécifique moyen du temps  i au temps  j 
X i est la biomasse au temps  i; 
X j est la biomasse au temps  j. ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 820
 
Pour chaque groupe traité et témoin, calculer un taux de croissance 
moyen et les estimations de la variance.  
Calculer le taux de croissance spécifique moyen sur toute la durée de 
l'essai (normalement du jour 0 au jour 3), en prenant, comme valeur 
de départ, la valeur nominale de la biomasse ensemencée plutôt que 
sa valeur mesurée, car cela permet généralement d'obtenir une plus grande précision. Si l'instrument utilisé pour mesurer la biomasse autorise des déterminations suffisamment précises d'une petite 
biomasse d'inoculum (par exemple, un cytomètre à flux), la concen ­
tration initiale mesurée de la biomasse peut alors être utilisée. Évaluer également les taux de croissance section par section en considérant, pour ce calcul, qu'ils équivalent aux taux de croissance 
spécifiques de chaque jour de l'essai (jours 0-1, 1-2 et 2-3) et vérifier 
si le taux de croissance des témoins reste constant (voir critères de validité, paragraphe 1.7). Le fait que le taux de croissance spécifique du premier jour soit sensiblement inférieur au taux de croissance 
spécifique moyen peut indiquer une phase de latence. S'il est 
possible de réduire presque à néant la phase de latence dans les cultures témoins par une propagation appropriée de la préculture, la présence d'une phase de latence dans les cultures exposées peut 
refléter un rétablissement après un choc toxique initial ou une expo ­
sition réduite due à une perte de substance d'essai (notamment par sorption sur la biomasse des algues) après l'exposition initiale. Le taux de croissance section par section permet ainsi d'étudier les 
différents effets de la substance d'essai durant la période d'exposition, 
d'où son intérêt. Des différences sensibles entre le taux de croissance section par section et le taux de croissance moyen traduisent un écart 
par rapport à la croissance exponentielle constante et appellent un 
examen attentif des courbes de croissance.
 
Calculer le pourcentage d'inhibition du taux de croissance pour 
chaque expérience identique de chaque groupe traité à l’aide de 
l'équation suivante:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
où: 
%I t est le pourcentage d'inhibition du taux de croissance spécifique 
moyen;  
μ C est la valeur moyenne du taux de croissance spécifique moyen 
(μ) dans le groupe témoin;  
μ T est le taux de croissance spécifique moyen d'une des expériences 
identiques du groupe traité.  
Si les solutions d'essai sont préparées à l'aide d'un solvant, c'est le 
témoin au solvant plutôt que le témoin sans solvant qui doit être utilisé pour calculer le pourcentage d'inhibition.
 
2.2.2.  Rendement  
Le rendement est calculé d'après la différence entre la valeur de la 
biomasse à la fin de l'essai et sa valeur au début de l'essai pour chaque expérience identique des groupes traités et témoins. Pour chaque concentration expérimentale et le témoin, calculer un rende ­
ment moyen ainsi que les estimations de la variance. Le pourcentage 
d'inhibition du rendement (%I
 r ) peut être calculé pour chaque expé ­
rience identique de chaque groupe traité d'après la formule suivante:  
%I r ¼ ðR C – R T Þ 
R C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 821
 
où: 
%I r est le pourcentage d'inhibition du rendement;  
R C est la valeur moyenne du rendement dans le groupe témoin;  
R T est la valeur du rendement dans l'une des expériences identiques 
du groupe traité.  
2.3. TRACÉ DES COURBES CONCENTRATION-EFFET  
Porter sur un graphique le pourcentage d'inhibition en fonction du 
logarithme de la concentration de la substance d'essai et examiner les 
points obtenus attentivement, sans tenir compte des points ayant été éliminés parce que considérés comme des valeurs aberrantes au cours de la première phase. Faire passer une courbe régulière entre les 
points, à vue d'œil ou par interpolation informatique, afin d'obtenir 
une première impression de la relation concentration-effet et pour ­
suivre par une méthode plus détaillée, de préférence une méthode statistique informatisée. En fonction de l'usage auquel on destine les 
données, de la qualité (précision) et de la quantité des données ainsi 
que de la disponibilité des outils d'analyse des données, on pourra décider (et cela se justifiera parfaitement dans certains cas) d'arrêter l'analyse des données à ce stade et de ne retenir que les chiffres clés, 
à savoir la CE
 50 et la CE  10 (et/ou la CE  20 ), de la courbe ajustée à 
vue d'œil (voir également le paragraphe ci-après sur les effets stimu ­
lants). Citons quelques raisons valables de ne pas recourir à une méthode statistique:
 
— traitées par des méthodes informatisées, les données ne livreront 
pas de résultats plus fiables que ceux obtenus par une analyse 
d'expert — dans ces circonstances, certains programmes informa ­
tiques risquent même d'être incapables de produire une solution 
fiable (les itérations peuvent ne pas converger, etc.),  
— les effets stimulant la croissance ne peuvent être traités correcte ­
ment par les programmes informatiques disponibles (voir plus bas).
 
2.4. MÉTHODES STATISTIQUES  
L'objectif consiste à obtenir une relation quantitative concentration- 
effet par une analyse de la régression. Il est possible d'appliquer une régression linéaire pondérée après avoir effectué une transformation 
linéarisant les valeurs décrivant l'effet observé — par exemple, en 
unités probit ou logit ou Weibull (9), mais il est préférable d'appli ­
quer des méthodes de régression non linéaire, celles-ci traitant mieux les irrégularités inévitables des valeurs et les écarts par rapport aux 
distributions régulières. Proches de zéro ou de l'inhibition totale, ces 
irrégularités risquent d'être amplifiées par la transformation et d'inter ­
férer avec l'analyse (9). Notons que les méthodes d'analyse courantes faisant appel aux transformations probit, logit ou Weibull se prêtent 
aux effets par tout ou rien (mortalité ou survie, par exemple) et 
doivent être modifiées pour pouvoir être utilisées avec les valeurs de croissance ou de biomasse. Les références (10)(11) et (12) décri ­
vent des procédures permettant de déterminer les valeurs de la CE
 x à 
partir de données continues. L'utilisation d'une analyse de la régres ­
sion non linéaire est détaillée à l'appendice 4.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 822
 
Pour chaque variable étudiée à analyser, utiliser la relation concen ­
tration-effet pour calculer des estimations ponctuelles des valeurs de 
CE x . Déterminer, si possible, les limites de confiance à 95 % pour 
chaque estimation. La validité de l'ajustement des données décrivant les effets au modèle de régression est à évaluer par un procédé 
statistique ou graphique. L'analyse de la régression doit s'appuyer 
sur les effets relevés dans chaque récipient traité de manière iden ­
tique et non sur les moyennes des groupes traités. Si toutefois, l'ajus ­
tement d'une courbe non linéaire est difficile ou échoue parce que les 
données sont trop dispersées, une régression peut alors être effectuée 
sur les moyennes des groupes, ce qui permet de réduire l'influence des valeurs que l’on soupçonne aberrantes. Le recours à cette option doit être signalé dans le rapport d'essai en tant qu'écart par rapport à 
la procédure normale, dû au fait que l'ajustement de la courbe avec 
les valeurs individuelles des expériences identiques n'a pas livré un bon résultat.
 
Les estimations de la CE  50 et les limites de confiance peuvent aussi 
être obtenues par interpolation linéaire avec  bootstrap  (rééchantillon ­
nage) (13) si les modèles ou les méthodes de régression disponibles 
ne conviennent pas aux données.  
Afin d'estimer la CMEO, et par conséquent la CSEO, pour les effets 
de la substance d'essai sur le taux de croissance, il est nécessaire de comparer les moyennes des groupes traités par des techniques d’ana ­
lyse de la variance (ANOVA). La moyenne de chaque concentration 
doit ensuite être comparée avec la moyenne du témoin à l'aide d'un 
test approprié à comparaisons multiples ou de tendance. Les tests de Dunnett ou de William peuvent être utiles (14)(15)(16)(17)(18). Il est nécessaire de vérifier si l'hypothèse de l’ANOVA de l'homogénéité 
de la variance se confirme. Cette vérification peut être pratiquée par 
un procédé graphique ou par un test formel (18), notamment les tests de Levene ou de Bartlett. L'infirmation de l'hypothèse de l'homogé ­
néité de la variance peut quelquefois être corrigée par une trans ­
formation logarithmique des données. Si l'hétérogénéité de la 
variance est extrême et ne peut être rectifiée par une transformation, on envisagera des méthodes d'analyse telles que les tests de tendance régressifs de Jonkheere. La référence (12) fournit des renseignements 
supplémentaires sur la détermination de la CSEO.
 
Des découvertes récentes ont conduit les scientifiques à préconiser 
l’abandon de la notion de CSEO au profit d’estimations ponctuelles de la CE
 x fondées sur la régression. Aucune valeur de x appropriée 
n'a encore été établie pour cet essai sur les algues. Néanmoins, une 
gamme de 10 à 20 % semble convenir (suivant la variable étudiée 
sélectionnée) et il est préférable de mentionner à la fois la CE  10 et la 
CE 20 dans le rapport.  
2.5. STIMULATION DE LA CROISSANCE  
On observe quelquefois une stimulation de la croissance (inhibition 
négative) aux faibles concentrations. Ce phénomène peut résulter d'une hormèse («stimulation toxique») ou de l'introduction de 
facteurs de stimulation de la croissance, véhiculés par la substance 
d'essai, dans le milieu minimal utilisé. Notons que l'ajout de nutri ­
ments minéraux ne devrait exercer aucun effet direct, étant donné que le milieu d'essai doit contenir un excès de nutriments tout au 
long de l'essai. La stimulation à faible dose peut habituellement être 
ignorée dans les calculs de la CE
 50 , à moins qu'elle ne soit très 
prononcée. Néanmoins, si cette stimulation est extrême ou s'il faut calculer une valeur de CE
 x pour une faible valeur de x, des procé ­
dures particulières pourraient être requises. On évitera, dans la 
mesure du possible, de soustraire les effets stimulants à l'analyse des données et, si le logiciel permettant d'ajuster la courbe ne peut pas accepter une stimulation mineure, une interpolation linéaire avec  
bootstrap  peut être employée. Si la stimulation est extrême, l'utilisa ­
tion d'un modèle d'hormèse est envisageable (19).
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 823
 
2.6. INHIBITION NON TOXIQUE DE LA CROISSANCE  
Les substances d'essai absorbant la lumière peuvent abaisser le taux 
de croissance, car l'obscurcissement diminue la quantité de lumière disponible. Il y a lieu de séparer ces types d'effets physiques des 
effets toxiques en modifiant les conditions expérimentales et de 
rapporter les premiers séparément. Les références (2) et (3) donnent des indications à ce sujet.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D’ESSAI  
Le rapport d'essai doit inclure les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— état physique et propriétés physico-chimiques pertinentes, y 
compris la limite de solubilité dans l'eau,  
— données d’identification chimique, notamment pureté.  
Espèce soumise à l'essai:  
— souche, fournisseur ou source et conditions de culture utilisées.  
Conditions expérimentales:  
— date du début de l'essai et durée de l'essai,  
— description de la conception de l'essai: récipients d'essai, volumes 
des cultures, densité de la biomasse au début de l'essai,  
— composition du milieu,  
— concentrations expérimentales et expériences identiques (par 
exemple, nombre d'expériences identiques, nombre de concentra ­
tions expérimentales et progression géométrique appliquée),  
— description de la préparation des solutions expérimentales, y 
compris l'utilisation de solvants, etc.,  
— appareillage destiné aux cultures,  
— intensité et qualité lumineuses (source, homogénéité),  
— température,  
— concentrations mises à l'essai: concentrations d’essai nominales et 
tous les résultats des analyses visant à déterminer la concentra ­
tion de la substance d'essai dans les récipients expérimentaux. Le 
rendement de récupération de la méthode et le seuil de quantifi ­
cation dans la matrice expérimentale doivent être mentionnés,  
— tous les écarts par rapport à cette méthode d’essai,  
— méthode de détermination de la biomasse et démonstration de la 
corrélation entre le paramètre mesuré et le poids sec.  
Résultats:  
— valeurs du pH au début et à la fin de l'essai dans tous les 
récipients traités,  
— biomasse dans chaque récipient à chaque point de mesure et 
méthode de mesure de la biomasse,  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 824
 
— courbes de croissance (biomasse en fonction du temps),  
— calcul des variables étudiées pour chaque expérience identique de 
chaque traitement ainsi que des moyennes et du coefficient de 
variation des expériences identiques,  
— représentation graphique de la relation concentration-effet,  
— estimation de la toxicité pour les variables étudiées, par exemple 
la CE  50 , la CE  10 et la CE  20 et intervalles de confiance associés; 
CMEO et CSEO, si elles ont été calculées, et méthodes statis ­
tiques appliquées à leur détermination,  
— si une analyse de la variance (ANOVA) a été pratiquée, puis ­
sance de l'effet détectable (par exemple, la différence la moins 
significative),  
— stimulation de la croissance éventuellement observée dans un 
groupe traité,  
— tout autre effet observé, par exemple changement morphologique 
des algues,  
— analyse des résultats, notamment l'influence d'un éventuel écart 
par rapport à cette méthode d’essai sur les résultats de l'essai.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
1) OCDE LD 201 (2006) Algues d'eau douce et cyanobactéries, 
essai d'inhibition de la croissance  
2) ISO 1998: Qualité de l'eau — lignes directrices pour essais 
d'inhibition de la croissance algale avec des matières peu solu ­
bles, des composés volatils, des métaux et des eaux résiduaires. 
ISO/DIS 14442  
3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.
 
4) ISO 1998: Qualité de l'eau — échantillonnage — partie 16: 
lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons. 
ISO 5667-16.  
5) ISO 1993: Qualité de l'eau — essai d'inhibition de la croissance 
des algues d'eau douce avec des algues vertes unicellulaires. ISO 8692.
 
6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.  
7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), pp.919-925  
8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal 
bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079.  
9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 825
 
10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494.
 
12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096-1121  
15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics 20: 482-491.  
16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103-117.  
17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.  
18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 826
 
Appendice 1  
Souches convenant à l'essai  
Algues vertes  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (autrefois dénommée  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG.  
— Desmodesmus subspicatus  (autrefois dénommée  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG.  
Diatomées  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cyanobactéries  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Sources des souches  
Les souches recommandées sont disponibles sous la forme de cultures unialgales 
dans les collections suivantes (par ordre alphabétique):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
ÉTATS-UNIS D'AMÉRIQUE  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
ROYAUME-UNI  
SAG: Collection of Algal Cultures  
Albrecht-von-Haller-Institut  
University of Göttingen  
Nicholausberger Weg 18  
D-37073 Göttingen  
ALLEMAGNE  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
ÉTATS-UNIS D'AMÉRIQUE  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 827
 
Aspect et caractéristiques des espèces recommandées  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Aspect Cellules soli ­
taires, incur ­
vées et torses Cellules 
ovales et soli ­
taires la plupart du temps Bâtonnets Chaînes de 
cellules 
ovales Bâtonnets 
Dimensions (L × l) μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volume cellulaire ( μm
 3 /cellule) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Poids sec des cellules (mg/cellule) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Taux de croissance (  3 ) (jour  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Mesuré avec un compteur électronique de particules. 
( 2 ) Calculé d’après la taille. 
( 3 ) Taux de croissance le plus souvent observé dans le milieu de l'OCDE sous une intensité lumineuse approximative de 70 μE·m  –2 ·s –1 
et à 21 °C.  
Recommandations particulières pour la culture et la manipulation des 
espèces d'essai recommandées  
Pseudokirchneriella subcapitata  et Desmodesmus subspicatus  
Ces algues vertes sont généralement faciles à cultiver dans différents milieux de 
culture. Les collections de cultures renseignent les utilisateurs sur les milieux 
appropriés. Les cellules sont normalement solitaires, et la densité cellulaire se 
mesure aisément à l'aide d'un compteur électronique de particules ou d'un micro ­
scope.  
Anabaena flos-aquae  
La culture mère se conserve dans divers milieux de croissance. Il importe parti ­
culièrement d'éviter que la culture des lots ait dépassé la phase exponentielle de croissance au moment du renouvellement, le rétablissement étant difficile à ce stade.
 
Anabaena flos-aquae  forme des chaînes de cellules enroulées en pelotes (agré ­
gats). La dimension de ces agrégats est susceptible de varier en fonction des conditions de culture. Il peut s'avérer nécessaire de dissocier ces agrégats pour compter les cellules au microscope ou avec un compteur électronique de parti ­
cules, afin de déterminer la biomasse.
 
Les chaînes de sous-échantillons peuvent être rompues en différents points par 
sonication, afin de réduire la variabilité lors du comptage. Une sonication plus longue que celle requise pour couper les chaînes en petits segments risque de 
détruire les cellules. L'intensité et la durée de la sonication doivent être identiques 
pour chaque traitement.
 
On dénombrera suffisamment de champs sur l'hémocytomètre (au moins quatre 
cents cellules) afin de compenser la variabilité. Cela augmentera la fiabilité des 
déterminations de la densité au microscope.  
Après le découpage des chaînes de cellules par une sonication menée délicate ­
ment, le volume cellulaire total d' Anabaena  peut être déterminé avec un 
compteur électronique de particules. Il convient de régler l'énergie de la sonica ­
tion de façon à éviter de briser les cellules.  
Utiliser un mélangeur à vortex ou un instrument analogue pour s'assurer que la 
suspension d'algues utilisée pour ensemencer les récipients d'essai est bien 
mélangée et homogène.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 828
 
Les récipients d'essai doivent être placés sur une table d’agitation animée d'un 
mouvement orbital ou de va-et-vient à environ cent cinquante tours par minute. 
Les Anabaena  peuvent également être agitées par intermittence de façon à former 
moins d'agrégats. Si elles s'agrègent, on veillera à prélever des échantillons représentatifs pour les mesures de biomasse. Une agitation vigoureuse avant le 
prélèvement peut être nécessaire pour désagréger les agrégats d’algues.
 
Synechococcus leopoliensis  
La culture mère se conserve dans divers milieux de croissance. Les collections de 
cultures renseignent les utilisateurs sur les milieux appropriés.  
Synechococcus leopoliensis  croît en formant des bâtonnets solitaires. La très 
petite dimension des cellules rend difficile le comptage au microscope pour les mesures de biomasse. Dans ce cas, il est utile de disposer d'un compteur élec ­
tronique capable de dénombrer des particules mesurant jusqu'à 1 μm. Une mesure 
par fluorométrie in vitro convient également.
 
Navicula pelliculosa  
La culture mère se conserve dans divers milieux de croissance. Les collections de 
cultures renseignent les utilisateurs sur les milieux appropriés. Ici, le milieu doit 
être additionné de silicate.  
Navicula pelliculosa  peut former des agrégats dans certaines conditions de 
culture. À cause de leur production lipidique, les cellules algales tendent parfois à s'accumuler dans le film qui se forme à la surface. Si tel est le cas, 
des mesures spéciales accompagneront le prélèvement de sous-échantillons en 
vue de la détermination de la biomasse, afin d'assurer la représentativité des échantillons. Une agitation vigoureuse, par exemple au moyen d'un mélangeur à vortex, peut être nécessaire.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 829
 
Appendice 2  
Milieux de croissance  
L'un des deux milieux de croissance suivants peut être utilisé:  
Milieu de l'OCDE: milieu de la première version de la ligne directrice 201 de 
l'OCDE, conforme à la norme ISO 8692  
Milieu AAP de l'Agence pour la protection de l'environnement des États-Unis 
(US EPA), conforme à l'ASTM.  
Ces milieux doivent être préparés avec des produits de qualité «réactifs» ou 
«pour analyse» et de l'eau désionisée.  
Composition du milieu AAP (US EPA) et du milieu de la ligne directrice 201 de l'OCDE  
Ingrédient US EPA OCDE 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Le rapport molaire de l'EDTA sur le fer est légèrement supérieur à l'unité. Cela empêche le fer de précipiter 
et réduit en même temps au minimum la chélation des ions de métaux lourds.  
Dans l'essai mené sur la diatomée  Navicula pelliculosa , les deux milieux doivent 
être additionnés de Na  2 SiO  3 9H 2 O, afin d'atteindre une concentration de 1,4 mg 
de Si/l.  
Le pH du milieu est obtenu à l'équilibre entre le système carbonate du milieu et 
la pression partielle de CO  2 dans l'air atmosphérique. Le pH à 25 °C et la 
concentration molaire de bicarbonate sont liés de façon approximative par l'équa ­
tion suivante:  
pH équ = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 830
 
Avec 15 mg/l de NaHCO  3 , le pH  équ = 7,5 (milieu de l'US EPA) et avec 50 mg/l 
de NaHCO  3 , le pH  équ = 8,1 (milieu de l'OCDE).  
Composition élémentaire du milieu d'essai  
Élément US EPA OCDE 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Préparation du milieu de l’OCDE  
Élément nutritif Concentration dans la solution mère 
Solution mère 1: macroéléments  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Solution mère 2: fer  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Solution mère 3: oligoéléments  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Solution mère 4: bicarbonate  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane (diamètre moyen des 
pores: 0,2 μm) ou à l'autoclave (15 minutes à 120 °C). Stocker les solutions à 
l'obscurité et à 4 °C.  
Ne pas autoclaver les solutions mères 2 et 4 mais les stériliser par filtration sur 
membrane.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 831
 
Préparer le milieu de croissance en ajoutant un volume approprié des solutions 
mères 1 à 4 à de l'eau:  
Ajouter à 500 ml d'eau stérilisée:  
— 10 ml de solution mère 1,  
— 1 ml de solution mère 2,  
— 1 ml de solution mère 3,  
— 1 ml de solution mère 4.  
Porter à 1 000 ml avec de l'eau stérilisée.  
Attendre que le milieu atteigne l'équilibre avec le CO  2 atmosphérique, si néces ­
saire en y faisant barboter de l'air stérile et filtré durant quelques heures.  
Préparation du milieu AAP  
A1.1. Ajouter 1 ml de chaque solution mère visée aux points A1.2.1 à A1.2.7 
ci-après à environ 900 ml d'eau désionisée ou distillée, et porter le 
volume à 1 litre.  
A1.2. Préparer les solutions mères de macroéléments en dissolvant les 
composés suivants dans 500 ml d'eau désionisée ou distillée. Les réac ­
tifs A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 et A1.2.4 peuvent être combinés dans une seule solution mère.
 
A1.2.1.  NaNO  3 – 12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 · 6H 2 O – 6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O – 2,205 g.  
A1.2.4.  Solution mère d’oligoéléments  (voir A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 – 0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 – 7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O — Voir note A1.1.  
NOTE A1.1 . — À n'utiliser que pour les diatomées. Peut être ajouté 
directement (202,4 mg) ou véhiculé dans une solution mère pour donner une concentration finale de 20 mg/l en Si dans le milieu.
 
A1.3. Préparer la solution mère d'oligoéléments en dissolvant les composés 
suivants dans 500 ml d'eau désionisée ou distillée:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 –92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O– 207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 –1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O–79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O–0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O–3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O–0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O– 150,000 mg.  
[Ethylènedinitrilotétraacétate de sodium].  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 832
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O–0,005 mg; voir note A1.2.  
NOTE A1.2 . — À n'utiliser que dans le milieu pour les substances 
mères des diatomées.  
A1.4. Ajuster le pH à 7,5 ± 0,1 avec du NaOH ou de l'HCl 0,1  N ou 1,0  N. 
A1.5. Filtrer le milieu dans un récipient stérile sur un filtre à membrane à 
pores de 0,22 μm si l'on utilise un compteur de particules, ou sur un 
filtre à pores de 0,45 μm si l'on n'utilise pas de compteur de particules.  
A1.6. Garder le milieu à l'obscurité, à environ 4 °C jusqu'à son utilisation.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 833
 
Appendice 3  
Exemple de méthode de culture des algues  
Observations générales  
La méthode suivante s'applique à la culture des algues destinées aux essais de 
toxicité.  
Il convient d'utiliser des méthodes préservant les cultures d'algues de toute conta ­
mination bactérienne. Il peut être souhaitable d'établir des cultures axéniques, 
mais il faut employer des cultures unialgales.  
Toutes les opérations doivent être réalisées dans des conditions stériles, afin 
d'éviter toute contamination par des bactéries ou d'autres algues.  
Matériel  
Voir à la section «Appareillage» de la méthode d'essai.  
Procédé d'obtention de cultures d'algues  
Préparation de solutions nutritives (milieu):  
Tous les sels minéraux du milieu sont préparés sous la forme de solutions mères 
concentrées et entreposées au frais et à l'abri de la lumière. Ces solutions sont 
stérilisées par filtration ou à l'autoclave.  
On prépare le milieu en ajoutant une quantité correcte de solution mère à de l'eau 
distillée stérile, en prenant bien soin d'éviter tout risque d'infection. Pour les 
milieux solides, on ajoute 0,8 % d'agar.  
Culture mère:  
Les cultures mères qui servent de matériau d'essai initial sont de petites cultures 
d'algues régulièrement transférées dans un milieu frais. Si les cultures ne sont pas 
utilisées régulièrement, il convient de les étaler en stries dans des tubes inclinés 
remplis d'agar. Ces cultures sont transférées dans un milieu frais au moins une fois tous les deux mois.
 
Les cultures mères sont cultivées dans des erlenmeyers contenant le milieu 
approprié (volume de quelque 100 ml). Lorsque les algues sont incubées 
à 20 °C sous un éclairage permanent, un transfert hebdomadaire s'impose.  
Lors du transfert, on transvase avec des pipettes stériles une quantité de «vieille» 
culture dans un flacon de milieu frais de manière que, pour les espèces à crois ­
sance rapide, la concentration initiale soit environ cent fois inférieure à ce qu'elle 
était dans la vieille culture.  
Le taux de croissance d'une espèce peut être déterminé à partir de la courbe de 
croissance. S'il est connu, il est possible d'estimer la densité à laquelle la culture doit être introduite dans le nouveau milieu. Il convient de le faire avant que la culture n'atteigne la phase de mort.
 
Préculture:  
La préculture sert à fournir une quantité d'algues suffisante pour l'ensemencement 
des cultures d'essai. La préculture est incubée dans les conditions de l'essai et utilisée lorsqu'elle est encore en croissance exponentielle, normalement après une 
période d'incubation de deux à quatre jours. Si les cultures d'algues renferment 
des cellules déformées ou anormales, il faut éliminer ces cultures.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 834
 
Appendice 4  
Analyse des données par une régression non linéaire  
Considérations générales  
L'effet observé dans les essais sur les algues et autres essais sur la croissance de 
micro-organismes (augmentation de la biomasse) est, par nature, exprimé par une 
variable continue ou métrique — le rythme d'un processus si l'on utilise le taux 
de croissance et son intégrale en fonction du temps si on choisit la biomasse. Ces deux variables sont comparées à l'effet moyen correspondant observé sur des témoins non exposés (représentés en plusieurs exemplaires identiques) manifes ­
tant un effet maximal dans les conditions imposées, la lumière et la température 
étant les principaux facteurs déterminants dans l'essai sur les algues. Le système est distribué ou homogène, et la biomasse peut être considérée comme un conti ­
nuum, en faisant abstraction des cellules individuelles. La distribution de la 
variance du type d'effet d'un tel système ne dépend que des facteurs expérimen ­
taux (décrits généralement par les distributions log-normales ou normales de l'erreur), et ce, contrairement aux bioessais classiques où les effets sont exprimés par des réponses par tout ou rien, pour lesquelles il est souvent admis que la 
tolérance (affichant généralement une distribution binomiale) de chaque orga ­
nisme constitue la composante dominante de la variance. Dans ce cas, l'effet relevé chez les témoins est nul ou assimilé à un niveau de fond.
 
Dans la situation simple, l'effet normalisé ou relatif, r, décroît de 1 (inhibition 
nulle) à 0 (inhibition à 100 %). Notons que tous les effets ont une erreur associée 
et qu'il est possible de calculer les inhibitions négatives apparentes en considérant qu'elles résultent uniquement de l'erreur aléatoire.
 
Analyse de la régression  
Modèles  
Une analyse de régression a pour objet de décrire quantitativement la courbe 
concentration-effet sous la forme d'une fonction mathématique de régression Y = 
f(C) ou, plus souvent, F(Z) où Z = log C. La fonction inverse, C = f  –1 (Y) permet 
de calculer des valeurs de la CE  x , notamment les CE  50 , CE  10 et CE  20 , et leurs 
limites de confiance à 95 %. Il se trouve que plusieurs fonctions mathématiques simples décrivent correctement la relation concentration-effet obtenue dans les 
essais d'inhibition de la croissance des algues. Parmi ces fonctions, citons l'équa ­
tion logistique, l'équation asymétrique de Weibull et la distribution log-normale, qui sont toutes des courbes sigmoïdes se rapprochant asymptotiquement de un pour C → 0 et de zéro pour C → infini.
 
L'utilisation de modèles de fonctions de seuil continues (par exemple, le modèle 
de Kooijman pour «l'inhibition de la croissance de la population», Kooijman et al., 1996) constitue une solution récemment proposée, différente des modèles asymptotiques. Ce modèle suppose qu'il n'y ait pas d'effet aux concentrations 
inférieures à un certain seuil, CE0+, estimé par une extrapolation de la relation 
concentration-effet consistant à intercepter l'axe des concentrations à l'aide d'une fonction continue simple non différentiable au point de départ.
 
Notons que l'analyse peut être une simple minimisation des sommes des carrés 
résiduels (en supposant que la variance soit constante) ou des carrés pondérés si 
l'hétérogénéité de la variance est compensée.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 835
 
Marche à suivre  
Sélectionner une équation fonctionnelle appropriée, Y = f(C), et l'ajuster aux 
données par une régression non linéaire. Utiliser de préférence les mesures rele ­
vées dans chaque flacon, plutôt que les moyennes des expériences identiques, afin de tirer un maximum d'informations des données. D'un autre côté, si la 
variance est élevée, l'expérience pratique nous porte à croire que les moyennes 
des expériences identiques peuvent fournir une estimation mathématique plus solide, moins influencée par les erreurs aléatoires des données que chaque point pris individuellement.
 
Porter sur un graphique les valeurs mesurées et la courbe ajustée et vérifier si 
l'ajustement est valable. L'analyse des valeurs résiduelles peut être particulière ­
ment utile à ce propos. Si la fonction choisie pour ajuster la courbe concentra ­
tion-effet ne décrit pas bien l'ensemble de la courbe ou une partie essentielle de celle-ci, telle que les effets aux faibles concentrations, choisir un autre modèle d'ajustement, par exemple une courbe asymétrique, telle que la fonction de 
Weibull, à la place d'une fonction symétrique. Les inhibitions négatives 
peuvent poser un problème, par exemple avec la fonction de distribution log- normale, qui nécessitera, de la même manière, la recherche d'une autre fonction de régression. Il est déconseillé d'assigner une valeur nulle ou une faible valeur 
positive à ces valeurs négatives parce que cela fausse la distribution des erreurs. 
Il peut être utile de procéder à des ajustements séparés sur des portions de la courbe telles que celle où l'inhibition est faible, afin d'estimer les valeurs de CE
 x 
faibles  . En partant de l'équation ajustée [par «estimation inverse», C = f  –1 (Y)], 
calculer des estimations ponctuelles caractéristiques des CE  x et rapporter au 
moins la CE  50 et une ou deux CE  x faibles  . La pratique des essais a montré que 
la précision de l'essai sur les algues permettait normalement d'effectuer une 
estimation raisonnablement précise au seuil de 10 % d'inhibition si les points 
dont on dispose sont en nombre suffisant — à moins qu'une stimulation ne survienne aux faibles concentrations, ce qui créerait une confusion. La précision de l'estimation de la CE
 20 est souvent bien meilleure que celle de la CE  10 , parce 
que la CE  20 se situe généralement sur la partie à peu près linéaire de la courbe 
concentration-effet centrale. Quelquefois, la CE  10 peut être difficile à interpréter à 
cause de la stimulation de la croissance, de sorte que, même si la CE  10 s'obtient 
généralement avec une précision suffisante, il est toujours recommandé de 
mentionner également la CE  20 . 
Facteurs de pondération  
En général, la variance expérimentale n’est pas constante et inclut une compo ­
sante proportionnelle, d'où l'intérêt de procéder d'office à une régression pondé ­
rée. Les facteurs de pondération s'appliquant à une telle analyse sont normale ­
ment supposés être inversement proportionnels à la variance:  
W i = 1/Var(r  i ) 
De nombreux programmes de régression permettent d'effectuer une analyse de 
régression pondérée avec des facteurs de pondération repris dans un tableau. Pour 
se simplifier la tâche, il faudrait normaliser les facteurs de pondération en les multipliant par n/ ∑ w
 i (n étant le nombre de points), de telle sorte que leur 
somme soit égale à un.  
Normalisation des valeurs prises par les effets  
La normalisation par la valeur moyenne de l’effet sur les témoins pose certains 
problèmes de principe et donne une structure de variance plutôt compliquée. En divisant les valeurs par la valeur moyenne des témoins en vue d'obtenir le pourcentage d'inhibition, on introduit une erreur supplémentaire due à l'erreur 
sur la moyenne des témoins. À moins que cette erreur ne soit négligeable, les 
facteurs de pondération appliqués à la régression et les limites de confiance doivent être corrigés en fonction de la covariance avec le témoin (17). Notons qu'il est important d'obtenir une précision élevée pour la moyenne estimée des 
valeurs affichées par les témoins, afin de minimiser la variance globale de l'effet 
relatif. Cette variance se calcule comme suit
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(l'indice i fait référence au niveau de concentration i et l'indice 0 aux témoins):  
Y i = effet relatif = r  i /r 0 = 1 — I = f(C  i ) 
avec une variance  
Var(Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (δY i / δr i ) 2 · Var(r  i ) + (δY i / δr 0 ) 2 ·Var(r  0 ) 
et comme  
(δ Y i / δ r i ) = 1/r  0 et (δ Y i / δ r 0 ) = r  i /r 0 2 
avec des données à distribution normale et des expériences identiques m  i et m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
la variance totale de l'effet relatif Y  i devient donc  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
L'erreur sur la moyenne du témoin est inversement proportionnelle à la racine 
carrée du nombre d'expériences identiques du témoin prises en compte dans la 
moyenne, et il est quelquefois justifié d'inclure des données antérieures, ce qui 
réduit considérablement l'erreur. Il est également possible de ne pas normaliser les données ni d'ajuster les effets absolus, y compris l'effet affiché par le témoin, mais d'introduire la valeur de l'effet prise par le témoin en tant que paramètre 
supplémentaire à ajuster par une régression non linéaire. Avec une équation de 
régression ordinaire à deux paramètres, cette méthode requiert l'ajustement de trois paramètres et demande, par conséquent, plus de points qu'une régression non linéaire pratiquée sur des données normalisées à l'aide d'une valeur de l'effet 
prise par le témoin déterminée à l'avance.
 
Intervalles de confiance inverses  
Le calcul des intervalles de confiance d'une régression non linéaire par une 
estimation inverse est assez complexe et ne figure généralement pas parmi les 
options livrées avec les programmes courants de calcul statistique. Des limites de 
confiance approximatives peuvent être obtenues avec des programmes classiques de régression non linéaire, à l'aide d'une reparamétrisation (Bruce et Versteeg, 1992), consistant à reformuler l'équation mathématique en prenant les estimations 
ponctuelles désirées, par exemple la CE
 10 et la CE  50 , comme paramètres à 
estimer [soit la fonction I = f ( α, β, concentration), utilisons les relations de 
définition f ( α, β, CE  10 ) = 0,1 et f ( α, β, CE  50 ) = 0,5 pour remplacer f ( α, β, 
concentration) par une fonction équivalente g (CE  10 , CE  50 , concentration)].  
Il existe un calcul plus direct (Andersen et al., 1998) effectué en conservant 
l'équation d'origine et en appliquant une expansion de Taylor autour des moyennes de r
 i et r  0 . 
Les procédés par  bootstrap , introduits récemment, sont appréciés. Ces procédés 
utilisent les données mesurées et un rééchantillonnage fréquent dirigé par un 
générateur de nombre aléatoire, pour estimer une distribution empirique de la 
variance.  
Bibliographie  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 837
 
C.4. DÉTERMINATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ «FACILE»  
PARTIE I.  GÉNÉRALITÉS  
I.1. INTRODUCTION  
Six méthodes d'essai permettant d'évaluer la biodégradabilité facile 
de produits chimiques en milieu aqueux en aérobiose sont décrites:  
a) Disparition du carbone organique dissous (COD) (Méthode 
C.4-A)  
b) Essai de screening modifié de l'OCDE — Disparition du COD — 
(Méthode C.4-B)  
c) Dégagement de dioxyde de carbone (CO  2 ) (Essai Sturm modifié) 
(Méthode C.4-C)  
d) Respirométrie manométrique (Méthode C.4-D)  
e) Fiole fermée (Méthode C.4-E)  
f) MITI (ministère de l'industrie et du commerce international — 
Japon) (Méthode C.4-F)  
La partie I contient des considérations d'ordre général ainsi que des 
considérations communes aux six essais. Les particularités propres à 
chaque méthode sont décrites dans les parties II à VII. Les annexes contiennent définitions, formules et données de référence.
 
Un exercice comparatif interlaboratoires de l'OCDE, réalisé en 1988, 
a montré que ces méthodes donnent des résultats comparables. Toutefois, l'une ou l'autre de ces méthodes peut être préférable en fonction des caractéristiques physiques de la substance.
 
I.2. CHOIX DE LA MÉTHODE APPROPRIÉE  
Il est essentiel, pour choisir la méthode la mieux appropriée, de 
disposer d'informations concernant la solubilité, la pression de 
vapeur et les caractéristiques d'adsorption de la substance à étudier. 
Pour calculer la valeur théorique et/ou vérifier les valeurs mesurées d'un paramètre tel que la DThO, le CO
 2 Th, le COD, le COT et la 
DCO (voir annexes I et II), il est nécessaire de connaître la structure 
chimique ou la formule brute du produit.  
Toutes ces méthodes sont applicables aux substances d'essai qui 
peuvent être dissoutes dans l'eau à des concentrations de 100 mg/l 
au moins, pourvu qu'elles ne soient ni volatiles ni adsorbables. Dans 
le cas de produits peu hydrosolubles, volatiles ou adsorbables, les méthodes appropriées sont indiquées dans le tableau 1. La manière de procéder avec les produits faiblement hydrosolubles et les subs ­
tances volatiles est décrite à l'annexe III. Les substances modérément 
volatiles peuvent être étudiées à l'aide de la méthode de disparition du COD pourvu que les récipients d'essai contiennent un volume gazeux suffisant et qu'ils soient fermés de manière appropriée. 
Dans ce cas, un contrôle abiotique doit toutefois être prévu afin de 
tenir compte de toute perte physique.
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Tableau 1  
Limites d'application des méthodes d'essai  
Essai Méthode analytique Approprié pour les substances qui sont: 
faiblement 
solubles volatiles adsorbables  
Disparition du COD Carbone organique dissous — — +/- 
Screening modifié de 
l'OCDE Carbone organique dissous — — +/- 
Dégagement de CO  2 Respirométrie: dégagement 
de CO  2 + — + 
Respirométrie manométrique Respirométrie manomé ­
trique: consommation 
d'oxygène + +/- + 
Fiole fermée Respirométrie: oxygène 
dissous +/- + + 
MITI Respirométrie: consomma ­
tion d'oxygène + +/- +  
L'interprétation des résultats obtenus nécessite des informations sur 
la pureté de la substance à étudier ou sur les proportions relatives de 
ses principaux composants, en particulier lorsque ces résultats sont 
faibles ou marginaux.  
Il peut être extrêmement utile de disposer d'informations sur la toxicité 
du produit à étudier vis-à-vis des bactéries (annexe IV) pour choisir les concentrations d'essai appropriées et interpréter les résultats de biodé ­
gradation, notamment lorsque les valeurs sont peu élevées.
 
I.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
La procédure est contrôlée à l'aide de substances de référence répon ­
dant aux critères de biodégradabilité facile. Ces substances sont 
étudiées parallèlement aux substances d'essai en ajoutant une fiole 
appropriée à la série normale d'essais.  
Les produits chimiques adéquats sont l'aniline (fraîchement distillée), 
l'acétate de sodium et le benzoate de sodium. Ces produits de réfé ­
rence sont tous dégradés dans les conditions de ces méthodes, même 
si aucun inoculum n'est délibérément ajouté.  
Il avait été suggéré de retenir un produit de référence qui soit faci ­
lement biodégradable, mais qui nécessite l'addition d'un inoculum. 
L'hydrogéno-phtalate de potassium a été proposé mais le bien-fondé de son utilisation reste à démontrer, avant de l'accepter comme subs ­
tance de référence.
 
Dans le cas des essais respirométriques, les composés azotés peuvent 
influencer la consommation d'oxygène du fait de la nitrification (voir 
les annexes II et V).  
I.4. PRINCIPE DES MÉTHODES D'ESSAI  
Une solution ou une suspension de la substance à étudier dans un 
milieu minéral est ensemencée et incubée en aérobiose, dans l'obscurité 
ou sous lumière diffuse. La quantité de COD due à l'inoculum présente dans la solution d'essai doit être aussi faible que possible par rapport à la quantité de COD provenant de la substance à étudier. L'activité 
endogène de l'inoculum est estimée en effectuant parallèlement des 
essais à blanc avec l'inoculum mais sans addition de substance à étudier, quoique l'activité endogène des cellules en présence de la subs ­
tance ne correspond pas exactement à celle de ce contrôle endogène. 
Un essai avec une substance de référence est effectué en parallèle pour 
vérifier le fonctionnement de ces procédures.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 839
 
La dégradation est en général suivie par la détermination de paramè ­
tres comme le COD, la production de CO  2 ou la consommation 
d'oxygène et les mesures sont effectuées avec une fréquence suffi ­
sante pour permettre l'identification du commencement et de la fin de la biodégradation. Les respiromètres automatiques permettent d'effec ­
tuer des mesures en continu. Le COD est parfois mesuré en plus d'un 
autre paramètre, mais cela n'est généralement le cas qu'au début et à la fin de l'essai. Une analyse chimique spécifique peut également servir à évaluer la dégradation primaire de la substance à étudier 
et à déterminer la concentration de toutes les substances inter ­
médiaires formées (obligatoire dans l'essai MITI).
 
L'essai dure normalement 28 jours. Un essai peut cependant être 
interrompu avant, dès lors que la courbe de biodégradation atteint 
un plateau qui se prolonge au moins sur trois mesures. Un essai peut 
également être prolongé au-delà de 28 jours si la courbe montre que la biodégradation a manifestement commencé sans toutefois avoir atteint un palier le 28
 e jour. 
I.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
I.5.1.  Reproductibilité  
En raison de la nature de la biodégradation et de l'hétérogénéité des 
populations bactériennes utilisées comme inoculum, les mesures 
doivent être effectuées au moins en double.  
On observe souvent que plus la concentration initiale des micro- 
organismes ajoutés au milieu d'essai est élevée, plus la variation entre les répétitions est faible. Des essais d'intercomparaison ont 
également montré que des variations importantes peuvent apparaître 
entre les résultats obtenus dans différents laboratoires, mais les résul ­
tats relatifs aux produits de référence facilement biodégradables sont généralement en bonne harmonie.
 
I.5.2.  Validité de l'essai  
Un essai est considéré comme valable si la différence entre les 
valeurs extrêmes en double de la mesure de la disparition du produit à étudier, au niveau du plateau, à la fin de l'essai ou à la fin de la fenêtre de 10 jours, est inférieure à 20 % et si le pourcen ­
tage de dégradation du produit de référence a atteint le niveau corres ­
pondant à une biodégradabilité facile en 14 jours. Si l'une de ces conditions n'est pas remplie, l'essai devra être recommencé. En 
raison du caractère rigoureux de ces méthodes, un résultat peu 
élevé ne signifie pas nécessairement que la substance soumise à l'essai n'est pas biodégradable dans les conditions de l'environne ­
ment; il indique seulement que d'autres études seront nécessaires 
pour en faire la preuve.
 
Si, lors d'un essai de toxicité effectué avec une solution contenant à 
la fois la substance à étudier et un produit de référence, la dégrada ­
tion est inférieure à 35 % (établie d'après le COD) ou à 25 % (établie 
d'après la DThO ou le CO  2 Th) au cours des 14 premiers jours, on 
peut estimer que le produit a un effet inhibiteur (voir également l'annexe IV). La série d'essais doit être recommencée, si possible en utilisant une concentration de substance à étudier plus faible 
et/ou une concentration d'inoculum plus élevée, sans toutefois 
dépasser 30 mg/l de matière en suspension.
 
I.6. PROCÉDURES ET PRÉPARATIONS GÉNÉRALES  
Les conditions générales qui s'appliquent aux essais sont résumées 
dans le tableau 2. Les appareils et les conditions expérimentales 
spécifiques d'un essai particulier sont décrits ci-après dans les chapi ­
tres consacrés à chaque essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 840
 
Tableau 2  
conditions d'essai  
Essai Disparition du 
COD Dégagement de 
CO 2 Respirométrie 
manométrique Screening 
modifié de 
l'OECD Fiolé fermée MITI (1)  
Concentration 
de la subs ­
tance à 
étudier 
en: mg/l C 100 2-10 100 mg/l COD 10-40 10-20 10-40 mg/l DThOD 50-100 5-10 
Concentration 
de l'inoculum (approxima ­
tive, en 
cellules/l) ≤ le; 30 mg/l MES 
ou ≤ le; 100 ml/l d'effluent 
(10
 7 — 10  8 ) 0,5 ml/l 
d'effluent se ­
condaire 
(10 5 ) jusqu'a 5 ml/ 
l d'effluent 
(10 4 — 10  6 ) 30 mg/l MES 
(10 7 — 10  8 ) 
Concentration 
d'éléments 
dans le milieu 
minéral (en mg/l): 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 112 12,2 36,5 
Mg 2,2 2,2 6,6 
Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 de préférence 
7,0 
Température 22 ±
 o C 25 ± 1  o C 
COD = Carbone Organique Dissout DThOD = Demande 
Théorique en 
Oxygène MES = Matières en 
Suspension  
I.6.1.  Eau de dilution  
De l'eau désionisée ou distillée, exempte de substances toxiques à 
des concentrations inhibitrices (tels que des ions Cu  + + ), est utilisée. 
Elle ne contient pas plus de 10 % de la quantité de carbone orga ­
nique introduite par la substance à étudier. L'eau d'essai doit être d'un haut degré de pureté afin d'éviter des valeurs élevées dans les essais à blanc. Des contaminations peuvent provenir non seulement 
des impuretés inhérentes, mais également des résines échangeuses 
d'ions et de matières provenant de la lyse des bactéries et des algues. Pour chaque série d'essais, n'utiliser qu'un même lot d'eau dont la teneur en COD doit être analysée au préalable. Une telle 
analyse n'est pas nécessaire pour l'essai en fiole fermée, mais la 
consommation en oxygène à partir de l'eau doit être faible.
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I.6.2.  Solutions mères de sels minéraux  
Les solutions de sels minéraux utilisées pour l'essai sont préparées à 
partir de solutions mères de concentration appropriée. Les solutions mères décrites ci-après peuvent être utilisées (avec différents facteurs 
de dilution) dans les méthodes de disparition du COD, de screening 
modifié de l'OCDE, de dégagement de CO
 2 , de respirométrie mano ­
métrique et dans l'essai en fiole fermée.  
Les facteurs de dilution et, pour l'essai MITI, la préparation spéci ­
fique du milieu minéral sont mentionnés dans les chapitres consacrés à chaque essai.
 
Solutions mères:  
Les solutions mères suivantes sont préparées en utilisant des réactifs 
de qualité analytique: 
a) Dihydrogénophosphate de potassium KH  2 PO 4 8,50 g 
Monohydrogénophosphate de potassium K  2 HPO  4 21,75 g 
Monohydrogénophosphate de sodium dihydraté 
Na 2 HPO  4 2H 2 0 33,40 g 
Chlorure d'ammonium NH  4 Cl 0,50 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre. Le pH de la solution doit être égal à 7,4. 
b) Chlorure de calcium, anhydre CaCl  2 27,50 g 
ou chlorure de calcium dihydraté CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre 
c) Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO  4 ,7 
H 2 O 22,50 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre 
d) Chlorure de fer (III) hexahydraté, FeCl  3 , 6 H  2 O 0,25 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre  
Note:  Afin d'éviter d'avoir à préparer cette solution immédiatement 
avant usage, ajouter une goutte d'HCl concentré ou 0,4 g/1 de sel disodique d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA).
 
I.6.3.  Solutions mères de produits chimiques  
Dissoudre, si la solubilité excède 1 g/1, par exemple, entre 1 et 10 g, 
selon les cas, de substance à étudier ou de substance de référence 
dans de l'eau désionisée et compléter le volume à 1 litre. Dans le cas 
contraire, préparer des solutions mères dans du milieu minéral ou ajouter directement le produit au milieu minéral. Dans le cas de substances de plus faible solubilité, se référer à l'annexe III, mais 
noter que, dans l'essai MITI (Méthode C.4-F), aucun solvant ni 
émulsifiant ne doit être utilisé.
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I.6.4.  Inoculums  
L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées, 
effluents non chlorés, eaux de surface, sols, ou encore un mélange de ceux-ci. Pour les essais de disparition du COD, de dégagement de 
CO
 2 et de respirométrie manométrique, si des boues activées sont 
utilisées, elles doivent provenir d'une station d'épuration ou d'une unité pilote traitant principalement des eaux ménagères. Il a été montré que les inoculums provenant d'autres sources donnent des 
résultats plus dispersés. Pour l'essai de screening modifié de 
l'OCDE et l'essai en fiole fermée, il convient d'utiliser un inoculum plus dilué ne contenant pas de flocs de boue et la source la plus 
appropriée consiste en un effluent secondaire d'une station d'épura ­
tion des eaux résiduaires urbaines ou d'une installation à l'échelle du laboratoire. Pour l'essai MITI, l'inoculum, qui provient d'un mélange de plusieurs origines, est décrit dans le chapitre consacré à cet essai.
 
I.6.4.1.  lnoculum provenant de boues activées  
Recueillir un échantillon de boue activée dans le compartiment d'aé ­
ration d'une station d'épuration traitant des eaux résiduaires ou d'une 
installation à l'échelle du laboratoire traitant principalement les eaux ménagères. Éliminer, si nécessaire, les grosses particules par filtra ­
tion à travers un tamis fin et conserver ensuite la boue en aérobiose.
 
Une autre possibilité consiste à laisser la boue sédimenter ou à la 
centrifuger (par exemple à 1 100 g pendant 10 mn) après avoir 
éliminé toutes les grosses particules. Écarter le surnageant. La boue peut être lavée dans le milieu minéral. Mettre la boue concen ­
trée en suspension dans un milieu minéral de telle sorte que la 
concentration soit comprise entre 3 et 5 g/1 de matière en suspen ­
sion. Aérer la suspension jusqu'à son utilisation.
 
Les boues doivent provenir d'une station conventionnelle fonction ­
nant bien. Si elles proviennent d'une station d'épuration dont le débit 
est important ou si elles sont susceptibles de contenir des inhibiteurs, 
elles doivent être lavées. Laisser sédimenter ou centrifuger la boue remise en suspension par une agitation vigoureuse, écarter le surnageant et remettre la boue lavée en suspension dans un milieu 
minéral frais. Répéter cette opération jusqu'à ce que l'on puisse 
considérer que la boue est exempte d'inhibiteur et de substrat en excès.
 
Prélever un échantillon de boue remise en suspension ou de boue 
non traitée juste avant son utilisation afin de déterminer le poids sec 
des matières solides en suspension.  
Une autre possibilité consiste à homogénéiser la boue activée (entre 
3 et 5 g/l de matière solide en suspension) à l'aide d'un agitateur mécanique pendant 2 minutes à vitesse moyenne. Laisser décanter la 
boue homogénéisée pendant 30 minutes ou plus si besoin est, et 
prélever la phase liquide, qui sera utilisée comme inoculum à raison de 10 ml/1 de milieu minéral.
 
I.6.4.2.  Autres sources d'inoculum  
L'inoculum peut provenir de l'effluent secondaire d'une station d'épu ­
ration ou d'une installation à l'échelle du laboratoire qui reçoit prin ­
cipalement des eaux ménagères. Recueillir un échantillon frais qui 
doit être maintenu en aérobiose pendant le transport. Laisser reposer pendant une heure ou filtrer à l'aide d'un papier filtre grossier et conserver le surnageant transvasé ou le filtrat en aérobiose jusqu'au 
moment de son utilisation. On peut utiliser jusqu'à 100 ml de ce type 
d'inoculum par litre de milieu.
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L'eau de surface peut constituer une autre source d'inoculum. Dans 
ce cas, recueillir un échantillon d'une eau de surface appropriée, par 
exemple de rivière ou de lac, et le maintenir en aérobiose jusqu'au moment de son utilisation. Si nécessaire, concentrer l'inoculum par filtration ou par centrifugation.
 
I.6.5.  Préconditionnement des inoculums  
Les inoculums peuvent être préconditionnés aux conditions expéri ­
mentales, mais non préadaptés au produit à étudier. Le précondition ­
nement consiste à aérer la boue activée dans un milieu minéral, ou 
l'effluent secondaire pendant une durée de 5 à 7 jours à la tempéra ­
ture de l'essai. Le préconditionnement permet parfois d'améliorer la précision des méthodes d'essai en réduisant les valeurs dans les essais à blanc. Il est inutile de préconditionner les inoculums destinés 
à l'essai MITI.
 
I.6.6.  Contrôles abiotiques  
Rechercher, si nécessaire, une dégradation abiotique éventuelle de la 
substance à étudier en déterminant la disparition du COD, la 
consommation d'oxygène ou le dégagement de dioxyde de carbone 
dans des témoins stériles ne contenant pas d'inoculum. La stérilisa ­
tion est effectuée par filtration à travers une membrane (0,2 à 0,45 μm) ou par addition d'une substance toxique adéquate à une 
concentration appropriée. Si la filtration sur membrane est utilisée, 
prélever les échantillons de façon aseptique pour maintenir la stéri ­
lité. À moins que l'adsorption de la substance à étudier ait pu être exclue a priori, des essais où la biodégradation est mesurée par 
l'élimination de COD doivent comporter, particulièrement lorsqu'il 
s'agit d'inoculums provenant de boues activées, un témoin abiotique qui sera inoculé et additionné de l'agent stérilisant.
 
I.6.7.  Nombre de fioles  
Le nombre de fioles d'une série type est précisé dans les chapitres 
consacrés à ces essais.  
Des fioles de type suivant peuvent être utilisées:  
— pour la suspension d'essai: contenant la substance à étudier et 
l'inoculum,  
— pour le blanc inoculum: ne contenant que l'inoculum,  
— pour le contrôle de la procédure: contenant la substance de réfé ­
rence et l'inoculum,  
— pour le témoin abiotique stérile: stérile et ne contenant que le 
produit à étudier (voir point I.6.6),  
— pour le contrôle de l'adsorption: contenant la substance à étudier, 
l'inoculum et l'agent stérilisant,  
— pour le contrôle de toxicité: contenant le produit à étudier, le 
produit de référence et l'inoculum.  
Il est obligatoire de suivre le COD et/ou les autres paramètres paral ­
lèlement dans la suspension d'essai et dans l'essai à blanc contenant l'inoculum. Il est souhaitable de suivre également le COD en paral ­
lèle dans les autres fioles.
 
Toutefois, il se peut que cela ne soit pas toujours possible. S'assurer 
que le nombre d'échantillons ou de lectures est suffisant pour 
permettre de déterminer le pourcentage de disparition au cours de 
l'intervalle de temps de 10 jours.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 844
 
I.7. ÉVALUATION DES DONNÉES  
Le pourcentage de dégradation, D  t , est calculé à l'aide des valeurs 
moyennes des doubles déterminations du paramètre dans le récipient d'essai et dans le blanc contenant l'inoculum. Les formules sont 
décrites dans les chapitres consacrés à chaque essai. L'évolution de 
la dégradation est représentée graphiquement sur un diagramme indi ­
quant l'intervalle de temps de 10 jours. Calculer et mentionner dans le rapport le pourcentage de disparition au terme de l'intervalle de 
temps de 10 jours et la valeur obtenue au plateau ou à la fin de 
l'essai, selon les cas.
 
Dans les essais de respirométrie, des composés contenant de l'azote 
peuvent affecter la consommation d'oxygène en raison de la nitrifi ­
cation (voir annexes II et V).  
I.7.1.  Estimation de la dégradation à l'aide de la détermination du 
COD  
Pour pouvoir vérifier la validité de l'essai (voir I.5.2), le pourcentage 
de dégradation (D  t ) à chaque instant t de prise d'un échantillon doit 
être calculé séparément pour les fioles contenant la substance à 
étudier en utilisant les valeurs moyennes de mesures en double du COD. Il se calcule à l'aide de la formule suivante:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100 
où: 
D t = % de dégradation au temps t,  
C o = concentration initiale moyenne de COD dans le milieu de 
culture ensemencé contenant la substance à étudier (mg 
COD/1),  
C t = concentration moyenne de COD dans le milieu de culture 
ensemencé contenant la substance à étudier, au temps t (mg COD/I),
 
C bo = concentration initiale moyenne de COD dans l'essai à blanc 
(milieu minéral ensemencé) (mg COD/1),  
C bt = concentration moyenne de COD dans l'essai à blanc (milieu 
minéral ensemencé) au temps t (mg COD/1).  
Toutes les concentrations sont mesurées expérimentalement.  
I.7.2.  Estimation de la dégradation à l'aide d'analyses spécifiques  
Lorsque l'on dispose de données analytiques spécifiques, la biodé ­
gradation primaire est calculée grâce à la formule suivante:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
où: 
D t = % de dégradation au temps t, soit normalement le 28  e jour, 
S a = quantité résiduelle de produit soumis à l'essai dans le milieu 
ensemencé à l'issue de l'essai (mg),  
S b = quantité résiduelle de produit à étudier dans l'essai à blanc 
constitué d'eau/milieu auquel on aura uniquement ajouté le 
produit à étudier (mg).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 845
 
I.7.3.  Dégradation abiotique  
Lorsqu'on utilise un témoin abiotique stérile, le pourcentage de 
dégradation abiotique se calcule par la formule:  
% de dégradation abiotique  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
où: 
C s(o) = concentration en COD dans le témoin stérile au temps 0,  
C s(t) = concentration en COD dans le témoin stérile au temps t.  
I.8. RAPPORT  
Le procès-verbal d'essai devra, si possible, comporter les renseigne ­
ments suivants:  
— produits à étudier et produits de référence ainsi que leur degré de 
pureté,  
— conditions de l'essai,  
— inoculum: nature et lieu(x) de prélèvement, concentration ainsi 
que tout traitement de préconditionnement,  
— proportion et nature des déchets industriels présents dans les eaux 
d'égout, si elles sont connues,  
— durée et température de l'essai,  
— dans le cas où les produits à étudier sont faiblement solubles, le 
traitement appliqué,  
— méthode d'essai appliquée; il convient de fournir les raisons 
scientifiques et l'explication de toute modification du mode opératoire,
 
— fiche de données,  
— tout phénomène d'inhibition observé,  
— toute dégradation abiotique observée,  
— les données concernant les analyses chimiques spécifiques, si 
elles sont disponibles,  
— les données concernant les analyses de substances intermédiaires, 
si elles sont disponibles,  
— la courbe représentant le pourcentage de dégradation en fonction 
du temps pour les substances soumises à l'essai et les substances de référence; la phase de latence, la phase de dégradation, l'inter ­
valle de temps de 10 jours et la pente doivent être clairement 
indiqués (annexe I). Si l'essai a satisfait les critères de validité, on peut utiliser la moyenne des pourcentages de dégradation des fioles contenant la substance à étudier pour la courbe,
 
— le pourcentage de disparition à l'issue de l'intervalle de temps de 
10 jours et au plateau ou à la fin de l'essai.  
PARTIE II.  ESSAI DE DISPARITION DU COD  (Méthode C.4.-A)  
II.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Un volume mesuré de milieu minéral ensemencé, contenant une 
concentration connue de substance à étudier (10 à 40 mg/l de 
COD) comme seule source de carbone organique, est aéré dans 
l'obscurité ou sous une lumière diffuse, à 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 846
 
La dégradation est suivie en analysant le COD à des intervalles 
fréquents pendant une durée de 28 jours. Le degré de biodégradation 
est calculé en exprimant la concentration de COD disparu (à laquelle on apportera une correction correspondant à la concentration de COD disparu dans l'essai à blanc contenant l'inoculum) en pourcen ­
tage de la concentration initiale. Le taux de biodégradation primaire 
peut également être calculé à partir d'analyses chimiques supplémen ­
taires effectuées au début et à la fin de l'incubation.
 
II.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
II.2.1  Appareillage  
a) des fioles coniques, d'une contenance comprise, par exemple, 
entre 250 ml et 2 1, selon le volume requis pour l'analyse du 
COD;  
b) un dispositif d'agitation adapté aux fioles coniques, soit muni d'un 
système automatique de contrôle de température, soit placé dans une pièce thermostatée, et permettant de maintenir des conditions 
d'aérobiose dans toutes les fioles;
 
c) un dispositif de filtration équipé des membranes adéquates;  
d) un analyseur du carbone organique dissous;  
e) un appareil de mesure de l'oxygène dissous;  
f) une centrifugeuse.  
II.2.2.  Préparation du milieu minéral  
Pour la préparation de la solution mère, voir I.6.2.  
Mélanger 10 ml de solution a) avec 800 ml d'eau de dilution, ajouter 
1 ml des solutions b) à d) et compléter le volume à 1 l avec l'eau de 
dilution.  
II.2.3.  Préparation et préconditionnement de l'inoculum  
L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées, 
effluents, eaux de surface, sols ou d'un mélange de celles-ci.  
Voir I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 et I.6.5.  
II.2.4.  Préparation des fioles  
Exemple: verser un volume de 800 ml de milieu minéral par fiole 
conique de 2 1 et ajouter dans des fioles distinctes un volume suffi ­
sant de solution mère de substance d'essai ou de substance de réfé ­
rence pour que la concentration de la substance corresponde à une 
concentration en COD comprise entre 10 et 40 mg/l. Vérifier le pH et l'ajuster, si nécessaire, à une valeur de 7,4. Ensemencer les flacons avec de la boue activée ou avec un inoculum provenant d'une autre 
source (voir I.6.4.), de telle sorte que la concentration finale n'excède 
pas 30 mg/l de matière solide en suspension. Préparer également des témoins constitués de milieu minéral contenant l'inoculum mais sans substance d'essai ni substance de référence.
 
Ajouter, si nécessaire, une fiole pour la détection d'un éventuel effet 
inhibiteur de la substance d'essai. Pour cela, ensemencer une solution contenant des concentrations, à la fois de produit à étudier et de produit de référence, identiques à celles des autres fioles.
 
Ajouter, si besoin est, une fiole supplémentaire stérile, contenant une 
solution de produit non ensemencée afin de vérifier si la substance 
soumise à l'essai subit une dégradation abiatique (voir I.6.6).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 847
 
De surcroît, si le produit à étudier est suspecté de s'adsorber de 
manière importante sur le verre, la boue, etc., il convient d'effectuer 
des mesures préliminaires permettant d'évaluer l'importance probable de cette adsorption et par conséquent de déterminer si l'essai convient pour la substance concernée (voir tableau 1). Préparer une 
fiole contenant la substance à étudier, l'inoculum et l'agent stérilisant.
 
Compléter le volume à 1 l dans toutes les fioles, avec le milieu 
minéral, mélanger, puis prélever un échantillon dans chaque fiole afin de déterminer la concentration initiale de COD (voir 
annexe II.4). Couvrir l'ouverture des fioles, par exemple avec du 
papier d'aluminium, de telle sorte que les échanges gazeux puissent s'effectuer librement entre la fiole et l'atmosphère environnante. Commencer ensuite l'essai en plaçant les fioles dans le dispositif 
d'agitation.
 
II.2.5.  Nombre de fioles d'une série type  
Fioles 1 et 2: suspension, d'essai  
Fioles 3 et 4: blanc inoculum  
Fiole 5: contrôle de la procédure  
et de préférence et si nécessaire:  
Fiole 6: témoin abiotique stérile  
Fiole 7: contrôle de l'adsorption  
Fiole 8: témoin de toxicité  
Voir également I.6.7.  
II.2.6.  Déroulement de l'essai  
Pendant l'essai, les concentrations de COD font l'objet de doubles 
déterminations à des intervalles de temps définis, suffisamment fréquents pour permettre de déterminer le début de l'intervalle de 
temps de 10 jours et le pourcentage de disparition au terme de 
cette période. Pour chaque détermination, il ne faut prélever que le volume de suspension d'essai strictement nécessaire.
 
Avant chaque prélèvement, le cas échéant, compenser les pertes dues 
à l'évaporation dans les fioles par ajout de la quantité nécessaire 
d'eau de dilution (I.6.1). Avant de prélever un échantillon, le milieu de culture est soigneusement mélangé et les substances adhé ­
rant aux parois du récipient doivent être dissoutes ou mises en 
suspension. Les échantillons sont immédiatement filtrés à travers 
une membrane ou centrifugés (voir annexe II.4); ils sont analysés le jour même; si tel n'est pas le cas, il faut les conserver entre 2 et 
4
 o C pendant un maximum de 48 heures, ou au-dessous de — 18  o C 
au-delà de 48 heures.  
II.3. RÉSULTATS ET RAPPORT  
II.3.1.  Traitement des résultats  
Calculer le pourcentage de dégradation au temps t, selon les indica ­
tions figurant au point I.7.1 (détermination du COD) et, éventuelle ­
ment, au point I.7.2 (analyse spécifique facultative).  
Reporter tous les résultats sur les fiches de données fournies.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 848
 
II.3.2.  Validité des résultats  
Voir I.5.2.  
II. 3.3. Rapport  
Voir I.8.  
II.4. FICHE DE DONNÉES  
Un exemple de fiche de données est fourni ci-dessous.  
ESSAI DE DISPARITION DU COD  
1. LABORATOIRE  
2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI  
3. SUBSTANCE À ÉTUDIER  
Nom:  
Concentration de la solution mère: …mg/l produit  
Concentration initiale dans le milieu, t  o : …mg/l produit  
4. INOCULUM  
Origine:  
Traitement:  
Préconditionnement éventuel:  
Concentration des matières solides en suspension dans le 
mélange réactionnel: mg/l  
5. DÉTERMINATION DU CARBONE  
Analyseur de carbone:  
Fiole n  o COD après n jours (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Substance à 
étudier plus inoculum 
1 a
 1 
a 2 
a, moyenne 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, moyenne 
C b(t) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 849
 
Fiole n  o COD après n jours (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Essai à blanc avec 
l'inoculum et sans substance à étudier 3 C
 1 
C 2 
c, moyenne C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, moyenne 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. ÉVALUATION DES DONNÉES BRUTES  
Fiole n  o % de dégradat. après n jours 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Moyenne (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Lorsque la différence entre les valeurs de D  1 et D  2 est trop grande, il ne faut pas calculer leur moyenne.  
Note:  Des tableaux similaires peuvent être utilisés pour les produits 
de référence et les témoins de toxicité.  
7. CONTRÔLE ABIOTIQUE  (facultatif)  
Durée (en jours) 
0 t  
Concentration de COD (mg/l) dans le témoin 
stérile C s(o) C s(t) 
% de dégradation abiotique  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. ANALYSE SPÉCIFIQUE  (facultative)  
quantité résiduelle de substance à 
étudier % de dégradation primaire  
Témoin stérile S  b ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 850
 
quantité résiduelle de substance à 
étudier % de dégradation primaire  
Milieu d'essai contaminé S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTIE III.  ESSAI DE SCREENING MODIFIÉ DE L'OCDE  
(Méthode C.4-B)  
III.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Un volume mesuré de milieu minéral contenant une concentration 
connue de substance à étudier (de 10 à 40 mg/l COD) comme unique source de carbone organique est ensemencé avec un volume de 0,5 
ml d'effluent par litre de milieu. Le mélange est aéré à 22 ± 2
 o C 
dans l'obscurité ou sous une lumière diffuse.  
La dégradation est suivie grâce à l'analyse du COD à des intervalles 
rapprochés pendant une période de 28 jours. Le taux de biodégra ­
dation est calculé en exprimant la concentration en COD disparu (corrigé en fonction de la quantité de COD disparu dans l'essai à 
blanc avec l'inoculum) en pourcentage de la concentration initiale. Le 
taux de dégradation primaire peut également être calculé à partir d'analyses chimiques supplémentaires effectuées au début et à la fin de l'incubation.
 
III.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
III.2.1. Appareillage  
a) des fioles coniques, d'une contenance comprise, par exemple, 
entre 250 ml et 2 1, selon le volume requis pour l'analyse du 
COD;  
b) un dispositif d'agitation adapté aux fioles coniques, soit muni d'un 
système automatique de contrôle de température, soit placé dans 
une pièce thermostatée, et permettant de maintenir des conditions d'aérobiose dans toutes les fioles;
 
c) un appareillage de filtration, accompagné des membranes 
adéquates;  
d) un analyseur du carbone organique dissous;  
e) un appareil de mesure de l'oxygène dissous;  
f) une centrifugeuse.  
III.2.2.  Préparation du milieu minéral  
Pour la préparation de la solution mère, voir I.6.2.  
Mélanger 10 ml de solution a) avec 800 ml d'eau de dilution, ajouter 
1 ml des solutions b) à d) et compléter le volume à 1 1 avec de l'eau 
de dilution.  
Cette méthode ne nécessitant que 0,5 ml/1 d'effluent comme inocu ­
lum, le milieu doit par conséquent être enrichi en oligoéléments et 
facteurs de croissance. On ajoute pour cela 1 ml de chacune des 
solutions ci-après par litre de milieu final.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 851
 
Solution d'oligoéléments: 
Sulfate de manganèse tétrahydraté, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Acide borique, H  3 BO 3 57,2 mg 
Sulfate de zinc heptahydraté, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Heptamolybdate d'ammonium (NH  4 ) 6 MO  7 O 24 34,7 mg 
Fer-chélaté (FeCl  3 , EDTA) 100,0 mg 
Dissoudre et compléter le volume à 1 l avec l'eau de 
dilution. 
Solution de vitamines: Extrait de levure 15,0 mg
 
Dissoudre l'extrait de levure dans 100 ml d'eau. Stériliser par passage 
à travers une membrane de porosité de 0,2 nm ou préparer une 
solution fraîche.  
III.2.3.  Préparation et préconditionnement de l'inoculum  
L'inoculum provient de l'effluent secondaire d'une station d'épuration 
ou d'une unité pilote qui reçoit essentiellement des eaux ménagères. Voir I.6.4.2 et I.6.5.
 
On en utilise 0,5 ml par litre de milieu minéral.  
III.2.4.  Préparation des fioles  
Exemple: verser un volume de 800 ml de milieu minéral par fiole 
conique de 2 1 et ajouter dans des fioles distinctes des volumes de solution mère de substance à étudier et de substance de référence tels 
que la concentration du produit soit comprise entre 10 et 40 mg/l de 
COD. Vérifier le pH et l'ajuster, si nécessaire, à une valeur de 7,4. Ensemencer les fioles avec un volume de 0,5 ml/1 d'effluent d'eau d'égout (voir I.6.4.2). Préparer également des témoins en ajoutant 
l'inoculum au milieu minéral, mais sans addition de substance 
d'essai ou de substance de référence.
 
Ajouter, si nécessaire, une fiole pour mesurer un éventuel effet inhi ­
biteur de la substance à étudier. Pour cela, ensemencer une solution contenant des concentrations de produit à étudier et de produit de 
référence identiques à celles des autres fioles.
 
Ajouter également, si besoin est, une fiole supplémentaire, stérile, 
contenant une solution de substance non ensemencée afin de vérifier si la substance à étudier subit une dégradation abiotique (voir I.6.6).
 
De surcroît, si le produit à étudier est suspecté de s'adsorber de 
manière importante sur le verre, la boue, etc., il convient d'effectuer 
des mesures préliminaires permettant de déterminer l'importance 
vraisemblable de l'adsorption et d'évaluer par conséquent si l'essai convient pour la substance concernée (voir tableau 1). Préparer une fiole contenant la substance à étudier, l'inoculum et l'agent stérilisant.
 
Compléter le volume à 1 l dans toutes les fioles, avec le milieu 
minéral, mélanger, puis prélever un échantillon dans chaque flacon 
afin de déterminer la concentration initiale de COD (voir annexe II.4). Recouvrir les fioles avec une feuille d'aluminium, par exemple, de telle sorte que les échanges gazeux puissent s'effectuer 
librement entre la fiole et l'atmosphère environnante. Commencer 
ensuite l'essai en plaçant les récipients dans le dispositif d'agitation.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 852
 
III.2.5.  Nombre de fioles d'une série type  
Fioles 1 et 2: suspension d'essai  
Fioles 3 et 4: blanc inoculum  
Fiole 5: contrôle de la procédure  
et de préférence et si besoin est:  
Fiole 6: témoin abiotique stérile  
Fiole 7: contrôle de l'adsorption  
Fiole 8: témoin de toxicité  
Voir également I.6.7.  
III.2.6.  Déroulement de l'essai  
Au cours de l'essai, les concentrations de COD dans chaque fiole 
font l'objet d'une double détermination à des intervalles de temps définis, suffisamment fréquents pour permettre de déterminer le 
début de l'intervalle de temps de 10 jours et le pourcentage de 
disparition au terme de cette période. Pour chaque détermination, il ne faut prélever que le volume strictement nécessaire.
 
Avant chaque prélèvement, le cas échéant, compenser les pertes dues 
à l'évaporation dans les fioles par ajout de la quantité nécessaire 
d'eau de dilution (I.6.1). Avant de prélever un échantillon, le milieu de culture est soigneusement mélangé et les substances adhé ­
rant aux parois des récipients sont dissoutes ou mises en suspension. 
Les échantillons sont immédiatement filtrés à travers une membrane 
ou centrifugés (voir annexe II.4). Ils sont analysés le jour même, si tel n'est pas le cas, il faut les conserver entre 2 et 4
 o C pendant un 
maximum de 48 heures, ou au-dessous de — 18  o C au-delà de 48 
heures.  
III.3. RÉSULTATS ET RAPPORT  
III.3.1.  Traitement des résultats  
Calculer le pourcentage de dégradation au temps t, selon les indica ­
tions figurant au point I.7.1 (détermination du COD) et, éventuelle ­
ment, au point I.7.2 (analyse spécifique facultative).  
Reporter tous les résultats sur les fiches de données fournies.  
III.3.2. Validité des résultats  
Voir I.5.2.  
III. 3.3. Rapport  
Voir I.8.  
III.4. FICHE DE DONNÉES  
Un exemple de fiche de données est présenté ci-après.  
ESSAI DE TRIAGE DE L'OCDE MODIFIÉ  
1. LABORATOIRE  
2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 853
 
3. SUBSTANCE À ÉTUDIER  
Nom:  
Concentration de la solution mère: mg/l produit  
Concentration initiale dans le milieu, t  o : mg/l produit  
4. INOCULUM  
Origine:  
Traitement:  
Préconditionnement éventuel:  
Concentration des matières solides en suspension dans le 
mélange réactionnel: mg/l  
5. DÉTERMINATION DU CARBONE  
Analyseur de carbone:  
Fiole n  o COD après n jours (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Substance à 
étudier plus inoculum 
1 a
 1 
a 2 
a, moyenne 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, moyenne 
C b(t) 
Essai à blanc avec 
l'inoculum et sans 
substance à 
étudier 3 C 1 
C 2 
c, moyenne C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, moyenne 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. ÉVALUATION DES DONNÉES BRUTES  
Fiole n  o % de dégradat. après n jours 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 854
 
Fiole n  o % de dégradat. après n jours 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Moyenne (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Il ne faut pas calculer la moyenne de D  1 et D  2 lorsque la différence entre leurs valeurs est trop grande.  
Note:  Des tableaux similaires peuvent être utilisés pour les produits 
de référence et les témoins de toxicité.  
7. CONTRÔLE ABIOTIQUE  (facultatif)  
Durée (en jours) 
0 t  
Concentration de COD (mg/l) dans le témoin 
stérile C s(o) C s(t) 
% de dégradation abiotique  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. ANALYSE SPÉCIFIQUE  (facultative)  
quantité résiduelle de substance à 
étudier % de dégradation primaire  
Témoin stérile S  b 
Milieu d'essai contaminé S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
PARTIE IV. ESSAI DE DÉGAGEMENT DE  CO  2 (Méthode 
C.4-C)  
IV.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Un volume mesuré de milieu minéral ensemencé, contenant une 
concentration connue de la substance à étudier (10 à 20 mg/l de COD ou de COT) comme seule source de carbone organique, est aéré par le passage d'air exempt de dioxyde de carbone, à un débit 
contrôlé et dans l'obscurité ou en lumière diffuse. La dégradation est 
suivie pendant une durée de 28 jours en déterminant le dioxyde de carbone produit, qui est piégé par de l'hydroxyde de sodium ou de baryum et mesuré par titration de l'hydroxyde résiduel ou en tant que 
carbone inorganique. La quantité de dioxyde de carbone produite à 
partir de la substance à étudier (corrigée en fonction de la quantité produite dans l'essai à blanc avec l'inoculum) est exprimée en pour ­
centage du CO
 2 Th. Le taux de biodégradation peut également être 
calculé à partir d'analyses supplémentaires du COD effectuées au 
début et à la fin de l'incubation.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 855
 
IV.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
IV.2.1.  Appareillage  
a) des fioles d'une contenance de 2 à 5 litres, munies d'un tube 
d'aération atteignant presque le fond du récipient et d'un orifice 
de sortie;  
b) des agitateurs magnétiques pour les essais avec des substances 
peu solubles;  
c) des flacons absorbeurs de gaz;  
d) un dispositif de contrôle et de mesure du débit d'air;  
e) un appareil de lavage du dioxyde de carbone, permettant d'obtenir 
de l'air exempt de dioxyde de carbone; une autre possibilité consiste à utiliser un mélange d'oxygène et d'azote exempts de 
CO
 2 , provenant de bouteilles de gaz, dans des proportions 
adéquates (20 % O  2 , 80 % N  2 ); 
f) un dispositif de mesure du dioxyde de carbone, soit par titrimé ­
trie, soit à l'aide d'un analyseur de carbone inorganique quel ­
conque;  
g) un dispositif de filtration sur membrane (facultatif);  
h) un analyseur de COD (facultatif).  
IV.2.2.  Préparation du milieu minéral  
Pour la préparation des solutions mères, voir I.6.2.  
Mélanger 10 ml de solution a) et 800 ml d'eau de dilution, ajouter 
1 ml des solutions b) à d) et compléter le volume à 1 l avec l'eau de 
dilution.  
IV.2.3.  Préparation et préconditionnement de l'inoculum  
L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées — 
effluents — eaux de surface — sols — ou d'un mélange de celles-ci.  
Voir I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 et I.6.5.  
IV.2.4.  Préparation des fioles  
Les volumes et poids cités ci-après à titre d'exemple indiquent des 
valeurs correspondant à des fioles de 5 l contenant 3 1 de suspen ­
sion. Si de plus petits volumes sont utilisés, il convient de modifier 
les valeurs en conséquence, mais en s'assurant que le dioxyde de 
carbone formé peut être mesuré avec précision.  
Verser 2 400 ml de milieu minéral dans chaque fiole de 5 1. Ajouter 
un volume approprié de boue activée préparée au préalable (voir I.6.4.1 et I.6.5) tel que la concentration des matières en suspension n'excède pas 30 mg/l dans le volume final de 3 1 de mélange 
ensemencé. Une autre possibilité consiste à diluer d'abord la boue 
préparée jusqu'à obtention d'une suspension de 500 à 1 000 mg/l dans le milieu minéral, puis à ajouter une partie aliquote de cette suspension dans la fiole de 5 1, de manière à atteindre une concen ­
tration de 30 mg/l; cette méthode permet une plus grande précision. 
On peut utiliser des inoculums d'origines différentes (voir I.6.4.2).
 
Éliminer le dioxyde de carbone du mélange ensemencé par barbotage 
d'air exempt de CO  2 , pendant une nuit.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 856
 
Ajouter séparément des volumes connus de solutions mères de la 
substance d'essai et de la substance de référence dans des fioles 
préparées en double, de telle sorte que la concentration de COD ou de COT, provenant des substances ajoutées, soit comprise entre 10 et 20 mg/l; conserver quelques fioles sans addition de substance 
comme témoins d'ensemencement. Si la substance à étudier est peu 
soluble, il convient d'ajouter directement un poids ou un volume défini, ou de procéder selon les indications données à l'annexe III.
 
Ajouter, si nécessaire, une fiole pour mesurer un éventuel effet inhi ­
biteur de la substance à étudier. Pour cela, ensemencer une solution 
contenant des concentrations du produit à étudier et du produit de référence identiques à celles des autres fioles.
 
Ajouter également, si besoin est, une fiole supplémentaire stérile, 
contenant une solution de produit non ensemencée afin de vérifier 
si la substance d'essai subit une dégradation abiotique (voir I.6.6). Stériliser par addition d'une substance toxique à une concentration appropriée.
 
Compléter le volume des suspensions à 3 litres, dans toutes les 
fioles, avec le milieu minéral aéré au préalable au moyen d'air exempt de CO
 2 . Des échantillons peuvent (facultatif) être prélevés 
afin d'analyser le COD (voir annexe II.4) et/ou d'effectuer une 
analyse spécifique. Relier les flacons absorbeurs à l'orifice de sortie d'air des fioles.
 
Si l'on utilise de l'hydroxyde de baryum, à chacune des fioles de 5 
litres, relier en série trois flacons absorbeurs, contenant chacun 
100 ml d'une solution 0,0125 M d'hydroxyde de baryum. La solution ne doit contenir ni sulfate ni carbonate précipité et il convient d'en déterminer la teneur juste avant son utilisation. Si l'on utilise de 
l'hydroxyde de sodium, relier deux pièges, le second servant de 
contrôle pour montrer que tout le dioxyde de carbone a été absorbé dans le premier. On pourra utiliser des flacons absorbeurs munis de systèmes de fermeture pour flacons de sérum. Ajouter dans 
chaque flacon 200 ml d'hydroxyde de sodium 0,05 M, ce qui suffit à 
absorber la totalité du dioxyde de carbone dégagé lors de la dégra ­
dation complète de la substance à étudier. La solution d'hydroxyde 
de sodium, même fraîchement préparée, contiendra des traces de 
carbonate; il convient donc d'effectuer une correction en déduisant la quantité de carbonate présente dans le témoin.
 
IV.2.5.  Nombre de fioles d'une série type  
Fioles 1 et 2: suspension d'essai  
Fioles 3 et 4: blanc inoculum  
Fiole 5: contrôle de la procédure  
et de préférence et si nécessaire:  
Fiole 6: témoin abiotique stérile  
Fiole 7: témoin de toxicité  
Voir également I.6.7.  
IV.2.6.  Déroulement de l'essai  
Commencer l'essai en faisant barboter de l'air exempt de CO  2 dans 
les suspensions à un débit de 30-100 ml/min. Prélever régulièrement 
des échantillons de l'absorbant de dioxyde de carbone pour en analyser la teneur en CO
 2 . Il est conseillé d'effectuer des analyses 
tous les deux ou trois jours pendant les dix premiers jours, puis 
ensuite tous les cinq jours jusqu'au 28  e jour de telle sorte que l'inter ­
valle de temps de 10 jours puisse être identifié.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 857
 
Le 28  e jour, prélever des échantillons (facultatif) pour analyser le 
COD et/ou effectuer une analyse spécifique, mesurer le pH des 
suspensions et ajouter 1 ml d'acide chlorhydrique concentré à chaque fiole; aérer la fiole pendant une nuit pour éliminer le dioxyde de carbone présent dans la suspension d'essai. Le 29
 e 
jour, analyser pour la dernière fois le dégagement de dioxyde de 
carbone.  
Les jours où l'on effectue les mesures de CO  2 , détacher le flacon 
absorbeur contenant de l'hydroxyde de baryum le plus proche de la fiole d'essai et titrer la solution d'hydroxyde de baryum à l'aide d'HCl 
0,05 M en utilisant la phénolphtaléine comme indicateur. Rapprocher 
les autres flacons absorbeurs en les décalant d'une place et introduire un nouveau flacon absorbeur contenant 100 ml d'hydroxyde de baryum 0,0125 M frais à l'extrémité de la série. Effectuer les titra ­
tions nécessaires, par exemple lorsqu'une précipitation importante se 
produit dans le premier piège et avant qu'elle n'apparaisse dans le second, ou au moins une fois par semaine. Une autre possibilité consiste à utiliser le NaOH comme absorbant et à prélever à l'aide 
d'une seringue un échantillon de faible volume (en fonction du type 
d'analyseur de carbone utilisé) de la solution d'hydroxyde de sodium qui se trouve dans le flacon absorbeur le plus proche de la fiole. Injecter l'échantillon dans la partie CI de l'analyseur de carbone pour 
analyser directement le dioxyde de carbone dégagé.
 
N'analyser le contenu du second piège qu'à la fin de l'essai afin 
d'apporter une correction correspondant à tout passage de dioxyde de carbone dans ce piège.
 
IV.3. RÉSULTATS ET RAPPORT  
IV.3.1.  Traitement des résultats  
Lorsqu'une titration est effectuée, la quantité de CO  2 piégée dans un 
flacon absorbeur est calculée à l'aide de la formule suivante:  
mg CO  2 = (100 × C  B - 0,5 × V × C  A ) × 44  
où: 
V = volume de HC1 utilisé pour la titration des 100 ml contenus 
dans le flacon absorbeur (ml),  
C B = concentration de la solution d'hydroxyde de baryum (M),  
C A = concentration de la solution d'acide chlorhydrique (M),  
si C  B est 0,0125 M et C  A est 0,05 M, la titration d'un volume de 
100 ml d'hydroxyde de baryum est de 50 ml et le poids de CO  2 est 
donné par la formule suivante:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml d 0 HCl titré ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
Ainsi, dans ce cas, le facteur permettant de convertir le volume 
d'HCl titré en mg de CO  2 est égal à 1,1.  
Calculer le poids de CO  2 produit par l'inoculum seul et par l'ino ­
culum plus la substance à étudier à l'aide des valeurs de titration 
obtenues dans les deux cas; la différence correspond au poids de CO
 2 produit à partir de la substance à étudier seule.  
Exemple: si la titration du flacon absorbeur correspondant à l'ino ­
culum seul nécessite un volume de 48 ml et celui du flacon corres ­
pondant à l'inoculum additionné à la substance, un volume de 45 ml:  
CO 2 de l'inoculum = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 858
 
CO 2 de l'inoculum plus substance à étudier = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg  
et par conséquent le poids de CO  2 produit à partir de la substance à 
étudier est égal à 3,3 mg.  
Le pourcentage de dégradation est calculé à l'aide de la formule 
suivante:  
% de dégradation ¼ mg CO  2 produit Ü 100 
CO  2 Th Ü mg substance àétudier ajoutée  
ou 
% de dégradation ¼ mg CO  2 Ü 100 
mg de COT ajouté dans l  0 essai Ü 3; 67 
où 3,67 est le facteur de conversion (44/12) du carbone en dioxyde 
de carbone.  
Calculer le pourcentage de dégradation après un temps déterminé en 
effectuant la somme des pourcentages de CO  2 Th calculés pour 
chaque jour où des mesures ont été effectuées pendant la période 
considérée.  
Lorsque l'absorbant utilisé est de l'hydroxyde de sodium, calculer la 
quantité de dioxyde de carbone produite, exprimée en CI (mg), en 
multipliant la concentration en CI dans l'absorbant par le volume de ce dernier.
 
Calculer le pourcentage de dégradation à l'aide de la formule 
suivante:  
% CO  2 Th ¼ mg CI de la fiole d  0 essai Ä mg CI de la fiole témoin 
mg de COT ajouté sous forme de substance d  0 essai Ü 100 
Calculer la disparition du COD (facultatif) comme décrit au point 
I.7. Consigner ces résultats, ainsi que tout autre résultat, sur les fiches de données fournies.
 
IV.3.2  Validité des résultats  
La teneur en CI de la suspension de substance à étudier en milieu 
minéral au début de l'essai doit être inférieure à 5 % du CT, et le dégagement total de CO
 2 dans l'essai à blanc contenant l'inoculum ne 
doit normalement pas excéder 40 mg/l de milieu à la fin de l'essai. Si 
les valeurs obtenues sont supérieures à 70 mg/l de CO  2 , les données et 
le protocole expérimental doivent être soumis à un examen critique.  
Voir également I.5.2.  
IV. 3.3 Rapport  
Voir I.8.  
IV.4. FICHE DE DONNÉES  
Un exemple de fiche de données est présenté ci-dessous.  
ESSAI DE DÉGAGEMENT DE DIOXYDE DE CARBONE  
1. LABORATOIRE  
2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI  
3. SUBSTANCE À ÉTUDIER  
Nom:  
Concentration de la solution mère: mg/l produit  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 859
 
Concentration initiale dans le milieu: mg/l produit  
Carbone total ajouté dans la fiole: mg/l  
CO 2 Th: mg CO  2 
4. INOCULUM  
Origine:  
Traitement:  
Préconditionnement éventuel:  
Concentration des matières solides en suspension dans le 
mélange réactionnel: mg/l  
5. PRODUCTION DE DIOXYDE DE CARBONE ET 
DÉGRADABILITÉ  
Méthode: Ba(OH)  2 NaOH/autre  
Temps 
(jours) CO 2 formé 
Essai (mg) CO 2 formé 
blanc (mg) CO 2 formé cumulé 
(mg) 
(essai moins blanc) % CO  2 Th 
CO  2 cumulé 
CO  2 Th Ü 100 
1 
2 moy. 3 
4 moy. 1 2 1 2 moy.  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Note: Des tableaux de ce type peuvent être utilisés pour le produit de 
référence et les témoins de toxicité.  
6. DÉTERMINATION DU CARBONE  (facultative)  
Analyseur de carbone: ...  
Temps (jours) Blanc mg/l Produit à étudier mg/l  
0 C  b(o) c o 
28 (*) C  b(t) c t 
(*) ou à la fin de l'incubation  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 860
 
% de COD éliminé  ¼ Í 
1Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. DÉGRADATION ABIOTIQUE  (facultative) 
% dégrad : abiot : ¼ Format : de CO  2 d: la fiole stérile ap : 28 jours ðmgÞ 
CO  2 Th ðmgÞ Ü 100 
PARTIE V.  ESSAI DE RESPIROMÉTRIE MANOMÉTRIQUE  
(Méthode C.4-D)  
V.l. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Un volume mesuré de milieu minéral ensemencé, contenant une 
concentration connue de la substance d'essai (100 mg/l de substance 
d'essai, de telle sorte que la DThO soit au moins comprise entre 50 et 100 mg/l au moins) comme seule source de carbone organique, est agité en fiole fermée, à température constante (± 1
 o C au maximum) 
pendant une durée maximale de 28 jours. La consommation d'oxy ­
gène est déterminée soit en mesurant la quantité d'oxygène (produit par électrolyse) nécessaire pour maintenir un volume gazeux constant dans la fiole respirométrique, soit en se basant sur les modifications 
de volume ou de pression (ou sur une combinaison des deux) dans 
l'appareil. Le dioxyde de carbone produit est absorbé par une solu ­
tion d'hydroxyde de potassium ou par un autre absorbant approprié. La quantité d'oxygène consommée par la substance à étudier (après 
une correction correspondant à la quantité d'oxygène consommée par 
le témoin inoculum, analysée parallèlement) est exprimée en pour ­
centage de DThO ou de DCO. Facultativement, la biodégradation primaire peut également être calculée à partir d'analyses supplémen ­
taires du COD effectuées au début et à la fin de l'incubation, et la 
biodégradation ultime par la mesure du COD.
 
V.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
V.2.1.  Appareillage  
a) un respiromètre approprié,  
b) un dispositif de régulation de température d'une précision de ± 
1 o C au moins,  
c) un dispositif de filtration sur membrane (facultatif),  
d) un analyseur de carbone (facultatif).  
V.2.2.  Préparation du milieu minéral  
Pour la préparation des solutions mères, voir I.6.2.  
Mélanger 10 ml de solution (a) et 800 ml d'eau de dilution, ajouter 
1 ml des solutions (b) à (d) et compléter le volume à un litre avec 
l'eau de dilution.  
V.2.3.  Préparation et préconditionnement de l'inoculum  
L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées — 
effluents — eaux de surface — sols — ou d'un mélange de celles-ci.  
Voir I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. et I.6.5.  
V.2.4.  Préparation des fioles  
À partir des solutions mères, préparer différents lots de solutions de 
substance d'essai et de substance de référence dans du milieu miné ­
ral, normalement à une concentration de 100 mg/l de substance (ce 
qui donne une DThO comprise, au moins, entre 50 et 100 mg/l).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 861
 
Calculer la DThO à partir de la formation de sels d'ammonium, à 
moins qu'un processus de nitrification ne soit prévisible, auquel cas 
le calcul reposera sur la formation de nitrate (voir annexe II.2.)  
Mesurer le pH et, le cas échéant, l'ajuster à 7,4 ± 0,2.  
Les substances faiblement solubles doivent être ajoutées lors d'une 
étape ultérieure (voir ci-après).  
S'il convient de déterminer la toxicité de la substance à étudier, 
préparer une solution de milieu minéral supplémentaire contenant à 
la fois la substance de référence et le produit à étudier aux mêmes concentrations que dans les solutions ne contenant que l'un des produits.
 
Dans le cas où il est nécessaire de mesurer la consommation 
physico-chimique d'oxygène, préparer une solution de produit à étudier, dont la concentration corresponde normalement à une 
DThO de 100 mg/l, stérilisée par l'addition d'une substance 
toxique appropriée (voir I.6.6).
 
Ajouter dans deux fioles, au moins, le volume requis de solution 
d'essai et dans deux autres, au moins, le volume adéquat de solution 
de référence. Préparer d'autres fioles ne contenant que du milieu minéral (pour les témoins inoculum) et, le cas échéant, la solution 
de mélange produit à étudier/substance de référence et la solution 
stérile.
 
Si la substance à étudier est peu soluble, en ajouter un poids ou un 
volume déterminé, directement à ce stade, ou suivre le mode opéra ­
toire décrit à l'annexe III. Ajouter de l'hydroxyde de potassium, de la chaux sodée ou un autre absorbant dans les compartiments d'absorp ­
tion du CO
 2 . 
V.2.5.  Nombre de fioles d'une série type  
Fioles 1 et 2: suspension d'essai  
Fioles 3 et 4: blanc inoculum  
Fiole 5: contrôle de la procédure de préférence,  
et si nécessaire:  
Fiole 6: témoin stérile  
Fiole 7: témoin de toxicité  
Voir également I.6.7.  
V.2.6.  Déroulement de l'essai  
Laisser les récipients atteindre la température souhaitée. Ensemencer 
les récipients appropriés avec les boues activées préparées au préa ­
lable ou avec un inoculum provenant d'une autre source, de telle 
sorte que la concentration des matières solides en suspension ne 
dépasse pas 30 mg/l. Assembler le matériel, mettre l'agitateur en marche, vérifier l'étanchéité à l'air et commencer à mesurer la consommation d'oxygène. Le déroulement de l'essai ne nécessite 
normalement aucune attention particulière en dehors des lectures et 
des vérifications quotidiennes permettant de s'assurer que la tempé ­
rature et l'agitation appropriées sont maintenues.
 
Calculer la consommation d'oxygène à partir des lectures effectuées 
à intervalles réguliers et rapprochés en suivant la méthode fournie par le fabriquant du matériel utilisé. A la fin de l'incubation, qui est normalement de 28 jours, mesurer le pH dans les fioles, en particu ­
lier si la consommation d'oxygène est faible ou supérieure à la 
DThO
 NH4 (pour les composés azotés).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 862
 
Prélever, si nécessaire, des échantillons dans les fioles du respiromè ­
tre, au début et à la fin de l'essai, pour analyser le COD ou effectuer 
un dosage spécifique (voir annexe II.4.). Lors du premier prélève ­
ment, noter le volume de suspension d'essai restant dans la fiole. Si la substance à étudier contient de l'azote, déterminer l'augmentation 
de la concentration de nitrite et de nitrate au cours de ces 28 jours et 
calculer la correction relative à la consommation d'oxygène due à la nitrification (annexe V).
 
V.3. RÉSULTATS ET RAPPORT  
V.3.1.  Traitement des résultats  
Diviser la consommation d'oxygène (mg) de la substance à étudier 
après une période donnée (après correction due à l'oxygène 
consommé dans l'essai à blanc contenant l'inoculum pendant une 
période identique) par le poids de substance utilisé. Le résultat, exprimé en mg d'oxygène par mg de substance, correspond à la DBO, à savoir:
 
DBO ¼ ðmg d 0 O 2 consom : par le produit à étudier  Ä mg O  2 consom : par le blancÞ 
ðmg de produit à étudier présent dans la fiole Þ 
= mg d'O  2 par mg de produit à étudier  
Calculer le pourcentage de biodégradation, soit à partir de la formule 
suivante:  
% de biodégrad : ¼ % DThO ¼ DBOðmg O  2=mg substanceÞ 
DThOðmg O  2=mg substanceÞ Ü 100; 
soit à l'aide de celle-ci:  
% DCO ¼ DBOðmg O  2=mg substanceÞ 
CODðmgO  2=mg substanceÞ Ü 100 
Il faut noter que ces deux méthodes n'aboutissant pas nécessairement 
au même résultat, il est préférable d'utiliser la première.  
Pour les substances à étudier azotées, choisir la DThO appropriée 
(NH  4 ou NO  3 ) en fonction de ce que l'on sait ou suppose quant à la 
nitrification (annexe II.2.). Si la nitrification a lieu mais de manière 
incomplète, calculer la correction pour l'oxygène consommé par la 
nitrification à partir des modifications des concentrations de nitrite et de nitrate (annexe V).
 
Lorsque les mesures facultatives du carbone organique et/ou d'un 
produit spécifique sont effectuées, calculer le pourcentage de dégra ­
dation, comme décrit au paragraphe 1.7.  
Consigner tous les résultats sur les fiches de données fournies.  
V.3.2.  Validité des résultats  
La consommation d'oxygène dans l'essai à blanc contenant l'ino ­
culum est normalement comprise entre 20 et 30 mg/l d'O  2 et ne 
doit pas dépasser 60 mg/l en 28 jours. Des valeurs supérieures à 
60 mg/l nécessitent un examen critique des données et des méthodes expérimentales. Si la valeur du pH se situe en dehors de l'intervalle 
compris entre 6 et 8,5 et si la consommation d'oxygène par le produit 
à étudier est inférieure à 60 %, l'essai doit être recommencé avec une concentration en produit à étudier plus faible.
 
Voir également 1.5.2.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 863
 
V.3.3.  Rapport  
Voir 1.8.  
V.4. FICHE DE DONNÉES  
Un exemple de fiche de données est présenté ci-après.  
ESSAI DE RESPIROMÉTRIE MANOMÉTRIQUE  
1. LABORATOIRE  
2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI  
3. SUBSTANCE À ÉTUDIER  
Nom:  
Concentration de la solution mère: … mg/l  
Concentration initiale dans le milieu, C  o : … mg/l  
Volume dans la fiole d'essai (V): … ml  
DThO/DCO: … mg O  2 /mg de produit à étudier (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOCULUM  
Origine: …  
Traitement: …  
Préconditionnement éventuel: …  
Concentration des matières solides en suspension dans le 
mélange réactionnel: … mg/l  
5. CONSOMMATION D'OXYGÈNE: BIODÉGRADABILITÉ  
Temps (jours) 
0 7 14 21 28  
Cons. O  2 (mg) 
du produit à étudier 1 
2 
a, moy. 
Cons. O
 2 (mg) 
du blanc 3 
4 
b, moy. 
DBO corr. 
(mg) (a 1 — b  m ) 
(a 2 — b  m ) 
DBO par mg 
de substance d'essai
 ða 1 Ä bÞ
CoV 
ða 2 Ä bÞ
CoV ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 864
 
Temps (jours) 
0 7 14 21 28  
% de dégrad.  
DBO 
DThO Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Moyenne (*)  
V = volume de milieu dans la fiole d'essai 
(*) Il ne faut pas calculer la moyenne de D  1 et D  2 lorsque la différence entre leurs valeurs est trop grande.  
Note: Des tableaux de ce type peuvent être utilisés pour le produit de 
référence et les témoins de toxicité.  
6. CORRECTION TENANT COMPTE DE LA NITRIFI ­
CATION  (voir annexe V)  
Jour 0 28 Différence  
i) Concentration de nitrate (mg N/l) (N) 
ii) Équivalent oxygène (4,57 × N × V) (mg) — — iii) Concentration de nitrite (mg N/l) (N) (iv) Équivalent oxygène (3,43 × N × V) (mg) — — (ii + iv) Total équivalent oxygène — —
 
7. ANALYSE DU CARBONE  (facultative)  
Analyseur de carbone: ...  
Temps (jour) Blanc mg/l Produit à étudier mg/l  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) ou à la fin de l'incubation  
% de COD éliminé  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. ANALYSE SPÉCIFIQUE  (facultative)  
S b = concentration dans le témoin physico-chimique (stérile), 
le 28  e jour. 
S a = concentration dans la fiole ensemencée, le 28  e jour. 
% de biodégradation  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. DÉGRADATION ABIOTIQUE  (facultative)  
a = consommation d'oxygène dans les fioles stériles au bout 
de 28 jours (mg).  
Consommation d  0 oxygène par mg de produità étudier  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 865
 
(Voir paragraphe 1 et 3)  
% de dégradation abiotique  ¼ a Ü 100 
C o V Ü DThO  
PARTIE VI.  ESSAI EN FIOLES FERMÉES  (Méthode C.4-E)  
VI.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La solution de substance à étudier en milieu minéral, généralement 
d'une concentration de 2 à 5 mg/l, est ensemencée avec un nombre relativement faible de micro-organismes provenant d'une population hétérogène et conservée dans des fioles fermées et remplies complè ­
tement dans l'obscurité et à température constante. La dégradation est 
suivie par l'analyse de l'oxygène dissous pendant une période de 28 jours. La quantité d'oxygène consommé par la substance à étudier, corrigée en fonction de la consommation dans l'essai à blanc conte ­
nant l'inoculum réalisé dans la même série, est exprimée en pour ­
centage de DThO ou de DCO.
 
VI.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
VI.2.1.  Appareillage  
a) des flacons pour analyse de la DBO, munis de bouchons de 
verre, d'un volume de 250 à 300 ml,  
b) un bain-marie ou un incubateur permettant de maintenir les fioles 
à température constante (± 1  o C au maximum) à l'abri de la 
lumière,  
c) de grands flacons de verre (2 à 5 l) pour la préparation des 
milieux et le remplissage des flacons à DBO,  
d) une électrode à oxygène couplée à un appareil de mesure, ou 
l'équipement et les réactifs nécessaires à la méthode de titration de Winkler.
 
VI.2.2.  Préparation du milieu minéral  
Pour la préparation des solutions mères, voir I.6.2.  
Mélanger 1 ml des solutions a) à d) et compléter le volume à un litre 
avec l'eau de dilution.  
VI.2.3.  Préparation de l'inoculum  
Normalement, l'inoculum provient de l'effluent secondaire d'une 
station d'épuration ou d'une unité pilote qui reçoit principalement des eaux ménagères. L'eau de surface peut constituer une autre source d'inoculum. Utiliser normalement une goutte (0,05 ml) à 
5 ml de filtrat par litre de milieu; il peut être nécessaire de procéder 
à des essais afin de déterminer le volume optimal pour un effluent donné (voir I.6.4.2. et I.6.5.)
 
VI.2.4.  Préparation des fioles  
Aérer fortement le milieu minéral pendant au moins 20 mn. Chaque 
série d'essais doit être effectuée avec du milieu minéral provenant 
d'un lot unique. Le milieu est généralement prêt à l'emploi après être 
resté pendant 20 heures à la température de l'essai. Déterminer la concentration d'oxygène dissous à des fins de contrôle; la valeur obtenue doit être proche de 9 mg/l à 20
 o C. Effectuer toutes les 
opérations de transfert et de remplissage avec le milieu saturé d'air 
en évitant la formation de bulles, par exemple à l'aide de siphons.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 866
 
Préparer des lots parallèles de flacons à DBO pour les déterminations 
avec la substance d'essai et la substance de référence dans des séries 
expérimentales simultanées. Réunir un nombre suffisant de flacons à DBO, comprenant des essais à blanc avec l'inoculum, pour pouvoir effectuer, au moins en double, les mesures de la consommation 
d'oxygène aux intervalles de temps souhaités, par exemple après 0, 
7, 14, 21 et 28 jours. Un plus grand nombre de flacons peut être nécessaire pour être sûr de pouvoir identifier l'intervalle de temps de 10 jours.
 
Transférer le milieu minéral parfaitement aéré dans les grands 
flacons de manière à remplir à peu près le tiers de leur volume. Ajouter ensuite dans de grands flacons distincts une quantité de 
solution mère du produit à étudier ou du produit de référence telle 
que la concentration finale ne dépasse pas, normalement, 10 mg/l. N'ajouter aucune substance dans le grand flacon destiné à l'essai à blanc.
 
Pour s'assurer que l'activité de l'inoculum n'est pas limitée, la 
concentration d'oxygène dissous ne doit pas descendre en-dessous de 0,5 mg/l dans les flacons à DBO. La concentration de produit 
à étudier se trouve ainsi limitée à environ 2 mg/l. Toutefois, on peut 
utiliser une concentration comprise entre 5 et 10 mg/l pour les composés peu dégradables et les composés dont la DThO est faible. Dans certains cas, il est préférable d'effectuer des séries d'es ­
sais en parallèle avec deux concentrations différentes, par exemple 2 
et 5 mg/l. La DThO est normalement calculée à partir de la forma ­
tion de sels d'ammonium, mais si l'on suppose ou si l'on est sûr qu'une nitrification doit avoir lieu, il convient alors de calculer la 
DThO
 NO3 en se basant sur la formation de nitrate (voir annexe II.2). 
Toutefois, si une nitrification se produit mais sans être complète, il faut effectuer une correction tenant compte des modifications de la concentration de nitrite et de nitrate déterminées par l'analyse (voir 
annexe V).
 
Si la toxicité du produit à étudier doit être recherchée (dans le cas, 
par exemple, où une faible biodégradabilité aurait été observée au 
préalable), une autre série de flacons est nécessaire.  
Préparer un autre grand flacon contenant du milieu minéral aéré 
(jusqu'au tiers de son volume environ) auquel on ajoute la substance 
à étudier et le produit de référence à des concentrations finales 
normalement égales à celles des autres grands flacons.  
Ensemencer les solutions contenues dans les grands flacons avec un 
effluent secondaire (dont le volume est compris entre une goutte, soit 
environ 0,05 ml, et 5 ml) ou avec un inoculum d'une autre origine, 
comme de l'eau de rivière (voir I.6.4.2.). Enfin, compléter le volume des solutions avec du milieu minéral aéré à l'aide d'un tuyau touchant 
le fond du flacon pour permettre un mélange adéquat.
 
VI.2.5.  Nombre de fioles d'une série type  
Une série type comporte les flacons suivants:  
— au moins 10 flacons contenant la substance à étudier et l'ino ­
culum (suspension d'essai),  
— au moins 10 flacons ne contenant que l'inoculum (essai à blanc 
avec l'inoculum),  
— au moins 10 flacons contenant le produit de référence et l'ino ­
culum (contrôle de la procédure),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 867
 
— et, si nécessaire, 6 flacons contenant la substance à étudier, le 
produit de référence et l'inoculum (contrôle de toxicité). Néan ­
moins, pour être certain de pouvoir identifier l'intervalle de temps de 10 jours, il faudrait environ deux fois plus de flacons.
 
VI.2.6. Déroulement de l'essai  
Toutes les solutions préparées sont immédiatement transférées dans 
le lot correspondant de flacons à DBO à l'aide d'un tuyau plongeant 
aux trois quarts (pas jusqu'au fond) du grand flacon approprié de telle sorte que tous les flacons à DBO soient complètement remplis. Tapoter doucement pour éliminer toutes les bulles d'air. L'oxygène 
dissous est analysé immédiatement dans les flacons destinés à la 
mesure au temps 0, par la méthode de Winkler ou avec une élec ­
trode. Le contenu des flacons peut être conservé en vue d'une analyse ultérieure par la méthode de Winkler si on lui ajoute du 
sulfate de manganèse (II) et de l'hydroxyde de sodium (le premier 
réactif de la méthode de Winkler). Les flacons dont le contenu en oxygène est fixé sous forme d'hydroxyde de manganèse (III) brun, sont conservés soigneusement fermés à l'obscurité, et à une tempé ­
rature comprise entre 10 et 20
 o C. Ne pas attendre plus de 24 heures 
avant de procéder aux étapes suivantes de la méthode de Winkler. Fermer les autres flacons préparés parallèlement en s'assurant qu'ils ne contiennent pas de bulles d'air et les incuber à 20
 o C a l'obscurité. 
Chaque série doit être accompagnée d'une série complète d'essais à 
blanc ensemencés pour la détermination du témoin inoculum. Prélever régulièrement (au moins chaque semaine) deux flacons au moins dans chaque série, afin d'analyser l'oxygène dissous pendant la 
durée de l'incubation qui est de 28 jours.
 
Les prélèvements hebdomadaires d'échantillons permettent de déter ­
miner le pourcentage de disparition dans un intervalle de 14 jours, 
alors que les prélèvements effectués tous les 3 ou 4 jours, qui néces ­
sitent environ deux fois plus de flacons, permettent d'identifier l'in ­
tervalle de temps de 10 jours.  
Si la substance à étudier contient de l'azote, il convient d'effectuer 
une correction pour tenir compte de la consommation d'oxygène due à la nitrification. Pour cela, déterminer la concentration d'oxygène dissous par la méthode de l'électrode à O
 2 et, ensuite, analyser la 
teneur en nitrite et en nitrate sur un échantillon prélevé dans le flacon 
DBO. Calculer la quantité d'oxygène utilisée sur la base de l'aug ­
mentation de la concentration de nitrite et de nitrate (voir annexe V).  
VI.3. RÉSULTATS ET RAPPORT  
VI.3.1.  Traitement des résultats  
En premier lieu, calculer la DBO après chaque période de temps en 
soustrayant la perte en oxygène (mg O  2 /l) dans l'essai à blanc conte ­
nant l'inoculum de celle que l'on observe avec la substance à étudier. 
Diviser cette perte en oxygène ainsi corrigée par la concentration 
(mg/l) de la substance à étudier. Le résultat obtenu correspond à la DBO spécifique exprimée en mg d'oxygène par mg de substance d'essai. Calculer le pourcentage de biodégradabilité en divisant la 
DBO spécifique par la DThO spécifique (calculée selon les indica ­
tions données à l'annexe II.2) ou par la DCO (déterminée par analyse, voir annexe II.3).
 
Ainsi:  
DBO ¼ mg O  2 consommé par la substance à étudier  Ä mg O  2 consommé par le blanc 
mg de substance à étudier dans la fiole  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 868
 
= mg d'O  2 par mg de produit à étudier  
% de dégradation ¼ DBO ðmg O  2=mg de substance à étudier Þ 
DThO ðmg O  2=mg de substance à étudier Þ Ü 100 
% de dégradation ¼ DBO ðmg O  2=mg de substance à étudier Þ 
DCO ðmg O  2=mg de substance à étudier Þ Ü 100 
Il faut noter que ces deux méthodes ne conduisant pas nécessaire ­
ment au même résultat, il est préférable d'utiliser la première.  
Dans le cas où la substance d'essai contient de l'azote, il convient 
d'utiliser la DThO appropriée (NH  4 ou NO  3 ) en fonction des 
connaissances ou des prévisions concernant l'éventualité de la nitri ­
fication (annexe II.2.). Si une nitrification a lieu sans toutefois être complète, corriger pour tenir compte de la consommation d'oxygène due à la nitrification à partir des modifications de la concentration de 
nitrite et de nitrate (annexe V).
 
VI.3.2.  Validité des résultats  
La perte d'oxygène dans l'essai à blanc contenant l'inoculum ne doit 
pas dépasser 1,5 mg/l d'oxygène dissous après 28 jours. Des valeurs supérieures nécessitent une vérification des méthodes expérimentales. 
La concentration résiduelle d'oxygène dans les flacons d'essai ne doit 
à aucun moment descendre au-dessous de 0,5 mg/l. Une teneur en oxygène aussi basse n'est acceptable que si la méthode utilisée pour mesurer l'oxygène dissous est capable de mesurer de telles concen ­
trations avec précision.
 
Voir également I.5.2.  
VI.3.3.  Rapport  
Voir 1.8.  
VI.4. FICHE DE DONNÉES  
Un exemple de fiche de données est présenté ci-dessous.  
ESSAI EN FIOLES FERMÉES  
1. LABORATOIRE  
2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI  
3. SUBSTANCE À ÉTUDIER  
Nom:  
Concentration de la solution mère: ... mg/l  
Concentration initiale dans la fiole: ... mg/l  
DThO/DCO: ... mg O  2 /mg de produit à étudier  
4. INOCULUM  
Origine: ...  
Traitement: ...  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 869
 
Préconditionnement éventuel: ...  
Concentration dans le mélange réactionnel: ... mg/l  
5. DÉTERMINATION DE L'OD  
Méthode de Winkler ou de l'électrode.  
Analyses des fioles  
Temps d'incubation (d) OD (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Blanc (sans produit) 1 C  1 
2 C  2 
Moyenne 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Produit à étudier 1 a  1 
2 a  2 
Moyenne 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Note: Des tableaux de ce type peuvent être utilisés pour le produit de 
référence et le témoin de toxicité.  
6. CORRECTION TENANT COMPTE DE LA NITRIFI ­
CATION  (annexe V)  
Temps d'incubation (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Concentration de nitrate (mg N/l) 
(ii) Modif. de la conc. de nitrate (mg N/l) — (iii) Équivalent oxygène (mg/l) — (iv) Concentration de nitrite (mg N/l) (v) Modif. de la conc. de nitrite (mg N/l) — (vi) Équivalent oxygène (mg/l) — (iii + vi) Total équivalent oxygène (mg/l) —
 
7. PERTE D'OD: % DE DÉGRADATION  
Perte après n jours (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
FIOLE 1: (m  to — m  tx ) — (m  bo — m  bx ) 
FIOLE 2: (m  to — m  tx ) — (m  bo — m  bx ) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 870
 
Perte après n jours (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
FIOLE 1: 
%D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : produit à étudier Ü DThO 
FIOLE 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : produit à étudier Ü DThO 
% D moyen (*) =  D 1 þ D 2 
2 
(*) Ne pas utiliser la moyenne si tes résultats des essais en double varient considérablement.  
m to = valeur dans la fiole d'essai au temps 0  
m tx = valeur dans la fiole d'essai au temps x  
m bo = valeur moyenne du blanc au temps 0  
m bx = valeur moyenne du blanc au temps x  
Appliquer également la correction tenant compte de la nitrification 
mentionnée aux points (iii) et (vi) du paragraphe 6.  
8. PERTE D'OD DANS L'ESSAI À BLANC  
Consommation d'oxygène dans l'essai à blanc: (m  bo — m  b28 ) 
mg/l. Cette consommation est importante pour la validité de l'essai. Elle doit être inférieure à 1,5 mg/l.
 
PARTIE VII.  ESSAI M.I.T.I.  (Méthode C.4-F)  
VII.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La consommation d'oxygène d'une solution ou d'une suspension 
agitée de substance à étudier dans un milieu minéral, ensemencée 
avec des micro-organismes cultivés à cet effet sans adaptation préa ­
lable, est établie à l'aide d'un respiromètre automatique en circuit fermé, à l'obscurité, pendant une période de 28 jours à 25 ± 1
 o C. 
Le dioxyde de carbone dégagé est absorbé par de la chaux sodée. La 
biodégradabilité est exprimée par le pourcentage de la consommation d'oxygène (corrigé en fonction de la consommation dans l'essai à blanc) par rapport à la consommation théorique (DThO). Le pour ­
centage de biodégradabilité primaire est également calculé d'après les 
analyses chimiques spécifiques supplémentaires effectuées au début et à la fin de l'incubation et, éventuellement, à l'aide de l'analyse du COD.
 
VII.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
VII.2.1.  Appareillage  
a) appareil de mesure automatique de la DBO par électrolyse ou 
respiromètre normalement équipé de 6 fioles d'une contenance 
de 300 ml chacune et de récipients contenant l'absorbant de CO  2 ; ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 871
 
b) pièce thermostatée et/ou bain-marie à 25  o C (± 1  o C au maxi ­
mum);  
c) dispositif de filtration sur membrane (facultatif);  
d) analyseur de carbone (facultatif).  
VII.2.2.  Préparation du milieu minéral  
Préparer les solutions mères suivantes, à l'aide de réactifs de qualité 
analytique et d'eau (1.6.1.): 
a) Dihydrogénophosphate de potassium, KH  2 PO 4 8,50 g 
Monohydrogénophosphate de potassium, K  2 HPO  4 21,75 g 
Monohydrogénophosphate de sodium dodécahy ­
draté, Na  2 HPO  4 .12 H  2 O 44,60 g 
Chlorure d'ammonium, NH  4 Cl 1,70 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre 
Le pH de la solution doit être égal à 7,2 
b) Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO  4 7 
H 2 O 22,50 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre 
c) Chlorure de calcium, anhydre CaCl  2 27,50 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre 
d) Chlorure de fer (III) hexahydraté, FeCl  3 .6 H  2 O 0,25 g 
Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 
1 litre  
Prélever 3 ml de chacune des solutions a), b) c) et d) et compléter le 
volume à 1 litre.  
VII.2.3.  Préparation de l'inoculum  
Recueillir des échantillons frais dans 10 emplacements au moins, 
principalement dans des zones où divers produits chimiques sont utilisés et rejetés dans l'environnement. Recueillir des échantillons d'un litre de boue, de sols superficiels, d'eau, etc., dans des sites 
tels que les stations d'épuration des eaux d'égout, les stations d'épu ­
ration industrielle, les rivières, les lacs et les mers et bien les mélan ­
ger. Après avoir enlevé les matières flottantes, laisser reposer le mélange, puis ajuster le pH du surnageant à 7 ± 1 au moyen d'hy ­
droxyde de sodium ou d'acide phosphorique.
 
Utiliser un volume de surnageant filtré suffisant pour remplir un 
récipient de traitement des boues activées et aérer le liquide pendant environ 23 heures 30. Trente minutes après avoir interrompu l'aération, retirer environ un tiers du volume total du liquide 
surnageant et ajouter à la partie décantée un volume égal d'une 
solution (pH 7) contenant 0,1 % de chacun des produits suivants: glucose, peptone, monophosphate de potassium, puis aérer à nouveau le mélange. Répéter cette opération chaque jour. La réserve de boue 
doit être préparée selon les bonnes pratiques: l'effluent doit être clair, 
la température doit être maintenue à 25 ± 2
 o C, son pH égal à 7 ± 1, 
la boue doit bien décanter, l'aération doit être suffisante pour que le mélange soit en permanence en aérobiose, des protozoaires doivent 
être présents et l'activité de la boue doit être testée à l'aide d'une 
substance de référence au moins tous les trois mois. Ne pas utiliser la boue comme inoculum avant au moins un mois après sa préparation ni après plus de quatre mois. Il convient donc d'effectuer périodi ­
quement des prélèvements d'échantillons, tous les trois mois, en 10 
emplacements différents au moins.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 872
 
Afin de conserver la même activité aux boues fraîches et anciennes, 
le surnageant filtré d'une boue activée utilisée pour l'essai doit être 
mélangé en volume égal au surnageant filtré d'une boue fraîchement recueillie provenant de dix sources différentes. Le mélange ainsi obtenu est mis en culture comme décrit ci-avant. Prélever la boue 
pour l'utiliser comme inoculum 18 à 24 heures après cette opération.
 
VII.2.4.  Préparation des fioles  
Préparer les six fioles suivantes:  
N o 1: eau de dilution contenant 100 mg/l de substance à étudier,  
N os 2, 3 et 4: milieu minéral contenant 100 mg/l de substance à 
étudier,  
N o 5: milieu minéral contenant 100 mg/l de produit de référence (par 
exemple de l'aniline),  
N o 6: milieu minéral seul.  
Si la substance à étudier est peu soluble, il convient d'en ajouter 
directement un poids ou un volume défini, ou de procéder selon les 
instructions figurant à l'annexe III, en n'utilisant toutefois ni solvant ni émulsifiant. Placer l'absorbant de CO
 2 pour chaque fiole, dans la 
coupelle spécialement prévue à cet effet. Ajuster à 7,0 le pH de la 
solution contenue dans les fioles n  os 2, 3 et 4.  
VII.2.5.  Déroulement de l'essai  
Ensemencer les fioles n  os 2, 3 et 4 (suspensions d'essai), n  o 5 (témoin 
d'activité) et n  o 6 (blanc contenant l'inoculum) avec un petit volume 
d'inoculum de manière à ce que la concentration des matières solides 
en suspension soit égale à 30 mg/l. Ne pas ajouter d'inoculum dans 
la fiole n  o 1 qui sert de témoin abiotique. Assembler le matériel, 
vérifier l'étanchéité à l'air, brancher les agitateurs et commencer à mesurer la consommation d'oxygène dans l'obscurité. Vérifier chaque 
jour la température et le fonctionnement des agitateurs et de l'enre ­
gistreur de l'appareil de mesure coulométrique de la consommation d'oxygène et noter toute modification de couleur du milieu contenu dans les fioles. Lire la consommation d'oxygène dans les six fioles 
directement avec une méthode appropriée, par exemple sur l'enregis ­
treur à six points, qui fournit une courbe de la DBO. À la fin de l'incubation, dont la durée normale est de 28 jours, mesurer le pH du contenu des fioles et déterminer la concentration résiduelle de la 
substance à étudier et de toute substance intermédiaire et dans le 
cas d'une substance hydrosoluble, la concentration de COD (annexe II.4). Des précautions particulières doivent être prises pour étudier les produits volatiles. Si un processus de nitrification est 
prévisible, déterminer, si possible, la concentration en nitrates et 
nitrites.
 
VII.3. PRÉSENTATION DES DONNÉES  
VII.3.1.  Traitement des résultats  
La quantité d'oxygène consommée (mg) par la substance d'essai 
après un temps donné, corrigée de façon à tenir compte de la quan ­
tité d'O  2 consommée dans l'essai à blanc contenant l'inoculum après 
la même période de temps, est divisée par le poids de substance à 
étudier utilisé pour l'essai. Le résultat ainsi obtenu correspond à la 
DBO exprimée en mg d'oxygène/mg de substance d'essai, c'est-à- dire:
 
DBO ¼ mg O  2 consom : par la substance d  0 essai Ä mg O  2 consom : par le blanc 
mg de substance d  0 essai dans la fiole  
= mg d'O  2 /mg de substance d'essai  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 873
 
Le pourcentage de biodégradation est alors obtenu à l'aide de la 
formule suivante:  
% de biodégradation  ¼ % DThO ¼ DBO ðmg O  2=mg produitÞ 
DThO ðmg O  2=mg produitÞ Ü 100 
Pour les mélanges, calculer la DThO à partir de l'analyse élémen ­
taire, comme pour un composé simple. Choisir la DThO appropriée 
(DThO  NH4 ou DThO  NO3 ) selon que la nitrification est absente ou 
complète (annexe II.2). Cependant, si la nitrification se produit mais sans toutefois être complète, il convient d'effectuer une correction 
correspondant à la quantité d'oxygène consommée par la nitrification 
à partir des modifications de la concentration en nitrites et en nitrates (annexe V).
 
Calculer le pourcentage de biodégradation primaire à partir de la 
perte de produit chimique spécifique (d'origine) (voir 1.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Si la mesure de la disparition physico-chimique révèle une perte de 
produit d'essai dans la fiole n  o 1, il convient de le consigner et de 
calculer le pourcentage de biodégradation en utilisant la concentra ­
tion de substance d'essai (S  b ) dans la fiole au bout de 28 jours.  
Si la concentration de COD est déterminée (facultatif), calculer le 
pourcentage de biodégradation ultime à l'aide de la formule suivante:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 
décrite au paragraphe I.7.1. Si la mesure de la disparition physico- 
chimique révèle une perte de COD dans la fiole n  o 1, il convient de 
calculer le pourcentage de dégradation en utilisant la concentration de COD dans cette fiole.
 
Consigner tous les résultats sur les fiches de données fournies.  
VII.3.2.  Validité des résultats  
La consommation d'oxygène dans l'essai à blanc contenant l'ino ­
culum est normalement comprise entre 20 et 30 mg O  2 /l et ne doit 
pas excéder 60 mg/l en 28 jours. Des valeurs supérieures à 60 mg/l nécessitent un examen critique des données et des méthodes expéri ­
mentales. Si la valeur du pH se trouve en dehors de l'intervalle 
compris entre 6 et 8,5 et si la consommation d'oxygène par la subs ­
tance d'essai est inférieure à 60 %, l'essai doit être répété avec une concentration plus faible de substance à étudier.
 
Voir également I.5.2.  
Si le pourcentage de dégradation de l'aniline calculé à partir de la 
consommation d'oxygène ne dépasse pas 40 % après 7 jours et 65 % après 14 jours, l'essai est considéré comme non valable.
 
VII. 3.3.  Rapport  
Voir I.8.  
VII.4. FICHE DE DONNÉES  
Un exemple de fiche de données est présenté ci-dessous.  
ESSAI MITI (I)  
1. LABORATOIRE  
2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 874
 
3. SUBSTANCE À ÉTUDIER  
Nom:  
Concentration de la solution mère: ... mg/l de produit  
Conc. initiale dans le milieu, C  o : ... mg/l de produit  
Volume du mélange réactionnel, V: ... ml  
DThO: ... mg O  2 /l 
4. INOCULUM  
Emplacements d'échantillonnage des boues: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 
3) … 8) … 
4) … 9) … 5) … 10) …
 
Concentration des matières en suspension dans la boue activée 
après acclimatation à l'aide d'une eau d'égout synthétique = mg/l  
Volume de boue activée par litre de milieu final = ml  
Concentration de boue dans le milieu final = mg/l  
5. CONSOMMATION D'OXYGÈNE: BIODÉGRADABILITÉ  
Type de respiromètre utilisé:  
Temps (jours) 
0 7 14 21 28  
Cons. d'O  2 (mg) 
du produit a 1 
a 2 
a 3 
Cons. d'O  2 (mg) 
du blanc b 
Cons. d'O  2 
corrigée (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
DBO par mg de 
produit ða Ä bÞ 
C o V Fiole 1 
Fiole 2 Fiole 3 
% dégradation
 
DBO 
DThO Ü 100 1 
2 3 
moy (*)
 
(*) Ne pas calculer la moyenne lorsque la différence entre les réplicats est trop grande.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 875
 
Note: Des tableaux de ce type peuvent être utilisés pour le produit de 
référence et les témoins de toxicité.  
6. ANALYSE DE CARBONE  (facultative)  
Analyseur de carbone: ...  
Fiole COD 
% COD éliminé Moy. 
Mesuré Corrigé  
Eau + subst. d'essai a — — 
Boue + subst. d'essai b  1 b 1 — c 
Boue + subst. d'essai b  2 b 2 — c 
Boue + subst. d'essai b  3 b 3 — c 
Essai à blanc c — — —  
% COD éliminé:  a Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. DONNÉES DE L'ANALYSE SPÉCIFIQUE CHIMIQUE  
Quantité résiduelle de produit à la fin 
de l'essai % de dégradation  
essai à blanc avec de l'eau S  b 
milieu inoculé S al 
S a2 
S a3 
% de dégradation ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Calculer le % de dégradation pour les fioles a  1 a 2 et a  3 respec­
tivement.  
8. OBSERVATIONS  
La courbe de la DBO en fonction du temps doit, le cas échéant, 
être jointe.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 876
 
Annexe 1  
ABRÉVIATIONS ET DÉFINITIONS  
OD: oxygène dissous (mg/l), c'est-à-dire la concentration d'oxygène dissous 
dans un échantillon aqueux.  
DBO: demande biochimique en oxygène (g), soit la quantité d'oxygène 
consommée par des micro-organismes au moment où ils métabolisent un produit soumis à l'essai; la DBO est également exprimée en g d'oxy ­
gène consommé par g de produit à étudier (voir la méthode C.5).
 
DCO: demande chimique d'oxygène (g), c'est-à-dire la quantité d'oxygène 
consommée au cours de l'oxydation d'un produit à étudier en présence de bichromate acide chaud; la DCO fournit une mesure de la quantité 
de matière oxydable présente; la DCO est également exprimée en g 
d'oxygène consommé par g de substance à étudier (voir méthode C.6).
 
COD: carbone organique dissous. Il s'agit du carbone organique présent dans 
une solution ou qui traverse un filtre d'une porosité de 0,45 micromètre 
ou encore qui reste dans le surnageant après une centrifugation de 
15 min à 40 000 m.s-  2 (± 4 000 g).  
DThO: demande théorique en oxygène (mg), c'est-à-dire la quantité totale 
d'oxygène nécessaire pour parvenir à l'oxydation complète d'un produit chimique. Elle est calculée à partir de la formule moléculaire 
(voir annexe II.2). La DThO est également exprimée en mg d'oxygène 
nécessaire par mg de produit à étudier.
 
CO 2 Th: dioxyde de carbone théorique (mg). Il s'agit de la quantité calculée de 
dioxyde de carbone pouvant être produite à partir du contenu en 
carbone mesuré ou connu dans le produit à étudier, lors de sa minéra ­
lisation totale. Le CO  2 Th est également exprimé en mg de dioxyde de 
carbone qui se dégage par mg de produit à étudier.  
COT: carbone organique total. Le COT d'un échantillon est égal à la somme 
du carbone organique en solution et en suspension.  
CI: carbone inorganique.  
CT: carbone total. Le CT est égal à la somme du carbone organique et du 
carbone inorganique présents dans l'échantillon.  
Biodégradation primaire:  
Altération de la structure chimique d'une substance obtenue par une action 
biologique et entraînant la perte de propriétés spécifiques de cette substance.  
Biodégradation ultime (en aérobiose):  
Taux de dégradation atteint lorsque la totalité de la substance à étudier a été 
utilisée par des micro-organismes pour produire du dioxyde de carbone, de l'eau, 
des sels minéraux et de nouveaux constituants cellulaires microbiens (biomasse).  
Facilement biodégradable:  
Il s'agit d'un classement arbitraire des produits chimiques qui ont répondu posi ­
tivement à des essais portant sur la biodégradabilité ultime; du fait de la rigueur 
de ces essais, on suppose que ces composés se dégradent rapidement et complè ­
tement en milieu aquatique dans des conditions d'aérobiose.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 877
 
Intrinsèquement biodégradable:  
Il s'agit d'une classification des produits chimiques donc la biodégradation (pri ­
maire ou ultime) a été prouvée sans ambiguïté au cours d'un essai de biodégra ­
dabilité reconnu internationalement.  
Traitabilité:  
Aptitude des composés à disparaître au cours du traitement biologique des eaux 
résiduaires sans effet indésirable sur le déroulement normal du traitement. D'une manière générale, les composés facilement biodégradables sont traitables, ce qui n'est pas le cas de tous les composés intrinsèquement biodégradables. Des 
processus abiotiques peuvent également se produire.
 
Phase de latence  
correspond à la période qui, au cours d'un essai de disparition, sépare le moment 
de l'ensemencement de celui où le pourcentage de dégradation a augmenté d'au 
moins 10 %. La durée de la phase de latence est souvent extrêmement variable et 
peu reproductible.  
Phase de dégradation  
correspond à la période qui commence à la fin de la phase de latence et se 
termine au moment où 90 % du taux maximal de dégradation a été atteint.  
Intervalle de 10 jours  
Il s'agit des 10 jours immédiatement consécutifs au moment où le taux de 
dégradation atteint 10 %.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 878
 
Annexe II  
CALCUL ET DÉTERMINATION DE PARAMÈTRES APPROPRIÉS  
Certains paramètres seront requis en fonction de la méthode choisie. Le chapitre 
suivant décrit le calcul de ces valeurs. L'utilisation de ces paramètres est décrite 
dans les chapitres consacrés à chaque méthode.  
1. Teneur en carbone  
La teneur en carbone est calculée à partir de la composition élémentaire 
connue de la substance à étudier, ou déterminée par l'analyse élémentaire 
de cette substance.  
2. Demande théorique en oxygène (DThO)  
La demande théorique en oxygène (DThO) peut être calculée si la compo ­
sition élémentaire est connue ou déterminée par analyse élémentaire. Par exemple la DThO du composé suivant:
 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
sera, en l'absence de nitrification, égale à:  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
et si une nitrification a lieu, elle sera égale à:  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Demande chimique en oxygène (DCO)  
La demande chimique en oxygène (DCO) est déterminée à l'aide de la 
méthode C.6.  
4. Carbone organique dissous (COD)  
Le carbone organique dissous (COD) est, par définition, le carbone orga ­
nique présent dans la solution aqueuse d'un produit chimique ou d'un mélange, qui traverse un filtre d'une porosité de 0,45 micromètre.
 
Prélever des échantillons dans les récipients d'essai et les filtrer immédia ­
tement à l'aide d'un dispositif de filtration en utilisant une membrane filtrante appropriée. Les 20 premiers ml de filtrat (la quantité peut être 
réduite si on utilise des filtres de petite taille) sont éliminés. Un volume 
de filtrat compris entre 10 et 20 ml, ou moins s'il doit être injecté (le volume dépend de la quantité requise pour l'analyseur de carbone), est retenu afin d'en analyser la teneur en carbone. La concentration en COD 
est déterminée à l'aide d'un analyseur de carbone organique capable de 
mesurer avec précision une concentration de carbone égale ou inférieure à 10 % de la concentration initiale de COD utilisée pour l'essai.
 
Les échantillons filtrés qui ne sont pas analysés le jour même peuvent être 
conservés pendant 48 heures dans un réfrigérateur entre 2 et 4  o C ou en- 
dessous de — 18  o C pour des périodes plus longues.  
Remarque:  
Les membranes filtrantes étant souvent imprégnées d'agents tensio-actifs 
pour l'hydrophilisation, sont susceptibles de contenir plusieurs milli ­
grammes de carbone organique soluble qui interfèrent avec les détermina ­
tions de la biodégradabilité. Pour débarrasser les filtres des agents tensio- 
actifs ainsi que d'autres composés organiques solubles, il convient de les faire bouillir trois fois pendant une heure dans de l'eau déionisée. Ils peuvent ensuite être conservés dans de l'eau pendant une semaine. Si l'on 
utilise des cartouches filtrantes à usage unique, chaque lot doit être vérifié 
afin de s'assurer qu'il ne libère pas de carbone organique soluble.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 879
 
La substance à étudier peut être retenue par adsorption sur certains types de 
membranes filtrantes. C'est pourquoi il est conseillé de s'assurer que le 
produit à étudier n'est pas retenu par le filtre.  
Une centrifugation à 40 000 m.sec  -2 (4 000 g) pendant 15 minutes peut 
remplacer la filtration pour distinguer le COT du COD. Cette méthode n'est pas fiable si la concentration initiale en COD est inférieure à 
10 mg/l, soit parce que toutes les bactéries ne sont pas éliminées, soit 
parce que du carbone faisant partie intégrante du plasma bactérien est redissous.
 
BIBLIOGRAPHIE  
(1) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65.
 
(2) Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.  
(3) DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 — Deutsches Einheitsverfahren zur 
Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische 
Wirkungs- und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des chemi ­
schen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
 
(4) Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 880
 
Annexe III  
ÉVALUATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ DES SUBSTANCES 
FAIBLEMENT SOLUBLES  
Lors des essais de biodégradabilité concernant des substances faiblement solu ­
bles, il faut prêter une attention particulière aux éléments énoncés ci-après.  
Alors que les liquides homogènes posent rarement des problèmes d'échantillon ­
nage, il est recommandé d'homogénéiser les matières solides par des moyens 
appropriés afin d'éviter les erreurs dues au manque d'homogénéité. Il convient de prendre des précautions particulières pour prélever, dans des mélanges de produits chimiques ou dans des substances riches en impuretés, des échantillons 
de quelques milligrammes qui soient représentatifs.
 
Différents types d'agitation peuvent être utilisés au cours de l'essai, mais il faut 
veiller à ce que l'agitation soit juste suffisante pour maintenir la dispersion du produit tout en évitant une surchauffe, la formation excessive de mousse ou des forces de cisaillement excessives.
 
Il est possible d'utiliser un émulsifiant qui produise une dispersion stable du 
produit. Il ne devra ni être toxique pour les bactéries, ni être biodégradé, ni former de la mousse dans les conditions d'essai.
 
Les mêmes critères s'appliquent aux solvants et aux émulsifiants.  
Il n'est pas conseillé d'utiliser des supports solides pour les produits solides; leur 
utilisation peut, par contre, être appropriée dans le cas des substances huileuses.  
Lorsqu'une substance auxiliaire, telle qu'un émulsifiant, un solvant ou un support, 
est utilisée, il convient d'effectuer un essai à blanc avec cette substance.  
Les trois essais de respirométrie, CO  2 , DBO ou MITI, conviennent pour étudier 
la biodégradabilité des composés faiblement solubles.  
BIBLIOGRAPHIE  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.  
— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 881
 
Annexe IV  
ÉVALUATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ DES PRODUITS 
CHIMIQUES SUSPECTÉS DE TOXICITÉ VIS-À-VIS DE L'INOCULUM  
Lorsqu'un produit est soumis à des essais de biodégradabilité facile et semble ne 
pas être biodégradable, il est recommandé de suivre la procédure suivante si l'on 
souhaite effectuer une distinction entre inhibition et inertie (Reynolds et al., 
1987).  
Il convient de procéder aux essais de toxicité et de biodégradation avec des 
inoculums semblables ou identiques.  
Pour évaluer la toxicité des produits soumis aux essais de biodégradabilité facile, 
il semble approprié d'appliquer soit l'une des méthodes suivantes soit une combi ­
naison de ces méthodes: inhibition du taux de respiration de la boue (essai 
d'inhibition de la respiration des boues activées — directive 88/302/CEE), DBO, et/ou inhibition de la croissance.
 
S'il convient d'éviter l'inhibition due à la toxicité, il est suggéré d'utiliser pour les 
essais de biodégradabilité facile des concentrations de la substance d'essai infé ­
rieures au 1/10 de la valeur de la CE  50 obtenue lors des essais de toxicité (ou 
inférieures à la valeur de la CE  20 ). Il est peu vraisemblable que les composés 
dont la CE  50 a une valeur supérieure à 300 mg/l produisent un effet toxique lors 
des tests de biodégradabilité facile. Il est vraisemblable que des valeurs de CE  50 
inférieures à 20 mg/l poseront de sérieux problèmes lors des essais ultérieurs. Il 
convient dans ce cas d'employer de faibles concentrations d'essai nécessitant l'utilisation de l'essai en fioles fermées, qui est rigoureux et sensible, ou de 
produit marqué au
 14 C. Une autre manière de procéder consiste à utiliser un 
inoculum acclimaté permettant d'utiliser des concentrations plus élevées de subs ­
tance d'essai. Toutefois, dans ce cas, on perd le critère spécifique de l'essai de biodégradation facile.
 
BIBLIOGRAPHIE  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16,2259.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 882
 
Annexe V  
CORRECTION TENANT COMPTE DE LA CONSOMMATION 
D'OXYGÈNE DUE À L'INTERFÉRENCE DE LA NITRIFICATION  
Les erreurs commises en ne tenant pas compte de la nitrification lors de la 
détermination de la biodégradabilité par mesure de la consommation d'oxygène 
sont mineures (inférieures a 5 %) lorsque les substances à étudier ne contiennent 
pas d'azote, même si l'oxydation de l'azote ammoniacal dans le milieu se produit occasionnellement dans les récipients d'essai ainsi que dans les essais à blanc. Par contre, des erreurs importantes peuvent se produire avec les substances qui 
contiennent de l'azote.
 
Si la nitrification se produit, mais n'est pas complète, la consommation d'oxygène 
observée dans le mélange réactionnel peut être corrigée d'une valeur correspon ­
dant à la quantité d'oxygène utilisée pour oxyder l'ammonium en nitrite et en nitrate, si les modifications de la concentration de nitrite et de nitrate au cours de 
l'incubation sont déterminées par les équations suivantes: 
2 NH
 4 C1 + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Au total: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
D'après l'équation (1), la quantité d'oxygène consommée par l'oxydation de 28 g 
d'azote contenus dans du chlorure d'ammonium (NH  4 Cl) pour former des nitrites 
est égale à 96 g, ce qui correspond à un facteur 3,43 (96/28). De même, d'après 
l'équation (3), la quantité d'oxygène consommée par l'oxydation de 28 g d'azote pour former des nitrates est de 128 g, ce qui correspond à un facteur 4,57 (128/28).
 
Les réactions étant séquentielles et effectuées par différentes espèces bactériennes 
distinctes, la concentration en nitrite peut augmenter ou diminuer; dans ce dernier cas, la concentration de nitrate est équivalente. La quantité d'oxygène consommée par la formation de nitrate est donc égale a 4,57 multiplié par l'augmentation de 
la concentration de nitrate, alors que la quantité d'oxygène associée à la forma ­
tion de nitrite est égale à 3,43 multiplié par l'augmentation de la concentration en nitrite ou dans le cas d'une réduction de sa teneur, la perte en oxygène est égale à - 3,43 multiplié par la diminution de concentration.
 
Ainsi: 
O 2 consommé par la formation de nitrate = 4,57 × augmentation 
de la concentration de N-nitrate (4), 
. 
O 2 consommé par la formation de nitrite = 3,43 × augmentation 
de la concentration de N-nitrite (5) 
et donc 
O 2 perdu lors de la disparition de nitrite = - 3,43 × réduction de 
la concentration de N-nitrite (6) 
De telle sorte que: 
la consommation d'O  2 due à la nitrification = ± 3,43 × modif. de 
la conc. de N-nitrite + 4,57 × augm. de la conc. de N-nitrate (7) 
et donc: 
la consommation d'O  2 due à l'oxydation du C = consommation 
totale observée — consommation due à la nitrification (8). 
Une autre possibilité consiste à estimer que, si seul l'azote oxydé total est déter ­
miné, la consommation d'oxygène due à la nitrification sera, en première approxi ­
mation, égale à 4,57 × l'augmentation de la teneur en azote oxydé.  
La valeur corrigée de la consommation d'oxygène due à l'oxydation du C est 
ensuite comparée à la DThO  NH3 calculée selon les instructions figurant à 
l'annexe II.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 883
 
C.5. DÉGRADATION — DEMANDE BIOCHIMIQUE EN OXYGÈNE  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La méthode a pour objet la mesure de la demande biochimique en 
oxygène (DBO) de substances organiques, liquides ou solides.  
Les données fournies par cet essai concernent les composés hydro ­
solubles; toutefois, les composes volatils et les composés à faible 
hydrosolubilité peuvent également être étudiés, du moins en principe.  
La méthode est applicable uniquement aux substances organiques, 
non inhibitrices vis-à-vis des bactéries à la concentration utilisée au cours de l'essai. Si la substance d'essai n'est pas soluble à la concen ­
tration d'essai, des procédures particulières telles que le recours à la 
dispersion ultrasonique pourraient être utilisées, afin d'obtenir une 
bonne dispersion de la substance.
 
Des données sur la toxicité de la substance chimique peuvent être 
utiles pour l'interprétation de résultats faibles et pour le choix de concentrations d'essai appropriées.
 
1.2. DÉFINITION ET UNITÉS  
La DBO est définie comme la masse d'oxygène dissoute nécessaire 
pour assurer, dans des conditions définies, l'oxydation biochimique d'un volume défini d'une solution de la substance soumise aux essais.
 
Les résultats sont exprimés en grammes de DBO par gramme de 
substance soumise à l'essai.  
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Il est souhaitable de vérifier l'activité de l'inoculum à l'aide d'une 
substance de référence appropriée.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Ensemencer avec des micro-organismes et incuber à une température 
ambiante constante, définie, dans l'obscurité, une quantité prédéter ­
minée de substance, dissoute ou dispersée en milieu aéré approprié.  
La DBO est déterminée par la différence entre la teneur en oxygène 
dissous au début et à la fin de l'essai. La durée de l'essai est d'au 
moins cinq jours et ne dépassera pas 28 jours.  
Un blanc doit être déterminé dans un essai parallèle ne contenant pas 
de substance d'essai.  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
La détermination de la DBO ne peut être considérée comme repré ­
sentant valablement la biodégradabilité d'une substance et ne 
constitue qu'un essai de sélection.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparer une solution ou une dispersion préliminaire de la substance, 
afin d'obtenir une concentration de DBO compatible avec la méthode 
utilisée. La DBO est alors déterminée par application de toute 
méthode appropriée, normalisée, nationale ou internationale.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 884
 
2. ÉVALUATION DES DONNÉES  
La DBO contenue dans la solution préliminaire est calculée suivant 
la méthode normalisée choisie et convertie en grammes de DBO par gramme de substance d'essai.
 
3. RÉSULTATS  
La méthode utilisée doit être indiquée.  
La demande biochimique en oxygène doit être la moyenne d'au 
moins trois mesures valables.  
Toutes les données et observations pertinentes aidant à l'interpréta ­
tion des résultats doivent être consignées, notamment en ce qui concerne les impuretés, l'état physique, les effets toxiques et la 
composition intrinsèque de la substance susceptibles d'affecter les 
résultats.
 
L'utilisation de tout additif inhibiteur de la nitrification biologique 
doit être consignée.  
4. RÉFÉRENCES  
Exemples de méthodes normalisées:  
NF T 90-103: Détermination de la demande biochimique en 
oxygène.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van net biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the 
examination of water and associated materials, HMSO, London.  
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 885
 
C.6. DÉGRADATION — DEMANDE CHIMIQUE EN OXYGÈNE  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La méthode a pour objet la mesure de la demande chimique en 
oxygène (DCO) de substances organiques, liquides ou solides, par 
application de tout mode opératoire normalisé, dans des conditions de laboratoire déterminées.
 
Le fait de disposer de données sur la formule de la substance faci ­
litera la réalisation de cet essai ainsi que l'interprétation des résultats obtenus (par exemple, sels halogénés, sels ferreux de composés 
organiques, composés organochlorés).
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
La demande chimique en oxygène est la mesure de l'oxydabilité 
d'une substance, définie comme la quantité d'oxygène d'un réactif 
oxydant, consommée par la substance dans des conditions de labo ­
ratoire déterminées.  
Le résultat est exprimé en grammes de DCO par gramme de subs ­
tance d'essai.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
L'emploi de substances de référence n'est pas requis dans tous les cas 
où l'on analyse une nouvelle substance. Ces substances de référence 
doivent permettre d'étalonner périodiquement la méthode et de permettre la comparaison des résultats en cas d'application de méthodes différentes.
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Une quantité déterminée de substance dissoute ou dispersée dans de 
l'eau est oxydée à l'aide de bichromate de potassium en présence d'acide sulfurique concentré (le catalyseur étant du sulfate d'argent) à 
reflux pendant deux heures. Le bichromate résiduel est dosé par 
titration à l'aide de sulfate ferreux ammoniacal titré.
 
Au cas où les substances contiennent du chlore, ajouter du sulfate 
mercurique (  1 ) pour réduire l'interférence des chlorures.  
1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ  
En raison des conditions arbitraires de détermination de la DCO, 
cette dernière est un «indicateur d'oxydabilité» à utiliser en tant 
que tel comme méthode pratique de mesure de matière organique.  
Les chlorures peuvent interférer au cours de cet essai; des substances 
inorganiques réductrices ou oxydantes peuvent également interférer avec la détermination de la DCO.
 
Certains composés cycliques et un grand nombre de produits volatils 
(par exemple les acides gras inférieurs) ne sont pas totalement oxydés lors de l'essai.
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Préparer une solution ou une dispersion préliminaire de la substance 
pour obtenir une DCO de 250 à 600 milligrammes par litre.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 886  
( 1 ) Afin d'éviter la dissémination de mercure dans l'environnement, les solutions contenant 
des sels de mercure doivent être traitées après utilisation.
 Remarque:  
Dans le cas des substances peu solubles et non dispersables, peser 
une quantité de substance finement pulvérisée ou à l'état liquide, 
correspondant à environ 5 milligrammes de DCO, et l'introduire dans l'appareil d'expérimentation avec addition d'eau.
 
Il est souvent avantageux, en particulier lorsqu'on a affaire à des 
substances peu solubles, de déterminer la demande chimique en 
oxygène (DCO) à l'aide d'une variante de la méthode, c'est-à-dire 
dans un système clos muni d'un régulateur de pression (H. Kelken ­
berg, 1975). Cette modification permet souvent de parvenir à quan ­
tifier des substances qui le sont difficilement en utilisant la méthode 
classique — par exemple l'acide acétique. Toutefois cette méthode 
échoue elle aussi dans le cas de la pyridine. Le fait d'augmenter jusqu'à une valeur 0,25 N (0,0416 M) la concentration de bichromate de potassium prescrite dans la référence (1) facilite la pesée directe 
d'une quantité de substance comprise entre 5 et 10 mg, ce qui est 
essentiel pour déterminer la DCO de substances faiblement hydroso ­
lubles [référence (2)].
 
Dans les autres cas, déterminer la DCO en suivant toute méthode 
normalisée nationale ou internationale.  
2. ÉVALUATION DES DONNÉES  
Calculer la DCO contenue dans le flacon expérimental, suivant la 
méthode normalisée choisie, et convertir en grammes de DCO par gramme de substance d'essai.
 
3. RÉSULTATS  
La méthode de référence utilisée doit être indiquée.  
La demande chimique en oxygène sera la moyenne d'au moins trois 
mesures. Il sera fait état de toutes données et observations présentant 
de l'intérêt pour l'interprétation des résultats, notamment en ce qui 
concerne les impuretés, l'état physique et les propriétés spécifiques de la substance (si elles sont connues) susceptibles d'affecter les résultats.
 
Mentionner si l'on a fait usage de sulfate mercurique pour réduire 
l'interférence des chlorures.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds, Chemosphere, 1984, vol. 13,169.  
Exemples de méthodes normalisées:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN O11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 887
 
C.7. DÉGRADATION — DÉGRADATION ABIOTIQUE: HYDRO ­
LYSE EN FONCTION DU PH  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est équivalente à la ligne directrice 111 (2004) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Les substances chimiques qui pénètrent dans les eaux de surface par 
différentes voies (applications directes, déperditions lors de l'épandage, 
drainages, élimination de déchets, effluents industriels, domestiques ou agricoles et dépôts atmosphériques) peuvent y être transformées sous l'action de processus chimiques (hydrolyse ou oxydation, par exemple), 
photochimiques et/ou microbiens. La ligne directrice 111 de l'OCDE 
décrit une méthode d'essai en laboratoire permettant d'évaluer les trans ­
formations hydrolytiques abiotiques des substances chimiques en milieux aquatiques à des valeurs de pH normalement rencontrées 
dans l'environnement (pH de 4 à 9), et s'appuie sur des lignes directrices 
existantes (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
Des expériences sont menées pour déterminer: (i) le taux d'hydrolyse 
de la substance d'essai en fonction du pH; et (ii) l'identité ou la nature et les taux de formation et de disparition des produits d'hy ­
drolyse auxquels les organismes peuvent être exposés. De telles 
études peuvent être requises pour les substances chimiques qui sont appliquées directement dans l'eau ou qui sont susceptibles d'at ­
teindre l'environnement par les différentes voies décrites ci-dessus.
 
1.2. DÉFINITION ET UNITÉS  
Voir annexe 2.  
1.3. APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE  
Cette méthode est globalement applicable aux substances chimiques 
(marquées ou non) pour lesquelles il existe une méthode analytique suffisamment sensible et précise. Elle convient également pour les 
composés légèrement volatils et non volatils suffisamment solubles 
dans l'eau. En revanche, cet essai ne peut pas être appliqué aux produits chimiques hautement volatils dans l'eau (fumigants et solvants organiques, par exemple), impossibles à maintenir en solu ­
tion dans les conditions expérimentales de l'essai. De même, avec les 
substances trop peu solubles dans l'eau, la réalisation de cet essai peut s'avérer difficile (8).
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Des solutions aqueuses tampon stériles de différents pH (pH 4, 7 et 
9) sont traitées avec la substance d'essai et incubées dans l'obscurité dans des conditions expérimentales contrôlées (à des températures 
constantes). Après des intervalles de temps appropriés, on analyse 
les solutions tampon pour déterminer la présence de la substance d'essai et des produits d'hydrolyse. Avec une substance d'essai marquée (par exemple, au
 14 C), il est plus facile d'établir un bilan 
massique.  
La présente méthode décrit une approche à plusieurs niveaux, dont le 
détail est donné dans l'annexe 1. Chaque niveau est déclenché par les 
résultats du niveau précédent.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 888
 
1.5. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Des substances d'essai marquées ou non peuvent être utilisées pour 
mesurer le taux d'hydrolyse. Les matières marquées conviennent généralement mieux pour étudier le chemin réactionnel de l'hydro ­
lyse et établir un bilan massique. Toutefois, dans certains cas parti ­
culiers, le marquage n'est pas impératif. Le marquage au
 14 C est 
recommandé, mais l'utilisation d'autres isotopes (  13 C, 15 N, 3 H, par 
exemple) peut aussi convenir. Autant que possible, le marquage doit 
être placé dans la partie la plus stable de la molécule. Par exemple, si 
la substance d'essai comporte un cycle, le marquage de celui-ci est requis. En revanche, pour les substances comportant deux cycles ou 
plus, il peut être nécessaire de procéder à des études distinctes pour 
évaluer le sort de chaque cycle marqué et obtenir les informations requises sur la formation des produits d'hydrolyse. La pureté de la substance d'essai doit être au moins de 95 %.
 
Avant de procéder à un essai d'hydrolyse, il convient de rassembler 
les informations suivantes sur la substance d'essai:  
a) solubilité dans l'eau [méthode d'essai A.6];  
b) solubilité dans les solvants organiques;  
c) pression de vapeur [Méthode d'essai A.4] et/ou constante de la loi 
de Henry;  
d) coefficient de partage n-octanol/eau [méthode d'essai A.8];  
e) constante de dissociation (pK  a ) [ligne directrice 112 de l'OCDE] 
(9); 
f) vitesse de phototransformation directe et indirecte dans l'eau, le 
cas échéant.  
Des méthodes d'analyse doivent être disponibles pour quantifier la 
substance d'essai et, le cas échéant, identifier et quantifier les 
produits d'hydrolyse dans les solutions aqueuses (voir également le point 1.7.2).
 
1.6. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Lorsque cela est possible, il convient d'utiliser des substances de 
référence pour identifier et quantifier les produits d'hydrolyse par 
analyse spectroscopique et chromatographique, ou autres méthodes suffisamment fines.
 
1.7. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.7.1.  Récupération  
L'analyse d'au moins deux solutions tampon ou de leurs extraits, 
immédiatement après l'ajout de la substance d'essai donne une 
première indication de la répétabilité de la méthode analytique et de l'uniformité de la procédure d'application de la substance d'essai. Ce sont les bilans massiques (dans le cas d'une matière marquée) qui 
permettent ensuite d'établir aux étapes suivantes la récupération des 
substances testées. La récupération des substances chimiques, marquées ou non, doit être comprise entre 90 et 110 % (7). S'il est techniquement difficile d'atteindre cette plage de valeurs, une 
récupération de 70 % des substances chimiques non marquées est 
acceptable, mais celle-ci doit faire l'objet d'une justification.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 889
 
1.7.2.  Répétabilité et sensibilité de la méthode analytique  
Pour contrôler la répétabilité de la (ou des) méthode(s) analytique(s) 
utilisée(s) pour quantifier la substance d'essai et les produits d'hy ­
drolyse, on peut procéder à deux analyses des mêmes solutions 
tampon (ou de leurs extraits) après que des produits d'hydrolyse 
ont été formés en quantités suffisantes pour permettre une quantifi ­
cation.  
La méthode analytique doit être suffisamment sensible pour 
permettre de quantifier des concentrations de la substance d'essai jusqu'à 10 %, ou moins, de la concentration initiale. Le cas échéant, 
les méthodes analytiques doivent également permettre de quantifier 
tout produit d'hydrolyse représentant 10 % ou plus de la substance appliquée (à n'importe quel moment au cours de l'étude), et jusqu'à 25 % ou moins de sa concentration maximale.
 
1.7.3.  Intervalles de confiance pour les données cinétiques de l'hydro ­
lyse 
Des intervalles de confiance doivent être calculés et présentés pour 
tous les coefficients de régression, constantes de vitesse, demi-vies et autres paramètres cinétiques (DT
 50 , par exemple).  
1.8. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.8.1.  Matériel et appareillage  
L'étude doit être conduite dans des récipients en verre (tubes à essai, 
petits flacons, par exemple), et le cas échéant dans l'obscurité et dans 
des conditions de stérilité, sauf s'il ressort d'une information prélimi ­
naire (telle que le coefficient de partage n-octanol/eau) que la subs ­
tance d'essai est susceptible d'adhérer au verre. Dans ce cas, une autre matière (le Téflon, par exemple) doit être envisagée. Les 
méthodes suivantes permettent également de contourner le problème 
de l'adhérence au verre:
 
— détermination de la masse de la substance d'essai et des produits 
d'hydrolyse fixés par adsorption au récipient d'essai,  
— utilisation d'un bain à ultrasons,  
— nettoyage de toute la verrerie à l'aide d'un solvant à chaque 
intervalle d'échantillonnage,  
— utilisation de produits formulés,  
— utilisation d'une quantité plus importante de cosolvant à ajouter à 
la substance d'essai. Dans ce dernier cas, il convient d'employer un cosolvant qui n'entraîne pas de réaction d'hydrolyse de la 
substance d'essai.
 
L'incubation des différentes solutions d'essai doit être effectuée avec 
des agitateurs mécaniques à bain thermorégulé ou des incubateurs à 
commande thermostatique.  
Cette expérience nécessite du matériel courant de laboratoire, et en 
particulier:  
— un pH-mètre,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 890
 
— des instruments d'analyse [équipements de chromatographie en 
phase gazeuse, chromatographie en phase liquide à haute perfor ­
mance (HPLC), chromatographie en couche mince, par exemple], et notamment des systèmes de détection appropriés pour l'analyse des substances radiomarquées ou non, l'application de la méthode 
de dilution isotopique inverse,
 
— des instruments d'identification (spectrométrie de masse, spectro ­
métrie de masse couplée à la chromatographie en phase gazeuse, 
spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide à haute performance, résonance magnétique nucléaire, etc.),
 
— un compteur à scintillation liquide;  
— des entonnoirs d'extraction liquide-liquide,  
— des instruments pour la concentration de solutions et d'extraits 
(évaporateur rotatif, par exemple),  
— des dispositifs de contrôle de la température (bain d'eau, par 
exemple).  
Les réactifs chimiques sont notamment:  
— des solvants organiques, de pureté analytique, tels que l'hexane, 
le dichlorométhane, etc.,  
— du liquide de scintillation,  
— des solutions tampon (voir détails point 1.8.3).  
Toute la verrerie, l'eau de qualité «réactif» et les solutions tampon 
utilisées dans les essais d'hydrolyse doivent être stérilisées.  
1.8.2.  Application de la substance d'essai  
La substance d'essai doit être appliquée sous forme de solution 
aqueuse dans les différentes solutions tampon (voir annexe 3). Le 
cas échéant, pour obtenir une dissolution adéquate, l'utilisation de 
petites quantités de solvants miscibles dans l'eau (acétonitrile, acétone, éthanol, par exemple) est autorisée pour assurer une appli ­
cation et une distribution correctes de la substance d'essai, mais la 
proportion ne doit normalement pas dépasser 1 % v/v. Si une 
concentration supérieure en solvants est envisagée (par exemple dans le cas de substances d'essai faiblement solubles), cela ne peut être autorisé que s'il est démontré que le solvant n'a aucune incidence 
sur l'hydrolyse de la substance d'essai.
 
Le recours à un produit formulé n'est pas recommandé, dans la 
mesure où on ne peut exclure que les ingrédients de la formulation 
interfèrent avec le processus d'hydrolyse. Toutefois, pour les subs ­
tances d'essai faiblement solubles dans l'eau, ou celles qui adhèrent au verre (voir point 1.8.1), le recours à un produit formulé peut 
constituer une solution acceptable.
 
Une seule concentration de la substance d'essai doit être utilisée; elle 
ne doit pas dépasser 0,01 M ou la moitié de la concentration de 
saturation (voir annexe 1).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 891
 
1.8.3.  Solutions tampon  
L'essai d'hydrolyse doit être réalisé aux valeurs de pH suivantes: 4, 7 
et 9. À cet effet, il convient de préparer des solutions tampon avec des produits chimiques de pureté analytique et de l'eau. L'annexe 3 
présente quelques systèmes tampon utiles. Il faut noter que le 
système tampon utilisé peut influencer la vitesse d'hydrolyse. Lorsque c'est le cas, il faut utiliser un autre système tampon (
 1 ). 
Le pH de chaque solution tampon doit être vérifié avec un pH-mètre 
étalonné à la température désirée avec une précision d'au moins 0,1.  
1.8.4.  Conditions d'essai  
1.8.4.1.  Température d'essai  
Les expériences d'hydrolyse doivent être menées à des températures 
constantes. Pour permettre l'extrapolation, il est important de main ­
tenir la température constante à ± 0,5  o C. 
Si on ne connaît pas le comportement de la substance d'essai à 
l'hydrolyse, il est nécessaire d'effectuer un essai préliminaire 
(niveau 1) à une température de 50  o C. Les essais cinétiques suivants 
doivent être menés à un minimum de trois températures différentes (y compris l'essai à 50
 o C), à moins que l'essai préliminaire de 
niveau 1 n'ait mis en évidence la stabilité de la substance à l'hydro ­
lyse. Une plage de températures allant de 10 à 70  o C est préconisée 
(avec de préférence au moins une température inférieure à 25  o C). 
Cette plage englobe la température utilisée dans le rapport d'essai 
(25 o C) et la plupart des températures rencontrées sur le terrain.  
1.8.4.2.  Lumière et oxygène  
Tous les essais d'hydrolyse doivent être effectués à l'aide d'une 
méthode adéquate pour éviter les effets de photolyse. Toutes les 
mesures appropriées doivent être prises afin d'éviter l'oxygène (par 
exemple, par barbotage d'hélium, d'azote ou d'argon pendant 5 minutes avant la préparation de la solution).
 
1.8.4.3.  Durée de l'essai  
L'essai préliminaire doit être mené pendant 5 jours, tandis que les 
essais des niveaux supérieurs doivent être conduits jusqu'à 90 % de la substance d'essai, ou pendant 30 jours, au premier des deux termes échus.
 
1.8.5.  Exécution de l'essai  
1.8.5.1.  Essai préliminaire (niveau 1)  
L'essai préliminaire doit être réalisé à 50 ± 0,5  o C et aux pH 
suivants: 4, 7 et 9. Si au bout de 5 jours, on observe un taux 
d'hydrolyse inférieur à 10 % (t  0,5 25  o C > 1 an), la substance est 
considérée comme stable dans l'eau et il n'est normalement pas nécessaire d'effectuer d'autres essais. Si on sait que la substance 
est instable aux températures observées dans l'environnement (
 2 ), il 
n'est pas obligatoire de réaliser un essai préliminaire. La méthode analytique employée doit être suffisamment précise et sensible pour détecter une diminution de 10 % de la concentration initiale.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 892  
( 1 ) Mabey et Mill recommandent l'utilisation de tampons borate ou acétate de préférence à 
des tampons phosphate (11). 
( 2 ) Cette information peut provenir d'autres sources, notamment des résultats d'hydrolyse de 
composés de structure comparable fournis par la littérature ou par d'autres essais d'hy ­
drolyse préliminaires ou semi-quantitatifs effectués sur la substance d'essai à une étape 
plus précoce de son développement.
 1.8.5.2.  Hydrolyse des substances instables (niveau 2)  
L'essai de niveau supérieur (avancé) doit être exécuté aux valeurs de 
pH auxquelles la substance d'essai est apparue instable selon la procédure définie pour l'essai préliminaire ci-avant. Les solutions 
tamponnées de la substance d'essai doivent alors être thermostatées 
aux températures choisies. Pour savoir si la réaction est du premier ordre, chaque solution doit être analysée à des intervalles de temps qui fournissent un minimum de six points espacés, se situant norma ­
lement entre 10 et 90 % d'hydrolyse de la substance étudiée. Des 
échantillons répétés (un minimum de deux échantillons identiques contenus dans des cuves de réaction distinctes) doivent être prélevés 
et leur contenu analysé à chacune des six échéances d'échantillon ­
nage (pour un minimum de 12 points identiques). L'option consistant à utiliser un seul échantillon global d'où serait tirée chacune des aliquotes de la solution d'essai à chaque intervalle d'échantillonnage 
n'est pas considérée comme appropriée du fait qu'elle ne permet pas 
d'analyser la variabilité des données, et qu'elle peut poser des problèmes de contamination de la solution d'essai. Des essais de confirmation de la stérilité doivent être effectués à la fin de l'essai 
de niveau supérieur (c'est-à-dire à 90 % d'hydrolyse ou à 30 jours). 
Toutefois, si aucune dégradation (c'est-à-dire aucune transformation) n'est observée, les essais de stérilité ne sont pas nécessaires.
 
1.8.5.3.  Identification des produits d'hydrolyse (niveau 3)  
Tout produit d'hydrolyse majeur, et au minimum ceux représentant > 
10 % de la dose appliquée, doit être identifié selon les méthodes analytiques appropriées.
 
1.8.5.4.  Essais facultatifs  
Des essais supplémentaires à des pH autres que 4, 7 et 9 peuvent être 
nécessaires pour les substances d'essai instables sur le plan hydroly ­
tique. Par exemple, à des fins physiologiques, il peut s'avérer néces ­
saire d'effectuer un essai dans des conditions plus acides (par exemple à un pH de 1,2) à une seule température pertinente du point de vue physiologique (37
 o C). 
2. RÉSULTATS  
Les quantités de la substance d'essai et des produits d'hydrolyse, le 
cas échéant, doivent être exprimées en pourcentage de la concentra ­
tion initiale appliquée et, lorsque cela est possible, en mg/l pour 
chaque intervalle d'échantillonnage, ainsi que pour chaque pH et température d'essai. En outre, lorsqu'une substance d'essai marquée a été utilisée, un bilan massique doit être fourni en pourcentage de la 
concentration initiale appliquée.
 
Une présentation graphique des logarithmes des concentrations de la 
substance d'essai en fonction du temps doit être présentée. Tous les 
produits d'hydrolyse majeurs, et au minimum ceux représentant > 10 % de la dose appliquée, doivent être identifiés, et les logarithmes de leurs concentrations doivent être présentés de la même manière 
que pour la substance mère, de façon à mettre en évidence leurs 
vitesses de formation et de disparition.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 893
 
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Des déterminations plus précises des demi-vies ou des valeurs de 
DT 50 doivent être obtenues par application des calculs de modèles 
cinétiques appropriés. Les valeurs de demi-vie et/ou de DT  50 (y 
compris les limites de confiance) doivent être précisées pour 
chaque pH et chaque température, avec une description du modèle utilisé, l'ordre de réaction cinétique et le coefficient de détermination (r
 2 ). Le cas échéant, ces calculs doivent être appliqués aux produits 
d'hydrolyse.  
Pour les études menées à différentes températures, les constantes de 
la vitesse d'hydrolyse de pseudo-premier ordre (k  obs ) doivent être 
décrites comme une fonction de température. Le calcul doit être 
basé sur une séparation des k  obs en constantes de vitesse pour les 
catalyses acides, neutres et basiques (respectivement k  H , k neutre , et 
k OH ) et sur l'équation d'Arrhenius:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutre þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutre ;OH A i e ÄB i=T 
où A  i et B  i sont des constantes de régression et d'interception, 
respectivement, des lignes de meilleur ajustement générées à partir 
de la régression linéaire ln k  i sur la réciproque de la température 
absolue en Kelvin (T). En utilisant la relation d'Arrhenius pour les catalyses acides, neutres et basiques, il est possible de calculer les constantes de pseudo-premier ordre, et ainsi les demi-vies, pour 
d'autres températures pour lesquelles la détermination expérimentale 
directe d'une constante de vitesse ne peut être pratiquée (10).
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATIONS DES RÉSULTATS  
La plupart des réactions d'hydrolyse affichent une vitesse de réaction 
apparente de premier ordre, et par conséquent les demi-vies sont indépendantes de la concentration (voir l'équation 4 dans 
l'annexe 2). Cette caractéristique permet généralement d'appliquer 
les résultats obtenus en laboratoire, déterminés entre 10
 -2 et 10  -3 
M, aux conditions dans l'environnement ( ≤ 10 -6 M) (10). Mabey et 
Mill (11) font état de plusieurs exemples de bonne concordance entre 
les taux d'hydrolyse mesurés dans l'eau pure et dans les eaux natu ­
relles, pour un ensemble de substances chimiques, à condition que le pH et la température aient bien été mesurés.
 
3. RAPPORTS  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— nom commun, nom chimique, numéro CAS, formule structurale 
(montrant la position du radiomarqueur, le cas échéant) et 
propriétés physico-chimiques pertinentes (voir point 1.5),  
— pureté (impuretés) de la substance d'essai,  
— pureté radiochimique des substances marquées et activité molaire 
(s'il y a lieu).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 894
 
— Solutions tampon:  
— dates et modalités de préparation,  
— tampons et eaux utilisés,  
— molarité et pH des solutions tampon.  
Conditions d'essai:  
— dates de réalisation des études,  
— quantité de substance d'essai appliquée,  
— méthodes et solvants utilisés (types et quantité) pour l'application 
de la substance d'essai,  
— volume des solutions tamponnées de substances d'essai incubées,  
— description du système d'incubation utilisé,  
— pH et température au cours de l'étude,  
— temps de prélèvement,  
— méthode(s) d'extraction,  
— méthodes de quantification et d'identification de la substance 
d'essai et de ses produits d'hydrolyse dans les solutions tampon,  
— nombre d'essais identiques.  
Résultats:  
— répétabilité et sensibilité des méthodes analytiques utilisées,  
— récupérations (les pourcentages pour une étude correcte sont 
données au point 1.7.1),  
— résultats et moyennes des essais identiques, présentés sous forme 
de tableaux,  
— bilan massique au cours et à la fin des études (en cas d'utilisation 
d'une substance marquée),  
— résultats de l'essai préliminaire,  
— discussion et interprétation des résultats,  
— intégralité des données et figures originales.  
Les informations suivantes sont obligatoires uniquement si une 
vitesse d'hydrolyse est déterminée:  
— tracés des concentrations en fonction du temps pour les subs ­
tances d'essai et, le cas échéant, pour les produits d'hydrolyse à 
chaque valeur de pH et température,  
— tableaux des résultats de l'équation d'Arrhenius pour la tempéra ­
ture 20  o C/25  o C, avec pH, constante [h  -1 ou jour  -1 ], demi-vie ou 
DT 50 , températures [en  o C] y compris les limites de confiance et 
les coefficients de corrélation (r  2 ) ou toute information compara ­
ble, 
— chemin réactionnel d'hydrolyse proposé.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 895
 
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) OCDE (1981). Hydrolyse en fonction du pH. Ligne directrice 
de l'OCDE pour les essais de produits chimiques, N  o 111, 
adoptée le 12 mai 1981.  
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Guide d'homologation des 
pesticides au Canada: chimie et devenir dans l'environnement.  
(4) Union européenne (UE) (1995), directive 2001/36/CE de la 
Commission du 16 mai 2001 portant modification de la direc ­
tive 91/414/CEE du Conseil concernant la mise sur le marché 
des produits phytopharmaceutiques. Annexe V: Devenir et 
comportement dans l'environnement  
(5) Commission néerlandaise pour l'enregistrement des pesticides 
(1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and 
air.
 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr.23.
 
(9) OCDE (1993). Lignes directrices de l'OCDE pour les essais de 
produits chimiques. Paris. OCDE (1994-2000): 6e au 1 1e addenda aux Lignes directrices pour les essais de produits chimiques.
 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, 
November 1993).  
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 896
 
Annexe 1  
Plan de l'essai d'hydrolyse par niveaux
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 897
 
Annexe 2  
Définitions et unités  
Les unités du système international d'unités (SI)  doivent être utilisées.  
Substance d'essai:  toute substance, qu'il s'agisse du composé parent ou des 
produits de transformation.  
Produits de transformation:  toutes les substances résultant des réactions de 
transformation biotique ou abiotique de la substance d'essai.  
Produits d'hydrolyse:  toutes les substances résultant des réactions de transfor ­
mation hydrolytique de la substance d'essai.  
L'hydrolyse  consiste en la réaction d'une substance d'essai RX avec l'eau, avec 
échange net du groupe X contre le groupe OH selon la réaction: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Dans ce processus simplifié, la vitesse à laquelle la concentration de RX décroît 
est donnée par: 
vitesse = k [H  2 O] [RX] réaction du second ordre 
ou 
vitesse = k [RX] réaction du premier ordre  
selon la phase qui détermine la vitesse. Du fait de la présence d'eau en large 
excès par rapport à la substance d'essai, ce type de réaction est habituellement 
décrit comme une réaction de premier ordre, dans laquelle la constante de vitesse 
observée est donnée par la relation: 
ko bs = k[H  2 O] [2]  
et peut être déterminée à partir de l'expression (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
où 
t = temps  
et C  o , C t = concentrations de RX au temps 0 et au temps t.  
Les unités de cette constante ont les dimensions de (temps)  -1 et la demi-vie de la 
réaction (temps au bout duquel 50 % de RX ont réagi) est donnée par:  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
La demi-vie  (t 0,5 ) est le temps requis pour obtenir 50 % d'hydrolyse d'une 
substance d'essai lorsque la réaction peut être décrite comme une cinétique du premier ordre. La demi-vie est indépendante de la concentration.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 898  
(*) Si le tracé des transformations logarithmiques en fonction du temps n'indique pas une 
fonction linéaire (ce qui équivaut à une vitesse de réaction du premier ordre), alors 
l'utilisation de l'équation [3] ne convient pas pour déterminer la constante de vitesse 
d'hydrolyse de la substance d'essai.
 La DT50 (Disappearance time 50)  correspond au laps de temps au bout duquel 
la concentration de la substance d'essai est réduite de 50 pour cent. Cette valeur 
est différente de la demi-vie (t  0,5 ) lorsque la réaction ne suit pas une cinétique du 
premier ordre.  
Estimation de k à différentes températures  
Lorsque les constantes de vitesse sont connues pour deux températures, les 
constantes de vitesse à d'autres températures peuvent être calculées en utilisant 
l'équation d'Arrhenius:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T or ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Un tracé de ln k en fonction de 1/T donne une ligne droite de pente -E/R  
où: 
k = constante de vitesse, mesurée à différentes températures  
E = énergie d'activation [kJ/mol]  
T = température absolue [K]  
R = constante des gaz [8,314 J/mol*K]  
L'énergie d'activation est calculée par analyse de régression ou par l'équation 
suivante:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
où: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 899
 
Annexe 3  
Systèmes tampon  
A. CLARK ET LUBS:  
Mélanges tampons de CLARK et LUBS  (*) 
Composition pH  
HCl 0,2 N et KCl 0,2 N À 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl dil. à 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl dil. à 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl dil. to 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl dil. à 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. à 100 ml 1,8 5,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. à 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl dil. à 100 ml 2,2  
Biphtalate de potassium 0,1 M + HCl 0,1 N à 20
 o C 
46,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 2,2 39,60 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 2,4 32,95 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 2,6 26,42 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 2,8 
20,32 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 3,0 
14,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 3,2 
9,90 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 3,4 5,97 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 3,6 2,63 ml HCl 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 3,8  
Biphtalate de potassium 0,1 M + NaOH 0,1 N à 20
 o C 
0,40 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 4,0 3,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 4,2 7,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 4,4 
12,15 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 4,6 
17,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 900  
(*) Ajouter de petits cristaux de thymol ou d’une substance comparable pour éviter la croissance de moisissures.
 Composition pH  
23,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 5,0 
29,95 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 5,2 
35,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 5,4 39,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 5,6 43,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 5,8 45,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biphtalate à 100 ml 6,0  
Phosphate monopotassique 0,1 M + NaOH 0,1 N à 20
 o C 
5,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 6,0 
8,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 6,2 
12,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 6,4 17,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 6,6 23,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 6,8 29,63 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 7,0 35,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 7,2 39,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 7,4 
42,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 7,6 
45,20 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 7,8 46,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml phosphate à 100 ml 8,0  
H3B03 0,1 M dans KCl 0,1 M + NaOH 0,1 N à 20
 o C 
2,61 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 7,8 3,97 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 8,0 5,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 8,2 8,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 8,4 
12,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 8,6 
16,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 8,8 21,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 9,0 26,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 901
 
32,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 9,4 
36,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 9,6 
40,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 9,8 
43,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acide borique à 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF ET VLEESCHHOUWER:  
Tampons citrate de KOLTHOFF et VLEESCHHOUWER  
Composition pH  
Citrate monopotassique 0,1 M et HCl 0,1 N à 18  o C (*)  
49,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 2,2 43,4 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 2,4 
36,8 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 2,6 
30,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 2,8 
23,6 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 3,0 
17,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 3,2 10,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 3,4 
4,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 3,6  
Citrate monopotassique 0,1 M et NaOH 0,1 N à 18
 o C (*)  
2,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 3,8 
9,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 4,0 
16,3 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 4,2 23,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 4,4 
31,5 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 4,6 
39,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 4,8 46,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 5,0 
54,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 5,2 
61,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 5,4 68,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 5,6 
74,4 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 5,8 
81,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrate à 100 ml 6,0
 
_____________ 
(*) Ajouter de petits cristaux de thymol ou d’une substance comparable pour éviter la croissance de moisissures.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 902
 
C. SÖRENSEN:  
Mélanges de borate de SÖRENSEN  
Composition Sörensen 
18 o C Walbum, pH à 
ml Borax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
Borax 0,05 M + HCl 0,1 N  
4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 
3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 
2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
Borax 0,05 M + NaOH 0,1 N  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Mélanges de phosphates de SÖRENSEN  
Composition pH  
Phosphate monopotassique 0,0667 M + phosphate disodique 0,0667 M à 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH2PO4+ 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH2PO4+ 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 903
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 904
 
C.8 TOXICITÉ POUR LES VERS DE TERRE  
ESSAI SUR SOL ARTIFICIEL  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Dans cet essai de laboratoire, la substance d'essai est ajoutée à un sol 
artificiel dans lequel les vers sont placés pendant 14 jours. Au bout de cette période (et facultativement au bout de 7 jours), l'effet létal de la substance sur les vers de terre est examiné. La méthode permet 
de déterminer assez rapidement l'effet de l'absorption dermique et de 
l'ingestion des produits chimiques sur les vers de terre.
 
1.2. DÉFINITION ET UNITÉ  
CL 50 : concentration d'une substance considérée comme responsable 
de la mort de 50 % des animaux d'expérience pendant la durée de 
l'essai.  
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Une substance de référence est utilisée périodiquement pour démon ­
trer que la sensibilité du système n'a pas changé de façon significa ­
tive. 
La substance de référence recommandée est le chloracétamide de 
qualité analytique.  
1.4. PRINCIPE DE L'ESSAI  
Le sol étant un milieu variable, on utilise pour cet essai un sol 
limoneux artificiel soigneusement défini. Des vers de terre adultes de l'espèce  Eisenia foetida  (voir note en appendice) sont placés dans 
un sol artificiel défini, traité par différentes concentrations de la 
substance d'essai. Le contenu des récipients est étalé sur un plateau 14 jours (et facultativement 7 jours) après le début de l'essai et, pour chaque concentration, les vers de terre survivants 
sont comptés.
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
L'essai est conçu pour être aussi reproductible que possible au point 
de vue du substrat et de l'organisme. Si la mortalité des témoins dépasse 10 % à la fin de l'essai, celui-ci n'est pas valide.
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Matériel  
1.6.1.1. S u b s t r a t  
On utilise comme substrat de base un sol artificiel bien défini.  
a) Substrat de base (les pourcentages sont exprimés en poids sec):  
— 10 % de tourbe à sphaignes (de pH aussi proche que possible 
de 5,5 à 6,0, ne contenant pas de restes de plante visibles et 
finement broyée),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 905
 
— 20 % d'argile kaolinique contenant si possible plus de 50 % 
de kaolinite,  
— environ 69 % de sable quartzique industriel (essentiellement 
du sable fin contenant plus de 50 % de particules de granu ­
lométrie comprise entre 0,05 et 0,2 mm). Si la substance n'est 
pas suffisamment dispersible dans l'eau, 10 g par récipient 
doivent être mis de côté pour être mélangés ultérieurement à la substance à tester,
 
— environ 1 % de carbonate de calcium (CaCO  3 ) pulvérisé, 
chimiquement pur, pour ajuster le pH à 6,0 ± 0,5.  
b) Substrat d'essai:  
Le substrat pour les essais contient le substrat de base, la subs ­
tance d'essai et de l'eau désionisée.  
Le teneur en eau est d'environ 25 à 42 % du poids sec du substrat 
de base. La teneur en eau du substrat est déterminée par séchage 
d'un échantillon à 105  o C, jusqu'à ce que le poids reste constant. 
Le critère clé est que le sol artificiel doit être humidifié jusqu'à saturation. Le mélange doit être effectué soigneusement, de 
manière à obtenir une répartition uniforme de la substance 
d'essai et du substrat. La façon dont la substance d'essai est introduite dans le substrat doit être indiquée.
 
c) Substrat témoin:  
Le substrat témoin contient le substrat de base et de l'eau. Si l'on 
utilise un additif, un substrat témoin supplémentaire doit contenir la même quantité d'additif.
 
1.6.1.2. R é c i p i e n t s  
Récipients en verre d'une capacité d'environ 1 litre (convenablement 
recouverts de couvercles en plastique, de coupelles ou d'une feuille de plastique avec trous d'aération), remplis d'une quantité de substrat 
d'essai ou de substrat témoin humide équivalant à 500 g de substrat 
sec.
 
1.6.2.  Conditions expérimentales  
Les récipients doivent être déposés dans des locaux climatisés dont 
la température est maintenue à 20  o C ± 2  o C, sous éclairement 
continu compris entre 400 et 800 lux.  
La durée de l'essai est de 14 jours, mais la mortalité peut être 
déterminée 7 jours après le début de l'essai.  
1.6.3.  Méthode  
C o n c e n t r a t i o n s  
Les concentrations de la substance d'essai sont exprimées en poids 
de substance par unité de substrat de base sec (mg/kg).  
E s s a i d e s é l e c t i o n d e s c o n c e n t r a t i o n s à u t i l i s e r  
La gamme des concentrations correspondant à des taux de mortalité 
allant de 0 à 100 % peut être déterminée par un essai renseignant sur 
l'intervalle de concentrations à utiliser dans l'essai définitif.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 906
 
La substance doit être testée aux concentrations suivantes: 1 000, 
100, 10, 1, 0,1 mg de substance/kg de substrat (poids sec).  
Si un essai définitif complet est effectué, un lot par concentration et 
un lot témoin contenant chacun dix vers devraient être suffisants pour l'essai de sélection des concentrations à utiliser.
 
E s s a i d é f i n i t i f  
Les résultats de l'essai de sélection des concentrations à employer 
sont utilisés pour choisir au moins 5 concentrations dans une série géométrique couvrant exactement l'intervalle de 0 à 100 % de morta ­
lité et dans un rapport constant inférieur ou égal à 1,8.
 
Un essai utilisant cette série de concentrations devrait permettre 
d'évaluer avec la plus grande précision possible la valeur de la CL
 50 et de ses limites de confiance.  
Pour l'essai définitif, on utilise au moins 4 lots par concentration et 4 
lots témoins contenant chacun 10 vers. Les résultats de ces lots en 
parallèle sont exprimés sous la forme de moyenne et d'écart type.  
Lorsque deux concentrations consécutives dans un rapport de 1,8 ne 
donnent que 0 % et 100 % de mortalité, ces deux valeurs suffisent à 
indiquer l'intervalle dans lequel se situe la CL  50. 
M é l a n g e d u s u b s t r a t d e b a s e e t d e l a s u b s t a n c e 
d ' e s s a i  
Le substrat ne devrait pas, si possible, contenir d'autres additifs que 
de l'eau. Immédiatement avant le début de l'essai, une émulsion ou 
une dispersion de la substance d'essai dans de l'eau désionisée ou dans un autre solvant est mélangée au substrat de base ou unifor ­
mément projetée à sa surface à l'aide d'un pulvérisateur de chroma ­
tographie ou du même type.
 
Si elle est insoluble dans l'eau, la substance d'essai peut être dissoute 
dans le plus petit volume possible d'un solvant organique approprié (par exemple hexane, acétone ou chloroforme).
 
Seuls des agents très volatils peuvent être utilisés pour solubiliser, 
disperser ou émulsifier la substance d'essai. Avant emploi, le substrat doit être aéré. La quantité d'eau évaporée doit être remplacée. Le substrat témoin doit contenir la même quantité de tout additif.
 
Si la substance d'essai n'est pas soluble, dispersible ou émulsifiable 
dans des solvants organiques, 10 g d'un mélange de sable quartzique 
finement broyé et d'une quantité de substance d'essai correspondant à la dose nécessaire pour traiter 500 g de sol artificiel sec sont 
mélangés à 490 g de substance d'essai sèche.
 
Pour chaque lot, une quantité de substrat humide équivalant à 500 g 
de poids sec est placée dans chaque récipient en verre et 10 vers de terre ayant été conditionnés pendant 24 heures dans un substrat de base humide analogue, puis rincés rapidement, l'eau excédentaire 
étant absorbée sur un papier-filtre sont placés à la surface du subs ­
trat.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 907
 
Les récipients sont recouverts de couvercles, de coupelles ou d'une 
feuille en plastique perforé afin d'éviter le dessèchement du substrat 
et ils sont maintenus dans les conditions d'essai pendant 14 jours.  
Les évaluations doivent être faites au bout de 14 jours (et facultati ­
vement de 7 jours). Le substrat est étalé sur une plaque de verre ou d'acier inoxydable. Les vers de terre sont examinés et le nombre de 
vers de terre survivants est déterminé. Les vers de terre sont consi ­
dérés comme morts s'ils ne réagissent pas à un léger stimulus méca ­
nique appliqué à leur extrémité antérieure.
 
Lorsque l'examen est fait au bout de 7 jours, le récipient est à 
nouveau rempli de substrat et les vers de terre survivants sont 
replacés sur le même substrat.  
1.6.4.  Organismes d'expérience  
Les organismes d'expérience doivent être des  Eisenia foetida  adultes 
(voir note en appendice) (âgés d'au moins 2 mois, avec clitellum) — 
poids humide: 300 à 600 mg (pour la méthode d'élevage, voir appen ­
dice).  
2. RÉSULTATS  
2.1. TRAITEMENT ET ÉVALUATION DES RÉSULTATS  
Les concentrations de la substance d'essai sont consignées avec les 
pourcentages correspondants de vers de terre morts.  
Si les données sont adéquates, la valeur de la CL  50 et les intervalles 
de confiance (p = 0,05) sont déterminées à l'aide de méthodes stan ­
dards (Litchfield et Wilcoxon, 1949 ou méthode équivalente). La CL
 50 doit être exprimée en milligrammes de la substance d'essai 
par kilogramme de substrat (poids sec).  
Dans le cas où la pente de la courbe est trop accentuée pour 
permettre le calcul de la CL  50 , il suffira de procéder à une estimation 
graphique de cette valeur.  
Lorsque deux concentrations consécutives dans un rapport de 1,8 ne 
donnent que 0 ou 100 % de mortalité, ces deux valeurs suffisent à 
indiquer l'intervalle dans lequel se situe la CL  50 . 
3. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— attestation de conformité de l'essai aux critères de qualité énoncés 
ci-dessus,  
— essai effectué (essai de détermination des ordres de grandeur 
et/ou essai définitif),  
— description précise des conditions d'essai ou attestation de 
conformité de l'essai, tout écart par rapport à la méthode étant indiqué,
 
— description précise de la manière dont la substance d'essai a été 
mélangée au substrat de base,  
— information sur les organismes soumis à l'essai (espèce, âge, 
poids moyen et gamme de poids, conditions d'élevage, fournis ­
seur),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 908
 
— méthode appliquée pour déterminer la CL  50 , 
— résultat de l'essai, avec toutes les données utilisées,  
— description des symptômes observés ou des modifications du 
comportement des organismes soumis à l'essai,  
— mortalité chez les témoins,  
— CL  50 ou concentration maximale testée n'ayant pas causé de 
mortalité et concentration minimale testée ayant causé 100 % de mortalité au bout de 14 jours (et facultativement de 7 jours),
 
— tracé de la courbe concentrations/réponses,  
— résultats obtenus avec la substance de référence, au cours du 
présent essai ou de contrôles antérieurs de la qualité.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice 207, décision du Conseil 
C(81) 30 final.  
(2) Edwards, C, A. and Lofty, 1977,  Biology of Earthworms , 
Chapman and Hall, London, 331 pages.  
(3) Bouche, M- B., 1972, Lombriciens de France, Écologie et 
Systématique, Institut national de la recherche agronomique, 
671 pages.  
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 
vol. 96, 1949, 99 pages.  
(5) Commission des Communautés européennes, Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und 
Forsrwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag «Toxizitäts ­
test am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden», in: 
Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 909
 
Appendice  
Élevage des vers avant les essais  
Trente à cinquante vers adultes sont introduits dans un récipient d'élevage conte ­
nant du substrat frais et en sont retirés au bout de 14 jours. Ces animaux peuvent être utilisés pour de nouveaux lots d'élevage. Les vers de terre sortis des cocons 
sont utilisés pour les essais lorsqu'ils sont arrivés à maturité (soit au bout de deux 
ou trois mois dans les conditions prescrites).
 
Conditions d'élevage  
Local climatisé: température: 20  o C ± 2  o C, de préférence sous éclaire ­
ment continu (intensité 400 à 800 lux).  
Récipient d'élevage: récipients creux d'une capacité de 10 à 20 litres.  
Substrat: l' Eisenia foetida  peut être élevé avec différents excré ­
ments animaux. Il est recommandé d'utiliser comme milieu d'élevage un mélange en volume de 50 % de 
fumier de vache ou de cheval et de 50 % de tourbe. 
Le milieu doit avoir un pH d'environ 6 ou 7 (ajusté avec du carbonate de calcium) et une faible conductivité 
ionique (moins de 6 mmhos ou une concentration de 
sel de 0,5 %). Le substrat doit être humide, mais ne doit pas être trop mouillé. 
Outre la méthode décrite ci-dessus, d'autres méthodes 
peuvent être utilisées.
 
Note : Il existe deux races d' Eisenia foetida  que certains taxonomistes ont sépa ­
rées en espèces (Bouche, 1972). Celles-ci sont morphologiquement semblables, mais l'une,  Etsenia foetida foetida , se distingue par des rayures ou des bandes sur 
les segments, tandis que l'autre,  Eisenia foetida andrei , n'en a pas et a une 
couleur rougeâtre aux nuances variées. Il convient d'utiliser si possible  Eisenia 
foetida andrei . D'autres espèces peuvent être utilisées si l'on dispose de la métho ­
dologie nécessaire.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 910
 
C.9 BIODÉGRADATION  
ESSAI DE ZAHN ET WELLENS  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode a pour but d'évaluer la biodégradabilité totale 
potentielle de substances organiques non volatiles solubles dans l'eau lorsqu'elles sont exposées à des concentrations relativement élevées de micro-organismes lors d'un essai statique.
 
Il peut y avoir adsorption physico-chimique sur les solides en 
suspension, et il convient d'en tenir compte lors de l'interprétation 
des résultats (voir 3.2).  
Les substances à étudier sont utilisées dans des concentrations 
correspondant à des valeurs de COD allant de 50 à 400 mg/litre 
ou à des valeurs de DCO situées entre 100 et 1 000 mg/litre (COD = carbone organique dissous; DCO = demande chimique en oxygène). Ces concentrations relativement élevées assurent une 
bonne fiabilité analytique. Les composés possédant des propriétés 
toxiques peuvent ralentir ou empêcher le processus de dégradation.
 
Dans cette méthode, on emploie la mesure de la concentration du 
carbone organique dissous ou la demande chimique en oxygène pour 
évaluer la biodégradation finale de la substance d'essai.  
L'emploi simultané d'une méthode analytique spécifique peut 
permettre d'évaluer la biodégradation primaire de la substance (dis ­
parition de la structure chimique initiale).  
La méthode n'est applicable qu'aux substances organiques qui, à la 
concentration utilisée dans l'essai:  
— sont solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai,  
— ont une pression de vapeur négligeable dans les conditions de 
l'essai,  
— n'ont pas d'effets inhibiteurs vis-à-vis des bactéries,  
— ne font pas l'objet d'une adsorption importante sur l'appareillage,  
— ne disparaissent pas de la solution par formation de mousse.  
Il est utile de connaître les proportions relatives des principaux 
éléments constitutifs de la substance d'essai pour interpréter les résul ­
tats obtenus, notamment lorsque ceux-ci sont peu élevés ou margi ­
naux.  
La connaissance de la toxicité de la substance vis-à-vis des micro- 
organismes peut être intéressante pour interpréter les résultats peu 
élevés et pour choisir les concentrations d'essai appropriées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 911
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le taux de dégradation obtenu à la fin de l'essai constitue la «biodé ­
gradabilité en essai de Zahn et Wellens»:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
dans laquelle:  
D T = biodégradation (%) au temps T,  
C A = valeurs du COD (ou de la DCO) du mélange d'essai mesu ­
rées 3 heures après le début de l'essai (mg/l) (COD = 
carbone organique dissous; DCO = demande chimique 
en oxygène),  
C T = valeurs du COD ou de la DCO du mélange d'essai au 
moment du prélèvement de l'échantillon (mg/l),  
C B = valeur du COD ou de la DCO du témoin au moment du 
prélèvement (mg/l),  
C BA = valeur du COD ou de la DCO du témoin mesurée 3 heures 
après le début de l'essai (mg/l).  
Le taux de dégradation obtenu est arrondi au pourcentage entier le 
plus proche.  
Le pourcentage de dégradation est défini comme étant le pourcentage 
de disparition du COD (ou de la DCO) de la substance d'essai.  
La différence entre la valeur mesurée après 3 heures et la valeur 
initiale calculée ou, mieux, mesurée, peut donner des renseignements 
intéressants sur l'élimination de la substance (voir 3.2: Interprétation 
des résultats).  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Des substances de référence peuvent parfois être utiles lors de l'étude 
de substances nouvelles; toutefois, des substances de référence spéci ­
fiques ne peuvent pas encore être recommandées.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
On introduit la boue activée, les substances nutritives minérales et 
une solution aqueuse de la substance à examiner constituant la seule 
source de carbone dans un récipient en verre de 1 à 4 litres muni 
d'un agitateur et d'un aérateur. Le mélange est agité et aéré à une température de 20 à 25
 o C, en lumière diffuse ou en chambre noire 
pendant une période pouvant aller jusqu'à 28 jours. Le processus de 
dégradation est suivi en déterminant la valeur du COD (ou de la 
DCO) dans la solution filtrée, quotidiennement ou selon une autre périodicité appropriée. Après chaque période, le COD (ou la DCO) éliminé est rapporté à la valeur constatée 3 heures après le début de 
l'essai et exprimé en pourcentage de biodégradation; cela constitue la 
mesure du taux de dégradation à ce moment. Le résultat rapporté graphiquement en fonction du temps donne la courbe de biodégra ­
dation.
 
Si on utilise une méthode analytique spécifique, on peut mesurer les 
variations de la concentration de la molécule originale dues à la 
biodégradation (biodégradabilité primaire).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 912
 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
La reproductibilité de la méthode a été reconnue satisfaisante lors 
d'un essai d'intercomparaison  
La sensibilité de la méthode est largement déterminée par la varia ­
bilité du témoin et, dans une moindre mesure, par la précision de la détermination du carbone organique dissous et de la concentration de 
la substance dans le milieu d'essai.
 
1.6. DESCRIPTION  
1.6.1.  Préparations  
1.6.1.1. R é a c t i f s  
Eau: eau potable contenant moins de 5 mg/l de carbone organique. 
La concentration totale d'ions calcium et magnésium ne doit pas dépasser 2,7 mmoles/l; si ce n'est pas le cas, corriger la dilution 
par addition d'eau déionisée ou distillée. 
Acide sulfurique, pureté analytique (P.A.): 50 g/l 
Solution d'hydroxyde de soude P.A.: 40 g/l Solution nutritive minérale: dissoudre dans un litre d'eau 
déionisée: 
Chlorure d'ammonium, NH
 4 C1, P.A.: 38,40 g 
Dihydrogénophosphate de sodium, NaH  2 PO 4 .2H  2 O, P.A.: 33,40 g 
Dihydrogénophosphate de potassium, KH  2 PO 4 , P.A.: 8,50 g 
Monohydrogénophosphate de potassium, K  2 HPO  4 , P.A.: 21,75 g  
Le mélange sert à la fois de milieu nutritif et de solution tampon.  
1.6.1.2. A p p a r e i l l a g e  
Récipients de verre contenant entre 1 et 4 litres (par exemple réci ­
pients cylindriques).  
Dispositif d'agitation comprenant un agitateur en verre ou en métal 
fixé à une tige appropriées (l'agitateur doit décrire un mouvement rotatif à environ 5 à 10 cm au-dessus du fond du récipient). On peut utiliser également un agitateur magnétique muni d'un barreau de 7 à 
10 cm de long.
 
Tube d'aération en verre de 2 à 4 mm de diamètre intérieur. L'ou ­
verture du tube doit se trouver à environ 1 cm au-dessus du fond du 
récipient.  
Centrifugeuse (environ 3 550 g).  
pH-mètre.  
Appareil pour la mesure de l'oxygène dissous.  
Filtres papier.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 913
 
Appareil de filtration sur membranes.  
Membranes filtrantes, porosité: 0,45 μm. Les membranes filtrantes 
conviennent si elles ne libèrent pas de carbone et n'absorbent pas la 
substance au stade de la filtration.  
Matériel d'analyse pour le dosage du carbone organique et la déter ­
mination de la demande chimique en oxygène.  
1.6.1.3. P r é p a r a t i o n d e l ' i n o c u l u m  
Laver la boue activée provenant d'une station d'épuration biologique 
par centrifugations ou décantations successives dans l'eau utilisée 
pour l'essai (voir supra).  
La boue activée doit avoir les caractéristiques requises. Cette boue 
peut être obtenue dans une station d'épuration en bon état de fonc ­
tionnement. Pour disposer d'autant d'espèces et de souches diffé ­
rentes de bactéries que possible, il peut être préférable de mélanger 
des inoculums provenant de sources différentes (par exemple de 
différentes stations d'épuration, d'extraits de sol, des eaux de rivière, etc.). Le mélange doit être traité comme indiqué plus haut.
 
Pour le contrôle d'activité de la boue activée, voir infra «Contrôle 
fonctionnel».  
1.6.1.4. P r é p a r a t i o n d e s s o l u t i o n s  
Dans le récipient d'essai, ajouter 500 ml d'eau (voir supra), 2,5 
ml/litre de solution minérale nutritive et une quantité de boues acti ­
vées correspondant à 0,2-1,0 g/l de matière sèche dans le mélange 
final. Ajouter suffisamment de solution stock de la substance à tester 
de façon à obtenir dans le mélange final une concentration de COD de 50 à 400 mg/l. Les valeurs correspondantes de DCO sont 100- 1 000 mg/l. Ajouter de l'eau jusqu'à un volume total de 1 à 4 litres. 
Le volume total choisi dépend du nombre d'échantillons à prélever 
pour la détermination du COD ou de la DCO et du volume néces ­
saire pour l'analyse.
 
Normalement, on considère 2 litres comme un volume satisfaisant. 
Pour chaque série d'essais, préparer au moins un récipient témoin (blanc) contenant uniquement de la boue activée et la solution miné ­
rale nutritive, diluées avec de l'eau jusqu'au même volume total que 
dans les récipients d'essai.
 
1.6.2.  Mode opératoire  
Les récipients d'essai sont agités au moyen d'agitateurs magnétiques 
ou à hélice, en lumière diffuse ou en chambre noire, a une tempé ­
rature de 20 à 25  o C. L'aération est assurée par injection d'air 
comprimé purifié par un filtre d'ouate et si nécessaire par un 
flacon laveur. Veiller à ce que la boue ne décante pas et que la 
concentration d'oxygène ne tombe pas au-dessous de 2 mg/l.  
Vérifier le pH à intervalles réguliers (par exemple quotidiennement) 
et l'amener le cas échéant à pH 7-8.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 914
 
Les pertes dues à l'évaporation sont compensées juste avant chaque 
prélèvement d'échantillon au moyen d'eau déionisée ou distillée. Une 
bonne méthode consiste à marquer le niveau du liquide sur le réci ­
pient avant de commencer l'essai. De nouvelles marques sont faites après chaque prélèvement (sans aération ni agitation). Les premiers 
échantillons sont toujours prélevés 3 heures après le début de l'essai 
de façon à permettre de détecter une adsorption de la substance d'essai sur la boue activée.
 
Pour suivre la dégradation de la substance d'essai, effectuer un 
dosage de COD ou de DCO quotidiennement ou à tout autre inter ­
valle régulier. Filtrer les échantillons provenant du récipient d'essai et 
du récipient témoin sur un papier filtre soigneusement lavé. Éliminer les 5 premiers millilitres du filtrat de la solution d'essai. Les boues difficilement filtrables peuvent être éliminées au préalable par une 
centrifugation de 10 minutes. Les déterminations de COD et de DCO 
sont faites au moins en double. La durée des essais va jusqu'à 28 jours.
 
Note:  Les échantillons restant troubles sont filtrés sur membranes. 
Celles-ci ne doivent ni libérer ni adsorber de matières organiques.  
C o n t r ô l e f o n c t i o n n e l d e s b o u e s a c t i v é e s  
Pour chaque série d'essais, on peut prévoir un récipient contenant 
une substance connue, de façon à pouvoir vérifier la capacité fonc ­
tionnelle de la boue activée. Le diéthylèneglycol s'est révélé utile à 
cette fin.  
A d a p t a t i o n  
Si des analyses sont effectuées à des intervalles relativement courts 
(par exemple quotidiennement), la courbe de dégradation peut faire 
clairement apparaître un phénomène d'adaptation (voir figure 2). 
L'essai ne devrait donc pas être commencé immédiatement avant un week-end.
 
Si l'adaptation se produit dans les derniers jours de l'essai, celui-ci 
peut être prolongé jusqu'à dégradation complète.  
Note:  Si une meilleure connaissance du comportement de la boue 
adaptée est nécessaire, on exposera à nouveau la même boue activée à la même substance d'essai suivant le mode opératoire ci-après:
 
Arrêter l'agitateur et l'aérateur et laisser décanter la boue activée. 
Éliminer le surnageant, remplir d'eau jusqu'à atteindre 2 litres, 
agiter pendant 15 minutes et laisser à nouveau décanter. Éliminer 
à nouveau le surnageant, et utiliser la boue restante pour répéter l'essai avec la même substance conformément aux paragraphes 1.6.1.4 et 1.6.2 ci-dessus. La boue activée peut égale ­
ment être séparée par centrifugation plutôt que par décantation.
 
La boue adaptée peut être mélangée avec de la boue fraîche pour 
atteindre 0,2 à 1 g de matière sèche par litre.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 915
 
A n a l y s e s  
En général, on filtre les échantillons sur papier-filtre soigneusement 
lavé à l'eau déionisée.  
Les échantillons qui restent troubles sont filtrés sur membranes 
(0,45 μm). 
Déterminer la concentration de COD en double dans les filtrats des 
échantillons (éliminer les cinq premiers millilitres), à l'aide d'un 
appareil de mesure du COT. Si l'analyse du filtrat ne peut être faite le jour même, le conserver au réfrigérateur jusqu'au lendemain. Il est déconseillé de la conserver plus longtemps.
 
Déterminer la concentration de DCO dans les filtrats d'échantillon à 
l'aide du dispositif d'analyse de la DCO conformément au mode 
opératoire décrit dans la référence (2) ci-après.  
2. ÉVALUATION DES DONNÉES  
Procéder au moins à deux déterminations de la concentration de 
COD et de DCO dans les échantillons, conformément aux indica ­
tions fournies ci-dessus au paragraphe 1.6.2. Calculer le pourcentage 
de dégradation au temps T suivant la formule (avec ses définitions) 
donnée au paragraphe 1.2 ci-dessus.  
Arrondir le taux de dégradation à l'unité de pourcentage la plus 
proche. Le taux de dégradation atteint à la fin de l'essai constitue 
la «biodégradabilité dans l'essai de Zahn-Wellens».  
Note:  Si la dégradation complète est réalisée avant la fin de la durée 
de l'essai et si ce résultat est confirmé par une seconde analyse effectuée le lendemain, il peut être mis fin à l'essai.
 
3. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal de l'essai contiendra, si possible:  
— la concentration initiale de la substance,  
— toutes autres indications et les résultats expérimentaux relatifs à 
la substance testée, à la substance de référence éventuelle, et au témoin,
 
— la concentration après trois heures,  
— la courbe de biodégradation avec description,  
— la date et l'endroit du prélèvement de l'inoculum, stade d'adapta ­
tion, concentration utilisée, etc.,  
— les raisons scientifiques d'éventuelles modifications de la procé ­
dure d'essai.  
3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
L'élimination du COD (ou de la DCO) qui se produit graduellement 
pendant un certain nombre de jours ou de semaines indique que la 
substance testée se dégrade biologiquement.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 916
 
Cependant, une adsorption physico-chimique peut jouer un rôle dans 
certains cas: ceci est montré lorsqu'il y a élimination totale ou 
partielle de la substance dès le début, lors des 3 premières heures, et que la différence entre le surnageant des milieux témoins et d'essai reste faible.
 
Des essais supplémentaires sont nécessaires si l'on doit faire la 
distinction entre biodégradation (ou biodégradabilité partielle) et 
adsorption.  
Il y a pour cela plusieurs méthodes, la meilleure étant d'employer le 
surnageant comme inoculum dans un essai du niveau de base (de préférence un essai respirométrique).
 
Les substances donnant dans cet essai une élimination élevée, non 
liée a l'adsorption du COD (ou de la DCO) devraient être considé ­
rées comme potentiellement biodégradables. Une élimination partielle, non liée à l'adsorption, indique que le produit chimique 
est au moins biodégradable dans une certaine mesure. Une élimina ­
tion faible ou nulle de COD (DCO) peut être due à l'inhibition des micro-organismes par la substance testée; ceci peut être révélé par lyse et perte de boue donnant des surnageants troubles. L'essai 
devrait être répété avec une concentration plus faible de substance.
 
L'emploi d'une méthode analytique spécifique ou d'une substance 
d'essai marquée au  14 C peut permettre une plus grande sensibilité. 
Dans le cas de composés marqués au  14 C, la récupération de  14 CO 2 
confirmera qu'il y a eu biodégradation.  
Quand les résultats sont exprimés en termes de biodégradation 
primaire, il conviendrait de fournir dans la mesure du possible une explication concernant le changement de structure chimique qui a conduit à une diminution de réponse de la substance d'origine.
 
La validation de la méthode analytique doit être accompagnée de 
l'indication de la réponse trouvée avec le témoin.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice 302 B, décision du Conseil 
C(81) 30 final.  
(2) Annexe V, C. 9. «Dégradation: demande chimique en oxygène», 
de la directive 84/449/CEE, Journal officiel des Communautés européennes n
 o L 251 du 19 septembre 1984.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 917
 
Appendice  
EXEMPLE D'ÉVALUATION 
Composé organique: acide 4-éthoxybenzoïque 
Concentration théorique: 600 mg/l COD théorique: 390 mg/l 
Inoculum: Station d'épuration des eaux d'égout de ... 
Concentration; 1 gramme de matière sèche par litre État d'adaptation: non adapté Analyse: détermination du COD 
Volume de l'échantillon: 3 ml 
Substance de contrôle: diethylèneglycol Toxicité du composé: sans effet toxique au-dessous de 1 000 mg/l 
Essai pratique: essai des tubes de fermentation.
 
Temps Substance de contrôle Substance à étudier 
Blanc 
COD (  1 ) 
mg/l COD (  1 ) 
mg/l COD net 
mg/l Dégradation 
% COD (  1 ) 
mg/l COD net 
mg/l Dégradation 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 heures 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 jour 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 jours 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 jours 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 jours 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 jours 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 jours 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 jours 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 jours 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Valeurs moyennes de trois déterminations.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 918
 
Figure 1  
Exemples de courbes de biodégradation
  
Figure 2  
Exemples d'adaptation d'une boue
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 919
 
C.10.  ESSAI DE SIMULATION – TRAITEMENT AÉROBIE DES EAUX 
USÉES: C.10-A: UNITÉS DE TRAITEMENT PAR BOUES ACTIVÉES – 
C.10-B: BIOFILMS  
C.10-A: Unités de traitement par boues activées  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 303 (2001) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Dans les années 50, on s’est rendu compte que les nouveaux tensioactifs provoquaient un gonfle ­
ment excessif de la mousse dans les stations de traitement des eaux usées et 
les cours d’eau. Ils n’étaient pas complètement éliminés par le traitement aérobie et limitaient dans certains cas l’élimination d’autres matières orga ­
niques. Ce constat a été à l’origine de nombreuses études sur les moyens 
d’éliminer les tensioactifs des eaux usées et sur les possibilités d’application 
des nouvelles substances chimiques produites par l’industrie au traitement des eaux usées. Des modèles d’unités représentant les deux principaux types 
de traitement biologique aérobie des eaux usées (boues activées et lits à 
ruissellement, ou lits bactériens) ont été utilisés à cette fin. Il aurait en effet été peu commode et très coûteux de répartir chaque nouvelle substance entre différentes stations de traitement à grande échelle et d’assurer un suivi des 
essais, même au niveau local.
 
CONSIDÉRATIONS INITIALES  
Unités de traitement par boues activées  
2. Les descriptions de modèles d’unités à boues activées mentionnent des 
dimensions comprises entre 300 ml et environ 2 000 ml. Certaines unités, répliques assez fidèles de stations en vraie grandeur, comportaient des 
bassins de décantation où les boues séjournaient avant d’être renvoyées 
par pompage dans le bassin d’aération, tandis que d’autres n’étaient pas équipées pour cette opération, par exemple le modèle de Swisher (1). La dimension de l’appareil résulte d’un compromis: il doit être assez grand 
pour fonctionner correctement sur le plan mécanique et traiter un volume 
d’échantillons suffisant sans que son fonctionnement en soit altéré et, d’autre part, il ne doit pas occuper trop d’espace ni demander une quantité de matériel excessive.
 
3. Deux types d’appareils, appliqués au départ à l’étude des tensioactifs, ont 
été abondamment utilisés avec des résultats satisfaisants: les unités d’Hus ­
mann (2) et les unités à vase poreux (3) (4), qui sont décrites dans la présente méthode d’essai. D’autres unités ont également fait leurs preuves, par exemple celle d’Eckenfelder (5). Compte tenu du coût relativement 
élevé et des efforts exigés par la conduite de cet essai de simulation, des 
essais de sélection plus simples et moins onéreux, qui figurent à présent au chapitre C.4-A à F de la présente annexe (6), ont été étudiés en parallèle. L’expérience acquise avec de nombreux tensioactifs et d’autres produits 
chimiques a montré que ceux qui donnaient un résultat positif aux essais 
de sélection (facilement biodégradables) se dégradaient aussi au cours de l’essai de simulation. Certaines des substances rejetées par les essais de sélection étaient acceptées d’après les essais de biodégradabilité intrinsèque 
[chapitres C.12 (7) et C.19 (8) de la présente annexe] mais une partie 
seulement des substances formant ce dernier groupe se dégradait au cours de l’essai de simulation, tandis que les substances écartées par les essais de biodégradabilité intrinsèque n’étaient pas dégradées au cours des essais de 
simulation (9) (10) (11).
 
4. Les essais de simulation conduits sous une seule combinaison de conditions 
expérimentales suffisent à remplir certains objectifs; les résultats sont 
exprimés en pourcentage d’élimination de la substance d’essai ou du carbone organique dissous (COD). Ce type d’essai est décrit dans la présente méthode d’essai. Toutefois, contrairement à la précédente version 
du présent chapitre, qui n’abordait qu’un seul type d’appareil traitant des 
eaux usées synthétiques en mode couplé suivant une méthode relativement
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grossière d’épuisement des boues, le présent texte propose plusieurs varia ­
tions. Il présente plusieurs options concernant les types d’appareil, les 
modes de fonctionnement, les eaux usées et l’évacuation des boues épuisées. Il s’aligne étroitement sur la norme ISO 11733 (12), qui a été examinée très attentivement durant sa préparation, bien que la méthode n’ait pas fait 
l’objet d’un essai circulaire.
 
5. Pour d’autres objectifs, il est nécessaire de connaître la concentration de la 
substance d’essai dans l’effluent avec plus de précision, ce qui demande une 
méthode plus élaborée. Le débit des boues épuisées, par exemple, doit subir un contrôle plus précis durant chaque journée d’essai et sur toute la période de l’essai, et il faut faire tourner les unités à plusieurs débits de boues 
épuisées. Pour que l’étude soit plus complète, les essais doivent aussi être 
menés à deux ou trois températures différentes: le mode opératoire est exposé par Birch (13) (14) et résumé à l’appendice 6. Toutefois, les connais ­
sances actuelles ne permettent pas de décréter quels modèles cinétiques sont 
applicables à la biodégradation des produits chimiques lors du traitement des 
eaux usées et dans le milieu aquatique en général. La cinétique de Monod, donnée à titre d’exemple à l’appendice 6, est limitée aux substances dont la concentration atteint au moins 1 mg/l, mais de l’avis de certains, même sous 
cette condition, cela reste à démontrer. Des essais réalisés à des concen ­
trations plus proches de celles trouvées dans les eaux usées sont présentés à l’appendice 7, mais ces essais et ceux de l’appendice 6 ne figurent qu’en appendices et ne font pas l’objet de méthodes d’essai.
 
Lits 
6. Les modèles de lits percolateurs ont beaucoup moins retenu l’attention, sans 
doute parce qu’ils sont plus encombrants et moins compacts que les modèles 
de stations à boues activées. Gerike  et al.  ont mis au point des unités à lits 
percolateurs qu’ils ont fait fonctionner en mode couplé (15). Ces lits étaient relativement grands (hauteur 2 m; volume 60 l) et demandaient pas moins de 2 l/h d’eaux usées chacun. Baumann  et al.  (16) ont simulé des lits 
percolateurs en insérant dans des tubes de 1 m (14 mm de diamètre interne) 
des bandes de polyester «velues» préalablement plongées dans des boues activées concentrées pendant 30 minutes. La substance d’essai, qui consti ­
tuait la seule source de carbone dans une solution de sels minéraux, était 
introduite par le haut du tube vertical et la biodégradation était évaluée 
d’après les mesures du COD dans l’effluent et du CO
 2 dans les dégagements 
gazeux.  
7. Les filtres biologiques ont été simulés d’une autre manière (15): on a 
alimenté les surfaces internes de tubes rotatifs légèrement inclinés par rapport à l’horizontale d’eaux usées (environ 250 ml/h) avec et sans la 
substance d’essai, puis recueilli les effluents pour analyse du COD et/ou 
de la substance d’essai étudiée.
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
8. Cette méthode a été conçue pour déterminer l’élimination et la biodégrada ­
tion primaire et/ou finale de substances organiques solubles dans l’eau par des micro-organismes aérobies dans un système d’essai à fonctionnement continu et simulant l’action des boues activées. Un milieu organique faci ­
lement biodégradable et la substance d’essai organique forment la source de 
carbone et d’énergie des micro-organismes.
 
9. Deux unités d’essai à fonctionnement continu (stations à boues activées ou 
vases poreux) tournent en parallèle dans des conditions identiques choisies en fonction de la finalité de l’essai. Normalement, le temps de rétention hydraulique moyen est de 6 h et l’âge moyen des boues (temps de rétention 
des boues) est de 6 à 10 jours. Les boues sont épuisées par application de 
l’une des deux méthodes et la substance d’essai est habituellement ajoutée à une concentration comprise entre 10 et 20 mg/l de carbone organique dissous (COD) aux eaux à traiter (milieu organique) d’une seule des 
unités. La deuxième unité sert de témoin pour déterminer la biodégradation 
dans le milieu organique.
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10. Le COD, de préférence, ou la demande chimique en oxygène (DCO), ainsi 
que la concentration de la substance d’essai (si nécessaire), sont déterminés 
par une analyse spécifique conduite sur des échantillons d’effluents fréquemment prélevés de l’unité qui reçoit la substance d’essai. On suppose que la différence de concentration du COD ou de la DCO dans 
les effluents de l’unité d’essai et de l’unité témoin est due à la substance 
d’essai ou à ses métabolites organiques. On la compare ensuite à la concen ­
tration du COD ou de la DCO dans les eaux à traiter attribuable à la substance d’essai, afin de déterminer les quantités de substance d’essai 
éliminées.
 
11. On parvient normalement à distinguer la biodégradation de la bioadsorption 
en étudiant attentivement la courbe d’élimination en fonction du temps, et 
elle peut ordinairement être confirmée par un essai de biodégradabilité 
immédiate conduit à l’aide d’un inoculum acclimaté provenant de l’unité qui reçoit la substance d’essai.
 
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
12. Il est nécessaire de connaître la pureté, la solubilité dans l’eau, la volatilité 
et les caractéristiques d’adsorption de la substance d’essai pour être en 
mesure d’interpréter les résultats correctement. Les substances volatiles et insolubles ne peuvent normalement être testées sans précautions particulières (voir appendice 5). Il faudrait connaître également la formule chimique 
développée ou, au moins, empirique, pour calculer les valeurs théoriques 
et/ou vérifier les valeurs mesurées de paramètres tels que la demande théo ­
rique en oxygène (DthO), le carbone organique dissous (COD) et la demande chimique en oxygène (DCO).
 
13. Des données sur la toxicité de la substance d’essai à l’égard des 
micro-organismes (voir appendice 4) peuvent aussi être utiles à la sélection 
des concentrations d’essai appropriées, et essentielles pour l’interprétation 
correcte de faibles valeurs de biodégradation.  
NIVEAUX DE SEUIL  
14. Dans l’application initiale de cet essai de simulation (de confirmation) à la 
biodégradation primaire des tensioactifs, la mise sur le marché du tensioactif 
était subordonnée à un taux d’élimination supérieur à 80 pour cent. À défaut 
d’atteindre un taux de 80 pour cent, on peut mener cet essai de simulation (de confirmation) à l’issue duquel le tensioactif ne sera mis sur le marché que s’il est éliminé à plus de 90 pour cent. En général, avec les produits 
chimiques, la question d’un résultat d’essai positif ou négatif n’entre pas 
enjeu, et le pourcentage d’élimination obtenu peut servir à calculer en gros la concentration probable dans l’environnement à introduire dans l’évalua ­
tion des risques dus aux substances chimiques. Les résultats ont tendance à 
être de type tout ou rien. Le pourcentage d’élimination du COD atteint dans 
plusieurs études sur des substances chimiques pures était supérieur à 90 pour cent pour plus des trois quarts des produits chimiques présentant un degré de biodégradabilité significatif et supérieur à 80 pour cent pour plus de 90 
pour cent d’entre eux.
 
15. Relativement peu de substances chimiques, par exemple des tensioactifs, 
sont présentes dans les eaux usées aux concentrations (environ 10 mg 
C/l) appliquées dans cet essai. Certains produits chimiques peuvent être 
inhibiteurs à de telles concentrations, tandis que la cinétique d’élimination d’autres substances risque d’être différente aux faibles concentrations. Il est possible d’évaluer la dégradation avec plus de précision en recourant à des 
méthodes modifiées et en choisissant des concentrations de la substance 
d’essai réalistement faibles; les résultats obtenus pourraient servir à calculer les constantes cinétiques. Cependant, non seulement les techniques expéri ­
mentales ne sont pas encore entièrement validées, mais les modèles ciné ­
tiques, qui reproduisent les réactions de biodégradation, n’ont pas été établis 
(voir appendice 7).
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SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
16. Pour s’assurer que le mode opératoire est correctement suivi, il est quelque ­
fois utile de tester des substances dont le comportement est connu, parallè ­
lement aux substances d’essai étudiées. Il s’agit notamment de l’acide 
adipique, du 2-phénylphénol, du bnaphthol, de l’acide diphénique, de 
l’acide 1-naphthoïque, etc. (9) (10) (11).  
REPRODUCTIBILITÉ DES RÉSULTATS DES ESSAIS  
17. Il existe beaucoup moins de rapports d’essais de simulation que de rapports 
d’essais de biodégradabilité immédiate. La reproductibilité entre essais 
conduits simultanément est bonne (de 10 à 15 pour cent) pour des subs ­
tances d’essai dégradées à 80 pour cent ou plus, mais la variabilité augmente pour les substances moins bien dégradées. Certaines substances limites ont 
donné des résultats très disparates (par exemple 10 pour cent, 90 pour cent) 
à différentes reprises au cours des neuf semaines de l’essai.
 
18. Les résultats obtenus à l’aide des deux types d’appareils ne différaient guère, 
mais certaines substances ont subi une dégradation plus poussée et plus constante avec les eaux usées domestiques qu’avec les eaux usées synthé ­
tiques reconstituées selon la formule de l’OCDE.
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D’ESSAI  
Appareils  
Système d’essai  
19. Le système d’essai d’une seule substance comprend une unité d’essai et une 
unité témoin, mais les analyses spécifiques (biodégradation primaire) ne 
demandent qu’une unité d’essai. Une unité témoin peut servir à plusieurs 
unités d’essai recevant des substances d’essai identiques ou différentes. En cas de couplage (appendice 3), chaque unité d’essai doit avoir sa propre unité témoin. Le système d’essai peut consister en un modèle de station à 
boues activées: unité d’Husmann (appendice 1, figure 1) ou vase poreux 
(appendice 1, figure 2). Dans les deux cas, il faut employer des récipients de stockage de capacité suffisante pour accueillir les eaux à traiter et les effluents ainsi que des pompes pour doser les eaux à traiter, mélangés ou 
non à la solution contenant la substance d’essai.
 
20. Chaque unité à boues activées se compose d’un récipient d’aération d’une 
capacité connue de quelque trois litres de boues activées et d’un décanteur 
secondaire qui contient environ un litre et demi; il est possible de modifier les volumes dans une certaine mesure en ajustant la hauteur du décanteur. L’utilisation de récipients de dimensions différentes est permise à condition 
de leur faire supporter des charges hydrauliques comparables. S’il n’y a pas 
moyen de maintenir la température de l’enceinte d’essai dans la gamme souhaitée, on recommande d’employer des récipients à chemise d’eau ther ­
mostatée. Les boues activées du décanteur sont ramenées dans le récipient 
d’aération, en continu ou à intervalles réguliers, à l’aide d’un émulseur à air 
ou d’une pompe doseuse, pour y être recyclée.
 
21. Le système du vase poreux consiste en un cylindre poreux à fond conique 
placé à l’intérieur d’un récipient légèrement plus grand de la même forme, mais fabriqué en matière plastique imperméable. Le matériau qui convient au cylindre poreux est du polyéthylène de 2 mm d’épaisseur dont les pores 
n’excèdent pas 90 μm. La séparation des boues et du milieu organique traité 
est opérée par un passage différentiel à travers la paroi poreuse. Les effluents se déversent dans l’espace annulaire d’où ils débordent dans le récipient collecteur. Aucune décantation n’a lieu, si bien qu’il n’y a pas de 
retour de boues. L’ensemble du système peut être monté dans un bain-marie 
thermostaté. Les vases poreux s’obstruent et risquent de déborder au début.
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Si cela se produit, il faut remplacer le revêtement poreux interne par un 
revêtement propre en commençant par siphonner les boues du vase dans un 
seau propre avant d’enlever le revêtement obstrué. Après avoir essuyé le cylindre imperméable extérieur, on place un revêtement propre et on remet la boue dans le vase. Si des boues adhèrent sur les côtés du revêtement 
obstrué, celles-ci doivent être soigneusement grattées et transférées. Le 
nettoyage des vases obstrués s’effectue d’abord à l’aide d’un mince jet d’eau pour enlever les boues restantes, ensuite par trempage dans une solu ­
tion diluée d’hypochlorite de sodium, puis dans l’eau, et s’achève par un 
rinçage complet à l’eau.
 
22. Il convient d’appliquer des techniques appropriées à l’aération des boues 
dans les récipients d’aération des deux systèmes, par exemple des cubes 
frittés (pierres diffuseuses) et de l’air comprimé. Si nécessaire, l’air sera épuré par passage à travers un filtre convenable, et lavé. Une quantité d’air suffisante doit être insufflée dans le système pour maintenir l’aérobiose 
et conserver les boues à l’état de floc pendant toute la durée de l’essai.
 
Appareil de filtration ou centrifugeuse  
23. Les échantillons seront filtrés à travers une membrane possédant une poro ­
sité adéquate (diamètre d’ouverture nominal de 0,45 μm) qui adsorbe les 
substances organiques solubles et libère le moins possible de carbone orga ­
nique. Si les lits utilisés libèrent du carbone organique, il faut les laver soigneusement à l’eau chaude afin d’évacuer le carbone organique lixivia ­
ble. Une centrifugeuse tournant à 40 000 m/s
 2 peut remplacer l’appareil de 
filtration.  
Matériel d’analyse  
24. Appareils permettant de déterminer:  
— le COD (carbone organique dissous) et le COT (carbone organique 
total), ou la DCO (demande chimique en oxygène),  
— la substance donnée, s’il y a lieu,  
— les solides en suspension, le pH, la concentration d’oxygène dans l’eau,  
— la température, l’acidité, l’alcalinité,  
— l’ammonium, les nitrites et les nitrates, si l’essai est réalisé dans des 
conditions nitrifiantes.  
Eau 
25. Eau du robinet renfermant moins de 3 mg/l de COD. Mesurer l’alcalinité si 
elle est inconnue.  
26. Eau désionisée contenant moins de 2 mg/l de COD.  
Milieu organique  
27. Les eaux usées synthétiques, les eaux usées domestiques ou un mélange des 
deux sont acceptés comme milieu organique. Il a été démontré (11) (14) que 
les eaux usées domestiques employées seules augmentaient souvent le pour ­
centage d’élimination du COD et entraînaient même l’élimination et la biodégradation de certaines substances chimiques non biodégradées par les 
eaux usées synthétiques formulées selon l’OCDE. En outre, l’addition 
constante ou intermittente d’eaux usées domestiques stabilise souvent les boues activées, y compris sa capacité à décanter convenablement, laquelle est déterminante. Aussi préconise-t-on l’utilisation d’eaux usées domes ­
tiques. On mesure la concentration du COD ou de la DCO. L’acidité ou 
l’alcalinité du milieu organique doivent être connues. Il peut être nécessaire de tamponner le milieu organique par un composé approprié (hydrogéno ­
carbonate de sodium ou dihydrogénophosphate de potassium) s’il est faible ­
ment acide ou alcalin, pour maintenir le pH à environ 7,5 ± 0,5 dans le 
récipient d’aération durant l’essai. La quantité de tampon à ajouter et le moment de cette addition seront décidés au cas par cas. Lorsqu’on utilise des mélanges de façon continue ou intermittente, le COD (ou la DCO) de 
ces mélanges doivent être maintenus à une valeur à peu près constante, par 
exemple par dilution dans l’eau.
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Eaux usées synthétiques  
28. Dans chaque litre d’eau du robinet, dissoudre 160 mg de peptone, 110 mg 
d’extrait de viande, 30 mg d’urée, 28 mg d’hydrogénophosphate de potas ­
sium anhydre (K  2 HPO  4 ), 7 mg de chlorure de sodium (NaCl), 4 mg de 
chlorure de calcium dihydraté (CaCl  2 .2H  2 O) et 2 mg de sulfate de magné ­
sium heptahydraté (Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Cette eau usée synthétique formulée 
selon l’OCDE offre un exemple où la concentration moyenne de COD dans les eaux à traiter atteint quelque 100 mg/l. Utiliser en alternance 
d’autres compositions donnant à peu près la même concentration de COD, 
plus proches des eaux usées domestiques. Si les eaux à traiter doivent être moins concentrées, diluer les eaux usées synthétiques, à 1/1 par exemple, 
dans de l’eau du robinet afin d’obtenir une concentration d’environ 50 mg/l. 
Ces eaux à traiter «allégées» favoriseront la croissance des organismes nitrifiants; cette modification devra être mise à profit au cas où s’avère nécessaire l’étude de la simulation de stations d’épuration des eaux usées 
en régime nitrifiant. Ces eaux usées synthétiques, à base d’eau distillée, 
peuvent être confectionnées sous une forme concentrée et stockées à environ 1 °C pendant une semaine au maximum. Selon les besoins, diluer avec de l’eau du robinet (ce milieu n’est pas satisfaisant, notamment parce 
qu’il présente une concentration en azote très élevée et une teneur en 
carbone relativement faible, mais rien de mieux n’a été suggéré, en dehors d’un apport supplémentaire de tampon phosphate et de peptone).
 
Eaux usées domestiques  
29. Utiliser des eaux usées qui viennent d’être décantées, recueillies quotidien ­
nement dans une station d’épuration qui reçoit principalement des eaux 
usées domestiques. Elles doivent être prélevées avant la sédimentation 
primaire, au niveau du déversoir de la cuve de sédimentation primaire ou dans les eaux brutes de la station de traitement par boues activées. Les eaux 
usées peuvent être utilisées après plusieurs jours de stockage (généralement 
pas plus de sept) à environ 4 °C, s’il est prouvé que le COD (ou la DCO) n’ont pas diminué de manière significative (c’est-à-dire de moins de 20 pour cent) durant le stockage. Afin de limiter la perturbation du système, il 
conviendrait d’ajuster le COD (ou la DCO) de chaque nouveau lot avant 
son utilisation à une valeur constante adéquate, par exemple en le diluant avec de l’eau du robinet.
 
Boues activées  
30. Prélever les boues activées destinées à l’inoculation dans la cuve d’aération 
d’une station d’épuration des eaux usées correctement exploitée ou d’une 
unité à boues activées conçue à l’échelle expérimentale traitant principale ­
ment des eaux usées domestiques.  
Solutions mères de la substance d’essai  
31. Pour les substances présentant une solubilité convenable, préparer des solu ­
tions mères aux concentrations appropriées (par exemple, 1 à 5 g/l) dans de 
l’eau désionisée, ou dans la fraction minérale de l’eau usée synthétique. En 
ce qui concerne les substances insolubles et volatiles, se reporter à l’appen ­
dice 5. Déterminer le COD et le carbone organique total (COT) de la solution mère et répéter les mesures à chaque nouveau lot. Si la différence 
entre le COD et le COT excède 20 pour cent, il faut vérifier l’hydrosolu ­
bilité de la substance d’essai. Comparer le COD ou la concentration de la substance d’essai mesurée par une analyse spécifique de la solution mère à la valeur nominale, pour s’assurer que la récupération est suffisante (elle 
doit normalement dépasser 90 pour cent). Vérifier, en particulier pour les 
dispersions, si le COD peut être utilisé comme paramètre d’analyse ou si seule une technique d’analyse spécifique de la substance d’essai est appli ­
cable. Les dispersions imposent la centrifugation des échantillons. Pour 
chaque nouveau lot, mesurer le COD, la DCO, ou la substance d’essai 
par une analyse spécifique.
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32. Déterminer le pH de la solution mère. Les valeurs extrêmes indiquent que 
l’addition de la substance est susceptible d’influencer le pH des boues 
activées dans le système d’essai. Dans ce cas, il faut neutraliser la solution mère à pH 7 ± 0,5 avec de faibles quantités d’un acide ou d’une base inorganiques, tout en évitant la précipitation de la substance d’essai.
 
MODE OPÉRATOIRE  
33. Le mode opératoire est décrit pour les unités à boues activées; pour le 
système du vase poreux, il doit être légèrement adapté.  
Préparation de l’inoculum  
34. Au début de l’essai, inoculer le système d’essai avec des boues activées ou 
un inoculum contenant une faible concentration de micro-organismes. L’ino ­
culum est conservé dans un endroit aéré à température ambiante avant d’être utilisé dans les 24 heures. Dans le premier cas, on prélève un échantillon de 
boues activées de la cuve d’aération d’une station d’épuration biologique 
des eaux usées exploitée avec efficacité ou d’une installation de traitement de laboratoire qui soit essentiellement alimentée par des eaux usées domes ­
tiques. S’il y a lieu de simuler des conditions nitrifiantes, collecter les boues 
d’une station de traitement des eaux usées en régime nitrifiant. Déterminer 
la concentration des solides en suspension et, si nécessaire, concentrer les boues par décantation pour que le volume ajouté au système d’essai soit minimal. Vérifier que la teneur en matière sèche de départ tourne autour de 
2,5 g/l.
 
35. Dans le deuxième cas, 2 ml/l à 10 ml/l d’un effluent d’une station d’épu ­
ration biologique des eaux usées constitueront l’inoculum. Afin de réunir 
autant d’espèces bactériennes que possible, il peut être utile d’ajouter des inoculums de diverses autres sources, par exemple les eaux de surface. Dans ces conditions, les boues activées vont se former et se développer dans le 
système d’essai.
 
Dosage du milieu organique  
36. Nettoyer méticuleusement les récipients destinés à recevoir les eaux à traiter 
et les effluents ainsi que les tuyaux reliant ces deux récipients, afin de 
prévenir toute prolifération de micro-organismes, au début de l’essai et 
tout au long de celui-ci. Assembler les systèmes d’essai dans une pièce thermostatée (normalement entre 20 et 25 °C) ou utiliser des unités d’essai à chemise d’eau. Préparer un volume suffisant du milieu organique 
requis (paragraphes 27-29). Commencer par remplir le récipient d’aération et 
le décanteur avant d’introduire l’inoculum (paragraphes 34, 35). Actionner le dispositif d’aération de telle sorte que les boues soient maintenues en suspension et en aérobiose, et entamer le dosage des eaux à traiter et le 
recyclage des boues décantées. Doser le milieu organique des récipients de 
stockage et introduire ce dernier dans les récipients d’aération (paragraphes 20, 21) des unités d’essai et témoin et recueillir leurs effluents respectifs dans des récipients de stockage similaires. Le temps de rétention hydrau ­
lique normal de 6 heures sera assuré par un pompage du milieu organique à 
raison de 0,5 l/h. Pour confirmer ce débit, mesurer la quantité quotidienne de milieu organique dosé en enregistrant la diminution de volume du milieu dans les récipients de stockage. Il faudrait faire appel à d’autres méthodes de 
dosage pour déterminer les effets du déversement intermittent et du traite ­
ment de «choc» par des produits chimiques.
 
37. Si le milieu organique est préparé en vue d’une utilisation dont la durée 
dépasse un jour, il y a lieu de le réfrigérer à environ 4 °C ou de le conserver par une autre méthode adéquate, afin de prévenir la croissance des micro-organismes et la biodégradation en dehors des unités d’essai (para ­
graphe 29). Si l’on emploie une eau usée synthétique, il est possible de 
préparer et d’entreposer à environ 4 °C une solution mère concentrée (par exemple dix fois la concentration normale, voir paragraphe 28). Cette solu ­
tion mère peut être convenablement mélangée à un volume adéquat d’eau du 
robinet avant usage, ou être pompée directement, tandis que le volume 
adéquat d’eau du robinet est pompé séparément.
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Dosage de la substance d’essai  
38. Un volume approprié de la solution mère de la substance d’essai (para ­
graphe 31) est introduit dans le récipient de stockage des eaux à traiter ou dosé directement, à l’aide d’une autre pompe, dans le récipient d’aéra ­
tion. La concentration d’essai moyenne normale dans les eaux à traiter doit 
se situer entre 10 mg/l et 20 mg/l de COD, et la concentration maximale à 50 mg/l. Si l’hydrosolubilité de la substance d’essai est faible ou si des effets toxiques risquent de se produire, abaisser la concentration à 5 mg/l de 
COD ou même moins, mais seulement si une méthode d’analyse spécifique 
est applicable (les substances d’essai dispersées peu solubles dans l’eau peuvent être ajoutées par le biais de techniques de dosage spéciales, voir 
appendice 5).
 
39. Une fois que le système est stabilisé et élimine le COD du milieu organique 
avec efficacité (environ 80 pour cent), commencer à ajouter la substance 
d’essai. Il est important de vérifier que toutes les unités travaillent avec le même rendement avant d’ajouter la substance d’essai; si ce n’est pas le cas, il est souvent utile de mélanger les différentes boues et de redistribuer des 
volumes égaux aux unités. Lorsqu’on utilise un inoculum de quelque 2,5 g/l 
(poids sec) de boues activées, la substance d’essai peut être ajoutée dès le début de l’essai, car l’addition directe de quantités croissantes dès le départ offre l’avantage de pouvoir rendre les boues activées mieux adaptables à la 
substance d’essai. Quelles que soient les modalités de l’adjonction de la 
substance d’essai, il est recommandé de mesurer les débits et/ou les volumes correspondants dans le(s) récipient(s) de stockage à intervalles réguliers.
 
Manipulation des boues activées  
40. La concentration des solides des boues activées se stabilise normalement 
durant l’essai, quel que soit l’inoculum utilisé, entre 1 et 3 g/l (poids sec) 
suivant la qualité et la concentration du milieu organique, les conditions 
expérimentales, la nature des micro-organismes présents et l’influence de la substance d’essai.
 
41. Déterminer les solides en suspension dans les récipients d’aération au moins 
une fois par semaine en jetant les boues excédentaires, afin de maintenir la concentration entre 1 g/l et 3 g/l (poids sec), ou veiller à la constance de 
l’âge moyen des boues, qui doit généralement se situer entre 6 et 10 jours. 
Si l’on choisit, par exemple, un temps de rétention des boues de 8 jours, on enlèvera chaque jour 1/8 du volume des boues activées dans le récipient d’aération et on le jettera. Effectuer cette opération quotidiennement ou, de 
préférence, utiliser une pompe automatique intermittente. Le maintien de la 
concentration des solides en suspension à une valeur constante ou entre des limites étroites ne fige pas le temps de rétention des boues, qui est la 
variable permettant de déterminer la concentration de la substance d’essai 
dans l’effluent.
 
42. Tout au long de l’essai, ôter au moins une fois par jour la boue qui adhère 
aux parois du récipient d’aération et du décanteur et remettre cette dernière en suspension. Inspecter et nettoyer régulièrement tous les tuyaux afin de prévenir la croissance d’un biofilm. Recycler les boues décantées du décan ­
teur en la renvoyant dans le récipient d’aération, de préférence par pompage 
intermittent. Le système des vases poreux ne comporte pas de recyclage, mais il faut veiller à placer des cylindres internes propres avant que le volume n’atteigne une croissance significative dans le récipient (paragraphe 
21).
 
43. Une mauvaise décantation et des pertes de boues peuvent se produire dans 
les unités d’Husmann. On peut y remédier en effectuant en parallèle dans les unités d’essai et les unités témoin une ou plusieurs des opérations énumérées ci-dessous:
 
— ajouter des boues fraîches ou un floculant (2 ml par récipient d’une 
solution de FeCl  3 à 50 g/l, par exemple) à intervalles réguliers, par 
exemple hebdomadaires, en s’assurant que le FeCl  3 ne réagit pas avec 
la substance d’essai et ne la fasse pas précipiter,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 927
 
— remplacer l’émulseur à air par une pompe péristaltique, afin d’instaurer 
un flux de recirculation des boues à peu près égal au débit entrant à 
appliquer et de permettre la formation d’une zone anaérobie dans les boues décantées (la géométrie du dispositif airlift limite le débit minimum du retour des boues à environ douze fois celui des eaux à 
traiter),
 
— pomper les boues, par intermittence, du décanteur vers le récipient 
d’aération (par exemple pendant 5 minutes toutes les 2,5 heures afin de recycler 1 à 1,5 l/h,
 
— utiliser un agent antimousse non toxique à une concentration mini ­
male pour empêcher les pertes dues à la formation de mousse (de l’huile de silicone, par exemple),
 
— insuffler de l’air à travers les boues dans le décanteur par puissantes 
saccades (par exemple pendant 10 secondes toutes les heures),  
— doser le milieu organique par intervalles dans le récipient d’aération 
(par exemple pendant 3 à 10 minutes toutes les heures).  
Échantillonnage et analyse  
44. À intervalles réguliers, mesurer la concentration d’oxygène dissous, la 
température et le pH des boues activées dans les récipients d’aération. 
Faire en sorte qu’il y ait toujours suffisamment d’oxygène disponible (> 2 
mg/l) et que la température demeure dans la gamme requise (normalement de 20 °C à 25 °C). Maintenir le pH à 7,5 ± 0,5 en dosant de petites quantités d’une base ou d’un acide inorganiques que l’on introduit dans le 
récipient d’aération ou dans les eaux à traiter, ou en augmentant le pouvoir 
tampon du milieu organique (voir paragraphe 27). Si une nitrification a lieu, elle génère de l’acide, l’oxydation de 1 mg d’azote produisant l’équivalent de quelque 7 mg de CO
 3 . La fréquence des mesures dépend du paramètre à 
mesurer et de la stabilité du système, et peut varier entre une cadence 
journalière et hebdomadaire.  
45. Déterminer le COD ou la DCO dans les eaux à traiter des récipients d’essai 
et témoins. Mesurer la concentration de la substance d’essai dans les eaux 
brutes par une analyse spécifique ou estimer cette variable d’après la 
concentration dans la solution mère (paragraphe 31), le volume utilisé et la quantité d’eaux usées dosées dans l’unité d’essai. Il est recommandé de calculer la concentration de la substance d’essai afin de réduire la variabilité 
des données relatives à la concentration.
 
46. Prélever des échantillons appropriés dans l’effluent recueilli (par exemple 
des échantillons composites sur 24 heures) qui seront filtrés à travers une membrane à pores de 0,45 μm ou centrifugés à environ 40 000 m/s
 2 pendant 
près d’un quart d’heure. Il convient de recourir à la centrifugation si la 
filtration pose des difficultés. Déterminer le COD ou la DCO au moins deux fois, afin de mesurer par une analyse spécifique de la substance d’essai la biodégradation finale et, selon les besoins, la biodégradation 
primaire.
 
47. L’utilisation de la DCO peut donner lieu à des problèmes analytiques aux 
faibles concentrations et n’est donc recommandée que si la concentration d’essai est suffisante (environ 30 mg/l). S’agissant de substances très adsor ­
bantes, on préconise de mesurer la quantité de substance adsorbée dans les 
boues par une technique d’analyse spécifique de la substance d’essai.
 
48. La fréquence de l'échantillonnage dépend de la durée supposée de l'essai. 
Un rythme de trois fois par semaine est recommandé. Une fois que les 
unités fonctionnent de manière efficace, on leur laisse une période d'adap ­
tation de une à six semaines maximum après l'introduction de la substance d'essai, afin de leur permettre d'atteindre un état stationnaire. Il faut, de préférence, obtenir au moins 15 valeurs valables pendant la phase plateau 
(paragraphe 59), qui dure normalement trois semaines, pour évaluer le 
résultat de l’essai. L’essai peut s’arrêter là si l’on a atteint un degré d’éli ­
mination suffisant (par exemple supérieur à 90 pour cent) et si l’on possède ces 15 valeurs issues d’analyses conduites chaque jour de semaine pendant 
trois semaines. L’essai ne doit normalement pas se prolonger au-delà de 12 
semaines après l’addition de la substance d’essai.
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49. Si les boues sont nitrifiantes et que les effets de la substance d’essai sur la 
nitrification sont à étudier, analyser des échantillons prélevés dans les 
effluents de l’unité d’essai et de l’unité témoin, au moins une fois par semaine pour l’ammonium et/ou les nitrites et nitrates.
 
50. Toutes les analyses doivent être exécutées le plus vite possible, en particu ­
lier celles qui portent sur l’azote. Au cas où les analyses doivent être 
différées, conserver les échantillons à environ 4 °C à l’obscurité dans des bouteilles pleines et bouchées hermétiquement. S’il y a lieu de stocker les échantillons pendant plus de 48 heures, on les conservera par congélation, 
acidification (par exemple 10 ml/l d’une solution d’acide sulfurique à 400 
g/l) ou par adjonction d’un toxique approprié [par exemple 20 ml/l d’une solution de chlorure de mercure (II) à 10 g/l]. S’assurer que la technique de conservation n’influence pas les résultats de l’analyse.
 
Couplage des unités d’essai  
51. Si l’on effectue un couplage (appendice 3), échanger quotidiennement la 
même quantité de boues activées (de 150 ml à 1 500 ml pour les récipients d’aération contenant trois litres de liquide) entre les récipients d’aération de l’unité d’essai et de l’unité témoin. Si la substance d’essai s’adsorbe forte ­
ment sur les boues, n’échanger que le surnageant des décanteurs. Introduire 
dans les deux cas un facteur de correction dans le calcul des résultats de l’essai (paragraphe 55).
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
52. Calculer le pourcentage d’élimination de la substance d’essai en termes de 
COD ou de DCO pour chaque évaluation programmée dans le temps à l’aide de l’équation suivante:
 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
où 
D t = pourcentage d’élimination du COD ou de la DCO à l’instant t;  
C s = COD ou DCO dans les eaux à traiter, induits par la substance d’essai, 
estimés de préférence à partir de la solution mère (mg/l);  
E = valeur mesurée du COD ou de la DCO dans les effluents d’essai à 
l’instant t (mg/l);  
E o = valeur mesurée du COD ou de la DCO dans les effluents témoins à 
l’instant t (mg/l).  
53. Le degré d’élimination du COD ou de la DCO du milieu organique de 
l’unité témoin est utile pour évaluer l’activité de biodégradation des boues activées pendant l’essai. Calculer le pourcentage d’élimination selon l’équa ­
tion suivante:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
où 
D B = pourcentage d’élimination du COD ou de la DCO du milieu orga ­
nique de l’unité témoin à l’instant t;  
C M = COD ou DCO du milieu organique des eaux brutes témoins (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 929
 
Calculer, facultativement, le pourcentage d’élimination du COD ou de la 
DCO engendrés par le milieu organique et la substance d’essai dans l’unité 
d’essai, à partir de l’équation suivante:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
où 
D T = pourcentage d’élimination du COD ou de la DCO dans la totalité 
des eaux brutes d’essai;  
C T = COD ou DCO de la totalité des eaux brutes d’essai ou calculés à 
partir des solutions mères (mg/l).  
54. Calculer l’élimination de la substance d’essai si elle a été mesurée par une 
méthode d’analyse spécifique à chaque instant d’évaluation, selon l’équation suivante:
 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
où 
D ST = pourcentage d’élimination primaire de la substance d’essai à l’ins ­
tant t;  
S i = concentration mesurée ou estimée de la substance d’essai dans les 
eaux brutes d’essai (mg/l);  
S e = concentration mesurée de la substance d’essai dans les eaux brutes 
d’essai à l’instant t (mg/l).  
55. En mode couplé, compenser la dilution de la substance d’essai dans le 
récipient d’aération, occasionnée par l’échange de boues, par un facteur 
de correction (voir appendice 3). Si on a appliqué un temps de rétention 
hydraulique moyen de six heures et échangé la moitié du volume de boues activées contenu dans le récipient d’aération, il faut corriger les valeurs déterminées de l’élimination quotidienne (D
 t , paragraphe 52) afin d’obtenir 
le degré réel d’élimination, D  tc , de la substance d’essai, à partir de l’équa ­
tion suivante:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Expression des résultats de l’essai  
56. Tracer une courbe des pourcentages d’élimination D  t (ou D  tc ) et D  ST , le cas 
échéant, en fonction du temps (voir appendice 2). Certaines conclusions 
peuvent être tirées de l’allure de la courbe d’élimination de la substance 
d’essai (proprement dite ou à travers le COD) sur le processus d’élimination.  
Adsorption  
57. Si l’on observe une élimination élevée de la substance d’essai en termes de 
COD dès le début de l’essai, cette substance est probablement évacuée par 
adsorption sur les solides des boues activées. Il est possible de prouver ce phénomène en mesurant la substance d’essai adsorbée au moyen d’une analyse spécifique. Il est rare que l’élimination du COD de substances 
adsorbables demeure élevée tout au long de l’essai; normalement, le degré 
d’élimination est élevé au départ puis décline progressivement jusqu’à une valeur d’équilibre. Si toutefois la substance d’essai était de nature à accli ­
mater la population de micro-organismes d’une façon ou d’une autre, l’éli ­
mination du COD de la substance d’essai augmenterait pour atteindre une 
valeur plateau élevée.
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Phase de latence  
58. Beaucoup de substances d’essai, comme cela se produit dans les essais de 
sélection statiques, traversent une phase de latence avant que la biodégra ­
dation n’opère à plein régime. Durant la phase de latence, les bactéries qui 
dégradent s’acclimatent ou s’adaptent et n’éliminent presque pas la subs ­
tance d’essai, ensuite elles commencent à croître. Cette phase s’achève et la phase de dégradation est censée débuter lorsque environ 10 pour cent de la quantité initiale de la substance d’essai est éliminée (y compris par adsorp ­
tion, le cas échéant). La phase de latence est souvent très variable et peu 
reproductible.
 
Phase plateau  
59. Le plateau de la courbe d’élimination d’un essai conduit en continu est 
défini comme la phase au cours de laquelle la dégradation est maximale. 
La phase plateau doit durer au moins trois semaines et être déterminée par une quinzaine de valeurs mesurées valables.
 
Degré moyen d’élimination de la substance d’essai  
60. Calculer la moyenne des valeurs d’élimination (D  t ) de la substance d’essai 
durant la phase plateau. Arrondie au nombre entier le plus proche (1 %), elle représente le degré d’élimination de la substance d’essai. On recommande également de calculer l’intervalle de confiance à 95 % de la valeur 
moyenne.
 
Élimination du milieu organique  
61. Porter sur un graphique le pourcentage d’élimination du COD ou de la DCO 
du milieu organique dans l’unité témoin (D  B ) en fonction du temps. Indiquer 
le degré d’élimination moyen comme pour la substance d’essai (paragraphe 
60). 
Indication de la biodégradation  
62. Si la substance d’essai n’est pas adsorbée de façon significative sur les 
boues activées et que la courbe d’élimination présente le profil typique 
d’une courbe de biodégradation avec phase de latence, dégradation et plateau (paragraphes 58, 59), l’élimination mesurée est attribuable à coup sûr à la biodégradation. Si l’élimination est élevée au début, l’essai de 
simulation ne permet pas de faire la distinction entre les processus d’élimi ­
nation biologiques et non biologiques. Dans ces cas-là, comme dans d’autres où la biodégradation suscite des doutes, (par exemple si on observe une séparation), analyser les substances d’essai adsorbées ou effectuer des essais 
de biodégradation statiques supplémentaires fondés sur des paramètres qui 
attestent clairement des processus biologiques. Il s’agit d’essais basés sur la consommation d’oxygène [chapitres C.4-D, E et F de la présente annexe (6)] ou sur la mesure de la production de dioxyde de carbone [chapitre C.4-C de 
la présente annexe (6)] ou de l’essai au CO
 2 dans l’espace de tête de l’ISO 
(18), à conduire sur un inoculum préexposé provenant de l’essai de simu ­
lation. Si l’élimination du COD et de la substance proprement dite ont été mesurées, des différences significatives (le premier étant inférieur à la 
seconde) entre les pourcentages indiquent que les effluents renferment des 
produits organiques intermédiaires susceptibles d’être plus difficiles à dégrader que la substance parente.
 
Validité des résultats de l’essai  
63. L’obtention d’informations sur l’activité de biodégradation normale de l’ino ­
culum est subordonnée à la détermination du degré d’élimination du milieu organique (paragraphe 53) dans l’unité témoin. L’essai est considéré comme valable si le degré d’élimination du COD ou de la DCO dans la ou les 
unités témoins est supérieur à 80 pour cent après deux semaines et qu’aucun 
phénomène inhabituel n’a été observé.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 931
 
64. Si on a utilisé une substance de référence immédiatement biodégradable, 
le degré de biodégradation (D  t , paragraphe 52) doit être supérieur à 90 pour 
cent.  
65. Si l’essai est mené dans des conditions nitrifiantes, la concentration 
moyenne dans les effluents doit être < 1 mg/l d’azote ammoniacal et < 2 
mg/l d’azote sous forme de nitrites.  
66. Faute de remplir ces critères (paragraphes 63-65), recommencer l’essai en 
prélevant l’inoculum à une source différente, mettre une substance de réfé ­
rence à l’essai et réexaminer tout le mode opératoire.  
Rapport d’essai  
67. Le rapport d’essai doit inclure les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— nature chimique,  
— état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques.  
Conditions d’essai:  
— type de système d’essai; toute modification imposée par l’essai de subs ­
tances insolubles et volatiles,  
— type de milieu organique,  
— proportion et nature des effluents industriels dans les eaux usées, s’ils 
sont connus,  
— inoculum, nature et site(s) de prélèvement, concentration et prétraitement 
éventuel,  
— solution mère de la substance d’essai: teneur en COD et en COT; mode 
de préparation, s’il s’agit d’une suspension; concentration d’essai appli ­
quée; justifier pourquoi, le cas échéant, on s’écarte de l’intervalle 10 à 20 mg/l de COD; méthode d’addition; date de la première addition; toute modification,
 
— âge moyen des boues et temps de rétention hydraulique moyen; méthode 
d’épuisement des boues; méthodes pour vaincre le foisonnement, pertes de boue, etc.,
 
— techniques d’analyse employées,  
— température d’essai,  
— qualités du foisonnement des boues, indice des boues, matières en 
suspension de la liqueur mixte,  
— tout écart du mode opératoire normal et toute circonstance susceptibles 
d’avoir affecté les résultats.  
Résultats de l’essai:  
— toutes les données mesurées (COD, DCO, analyses spécifiques, pH, 
température, concentration d’oxygène, solides en suspension, substances azotées, le cas échéant),
 
— toutes les valeurs calculées de D  t (ou D  tc ), D  B , D  St présentées sous 
forme de tableau et de courbes d’élimination,  
— informations sur les phases de latence et de plateau, durée de l’essai, 
degré d’élimination de la substance d’essai et du milieu organique dans l’unité témoin, données statistiques, conclusions sur la biodégradabilité et validité de l’essai,
 
— examen des résultats.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 932
 
BIBLIOGRAPHIE:  
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(5) Eckenfelder, W.W. (19) US EPA.  
(6) Chapitre C.4 de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité 
«facile».  
(7) Chapitre C.12 de la présente annexe, Biodégradation – Test S.C.A.S. modi ­
fié. 
(8) Chapitre C.19 de la présente annexe, Estimation du coefficient d’adsorption 
(K OC ) sur le sol et les boues d’épuration par chromatographie liquide haute 
performance (HPLC).  
(9) Gerike P. and Fischer W.K. (1979). A correlation study of biodegradability 
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biodégradabilité des composés organiques en milieu aqueux – Essai de 
simulation des boues activées.  
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Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
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(15) Gerike P., Fischer W.K. and Holtmann W. (1980). Biodegradability deter ­
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(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91- 98 ISBN 011 751661 9.
 
(18) ISO 14593 (1998). Qualité de l’eau – Évaluation en milieu aqueux de la 
biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques – Méthode par 
analyse du carbone inorganique dans des récipients hermétiquement clos 
(Essai au CO  2 dans l’espace de tête).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 933
 
Appendice 1  
Figure 1  
Matériel utilisé pour évaluer la biodégradabilité  
Unité d’Husmann
  
A. Récipient de stockage  
B. Pompe doseuse  
C. Récipient d’aération (3 litres)  
D. Décanteur  E. Émulseur à air  
F. Collecteur  
G. Cuve d’aération  
H. Débitmètre d’air  
Figure 2  
Matériel utilisé pour évaluer la biodégradabilité  
Vase poreux
  
A. Récipient de stockage  
B. Pompe doseuse  
C. Vase d’aération poreux  
D. Enveloppe imperméable  E. Collecteur  
F. Diffuseur  
G. Débitmètre d’air  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 934
 
Figure 3  
Agrandissement du vase d’aération poreux de 3 litres
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 935
 
Appendice 2  
Exemple d’une courbe d’élimination
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 936
 
Appendice 3  
COMPLÉMENT D’INFORMATION  
COUPLAGE DES UNITÉS D’ESSAI  
Pour tenter d’égaliser les populations de micro-organismes dans les boues de 
l’unité d’essai, qui reçoit les eaux usées et une substance d’essai, et de l’unité 
témoin, qui ne reçoit que les eaux usées, on a instauré un échange de boue quotidien entre ces deux unités (1). Ce procédé dit «de couplage» a donné lieu à la méthode des unités couplées. Le couplage, réalisé au départ sur des 
unités à boues activées de Husmann, a aussi été appliqué à des unités à vase 
poreux (2) (3). Les résultats obtenus avec les unités couplées et non couplées, qu’il s’agisse des unités d’Husmann ou des unités à vase poreux, ne donnent lieu à aucune différence significative, si bien qu’il n’y a aucun avantage à investir 
plus de temps et d’énergie dans le couplage.
 
Les échanges de boue peuvent laisser croire à une élimination assez considérable, 
puisqu’une partie de la substance d’essai est transférée et que l’écart entre la concentration de la substance d’essai dans les effluents d’essai et dans les 
effluents témoins se comble. Il faut donc appliquer des facteurs de correction 
qui dépendent de la fraction échangée et du temps de rétention hydraulique moyen. Une méthode de calcul plus détaillée a été publiée (1).
 
Calculer le degré d’élimination corrigé du COD ou de la DCO selon la formule 
générale suivante:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
où 
D tc = pourcentage d’élimination corrigé du COD ou de la DCO;  
D t = pourcentage d’élimination déterminé du COD ou de la DCO;  
a = fraction volumique échangée entre les unités à boues activées;  
r = temps de rétention hydraulique moyen (h)  
Si, par exemple, la moitié du volume du récipient d’aération est échangée (a = 
0,5) et que le temps de rétention hydraulique moyen est de 6 h, la formule de 
correction devient:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
BIBLIOGRAPHIE:  
(1) Fischer W., Gerike P., Holtmann W. (1975). Biodegradability Determinations 
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Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.  
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Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. 
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(3) Painter H.A., King E.F. (1978). Water Research Centre Porous Pot Method 
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 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 937
 
Appendice 4  
ÉVALUATION DE L’INHIBITION DES BOUES ACTIVÉES  
Inhibition par les substances d’essai  
1. Il se peut qu’une substance chimique (ou des eaux usées) ne soient ni 
dégradées ni éliminées au cours de l’essai de simulation et qu’elles inhibent 
de surcroît les micro-organismes des boues. D’autres composés chimiques sont biodégradés à faible concentration, mais ont une action inhibitrice à des concentrations supérieures (hormèse). Les effets inhibiteurs peuvent avoir été 
révélés à un stade précédent ou être déterminés par un essai de toxicité, 
conduit sur un inoculum semblable ou identique à celui utilisé au cours de l’essai de simulation (1). Ces méthodes ont trait à l’inhibition de la fixation d’oxygène [chapitre C.11 de la présente annexe (2) et norme ISO 8192 (3)] 
ou à l’inhibition de la croissance des organismes des boues [norme ISO 
15522 (4)].
 
2. Une inhibition survenant au cours d’un essai de simulation se manifestera par 
une différence de COD ou de DCO entre les effluents du récipient d’essai et ceux du récipient témoin supérieure au COD ajouté par la substance d’essai. 
En d’autres termes, la présence de la substance d’essai abaissera le pourcen ­
tage d’élimination du COD (et de la demande biochimique en oxygène DBO, de la demande chimique en oxygène DCO, et/ou de l’ion NH
 + 4 ) du milieu 
organique traité. Si cela se produit, il faudrait recommencer l’essai en rame ­
nant la concentration de la substance d’essai jusqu’à un niveau où elle n’est 
pas inhibitrice et éventuellement aussi en diminuant davantage sa concen ­
tration jusqu’à une valeur où elle est biodégradée. Néanmoins, si la substance d’essai (ou les eaux usées) altèrent le processus à toutes les concentrations 
testées, il est vraisemblable que la substance est difficile, voire impossible, à 
traiter par voie biologique, mais il peut être pertinent de répéter l’essai avec des boues activées prélevées à une autre source et/ou en soumettant les boues 
à une acclimatation plus progressive.
 
3. Par contre, si la substance d’essai est éliminée par voie biologique du premier 
coup dans l’essai de simulation, il convient d’accroître sa concentration si l’on cherche à savoir si elle a un pouvoir inhibiteur.
 
4. N’oublions pas, lorsqu’on tente de déterminer les degrés d’inhibition, que la 
population d’une boue activée est susceptible d’évoluer, si bien qu’avec le 
temps, les micro-organismes peuvent devenir résistants vis-à-vis d’une subs ­
tance inhibitrice.  
5. Calcul du degré d’inhibition:  
Les pourcentages d’élimination globaux R  o de la DBO, du COD, de la DCO, 
etc., dans les unités d’essai et témoins peuvent être calculés comme suit:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
où: 
I = concentration de la DBO, du COD, de la DCO etc., dans les eaux à 
traiter des récipients d’essai ou témoins (mg/l);  
E = concentrations respectives dans les effluents (mg/l).  
I et E doivent être corrigés pour tenir compte du COD provenant de la 
substance d’essai dans les unités d’essai, sinon le calcul du pourcentage 
d’inhibition sera incorrect.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 938
 
Le degré d’inhibition découlant de la présence de la substance d’essai peut 
être calculé selon cette formule:  
%d’inhibition ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
où: 
R c = pourcentage d’élimination dans les récipients témoins;  
R t = pourcentage d’élimination dans les récipients d’essai.  
BIBLIOGRAPHIE:  
(1) Reynolds L.  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) Chapitre C.11 de la présente annexe, Biodégradation – boues activées: essai 
d’inhibition de la respiration.  
(3) ISO 8192 (2007) Qualité de l’eau – Essai d’inhibition de la consommation 
d’oxygène par des boues activées pour l’oxydation du carbone et de l’am ­
monium.  
(4) ISO 15522 (1999) Détermination de l’effet inhibiteur des constituants de 
l’eau sur la croissance des micro-organismes de boues activées.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 939
 
Appendice 5  
Substances d’essai peu solubles dans l’eau – substances volatiles  
Substances peu solubles dans l’eau  
Il semble qu’il y ait peu de publications rapportant des essais de simulation de 
traitement des eaux usées conduits sur des substances peu solubles dans l’eau et 
insolubles (1) (2) (3).  
Il n’existe pas de méthode de dispersion universelle applicable à toutes les subs ­
tances d’essai insolubles. Sur les quatre catégories de méthodes décrites dans la norme ISO 10634 (4), les deux qui paraissent convenir à la dispersion des 
substances destinées à un essai de simulation font appel à des agents émulsifiants 
et/ou à des ultrasons. La stabilité de la dispersion obtenue doit être établie pour une période d’au moins 24 heures. Des dispersions convenablement stabilisées contenues dans des réservoirs agités en permanence (paragraphe 38), seront 
ensuite dosées dans le récipient d’aération séparément des eaux usées domes ­
tiques ou synthétiques.
 
Si les dispersions sont stables, étudier comment déterminer la substance d’essai 
sous sa forme dispersée. Comme le COD risque fort d’être inapproprié, il faudrait mettre au point une méthode d’analyse spécifique de la substance d’essai appli ­
cable aux effluents, aux solides des effluents et à la boue activée. Le devenir de 
la substance d’essai dans la simulation du traitement par boues activées serait alors déterminé dans les phases solides et liquides. On établirait ainsi un bilan massique pour savoir si la substance d’essai a été biodégradée. Mais ce dernier 
n’indique que la biodégradation primaire. Il faudrait tâcher de démontrer la 
biodégradation finale par le biais d’un essai de biodégradabilité immédiate au respiromètre [chapitre C.4 de la présente annexe (5), C, F ou D] en utilisant comme inoculum une boue exposée à la substance d’essai au cours de l’essai de 
simulation.
 
Substances volatiles  
L’application d’un essai de simulation du traitement des eaux usées aux subs ­
tances volatiles est discutable et problématique. Comme pour les substances 
d’essai peu solubles dans l’eau, les rapports décrivant des essais de simulation sur des substances volatiles semblent très rares. On adapte un appareil classique de mélange intégral en bouchant hermétiquement le récipient d’aération et le 
décanteur, en mesurant et contrôlant le flux d’air par des débitmètres et en 
faisant passer les gaz sortants par des pièges afin de recueillir les matières organiques volatiles. Dans certains cas, une pompe à vide dirige les gaz sortants vers un piège froid ou un piège purgeur contenant du Tenax ou un gel de silice 
pour analyse par chromatographie en phase gazeuse. La substance d’essai retenue 
par le piège peut être déterminée par analyse.
 
L’essai est réalisé en deux parties. Les unités fonctionnent d’abord sans boue, 
mais en pompant les eaux usées synthétiques additionnées de la substance d’essai dans le récipient d’aération. On analyse la substance d’essai dans des échantillons 
d’eaux à traiter, d’effluents et de gaz sortants pendant quelques jours. À partir 
des données recueillies, il est possible de calculer le pourcentage (R
 vs ) de subs ­
tance d’essai extraite du système.  
Ensuite l’essai biologique normal (avec boue) est mené dans des conditions 
expérimentales identiques à celles de l’étude d’extraction. On mesure aussi le COD ou la DCO pour s’assurer que les unités fonctionnement efficacement. La 
substance d’essai est mesurée de temps à autre dans les eaux à traiter, les 
effluents et les gaz sortants au cours de la première partie de l’essai, et plus fréquemment après l’acclimatation. Les données tirées de la phase stationnaire permettent à nouveau de calculer le pourcentage d’élimination de la substance 
d’essai dans la phase liquide par les processus physiques et biologiques (R
 T ) 
ainsi que la proportion (R  v ) extraite du système.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 940
 
Calcul:  
a) Dans l’essai non biologique, le pourcentage (R  VP ) de substance d’essai 
extraite du système peut être calculé à partir de la formule suivante:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
où 
R VP = élimination de la substance d’essai par volatilisation (%),  
S VP = substance d’essai collectée par le piège, exprimée en équivalent de 
concentration dans la phase liquide (mg/l),  
S IP = concentration de la substance d’essai dans les eaux à traiter (mg/l).  
b) Dans l’essai biologique, le pourcentage (R  V ) de la substance d’essai extraite 
du système peut être calculé à partir de la formule suivante:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
où 
R V = élimination de la substance d’essai par volatilisation au cours de 
l’essai biologique (%),  
S V = substance d’essai collectée par le piège au cours de l’essai biologique, 
exprimée en équivalent de concentration dans les flux liquides 
entrants (mg/l),  
S I = concentration de la substance d’essai dans les eaux brutes (mg/l).  
c) Dans l’essai biologique, le pourcentage (R  T ) de substance d’essai éliminée par 
tous les processus est régi par l’équation suivante:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
où 
S E = concentration de la substance d’essai dans les effluents (liquides) 
(mg/l).  
d) Aussi, le pourcentage (R  BA ) enlevé par biodégradation et par adsorption 
peut-il être calculé comme suit:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Il conviendrait de réaliser d’autres essais pour déterminer si la substance 
d’essai est adsorbée, auquel cas une correction supplémentaire pourrait être 
apportée.  
e) Une comparaison entre la proportion de substance d’essai extraite lors de 
l’essai biologique (R  v ) et de l’essai non biologique (R  vp ) montre l’effet 
global du traitement biologique sur l’émission de la substance d’essai dans l’atmosphère.
 
Exemple:  Benzène  
Temps de rétention des boues = 4 jours  
Eaux usées synthétiques: temps de rétention = 8 heures  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 941
 
Donc,  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % and R  BA = 85 %.  
On a supposé qu’il n’y avait pas adsorption du benzène sur la boue.  
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le traitement des composés organiques peu solubles dans l’eau en vue de l’évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux.
 
(5) Chapitre C.4 de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité 
«facile».  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 942
 
Appendice 6  
Effets du temps de rétention des boues (TRB) sur les possibilités de 
traitement des substances chimiques  
INTRODUCTION  
1. La méthode décrite dans le corps de texte a été conçue pour vérifier si les 
substances chimiques testées (généralement celles connues comme étant intrinsèquement, mais pas immédiatement biodégradables) pouvaient être biodégradées dans les limites imposées par les stations d’épuration des 
eaux usées. Les résultats sont exprimés en pourcentage d’élimination et de 
biodégradation. Les conditions de fonctionnement des unités à boues acti ­
vées et le choix des eaux à traiter autorisent une variation assez marquée de la concentration de la substance d’essai dans les effluents. Les essais ne 
portent que sur une seule concentration nominale de solides des boues ou 
sur un seul temps de rétention nominal des boues (TRB), et les régimes d’épuisement des boues décrits sont susceptibles de faire varier considéra ­
blement le TRB durant l’essai, d’un jour à l’autre et sur une journée.
 
2. Dans cette variante (1) (2), le TRB est régulé dans des limites beaucoup plus 
étroites tout au long de chaque période de 24 heures (comme à grande 
échelle), si bien que la concentration des effluents est plus constante. On 
recommande les eaux usées domestiques, qui donnent des pourcentages d’élimination plus réguliers et plus élevés. Les effets de plusieurs valeurs du TRB sont aussi examinés et l’incidence d’une gamme de températures 
sur la concentration dans les effluents peut être déterminée dans une étude 
plus détaillée.
 
3. Il n’existe pas encore de consensus général sur les modèles cinétiques qui 
reproduisent la biodégradation des substances chimiques dans les conditions 
d’une station de traitement des eaux usées. S’agissant des données collec ­
tées, le modèle de croissance bactérienne et d’utilisation du substrat de Monod a été choisi (1) (2) dans la mesure où la méthode était destinée à 
ne s’appliquer qu’aux substances chimiques produites par tonnes et donc 
présentes à des concentrations supérieures à 1 mg/l dans les eaux usées. La validité du modèle simplifié et des hypothèses émises a été établie à l’aide d’une série d’alcooléthoxylates (2) (3) manifestant des degrés variables de 
biodégradabilité primaire.
 
Note:  cette variante reprend en grande partie le texte de la présente 
méthode d’essai C.10-A, seuls les détails qui s’en écartent étant mentionnés ci-après.
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
4. Des unités à boues activées comportant un vase poreux, conçues pour 
faciliter l’épuisement (presque) continu de la liqueur mixte grâce à un réglage très précis du temps de rétention des boues (TRB, ou θ
 s ), fonction ­
nent en mode non couplé et couvrent une gamme de temps de rétention et, 
facultativement, de températures. Le temps de rétention varie généralement 
entre 2 et 10 jours et la température entre 5 et 20 °C. Les eaux usées, de préférence domestiques, et une solution de la substance d’essai sont dosées séparément dans les unités à des fréquences induisant le temps de rétention 
des eaux usées requis (3 à 6 heures) et la concentration voulue de la subs ­
tance d’essai dans les eaux à traiter. Les unités témoins qui ne reçoivent pas la substance d’essai tournent en parallèle, à des fins de comparaison.
 
5. D’autres types d’appareils peuvent être utilisés, mais il faut être très attentif 
à bien maîtriser le TRB. Lorsqu’on utilise, par exemple, des installations qui comprennent un décanteur, il peut être nécessaire de tenir compte de la perte de solides via les effluents de l’installation. En outre, les erreurs dues à la 
variation de la quantité de boue dans le décanteur doivent être évitées par 
des précautions particulières.
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6. Les unités fonctionnent sous chaque combinaison de conditions choisie et, 
une fois l’équilibre atteint, on mesure les concentrations moyennes de la 
substance d’essai dans les effluents à l’état stationnaire et, facultativement, le COD, sur une période d’environ trois semaines. L’évaluation du pour ­
centage d’élimination de la substance d’essai et, facultativement, du COD, 
sera complétée par une représentation graphique de la relation entre les 
conditions de fonctionnement de l’installation et la concentration dans les effluents. À partir de là, il est possible de calculer des constantes cinétiques expérimentales et de prévoir les conditions dans lesquelles la substance 
d’essai peut être traitée.
 
INFORMATION SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
7. Appliquer les paragraphes 12 et 13 du chapitre C.10-A.  
NIVEAUX DE SEUILS  
8. Appliquer les paragraphes 14 et 15 du chapitre C.10-A.  
SUBSTANCE D’ESSAI DE RÉFÉRENCE  
9. Appliquer le paragraphe 16 du chapitre C.10-A.  
REPRODUCTIBILITÉ DES RÉSULTATS D’ESSAI  
10. Appliquer les paragraphes 17 et 18 du chapitre C.10-A.  
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Appareils  
11. Une unité qui convient ici est une adaptation du système du vase poreux 
(appendice 6.1). Elle consiste en un vase interne (ou revêtement) en poly ­
propylène poreux de 3,2 mm d’épaisseur dont les pores mesurent environ 90 μm; l’assemblage est soudé bout à bout, ce qui rend l’unité plus robuste 
que celle décrite au paragraphe 21 du présent chapitre, C.10-A). Le revête ­
ment est entouré d’une enveloppe en polyéthylène imperméable qui 
comprend deux parties: une base circulaire perforée pour laisser passer deux tuyaux à air et un tuyau transportant la boue épuisée, et un cylindre vissé sur le dessus de la base et doté d’une sortie placée de manière à ce 
qu’il déverse un volume connu (3 l) dans le vase poreux. L’un des deux 
tuyaux à air est équipé d’une pierre diffuseuse et l’autre est ouvert aux extrémités et disposé à angle droit de la pierre dans le vase. Ce système crée suffisamment de turbulences pour assurer un mélange intégral des 
composants du vase et engendrer des concentrations en oxygène dissous 
supérieures à 2 mg/l.
 
12. Les unités, en nombre adéquat, sont placées dans un bain-marie ou dans des 
locaux à température constante et thermostatées entre 5 et 20 °C (± 1 °C). On emploie deux pompes pour doser la solution de la substance d’essai et 
les boues décantées dans les récipients d’aération aux débits requis (res ­
pectivement 0-1,0 ml/min et 0-25 ml/min) et une troisième pompe pour évacuer la boue épuisée des récipients d’aération. Le débit nécessairement 
très lent des boues épuisées est imprimé par une pompe qui fonctionne à 
une vitesse supérieure et par intermittences, au moyen d’un minuteur qui l’actionne, par exemple, pendant 10 secondes par minute avec un débit de 3 ml/min, ce qui donne un débit de boue épuisée de 0,5 ml/min.
 
Appareil de filtration ou centrifugeuse  
13. Appliquer le paragraphe 23 du chapitre C10-A.  
Matériel d’analyse  
14. Appliquer le paragraphe 24 du chapitre C.10-A.  
Eau ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 944
 
15. Appliquer les paragraphes 25 et 26 du chapitre C.10-A.  
Milieu organique  
16. Appliquer le paragraphe 27 du chapitre C.10-A.  
Eaux usées synthétiques  
17. Appliquer le paragraphe 28 du chapitre C.10-A.  
Eaux usées domestiques  
18. Appliquer le paragraphe 29 du chapitre C.10-A.  
Boues activées  
19. Appliquer le paragraphe 30 du chapitre C10-A.  
Solutions mères de la substance d’essai  
20. Appliquer les paragraphes 31 et 32 du chapitre C.10-A.  
MODE OPÉRATOIRE  
Préparation de l’inoculum  
21. Voir chapitre C.10-A, paragraphe 34 uniquement – utiliser des boues acti ­
vées (environ 2,5 g/l).  
Nombre d’unités d’essai  
22. S’agissant d’un essai simple, qui ne vise qu’à mesurer le pourcentage d’éli ­
mination, un seul TRB suffit, mais si on veut réunir les données nécessaires pour calculer les constantes cinétiques expérimentales, on aura besoin de 4 
ou 5 valeurs de TRB. Les valeurs choisies sont généralement comprises 
entre 2 et 10 jours. Il est plus pratique de réaliser un essai en appliquant 4 ou 5 valeurs de TRB simultanément à la même température; les études 
plus poussées portent sur les mêmes valeurs de TRB, ou éventuellement sur 
une gamme de valeurs différentes, à d’autres températures fixées entre 5 et 20 °C. La biodégradation primaire (utilisation principale) ne requiert norma ­
lement qu’une seule unité par combinaison de conditions. Il faut ajouter une 
unité témoin par combinaison de conditions, qui reçoit les eaux usées mais 
pas la substance d’essai, pour la biodégradation finale. Si on suppose que les eaux usées employées renferment la substance d’essai, il y a lieu d’incor ­
porer des unités témoins lorsqu’on évalue la biodégradation primaire, et 
d’apporter les corrections nécessaires aux calculs.
 
Dosage du milieu organique et de la substance d’essai  
23. Voir le chapitre C.10-A, paragraphes 36 à 39, mais remarquer que la solu ­
tion de la substance d’essai est dosée séparément et différents débits de boues épuisées sont appliqués. Surveiller fréquemment, par exemple deux fois par jour et ajuster si nécessaire à ± 10 pour cent, les débits des eaux à 
traiter, des effluents et des boues épuisées. Si les méthodes d’analyse posent 
des difficultés avec les eaux usées domestiques, mener l’essai avec de l’eau usée synthétique, en s’assurant que différents milieux donnent des résultats cinétiques comparables.
 
Manipulation des boues activées  
24. S’aligner sur le chapitre C.10-A, paragraphes 40 à 43, mais ne réguler le 
TRB que par un débit «constant» de boues épuisées.  
Échantillonnage et analyse  
25. Se référer au chapitre C.10-A, paragraphes 44 à 50, à cette exception près 
qu’on déterminera la concentration de la substance d’essai et, facultative ­
ment, le COD, mais la DOC ne doit pas être utilisée.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 945
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
26. Suivre le chapitre C.10-A, paragraphes 52 à 54.  
Expression des résultats de l’essai  
27. Suivre le chapitre C.10-A, paragraphes 56 à 62.  
Calcul des constantes cinétiques  
28. Il est plus réaliste de mentionner la concentration moyenne de la substance 
d’essai à l’état stationnaire dans l’effluent et de décrire comment elle varie en fonction des conditions de fonctionnement de l’installation que de citer le pourcentage de biodégradation primaire. L’équation [6] de l’appendice 6.2 
est utile à cet égard, qui livre des valeurs de K
 S , μ m et θ SC , le temps de 
rétention critique des boues.  
[Des valeurs approximatives de K  S et de μm peuvent aussi être déduites à 
l’aide d’un programme informatique simple qui ajuste la courbe théorique calculée à partir de l’équation [2] (appendice 6.2) aux valeurs expérimen ­
tales. Bien qu’une solution donnée ne constitue pas une réponse absolue, on 
peut parvenir à une approximation raisonnable de K
 S et de μ m ]. 
Variabilité des résultats  
29. Il est fréquent de trouver des paramètres cinétiques variables pour une même 
substance. On pense que les conditions de croissance des boues et les 
conditions dans lesquelles s’est déroulé l’essai (comme au paragraphe 5 et 
dans d’autres essais) ont une incidence marquée sur les résultats. Un aspect de cette variabilité a été examiné par Grady  et al.  (4), qui ont proposé que 
les termes «effectif» et «intrinsèque» s’appliquent à deux états extrêmes 
représentant les limites de l’état physiologique qu’une culture peut atteindre 
au cours d’une expérience cinétique. Si l’état est maintenu durant l’essai, les valeurs du paramètre cinétique reflètent les conditions du milieu dans lequel les micro-organismes ont été prélevés; ces valeurs sont dites «effectives». À 
l’autre extrême, si les conditions de l’essai autorisent le plein développement 
du système de synthèse des protéines et donc un taux de croissance maxi ­
mum, les paramètres cinétiques résultants sont dits «intrinsèques» et ne dépendent que de la nature du substrat et des types de bactéries qui compo ­
sent la culture. À titre indicatif, on obtiendra des valeurs effectives en 
appliquant un rapport de la concentration du substrat sur les micro-organismes qui dégradent (S
 o /X o ) faible, par exemple de 0,025, et 
les valeurs intrinsèques apparaîtront avec un rapport élevé, par exemple 
d’au moins 20. Dans les deux cas, S  o doit être supérieur ou égal à la 
valeur applicable de Ks, la constante de demi-saturation.  
30. La variabilité et d’autres aspects de la cinétique de biodégradation ont été 
examinés lors d’une réunion récente du SETAC (5). Qu’elles aient fait l’objet de publications ou qu’il s’agisse de projets, ces études devraient bientôt livrer une image plus claire de la cinétique qui gouverne le traite ­
ment des eaux usées dans les stations et permettre ainsi de mieux interpréter 
les données existantes et d’avancer des conceptions plus pertinentes concer ­
nant de futures méthodes d’essai.
 
BIBLIOGRAPHIE:  
(1) Birch R.R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
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(4) Grady C.P.L., Smets B.F. and Barbeau D.S. (1996). Variability in kinetic 
parameter estimates: A review of possible causes and a proposed termino ­
logy. Wat. Res., 30 (3): 742-748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W. 4-6th September 1996. SETAC – Europe, 
Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 947
 
Appendice 6.1  
Vase poreux avec régulation du TRB
  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 948
 
Appendice 6.2  
Calcul des constantes cinétiques  
1. En supposant que la cinétique de Monod s’applique et compte tenu d’un 
bilan massique de solides actifs et de substrat dans le système à boues activées (1), les expressions suivantes décrivent l’état stationnaire:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
ou 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
Où: 
S 1 = concentration de substrat dans les effluents (mg/l)  
K S = constante de demi-saturation, concentration à laquelle μ = μ m /2 
(mg/l)  
μ = taux de croissance spécifique (d  –1 ) 
μ m = valeur maximale de μ m (d –1 ) 
K d = vitesse de dégradation spécifique des solides actifs (d  –1 ) 
θ S = temps de rétention moyen des boues, TRB (d)  
L’étude de cette équation amène les conclusions suivantes:  
i) La concentration dans les effluents est indépendante de celle qui règne 
dans les eaux à traiter (S  0 ); aussi, le pourcentage de biodégradation 
varie-t-il avec la concentration dans les eaux à traiter, S  0 . 
ii) Le seul paramètre régulé de l’installation qui affecte S  1 est le temps de 
rétention des boues, θ S . 
iii) Une concentration donnée dans les eaux à traiter, S  0 , correspondra à un 
temps de rétention critique des boues selon la relation:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
Où: 
θ SC = temps de rétention critique des boues, en dessous duquel les 
micro-organismes qui dégradent seront expulsés de l’installation.  
iv) Comme les autres paramètres de l’équation [2] sont liés à la cinétique de 
croissance, la température est susceptible d’affecter la teneur en substrat 
dans les effluents et l’âge critique des boues, en d’autres termes, le temps de rétention des boues nécessaire pour obtenir un certain degré de traitement augmenterait à mesure que la température diminuerait.
 
2. Soit un bilan massique de solides dans le système à vase poreux, et en 
supposant que la concentration des solides dans les effluents de la station, X
 2 , est faible comparée à celle du récipient d’aération, X  1 , le temps de 
rétention des boues s’exprime comme suit:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 949
 
et 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
où: 
V = volume du récipient d’aération (l)  
X 1 = concentration des solides dans le récipient d’aération (mg/l)  
X 2 = concentration des solides dans l’effluent (mg/l)  
Q 0 = débit des eaux à traiter (l/d)  
Q 1 = débit des boues épuisées (l/d)  
Il est donc possible de régler le temps de rétention des boues sur n’importe 
quelle valeur présélectionnée en régulant le débit des boues épuisées, Q  1 . 
Conclusions:  
3. Cet essai vise principalement à permettre de prédire la concentration dans 
les effluents et, à partir de là, la concentration de la substance d’essai dans les eaux réceptrices.
 
4. La courbe de S  1 en fonction de θ S autorise parfois une évaluation immédiate 
du temps de rétention critique des boues, θ SC ; voir par exemple la courbe 3 
à la figure 1. Si c’est impossible, on peut calculer θ SC en même temps que 
des valeurs approximatives de μ m et K  S , en traçant S  1 en fonction de S  1 •θ S . 
L’équation [1] est reformulée en ces termes:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Si K  d est petit, alors 1 + θ s • K  d ~ 1 et [5] devient:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Par la suite, la courbe devrait prendre l’allure d’une droite (voir figure 2) de 
pente 1/μ m et intercepter K  S /μ m ; et θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 950
 
Figure 1  
Trois températures; cinq TRB
  
Figure 2  
Droite de régression TRB · S 1 en fonction de S  1 à T = 5 °C
  
Glossaire  
concentration de l’effluent.  
courbe.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 951
 
Appendice 7  
ESSAIS RÉALISÉS À FAIBLES CONCENTRATIONS ( μG/L)  
1. De nombreuses substances chimiques sont normalement présentes dans le 
milieu aquatique, même dans les eaux usées, à de très faibles concentrations (μg/l). À de telles teneurs, elles ne servent probablement pas de substrats 
primaires pour la croissance, et il est plus vraisemblable qu’elles subissent 
une dégradation en tant que substrats secondaires sans intervenir dans la 
croissance, parallèlement à diverses substances chimiques carbonées natu ­
relles. Par conséquent, les dégradations de ces substances chimiques ne correspondront pas au modèle décrit à l’appendice 6. De nombreux 
modèles pourraient les représenter et, dans les conditions qui régissent les 
systèmes de traitement des eaux usées, celles-ci peuvent probablement se refléter simultanément dans plusieurs modèles. Il faudra entreprendre des recherches bien plus poussées pour élucider ce problème.
 
2. En attendant, le mode opératoire exposé dans le corps de texte (chapitre 
C.10-A) peut être suivi, mais il ne s’applique qu’à la biodégradabilité primaire, à des concentrations suffisamment basses (< 100 μg/l), et requiert 
une méthode d’analyse validée. Le pourcentage de biodégradation peut être 
calculé (voir au paragraphe 54 de la présente méthode d’essai), mais à condition de tenir compte des processus non biologiques (adsorption, vola ­
tilité, etc.). L’étude conduite par Nyholm et son équipe (1) (2) sur un cycle 
de quatre heures dans un système à lit de contact en est un exemple. Ils ont 
opposé des pseudo-constantes de premier ordre pour cinq substances chimiques ajoutées à des eaux usées synthétiques à raison de 5 à 100 μg/l (s’agissant de la biodégradabilité finale, des substances d’essai 
marquées au
 14 C peuvent être utilisées). La description d’un procédé 
n’entre pas dans le cadre de la présente méthode d’essai dans la mesure où aucun ne fait encore l’unanimité, bien qu’une méthode proposée pour la norme ISO 14592 (3) contienne des indications concernant l’emploi de 
substances marquées au
 14 C. 
Essai de biodégradation en semi-continu à l’aide de boues activées  
3. Un essai plus simple en deux étapes a été présenté ultérieurement (4) (5) (6); 
la méthode en semi-continu à l’aide de boues activées (SCBA) est suivie par des essais cinétiques à court terme pratiqués sur des échantillons prélevés dans les unités SCBA. Les débits de boues épuisées sont connus dans le 
système SCBA (contrairement à la méthode d’essai originale C.12), qui est 
alimenté par des eaux usées synthétiques (formule de l’OCDE modifiée) ou par des eaux usées domestiques. Les eaux usées synthétiques ont été modi ­
fiées (à cause de la fluctuation du pH et de la mauvaise décantabilité des 
boues) par addition d’un tampon phosphate, d’un extrait de levure, de 
chlorure de fer (III) et de sels d’oligo-éléments, et leur DCO a été relevée jusqu’à environ 750 mg/l moyennant une augmentation de la concentration 
de peptone et d’extrait de viande. Les unités tournaient en cycles de 24 
heures: aération pendant 23 heures, épuisement des boues, décantation, enlèvement du surnageant (effluent), suivis par l’adjonction des eaux usées synthétiques et de la substance d’essai jusqu’à 100 μg/l (c’est-à-dire 
à peu près la même concentration que celle appliquée dans l’essai à court 
terme). Une fois par semaine, on remplace 10 pour cent de la totalité des boues par des boues fraîches, afin de maintenir l’équilibre de la population de micro-organismes.
 
4. Les concentrations de la substance d’essai sont mesurées au début et à la fin 
de l’aération, et l’essai est poursuivi jusqu’à ce que l’élimination de la substance d’essai devienne constante, ce qui peut prendre une semaine à plusieurs mois.
 
Essai à court terme  
5. Pratiquer un essai à court terme (8 heures, par exemple), afin de déterminer 
la pseudo-constante cinétique de premier ordre relative à la dégradation de la 
substance d’essai dans des boues activées ayant des origines et des évolu ­
tions différentes, mais connues. En particulier, prélever des échantillons de boues des réacteurs SCBA – à la fin d’une période d’aération lorsque la 
concentration de substrat organique est basse – au cours d’un essai d’ac ­
climatation (paragraphes 3, 4). On peut aussi prélever des boues d’une unité
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SCBA tournant en parallèle et non exposée à la substance d’essai, pour 
comparaison. Aérer des mélanges de boue et de substance d’essai incorporée 
à deux ou plusieurs concentrations comprises entre 1 et 50 μg/l, sans ajouter 
d’eaux usées synthétiques ni d’autre substrat organique. La substance d’essai restant en solution est mesurée à intervalles réguliers, par exemple toutes les 
heures, suivant la dégradabilité de la substance, durant une période qui 
n’excède pas 24 heures. Centrifuger les échantillons avant de les soumettre à une analyse appropriée..
 
Calculs  
6. Les données provenant des unités SCBA servent à calculer le pourcentage 
d’élimination de la substance d’essai (paragraphe 54). Une constante de 
vitesse moyenne, K  1 (établie en fonction de la concentration des solides 
en suspension), peut aussi être calculée à partir de la formule suivante:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
Où: 
t = durée d’aération (23 h)  
C e = concentration à la fin de la période d’aération ( μg/l) 
C i = concentration au début de l’aération ( μg/l) 
SS = concentration des solides des boues activées (g/l)  
7. Dans l’essai à court terme, tracer la courbe du logarithme de la concen ­
tration (%) restante en fonction du temps; la pente de la partie initiale (10-50 pour cent de dégradation) de la courbe est équivalente à K
 1 , la 
pseudo-constante de premier ordre. Établir la constante en fonction de la 
concentration des solides des boues en divisant la pente par la concentration de ces solides. Le résultat indiqué doit préciser les concentrations initiales de la substance d’essai et des solides en suspension, le temps de rétention des 
boues, la charge et la source des boues ainsi que, le cas échéant, la préex ­
position à la substance d’essai.
 
Variabilité des résultats  
8. La variabilité et d’autres aspects de la cinétique de biodégradation ont été 
examinés lors d’une réunion récente du SETAC (7). Qu’elles aient fait l’objet de publications ou qu’il s’agisse de projets, ces études devraient 
bientôt livrer une image plus claire de la cinétique qui gouverne le traite ­
ment des eaux usées dans les stations et permettre ainsi de mieux interpréter les données existantes et d’avancer des conceptions plus pertinentes concer ­
nant de futures méthodes d’essai.
 
BIBLIOGRAPHIE:  
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Schultz B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge 
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Europe, Brussels.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 954
 
C.10-B: Biofilms  
INTRODUCTION  
1. Les essais de simulation s’appliquent normalement aux substances 
chimiques qui ont donné un résultat négatif à l’essai de biodégradabilité immédiate [chapitre C.4-A à F de la présente annexe (9)], mais un résultat positif à l’essai de biodégradabilité intrinsèque. Exceptionnellement, les 
essais de simulation se pratiquent aussi en vue d’obtenir des informations 
supplémentaires sur une substance d’essai, en particulier les substances chimiques produites en grandes quantités, et l’on recourt normalement à l’essai de traitement par boues activées (C.10-A). Toutefois, dans certaines 
circonstances, il y a lieu de connaître certaines données particulières concer ­
nant la réaction d’une substance chimique à des méthodes de traitement des eaux usées comportant des biofilms, à savoir des lits à ruissellement ou lits bactériens, des disques biologiques et des lits fluidisés. Différents dispositifs 
ont été créés à cette fin.
 
2. Gerike  et al.  (1) ont utilisé de grands lits bactériens en mode couplé à 
l’échelle pilote. Ces lits occupaient beaucoup d’espace et exigeaient des 
volumes relativement élevés d’eaux usées domestiques ou synthétiques. Truesdale  et al.  (2) ont décrit des lits plus petits (1,83 m × 0,15 m de 
diamètre) alimentés par des eaux usées naturelles dépourvues de tensioactifs, 
mais qui demandaient encore des volumes assez importants. Il ne fallait pas 
moins de 14 semaines pour qu’un biofilm arrive à «maturité» et 4 à 8 semaines supplémentaires après la première introduction du tensioactif d’essai pour l’acclimatation.
 
3. Baumann et al. (3) ont mis au point un lit beaucoup plus petit à base de 
polyester «velu» préalablement plongé dans des boues activées, servant de 
substrat inerte pour le biofilm. La substance d’essai constituait la seule 
source de carbone et la biodégradabilité était évaluée d’après la mesure du carbone organique dissous (COD) dans les eaux à traiter et les effluents, 
et la quantité de CO
 2 dans les dégagements gazeux.  
4. Une approche assez différente a été tentée par Gloyna  et al.  (4), qui ont 
inventé le réacteur tubulaire rotatif. Ils ont cultivé un biofilm sur la surface 
interne d’un tube rotatif, sur la superficie connue, en y faisant passer des 
eaux à traiter qu’ils déversaient au sommet du tube légèrement incliné par rapport à l’horizontale. Le réacteur a servi à étudier la biodégradabilité des 
tensioactifs (5) ainsi que l’épaisseur optimale du biofilm et la diffusion à 
travers le film (6). Ces auteurs ont perfectionné le réacteur, notamment pour pouvoir déterminer le CO
 2 dans les dégagements gazeux.  
5. Le réacteur tubulaire rotatif a été adopté par le Standing Committee of 
Analysts (Royaume-Uni) comme méthode de référence pour évaluer la biodégradabilité des substances chimiques (7) ainsi que les possibilités de 
traitement des eaux usées et leur toxicité (8). La méthode décrite ici est 
simple, concise et reproductible et, de surcroît, ne nécessite que des volumes relativement petits de milieu organique.
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
6. Des eaux usées synthétiques ou domestiques et la substance d’essai sont 
appliquées, séparément ou incorporées, sur la surface interne d’un tube 
incliné en rotation lente. Une couche de micro-organismes, semblables à ceux présents dans le milieu du biofiltre, se développe sur la surface interne. Le fonctionnement du réacteur est régulé de telle sorte qu’il entraîne une 
élimination adéquate de la matière organique et, si nécessaire, l’oxydation de 
l’ammonium.
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7. Les effluents du tube sont collectés et décantés et/ou filtrés avant l’analyse 
du carbone organique dissous (COD) et/ou de la substance d’essai par une 
méthode spécifique. Les unités témoins, qui ne reçoivent pas la substance d’essai, tournent en parallèle dans les mêmes conditions, à des fins de comparaison. La différence entre les concentrations de COD dans les 
effluents de l’unité d’essai et de l’unité témoin est imputée par hypothèse 
à la substance d’essai et à ses métabolites organiques. On compare cette différence à la concentration de la substance d’essai ajoutée (en termes de COD) pour calculer l’élimination de la substance d’essai.
 
8. Il est normalement possible de distinguer la biodégradation de la bioadsorp ­
tion par un examen attentif de la courbe d’élimination en fonction du temps. 
L’observation peut généralement être confirmée par un essai de biodégra ­
dabilité immédiate (consommation d’oxygène ou production de dioxyde de carbone) réalisé à l’aide d’un inoculum acclimaté prélevé à la fin de l’essai dans les réacteurs qui reçoivent la substance d’essai.
 
INFORMATION SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
9. La pureté, la solubilité dans l’eau, la volatilité et les caractéristiques d’ad ­
sorption de la substance d’essai doivent être connues pour que l’interpréta ­
tion des résultats soit correcte.  
10. Normalement, les substances chimiques volatiles et peu solubles ne peuvent 
être mises à l’essai sans précautions particulières (voir appendice 5 du 
chapitre C.10-A). Il faudrait connaître également la formule chimique déve ­
loppée ou, au moins, empirique, pour calculer les valeurs théoriques et/ou vérifier les valeurs mesurées de paramètres tels que la demande théorique en 
oxygène (DthO) et le carbone organique dissous (COD).
 
11. Des données sur la toxicité de la substance d’essai à l’égard des 
micro-organismes (voir appendice 4 du chapitre C.10-A) peuvent aussi 
être utiles à la sélection des concentrations d’essai appropriées et essentielles pour l’interprétation correcte de faibles valeurs de biodégradation.
 
NIVEAUX DE SEUIL  
12. À l’origine, la mise sur le marché des tensioactifs était subordonnée à un 
taux de biodégradation primaire supérieur ou égal à 80 pour cent. Faute d’atteindre un taux de 80 pour cent, on peut mener cet essai de simulation 
(de confirmation) à l’issue duquel le tensioactif ne sera mis sur le marché 
que s’il est éliminé à plus de 90 pour cent. En général, avec les produits chimiques, la question d’un résultat d’essai positif ou négatif n’entre pas en jeu, et le pourcentage d’élimination obtenu peut servir à calculer en gros la 
concentration probable dans l’environnement à introduire dans l’évaluation 
des risques dus aux substances chimiques. Le pourcentage d’élimination du COD atteint dans plusieurs études sur des substances chimiques pures était supérieur à 90 pour cent pour plus des trois quarts des produits chimiques 
présentant un degré de biodégradabilité significatif et supérieur à 80 pour 
cent pour plus de 90 pour cent d’entre eux.
 
SUBSTANCES CHIMIQUES DE RÉFÉRENCE  
13. Pour s’assurer que le mode opératoire est correctement suivi, il est quelque ­
fois utile de tester des substances chimiques dont le comportement est 
connu. Il s’agit notamment de l’acide adipique, du 2-phénylphenol, du 1- naphthol, de l’acide diphénique, de l’acide 1-naphthoïque.
 
REPRODUCTIBILITÉ DES RÉSULTATS D’ESSAI  
14. L’écart-type obtenu par un laboratoire britannique s’élevait à 3,5 % au 
moment des essais et à 5 % entre les essais (7).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 956
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Appareils  
Réacteurs tabulaires rotatifs  
15. L’appareil (voir figures 1 et 2 de l’appendice 8) consiste en une batterie de 
tubes en acrylique de 30,5 cm de long et 5 cm de diamètre interne, 
supportés par des roulettes entourées de caoutchouc, fixées sur un cadre métallique. Chaque tube s’accroche aux roulettes par un bourrelet extérieur de 0,5 cm d’épaisseur environ, et possède un bourrelet interne de la même 
épaisseur à l’extrémité supérieure (d’alimentation) pour retenir le liquide; la 
surface interne a été rendue rugueuse par un tampon de laine à poils épais. Les tubes sont inclinés à un angle d’environ un degré par rapport à l’hori ­
zontale pour que le milieu d’essai appliqué sur un tube propre reste en 
contact avec celui-ci le temps nécessaire. Les roulettes revêtues de caout ­
chouc sont actionnées par un moteur lent à vitesse variable. La température des tubes est régie par leur installation dans un local à température constante.
 
16. En enfermant chaque réacteur tubulaire dans un tube légèrement plus grand 
et fermé par un capuchon en veillant à ce que les connexions soient étanches 
aux gaz, on peut collecter les dégagements de CO  2 dans une solution 
alcaline en vue de mesures ultérieures (6).  
17. Chaque tube est alimenté en milieu organique et en substance d’essai, le cas 
échéant, par un réservoir de 20 litres (A) (voir figure 2) pour une période de 
24 heures. Si nécessaire, la solution de la substance d’essai peut être dosée séparément. Il existe un orifice de sortie situé près du fond de chaque réservoir connecté par un tuyau fait d’une matière appropriée, par 
exemple du caoutchouc de silicone, via une pompe péristaltique (B) à un 
tube en verre ou en acrylique qui s’enfonce sur 2 à 4 cm à l’intérieur de l’extrémité supérieure (d’alimentation) du tube incliné (C). L’effluent s’égoutte ainsi de l’extrémité inférieure du tube incliné dans un autre réci ­
pient de stockage (D). L’effluent est décanté ou filtré avant analyse.
 
Appareil de filtration – centrifugeuse  
18. Les échantillons seront filtrés à travers une membrane possédant une poro ­
sité adéquate (diamètre d’ouverture nominale de 0,45 μm) qui adsorbe les 
composés organiques solubles et libère le moins possible de carbone orga ­
nique. Si les lits utilisés libèrent du carbone organique, il faut les laver soigneusement à l’eau chaude afin d’évacuer le carbone organique lixivia ­
ble. Une centrifugeuse tournant à 40 000 m/s
 2 peut remplacer l’appareil de 
filtration.  
19. Matériel d’analyse permettant de déterminer:  
— le rapport carbone organique dissous (COD)/carbone organique 
total (COT), ou la demande chimique en oxygène (DCO),  
— la substance chimique donnée (CLHP, CG, etc.) s’il y a lieu,  
— le pH, la température, l’acidité, l’alcalinité,  
— l’ammonium, les nitrites et les nitrates, si les essais sont réalisés dans 
des conditions nitrifiantes.  
Eau 
20. Eau du robinet renfermant moins de 3 mg/l de COD.  
21. Eau distillée ou désionisée contenant moins de 2 mg/l de COD.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 957
 
Milieu organique  
22. Les eaux usées synthétiques, les eaux usées domestiques ou un mélange des 
deux sont acceptés comme milieu organique. Comme il a été démontré que les eaux usées domestiques employées seules augmentaient souvent le pour ­
centage d’élimination du COD (dans les unités à boues activées) et entraî ­
naient même la biodégradation de certaines substances chimiques non biodé ­
gradées par les eaux usées synthétiques formulées selon l’OCDE, on préco ­
nise l’utilisation d’eaux usées domestiques. On mesure la concentration du 
COD ou de la DCO dans chaque nouveau lot de milieu organique. L’acidité 
ou l’alcalinité du milieu organique doivent être connues. Il peut être néces ­
saire de tamponner le milieu organique par un composé approprié (hydro ­
génocarbonate de sodium ou hydrogénophosphate de potassium) s’il est 
faiblement acide ou alcalin, pour maintenir le pH à environ 7,5 ± 0,5 dans le réacteur durant l’essai. La quantité de tampon à ajouter et le moment de cette addition seront décidés au cas par cas.
 
Eaux usées synthétiques  
23. Dans chaque litre d’eau du robinet, dissoudre 160 mg de peptone, 110 mg 
d’extrait de viande, 30 mg d’urée, 28 mg d’hydrogénophosphate de potas ­
sium anhydre (K  2 HPO  4 ), 7 mg de chlorure de sodium (NaCl), 4 mg de 
chlorure de calcium dihydraté (CaCl  2 .2H  2 O) et 2 mg de sulfate de magné ­
sium heptahydraté (MgSO  4 .7H  2 0). Cette eau usée synthétique formulée 
selon l’OCDE offre un exemple où la concentration moyenne de COD dans les eaux à traiter atteint quelque 100 mg/l. On utilisera en alternance d’autres compositions donnant à peu près la même concentration de COD, 
plus proches des eaux usées domestiques. Ces eaux usées synthétiques 
peuvent être confectionnées à base d’eau distillée, sous une forme concen ­
trée, et stockées à environ 1 °C pendant une semaine au maximum. Selon les besoins, diluer avec de l’eau du robinet (ce milieu n’est pas satisfaisant, 
notamment parce qu’il présente une concentration en azote très élevée et une 
teneur en carbone relativement faible, mais rien de mieux n’a été suggéré, en dehors d’un supplément de tampon phosphate et de peptone).
 
Eaux usées domestiques  
24. Utiliser des eaux usées qui viennent d’être décantées, recueillies quotidien ­
nement dans une station d’épuration qui reçoit principalement des eaux usées domestiques. Elles doivent être prélevées au niveau du déversoir de la cuve de sédimentation primaire ou dans les eaux à traiter de la station de 
traitement par boues activées et renfermer très peu de grosses particules. Les 
eaux usées peuvent être utilisées après plusieurs jours de stockage à environ 4 °C, s’il est prouvé que le COD (ou la DCO) n’a pas diminué de manière significative (c’est-à-dire de moins de 20 pour cent) durant le stockage. Afin 
de limiter la perturbation du système, il conviendrait d’ajuster le COD (ou la 
DCO) de chaque nouveau lot avant son utilisation à une valeur constante adéquate, par exemple en le diluant avec de l’eau du robinet.
 
Lubrifiant  
25. Les roulettes de la pompe péristaltique peuvent être lubrifiées avec du 
glycérol ou de l’huile d’olive: les deux conviennent aux tubes en caoutchouc de silicone.
 
Solutions mères de la substance d’essai  
26. Pour les substances chimiques présentant une solubilité convenable, préparer 
des solutions mères aux concentrations appropriées (par exemple, 1 à 5 g/l) 
dans de l’eau désionisée, ou dans la fraction minérale de l’eau usée synthé ­
tique. En ce qui concerne les substances chimiques insolubles, se reporter à l’appendice 5 du chapitre C.10-A. La présente méthode n’est pas applicable 
aux substances chimiques volatiles sans modification préalable des réacteurs 
tubulaires (paragraphe 16). Déterminer le COD et le carbone organique total (COT) de la solution mère et répéter les mesures à chaque nouveau lot. Si la différence entre le COD et le COT excède 20 pour cent, il faut 
vérifier l’hydrosolubilité de la substance d’essai. Comparer le COD ou la 
concentration de la substance d’essai mesurée par une analyse spécifique
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dans la solution mère à la valeur nominale, pour s’assurer que la récupéra ­
tion est suffisante (elle dépasse normalement 90 pour cent). Vérifier, en 
particulier pour les dispersions, si le COD peut être utilisé comme paramètre d’analyse ou si seule une technique d’analyse spécifique de la substance d’essai est praticable. Les dispersions imposent la centrifugation des échan ­
tillons. Pour chaque nouveau lot, mesurer le COD, la DCO, ou la substance 
d’essai par une analyse spécifique.
 
27. Déterminer le pH de la solution mère. Les valeurs extrêmes indiquent que 
l’addition de la substance est susceptible d’influencer le pH des boues activées dans le système d’essai. Dans ce cas, il faut neutraliser la solution mère à pH 7 ± 0,5 avec de faibles quantités d’un acide ou d’une base 
inorganiques, tout en évitant la précipitation de la substance d’essai.
 
MODE OPÉRATOIRE  
Préparation du milieu organique à doser  
28. Nettoyer à fond les récipients destinés à recevoir les eaux à traiter et les 
effluents ainsi que les tuyaux reliant ces deux récipients, afin de prévenir toute prolifération de micro-organismes, au début de l’essai et tout au long 
de celui-ci.
 
29. Utiliser des eaux usées synthétiques (paragraphe 23) préparées le jour 
même, en diluant dans les proportions requises les solides ou la solution mère concentrée avec de l’eau du robinet. La quantité nécessaire est mesurée dans un cylindre et versée dans un récipient propre destiné à recevoir les 
eaux à traiter. S’il y a lieu, ajouter la quantité voulue de solution mère de la 
substance d’essai ou de substance de référence aux eaux usées synthétiques avant la dilution. Si cela est plus approprié, ou nécessaire afin d’éviter des pertes de substance d’essai, préparer à part une solution diluée de la subs ­
tance d’essai dans un autre récipient et répartir cette dernière dans les tubes 
inclinés au moyen d’une autre pompe doseuse.
 
30. En alternance (et de préférence), utiliser des eaux usées domestiques décan ­
tées (paragraphe 24) récoltées le jour même si possible.  
Fonctionnement des réacteurs tubulaires rotatifs  
31. L’évaluation de la substance d’essai demande deux réacteurs tubulaires 
identiques assemblés dans un local à température constante, normalement à 22 ± 2 °C.
 
32. Ajuster les pompes péristaltiques de façon à répartir 250 ± 25 ml/h de 
milieu organique (sans substance d’essai) dans les tubes inclinés, qui tour ­
nent à 18 ± 2 tr/min. Lubrifier (paragraphe 25) les tuyaux de la pompe au 
début de l’essai et régulièrement au cours de celui-ci afin de lui assurer un 
bon fonctionnement et de prolonger la vie des tuyaux.  
33. Régler l’angle d’inclinaison des tubes par rapport à l’horizontale de façon à 
produire un temps de séjour de l’eau d’alimentation de 125 ± 12,5 secondes dans un tube propre. Estimer le temps de rétention en ajoutant un marqueur 
non biologique (par exemple: NaCl, un colorant inerte) à l’eau d’alimenta ­
tion: le temps requis pour atteindre la concentration maximale dans l’ef ­
fluent est censé être le temps de rétention moyen (quand le développement du film est à son maximum, le temps de rétention peut s’accroître jusqu’à 
environ 30 minutes).
 
34. On a constaté que ces débits, vitesses et temps donnaient des pourcentages 
d’élimination adéquats (supérieurs à 80 pour cent) de COD (ou DCO) et 
engendraient des effluents nitrifiés. Le débit doit être modifié si l’élimina ­
tion est insuffisante ou s’il y a lieu de simuler le fonctionnement d’une station d’épuration donnée. Dans ce cas, ajuster le débit de dose du 
milieu organique jusqu’à ce que le fonctionnement du réacteur s’aligne 
sur celui de la station d’épuration.
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Inoculation  
35. L’inoculation par exposition à l’air peut suffire à déclencher la croissance 
des micro-organismes lorsqu’on utilise des eaux usées synthétiques, sinon on ajoutera 1 ml/l d’eaux usées décantées à l’alimentation pendant trois 
jours.
 
Mesures  
36. Vérifier à intervalles réguliers que les débits de dose et les vitesses de 
rotation restent dans les limites requises. Mesurer aussi le pH de l’effluent, 
en particulier s’il devrait y avoir une nitrification.  
Échantillonnage et analyse  
37. La méthode, la répartition et la fréquence de l’échantillonnage sont choisies 
en fonction de la finalité de l’essai. Prélever au hasard des échantillons d’eaux à traiter et d’effluents, par exemple, ou récolter des échantillons 
sur une période plus longue, comprise entre trois et six heures, par exemple. 
Durant la première période, à savoir en l’absence de substance d’essai, prélever des échantillons deux fois par semaine. Les échantillons sont filtrés à travers des membranes ou centrifugés à quelque 40 000 m/s
 2 
pendant environ 15 minutes (paragraphe 18). Il peut être nécessaire de 
décanter et/ou de filtrer grossièrement les échantillons avant leur filtration à travers la membrane. Déterminer le COD (ou la DCO) au moins deux fois et, selon les besoins, la DBO, l’ammonium, les nitrites et les nitrates.
 
38. Toutes les analyses doivent être exécutées le plus vite possible après la 
collecte et la préparation des échantillons. Au cas où les analyses doivent 
être différées, conserver les échantillons à environ 4 °C à l’obscurité dans des bouteilles pleines et bouchées hermétiquement. S’il y a lieu de stocker les échantillons pendant plus de 48 heures, les conserver par congélation, 
acidification ou adjonction d’une substance toxique appropriée [par exemple 
20 ml/l d’une solution de chlorure de mercure (II) à 10 g/l]. S’assurer que la technique de conservation n’influence pas les résultats de l’analyse.
 
Période de mise en route  
39. Durant cette période, le biofilm superficiel se développe jusqu’à atteindre 
une épaisseur optimale, ce qui prend normalement environ deux semaines et ne doit pas en dépasser six. L’élimination (paragraphe 44) du COD (ou de la 
DCO) s’accroît et atteint un plateau. Lorsque le plateau présente la même 
valeur dans les deux tubes, sélectionner le tube qui servira de témoin pour le restant de l’essai, au cours duquel leur fonctionnement devra conserver les mêmes caractéristiques..
 
Introduction de la substance d’essai  
40. À ce stade, ajouter la substance d’essai dans l’autre réacteur à la concen ­
tration requise, ordinairement 10 à 20 mg C/l. Le témoin continue de ne 
recevoir que le milieu organique.  
Période d’acclimatation  
41. Poursuivre les analyses bihebdomadaires du COD (ou de la DCO) et, s’il 
faut évaluer la biodégradabilité primaire, mesurer aussi la concentration de 
la substance d’essai par une analyse spécifique. Appliquer une période d’acclimatation d’une à six semaines (ou davantage dans des conditions spéciales) après la première adjonction de la substance d’essai. Lorsque le 
pourcentage d’élimination (paragraphes 43-45) atteint son maximum, déter ­
miner 12 à 15 valeurs valables au cours de la phase plateau sur environ trois semaines, afin d’évaluer le pourcentage d’élimination moyen. L’essai est considéré comme terminé si un degré d’élimination suffisamment élevé a 
été obtenu. L’essai ne doit normalement pas se prolonger au-delà de 12 
semaines après la première introduction de la substance d’essai.
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Détachement du film  
42. Le brusque détachement de grandes quantités de film excédentaire des tubes 
(«sloughing») se produit assez régulièrement. On veillera à ce que ce processus n’altère pas la comparabilité des résultats, en laissant les essais 
couvrir au moins deux cycles complets de croissance et de détachement.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
43. Calculer le pourcentage d’élimination de la substance d’essai en termes de 
COD (ou de DCO) pour chaque évaluation programmée dans le temps à l’aide de la formule suivante:
 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
où: 
D t = pourcentage d’élimination du COD (ou de la DCO) à l’instant t;  
C s = concentration de COD (ou DCO) dans les eaux à traiter due à la 
substance d’essai, estimée de préférence d’après la concentration dans la solution mère et le volume de cette solution ajouté (mg/l);
 
E = COD (ou DCO) mesurés dans les effluents d’essai à l’instant t (mg/l);  
E o = COD (ou DCO) mesurés dans les effluents témoins à l’instant t 
(mg/l).  
Répéter le calcul pour la substance de référence, le cas échéant.  
Résultats du réacteur témoin  
44. Le degré d’élimination du COD ou de la DCO (D  B ) du milieu organique 
dans les réacteurs témoins est utile pour éaluer l’activité de biodégradation 
du biofilm durant l’essai. Calculer le pourcentage d’élimination selon l’équa ­
tion suivante:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
où: 
C m = COD (ou DCO) du milieu organique dans les eaux à traiter témoins 
(mg/l).  
45. Calculer l’élimination (D  ST ) de la substance d’essai, si elle a été mesurée par 
une méthode d’analyse spécifique, à chaque instant d’évaluation à partir de 
l’équation suivante:  
D ST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
où: 
Si = concentration mesurée ou, de préférence, estimée de la substance 
d’essai dans les eaux brutes d’essai (mg/l)  
Se = concentration mesurée de la substance d’essai dans les effluents 
d’essai à l’instant t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 961
 
Si la méthode d’analyse donne une valeur positive dans les eaux usées non 
améliorées équivalente à S  c mg/l, calculer le pourcentage d’élimination 
(D SC ) selon la formule suivante:  
D SC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Expression des résultats de l’essai  
46. Porter sur un graphique les pourcentages d’élimination D  t et D  ST (ou D  SC ), 
s’ils sont disponibles, en fonction du temps (voir appendice 2 du chapitre C.10-A). Prendre la moyenne (arrondie au nombre entier le plus proche) et l’écart-type des 12 à 15 valeurs de D
 T (et de D  ST , le cas échéant) 
obtenue au cours de la phase plateau comme pourcentage d’élimination de la 
substance d’essai. L’allure de la courbe d’élimination permet de tirer certaines conclusions sur les processus d’élimination.
 
Adsorption  
47. Si on observe une élimination substantielle de la substance d’essai en termes 
de COD au début de l’essai, c’est probablement à cause de l’adsorption de 
cette substance sur le biofilm. Il devrait être possible de prouver ce phéno ­
mène en mesurant la substance d’essai adsorbée sur les solides qui se détachent du film. Il est rare que l’élimination du COD de substances 
adsorbables demeure élevée tout au long de l’essai; le degré d’élimination 
est normalement élevé au début, puis décline progressivement jusqu’à une valeur d’équilibre. Si, toutefois, la substance d’essai adsorbée est de nature à acclimater la population de micro-organismes, l’élimination de la substance 
d’essai en termes de COD augmenterait pour atteindre une valeur de plateau 
élevée.
 
Phase de latence  
48. Beaucoup de substances d’essai, comme cela se produit dans les essais de 
sélection statiques, traversent une phase de latence avant que la biodégra ­
dation n’opère à plein régime. Durant la phase de latence, les bactéries 
responsables de la dégradation s’acclimatent ou s’adaptent et n’éliminent presque pas la substance d’essai; ensuite elles commencent à croître. Après l’achèvement de cette phase, on considère de manière arbitraire que 
la phase de dégradation débute lorsque 10 pour cent environ de la quantité 
initiale de la substance d’essai est éliminée (après avoir laissé l’adsorption se produire, le cas échéant). La phase de latence est souvent très variable et peu reproductible.
 
Phase plateau  
49. Le plateau de la courbe d’élimination d’un essai conduit en continu est 
défini comme la phase au cours de laquelle la dégradation est maximale. La phase plateau doit durer au moins trois semaines et être déterminée grosso modo par 12 à 15 valeurs mesurées valables.
 
Degré d’élimination moyen de la substance d’essai  
50. Calculer la moyenne des valeurs d’élimination D  t (et D  ST le cas échéant) de 
la substance d’essai durant la phase plateau. Arrondie au nombre entier le 
plus proche (1 pour cent), elle représente le degré d’élimination de la subs ­
tance d’essai. On recommande également de calculer l’intervalle de confiance à 95 pour cent de la valeur moyenne. Calculer de la même 
manière le degré moyen (D
 B ) d’élimination du milieu organique dans le 
récipient témoin.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 962
 
Indication de la biodégradation  
51. Si la substance d’essai n’est pas adsorbée de façon significative sur le 
biofilm et que la courbe d’élimination présente le profil typique d’une courbe de biodégradation avec phase de latence, dégradation et plateau 
(paragraphes 48, 49), l’élimination mesurée est avec certitude attribuable à 
la biodégradation. Si l’élimination est élevée au début, l’essai de simulation ne permet pas de faire la distinction entre les processus d’élimination biolo ­
giques et non biologiques. Dans ces cas-là, comme dans d’autres où la 
biodégradation suscite des doutes (par exemple si on observe une sépara ­
tion), analyser les substances d’essai adsorbées sur des échantillons du film ou effectuer des essais de biodégradation statiques (de sélection) supplémen ­
taires fondés sur des paramètres qui attestent clairement des processus biolo ­
giques. Il s’agit d’essais reposant sur la consommation d’oxygène (chapitre C.4 de la présente annexe, D, E et F) (9) ou sur la mesure de la production de dioxyde de carbone (chapitre C.4-C de la présente annexe ou méthode de 
l’espace de tête – ou de l’espace tête) (10); il convient d’utiliser comme 
inoculum un biofilm préexposé issu du bioréacteur approprié.
 
52. Si l’élimination du COD et de la substance proprement dite ont été mesu ­
rées, des différences significatives entre les pourcentages observés (le 
premier étant inférieur au second) indiquent que les effluents renferment des produits organiques intermédiaires susceptibles d’être plus difficiles à dégrader; ceux-ci doivent être examinés.
 
Validité des résultats de l’essai  
53. Considérer l’essai comme valable si le degré d’élimination (D  B ) du COD ou 
de la DCO dans les unités témoins est supérieur à 80 pour cent après deux semaines de fonctionnement et qu’aucun phénomène inhabituel n’a été observé.
 
54. Si une substance de référence facilement biodégradable a été mise à l’essai, 
le degré de biodégradation doit être supérieur à 90 pour cent et la différence 
entre des valeurs mesurées en parallèle ne doit pas excéder 5 pour cent. 
Faute de satisfaire à ces deux critères, réexaminer les méthodes expérimen ­
tales et/ou prélever des eaux usées domestiques à une autre source.  
55. De même, les différences de valeurs de biodégradation entre deux unités 
identiques (le cas échéant) traitant une substance d’essai ne doivent pas s’écarter de plus de cinq pour cent. Si ce critère n’est pas rempli, mais que l’élimination est élevée, poursuivre l’analyse pendant trois semaines 
supplémentaires. Si l’élimination est faible, étudier les effets inhibiteurs de 
la substance d’essai, s’ils ne sont pas connus, et recommencer l’essai à une concentration plus basse de la substance d’essai, si c’est possible.
 
Rapport d’essai  
56. Le rapport d’essai doit livrer les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— nature chimique,  
— état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques.  
Conditions d’essai:  
— toute modification du système d’essai, notamment si des substances 
volatiles ou insolubles ont été testées,  
— type de milieu organique,  
— proportion et nature des déchets industriels dans les eaux usées, si cette 
information est pertinente et connue,  
— méthode d’inoculation,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 963
 
— solution mère de la substance d’essai – teneurs en COD (carbone orga ­
nique dissous) et COT (carbone organique total); mode de préparation, 
dans le cas d’une suspension; concentration(s) d’essai utilisée(s), justifi ­
cation des concentrations de COD qui sortiraient de l’intervalle 10-20 mg/l; méthode d’addition; date de la première adjonction; toute variation 
de concentration,
 
— temps de rétention hydraulique moyen (sans croissance); vitesse de rota ­
tion du tube, angle d’inclinaison approximatif, si possible,  
— détails du détachement du biofilm; moment et intensité,  
— température d’essai et gamme de températures,  
— techniques d’analyse employées.  
Résultats de l’essai:  
— toutes les valeurs mesurées: COD, DCO, analyses spécifiques, pH, 
température, composés azotés, le cas échéant,  
— toutes les valeurs calculées de D  t (ou D  tc ), D  B , D s présentées sous forme 
de tableaux et de courbes d’élimination,  
— informations sur les phases de latence et de plateau, durée de l’essai, 
degré d’élimination de la substance d’essai, de la substance de référence (si testée) et du milieu organique (dans l’unité témoin), données statis ­
tiques, conclusions sur la biodégradabilité et validité de l’essai,
 
— examen des résultats.  
BIBLIOGRAPHIE:  
(1) Gerike P., Fischer W., Holtmann W. (1980). Biodegradability determina ­
tions in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
 
(2) Truesdale G.A., Jones K., Vandyke K.G. (1959). Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically 
attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.  
(3) Baumann U., Kuhn G. and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220.  
(4) Gloyna E.F., Comstock R.F., Renn C.E. (1952). Rotary tubes as experi ­
mental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
(5) Kumke G.W., Renn C.E. (1966). LAS removal across an institutional 
trickling filter. JAOCS 43: 92-94.  
(6) Tomlinson T.G., Snaddon D.H.M. (1966). Biological oxidation of sewage 
by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
 
(9) Chapitre C.4 de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité 
«facile», A-F.  
(10) ISO 14593 (1998). Qualité de l’eau – Évaluation en milieu aqueux de la 
biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques. Méthode par 
analyse du carbone inorganique dans des récipients hermétiquement clos 
(Essai au CO  2 dans l’espace de tête).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 964
 
Appendice 8  
Figure 1  
Tubes rotatifs
  
Glossaire  
vue en plan.  
vue A/B.  
roues menées.  
roues folles.  
moteur d’entraînement.  
réducteur.  
bride interne.  
dispositif de basculement.  
couple conique d’entraînement.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 965
 
Figure 2  
Schéma de déroulement
  
A: réservoir.  
B: pompe péristaltique.  
C: tube rotatif.  
D: récipient recueillant les effluents.  
DÉFINITIONS:  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  
Substances chimiques: «il est à noter que le terme “produit chimique” utilisé 
dans les accords de la CNUED et dans les documents ultérieurs comprend les substances, les produits, les mélanges, les préparations et tout autre terme utilisé dans les systèmes actuels pour décrire les produits chimiques visés».
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 966
 
C. 11  BIODÉGRADATION  
BOUES ACTIVÉES; ESSAI D'INHIBITION DE LA RESPIRATION  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
La méthode décrite évalue l'effet d'une substance d'essai sur les 
micro-organismes en mesurant le rythme de respiration dans des conditions déterminées, en présence de différentes concentrations de la substance.
 
L'objectif de cette méthode est de fournir un procédé de sélection 
rapide permettant d'identifier les substances d'essai qui peuvent nuire 
au fonctionnement des installations de traitement biologique aérobie 
et de faire une estimation des concentrations adéquates non inhibi ­
trices des substances d'essai à utiliser dans les expériences de biodé ­
gradabilité.  
Un essai de détermination de l'ordre de grandeur peut précéder l'essai 
plus complet. Il fournit des informations sur la gamme de concen ­
trations à utiliser dans l'essai principal.  
En plus des essais avec la substance étudiée, on effectue deux essais 
témoins, l'un au début et l'autre à la fin de série expérimentale. 
Chaque lot de boue activée doit également être vérifié à l'aide d'une substance de référence.
 
Cette méthode s'applique surtout aux substances qui, en raison de 
leur solubilité dans l'eau et de leur faible volatilité, sont susceptibles de demeurer dans l'eau.
 
Pour les substances dont la solubilité dans le milieu d'essai est limi ­
tée, il peut ne pas être possible de déterminer la CE  50 . 
Les résultats basés sur la consommation d'oxygène peuvent mener à 
des conclusions erronées lorsqu'une substance d'essai a tendance à 
interférer sur la phosphorylation oxydative.  
Il est utile de disposer des informations suivantes pour faire l'essai:  
— solubilité dans l'eau,  
— tension de vapeur,  
— formule de structure,  
— pureté de la substance d'essai.  
Recommandation:  
Les boues activées peuvent contenir des organismes pathogènes et 
doivent être manipulées avec prudence.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Le taux de respiration est la consommation d'oxygène des micro- 
organismes aérobies contenus dans les boues ou dans les eaux usées, 
exprimée généralement en mg 0  2 par milligramme de boue, par 
heure.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 967
 
Pour calculer l'effet inhibiteur d'une substance d'essai, à une concen ­
tration donnée, le taux de respiration est exprimé en pourcentage de 
la moyenne des taux de respiration des deux témoins:  
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ pourcentaged  0 inhibition  
ou: 
R s = taux de consommation de l'oxygène à une concentration 
donnée en substance étudiée,  
Rc 1 = taux de consommation d'oxygène du Témoin C  1 , 
Rc 2 = taux de consommation d'oxygène du témoin C  2 . 
Dans cette méthode, la CE  50 est la concentration de la substance 
d'essai pour laquelle le taux de respiration est égal à 50 % de celui des témoins dans les conditions décrites.
 
1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Il est recommandé d'utiliser comme substance de référence le 3,5- 
dichlorophénol, qui est un inhibiteur connu de la respiration. Pour chaque lot de boue activée, on mesure la CE
 50 de cette substance, 
afin de déterminer si la sensibilité de la boue n'est pas anormale.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
On mesure le taux de respiration d'une boue activée alimentée en une 
quantité donnée d'effluent synthétique après un temps de contact de 
30 minutes ou de 3 heures, ou à ces deux moments. On mesure également dans des conditions identiques le taux de respiration de la même boue activée en présence de la substance d'essai à diffé ­
rentes concentrations. L'effet inhibiteur de la substance d'essai à une 
concentration donnée s'exprime en pourcentage de la valeur moyenne des taux de respiration des deux témoins. À partir des déterminations faites à différentes concentrations, on calcule une valeur de la CE
 50 . 
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
Les résultats sont valables si:  
— les taux de respiration des deux témoins ne différent pas l'un de 
l'autre de plus de 15 %,  
— la CE  50 (30 minutes et/ou 3 heures) du 3,5-dichlorophénol se 
situe dans l'intervalle 5 à 30 mg/l.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Réactifs  
1.6.1.1. S o l u t i o n s d e l a s u b s t a n c e d ' e s s a i  
Des solutions de la substance d'essai sont préparées au début de 
l'essai à partir d'une solution de réserve. Une solution de réserve à 
0,5 g/l convient quand le mode opératoire indiqué ci-dessous est 
suivi.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 968
 
1.6.1.2. S o l u t i o n d e l a s u b s t a n c e d e r é f é r e n c e  
On peut préparer par exemple une solution de 3,5-dichlorophénol en 
dissolvant 0,5 g de 3,5-dichlorophénol dans 10 ml de 1M NaOH, en diluant à 30 ml à l'eau distillée, en ajoutant, tout en agitant, du 0,5M 
H
 2 SO 4 jusqu'au point où la précipitation commence — environ 8 ml 
sont nécessaires — et, enfin, en diluant à 1 litre avec de l'eau distillée. Le pH devrait alors être compris dans l'intervalle 7 à 8.
 
1.6.1.3. E f f l u e n t s y n t h é t i q u e  
On prépare un effluent synthétique en dissolvant les quantités 
suivantes de substance dans 1 litre d'eau:  
— 16 g de peptone,  
— 11g d'extrait de viande,  
— 3 g d'urée,  
— 0,7 g de NaCl,  
— 0,4g de CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g de MgSO  4 .7H  2 0, 
— 2,8 g de K  2 HP0  4 . 
Note 1:  Cet effluent synthétique est 100 fois plus concentré que celui 
décrit dans le rapport technique de l'OCDE «Méthode proposée pour la détermination de la biodégradabilité des agents tensio-actifs utilisés dans les détergents synthétiques» du 11 juin 1976, et contient 
en outre de l'hydrogénophosphate de potassium.
 
Note 2:  Si le milieu ainsi préparé n'est pas immédiatement utilisé, il 
sera stocké à l'obscurité, entre 0 et 4  o C pendant une durée maximale 
d'une semaine, dans des conditions qui ne conduiront à aucun chan ­
gement en ce qui concerne sa composition. Le milieu peut aussi être 
stérilisé avant son stockage, ou bien la peptone et l'extrait de viande 
peuvent être ajoutés immédiatement avant le début de l'essai. Avant son emploi, le milieu sera agité avec soin et son pH sera ajusté.
 
1.6.2.  Équipement  
Appareil de mesure: aucune prescription n'est fournie à ce sujet. 
Toutefois, il faut veiller à ce qu'il n'y ait pas de volume libre au- dessus du liquide et à ce que l'électrode s'adapte parfaitement au 
récipient.
 
Un équipement normal de laboratoire et notamment les articles 
suivants sont nécessaires:  
— appareil de mesure,  
— dispositif d'aération,  
— électrode et appareil de mesure pour le pH,  
— électrode à oxygène.  
1.6.3.  Préparation de l'inoculum  
Comme inoculum pour l'essai, on utilise de la boue activée prove ­
nant d'une installation de traitement des eaux usées traitant un effluent à dominance domestique.
 
En cas de nécessité, à l'arrivée au laboratoire, les grosses particules 
pourront être éliminées par sédimentation pendant une courte période, par exemple pendant 15 minutes, puis par décantation des 
particules fines de la couche supérieure. Comme solution alternative, 
la boue peut être agitée quelques secondes au moyen d'un mixeur.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 969
 
Si des produits inhibiteurs sont présents la boue peut être lavée avec 
de l'eau du robinet ou avec la solution isotonique. Après centrifuga ­
tion, le surnageant est décanté (cette manipulation est répétée 3 fois).  
Une petite quantité de boue est pesée et séchée. À partir de ce 
résultat, il est possible de déterminer la quantité de boue humide 
qui doit être mise en suspension dans l'eau dans le but d'obtenir une boue activée renfermant 2 à 4 g/l de matières en suspension. Cette concentration permet d'obtenir une teneur en matières en 
suspension comprise entre 0,8 et 1,6 g/l dans le milieu d'essai, si 
le protocole expérimental recommandé est appliqué.
 
Si la boue ne peut être utilisée le jour même de sa collecte, on ajoute 
50 ml d'effluent synthétique à chaque litre de boue activée préparée de la façon décrite ci-dessus; elle est ensuite aérée toute la nuit à 20
 o C ± 2  o C. Elle est alors conservée sous aération en vue de son 
emploi dans la journée. Avant de l'utiliser, on vérifie le pH et, si 
nécessaire, on l'ajuste de façon à atteindre un pH se situant entre 6,0 et 8,0. La teneur en matière en suspension du mélange peut être déterminée selon la méthode décrite dans le précédent paragraphe.
 
Si l'on doit utiliser le même lot de boue pendant plusieurs jours 
consécutifs (4 au maximum), on ajoute un autre volume de S0 ml d'effluent synthétique par litre de boue à la fin de chaque jour de 
travail.
 
1.6.4.  Exécution de l'essai  
Durée/temps de contact: 30 minutes et/ou 3 heures, pendant 
lesquelles le milieu d'essai est aéré 
Eau: Eau potable (déchlorurée, si nécessaire) Apport d'air: Air propre, exempt d'huile. Débit d'air 
de 0,5 à 1 litre par minute 
Appareil de mesure: Fiole a fond plat du type DBO 
Mesure de l'oxygène: Électrode à oxygène adéquate, avec 
enregistrement 
Solution nutritive: Effluent synthétique (voir ci-dessus) 
Substance d'essai: Préparée au début de l'essai Substance de référence: Par exemple 3,5-dichIorophénol (au 
moins 3 concentrations) 
Témoins: Échantillon inoculé, sans substance 
d'essai 
Température: 20
 o C ± 2  o C 
On trouvera ci-après une méthode expérimentale pouvant être appli ­
quée à la fois pour la substance d'essai et pour la substance de référence pendant une période de 3 heures:
 
On utilise plusieurs récipients (par exemple béchers d'un litre). On 
peut utiliser au moins 5 concentrations croissantes, selon une 
progression de raison n'excédant pas 3,2.  
Au temps «O», on verse 16 ml d'effluent synthétique dans un verre 
cylindrique graduée de 500 ml et l'on complète à 300 ml avec de 
l'eau. On ajoute 200 ml d'inoculum bactérien et l'on verse l'ensemble 
du mélange dans le premier récipient (premier témoin C  1 ). ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 970
 
Les récipients d'essai doivent être aérés en continu de façon à être 
certain que les concentrations en oxygène dissout ne seront pas infé ­
rieures à 2,5 mg/l et qu'immédiatement avant détermination du taux de respiration, la concentration en oxygène dissout sera au moins égale à 6,5 mg/l.
 
Au temps «15 minutes» (15 minutes représentant un intervalle de 
temps arbitraire, mais commode), on répète l'opération précédente, 
sauf que l'on ajoute 100 ml de la solution de réserve de la subs ­
tance d'essai aux 16 ml d'effluent synthétique avant de procéder à l'addition d'eau jusqu'à 300 ml et d'inoculum jusqu'à 500 ml. Ce mélange est ensuite versé dans le deuxième récipient, puis aéré 
comme ci-dessus. On recommence cette opération toutes les 
15 minutes avec différents volumes de la solution de réserve de la substance d'essai, afin d'obtenir une série de récipients avec des concentrations différentes en substance d'essai. Enfin, on prépare 
un deuxième témoin (C
 2 ). 
Au bout de trois heures, on mesure et note le pH; un échantillon 
homogène du contenu du premier récipient est versé dans l'appareil 
de mesure et le taux de respiration est mesuré pendant une période allant jusqu'à 10 minutes.
 
Cette détermination est répétée sur le contenu de chaque récipient à 
des intervalles de 15 minutes, de manière à obtenir un temps de contact de 3 heures pour chaque récipient.
 
La substance de référence est testée de la même façon sur chaque lot 
d'inoculum bactérien.  
Une organisation différente (par exemple plus d'un appareil de 
mesure d'oxygène) est nécessaire, si les mesures doivent être faites 
après un contact de 30 minutes.  
S'il est nécessaire de mesurer la consommation chimique en 
oxygène, on ajoute des récipients supplémentaires contenant la 
substance d'essai, l'effluent synthétique, de l'eau, mais pas de boue activée.
 
La consommation d'oxygène est mesurée et enregistrée après un 
temps d'aération de 30 minutes et/ou de 3 heures (temps de contact).  
2. TRAITEMENT ET ÉVALUATION DES DONNÉES  
Le taux de respiration est calculé à partir du tracé de l'enregistreur en 
mg 0  2 /l.h pour les concentrations comprises approximativement entre 
6,5 mg de 0  2 /l et 2,5 mg de 0  2 /l, ou pendant une période de dix 
minutes quand le taux de respiration est faible. La partie de la courbe 
à partir de laquelle on mesure le taux de respiration doit être linéaire.  
Si les taux de respiration des deux témoins diffèrent l'un de l'autre de 
plus de 15 % ou si la CE  50 (30 minutes et/ou 3 heures) de la subs ­
tance de référence n'est pas dans l'intervalle requis (5 à 30 mg/l pour le 3,5-dichlorophénol), l'essai n'est pas valable et doit être recom ­
mencé.
 
Le pourcentage d'inhibition est calculé pour chaque concentration 
d'essai (voir 1.2). On porte le pourcentage d'inhibition en fonction 
de la concentration sur du papier log-normal (ou log-probabilité) et 
on en déduit une valeur de la CE  50 . 
Des limites de confiance à 95 % pour les valeurs de la CE  50 peuvent 
être déterminées par application de méthodes normalement utilisées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 971
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible les renseignements 
suivants:  
— substance d'essai: données permettant son identification,  
— système d'essai: origine, concentration et traitement préalable 
éventuel de la boue activée,  
— conditions d'essai:  
— pH du mélange avant mesure de la consommation d'oxygène,  
— température d'essai,  
— durée de l'essai,  
— substance de référence et CE  50 mesurée,  
— consommation chimique d'oxygène (s'il y a lieu),  
— résultats:  
— toutes les données obtenues,  
— courbe d'inhibition et méthode de calcul de la CE  50 , 
— CE  50 et, si possible, limites de confiance à 95 %, CE  20 et 
CE 50 ,, 
— toutes les observations et tous les écarts par rapport à la 
méthode d'essai qui auraient pu influencer les résultats.  
3.2. INTERPRÉTATION DES DONNÉES  
La valeur de la CE  50 doit simplement être considérée comme une 
indication de la toxicité probable de la substance d'essai pour le 
traitement des eaux usées par des boues activées ou pour les micro-organismes des eaux usées. En effet, les interactions complexes qui se produisent dans l'environnement ne peuvent pas 
être simulées avec précision dans un essai de laboratoire. En outre, 
les substances testées qui pourraient avoir des effets inhibiteurs sur l'oxydation de l'ammoniaque peuvent fournir des courbes d'inhibition atypiques. En conséquence, de telles courbes doivent être interprétées 
avec précaution.
 
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) International Standard ISO 8192-1986.  
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11,1977, p. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, 
p. 245.  
(4) ETAD (Ecological and Tox.icological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries), Recommended Method n  o 103, also 
described by:  
(5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, p. 80.  
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6,1977, p. 247.  
(7) OECD, Paris, 1981, Ligne directrice 209, décision du Conseil 
C(84) 30 final.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 972
 
C. 12.  BIODÉGRADATION  
TEST S.C.A.S. MODIFIÉ  
1. MÉTHODE  
1.1. INTRODUCTION  
Le but de la méthode est de mesurer la biodégradabilité totale poten ­
tielle de composés organiques non volatils et solubles dans l'eau, lorsqu'ils sont exposés à des concentrations relativement élevées de micro-organismes pendant une longue période. La viabilité des 
micro-organismes est maintenue tout au long de cette période par 
un apport journalier d'eaux résiduaires décantées. (Pendant le week- end, les eaux résiduaires peuvent être stockées à 4
 o C. Les eaux 
résiduaires synthétiques de l'essai de confirmation de l'OCDE 
peuvent également être utilisées.)  
Une adsorption physico-chimique sur les particules solides en 
suspension peut se produire et doit être prise en considération lors 
de l'interprétation des résultats (voir 3.2).  
Étant donné la longue période de rétention de la phase aqueuse (36 
heures) et l'ajout régulier de substances nutritives, l'essai n'est pas une simulation des conditions rencontrées dans une station d'épura ­
tion des eaux usées. Les résultats obtenus avec diverses substances 
d'essai indiquent que cet essai a un potentiel élevé de biodégradation.
 
Les conditions dans lesquelles se déroule l'essai facilitent la sélection 
et/ou l'acclimatation de micro-organismes susceptibles de dégrader la 
solution d'essai (la procédure peut également être utilisée en vue de préparer un inoculum acclimaté pour d'autres essais).
 
Dans cette méthode, on mesure la concentration de carbone orga ­
nique dissous (COD) pour évaluer la biodégradabilité finale des 
substances d'essai. Il est préférable de déterminer le COD après acidification et purge plutôt qu'en établissant la différence C
 total —C  minéral  . 
Le recours simultané à une analyse spécifique permet de déterminer 
la biodégradabilité primaire de la substance (disparition de la struc ­
ture chimique initiale).  
La méthode n'est applicable qu'aux substances organiques qui, à la 
concentration d'essai:  
— sont solubles dans l'eau (au moins 20 mg de COD par litre),  
— ont une pression de vapeur négligeable,  
— n'ont pas d'effet inhibiteur vis-à-vis des bactéries,  
— ne font pas l'objet d'une adsorption importante au cours de l'essai,  
— ne sont pas éliminées par moussage de la solution d'essai.  
La teneur en carbone organique de la substance d'essai doit être 
déterminée.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 973
 
Il est utile de connaître les proportions relatives des principaux 
éléments constitutifs de la substance d'essai pour interpréter les résul ­
tats obtenus, notamment lorsque ceux-ci sont peu élevés ou margi ­
naux.  
Il est souhaitable de connaître le seuil de toxicité de la substance vis- 
à-vis des micro-organismes pour interpréter les résultats peu élevés et 
pour choisir les concentrations d'essai appropriées.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
C T = concentration de la substance d'essai en carbone organique 
contenu dans ou ajouté à l'effluent décanté au début de la période d'aération (mg par litre)
 
C t = concentration en COD du liquide surnageant de la substance 
d'essai à la fin de la période d'aération (mg par litre)  
C c = concentration en COD du liquide surnageant du témoin à la 
fin de la période d'aération (mg par litre)  
Dans cette méthode, la biodégradation est déterminée par la dispari ­
tion du carbone organique. La dégradation biotique peut être exprimée en:
 
1) pourcentage d'élimination de D  da de l'apport journalier de la subs ­
tance:  
D da ¼ C T Ä ðC t Ä C c Þ 
C T Ü 100 (1) 
où: 
D da = dégradation/apport journalier;  
2) pourcentage d'élimination des substances présentes en début de 
journée:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2(a)] 
¼ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2(b)]  
où: 
D ssd = dégradation/substance en début de journée.  
Les facteurs i et (i + 1) se réfèrent au jour où la mesure a été 
effectuée.  
Il est recommandé d'utiliser l'équation 2(a) si l'effluent COD varie 
d'un jour à l'autre et l'équation 2(b) lorsque l'effluent COD reste 
relativement constant d'un jour à l'autre.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 974
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Quand on étudie une nouvelle substance, les produits de référence 
peuvent parfois se révéler utiles; on ne peut cependant pas encore recommander de produits de référence particuliers.
 
Il est fait mention de données relatives à plusieurs composés qui ont 
fait l'objet d'essais d'intercomparaison (voir appendice 1), notamment 
pour pouvoir procéder à l'étalonnage périodique de la méthode et pour permettre de comparer des résultats obtenus par une autre méthode.
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
Placer des boues activées provenant d'une station d'épuration des 
eaux usées dans une unité de traitement de boue activée à alimen ­
tation semi-continue (SCAS). Ajouter la substance d'essai et des eaux 
domestiques décantées et aérer le mélange pendant 23 heures. Arrêter ensuite l'aération, mettre la boue à décanter et retirer le liquide surnageant.
 
Puis, mélanger les boues restées dans l'aérateur à une autre partie 
aliquote de substance d'essai et d'eaux résiduaires et répéter le cycle.  
La biodégradabilité est mesurée en déterminant la teneur en carbone 
organique dissous du liquide surnageant. Cette valeur est comparée à 
celle du liquide provenant d'un témoin alimenté uniquement avec des eaux domestiques décantées.
 
Lorsqu'on effectue une analyse spécifique, la modification de la 
concentration de la molécule mère en fonction de la biodégradabilité 
peut être mesurée (biodégradation primaire).  
1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ  
La reproductibilité de cette méthode basée sur l'élimination de COD 
n'a pas encore été établie (en ce qui concerne la biodégradation 
primaire, on obtient des données très précises pour les substances qui sont fortement dégradées).
 
La sensibilité de la méthode est en grande partie conditionnée par la 
variabilité du témoin et, dans une moindre mesure, par la précision 
de la détermination de COD et par la concentration de la substance 
d'essai dans le liquide au début de chaque cycle.  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.6.1.  Préparations  
Réunir un nombre suffisant d'unités d'aération (l'unité d'essai SCAS 
de 1,5 litre peut également être utilisée) et de tuyaux d'aération (figure 1) pour chaque substance d'essai et de référence. L'air 
comprimé fourni aux unités d'essai, nettoyées au moyen d'un filtre 
de coton hydrophile, ne doit pas contenir de carbone organique et doit être saturé préalablement à l'eau pour réduire les pertes dues à l'évaporation.
 
Prélever un échantillon de liqueur mixte, contenant de 1 à 4 
grammes de solides en suspension par litre dans une station d'épu ­
ration de boues activées traitant plus particulièrement les eaux ména ­
gères. Prévoir environ 150 ml de liqueur mixte par aérateur.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 975
 
Préparer la solution mère de la substance d'essai dans de l'eau distil ­
lée; la concentration normalement requise est de 400 mg/l de carbone 
organique, ce qui donne une concentration en carbone de la subs ­
tance d'essai de 20 mg/l au début de chaque cycle d'aération s'il n'y a pas de biodégradation.
 
Des concentrations plus élevées peuvent être utilisées si la toxicité 
vis-à-vis des micro-organismes le permet.  
On mesure la teneur en carbone organique de la solution mère.  
1.6.2.  Mode opératoire  
L'essai doit être effectué à une température comprise entre 20 et 
25 o C. 
Utiliser une concentration élevée de micro-organismes aérobies (de 1 
à 4 g/l de matières en suspension) et respecter une période de réten ­
tion effective de 36 heures. Largement oxyder les substances carbo ­
nées dans l'effluent d'alimentation, normalement pendant une période de 8 heures suivant le début de chaque cycle d'aération. Laisser ensuite respirer la boue en façon endogène pendant le reste de la 
période d'aération. Le seul substrat disponible est la substance d'es ­
sai, à moins qu'elle n'ait été également métabolisée. Ces conditions, combinées à une réinoculation journalière de l'essai lorsque des eaux domestiques sont utilisées comme milieu, sont extrêmement favora ­
bles à l'acclimatation et à une biodégradation rapide.
 
1.6.3.  Réalisation de l'essai  
Prélever un échantillon de liqueur mixte dans une station d'épuration 
de boues activées traitant plus particulièrement les eaux domestiques 
ou dans une unité de laboratoire et le maintenir en aérobiose jusqu'à son utilisation en laboratoire. Chaque aérateur ainsi que l'unité de référence sont remplis avec 150 ml (en cas d'utilisation de l'unité 
d'essai SCAS originelle, il faut multiplier les volumes donnés par 10) 
de liqueur mixte et l'aération commence. Après 23 heures, l'aération est arrêtée et on laisse reposer les boues pendant 45 minutes. Ouvrir un à un les robinets de chaque récipient et retirer 100 ml du liquide 
surnageant. Prélever un échantillon des eaux domestiques décantées 
immédiatement avant l'utilisation et ajouter 100 ml aux boues demeurant dans chaque aérateur. L'aération est répétée. À ce stade, ne plus ajouter aucune substance d'essai et alimenter journellement 
les unités avec des eaux ménagères jusqu'à l'obtention d'un liquide 
surnageant limpide lors de la précipitation. Cette opération prend normalement deux semaines. À ce moment, le COD dans le liquide surnageant à la fin de chaque cycle d'aération tend vers 
une valeur constante.
 
À la fin de cette période, mélanger les boues décantées individuel ­
lement et ajouter 50 ml de boues composites à chaque unité.  
Ajouter 95 ml d'eaux résiduaires décantées et 5 ml d'eau aux unités 
de référence et 95 m) d'eaux résiduaires décantées et 5 ml de solu ­
tion mère de la substance d'essai appropriée (400 mg par litre) aux unités d'essai. Procéder à une nouvelle aération pendant 23 heures. 
Laisser les boues décanter pendant 45 minutes, retirer le liquide 
surnageant et l'analyser pour déterminer sa teneur en COD.
 
Cette procédure de prélèvement et de remplissage décrite ci dessus 
est répétée tous les jours pendant la période de l'essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 976
 
Avant la décantation, il peut s'avérer nécessaire de nettoyer les parois 
des unités afin d'empêcher l'accumulation de solides au-dessus du 
niveau du liquide. Pour nettoyer chaque unité, un hérisson ou une brosse séparée sont utilisés afin d'empêcher la contamination croisée.
 
Théoriquement, il faudrait déterminer journellement le COD dans les 
liquides surnageants, mais des analyses moins fréquentes sont auto ­
risées. Avant d'être analysées, les liqueurs doivent être filtrées sur 
une membrane de 0,45 μm ou centrifugées. Les membranes filtrantes 
conviennent s'il a été prouvé qu'elles ne libèrent pas de carbone et qu'elles n'absorbent pas la substance d'essai au cours de la filtration. La température de l'échantillon ne doit pas dépasser 40
 o C lorsqu'il 
se trouve dans la centrifugeuse.  
La durée de l'essai pour les composés peu ou non biodégradables est 
indéterminée, mais l'expérience démontre qu'il faut compter au moins 
12 semaines et qu'il ne faut pas dépasser 26 semaines.  
2. DONNÉES ET ÉVALUATION  
La courbe de la teneur en COD des liquides surnageants des unités 
d'essai et des unités de référence est établie en fonction du temps.  
Lorsque la biodégradation est terminée, le niveau constaté dans la 
substance d'essai est voisin de celui du témoin. Lorsque la différence 
entre ces deux niveaux ne varie plus sur trois mesures consécutives, il suffit alors d'obtenir un nombre de mesures complémentaires suffi ­
santes pour permettre l'analyse statistique des données et de calculer 
le pourcentage de biodégradation de la substance d'essai (D
 da ou 
D ssd : voir 1.2).  
3. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS  
3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI  
Le procès-verbal d'essai contiendra si possible:  
— toutes les informations relatives à la nature des eaux résiduaires, 
au type d'unité utilisé et aux résultats expérimentaux concernant la substance d'essai, a la substance de référence s'il y a lieu et au témoin,
 
— la température,  
— la courbe de disparition avec description, mode de calcul 
(voir 1.2),  
— la date et l'endroit du prélèvement des échantillons de boues 
activées et d'eaux résiduaires, le degré d'acclimatation, de concentration etc.,
 
— les raisons scientifiques de toute modification du mode opéra ­
toire,  
— la signature et la date.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 977
 
3.2. INTERPRETATION DES RESULTATS  
Étant donné que, en l'occurrence, la substance d'essai n'est pas faci ­
lement biodégradable, toute disparition de COD due uniquement à la biodégradation devrait se faire graduellement sur une période de 
quelques jours ou de quelques semaines, sauf dans les cas où l'ac ­
climatation est soudaine, ce qui se traduit par une brusque disparition après quelques semaines.
 
Toutefois, l'adsorption physico-chimique peut parfois jouer un rôle 
important; cela se manifeste par la disparition partielle ou complète 
du COD ajouté au départ. Ce qui se passe ultérieurement dépend de facteurs tels que les degrés d'adsorption et de concentration des solides en suspension dans l'effluent écarté. Généralement, la diffé ­
rence de concentration en COD dans les liquides surnageants d'essai 
et de référence augmente graduellement à partir d'une valeur initiale peu élevée et se maintient au niveau de la nouvelle valeur pour la durée restante de l'expérience, à moins qu'une acclimatation n'inter ­
vienne.
 
Pour distinguer la biodégradation (ou la biodégradation partielle) de 
l'adsorption, il faut procéder à d'autres essais. Il existe plusieurs méthodes mais la plus probante consiste à utiliser les liquides surnageants ou les boues comme inoculum dans un test du dossier 
de base (de préférence un test respirométrique).
 
Les substances d'essai faisant disparaître de grandes quantités de 
COD sans adsorption doivent être considérées comme potentielle ­
ment biodégradables. Une disparition partielle, qui n'est pas due à 
l'adsorption, indique que le produit est susceptible de se dégrader 
partiellement.  
Des disparitions de COD peu importantes ou nulles peuvent être 
dues à l'inhibition de micro-organismes par des substances d'essai, ce qui peut également se traduire par lyses et perte de boues; dans ce 
cas, les liquides surnageants sont troubles. Le test doit alors être 
répété en utilisant une concentration moins élevée de substances d'essai.
 
L'utilisation d'une analyse spécifique ou d'une substance d'essai 
marquée au  14 C peut permettre une plus grande sensibilité. Dans le 
cas d'un composé d'essai marqué au  14 C, la récupération de  14 C0 2 
confirmera la biodégradation.  
Lorsque les résultats sont également exprimés en termes de biodé ­
gradation primaire, il convient de donner, dans la mesure du 
possible, des explications sur les modifications intervenues dans les 
structures chimiques aboutissant au défaut de réponse de la substance d'essai mère.
 
La validation de l'analyse doit être indiquée avec! e résultat obtenu 
dans le milieu de l'essai témoin.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
(1) OCDE, Paris, Lignes directrices 302 A, décision du Conseil 
C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 978
 
Appendice 1  
Test S.C.A.S.: exemple de résultats  
Substance C T 
(mg/l) C t — C  c 
(mg/l) Pourcentage 
biodégradation 
D da Durée de l'essai 
(jours)  
4-acétyl aminobenzène sulphonate 17,2 2,0 85 40 
Tetra propylène benzène sulphonate 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrophénol 16,9 0,8 95,3 40 
Diéthylène glycol 16,5 0,2 98,8 40 
Aniline 16,9 1,7 95,9 40 Cyclopentane tétra carboxylate 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 979
 
Appendice 2  
Exemple d'appareil d'essai
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 980
 
C.13  BIOCONCENTRATION: ESSAI AVEC RENOUVELLEMENT 
CONTINU SUR LES POISSONS  
1. MÉTHODE  
La présente méthode de bioconcentration reproduit les directives 
OECD TG 305 (1996).  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode décrit une procédure de caractérisation du 
potentiel de bioconcentration dans le cas de poissons soumis à un 
renouvellement continu de certaines substances. Les régimes d'essais avec renouvellement continu seront très largement préférés, mais des régimes semi-statiques sont également acceptables dans la mesure où 
les critères de validité sont satisfaits.
 
La méthode donne toutes informations nécessaires à l'exécution de 
fessai mais laisse les libertés indispensables à l'adaptation du concept 
expérimental aux conditions spécifiques de chaque laboratoire et 
n'impose pas strictement les caractéristiques des substances à tester. Elle convient particulièrement bien aux produits organiques 
stables dont les valeurs log P
 ow sont comprises entre 1,5 et 6,0 (1) 
mais reste applicable aux substances superlipophiles (log P  ow > 6,0). 
Pour ces dernières, l'estimation préalable du facteur de bioconcen ­
tration (BCF), parfois dénommé K  B , sera vraisemblablement supé ­
rieure à la valeur du facteur de bioconcentration à l'état stable 
(BCF  SS ) auquel on peut s'attendre dans une expérience de labora ­
toire. Les évaluations préliminaires du facteur de bioconcentration des produits organiques dont les valeurs log P
 ow vont jusqu'à 9,0 
environ sont calculables à l'aide de l'équation de Bintein et al (2). Le 
potentiel de bioconcentration se caractérise par certains paramètres, dont la constante de vitesse d'absorption (k
 1 ), la constante de vitesse 
d'élimination (k  2 ) et le BCF  SS . 
Les substances d'essai radiomarquées peuvent faciliter l'analyse des 
échantillons d'eau et de poissons et peuvent aussi servir à définir s'il 
est souhaitable d'identifier et quantifier la dégradation. Si les résidus 
radioactifs totaux sont mesurés (par exemple par combustion ou solubilisation des tissus), le BCF est basé sur le composé d'origine, tous les métabolites retenus ainsi que le carbone assimilé. Les BCF 
basés sur les résidus radioactifs totaux ne peuvent donc pas être 
directement comparables à un BCF dérivé d'une analyse chimique particulière du composé d'origine seul.
 
On pourra mettre en œuvre des procédures d'assainissement dans les 
études radiomarquées pour déterminer le BCF sur ta base du composé d'origine et les principaux métabolites seront déterminés si on le juge nécessaire. Il est possible aussi de combiner une 
étude du métabolisme du poisson avec une étude de bioconcentration 
par analyse et identification des résidus tissulaires.
 
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Bioconcentration/Bioaccumulation: augmentation de la concentration 
de la substance à tester dans ou sur un organisme (des tissus spéci ­
fiques de celui-ci) par rapport à la concentration de cette substance dans le milieu ambiant.
 
Facteur de bioconcentration (BCF ou K  b ): à tout moment pendant la 
phase d'absorption de l'essai d'accumulation, concentration de la substance à tester dans/sur le poisson, ou des tissus déterminés de 
celui-ci, [C
 t en μg/g (ppm)] divisée par la concentration de la subs ­
tance chimique dans le milieu ambiant [C  w en μg/ml (ppm)].  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 981
 
Facteur de bioconcentration à l'état stable (BCF  SS ou K  b ): il ne 
change pas notablement pendant un laps de temps prolongé, la 
concentration de la substance d'essai dans le milieu ambiant étant constante pendant cette même période.
 
Plateau ou état stable; sur la représentation graphique de la substance 
d'essai dans le poisson (C  t ) en fonction du temps, il est atteint 
lorsque la courbe devient parallèle à l'axe du temps et que trois 
analyses successives du C  f réalisées sur des échantillons prélevés à 
des intervalles de deux jours au moins restent dans une plage de 20 % les unes des autres, et qu'il n'y a pas de différences significa ­
tives entre les trois périodes d'échantillonnage. Lorsqu'on analyse des 
échantillons mis en commun, il faut procéder à quatre analyses successives au moins. Si les substances d'essais ont des caractéris ­
tiques d'absorption lentes, on optera de préférence pour des inter ­
valles hebdomadaires.
 
Facteurs de bioconcentration: calculés directement à partir des 
constantes cinétiques (k  l /k 2 ) on les appelle facteurs de concentration 
cinétique, BCF  k . 
Coefficient de partage octanol-eau (P  ow) : rapport de la solubilité d'un 
produit chimique dans le n-octanol et dans l'eau, à l'équilibre 
(Méthode A.8), également désigné par K  ow . Le logarithme de P  ow 
indique le potentiel de bioconcentration d'un produit chimique par les 
organismes aquatiques.  
Phase d'exposition ou d'absorption: temps pendant lequel les pois ­
sons sont exposés au produit chimique teste.  
Constante de vitesse d'absorption (k  1 ): valeur numérique définissant la 
vitesse d'accroissement de la concentration dans la substance à tester 
dans/sur le poisson (ou des tissus spécifiques de celui-ci) lorsqu'il est exposé à ce produit chimique (k
 1 est exprimé en jours –  1 ). 
Phase de post-exposition ou d'élimination (perte), à la suite du trans ­
fert des poissons d'un milieu contenant la substance à tester à un 
milieu exempt de celle-ci, temps pendant lequel l'élimination (ou 
perte nette) de la substance par les poissons de l'essai (ou les tissus spécifiques) est étudiée.
 
Constante de vitesse d'élimination (perte) (k  2 : valeur numérique défi ­
nissant la vitesse de diminution de la concentration de la substance à 
tester dans les poissons de l'essai (ou les tissus spécifiques) à la suite de leur transfert d'un milieu contenant la substance à tester à un milieu qui en est exempt (k
 2 exprimé en jours –  1 ). 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
L'essai se décompose en deux phases: la phase d'exposition (absorp ­
tion) et de post-exposition (élimination). Pendant la phase d'absorp ­
tion, des groupes distincts de poissons d'une espèce sont exposés à 
au moins deux concentrations de la substance d'essai. Puis ils sont transférés dans un milieu exempt de cette substance, pour la phase d'élimination. Cette dernière est toujours nécessaire sauf lorsque l'ab ­
sorption de la substance pendant la phase d'absorption a été insigni ­
fiante (par exemple si le BCF est inférieur à 10). La concentration de la substance à tester dans/sur le poisson (ou des tissus spécifiques) est suivie pendant les deux phases de l'essai. Outre les deux concen ­
trations de l'essai, un groupe témoin de poissons est maintenu dans 
des conditions identiques hormis la substance à tester, qui est absente. Ceci pour établir les éventuelles relations entre les effets néfastes observés dans le test de bioconcentration et ce groupe 
témoin assorti, et déduire les concentrations de fond de la substance 
à tester.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 982
 
La phase d'absorption dure 28 jours sauf s'il est démontré que l'équi ­
libre a été atteint plus tôt. On peut prévoir la durée de la phase 
d'absorption et le temps nécessaire à l'obtention de l'état stable grâce à l'équation donnée à l'annexe 3- La période de dépuration commence alors par le transfert des poissons dans un autre récipient 
propre contenant le même milieu, exempt cette fois de la substance à 
tester. Lorsque cela est possible, on calcule le facteur de bioconcen ­
tration de préférence à la fois en tant que rapport (BCF
 ss ) de concen ­
tration des poissons (C  f ) et dans l'eau (C .) à l'état d'équilibre appa ­
rent et en tant que facteur de bioconcentration cinétique; et BCF  k en 
tant que rapport des constantes de vitesse d'absorption (k  1 ) et de 
dépuration (k  2 ), en supposant une cinétique de premier ordre. Si, à 
l'évidence, on n'entre pas dans une cinétique de premier ordre, des 
modèles plus complexes devront être mis en œuvre (annexe 5).  
Si l'on ne parvient pas à un état stable dans les 28 jours, la phase 
d'absorption sera prolongée jusqu'à cet état stable, ou bien pendant 
60 jours, l'alternative la plus courte prévalant; puis commence la phase d'élimination.
 
La constante de vitesse d'absorption, la constante de vitesse de dépu ­
ration (perte) (ou les constantes, lorsque des modèles plus complexes 
entrent en jeu), le facteur de bioconcentration et, si possible, les 
limites de confiance de chacun de ces paramètres, sont calculés à partir du modèle décrivant le plus fidèlement les mesures de concen ­
trations de la substance à tester dans les poissons et l'eau.
 
Le BCF est exprimé en fonction du poids frais total du poisson. 
Cependant, pour certaines études, des tissus ou organes spécifiques 
(par exemple muscles, foie) peuvent être utilisés si les poissons sont suffisamment gros ou s'il est possible d'en séparer les parties comes ­
tibles (filets) et non comestibles (viscères). La relation claire liant le 
potentiel de bioconcentration et la lipophilie pour de nombreuses 
substances organiques, entraîne une relation correspondante entre la teneur en lipides des poissons de l'essai et des bioconcentrations observées de ces substances. Donc, pour réduire cette source de 
variabilité dans les résultats des essais concernant les substances à 
forte lipophilie (c'est-à-dire ayant un log P
 ow > 3), la bioconcentra ­
tion devrait être exprimée en fonction de la masse corporelle totale, mais aussi de la teneur lipidique.
 
La teneur lipidique sera établie si possible sur les mêmes matériels 
biologiques qui auront servi à déterminer la concentration de la 
substance à tester.  
1.4. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Avant d'entreprendre l'essai de bioconcentration, les informations 
suivantes devront être réunies au sujet de la substance à tester:  
a) solubilité dans l'eau;  
b) coefficient de partage octanol-eau P  ow , (noté également K  ow , 
déterminé par une méthode HPLC en A.8);  
c) hydrolyse;  
d) caractéristiques de la phototransformation dans l'eau sous rayon ­
nement solaire ou solaire artificiel et dans les conditions de 
rayonnement de l'essai de bioconcentration (3),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 983
 
e) tension superficielle (c'est-à-dire pour les substances dont le log 
P ow ne peut être établi;  
f) pression de vapeur;  
g) biodégradabilité dite «facile» (le cas échéant).  
Il faudra aussi connaître la toxicité relative à l'espèce de poissons 
utilisée dans l'essai, de préférence la LC  50 à l'asymptote (c'est-à-dire 
indépendante du temps). Il est indispensable de disposer d'une méthode analytique correcte, d'une exactitude, d'une précision et d'une sensibilité connues pour la quantification de la substance à 
tester dans les solutions d'essai et dans le matériel biologique, 
ainsi que d'informations précises sur la préparation et le stockage des échantillons. Il faut aussi connaître la limite de détection analy ­
tique de la substance à tester tant dans l'eau que dans les tissus des 
poissons. Si une substance à tester marquée au
 14 C est utilisée, le 
pourcentage de radioactivité associée aux impuretés devra être connu.
 
1.5. CONDITIONS DE VALIDITÉ DE L'ESSAI  
Pour qu'un essai soit valide, les conditions suivantes devront être 
vérifiées:  
— la variation de température est inférieure à ± 2  o C, 
— la concentration d'oxygène dissous ne tombe pas au-dessous de 
60 o /o du niveau de saturation  
— la concentration de la substance à tester dans les enceintes est 
maintenue à ± 20 % de la moyenne des valeurs mesurées 
pendant la phase d'absorption,  
— la mortalité et autres effets/maladies indésirables tant parmi les 
poissons témoins que chez ceux traités sont inférieures à 10 % à 
la fin de l'essai; lorsque l'essai est prolongé sur plusieurs 
semaines ou mois, la mortalité ou les autres effets indésirables dans les deux ensembles de poissons devront être inférieurs à 5 % par mois et ne pas excéder 30 % au total.
 
1.6. COMPOSÉS DE RÉFÉRENCE  
L'utilisation de composés de référence ayant un potentiel de biocon ­
centration connu pourra aider au contrôle de la procédure expérimen ­
tale, si nécessaire. On ne peut cependant encore recommander de 
substances spécifiques.  
1.7. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.7.1.  Appareillage  
On prendra soin d'éviter les matériaux susceptibles de présenter un 
effet indésirable d'adsorption, de dissolution ou de lessivage sur les 
poissons, et ce pour toutes les pièces de l'équipement. Des réservoirs standards rectangulaires ou cylindriques, en matériaux chimiquement inertes et d'une capacité adaptée au régime de remplissage seront 
utilisés. On réduira au minimum l'usage de tuyaux en plastique 
souple. Les tubages en Téflon ®, acier inoxydable et/ou verre auront la préférence. L'expérience a montré que pour les substances présentant de forts coefficients d'adsorption, tels que les pyréthrines 
de synthèse, le verre silanisé peut être nécessaire. Il faudra, dans ces 
cas-là, se débarrasser des équipements après usage.
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1.7.2.  Eau  
On utilise généralement pour les essais une eau naturelle provenant 
d'une source non polluée et de qualité uniforme. L'eau de dilution doit être d'une qualité permettant la survie de l'espèce de poissons 
choisie, pour la durée des périodes d'acclimatation et d'essai, sans 
qu'apparaissent aucun comportement ni aspect anormaux. Dans l'idéal, il faudrait démontrer que les espèces soumises à l'essai peuvent survivre, grandir et se reproduire dans l'eau de dilution 
(par exemple en élevage de laboratoire ou par une étude de toxicité 
sur un cycle biologique). L'eau sera caractérisée au minimum selon son pH, sa dureté, ses matières solides totales, son carbone organique 
total et, de préférence aussi, ses teneurs ammoniacales, en nitrates et 
son alcalinité et, pour les espèces marines, sa salinité. On connaît parfaitement les paramètres importants du bien-être optimal chez les poissons, mais l'annexe 1 indique les concentrations maximales 
recommandées d'un certain nombre de paramètres concernant les 
eaux d'essais, douces et marines.
 
Pendant toute la durée d'un essai, l'eau sera d'une qualité constante. 
Le pH se tiendra entre 6,0 et 8,5, mais pour un essai donné il restera à l'intérieur d'une plage de ± 0,5 unité de pH. Pour s'assurer que l'eau 
de dilution n'influencera pas indûment les résultats de l'étude (par 
exemple par complexation de la substance à tester) ou n'affectera pas négativement les performances du stock de poissons, on prélèvera régulièrement des échantillons pour analyses. Il conviendra par 
exemple de procéder tous les trois mois, lorsqu'une eau de dilution 
est connue pour être relativement constante en qualité, à la détermi ­
nation des métaux lourds (par exemple Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), des anions et cations principaux (par exemple Ca, Mg, Na, K, CI, S0
 4 ), 
des pesticides (par exemple organophosphorés totaux et organo ­
chlorés totaux), du carbone organique total et des solides en suspen ­
sion. S'il est démontré que la qualité de l'eau est constante pendant une année au moins, ces analyses pourront être moins fréquentes et 
leurs intervalles espacés (par exemple tous les six mois).
 
La teneur en particules naturelles ainsi que le carbone organique total 
(TOC) de l'eau de dilution seront aussi faibles que possible pour éviter l'adsorption de la substance à tester sur les matières orga ­
niques, qui pourrait réduire sa biodisponibilité (4). La valeur maxi ­
male admissible est de 5 mg/l pour les particules de matière (matière sèche ne traversant pas un filtre de 0,45 μm) et 2 mg/l pour le 
carbone organique total (voir annexe 1). Si nécessaire, l'eau sera 
filtrée avant usage. La contribution des poissons de l'expérience 
(excréta) et des résidus alimentaires, et la teneur de l'eau en carbone organique total devra être aussi faible que possible. Tout au long de l'essai, la concentration en carbone organique dans le 
récipient concerné ne devra pas dépasser de plus de 10 mg/l (± 
20 %) celle du carbone organique provenant de la substance à tester et, le cas échéant, de l'agent de dissolution.
 
1.7.3.  Solutions d'essai  
On prépare une solution stock de la substance à tester, à la concen ­
tration voulue. La solution stock sera de préférence préparée par 
simple mélange ou agitation de la substance à tester dans l'eau de 
dilution. L'utilisation de solvants ou de dispersants (agents de dissolution) n'est pas recommandée; on peut y recourir cependant dans certains cas pour produire une solution stock à la concentration 
nécessaire. Les solvants susceptibles d'être utilisés sont l'éthanol, le 
méthanol, l'éther monométhylique d'éthylène glycol, l'éther diméthy ­
lique d'éthylène glycol, le diméthylformamide et le triéthylène glycol. Les dispersants utilisables sont le Cremophor RH40, le 
Tween 80, la méthylcellulose à 0,01 % et le HCO-40. Des précau ­
tions seront prises en cas d'utilisation d'agents facilement biodégra ­
dables, ces derniers pouvant provoquer des problèmes de croissance bactérienne dans les tests avec renouvellement continu. La substance 
d'essai peut être radiomarquée et devra être du plus haut niveau de 
pureté (par ex. de préférence > 98 %).
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Pour les essais avec renouvellement continu, un appareillage appor ­
tera et diluera en permanence la solution stock de la substance à 
tester (par exemple pompe doseuse, dilueur proportionnel, système saturateur) pour amener les concentrations d'essai jusqu'aux enceintes. Il sera préférable de prévoir au moins cinq volumes de 
remplacement par jour pour chaque enceinte d'essai. Le mode avec 
renouvellement continu sera préféré, mais en cas d'impossibilité (par exemple les organismes de l'essai subissent des effets néfastes) une technique semistatique pourra être mise en œuvre si les critères de 
validité restent satisfaits. Les régimes d'écoulement des solutions 
stocks et de l'eau de dilution seront contrôlés 48 heures avant l'essai puis au moins quotidiennement pendant celui-ci. Ce contrôle comportera la détermination du débit dans chaque enceinte d'essai et 
l'on s'assurera qu'il ne s'écarte pas de plus de 20 % pour chacune 
d'elles ou bien entre elles et les autres.
 
1.7.4.  Sélection des espèces  
Parmi les critères importants de sélection des espèces figurent la 
facilité de se les procurer, leur taille, et la possibilité d'un entretien 
aisé en laboratoire. On sélectionnera aussi les espèces de poissons en fonction de leur importance en matière de loisirs, commerce ou écologie; ils doivent également être de sensibilités comparables, 
avoir produit de bons résultats dans le passé, etc.
 
On trouvera à l'annexe 2 une liste d'espèces recommandées pour les 
essais. D'autres espèces peuvent être utilisées mais la procédure 
d'essai peut devoir être adaptée pour établir des conditions expéri ­
mentales convenables. Dans un tel cas, on exposera les motivations du choix des espèces et la méthode expérimentale retenue.
 
1.7.5.  Conservation des poissons  
Il faut acclimater la population de poissons pendant deux semaines 
au moins dans une eau à la température de l'essai et apporter une quantité de nourriture suffisante et du même type que celle qui sera 
utilisée pendant l'essai.
 
Après une période d'installation de 48 heures, on enregistre les taux 
de mortalité et les critères suivants sont appliques:  
— mortalité supérieure à 10 % de la population en sept jours: rejeter 
le lot entier,  
— mortalité entre 5 et 10 % de la population en sept jours: 
prolonger l'acclimatation pendant sept jours de plus,  
— mortalité inférieure à 5 % de la population en sept jours: accepter 
le lot — si la mortalité dépasse 5 % pendant les sept jours suivants, rejeter le lot entier.
 
S'assurer que les poissons utilisés pour les essais ne présentent pas 
de maladies ni d'anomalies observables. Écarter tout poisson malade. Les poissons ne sont pas censés être traités contre une quelconque 
maladie pendant les deux semaines précédant l'essai, ni pendant 
celui-ci.
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1.8. EXÉCUTION DE L'ESSAI  
1.8.1.  Essai préliminaire  
Il peut être utile de procéder à une expérimentation préliminaire pour 
optimiser les conditions d'exécution de l'essai réel, en ce qui 
concerne par ex. la sélection de la/des concentration(s) de la subs ­
tance à tester, la durée des phases d'absorption et d'élimination.  
1.8.2.  Conditions d'exposition  
1.8.2.1. D u r é e d e l a p h a s e d ' a b s o r p t i o n  
On peut prévoir la durée de la phase d'absorption en s'appuyant sur 
une expérience concrète (par ex. à partir d'une étude antérieure ou d'un produit chimique ayant des propriétés d'accumulation) ou à partir de certaines relations empiriques fondées sur ce que l'on sait 
de la solubilité dans l'eau ou bien du coefficient de partage octa ­
nol/eau de la substance à tester (voir annexe 3).
 
La phase d'absorption durera 28 jours sauf s'il peut être démontré 
qu'un équilibre a été atteint plus tôt. Si l'on ne parvient pas à un état stable dans les 28 jours, la phase d'équilibre sera prolongée et l'on procédera à d'autres mesures, jusqu'à état stable ou pendant 60 jours, 
l'alternative la plus courte prévalant.
 
1.8.2.2. D u r é e d e l a p h a s e d ' é l i m i n a t i o n  
La moitié de la durée de la phase d'absorption convient généralement 
pour que se produise une réduction convenable (par exemple 95 %) 
de la charge corporelle en substance d'essai (voir les explications de 
l'estimation à l'annexe 3). Si le temps nécessaire pour parvenir à une perte de 95 % est démesurément long, dépassant par exemple de deux fois la durée normale de la phase d'absorption (à savoir plus 
de 56 jours), on pourra en rester à une période plus courte (c'est-à- 
dire jusqu'à ce que la concentration de la substance à tester soit inférieure à 10 % de la concentration d'état stable). Cependant, pour les substances ayant des schémas d'absorption et d'élimination 
plus complexes que le modèle de poissons à compartiment unique, 
donnant une cinétique de premier ordre, on autorisera des phases de dépuration plus longues pour déterminer les constantes de vitesse d'élimination. Ce laps de temps peut néanmoins être régi par la 
période durant laquelle la concentration dans les poissons de la subs ­
tance à tester demeure au-dessus de la limite de détection analytique.
 
1.8.2.3. N o m b r e d e p o i s s o n s d e l ' e s s a i  
Choisir les nombres de poissons par concentrations d'essai de telle 
sorte qu'au minimum quatre poissons par échantillon seront disponi ­
bles à chaque échantillonnage. Si l'on souhaite une statistique plus fine, le nombre de poissons par échantillon devra augmenter.
 
Si on utilise des poissons adultes, indiquer s'ils sont mâles ou 
femelles ou si les deux sexes servent à l'expérience. Dans ce dernier cas, avant de commencer l'exposition, il faudra vérifier que les différences de teneurs lipidiques ne sont pas significatives; il 
pourra être nécessaire de faire des lots distincts de mâles et de 
femelles.
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Tous les essais se feront avec un choix de poissons de poids simi ­
laires, de sorte que les plus petits ne soient pas inférieurs aux deux 
tiers du poids des plus gros. Ils appartiendront tous à la même classe d'âge et proviendront de la même source. Le poids et l'âge d'un poisson ayant apparemment parfois des effets notables sur les 
valeurs BCF (1), ces informations seront enregistrées avec précision. 
Il est souhaitable qu'un sous-échantillon de la population de poissons soit pesé avant l'essai, pour en estimer le poids moyen.
 
1.8.2.4. C h a r g e m e n t  
Les rapports eau/poissons seront élevés afin de minimiser la réduc ­
tion du C  w due à l'ajout des poissons au début de l'essai, mais aussi 
pour éviter les diminutions de concentration en oxygène dissous. Il importe que le régime de chargement soit adapté à l'espèce utilisée 
pour l'essai. Un régime de chargement de 0,1-1,0 g de poisson (poids 
humide) par litre d'eau et par jour est recommandé en tout état de cause. On peut réaliser des chargements à hauts régimes s'il est démontré que la concentration voulue en substance à tester est 
maîtrisable dans des limites de ± 20 % et que la concentration 
d'oxygène dissous ne tombe pas au-dessous de 60 % du niveau de saturation.
 
On tiendra compte de l'habitat normal de l'espèce dans le choix du 
régime de chargement. Les poissons benthiques par exemple peuvent demander un aquarium ayant davantage de surface de fond que les 
espèces pélagiques, pour un même volume d'eau.
 
1.8.2.5. A l i m e n t a t i o n  
Pendant les périodes d'alimentation et d'essai, les poissons sont 
nourris selon un régime approprié ayant des teneurs en lipides et 
protéines totales déterminées, en quantités suffisantes pour les main ­
tenir en bonne santé et conserver leur poids corporel. Les poissons sont nourris quotidiennement pendant les périodes d'acclimatation et d'essai à raison d'environ 1 à 2 % de leur poids corporel chaque jour; 
on maintient ainsi pour la plupart des espèces une concentration 
lipidique d'un niveau relativement constant pendant l'essai. La quan ­
tité de nourriture devra être recalculée une fois par semaine par exemple, afin de maintenir un poids corporel et des teneurs lipi ­
diques cohérents. Pour ce calcul, le poids des poissons de chaque 
enceinte d'essai sera estimé à partir du poids des poissons échan ­
tillonnés le plus récemment dans cette enceinte. Ne pas peser les poissons restant dans l'enceinte.
 
La nourriture non consommée et les excréments sont évacués par 
siphonage quotidien des enceintes d'essai peu après le nourrissage 
(30 minutes à une heure). Les enceintes seront tenues aussi propres 
que possible tout au long de l'essai de sorte que la concentration de matière organique reste au plus bas niveau envisageable, car la présence de carbone organique peut limiter la biodisponibilité de la 
substance à tester. (1)
 
Nombre d'aliments étant des dérivés de farines de poissons, ils seront 
analysés pour déterminer leur teneur en substance d'essai. Il est 
préférable aussi d'analyser les teneurs de ces nourritures en pesticides 
et métaux lourds.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 988
 
1.8.2.6. É c l a i r a g e e t t e m p é r a t u r e  
La photopériode est généralement de 12 à 16 heures et la tempéra ­
ture (+ 2  o C) correspondra à l'espèce utilisée (voir annexe 2). Le type 
et les caractéristiques de l'éclairage seront nettement définis. Il faudra 
prendre garde aux phototransformations éventuelles de la substance à 
tester dans les conditions de rayonnement de l'étude. L'éclairage ne devra pas exposer les poissons à des photoproduits non naturels. Dans certains cas, il peut être essentiel d'utiliser un filtre pour 
bloquer les rayons UV inférieurs à 290 nm.
 
1.8.2.7. C o n c e n t r a t i o n s d e l ' e s s a i  
Les poissons sont exposés a un renouvellement continu de deux 
concentrations aqueuses au moins de la substance à tester. Norma ­
lement, la concentration haute (ou la plus haute) de la substance à 
tester sera d'environ 1 % de sa LC  50 aiguë à l'asymptote, et au moins 
10 fois supérieure à sa limite de détection dans l'eau par la méthode d'analyse retenue.
 
La plus forte concentration de l'essai peut aussi être établie en divi ­
sant la LC  50 à 96 heures par un ratio approprié aigu/chronique (les 
ratios adéquats de certains produits chimiques peuvent aller de 3 à 100). Si possible, choisir l'autre (les autres) concentration(s) de sorte 
que la différence avec celle qui lui est supérieure atteigne un facteur 
dix. En cas d'impossibilité due au critère de 1 % de la LC.
 50 et de la 
limite analytique, un facteur inférieur à dix pourra être utilisé ou bien on songera à l'intervention d'une substance radiomarquée du
 14 C. 
Aucune concentration mise en œuvre ne devrait dépasser la solubilité 
de la substance d'essai.  
Lorsqu'un agent de dissolution est utilisé sa concentration ne doit pas 
dépasser 0,1 ml/1 et doit être identique dans tous les récipients de 
l'essai. Sa contribution, ajoutée à celle de la substance à tester, à la 
teneur globale en carbone organique dans l'eau de l'expérience doivent être connues. Tout sera néanmoins fait pour éviter le recours à ce type de matériels.
 
1.8.2.8. T é m o i n s  
Une eau de dilution témoin ou, si nécessaire, un témoin contenant 
l'agent de dissolution sera disponible en marge de la série des tests, dans la mesure où il a été établi que l'agent n'a aucun effet sur les poissons. Dans le cas contraire, on mettra en place les deux témoins.
 
1.8.3.  Fréquence des mesures de la qualité de l'eau  
Pendant l'essai, l'oxygène dissous, le TOC, le pH et la température 
seront mesurés dans tous les récipients. La dureté totale, et la salinité éventuellement, seront mesurées dans les témoins et un récipient contenant la concentration haute (la plus haute). Au minimum, l'oxy ­
gène dissous et éventuellement la salinité seront mesurés trois fois — 
au début, vers le milieu et à la fin de la période d'absorption — et une fois par semaine pendant la période d'élimination. Le TOC sera mesuré au début de l'essai (24 et 48 heures avant le démarrage de la 
phase d'absorption), avant l'ajout des poissons et au moins une fois 
par semaine pendant les périodes d'absorption et d'élimination. La température sera mesurée quotidiennement, le pH au début et à la fin de chaque période et la dureté une fois pour chaque essai. La tempé ­
rature sera de préférence surveillée en continu dans un récipient au 
moins.
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1.8.4.  Échantillonnage et analyse des poissons et de l'eau  
1.8.4.1. C a l e n d r i e r d ' é c h a n t i l l o n n a g e d e s p o i s s o n s e t d e 
l ' e a u  
De l'eau sera prélevée dans les enceintes d'essai pour établir la 
concentration de la substance a tester avant l'ajout des poissons et 
pendant les phases d'absorption et de dépuration. Au minimum, l'eau est prélevée en même temps que les poissons et avant leur alimen ­
tation. Pendant la phase d'absorption, les concentrations de substance 
à tester sont déterminées pour vérifier qu'elles satisfont aux critères 
de validité.
 
Les poissons sont échantillonnés en cinq occasions au moins pendant 
la phase d'absorption et en quatre occasions au moins pendant la phase de dépuration. Il est parfois difficile de calculer une valeur 
estimative raisonnablement précise du BCF sur la base de ce nombre 
d'échantillons, en particulier lorsque l'on sort du cadre d'une simple cinétique de dépuration de premier ordre. Dans ce cas, on pourra alors échantillonner à des rythmes plus rapides dans les deux 
périodes (voir annexe 4). Les échantillons supplémentaires sont 
stockés et analysés uniquement si les résultats de la première série d'analyses se révèlent insuffisants au calcul du BCF avec la précision voulue.
 
On trouvera à l'annexe 4 un exemple de calendrier d'échantillonnage 
acceptable. D'autres peuvent être facilement établis sur la base d'au ­
tres valeurs supposées du P  OW pour calculer le temps d'exposition 
correspondant à une absorption de 95 %.  
On poursuit l'échantillonnage pendant la phase d'absorption jusqu'à 
établissement d'un état stable ou pendant 28 jours, l'alternative la plus courte prévalant. Si l'on ne parvient pas a un état stable en 
28 jours, l'échantillonnage continue jusqu'à obtention d'un état 
stable ou pendant 60 jours, l'alternative la plus courte prévalant. Avant de commencer la phase d'élimination, les poissons sont trans ­
férés dans des réservoirs propres.
 
1.8.4.2. É c h a n t i l l o n n a g e e t p r é p a r a t i o n d e s é c h a n t i l l o n s  
On prélève les échantillons d'eau destinés aux analyses, par exemple 
en siphonnant à l'aide d'un tube inerte un point central de l'enceinte d'essai. Puisqu'il semble que l'on ne peut séparer ni par centrifugation 
ni par filtration la fraction non biodisponible de la substance à tester 
de celle qui est biodisponible (en particulier dans le cas des produits chimiques super-lipophiles, c'est-à-dire ceux ayant un log P
 Ow > 5) 
(1) (5), on peut s'abstenir de soumettre les échantillons à ces traite ­
ments.  
Par contre, il faudra veiller à ce que les réservoirs restent aussi 
propres que possible et à ce que la teneur en carbone organique total soit surveillée tout au long des phases d'absorption et d'élimi ­
nation.
 
Un nombre convenable de poissons (normalement quatre au mini ­
mum) est prélevé dans chaque enceinte d'essai pour chaque échan ­
tillonnage. Les poissons prélevés sont rapidement rincés à l'eau, 
séchés avec un papier absorbant, et sacrifiés instantanément de la manière la plus humaine possible, puis pesés.
 
Il est préférable d'analyser les poissons et l'eau immédiatement après 
l'échantillonnage pour éviter toute dégradation ou autres pertes et pour calculer approximativement les régimes d'absorption et de dépu ­
ration pendant que l'essai se poursuit. L'analyse immédiate évite 
aussi de ne pas retarder le constat qu'un plateau a été atteint.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 990
 
Faute d'une analyse immédiate, les échantillons sont conservés selon 
une méthode convenable. Avant le début de l'étude, on réunira toutes 
informations sur la méthode de stockage adéquate de cette substance à tester, par exemple congélation, maintien à 4
 o C, durée du 
stockage, extraction, etc.  
1.8.4.3. Q u a l i t é d e l a m é t h o d e a n a l y t i q u e  
L'intégralité de la procédure étant régie principalement par l'exacti ­
tude, la précision et la sensibilité de la méthode analytique mise en 
œuvre pour la substance à tester, il faut contrôler expérimentalement que la précision et la reproductibilité de l'analyse chimique, ainsi que la récupération de la substance à tester tant dans l'eau que dans les 
poissons donnent toute satisfaction dans le cadre particulier de cette 
méthode. Vérifier aussi que la substance à tester n'est pas détectable dans l'eau de dilution utilisée.
 
Si nécessaire, les valeurs de C  w et C  f dérivées des essais seront 
corrigées au vu des valeurs fournies par les témoins et la concen ­
tration naturelle de la substance d'essai. Les échantillons de poissons et d'eau sont manipulés en permanence de manière à minimiser les 
pollutions et les pertes (résultant par exemple de l'absorption par le 
matériel d'échantillonnage).
 
1.8.4.4. A n a l y s e d e s p o i s s o n s é c h a n t i l l o n n é s  
Si l'on utilise pour l'essai des matériels radiomarqués, on peut 
analyser le marquage radioactif total (c.à.d. composés d'origine et métabolites) ou purifier les échantillons de sorte que le composé 
d'origine puisse être analysé séparément. En outre, les principaux 
métabolites peuvent être caractérisés soit à l'état stable soit à la fin de la phase d'absorption, l'alternative la plus courte prévalant. Si le BCF en termes de résidus radiomarqués totaux est > 1 000 %, il peut 
être conseillé (et, pour certaines catégories de produits chimiques tels 
que les pesticides, fortement recommandé), d'identifier et quantifier les produits de dégradation représentant ≥10 % des résidus totaux 
dans les tissus des poissons à l'état stable. Si ces produits représen ­
tant ≥ 10 % des résidus totaux radiomarqués dans les tissus de 
poissons sont identifies et quantifiés, il est alors recommandé de les identifier et les quantifier aussi dans l'eau de l'essai.
 
La concentration de la substance à tester devrait généralement être 
déterminée pour chaque poisson pesé. Si cela n'est pas possible, on pourra mettre en commun les échantillons à chaque échantillonnage, mais cette mise en commun restreint véritablement les procédures 
statistiques dont les données pourraient bénéficier. Si une procédure 
et une finesse statistiques spécifiques sont souhaitées, il conviendra alors de faire participer à l'essai un nombre adéquat de poissons pour satisfaire à la procédure de regroupement et à la précision statistique 
désirées (6) (7).
 
Le BCF sera exprimé à la fois en fonction du poids frais total et, 
pour les substances fortement lipophiles, en fonction de la teneur lipidique. La teneur lipidique des poissons est établie si possible 
lors de chaque échantillonnage. Des méthodes bien adaptées seront 
utilisées pour déterminer la teneur en lipides (réf. 8 et 2 de l'annexe 3). On recommande les techniques d'extraction par chloro ­
forme/méthanol comme méthode standard (9). Toutes les méthodes 
ne donnant pas des valeurs identiques (10), il importe de bien 
préciser celle utilisée. L'analyse des lipides sera si possible faite sur les mêmes extraits que ceux consacrés à l'analyse de la substance à tester, puisque les lipides doivent souvent être enlevés de l'extrait 
avant qu'on puisse l'analyser par chromatographie. La teneur lipi ­
dique des poissons (en mg/kg de poids frais) à la fin de l'expérience ne devrait pas s'écarter de celle du début de ± 25 %. Le pourcentage de solides dans les tissus sera lui aussi indique pour permettre la 
conversion de la concentration lipidique de la base humide à la base 
sèche.
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2. DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
La courbe d'absorption de la substance à tester résultera du tracé de 
sa concentration, en fonction du temps, dans/sur les poissons (ou des 
tissus spécifiques) pendant la phase d'absorption, sur une échelle 
arithmétique. Si la courbe a atteint un plateau, c'est-à-dire adopte approximativement un tracé asymptotique à Taxe du temps, l'état stable BCF
 ss sera calculé comme suit:  
C f étatstable ðmédianÞ 
C w état stable ðmédianÞ 
Lorsqu'on ne parvient à aucun état stable, il reste possible de calculer 
un BCF  ss d'une précision suffisante pour l'évaluation des risques à 
partir d'un «état stable» à 80 % (1,6/k  2 ) ou 9,5 % (3,0/k  2 ) de l'équi ­
libre.  
En outre, le facteur de concentration (BCF  k ) sera défini comme le 
rapport k  1 /k 2 , des deux constantes cinétiques de premier ordre. La 
constante de vitesse d'élimination (k  2 ) est généralement déterminée à 
partir de la courbe d'élimination (c.a.d. un tracé de la décroissance en 
fonction du temps de la concentration de la substance à tester dans le 
poisson). La constante de vitesse d'absorption (k  t ) est alors calculée 
en fonction de k  2 et d'une valeur de C  1 dérivée de la courbe d'ab ­
sorption (voir aussi annexe 5). La méthode de choix pour obtenir 
BCF  k et les constantes de vitesse k  1 et k  2 , est de recourir à des 
méthodes informatiques non linéaires d'estimation des paramètres (11). On peut alternativement utiliser des méthodes graphiques pour calculer k
 t et k  2 . Si la courbe de dépuration est à l'évidence 
autre que de premier ordre, alors il conviendra d'utiliser des modèles 
plus complexes (voir références à l'annexe 3) et de demander conseil à un biostatisticien.
 
2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Les résultats seront interprétés avec précaution lorsque les concen ­
trations de solution d'essai mesurées se trouvent à des niveaux proches de la limite de détection de la méthode d'analyse.
 
La clarté de définition des courbes d'absorption et d'élimination 
témoigne de la bonne qualité des données de bioconcentration. La 
variation des constantes absorption/élimination entre les deux concentrations d'essai doit être inférieure à 20 %. Les différences notables observées dans les taux d'absorption/élimination entre les 
deux essais de concentration seront enregistrées et expliquées si 
possible. En général, la limite de confiance des BCF approche ± 20 % dans les études bien connues.
 
3. RAPPORT  
Le procès-verbal d'essai doit comporter les informations suivantes:  
3.1. SUBSTANCE D'ESSAI  
— nature physique et, le cas échéant, propriétés physico-chimiques,  
— données d'identification chimique (y compris la teneur en 
carbone organique, si besoin),  
— en cas de marquage radioactif, position précise du/des atome(s) 
marqué(s) et pourcentage de radioactivité associée aux impuretés.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 992
 
3.2. ESPÈCES UTILISÉES  
— Dénomination scientifique, souche, source, tout traitement préa ­
lable éventuel, acclimatation, âge, gamme des tailles, etc.  
3.3. CONDITIONS DE L'ESSAI  
— procédure mise en œuvre (par exemple renouvellement continu 
ou semi-statique),  
— type et caractéristiques de l'éclairage utilisé et photopériode(s),  
— concept de l'essai (par exemple nombre et taille des enceintes 
d'essai, régime de remplacement des volumes d'eau, nombre de sous-échantillons et de poissons par sous-échantillon, nombre de concentrations testées, durée des phases d'absorption et de dépu ­
ration, fréquence des échantillonnages pour les poissons et l'eau),
 
— méthode de préparation des solutions mères et fréquence de 
renouvellement (l'agent de dissolution, sa concentration et sa contribution à la teneur en carbone organique de l'eau de 
l'essai seront indiqués, le cas échéant),
 
— les concentrations d'essai nominales, les moyennes des valeurs 
mesurées et leurs écarts-types dans les récipients d'essai et leur méthode d'obtention,
 
— source de l'eau de dilution, description de tout traitement préala ­
ble, résultats de toute démonstration de l'aptitude des poissons 
utilisés à vivre dans cette eau et caractéristiques de celle-ci: pH, dureté, température, concentration en oxygène dissous, niveaux de chlore résiduel (si mesuré) carbone organique total, solides en 
suspension, salinité du milieu d'essai (le cas échéant) et toutes 
autres mesures réalisées,
 
— qualité de l'eau dans les récipients d'essai, pH, dureté, TOC, 
température et concentration en oxygène dissous,  
— renseignements précis sur l'alimentation (par exemple type de 
nourriture, source, composition — au moins teneurs en lipides 
et protéines si possible, quantité donnée et fréquence),  
— renseignements sur le traitement des poissons et de l'eau échan ­
tillonnés, y compris détails de préparation, stockage, extraction, procédures (et précision) de l'analyse de la substance à tester et 
teneur en lipides (si mesurée).
 
3.4. RÉSULTATS  
— résultats de toute étude préliminaire effectuée,  
— mortalité des poissons témoins et des poissons dans chaque 
enceinte d'essai et tous comportements anormaux observés,  
— teneur lipidique des poissons (si détermination à l'occasion de 
l'essai),  
— courbes (dont toutes données mesurées) montrant l'absorption et 
l'élimination des produits chimiques de l'essai dans les poissons, 
le temps d'accès à l'état stable,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 993
 
— C  f et C  w (avec écart-type et plage, le cas échéant) au moment de 
chaque échantillonnage (C  f exprimé en μg/g de poids frais (ppm) 
de tout l'animal ou de certains de ses tissus, par exemple lipides et C
 w en μg/ml (ppm). Valeurs C  w de la série témoin (indiquer 
aussi la concentration de fond),  
— facteur de bioconcentration à l'état stable (BCF  ss ) et/ou facteur de 
concentration cinétique (BCF  k ) et, le cas échéant, limites de 
confiance à 95 % des constantes de vitesse d'absorption et d'éli ­
mination (perte) toutes exprimées par rapport au corps entier et 
de la teneur totale en lipide, si elle est mesurée, de l'animal (ou certains de ses tissus), limites de confiance et écart-type (si disponible), méthodes de calcul/analyse des données pour 
chaque concentration de substance d'essai utilisée,
 
— lorsqu'on utilise des substances radiomarquées, l'accumulation de 
tous les métabolites détectés pourra être signalée si cela est 
nécessaire,  
— toute situation inhabituelle concernant l'essai, tout écart de ces 
procédures et toutes autres informations pertinentes.  
Minimiser les résultats du type «non détecté à la limite de détection» 
par la mise en place d'une méthode d'essai préliminaire et l'élabora ­
tion d'un concept expérimental, car ces résultats sont inutilisables 
pour les calculs des constantes de vitesse.  
4 BIBLIOGRAPHIE  
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chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
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Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 995
 
Annexe 1  
Caractéristiques chimiques acceptables pour l'eau de dilution  
Substance Limite de concentration  
1 Particules de matière 5 mg/l 
2 Carbone organique total 2 mg/l 3 Ammoniaque non ionisé 1 μg/l 
4 Chlore résiduel 10 μg/l 
5 Pesticides organophosphorés totaux 50 μg/l 
6 Pesticides organochlorés totaux plus polychlorobiphé ­
nyles 50 ng/l 
7 Chlore organique total 25 ng/l 
8 Aluminium 1 μg/l 
9 Arsenic 1 μg/l 
10 Chrome 1 μg/l 
11 Cobalt 1 μg/l 
12 Cuivre 1 μg/l 
13 Fer 1 μg/l 
14 Plomb 1 μg/l 
15 Nickel 1 μg/l 
16 Zinc. 1 μg/l 
17 Cadmium 100 ng/l 18 Mercure 100 ng/l 19 Argent 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 996
 
Annexe 2  
Espèces de poissons recommandées pour les essais  
Espèces recommandées Plages de tempé ­
ratures recom ­
mandées pour les 
essais (  o C) Longueur totale 
recommandée des 
animaux utilisés 
(cm) 
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae ) (Hamilton- 
Buchanan) Petit Danio 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas ( Teleostei, Cyprinidae ) (Rafi­
nesque) Tète de boule 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio ( Teleostei, Cyprinidae ) (Linnaeus) 
Carpe 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes ( Teleostei, Poeciliidae ) (Temminck 
and Schlegel) 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata ( Teleostei, Poeciliidae ) (Peters) 
Guppy 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus ( Teleostei, Centrarchidae ) 
(Rafinesque) Crapet arlequin 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss ( Teleostei, Salmonidae ) (Wal­
baum) Truite de Kamloops 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus ( Teleostei, Gasterosteidae ) 
(Linnaeus) Epinoche épineuse 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Séries B., Vol. 252, p. 231.  
Diverses espèces d'estuaires et marines ont été utilisées dans certains pays par exemple: 
Tambour croca  Leiostomus xanthurus  
Pétote  Cyprinodon variegatus  
Siouclet  Menidia beryllina  
Perche-méné  Cymatogaster aggregata  
Carlottin anglais  Parophrys vetulus  
Chabot  Leptocottus armatus  
Epinoche épineuse  Gasterosteus aculeatus  
Bar Dicentracus labrax  
Ablette  Alburnus alburnus  
Récolte  
Les poissons d'eau douce énumérés dans le tableau ci-dessus sont faciles à élever et/ou largement 
disponibles tout au long de l'année, alors que la disponibilité des espèces marines ou d'estuaires est en partie limitée à certains pays. Ils peuvent se reproduire et vivre soit dans des fermes piscicoles 
soit en laboratoire, dans des conditions où les maladies et parasites sont sous contrôle; les animaux 
utilisés seront donc sains et de lignées connues. On les trouve à peu près partout dans le monde.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 997
 
Annexe 3  
Prévision de la durée des phases d'absorption et d'élimination  
1. Prévision de la durée de la phase d'absorption  
Avant d'exécuter l'essai, on pourra estimer k  2 et donc un pourcentage du 
temps nécessaire pour parvenir à l'état stable, à partir de relations empi ­
riques entre k  2 et le coefficient de partage n-octanol/eau (P  ow ) ou k  2 et la 
solubilité dans l'eau (s).  
On estimera k  2 (jour  -1 ) à partir, par exemple, de la relation empirique 
suivante (1): 
log 10 k 2 = - 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (equation 1)  
Pour les autres relations, voir réf. (2).  
Si le coefficient de partage (P  ow) est inconnu, on procédera à une estimation 
(3) à partir de la solubilité dans l'eau (s) de la substance d'après: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (equation 2)  
où 
s = solubilité (moles/l): (n = 36).  
Ces relations ne s'appliquent qu'aux produits chimiques dont les valeurs log 
P ow se situent entre 2 et 6,5 (4).  
Le temps nécessaire pour atteindre un certain pourcentage de l'état stable 
résultera de l'équation cinétique générale illustrant l'absorption et l'élimina ­
tion (cinétique de premier ordre), par application du k  2 estimé:  
dC f 
dt ¼ k 1 ·C w Ä k 2 · C f 
où, si C  w est constant:  
C f ¼ k 1 
k 2 ·C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (equation 3)  
Lorsque l'on se rapproche de l'état stable (t → ∞), l'équation 3 se réduit (5) 
(6) à:  
C f ¼ k 1 
k 2:C w or C f /C w = k  1 /k 2 = BCF.  
Le rapport k  1 /k 2 . C w approche alors la concentration dans le poisson à 
«l'état stable» (C  fs ). 
L'équation 3 peut être ainsi transcrite:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ ou C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (equation 4)  
Le temps nécessaire pour atteindre un certain pourcentage de l'état stable 
peut être prévu grâce à l'équation 4 lorsque k  2 , est estimé au préalable à 
l'aide des équations 1 ou 2.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 998
 
À titre indicatif, la durée optimale statistique de la phase d'absorption 
permettant d'obtenir des données statistiquement acceptables (BCF  k ) est 
la période nécessaire pour que la courbe du logarithme de la concentration de la substance à tester dans le poisson, portée en temps linéaire, parvienne à son point médian, soit à 1,6/k
 2 , ou à 80 % de l'état stable, mais ne 
dépasse pas 3,0/k, ou 95 % de l'état stable (7).  
Le temps d'accession à 80 % de l'état stable est (équation 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 ou t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (equation 5)  
De même, pour 95 % de l'état stable:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (equation 6)  
Par exemple, la durée de la phase d'absorption (abs.) d'une substance à 
tester ayant un log P  ow = 4 serait (avec les équations 1, 5 et 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 jours  -1 
abc. (80 %) = 1,6/0,652, c'est à dire. 2,45 jours (59 heures)  
ou abc. (95 %) = 3,0/0,652, c'est à dire. 4,60 jours (110 heures)  
De même, pour une substance à tester avec s = 10  - 5 mol/l (log(s) = - 5,0), 
la durée de l'absorption serait (avec les équations 1, 2, 5 et 6):  
log 10 (P ow ) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 jours  -1 
abc. (80 %) = 1,6/0,246, c'est à dire 6,5 jours (156 heures)  
ou abc. (95 %) = 3,0/0,246, c'est à dire 12,2 jours (293 heures)  
On utilisera aussi, à titre d'alternative, l'expression:  
t eq = 6,54 × 10  -3 P ow + 55,31 (heures)  
pour calculer le temps d'accession effective à l'état stable (4).  
2. Prévision de la durée de la phase d'élimination  
On pourra également prévoir le temps nécessaire pour que la charge corpo ­
relle se réduise à un certain pourcentage de la concentration initiale grâce à 
l'équation générale illustrant l'absorption et l'élimination (cinétique de premier ordre) (1) (8).
 
Pour la phase d'élimination, C  w est supposé nul. L'équation peut être 
réduite à:  
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f ou C f ¼ C f;o ·e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 999
 
où C  fo est la concentration au début de la période d'élimination. On 
parviendra ensuite à une élimination de 50 % à l'instant (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 ou t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
De même, 95 % d'élimination seront atteints à:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Si l'on se place à 80 % de l'absorption pour la première période (1,6/k  2 ) et 
95 % de perte dans la phase d'élimination (3,0/k  2 ), alors la phase d'élimi ­
nation est approximativement le double de la durée de la phase d'absorp ­
tion. 
Il importe cependant de noter que ces estimations sont fondées sur l'hypo ­
thèse que les schémas d'absorption et d'élimination suivent une cinétique de 
premier ordre. Si l'on n'est pas, à l'évidence, dans ce cadre, des modèles plus complexes devront être employés [par exemple réf (1)].
 
Bibliographie (de l'annexe 3)  
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(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
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(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic 
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pp 4-10.  
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(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
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(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, pp 3-19.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1000
 
Annexe 4  
Exemples théoriques de calendriers d'échantillonnage pour les tests de bioconcentration des substances ayant un 
log P  ow = 4 
Prélèvements de poissons Calendrier d'échantillonnage 
Nombre d'échantillons d 
eau Nombre de poissons par 
échantillon Fréquence minimale 
requise (jours) Échantillonnage supplé ­
mentaire  
Phase d'absorption – 1 
0 2 (*) 
2 ajouter 45-80 poissons 
1er 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2e 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3e 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4e 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5e 4,7 2 6 
Phase de dépuration Transférer les pois ­
sons dans une eau 
exempte du produit à 
tester 
6e 5,0 5,3 4 
(4) 
7e 5,9 7,0 4 
(4) 
8e 9,3 11,2 4 
(4) 
9e 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Prélever l'eau après apport de 3 «volumes d'enceintes» au moins. 
Les valeurs entre parenthèses sont les nombres d'échantillons (eau, poissons) à prélever si l'on procède a un échantillonnage s upplémentaire.  
Note: L'estimation avant essai de k  2 , pour un log P  ow de 4,0 est de 0,652 jour  –1 . La durée totale de l'expérience est fixée à: 3 × abs. = 
3 × 4,6 jours, soit 14 jours. Se reporter a l'annexe 3 pour l'estimation de l'«absorption».  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1001
 
Annexe 5  
Discrimination des modèles  
On suppose que la plupart des données de bioconcentration sont «raisonnable ­
ment» bien décrites par un modèle simple à deux compartiments/deux paramè ­
tres, selon la courbe rectiligne qui reprend approximativement les points de 
mesure des concentrations dans les poissons pendant la phase d'élimination, 
sur papier semilogarithmique. (Lorsque ces points ne peuvent se ramener à une droite, il convient de recourir à des modèles plus complexes, voir par exemple Spacie and Hamelink, réf. 1 à l'annexe 3.)
 
Méthode graphique de détermination de la constante de vitesse d'élimination 
(perte) k  2 
Porter sur du papier semilogarithmique la concentration de la substance à tester 
trouvée dans chaque échantillon de poisson, selon le calendrier d'échantillonnage. La pente de cette droite est k
 2 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Attention: les écarts par rapport à cette ligne droite peuvent indiquer un schéma 
d'élimination plus complexe qu'une cinétique de premier ordre. Une méthode 
graphique peut résoudre des types d'élimination s'écartant de la cinétique de premier ordre.
 
Méthode graphique de détermination de la constante de vitesse 
d'absorption k  t 
K 2 étant établi, on calcule k  1 comme suit:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ [equation 1]  
On lit la valeur de C  f au point médian de la courbe d'absorption lissée produite 
par les données lorsque la concentration logarithmique est portée en fonction du 
temps (sur une échelle arithmétique).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1002
 
Méthode de calcul informatique des constantes de vitesse d'absorption et 
d'élimination (perte)  
Pour obtenir le facteur de bioconcentration et les constantes de vitesse k  1 et k  2 on 
utilisera de préférence des méthodes informatiques non linéaires d'estimation paramétriques. Ces programmes établissent les valeurs de k
 1 et k  2 en fonction 
d'un ensemble de données séquentielles de concentration dans le temps et du 
modèle:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ 0 < t < t  c [equation 2]  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ðe Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Þ t < t  c [equation 3]  
où t  e = temps à la fin de la phase d'absorption.  
Cette démarque débouche sur des estimations de l'écart-type pour k  1 et k  2 
Puisqu'on peut dans la plupart des cas estimer k  2 , à partir de la courbe d'élimi ­
nation et ce avec une précision relativement grande, et puisqu'il existe une forte corrélation entre les deux paramètres k
 1 et k  2 , il peut être souhaitable de calculer 
d'abord k  2 , à partir des données d'élimination uniquement, puis de calculer k  1 , à 
partir des données d'absorption à l'aide d'une régression non linéaire.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1003
 
C.14.  POISSON, ESSAI SUR LA CROISSANCE DES JUVÉNILES  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de toxicité sur la croissance des 
juvéniles reprend la ligne directrice n  o 215 de l'OCDE (2000).  
1.1. INTRODUCTION  
Cet essai vise à évaluer les effets d'une exposition prolongée à des 
produits chimiques sur la croissance des poissons au stade juvénile. Il s'appuie sur une méthode mise au point et soumise à des essais tournants (1) (3) dans l'Union européenne, qui a pour objet d'évaluer 
les effets de substances chimiques sur la croissance de la truite arc- 
en-ciel ( Oncorynchus mvkiss ) au stade juvénile dans des conditions 
dynamiques. D'autres espèces de poissons bien étudiées peuvent être 
utilisées. Par exemple, on possède une certaine expérience des essais 
de croissance sur le danio ( Danio rerio ) (
 1 ) (2) (4) (5) et sur le 
medaka ( Oryzias latipes ) (6) (7) (8).  
Voir aussi introduction générale, partie C.  
1.2. DÉFINITIONS  
Concentration minimale avec effet observé (CMEO) : la plus 
faible concentration de la substance d'essai à laquelle on observe un effet significatif (à p < 0,05) par rapport au témoin. Cependant, toutes les concentrations d'essai supérieures à la CMEO doivent 
exercer un effet nocif égal ou supérieur à celui observé à la CMEO.
 
Concentration sans effet observé (CSEO) : la concentration d'essai 
immédiatement inférieure à la CMEO.  
CE X : dans la méthode décrite pour cet essai, la concentration de la 
substance d'essai qui provoque une variation de x % du taux de croissance des poissons par rapport aux témoins.
 
Taux de charge : le poids frais des poissons par unité de volume 
d'eau.  
Densité de peuplement : le nombre de poissons par unité de volume 
d'eau.  
Taux de croissance spécifique de chaque poisson : le taux de crois ­
sance d'un individu par rapport à son poids initial.  
Taux de croissance spécifique moyen par récipient : le taux de 
croissance moyen de la population d'un récipient (cuve) à une 
concentration donnée.  
Taux de croissance pseudo-spécifique : le taux de croissance indi ­
viduel comparé au poids initial moyen de la population du récipient.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1004  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, p. 231-236.
 1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI  
Des juvéniles en phase de croissance exponentielle sont pesés, puis 
placés dans des enceintes expérimentales où ils sont exposés à une gamme de concentrations sublétales de la substance d'essai dissoute 
dans l'eau, de préférence dans des conditions dynamiques ou, à 
défaut, dans des conditions semi-statiques (renouvellement discon ­
tinu) adéquates. L'essai dure 28 jours. Les poissons sont nourris quotidiennement. La ration alimentant est déterminée en fonction 
du poids initial des poissons et peut être recalculée après 14 jours. 
On pèse à nouveau les poissons à la fin de l'essai. Les effets sur le taux de croissance sont analysés à l'aide d'un modèle de-régression 
afin d'estimer la concentration qui provoquerait une variation de x % 
du taux de croissance, soit CE
 X (CE  10 , CE  20 ou CE  30 par exemple). 
Les données peuvent aussi être comparées aux valeurs des témoins pour déterminer la concentration minimale avec effet observé 
(CMEO) et, de là, la concentration (maximale) sans effet observé 
(CSEO).
 
1.4. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Il faudrait disposer des résultats d'un essai de toxicité aigué (voir 
méthode d'essai C.1) réalisé de préférence sur l'espèce choisie pour le présent essai. Cela implique que la solubilité dans l'eau et la pression de vapeur de la substance d'essai soient connues et que 
l'on dispose d'une méthode d'analyse fiable pour déterminer la quan ­
tité de substance dans les solutions d'essai avec une précision et une limite de détection connues et mentionnées dans le rapport.
 
Il est utile de connaître la formule structurale, la pureté de la subs ­
tance, la stabilité dans l'eau et à la lumière, le pK  a , le P  oe et les 
résultats d'un essai de biodégradabilité immédiate (voir méthode d'essai C.4).
 
1.5. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
Pour qu'un essai soit valide, les conditions suivantes doivent être 
remplies:  
— la mortalité dans le(s) groupe(s) témoin(s) ne doit pas dépasser 
10 % a la fin de l'essai,  
— le poids moyen des poissons du (des) groupe(s) témoin(s) doit 
avoir augmenté suffisamment pour que la variation minimale du taux de croissance qui est jugée significative soit détectable. Un essai tournant (2) a montré que, dans le cas de la truite arc-en- 
ciel, le poids moyen des poissons dans les groupes témoins doit 
avoir au moins doublé (soit 50 %) par rapport à leur poids moyen initial sur 28 jours; par exemple, poids initial: 1 g/poisson (= 100 %), poids final après 28 jours: > 
1,5 g/poisson (> 150 %),
 
— la concentration de l'oxygène dissous doit se situer à au moins 
60 % de la valeur de saturation en air tout au long de l'essai,  
— à aucun moment, durant l'essai, la température de l'eau ne doit 
varier de plus de ± 1  o C entre les enceintes expérimentales et 
devrait être maintenue dans un intervalle de 2  o C compris dans la 
plage spécifiée pour l'espèce testée (voir appendice 1).  
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareillage  
On utilise du matériel courant de laboratoire et notamment:  
a) un pH-mètre et un appareil à mesurer l'oxygène;  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1005
 
b) un instrument pour mesurer la dureté et l'alcalinité de l'eau;  
c) un dispositif adéquat de régulation de la température avec, de 
préférence, une surveillance en continu;  
d) des récipients (cuves) fabriqués en un matériau chimiquement 
inerte et d'une capacité adaptée à la charge et à la densité de peuplement recommandées (voir point 1.8.5 et appendice 1);
 
e) une balance suffisamment précise (précision de ± 0,5 %).  
1.6.2.  Eau  
Toute eau dans laquelle l'espèce testée présente des taux de survie et 
de croissance à long terme adéquates peut être utilisée pour l'essai. Sa qualité doit demeurer constante pendant toute la durée de l'essai. 
Le pH de l'eau sera compris dans un intervalle de 6,5 à 8,5 unités, 
mais sans varier de plus de ± 0,5 unité (de pH) au cours d'un même essai. Une dureté supérieure à 140 mg/l (CaC0
 3 ) est recommandée, 
Pour s'assurer que l'eau de dilution n'influencera pas indûment le 
résultat de l'essai (par exemple en complexant la substance d'essai), 
on prélèvera des échantillons à différents intervalles pour analyse. Il y a lieu de mesurer la teneur en métaux lourds (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni, par exemple), en principaux anions et cations (Ca, Mg, Na, K, 
Cl, S0
 4 , par exemple), en pesticides (total des pesticides organophos ­
phorés et organochlorés, par exemple), en carbone organique total et en solides en suspension. Ces mesures devraient être effectuées tous les trois mois, par exemple, pour une eau de dilution dont on sait que 
la qualité est relativement constante. Si la qualité de l'eau s'est avérée 
constante durant au moins un an, on pourra espacer les détermina ­
tions (par exemple tous les 6 mois). Certaines caractéristiques 
chimiques requises pour une eau de dilution acceptable sont énumé ­
rées a l'appendice 2.
 
1.6.3.  Solutions d'essai  
Par dilution d'une solution mère, on prépare des solutions d'essai aux 
concentrations choisies.  
La solution mère devrait, de préférence, être préparée par simple 
mélange ou agitation de la substance d'essai dans l'eau de dilution par des moyens mécaniques (agitateur ou ultrasons, par exemple). 
Des colonnes de saturation (colonnes de solubilité) peuvent être 
utilisées pour amener la solution mère à la concentration souhaitée.
 
L'emploi de solvants ou de dispersants (agents solubilisants) peut 
être indiqué dans certains cas pour obtenir une solution mère à la concentration voulue. Les solvants qui conviennent sont, par exem ­
ple, l'acétone, l'éthanol, le méthanol, le diméthylsulfoxyde, le dime ­
thylformamide et le triethylèneglycol. Parmi les dispersants adéquats. citons le Cremophor RH40. le Tween 80, la méthylcellulose à 0,01 % et le HCO-40. Il convient d'être vigilant lorsqu'on utilise 
des agents facilement biodégradables (comme l'acétone) et/ou des 
composés très volatils car ils peuvent entraîner une prolifération bactérienne dans les essais dynamiques. Lorsqu'on utilise un agent solubilisant, il ne doit pas avoir d'effet significatif sur la croissance 
des poissons ni d'effets nocifs visibles sur les juvéniles, ce que 
révélera l'observation d'un témoin ne comprenant que le solvant.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1006
 
Les essais dynamiques nécessitent un système qui délivre et dilue en 
continu une solution mère de la substance d'essai (par exemple, une 
pompe doseuse, un dilueur proportionnel, un système de saturation), pour distribuer une série de concentrations dans les enceintes d'essai. Les débits des solutions mères et de l'eau de dilution doivent être 
contrôlés à intervalles quotidiens de préférence, au cours de l'essai, et 
ne devraient pas varier de plus de 10 % tout au long de celui-ci. Un essai tournant (3) a montré que, pour la truite arc-en-ciel, une fréquence de renouvellement de l'eau au cours de l'essai de 6 litres/g 
de poisson/jour était acceptable (voir point 1.8.2.2).
 
S'agissant des essais semi-statiques (essais avec renouvellement), la 
fréquence de renouvellement du milieu dépendra de la stabilité de la substance d'essai, mais un renouvellement quotidien de l'eau est recommandé. Si des essais de stabilité préliminaires (voir point 
1.4) révèlent que la concentration de la substance n'est pas stable 
(c'est-à-dire qu'elle sort d'un intervalle de 80 à 120 % de la concen ­
tration nominale ou qu'elle tombe en dessous de 80 % de la concen ­
tration mesurée initialement) au cours de la période de renouvelle ­
ment, il faudra envisager de pratiquer un essai dynamique.
 
1.6.4.  Sélection de l'espèce  
La truite arc-en-ciel ( Oncorhynchas mykiss ) est recommandée dans 
cet essai car c'est à propos de cette espèce que l'on a acquis la plus grande expérience au cours d'essais tournants (1) (3). D'autres 
espèces bien étudiées peuvent cependant être utilisées, mais le 
mode opératoire devra éventuellement être adapté afin d'offrir les conditions adéquates. Par exemple, on dispose également d'une certaine expérience au sujet du danio ( Danio rerio ) (4) (5) et du 
medaka ( Oryzias latipes ) (6) (7) (8). Dans ce cas, le choix de l'es ­
pèce et de la méthode expérimentale doit être justifié.
 
1.6.5.  Soins des poissons  
Les poissons d'essai seront sélectionnes au sein d'une même popu ­
lation, issue de préférence du même frai, qui aura été gardée pendant au moins deux semaines avant l'essai dans des conditions de qualité 
de l'eau et d'illumination similaires à celles de l'essai. Ils devraient 
recevoir une ration alimentaire quotidienne atteignant au moins 2 % de leur poids corporel et de préférence 4 % pendant toute la durée des soins et de l'essai.
 
Après une période de mise en condition de 48 heures, on mesure la 
mortalité et on applique les critères suivants:  
— mortalité supérieure à 10 % de la population en sept jours: le lot 
entier est rejeté,  
— mortalité comprise entre 5 et 10 % de la population: période 
d'acclimatation prolongée de sept jours, si la mortalité dépasse 
5 % pendant la deuxième période de sept jours, le lot entier est rejeté,
 
— mortalité inférieure à 5 % de la population en sept jours: le lot 
est accepté.  
Les poissons ne devraient pas recevoir un traitement pour une 
maladie durant les deux semaines précédant l'essai ou pendant l'essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1007
 
1.7. CONCEPTION DE L'ESSAI  
Par «conception de l'essai», on entend le choix du nombre et de 
l'espacement des concentrations d'essai, le nombre de récipients par concentration et le nombre de poissons par récipient. Idéalement, 
l'essai devrait être conçu en fonction de:
 
a) l'objectif de l'étude:  
b) la méthode d'analyse statistique qui sera utilisée;  
c) la disponibilité et le coût des ressources expérimentales.  
L'énoncé de l'objectif devrait, si possible, spécifier la puissance 
statistique que requiert une différence donnée (par exemple, dans 
le taux de croissance) pour être détectée, ou encore la précision 
avec laquelle la CE, doit être fournie (avec x = 10, 20 ou 30, par exemple et de préférence pas au-dessous de 10) pour être estimée. 
Faute de quoi il est impossible de donner une indication précise de 
l'échelle de l'étude.
 
Il importe de reconnaître qu'une conception qui est optimale (qui tire 
le meilleur parti des ressources) lorsqu'on utilise une certaine méthode d'analyse statistique ne l'est pas nécessairement avec une autre méthode. La conception recommandée pour l'estimation d'une 
CMEO/CSEO ne sera donc pas identique à celle recommandée pour 
une analyse par régression.
 
Dans la plupart des cas, l'analyse par régression est préférable à 
l'analyse de la variance, pour des raisons exposées par Stephan et Rogers (9) Cependant, si on ne trouve aucun modèle de régression 
adéquat (r
 2 < 0,9), il faut recourir à la CSEO/CMEO.  
1.7.1.  Conception pour l'analyse par régression  
Les considérations importantes pour la conception d'un essai à 
analyser par régression sont les suivantes:  
a) La concentration avec effet (par exemple, CE  10, 20, 30  ) et la 
gamme de concentrations dans laquelle la substance d'essai 
produit un effet intéressant doivent nécessairement être couvertes par les concentrations incluses dans l'essai. La précision avec laquelle les concentrations produisant un effet peuvent être 
estimées sera la meilleure lorsque la concentration avec effet se 
trouve au milieu de la plage des concentrations testées. Un essai préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur peut s'avérer utile pour sélectionner les concentrations d'essai appropriées.
 
b) Pour satisfaire les conditions de la modélisation statistique, l'essai 
doit comporter au moins un récipient témoin et cinq autres à 
différentes concentrations. Le cas échéant, lorsqu'on utilise un agent solubilisant, il faudrait étudier un groupe témoin contenant l'agent solubilisant à la concentration d'essai la plus élevée en 
plus des groupes d'essai (voir paragraphes 1.8.3 et 1.8.4).
 
c) Une série géométrique ou logarithmique appropriée (10) (voir 
appendice 3) peut être utilisée. Un espacement logarithmique 
entre les concentrations d'essai est préférable.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1008
 
d) Si on dispose de plus de six récipients, les récipients supplémen ­
taires devraient servir de répliques ou être répartis dans la gamme 
des concentrations de manière à diminuer l'espacement entre les concentrations. Ces deux mesures sont aussi valables l'une que l'autre.
 
1.7.2.  Conception pour l'estimation de la CSEO/CMEO à l'aide de 
l'analyse de la variance  
Il serait préférable d'avoir plusieurs récipients répliques pour chaque 
concentration, et d'effectuer l'analyse statistique au niveau du réci ­
pient (11). Sans récipients répliques, il est impossible de prendre en 
compte la variabilité entre les récipients en plus de celle qui existe 
d'un poisson à l'autre. L'expérience a cependant montré (12) que la variabilité entre les récipients était très inférieure à celle qui existe au sein de chaque récipient (autrement dit, entre les poissons) dans le 
cas examiné. C'est pourquoi une alternative relativement acceptable 
consiste à effectuer l'analyse statistique au niveau de chaque poisson.
 
On doit normalement utiliser au moins cinq concentrations d'essai 
selon une série géométrique obéissant à un facteur qui ne dépasse 
pas de préférence 3.2.  
Généralement, lorsque les essais sont conduits dans des récipients 
répliques, le nombre de récipients témoins répliques, et par consé ­
quent le nombre de poissons, devrait être le double du nombre choisi 
à chaque concentration d'essai, qui devrait être toujours le même (13) (14) (15). A contrario, sans récipients répliques, le nombre de pois ­
sons dans le groupe témoin devrait être le même que dans chaque 
concentration d'essai.
 
Si l'analyse de la variance est conduite au niveau des récipients 
plutôt qu'à celui des poissons [ce qui exigerait un marquage indivi ­
duel des poissons ou l'utilisation de taux de croissance «pseudo- 
spécifiques» (voir paragraphe 2.1.2)], il faut un nombre suffisant 
de récipients répliques pour pouvoir déterminer l'écart-type entre les «récipients de même concentration». Ce qui signifie que l'erreur dans l'analyse de la variance ait au moins 5 degrés de liberté (1l). Si 
seuls les témoins ont des répliques, la variabilité de l'erreur risque 
d'être faussée puisqu'elle pourrait s'accroître avec la valeur moyenne du taux de croissance en question. Comme le taux de croissance a des chances de diminuer lorsque la concentration augmente, on aura 
tendance à surestimer la variabilité.
 
1.8. MODE OPÉRATOIRE  
1.8.1.  Sélection et pesée des poissons d'essai  
Il importe que le poids des poissons varie le moins possible au début 
de l'essai. On trouvera à l'appendice 1 les gammes de poids qui 
conviennent aux différentes espèces recommandées pour cet essai. 
Idéalement, au début de l'essai, la gamme des poids de l'ensemble du lot de poissons utilisés dans l'essai devrait rester comprise dans un intervalle de ± 10 % de la moyenne arithmétique et en aucun cas 
excéder 25 %. Il est recommandé de peser un sous-échantillon de 
poissons avant l'essai afin d'estimer le poids moyen.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1009
 
Les poissons doivent être privés de nourriture pendant les 24 heures 
qui précèdent le début de l'essai. Ils sont ensuite choisis au hasard. À 
l'aide d'un anesthésique général [par exemple, une solution aqueuse de 100 mg/litre de méthanesulphonate de tricaïne (MS 222) neutra ­
lisée par l'adjonction de deux parts de bicarbonate de sodium par part 
de MS 222], les poissons doivent être pesés individuellement en 
poids frais ( blolted dry , poissons essuyés) avec la précision indiquée 
à l'appendice 1. Les poissons dont le poids se situe à l'intérieur de l'intervalle voulu seront retenus puis répartis au hasard entre les 
récipients d'essai. On notera le poids frais ( wet weighl ) total des 
poissons dans chaque récipient, l'utilisation d'anesthésique de même que la manipulation des poissons (y compris le séchage et la pesée) peuvent stresser et blesser les jeunes poissons, en particu ­
lier les espèces de petite taille. Les juvéniles doivent donc être 
manipulés avec la plus grande précaution afin d'éviter de stresser et de blesser les animaux testés.
 
Les poissons sont pesés à nouveau le 28  e jour de l'essai (voir point 
1.8.6). Si toutefois on juge nécessaire de recalculer la ration alimen ­
taire, on pèsera à nouveau les poissons au 14  e jour de l'essai (voir 
point 1.8.2.3). On pourra recourir à une autre méthode telle que la 
technique photographique par exemple pour évaluer les variations de taille des poissons à partir de quoi la ration alimentaire pourra être ajustée.
 
1.8.2.  Conditions d'exposition  
1.8.2.1.  Durée  
La durée de l'essai est de ≥ 28 jours.  
1.8.2.2.  Taux de charge et densité de peuplement  
Il importe que le taux de charge et la densité soient adaptés à l'espèce 
testée (voir appendice 1). Si la densité de peuplement est trop élevée, le stress engendré par la surpopulation entraînera une diminution des taux 
de croissance, et probablement la maladie. Si elle est trop faible, elle 
peut induire un comportement territorial susceptible d'affecter égale ­
ment la croissance. En tout état de cause, le taux de charge doit être suffisamment bas pour que la concentration de l'oxygène dissous puisse 
être maintenue à au moins 60 % de la valeur de saturation en air, sans 
aération. Un essai tournant (3) a montré que, dans le cas de la truite arc- en-ciel, un taux de charge de 16 truites de 3 à 5 grammes dans un volume de 40 litres était acceptable. La fréquence de renouvellement de 
l'eau recommandée durant l'essai est de 6 litres/g de poissons par jour.
 
1.8.2.3.  Alimentation  
Les poissons doivent recevoir une alimentation adéquate (voir 
appendice 1) en quantité suffisante pour permettre un taux de crois ­
sance acceptable. Il faut veiller à éviter la prolifération microbienne 
et la turbidité de l'eau. Dans le cas de la truite arc-en-ciel, une ration quotidienne de 4 % de son poids corporel par jour devrait remplir ces conditions (3) (16) (17) (18). La ration quotidienne peut être 
divisée en deux parts égales et administrée aux poissons en deux 
fois, à au moins 5 heures d'intervalle. La ration est fonction du poids total initial des poissons dans chaque récipient d'essai. Si les pois ­
sons sont pesés à nouveau le 14
 e jour, on recalcule la ration. Les 
poissons doivent être privés de nourriture pendant les 24 heures qui 
précèdent leur pesée.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1010
 
Les aliments non consommés et les matières fécales doivent être 
enlevés quotidiennement des récipients d'essai par un nettoyage 
soigneux du fond de chaque récipient à l'aide d'un suceur.  
1.8.2.4.  Lumière et température  
La photopériode et la température de l'eau d'essai doivent être adap ­
tées à l'espèce testée (voir appendice 1).  
1.8.3.  Concentrations d'essai  
On doit normalement utiliser cinq concentrations de la substance 
d'essai, quelle que soit la conception de l'essai (voir point 1.7.2). 
Une connaissance préalable de la toxicité de la substance d'essai 
(tirée par exemple d'un essai de toxicité aiguë et/ou d'études de détermination de l'ordre de grandeur) devrait faciliter le choix des concentrations d'essai adéquates. L'utilisation de moins de cinq 
concentrations doit être justifiée. La concentration d'essai la plus 
élevée ne doit pas dépasser la limite de solubilité de la substance dans l'eau.
 
Si un agent solubilisant est utilisé pour faciliter la préparation de la 
solution mère, sa concentration finale ne doit pas dépasser 0,1 ml/1 
et doit, de préférence, être identique dans tous les récipients d'essai 
(voir point 1.6.3). Le recours à ce genre de produit devrait cependant être évité dans toute la mesure du possible.
 
1.8.4.  Témoins  
Le nombre de récipients témoins contenant l'eau de dilution dépend 
de la conception de l'essai (voir points 1.7-1.7.2). Si l'on utilise un 
agent solubilisant, on inclura le même nombre de témoins pour l'eau 
de dilution que pour l'agent solubilisant.  
1.8.5.  Fréquence des analyses quantitatives et des mesures  
Au cours de l'essai, les concentrations de la substance à tester sont 
déterminées à intervalles réguliers (voir ci-après).  
Dans les essais dynamiques, les débits du diluant et de la solution 
mère de substance toxique seront vérifiés périodiquement, de préfé ­
rence chaque jour. Ces débits ne devraient pas varier de plus de 10 % tout au long de l'essai. Lorsque les concentrations de la subs ­
tance d'essai sont censées ne pas s'écarter de ± 20 % des valeurs 
nominales (autrement dit rester comprises dans une plage de 80 à 
120 %; voir points 1.6.2 et 1.6.3), on recommande d'analyser au moins la concentration la plus basse et la plus élevée au début de l'essai et périodiquement toutes les semaines par la suite. Pour les 
essais dans lesquels la concentration de la substance d'essai n'est pas 
censée rester comprise dans un intervalle de ± 20 % des valeurs nominales (d'après les données sur la stabilité de la substance d'es ­
sai), il est nécessaire d'analyser toutes les concentrations d'essai, mais 
selon le même régime.
 
Dans les essais semi-statiques (avec renouvellement) où la concen ­
tration de la substance d'essai est censée rester comprise dans un intervalle de ± 20 % des valeurs nominales, il est recommandé, au minimum, d'analyser la concentration la plus basse et la plus élevée 
juste après leur préparation et juste avant le renouvellement au début 
de l'essai et toutes les semaines par la suite. Pour les essais dans lesquels la concentration de la substance d'essai n'est pas censée rester comprise dans un intervalle de ± 20 % des valeurs nominales, 
il est nécessaire d'analyser toutes les concentrations selon le même 
régime que pour les substances plus stables.
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On préconise de fonder les résultats sur les concentrations mesurées. 
Toutefois, si les données disponibles démontrent que la concentration 
de la substance d'essai en solution a été correctement maintenue, tout au long de l'essai, dans un intervalle de ± 20 % autour de la concen ­
tration nominale ou de la concentration mesurée au départ, les résul ­
tats peuvent s'appuyer sur les valeurs nominales ou mesurées.
 
Il peut s'avérer nécessaire de filtrer (par exemple, à l'aide d'un filtre à 
porcs de 0,45 μm) ou de centrifuger les échantillons. La centrifuga ­
tion est la procédure recommandée. Toutefois, si le milieu d'essai ne s'absorbe pas sur les filtres, la filtration est également acceptable.
 
Pendant l'essai, l'oxygène dissous, le pH et la température doivent 
être mesurés dans tous les récipients d'essai. La dureté totale, l'alca ­
linité et la salinité, s'il y a lieu, doivent être mesurées dans les récipients témoins et dans celui qui contient la concentration la 
plus forte. L'oxygène dissous et la salinité, s'il y a lieu, doivent 
être mesurés au moins trois fois: au début, au milieu et à la fin de l'essai. Dans les essais semi-statiques, on recommande de mesurer l'oxygène dissous plus souvent, de préférence avant et après chaque 
renouvellement de l'eau ou au moins une fois par semaine. Il faut 
mesurer le pH au début et à la fin de chaque période de renouvel ­
lement de l'eau dans les essais à renouvellement statique et au moins une fois par semaine dans les essais dynamiques. La dureté et l'al ­
calinité devraient être mesurées une fois au cours de chaque essai. 11 
est préférable de surveiller la température en continu dans au moins un récipient d'essai.
 
1.8.6.  Observations  
Poids: à la fin de l'essai tous les poissons survivants seront pesés en 
poids frais (poissons essuyés,  blotted dry ) soit en groupes par réci ­
pient d'essai soit individuellement. Il est préférable de peser les 
animaux par récipient d'essai plutôt qu'individuellement, cette dernière méthode obligeant à marquer chaque poisson. Si l'on mesure le taux de croissance spécifique de chaque poisson (pesée 
individuelle), la technique de marquage devra être choisie de façon à 
perturber le moins possible les animaux [on peut utiliser une tech ­
nique différente du cryo-marquage (par congélation), par exemple un mince fil de pêche coloré].
 
Il faut examiner quotidiennement les poissons durant l'essai et 
relever toutes les anomalies externes éventuelles (hémorragie, déco ­
loration, par exemple) et les comportement anormaux. Les décès doivent être comptés et les poissons morts retirés du récipient dès que possible. Les poissons morts ne seront pas remplacés, le taux de 
charge et la densité de peuplement étant suffisamment élevés pour 
éviter que la modification du nombre de poissons ait des effets sur la croissance. Cependant, la ration alimentaire devra être ajustée.
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Il est recommandé qu'un statisticien participe à la fois à la concep ­
tion et à l'analyse de l'essai, car cette méthode autorise des variations 
considérables dans la procédure expérimentale, par exemple en ce qui concerne le nombre d'enceintes expérimentales, de concentrations d'essai, de poissons etc. Compte tenu des choix possibles dans la 
conception de l'essai, aucune orientation ou méthode statistique 
précise n'est proposée ici.
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Il n'y a pas lieu de calculer les taux de croissance dans les récipients 
d'essai où la mortalité dépasse 10 %. Le taux de mortalité doit 
cependant être spécifié pour toutes les concentrations d'essai.  
Quelle que soit la méthode utilisée pour analyser les données, le 
concept central est le taux de croissance spécifique r entre l'instant t
 1 et l'instant t  2 . Il peut être défini de diverses manières selon que les 
poissons ont été ou non marqués individuellement ou selon que l'on 
recherche une moyenne par récipient.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
où: 
r 1 = taux de croissance spécifique de chaque poisson  
r 2 = taux de croissance spécifique moyen par récipient  
r 3 = taux de croissance «pseudo»-spécifique  
w 1 , w 2 = poids d'un poisson donné aux instants t  1 et t 2 , respec­
tivement  
log e w 1 = logarithme du poids d'un poisson donné au début de la 
période d'étude  
log e w 2 = logarithme du poids d'un poisson donné à la fin de la 
période d'étude  
log e W 1 = moyenne des logarithmes des valeurs w  1 des poissons 
du récipient à la fin de la période d'étude  
log e W 2 = moyenne des logarithmes des valeurs w  2 des poissons 
du récipient à la fin de la période d'étude  
t 1 , t 2 = moments (jours) du début et de la fin de la période 
d'étude  
r 1 , r 2 , r 3 peuvent être calculés pour la période comprise entre le jour 
0 et le jour 28 et, s'il y a lieu (c'est-à-dire lorsqu'une mesure a été effectuée au 14
 e jour), pour les périodes entre 0 et 14 jours et 14 et 
28 jours.  
2.1.1.  Analyse des résultats par régression (modélisation concentration- 
effet)  
Cette méthode d'analyse établit une relation mathématique adéquate 
entre le taux de croissance spécifique et la concentration, ce qui permet d'estimer la «CE
 X » c'est-à-dire toute valeur de CE requise. 
Si l'on utilise cette méthode, il est inutile de calculer r pour chaque 
poisson (r  1 ) et l'analyse peut alors s'appuyer sur la valeur moyenne 
de r pour le récipient (r  2 ). Cette dernière méthode est préférable. En 
outre, elle se prête mieux à l'utilisation d'espèces plus petites.  
Pour étudier la relation concentration-effet, on porte sur un graphique 
les taux de croissance spécifiques moyens par récipient (r  2 ) en fonc ­
tion de la concentration.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1013
 
Pour exprimer la relation entre r  2 et la concentration, il convient de 
choisir un modèle adéquat et d'étayer ce choix par un raisonnement 
pertinent.  
Si le nombre de poissons survivants varie suivant le récipient, le 
processus d'ajustement du modèle, qu'il soit simple ou non linéaire, 
doit être pondéré pour tenir compte de la taille inégale des groupes.  
La méthode d'ajustement du modèle doit permettre d'estimer, par 
exemple, la CE  20 et de déduire sa dispersion (écart-type ou intervalle 
de confiance). Le graphique du modèle ajusté devrait être montré en 
regard des données pour permettre d'apprécier l'adéquation de l'ajus ­
tement du modèle (9) (19) (20) (21).  
2.1.2.  Analyse des résultats pour l'estimation de la CMEO  
Si le test porte sur plusieurs récipients d'essai répliques (identiques) 
pour toutes les concentrations, l'estimation de la CMEO pourrait 
s'appuyer sur une analyse de la variance du taux de croissance spécifique moyen de chaque récipient (voir point 2.1), suivie de l'utilisation d'une méthode pertinente [par exemple, un test de 
Dunnett ou de Williams (13) (14) (15) (22)] consistant à comparer 
la moyenne r à chaque concentration avec la moyenne r des témoins afin d'identifier la concentration minimale à laquelle cette différence est significative avec un seuil de probabilité de 0,05. Si les hypo ­
thèses requises concernant les méthodes paramétriques ne sont pas 
remplies — distribution non normale (par exemple, test de Shapiro- Wilk) ou variance hétérogène (test de Bartlett) — il faudra envisager de transformer les données pour homogénéiser les variances avant de 
mener l'analyse de la variance ou de réaliser une analyse pondérée de 
la variance.
 
Si l'essai ne porte pas sur plusieurs récipients par concentration, 
l'analyse de la variance fondée sur les récipients sera insensible ou 
impossible. Dans ces circonstances, on peut parvenir à un compromis acceptable en fondant l'analyse de la variance sur le taux de crois ­
sance «pseudo» spécifique r
 3 de chaque poisson.  
La moyenne r  3 pour chaque concentration d'essai peut ensuite être 
comparée à la moyenne r  3 des témoins. Et la CMEO peut alors être 
déterminée comme précédemment. Il faut admettre que cette méthode ne tient absolument pas compte de la variabilité entre les 
récipients, en dehors de celle imputable à la variabilité entre les 
poissons, et n'offre aucune protection à cet égard. L'expérience a cependant montre (9) que la variabilité entre les récipients était très faible par rapport à celle qui existe dans les récipients (c'est-à- 
dire entre les poissons). Si l'analyse n'englobe pas les données 
concernant chaque poisson, il convient d'indiquer la méthode d'iden ­
tification des valeurs aberrantes (erronées) et de justifier son emploi.
 
2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Les résultats doivent être interprétés avec prudence lorsque les 
concentrations mesurées des produits toxiques dans les solutions 
d'essai sont proches des limites de détection de la méthode d'analyse ou, dans les essais semi-statiques, lorsque la concentration de la substance d'essai diminue entre le moment où la solution vient 
d'être préparée et le moment qui précède le renouvellement.
 
2.3. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit fournir les informations suivantes:  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1014
 
2.3.1.  Substance d'essai  
— État physique et propriétés physico-chimiques pertinentes,  
— données relatives à l'identification chimique, notamment la pureté 
et la méthode d'analyse quantitative de la substance d'essai, s'il y 
a lieu.  
2.3.2.  Espèce testée  
— Nom scientifique,  
— souche éventuelle, taille, fournisseur, traitement préalable éven ­
tuel, etc.  
2.3.3.  Conditions d'essai  
— Méthode utilisée (par exemple, semi-statique/avec renouvelle ­
ment, dynamique, charge, densité de peuplement, etc.),  
— conception de l'essai (par exemple, nombre d'enceintes expéri ­
mentales, de concentrations d'essai et de répliques, nombre de 
poissons par récipient),  
— méthode de préparation des solutions mères et fréquence de 
renouvellement (le solubilisant et sa concentration doivent être 
indiqués, le cas échéant),  
— concentrations d'essai nominales, moyennes des valeurs mesurées 
avec leurs écarts-types dans les récipients d'essai, méthode de 
détermination et données montrant que les mesures se réfèrent aux concentrations de la substance d'essai en solution vraie,
 
— caractéristiques de l'eau de dilution: pH. dureté, alcalinité, tempé ­
rature, concentration de l'oxygène dissous, teneurs résiduelles en chlore (si mesurées), carbone organique total, solides en suspen ­
sion, salinité du milieu d'essai (si mesurée) et toute autre mesure 
effectuée,
 
— qualité de l'eau dans les récipients d'essai: pH, dureté, tempéra ­
ture et concentration de l'oxygène dissous,  
— informations détaillées sur l'alimentation, [par exemple, le type 
d'aliment{s), la source, la quantité donnée et la fréquence].  
2.3.4.  Résultats  
— Données montrant que les témoins remplissent les critères de 
validité relatifs à la survie, et données sur la mortalité à toutes les concentrations d'essai,
 
— techniques d'analyse statistique appliquées, statistiques fondées 
sur les répliques ou les poissons, traitement des données et justification des méthodes utilisées,
 
— tableaux donnant les poids individuels et moyens des poissons 
aux jours 0, 14 (si mesurés) et 28, valeurs des moyennes par récipient ou taux de croissance pseudo-spécifiques (s'il y a lieu) pour les périodes de 0 à 28 jours, ou éventuellement de 0 à 14 et 
de 14 à 28 jours,
 
— résultats de l'analyse statistique (analyse par régression ou 
analyse de la variance) fournis de préférence sous forme de 
tableau ou de graphique, CMEO (p = 0,05) et CSEO ou CE  X 
avec leurs écarts-types si possible,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1015
 
— incidence de toute réaction inhabituelle des poissons et de tout 
effet visible produit par la substance d'essai.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
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 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1018
 ▼B 
Appendice 1  
ESPÈCES DE POISSONS RECOMMANDÉES POUR L'ESSAI ET CONDITIONS D'ESSAI APPROPRIÉES  
Espèce Gamme de 
températures 
recommandée 
( o C) Photopériode 
(heures) Gamme 
recommandée pour 
le poids initial des 
poissons 
(g) Précision requise de 
la mesure Taux de charge 
(g/l) Densité de 
peuplement 
(par litre) Alimentation Durée de l'essai 
(jours)  
Espèce recommandée:  
Oncorhynchus mykiss  
Truite arc-en-ciel 12,5-16,0 12-16 1-5 à 100 mg près 1,2-2,0 4 Spécialité alimentaire sèche 
pour frai de salmonidé ≥ 28 
Autres espèces bien étudiées:  
Danio rerio  
Danio 21-25 12-16 0,050-0,100 à 1 mg près 0,2-1,0 5-10 nourriture vivante  (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28 
Oryzias latipes  
Medaka 21-25 12-16 0,050-0,100 à 1 mg près 0,2-1,0 5-20 nourriture vivante  (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28
Appendice 2  
QUELQUES CARACTÉRISTIQUES CHIMIQUES D'UNE EAU DE 
DILUTION ACCEPTABLE  
Substance Concentrations  
Matières particulaires (particules) < 20 mg/l 
Carbone organique total < 2 mg/l 
Ammoniac non ionisé < 1 μg/l 
Chlore résiduel < 10 μg/l 
Pesticides organophosphorés totaux < 50 ng/l Pesticides organochlorés totaux et biphényles polychlorés < 50 ng/l Chlore organique total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1019
 
Appendice 3  
Série logarithmique de concentrations convenant à un essai de toxicité (9)  
Colonne (nombre de concentrations entre 100 et 10, ou entre 10 et 1)(*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 
10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 
1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 
1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Une série de cinq concentrations successives (ou plus) peut être choisie dans une colonne. Les points intermédiaires entre 
les concentrations d'une colonne (x) se trouvent dans la colonne (2x + 1). Les valeurs énumérées peuvent représenter des 
concentrations exprimées sous forme de pourcentage en volume ou en poids (mg/l ou μg/l). Les valeurs peuvent être 
multipliées ou divisées par la puissance de 10, adéquate. On pourra utiliser la première colonne si le degré de toxicité est tr ès 
incertain.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1020
 
C.15.  POISSON, ESSAI DE TOXICITÉ À COURT TERME AUX 
STADES DE L'EMBRYON ET DE L'ALEVIN  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de toxicité à court terme reprend la 
ligne directrice n  o 212 de l'OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCTION  
Cet essai de toxicité à court terme chez le poisson aux stades de 
l'embryon et de l'alevin consiste à exposer l'animal depuis le stade de 
l'œuf qui vient d'être fécondé jusqu'à la fin du stade de l'alevin. Aucune alimentation n'est fournie durant l'essai sur les embryons et les alevins, et l'essai devrait donc prendre fin alors que les 
alevins se nourrissent encore grâce à leur sac vitellin.
 
Cet essai vise à déterminer les effets létaux et, dans une moindre 
mesure, sublétaux de produits chimiques à des stades définis de la 
vie des espèces testées. Il devrait fournir des informations utiles en ce sens qu'il pourrait a) permettre de faire le lien entre les essais létaux et sublétaux, b) servir d'essai de sélection en vue soit d'un 
essai (complet) de toxicité aux premiers stades de la vie, soit d'un 
essai de toxicité chronique, et c) être utilisé pour tester des espèces pour lesquelles les techniques d'élevage ne sont pas suffisamment au point pour couvrir la période de transition entre alimentation endo ­
gène et alimentation exogène. Il faut savoir que seuls les essais 
couvrant tous les stades de la vie du poisson sont généralement susceptibles de donner une estimation précise de la toxicité chro ­
nique de produits chimiques pour les poissons et que toute limitation 
de l'exposition écartant tel ou tel stade de la vie risque de diminuer la 
sensibilité et donc de donner lieu à une sous-estimation de la toxicité chronique. L'essai aux stades de l'embryon et de l'alevin devrait donc être moins sensible que l'essai (complet) de toxicité aux premiers 
stades de la vie, notamment en ce qui concerne les produits 
chimiques fortement lipophiles (log P
 oe > 4) et les substances 
possédant un mode d'action toxique particulier. On s'attend toutefois à ce que la différence de sensibilité entre les deux essais soit moindre 
pour les produits chimiques à mode d'action narcotique non spéci ­
fique (1).
 
Avant la publication du présent essai, l'essai aux stades de l'embryon 
et de l'alevin a surtout été réalisé sur le poisson d'eau douce  Danio 
rerio  Hamilton-Buchanan (téléostéens, cyprinidés — nom commun: 
danio). C'est la raison pour laquelle l'appendice 1 donne des indica ­
tions détaillées pour la réalisation de l'essai sur cette espèce. 
Cela n'exclut pas pour autant l'utilisation d'autres espèces de poissons pour lesquelles on dispose déjà d'une certaine expérience (tableaux A et B).
 
1.2. DÉFINITIONS  
Concentration minimale avec effet observé (CMEO) : concentra ­
tion la plus basse d'une substance d'essai à laquelle on observe un 
effet significatif (à p ≤ 0,05) par rapport au témoin. Cependant, 
toutes les concentrations d'essai supérieures à la CMEO doivent exercer un effet nocif supérieur ou égal à celui observé à la CMEO.
 
Concentration (maximale) sans effet observé (CSEO) : concentra ­
tion d'essai immédiatement inférieure à la CMEO.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1021
 
1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI  
Les poissons aux stades de l'embryon et de l'alevin sont exposés à 
une gamme de concentrations de la substance d'essai dissoute dans l'eau. Le protocole permet de choisir entre un essai semi-statique ou 
dynamique. Le choix dépend de la nature de la substance d'essai. 
L'essai débute au moment où l'on place les œufs fécondés dans les enceintes expérimentales et prend fin juste avant que le sac vitellin d'une quelconque larve d'une quelconque enceinte expérimentale ait 
été complètement absorbé ou avant que des poissons témoins ne 
meurent d'inanition. Les effets létaux et sublétaux sont évalués et comparés aux valeurs des témoins, en vue de déterminer la concen ­
tration minimale avec effet observé (CMEO) et, de là. la concen ­
tration (maximale) sans effet observé (CSEO). Une autre possibilité consiste à analyser ces effets à l'aide d'un modèle de régression permettant d'estimer la concentration qui provoquerait un certain 
pourcentage d'effet (CL/CE
 x ) où x représente un pourcentage 
d'effet défini).  
1.4. INFORMATIONS CONCERNANT LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Il faudrait disposer des résultats d'un essai de toxicité aiguë réalisé de 
préférence sur l'espèce choisie pour le présent essai. Ces résultats pourront s'avérer utiles pour sélectionner une plage de concentrations appropriée pour l'essai aux premiers stades de la vie. La solubilité 
dans l'eau (y compris la solubilité dans l'eau de l'essai) et la pression 
de vapeur de la substance d'essai doivent être connues. Pour déter ­
miner la concentration de la substance dans les solutions d'essai, il convient d'appliquer une méthode d'analyse fiable, dont la précision 
et la limite de détection sont connues et mentionnées dans le rapport.
 
Les informations sur la substance d'essai qui peuvent être utiles pour 
établir les conditions de l'essai comprennent la formule structurale, la pureté de la substance, la stabilité à la lumière, la stabilité dans les 
conditions de l'essai, le pKa, le coefficient de partage n-octanol/eau 
(P
 oe ) et les résultats d'un essai de biodégradabilité immédiate (voir 
méthode C.4).  
1.5. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
La validité de l'essai repose sur les conditions suivantes:  
— le taux global de survie des œufs fécondés dans les groupes 
témoins et, s'il y a lieu, dans les récipients ne contenant que le solvant, doit être supérieur ou égal aux limites définies dans les 
appendices 2 et 3,
 
— la concentration de l'oxygène dissous doit se situer entre 60 et 
100 % de la valeur de saturation en air tout au long de l'essai,  
— à aucun moment au cours de l'essai, la température de l'eau ne 
doit varier de plus de ± 1,5  o C entre les différentes enceintes 
expérimentales ou entre deux jours consécutifs, et devrait être 
maintenue dans la plage spécifiée pour l'espèce testée 
(appendices 2 et 3).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1022
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Enceintes d'essai  
N'importe quel récipient en verre ou fabriqué dans un matériau 
chimiquement inerte peut être utilisé. Les récipients doivent être 
suffisamment grands pour répondre aux critères de charge (voir 
point 1.7.1.2). Il est recommandé de placer les enceintes expérimen ­
tales au hasard dans la partie du laboratoire où se déroule l'essai. Il est souhaitable de disposer les enceintes expérimentales selon un 
schéma randomisé par blocs, chaque traitement étant représenté 
dans chaque bloc, plutôt que de les placer de façon complètement aléatoire, lorsqu'il existe des effets systématiques dans le laboratoire 
qui peuvent être contrecarrés par la randomisation par blocs. Si celle- 
ci est utilisée, elle doit être prise en compte dans l'analyse ultérieure des résultats. Les enceintes expérimentales doivent être protégées de toute perturbation indésirable.
 
1.6.2.  Sélection des espèces de poissons  
Les espèces de poissons recommandées sont énumérées dans le 
tableau 1A. Cela n'exclut pas l'utilisation d'autres espèces (des exem ­
ples figurent dans le tableau 1B), mais le mode opératoire devra 
éventuellement être adapté afin d'offrir les conditions adéquates. Dans ce cas, les choix de l'espèce et de la méthode expérimentale doivent être justifiés.
 
1.6.3.  Soin des poissons géniteurs  
La ligne directrice 210 de l'OCDE (  1 ) et les références (2) (3) (4) (5) 
(6) donnent des indications détaillées sur la façon de maintenir les 
poissons géniteurs dans des conditions satisfaisantes.  
1.6.4.  Manipulation des embryons et des larves  
Les embryons et les larves peuvent être exposés, au sein de la cuve 
principale, dans des récipients plus petits pourvus de côtés ou d'ex ­
trémités en filet, permettant le passage de la solution d'essai. Il est 
possible d'induire un écoulement non turbulent dans ces petits réci ­
pients en les suspendant à un bras qui déplace le récipient vertica ­
lement, en gardant toujours les organismes submergés; un système de siphon peut aussi être employé. Les œufs fécondés des salmo ­
nidés peuvent être posés sur des supports ou des grilles ayant des 
ouvertures suffisantes pour permettre aux larves de passer au travers après l'éclosion. Les pipettes Pasteur conviennent au prélèvement des embryons et des larves dans les essais semi-statiques où le milieu est 
entièrement renouvelé chaque jour (voir point 1.6.6).
 
Quand on utilise des récipients, des grilles ou des filets pour main ­
tenir les œufs à l'intérieur de la cuve d'essai principale, ces dispositifs doivent être enlevés après l'éclosion des larves (
 1 ), mais il faut 
conserver des filets pour empêcher les poissons de s'échapper. Si 
les larves doivent être transférées, il ne faut pas les exposer à l'air ni utiliser de filets pour enlever les poissons des récipients contenant les œufs (ces précautions sont superflues pour des espèces moins 
fragiles, comme la carpe). Le moment de ce transfert varie avec 
l'espèce et il n'est pas toujours nécessaire. Dans les essais semi- statiques, des béchers ou des récipients peu profonds peuvent être utilisés, munis, si nécessaire, d'une grille placée un peu au-dessus du 
fond du récipient. Si le volume de ces récipients est suffisant pour 
satisfaire aux critères de charge (voir point 1.7.1.2), il n'est pas nécessaire de transférer les embryons ou les larves.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1023  
( 1 ) OCDE. Paris, 1992, ligne directrice 210, «Poisson, essai de toxicité aux premiers stades 
de la vie».
 1.6.5.  Eau  
Toute eau répondant aux caractéristiques chimiques d'une eau de 
dilution acceptable (énumérées à l'appendice 4) et dans laquelle les témoins de l'espèce testée ont un taux de survie au moins aussi 
satisfaisant que celui décrit dans les appendices 2 et 3 peut être 
utilisée pour l'essai. La qualité de cette eau devrait rester constante pendant toute la durée de l'essai. La variation du pH devrait rester comprise dans un intervalle de ± 0,5 unités. Pour s'assurer que l'eau 
de dilution n'influencera pas indûment les résultats de l'essai (par 
exemple en complexant la substance d'essai) ou ne nuira pas au comportement des poissons géniteurs, des échantillons doivent être 
prélevés périodiquement en vue d'être analysés. Il y a lieu de 
mesurer la teneur en métaux lourds (par exemple, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd et Ni), en principaux anions et cations (par exemple, Ca, Mg, Na, K, Cl et SO
 4 ), en pesticides (par exemple, la totalité des organophos ­
phorés et la totalité des organochlorés), en carbone organique total et 
en solides en suspension. Ces mesures devraient être effectuées tous les trois mois, par exemple, lorsqu'on sait que l'eau de dilution présente une qualité relativement constante. Si la qualité de l'eau 
s'est avérée constante sur une période d'au moins un an, les déter ­
minations pourront être plus espacées (par exemple, tous les six mois).
 
1.6.6.  Solutions d'essai  
Par dilution d'une solution mère, on prépare des solutions d'essai aux 
concentrations choisies.  
La solution mère devrait, de préférence, être préparée par simple 
mélange ou agitation mécanique de la substance d'essai dans l'eau 
de dilution (par exemple, au moyen d'un agitateur ou par ultrasons). 
Des colonnes de saturation (colonnes de solubilité) peuvent être utilisées pour amener la solution mère à la concentration souhaitée. Le recours à des solvants ou dispersants (agents solubilisants) doit 
être évité dans toute la mesure du possible; il peut toutefois s'avérer 
nécessaire d'utiliser ces produits pour obtenir une solution mère à la concentration voulue. Les solvants qui conviennent sont, par exem ­
ple, l'acétone, l'éthanol, le méthanol, le diméthyl-formamide et le 
triéthylèneglycol. Parmi les dispersants adéquats, citons le Cremo ­
phor RH40, le Tween 80, la méthylcellulose à 0,01 % et le HCO- 40. Il convient d'être vigilant lorsque l'on utilise des agents facile ­
ment biodégradables (par exemple, l'acétone) et/ou volatils, car ils 
peuvent entraîner une prolifération bactérienne dans les essais dyna ­
miques. L'agent solubilisant, le cas échéant, ne doit pas exercer d'effet significatif sur la survie ni nuire de façon visible aux premiers stades de la vie. d'après l'observation d'un témoin ne comportant que 
le solvant. Cependant, l'usage de ces substances doit être évité dans 
toute la mesure du possible.
 
S'agissant des essais semi-statiques, deux méthodes de renouvelle ­
ment peuvent être adoptées: soit i) les nouvelles solutions d'essai sont préparées dans des récipients propres et l'on transvase avec 
précaution les œufs et les larves survivants dans les nouveaux 
récipients avec un petit volume de solution ancienne, en évitant de les exposer à l'air, soit ii) les organismes testés sont laissés dans leur récipient d'essai pendant que l'on renouvelle au moins 
les trois-quarts de leur eau. La fréquence de renouvellement du 
milieu dépend de la stabilité de la substance d'essai, mais un renouvellement quotidien de l'eau est recommandé. Si les tests préliminaires de stabilité (voir point 1.4) révèlent que la concen ­
tration de la substance n'est pas stable (sort de l'intervalle de 80 à 
120 % de la concentration nominale ou tombe en dessous de 80 % de la concentration mesurée initialement) au cours de la période de renouvellement, il faudrait envisager de pratiquer un 
essai dynamique. Quoi qu'il en soit, il convient d'éviter de stresser 
les larves durant le renouvellement de l'eau.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1024
 
Les essais dynamiques nécessitent un système qui délivre et dilue en 
continu la solution mère de la substance d'essai (par exemple, une 
pompe doseuse, un dilueur proportionnel, un système de saturation), pour distribuer une série de concentrations vers les enceintes d'essai. Les débits des solutions mères et de l'eau de dilution doivent être 
contrôlés à intervalles quotidiens de préférence, et ne devraient pas 
varier de plus de 10 % tout au long de l'essai. Un débit équivalent à au moins cinq volumes d'enceintes expérimentales par 24 heures s'est avéré adéquat (2).
 
1.7. MODE OPÉRATOIRE  
Des informations utiles concernant la marche à suivre pour les essais 
de toxicité sur les embryons de poisson et les alevins se trouvent dans les publications; la bibliographie de ce texte en donne quelques références (7) (8) (9).
 
1.7.1.  Conditions d'exposition  
1.7.1.1.  Durée  
L'essai devrait débuter de préférence dans les 30 minutes qui suivent 
la fécondation des œufs. Les embryons sont immergés dans la solu ­
tion d'essai avant, ou aussitôt que possible après, le commencement 
de la phase de segmentation du blastodisque et, dans tous les cas. 
avant le début du stade de la gastrula. Quand les œufs proviennent d'un fournisseur commercial, il n'est pas toujours possible de débuter l'essai juste après la fécondation. Comme la sensibilité de l'essai peut 
être fortement influencée par un retard dans son lancement, l'essai 
devrait débuter dans les 8 heures qui suivent la fécondation. Les larves n'étant pas nourries durant la période d'exposition, l'essai 
doit s'achever juste avant que le sac vitellin d'une quelconque 
larve d'une quelconque enceinte expérimentale soit complètement absorbé ou avant que les témoins ne meurent d'inanition. La durée de l'essai dépend de l'espèce utilisée. Certaines durées sont recom ­
mandées aux appendices 2 et 3.
 
1.7.1.2.  Charge  
Le nombre d'œufs fécondés au début de l'essai doit être suffisant 
pour répondre aux critères statistiques. Il y a lieu de les répartir au hasard entre les différents traitements et d'utiliser au moins 30 œufs 
fécondés répartis en nombre égal (ou aussi proche de l'égalité que 
possible, car il peut être difficile d'obtenir des lots identiques avec certaines espèces) entre au moins trois enceintes d'essai identiques pour chaque concentration. Le taux de charge (biomasse par volume 
de solution d'essai) doit être suffisamment bas pour qu'une concen ­
tration d'oxygène dissous d'au moins 60 % de la valeur de saturation en air puisse être maintenue sans aération. Dans le cas des essais dynamiques, un taux de charge n'excédant pas 0,5 g/l par 24 heures 
et ne dépassant pas 5 g/l de solution, à tout moment, a été recom ­
mandé (2).
 
1.7.1.3.  Lumière et température  
La photopériode et la température de l'eau d'essai doivent être adap ­
tées à l'espèce testée (voir appendices 2 et 3). En vue de surveiller la 
température, il peut être approprié d'utiliser un récipient d'essai 
supplémentaire.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1025
 
1.7.2.  Concentrations d'essai  
On doit normalement utiliser cinq concentrations de la substance 
d'essai espacées par un facteur constant ne dépassant pas 3,2. La courbe de la CL
 50 en fonction de la période d'exposition, obtenue 
au cours de l'étude de toxicité aiguë, doit être prise en considération 
lors de la sélection de la plage des concentrations d'essai. Il peut être judicieux, dans certaines circonstances, d'utiliser moins de cinq concentrations, par exemple, dans les essais limites, et un intervalle 
plus faible entre les concentrations. L'utilisation de moins de cinq 
concentrations doit être justifiée. Il n'est pas nécessaire de tester les concentrations supérieures à la CL
 50 après 96 heures ou supérieures 
à 100 mg/l lorsque la CL  50 est supérieure à cette concentration. Les 
substances ne devraient pas être testées au-delà de leur limite de solubilité dans l'eau d'essai.
 
Lorsqu'un agent solubilisant est utilisé pour faciliter la préparation 
des solutions d'essai (voir point 1.6.6), sa concentration finale dans les récipients d'essai ne doit pas dépasser 0,1 ml/1 et doit être iden ­
tique dans tous les récipients d'essai.
 
1.7.3.  Témoins  
Un témoin contenant l'eau de dilution (en autant d'exemplaires que 
de besoin) et, le cas échéant, un témoin contenant l'agent solubilisant 
(en autant d'exemplaires que de besoin) doivent être étudiés parallè ­
lement aux séries traitées avec la substance.  
1.7.4.  Fréquence des analyses quantitatives et des mesures  
Au cours de l'essai, les concentrations de la substance à tester sont 
déterminées à intervalles réguliers.  
Dans les essais semi-statiques où la concentration de la substance 
d'essai est censée rester comprise dans un intervalle de ± 20 % 
autour de la concentration nominale (dans une plage de 80 à 
120 %, voir points 1.4 et 1.6.6), il est recommandé, au minimum, d'analyser la concentration la plus basse et la plus élevée, dès leur préparation et juste avant le renouvellement du milieu, à au moins 
trois occasions régulièrement espacées au cours de l'essai (les 
analyses devraient être pratiquées sur des échantillons prélevés dans la même solution, dès leur préparation et au moment du renou ­
vellement).
 
Pour les essais dans lesquels la concentration de la substance d'essai 
n'est pas censée rester comprise dans un intervalle de ± 20 % autour 
de la concentration nominale (d'après les résultats concernant la 
stabilité de la substance), ii est nécessaire d'analyser toutes les concentrations, dès leur préparation et au moment du renouvelle ­
ment, mais selon le même régime, c'est-à-dire à au moins trois 
occasions, régulièrement espacées au cours de l'essai. La détermina ­
tion des concentrations de la substance d'essai avant le renouvelle ­
ment ne doit être réalisée que sur un seul récipient par concentration. 
Les déterminations ne devraient pas être espacées de plus de sept 
jours. On préconise de baser les résultats sur les concentrations mesurées. Toutefois, si les données disponibles montrent que la concentration de la substance d'essai dans la solution s'est maintenue 
correctement dans un intervalle de ± 20 % autour de la concentration 
nominale ou mesurée au départ, tout au long de l'essai, les résultats peuvent s'appuyer sur la concentration nominale ou les valeurs mesu ­
rées au départ.
 
Dans le cas des essais dynamiques, il convient d'appliquer un régime 
de prélèvement des échantillons similaire à celui décrit pour les 
essais semi-statiques (mais le dosage des solutions juste avant leur 
renouvellement ne s'applique pas ici). Néanmoins, si l'essai dure plus de sept jours, il peut être souhaitable d'augmenter le nombre de prélèvements au cours de la première semaine (par exemple, trois 
séries de mesures), afin de s'assurer que les concentrations d'essai 
restent stables.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1026
 
Il peut, dans certains cas, s'avérer nécessaire de filtrer (par exemple, 
à l'aide d'un filtre à pores de 0,45 μm de diamètre) ou de centrifuger 
les échantillons. Toutefois, comme la centrifugation ou la filtration ne permettent pas toujours de séparer la fraction non biodisponible de la substance d'essai de sa fraction biodisponible, il peut être 
inutile de soumettre les échantillons à ces traitements.
 
Pendant l'essai, l'oxygène dissous, le pH et la température doivent 
être mesurés dans tous les récipients d'essai. La dureté totale et la 
salinité, le cas échéant, doivent être déterminées dans les témoins et dans un des récipients contenant la concentration la plus élevée. 
L'oxygène dissous et la salinité, le cas échéant, doivent être 
mesurés au moins trois fois: au début, au milieu et à la fin de l'essai. Dans les essais semi-statiques, il est recommandé de mesurer l'oxy ­
gène dissous plus fréquemment, de préférence avant et après chaque 
renouvellement de l'eau ou au moins une fois par semaine. Le pH 
devrait être mesuré au début et à la fin de chaque période de renou ­
vellement de l'eau dans les essais semi-statiques et au moins une fois par semaine dans les essais dynamiques. Il faudrait déterminer la 
dureté une fois dans chaque essai. La température devrait être 
mesurée quotidiennement et, de préférence, surveillée en continu dans au moins un récipient d'essai.
 
1.7.5.  Observations  
1.7.5.1.  Stade de développement embryonnaire  
Le stade embryonnaire (stade de la gastrula) au début de l'exposition 
à la substance d'essai doit être vérifié aussi précisément que possible. 
Cela peut se faire sur un échantillon représentatif d'œufs bien 
conservés et rendus translucides. Des descriptions et des illustrations des stades embryonnaires peuvent être consultées dans les publica ­
tions (2) (5) (10) (11).
 
1.7.5.2.  Éclosion et survie  
Il faut observer et dénombrer les éclosions et les survivants au moins 
une fois par jour. Il peut être souhaitable d'effectuer des observations 
plus fréquentes au début de l'essai (par exemple, toutes les 30 minutes au cours des trois premières heures), puisque dans certains cas, les temps de survie peuvent être plus significatifs que 
le seul nombre de morts (notamment en cas d'effets toxiques aigus). 
Les larves et les embryons morts doivent être retirés dès qu'ils sont repérés, car ils peuvent se décomposer rapidement. Il convient d'être extrêmement attentif, lorsque l'on retire les individus morts, à ne pas 
heurter ou léser physiquement les œufs et les larves adjacents, qui 
sont très délicats et sensibles. Les critères indiquant la mort varient en fonction du stade de développement:
 
— pour les œufs : en particulier au début de leur cycle, une dimi ­
nution marquée de la transparence et un changement de colora ­
tion, dus à la coagulation et/ou à la précipitation de protéines et 
conduisant à un aspect blanc opaque,  
— pour les embryons : absence de mouvement corporel et/ou 
absence de battement du cœur et/ou décoloration opaque chez les espèces dont les embryons sont normalement transparents,
 
— pour les larves : immobilité et/ou absence de mouvement respira ­
toire et/ou absence de battement du cœur et/ou coloration blanche 
opaque du système nerveux central et/ou absence de réaction aux 
stimuli mécaniques.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1027
 
1.7.5.3.  Aspect anormal  
On doit noter le nombre de larves présentant une anomalie corporelle 
et/ou de la pigmentation, ainsi que le stade de résorption du sac vitellin, à des intervalles de temps adéquats, en fonction de la 
durée de l'essai et de la nature de l'anomalie décrite. Il faut savoir 
que des larves et des embryons anormaux surviennent de façon naturelle et que leur proportion peut atteindre quelques pour cent chez le ou les témoins de certaines espèces. Les animaux anormaux 
ne doivent être retirés des récipients d'essai qu'à leur mort.
 
1.7.5.4.  Comportement anormal  
Des anomalies telles qu'une hyperventilation, une nage mal coor ­
donnée et une immobilité atypique doivent être notées à des inter ­
valles de temps qui dépendent de la durée de l'essai. Ces effets, bien que difficiles à quantifier, peuvent le cas échéant contribuer à l'inter ­
prétation des données de mortalité, en fournissant des informations 
sur le mode d'action toxique de la substance.
 
1.7.5.5.  Longueur  
À la fin de l'essai, il est recommandé de mesurer la longueur de 
chaque individu en utilisant la longueur standard, la longueur à la 
fourche ou la longueur totale. Cependant, si l'on constate une putré ­
faction de la nageoire caudale ou une usure des nageoires, on doit employer la longueur standard. Habituellement, dans un essai correc ­
tement exécuté, le coefficient de variation de la longueur entre les 
différents récipients des témoins doit être ≤ 20 %.
 
1.7.5.6.  Poids  
À la fin de l'essai, chaque individu peut être pesé; le poids sec (24 
heures à 60  o C) est préférable au poids frais (poissons essuyés). 
Généralement, dans un essai correctement exécuté, le coefficient de 
variation du poids entre les différents récipients des témoins doit être ≤ 20 %.
 
Ces observations permettront de livrer une partie ou la totalité des 
données suivantes à l'analyse statistique:  
— mortalité cumulée,  
— nombre de larves saines à la fin de l'essai,  
— moment du commencement de l'éclosion et de la fin de celle-ci 
(90 % d'œufs éclos dans chaque enceinte de concentration iden ­
tique),  
— nombre de larves écloses chaque jour,  
— longueur (et poids) des animaux survivants à la fin de l'essai,  
— nombre de larves déformées ou d'aspect anormal,  
— nombre de larves présentant un comportement anormal.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1028
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Il est recommandé qu'un statisticien participe à la fois à la concep ­
tion et à l'analyse de l'essai, puisque cette méthode autorise des 
variations considérables dans la procédure expérimentale, par 
exemple en ce qui concerne le nombre d'enceintes expérimentales, le nombre de concentrations d'essai, le nombre initial d'œufs fécondés et les paramètres mesurés. Compte tenu des choix possibles 
dans la conception de l'essai, on ne donnera pas ici d'orientations 
précises sur les méthodes statistiques.
 
Si la CMEO et la CSEO doivent être estimées, il sera nécessaire 
d'analyser les variations au sein de chaque série d'enceintes de 
concentration identique par l'analyse de la variance ou les méthodes 
avec tableau de contingence. La méthode de Dunnett peut être utile pour procéder à des comparaisons multiples entre les résultats obtenus à chaque concentration et ceux des témoins (12) (13). Il 
existe d'autres exemples pertinents (14) (15). La grandeur de l'effet 
détectable par l'analyse de la variance ou par d'autres méthodes (c'est-à-dire la puissance de l'essai) devrait être calculée et mentionnée dans le rapport. Il faut savoir que les observations 
énumérées au point 1.7.5.6 ne se prêtent pas toutes au traitement 
statistique par l'analyse de la variance. À titre d'exemple, la mortalité cumulée et le nombre de larves saines à la fin de l'essai pourraient être analysés à l'aide de méthodes des probits.
 
S'il y a lieu d'estimer la CL et la CE  X , une courbe adéquate, telle que 
la courbe logistique, doit être ajustée aux résultats étudiés par une méthode statistique telle que la méthode des moindres carrés ou des moindres carrés non linéaires. La ou les courbes doivent être para ­
métrées de façon que la CL et la CE, recherchées et leur écart-type 
puissent être estimés directement. Cela facilitera beaucoup le calcul des limites de confiance autour de la CL et de la CE
 X . À moins 
d'avoir de bonnes raisons de préférer d'autres niveaux de confiance, 
des limites de confiance de 95 % de part et d'autre devraient être 
choisies. La procédure d'ajustement devrait, de préférence, permettre d'évaluer la signification du manque d'ajustement. Des méthodes graphiques d'ajustement des courbes peuvent être utilisées. Toutes 
les observations énumérées au point 1.7.5.6 se prêtent à l'analyse 
de régression.
 
2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Les résultats doivent être interprétés avec prudence, lorsque les 
concentrations mesurées des produits toxiques dans les solutions d'essai sont proches des limites de détection de la méthode d'analyse. 
L'interprétation des résultats concernant les concentrations supé ­
rieures à la solubilité de la substance dans l'eau doit aussi se faire avec prudence.
 
2.3. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
2.3.1.  Substance d'essai  
— État physique et propriétés physico-chimiques pertinentes,  
— données relatives à l'identification chimique, notamment la pureté 
et la méthode d'analyse quantitative de la substance d'essai, s'il y 
a lieu.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1029
 
2.3.2.  Espèce d'expérience  
— Nom scientifique, variété, nombre de poissons parents (c'est-à- 
dire nombre de femelles utilisées pour fournir le nombre d'œufs requis par l'essai), source et méthode de collecte des œufs 
fécondés et manipulations ultérieures.
 
2.3.3.  Conditions d'essai  
— Méthode utilisée (par exemple, semi-statique ou dynamique, 
temps écoulé entre la fécondation et le début de l'essai, charge, etc.),
 
— photopériode(s),  
— conception de l'essai (par exemple, nombre d'enceintes expéri ­
mentales et d'exemplaires de même concentration, nombre d'em ­
bryons par exemplaire),  
— méthode de préparation des solutions mères et fréquence de 
renouvellement (l'agent solubilisant et sa concentration doivent 
être spécifiés, le cas échéant),  
— concentrations nominales de l'essai, valeurs mesurées dans les 
récipients d'essai, moyennes et écarts-types de celles-ci et 
méthode de détermination; si la substance d'essai est soluble 
dans l'eau à des concentrations inférieures à celles qui ont été testées, il faut démontrer que les mesures se réfèrent aux concen ­
trations de la substance d'essai dans la phase dissoute,
 
— caractéristiques de l'eau de dilution: pH, dureté, température, 
concentration d'oxygène dissous, teneur en chlore résiduel (si elle a été mesurée), carbone organique total, solides en suspen ­
sion, salinité du milieu d'essai (si elle a été mesurée) et toute 
autre mesure effectuée,
 
— qualité de l'eau dans les récipients d'essai, pH, dureté, tempéra ­
ture et concentration d'oxygène dissous.  
2.3.4.  Résultats  
— Résultats des éventuelles études préliminaires sur la stabilité de la 
substance d'essai,  
— données montrant que les témoins répondent à la norme générale 
d'acceptabilité relative à la survie de l'espèce (appendices 2 et 3),  
— résultats concernant la mortalité et la survie aux stades de l'em ­
bryon et de la larve et taux de mortalité et de survie globaux,  
— délais d'éclosion et nombre d'œufs éclos,  
— longueur (et poids),  
— description et fréquence des anomalies morphologiques, le cas 
échéant,  
— description et fréquence des effets sur le comportement, le cas 
échéant,  
— analyse statistique et traitement des données,  
— pour les essais soumis à l'analyse de la variance, la concentration 
minimale avec effet observé (CMEO) à p = 0,05 et la concen ­
tration sans effet observé (CSEO) pour chaque réponse évaluée, 
ainsi qu'une description des méthodes statistiques utilisées et une 
indication de la grandeur de l'effet qui peut être détecté.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1030
 
— pour les essais analysés à l'aide de techniques de régression, la 
CL et la CE  x et leurs intervalles de confiance et un graphique du 
modèle ajusté utilisé pour les calculer,  
— justification de tout écart par rapport à la présente méthode 
d'essai.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
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Tableau 1A  
Espèces de poissons recommandées pour l'essai  
Eau douce  
Oncorhynchus mykiss  
Truite arc-en-ciel (9) (16)  
Danio rerio  
Danio (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Carpe commune (8) (19)  
Oryzias latipes  
Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
Tête-de-boule (8) (22)  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1032
 
Tableau 1B  
Exemples d'autres espèces également utilisées et sur lesquelles on possède une bonne documentation  
Eau douce Eau salée  
Carassius auratus  
Cyprin doré (8)  Menidia peninsulae  
Capucette nord-américaine (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
Crapet arlequin (8)  Clupea harengus  
Hareng (24) (25)  
Gadus morhua  
Morue (24) (25)  
Cyprinodon variegalus  
Fondule tête de mouton (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1033
 
Annexe 1  
ORIENTATIONS POUR LA RÉALISATION D'UN ESSAI DE TOXICITÉ 
SUR LES EMBRYONS ET LES ALEVINS DU DANIO  (BRACHYDANIO 
RERIO)  
INTRODUCTION  
Le danio est originaire de la côte de Coromandel. en Inde, où il peuple les 
rivières à courant rapide. C'est une espèce courante en aquarium, appartenant à la famille des carpes. Des informations sur les méthodes d'élevage et les soins à lui apporter se trouvent dans des manuels de référence sur les poissons tropicaux. 
Sa biologie et son utilisation dans la recherche liée à la pêche ont été passées en 
revue par Laale (1).
 
Ce poisson dépasse rarement 45 mm de longueur. Son corps cylindrique arbore 7 
à 9 rayures horizontales bleu foncé et argentées. Ces rayures se prolongent dans les nageoires caudales et anales. Son dos est vert olive. Les mâles sont plus 
minces que les femelles. Les femelles sont plus argentées et leur abdomen est 
distendu, en particulier avant le frai.
 
Les poissons adultes sont capables de supporter de grandes fluctuations de 
température, de pH et de dureté. Toutefois, afin de disposer de poissons sains qui produisent des œufs de bonne qualité, il faut leur fournir des conditions 
optimales.
 
Pendant la parade nuptiale, le mâle poursuit la femelle et lui donne des coups de 
tête; les œufs sont fécondés dès qu'ils sont expulsés. Les œufs, qui sont trans ­
parents et non adhérents, tombent au fond où ils peuvent être mangés par les parents. Le frai est influencé par la lumière. Si la lumière du matin est suffisante, 
le poisson fraie habituellement au cours des premières heures qui suivent le lever 
du soleil.
 
Une femelle peut produire des pontes de plusieurs centaines d'œufs à des inter ­
valles d'une semaine.  
ÉTAT DES POISSONS PARENTS, REPRODUCTION ET PREMIERS 
STADES DE LA VIE  
Un nombre adéquat de poissons sains est sélectionné et gardé dans une eau 
appropriée (voir à l'appendice 4 par exemple) pendant au moins deux semaines avant le frai prévu. Le groupe de poissons devrait s'être reproduit au moins une fois avant d'engendrer la série d'œufs utilisés dans l'essai. La densité des poissons 
durant cette période ne devrait pas excéder 1 gramme de poissons par litre. La 
densité pourra être plus élevée si l'eau est renouvelée régulièrement ou si on a recours à des systèmes de purification. La température des aquariums devrait être maintenue à 25 ± 2
 o C. Les poissons devraient recevoir un régime alimentaire 
varié, qui pourrait se composer, par exemple, d'aliments déshydratés appropriés 
trouvés dans le commerce, d'Artemia vivants récemment éclos, de chironomidés, de Daphnia  et de vers blancs de la famille des enchytréidés.
 
Deux méthodes ayant permis d'obtenir un lot suffisant d'œufs fécondés sains, en 
vue de l'essai, sont résumées ci-dessous:  
i) Huit femelles et seize mâles sont placés dans un aquarium contenant 50 litres 
d'eau de dilution, protégé de la lumière directe. On évitera le plus possible de 
les perturber pendant au moins 48 heures. Un support de frai est disposé au fond de l'aquarium, pendant l'après-midi du jour qui précède le début de l'essai. Le support de frai se compose d'un cadre (en plexiglas ou dans un 
autre matériau adapté) de 5 à 7 cm de haut, muni d'un filet à grosse; mailles 
(2-5 mm) à son sommet et d'un filet à mailles fines (10-30 um) à sa base. Plusieurs «arbres à frai», consistait en une corde de nylon non torsadée, sont attachés au filet à grosses mailles du support. Après que les poissons on été 
laissés dans l'obscurité pendant 1 2 heures, on allume une faible lumière qui 
va déclencher le frai. 2 à 4 heure après le frai, le support de frai est retiré et les œufs sont récupérés. Le support de frai empêchera les poissons d manger les œufs et facilitera en même temps la collecte des œufs. Le groupe de 
poissons devra avoir frayé au moin une fois avant le frai qui donnera les 
oeufs destinés à l'essai.
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ii) Cinq à dix poissons mâles et femelles sont gardés dans des aquariums indi ­
viduels pendant au moins deux semaint avant le frai prévu. Après 5 à 10 
jours, les abdomens des femelles seront distendus et leurs papilles génitales app, raîtront visiblement. Les poissons mâles n'ont pas de papilles. Le frai se déroule dans des cuves équipées d'un fat fond en filet (voir ci-dessus}. La 
cuve est remplie d'eau de dilution jusqu'à une hauteur de 5 à 10 cm au-dessus 
c filet. Une femelle et deux mâles sont placés dans la cuve un jour avant le frai prévu. La température de l'eau (portée progressivement à un degré au- dessus de la température d'acclimatation. On éteint la lumière et on évi autant 
que possible toute perturbation aux poissons. Au matin, une faible lumière est 
allumée, qui déclenchera frai. Après 2 à 4 heures, les poissons sont enlevés et les œufs récoltés. Si le nombre d'œufs nécessaire dépasse capacité de produc ­
tion d'une femelle, un nombre suffisant de cuves de frai peut être disposé en 
parallèle. En nota la capacité de reproduction de chaque femelle avant l'essai 
(taille de la ponte et qualité des œufs), on peut sélectio ner les femelles qui possèdent la capacité de reproduction la plus avantageuse pour l'essai.
 
Les œufs doivent être transférés vers les récipients d'essai dans des tubes en verre 
(diamètre intérieur supérieur ou égal à 4 mm) dotés d'une poire aspirante souple. La quantité d'eau accompagnant les œufs lors de leur transfert devrait être aussi 
faible que possible. Les œufs sont plus denses que l'eau et tombent hors du tube. 
Il faut veiller à ce que les œufs (et les larves) n'entrent pas en contact avec l'air. On procédera à un examen microscopique d'un ou de plusieurs échantillons de pontes, pour vérifier s'il n'y a pas d'anomalies aux premiers stades de dévelop ­
pement. La désinfection des œufs n'est pas autorisée.
 
Le taux de mortalité des œufs est le plus élevé dans les 24 heures qui suivent la 
fécondation. On observe souvent une mortalité de 5 à 40 % durant cette période. Les œufs dégénèrent parce que la fécondation a échoué ou le développement ne se déroule pas normalement. La qualité des œufs d'une ponte semble dépendre de 
la femelle, certaines femelles produisant systématiquement des œufs de bonne 
qualité, tandis que d'autres n'y arrivent jamais. La vitesse de développement et d'éclosion varie aussi d'une ponte à l'autre. Les œufs dont la fécondation s'est bien déroulée et les alevins présentent un taux de survie élevé, normalement 
supérieur à 90 % pour cent. À 25
 o C, les œufs éclosent 3 à 5 jours après la 
fécondation et le sac vitellin est absorbé environ 13 jours après la fécondation.  
Le développement embryonnaire a été bien caractérisé par Hisaoka et Battle (2). 
Grâce à la transparence des œufs et des larves écloses, il est possible de suivre le développement des poissons et d'observer la présence de malformations. Environ 
4 heures après le frai, les œufs fécondés peuvent être distingués des œufs non 
fécondés (3). Les œufs et les larves sont placés dans des récipients d'essai de petit volume puis examinés au microscope.
 
Les conditions d'essai qui s'appliquent aux premiers stades de la vie sont énumé ­
rées à l'appendice 2. Les valeurs optimales pour le pH et la dureté de l'eau de dilution sont respectivement de 7,8 et de 250 mg de CaCO
 3 /l. 
CALCULS ET STATISTIQUES  
Une démarche en deux étapes est proposée. Tout d'abord, on procède à l'analyse 
statistique des données concernant la mortalité, les anomalies du développement et le moment de l'éclosion. Ensuite, on évalue statistiquement la longueur corpo ­
relle des poissons pour les concentrations auxquelles aucun effet nuisible n'a été 
détecté sur l'ensemble de ces trois premiers paramètres. Cette démarche est 
souhaitable étant donné que le produit toxique peut sélectivement tuer les plus petits poissons, retarder l'éclosion et induire des malformations évidentes, et par conséquent fausser les mesures de la longueur. En outre, il y aura à peu près le 
même nombre de poissons à mesurer par traitement, ce qui garantira la validité 
de l'analyse statistique de l'essai.
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DÉTERMINATION DE LA CL  50 ET DE LA CE  50 
Le pourcentage d'œufs et de larves survivants est calculé et corrigé en fonction 
de la mortalité chez les témoins à l'aide de la formule d'Abbott (4):  
P ¼ 100 Ä Í C Ä P 
C Ü 100 Î 
où: 
P = pourcentage de survivants corrigé  
P' = pourcentage de survivants observé dans la concentration d'essai  
C = pourcentage de survivants chez les témoins  
Si possible, la CL  50 devra être déterminée par une méthode appropriée à la fin de 
l'essai.  
Si l'on souhaite intégrer les données relatives aux malformations morphologiques 
dans le traitement statistique de In CE  50 on trouvera des indications à ce sujet 
dans l'article de Stephan (5).  
ESTIMATION DE LA CMEO ET DE LA CSEO  
L'essai de toxicité aux stades de l'embryon et de l'alevin vise notamment à 
comparer les expériences menées à des concentrations non nulles avec les témoins afin de déterminer la CMEO. Il y a donc lieu d'appliquer les méthodes 
de comparaisons multiples (6) (7) (8) (9) (10).
 
BIBLIOGRAPHIE  
(1) Laale H. W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanïo  
rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10. 
pp. 121-173.  
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages 
of the Zebrafish  Brachydanio reno  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102. 
311 pp.  
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, pp. 173-181.  
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1-333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 
766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81.
 
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Compa ­
ring Several Treatments with a Control.). Amer. Statist. Assoc, 50, 
pp. 1096-1121.  
(7) Dunnett C. W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, pp. 103-117.  
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1036
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Appendice 2  
CONDITIONS ET DURÉE DE L'ESSAI ET CRITÈRES DE SURVIE POUR LES ESPÈCES RECOMMANDÉES  
Espèce Température 
(degrés C) Salinité 
( %o) Photopériode 
(heures) Durée des stades 
(jours) 
Durée habituelle de l'essai Survie des témoins 
( % minimum) 
Embryon Alevin Taux de réussite 
de l'éclosion Après éclosion  
EAU DOUCE  
Brachydanio rerio  
Danio 25 ± 1 — 12-16 3-5 8-10 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 5 jours 
après l'éclosion (8-10 jours) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Truite arc-en-ciel 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  3 ) 30-35 25-30 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 20 jours après l'éclosion (50-55 jours) 66 70  
Cyprinus carpio  
Carpe commune 21-25 — 12-16 5 > 4 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 4 jours 
après l'éclosion (8-9 jours) 80 75  
Oryzias latipes  
Medaka 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 5 jours après l'éclosion (13-16 jours) 80 80  
Pimephales promelas  
Tête-de-boule 25 ± 2 — 16 4-5 5 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 4 jours après l'éclosion (8-9 jours) 60 70
 
( 1 ) Pour les embryons. 
( 2 ) Pour les larves. 
( 3 ) Obscurité pour les embryons et les larves jusqu'à une semaine après l'éclosion, sauf pendant qu'on les examine. Une lumière t amisée est ensuite appliquée jusqu'à la fin de l'essai.
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Appendice 3  
Conditions de l'essai, durée et critères de survie pour d'autres espèces sur lesquelles on possède une bonne documentation  
Espèce Température 
(degrés C) Salinité (% 0) Photopériode 
(heures) Durée des stades (jours) 
Durée habituelle de l'essai sur l'embryon et l'alevin Survie des témoins ( % minimum) 
Embryon Alevin Taux de réussite 
de l'éclosion Après éclosion  
EAU DOUCE  
Carassius auratus  
Cyprin doré 24 ± 1 — — 3-4 > 4 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 4 jours après l'éclosion (7 jours) _ 80  
Léopomis macrochirus  
Crapet arlequin 21 ± 1 — 16 3 > 4 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 4 jours 
après l'éclosion (7 jours) — 75 
EAU SALÉE  
Menidia peninsulae  
Capucette nord-américaine 22-25 15-22 12 1,5 10 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 5 jours 
après l'éclosion (6-7 jours) 80 60  
Clupea harengus  
Hareng 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 3 jours après l'éclosion (23-27 jours) 60 80  
Gadus morhua  
Morue 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 3 jours 
après l'éclosion (18 jours) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Fondule tête de mouton 25 ± 1 15-30 12 — — Dès que possible après la fécondation 
(début du stade gastrula) jusqu'à 4/7 jours après l'éclosion (28 jours) > 75 80
APPENDICE 4  
QUELQUES CARACTÉRISTIQUES CHIMIQUES D'UNE EAU DE 
DILUTION ACCEPTABLE  
Substance Concentrations  
Matières particulaires < 20 mg/l 
Carbone organique total < 2 mg/l 
Ammoniac non ionisé < 1 μg/l 
Chlore résiduel < 10 μg/l 
Pesticides organophosphorés totaux < 50 ng/l Pesticides organochlorés totaux et biphényles polychlorés < 50 ng/l Chlore organique total < 25 ng/l
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C.16.  ABEILLE DOMESTIQUE — ESSAI DE TOXICITÉ AIGUË 
PAR VOIE ORALE  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de toxicité aiguë reprend la ligne 
directrice n  o 213 de l'OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCTION  
Le présent essai de toxicité est une méthode d'essai en laboratoire 
destinée à évaluer la toxicité aiguë par voie orale des pesticides et d'autres produits chimiques pour des abeilles domestiques ouvrières adultes.
 
Lorsqu'on apprécie et évalue les caractéristiques toxiques d'une subs ­
tance, il peut être nécessaire de déterminer sa toxicité aiguë par voie 
orale pour les abeilles domestiques, par exemple, lorsque des abeilles risquent d'être exposées à cette substance. L'essai de toxicité aiguë par voie orale vise à déterminer la toxicité intrinsèque des pesticides 
et d'autres produits chimiques pour les abeilles. Les résultats de cet 
essai devraient être mis à profit pour établir la nécessité d'une évaluation plus poussée. Cette méthode peut être utilisée, en parti ­
culier, dans des programmes séquentiels destinés à évaluer les 
risques des pesticides pour les abeilles, selon la progression suivante: essais de toxicité en laboratoire, essais en conditions semi-naturelles et essais sur le terrain (1). Les pesticides peuvent être testés en tant 
que substances actives ou en tant que préparations chimiques.
 
Un étalon de toxicité doit être utilisé pour vérifier la sensibilité des 
abeilles et la précision du protocole d'essai.  
1.2. DÉFINITIONS  
Toxicité aiguë par voie orale : effets nocifs se produisant dans un 
délai maximal de 96 heures après l'administration d'une dose unique de la substance d'essai par voie orale.
 
Dose : de substance d'essai consommée. La dose est exprimée en 
masse (μg) de substance d'essai par animal testé ( μg/abeille). La 
dose réellement consommée par chaque abeille ne peut être calculée, étant donné que les abeilles sont nourries collectivement, mais il est possible d'estimer une dose moyenne (quantité totale de substance 
d'essai consommée/nombre d'abeilles testées par cage).
 
DL 50 (dose létale 50 %) orale : dose unique d'une substance, 
obtenue par calcul statistique, susceptible d'entraîner la mort de 50 % des animaux lorsqu'elle est administrée par voie orale. La DL
 50 s'exprime en μg de substance d'essai par abeille. Pour les 
pesticides, la substance d'essai peut être une substance active ou 
une préparation chimique contenant une ou plusieurs substances actives.
 
Mortalité : un animal est noté comme mort lorsqu'il est complète ­
ment immobile.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Des abeilles domestiques ouvrières adultes  (Apis mellifera)  sont 
exposées à une gamme de doses de la substance d'essai dispersée 
dans une solution de saccharose. Elles reçoivent ensuite la même alimentation, mais sans la substance d'essai. La mortalité est notée quotidiennement durant au moins 48 heures et comparée aux valeurs 
des témoins. Si le taux de mortalité augmente entre 24 heures et 48 
heures, tandis que la mortalité des témoins demeure à un niveau acceptable, c'est-à-dire ≤ 10 %, il convient d'allonger la durée de 
l'essai jusqu'à 96 heures au maximum. On analyse les résultats afin 
de calculer la DL
 50 à 24 heures et à 48 heures et, si l'étude est 
prolongée, à 72 heures et à 96 heures.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1040
 
1.4. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
La validité de l'essai repose sur les conditions suivantes:  
— le taux moyen de mortalité de l'ensemble des témoins ne doit pas 
dépasser 10 % à la fin de l'essai,  
— la DL  50 de l'étalon de toxicité se trouve dans la gamme spécifiée.  
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.5.1.  Collecte des abeilles  
Il convient d'utiliser de jeunes abeilles ouvrières adultes de la même 
race, autrement dit des abeilles du même âge, nourries de la même façon, etc. Elles doivent provenir de colonies saines, correctement nourries, dépourvues autant que possible d'individus malades, 
possédant une reine dans la ruche, et dont on connaît l'histoire et 
l'état physiologique. Elles peuvent être collectées le matin du jour où elles seront utilisées ou la veille au soir et gardées dans les condi ­
tions de l'essai jusqu'au jour suivant. Les abeilles récoltées sur des 
cadres dépourvus de couvain conviennent. Il faut éviter de collecter 
les abeilles au début du printemps ou à la fin de l'automne parce qu'elles subissent un changement physiologique à ces époques. Si les 
essais doivent être effectués au début du printemps ou à la fin de 
l'automne, on peut faire éclore les abeilles dans une étuve et elles seront ensuite élevées pendant une semaine avec du pain d'abeille (pollen récolté sur les rayons) et une solution de saccharose. Les 
abeilles traitées avec des substances chimiques, telles que des anti ­
biotiques, des antivarroa, etc., ne doivent pas être soumises à des essais de toxicité durant 4 semaines à partir de la fin du dernier traitement.
 
1.5.2.  Conditions d'encagement et d'alimentation  
On utilise des cages faciles à nettoyer et bien ventilées. Tout maté ­
riau approprié peut être employé, par exemple des cages en acier inoxydable, en toile métallique, en plastique, des cages jetables en 
bois, etc. Il est préférable de répartir les abeilles en groupes de dix 
par cage. La dimension des cages d'essai doit être adaptée au nombre d'abeilles, c'est-à-dire leur fournir un espace suffisant.
 
Les abeilles doivent être gardées à l'obscurité dans une salle d'expé ­
rience chauffée à une température de 25 ± 2  o C. L'humidité relative, 
comprise normalement entre 50 et 70 %, doit être enregistrée tout au 
long de l'essai. Les manipulations, et notamment le traitement et les observations, peuvent s'effectuer à la lumière (du jour). Les abeilles sont nourries avec une solution de saccharose dans l'eau dont la 
concentration finale s'élève à 500 g/1 (50 % en poids par unité de 
volume). Après que les doses d'essai ont été administrées, l'alimen ­
tation doit être fournie ad libitum. Le système d'alimentation doit permettre l'enregistrement de la prise de nourriture dans chaque cage 
(voir point 1.6.3.1). Un tube de verre (de quelque 50 mm de long et 
10 mm de large, dont le diamètre de l'extrémité ouverte est rétréci à environ 2 mm) peut être utilisé.
 
1.5.3.  Préparation des abeilles  
Les abeilles récoltées sont réparties au hasard dans les cages d'essai 
qui, elles-mêmes, sont disposées au hasard dans la salle d'expérience.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1041
 
Les abeilles peuvent être privées de nourriture pendant une durée 
maximale de 2 heures avant le début de l'essai. On recommande de 
faire jeûner les abeilles avant le traitement pour que le niveau de remplissage de leur tube digestif soit identique au début de l'essai. Les abeilles moribondes doivent être enlevées et remplacées par des 
abeilles saines avant le début de l'essai.
 
1.5.4.  Préparation des doses  
Si la substance d'essai est miscible dans l'eau, elle peut être dispersée 
directement dans une solution de saccharose à 50 %. Pour les produits de qualité technique et les substances peu solubles dans l'eau, des véhicules tels que des solvants organiques, des émulsifiants 
ou des dispersants peu toxiques pour les abeilles peuvent être utilisés 
(par exemple, de l'acétone, du diméthylformamide, du diméthylsul ­
foxyde). La concentration du véhicule dépend de la solubilité de la substance d'essai et doit être identique pour toutes les concentrations 
testées. Cependant, il convient généralement d'appliquer une concen ­
tration de 1 % pour le véhicule et de ne pas la dépasser.
 
Des solutions témoins appropriées doivent être préparées; autrement 
dit, si un solvant ou un dispersant ont été employés pour solubiliser 
la substance d'essai, deux groupes de témoins doivent être utilisés: une solution aqueuse et une solution de saccharose renfermant le solvant ou le véhicule à la même concentration que dans les solu ­
tions d'essai.
 
1.6. MODE OPÉRATOIRE  
1.6.1.  Groupes testés et groupes témoins  
Le nombre de doses et de groupes d'essai testés par dose doit se 
prêter aux exigences statistiques de la détermination de la DL  50 , avec 
des limites de confiance de 95 %. L'essai demande normalement 5 
doses appartenant à une série géométrique dont le facteur n'excède 
pas 2,2 et qui englobe la DL  50 . Toutefois, le facteur de dilution et le 
nombre de concentrations du traitement doivent être déterminés en fonction de la pente de la courbe de toxicité (dose en fonction de la 
mortalité) et en tenant compte de la méthode statistique choisie pour 
analyser les résultats. Un test de détermination de l'ordre de grandeur permet de choisir les concentrations appropriées pour le dosage.
 
Il faut tester au moins 3 groupes d'essai identiques, comportant 
chacun 10 abeilles, par concentration d'essai. Pas moins de 3 groupes témoins, comportant chacun 10 abeilles, devraient être testés parallèlement aux groupes traités. Des séries de témoins 
devraient également être incluses pour les solvants ou les véhicules 
utilisés (voir point 1.5.4).
 
1.6.2.  Étalon de toxicité  
Un étalon de toxicité doit être testé parallèlement aux groupes traités. 
Il faut sélectionner au moins 3 doses afin d'englober la valeur supposée de la DL
 50 . Chaque dose doit être testée dans au moins 
3 cages contenant chacune 10 abeilles. L'étalon de toxicité préféré 
est le diméthoate, dont la DL  50 par voie orale après 24 heures se 
situe entre 0,10 et 0,35 μg de substance active/abeille (2). D'autres 
étalons de toxicité pourraient toutefois être acceptables, s'il existe 
suffisamment de données qui permettent de vérifier la relation dose/ 
effet escomptée (par exemple le parathion).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1042
 
1.6.3.  Exposition  
1.6.3.1.  Administration des doses  
Il faut fournir à chaque groupe d'abeilles testé 100 à 200 μl d'une 
solution aqueuse de saccharose à 50 % contenant la substance d'essai 
à la concentration appropriée. Il est nécessaire d'administrer un 
volume plus grand dans le cas des produits peu solubles, peu toxiques ou peu concentrés dans la préparation, étant donné qu'il faut utiliser des proportions plus élevées dans la solution de saccha ­
rose. La quantité de nourriture traitée consommée par groupe doit 
être surveillée. Une fois vidé (généralement en 3 à 4 heures), le tube contenant la solution alimentaire traitée doit être retiré de la cage et 
remplacé par un tube contenant une solution de saccharose pure. Les 
solutions de saccharose sont ensuite fournies ad libitum. Pour certains composés, la nourriture traitée avec des concentrations élevées peut être rejetée par les abeilles, si bien que la quantité de 
nourriture consommée risque d'être faible ou nulle. Après 6 heures 
au maximum, la nourriture traitée non consommée doit être remplacée par une solution de saccharose pure. La quantité de nour ­
riture traitée consommée doit être évaluée {par exemple, en mesurant 
le volume ou le poids de la nourriture traitée restante).
 
1.6.3.2.  Durée  
L'essai dure 48 heures après que la solution d'essai a été remplacée 
par une solution de saccharose pure. Si! a mortalité continue de 
s'accroître de plus de 10 % après les premières 24 heures, la durée de l'essai doit être prolongée jusqu'à 96 heures au maximum, à condition que la mortalité des témoins n'excède pas 10 %.
 
1.6.4.  Observations  
La mortalité est relevée 4 heures après le début de l'essai et ensuite 
24 heures et 48 heures après que la dose a été administrée. Si une 
période d'observation prolongée est requise, d'autres évaluations 
devront être pratiquées à des intervalles de 24 heures jusqu'à 96 heures au maximum, à condition que la mortalité des témoins ne dépasse pas 10 %.
 
La quantité de solution alimentaire consommée par groupe doit être 
estimée. La comparaison entre les taux de consommation des solu ­
tions traitées et non traitées en l'espace de 6 heures peut donner une idée des qualités organoleptiques de la nourriture traitée.
 
Tous les effets se traduisant par des anomalies du comportement 
pendant la période d'essai doivent être notés.  
1.6.5.  Essai limite  
Dans certains cas (par exemple, lorsqu'on s'attend à ce qu'une subs ­
tance d'essai soit peu toxique), un essai limite peut être exécuté avec 100 μg de substance active/abeille afin de démontrer que la DL
 50 est 
supérieure à cette valeur. Le même protocole doit être appliqué, et 
notamment les 3 groupes d'essai identiques pour la dose testée, les témoins nécessaires, l'évaluation de la quantité de nourriture traitée consommée et l'utilisation d'un étalon de toxicité. Si on constate une 
mortalité, il convient de mener une étude complète. Si on observe 
des effets sublétaux (voir point 1.6.4), il faut les noter.
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2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. RÉSULTATS  
Les résultats doivent être récapitulés sous la forme de tableaux, 
montrant pour chaque groupe traité avec la substance d'essai ainsi 
que pour les témoins et les groupes traités avec l'étalon de toxicité, le 
nombre d'abeilles employé, la mortalité à chaque heure d'observation et le nombre d'abeilles présentant un comportement anormal. Les données de mortalité seront analysées par les méthodes statistiques 
appropriées (par exemple, la méthode des probits, la moyenne 
mobile, la probabilité binomiale) (3) (4). On trace les courbes dose/ effet pour chaque moment d'observation recommandé (24 heures, 48 
heures, et, si nécessaire, 72 heures, 96 heures) et on calcule les 
pentes des courbes et les doses létales 50 % (DL
 50 ) avec des 
limites de confiance de 95 %. Les corrections relatives à la mortalité des témoins doivent s'effectuer selon la méthode d'Abbott (4) (5). 
Lorsque la nourriture traitée n'est pas complètement consommée, la 
dose de la substance d'essai consommée par groupe doit être déter ­
minée. La DL
 50 doit être exprimée en μg de substance d'essai par 
abeille.  
2.2. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
2.2.1.  Substance d'essai  
— État physique et propriétés physico-chimiques pertinentes (par 
exemple, stabilité dans l'eau, pression de vapeur),  
— données relatives à l'identification chimique, notamment la 
formule structurale, la pureté (dans le cas des pesticides, l'identité et la concentration de la ou des substances actives).
 
2.2.2.  Espèce d'expérience  
— Nom scientifique, race, âge approximatif (en semaines), méthode 
et date de collecte,  
— informations sur les colonies dans lesquelles les abeilles ont été 
récoltées, en particulier l'état de santé, toute maladie des adultes, les prétraitements éventuels, etc.
 
2.2.3.  Conditions d'essai  
— Température et humidité relative de la salle d'expérience,  
— conditions d'encagement, en particulier le type, la dimension et le 
matériau des cages,  
— méthodes de préparation des solutions mères et des solutions 
d'essai (le solvant et sa concentration doivent être indiqués, le cas échéant),
 
— conception de l'essai, par exemple, nombre et niveau des concen ­
trations d'essai appliquées, nombre de témoins; pour chaque concentration d'essai et témoin: nombre de cages et nombre d'abeilles par cage,
 
— date de l'essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1044
 
2.2.4.  Résultats  
— Résultats d'une étude préliminaire de détermination de l'ordre de 
grandeur, le cas échéant,  
— données brutes: mortalité à chaque dose testée et à chaque temps 
d'observation.  
— courbes dose/effet à la fin de l'essai,  
— valeurs de la DL  50 avec des limites de confiance de 95 %, à 
chaque temps d'observation recommandé, pour la substance d'essai et l'étalon de toxicité,
 
— méthodes statistiques utilisées pour calculer la DL  50 , 
— mortalité chez les témoins,  
— autres effets biologiques observes ou mesurés, par exemple, 
comportement anormal des abeilles (y compris rejet de la dose d'essai), vitesse de consommation de la nourriture dans les groupes traités et non traités,
 
— tout écart par rapport au protocole décrit ici et toute autre infor ­
mation utile.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, pp. 119-125.  
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1045
 
C.17.  ABEILLE DOMESTIQUE — ESSAI DE TOXICITÉ AIGUË 
PAR CONTACT  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de toxicité aiguë reprend la ligne 
directrice n  o 214 de l'OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCTION  
Le présent essai de toxicité est une méthode d'essai en laboratoire 
destinée à évaluer la toxicité aiguë par contact des pesticides et d'autres produits chimiques pour des abeilles domestiques ouvrières adultes.
 
Lorsqu'on apprécie et évalue les caractéristiques toxiques d'une subs ­
tance, il peut être nécessaire de déterminer sa toxicité aiguë par 
contact pour les abeilles domestiques, par exemple lorsque des abeilles risquent d'être exposées à cette substance. L'essai de toxicité aiguë par contact vise à déterminer la toxicité intrinsèque des 
pesticides et d'autres produits chimiques pour les abeilles. Les résul ­
tats de cet essai devraient être mis à profit pour établir la nécessité d'une évaluation plus poussée. Cette méthode peut être utilisée, en particulier, dans des programmes séquentiels destinés à évaluer les 
risques des pesticides pour les abeilles, selon la progression suivante: 
essais de toxicité en laboratoire, essais en conditions semi-naturelles et essais sur le terrain (1). Les pesticides peuvent être testés en tant que substances actives ou en tant que préparations chimiques.
 
Un étalon de toxicité doit être utilisé pour vérifier la sensibilité des 
abeilles et la précision du protocole d'essai.  
1.2. DÉFINITIONS  
Toxicité aiguë par contact : effets nocifs se produisant dans un délai 
maximal de 96 heures après l'application locale d'une dose unique de la substance d'essai.
 
Dose : quantité de substance d'essai appliquée. La dose est exprimée 
en masse ( μg) de substance d'essai par animal testé ( μg/abeille).  
DL 50 (dose létale 50 %) par contact : dose unique d'une substance, 
obtenue par calcul statistique, susceptible d'entraîner la mort de 50 % 
des animaux lorsqu'elle est administrée par contact. La DL  50 est 
exprimée en μg de substance d'essai par abeille. Pour les pesticides, 
la substance d'essai peut être une substance active ou une préparation 
chimique contenant une ou plusieurs substances actives.  
Mortalité : un animal est noté comme mort lorsqu'il est complète ­
ment immobile.  
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Des abeilles domestiques ouvrières adultes sont exposées à une 
gamme de doses de la substance d'essai dissoute dans un véhicule approprié, par application directe sur le thorax (aérosol). L'essai dure 48 heures. Si le taux de mortalité augmente entre 24 heures et 48 
heures, alors que la mortalité des témoins reste à un niveau accep ­
table, c'est-à-dire ≤ 10 %, il convient de prolonger l'essai jusqu'à 96 
heures au maximum. La mortalité est notée tous les jours et comparée avec les valeurs des témoins. On analyse les résultats 
afin de calculer la DL
 50 à 24 heures et à 48 heures et, au cas où 
l'étude est prolongée, à 72 heures et à 96 heures.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1046
 
1.4. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
La validité de l'essai repose sur les conditions suivantes:  
— le taux moyen de mortalité de l'ensemble des témoins ne doit pas 
dépasser 10 % à la fin de l'essai,  
— la DL  50 de l'étalon de toxicité se trouve dans la gamme spécifiée.  
1.5. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.5.1.  Collecte des abeilles  
Il convient d'utiliser de jeunes abeilles ouvrières adultes de la même race, 
autrement dit des abeilles du même âge, nourries de la même façon, etc. Elles doivent provenir de colonies saines, correctement nourries, dépour ­
vues autant que possible d'individus malades, possédant une reine dans la 
ruche, et dont on connaît l'histoire et l'état physiologique. Elles peuvent être collectées le matin du jour où elles seront utilisées ou la veille au soir et gardées dans les conditions de l'essai jusqu'au jour suivant. Les 
abeilles récoltées sur des cadres dépourvus de couvain conviennent. Il 
faut éviter de collecter les abeilles au début du printemps ou à la fin de l'automne parce qu'elles subissent un changement physiologique à ces époques. Si les essais doivent être effectués au début du printemps ou à la 
fin de l'automne, on peut faire éclore les abeilles dans un incubateur et 
elles seront ensuite élevées pendant une semaine avec du pain d'abeille (pollen récolté sur les rayons) et une solution de saccharose. Les abeilles traitées avec des substances chimiques, telles que des antibiotiques, des 
antivarroa, etc., ne doivent pas être soumises à des essais de toxicité 
durant 4 semaines à partir de la fin du dernier traitement.
 
1.5.2.  Conditions d'encagement et d'alimentation  
On utilise des cages faciles à nettoyer et bien ventilées. Tout maté ­
riau approprié peut être employé, par exemple des cages en acier inoxydable, en toile métallique, en plastique, des cages jetables en bois, etc. La dimension des cages d'essai doit être adaptée au nombre 
d'abeilles, c'est-à-dire leur fournir un espace suffisant. Il est préfé ­
rable de répartir les abeilles en groupes de dix par cage.
 
Les abeilles doivent être gardées à l'obscurité dans une salle d'expé ­
rience chauffée à 25 ± 2  o C. L'humidité relative, généralement 
comprise entre 50 et 70 %, doit être enregistrée tout au long de l'essai. Les manipulations, et notamment le traitement et les obser ­
vations, peuvent s'effectuer à la lumière (du jour). La nourriture se 
compose d'une solution de saccharose dans l'eau dont la concentra ­
tion finale s'élève à 500 g/l (50 % en poids par unité de volume), 
fournie ad libitum durant toute la durée de l'essai à l'aide d'une 
mangeoire pour abeilles. Celle-ci peut consister en un tube de verre (d'environ 50 mm de long et 10 mm de large, dont le diamètre de l'extrémité ouverte est rétréci à environ 2 mm).
 
1.5.3.  Préparation des abeilles  
Les abeilles récoltées peuvent être anesthésiées avec du dioxyde de 
carbone ou de l'azote en vue de l'application de la substance d'essai. La quantité d'anesthésiant utilisée et la durée de l'exposition doivent 
être réduites au minimum. Les abeilles moribondes doivent être enle ­
vées et remplacées par des abeilles saines avant le début de l'essai.
 
1.5.4.  Préparation des doses  
La substance d'essai doit être appliquée sous la forme de solution dans un 
véhicule, à savoir un solvant organique ou de l'eau avec un agent mouil ­
lant. Parmi les solvants organiques, on préfère l'acétone, mais d'autres solvants organiques peu toxiques pour les abeilles peuvent être utilisés 
(par exemple, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde). Dans le cas 
des préparations chimiques dispersées dans l'eau et des substances orga ­
niques fortement polaires non solubles dans les solvants organiques, les solutions peuvent être plus faciles à appliquer si elles sont préparées dans 
une solution faible d'un agent mouillant commercial (par exemple, Agral, 
Citowett, Lubrol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1047
 
Des solutions témoins appropriées doivent être préparées, autrement dit, 
si un solvant ou un dispersant ont été employés pour solubiliser la subs ­
tance d'essai, deux groupes de témoins doivent être utilisés, l'un étant traité avec de l'eau et l'autre avec le solvant ou le dispersant.
 
1.6. MODE OPÉRATOIRE  
1.6.1.  Groupes testés et groupes témoins  
Le nombre de doses et de groupes d'essai testes par dose doit se 
prêter aux exigences statistiques de la détermination de la DL  50 , avec 
des limites de confiance de 95 %. L'essai demande normalement cinq doses appartenant à une série géométrique dont le facteur n'excède 
pas 2,2 et qui englobe la DL
 50 . Toutefois, le nombre de doses doit 
être déterminé en fonction de la pente de la courbe de toxicité (dose en fonction de la mortalité) et en tenant rompre  de la méthode statis ­
tique choisie pour analyser les résultats. Un test de détermination de 
l'ordre de grandeur permet de choisir les doses appropriées.
 
Il faut tester au moins 3 groupes d'essai identiques, comportant 
chacun 10 abeilles, par concentration d'essai.  
Pas moins de 3 groupes témoins, comportant chacun 10 abeilles, 
devraient être testes parallèlement aux groupes traités. Si on utilise un solvant organique ou un agent mouillant, 3 groupes supplémen ­
taires de 10 abeilles chacun doivent être inclus pour le solvant ou 
l'agent mouillant.
 
1.6.2.  Étalon de toxicité  
Un étalon de toxicité doit être testé parallèlement aux groupes traités. 
Il faut sélectionner au moins 3 doses afin d'englober la valeur 
supposée de la DL  50 . Chaque dose doit être testée dans au moins 
3 cages contenant chacune 10 abeilles. L'étalon de toxicité préféré est le diméthoate, dont la DL
 50 par contact après 24 heures se situe 
entre 0,10 et 0,30 μg de substance active/abeille (2). D'autres étalons 
de toxicité pourraient toutefois être acceptables, s'il existe suffisam ­
ment de données qui permettent de vérifier la relation dose/effet escomptée (par exemple, le parathion).
 
1.6.3.  Exposition  
1.6.3.1.  Administration des doses  
Les abeilles anesthésiées sont traitées individuellement par applica ­
tion locale. Les abeilles sont réparties au hasard entre les groupes traites aux différentes doses et les groupes témoins. Un volume de 1 
μl de solution contenant la substance d'essai à la concentration 
appropriée doit être appliqué à l'aide d'un micro-applicateur sur la face dorsale du thorax de chaque abeille. D'autres volumes peuvent être utilisés si cela se justifie. Après l'application, les abeilles sont 
réparties entre les cages d'essai dans lesquelles on distribue une 
solution de saccharose.
 
1.6.3.2.  Durée  
L'essai dure 48 heures. Si la mortalité augmente de plus de 10 % 
entre 24 heures et 48 heures, la durée de l'essai doit être prolongée 
jusqu'à 96 heures, à condition que la mortalité des témoins ne 
dépasse pas 10 %.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1048
 
1.6.4.  Observations  
La mortalité est relevée 4 heures après l'application de la dose, puis 
24 heures et 48 heures après celle-ci. Si une période d'observation prolongée est requise, d'autres évaluations devront être pratiquées à 
des intervalles de 24 heures pendant 96 heures au maximum, à 
condition que la mortalité des témoins ne dépasse pas 10 %.
 
Tous les effets se traduisant par des anomalies du comportement 
pendant la période d'essai doivent être notés.  
1.6.5.  Essai limite  
Dans certains cas (par exemple lorsqu'on s'attend à ce qu'une subs ­
tance d'essai soit peu toxique), un essai limite peut être exécuté avec 100 μg de substance active/abeille afin de démontrer que la DL
 50 est 
supérieure à cette valeur. Le même protocole doit être appliqué, et 
notamment les 3 groupes d'essai identiques pour la dose testée, les témoins nécessaires et l'utilisation d'un étalon de toxicité. Si on constate une mortalité, il convient de mener une étude complète. 
Si on observe des effets sublétaux (voir point 1.6.4), il faut les noter.
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. RÉSULTATS  
Les résultats doivent être récapitulés sous la forme de tableaux, 
montrant pour chaque groupe traité avec la substance d'essai, ainsi 
que pour les témoins et les groupes traites avec l'étalon de toxicité, le 
nombre d'abeilles employé, la mortalité à chaque heure d'observation et le nombre d'abeilles présentant un comportement anormal. Les 
données de mortalité seront analysées par les méthodes statistiques 
appropriées (par exemple, la méthode des probits, la moyenne mobile, la probabilité binomiale) (3) (4). On trace les courbes dose-effet pour chaque moment d'observation recommandé (24 
heures, 48 heures, et, si nécessaire, 72 heures, 96 heures) et on 
calcule les pentes des courbes et les doses létales 50 % DL
 50 ) 
avec des limites de confiance de 95 %. Les corrections relatives à la mortalité des témoins doivent s'effectuer selon la méthode d'Ab ­
bott (4) (5). La DL
 50 doit être exprimée en μg de substance d'essai 
par abeille.  
2.2. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
2.2.1.  Substance d'essai  
— État physique et propriétés physico-chimiques pertinentes (par 
exemple, stabilité dans l'eau, pression de- vapeur),  
— données relatives à l'identification chimique, notamment la 
formule structurale, la pureté (dans le cas des pesticides, l'identité 
et la concentration de la ou des substances actives).  
2.2.2.  Espèce d'expérience  
— Nom scientifique, race, âge approximatif (en semaines), méthode 
et date de collecte,  
— informations sur les colonies dans lesquelles les abeilles ont été 
récoltées, en particulier l'état de santé, toute maladie des adultes, 
les prétraitements éventuels, etc.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1049
 
2.2.3.  Conditions d'essai  
— Température et humidité relative de la salle d'expérience,  
— conditions d'encagement, en particulier le type, la dimension et le 
matériau des cages,  
— modalités d'administration de la substance d'essai, par exemple, 
solvant utilisé, volume de solution d'essai appliqué, anesthésiants 
utilisés,  
— conception de l'essai, par exemple, nombre et niveau des concen ­
trations d'essai appliquées, nombre de témoins; pour chaque 
concentration d'essai et témoin: nombre de cages et nombre 
d'abeilles par cage,  
— date de l'essai.  
2.2.4.  Résultats  
— Résultats d'une étude préliminaire de détermination de l'ordre de 
grandeur, le cas échéant,  
— données brutes: mortalité à chaque concentration testée et à 
chaque temps d'observation,  
— courbes dose/effet à la fin de l'essai,  
— valeurs de la DL  50 avec des limites de confiance de 95 %, à 
chaque temps d'observation recommandé, pour la substance d'essai et l'étalon de toxicité,
 
— méthodes statistiques utilisées pour calculer la DL  50 , 
— mortalité chez les témoins,  
— autres effets biologiques observés et toute réaction anormale des 
abeilles,  
— tout écart par rapport au protocole décrit ici et toute autre infor ­
mation utile.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 
165. March 1993.
 
(2) Cough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119-125.
 
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
 
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1050
 
C.18.  DÉTERMINATION DE L'ADSORPTION/DÉSORPTION AU 
MOYEN DE LA MÉTHODE PAR AGITATION  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite reprend la ligne directrice n  o 106 de l'OCDE sur 
l'adsorption/désorption dans les sols fondée sur la méthode par agita ­
tion (2000).  
1.1. INTRODUCTION  
La méthode s'inspire d'un test circulaire, d'un séminaire sur la sélec ­
tion des sols pour le développement d'un essai d'adsorption (1) (2) (3) (4) et de certaines lignes directrices nationales (5) (6) (7) (8) (9) 
(10) (11).
 
Les études d'adsorption/désorption donnent des informations 
précieuses sur la mobilité des substances chimiques et leur répartition 
dans les trois compartiments de la biosphère (lithosphère, hydro ­
sphère, atmosphère) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Ces informations servent à prédire et à évaluer certaines carac ­
téristiques d'une substance: la capacité de dégradation (22) (23), de 
transformation et d'absorption par les organismes (24), la lixiviation à travers le sol (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28), la volatilité à partir du sol (21) (29) (30), le ruissellement à la surface du sol vers 
les eaux naturelles (18) (31) (32). Les données sur l'adsorption 
peuvent être utilisées à des fins de comparaison ou de modélisation (19) (33) (34) (35).
 
La distribution d'une substance chimique entre les phases solides et 
aqueuses est un processus complexe qui dépend d'un grand nombre 
de facteurs: nature chimique de la substance (12) (36) (37) (38) (39) 
(40), caractéristiques du sol (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49), mais aussi des conditions climatiques, telles que précipitations, température, ensoleillement, vent. La méthode 
présentée ici, qui est un modèle de laboratoire simplifié, ne permet 
pas d'expliquer entièrement les phénomènes et les mécanismes impli ­
qués dans l'adsorption d'une substance chimique par le sol. Mais si elle n'est pas exhaustive, elle donne tout de même d'utiles informa ­
tions sur les effets environnementaux de l'adsorption d'un produit 
chimique.
 
Voir également l'introduction générale.  
1.2. OBJET DE LA MÉTHODE  
La méthode vise à évaluer le comportement d'adsorption/désorption 
d'une substance dans les sols. Il s'agit d'obtenir une valeur de sorp ­
tion permettant de prédire le partage d'une substance sous diverses conditions environnementales. Les coefficients d'adsorption à l'équi ­
libre d'une substance chimique sur différents sols sont déterminés en 
fonction des caractéristiques du sol (par exemple, teneur en carbone organique, teneur en argile, texture, pH). Il faut utiliser plusieurs types de sols pour couvrir le plus grand nombre possible d'inter ­
actions d'une substance donnée avec des sols naturels.
 
La présente méthode considère l'adsorption comme la liaison d'une 
substance chimique à la surface des sols. Elle ne fait pas de distinc ­
tion entre les différents processus d'adsorption (adsorption physique et chimique) et d'autres processus tels que la dégradation catalysée par la surface, l'adsorption de masse ou la réaction chimique. Elle ne 
tient pas compte de l'adsorption sur les particules colloïdales (dia ­
mètre < 0,2 μm) générées par les sols.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1051
 
Les paramètres considérés comme les plus importants pour l'adsorp ­
tion sont: la teneur en carbone organique (3) (4) (12) (13) (14) (41) 
(43) (44) (45) (46) (47) (48), la teneur en argile, la texture (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48), le pH (pour les composés ionisables) (3) (4) (42). D'autres sont susceptibles d'avoir une inci ­
dence sur l'adsorption: la capacité d'échange cationique réelle 
(CECR), la teneur en fer amorphe et en oxydes d'aluminium, notam ­
ment dans le cas des sols volcaniques et tropicaux (4), ainsi que la surface spécifique (49).
 
L'essai permet d'évaluer l'adsorption d'une substance chimique sur 
des sols de texture et de pH différents et n'ayant pas la même teneur 
en carbone organique et en argile. Il comprend trois phases:  
Phase 1:  Étude préliminaire servant à déterminer:  
— le rapport sol/solution,  
— le temps d'équilibre de l'adsorption et la quantité de 
substance adsorbée à l'équilibre,  
— l'adsorption de la substance sur la surface des réci ­
pients d'essai et la stabilité de la substance durant l'essai.
 
Phase 2:  Essai de sélection: l'adsorption est étudiée sur cinq sols 
différents. On détermine la cinétique d'adsorption avec 
une concentration unique ainsi que le coefficient de distri ­
bution K  d et K  oc . 
Phase 3:  Détermination des isothermes d'adsorption de Freundlich: 
cet essai sert à évaluer l'effet de la concentration sur 
le degré d'adsorption sur les sols.  
Étude de la désorption par l'évaluation de la cinétique et 
des isothermes de désorption de Freundlich (appendice 1).  
1.3. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Symbole Définition Unités  
A t i pourcentage d'adsorption au temps t  i % 
A eq pourcentage d'adsorption à l'équilibre %  
m s ads ðt i Þ masse de substance adsorbée sur le sol à l'instant t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ masse de substance adsorbée sur le sol durant l'intervalle 
de temps Δt i μg 
m s ads ðeqÞ masse de substance adsorbée sur le sol à l'équilibre d'ad ­
sorption μg 
m 0 masse de substance dans le tube au début de l'essai μg 
m m ads ðt i Þ masse de substance mesurée dans une aliquote ( v a A ) au 
temps t  i μg 
m aq ads ðeqÞ masse de substance dans la solution à l'équilibre d'ad ­
sorption μg 
m soil quantité de phase de sol exprimée en masse sèche du sol g  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1052
 
Symbole Définition Unités  
C st concentration massique de la solution de réserve μg cm  -3 
C 0 concentration massique initiale de la solution en contact 
avec le sol μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ concentration massique de la substance dans la phase 
aqueuse au temps t  i , lorsque l'analyse est effectuée μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ concentration de la substance adsorbée sur le sol à l'équi ­
libre d'adsorption μg g -1 
C aq ads ðeqÞ concentration massique de la substance dans la phase 
aqueuse à l'équilibre d'adsorption μg cm  -3 
V 0 volume initial de la phase aqueuse en contact avec le sol 
durant l'essai d'adsorption cm 3 
v a A volume de l'aliquote dans laquelle la substance est mesurée cm  3 
K d coefficient de répartition de l'adsorption cm  -3 g -1 
K oc coefficient d'adsorption normalisé basé sur la teneur en 
carbone organique cm 3 g -1 
K om coefficient de la répartition normalisé basé sur la teneur en 
matière organique cm 3 g -1 
K F ads coefficient d'adsorption de Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n exposant de Freundlich  
D t i pourcentage de désorption à l'instant t  i % 
D Δt i pourcentage de désorption durant l'intervalle de temps Δt i % 
K des coefficient de désorption apparente cm  3 g -1 
K F des coefficient de désorption de Freundlich μg -1/n (cm  3 ) 1/n g 1 
m aq des ðt i Þ masse de substance désorbée à partir du sol à l'instant t  j μg 
m m des ðΔt i Þ masse de substance désorbée à partir du sol durant l'in ­
tervalle de temps Δt i μg 
m m des ðeqÞ masse de substance déterminée par analyse dans la phase 
aqueuse à l'équilibre de désorption μg 
m aq des ðeqÞ masse totale de substance désorbée à l'équilibre de 
désorption μg 
m s des ðΔt i Þ masse de substance restant adsorbée sur le sol après l'in ­
tervalle de temps Δt i μg 
m aq A masse de substance résiduelle après atteinte de l'équilibre 
d'adsorption due à un volume de remplacement insuffisant μg 
C s des ðeqÞ concentration de la substance restant adsorbée dans le sol à 
l'équilibre de désorption μg g -1 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1053
 
Symbole Définition Unités  
C aq des ðeqÞ concentration massique de la substance dans la phase 
aqueuse à l'équilibre de désorption μg cm  -3 
V T volume total de la phase aqueuse en contact avec le sol 
durant l'essai de cinétique de désorption réalisé avec la 
méthode séquentielle cm 3 
V R volume de surnageant extrait du tube après obtention de 
l'équilibre d'adsorption et remplacé par un volume iden ­
tique d'une solution de 0,01 M de CaCl  2 cm 3 
v a D volume de l'aliquote extrait du tube (i) pour analyse lors de 
l'essai de cinétique de désorption réalisé avec la méthode 
séquentielle cm 3 
V r i volume de solution extrait du tube (i) afin de mesurer la 
substance lors de l'essai de cinétique de désorption (méthode parallèle) cm
 3 
V r F volume de solution extrait du tube afin de mesurer la 
substance à l'équilibre de désorption cm 3 
MB bilan matière % 
m t masse totale de substance extraite en deux étapes du sol et 
des parois du tube d'essai μg 
V rec volume de surnageant récupéré après l'équilibre d'adsorp ­
tion cm 3 
P ow coefficient de partage octanol/eau 
pKa constante de dissociation 
S w solubilité dans l'eau g l  -1 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Des volumes connus de la substance, non marquée ou radiologique ­
ment marquée, mélangée à des concentrations connues de CaCl  2 0,01 
M, sont ajoutés à des échantillons de sol d'un poids sec connu, préalablement équilibrés dans du CaCl
 2 0,01 M. Le mélange est 
agité pendant le temps requis. Les particules du sol en suspension 
sont séparées par centrifugation et, le cas échéant, par filtration, puis la phase aqueuse est analysée. La quantité de substance adsorbée sur le sol correspond à la différence entre la quantité de substance 
initialement présente dans la solution et la quantité restant à la fin 
de l'expérience (méthode indirecte).
 
La quantité de substance adsorbée peut également être directement 
calculée par l'analyse du sol (méthode directe). Cette méthode, qui consiste à extraire progressivement le sol au moyen d'un solvant 
approprié, est recommandée lorsque l'on ne peut pas déterminer 
avec précision les écarts de concentration de la substance dans la solution, par exemple dans les cas suivants: adsorption de la subs ­
tance sur la surface des tubes d'essai, instabilité de la substance au 
cours de l'expérience, faible adsorption modifiant peu la concentra ­
tion de la substance dans la solution, forte adsorption entraînant une faible concentration ne pouvant être mesurée avec précision. L'utili ­
sation d'une substance radioactivement marquée permet d'éviter d'ex ­
traire le sol. On analyse dans ce cas la phase du sol par combustion 
et comptage à scintillation liquide. Cette dernière méthode, non spécifique, ne permet cependant pas de distinguer les produits primaires des produits de transformation. Elle ne devrait donc être 
utilisée que si la substance à tester reste stable pendant toute la durée 
de l'étude.
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1.5. INFORMATION SUR LA SUBSTANCE  
Les réactifs chimiques doivent être purs. On recommande l'emploi de 
substances non marquées de composition connue et présentant de préférence un degré de pureté d'au moins 95 % ou de substances 
radioactivement marquées de composition connue et radioactivement 
pures. Il faut appliquer des corrections pour tenir compte de la désintégration lorsque l'on emploie des traceurs à demi-vie courte.
 
Les paramètres suivants doivent être connus avant de réaliser un 
essai d'adsorption/désorption:  
a) solubilité dans l'eau (A.6);  
b) pression de vapeur (A.4) et/ou constante de la loi de Henry;  
c) dégradation non biologique: hydrolyse en fonction du pH (C.7);  
d) coefficient de partage (A.8);  
e) biodégradabilité facile (C.4) ou transformation aérobie et anaé ­
robie dans le sol;  
f) pKa des substances ionisables;  
g) photolyse directe dans l'eau (c'est-à-dire spectre d'absorption UV- 
Vis dans l'eau, rendement quantique, par exemple) et photodé ­
gradation sur le sol.  
1.6. APPLICABILITÉ DE L'ESSAI  
L'essai est applicable aux substances chimiques pour lesquelles on 
dispose d'une méthode analytique suffisamment précise. La stabilité 
de la substance durant l'essai est un paramètre important qui peut 
influencer la fiabilité des résultats, notamment avec la méthode indi ­
recte. Il faut donc vérifier la stabilité par une étude préliminaire. Si 
l'on observe une transformation durant l'essai, il est recommandé 
d'analyser le sol et les phases aqueuses lors de l'étude principale.  
Des difficultés peuvent survenir avec des substances faiblement solu ­
bles dans l'eau (S  w < 10  -4 g l -1 ) ou avec des substances fortement 
chargées du fait que la concentration de la phase aqueuse ne peut pas 
être mesurée avec suffisamment de précision avec la méthode analy ­
tique. Il faut prendre d'autres mesures dans ces cas. Les moyens d'aborder ces problèmes sont traités dans les points correspondants.
 
Il faut veiller à éviter les pertes si l'on analyse des substances vola ­
tiles.  
1.7. MODE OPÉRATOIRE  
1.7.1.  Appareillage, réactifs chimiques  
Le laboratoire doit être équipé de l'équipement standard suivant:  
a) tubes ou récipients d'essai. Il est important qu'ils soient:  
— adaptés à la centrifugeuse afin de diminuer les erreurs de 
manipulation et de transfert,  
— constitués d'un matériau inerte qui diminue l'adsorption de la 
substance sur les parois:  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1055
 
b) agitateur: agitateur vertical ou équipement équivalent: le sol doit 
être maintenu en suspension pendant l'agitation;  
c) centrifugeuse: elle doit être de préférence à vitesse de rotation 
élevée (forces de centrifugation > 3 000 g, par exemple), à tempé ­
rature contrôlée et capable d'éliminer de la solution aqueuse les particules d'un diamètre supérieur à 0,2 μm. Les récipients 
doivent être fermés durant l'agitation et la centrifugation afin 
d'éviter les pertes par volatilité et les pertes en eau; il est recom ­
mandé d'utiliser des couvercles désactivés (couvercles filetés recouverts de téflon, par exemple) afin de diminuer l'adsorption sur leur surface;
 
d) équipement facultatif; filtres stériles jetables d'une porosité de 
0,2 μm. Le matériau filtrant doit être choisi avec soin afin d'éviter 
l'adsorption de la substance à sa surface; les filtres organiques 
sont déconseillés pour les substances peu solubles;  
e) instrumentation analytique permettant de mesurer la concentration 
de la substance;  
f) four de laboratoire permettant de maintenir une température de 
103 à 110  o C. 
1.7.2.  Caractérisation et sélection des sols  
Les sols doivent être caractérisés par les trois paramètres principale ­
ment responsables de la capacité d'adsorption: le carbone organique, la teneur en argile et la texture, le pH. Comme nous l'avons dit plus haut (voir le point «Objet de la méthode»), d'autres caractéristiques 
physico-chimiques peuvent influer sur l'adsorption/désorption d'une 
substance et elles doivent donc être prises en compte.
 
Les méthodes de caractérisation des sols revêtent une extrême impor ­
tance car elles peuvent influencer les résultats de manière significa ­
tive. Il est donc recommandé de mesurer le pH du sol dans une 
solution de CaCl  2 , 0,01 M (la solution utilisée lors de l'essai d'ad ­
sorption/désorption) selon la méthode ISO correspondante (ISO 10390-1). Il est également conseillé de déterminer certaines autres propriétés du sol selon les méthodes standard (par exemple, manuel 
ISO de l'analyse des sols, «Handbook of Soil Analysis»). On peut 
ainsi faire reposer l'analyse des données relatives à la sorption sur des paramètres de sol harmonisés. La bibliographie donne quelques références de méthodes harmonisées d'analyse et de caractérisation 
des sols (50-52). L'utilisation de sols de référence est recommandée 
pour calibrer les méthodes d'essai des sols.
 
Le tableau 1 indique comment choisir les sols pour les essais d'ad ­
sorption/désorption. Les sept types de sols choisis se rencontrent dans des zones géographiques tempérées. Pour les substances ionisa ­
bles, les sols sélectionnés doivent couvrir un large spectre de pH 
pour permettre d'évaluer l'adsorption de la substance sous sa forme 
ionisée et non ionisée. Le point 1.9 («Réalisation de l'essai») indique combien de sols différents doivent être utilisés durant les diverses phases de l'essai.
 
Si d'autres types de sols sont choisis, il faut les caractériser au moyen 
des mêmes paramètres et ils doivent présenter des propriétés aussi 
diverses que celles décrites dans le tableau 1, même s'ils ne remplis ­
sent pas tout à fait les critères.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1056
 
Tableau 1  
Aide à la sélection des échantillons de sol pour les essais d'adsorption/désorption  
Type de sol pH (dans le CaCl  2 
0,01 M) Teneur en carbone 
organique (%) Teneur en argile (%) Texture du sol (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65-80 argile 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20-40 limon argileux 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15-25 limons fins 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15-30 limon 5 < 4,0 - 6,0 (
 2 ) < 0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) sable limoneux 
6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 limon argileux/ 
argile 
7 < 4,5 > 10 < 10 sable/sable glaiseux  
( 1 ) Selon la FAO et le système américain (85). 
( 2 ) Les valeurs des variables doivent être comprises de préférence dans les limites du spectre indiqué. En cas de difficulté 
à trouver un sol approprié, des valeurs inférieures au minimum indiqué sont acceptées. 
( 3 ) Les sols contenant moins de 0,3 % de carbone organique risquent de perturber la corrélation entre la teneur en 
carbone organique et l'adsorption. Il est donc recommandé d'util iser des sols présentant une teneur supérieure à 0,3 %.  
1.7.3.  Collecte et stockage des échantillons de sols  
1.7.3.1.  Collecte  
Aucune technique ou instrument d'échantillonnage particulier n'est 
recommandée; la technique d'échantillonnage dépend des objectifs 
de l'étude (53) (54) (55) (56) (57) (58).  
Il convient de considérer les aspects suivants:  
a) il faut disposer d'informations détaillées sur le site d'essai: loca ­
lisation, couverture végétale, traitement aux pesticides et/ou aux 
engrais, adjuvants biologiques ou contamination accidentelle. Le 
site doit être décrit selon les recommandations de la norme ISO sur l'échantillonnage des sols (ISO 10381-6);
 
b) le site d'échantillonnage doit être défini par l'UTM (Universal 
Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) ou par des coordonnées géographiques, de manière à pouvoir recon ­
naître ultérieure ment un sol particulier ou à définir un sol en 
fonction des divers systèmes de classification utilisés dans les différents pays. Il est également recommandé de prélever dans l'horizon A jusqu'à une profondeur maximale de 20 cm. Si un 
horizon O
 h est présent dans le sol n  o 7 en particulier, il doit être 
inclus dans l'échantillon.  
Les échantillons sont transportés dans des conteneurs et dans des 
conditions thermiques propres à préserver au mieux les propriétés 
initiales du sol.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1057
 
1.7.3.2.  Stockage  
Il est préférable d'utiliser des sols fraîchement prélevés. Si cela n'est 
pas possible, le sol peut être stocke à la température ambiante et maintenu au sec. Aucun temps de stockage maximal n'est recom ­
mandé, mais au-delà de trois ans, les sols doivent être à nouveau 
analyses avant l'emploi afin de vérifier leur teneur en carbone-orga ­
nique, leur pH et leur CEC.
 
1.7.3.3.  Manipulation et préparation des échantillons d'essai  
Les sols sont séchés à l'air à la température ambiante (de préférence 
entre 20 et 25  o C). Ils sont désagrégés en appliquant des forces 
minimes de manière à modifier aussi peu que possible la texture 
originale, puis tamises pour ne conserver que les particules ≤ 
2 mm. Le tamisage doit respecter les recommandations de la norme ISO sur l'échantillonnage des sols (ISO 10381-6). Une bonne homogénéisation est recommandée car elle améliore la repro ­
ductibilité des résultats. La teneur en eau de chaque sol est déter ­
minée à partir de trois aliquotes par un réchauffement à 105
 o C 
jusqu'à stabilisation du poids (environ 12 heures). Pour tous les calculs, la masse du sol se réfère à la masse sèche à l'étuve, c'est- 
à-dire au poids de sol diminué de la teneur en eau.
 
1.7.4.  Préparation de la substance d'essai devant être appliquée sur 
le sol  
La substance d'essai est dissoute dans une solution de CaCl  2 0,01 M 
dans de l'eau distillée ou désionisée; la solution de CaCl  2 est utilisée 
comme solvant aqueux pour améliorer la centrifugation et diminuer les échanges de cations. La concentration de la solution mère doit 
être supérieure de 3 ordres de grandeur à la limite de détection de la 
méthode d'analyse utilisée. Ce seuil permet de faire des mesures précises avec la méthodologie employée lors de l'essai. Enfin, la concentration de la solution de réserve doit être inférieure à la solu ­
bilité dans l'eau de la substance.
 
Il est conseillé de préparer la solution de réserve immédiatement 
avant de l'appliquer sur le sol et de la conserver dans un récipient 
hermétique à l'abri de la lumière à une température de 4  o C. La durée 
de stockage dépend de la stabilité de la substance et de sa concen ­
tration dans la solution.  
Un agent solubilisant peut être utilisé pour les substances peu solu ­
bles (S  w < 10  4 g l -1 ) qui se dissolvent difficilement. Il doit être 
miscible avec l'eau, comme le méthanol ou l'acétonitrile: sa concen ­
tration ne doit pas dépasser 1 % du volume total de la solution de réserve et elle doit être inférieure à celle de la substance dans la solution qui entrera en contact avec le sol (de préférence moins de 
0,1 %); il ne doit pas être un surfactant ou subir des réactions 
solvolytiques avec la substance d'essai. Le procès-verbal d'essai doit indiquer qu'un tel agent a été employé et en donner les raisons.
 
Un autre moyen de traiter les substances peu solubles consiste à 
introduire la substance d'essai dans le système d'essai à l'aide d'un solvant auxiliaire: la substance est dissoute dans un solvant orga ­
nique, dont une fraction est ajoutée au système constitué par le sol et 
par une solution 0,01 M de CaCl
 2 dans de l'eau distillée ou désioni ­
sée. La concentration du solvant organique dans la phase aqueuse devrait être aussi faible que possible et ne pas excéder en principe 
0,1 %. L'expérimentateur devra toutefois tenir compte du fait que 
l'introduction de la substance à l'aide d'une solution organique est susceptible de nuire à la reproductibilité des volumes. La concen ­
tration de la substance d'essai et du solvant auxiliaire risquent donc 
de varier légèrement entre les essais et d'introduire une erreur supplé ­
mentaire.
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1.8. CONDITIONS PRÉALABLES À LA RÉALISATION DE L'ESSAI 
D'ADSORPTION/DÉSORPTION  
1.8.1.  Méthode analytique  
Un certain nombre de paramètres peuvent influencer la précision des 
mesures: la précision de la méthode d'analyse de la solution et des 
phases adsorbées, la stabilité et la pureté de la substance, le temps pour atteindre l'équilibre de sorption, l'étendue des variations de concentration de la solution, le rapport sol/solution et les modifica ­
tions de la structure du sol au cours du processus d'équilibrage (35) 
(59-62). L'appendice 2 donne quelques exemples à ce propos.
 
La fiabilité de la méthode d'analyse doit être vérifiée selon la gamme 
de concentration susceptible d'être celle rencontrée durant l'essai. 
L'expérimentateur est libre d'élaborer une méthode appropriée présentant toutes les qualités requises en matière de précision, d'exactitude, de reproductibilité, de limites de détection et de récu ­
pération. L'expérience ci-dessous montre comment effectuer un tel 
essai.
 
Un volume approprié de CaCl  2 , 0,01 M (100 cm  3 , par exemple), est 
agité pendant 4 heures avec un certain poids de sol (20 g, par 
exemple) hautement adsorbant, c'est-à-dire riche en carbone orga ­
nique et en argile. Le poids et le volume varient selon les besoins de l'analyse mais un rapport sol/solution de 1:5 constitue un bon point de départ. Le mélange est centrifugé et la phase aqueuse filtrée. 
Une partie de la solution de réserve de la substance est ajoutée à 
cette dernière afin d'obtenir une concentration nominale comprise dans la gamme de concentration correspondant à celle de l'essai. Ce volume ne doit pas excéder 10 % du volume final de la phase 
aqueuse afin de modifier aussi peu que possible la nature de la 
solution de prééquilibrage. La solution est ensuite analysée.
 
Un témoin constitué du système du sol et de la solution de CaCl  2 
(sans substance d'essai) doit être ajouté afin de vérifier les artéfacts 
de la méthode d'analyse et les effets de matrice induits par le sol.  
La chromatographie gaz-liquide (CGL), la chromatographie liquide à 
haute performance (HPLC), la spectrométrie (CG/spectrométrie de 
masse, HPLC/spectrométrie de masse) et le comptage à scintillation 
liquide (pour les substances radiologiquement marquées) figurent parmi les méthodes de mesure de la sorption. Un taux de récupéra ­
tion de 90 à 110 % de la valeur nominale est jugé satisfaisant quelle 
que soit la méthode d'analyse utilisée. La limite de détection de la 
méthode d'analyse doit être d'au moins de deux ordres de grandeur inférieure à la concentration nominale afin de permettre la détection et l'évaluation une fois que le partage est effectué.
 
Les caractéristiques et la limite de détection de la méthode utilisée 
pour effectuer les études d'adsorption déterminent les conditions d'essai et les résultats expérimentaux. La méthode présentée ici suit un protocole expérimental général et propose des solutions de 
rechange lorsque la méthode analytique ou les équipements de labo ­
ratoire imposent des limites.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1059
 
1.8.2.  Choix de rapports sol/solution optimaux  
Les rapports sol/solution appropriés à l'étude de la sorption sont 
choisis en fonction du coefficient de répartition K  d et du degré 
relatif d'adsorption souhaité. Le changement de la concentration de 
la substance dans la solution détermine la précision statistique de la 
mesure, fondée sur la forme de l'équation d'adsorption et sur la limite de la méthode d'analyse, ainsi que l'exactitude avec laquelle elle permettra de détecter la substance contenue dans la solution. Il est 
donc utile de déterminer plusieurs rapports fixes présentant un pour ­
centage adsorbé supérieur à 20 % ou, de préférence, à 50 % (62), tout en veillant a ce que la concentration de la substance dans la 
phase aqueuse reste suffisamment élevée pour pouvoir être mesurée 
avec précision, notamment lorsque les pourcentages d'adsorption sont importants.
 
Une solution pratique consiste à choisir les rapports sol/solution en 
estimant la valeur du coefficient de répartition K  d lors d'études préli ­
minaires ou par des techniques d'estimation bien établies (voir l'appendice 3). On peut ensuite porter sur un graphique le rapport sol/solution en fonction du coefficient de distribution pour différents 
pourcentages fixes d'adsorption (figure 1). Dans le graphique ci- 
dessous, on estime que l'équation d'adsorption est linéaire (
 1 ). La 
relation est obtenue en réécrivant l'équation 4 du K  d sous la forme 
suivante 1:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
ou sous sa forme logarithmique, en supposant que R = m  soil /V 0 et 
A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Figure 1.  Relation entre les rapports sol/solution et K  d pour différents pourcentages 
d'adsorption de la substance  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1060  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K d ·C aq ads ðeqÞ
 La figure 1 montre le rapport sol/solution requis en fonction de K  d 
pour divers niveaux d'adsorption. Par exemple, avec un rapport sol/ 
solution de 1:5 et un K  d de 20, l'adsorption serait de 80 % environ. 
Pour obtenir un pourcentage d'adsorption de 50 % avec le même K  d , 
il faudrait un rapport de 1:25. Cette méthode souple permet de 
choisir les rapports sol/solution en fonction des besoins de l'expé ­
rience.  
Les zones où la substance est très fortement ou très légèrement 
adsorbée sont plus difficiles à maîtriser. En cas de faible absorption, 
un rapport sol/solution de 1:1 est recommandé, mais des ratios plus 
faibles peuvent être nécessaires avec certains types de sols très orga ­
niques afin d'obtenir une boue. Avec la méthode analytique, il faut veiller à mesurer les légères variations de concentration de la subs ­
tance, faute de quoi la mesure d'adsorption sera inexacte. Avec un 
coefficient de distribution K
 d très élevé, on peut aller jusqu'à un 
rapport de 1:100 de manière à conserver une quantité importante de substance en solution. Il faut cependant bien mélanger et 
donner au système le temps de s'équilibrer. On peut aussi prédire 
la valeur Kj au moyen de techniques d'estimation fondées par exemple sur la valeur P
 ow (voir l'appendice 3). Cette méthode peut 
être utile pour les substances chimiques polaires ou faiblement adsor ­
bées ayant un P  ow < 20 et pour les substances lipophiles ou forte ­
ment sorbantes dotées d'un P  ow > 10  4 . 
1.9. RÉALISATION DE L'ESSAI  
1.9.1.  Conditions de l'essai  
Les essais sont réalisés à température ambiante et, si possible, à une 
température constante comprise entre 20 et 25  o C. 
La centrifugation doit permettre d'éliminer de la solution les parti ­
cules supérieures à 0,2 μm. Cette valeur correspond à la plus petite 
particule considérée comme une particule solide et constitue la limite 
entre les particules solides et les colloïdes. L'appendice 4 explique comment déterminer les paramètres de la centrifugation.
 
Si l'équipement de centrifugation ne permet pas d'éliminer à coup sûr 
les particules supérieures à 0,2 μm, on peut combiner la centrifuga ­
tion et la filtration avec des filtres de 0,2 μm. Ces filtres doivent être 
fabriqués en matériau inerte afin d'éviter les pertes de substance. Il 
faut dans tous les cas apporter la preuve qu'il n'y a aucune perte de 
substance au cours de la filtration.  
1.9.2.  Phase 1 — Étude préliminaire  
Le but de l'étude préliminaire a déjà été expliqué dans le point 
«Objet de la méthode». La réalisation de l'essai est exposée ci-après.  
1.9.2.1.  Sélection de rapports sol/solution optimaux  
On utilise deux types de sols et trois rapports sol/solution (six 
essais). Un sol a une teneur en carbone organique élevée et une faible teneur en argile, l'autre une faible teneur en carbone organique et une teneur élevée en argile. Les rapports suivants sont proposés:
 
— 50 g de sol et 50 cm  3 de solution aqueuse de la substance d'essai 
(rapport 1:1),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1061
 
— 10 g de sol et 50 cm  3 de solution aqueuse de la substance d'essai 
(rapport 1:5),  
— 2 g de sol et 50 cm  3 de solution aqueuse de la substance d'essai 
(rapport 1:25).  
La quantité minimale de sol qui va servir à l'expérience dépend de 
l'équipement de laboratoire dont on dispose et des performances des méthodes analytiques utilisées. Il est cependant recommandé d'uti ­
liser au moins 1 g, de préférence 2 g, afin d'obtenir des résultats 
d'essai fiables.
 
Un échantillon de contrôle contenant uniquement la substance d'essai 
dans une solution de CaCl  2 0,01 M (sans sol) est soumise exacte ­
ment aux mêmes opérations que le système d'essai afin de vérifier la 
stabilité de la substance dans une solution de CaCl  2 et son adsorption 
éventuelle à la surface des récipients d'essai.  
Un témoin par sol contenant la même quantité de sol dans un 
volume total de 50 cm  3 de solution de CaCl  2 0,01 M (sans subs ­
tance) est soumis à la même procédure d'essai. Il permet de détecter 
les substances étrangères ou les sols contaminés.  
Tous les essais, contrôles et témoins sont réalisés au moins en 
double. Le nombre total d'échantillons devant être préparés pour l'étude est calculé selon la méthode suivie.
 
L'étude préliminaire et l'étude principale reposent sur les mêmes 
méthodes, sauf indication contraire.  
Les échantillons de sols séchés à l'air sont mélangés à un volume 
minimal de 45 cm  3 de CaCl  2 0,01 M et agités pendant 12 heures la 
nuit précédant l'expérience. On y ajoute par la suite de la solution de réserve de la substance d'essai afin d'obtenir un volume final de 
50 cm
 3 . Ce volume ajouté ne doit pas excéder 10 % du volume 
final de la phase aqueuse (50 cm  3 ) afin de modifier aussi peu que 
possible la nature de la solution de prééquilibrage. Par ailleurs, la concentration initiale de la substance d'essai en contact avec le sol 
(C
 0 ) doit être supérieure d'au moins deux ordres de grandeur à la 
limite de détection de la méthode analytique. Ce seuil permet d'ob ­
tenir des mesures fiables, même en cas d'adsorption élevée (> 90 %) et de déterminer ultérieurement les isothermes d'adsorption. La 
concentration (C
 0 ) de la substance initiale ne devrait pas non plus 
excéder la moitié de sa limite de solubilité.  
Voici comment calculer la concentration de la solution de réserve 
(C M ). Si la limite de détection est de 0,01 μg cm  -3 et l'adsorption de 
90 %, la concentration initiale de la substance en contact avec le sol 
sera de préférence de 1 μg cm  -3 (soit de deux ordres de grandeur 
plus élevée que celle de la limite de détection). En supposant que l'on ajoute le volume maximal recommandé de la solution de réserve, soit 5 cm
 3 , aux 45 cm  3 de la solution d'équilibrage de CaCl  2 0,01 M 
(c'est-à-dire 10 % de la solution de réserve au volume total de la 
phase aqueuse), la concentration de la solution de réserve sera de 10 μg cm
 -3 , ce qui est de trois ordres de grandeur supérieur à la limite 
de détection de la méthode analytique.  
Il faut mesurer le pH de la phase aqueuse avant et après le contact 
avec le sol, compte tenu de son rôle dans le processus d'adsorption, 
notamment dans le cas des substances ionisables.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1062
 
Le mélange est agité jusqu'à ce que le point d'équilibre soit atteint. 
Le temps d'équilibre dans les sols est très variable. Il dépend du 
produit chimique et du sol. Une période de 24 heures est générale ­
ment suffisante (77). Lors de l'étude préliminaire, des échantillons peuvent être prélevés de manière séquentielle pendant une période de 
mélange de 48 heures (à la 4
 e , 8 e , 24  e et 48  e heure, par exemple). 
Les temps d'analyse ne sont pas rigides et doivent être considérés en fonction du programme de travail du laboratoire.
 
La substance dans la solution aqueuse peut être mesurée par la 
méthode parallèle ou par la méthode séquentielle. La méthode paral ­
lèle est plus difficile à réaliser sur le plan expérimental mais le traitement mathématique des résultats est plus simple (voir l'appendice 5). Le choix de la méthode est laissée à l'appréciation 
de l'expérimentateur, qui décide en fonction des équipements de 
laboratoire et des ressources disponibles.
 
a) Méthode parallèle: on prépare des échantillons avec un rapport 
sol/solution identique, leur nombre étant égal aux intervalles de 
temps auxquels on souhaite étudier la cinétique d'adsorption. Après centrifugation et, le cas échéant, filtration, la phase aqueuse du premier tube est récupérée aussi complètement que 
possible et mesurée au bout de 4 heures, par exemple, celle du 
deuxième tube au bout de 8 heures, celle du troisième au bout de 24 heures, etc.
 
b) Méthode séquentielle: on prépare uniquement un double échan ­
tillon pour chaque rapport sol/solution. Le mélange est centrifugé 
à des intervalles de temps définis afin de séparer les phases. Une petite aliquote de la phase aqueuse est immédiatement analysée afin de rechercher la substance, puis l'expérience se poursuit avec 
le mélange original. S'il y a filtration après centrifugation, le 
laboratoire doit disposer d'équipements permettant de filtrer de petites aliquotes en phase aqueuse. Le volume total des aliquotes ne devrait pas dépasser 1 % du volume total de la solution afin de 
ne pas modifier de manière significative le rapport sol/ solution et 
de diminuer la masse de soluté susceptible d'être adsorbée durant l'essai.
 
Le pourcentage d'adsorption  A t i est calculé à chaque instant (t  j ) sur 
la base de la concentration initiale nominale et de la concentration mesurée au temps d'échantillonnage (t
 i ), corrigé de la valeur du 
témoin. Des graphes  A t i représentant en fonction du temps (figure 
1, appendice 5) sont tracés afin de savoir à quel moment le plateau 
d'équilibre est atteint (  1 ). On calcule également la valeur K  d à l'équi­
libre. On choisit à partir de cette valeur le rapport sol/solution appro ­
prié de la figure 1, de manière que le pourcentage d'adsorption 
dépasse 20 % et, de préférence, 50 % (61). Les équations et les 
principes relatifs au tracé sont exposés au point «Présentation des données» ainsi qu'à l'appendice 5.
 
1.9.2.2.  Détermination du temps d'adsorption et de la quantité de substance 
adsorbée à l'équilibre  
Comme nous l'avons déjà dit, le graphe représentant  A t i ou C aq ads en 
fonction du temps permet d'estimer l'adsorption et la quantité de substance adsorbée à l'équilibre (voir les figures 1 et 2 de l'appendice 5). Le temps d'équilibre correspond au temps que le 
système met pour atteindre un plateau.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1063  
( 1 ) On peut également utiliser des graphiques de concentration de la substance en phase 
aqueuse ( C aq ads ) en fonction du temps pour estimer l'obtention du plateau d'équilibre (voir 
la figure 2 de l'appendice 5).
 L'absence de plateau ou l'accroissement progressif de la courbe peut 
être dû à des facteurs complexes tels que b. biodégradation ou une 
diffusion lente. La biodégradation peut être mise en évidence en répétant l'expérience avec un échantillon de sol stérile. Si aucun plateau n'est atteint même dans ce cas, l'expérimentateur doit cher ­
cher d'autres causes inhérentes à l'étude. Il peut par exemple modifier 
les conditions de l'essai (température, temps d'agitation, rapport sol/ solution). Lui seul décide de poursuivre la procédure d'essai, même s'il court le risque de ne pas atteindre un équilibre.
 
1.9.2.3.  Adsorption sur les parois du récipient et stabilité de la substance  
L'analyse des échantillons de contrôle peut fournir quelques infor ­
mations sur l'adsorption de la substance sur les parois des récipients 
d'essai ainsi que sur sa stabilité. Une déplétion supérieure à l'écart type de la méthode analytique peut être due à une dégradation abio ­
tique et/ou à l'adsorption sur les parois du récipient. On peut indi ­
vidualiser l'un ou l'autre de ces phénomènes en lavant soigneusement 
les parois du récipient avec un volume connu de solvant, puis en recherchant la substance dans la solution de lavage. L'absence d'ad ­
sorption sur les parois du récipient prouve l'instabilité abiotique de la 
substance. En cas d'adsorption, en revanche, il convient de modifier 
le matériau du récipient d'essai. Ces données sur l'adsorption sur les parois des récipients d'essai ne peuvent cependant pas être directe ­
ment extrapolées à l'essai sol/solution, dans la mesure où la présence 
de sol modifie l'adsorption.
 
On peut obtenir des informations supplémentaires sur la stabilité de 
la substance d'essai en déterminant le bilan matière dans le temps. La substance est recherchée dans la phase aqueuse, dans les extraits de 
sol et sur les parois des récipients d'essai. La différence entre la 
masse de la substance ajoutée et la somme des masses de substance présentes dans la phase aqueuse, les extraits de sol et sur les parois des récipients correspond à la masse dégradée, volatilisée et/ou non 
extraite. Pour effectuer un bilan matière, l'équilibre d'adsorption doit 
être atteint durant l'essai.
 
Le bilan matière est effectué sur les deux sols et avec un rapport 
sol/solution par sol générant une déplétion à l'équilibre supérieure à 20 % et, de préférence, à 50 %. Une fois que l'essai consistant à 
trouver le rapport sol/solution est terminé (analyse du dernier échan ­
tillon de phase aqueuse au bout de 48 heures), les phases sont séparées par centrifugation et, le cas échéant, par filtration. Le maximum de phase aqueuse est récupérée puis un solvant d'extrac ­
tion approprié (c'est-à-dire doté d'un coefficient d'extraction d'au 
moins 95 %) est ajouté au sol afin d'extraire la substance. Deux extractions successives au moins sont recommandées. On détermine ensuite la quantité de substance présente dans les extraits de sol et 
dans le récipient afin de calculer le bilan matière (équation 10 du 
chapitre «Présentation des données»). S'il est inférieur à 90 %, la substance est jugée instable durant la durée de l'essai. Les études peuvent être cependant poursuivies en tenant compte de cette insta ­
bilité. Il est conseillé dans ce cas d'analyser les deux phases lors de 
l'étude principale.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1064
 
1.9.2.4  Phase 2 — Cinétique d'adsorption avec une concentration unique de 
substance  
Cinq sols choisis dans le tableau 1 sont utilisés à cet effet. On a 
intérêt à y inclure tout ou partie des sols utilisés dans l'étude préli ­
minaire. Dans ce cas, ils ne sont pas soumis aux essais de la phase 2.  
Le temps d'équilibrage, le rapport sol/solution, le poids de l'échan ­
tillon de sol, le volume de la phase aqueuse en contact avec le sol et la concentration de la substance d'essai dans la solution sont choisis en fonction des résultats de l'étude préliminaire. L'analyse doit être 
effectuée de préférence après un temps de contact de 2, 4, 6, 8 
(éventuellement 10) et 24 heures. Le temps d'agitation peut être étendu à 48 heures maximum lorsque les résultats sur le rapport sol/solution font ressortir un temps d'équilibrage plus long. Les 
temps d'analyse doivent être considérés avec une certaine souplesse.
 
Chaque expérience (un sol et une solution) est effectuée au moins en 
double afin d'évaluer la variance des résultats. Un témoin est préparé 
pour chacune d'elle avec du sol et de la solution de CaCl  2 0,01 M, 
sans substance d'essai, d'un poids et d'un volume identiques aux échantillons d'essai. Un échantillon de contrôle préparé uniquement 
à partir de la substance d'essai contenue dans une solution de CaCl
 2 
0,01 M (sans sol) est soumis à la même procédure d'essai afin de se 
prémunir contre l'imprévu.  
Le pourcentage d'adsorption est calculé à chaque instant  A t i et/ou 
intervalle de temps  A Δt i (selon les besoins). Il est porté sur un graphe 
en fonction du temps. Le coefficient de distribution K  d à l'équilibre 
ainsi que le coefficient d'adsorption normalisé basé sur la teneur en 
carbone organique K  oc (pour les substances chimiques non polaires) 
sont également calculés.  
Résultats de l'essai de cinétique d'adsorption  
La valeur linéaire K  d , qui exprime la mobilité inhérente des subs ­
tances chimiques dans le sol, est généralement suffisamment précise pour décrire le comportement de sorption du sol (35)(78). Les subs ­
tances chimiques dont K
 d est ≤ 1 cm  3 g -1 sont en général considérées 
comme étant mobiles. Mac Gall et coll. ont élaboré un système de 
classification de la mobilité fondé sur les valeurs K  oc (16). Il existe 
également des systèmes de classification de la lixiviation fondés sur la relation entre K
 oc et DT-50 (  1 ) (32) (79).  
Selon les études d'analyse d'erreurs (61), les valeurs K  d inférieures à 
0,3 cm  3 g -1 ne peuvent pas être estimées avec précision à partir d'une 
diminution de la concentration dans la phase aqueuse, même si l'on applique le rapport sol/solution le plus favorable (sur le plan de la précision), c'est-à-dire 1:1. Dans ce cas, l'analyse des deux phases 
(sol et solution) est recommandée.
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( 1 ) DT-50: temps de dégradation de 50 % de la substance d'essai.
 En ce qui concerne les remarques précédentes, il est conseillé de 
poursuivre l'étude du comportement de sorption d'un produit 
chimique dans le sol et de sa mobilité potentielle en déterminant les isothermes d'adsorption de Freundlich des systèmes dont on peut déterminer précisément K
 d grâce au protocole expérimental 
suivi dans la présente méthode. Il suffit pour cela que la valeur 
obtenue en multipliant K  d avec le rapport sol/solution soit > 0,3 
— lorsque les mesures reposent sur la baisse de concentration de la phase aqueuse (méthode indirecte) — ou > 0,1 lorsque les deux 
phases sont analysées (méthode directe) (61).
 
1.9.2.5  Phase 3 — Isothermes d'adsorption, cinétique de désorption et 
isothermes de désorption  
1.9.2.5.1 I s o t h e r m e s d ' a d s o r p t i o n  
On utilise cinq concentrations de substances d'essai couvrant de 
préférence deux ordres de grandeur. La solubilité dans l'eau et les 
concentrations à l'équilibre de la phase aqueuse qui en résultent sont prises en compte lors du choix de ces concentrations. Il convient de garder le même rapport sol/solution par sol tout au long de l'étude. 
L'essai d'adsorption est effectué selon la description ci-dessus, à la 
différence près que la phase aqueuse est analysée une seule fois, au moment où le point d'équilibre déterminé au cours de la phase 2 est atteint. Les concentrations à l'équilibre dans la solution sont déter ­
minées et la quantité adsorbée est calculée à partir de la déplétion de 
la substance dans la solution ou avec la méthode directe. La masse adsorbée par unité de masse de sol est portée sur un graphe en fonction de la concentration à l'équilibre de la substance (voir le 
chapitre «Présentation des données»).
 
Résultats de l'essai relatif aux isothermes d'adsorption  
De tous les modèles mathématiques d'adsorption proposés jusqu'à 
présent, l'isotherme de Freundlich est le plus fréquemment utilisé pour décrire les processus d'adsorption. On peut trouver de plus amples informations sur l'interprétation et l'importance des modèles 
d'adsorption dans la bibliographie (41) (45) (80) (81) (82).
 
Remarque : il est bon de mentionner qu'une comparaison des 
valeurs K  F (coefficient d'adsorption de Freundlich) de différentes 
substances n'est possible que si ces valeurs sont exprimées en unités identiques (83).
 
1.9.2.5.2 C i n é t i q u e d e d é s o r p t i o n  
Cet essai vise à évaluer le caractère réversible ou irréversible de 
l'adsorption d'une substance sur un sol. C'est une information impor ­
tante dans la mesure où le processus de désorption joue un rôle non négligeable dans le comportement d'une substance chimique dans un 
sol. Ces données sur la désorption peuvent également servir à 
élaborer des modèles informatisés de simulation du lessivage et de l'écoulement des substances dissoutes. Si l'on souhaite effectuer une étude de désorption, il est conseillé d'effectuer l'étude ci-après pour 
tous les systèmes dont on aura pu déterminer Kd au cours de l'essai 
sur la cinétique d'adsorption précédent.
 
Comme pour l'étude sur la cinétique d'adsorption, l'essai sur la ciné ­
tique de désorption peut se faire selon la méthode parallèle ou la méthode séquentielle. Le choix de la méthode est laissé à l'apprécia ­
tion de l'expérimentateur, qui devra considérer les disponibilités en 
équipements de laboratoire et en ressources.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1066
 
a) méthode parallèle: on prépare, pour chaque sol inclus dans l'étude 
de désorption, des échantillons ayant un rapport sol/solution iden ­
tique, leur nombre étant égal aux intervalles de temps auxquels on souhaite étudier la cinétique de désorption. Il est préférable d'utiliser les mêmes intervalles de temps que pour l'étude sur la 
cinétique d'adsorption. Le temps total peut cependant être étendu 
de manière que le système parvienne à l'équilibre de désorption. On prépare un témoin pour chaque expérience (un sol, une solu ­
tion) à partir de sol et d'une solution de CaCl
 2 0,01 M (sans 
substance d'essai), d'un poids et d'un volume identiques à ceux 
de l'expérience. La substance d'essai dans une solution de CaCl  2 
0,01 M (sans sol) est soumise à la même procédure d'essai en tant 
qu'échantillon de contrôle. Tous les mélanges sol/solution sont 
agités jusqu'à l'équilibre d'adsorption (tel qu'il a été déterminé 
dans la phase 2). Les phases sont ensuite séparées par centrifu ­
gation et les phases aqueuses sont extraites le plus complètement possible. Le volume de solution extrait est remplacé par un 
volume égal de CaCl
 2 0,01 M ne contenant pas de substance 
d'essai et ces mélanges sont à nouveau agités. La phase aqueuse du premier tube est récupérée le plus complètement possible puis mesurée après 2 h, par exemple, celle du deuxième 
tube après 4 h, celle du troisième après 6 h, etc., jusqu'à ce que 
l'équilibre de désorption soit atteint.
 
b) méthode séquentielle: après l'essai de cinétique d'adsorption, le 
mélange est centrifugé et la phase aqueuse est extraite le plus 
complètement possible. Le volume de solution extrait est 
remplacé par un volume égal de CaCl  2 0,01 M sans substance 
d'essai. Ce mélange est agité jusqu'à ce que l'équilibre de désorp ­
tion soit atteint. Pendant ce temps, le mélange est centrifugé à des 
intervalles de temps définis afin de séparer les phases. Une petite 
aliquote de la phase aqueuse est immédiatement analysée afin de rechercher la substance d'essai, puis on poursuit l'expérience avec 
le mélange original. Le volume de chaque aliquote ne devrait pas 
dépasser 1 % du volume total. La même quantité de solution fraîche de CaCl
 2 0,01 M est ajoutée au mélange afin de maintenir 
le rapport sol/solution, puis celui-ci est agité jusqu'au prochain 
intervalle de temps.  
Le pourcentage de désorption est calculé à chaque temps ( ðD t i Þ) 
et/ou intervalle de temps ( ðD Δt i Þ) (selon les besoins de l'étude), 
puis il est porté sur un graphique en fonction du temps. Le coeffi ­
cient de désorption K  des à l'équilibre est également calculé. Toutes 
les équations applicables sont données dans le chapitre «Présentation des données» de l'annexe 5.
 
Résultats de l'essai de cinétique de désorption  
L'inscription sur un même graphe du pourcentage de désorption  D t i et d'adsorption  A t i en fonction du temps permet d'estimer la réver ­
sibilité du processus d'adsorption. L'adsorption est jugée réversible si 
l'équilibre de désorption est atteint avant le double de temps néces ­
saire à l'équilibre d'adsorption et si la désorption totale est supérieure à 75 % de la quantité adsorbée.
 
1.9.2.5.3 I s o t h e r m e s d e d é s o r p t i o n  
Les isothermes de désorption de Freundlich sont déterminés sur les 
sols utilisés lors de l'expérience relative aux isothermes d'adsorption. L'essai de désorption est réalisé selon les modalités décrites dans le chapitre «Cinétique de désorption», à la différence près que la phase 
aqueuse n'est analysée qu'une fois, à l'équilibre de désorption. On 
calcule ensuite la quantité de substance désorbée. La quantité de substance restant adsorbée sur le sol à l'équilibre de désorption est portée sur un graphe en fonction de la concentration d'équilibre de la 
substance d'essai en solution (voir le chapitre «Présentation des 
données» et l'annexe 5).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1067
 
2. PRÉSENTATION DES DONNÉES  
Les données analytiques sont présentées sous forme de tableaux (voir 
l'annexe 6) dans lesquels figurent les mesures et les moyennes calcu ­
lées. Les isothermes d'adsorption sont représentés sous forme de 
graphiques. Les calculs sont effectués selon les modalités présentées 
ci-après.  
Pour les besoins de l'essai, on estime que le poids de 1 cm  3 de 
solution aqueuse est de 1 g. Le rapport sol/solution peut être exprimé en M/M ou M/vol.
 
2.1 ADSORPTION  
L'adsorption ( A t i ) est définie comme le pourcentage de substance 
adsorbée sur le sol en fonction de la quantité présente au début de 
l'essai, dans les conditions de l'essai. Si la substance est stable et qu'elle n'adsorbe pas de manière significative sur la paroi du réci ­
pient,
 A t i est calculé à chaque instant t  i selon l'équation suivante:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
où: 
A t i = est le pourcentage d'adsorption à l'instant t  i (%); 
m s ads ðt i Þ = est la masse de substance d'essai adsorbée sur le sol 
durant le temps t  i (μg); 
m 0 = est la masse de substance dans le tube au début de 
l'essai (μg). 
L'annexe 5 donne des informations détaillées sur le mode de calcul 
du pourcentage d'adsorption  A  t i avec les méthodes parallèles et 
séquentielles.  
Le coefficient de répartition K  d est le rapport entre le contenu de la 
substance dans le sol et sa concentration massique dans la solution 
aqueuse, dans les conditions d'essai, lorsque l'équilibre d'adsorption est atteint.
 
Soit: 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
où: 
C s ads ðeqÞ = est la concentration de la substance adsorbée sur le 
sol à l'équilibre d'adsorption ( μg g-  1 ); 
C aq ads ðeqÞ = est la concentration massique de la substance dans la 
phase aqueuse à l'équilibre d'adsorption ( μg cm  -3 ). 
Elle est déterminée par analyse en tenant compte des valeurs données par les témoins.
 
m s ads ðeqÞ = est la masse de substance adsorbée sur le sol à l'équi ­
libre d'adsorption ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = est la masse de substance dans la solution à l'équilibre 
d'adsorption ( μg); 
m soil = est la quantité de phase de sol exprimée en masse 
sèche de sol (g);  
V 0 = est le volume initial de la phase aqueuse en contact 
avec le sol (cm  3 ). 
La relation entre A  eq et K  d est donnée par l'équation suivante:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1068
 
où: 
A eq = est le pourcentage d'adsorption à l'équilibre d'adsorption (%).  
Le coefficient normalisé basé sur la teneur en carbone organique K  oc 
lie le coefficient de répartition K  d à la teneur en carbone organique 
de l'échantillon de sol:  
soit: 
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
où: 
%OC = est le pourcentage de carbone organique dans l'échantillon 
de sol (g g  -1 ). 
Le coefficient K  oc représente une valeur unique qui caractérise prin ­
cipalement le partage de substances chimiques non polaires entre le carbone organique dans le sol ou sédiment et eau. L'adsorption de ces substances est liée à la teneur organique du solide adsorbant (7); 
les valeurs K
 oc dépendent donc des caractéristiques spécifiques des 
fractions humiques dont la capacité de sorption varie considérable ­
ment selon l'origine, la genèse, etc.  
2.1.1  Isothermes d'adsorption  
L'équation des isothermes d'adsorption de Freundlich lie la quantité 
de substance adsorbée à la concentration de substance en solution à 
l'équilibre (équation 8).  
Les données sont traitées comme dans le chapitre «Adsorption». On 
calcule pour chaque tube d'essai la quantité de la substance adsorbée 
sur le sol après l'essai d'adsorption ( C s ads ðeqÞ, noté ailleurs x/m). On 
suppose que l'équilibre a été atteint et que  C s ads ðeqÞreprésente la 
valeur d'équilibre:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ C 0 Ä C aq ads ðeqÞ h i
:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
L'adsorption de Freundlich est donnée par l'équation suivante (8):  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
ou, sous sa forme linéaire, par:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
où: 
K F ads = est le coefficient d'adsorption de Freundlich; il se mesure 
en cm  3 g -1 uniquement si 1/n = 1; dans tous les autres 
cas, la pente l/n s'écrit  K F ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ); 
n = est la constante de régression; l/n est généralement 
compris entre 0,7 et 1,0, ce qui indique que la donnée de sorption est fréquemment légèrement non linéaire.
 
Les équations (8) et (9) sont portées sur un graphique et les valeurs  
K F ads et l/n sont calculées au moyen d'une analyse de régression 
utilisant l'équation 9. Le coefficient de corrélation r  2 de l'équation 
logarithmique est également calculé. La figure 2 donne des exemples 
de graphes.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1069
 
Fig. 2.  Graphique d'adsorption de Freundlich, normalisé et linéarisé  
2.1.2  Bilan matière  
Le bilan matière (MB) correspond au pourcentage de substance 
récupéré par analyse après un essai d'adsorption par rapport à la quantité nominale de substance présente au début de l'essai.
 
Le traitement des données est différent si le solvant est complète ­
ment miscible avec l'eau. On peut dans ce cas appliquer le traitement des données visé au chapitre «Désorption» pour déterminer la quan ­
tité de substance extraite par solvant. Si celui-ci est moins miscible 
avec l'eau, il convient de déterminer la quantité récupérée.
 
Le bilan matière de l'adsorption est calculé de la manière suivante: 
on suppose que le terme (m  E ) correspond à la somme des masses de 
substance extraites du sol et de la surface du récipient d'essai au moyen d'un solvant organique.
 
soit: 
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
où: 
MB = est le bilan matière (%);  
m E = est la masse totale de substance extraite en deux étapes du 
sol et des parois du récipient ( μg); 
C o = est la concentration massique initiale de la solution en 
contact avec le sol ( μg cm  -3 ); 
V rec = est le volume de surnageant récupéré à l'équilibre d'adsorp ­
tion (cm  -3 ). 
2.2 DÉSORPTION  
La désorption (D) est définie comme le pourcentage de substance 
désorbée, rapporté à la quantité de substance préalablement adsorbée, 
dans les conditions d'essai:  
soit: 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
où: 
D t i = est le pourcentage de désorption à l'instant t  i (%); ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1070
 
m aq des ðt i Þ = est la masse de substance désorbée à partir du sol à 
l'instant t  i , (μg); 
m s ads ðeqÞ = est la masse de substance adsorbée sur le sol à l'équi ­
libre d'adsorption, ( μg). 
L'annexe 5 donne des informations détaillées sur la manière de 
calculer le pourcentage de désorption  D t i par la méthode parallèle 
et séquentielle.  
Le coefficient de désorption apparente (K  des ) correspond, dans les 
conditions d'essai, au rapport entre le contenu de la substance restant 
dans la phase du sol et la concentration massique de la substance 
désorbée dans la solution aqueuse, lorsque l'équilibre de désorption est atteint:
 
soit: 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
où: 
K des = est le coefficient de désorption (cm  3 g -1 ); 
m aq des ðeqÞ = est la masse totale de substance désorbée à partir du 
sol à l'équilibre de désorption ( μg); 
V T = est le volume total de la phase aqueuse en contact 
avec le sol durant l'essai de cinétique de désorption (cm
 3 ). 
Le chapitre «Désorption» de l'annexe 5 explique comment calculer  
m aq des ðeqÞ. 
Remarque  
Si l'essai d'adsorption a été réalisé avec la méthode parallèle, le 
volume V  T de l'équation (12) est estimé égal à V  0 . 
2.2.1  Isothermes de désorption  
L'équation des isothermes de désorption de Freundlich relie la quan ­
tité de la substance restant adsorbée sur le sol à la concentration de substance en solution à l'équilibre de désorption (équation 16).
 
La quantité de substance restant adsorbée sur le sol à l'équilibre de 
désorption est calculé pour chaque tube de la manière suivante:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ est défini comme:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
C s des ðeqÞ = est la quantité de la substance restant adsorbée sur le 
sol à l'équilibre de désorption ( μg g -1 ); 
m m des ðeqÞ = est la masse de substance déterminée par analyse dans 
la phase aqueuse à l'équilibre de désorption ( μg); ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1071
 
m aq A = est la masse de substance restant après l'équilibre d'ad ­
sorption en raison d'un remplacement volumique 
incomplet μg); 
m aq des ðeqÞ = est la masse de substance en solution à l'équilibre 
d'adsorption ( μg); 
m aq A ¼ m  aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = est le volume de solution prélevé du tube afin de mesurer la 
substance, à l'équilibre de désorption (cm  3 ) 
V R = est le volume de surnageant extrait du tube après obtention 
de l'équilibre d'adsorption et remplacé par le même volume de CaCl
 2 0,01 M (cm  3 ); 
L'équation de la désorption de Freundlich s'écrit (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K  F des · C aq des ðeqÞ 1=n (μg g -1 ) (16) 
ou, sous une forme linéaire:  
log C  s des ðeqÞ ¼ log K  F des þ 1=n · log C  aq des ðeqÞ (17) 
où: 
K F des = est le coefficient de désorption de Freundlich;  
n = est la constante de régression;  
C aq des ðeqÞ = est la concentration massique de substance dans la 
phase aqueuse à l'équilibre de désorption ( μg cm  -3 ). 
Les équations (16) et (17) peuvent être portées sur un graphique et 
les valeurs  K F des et 1/n sont calculées au moyen d'une analyse de 
régression en utilisant l'équation 17.  
Remarque:  
Si l'exposant d'adsorption ou de désorption de Freundlich 1/n est 
égal à 1, les constantes d'adsorption ou de désorption de Freundlich 
(K F ads et K F des ) sont identiques aux constantes d'adsorption ou de 
désorption à l'équilibre (K  d et K  des ) et les graphiques de C  s en 
fonction de C  aq seront linéaires. Si les exposants ne sont pas 
égaux à 1, les graphiques de C  s en fonction de C  aq seront non 
linéaires et les constantes d'adsorption et de désorption varieront selon les isothermes.
 
2.2.2  Procès-verbal d'essai  
Le procès-verbal doit comprendre les informations suivantes:  
— Identification complète des échantillons de sol utilisés, à savoir:  
— références géographiques du site (latitude, longitude);  
— date de l'échantillonnage;  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1072
 
— origine (sol agricole, forêt, etc.);  
— profondeur de l'échantillonnage;  
— contenu en sable/limon/argile;  
— valeurs du pH (dans CaCl  2 0,01M);  
— teneur en carbone organique;  
— teneur en matière organique;  
— teneur en azote;  
— rapport C/N;  
— capacité d'échange cationique (mmol/kg);  
— toutes les informations sur la collecte et le stockage des échan ­
tillons de sol;  
— le cas échéant, toutes les informations utiles à l'interprétation de 
l'adsorption et de la désorption de la substance testée;  
— la référence aux méthodes utilisées pour déterminer chaque para ­
mètre;  
— le cas échéant, des informations sur la substance à tester;  
— la température des essais;  
— les conditions de centrifugation;  
— le procédé utilisé pour analyser la substance;  
— les raisons motivant l'emploi d'un agent solubilisant pour préparer 
la solution de substance de réserve;  
— les raisons expliquant les corrections de calcul, le cas échéant;  
— les données relatives au formulaire (annexe 6) et à la présentation 
graphique;  
— toutes les informations et observations utiles pour interpréter les 
résultats des essais.  
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Annexe 1  
Organigramme d'essai
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1079
 
Appendice 2  
LES EFFETS DE LA PRÉCISION DE LA MÉTHODE ANALYTIQUE ET 
DES VARIATIONS DE CONCENTRATION SUR LA PRÉCISION DES 
RÉSULTATS DE L'ADSORPTION  
II ressort clairement du tableau suivant (84) que si la différence entre la masse 
initiale (m  0 = 110 μg) et la masse ( m aq ads ðeqÞ = 100 μg) de la substance dans la 
solution à l'équilibre est très faible, une erreur de 5 % dans la mesure de la concentration à l'équilibre fausse de 50 % le calcul de la quantité de la substance adsorbée sur le sol (
m s ads ðeqÞ) et de 52,4 % le calcul de K  d . 
Quantité de sol m  sol = 10g 
Volume de solution V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g -1 ) R‡ K  d (*) R‡  
POUR A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg ou 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 100 1,000 valeur 
réelle 10 1,00 valeur 
réelle 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
POUR A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg ou 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 50,0 0,500 valeur 
réelle 60,0 6,00 valeur 
réelle 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 
55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
POUR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg ou 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 1,100 0,011 valeur 
réelle 108,9 10,89 valeur 
réelle 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
(*) m  s ads ðeqÞ ¼ m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
où: 
m s ads ðeqÞ = est la masse de substance dans la phase de sol a l'équilibre ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = est la masse de substance dans la phase aqueuse à l'équilibre ( μg); 
C s ads ðeqÞ = est la concentration de substance dans la phase de sol à l'équilibre 
(μg g  -1 ); 
C aq ads ðeqÞ = est la concentration massique de la substance dans la phase 
aqueuse à l'équilibre ( μg cm  -3 ); 
R = est l'erreur analytique lors du calcul de  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = est l'erreur calculée due à l'erreur analytique R.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1080
 
Appendice 3  
TECHNIQUES D'ESTIMATION DE K  d 
1. Les techniques d'estimation permettent de prédire K  d en se fondant sur des 
corrélations avec des valeurs P  ow (12) (39) (63-68), avec des données sur 
l'hydrosolubilité (12) (19) (21) (39) (68-73) ou avec des données sur la 
polarité obtenues par HPLC en phase inversée (74-76). Comme le montrent 
les tableaux 1 et 2, on calcule K  oc ou K  om à partir de ces équations puis on 
obtient, indirectement, K  d à partir des équations suivantes:  
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Ces corrélations se fondent sur deux hypothèses: 1) c'est la matière orga ­
nique du sol qui influence principalement l'adsorption d'une substance: 2) 
les interactions en jeu sont essentiellement non polaires. Il en résulte que 
ces corrélations: 1) ne sont pas applicables aux substances polaires, ou uniquement de manière limitée et: 2) qu'elles ne s'appliquent pas lorsque la teneur en matière organique du sol est très faible (12). Par ailleurs, si l'on 
a trouvé des corrélations satisfaisantes entre P
 ow et l'adsorption (19), on ne 
peut pas en dire autant des relations entre l'hydrosolubilité et l'étendue de l'adsorption (19) (21); les études sont par conséquent très contradictoires.
 
3. Les tableaux 1 et 2 donnent quelques exemples de corrélations entre le 
coefficient d'adsorption et, respectivement, le coefficient de partage octanol- 
eau et l'hydrosolubilité.  
Tableau 1  
Exemples de corrélations entre le coefficient de distribution de l'adsorption et le coefficient de partage 
octanol-eau: pour d'autres exemples voir (12) (68)  
Substances Corrélations Auteurs  
Urée substituée log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Substances aromatiques 
chlorées log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou et al. (1983) (65) 
Divers pesticides log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl et Mingelgrin (1984) (66) 
Hydrocarbures aromatiques log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles et Mantoura (1987) (67)  
Tableau 2  
Exemples de corrélations entre le coefficient de distribution de l'adsorption et l'hydrosolubilité; pour 
d'autres exemples voir (68) (69)  
Composés Corrélations Auteurs  
Divers pesticides log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl et Mingelgrin (1984) (66) 
Substances aliphatiques 
aromatiques chlorées  lo g K  om = (4,040 +/– 0,038) – (0,557 
+/– 0,012) log S  w Chiou et al. (1979) (70) 
α-naphtol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Substances cycliques alipha ­
tiques chlorées log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Divers composés log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1081
 
Appendice 4  
CALCUL DES CONDITIONS DE CENTRIFUGATION  
1. Le temps de centrifugation est donné par la formule suivante (on suppose 
que les particules sont sphériques):  
t ¼ 9 
2 " 
η 
ω 2 rp 2 ðρ s Ä ρ aq Þ # 
lnðR b=R t Þ (1) 
Par commodité, tous les paramètres sont indiqués en unités n'appartenant 
pas au SI (g, cm)  
où: 
ω = vitesse de rotation (= 2 π rpm/60), rad s  -1 
rpm = tours par minute;  
η = viscosité de la solution, g s  -1 cm -1 
r p = rayon des particules, cm  
p s = densité du sol, g cm  -3 
p aq = densité de la solution, g cm  -3 
R t = distance entre le centre du rotor de la centrifugeuse et le haut de 
la solution dans le tube de la centrifugeuse, cm  
R b = distance entre le centre du rotor de la centrifugeuse et la base du 
tube de la centrifugeuse, cm  
R b -R t = longueur du mélange sol/solution dans le tube de la 
centrifugeuse, cm  
Dans la pratique, le double du temps calculé est nécessaire pour obtenir une 
séparation complète.  
2. On peut simplifier l'équation (1) si l'on considère que la viscosité ( η) et la 
densité (p  aq ) de la solution sont égales à la viscosité et à la densité de l'eau 
à 25  o C; dans ce cas, η = 8,95 x 10  -3 g s -1 cm -1 et p  aq = 1,0 g cm  3 . 
Le temps de centrifugation est donné par l'équation 2:  
t ¼ 3:7 
ðrpmÞ 2: p 2 ðρ s Ä lÞ ln Rb 
Rt (2) 
3. L'équation 2 montre l'importance des paramètres du temps (t) et de la 
vitesse (rpm} pour définir les conditions de centrifugation permettant de séparer des particules d'une taille définie (c'est-à-dire d'un rayon de 0,1 μm 
dans notre cas): 1) la densité du sol et 2) la longueur du mélange dans le 
tube de la centrifugeuse (R
 b -R t ), déterminent la distance qu'une particule de 
sol doit parcourir entre le haut de la solution et la base du tube; il apparaît que, pour un volume fixe, la longueur du mélange dans le tube dépend du carré du rayon du tube.
 
4. La figure 1 présente les différents temps de centrifugation (t) en fonction de 
la vitesse de centrifugation (rpm) pour différentes densités du sol (p  s ) 
(figure la) et pour différentes longueurs du mélange dans les tubes de la 
centrifugeuse (figure 2a). La figure la montre nettement l'influence de la 
densité du sol. Pour une centrifugation classique de 3 000 rpm, le temps de centrifugation est d'environ 240 min pour une densité du sol de 1,2 g cm
 1 , 
alors qu'il n'est que de 50 min pour 2,0 g cm  3 . La figure lb montre d'une 
manière similaire que, pour une centrifugation classique de 3 000 rpm, le 
temps de centrifugation est d'environ 50 min pour un mélange de 10 cm de long et de seulement 7 min pour une longueur de 1 cm. Il convient cependant de trouver un compromis optimal entre un mode de centrifuga ­
tion exigeant le moins de longueur possible et la séparation commode des 
phases après la centrifugation.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1082
 
5. De plus, lorsque l'on définit les conditions expérimentales de la séparation 
sol/solution, il importe de considérer l'existence d'une troisième «pseudo- 
phase», les colloïdes. Ces particules, d'une taille inférieure à 0,2 μm, 
peuvent influencer de manière significative le mécanisme d'adsorption d'une substance dans une suspension de sol. Après la centrifugation, 
réalisée comme cela est décrit ci-dessus, les colloïdes restent dans la 
phase aqueuse et sont analysés en même temps que celle-ci. On perd donc les informations sur leur impact.
 
Si le laboratoire dispose d'équipements d'ultracentrifugation ou d'ultrafiltra ­
tion, il peut étudier plus en détail l'adsorption/désorption d'une substance 
dans le sol et obtenir des informations sur l'adsorption de la substance sur 
les colloïdes. Il faut effectuer dans ce cas une ultracentrifugation à 60 000 rpm/min ou une ultrafiltration avec des filtres d'une porosité de 100 000 dalton pour séparer les trois phases, sol, colloïdes, solution. Le protocole 
d'essai doit être modifié en conséquence afin que les trois phases soient 
analysées.
 
Fig. la.
  
Variation du temps de centrifugation (t) en fonction de la vitesse de centri ­
fugation (rpm) et de la densité du sol.  
(p s ). R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, η = 8,95 x 10  -3 g s -1 cm -1 et p  aq = 
1,0 g cm  -3 à 25  o C. 
Fig. lb.
  
Variation du temps de centrifugation (t) en fonction de la vitesse de centri ­
fugation (rpm) et de la longueur du mélange dans le tube de la centrifu ­
geuse (R  b -R t ) = L; R  t = 10 cm, η = 8,95 x 10  -3 g s -1 cm -1 , p aq = 1,0 g cm  -3 
à 25  o C et p  s = 2,0 g cm  3 . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1083
 
Appendice 5  
CALCUL DE L'ADSORPTION A (%) ET DE LA DÉSORPTION D (%)  
Organisation de l'essai dans le temps:
  
On suppose pour tous les calculs que la substance d'essai est stable et qu'elle 
n'adsorbe pas de manière significative sur les parois du récipient.  
ADSORPTION A (A %)  
a) Méthode parallèle  
Le pourcentage d'adsorption est calculé pour chaque tube d'essai (i) au 
temps (t  i ) selon l'équation suivante:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 % (1) (  1 ) 
On peut calculer ainsi les termes de l'équation: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m 0 Ä C aq ads ðt i Þ·V 0 (μg) (3) 
où 
A t i = pourcentage d'adsorption ( %) au temps t  i 
m s ads ðt i Þ = masse de substance d'essai sur le sol au moment t  i où l'ana­
lyse est effectuée ( μg) 
m 0 = masse de la substance d'essai dans le tube au début de 
l'essai (μg) 
C o = concentration massique initiale de la solution en contact avec 
le sol (μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1084  
( 1 ) Équation applicable à la méthode directe et indirecte. Toutes les autres équations s'ap ­
pliquent uniquement à la méthode indirecte.
 C aq ads ðt i Þ = concentration massique de la substance dans la phase aqueuse 
au temps t  i où l'analyse est effectuée ( μg cm  -3) ; cette concen ­
tration est déterminée par analyse en tenant compte des valeurs données par les témoins
 
V O = volume initial de la solution en contact avec le sol (cm  3 ). 
Les valeurs du pourcentage d'adsorption  A t i ou C aq ads ðt i Þ sont portées sur un 
graphe en fonction du temps, puis on détermine le temps mis pour atteindre l'équilibre de sorption (voir les figures 1 et 2).
 
Figure 1.  
Courbe de l'équilibre d'adsorption
  
Figure 2.  
Concentration massique de la substance d'essai dans la phase aqueuse (C  aq ) 
en fonction du temps  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1085
 
b) Méthode séquentielle  
Les équations suivantes tiennent compte du fait que le procédé d'adsorption 
s'opère en mesurant la substance d'essai dans de petites aliquotes de la phase aqueuse à des intervalles de temps précis.
 
— Durant chaque intervalle de temps, la quantité de substance adsorbée 
sur le sol est calculée comme suit:  
— pour le premier intervalle de temps Δt i = t i — t  0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ· Í V 0 
v a A Î (4) 
— pour le deuxième intervalle de temps Δt 2 = t 2 — t  1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— pour le troisième intervalle de temps Δt 3 = t 3 — t  2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2·v a A 
v a A Î (6) 
— pour le n  ième intervalle de temps Δt n = t n - t n-1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— le pourcentage d'adsorption à chaque intervalle de temps  A  Δt i est 
calculée selon l'équation suivante:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) (  1 ) 
tandis que le pourcentage d'adsorption ( A t i ) au temps t  i est donné par 
l'équation:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) (  1 ) 
Les valeurs de l'adsorption  A t i or A Δt i (selon les besoins de l'étude) 
sont portées sur un graphe en fonction du temps, puis on détermine le 
temps mis pour atteindre l'équilibre de sorption.  
— Au temps d'équilibre t  eq : 
— la masse de substance adsorbée sur le sol est égale à:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) (  1 ) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1086  
( 1 ) Équations applicables à la méthode directe et indirecte. Toutes les autres équations 
s'appliquent uniquement à la méthode indirecte.
 — la masse de substance dans la soulution est égale à:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) (  1 ) 
— et le pourcentage d'adsorption à l'équilibre est égal à:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) (  1 ) 
Les paramètres ci-dessus sont définis de la manière suivante:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = masse de substance adsorbée sur le 
sol durant les intervalles de temps Δt
 1 . Δt 2 ,..., Δt n (μg) 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = masse de substance mesurée dans 
une aliquote  V a A au temps t  1 , t 2 , ..., 
t n (μg) 
m s ads ðeqÞ = masse de substance adsorbée sur le 
sol à l'équilibre d'adsorption ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = masse de substance dans la solu ­
tion à l'équilibre d'adsorption ( μg) 
V a A = volume de l'aliquote dans laquelle 
la substance est mesurée (cm  3 ) 
A Δt i = pourcentage d'adsorption corres ­
pondant à l'intervalle de temps 
Δt i ( %) 
A eq = pourcentage d'adsorption à l'équi ­
libre d'adsorption ( %).  
DÉSORPTION D (%)  
Le temps t  0 qui marque le début de l'essai de cinétique de désorption correspond 
au moment où le volume maximal de substance récupérée (une fois que l'équi ­
libre d'adsorption a été atteint) est remplacé par un volume égal de solution de 
CaCl  2 0,01 M.  
a) Méthode parallèle  
Au temps t  i , on mesure la concentration massique de la substance dans la 
phase aqueuse prélevée dans le tube i ( V i 
r ) et la masse désorbée est calculée 
selon l'équation suivante:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ· Í V 0 
v r i Î 
Ä m aq A 
(13) 
À l'équilibre de désorption t  i — t  eq de sorte que  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
La masse de substance désorbée durant l'intervalle de temps ( Δt i ) est 
donnée par l'équation suivante:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Le pourcentage de désorption est calculé comme suit:  
au temps t  i avec l'équation:  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1087  
( 1 ) Équations applicables à la méthode directe et indirecte. Toutes les autres équations 
s'appliquent uniquement à la méthode indirecte.
 D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
durant l'intervalle de temps ( Δt i ) avec l'équation:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
où: 
D t i = pourcentage de désorption au temps t  i ( %) 
D Δt i = pourcentage de désorption à l'intervalle de temps Δt i ( %) 
m aq des ðt 1 Þ = masse de substance désorbée au temps t  i , (μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ = masse de substance désorbée durant l'intervalle de temps 
Δt i (μg) 
m m des ðt i Þ = masse de substance mesurée par analyse au temps t  i dans 
un volume de solution  V r i prélevé pour l'analyse ( μg); 
m aq A = masse de substance subsistant après l'équilibre d'adsorption 
en raison d'un volume de remplacement insuffisant ( μg); 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(17) 
m aq ads ðeqÞ = masse de substance dans la solution à l'équilibre d'adsorp ­
tion (μg) 
V R = volume de surnageant prélevé du tube après obtention de 
l'équilibre d'adsorption et remplacé par un volume égal de 
solution de CaCl  2 0,01 M (cm  3 ) 
V r i = volume de solution prélevé du tube (i) afin de mesurer la 
substance lors de l'essai de cinétique de désorption (cm  3 ). 
Les valeurs de désorption  D t i ou D Δt i (selon les besoins de l'étude) sont 
portées sur un graphe en fonction du temps, puis on calcule le temps mis 
pour atteindre l'équilibre de désorption.  
b) Méthode séquentielle  
Les équations ci-après tiennent compte du fait que le procédé d'adsorption a 
été réalisé en mesurant la substance d'assai dans de petites aliquotes ( ðv A 
a Þ) 
de la phase aqueuse (voir le chapitre sur la méthode séquentielle au point 
1.9 «Réalisation de l'essai»). On suppose a) que le volume de surnageant 
prélevé du tube après l'essai de cinétique d'adsorption a été remplacé par un volume égal de solution de CaCl
 2 0,01 M (V  R ) et b) que le volume total de 
la phase aqueuse en contact avec le sol (V  T ) durant l'essai de cinétique de 
désorption reste constant et égal à l'équation suivante:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1088
 
Au temps t  i : 
— La masse de substance est mesurée dans une petite aliquote  ðv a D Þ et la 
masse désorbée est calculée selon l'équation suivante:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— À l'équilibre de désorption t  i = t eq de sorte que  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
— Le pourcentage de désorption  D t i est calculé selon l'équation suivante:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
À l'intervalle de temps ( Δt i ): 
La quantité de substance désorbée durant chaque intervalle de temps est 
calculée de la manière suivante:  
— pour le premier intervalle de temps Δt 1 = t 1 — t  0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— pour le deuxième intervalle de temps Δt 2 = t 2 — t  1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
et 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— pour le nième intervalle de temps Δt n = t n — t  n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
et 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Enfin, le pourcentage de désorption à chaque intervalle de temps  D Δt i est 
calculé au moyen de l'équation suivante:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
tandis que le pourcentage de désorption  D t i à un moment t  i est donné par 
l'équation ci-dessous:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1089
 
Les paramètres ci-dessus sont définis de la manière suivante:  
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = masse de substance restant 
adsorbée sur le sol après les intervalles de temps Δt
 1 , Δt 2 , 
..., Δt n (μg) 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = masse de substance désorbée 
durant les intervalles de temps 
Δt 1 , Δ t 2 , …, Δt n (μg) 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = masse de substance mesurée 
dans une aliquote  ðv D 
a Þ au 
temps t  1 , t 2 , …, t  n , (μg); 
V T = volume total de la phase 
aqueuse en contact avec le sol durant l'essai de cinétique de désorption réalisé avec la 
méthode séquentielle (cm
 3 ) 
m A 
aq = masse de substance subsistant 
après l'équilibre d'adsorption en raison d'un volume de 
remplacement insuffisant ( μg);
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
où: 
V R = volume de surnageant extrait 
du tube après l'obtention de 
l'équilibre d'adsorption et remplacé par un volume égale de solution de CaCl
 2 0,01 M 
(cm  3 ) 
v a D = volume d'aliquote extrait du 
tube (i) pour analyse durant l'essai de cinétique de désorp ­
tion réalisé avec la méthode 
séquentielle (cm
 3 ) 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1090
 
Appendice 6  
ADSORPTION-DÉSORPTION DANS LES SOLS: PRÉSENTATION DES DONNÉES (FORMULAIRES)  
Substance testée:  
Sol testé:  
Teneur du sol en matière sèche (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . %  
Température: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adéquation de la méthode analytique  
Poids du sol g 
Sol: matière sèche g 
Volume de la solution de CaCl  2 cm 3 
Concentration nominale de la solution finale μg cm  -3 
Concentration d'analyse de la solution finale μg cm  -3 
Méthode analytique utilisée:  
Calibration de la méthode analytique:  
Substance testée:  
Sol testé:  
Teneur du sol en matière sèche (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . %  
Température: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Méthode analytique utilisée: Indirecte  □ Parallèle  □ Séquentielle  □ 
Directe  □ 
Essai d'adsorption: échantillons d'essai  
Symbole Unités Temps d'équili ­
brage Temps d'équili ­
brage Temps d'équili ­
brage Temps d'équili ­
brage  
Tube n  o 
Poids du sol — g 
Sol: matière sèche m  sol g 
Volume d'eau dans le sol pesé 
(calculé) V ws cm 3 
Volume de CaCl  2 0,01 M pour 
équilibrer le sol cm 3 
Volume de solution de réserve cm  3 
Volume total de phase aqueuse 
en contact avec le sol V 0 cm 3 
Concentration initiale de la 
solution à tester C 0 μg cm  -3 
Masse de substance au début de 
l'essai m 0 μg ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1091
 
Symbole Unités Temps d'équili ­
brage Temps d'équili ­
brage Temps d'équili ­
brage Temps d'équili ­
brage  
Après agitation et centrifugation  
MÉTHODE INDIRECTE 
Méthode parallèle 
Concentration de la substance 
dans la phase aqueuse, correc ­
tion témoins incluse  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Méthode séquentielle 
Masse de substance mesurée 
dans l'aliquote V  a A m m ads ðt i Þ μg 
MÉTHODE DIRECTE 
Masse de substance adsorbée sur 
le sol  m s ads ðt i Þ μg 
Calcul de l'adsorption 
Adsorption  A  t i % 
A Δt i % 
Moyennes 
Coefficient d'adsorption K  d cm 3 g -1 
Moyennes 
Coefficient d'adsorption K  oc cm 3 g -1 
Moyennes  
Substance testée:  
Sol testé:  
Teneur du sol en matière sèche (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . %  
Température: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Essai d'adsorption: témoins et contrôles  
Symbole Unités Témoin Témoin Contrôle  
Tube n  o 
Poids du sol g 0 0 
Volume d'eau dans le sol pesé (cal ­
culé) cm 3 — — 
Volume de solution de CaCl  2 0,01 M 
ajouté cm 3 
Volume ajouté de solution de réserve 
de la substance cm 3 0 0 
Volume total de la phase aqueuse 
(calculé) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1092
 
Symbole Unités Témoin Témoin Contrôle  
Concentration initiale de la substance 
dans la phase aqueuse μg cm  -3 
Après agitation et centrifugation  
Concentration dans la phase aqueuse μg cm  -3 
Remarque: ajouter des colonnes si nécessaire.  
Substance testée:  
Sol testé:  
Teneur du sol en matière sèche (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . %  
Température: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Bilan matière  
Symbole Unités  
Tube n  o 
Poids du sol — g 
Sol: matière sèche m  sol g 
Volume d'eau dans le sol pesé (calculé) V  ws ml 
Volume de CaCl  2 0,01 M pour équilibrer 
le sol ml 
Volume de solution de réserve cm  3 
Volume total de phase aqueuse en 
contact avec le sol V 0 cm 3 
Concentration initiale de la solution à 
tester C 0 μg cm  -3 
Temps d'équilibrage — h  
Après agitation et centrifugation  
Concentration de la substance dans la 
phase aqueuse à l'équilibre d'adsorption, 
correction témoin incluse  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temps d'équilibrage t  eq h 
1 re dilution au solvant 
Volume extrait de phase aqueuse V  rec cm 3 
Volume ajouté de solvant ΔV cm  3 
1 re extraction au solvant 
Signal analysé dans le solvant S  E1 var. 
Concentration de substance dans le 
solvant C E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1093
 
Symbole Unités  
Masse de substance extraite du sol et des 
parois du récipient m E1 μg 
2 e dilution au solvant 
Volume de solvant extrait ΔV S cm 3 
Volume de solvant ajouté ΔV' cm  3 
2 e extraction au solvant 
Signal analysé dans le solvant S  E2 var. 
Concentration de substance dans le 
solvant C E2 μg cm  -3 
Masse de substance extraite du sol et des 
parois lu récipient m E2 μg 
Masse totale de substance: extraction en 
deux tapes m E μg 
Bilan matière MB %  
Substance testée:  
Sol testé:  
Teneur du sol en matière sèche (105  o C, 12 h): … %  
Température: …  o C 
Isothermes d'adsorption  
Symbole Unités  
Tube n  o 
Poids du sol — g 
Sol: matière sèche E g Volume d'eau dans le sol pesé 
(calculé) V
 WS cm 3 
Volume de CaCl  2 0,01 M pour 
équilibrer le sol cm 3 
Volume de solution de réserve 
ajouté cm 3 
Volume total de phase aqueuse 
en contact avec le sol (calculé) V 0 cm 3 
Concentration de la solution C  0 μg cm  -3 
Temps d'équilibrage — h  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1094
 
Symbole Unités  
Après agitation et centrifugation  
Concentration de la substance 
dans la phase aqueuse, correc ­
tion témoin incluse  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Température  o C 
Masse adsorbée par unité de sol  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Analyse de régression:  
valeur de K  F ads : 
valeur de l/n:  
coefficient de régression r  2 : 
Substance testée:  
Sol testé:  
Teneur du sol en matière sèche (105  o C 12 h): … %  
Température: …  o C 
Méthode analytique utilisée: Indirecte  □ Parallèle  □ Séquentielle  □ 
Essai de désorption  
Symbole Unités Intervalle 
de temps Intervalle 
de temps Intervalle 
de temps Intervalle 
de temps  
Tube n  o provenant de l'essai d'adsorption 
Masse de substance adsorbée sur le sol à 
l'équilibre d'adsorption  m s ads ðeqÞ μg 
Volume extrait de phase aqueuse 
remplacé par CaCl  2 0,01 M V R cm 3 
Volume total de phase 
aqueuse en contact avec le sol PM V
 0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Masse de substance restant après l'équi ­
libre d'adsorption en raison d'un volume 
de remplacement insuffisant  m aq A μg 
Cinétique de désorption  
Masse mesurée de substance désorbée du 
sol au temps t  i m m des ðt i Þ μg 
Volume de solution extrait 
du tube (i) afin PM V  f i cm 3 
SM V  a D cm 3 
Masse de substance désorbée du sol du 
sol au temps t  i (calculé)  m aq des ðt i Þ μg 
Masse de substance désorbée du sol 
durant l'intervalle de temps Δt i (calculé)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1095
 
Symbole Unités Intervalle 
de temps Intervalle 
de temps Intervalle 
de temps Intervalle 
de temps  
Pourcentage de désorption  
Désorption au temps t  i D ti % 
Désorption à l'intervalle de temps Δt i D Δt i % 
Coefficient de désorption apparente K  des 
PM: Méthode parallèle.  
SM: Méthode séquentielle.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1096
 
C.19.  ESTIMATION DU COEFFICIENT D'ADSORPTION (K  OC ) SUR 
LE SOL ET LES BOUES D'ÉPURATION PAR 
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE 
(HPLC)  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite reprend la ligne directrice n  o 121 de l'OCDE 
(2001).  
1.1. INTRODUCTION  
On peut décrire le comportement de sorption des substances dans les 
sols ou les boues d'épuration à l'aide de paramètres déterminés expé ­
rimentalement selon la méthode d'essai C18. Un des paramètres essentiels est le coefficient d'adsorption, défini comme le rapport 
entre la concentration d'une substance dans le sol ou les boues et 
sa concentration dans la phase aqueuse à l'équilibre d'adsorption. Le coefficient d'adsorption normalisé basé sur la teneur en carbone organique du sol (K
 oc ) est un bon indicateur de la capacité de 
liaison d'une substance chimique à la matière organique du sol ou 
des boues d'épuration, et permet de comparer les substances chimiques entre elles. On peut estimer ce paramètre à partir de corrélations entre la solubilité dans l'eau et le coefficient de 
partage n-octanol/eau (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
La méthode expérimentale décrite dans cet essai utilise la HPLC 
pour estimer le coefficient d'adsorption K  oc dans le sol ou les 
boues d'épuration (8). Elle donne des résultats beaucoup plus fiables que ceux obtenus par les calculs de la méthode QSAR (9). En tant que méthode d'estimation, elle ne peut pas être totalement 
substituée aux essais par agitation conduits dans le cadre de la 
méthode d'essai C.18. Toutefois, le K
 oc estimé peut servir à sélec ­
tionner des paramètres d'essai pertinents pour l'étude des processus d'adsorption/désorption suivant la méthode précitée, grâce au calcul 
du coefficient de distribution (K
 d ) ou du coefficient d'adsorption de 
Freundlich (K  f ) selon l'équation 3 (voir paragraphe 1.2).  
1.2. DÉFINITIONS  
K d est le coefficient de distribution défini comme le rapport des 
concentrations à l'équilibre (C) d'une substance d'essai dissoute 
dans un système à deux phases dont une sorbante (sol ou boues 
d'épuration) et l'autre aqueuse. Il est sans unité lorsque les concen ­
trations dans les deux phases sont exprimées en termes de poids par 
poids. Si la concentration dans la phase aqueuse est exprimée en 
poids par volume, les unités sont alors en ml · g -1 . K d est susceptible 
de varier en fonction des propriétés du sorbant et peut dépendre de la concentration.
 
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
où: 
C soil = est la concentration de la substance d'essai dans le sol à 
l'équilibre d'adsorption ( μg· g -1 ); 
C slud = est la concentration de la substance d'essai dans les boues 
à l'équilibre d'adsorption ( μg· g -1 ); 
C aq = est la concentration de la substance d'essai dans la phase 
aqueuse à l'équilibre d'adsorption ( μg· g -1 , μg· ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1097
 
K f est le coefficient d'adsorption de Freundlich, défini comme la 
concentration de la substance d'essai dans le sol ou les boues d'épu ­
ration (x/m) lorsque la concentration à l'équilibre (C  aq ) dans la phase 
aqueuse est égale à un. Il est exprimé en μg.g -1 de sorbant. Il se 
calcule selon l'équation suivante.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
où: 
x/m = est la quantité de sorbant;  
1/n = est la pente de l'isotherme d'adsorption de Freundlich;  
C aq = est la concentration de la substance d'essai dans la phase 
aqueuse à l'équilibre d'adsorption ( μg . ml-  1 ). 
Lorsque  C aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc est le coefficient de distribution (K  d ) ou le coefficient d'adsorp ­
tion de Freundlich (K  f ) normalisé basé sur la teneur en carbone 
organique (f  oc ) du sorbant. Plus particulièrement dans le cas des 
substances non ionisées, il donne une approximation du degré d'ad ­
sorption d'une substance sur le sorbant et permet de faire des compa ­
raisons entre différents produits chimiques. Dépendant de K  d et de 
K f , il peut être sans unité ou s'exprimer en ml . g  -1 ou en μg . g  -1 de 
matière organique.  
Koc ¼ Kd 
foc ðsans unité ou en ml ·g Ä1 Þ ou Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
Comme la relation entre K  oc et K  d n'est pas toujours linéaire, les 
valeurs de K  oc peuvent donc varier d'un sol à l'autre, mais leur 
variabilité est très réduite par rapport aux valeurs de K  d ou de K  f . 
Le coefficient d'adsorption (K  oc ) se déduit du facteur de capacité (k') 
à partir de la courbe d'étalonnage de log k' en fonction de log K  oc , 
tracée pour les composés de référence sélectionnés. L'équation est la 
suivante:  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
où: 
t R = est le temps de rétention de la substance d'essai et de la 
substance de référence dans la colonne de HPLC (en minutes)
 
t 0 = est le temps mort dans la colonne de HPLC (en minutes) 
(voir point 1.8.2).  
P ow est le coefficient de partage octanol/eau. défini comme le rapport 
des concentrations d'une substance dissoute dans l'eau et le n-octa ­
nol. Il est sans dimension.  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Avant d'utiliser cette méthode, il convient de connaître la formule 
développée, la pureté et, le cas échéant, la constante de dissociation des substances de référence. Il est également utile d'être renseigné sur leur solubilité dans l'eau et les solvants organiques, leur coeffi ­
cient de partage octanol/eau ainsi que sur leurs caractéristiques d'hy ­
drolyse.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1098
 
Pour établir la corrélation entre les résultats expérimentaux de réten ­
tion en HPLC d'une substance d'essai et son coefficient d'adsorption 
K oc , on doit tracer la courbe d'étalonnage de log K  oc en fonction de 
log k'. Il faudrait utiliser au minimum six points dont au moins un supérieur et un inférieur à la valeur supposée de la substance d'essai. 
La précision de la méthode sera d'autant plus grande que les subs ­
tances de référence employées présenteront une structure chimique analogue à celle de la substance d'essai. S'il n'est pas possible d'avoir ces données, l'utilisateur est libre de sélectionner les substances d'éta ­
lonnage les mieux adaptées. Il devrait alors opter pour une série plus 
générale de substances présentant une hétérogénéité de structure. Les substances et les valeurs de K
 oc recommandées à l'usage sont indi ­
quées en annexe, au tableau 1 pour les boues d'épuration et au 
tableau 3 pour les sols. Il y aura donc lieu de justifier le choix de 
toute autre substance d'étalonnage.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
La HPLC est réalisée sur des colonnes d'analyse dont la phase solide 
est composée de résines commerciales cyanopropyliques contenant 
des radicaux lipophiles et polaires. On utilise une phase stationnaire 
modérément polaire basée sur une matrice de silice: 
– O – Si – CH  2 — CH  2 — CH  2 – CN 
silice espaceur apolaire radical polaire  
Le principe de cette méthode d'essai est analogue à celui de la 
méthode d'essai A.8 (coefficient de partage, méthode par HPLC). La substance d'essai, en migrant dans la colonne contenant la 
phase mobile, interagit avec la phase stationnaire. La répartition de 
la substance entre la phase mobile et la phase stationnaire contribue à en ralentir la progression. La composition de la phase stationnaire qui comporte à la fois des sites polaires et apolaires fait qu'une 
interaction est possible entre groupements polaires et radicaux 
apolaires d'une molécule — à l'instar de la matière organique dans des matrices de sol ou de boues d'épuration. On peut ainsi établir une relation entre le temps de rétention sur la colonne et le coefficient 
d'adsorption sur la matière organique.
 
Le pH exerce une influence significative, en particulier, sur le 
comportement de sorption des substances polaires. En règle générale, 
le pH varie entre 5,5 et 7,5 dans les sols agricoles et les bassins des 
stations de traitement des eaux usées. Les substances ionisables devraient être testées deux fois dans des solutions tampons appro ­
priées, à savoir sous leur forme ionisée et non ionisée, mais seule ­
ment si la dissociation du composé chimique atteint au moins 10 %, 
à des valeurs de pH comprises entre 5,5 et 7,5.
 
Comme l'évaluation se fonde exclusivement sur la relation entre la 
rétention sur la colonne de HPLC et le coefficient d'adsorption, il est 
inutile de faire appel à une méthode d'analyse quantitative, car seule 
la détermination du temps de rétention est nécessaire. À condition de disposer d'une série de substances de référence appropriées et d'ap ­
pliquer des conditions expérimentales normalisées, cette méthode 
constitue un moyen rapide et efficace d'estimer le coefficient d'ad ­
sorption K
 oc . 
1.5. APPLICABILITÉ DE L'ESSAI  
La méthode par HPLC convient aux substances chimiques (marquées 
ou non) pour lesquelles il existe un système de détection approprié 
(spectrophotomètre ou détecteur de radioactivité, par exemple) et qui 
restent suffisamment stables tout au long de l'essai. Elle peut s'avérer particulièrement utile pour les substances difficiles à étudier dans d'autres systèmes expérimentaux (à savoir, les substances volatiles, 
les substances insolubles dans l'eau à une concentration mesurable 
par analyse et les substances présentant une très grande affinité avec la surface des récipients d'incubation). On peut également l'appliquer à des mélanges qui donnent des bandes d'élution non résolues. Dans 
ce cas, il faut déterminer les valeurs limites supérieures et inférieures 
du log K
 oc des composants du mélange d'essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1099
 
Les impuretés risquent parfois de compliquer l'interprétation des 
résultats de la HPLC, mais leur importance restera négligeable si 
la substance d'essai peut être clairement identifiée et séparée des impuretés par une méthode analytique.
 
Après avoir été validée pour les substances énumérées au tableau 1 
de l'appendice, cette méthode a été appliquée à toute une série d'au ­
tres composés chimiques répertoriés dans les classes chimiques suivantes:
 
— amines aromatiques (exemples: trifluraline, 4-chloroaniline, 3,5- 
dinitro-aniline, 4-méthylaniline, N-méthvl- aniline, 1-naphthyla ­
mine),  
— esters d'acides carboxyliques aromatiques (exemples: ester 
méthylique de l'acide benzoïque, 3,5-dinitroben- zoate d'éthyle),  
— hydrocarbures aromatiques (exemples: toluène, xylène, éthylben ­
zène, nitrobenzène),  
— esters de l'acide aryloxyphénoxypropionique (exemples: didofop- 
méthyle, fénoxaprop-éthyle, fénoxaprop- P-éthyle).  
— fongicides à base de benzimidazole ou d'imidazole (exemples: 
carbendazime, fubéridazole, triazoxyde),  
— amides de l'acide carboxilique (exemples: 2-chlorobenzamide, 
N,N-diméthylbenzamide, 3,5-dinitrobenzamide, N-méthylbenza ­
mide, 2-nitrobenzamide, 3-nitrobenzamide),  
— hydrocarbures chlorés (exemples: endosulfan, DDT, hexachloro ­
benzène, quintozène, 1,2,3-trichlorobenzène),  
— insecticides organo-phosphorés (exemples: azinphos-méthyle, 
disulfoton, phénamiphos, isophenphos, pyrazophos, sulprophos, 
triazophos),  
— phénols (exemples: phénol, 2-nitrophénol, 4-nitrophénol, penta ­
chlorophénol, trichloro-2,4,6-phénol, 1-naphtol),  
— dérivés de la phénylurée (exemples: isoproturon, monolinuron, 
pencycuron),  
— colorants pigmentaires (exemples: Acid yellow 219, Basic Blue 
41, Direct Red 81),  
— hydrocarbures aromatiques polycycliques (exemples: acénaph ­
thène, naphthalène),  
— herbicides à base de triazine-1,3,5 (exemples: prométryne, propa ­
zine, simazine, terbutryne),  
— dérivés de triazole (exemples: tébuconazole, triadiméfon, tradi ­
ménol, triapenthénol).  
Cette méthode ne convient pas aux substances réagissant avec 
l'éluant ou la phase stationnaire. Par ailleurs, elle n'est pas applicable 
aux substances qui interagissent de manière spécifique avec des constituants inorganiques (formation de complexes en grappe avec les minéraux argileux, par exemple). Elle risque d'être inopérante 
pour les produits tensio-actifs, les substances inorganiques ainsi 
que les acides et bases modérés à forts. Elle permet de déterminer des valeurs de log K
 oc comprises entre 1,5 et 5,0. Les substances 
ionisantes doivent être mesurées dans une phase mobile tamponnée, 
en prenant toutes les précautions nécessaires pour éviter la précipi ­
tation des composants du tampon ou de la substance d'essai.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1100
 
1.6. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.6.1.  Précision  
En règle générale, le coefficient d'adsorption d'une substance d'essai 
peut être estimé à ± 0,5 unité logarithmiques de la valeur déterminée 
d'après la méthode par agitation (voir au tableau 1 de l'appendice). Il 
est possible d'atteindre une plus grande précision si les substances de référence utilisées présentent une structure chimique analogue à celle de la substance d'essai.
 
1.6.2.  Répétabilité  
Toutes les analyses doivent être répétées au moins deux fois. Les 
valeurs du log K  oc calculées à partir de résultats expérimentaux 
doivent être comprises dans un intervalle de 0,25 unité log.  
1.6.3.  Reproductibilité  
L'expérience acquise jusqu'à présent en appliquant la méthode d'essai 
par HPLC vient en corroborer la validité. À l'issue d'une étude expérimentant 48 substances (en majorité des pesticides) pour 
lesquelles existaient des données fiables concernant le K
 oc sur des 
sols, on a obtenu un coefficient de corrélation: R = 0,95 (10) (11).  
Un essai comparatif interlaboratoires conduit par 11 laboratoires a 
permis d'améliorer et de valider la méthode (12). Tous les résultats sont reproduits au tableau 2 de l'appendice.
 
1.7. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.7.1.  Estimation préliminaire du coefficient d'adsorption  
Le coefficient de partage octanol/eau P  ow (= K  ow ) et, dans une 
certaine mesure, l'hydrosolubilité peuvent servir d'indicateurs 
du degré d'adsorption, en particulier, pour les substances non ioni ­
sées. Ils permettent donc une première approximation des ordres de grandeur. Une série de corrélations utiles ont été publiées concernant 
plusieurs classes de produits chimiques (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Appareillage  
L'appareillage doit nécessairement comprendre un chromatographe 
en phase liquide équipé d'une pompe sans pulsations et d'un système de détection adapté. Il est recommandé d'utiliser une boucle d'injection munie d'une valve d'injection. Il faut employer 
des résines commerciales cyanopropyliques liées chimiquement sur 
une base de silice (Hypersil ou Zorbax CN, par exemple). Une colonne de garde du même matériau peut être insérée entre le système d'injection et la colonne d'analyse. La puissance de sépara ­
tion des colonnes d'analyse est susceptible de varier énormément 
d'un fournisseur à l'autre. À titre indicatif, il faudrait atteindre les facteurs de capacité (k') suivants: log k' > 0,0 pour log K
 oc = 3,0 et 
log k' > — 0,4 pour log K  oc = 2,0, en utilisant une phase mobile 
méthanol/eau 55/45 %.  
1.7.3.  Phases mobiles  
Après avoir testé différentes phases mobiles, on recommande les 
deux suivantes:  
— méthanol/eau (55/45 % v/v),  
— méthanol/solution tampon de citrate 0,01 M à pH 6,0 (55/45 % 
v/v). ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1101
 
Le solvant d'élution est préparé à partir de méthanol de qualité 
HPLC et d'eau distillée ou d'un tampon citrate. Le mélange est 
dégazé avant emploi. Il est préférable d'effectuer une élution isocra ­
tique. Si les mélanges méthanol/eau sont contre-indiqués, on peut essayer d'autres mélanges de solvant organique/eau, à savoir étha ­
nol/eau ou acétonitrile/eau. Dans le cas de composés ionisants, il est 
recommandé d'utiliser une solution tampon afin de stabiliser le pH. Il faut veiller à éviter que les sels ne précipitent ou que la colonne ne se détériore, ce qui risque de se produire avec certains mélanges de 
phase organique/tampon.
 
On s'abstiendra d'utiliser des additifs tels que des réactifs à paires 
d'ions, car ils risquent d'affecter les propriétés sorbantes de la phase stationnaire. Vu que des modifications de cette nature dans la phase 
stationnaire risquent d'être irréversibles, il est impératif d'effectuer les 
analyses comportant ce type d'additifs sur des colonnes séparées.
 
1.7.4.  Solutés  
Les substances de référence et d'essai doivent être dissoutes dans la 
phase mobile.  
1.8. RÉALISATION DE L'ESSAI  
1.8.1.  Conditions expérimentales  
On doit enregistrer la température pendant les mesures. Il est forte ­
ment recommandé d'utiliser une colonne placée dans une enceinte 
thermorégulée afin de garantir des conditions de température 
constantes pendant les différents cycles d'étalonnage et d'évaluation et la mesure de la substance d'essai.
 
1.8.2.  Détermination du temps mort t  o 
On peut utiliser deux méthodes pour déterminer le temps mort t  o 
(voir également point 1.2).  
1.8.2.1.  Détermination du temps mon t  o au moyen d'une série homologue  
Cette procédure a montré qu'il est possible d'obtenir des valeurs de t  o 
harmonisées et fiables. Pour sa description, il faut se reporter à la 
méthode d'essai A.8 «Coefficient de partage n-octanol/eau et 
méthode d'analyse par HPLC».  
1.8.2.2.  Détermination du temps mort t  o par des substances inertes non 
retenues sur la colonne  
Cette technique met en jeu l'injection de solutions de formamide, 
d'urée ou de nitrate de sodium. Il convient de répéter les mesures 
au moins deux fois.  
1.8.3.  Détermination des temps de rétention t  R 
Les substances de référence doivent être sélectionnées selon les 
indications du point 1.3. Pour déterminer leur temps de rétention, on peut les injecter sous la forme d'un étalon composite, à condition 
d'avoir vérifié au préalable que le temps de rétention de chaque 
étalon n'est pas influencé par la présence des autres étalons de réfé ­
rence. Il faudrait procéder à un étalonnage à intervalles réguliers, au moins deux fois par jour, pour tenir compte de toute variation 
imprévue dans le fonctionnement de la colonne. Pour la bonne 
règle, il est préférable d'injecter les étalons avant et après la subs ­
tance d'essai pour s'assurer que les temps de rétention n'ont pas évolué. On injecte chaque substance d'essai séparément dans des 
proportions aussi faibles que possible (ce qui évite de surcharger 
la colonne}, puis on détermine son temps de rétention.
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Afin d'accroître la fiabilité des mesures, toutes les déterminations 
doivent être effectuées au moins en double. Les valeurs de log K  oc 
déduites des résultats expérimentaux doivent être comprises dans un 
intervalle de 0,25 unité log.  
1.8.4.  Évaluation  
Les facteurs de capacité k' sont calculés à partir du temps mort t  o et 
des temps de rétention t  R des substances de référence selon l'équation 
4 (voir point 1.2). Les valeurs de log k' des substances de référence 
sont ensuite portées sur une courbe graphique en fonction des 
valeurs de leur log K  oc extraites des essais par agitation dont les 
résultats figurent aux tableaux 1 et 3 de l'appendice. À l'aide de cette courbe, la valeur du log K
 oc d'une substance d'essai est calculée à 
partir de son log k'. Si les résultats expérimentaux montrent que le 
log K  oc de la substance sort de l'intervalle des valeurs d'étalonnage, il 
convient de recommencer l'essai en employant d'autres substances de référence plus appropriées.
 
2. PRÉSENTATION DES DONNÉES  
Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes:  
— identité, degré de pureté et. le cas échéant, valeurs de pK  d des 
substances d'essai et de référence.  
— description des matériels utilisés et des conditions expérimen ­
tales, en indiquant le type et les dimensions de la colonne d'ana ­
lyse (et de la colonne de garde), du dispositif de détection, de la phase mobile (rapport des composants et pH), de la plage des 
températures pendant les mesures,
 
— temps mort et méthode appliquée pour l'évaluer,  
— quantités de substances de référence et d'essai injectées dans la 
colonne,  
— temps de rétention des composés de référence employés pour 
l'étalonnage,  
— détails de la courbe de régression ajustée (log k' en fonction de 
log K  oc ) et représentation graphique de cette courbe,  
— valeurs moyennes de rétention et valeur estimée du log K  oc de la 
substance d'essai,  
— chromatogrammes.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1 67.  
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the 
parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.  
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.
 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic subs ­
tances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 
pp. 297-312.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1103
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, pp. 831-832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121-128.  
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on 
soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemos ­
phere, 27(12), pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 28 5-304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1104
 
Appendice  
Tableau 1  
Comparaison entre les valeurs de K  oc sur les sols et les boues d'épuration et les valeurs calculées suivant la 
méthode de sélection par HPLC  ( 1 ) ( 2 ) 
Type de substance N  o CAS Log K  oc 
pour boues 
d'épuration Lo Log K  oc 
par HPLC Δ Log Log 
K oc pour 
sols Lo Log K  oc 
par HPLC Δ 
Atrazine 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Phénanthrène 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Benzoate de phényle 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamide 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamide 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acétanilide 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Aniline 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloroaniline 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), pp. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), pp. 107-119.  
Tableau 2  
Résultats des essais comparatifs inter-laboratoires (11 laboratoires participants) en vue d'améliorer et de valider 
la méthode par HPLC  ( 1 ) 
Type de substance N  o CAS Log K  oc Log K  oc 
(OCDE 106) [Méthode par HPLC|  
Atrazine 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapenthénol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fenthion 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30 (7), pp. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1105
 
Tableau 3  
Substances de référence recommandées pour des essais de sélection par HPLC d'après des données relatives à 
l'adsorption sur les sols  
Substance de référence N  o CAS Valeurs 
moyennes de log 
K oc d'après la 
méthode par 
agitation Nombre de 
résultats pour le 
K oc Écart type du log Source  
Acétanilide 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Phénol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamide 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N.N-diméthylbenzamide 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Méthylbenzamide 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Benzoate de méthyle 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazine 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamidc 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Aniline 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamide 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazime 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadiménol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxyde 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazophos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naphtalène 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfane-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Méthiocarbe 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichlorobenzène 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fenchion 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 8 1 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazophos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfane 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop-méthyle i 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Phénanthrène 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (mix) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmug; des orptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report 
No 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285-304. 
( c ) Données communiquées par les industriels.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1106
 
C.20.  DAPHNIA MAGNA, ESSAI DE REPRODUCTION  
1. MÉTHODE  
La méthode décrite pour cet essai de reproduction reprend la ligne 
directrice n  o 211 de l'OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCTION  
Le principal objectif de l'essai consiste à évaluer l'effet de produits 
chimiques sur la capacité reproductrice de  Daphnia magna.  
1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS  
Animaux parents:  Daphnia  femelles présentes au début de l'essai et 
dont la capacité reproductrice représente l'objet de cette étude.  
Descendants: jeunes  Daphnia  engendrées par les animaux parents au 
cours de l'essai.  
Concentration minimale avec effet observé (CMEO): concentration 
d'essai la plus basse à laquelle on a observé un effet statistiquement 
significatif de la substance sur la reproduction et la mortalité des 
animaux parents (à p < 0,05) par rapport au témoin, durant une période d'exposition définie. Cependant, toutes les concentrations d'essai supérieures à ta CMEO doivent exercer un effet nocif supé ­
rieur ou égal à celui observé à la CMEO. Si ces deux conditions ne 
peuvent être remplies, il convient de justifier de façon détaillée le choix de la CMEO (et donc de la CSEO).
 
Concentration (maximale) sans effet observé (CSEO): concentration 
d'essai immédiatement inférieure à la CMEO qui, comparée au 
témoin, n'a pas d'effet statistiquement significatif (à p < 0,05), 
durant une période d'exposition définie.  
CE x : concentration de la substance d'essai dissoute dans l'eau qui 
entraîne une diminution de x % de la reproduction chez  Daphnia 
magna , durant une période d'exposition définie.  
Taux intrinsèque d'accroissement : mesure de l'accroissement de la 
population qui intègre la capacité reproductrice et la mortalité par tranche d'âge (20) (21) (22). Cette valeur est nulle dans les popula ­
tions à l'état sta-tionnaire, positive dans les populations en croissance 
et négative dans les populations qui régressent. Cette dernière caté ­
gorie de population n'est évidemment pas durable et est vouée en fin de compte à l'extinction.
 
Limite de détection : la plus basse concentration susceptible d'être 
détectée, mais non chiffrée.  
Limite de détermination : la plus basse concentration susceptible 
d'être mesurée quantitativement.  
Mortalité : un animal est noté comme mort lorsqu'il est immobile, 
autrement dit lorsqu'il n'est pas capable de nager ou si aucun mouve ­
ment des appendices ou du postabdomen n'est observé dans les 15 secondes qui suivent l'agitation douce du récipient d'essai. (Si 
on utilise une autre définition, celle-ci doit être stipulée avec sa 
référence.)
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1107
 
1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
De jeunes femelles  Daphnia  (les animaux parents), âgées de moins 
de 24 heures au début de l'essai, sont expo-secs à la substance d'essai ajoutée à l'eau à différentes concentrations. L'essai dure 21 jours. À 
la fin de l'essai, le nombre total de descendants vivants produits par 
animal parent survivant à la fin de l'essai est évalué. La capacité reproductrice des animaux parents peut s'exprimer autrement (par exemple, par le nombre de descendants vivants produits par animal 
et par jour, à partir du premier jour où des descendants ont été 
observés), mais ces résultats doivent être fournis en plus du nombre total de juvéniles engendrés par parent survivant à la fin 
de l'essai. La capacité reproductrice des animaux exposés à la subs ­
tance d'essai est comparée à celle des témoins afin de déterminer la concentration minimale avec effet observé (CMEO) et, de là, la concentration (maximale) sans effet observé (CSEO). De plus, 
dans toute la mesure du possible, les résultats sont analysés à 
l'aide d'un modèle de régression, en vue d'estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % de la capacité reproductrice, c'est-à-dire la CE
 x (par exemple, CE  50 , CE  20 ou CE  10 ). 
Il faut aussi indiquer le taux de survie des animaux parents et le 
moment de la première portée. D'autres effets liés à la substance sur 
des paramètres tels que la croissance (par exemple, la longueur) et 
éventuellement le taux intrinsèque d'accroissement de la population peuvent aussi être examinés.
 
1.4. INFORMATIONS CONCERNANT LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Les résultats d'un essai de toxicité aiguë (voir méthode C.2, partie I) 
réalisé sur  Daphnia magna  devraient être disponibles. Ces résultats 
peuvent être utiles pour sélectionner une plage de concentrations 
d'essai adaptée aux essais de reproduction. La solubilité dans l'eau 
et la pression de vapeur de la substance d'essai doivent être connues. Il faudrait pouvoir disposer d'une méthode d'analyse fiable, dont le rendement et la limite de détermination sont connus, pour doser la 
substance dans les solutions d'essai.
 
Des informations sur la substance d'essai qui peuvent être utiles pour 
établir les conditions de l'essai comprennent la formule structurale, la 
pureté de la substance, la stabilité à la lumière, la stabilité dans les conditions de l'essai, le pKa, le coefficient de partage n-octanol/eau (P
 oe ) et les résultats d'un essai de biodégradabilité immédiate (voir 
méthode C.4).  
1.5. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
Pour que l'essai soit valable, les témoins doivent remplir les critères 
de performance suivants:  
— la mortalité des animaux parents ( Daphnia  femelles) ne dépasse 
pas 20 % à la fin de l'essai,  
— le nombre moyen de descendants vivants produits par animal 
parent survivant à la fin de l'essai est ≥ 60. 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareillage  
Les récipients d'essai et les autres dispositifs qui entreront en contact 
avec les solutions d'essai doivent être entièrement en verre ou consti ­
tués d'une autre matière chimiquement inerte. On utilisera en prin ­
cipe des béchers en verre.  
En outre, il sera nécessaire d'employer une partie ou la totalité du 
matériel suivant:  
— un appareil pour mesurer la concentration de l'oxygène (à l'aide 
d'une microélectrode ou d'un autre dispositif destiné à mesurer 
l'oxygène dissous dans des échantillons de faible volume),  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1108
 
— un thermostat adéquat,  
— un pH-mètre,  
— un appareil pour mesurer la dureté de l'eau,  
— un appareil pour déterminer la concentration de carbone orga ­
nique total (COT) dans l'eau ou la demande chimique en 
oxygène (DCO),  
— un dispositif approprié pour régler le régime d'éclairage et 
mesurer l'intensité lumineuse.  
1.6.2.  Organisme d'essai  
L'espèce à utiliser dans cet essai est  Daphnia magna  Straus. D'autres 
espèces de  Daphnia  peuvent être utilisées à condition qu'elles 
remplissent les critères de validité pertinents (ceux qui concernent la capacité reproductrice des témoins doivent s'appliquer aux espèces de Daphnia ). Si d'autres espèces de  Daphnia  sont utilisées, il y a lieu 
de les identifier clairement et de justifier leur utilisation.
 
Le clone devrait de préférence avoir été identifié d'après son géno ­
type. La recherche (1) a montré que la capacité reproductrice du clone A (originaire de l'IRCHA, en France) (3) répond de façon 
stable au critère de validité qui stipule une moyenne de ≥ 60 descen ­
dants par animal parent survivant, lorsqu'il est élevé dans les condi ­
tions décrites dans la présente méthode. D'autres clones sont toute ­
fois acceptables à condition de prouver que la culture de  Daphnia  
remplit les critères de validité pour l'essai.
 
Au début de l'essai, les animaux doivent être âgés de moins de 24 
heures et ne peuvent pas provenir d'une première génération de descendants. Ils doivent être issus d'un lot sain (c'est-à-dire qui ne 
présente pas de signes de stress, tels qu'une mortalité élevée, la 
présence de mâles et d'éphippies, un retard dans la production des premiers descendants, des animaux décolorés, etc.). Le lot d'animaux doit être maintenu dans des conditions de culture (lumière, tempéra ­
ture, milieu, alimentation et nombre d'animaux par unité de volume) 
semblables à celles qui seront appliquées au cours de l'essai. Si le milieu utilisé dans l'essai est différent de celui où sont normalement élevées les  Daphnia , il convient de laisser aux  Daphnia  une période 
d'acclimatation, avant l'essai, qui dure habituellement quelque 3 
semaines (c'est-à-dire une génération), afin d'éviter de stresser les animaux parents.
 
1.6.3.  Milieu d'essai  
Il est recommandé d'utiliser un milieu entièrement défini dans cet 
essai. Cela permet d'éviter le recours aux additifs (par exemple, 
algues, extraits de sol, etc.), qui sont difficiles à caractériser, et d'améliorer ainsi les possibilités de normalisation entre les labora ­
toires. Les milieux Elendt M4 (4) et M7 (voir appendice 1) se sont 
avérés pertinents à cette fin. D'autres milieux sont cependant accep ­
tables [par exemple (5) et (6)], à condition que les  Daphnia  élevées 
dans ces milieux satisfassent aux critères de validité établis pour l'essai.
 
Si le milieu utilisé contient des additifs non définis, ceux-ci devraient 
être spécifiés clairement et le rapport d'essai devrait comporter des informations sur la composition, notamment la teneur en carbone, étant donné qu'elle peut contribuer au régime alimentaire fourni. On 
préconise de déterminer le carbone organique total (COT) et/ou la 
demande chimique en oxygène (DCO) de la solution mère de l'ad ­
ditif organique et d'estimer leur incidence sur le COT et la DCO du milieu d'essai. En outre, il est souhaitable que les concentrations de 
COT du milieu (c'est-à-dire avant l'ajout des algues) soient infé ­
rieures à 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1109
 
Lorsque l'on teste des substances contenant des métaux, il est impor ­
tant de savoir que les propriétés du milieu d'essai (par exemple, la 
dureté, le pouvoir de chélation) peuvent influer sur leur toxicité. C'est pourquoi il est souhaitable d'opérer dans un milieu entièrement défini. Néanmoins, dans l'état actuel des connaissances, les seuls 
milieux entièrement définis qui conviennent aux cultures à long 
terme de  Daphnia magna  sont Elendt M4 et M7. Ces deux 
milieux contiennent l'agent chélateur EDTA. Des travaux ont montré (2) que la «toxicité apparente» du cadmium est généralement 
inférieure lorsque l'essai de reproduction est effectué dans les milieux 
M4 et M7, que lorsqu'il est effectué dans des milieux ne contenant pas d'EDTA. M4 et M7 ne sont donc pas recommandés pour tester des substances contenant des métaux, de même que d'autres milieux 
contenant des agents chélateurs connus. Il est souhaitable d'utiliser 
un autre milieu pour les substances renfermant des métaux, par exemple l'eau douce calcaire reconstituée d'ASTM (7), qui ne contient pas d'EDTA, additionnée d'un extrait d'algues (8). La 
combinaison de l'eau douce calcaire reconstituée d'ASTM et de l'ex ­
trait d'algues convient également aux essais et aux cultures à long terme de  Daphnia magna  (2), bien qu'elle exerce encore une légère 
action chélatante à cause des matières organiques contenues dans 
l'extrait d'algues.
 
Au début de l'essai et durant celui-ci, la concentration d'oxygène 
dissous devrait être supérieure à 3 mg/l. Le pH devrait être 
compris entre 6 et 9, et ne devrait normalement pas varier de plus 
de 1,5 unité au cours d'un même essai. Une dureté supérieure à 140 mg/l (en CaCO
 3 ) est recommandée. La capacité reproductrice 
des animaux dans les essais pratiqués à un niveau au moins égal à ce 
seuil s'est avérée conforme aux critères de validité (9) (10).  
1.6.4.  Solutions d'essai  
Les solutions d'essai sont généralement amenées à la concentration 
voulue par dilution d'une solution mère. Les solutions mères devraient, de préférence, être préparées par dissolution de la subs ­
tance dans le milieu d'essai.
 
Le recours à des dispersants ou solvants organiques peut quelquefois 
s'avérer nécessaire pour obtenir une solution mère à la concentration 
voulue, mais ces additifs doivent être évités dans toute la mesure du 
possible. Voici quelques exemples de solvants adéquats: acétone, éthanol, méthanol, diméthylformamide et triéthylè-neglycol. Parmi les dispersants recommandables, citons le Cremophor RH40, la 
méthylcellulose à 0,01 % et le HCO-40. En tout état de cause, la 
substance d'essai ne doit pas être testée au-delà de sa limite de solubilité dans le milieu d'essai.
 
Les solvants sont employés pour confectionner une solution mère qui 
peut être dosée avec précision dans l'eau. Les solvants énumérés ci- dessus, utilisés à la concentration recommandée dans le milieu 
d'essai final ( ≤ 0,1 ml/1), ne seront pas toxiques et n'augmenteront 
pas la solubilité de la substance dans l'eau.
 
Les dispersants peuvent faciliter le dosage précis et la dispersion. À 
la concentration recommandée dans le milieu d'essai final ( ≤ 0,1 
ml/1), les dispersants mentionnés ci-dessus ne seront pas toxiques 
et n'augmenteront pas la solubilité de la substance dans l'eau.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1110
 
1.7. CONCEPTION DE L'ESSAI  
Les traitements sont répartis dans les récipients d'essai et toutes les 
manipulations ultérieures de ces récipients sont réalisées dans un ordre aléatoire, faute de quoi, les résultats pourraient présenter un 
biais qui risquerait d'être interprété comme un effet de la concen ­
tration. Notamment, si les unités expérimentales sont manipulées par ordre de traitement ou de concentration, certains effets liés au temps, comme la fatigue du manipulateur ou d'autres erreurs, pourraient 
avoir un impact plus prononcé aux concentrations supérieures. En 
outre, si les résultats de l'essai sont susceptibles d'être affectés par une condition initiale ou liée à l'environnement, comme la situation 
dans le laboratoire, il conviendra d'envisager un plan en blocs.
 
1.8. MODE OPÉRATOIRE  
1.8.1.  Conditions d'exposition  
1.8.1.1.  Durée  
L'essai dure 21 jours.  
1.8.1.2.  Charge  
Les animaux parents sont répartis individuellement dans les réci ­
pients d'essai contenant chacun 50-100 ml de milieu.  
Il est parfois nécessaire d'avoir recours à des volumes plus impor ­
tants afin de pouvoir appliquer la méthode d'analyse utilisée pour 
déterminer la concentration de la substance d'essai, bien qu'il soit 
aussi possible de mélanger les récipients de même concentration aux fins de l'analyse chimique. Si des volumes supérieurs à 100 ml sont employés, il faudra peut-être augmenter la ration distribuée aux  
Daphnia , afin que la nourriture disponible soit suffisante et que les 
critères de validité soient satisfaits. S'agissant des essais dynamiques, d'autres protocoles peuvent être envisagés pour des raisons tech ­
niques (par exemple, 4 groupes de 10 animaux dans des volumes 
expérimentaux plus élevés), mais toute modification du mode opéra ­
toire doit être signalée.
 
1.8.1.3.  Nombre d'animaux  
Pour les essais semi-statiques, on utilisera au moins 10 animaux 
répartis individuellement à chaque concentration d'essai et au 
moins 10 animaux répartis individuellement dans la série de témoins.  
Pour les essais dynamiques, il s'avère approprié d'utiliser 40 animaux 
répartis en 4 groupes de 10 à chaque concentration d'essai (1). Un plus petit nombre d'animaux d'expérience peut être utilisé, mais on 
recommande d'employer au moins 20 animaux par concentration, 
répartis dans au moins 2 récipients contenant le même nombre d'ani ­
maux (par exemple, 4 récipients contenant 5 daphnies chacun). Notons que pour les essais où les animaux sont maintenus en 
groupe, il ne sera pas possible d'exprimer la capacité reproductrice 
en fonction du nombre total de descendants vivants produits par animal parent survivant à la fin de l'essai, si des animaux parents 
meurent. Auquel cas, il faudra exprimer la capacité reproductrice par 
«le nombre total de descendants vivants produits par parent présent au début de l'essai».
 
1.8.1.4.  Alimentation  
Dans les essais semi-statiques, on préconise d'administrer une ration 
quotidienne, ou au moins tri-hebdomadaire (ce qui correspond au 
renouvellement du milieu). Les écarts par rapport à cette fréquence 
(par exemple, dans les essais dynamiques) doivent être signalés.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1111
 
Au cours de l'essai, le régime alimentaire des animaux parents 
devrait, de préférence, se composer d'algues unicellulaires vivantes 
appartenant à une ou plusieurs des espèces suivantes:  Chlorella  sp., 
Selenastrum capricor-nutum  [renommée  Pseudokirchneriella subca ­
pitata  (11)] et  Scenedesmus subspicatus.  La nourriture devrait être 
dispensée en fonction de la teneur en carbone organique (C) fournie 
à chaque animal parent. La recherche (12) a montré que pour  
Daphnia magna , des teneurs comprises entre 0,1 et 0,2 mg de 
C/Daphnia /jour dans la ration alimentaire suffisaient pour produire 
le nombre de descendants requis selon les critères de validité. On 
peut fournir des rations à teneur constante tout au long de l'essai ou utiliser des teneurs plus faibles au début, que l'on augmentera afin de tenir compte de la croissance des animaux parents. Dans ce cas, la 
ration devrait toujours contenir entre 0,1 et 0,2 mg de C/ Daphnia / 
jour, qui est la teneur recommandée.
 
Si des paramètres de remplacement, comme le nombre de cellules 
d'algues ou l'absorbance de la lumière, sont utilisés pour doser la teneur en carbone requise dans la ration alimentaire (pour des raisons pratiques, car la mesure de la teneur en carbone prend beaucoup de 
temps), chaque laboratoire est tenu de produire son propre nomo ­
gramme mettant en relation le paramètre de remplacement et la teneur en carbone de la culture d'algues (des conseils concernant l'établissement d'un nomogramme sont donnés à l'appendice 2). 
Les nomogrammes devraient être vérifiés au moins une fois par 
an, et plus souvent si les conditions de culture des algues ont changé. Il a été démontré que l'absorbance de la lumière donne une meilleure indication de la teneur en carbone que le nombre de 
cellules (13).
 
Il convient d'administrer une suspension d'algues concentrée aux  
Daphnia , afin de réduire au minimum le volume du milieu de 
culture des algues transféré dans les récipients d'essai. On peut concentrer les algues par centrifugation, puis remise en suspension dans de l'eau distillée, de l'eau désionisée ou le milieu de culture des  
Daphnia.
 
1.8.1.5.  Lumière  
16 heures de lumière à une intensité ne dépassant pas 
15-20 μE· m  -2 · s -1 . 
1.8.1.6.  Température  
La température des milieux d'essai devrait être comprise entre 18 et 
22 o C. Néanmoins, dans un même essai, la température ne devrait 
pas, si possible, varier de plus de 2  o C au sein de cet intervalle (par 
exemple, 18-20, 19-21 ou 20-22  o C). Il peut être utile d'utiliser un 
récipient d'essai supplémentaire pour surveiller la température.  
1.8.1.7.  Aération  
Les récipients d'essai ne doivent pas être aérés durant l'essai.  
1.8.2.  Concentrations d'essai  
Il faudrait normalement utiliser au moins 5 concentrations d'essai 
formant une série géométrique, de préférence espacées d'un facteur 
n'excédant pas 3,2. Il convient d'utiliser un nombre approprié de répliques pour chaque concentration d'essai (voir point 1.8.1.3). L'utilisation de moins de 5 concentrations doit être justifiée. Les 
substances ne devraient pas être testées au-delà de leur limite de 
solubilité dans le milieu d'essai.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1112
 
Lors de la détermination de la plage de concentrations, il convient de 
tenir compte des éléments suivants:  
i) si l'on cherche à déterminer la CMEO et la CSEO, la plus faible 
concentration testée doit être suffisamment basse pour que le 
taux de fécondité à cette concentration ne soit pas significative ­
ment plus bas que celui du groupe témoin. Dans le cas contraire, il faudra recommencer l'essai en abaissant la concentration la 
plus basse;
 
ii) si l'on cherche à déterminer la CMEO et la CSEO, la plus forte 
concentration testée devra être suffisamment élevée pour que le taux de fécondité à cette concentration soit significativement inférieur à celui du groupe témoin. Dans le cas contraire, il 
faudra recommencer l'essai en augmentant la concentration la 
plus forte;
 
iii) si l'on veut estimer la CE  x relative aux effets sur la reproduction, 
il est conseillé d'utiliser des concentrations suffisantes pour définir cette CE
 x avec un niveau de confiance satisfaisant. Si 
l'on évalue la CE  50 relative aux effets sur la reproduction, il 
est souhaitable que la concentration d'essai la plus forte soit 
supérieure à cette CE  50 . Si tel n'est pas le cas, on pourra toujours 
estimer la CE  50 , mais l'intervalle de confiance sera très large et 
on risque de ne pas être en mesure d'évaluer la pertinence du 
modèle;  
iv) il vaut mieux éviter d'inclure dans la plage des concentrations 
d'essai celles qui ont un effet statistiquement significatif sur la survie des adultes parce que, ce faisant, on modifierait la nature de l'essai qui passerait d'un simple essai de reproduction à un 
essai combiné de reproduction et de mortalité, ce qui exige une 
analyse statistique bien plus complexe.
 
Une connaissance préalable de la toxicité de la substance d'essai 
(résultant d'une étude de toxicité aiguë et/ou d'études de détermina ­
tion de l'ordre de grandeur) devrait faciliter la sélection de concen ­
trations d'essai pertinentes.  
Lorsqu'un solvant ou un dispersant est utilisé pour faciliter la prépa ­
ration des solutions d'essai (voir point 1.6.4), sa concentration finale 
dans les récipients d'essai ne doit pas dépasser 0,1 ml/l et doit être identique dans tous les récipients d'essai.
 
1.8.3.  Témoins  
Il faudrait tester une série de témoins du milieu d'essai et, le cas 
échéant, une série de témoins contenant le solvant ou le dispersant, parallèlement aux séries traitées avec la substance d'essai. Le cas 
échéant, la concentration du solvant ou du dispersant doit être iden ­
tique à celle utilisée dans les récipients contenant la substance d'es ­
sai. Il convient d'utiliser un nombre approprié de répliques (voir point 1.8.1.3).
 
Généralement, dans un essai correctement mené, le coefficient de 
variation autour du nombre moyen de descendants vivants produits 
par animal parent dans le ou les groupes témoins devrait être ≤ 
25 %, et cette information doit être communiquée pour les essais où les animaux sont maintenus dans des récipients individuels.
 
1.8.4.  Renouvellement du milieu d'essai  
La fréquence de renouvellement du milieu dépend de la stabilité de 
la substance d'essai, mais devrait être au moins trihebdomadaire. Si les essais préliminaires de stabilité (voir point 1.4) montrent que la 
concentration de la substance d'essai n'est pas stable (c'est-à-dire en 
dehors de la fourchette de 80-120 % de la concentration nominale ou inférieure à 80 % de la concentration initiale mesurée) durant la période de renouvellement la plus longue (3 jours), il faut envisager 
de renouveler le milieu plus fréquemment ou de pratiquer un essai 
dynamique.
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Lors du renouvellement du milieu dans les essais semi-statiques, on 
prépare une deuxième série de récipients d'essai en vue d'y transférer 
les animaux parents avec, par exemple, une pipette en verre d'un diamètre approprié. Le volume de milieu transféré avec les  Daphnia  
doit être le plus petit possible.
 
1.8.5.  Observations  
Les résultats des observations effectuées durant l'essai doivent être 
consignés dans des fiches de données (voir exemples aux 
appendices 3 et 4). Si d'autres mesures s'imposent (voir points 1.3 et 1.8.8), des observations supplémentaires pourront être requises.
 
1.8.6.  Descendants  
Les descendants engendrés par chaque animal parent devraient de 
préférence être retirés et comptés quotidiennement, dès la première 
portée, pour ne pas qu'ils consomment la nourriture destinée aux 
adultes. Aux fins de la présente méthode, il ne faut compter que les descendants vivants, mais la présence d'œufs avortés ou de descendants morts doit être signalée.
 
1.8.7.  Mortalité  
La mortalité des animaux parents doit être notée, de préférence 
quotidiennement, et au moins à chaque comptage des descendants.  
1.8.8.  Autres paramètres  
Bien que la présente méthode vise avant tout à évaluer les effets sur 
la reproduction, il se peut que d'autres effets soient suffisamment quantifiés pour se prêter à l'analyse statistique. La mesure de la 
croissance est très intéressante, puisqu'elle fournit des indications 
sur les éventuels effets sublétaux, ce qui peut se révéler plus utile que les seules données de reproduction. On préconise de mesurer la longueur des animaux parents (la longueur du corps sans l'épine 
anale) à la fin de l'essai. D'autres paramètres peuvent être mesurés 
ou calculés: le moment de la première portée (et des portées suivantes), le nombre et la taille des portées par animal, le nombre de portées avortées, la présence de mâles ou d'éphippies et, éven ­
tuellement, le taux intrinsèque d'accroissement de la population.
 
1.8.9.  Fréquence des analyses quantitatives et des mesures  
La concentration d'oxygène, la température, la dureté et le pH 
doivent être mesurés au moins une fois par semaine, avant et après le renouvellement des milieux, chez les témoins et dans les 
récipients qui renferment la concentration la plus élevée de la subs ­
tance d'essai.
 
Au cours de l'essai, les concentrations de la substance à tester sont 
déterminées à intervalles réguliers.  
Dans les essais semi-statiques, où l'on suppose que la concentration 
de la substance d'essai ne s'écartera pas de plus de 20 % de la 
concentration nominale (c'est-à-dire qu'elle restera comprise dans un intervalle de 80 à 120 % — voir points 1.4 et 1.8.4), on recom ­
mande, au minimum, d'analyser les concentrations d'essai la plus 
élevée et la plus basse juste après leur préparation et au moment 
de leur renouvellement au cours de la première semaine de l'essai (les analyses devraient être pratiquées sur des échantillons prélevés dans la même solution, juste après la préparation de la solution et au 
moment du renouvellement). Ces déterminations devraient ensuite 
être répétées selon une fréquence au moins hebdomadaire.
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S'agissant des essais où la concentration n'est pas supposée demeurer 
dans un intervalle de ± 20 % de la concentration nominale, il est 
nécessaire d'analyser toutes les concentrations d'essai, juste après leur préparation et au moment du renouvellement. Cependant, pour les essais où la concentration initiale mesurée de la substance d'essai sort 
de l'intervalle de ± 20 % de la concentration nominale, mais pour 
lesquels on peut montrer de façon suffisamment convaincante que les concentrations initiales sont répétables et stables (c'est-à-dire comprises dans un intervalle de 80 à 120 % des concentrations 
initiales), les déterminations chimiques pourraient se limiter durant 
les deuxième et troisième semaines aux concentrations d'essai la plus élevée et la plus basse. En tout état de cause, la détermination de la concentration de la substance d'essai avant le renouvellement ne doit 
être effectuée que sur une seule réplique de chaque concentration 
d'essai.
 
Si on pratique un essai dynamique, il convient de recourir à un 
régime de prélèvements identique à celui décrit pour les essais semi-statiques (mais l'analyse des solutions «anciennes» ne s'ap ­
plique pas ici). Toutefois, il peut être souhaitable d'augmenter le 
nombre de prélèvements durant la première semaine (par exemple, trois séries de mesures) afin de vérifier la stabilité des concentrations d'essai. Dans ces types d'essai, le débit du diluant et de la substance 
d'essai doivent être contrôlés chaque jour.
 
S'il s'avère que la concentration de la substance d'essai a pu être 
correctement maintenue tout au long de l'essai dans un intervalle de ± 20 % de la concentration initiale mesurée ou nominale, les résultats peuvent être déduits des valeurs initiales mesurées ou nomi ­
nales. Si l'écart par rapport à la concentration initiale mesurée ou 
nominale est supérieur à ± 20 %, les résultats devraient être exprimés par rapport à la moyenne pondérée en fonction du temps (voir appendice 5).
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
L'objectif de cet essai est de déterminer l'effet de la substance à tester 
sur le nombre total de descendants vivants produits par animal parent survivant à la fin de l'essai. Le nombre total de descendants par animal parent doit être calculé pour chaque récipient d'essai (autre ­
ment dit, pour chaque récipient de même concentration). Si, dans un 
récipient, un animal parent meurt durant l'essai ou se révèle être un mâle, ce récipient est exclu de l'analyse. L'analyse reposera alors sur un nombre réduit de récipients de même concentration.
 
Pour l'estimation de la CMEO et, par conséquent, de la CSEO rela ­
tives aux effets du produit chimique sur la capacité reproductrice, il 
est nécessaire de calculer la moyenne de la capacité reproductrice à chaque concentration pour tous les récipients, ainsi que l'écart type résiduel groupé, et ce calcul peut être effectué à l'aide de l'analyse de 
la variance. La moyenne pour chaque concentration doit ensuite être 
comparée à la moyenne pour les témoins, par une méthode appro ­
priée de comparaisons multiples. Les tests de Dunnett ou de Williams peuvent convenir (14) (15) (16) (17). 11 est nécessaire 
de vérifier l'hypothèse (de l'analyse de la variance) concernant l'ho ­
mogénéité de la variance. On recommande d'effectuer cette vérifica ­
tion sur un graphique plutôt que par un test formel de signification (18); le test de Barlett convient également. Si cette hypothèse n'est 
pas vérifiée, il faut envisager de transformer les résultats afin d'ho ­
mogénéiser les variances avant d'effectuer l'analyse de la variance ou de réaliser une analyse de la variance pondérée. La grandeur de l'effet détectable par l'analyse de la variance (c'est-à-dire la plus 
petite différence significative) devrait être calculée et figurer dans 
le rapport.
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Four estimer la concentration qui provoquerait une réduction de 
50 % de la capacité reproductrice (CE  50 ), une courbe adéquate, 
comme la courbe logistique, devrait être ajustée aux résultats au moyen d'une méthode statistique telle que les moindres carrés. La courbe pourrait être paramétrée de manière que la CE
 50 et son écart 
type puissent être estimés directement. Cela faciliterait considérable ­
ment le calcul des limites de confiance de la CE  50 . À moins d'avoir 
de bonnes raisons de préférer d'autres niveaux de confiance, il convient d'opter pour des limites de confiance de 95 % de part et 
d'autre. La procédure d'ajustement devrait, de préférence, permettre 
d'évaluer la signification du manque d'ajustement. Cela peut se faire graphiquement ou en recherchant la part du manque d'ajustement et la part des erreurs proprement dites dans la somme des carrés des 
résidus et en pratiquant un test de signification pour le manque 
d'ajustement. Comme les traitements qui entraînent un taux de fécon ­
dité élevé sont susceptibles de donner lieu à une plus grande variance dans le nombre de juvéniles produits que les traitements 
diminuant le taux de fécondité, il faudrait envisager de pondérer les 
valeurs observées afin de refléter les diverses variances dans les différents groupes traités (voir référence 18).
 
Dans l'analyse des données obtenues à partir de l'essai tournant final 
(2), une courbe logistique a été ajustée à l'aide du modèle suivant, mais d'autres modèles conviennent également:
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
où: 
Y = est le nombre total de juvéniles par anima! paient survivant à la 
fin de l'essai (calculé pour chaque récipient)  
x = est la concentration de la substance  
c = est le nombre escompté de juvéniles lorsque x = 0  
x 0 = est la CE  50 dans la population  
b = est le paramètre caractérisant la pente  
Ce modèle devrait convenir dans un grand nombre de situations, 
mais pas dans toutes. Il faudrait vérifier la validité du modèle comme indiqué ci-dessus. Dans certains cas. il pourrait être approprié d'utiliser un modèle d'hormèse dans lequel les basses concentrations 
donnent des effets plus marqués (19).
 
D'autres effets liés à la concentration, comme la CE  10 ou la CE  20 , 
peuvent également être estimés, mais il faudra probablement para ­
métrer le modèle autrement que dans le cas de la CE  50 . 
2.2. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit mentionner les informations suivantes:  
2.2.1.  Substance d'essai  
— État physique et propriétés physico-chimiques pertinentes,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1116
 
— données permettant l'identification chimique, y compris la pureté.  
2.2.2.  Espèce d'expérience  
— Clone (préciser si son génotype a été déterminé), fournisseur ou 
source (quand elle est connue) et conditions de culture appli ­
quées. Si l'on utilise une espèce autre que  Daphnia magna,  il 
faut le signaler et le justifier.  
2.2.3.  Conditions d'essai  
— Mode opératoire utilisé (par exemple, semi-statique ou dyna ­
mique, volume, charge en nombre de  Daphnia  par litre),  
— photopériode et intensité lumineuse,  
— plan de l'essai (par exemple, nombre de récipients de même 
concentration, nombre de parents par récipient),  
— détails du milieu de culture employé,  
— le cas échéant, ajout de matière organique (préciser la composi ­
tion, la source, la méthode de préparation, le COT et la DCO des solutions mères, une estimation du COT et de la DCO résultants 
dans le milieu d'essai,
 
— informations détaillées concernant l'alimentation, notamment 
quantité (en mg de C/ Daphnia /jour) et programme (par exemple, 
type d'aliment(s), y compris, pour les algues, le nom de l'espèce et, si elles sont connues, la variété et les conditions de culture),
 
— méthode de préparation des solutions mères et fréquence de 
renouvellement (la nature et la concentration du solvant ou du 
dispersant doivent être indiquées, le cas échéant).  
2.2.4.  Résultats  
— Résultats des éventuelles études préliminaires sur la stabilité de la 
substance d'essai,  
— concentrations d'essai nominales et résultats de toutes les 
analyses permettant de déterminer la concentration de la subs ­
tance d'essai dans les récipients d'essai (l'appendice 4 fournit des exemples de fiches de données); le rendement de la méthode et 
sa limite de détermination devraient aussi être mentionnés,
 
— qualité de l'eau dans les récipients d'essai (pH, température, 
concentration d'oxygène dissous, COT et/ou DCO et dureté, le cas échéant) (l'appendice 3 fournit un exemple de fiche de données),
 
— dénombrement complet des descendants vivants de chaque 
animal parent (voir exemple de fiche de données à l'appendice 3),  
— nombre et dates des décès chez les animaux parents (voir 
exemple de fiche de données à l'appendice 3),  
— coefficient de variation de la fécondité chez les témoins (en 
fonction du nombre total de descendants vivants par animal parent survivant à la fin de l'essai),
 
— graphique représentant le nombre total de descendants vivants 
par animal parent survivant (pour chaque récipient de même 
concentration) à la fin de l'essai, en fonction de la concentration 
de la substance d'essai,  
— concentration minimale avec effet observé (CMEO) sur la repro ­
duction, y compris une description des méthodes statistiques utilisées et une indication de la grandeur de l'effet qui a pu être détecté, et concentration (maximale) sans effet observé 
(CSEO) sur la reproduction; s'il y a lieu, mentionner également 
la CMEO et la CSEO sur la mortalité des animaux parents,
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— s'il y a lieu, CE  x pour la reproduction et intervalles de confiance, 
ainsi qu'un graphique du modèle ajusté employé pour ces calculs, 
la pente de la courbe dose-effet et son écart type,  
— autres effets biologiques observés ou mesurés: indiquer tout autre 
effet biologique observé ou mesuré (par exemple, croissance des animaux parents) avec justification appropriée, le cas échéant,
 
— justification de tout écart par rapport à la présente méthode 
d'essai.  
3. BIBLIOGRAPHIE  
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(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
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logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1118
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.
 
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, pp. 1096-1121.  
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96.  
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, 
pp. 5 32.  
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1119
 
Appendice 1  
PRÉPARATION DE MILIEUX ELENDT M7 ET M4 ENTIÈREMENT 
DÉFINIS  
Acclimatation aux milieux Elendt M7 et M4  
Certains laboratoires ont éprouvé des difficultés à transférer directement les  
Daphnia  dans les milieux M4 (1) et M7. Ils ont toutefois obtenu certains résultats 
en procédant à une acclimatation progressive, c'est-à-dire en transférant les animaux de leur milieu vers un milieu à 30 % d'Elendt, puis à 60 % d'Elendt et enfin à 100 % d'Elendt. La période d'acclimatation peut prendre jusqu'à un 
mois.
 
PRÉPARATION  
Éléments en traces  
Différentes solutions mères (1), contenant chacune une seule substance en traces, 
sont tout d'abord préparées avec une eau d'une pureté adéquate, par exemple de 
l'eau désionisée, distillée ou obtenue par osmose inverse. À partir de ces diffé ­
rentes solutions mères (1), on prépare une deuxième solution mère unique (II) renfermant toutes les substances en traces (solution combinée), à savoir:
 
Solutions mères I 
(substance unique) Quantité ajoutée à 
l'eau 
(mg/l) Concentration (par 
rapport au milieu 
M4) 
(fois) Pour préparer la solution mère combinée 
II, ajouter la quantité suivante de solu ­
tion mère I à l'eau 
(ml/l) 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Les solutions de Na  2 EDTA et de FeSO  4 sont préparées séparément, puis mélangées et immédiatement autoclavées. 
Cela donne: 
Solution 21 Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1120
 
Milieux M4 et M7  
Les milieux M4 et M7 sont préparés à partir de la solution mère II, des macro ­
nutriments et des vitamines suivants:  
Quantité ajoutée à 
l'eau 
(mg/l) Concentration (par 
rapport au milieu 
M4) 
(fois) Quantité de solution mère ajoutée pour 
préparée le milieu 
(ml/l) 
M 4 M 7  
Solution mère II (combinaison de substances 
en traces) 20 50 50 
Solutions mères contenant les macronutriments (une substance par solution) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Solution mère de vitamines combinées — 10 000 0,1 0,1 La solution mère de vitamines combinées est préparée en additionnant 3 vitamines à 1 litre d'eau, comme indiqué ci- 
dessous: 
Chlorhydrate de thyamine 750 10 000 — — 
Cyanocobalamine (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotine 7,5 10 000 — —  
La solution mère de vitamines combinées est congelée par petites parties aliquotes. Les vitamines sont ajoutées au milieu peu d e temps 
avant son utilisation.  
Notes:  Afin d'éviter la précipitation des sels lors de la préparation du milieu complet, il faut ajouter les parties aliquotes de sol ution mère 
à quelque 500-800 ml d'eau désionisée et amener le volume à 1 litre. 
La première publication relative au milieu M4 se trouve dans Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultra- 
structural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma. 154, pp. 25-33.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1121
 
Appendice 2  
ANALYSE DE LA TENEUR EN CARBONE ORGANIQUE TOTAL (COT) 
ET ÉTABLISSEMENT D'UN NOMOGRAMME POUR LA TENEUR EN 
COT DES ALIMENTS À BASE D'ALGUES  
Il est admis que la teneur en carbone des algues alimentaires n'est généralement 
pas mesurée directement, mais déduite de corrélations (par nomogramme) avec 
des paramètres de remplacement comme le nombre de cellules d'algues ou l'ab- sorbanec de la lumière.
 
Il faudrait mesurer le COT par oxydation à haute température plutôt que par les 
méthodes aux UV ou au persulfate (voir: The Instrumental Determination of 
Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, 
HMSO 1980; 49 High Holborn, London WCIV 6HB).  
Pour établir le nomogramme, il y a lieu d'isoler les algues du milieu de crois ­
sance par une centrifugation suivie d'une remise en suspension dans de l'eau distillée. On mesure le paramètre de remplacement et la teneur en COT dans 
chaque échantillon, produit en triple exemplaire. Les témoins contenant unique ­
ment de l'eau distillée devraient être analysés et la teneur en COT déduite de celle de l'échantillon contenant les algues.
 
Les nomogrammes devraient être linéaires sur la plage prescrite des concentra ­
tions de carbone. Des exemples sont présentés ci-dessous.  
NB: Ne pas utiliser pour les conversions; il est essentiel que les laboratoires 
établissent leurs propres nomogrammes.
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1122
 
▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1123
 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1124
 ▼B 
Appendice 3  
EXEMPLE DE FICHE POUR CONSIGNER LE RENOUVELLEMENT DU MILIEU, LES DONNÉES DE SURVEILLANCE PHYSICO-CHIMIQUES, L'ALIMENTATION, LA 
REPRODUCTION DES  DAPHNIA  ET LA MORTALITÉ DES ADULTES  
Expérience n  0 : Date de départ: Clone: Milieu: Type d'alimentation: Substance d'essai: Concentration nominale 
Jour 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Renouvellement du 
milieu (cocher) 
PH (  1 ) Nouveau 
Ancien 
O 2 mg/l (  1 ) Nouveau 
Ancien 
Température (  o C) (  1 ) Nouveau 
Ancien 
Alimentation fournie 
(cocher) 
Nombre de descen ­
dants vivants (  2 ) Total 
Récipient 1 
2 
3 
4 5
 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1125
 ▼B 
Expérience n  0 : Date de départ: Clone: Milieu: Type d'alimentation: Substance d'essai: Concentration nominale 
Jour 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Mortalité cumulée des 
adultes (
 3 ) 
( 1 ) Indiquer quel récipient a été utilisé pour l'expérience. 
( 2 ) Indiquer la mortalité de tout animal adulte par la lettre «M» dans la case appropriée. 
( 3 ) Indiquer les portées avortées par les lettres «AB» dans la case appropriée.
 Appendice 4  
EXEMPLE DE FICHE DE DONNÉES POUR CONSIGNER LES RÉSULTATS DES ANALYSES CHIMIQUES  
a) Concentrations mesurées  
Concentration 
nominale Échantillon prélevé durant la 
première semaine Échantillon prélevé durant la 
deuxième semaine Échantillon prélevé durant la troi ­
sième semaine 
Après renouvel ­
lement Avant renouvel ­
lement Après renouvel ­
lement Avant renouvel ­
lement Après renouvel ­
lement Avant renouvel ­
lement  
b) Concentrations mesurées en pourcentage de la concentration nominale  
Concentration 
nominale Échantillon prélevé durant la 
première semaine Échantillon prélevé durant la 
deuxième semaine Échantillon prélevé durant la troi ­
sième semaine 
Après renouvel ­
lement Avant renouvel ­
lement Après renouvel ­
lement Avant renouvel ­
lement Après renouvel ­
lement Avant renouvel ­
lement  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1126
 
Appendice 5  
CALCUL D'UNE MOYENNE PONDÉRÉE DANS LE TEMPS  
Moyenne pondérée dans le temps  
Étant donné que la concentration de la substance d'essai peut diminuer au cours 
de la période comprise entre deux renouvellements du milieu, il est nécessaire de 
rechercher la concentration qui devrait être considérée comme représentative de 
la plage des concentrations appliquées aux  Daphnia  parents. Le choix devrait être 
guidé par des considérations tant biologiques que statistiques. Si on estime, par exemple, que les effets sur la reproduction sont surtout sensibles à la concen ­
tration maximale, il faut utiliser la concentration maximale. Si, par contre, on 
juge que c'est l'effet cumulé ou à long terme de la substance toxique qui est prépondérant, il est plus pertinent d'utiliser une concentration moyenne. Dans ce cas, la concentration moyenne pondérée dans le temps convient, puisqu'elle tient 
compte de la variation de la concentration instantanée en fonction du temps.
 
Figure 1  
Exemple de moyenne pondérée dans le temps
  
La figure 1 représente un essai (simplifié), d'une durée de 7 jours, avec renou ­
vellement du milieu aux jours 0, 2 et 4.  
— La ligne fine en zigzag représente la concentration en fonction du temps. La 
concentration est censée diminuer sui vant un schéma de décroissance expo ­
nentielle.  
— Les six points portés sur le graphique représentent les concentrations mesu ­
rées au début et à la fin de chaque période de renouvellement.  
— La ligne épaisse représente la moyenne pondérée dans le temps.  
La moyenne pondérée dans le temps est calculée de façon que l'aire sous la 
moyenne pondérée dans le temps soit égale à l'aire sous la courbe de concen ­
tration. Le calcul correspondant a l'exemple Ci-dessus est illustré dans le 
tableau 1.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1127
 
Tableau 1  
Calcul de la moyenne pondérée dans le temps  
Renouvellement n  o Jours Conc. 0 Conc. 1 Ln (Conc. 0) Ln (Conc. 1) Aire  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Nombre total de jours: 7 Aire totale 50,091 
Moyenne PT 7,156
 
«Jours» correspond au nombre de jours de la période de renouvellement.  
«Conc. 0» est la concentration mesurée au début de chaque période de renouvellement.  
«Conc. 1» est la concentration mesurée à la fin de chaque période de renouvellement,  
«Ln (Conc. 0)» est le logarithme népérien de Conc. 0.  
«Ln (Conc. 1)» est le logarithme népérien de Conc. 1.  
«Aire» est l'aire sous la courbe exponentielle correspondant à chaque période de renouvel ­
lement. Elle se calcule par la formule suivante:  
Aire ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü jours  
La moyenne pondérée dans «moyenne PT» est l'«aire totale» divisée par le 
«nombre total de jours».  
Bien entendu, dans le cas de l'essai de reproduction chez  Daphnia , le tableau 
devrait être complété jusqu'à 21 jours.  
Il est clair que lorsque les observations ne sont faites qu'au début et à la fin de 
chaque période de renouvellement, il n'est pas possible d'affirmer avec certitude 
que la baisse de concentration est effectivement exponentielle. Une courbe diffé ­
rente donnerait lieu à un calcul différent de l'aire. Cependant, une baisse de concentration exponentielle est plausible et constitue probablement la meilleure 
courbe à utiliser en l'absence d'autres informations.
 
Il convient toutefois d'être prudent si l'analyse chimique ne détecte aucune subs ­
tance à la fin de la période de renouvellement. À moins de pouvoir estimer la vitesse à laquelle la substance a disparu de la solution, il est impossible d'obtenir une aire sous la courbe réaliste et, partant, une moyenne pondérée dans le temps 
qui soit raisonnable.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1128
 
C.21.  MICRO-ORGANISMES DU SOL: ESSAI DE TRANSFORMA ­
TION DE L'AZOTE  
1. MÉTHODE  
La présente méthode d'essai reprend l'essai TG 216 (2000) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode d'essai décrit une méthode de laboratoire 
conçue pour étudier les effets à long terme des substances chimiques, 
après une exposition unique, sur l'activité de transformation de 
l'azote par les micro-organismes du sol. L'essai s'appuie principale ­
ment sur les recommandations de l'Organisation européenne et médi ­
terranéenne pour la protection des plantes (1). Toutefois, d'autres 
lignes directrices, notamment celles du Biologische Bundesanstalt 
allemand (2), de l'agence de protection de l'environnement des États-Unis (3) de la SETAC (4) et de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) (5), ont également été prises en considération. 
Lors d'un atelier de l'OCDE sur la sélection des sols et des sédi ­
ments, qui s'est tenu à Belgirate, Italie, en 1995 (6), le nombre et le type de sols à utiliser dans le cadre de cet essai ont été définis. Les recommandations relatives au prélèvement, à la manipulation et au 
stockage des échantillons de sol s'appuient sur des lignes directrices 
de l'ISO (7) et sur les recommandations de l'atelier de Belgirate. Pour déterminer et évaluer les caractéristiques toxiques des substances d'essai, il peut être nécessaire de déterminer leurs effets sur l'activité 
microbienne du sol, par exemple lorsqu'il est nécessaire de disposer 
de données sur les effets secondaires potentiels des produits phyto ­
sanitaires sur la microflore du sol ou bien en cas de risque d'expo ­
sition des micro-organismes du sol à des substances chimiques autres 
que les produits phytosanitaires. L'essai de transformation de l'azote 
est effectué pour déterminer les effets de ces substances chimiques sur la microflore du sol. Si l'essai porte sur des produits agrochi ­
miques (produits phytosanitaires, engrais, produits chimiques sylvi ­
coles), deux essais sont effectués: l'essai de transformation de l'azote et l'essai de transformation du carbone. S'il s'agit d'autres substances que les produits agrochimiques, l'essai de transformation de l'azote 
suffit. Toutefois, si les valeurs CE
 50 de l'essai de transformation de 
l'azote relatives à ces substances chimiques correspondent à celles des inhibiteurs de la nitrification commerciaux (nitrapyrine), un essai de transformation du carbone peut être effectué afin d'obtenir des 
informations complémentaires.
 
Les sols sont formés de composés vivants et non vivants qui existent 
sous forme de mélanges complexes et hétérogènes. Les micro-orga ­
nismes jouent un rôle important dans la décomposition et la trans ­
formation de la matière organique en sol fertile et un grand nombre d'espèces contribuent aux différents aspects de la fertilisation des sols. Toute interférence à long terme avec ces processus biochi ­
miques risque de perturber le cycle des éléments nutritifs et par 
conséquent d'altérer la fertilité du sol. La transformation du carbone et de l'azote se produit dans tous les sols fertiles. Bien que les colonies microbiennes responsables de ces processus diffè ­
rent d'un sol à un autre, les voies de transformation sont identiques 
pour l'essentiel.
 
La méthode d'essai décrite ici est conçue pour détecter les effets 
nocifs à long terme d'une substance sur le processus de transforma ­
tion de l'azote à la surface aérobie des sols. La méthode d'essai permet également d'estimer les effets des substances sur la trans ­
formation du carbone par la microflore du sol. La formation de 
nitrate se produit par suite de la dégradation des liaisons carbone- 
azote. Par conséquent, si l'on trouve des taux identiques de produc ­
tion de nitrate dans des sols traités et dans les sols témoins, il est très probable que les voies de dégradation principales du carbone soient 
intactes et fonctionnelles. Le substrat choisi pour l'essai (farine de 
luzerne en poudre) présente un bon rapport carbone-azote (générale ­
ment entre 12/1 et 16/1). De ce fait, la carence en carbone est réduite pendant l'essai et si la population microbienne est endommagée par 
une substance chimique, elle peut se reconstituer dans un délai de 
100 jours.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1129
 
Les essais à partir desquels la présente méthode d'essai a été mise au 
point étaient conçus avant tout pour des substances dont il est 
possible d'estimer la quantité qui pénètre dans le sol. C'est le cas par exemple, des produits phytosanitaires dont la dose d'application dans le champ est connue. Pour les produits agrochimiques, il suffit 
de pratiquer un essai sur deux doses correspondant au taux d'appli ­
cation prévu ou estimé. Les produits agrochimiques peuvent être testés sous forme de principes actifs (p.a.) ou de produits formulés. Toutefois, l'essai n'est pas limité aux produits agrochimiques. En 
modifiant la quantité de substance-d'essai appliquée au sol, et le 
mode d'évaluation des données, on détermine les effets d'une série de concentrations sur la transformation de l'azote pour les substances chimiques autres que les produits agrochimiques L'essai peut égale ­
ment être utilisé pour les substances chimiques dont on ne connaît 
pas la quantité qui pénètre dans le sol.. Les résultats de ces essais sont utilisés pour préparer une courbe dose-réponse et calculer les valeurs CE
 x , où x est défini comme le pourcentage d'effet.  
1.2. DÉFINITIONS  
Transformation de l'azote : dégradation par des micro-organismes 
de la matière organique contenant de l'azote, par le processus d'am ­
monification et de nitrification, en son produit final, le nitrate inor ­
ganique.  
CE x (concentration produisant x % d'effet) : concentration de la 
substance d'essai dans le sol qui produit x pour cent d'inhibition de la transformation de l'azote en nitrate.
 
CE 50 (concentration produisant 50 % d'effet) : concentration de la 
substance d'essai dans le sol qui produit 50 pour cent (50 %) d'inhi ­
bition de la transformation de l'azote en nitrate.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Aucune.  
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Le sol tamisé est amendé avec de la farine végétale en poudre puis 
traité avec la substance d'essai ou laissé non traité (témoin). Si l'essai 
porte sur des produits agrochimiques, il est recommandé d'utiliser au 
moins deux concentrations d'essai et celles-ci doivent être choisies en fonction de la concentration maximale prévisible dans le champ. Au 
bout de 0, 7, 14 et 28 jours d'incubation, des échantillons de sol 
traité et des échantillons témoins sont extraits avec un solvant appro ­
prié, et les quantités de nitrate présentes dans les extraits sont déter ­
minées. Le taux de formation de nitrate dans les échantillons traités 
est comparé au taux des échantillons témoins, et l'écart en pourcen ­
tage entre l'échantillon traité et l'échantillon témoin est calculé. Tous les essais durent au moins 28 jours. Si, au 28
 e jour, les différences 
entre les sols traités et les sols non traités sont égales ou supérieures 
à 25 %, les mesures sont poursuivies pendant une durée maximale de 
100 jours. Lorsque l'essai porte sur des produits non agrochimiques, une série de concentrations de substance d'essai sont ajoutées aux échantillons de sol, et les quantités de nitrate formées dans les échan ­
tillons traités et les échantillons témoins sont mesurées au bout de 28 
jours d'incubation. Les résultats des essais avec une série de concen ­
trations sont analysés à l'aide d'un modèle de régression, et les valeurs CE
 x sont calculées (CE  50 , CE  25 et/ou CE  10 ). Voir définitions.  
1.5. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
L'évaluation des résultats des essais effectués avec des produits agro ­
chimiques repose sur des différences relativement faibles (valeur moyenne ± 25 %) entre les concentrations en nitrate dans les échan ­
tillons témoins et les échantillons traités, de sorte qu'une variabilité 
importante des témoins peut entraîner des résultats erronés. C'est 
pourquoi la variation entre les témoins doit être inférieure à ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1130
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareillage  
Des récipients d'essai en matériau chimiquement inerte sont utilisés. 
Ces récipients doivent avoir une contenance adaptée à la méthode 
d'incubation utilisée, c'est-à-dire: incubation en vrac ou avec une 
série d'échantillons individuels (voir le paragraphe 1.7.1.2). Il convient de veiller à la fois à minimiser l'évaporation et à permettre l'échangé gazeux pendant l'essai (les récipients d'essai peuvent par 
exemple être couverts d'une feuille de polyéthylène perforée). 
Lorsque l'essai porte sur des substances volatiles, il convient d'uti ­
liser des récipients hermétiques et étanches au gaz. La taille de ces 
récipients doit être telle qu'ils soient remplis environ au quart de leur 
contenance avec l'échantillon de sol.
 
Le matériel courant de laboratoire suivant est utilisé:  
— agitateur: agitateur mécanique ou équivalent;  
— centrifugeuse (3 000 g) ou appareil de filtration (avec du papier 
filtre sans nitrate);  
— instrument de sensibilité et de reproductibilité adapté à l'analyse 
des nitrates.  
1.6.2.  Sélection et nombre de sols  
Un seul sol est utilisé. Les caractéristiques recommandées sont les 
suivantes:  
— teneur en sable: supérieure à 50 % et inférieure à 75 %,  
— pH: 5,5 - 7,5,  
— teneur en carbone organique: 0,5 — 1,5 %,  
— la biomasse microbienne doit être mesurée (8) (9) et sa teneur en 
carbone doit être égale à 1 % au moins du carbone organique 
total du sol.  
Dans la plupart des cas, un sol possédant ces caractéristiques repré ­
sente les conditions les plus défavorables, puisque l'adsorption de la substance chimique de l'essai est minimale et que l'exposition de la 
microflore est maximale. Il est donc généralement inutile d'effectuer 
des essais avec d'autres sols. Toutefois, dans certains cas, par exemple lorsque l'utilisation principale prévue de la substance d'essai concerne des sols particuliers comme les sols forestiers 
acides, ou dans le cas de substances chimiques chargées électrosta ­
tiquement, il peut être nécessaire d'utiliser un sol différent.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1131
 
1.6.3.  Prélèvement et stockage des échantillons de sol  
1.6.3.1.  Prélèvement  
Il est nécessaire de fournir des informations détaillées sur l'historique 
du site de prélèvement. Ces détails doivent comprendre la localisa ­
tion exacte, le couvert végétal, les dates de traitement aux produits 
phytosanitaires, les traitements aux engrais organiques et inorga ­
niques, les apports biologiques ou les contaminations accidentelles. Le site choisi pour le prélèvement de sol doit être de nature à 
permettre une utilisation de longue durée. Les pâturages permanents, 
les champs plantés de céréales annuelles (à l'exception du maïs) ou à ensemencement dense en engrais verts conviennent. Le site de prélè ­
vement retenu ne doit pas avoir été traité avec des produits phyto ­
sanitaires pendant un an au moins avant le prélèvement des échan ­
tillons. De même, aucun engrais organique ne doit avoir été appliqué pendant au moins six mois. L'utilisation d'engrais minéraux est 
acceptable uniquement si elle satisfait aux exigences de la culture 
et aucun échantillon de sol ne doit être prélevé que trois mois au moins après l'application d'engrais. L'utilisation de sol traité avec des engrais ayant des effets biocides connus (comme le cyanamide 
calcique) doit être évitée.
 
Il convient d'éviter de prélever des échantillons pendant ou immé ­
diatement après de longues périodes (plus de 30 jours) de sécheresse 
ou de saturation en eau. En ce qui concerne les sols labourés, les échantillons doivent être prélevés à une profondeur de 0 à 20 cm. En ce qui concerne les herbages (pâture) ou les sols qui ne sont pas 
labourés pendant de longues périodes (au moins une période végé ­
tative), la profondeur maximale du prélèvement peut être légèrement supérieure à 20 cm (25 cm par exemple).
 
Les échantillons de sol doivent être transportés dans des récipients et 
dans des conditions de température de nature à garantir que les 
propriétés initiales du sol ne soient pas altérées de manière signifi ­
cative.  
1.6.3.2.  Stockage  
Il est préférable d'utiliser des sols qui viennent d'être extraits du site. 
S'il n'est pas possible d'éviter le stockage dans le laboratoire, les sols 
peuvent être entreposés dans le noir à 4 ± 2  o C pendant une durée 
maximale de trois mois. Pendant la durée de stockage des sols, des conditions aérobies doivent être assurées. Si les sols sont prélevés 
dans une zone où il gèle au moins trois mois par an, il peut être 
envisagé de stocker le sol pendant six mois entre moins 18
 o C et 
moins 22  o C. La biomasse microbienne des sols stockés est mesurée 
avant chaque expérience et le carbone présent dans la biomasse doit 
être égal à 1 % au moins de la teneur totale en carbone organique du sol (voir le paragraphe 1.6.2).
 
1.6.4  Manipulation et préparation du sol pour l'essai  
1.6.4.1  Pré-incubation  
Si le sol a été stocké (voir le paragraphe 1.6.3.2), il est recommandé 
de procéder à une pré-incubation pendant 2 à 28 jours. La tempéra ­
ture et la teneur en eau du sol pendant la pré-incubation doivent être 
les mêmes que celles utilisées pendant l'essai (voir les 
paragraphes 1.6.4.2 et 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1132
 
1.6.4.2  Propriétés physico-chimiques  
Le sol est débarrassé manuellement des gros objets (pierres, débris 
végétaux, etc.) puis tamisé humide sans séchage excessif jusqu'à obtention d'une granulométrie inférieure ou égale à 2 mm. La 
teneur en eau de l'échantillon de sol doit être ajustée avec de l'eau 
distillée ou désionisée à une valeur située entre 40 % et 60 % de la capacité maximale de rétention d'eau.
 
1.6.4.3  Amendement à l'aide d'un substrat organique  
Le sol doit être amendé à l'aide d'un substrat organique approprié, 
comme de la farine de luzerne verte en poudre (composant principal:  
Medicago sativa ) avec un rapport C/N situé entre 12/1 et 16/1. Le 
rapport luzerne-sol recommandé est de 5 g de luzerne par kilo ­
gramme de sol (poids sec).  
1.6.5  Préparation de la substance d'essai à appliquer au sol  
La substance d'essai est généralement appliquée à l'aide d'un exci ­
pient. L'excipient peut être de l'eau (pour les substances solubles 
dans l'eau) ou un solide inerte comme du sable de quartz fin (gra ­
nulométrie: 0,1 - 0,5mm). Il convient d'éviter les excipients liquides autres que l'eau (solvants organiques tels que l'acétone ou le chloro ­
forme) car ils peuvent endommager la microflore. Si l'on utilise du 
sable comme excipient, celui-ci peut être traité par la substance d'essai dissoute ou en suspension dans un solvant approprié. Dans ce cas, le solvant doit être éliminé par évaporation avant de mélanger 
l'excipient avec le sol. Pour obtenir une répartition optimale de la 
substance d'essai dans le sol, un rapport de 10 g de sable par kilo ­
gramme de sol (poids sec) est recommandé. Les échantillons témoins sont traités avec une quantité équivalente d'eau et/ou de sable de 
quartz uniquement.
 
Lorsque l'on teste des substances chimiques volatiles, il convient 
d'éviter dans la mesure du possible les pertes pendant le traitement 
et il convient d'essayer de veiller à la répartition homogène dans l'échantillon de sol (la substance d'essai doit être injectée dans le sol en plusieurs endroits).
 
1.6.6  Concentrations d'essai  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, il convient d'utiliser 
au moins deux concentrations. La concentration la plus faible doit correspondre au moins à la quantité maximale susceptible de pénétrer 
dans le sol dans des conditions réelles alors que la concentration la 
plus élevée doit être un multiple de la concentration la plus faible. Les concentrations de substance d'essai ajoutées au sol sont calculées en supposant une incorporation uniforme à une profondeur de 5 cm 
et une densité apparente du sol de 1,5. Dans le cas des produits 
agrochimiques appliqués directement sur le sol, ou des substances chimiques dont on peut prévoir la quantité qui pénètre dans le sol, les concentrations d'essai recommandées sont égales à la concentra ­
tion maximale prévisible dans l'environnement (CPE) et cinq fois 
cette concentration. Les substances qui doivent être appliquées sur le sol plusieurs fois au cours d'une même saison doivent être testées à des concentrations calculées en multipliant la CPE par le nombre 
maximal d'applications prévu. La concentration la plus élevée testée 
ne doit toutefois pas dépasser dix fois la dose maximale d'une appli ­
cation. Si l'essai porte sur des produits non agrochimiques, une série géométrique de cinq concentrations au moins est utilisée. Les 
concentrations testées doivent couvrir la gamme nécessaire pour 
déterminer les valeurs CE
 x . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1133
 
1.7. EXÉCUTION DE L'ESSAI  
1.7.1.  Conditions expérimentales  
1.7.1.1.  Traitement et contrôle  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, le sol est divisé en 
trois fractions de poids égal. Deux fractions sont mélangées à l'ex ­
cipient contenant le produit, et la troisième avec l'excipient sans produit (témoin). Il est recommandé de préparer un minimum de trois réplicats de sol traité et non traité. Si l'essai porte sur des 
produits non agrochimiques, le sol est divisé en six fractions de 
poids égal. Cinq échantillons sont mélangés avec l'excipient conte ­
nant la substance d'essai, et le sixième est mélangé avec l'excipient 
sans la substance chimique. Il est recommandé de préparer trois 
réplicats de sol traité et de témoins. Il convient de veiller à la répartition homogène de la substance d'essai dans les échantillons de sol traité. Pendant le mélange, il convient d'éviter la compression 
ou le compactage de l'échantillon de sol.
 
1.7.1.2.  Incubation des échantillons de sol  
L'incubation des échantillons de sol peut être effectuée de deux 
façons: sous forme d'échantillons en vrac de sol traité et de sol 
non traité ou sous forme d'une série de sous-échantillons individuels 
et de taille identique de chaque sol traité et non traité. Toutefois, lorsque l'essai porte sur des substances volatiles, l'essai doit être effectué uniquement avec une série de sous-échantillons individuels. 
Lorsque les sols sont incubés en vrac, de grandes quantités de 
chaque sol traité et non traité sont préparées et les sous-échantillons à analyser sont prélevés en fonction des besoins pendant l'essai. La quantité préparée initialement pour chaque traitement et pour le 
contrôle dépend de la taille des sous-échantillons, du nombre de 
réplicats utilisés pour l'analyse et du nombre maximal de temps de prélèvement. Les sols incubés en vrac doivent être soigneusement mélangés avant de procéder au sous-échantillonnage. Lorsque les 
sols sont incubés sous forme d'échantillons individuels, on divise 
chaque sol en vrac traité et non traité dans le nombre requis de sous-échantillons, et ceux-ci sont utilisés selon les besoins. Dans les expériences où l'on peut prévoir plus de deux temps de prélève ­
ment, une quantité suffisante de sous-échantillons doit être préparée 
pour tenir compte de tous les réplicats et de tous les temps de prélèvement. Au moins trois exemplaires d'échantillons du sol d'essai doivent être incubés en milieu aérobie (voir le 
paragraphe 1.7.1.1). Pendant tous les essais, il convient d'utiliser 
des récipients appropriés comportant-un espace libre suffisant afin d'éviter le développement de conditions anaérobies. Lorsque l'essai porte sur des substances volatiles, il doit être effectué uniquement 
avec une série de sous-échantillons individuels.
 
1.7.1.3.  Conditions et durée de l'essai  
L'essai est effectué dans le noir à température ambiante de 20 ± 2  o C. 
Pendant l'essai, la teneur en eau des échantillons de sol doit être 
maintenue entre 40 % et 60 % de la capacité maximale de rétention d'eau du sol (voir le paragraphe 1.6.4.2) avec une marge de ± 5 %. De l'eau distillée, désionisée peut être ajoutée si nécessaire.
 
La durée minimale de l'essai est de 28 jours. Si l'essai porte sur des 
produits agrochimiques, on compare les taux de formation de nitrate dans les échantillons traités et dans les échantillons témoins. Si ceux- 
ci diffèrent de plus de 25 % au jour 28, on poursuit l'essai jusqu'à 
obtenir une différence égale ou inférieure à 25 %, ou pendant une durée maximale de 100 jours. En ce qui concerne les produits non agrochimiques, l'essai est arrêté au bout de 28 jours. Au jour 28, les 
quantités de nitrate dans les échantillons traités et les échantillons 
témoins sont déterminées et les valeurs CE
 x sont calculées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1134
 
1.7.2.  Prélèvement et analyse des sols  
1.7.2.1.  Échelonnement des prélèvements  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, les échantillons de 
sol font l'objet d'une analyse de mesure du nitrate aux jours 0, 7, 14 
et 28. S'il est nécessaire de prolonger l'essai, de nouvelles mesures 
doivent être effectuées tous les 14 jours après le jour 28.  
Lorsque l'essai porte sur des produits non agrochimiques, au moins 
cinq concentrations d'essai sont utilisées et les échantillons de sol 
sont analysés pour mesurer le nitrate au début (jour 0) et à la fin de 
la période d'exposition (28 jours). Une mesure intermédiaire, par exemple au jour 7, peut être ajoutée si nécessaire. Les données obtenues au jour 28 sont utilisées pour déterminer la valeur CE
 x 
de la substance chimique. Si on le souhaite, on peut utiliser les 
données des témoins du jour 0 afin de mesurer la quantité initiale de nitrate dans le sol.
 
1.7.2.2.  Analyse des échantillons de sol  
La quantité de nitrate formé dans chaque échantillon traité et dans 
chaque témoin est déterminée à chaque temps de prélèvement. Le 
nitrate est extrait du sol en agitant les échantillons en présence d'un solvant d'extraction, par exemple, une solution de 0,1 M de chlorure de potassium. Un rapport de 5 ml de solution de KCl par gramme 
d'équivalent poids sec de sol est recommandé. Afin d'optimiser l'ex ­
traction, les récipients contenant le sol et la solution d'extraction ne doivent pas être remplis à plus de la moitié de leur contenance. Les mélanges sont agités à 150 tpm pendant 60 minutes. Les mélanges 
sont centrifugés ou filtrés et les phases liquides sont analysées pour 
mesurer le nitrate. Les extraits liquides débarrassés de particules peuvent être stockés à moins 20 ± 5
 o C pendant une durée 
pouvant aller jusqu'à six mois avant d'être analysés.  
2. DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, la quantité de nitrate 
formé dans chaque échantillon de sol doit être enregistrée, et les valeurs moyennes de tous les réplicats doivent être présentées sous forme de tableau. Les taux de transformation de l'azote doivent être 
évalués à l'aide de méthodes statistiques appropriées et généralement 
reconnues (F-test, seuil de signification de 5 %). Les quantités de nitrate formé sont exprimées en mg nitrate/kg poids sec/jour. On compare le taux de formation de nitrate dans chaque échantillon 
traité avec le taux dans le témoin, et on calcule l'écart en pourcentage 
par rapport au témoin.
 
Si l'essai porte sur des produits non agrochimiques, la quantité de 
nitrate formé dans chaque réplicat est déterminée, et une courbe 
dose-réponse est établie pour déterminer les valeurs CE  x . Les quan ­
tités de nitrate (mg nitrate/kg poids sec de sol) trouvées dans les échantillons traités au bout de 28 jours sont comparées aux quantités observées dans les échantillons témoins. À partir de ces résultats, on 
calcule le pourcentage des valeurs d'inhibition pour chaque concen ­
tration d'essai. Une courbe de pourcentages en fonction de la concen ­
tration est établie, et on utilise ensuite une méthode statistique pour calculer les valeurs CE
 x . Les seuils de confiance (p = 0,95) des CE  x 
calculées sont également déterminés à l'aide des méthodes standards 
(10) (11) (12).  
Les substances d'essai qui contiennent d'importantes quantités d'azote 
peuvent être à l'origine des quantités de nitrate qui se forment 
pendant l'essai. Si ces substances sont testées à une concentration 
élevée (par exemple, dans le cas des substances chimiques destinées à être utilisées en applications répétées), des contrôles appropriés doivent être prévus dans l'essai (sol plus substance d'essai mais 
sans farine végétale). Les résultats de ces contrôles doivent être 
pris en compte dans le calcul des valeurs CE
 x . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1135
 
2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Lorsqu'on évalue les résultats d'essais avec des produits agrochi ­
miques, et que la différence de taux de formation de nitrate entre l'échantillon le moins traité (concentration maximale prévisible) et le 
témoin est égale ou inférieure à 25 % quel que soit le temps de 
prélèvement après le jour 28, le produit peut être considéré comme n'ayant aucune influence à long terme sur la transformation de l'azote dans le sol. Lorsqu'on évalue les résultats d'essais avec des subs ­
tances chimiques autres que les produits agrochimiques, on utilise les 
valeurs CE
 50 , CE  25 et/ou CE  10 . 
3. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes:  
Identification complète du sol utilisé à savoir:  
— coordonnées géographiques du site (latitude, longitude),  
— information sur l'historique du site (couvert végétal, traitement 
aux produits phytosanitaires, traitement aux engrais, contamina ­
tion accidentelle, etc.),  
— type d'utilisation (sol agricole, forestier, etc.),  
— profondeur du prélèvement (cm),  
— teneur en sable/limon/argile (% poids sec),  
— valeurs du pH (dans l'eau),  
— teneur en carbone organique (% poids sec),  
— teneur en azote (% poids sec),  
— concentration initiale en nitrate (mg nitrate/kg poids sec),  
— capacité d'échange cationique (mmol/kg),  
— biomasse microbienne en pourcentage du carbone organique 
total,  
— référence des méthodes utilisées pour la détermination de chaque 
paramètre,  
— toutes les informations relatives au prélèvement et au stockage 
des échantillons de sol,  
— détails de la pré-incubation du sol s'il y a lieu.  
Substance d'essai:  
— nature physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques,  
— données d'identification des substances chimiques, s'il y a lieu, 
comprenant la formule structurale, la pureté (pour les produits 
phytosanitaires, le pourcentage de produit actif), la teneur en azote.
 
Substrat:  
— source du substrat,  
— composition (farine de luzerne, farine de luzerne verte),  
— teneur en carbone, azote (% poids sec),  
— taille du tamis (mm).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1136
 
Conditions de l'essai:  
— détails de la modification du sol avec un substrat organique,  
— nombre de concentrations de la substance d'essai utilisée et, le 
cas échéant, justification des concentrations sélectionnées,  
— procédure d'application de la substance d'essai au sol,  
— température d'incubation,  
— teneur en eau du sol au début et pendant le déroulement de 
l'essai,  
— méthode d'incubation du sol utilisée (en vrac ou en série de sous- 
échantillons individuels),  
— nombre de réplicats,  
— temps de prélèvement,  
— méthode utilisée pour l'extraction du nitrate du sol.  
Résultats:  
— procédure analytique et matériel utilisé pour analyser le nitrate,  
— tableaux indiquant les valeurs individuelles et moyennes des 
mesures du nitrate,  
— variation entre réplicats dans les échantillons traités et dans les 
échantillons témoins,  
— explications des corrections apportées aux calculs, le cas échéant,  
— la variation en pourcentage des taux de formation de nitrate à 
chaque temps de prélèvement ou, le cas échéant, la valeur CE  50 
avec une limite de confiance de 95 pour cent, les autres valeurs 
CE x (CE  25 ou CE  10 ) avec des intervalles de confiance, et un 
graphique de la courbe dose-réponse,  
— traitement statistique des résultats,  
— toutes informations et observations utiles pour l'interprétation des 
résultats.  
4 RÉFÉRENCES  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24, p. 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
(4) SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality - Biological 
Methods .
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1137
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, p. 18-20, January 
1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and WUcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and 
Exper. Ther., 96, p. 99-113.  
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1138
 
C.22.  MICRO-ORGANISMES DU SOL: ESSAI DE TRANSFORMA ­
TION DU CARBONE  
1. MÉTHODE  
La présente méthode d'essai reprend l'essai TG 217 (2000) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode d'essai décrit une méthode de laboratoire 
conçue pour étudier les effets à long terme des substances chimiques, 
après une exposition unique, sur l'activité de transformation du carbone par les micro-organismes du sol. L'essai s'appuie principa ­
lement sur les recommandations de l'Organisation européenne et 
méditerranéenne pour la protection des plantes (1). Toutefois, d'au ­
tres lignes directrices, notamment celles du Biologische Bundesaris ­
talt allemand (2), de l'agence de protection de l'environnement des États-Unis (3) et de la SETAC (4), ont également été prises en 
considération. Lors d'un atelier de l'OCDE sur la sélection des sols 
et des sédiments, qui s'est tenu à Belgirate, Italie, en 1995 (5), le nombre et le type de sols à utiliser dans le cadre de cet essai ont été définis. Les recommandations relatives au prélèvement, à la manipu ­
lation et au stockage des échantillons de sol s'appuient sur des lignes 
directrices de l'ISO (6) et sur les recommandations de l'atelier de Belgirate.
 
Pour déterminer et évaluer les caractéristiques toxiques des subs ­
tances d'essai, il peut être nécessaire de déterminer leurs effets sur 
l'activité microbienne du sol, par exemple lorsqu'il est nécessaire de 
disposer de données sur les effets secondaires potentiels des produits phytosanitaires sur la microflore du sol ou bien en cas de risque d'exposition des micro-organismes du sol à des substances chimiques 
autres que les produits phytosanitaires. L'essai de transformation du 
carbone est effectué pour déterminer les effets de ces substances chimiques sur la microflore du sol. Si l'essai porte sur des produits agrochimiques (produits phytosanitaires, engrais, produits chimiques 
sylvicoles), deux essais sont effectués: l'essai de transformation du 
carbone et l'essai de transformation de l'azote. S'il s'agit d'autres substances que les produits agrochimiques, l'essai de transformation de l'azote suffit. Toutefois, si les valeurs CE
 50 de l'essai de trans ­
formation de l'azote relatives à ces substances chimiques correspon ­
dent à celles des inhibiteurs de la nitrification (nitrapyrine) commer ­
ciaux, un essai de transformation du carbone peut être effectué afin d'obtenir des informations complémentaires.
 
Les sols sont formés de composés vivants et non vivants qui existent 
sous forme de mélanges complexes et hétérogènes. Les micro-orga ­
nismes jouent un rôle important dans la décomposition et la trans ­
formation de la matière organique en sol fertile et un grand nombre d'espèces contribuent aux différents aspects de la fertilisation des sols. Toute interférence à long terme avec ces processus biochi ­
miques risque de perturber le cycle des éléments nutritifs et par 
conséquent d'altérer la fertilité du sol. La transformation du carbone et de l'azote se produit dans tous les sols fertiles. Bien que les colonies microbiennes responsables de ces processus diffè ­
rent d'un sol à un autre, les voies de transformation sont identiques 
pour l'essentiel.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1139
 
La méthode d'essai décrite ici est conçue pour détecter les effets 
nocifs à long terme d'une substance sur le processus de transforma ­
tion du carbone à la surface aérobie des sols. L'essai est sensible aux changements de taille et d'activité des colonies microbiennes respon ­
sables de la transformation du carbone puisqu'il soumet ces colonies 
à la fois au stress chimique et à la carence en carbone. Un sol 
sableux pauvre en matière organique est utilisé. Ce sol est traité avec la substance d'essai et il est incubé dans des conditions permet ­
tant un métabolisme microbien rapide. Dans ces conditions, les 
sources de carbone présentes dans le sol sont rapidement épuisées. 
Cela provoque la carence en carbone qui tue à la fois les cellules microbiennes et qui induit la dormance et/ou la sporulation. Si la durée de l'essai est supérieure à 28 jours, on peut mesurer la somme 
de ces réactions dans les témoins (sol non traité) en mesurant la perte 
progressive de biomasse microbienne active métaboliquement (7). Si la biomasse d'un sol carence en carbone, dans les conditions de l'essai, est affectée par la présence d'une substance chimique, celle- 
ci peut ne pas retrouver le même niveau que l'échantillon témoin. 
C'est pourquoi la perturbation provoquée par la substance d'essai à n'importe quel moment de l'essai perdurera souvent jusqu'à la fin de l'essai.
 
Les essais à partir desquels la présente méthode d'essai a été mise au 
point étaient conçus principalement pour des substances dont il est 
possible d'estimer la quantité qui pénètre dans le sol. C'est le cas par 
exemple des produits phytosanitaires dont la dose d'application dans le champ est connue. Pour les produits agrochimiques, il suffit de pratiquer un essai sur deux doses correspondant au taux d'application 
prévu ou estimé. Les produits agrochimiques peuvent être testés sous 
forme de principes actifs (p.a.) ou de produits formulés. Toutefois, l'essai n'est pas limité aux substances chimiques dont les concentra ­
tions dans l'environnement peuvent être estimées. En modifiant à la 
fois la quantité de substance d'essai appliquée au sol, et le mode 
d'évaluation des données, on peut également utiliser l'essai pour les substances chimiques dont on ne connaît pas la quantité susceptible d'atteindre le sol. C'est pourquoi, dans le cas des produits non agro ­
chimiques, les effets d'une série de concentrations sur la transforma ­
tion du carbone sont déterminés. Les résultats de ces essais sont utilisés pour préparer une courbe dose-réponse et calculer les valeurs CE
 X , où x est défini comme le pourcentage d'effet.  
1.2. DÉFINITIONS  
Transformation du carbone : dégradation par des micro-organismes 
de la matière organique en son produit final, le dioxyde de carbone 
inorganique.  
CE X (concentration produisant x % d'effet) : concentration de la 
substance d'essai dans le sol qui produit x % d'inhibition de la trans ­
formation du carbone en dioxyde de carbone.  
CE 50 (concentration produisant 50 % d'effet) : concentration de la 
substance d'essai dans le sol qui produit 50 % d'inhibition de la transformation du carbone en dioxyde de carbone.
 
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Aucune.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1140
 
1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Le sol tamisé est traité avec la substance d'essai ou laissé non traité 
(témoin). Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, il est recommandé d'utiliser au moins deux concentrations d'essai et 
celles-ci doivent être choisies en fonction de la concentration maxi ­
male prévisible dans le champ. Au bout de 0, 7, 14 et 28 jours d'incubation, les échantillons de sol traité et les échantillons témoins sont mélangés avec du glucose, et les taux de respiration 
induits par le glucose sont mesurés pendant 12 heures consécutives. 
Les taux de respiration sont exprimés en dioxyde de carbone dégagé (mg dioxyde de carbone/kg sol sec/h) ou oxygène consommé (mg 
oxygène/kg sol/h). On compare le taux moyen de respiration dans les 
échantillons de sol traité avec celui des échantillons témoins et on calcule l'écart en pourcentage entre l'échantillon traité et l'échantillon témoin. Tous les essais ont une durée de 28 jours au moins. Si, au 
28
 e jour, les différences entre les sols traités et les sols non traités 
sont égales ou supérieures à 25 %, les mesures se poursuivent à intervalles de 14 jours pendant une durée maximale de 100 jours. Si l'essai porte sur des substances chimiques autres que les produits 
agrochimiques, une série de concentrations de la substance d'essai est 
ajoutée aux échantillons de sol, et les taux de respiration induits par le glucose (moyenne des quantités de dioxyde de carbone formé ou l'oxygène consommé) sont mesurés au bout de 28 jours. Les résultats 
des essais effectués avec une série de concentrations sont analysés à 
l'aide d'un modèle de régression, et les valeurs CE
 x sont calculées 
(CE  50 , CE  25 et/ou CE  10 ). Voir définitions.  
1.5. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
L'évaluation des résultats des essais effectués avec des produits agro ­
chimiques repose sur des différences relativement faibles (valeur moyenne ± 25 %) entre le dioxyde de carbone dégagé ou l'oxygène 
consommé dans (ou par) les échantillons témoins et les échantillons 
de sol traité, de sorte qu'une variabilité importante des témoins peut entraîner des résultats erronés. C'est pourquoi la variation entre les témoins doit être inférieure à ± 15 %.
 
1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.6.1.  Appareillage  
Des récipients d'essai en matériau chimiquement inerte sont utilisés. 
Ces récipients doivent avoir une contenance adaptée à la méthode 
d'incubation utilisée, c'est-à-dire incubation en vrac ou avec une série d'échantillons individuels (voir le point 1.7.1.2). Il convient de veiller 
à la fois à minimiser l'évaporation et à permettre l'échange gazeux 
pendant l'essai (les récipients d'essai peuvent par exemple être couverts d'une feuille de polyéthylène perforée). Lorsque l'essai porte sur des substances volatiles, il convient d'utiliser des récipients 
hermétiques et étanches. La taille de ces récipients doit être telle 
qu'ils soient remplis environ au quart de leur contenance avec l'échantillon de sol.
 
Pour déterminer la respiration induite par le glucose, des systèmes 
d'incubation et des instruments de mesure de la production de dioxyde de carbone ou de la consommation d'oxygène sont néces ­
saires. On trouve des exemples de ces systèmes et de ces instruments 
dans la littérature (8) (9) (10) (11).
 
1.6.2.  Sélection et nombre de sols  
Un seul sol est utilisé. Les caractéristiques recommandées sont les 
suivantes:  
— teneur en sable: supérieure à 50 % et inférieure à 75 %,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1141
 
— pH: 5,5-7,5,  
— teneur en carbone organique: 0,5-1,5 %,  
— la biomasse microbienne doit être mesurée (12) (13) et sa teneur 
en carbone doit être égale à 1 % au moins du carbone organique 
total du sol.  
Dans la plupart des cas, un sol possédant ces caractéristiques corres ­
pond aux conditions les plus défavorables, puisque l'adsorption de la 
substance chimique de l'essai est minimale et que l'exposition de la microflore est maximale. Il est donc généralement inutile d'effectuer des essais avec d'autres sols. Toutefois, dans certains cas, par 
exemple lorsque l'utilisation principale prévue de la substance 
d'essai concerne des sols particuliers comme les sols forestiers acides, ou dans le cas de substances chimiques chargées électrosta ­
tiquement, il peut être nécessaire d'utiliser un sol différent.
 
1.6.3.  Prélèvement et stockage des échantillons de sol  
1.6.3.1.  Prélèvement  
Il est nécessaire de fournir des informations détaillées sur l'historique 
du site de prélèvement. Ces détails doivent comprendre la localisa ­
tion exacte, le couvert végétal, les dates de traitement avec des 
produits phytosanitaires, les traitements aux engrais organiques et inorganiques, les apports biologiques ou les contaminations acciden ­
telles. Le site choisi pour le prélèvement de sol doit être de nature à 
permettre une utilisation de longue durée. Les pâturages permanents, 
les champs plantés de céréales annuelles (à l'exception du maïs) ou à ensemencement dense en engrais verts conviennent. Le site de prélè ­
vement retenu ne doit pas avoir été traité avec des produits phyto ­
sanitaires pendant un an au moins avant les prélèvements. De même, 
aucun engrais organique ne doit avoir été appliqué pendant au moins six mois. L'utilisation d'engrais minéraux est acceptable uniquement si elle satisfait aux exigences de la culture, et les échantillons de sol 
ne doivent être prélevés qu'au moins trois mois après l'application 
d'engrais. L'utilisation de sol traité avec des engrais aux effets biolo ­
giques connus (cyanamide calcique) doit être évitée.
 
Il convient d'éviter de prélever des échantillons pendant ou immé ­
diatement après de longues périodes (plus de 30 jours) de sécheresse ou de saturation en eau. En ce qui concerne les sols labourés, les 
échantillons doivent être prélevés à une profondeur de 0 à 20 cm. En 
ce qui concerne les herbages (pâture) ou les sols qui ne sont pas labourés pendant de longues périodes (au moins une période végé ­
tative), la profondeur maximale du prélèvement peut être légèrement 
supérieure à 20 cm (25 cm par exemple). Les échantillons de sol 
doivent être transportés dans des récipients et dans des conditions de température de nature à garantir que les propriétés initiales du sol ne soient pas altérées de manière significative.
 
1.6.3.2.  Stockage  
Il est préférable d'utiliser des sols qui viennent d'être extraits du site. 
S'il n'est pas possible d'éviter le stockage dans le laboratoire, les sols peuvent être entreposés dans le noir à 4 ± 2
 o C pendant une durée 
maximale de trois mois. Pendant la durée de stockage des sols, des 
conditions aérobies doivent être assurées. Si les sols sont prélevés 
dans une zone où il gèle au moins trois mois par an, il peut être envisagé de stocker le sol pendant six mois à — 18
 o C. La biomasse 
microbienne des sols stockés est mesurée avant chaque expérience et 
le carbone présent dans la biomasse doit être égal à 1 % au moins de 
la teneur totale en carbone organique du sol (voir le point 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1142
 
1.6.4.  Manipulation et traitement du sol pour l'essai  
1.6.4.1.  Préincubation  
Si le sol a été stocké (voir les points 1.6.4.2 et 1.7.1.3), il est 
recommandé de procéder à une préincubation pendant 2 à 28 
jours. La température et la teneur en eau du sol pendant la préin ­
cubation doivent être les mêmes que celles utilisées pendant l'essai (voir les points 1.6.4.2 et 1.7.1.3).
 
1.6.4.2.  Propriétés physico-chimiques  
Le sol est débarrassé manuellement des gros objets (pierres, débris 
végétaux, etc.) puis tamisé humide sans séchage excessif jusqu'à 
obtention d'une granulométrie inférieure ou égale à 2 mm. La teneur en eau de l'échantillon doit être ajustée avec de l'eau distillée ou désionisée à une valeur située entre 40 % et 60 % de la capacité 
maximale de rétention d'eau.
 
1.6.5.  Préparation de la substance d'essai à appliquer au sol  
La substance d'essai est généralement appliquée à l'aide d'un exci ­
pient. L'excipient peut être de l'eau (pour les substances solubles dans l'eau) ou un solide inerte comme du sable de quartz fin (gra ­
nulométrie: 0,1-0,5 mm). Il convient d'éviter les excipients liquides 
autres que l'eau (solvants organiques tels que l'acétone ou le chloro ­
forme), car ils peuvent endommager la microflore. Si l'on utilise du sable comme excipient, celui-ci peut être traité par la substance 
d'essai dissoute ou en suspension dans un solvant approprié. Dans 
ce cas, le solvant doit être éliminé par évaporation avant de mélanger l'excipient avec le sol. Pour obtenir une répartition optimale de la substance d'essai dans le sol, un rapport de 10 g de sable par kilo ­
gramme de sol (poids sec) est recommandé. Les échantillons témoins 
sont traités avec une quantité équivalente d'eau et/ou de sable de quartz uniquement.
 
Lorsque l'on teste des substances chimiques volatiles, il convient 
d'éviter dans la mesure du possible les pertes pendant le traitement 
et il convient d'essayer de veiller à la répartition homogène dans l'échantillon de sol (la substance d'essai doit être injectée dans le sol en plusieurs endroits).
 
1.6.6.  Concentrations d'essai  
Si l'essai porte sur des produits phytosanitaires ou sur d'autres subs ­
tances chimiques dont les concentrations dans l'environnement 
peuvent être estimées, il convient d'utiliser au moins deux concen ­
trations. La concentration la plus faible doit correspondre au moins à la quantité maximale susceptible de pénétrer dans le sol dans des 
conditions réelles alors que la concentration la plus élevée doit être 
un multiple de la concentration la plus faible. Les concentrations de substance d'essai ajoutées au sol sont calculées en supposant une incorporation uniforme à une profondeur de 5 cm et une densité 
apparente du sol de 1,5. Dans le cas des produits agrochimiques 
appliqués directement sur le sol, ou des substances chimiques dont on peut prévoir la quantité qui pénètre dans le sol, les concentrations d'essai recommandées sont égales à la concentration maximale prévi ­
sible dans l'environnement (CPE) et cinq fois cette concentration. 
Les substances qui doivent être appliquées sur le sol plusieurs fois au cours d'une même saison doivent être testées à des concentrations calculées en multipliant la CPE par le nombre maximal d'applica ­
tions prévues. La concentration la plus élevée testée ne doit toutefois 
pas dépasser dix fois la dose maximale d'application unique.
 
Si l'essai porte sur des produits non agrochimiques, une série géomé ­
trique de cinq concentrations au moins est utilisée. Les concentra ­
tions testées doivent couvrir la gamme nécessaire pour déterminer les 
valeurs CE  x . ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1143
 
1.7. EXÉCUTION DE L'ESSAI  
1.7.1.  Conditions expérimentales  
1.7.1.1.  Traitement et contrôle  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, le sol est divisé en 
trois fractions de poids égal. Deux fractions sont mélangées avec 
l'excipient contenant le produit, et la troisième avec l'excipient sans produit (témoin). Il est recommandé de préparer un minimum de trois réplicats de sol traité et non traité. Si l'essai porte sur des 
produits non agrochimiques, le sol est divisé en six fractions de 
poids égal. Cinq échantillons sont mélangés avec l'excipient conte ­
nant la substance d'essai, et le sixième est mélangé avec l'excipient 
sans la substance chimique. Il est recommandé de préparer trois 
réplicats de sol traité et de témoins. Il convient de veiller à la répartition homogène de la substance d'essai dans les échantillons de sol traité. Pendant le mélange, il convient d'éviter la compression 
ou le compactage du sol.
 
1.7.1.2  Incubation des échantillons de sol  
L'incubation des échantillons de sol peut être effectuée de deux façons: 
sous forme d'échantillons en vrac de sol traité et de sol non traité ou sous 
forme d'une série de sous-échantillons individuels et de taille identique 
de chaque sol traité et non traité. Toutefois, lorsque l'essai porte sur des substances volatiles, l'essai doit être effectué uniquement avec une série de sous-échantillons individuels. Lorsque les sols sont incubés en vrac, 
de grandes quantités de chaque sol traité et non traité sont préparées et les 
sous-échantillons à analyser sont prélevés en fonction des besoins pendant l'essai. La quantité préparée initialement pour chaque traitement et pour le contrôle dépend de la taille des sous-échantillons, du nombre 
de réplicats utilisés pour l'analyse et du nombre maximal de temps de 
prélèvement. Les sols incubés en vrac doivent être soigneusement mélangés avant de procéder au sous-échantillonnage. Lorsque les sols sont incubés sous forme d'échantillons individuels, on divise chaque sol 
en vrac traité et non traité dans le nombre requis de sous-échantillons, et 
ceux-ci sont utilisés selon les besoins. Dans les expériences où l'on peut prévoir plus de deux temps de prélèvement, une quantité suffisante de sous-échantillons doit être préparée pour tenir compte de tous les répli ­
cats et de tous les temps de prélèvement. Au moins trois exemplaires de 
sol d'essai doivent être incubés en milieu aérobie (voir le point 1.7.1.1). Pendant tous les essais, il convient d'utiliser des récipients appropriés comportant un espace libre suffisant afin d'éviter le développement de 
conditions anaérobies. Lorsque l'essai porte sur des substances volatiles, 
il doit être effectué uniquement avec une série de sous-échantillons individuels.
 
1.7.1.3.  Conditions et durée de l'essai  
L'essai est effectué dans le noir à température ambiante de 20 ± 2  o C. 
Pendant l'essai, la teneur en eau des échantillons de sol doit être maintenue entre 40 % et 60 % de la capacité maximale de rétention 
d'eau du sol (voir le point 1.6.4.2) avec une marge de ± 5 %. De 
l'eau distillée, désionisée peut être ajoutée si nécessaire.
 
La durée minimale de l'essai est de 28 jours. Si l'essai porte sur des 
produits agrochimiques, on compare les quantités de dioxyde de 
carbone dégagé ou d'oxygène consommé dans les échantillons traités et dans les échantillons témoins. Si celles-ci diffèrent de plus de 25 % au jour 28, on poursuit l'essai jusqu'à obtenir une 
différence égale ou inférieure à 25 %, ou pendant une durée maxi ­
male de 100 jours, si celle-ci est la plus courte. Si l'essai porte sur des produits non agrochimiques, l'essai est arrêté au bout de 28 jours. Au jour 28, les quantités de dioxyde de carbone dégagé ou d'oxy ­
gène consommé dans les échantillons traités et les échantillons 
témoins sont déterminées et les valeurs CE
 x sont calculées.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1144
 
1.7.2.  Prélèvement et analyse des sols  
1.7.2.1.  Échelonnement des prélèvements  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, les échantillons de 
sol font l'objet d'une analyse de mesure des taux de respiration 
induits par le glucose aux jours 0, 7, 14 et 28. S'il est nécessaire 
de prolonger l'essai, de nouvelles mesures doivent être effectuées tous les 14 jours après le jour 28.
 
Lorsque l'essai porte sur des produits non agrochimiques, au moins 
cinq concentrations d'essai sont utilisées et les échantillons de sol 
sont analysés pour mesurer la respiration induite par le glucose au début (jour 0) et à la fin de la période d'exposition (28 jours). Une mesure intermédiaire, par exemple au jour 7, peut être ajoutée si 
nécessaire. Les données obtenues au jour 28 sont utilisées pour 
déterminer la valeur CE
 x de la substance chimique. Si on le souhaite, 
on peut utiliser les données des témoins du jour 0 afin d'estimer les quantités initiales de biomasse microbienne métaboliquement active 
dans le sol (12).
 
1.7.2.2.  Mesure des taux de respiration induits par le glucose  
Le taux de respiration induit par le glucose est déterminé dans 
chaque échantillon de sol traité et dans chaque témoin à chaque temps de prélèvement. Les échantillons de sol sont mélangés avec 
une quantité de glucose suffisante pour entraîner une réaction 
respiratoire maximale immédiate. La quantité de glucose nécessaire pour provoquer une réaction respiratoire maximale dans un sol donné peut être déterminée dans un essai préliminaire à l'aide d'une série de 
concentrations de glucose (14). Toutefois, dans le cas des sols 
sableux contenant 0,5-1,5 % de carbone organique, 2 000 mg à 4 000 mg de glucose par kg de poids sec sont généralement suffi ­
sants. Le glucose peut être réduit en poudre avec du sable de quartz 
propre (10 g sable/kg poids sec) et mélangé de façon homogène avec 
le sol.
 
Les échantillons de sol amendés avec le glucose sont incubés dans 
un appareil adapté pour mesurer les taux de respiration en continu, 
toutes les heures, ou toutes les deux heures (voir point 1.6.1) à 20 ± 
2 o C. Le dioxyde de carbone dégagé ou l'oxygène consommé est 
mesuré pendant 12 heures consécutives et les mesures doivent commencer le plus rapidement possible, c'est-à-dire 1 à 2 heures 
après l'adjonction de glucose. On mesure la quantité totale de 
dioxyde de carbone dégagé ou d'oxygène consommé pendant les 12 heures et on détermine le taux moyen de respiration.
 
2 DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Si l'essai porte sur des produits agrochimiques, le dioxyde de 
carbone dégagé ou l'oxygène consommé par chaque réplicat doit 
être enregistré, et les valeurs moyennes de tous les réplicats doivent être présentées sous forme de tableau. Les résultats doivent être évalués à l'aide de méthodes statistiques appropriées et généra ­
lement reconnues (F-test, seuil de signification de 5 %). Les taux de 
respiration induits par le glucose sont exprimés en mg de dioxyde de carbone/kg poids sec/h ou mg oxygène/poids sec/h. Le taux moyen de formation de dioxyde de carbone ou le taux moyen de consom ­
mation d'oxygène de chaque échantillon traité est comparé à celui du 
témoin, et l'écart en pourcentage par rapport au témoin est calculé.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1145
 
Si l'essai porte sur des produits non agrochimiques, les quantités de 
dioxyde de carbone dégagé ou d'oxygène consommé dans chaque 
réplicat sont déterminées, et une courbe dose-réponse est établie pour déterminer les valeurs CE
 x . Les taux de respiration induits par le 
glucose (mg de dioxyde de carbone/kg poids sec/h ou mg oxygène/ 
poids sec/h) observés dans les échantillons traités au bout de 28 jours 
sont comparés à ceux des échantillons témoins. À partir de ces résultats, on calcule le pourcentage des valeurs d'inhibition pour chaque concentration d'essai. Une courbe de pourcentages en fonc ­
tion de la concentration est établie, et on utilise ensuite une méthode 
statistique pour calculer les valeurs CE
 x . Les seuils de confiance (p = 
0,95) des CE  x calculées sont également déterminés à l'aide des 
méthodes standard (15) (16) (17).  
2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Lorsqu'on évalue les résultats d'essais avec des produits agrochi ­
miques, et que la différence de taux de respiration entre l'échantillon le moins traité (concentration maximale prévisible) et l'échantillon témoin est égale ou inférieure à 25 % quel que soit le temps de 
prélèvement après le jour 28, le produit peut être considéré comme 
n'ayant aucune influence à long terme sur la transformation du carbone dans le sol. Lorsqu'on évalue les résultats d'essais avec des substances chimiques autres que les produits agrochimiques, 
on utilise les valeurs CE
 50 , CE  25 et/ou CE  10 . 
3. RAPPORT D'ESSAI  
RAPPORT DE L'ESSAI  
Le rapport de l'essai doit comporter les informations suivantes:  
Identification complète du sol utilisé, à savoir:  
— coordonnées géographiques du site (latitude, longitude),  
— information sur l'historique du site (couvert végétal, traitement 
aux produits phytosanitaires, traitement aux engrais, contamina ­
tion accidentelle, etc.),  
— type d'utilisation (sol agricole, forestier, etc.),  
— profondeur du prélèvement (cm),  
— teneur en sable/limon/argile (% poids sec),  
— pH (dans l'eau),  
— teneur en carbone organique (% poids sec),  
— teneur en azote (% poids sec),  
— capacité d'échange cationique (mmol/kg),  
— biomasse microbienne initiale en pourcentage du carbone orga ­
nique total,  
— référence des méthodes utilisées pour la détermination de chaque 
paramètre,  
— toutes les informations relatives au prélèvement et au stockage 
des échantillons de sol,  
— détails de la préincubation du sol s'il y a lieu.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1146
 
Substance d'essai:  
— nature physique et, s'il y a lieu, propriétés physico-chimiques,  
— données d'identification des substances chimiques, s'il y a lieu, 
notamment la formule structurale, la pureté (pour les produits 
phytosanitaires, le pourcentage de produit actif), la teneur en azote.
 
Conditions de l'essai:  
— détails de la modification du sol avec un substrat organique,  
— nombre de concentrations de la substance d'essai utilisée et, le 
cas échéant, justification des concentrations sélectionnées,  
— procédure d'application de la substance d'essai au sol,  
— température d'incubation,  
— teneur en eau du sol au début et pendant le déroulement de 
l'essai,  
— méthode d'incubation du sol utilisée (en vrac ou en série de sous- 
échantillons individuels),  
— nombre de réplicats,  
— temps de prélèvement.  
Résultats:  
— méthode et matériel utilisés pour mesurer les taux de respiration,  
— tableaux indiquant les valeurs individuelles et les valeurs 
moyennes des quantités de dioxyde de carbone ou d'oxygène,  
— variation entre réplicats dans les échantillons traités et dans les 
échantillons témoins,  
— explications des corrections apportées aux calculs, s'il y a lieu,  
— la variation en pourcentage des taux de respiration induits par le 
glucose à chaque temps de prélèvement ou, le cas échéant, la valeur CE
 50 avec une limite de confiance de 95 %, les autres 
valeurs CE  X (CE  25 ou CE  10 ) avec des intervalles de confiance, et 
un graphique de la courbe dose-réponse,  
— traitement statistique des résultats, s'il y a lieu,  
— toutes informations et observations utiles pour l'interprétation des 
résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24, p. 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1147
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils 
for Pesticide Experiments, in «Pesticide Effects on Soil Microflora». Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 
3, p. 45-60.
 
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in «Methods of Soil 
Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties». Agronomy Monograph N
 o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41, p. 831-871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests, for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeyej, O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116, p. 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). EinfluB von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenuber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a 
Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzen ­
schutzd., Braunschweig, 38, p. 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1148
 
C.23.  TRANSFORMATION AÉROBIE ET ANAÉROBIE DANS LE 
SOL  
1. MÉTHODE  
La présente méthode d'essai reprend la méthode TG 307 (2002) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
La présente méthode d'essai s'appuie sur les lignes directrices exis ­
tantes (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). La méthode décrite ici est 
conçue pour mesurer la transformation aérobie et anaérobie des subs ­
tances chimiques dans le sol. Les expériences ont pour but de déter ­
miner i) le taux de transformation de la substance d'essai, et ii) la nature des produits de transformation auxquels les végétaux et les 
organismes du sol peuvent être exposés, ainsi que les taux de forma ­
tion et de déplétion de ces produits. Ces études sont nécessaires pour les substances chimiques qui sont appliquées directement sur le sol ou qui sont susceptibles d'atteindre l'environnement du sol. Les résul ­
tats de ces études de laboratoire peuvent également être utilisés pour 
mettre au point des protocoles d'échantillonnage et d'analyse destinés à des études dans des domaines voisins.
 
Il est généralement suffisant d'effectuer des études aérobies et anaé ­
robies avec un seul type de sol pour déterminer les voies de trans ­
formation (8) (10) (11). Les taux de transformation doivent être 
déterminés dans trois autres sols au moins (8) (10).  
Un atelier de l'OCDE sur la sélection des sols et des sédiments, 
organisé à Belgirate, en Italie, en 1995 (10), a défini notamment le 
nombre et le type de sols à utiliser dans le cadre de cet essai. Les 
types de sol testés doivent être représentatifs des conditions environ ­
nementales d'utilisation ou de rejet prévus. Par exemple, les subs ­
tances chimiques devant être appliquées sous des climats subtropi ­
caux ou tropicaux doivent être testées avec des Ferrasols ou des 
Nitosols (système FAO). Cet atelier a également formulé des recom ­
mandations relatives au prélèvement, à la manipulation et au stockage des échantillons de sol, sur la base des lignes directrices 
de l'ISO (15). L'utilisation de sols de rizières est également étudiée 
dans le cadre de cette méthode.
 
1.2. DÉFINITIONS  
Substance d'essai : toute substance, qu'il s'agisse de la substance 
mère ou des produits de transformation correspondants.  
Produits de transformation : toute substance résultant de réactions 
de transformations biotiques ou abiotiques de la substance d'essai et 
en particulier le CO  2 et les produits qui se trouvent dans les résidus 
liés. 
Résidus liés : les «résidus liés» désignent des composés du sol, 
végétaux ou animaux, qui subsistent dans la matrice après extraction, 
sous forme de la substance mère ou de ses métabolite(s)/produits de transformation. La méthode d'extraction ne doit pas modifier de manière substantielle les composés eux-mêmes ni la structure de la 
matrice. La nature de la liaison peut être clarifiée en partie par des 
méthodes d'extraction qui modifient la matrice et par des techniques analytiques complexes. C'est de cette façon que l'on a déterminé jusqu'ici la nature de la liaison, covalente, ionique et de la liaison 
par sorption ou piégeage. De manière générale, la formation de 
résidus liés abaisse sensiblement la bioaccessibilité et la biodisponi ­
bilité (12) [modifié d'après l'UICPA 1984 (13)].
 
Transformation aérobie : réaction se produisant en présence d'oxy ­
gène moléculaire (14).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1149
 
Transformation anaérobie : réaction se produisant en l'absence 
d'oxygène moléculaire (14).  
Sol: mélange de constituants chimiques minéraux et organiques, ces 
derniers contenant des composés à haute teneur en carbone et en azote, et à poids moléculaire élevé, contenant de petits (principale ­
ment micro) organismes. Le sol peut être manipulé sous deux 
formes:
 
a) non brassé, tel qu'il s'est formé au cours du temps, en couches 
caractéristiques d'un grand nombre de types de sol;  
b) brassé, tel qu'on le trouve habituellement dans les terres arables 
ou qu'il est recueilli en creusant et tel qu'il est utilisé dans la présente méthode d'essai (14).
 
Minéralisation : dégradation complète d'un composé organique en 
CO 2 et H  2 O dans des conditions aérobies, et en CH  4 , CO  2 et H  2 O 
dans des conditions anaérobies. Dans le cadre de la présente méthode d'essai, lorsqu'on utilise un composé marqué au
 14 C, la minéralisa ­
tion désigne la dégradation importante au cours de laquelle un atome 
de carbone marqué est oxydé quantitativement avec dégagement de 
la quantité correspondante de  14 CO 2 (14).  
Demi-vie : t 0,5 , temps nécessaire à la transformation de 50 % d'une 
substance d'essai lorsque la transformation peut être décrite par une cinétique du premier ordre; la demi-vie est indépendante de la 
concentration.
 
DT 50 (temps de dégradation 50) : période au cours de laquelle la 
concentration de la substance d'essai diminue de 50 %; elle est différente de la demi-vie t
 0,5 lorsque la transformation ne suit pas 
une cinétique du premier ordre.  
DT 75 (temps de dégradation 75) : période au cours de laquelle la 
concentration de la substance d'essai diminue de 75 %.  
DT 90 (temps de dégradation 90) : période au cours de laquelle la 
concentration de la substance d'essai diminue de 90 %.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Des substances de référence doivent être utilisées pour caractériser 
et/ou identifier les produits de transformation par des méthodes spec ­
troscopiques et chromatographiques.  
1.4. APPLICABILITÉ DE L'ESSAI  
La méthode s'applique à toutes les substances chimiques (non 
marquées ou radiomarquées) pour lesquelles il existe une méthode 
analytique présentant une précision et une sensibilité suffisantes. Elle 
peut être appliquée aux composés légèrement volatils, non volatils, solubles ou insolubles dans l'eau. L'essai ne doit pas être appliqué aux substances chimiques fortement volatiles à partir du sol (fumi ­
gants, solvants organiques) et qui ne peuvent donc pas être mainte ­
nues dans le sol dans les conditions expérimentales de cet essai.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1150
 
1.5. INFORMATIONS RELATIVES À LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Une substance d'essai marquée ou non marquée peut être utilisée 
pour mesurer le taux de transformation. Il est nécessaire d'utiliser du matériel marqué pour étudier les voies de transformation et établir 
un bilan massique. Le marquage au
 14 C est recommandé mais l'uti ­
lisation d'autres isotopes, comme  13 C, 15 N, 3 H, 32 P, peut aussi être 
utile. Dans la mesure du possible, le marquage doit être situé dans la(les) partie(s) la(les) plus stable(s) de la molécule (
 1 ). La pureté de 
la substance d'essai doit être d'au moins 95 %.  
Avant de procéder à un essai sur la transformation aérobie et anaé ­
robie dans le sol, il convient de disposer des informations suivantes sur la substance d'essai:
 
a) solubilité dans l'eau (Méthode A.6)  
b) solubilité dans les solvants organiques;  
c) pression de vapeur (Méthode A.4) et constante de la loi de 
Henry;  
d) coefficient de partage n-octanol/eau (Méthode A.8);  
e) stabilité chimique dans le noir (hydrolyse) (Méthode C.7);  
f) coefficient pK  a si une molécule est susceptible de subir une 
protonation ou une déprotonation (ligne directrice 112 de l'OCDE) (16).
 
Il peut également être utile de disposer d'informations relatives à la 
toxicité de la substance d'essai sur les micro-organismes du sol 
(Méthodes d'essai C.21 et C.22) (16).  
Il faut disposer des méthodes analytiques (dont des méthodes d'ex ­
traction et de purification) nécessaires à la quantification et à l'iden ­
tification de la substance d'essai et de ses produits de transformation.  
1.6. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
Les échantillons de sol sont traités avec la substance d'essai et 
incubés dans le noir dans des flacons de type biomètre ou dans 
des systèmes à circulation continue dans des conditions de labora ­
toire contrôlées (à température et humidité constantes). Après un intervalle de temps approprié, les échantillons de sol sont extraits 
et analysés pour mesurer la substance mère et les produits de trans ­
formation. Les produits volatils sont aussi collectés pour analyse au moyen de dispositifs d'absorption appropriés. À l'aide de produit 
marqué au
 14 C, il est possible de mesurer les différents taux de 
minéralisation de la substance d'essai en piégeant le  4 CO 2 dégagé, 
et un bilan massique, notamment la formation de résidus liés au sol, peut être établi.
 
1.7. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.7.1.  Récupération  
L'extraction et l'analyse, en double exemplaire au moins, des échan ­
tillons de sol immédiatement après l'addition de la substance d'essai 
donnent une première indication de la reproductibilité de la méthode 
analytique et de l'uniformité de la procédure d'application de la subs ­
tance d'essai. Les taux de récupération concernant les étapes ulté ­
rieures des expériences sont fournis par les bilans massiques respec ­
tifs. Ces taux de récupération doivent osciller entre 90 % et 110 % 
pour les substances chimiques marquées (8) et entre 70 % et 110 % pour les substances chimiques non marquées (3).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1151  
( 1 ) Par exemple, si la substance d'essai contient un cycle, il est nécessaire de marquer ce 
cycle; si la substance d'essai contient deux cycles ou plus, il peut être nécessaire d'ef ­
fectuer des études distinctes pour évaluer le devenir de chaque cycle marqué et obtenir 
des informations fiables sur la formation de produits de transformation.
 1.7.2.  Reproductibilité et sensibilité de la méthode analytique  
La reproductibilité de la méthode analytique (à l'exception du rende ­
ment d'extraction initial) servant à quantifier la substance d'essai et les produits de transformation peut être contrôlée en effectuant en 
double les analyses du même extrait de sol, incubé suffisamment 
longtemps pour permettre la formation de produits de transformation.
 
Le seuil de détection de la méthode d'analyse de la substance d'essai 
et des produits de transformation doit être au moins égal à 0,01 mg.kg-
 1 de sol (substance d'essai) ou 1 % de la dose appliquée si 
celle-ci est inférieure. Le seuil de quantification doit également être 
spécifié.  
1.7.3.  Précision des données de transformation  
L'analyse de régression des concentrations de la substance d'essai en 
fonction du temps permet d'obtenir les informations sur la précision de la courbe de transformation et de calculer les limites de confiance des demi-vies (en cas de cinétique du pseudo premier ordre) ou des 
valeurs DT
 50 et, le cas échéant, des valeurs DT  75 et DT  90 . 
1.8. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.8.1.  Appareils et réactifs chimiques  
Les incubateurs sont composés de circuits fermés statiques ou de 
systèmes à circulation continue adaptés (7) (17). Les figures 1 et 2, respectivement, présentent des exemples d'incubateur à circulation continue et de flacons de type biomètre. Les deux types d'incubateur 
présentent des avantages et des inconvénients (7) (17).
 
Matériel courant de laboratoire, notamment:  
— instruments d'analyse: chromatographie gaz-liquide, chromatogra ­
phie en phase liquide à haute performance (HPLC), chromato ­
graphie en couche mince, y compris les systèmes de détection appropriés pour analyser les substances radiomarquées ou non marquées ou la méthode de dilution isotopique inverse,
 
— instruments destinés à l'identification (spectromètre de masse, 
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie 
de masse (GC-MS, HPLC-MS, RMN, etc.),  
— compteur à scintillation liquide,  
— appareillage d'oxydation pour la combustion des produits 
radioactifs,  
— centrifugeuse,  
— appareil d'extraction (par exemple, tubes de centrifugation pour 
extraction à froid et appareil pour extraction en continu sous reflux de type soxhlet),
 
— instrumentation pour concentrer les solutions et les extraits (éva ­
porateur rotatif),  
— bain-marie,  
— mélangeurs mécaniques (pétrin, mélangeur rotatif).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1152
 
Les réactifs chimiques utilisés sont, par exemple:  
— NaOH, de pureté analytique, 2 mol . dm  -3 , ou une autre base 
appropriée (par exemple, KOH, éthanolamine),  
— H  2 SO 4 , de pureté analytique, 0,05 mol . dm  -3 , 
— Éthylène glycol, de pureté analytique,  
— matériaux d'absorption solide tels que chaux sodée et tampons de 
polyuréthane,  
— solvants organiques, de pureté analytique, tels qu'acétone, métha ­
nol, etc.,  
— liquide de scintillation.  
1.8.2.  Application de la substance d'essai  
Pour l'incorporer et la répartir dans le sol, on peut dissoudre la 
substance d'essai dans l'eau (désionisée ou distillée) ou, si nécessaire, 
dans une quantité minimale d'acétone ou d'autres solvants organiques (6) dans lesquels la substance d'essai est suffisamment soluble et stable. Toutefois, la quantité de solvant sélectionnée ne doit pas 
avoir une influence significative sur l'activité microbienne du sol 
(voir les points 1.5 et 1.9.2-1.9.3). Il convient d'éviter d'utiliser des solvants qui inhibent l'activité microbienne, comme le chloroforme, le dichlorométhane et autres solvants halogénés.
 
La substance d'essai peut également être ajoutée sous forme solide, 
mélangée avec du sable de quartz (6) ou dans un petit sous-échan ­
tillon de sol séché à l'air et stérilisé. Si la substance d'essai est ajoutée à l'aide d'un solvant, le solvant doit pouvoir s'évaporer 
avant que le sous-échantillon chargé soit ajouté à l'échantillon 
original de sol non stérile.
 
Pour les substances chimiques courantes, dont la principale voie de 
pénétration dans le sol passe par les boues d'épuration ou le traite ­
ment agricole, il convient de commencer par ajouter la substance d'essai dans la boue avant de l'introduire dans l'échantillon de sol (voir les points 1.9.2 et 1.9.3).
 
Il n'est pas recommandé d'utiliser systématiquement des produits 
formulés. Toutefois, pour les substances peu solubles, l'utilisation de produit formulé peut être une solution appropriée.
 
1.8.3.  Sols  
1.8.3.1.  Sélection du sol  
Pour déterminer la voie de transformation, on peut utiliser un sol 
représentatif; un limon sableux, un limon fin, un limon ou un sable limoneux [selon la classification de la FAO et de l'USDA (18)] avec un pH de 5,5-8,0, une teneur en carbone organique de 0,5-2,5 % et 
une biomasse microbienne d'au moins 1 % de carbone organique 
total est recommandée (10).
 
Pour les études des taux de transformation, il convient d'utiliser au 
moins trois sols supplémentaires représentatifs de la gamme de sols 
concernés. La teneur en carbone organique, le pH, la teneur en argile 
et la biomasse microbienne des sols doivent varier (10).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1153
 
Pour tous les sols, il convient d'établir au moins les caractéristiques 
suivantes: texture (% sable, % limon, % argile) [selon la classifica ­
tion de la FAO et de l'USDA (18)], pH, capacité d'échange catio ­
nique, carbone organique, densité apparente, caractéristiques de rétention d'eau (
 1 ) et biomasse microbienne (pour les études aérobies 
uniquement). Des informations complémentaires sur les propriétés du 
sol peuvent être utiles pour interpréter les résultats. Les méthodes recommandées dans les références (19) (20) (21) (22) (23) peuvent être utilisées pour déterminer les caractéristiques du sol. La biomasse 
microbienne doit être déterminée à l'aide de la méthode de respira ­
tion induite par le substrat (SIR) (25) (26) ou d'autres méthodes (20).
 
1.8.3.2.  Prélèvement, manipulation et stockage des sols  
Il est nécessaire de fournir des informations détaillées sur l'historique 
du site de prélèvement, qui englobent la localisation, le couvert végétal, les traitements aux substances chimiques, les traitements 
aux engrais organiques et inorganiques, les apports biologiques ou 
d'autres contaminations. Si les sols ont été traités avec la substance d'essai ou ses analogues structuraux au cours des quatre années précédentes, ils ne doivent pas être utilisés pour les études de trans ­
formation (10) (15).
 
Le sol doit être fraîchement extrait du site (de l'horizon A ou de la couche 
supérieure de 20 cm) avec une teneur en eau facilitant le tamisage. Pour les sols autres que les sols de rizières, il faut éviter de prélever les échan ­
tillons pendant ou immédiatement après de longues périodes (> 30 jours) 
de sécheresse, de gel ou d'inondations (14). Les échantillons doivent être transportés de façon à minimiser les modifications de la teneur en eau du sol et conservés dans le noir avec libre circulation d'air, dans la mesure 
du possible. Un sac en polyéthylène à fermeture non étanche est géné ­
ralement indiqué à cet effet.
 
Le sol doit être traité le plus rapidement possible après le prélève ­
ment. Il convient de retirer les gros débris végétaux, animaux et les 
pierres avant de passer le sol à travers un tamis de 2 mm pour retirer 
les petits débris de pierres, et les débris animaux et végétaux. Il convient d'éviter de sécher et de broyer le sol de manière importante avant de le tamiser (15).
 
Lorsqu'il est difficile de prélever des échantillons en hiver (sol gelé 
ou recouvert d'une couche de neige), ceux-ci peuvent être prélevés sur un lot de sol stocké dans une serre sous couvert végétal (herbe ou mélange d'herbe et de trèfle). Il est nettement préférable d'effec ­
tuer des études avec des sols qui viennent d'être extraits du site, mais 
si le sol prélevé et traité doit être stocké avant le début de l'étude, les conditions de stockage doivent être appropriées et leur durée doit être limitée (4 + 2
 o C pendant une durée maximale de trois mois) 
afin de préserver l'activité microbienne (  2 ). On trouvera des instruc ­
tions détaillées sur le prélèvement, la manipulation et le stockage des sols à utiliser pour les expériences de biotransformation sous les références (8) (10) (15) (26) (27).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1154  
( 1 ) La caractéristique de rétention d'eau d'un sol peut être mesurée comme capacité au 
champ, capacité de rétention d'eau ou comme potentiel de succion (pF). Pour les expli ­
cations, voir l'annexe 1. Il convient d'indiquer dans le rapport d'essai si les caractéris ­
tiques de rétention d'eau et la densité apparente des sols ont été déterminées sur des 
échantillons de sol non brassé ou avec des échantillons brassés (transformés). 
( 2 ) Des résultats récents indiquent que les sols des zones tempérées peuvent également être 
stockés à — 20  o C pendant plus de trois mois (28) (29) sans perte significative de 
l'activité microbienne.
 Avant son utilisation dans le cadre du présent essai, le sol traité doit 
être préincubé afin de permettre la germination et l'élimination des 
semences, et de rétablir l'équilibre du métabolisme microbien après le passage des conditions de prélèvement ou de stockage aux condi ­
tions d'incubation. Une période de préincubation de 2 à 28 jours 
approchant les conditions de température et d'humidité de l'essai 
réel est généralement indiquée (15). La durée du stockage et de la préincubation ne doit pas dépasser trois mois au total.
 
1.9. EXÉCUTION DE L'ESSAI  
1.9.1.  Conditions de l'essai  
1.9.1.1.  Température de l'essai  
Au cours de toute la période d'essai, les sols doivent être incubés 
dans le noir, à température constante, respectant les conditions clima ­
tiques dans lesquelles l'utilisation ou le rejet interviendra. Une température de 20 ± 2
 o C est recommandée pour toutes les subs ­
tances d'essai susceptibles d'entrer en contact avec le sol dans les 
climats tempérés. La température doit être enregistrée.  
Pour les substances chimiques appliquées ou libérées dans les 
climats froids (par exemple dans les pays nordiques, pendant l'au ­
tomne/hiver), des échantillons de sol supplémentaires doivent égale ­
ment être incubés mais à une température plus basse (par exemple à 
10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Teneur en humidité  
Pour les essais de transformation en milieu aérobie, la teneur en 
humidité du sol (  1 ) doit être ajustée et maintenue à une pF située 
entre 2,0 et 2,5 (3). La teneur en humidité du sol est exprimée en 
masse d'eau par masse de sol sec et elle doit être contrôlée réguliè ­
rement (toutes les 2 semaines par exemple) en pesant les flacons d'incubation et les pertes en eau doivent être compensées par l'ad ­
jonction d'eau (de préférence de l'eau du robinet stérilisée par filtra ­
tion). Il convient de veiller à éviter ou à réduire les pertes de subs ­
tance d'essai et/ou des produits de transformation par évaporation et/ou photodégradation (le cas échéant) pendant l'ajout d'eau.
 
Pour les essais de transformation dans des conditions anaérobies et 
de rizière, le sol est saturé en eau par submersion.  
1.9.1.3.  Conditions d'incubation aérobies  
Dans les systèmes à circulation continue, les conditions aérobies sont 
maintenues par lessivage périodique ou par aération continue avec de l'air humidifié. Dans les flacons de type biomètre, l'échange d'air est maintenu par diffusion.
 
1.9.1.4.  Conditions aérobies stériles  
Pour obtenir des informations sur l'importance de la transformation 
abiotique d'une substance d'essai, les échantillons de sol peuvent être stérilisés (pour les méthodes de stérilisation, voir les références 16 et 29), traités avec une substance d'essai stérile (par exemple l'addition 
de solution à travers un filtre stérile) et aérés avec de l'air stérile 
humidifié comme décrit au point 1.9.1.3. Pour les sols de rizière, le sol et l'eau doivent être stérilisés et l'incubation doit être effectuée comme décrit au point 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1155  
( 1 ) Le sol ne doit jamais être trop humide ni trop sec afin de maintenir des conditions 
adéquates d'aération et de nutrition de la microflore du sol. Les teneurs en eau recom ­
mandées pour une croissance microbienne optimale vont de 40 à 60 % de capacité de 
rétention d'eau (WHC) et de 0,1 à 0,33 bar (6). Cette fourchette est équivalente à un 
intervalle de pF de 2,0-2,5. L'annexe 2 présente la teneur habituelle en eau de plusieurs 
types de sol.
 1.9.1.5.  Conditions d'incubation anaérobies  
Afin de créer et de maintenir des conditions anaérobies, le sol traité 
avec la substance d'essai et incubé dans des conditions aérobies pendant 30 jours ou une demi-vie ou DT
 50 (si celle-ci est plus 
courte) est ensuite recouvert d'eau (couche de 1-3 cm d'eau) et le 
système d'incubation est balayé avec un gaz inerte (azote ou argon) (  1 ). 
Le système d'essai doit permettre de mesurer le pH, la concentration en oxygène et le potentiel redox et comprendre des dispositifs de piégeage 
des produits volatiles. Le système de type biomètre doit être fermé pour 
éviter toute entrée d'air par diffusion.
 
1.9.1.6.  Conditions d'incubation dans les sols de rizière  
Pour étudier la transformation dans les sols de rizière, le sol est 
recouvert d'une couche d'eau de 1-5 cm environ et la substance 
d'essai appliquée à la phase aqueuse (9). Une profondeur de 
couche de sol de 5 cm au moins est recommandée. Le système est ventilé avec de l'air comme en situation aérobie. Le pH, la concen ­
tration en oxygène et le potentiel redox de la couche aqueuse doivent 
être surveillés et enregistrés. Une période de préincubation de deux 
semaines au moins est nécessaire avant de commencer les études de transformation (voir le point 1.8.3.2).
 
1.9.1.7.  Durée de l' essai  
En règle générale, les études des taux et des voies de transformation 
ne doivent pas dépasser 120 jours (  2 ) (3) (6) (8), parce qu'au-delà, 
dans un système artificiel en laboratoire qui ne peut se reconstituer 
naturellement, on peut attendre une diminution de l'activité micro ­
bienne du sol avec le temps. S'il est nécessaire de caractériser la déplétion de la substance d'essai et la formation et la déplétion des 
principaux produits de transformation, les études peuvent être pour ­
suivies pendant une période plus longue (de 6 à 12 mois) (8). Des périodes d'incubation plus longues doivent être justifiées dans le rapport d'essai et accompagnées de mesures de la biomasse 
pendant et à la fin de ces périodes.
 
1.9.2.  Exécution de l'essai  
On place 50 à 200 g de sol environ (sur la base du poids sec) dans 
chaque flacon d'incubation (voir les figures 1 et 2 à l'annexe 3) et on traite le sol avec la substance d'essai en utilisant l'une des méthodes 
décrites au point 1.8.2. Si l'on utilise des solvants organiques pour 
appliquer la substance d'essai, il convient de les éliminer du sol par évaporation. Puis, le sol est soigneusement mélangé à l'aide d'une spatule et/ou en agitant le flacon. Si l'étude est menée dans des 
conditions de sol de rizière, le sol et l'eau doivent être soigneusement 
mélangés après l'application de la substance d'essai. De petits aliquots (1 g par exemple) des sols traités doivent être analysés pour mesurer la substance d'essai afin de vérifier l'uniformité de la 
répartition. D'autres méthodes sont décrites ci-dessous.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1156  
( 1 ) Les conditions aérobies sont prédominantes dans les sols de surface et même dans les 
sols subsurfaciques comme le montre un projet de recherche financé par PUE [K. Takagi 
et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil températures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. 
Aspects Pesticides Microbiol., p. 270-277, 17-21 août 1992, Sigtuna, Suède]. Les condi ­
tions anaérobies ne peuvent se produire qu'occasionnellement sur des sols inondés après 
d'importantes chutes de pluie ou sur des sols de rizières submergées. 
(
 2 ) Les études aérobies doivent être terminées en moins de 120 jours sous réserve que la 
voie de transformation et la minéralisation se soient effectivement produites à cette date. 
Il est possible de mettre fin à l'essai au bout de 120 jours, ou lorsque 90 % au moins de 
la substance d'essai sont transformés, mais seulement s'il y a formation de 5 % de CO  2 
au moins.
 Le taux de traitement doit correspondre à la dose d'application la plus 
élevée d'un produit phytosanitaire recommandée dans les instructions 
d'utilisation et à l'incorporation uniforme à une profondeur appropriée dans le champ [couche supérieure du sol sur 10 cm (
 1 ) ]. Par exemple, 
pour les substances chimiques appliquées sur le feuillage ou sans 
enfouissement dans le sol, la profondeur appropriée pour calculer la 
quantité de substance chimique à ajouter à chaque flacon est de 2,5 cm. Pour les substances chimiques enfouies dans le sol, la profondeur appropriée est la profondeur d'enfouissement spécifiée dans les instruc ­
tions d'utilisation. Pour les substances chimiques courantes, la dose d'ap ­
plication doit être estimée sur la base de la voie de pénétration la plus pertinente; par exemple, lorsque les boues d'épuration sont la principale voie de pénétration dans le sol, la substance chimique doit être dosée 
dans la boue à une concentration correspondant à la concentration prévue 
et la quantité de boue ajoutée au sol doit correspondre à la charge normale en boue des sols agricoles. Si cette concentration n'est pas suffisamment élevée pour identifier les principaux produits de transfor ­
mation, l'incubation d'échantillons de sol contenant des taux plus élevés 
peut être utile, mais il convient d'éviter des taux excessifs qui influencent les fonctions microbiennes du sol (voir les points 1.5 et 1.8.2).
 
Un autre moyen consiste à traiter un lot plus important (de 1 à 2 kg) 
de sol avec la substance d'essai, en le mélangeant soigneusement 
dans un mélangeur adapté puis en le transférant en petites fractions 
de 50 à 200 g dans les flacons d'incubation (par exemple à l'aide de répartiteurs). De petits aliquots (1 g par exemple) du lot de sol traité doivent être analysés afin de vérifier l'uniformité de la répartition de 
la substance d'essai. Cette procédure est préférable car elle permet 
une répartition plus uniforme de la substance d'essai dans le sol.
 
De même, les échantillons de sol non traités sont incubés dans les 
mêmes conditions (aérobies) que les échantillons traités avec la subs ­
tance d'essai. Ces échantillons sont utilisés pour mesurer la biomasse 
pendant le déroulement et à la fin des essais.  
Lorsque la substance d'essai est appliquée dans le sol dissous dans 
un (ou plusieurs) solvant(s) organique(s), des échantillons de sol 
traité avec la même quantité de solvant(s) sont incubés dans les mêmes conditions (aérobies) que les échantillons traités avec la subs ­
tance d'essai. Ces échantillons sont utilisés pour mesurer la biomasse 
au début, pendant le déroulement et à la fin des essais afin de 
contrôler les effets du(des) solvant(s) sur la biomasse microbienne.
 
Les flacons contenant le sol traité sont attachés au système à circu ­
lation continue décrit à la figure 1 ou fermés par la colonne d'ab ­
sorption présentée dans la figure 2 (voir l'annexe 3).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1157  
( 1 ) Calcul de la concentration initiale en fonction de la superficie à l'aide de l'équation 
suivante:  
C sol mg=kg sol ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg=kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  sol=m 3 h i  
C sol = concentration initiale dans le sol [mg.kg-  1 ] 
A = Taux d'application [kg.ha-  1 ]; 1 = épaisseur de la couche de sol du champ [m]; d = 
densité apparente du sol sec [kg-m-  3 ]. 
En règle générale, si on applique un taux de 1 kg.ha-  1 , on obtient une concentration de 
1 mg.kg-  1 environ dans une couche de 10 cm (en supposant une densité apparente de 
1 g.cm-  3 ).
 1.9.3.  Échantillonnage et mesures  
Les flacons d'incubation en deux exemplaires sont retirés à des inter ­
valles appropriés et les échantillons de sol extraits à l'aide de solvants appropriés de polarité différente et analysés pour mesurer 
la substance d'essai et/ou les produits de transformation. Une étude 
bien conçue comprend un nombre suffisant de flacons de façon à pouvoir sacrifier deux flacons à chaque prélèvement. De plus, des solutions d'absorption ou des matériaux d'absorption solides sont 
retirés à différents intervalles de temps (tous les 7 jours au cours 
du premier mois et, au bout d'un mois, tous les 17 jours) pendant et à la fin de l'incubation de chaque échantillon de sol et analysés pour 
mesurer les produits volatils. Par ailleurs, au moins 5 points supplé ­
mentaires de prélèvement devraient être prévus en plus de l'échan ­
tillon de sol prélevé directement après application (échantillon de 0 jour). Les intervalles de temps doivent être choisis de façon à 
pouvoir établir la courbe de déplétion de la substance d'essai et les 
courbes de formation et de déplétion des produits de transformation (par exemple 0, 1, 3, 7 jours; 2, 3 semaines; 1, 2, 3 mois, etc.).
 
Lorsqu'on utilise une substance d'essai marquée au  14 C, la radioac ­
tivité non extractible est quantifiée par combustion et un bilan massique est calculé pour chaque intervalle de prélèvement.
 
Dans le cas de l'incubation anaérobie et des sols de rizière, la phase 
sol et la phase aqueuse peuvent être analysées ensemble pour mesurer la substance d'essai et les produits de transformation ou 
séparées par filtration ou centrifugation avant extraction et analyse.
 
1.9.4.  Essais facultatifs  
Il peut être utile d'effectuer des études aérobies non stériles à d'autres 
températures et humidités de sol pour estimer l'influence de la 
température et de l'humidité du sol sur le taux de transformation 
d'une substance d'essai et/ou de ses produits de transformation dans le sol.
 
On peut essayer d'effectuer une caractérisation plus poussée de la 
radioactivité non extractible en utilisant, par exemple, l'extraction par un fluide supercritique.
 
2. DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Les quantités de substance d'essai, de produits de transformation, de 
substances volatiles (en % uniquement) et non extractibles doivent 
être données en pourcentage de la concentration initiale appliquée et, 
s'il y a lieu, en mg.kg  -1 de sol (sur la base du poids sec de sol) à 
chaque intervalle de prélèvement. Pour chaque intervalle de prélève ­
ment, un bilan massique doit être donné en pourcentage de la 
concentration initiale appliquée. La représentation graphique des concentrations de la substance d'essai en fonction du temps permet d'estimer sa durée de demi-vie de la transformation ou sa DT
 50 . Les 
produits de transformation principaux doivent être identifiés et leurs 
concentrations doivent également être présentées graphiquement en fonction du temps afin de montrer leurs taux de formation et de déplétion. On entend par produit de transformation principal tout 
produit représentant > 10 % de la dose appliquée à n'importe quel 
moment de l'étude.
 
Les produits volatils piégés donnent une indication du potentiel de 
volatilité d'une substance d'essai et de ses produits de transformation 
à partir du sol.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1158
 
Il est possible de déterminer avec plus de précision les demi-vies ou 
les valeurs DT  50 et, s'il y a lieu, les valeurs DT  75 et DT  90 en utilisant 
des méthodes de calcul fondées sur des modèles cinétiques appro ­
priés. La durée de demi-vie et les valeurs DT  50 doivent être notées 
dans le rapport avec la description du modèle cinétique utilisé, 
l'ordre de la cinétique et le coefficient de détermination (r  2 ). La 
cinétique du premier ordre est préférable sauf si r  2 < 0,7. Si néces ­
saire, les calculs doivent aussi être appliqués aux principaux produits de transformation. Des exemples des modèles appropriés sont décrits 
sous les références 31 à 35.
 
Dans le cas des études de taux effectuées à des températures diffé ­
rentes, les taux de transformation doivent être décrits comme fonc ­
tion de la température à l'intérieur de l'intervalle de température de 
l'expérience en appliquant la formule de la relation d'Arrhenius:  
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T 
où In A et B sont des constantes de régression, respectivement, 
l'intersection et la pente de la droite d'interpolation produite par 
régression linéaire de In k par rapport à 1/T, où k est la constante 
de vitesse à la température T et T la température en degrés Kelvin. Il convient de prendre soin à l'intervalle limité de température à l'inté ­
rieur de laquelle la relation d'Arrhenius est valable dans le cas où la 
transformation dépend de l'activité microbienne.
 
2.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
Bien que les études soient effectuées dans un système artificiel en 
laboratoire, les résultats permettent d'estimer le taux de transforma ­
tion de la substance d'essai ainsi que les taux de formation et de 
déplétion des produits de transformation dans des conditions de 
terrain (36) (37).  
L'étude des voies de transformation d'une substance d'essai donne 
des informations sur la façon dont la structure de la substance appli ­
quée est modifiée dans le sol par des réactions chimiques et micro ­
biennes.  
3. RAPPORT  
RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— nom courant, nom chimique, numéro de fichier CAS, formule 
structurale [indiquant la(les) position (s) du(des) marquage(s) 
lorsqu'on utilise un produit radiomarqué] et propriétés physico- 
chimiques pertinentes (voir le point 1.5),  
— pureté (impuretés) de la substance d'essai,  
— pureté radiochimique de la substance marquée et activité spéci ­
fique (s'il y a lieu).  
Substances de référence:  
— nom et structure chimique des substances de référence utilisées 
pour caractériser et/ou identifier le produit de transformation.  
Sol d'essai:  
— détails du site de prélèvement,  
— date et procédure d'échantillonnage du sol,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1159
 
— propriétés des sols: pH, teneur en carbone organique, texture (% 
sable, % limon, % argile), capacité d'échange cationique, densité 
apparente, caractéristique de rétention d'eau, et biomasse micro ­
bienne,  
— durée et conditions de stockage du sol (s'il y a lieu).  
Conditions d'essai:  
— dates de réalisation des études,  
— quantité de substance d'essai appliquée,  
— solvants utilisés et méthode d'application de la substance d'essai,  
— poids de sol traité initialement et prélevé à chaque intervalle pour 
analyse,  
— description du système d'incubation utilisé,  
— débit d'écoulement de l'air (pour les systèmes à circulation 
continue uniquement),  
— température au début de l'expérience,  
— teneur en humidité du sol pendant l'incubation,  
— biomasse microbienne au début, pendant le déroulement et à la 
fin des études aérobies,  
— pH, concentration en oxygène et potentiel redox au début, 
pendant le déroulement et à la fin des études anaérobies et des 
sols de rizière,  
— méthode(s) d'extraction,  
— méthodes de quantification et d'identification de la substance 
d'essai et des principaux produits de transformation dans le sol 
et matériau d'absorption,  
— nombre de réplicats et nombre de témoins.  
Résultats:  
— résultat de la détermination de l'activité microbienne,  
— reproductibilité et sensibilité des méthodes analytiques utilisées,  
— taux de récupération (les pourcentages acceptables pour que 
l'étude soit valable sont présentés au point 1.7.1),  
— tableaux de résultats exprimés en % de la dose initiale appliquée 
et, s'il y a lieu, en mg.kg  -1 de sol (sur la base de poids sec),  
— bilan massique pendant et à la fin des études,  
— caractérisation de la radioactivité non extractible (liée) ou des 
résidus dans le sol,  
— quantification du CO  2 dégagé et des autres composés volatiles,  
— graphes représentant la concentration de la substance d'essai dans 
le sol en fonction du temps et, s'il y a lieu, des principaux produits de transformation,
 
— demi-vie ou DT  50 , DT  75 et DT  90 pour la substance d'essai et, s'il 
y a lieu, des principaux produits de transformation, ainsi que les 
limites de confiance,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1160
 
— estimation de la vitesse de dégradation abiotique dans des condi ­
tions stériles,  
— évaluation de la cinétique de transformation de la substance 
d'essai et, s'il y a lieu, des principaux produits de transformation,  
— voies de transformation proposées, s'il y a lieu,  
— discussion et interprétation des résultats,  
— données brutes (chromatogramme des échantillons, calcul des 
vitesses de transformation des échantillons et moyens utilisés pour identifier les produits de transformation).
 
4. RÉFÉRENCES  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) Union européenne (UE) (1995). Directive 95/36/CE de la 
Commission du 14 juillet 1995 modifiant la directive 91/414/CEE du Conseil concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques. Annexe II, partie A, et 
annexe III, partie A: Devenir et comportement dans l'environ ­
nement.
 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prüfung von Pflanzen ­
schutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden — Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil — Part 1: Aerobic conditions.
 
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality — Laboratory incubation 
Systems for measuring the mineralization of organic chemicals 
in soil under aerobic conditions.  
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF — Japon 2000 — Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil — Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
(10) OCDE (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italie, 18-20 January 1995.  
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academie Press, p. 123-157.
 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH 
(1998).  
(13) T.R. Roberts: Non extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(14) Ligne directrice de l'OCDE 304 A: Biodégradabilité intrinsèque 
dans le sol (adoptée le 12 mai 1981).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1161
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Qualité des sols — Échantillonnage — 
Partie 6: Guide du prélèvement, de la manipulation et du 
stockage des sols pour l'évaluation des processus microbiens en laboratoire.
 
(16) Annexe V de la directive 67/548/CEE.  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO Systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods. A. Kliite, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd 
Edition.  
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, 
Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.  
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
— General aspects; chemicai and physical méthodes of analy ­
sis; biological methods of analysis. First Edition.  
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Schefïer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, p. 215-221.
 
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality — Determination of 
soil microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
 
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, p. 45-60.
 
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio- transformation of 
pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16  th 
Symposium on Environmental Science of Pesticide, p. 105- 
120. 
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
 
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, p. 197-200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1162
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbi ­
cides, p. 181-199.  
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
«Environmental Dynamics of Pesticides». R. Haque and V.H. 
Freed, Eds., p. 135-172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide résidus. II. Pflanzenschutz — Nachrichten 
Bayer 39, p. 188-204.  
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 
33, p. 47-60.
 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide 
dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, p. 1032-1041.
 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, p. 83-122.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1163
 
Annexe 1  
SUCCION, CAPACITÉ AU CHAMP (FC) ET CAPACITÉ DE RÉTENTION D'EAU 
(WHC)  ( 1 ) 
Hauteur de la colonne d'eau 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Remarques  
10 7 7 10  4 Sol sec 
1,6 · 10 4 4,2 16 Point de flétrissement 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Échelle de la 
capacité au champ (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 Capacité de rétention d'eau 
(approximation) 
1 0 0,001 Sol saturé en eau
 
( a ) pF = log de la colonne d'eau en cm. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Correspond à une teneur en eau approximative de 10 % dans le sable, de 35 % dans le limon et de 45 % 
dans l'argile. 
( d ) La capacité au champ n'est pas constante mais varie selon le type de sol de pF 1,5 à 2,5.  
La succion  est mesurée en cm de colonne d'eau ou en bar. Comme l'échelle de valeur de la succion 
est très large, celle-ci est exprimée simplement en pF, qui est égal au logarithme de la colonne d'eau en cm.
 
La capacité au champ  (FC) est définie comme la quantité d'eau qui peut être stockée contre la 
gravité par un sol naturel 2 jours après une longue période de pluie ou après une irrigation 
suffisante. Elle est déterminée dans un sol non brassé in situ dans le champ. Cette mesure ne peut donc pas s'appliquer aux échantillons de sol brassé. Les valeurs de capacité au champ déter ­
minées dans les sols brassés peuvent présenter une variabilité systématique importante.
 
La capacité de rétention d'eau  (WHC) est déterminée en laboratoire avec un sol non brassé et un 
sol brassé en saturant une colonne de sol avec de l'eau par capillarité. Elle est particulièrement utile pour les sols brassés et peut être jusqu'à 30 % supérieure à la capacité au champ (1). Elle est également plus facile à déterminer expérimentalement que des valeurs de capacité au champ fiables.
 
Notes  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1164
 
Annexe 2  
TENEUR EN HUMIDITÉ (g d'eau pour 100 g de sol sec) DE DIFFÉRENTS TYPES DE SOL 
PROVENANT DE DIFFÉRENTS PAYS  
Teneur en humidité à 
Type de sol Pays 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Sable Allemagne 28,7 8,8 3,9 
Sable limoneux Allemagne 50,4 17,9 12,1 
Sable limoneux Suisse 44,0 35,3 9,2 
Limon fin Suisse 72,8 56,6 28,4 Limon argileux Brésil 69,7 38,4 27,3 Limon argileux Japon 74,4 57,8 31,4 Limon sableux Japon 82,4 59,2 36,0 Limon fin États-Unis 47,2 33,2 18,8 Limon sableux États-Unis 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Capacité de rétention d'eau  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1165
 
Annexe 3  
Figure 1  
Exemple d'appareil à circulation continue pour étudier la transformation des substances 
chimiques dans le sol  ( 1 ) ( 2 )
 
Figure 2  
Exemple de flacon de type biomètre pour l'étude de la transformation des substances 
chimiques dans le sol  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1166  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academie Press, p. 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.
 C.24.  TRANSFORMATION AÉROBIE ET ANAÉROBIE DANS LES 
SYSTÈMES SÉDIMENTAIRES AQUATIQUES  
1. MÉTHODE  
La présente méthode d'essai reprend l'essai TG 308 (2002) de 
l'OCDE.  
1.1. INTRODUCTION  
Les substances chimiques peuvent pénétrer dans les eaux de surface 
peu ou très profondes par des voies telles que l'application directe, la déperdition lors de l'épandage, le ruissellement, le drainage, l'élimi ­
nation des déchets, les effluents industriels, domestiques ou agricoles 
et le dépôt atmosphérique. La présente méthode d'essai décrit une méthode de laboratoire conçue pour évaluer la transformation aérobie et anaérobie des substances chimiques organiques dans les systèmes 
sédimentaires aquatiques. Elle s'appuie sur les lignes directrices exis ­
tantes (1) (2) (3) (4) (5) (6). Un atelier de l'OCDE sur la sélection des sols et des sédiments, qui s'est tenu à Belgirate, en Italie, en 1995 (7), a défini notamment le nombre et le type de sédiments à 
utiliser dans le cadre de cet essai. Il a également formulé des recom ­
mandations relatives au prélèvement, à la manipulation et au stockage des échantillons de sédiments, sur la base des lignes direc ­
trices de l'ISO (8). Ces études sont nécessaires pour les substances 
chimiques qui sont introduites directement dans l'eau ou qui sont 
susceptibles de pénétrer dans le milieu aquatique par les voies décrites ci-dessus.
 
La phase aqueuse supérieure des systèmes sédimentaires aquatiques 
présente souvent des conditions aérobies. La couche superficielle du 
sédiment peut être aérobie ou anaérobie, alors que, en profondeur, le sédiment est généralement anaérobie. Afin de tenir compte de toutes ces possibilités, le présent document décrit des essais aérobies et 
anaérobies. L'essai aérobie simule une colonne d'eau aérobie sur 
une couche de sédiment aérobie et une sous-couche avec un gradient anaérobie. L'essai anaérobie simule un système eau-sédiment complètement anaérobie. Si, selon les circonstances, il est nécessaire 
de s'écarter sensiblement de ces recommandations, par exemple en 
utilisant des carottes de sédiment intact ou des sédiments qui ont pu être exposés à la substance d'essai, il existe d'autres méthodes à cette 
fin (9).
 
1.2. DÉFINITIONS  
Il convient d'utiliser dans tous les cas les unités standard internatio ­
nales (SI).  
Substance d'essai:  toute substance, qu'il s'agisse de la substance 
mère ou des produits de transformation correspondants.  
Produits de transformation:  toutes les substances résultant des 
réactions de transformation biotiques et abiotiques de la substance d'essai, et notamment le CO
 2 et les résidus liés.  
Résidus liés:  les «résidus liés» désignent des composés du sol, végé ­
taux ou animaux, qui subsistent dans la matrice après extraction, sous la 
forme de la substance mère ou de ses métabolite(s). La méthode d'ex ­
traction ne doit pas modifier de manière substantielle les composés eux- mêmes ni la structure de la matrice. La nature de la liaison peut être 
clarifiée en partie par les méthodes d'extraction qui modifient la matrice 
et des techniques analytiques sophistiquées. C'est de cette façon que l'on a déterminé jusqu'ici la nature de la liaison, covalente ionique, par sorp ­
tion ou piégeage. De manière générale, la formation de résidus liés 
abaisse sensiblement la bioaccessibilité et la biodisponibilité (10) 
[modifié d'après l'UICPA 1984 (11)].
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1167
 
Transformation aérobie:  (oxydation): réaction se produisant en 
présence d'oxygène moléculaire (12).  
Transformation anaérobie:  (réduction): réaction se produisant en 
l'absence d'oxygène moléculaire (12).  
Eaux naturelles:  eaux superficielles provenant de mares, rivières, 
fleuves, etc.  
Sédiment:  mélange de constituants chimiques minéraux et orga ­
niques, ces derniers contenant des composés à haute teneur en carbone et en azote et à masse moléculaire élevée. Il est déposé par les eaux naturelles avec lesquelles il forme une interface.
 
Minéralisation:  dégradation complète d'un composé organique en 
CO 2 et H  2 O dans des conditions aérobies, et en CH  4 , CO  2 et H  2 O 
dans des conditions anaérobies. Dans le cadre de la présente méthode d'essai, lorsqu'on utilise un composé radiomarqué, la minéralisation désigne la dégradation importante au cours de laquelle un atome de 
carbone marqué est oxydé ou réduit quantitativement avec dégage ­
ment de la quantité correspondante de
 14 CO 2 ou de  14 CH 4 , respec­
tivement.  
Demi-vie,  t 0,5 , temps nécessaire à la transformation de 50 % d'une 
substance d'essai lorsque la transformation peut être décrite par une cinétique du premier ordre; elle est indépendante de la concentration 
initiale.
 
DT 50 (temps de dégradation 50):  période au cours de laquelle la 
concentration initiale de la substance d'essai diminue de 50 %.  
DT 75 (temps de dégradation 75):  période au cours de laquelle la 
concentration initiale de la substance d'essai diminue de 75 %.  
DT 90 (temps de dégradation 90):  période au cours de laquelle la 
concentration initiale de la substance d'essai diminue de 90 %.  
1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
Des substances de référence doivent être utilisées pour caractériser 
et/ou identifier les produits de transformation par des méthodes spec ­
troscopiques et chromatographiques.  
1.4. INFORMATIONS RELATIVES À LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Une substance d'essai marquée ou non marquée peut être utilisée 
pour mesurer le taux de transformation, bien qu'il soit préférable 
d'utiliser du matériel marqué. Il est nécessaire d'utiliser du matériel 
marqué pour étudier les voies de transformation et établir un bilan massique, le marquage au
 14 C est recommandé mais l'utilisation 
d'autres isotopes, comme  13 C, 15 N, 3 H, 32 P, peut aussi être utile. 
Dans la mesure du possible, le-marquage doit être situé dans la 
partie(s) la plus stable de la molécule (  1 ). La substance d'essai doit 
avoir une pureté chimique et/ou radiochimique d'au moins 95 %.  
Avant de procéder à un essai, il convient de disposer des informa ­
tions suivantes sur la substance d'essai:  
a) solubilité dans l'eau (Méthode A.6);  
b) solubilité dans les solvants organiques;  
c) pression de vapeur (Méthode A.4) et constante de la loi de 
Henry;  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1168  
( 1 ) Par exemple, si la substance d'essai contient un cycle, il est nécessaire de marquer ce 
cycle; si la substance d'essai contient deux cycles ou plus, il peut être nécessaire d'ef ­
fectuer des études distinctes pour évaluer le devenir de chaque cycle marqué et obtenir 
des informations fiables sur la formation de produits de transformation.
 d) coefficient de partage n-octanol/eau (Méthode A.8);  
e) coefficient d'adsorption (K  d , K  r ou K  oc , s'il y a lieu) (Méthode 
C.18);  
f) hydrolyse (Méthode C.7);  
g) constante de dissociation (pK  a ) [ligne directrice 112 de 
l'OCDE] (13);  
h) structure chimique de la substance d'essai et position des 
marqueurs isotopiques, s'il y a lieu.  
Note:  Il convient d'indiquer la température à laquelle ces mesures ont 
été effectuées.  
Il peut également être utile de disposer d'informations sur la toxicité 
de la substance d'essai sur les micro-organismes, sur la biodégrada ­
bilité immédiate et/ou intrinsèque, ainsi que sur la transformation 
aérobie et anaérobie dans le sol.  
Il faut disposer des méthodes analytiques (dont des méthodes d'ex ­
traction et de purification) nécessaires à la quantification et à l'iden ­
tification de la substance d'essai et de ses produits de transformation dans l'eau et dans les sédiments (voir le point 1.7.2).
 
1.5. PRINCIPE DE LA MÉTHODE  
La méthode décrite ici emploie un système sédimentaire aquatique 
aérobie et anaérobie (voir l'annexe 1) qui permet:  
i) de mesurer le taux de transformation de la substance d'essai dans 
le sédiment;  
ii) de mesurer le taux de transformation de la substance d'essai dans 
le sédiment;  
iii) de mesurer le taux de minéralisation de la substance d'essai et/ou 
de ses produits de transformation (lorsqu'on utilise une substance 
d'essai marquée au  14 C); 
iv) d'identifier et de quantifier les produits de transformation dans 
les phases aqueuse et sédimentaire et notamment le bilan 
massique (lorsqu'on utilise une substance d'essai marquée);  
v) de mesurer la répartition de la substance d'essai et de ses produits 
de transformation entre les deux phases pendant une période d'incubation dans le noir (pour éviter, par exemple, la proliféra ­
tion d'algues) à température constante. Les durées de demi-vie, 
les valeurs DT
 50 , DT  75 et DT  90 sont déterminées lorsque les 
données le permettent, mais elles ne doivent pas être extrapolées bien au-delà de la période expérimentale (voir le point 1.2).
 
Au moins deux sédiments et les phases aqueuses associées sont 
nécessaires pour les études aérobies et anaérobies respectivement (7). Il peut toutefois être nécessaire dans certains cas d'utiliser plus de deux sédiments aquatiques, par exemple, pour une substance 
chimique pouvant être présente dans l'eau douce et/ou le milieu 
marin.
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1.6. APPLICABILITÉ DE L'ESSAI  
La méthode peut être appliquée aux substances chimiques (marquées 
ou non marquées) pour lesquelles il existe une méthode analytique de précision et de sensibilité suffisantes. Elle s'applique à des 
composés faiblement volatils, non volatils, hydrosolubles ou peu 
hydrosolubles. L'essai ne doit pas être appliqué aux substances chimiques fortement volatiles dans l'eau (fumigants, solvants orga ­
niques) et qui ne peuvent donc pas être gardées dans l'eau et/ou le 
sédiment dans les conditions expérimentales de cet essai.
 
La méthode a été appliquée jusqu'ici pour étudier la transformation 
des substances chimiques dans les eaux douces et dans les sédiments, mais, en principe, elle peut également être appliquée aux systèmes 
estuariens/marins. Elle n'est pas adaptée à la simulation des condi ­
tions de l'eau courante (rivières) ou de pleine mer.
 
1.7. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.7.1.  Récupération  
L'extraction et l'analyse, au moins en double exemplaire, des échan ­
tillons d'eau et de sédiment immédiatement après l'addition de la 
substance d'essai donnent une première indication de la reproducti ­
bilité de la méthode analytique et de l'uniformité de la procédure d'application de la substance d'essai. Les taux de récupération des stades ultérieurs des expériences sont fournis par les bilans 
massiques respectifs (lorsqu'on utilise une substance marquée). Les 
taux de récupération doivent osciller entre 90 % et 110 % pour les substances chimiques marquées (6) et entre 70 % et 110 % pour les substances chimiques non marquées.
 
1.7.2.  Reproductibilité et sensibilité de la méthode analytique  
La reproductibilité de la méthode analytique (à l'exception du rende ­
ment d'extraction initial) servant à quantifier la substance d'essai et 
les produits de transformation peut être contrôlée en effectuant en double les analyses du même extrait d'échantillons d'eau ou de sédi ­
ments, incubés suffisamment longtemps pour permettre la formation 
de produits de transformation.
 
La limite de détection de la méthode d'analyse de la substance d'essai 
et ses produits de transformation doit être au moins égale à 0,01 mg.kg
 -1 dans l'eau ou le sédiment (substance d'essai) ou à 1 % de la 
quantité initiale appliquée à un système d'essai si cette quantité est 
inférieure. La limite de quantification doit également être spécifiée.  
1.7.3.  Précision des données de transformation  
L'analyse de régression des concentrations de la substance d'essai en 
fonction du temps permet d'obtenir les informations appropriées sur la précision de la courbe de transformation et de calculer les limites 
de confiance des demi-vies (en cas de cinétique du pseudo premier 
ordre) ou des valeurs DT
 50 et, le cas échéant, des valeurs DT  75 
et DT  90 . 
1.8. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.8.1.  Système et appareillage d'essai  
L'étude doit être effectuée dans des récipients en verre (bouteilles, 
tubes de centrifugation), à moins que les informations préliminaires 
(coefficient de partage n-octanol/eau, données de sorption, etc.) indi ­
quent que la substance d'essai risque d'adhérer au verre, auquel cas on peut envisager l'utilisation d'un autre matériau (Téflon). Lorsque 
l'on sait que la substance d'essai adhère au verre, il est possible de 
contourner le problème en utilisant l'une des méthodes suivantes:
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— déterminer la masse de la substance d'essai et de ses produits de 
transformation sorbés sur le verre,  
— veiller à nettoyer toute la verrerie à l'aide d'un solvant à la fin de 
l'essai,  
— utilisation de produits formulés (voir également le point 1.9.2),  
— utilisation d'une quantité croissante de cosolvant pour ajouter la 
substance d'essai au système; si l'on utilise un cosolvant, celui-ci 
ne doit pas entraîner de réaction de solvolyse avec la substance d'essai.
 
Des exemples d'appareillage d'essai courant (systèmes à flux continu 
et biomètres) sont présentés dans les annexes 2 et 3, respectivement 
(14). On trouvera d'autres systèmes d'incubation sous la référence 
15. L'appareil utilisé pour l'expérience doit permettre l'échange d'air ou d'azote et le piégeage des produits volatils. Les dimensions de l'appareillage doivent permettre de satisfaire aux exigences de 
l'essai (voir le point 1.9.1). La ventilation peut être effectuée soit 
par léger barbotage soit en faisant circuler de l'air ou de l'azote à la surface de l'eau. Dans ce cas, il est conseillé de remuer doucement la surface de l'eau pour obtenir une meilleure répartition de l'oxygène 
ou de l'azote dans l'eau. Il ne faut pas utiliser d'air sans CO
 2 car cela 
pourrait entraîner une augmentation du pH de l'eau. Dans les deux cas, il n'est pas souhaitable de toucher au sédiment et il convient de l'éviter dans toute la mesure du possible. Les substances chimiques 
faiblement volatiles doivent être testées dans un système de type 
biomètre en remuant légèrement la surface de l'eau. Des récipients fermés avec un espace libre d'air atmosphérique ou d'azote et des fioles à l'intérieur pour le piégeage des produits volatils peuvent 
également être utilisés (16). Un bon échange du gaz de surface est 
nécessaire dans l'essai aérobie afin de compenser la consommation d'oxygène par la biomasse.
 
La liste non restrictive des pièges adaptés à la collecte des produits 
de transformation volatils est la suivante: solutions à 1 mol.dm  -3 
d'hydroxyde de potassium ou d'hydroxyde de sodium pour le 
dioxyde de carbone (  1 ) et éthylène glycol, éthanolamine ou 2 % 
paraffine dans le xylène pour les composés organiques. Les produits volatils formés en anaérobie, comme le méthane, peuvent être récu ­
pérés, par exemple, à l'aide de tamis moléculaires. Ces produits 
volatils peuvent être brûlés, par exemple, en CO
 2 en faisant passer 
le gaz à travers un tube de quartz rempli de CuO à la température de 900
 o C et en piégeant le CO  2 formé dans une colonne d'absorption 
contenant un produit alcalin (17).  
Des instruments de laboratoire pour l'analyse chimique de la subs ­
tance d'essai et des produits de transformation sont nécessaires [chro ­
matographie gaz-liquide (GLQ), chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), chromatographie en couche mince 
(TLC), spectroscopie de masse (MS), chromatographie en phase 
gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), chromatogra ­
phie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS), résonance magnétique nucléaire (RMN), etc.], ainsi que, le cas 
échéant, des dispositifs de détection des substances chimiques radio ­
marquées ou non marquées. Lorsqu'on utilise des substances radio ­
marquées, un compteur à scintillation liquide et un appareil d'oxy ­
dation pour la combustion (pour la combustion des échantillons de 
sédiment avant l'analyse de radioactivité) sont également nécessaires.
 
D'autres équipements courants de laboratoire peuvent s'avérer néces ­
saires selon le cas pour effectuer des analyses physico-chimiques et 
biologiques (voir le tableau 1 du point 1.8.2.2), ainsi que de la verrerie, des produits chimiques et des réactifs.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1171  
( 1 ) Comme ces solutions d'absorption alcalines absorbent également le dioxyde de carbone 
de l'air de ventilation et de l'air formé par la respiration dans les expériences aérobies, il 
convient de les changer à intervalles réguliers afin d'éviter leur saturation et par consé ­
quent la perte de leur capacité d'absorption.
 1.8.2.  Sélection et nombre de sédiments aquatiques  
Les sites de prélèvement doivent être choisis en fonction de la fina ­
lité de l'essai dans une situation donnée. Pour choisir les sites de prélèvement, il convient de prendre en compte l'historique des éven ­
tuels apports agricoles, industriels ou domestiques dans le bassin 
versant et les eaux en amont. Les sédiments ne doivent pas être utilisés s'ils ont été contaminés par la substance d'essai ou ses analogues structuraux au cours des quatre années précédentes.
 
1.8.2.1.  Sélection des sédiments  
On utilise généralement deux sédiments pour les études aérobies (7). 
Les deux sédiments sélectionnés doivent différer en texture et en teneur en carbone organique. Un sédiment doit avoir une teneur 
élevée en carbone organique (2,5-7,5 %) et une texture fine, et 
l'autre doit avoir une teneur en carbone organique peu élevée (0,5- 2,5 %) et une texture grossière. La différence de teneur en carbone 
organique doit être normalement égale ou supérieure à 2 %. On 
entend par «texture fine» une teneur en [argile + limon] (
 1 ) > 
50 % et par «texture grossière» une teneur en [argile + limon] < 50 %. La différence de teneur [argile + limon] entre les deux sédi ­
ments doit être normalement égale ou supérieure à 20 %. Dans le cas 
où des substances chimiques risquent d'entrer également en contact avec les eaux de mer, au moins un des deux systèmes eau-sédiment doit être d'origine marine.
 
Pour l'étude strictement anaérobie, deux échantillons de sédiments 
(ainsi que la phase aqueuse associée) doivent être prélevés dans les zones anaérobies des systèmes à eaux de surface (7). Les sédiments 
comme les phases aqueuses doivent être manipulés et transportés 
avec précaution en évitant tout contact avec l'oxygène.
 
D'autres paramètres peuvent présenter de l'importance dans la sélec ­
tion des sédiments et ils doivent être envisagés cas par cas. Par exemple, le pH des sédiments est important pour tester les subs ­
tances chimiques dont la transformation et/ou la sorption peuvent 
être dépendantes du pH. La dépendance au pH de la sorption peut 
être une conséquence du pK
 a de la substance d'essai.  
1.8.2.2.  Caractérisation des échantillons eau-sédiment  
Les paramètres clés qui doivent être mesurés et notés dans le rapport 
(en indiquant la méthode utilisée) pour l'eau et pour le sédiment, 
ainsi que l'étape de l'essai à laquelle ces paramètres doivent être déterminés, sont résumés dans le tableau ci-dessous. Pour informa ­
tion, les méthodes de détermination de ces paramètres sont fournies 
sous les références (18) (19) (20) (21).
 
Par ailleurs, il peut être nécessaire de mesurer et d'enregistrer d'autres 
paramètres selon le cas [eau douce: particules, alcalinité, dureté, 
conductivité, NO  3 /PO  4 (rapport et valeurs individuelles); pour les 
sédiments: capacité d'échange cationique, capacité de rétention d'eau, carbonate, azote total et phosphore; pour les systèmes 
marins: salinité]. Il peut également être utile d'analyser les sédiments 
et l'eau pour mesurer le nitrate, le sulfate, le fer biodisponible, et d'autres accepteurs d'électrons peuvent aussi être utiles pour évaluer les conditions redox, notamment en ce qui concerne la transforma ­
tion anaérobie.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1172  
( 1 ) [Argile + limon] est la fraction minérale du sédiment de granulométrie < 50 μm.
 Paramètres mesurés pour la caractérisation des échantillons d'eau et de sédiment (7) (22) (23)  
Paramètre Étape de la procédure d'essai 
prélèvement 
sur site post-mani ­
pulation début de 
l'acclimata ­
tion début de 
l'essai pendant 
l'essai à la fin de 
l'essai  
Eau 
Origine/source x 
Température x pH x x x x x 
Carbone organique total x x x 
Concentration O
 2 * x x x x x 
Potentiel redox* x x x x  
Sédiment  
Origine/source x 
Profondeur de la couche x 
pH x x x x x 
Répartition de la taille des 
particules x 
Carbone organique total x x x x 
Biomasse microbienne (**) x x x 
Potentiel redox (*) Observa ­
tion (couleur/ odeur) x x x x
 
(*) Selon des résultats récents, les mesures des concentrations d'oxygène dans l'eau et des potentiels redox n'ont de valeur 
ni mécanique ni prédictive en ce qui concerne la croissance et le développement de colonies microbiennes dans les 
eaux superficielles (24) (25). La détermination de la demande biochimique en oxygène (lors du prélèvement, au début 
et à la fin de l'essai) et des concentrations de micro/macroéléments nutritifs Ca, Mg et Mn (au début et à la fin de 
l'essai) dans l'eau et la mesure du N total et du P total dans les sédiments (lors du prélèvement et à la fin de l'essai) 
peuvent être de meilleurs outils pour interpréter et évaluer les taux et les voies de biotransformation aérobie. 
(**) Méthode du taux de respiration microbienne (26), méthode de fumigation (27) ou mesures de numération (bactéries, 
actinomycètes, champignons et colonies totales) pour les études aérobies; taux de méthanogenèse pour les études 
anaérobies.  
1.8.3.  Prélèvement, manipulation et stockage  
1.8.3.1.  Prélèvement  
Il convient de se référer au projet de ligne directrice ISO sur 
l'échantillonnage des fonds sédimentaires (8) pour prélever les échantillons de sédiment. Les échantillons de sédiment doivent être prélevés sur la totalité de la couche supérieure de 5 à 
10 cm du sédiment. L'eau correspondante doit être collectée sur 
le même site ou dans le même lieu et en même temps que le sédiment. Pour l'étude anaérobie, le sédiment et l'eau correspon ­
dante doivent être prélevés et transportés en évitant tout contact 
avec l'oxygène (28) (voir le point 1.8.2.1). Quelques dispositifs 
d'échantillonnage sont décrits dans la littérature (8) (23).
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1173
 
1.8.3.2.  Manipulation  
Le sédiment est séparé de l'eau par filtration et passé au travers d'un 
tamis de 2 mm en utilisant l'eau excédentaire prélevée sur le même site qui est ensuite éliminée. Des quantités connues de sédiments et 
d'eau sont ensuite mélangées dans le rapport désiré (voir le point 
1.9.1) dans des flacons d'incubation et préparées pour la période d'acclimatation (voir le point 1.8.4). Pour l'étude anaérobie, toutes les étapes de la manipulation doivent être effectuées en l'absence 
d'oxygène (29) (30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3.  Stockage  
Il est vivement recommandé d'utiliser des sédiments et de l'eau fraî ­
chement prélevés, mais si le stockage est nécessaire, le sédiment et 
l'eau doivent être tamisés comme décrit ci-dessus et stockés ensem ­
ble, recouverts d'eau (couche d'eau de 6-10 cm), dans l'obscurité, à 4 ± 2
 o C 4 pendant une durée maximale de quatre semaines (7) (8) (23). 
Les échantillons destinés aux études aérobies doivent être stockés en 
laissant un accès libre à l'air (dans des récipients ouverts), alors que les échantillons destinés aux études anaérobies doivent être conservés en l'absence d'oxygène. Il ne faut pas que le sédiment et l'eau soient 
congelés ni que le sédiment sèche pendant le transport et le stockage.
 
1.8.4.  Préparation des échantillons de sédiment/eau pour l'essai  
Une période d'acclimatation doit être respectée avant d'ajouter la 
substance d'essai, au cours de laquelle chaque échantillon de sédi ­
ment/eau est placé dans le récipient d'incubation à utiliser dans l'essai 
principal, et l'acclimatation est réalisée exactement dans les mêmes conditions que l'incubation de l'essai (voir le point 1.9.1). La période d'acclimatation est le temps nécessaire pour atteindre une stabilité 
suffisante du système, en termes de pH, de concentration de l'oxy ­
gène dans l'eau, de potentiel redox du sédiment et de l'eau, et de séparation macroscopique des phases. La période d'acclimatation doit durer normalement de une à deux semaines et elle ne doit pas 
excéder quatre semaines. Le résultat des déterminations effectuées 
pendant cette période doit être enregistré.
 
1.9. RÉALISATION DE L'ESSAI  
1.9.1.  Conditions de l'essai  
L'essai doit être effectué dans le dispositif d'incubation (voir le point 
1.8.1) avec un rapport de volume eau/sédiment situé entre 3:1 et 4:1, et une couche sédimentaire de 2,5 cm (± 0,5 cm). (
 1 ) On recom ­
mande une quantité minimale de 50 g de sédiment (sur une base de 
poids sec) par récipient d'incubation.  
L'essai doit être effectué dans le noir à température constante dans la 
fourchette de 10 à 30  o C. La température indiquée est de 20 ± 2  o C. 
Le cas échéant, une température supplémentaire plus basse (10  o C 
par exemple) peut être envisagée selon le cas, en fonction de l'in ­
formation que l'on souhaite retirer de l'essai. La température d'incu ­
bation doit être surveillée et enregistrée.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1174  
( 1 ) Selon des études récentes, un stockage à 4  o C peut entraîner une diminution de la teneur 
en carbone organique du sédiment, ce qui risque d'entraîner une diminution de l'activité 
microbienne (34).
 1.9.2.  Traitement et application de la substance d'essai  
Une seule concentration d'essai de la substance chimique est 
utilisée (  1 ) Pour les produits phytosanitaires appliqués directement 
dans le milieu aquatique, le dosage maximal indiqué sur le mode 
d'emploi doit être pris comme taux maximal d'application calculé sur 
la base de la surface de l'eau dans le récipient d'essai. Dans tous les autres cas, la concentration à utiliser doit s'appuyer sur les estima ­
tions des émissions dans l'environnement. Il convient de veiller à 
appliquer une concentration de substance d'essai adéquate afin de 
caractériser la voie de transformation et la formation et le déclin des produits de transformation. Il peut être nécessaire d'appliquer 
des doses plus élevées (10 fois par exemple) dans le cas où les 
concentrations de la substance d'essai sont proches de la limite de détection au début de l'étude et/ou les principaux produits de trans ­
formation n'ont pas pu être facilement détectés à un taux égal à 10 % 
du taux d'application de la substance d'essai. Toutefois, si des 
concentrations d'essai plus élevées sont utilisées, celles-ci ne doivent pas avoir un effet négatif important sur l'activité microbienne du système eau-sédiment. Afin d'obtenir une concentration constante 
de la substance d'essai dans des récipients de dimensions différentes, 
il peut être indiqué d'ajuster la quantité de produit appliqué, en fonction de la profondeur de la colonne d'eau dans le récipient par rapport à la profondeur de l'eau dans le champ (que l'on suppose 
égale à 100 cm, mais on peut prendre une autre profondeur comme 
base). Voir l'annexe 4 pour un exemple de calcul.
 
Théoriquement, la substance d'essai doit être appliquée sous forme 
de solution aqueuse dans la phase aqueuse du système d'essai. S'il 
n'est pas possible de procéder autrement, on peut utiliser de faibles quantités de solvants miscibles avec l'eau (comme l'acétone ou l'étha ­
nol) pour appliquer et répartir la substance d'essai, mais ce solubili ­
sant ne doit pas dépasser 1 % v/v ni avoir d'effets négatifs sur 
l'activité microbienne du système d'essai. La solution aqueuse de la substance d'essai doit être préparée avec soin — afin d'assurer une homogénéité totale, on peut effectuer un prémélange et utiliser des 
colonnes de générateur. Après l'addition de la solution aqueuse au 
système d'essai, il est recommandé de remuer doucement la phase aqueuse en brassant le moins possible le sédiment.
 
Il n'est pas recommandé d'utiliser de manière routinière des produits 
formulés car les ingrédients de formulation risquent d'affecter la répartition de la substance d'essai et/ou des produits de transforma ­
tion entre la phase aqueuse et la phase sédimentaire. Toutefois, dans 
le cas de substances peu solubles dans l'eau, l'utilisation de matériau formulé peut être une solution de remplacement appropriée.
 
Le nombre de récipients d'incubation dépend du nombre de temps de 
prélèvement (voir le point 1.9.3). Un nombre suffisant de systèmes d'essai doit être prévu de façon à pouvoir sacrifier deux systèmes à chaque temps de prélèvement. Lorsqu'on utilise des unités témoins 
de chaque système sédimentaire aquatique, ces unités ne doivent pas 
être traitées avec la substance d'essai. Les unités témoins peuvent être utilisées pour déterminer la biomasse microbienne du sédiment et le carbone organique total de l'eau et du sédiment à la fin de 
l'étude. Deux unités témoins (une unité de chaque sédiment aqua ­
tique) peuvent être utilisées pour surveiller les paramètres requis dans le sédiment et dans l'eau pendant la période d'acclimatation (voir le tableau du point 1.8.2.2). Deux témoins supplémentaires 
doivent être ajoutés lorsque la substance d'essai est appliquée au 
moyen d'un solvant afin de mesurer les effets négatifs sur l'activité microbienne du système d'essai.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1175  
( 1 ) Il peut être utile d'effectuer un essai avec une deuxième concentration pour les substances 
chimiques qui atteignent les eaux superficielles par différentes voies d'entrée, ce qui 
entraîne des concentrations très différentes, dans la mesure où la concentration la plus 
faible peut être analysée avec une précision suffisante.
 1.9.3.  Durée de l'essai et échantillonnage  
L'expérience ne doit pas durer plus de 100 jours (6), et elle doit se 
poursuivre jusqu'à ce que les voies de dégradation et le profil de répartition eau/sédiment se soient établis ou lorsque 90 % de la 
substance d'essai s'est dissipée par transformation et/ou volatilisation. 
Le nombre de temps de prélèvement doit être au moins égal à six (y compris le temps zéro), et une étude préliminaire facultative (voir le point 1.9.4) est effectuée pour déterminer le régime de prélèvement 
et la durée de l'essai, à moins que l'on ne dispose de données suffi ­
santes sur la substance d'essai d'après les études antérieures. Pour les substances hydrophobes, il peut être nécessaire d'effectuer des points 
de prélèvement complémentaires pendant la période initiale afin de 
déterminer le taux de répartition entre la phase aqueuse et la phase sédimentaire.
 
À chaque temps de prélèvement, les récipients d'incubation (répli ­
cats) sont retirés pour analyse. Le sédiment et l'eau qui le recouvre 
sont analysés séparément (  1 ). L'eau de surface doit être retirée avec 
précaution en évitant autant que possible de toucher au sédiment. L'extraction et la caractérisation de la substance d'essai et des 
produits de transformation doivent suivre les procédures analytiques 
appropriées. Il faut prendre soin d'éliminer les matières adsorbées sur les parois du récipient d'incubation et dans les tuyaux utilisés pour piéger les produits volatils.
 
1.9.4.  Essai préliminaire facultatif  
S'il n'est pas possible de prévoir la durée et le régime d'échantillon ­
nage à partir d'autres études analogues sur la substance d'essai, il peut être indiqué d'effectuer un essai préliminaire, dans les mêmes 
conditions d'essai que les conditions proposées pour l'étude défini ­
tive. Si cet essai préliminaire est effectué, les conditions expérimen ­
tales et les résultats de l'essai doivent être décrits brièvement.
 
1.9.5.  Mesures et analyse  
La concentration de la substance d'essai et des produits de trans ­
formation à chaque temps de prélèvement dans l'eau et le sédiment 
doit être mesurée et enregistrée (en concentration et en pourcentage de la substance appliquée). En règle générale, tout produit de trans ­
formation détecté à > 10 % de la radioactivité totale appliquée au 
système eau/sédiment, quel que soit le temps de prélèvement, doit 
être identifié, à moins d'une justification suffisante. Les produits de transformation dont les concentrations sont en augmentation constante pendant la durée de l'étude doivent également être identi ­
fiés, même si leurs concentrations ne dépassent pas les limites indi ­
quées ci-dessus, car cela peut indiquer une persistance. Des justifi ­
cations doivent être fournies dans le rapport.
 
Les résultats des systèmes de piégeage des gaz/volatils (CO  2 et 
autres, à savoir les composés organiques volatils) doivent être enre ­
gistrés à chaque temps de prélèvement. Les taux de minéralisation doivent être enregistrés. Les résidus (liés) non extractibles dans le 
sédiment doivent être notés à chaque temps de prélèvement.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1176  
( 1 ) Dans le cas où les produits de transformation anaérobie peuvent se réoxyder très rapi ­
dement, les conditions anaérobies doivent être maintenues pendant l'échantillonnage et 
l'analyse.
 2. DONNÉES  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
Le bilan massique total ou la récupération (voir le point 1.7.1) de la 
radioactivité ajoutée doit être calculé à chaque temps de prélèvement. 
Les résultats doivent être transcrits en pourcentage de radioactivité 
ajoutée. La répartition de la radioactivité entre l'eau et le sédiment doit être transcrite sous la forme de concentration et de pourcentage, à chaque temps de prélèvement.
 
La demi-vie, les valeurs DT  50 et, le cas échéant, DT  75 et DT  90 de la 
substance d'essai doivent être calculées avec leurs limites de confiance (voir le point 1.7.3). Différents outils d'évaluation permet ­
tent d'obtenir des informations sur le taux de dégradation de la subs ­
tance d'essai dans l'eau et le sédiment. Il est possible d'appliquer des cinétiques du pseudo premier ordre, des techniques d'interpolation empiriques utilisant des solutions graphiques ou numériques ou d'au ­
tres méthodes d'évaluation utilisant par exemple des modèles à un ou 
plusieurs compartiments. On trouvera plus de détails dans la littéra ­
ture spécialisée (35) (36) (37).
 
Toutes les méthodes ont leurs avantages et leurs inconvénients et 
leur complexité varie considérablement. L'hypothèse d'une cinétique 
du premier ordre peut être une simplification trop poussée des processus de dégradation et de répartition, mais cette hypothèse, 
lorsque c'est possible, donne un terme (la constante de vitesse ou 
la demi-vie) facilement compréhensible et très utile en modélisation par simulation et pour calculer les concentrations prévisibles dans l'environnement. Les méthodes empiriques ou les transformations 
linéaires peuvent produire une meilleure interpolation entre les 
courbes et les données et permettre ainsi une meilleure estimation des demi-vies, des valeurs DT
 50 et, le cas échéant, DT  75 et DT  90 . 
L'utilisation des constantes dérivées est toutefois limitée. Les 
modèles à compartiments servent à établir des constantes utiles 
pour l'évaluation des risques qui décrivent la vitesse de dégradation dans les différents compartiments et la répartition de la substance chimique. Ils doivent également être utilisés pour estimer les 
constantes de vitesse de formation et de dégradation des principaux 
produits de transformation. Dans tous les cas, la méthode choisie doit être justifiée et l'expérimentateur doit démontrer graphiquement et/ou statistiquement la qualité de l'ajustement.
 
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport doit comprendre les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— nom courant, nom chimique, numéro de fichier CAS, formule 
structurale (indiquant la position du marquage lorsqu'on utilise un produit radiomarqué) et propriétés physico-chimiques pertinentes,
 
— pureté (impuretés) de la substance d'essai,  
— pureté radiochimique de la substance marquée et activité molaire 
(s'il y a lieu).  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1177
 
Substances de référence:  
— nom et structure chimique des substances de référence utilisées 
pour caractériser et/ou identifier les produits de transformation.  
Sédiments et eaux d'essai:  
— localisation et description du (ou des) site(s) de prélèvement des 
sédiments aquatiques avec, si possible, l'historique de la conta ­
mination,  
— toute information relative au prélèvement, au stockage (s'il y a 
lieu) et à l'acclimatation des systèmes eau-sédiment,  
— caractéristiques des échantillons eau-sédiment telles qu'indiquées 
dans le tableau du point 1.8.2.2.  
Conditions de l'essai:  
— système d'essai utilisé (circulation continue, biomètre, mode de 
ventilation, méthode de remuage, volume d'eau, masse sédimen ­
taire, épaisseur de la couche d'eau et de la couche de sédiment, dimension des récipients d'essai, etc.),
 
— application de la substance d'essai au système: concentration 
utilisée, nombre de réplicats et de témoins, mode d'application 
de la substance d'essai (usage éventuel de solvant), etc.,  
— température d'incubation,  
— temps de prélèvement,  
— méthodes d'extraction, rendements et limites de détection des 
méthodes analytiques,  
— méthodes de caractérisation/identification des produits de trans ­
formation,  
— modification du protocole d'essai ou des conditions de l'essai 
pendant l'étude.  
Résultats:  
— données brutes des analyses représentatives (toutes les données 
brutes doivent être conservées dans les archives BPL),  
— reproductibilité et sensibilité des méthodes analytiques utilisées,  
— taux de récupération (les % acceptables pour valider une étude 
sont présentés au point 1.7.1),  
— tableaux des résultats exprimés en % de la dose appliquée et en 
mg.kg  -1 dans l'eau, le sédiment et le système total (% unique ­
ment) de la substance d'essai et, s'il y a lieu, des produits de transformation et de la radioactivité non extractible,
 
— bilan massique pendant la durée et à la fin des expériences,  
— représentation graphique de la transformation dans les fractions 
eau/sédiment et dans le système total (y compris la minéralisa ­
tion),  
— taux de minéralisation,  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1178
 
— durée de demi-vie, DT  50 et, le cas échéant, valeurs DT  75 et DT  90 
de la substance d'essai et, s'il y a lieu, des principaux produits de 
transformation comprenant les limites de confiance dans l'eau, le sédiment et dans le système total,
 
— une évaluation de la cinétique de transformation de la substance 
d'essai et, le cas échéant, des principaux produits de transforma ­
tion, 
— voie de transformation proposée, le cas échéant,  
— discussion des résultats.  
4. RÉFÉRENCES  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment System. Germany.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for 
registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the 
product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water Systems. Ref No SC 9046. United 
Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic 
(Laboratory) — Anaerobic and aerobic. Canada. p. 35-37.  
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anae ­
robic aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.  
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18-20 January 1995.  
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 
12: Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
 
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, p. 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988). 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosys ­
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(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, p. 631-637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, p. 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17  th edition). American Public Health 
Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
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(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, p. 1038- 1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in fresh water mesocosms. From the Workshop «A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests», 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and 
marine environments. From the Workshop On Sediment Toxi ­
city Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 
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(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
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nitrifying waters. Environ. Toxicol, p. 329-338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations 
under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, p. 197-203.  
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality — Determination of soil 
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(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen, (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), p. 13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, p. 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
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(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegra ­
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(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, p. 3597-3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
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EPA 712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contain. Toxicol. 58, p. 961-968.
 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 39, p. 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of 
pesticide residues I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 33, p. 47-60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pestici- des in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference — Pest and Diseases, p. 1349- 1354.
 ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1181
 
Annexe 1  
INFORMATIONS SUR LES SYSTÈMES D'ESSAI AÉROBIES ET 
ANAÉROBIES  
Système d'essai aérobie  
Le système d'essai aérobie décrit dans la présente méthode d'essai se compose 
d'une couche d'eau aérobie (généralement la concentration d'oxygène varie entre 
7 et 10 mg.1  –1 ) et une couche de sédiment, aérobie à la surface et anaérobie sous 
la surface [généralement, le potentiel redox moyen (E  h ) dans la zone anaérobie 
du sédiment est situé entre –80 et –190 mV]. On fait passer de l'air humide à la 
surface de l'eau dans chaque unité d'incubation afin de maintenir suffisamment 
d'oxygène dans l'espace libre.  
Système d'essai anaérobie  
Dans le système d'essai anaérobie, la méthode d'essai est pratiquement la même 
que celle du système aérobie, à l'exception que l'on fait passer de l'azote humide 
à la surface de l'eau dans chaque unité d'incubation afin de maintenir un espace libre d'azote. Le sédiment et l'eau sont considérés comme anaérobies lorsque le potentiel redox (E
 h ) est inférieur à –100 mV.  
Dans l'essai anaérobie, l'évaluation de la minéralisation comprend la mesure du 
dioxyde de carbone et du méthane dégagé.  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1182
 
Annexe 2  
EXEMPLE D'APPAREIL À CIRCULATION CONTINUE
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1183
 
Annexe 3  
EXEMPLE DE BIOMÈTRE
  ▼B 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1184
 
Annexe 4  
EXEMPLE DE CALCUL DE LA DOSE À APPLIQUER AUX 
RÉCIPIENTS D'ESSAI  
Diamètre interne du cylindre: = 8 cm 
Profondeur de la colonne d'eau excluant le 
sédiment: = 12 cm 
Surface: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Taux d'application: 500 g de substance d'essai/ 
ha correspondant à 5 μg/cm  2 
Total en μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Ajuster la quantité par rapport à la quantité 
correspondant à une profondeur de 100 cm: 12 × 251,5 ÷100 = 30,18 μg 
Volume de la colonne d'eau: 50,3 × 12 = 603 ml 
Concentration dans l'eau: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml ou 50 μg/l
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C.25.  MINÉRALISATION AÉROBIE DANS LES EAUX SUPER ­
FICIELLES — ESSAI DE SIMULATION DE LA BIODÉGRA ­
DATION  
1. MÉTHODE  
Cette méthode est équivalente à la ligne directrice TG 309 (2004) de 
l’OCDE (1).  
1.1. INTRODUCTION  
Cet essai est destiné à mesurer la biodégradation en fonction du 
temps d'une substance d'essai présente en faible concentration dans 
une eau naturelle aérobie et à quantifier les observations sous la 
forme d'expressions cinétiques. Cet essai de simulation, réalisé en laboratoire avec des lots de flacons agités, sert à déterminer les vitesses de biodégradation aérobie de substances organiques dans 
des échantillons d'eaux naturelles de surface (douces, saumâtres 
ou marines). Il s'appuie sur la norme ISO/DIS 14592-1 (2) et reprend également des éléments des méthodes d’essai C.23 et C.24 (3)(4). Si l'essai dure longtemps, le procédé en lots peut 
être remplacé par un processus semi-continu, afin de prévenir la 
détérioration du microcosme expérimental. L'essai de simulation vise principalement à déterminer la minéralisation de la substance d'essai dans les eaux de surface, minéralisation qui est à la base de 
l'expression cinétique de la dégradation. Néanmoins, l'essai permet 
aussi, si on le souhaite, d'obtenir des renseignements sur la dégra ­
dation primaire et la formation des principaux produits de transfor ­
mation. L'identification des produits de transformation et, si possible, 
la quantification de leurs concentrations, sont particulièrement impor ­
tantes pour les substances qui se minéralisent très lentement (par exemple, dont la demi-vie du
 14 C résiduel total dépasse soixante 
jours). L'identification et la quantification des principaux produits 
de transformation réclament normalement des concentrations plus élevées de la substance d'essai (par exemple, > 100 μg/l), en 
raison des limites analytiques.
 
Dans cet essai, on entend par faible concentration (par exemple, 
inférieure à 1 μg/l et jusqu’à 100 μg/l), une concentration suffisam ­
ment faible pour que la cinétique de biodégradation obtenue au cours 
de l'essai reflète les cinétiques que l'on s'attend à trouver dans l«en ­
vironnement. Comparée à la masse totale des substrats carbonés biodégradables présents dans l'eau naturelle utilisée pour l»essai, la substance d'essai en faible concentration servira de 
substrat secondaire. Cela implique que la cinétique de biodégradation 
attendue soit de premier ordre (cinétique de «non-croissance») et que la substance d'essai puisse être dégradée par «cométabolisme». Une cinétique de premier ordre signifie que la vitesse de dégradation 
(mg/l/jour) est proportionnelle à la concentration du substrat qui 
diminue au cours du temps. Avec une véritable cinétique de premier ordre, la constante spécifique de la vitesse de dégradation, k, est indépendante du temps et de la concentration. Autrement dit, k 
ne varie pas sensiblement au cours d'une expérience et ne se modifie 
pas avec l'augmentation de la concentration entre les expériences. Par définition, la constante spécifique de la vitesse de dégradation est égale au changement relatif de concentration par unité de temps: k = 
(1/C) . (dC/dt). Bien qu'il faille normalement s'attendre à une ciné ­
tique de premier ordre dans les conditions prescrites, il se peut que d'autres cinétiques soient plus appropriées dans certaines circons ­
tances. Des écarts par rapport à la cinétique de premier ordre 
peuvent s'observer si, par exemple, un phénomène de transfert de 
masse, tel que la vitesse de diffusion, plutôt que la vitesse de réac ­
tion biologique, freine la biotransformation. Cependant, les résultats peuvent presque toujours être décrits par une cinétique de pseudo- 
premier ordre acceptant une constante de vitesse dépendante de la 
concentration.
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Avant d'entamer l'essai, il faudrait disposer d'informations sur la 
biodégradabilité de la substance d'essai aux concentrations supé ­
rieures (tirées, par exemple, d'essais préliminaires standard) et de données sur la dégradabilité abiotique, les produits de transformation et les propriétés physico-chimiques pertinentes, afin de mieux plani ­
fier l'essai et de faciliter l’interprétation des résultats. L'utilisation de 
substances d'essai marquées au
 14 C et la détermination de la répar ­
tition du  14 C entre les phases à la fin de l'essai permettent de déter ­
miner la biodégradabilité finale. Si on utilise une substance d'essai 
non marquée, la biodégradation finale ne peut être estimée que si une 
concentration supérieure est mise à l'essai et si tous les principaux produits de transformation sont connus.
 
1.2. DÉFINITIONS  
Biodégradation primaire : transformation structurelle d'une subs ­
tance chimique par des microorganismes, débouchant sur la perte 
de l'identité chimique.  
Biodégradation fonctionnelle : transformation structurelle d'une 
substance chimique par des microorganismes, entraînant la perte 
d'une propriété spécifique.  
Biodégradation aérobie finale : décomposition d'une substance 
chimique par des microorganismes, en présence d'oxygène, en 
dioxyde de carbone, eau et sels minéraux des autres éléments présents (minéralisation) et production d'une nouvelle biomasse et de produits organiques par synthèse biomicrobienne.
 
Minéralisation : décomposition d'une substance chimique ou de 
matières organiques par des microorganismes, en présence d'oxy ­
gène, en dioxyde de carbone, eau et sels minéraux des autres 
éléments présents.  
Phase de latence : période comprise entre le début de l'essai et le 
moment où le degré de biodégradation d'une substance chimique ou 
de la matière organique atteint une valeur détectable (par exemple, 
10 % de la biodégradation théorique maximale, ou moins, selon la précision de la technique de mesure) et durant laquelle les microor ­
ganismes dégradants s'adaptent.
 
Degré maximal de biodégradation : degré de biodégradation d'une 
substance chimique ou de la matière organique, au cours d'un essai, enregistré en pourcentage, au delà duquel la biodégradation ne se 
produit plus durant l'essai.
 
Substrat primaire : ensemble de sources de carbone naturel et 
d'énergie grâce auxquelles la biomasse microbienne croît et se main ­
tient.  
Substrat secondaire : élément du substrat présent à une concentra ­
tion si faible que sa dégradation ne fournit que des quantités négli ­
geables de carbone et d'énergie aux microorganismes compétents, en 
comparaison avec l'apport de carbone et d'énergie que les microor ­
ganismes tirent de la dégradation des principaux composés du subs ­
trat (substrats primaires).  
Constante de vitesse de dégradation : constante de vitesse corres ­
pondant à une cinétique de premier ordre ou de pseudo-premier ordre, k (jour
 –1 ), indiquant la vitesse des processus de dégradation. 
Dans un essai en lots, k est estimé à partir de la première partie de la 
courbe de dégradation, débutant juste après la fin de la phase de 
latence.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1187
 
Demi-vie, t  1/2 (jour) : caractérise la vitesse d'une réaction de premier 
ordre; c'est le laps de temps durant lequel la concentration diminue 
d'un facteur 2. La relation entre la demi-vie et la constante de vitesse de dégradation est régie par l'équation: t
 1/2 = ln2/k.  
Demi-temps de dégradation, TD  50 (jour) : quantifie le résultat des 
essais de biodégradation; c'est le laps de temps, incluant la phase de 
latence, nécessaire pour atteindre 50 % de biodégradation.  
Seuil de détection et seuil de quantification : le seuil de détection 
est la concentration d'une substance en dessous de laquelle il n'est plus possible de distinguer l'identité de la substance des artéfacts de 
la technique d'analyse. Le seuil de quantification est la concentration 
d'une substance en dessous de laquelle la concentration ne peut être déterminée avec une précision acceptable.
 
Carbone organique dissous (COD) : fraction du carbone organique 
présent dans un échantillon d'eau qui ne peut être extraite par une 
technique de séparation des phases définie, par exemple par centri ­
fugation à 40 000 ms  –2 durant 15 minutes ou par filtration sur une 
membrane dont les pores mesurent entre 0,20 et 0,45 μm de diamè ­
tre. 
Activité totale du  14 C organique (AOT) : activité totale du  14 C 
associé au carbone organique.  
Activité du  14 C organique dissous (AOD) : activité totale du  14 C 
associé au carbone organique dissous.  
Activité du  14 C organique particulaire (AOP) : activité totale du  
14 C associé au carbone organique particulaire.  
1.3. APPLICABILITÉ DE L'ESSAI  
Cet essai de simulation s'applique aux substances organiques non 
volatiles ou légèrement volatiles testées à de faibles concentrations. Si l'on utilise des flacons ouverts à l'atmosphère (par exemple, 
fermés par des tampons d'ouate), les substances dont les constantes 
de Henry sont inférieures à environ 1 Pa.m
 3 /mol 
(approximativement 10  –5 atm.m  3 /mol) peuvent être considérées 
comme non volatiles en pratique. En utilisant des flacons fermés 
pourvus d'un espace libre au-dessus du liquide, il est possible de 
mettre à l'essai des substances légèrement volatiles (avec des constantes de Henry < 100 Pa.m
 3 /mol ou < 10  –3 atm.m  3 /mol) sans 
que le système expérimental ne fuie. Des pertes de substances 
marquées au  14 C peuvent se produire si les précautions requises ne 
sont pas prises, lors de l'extraction du CO  2 . Dans ces situations, il 
peut être nécessaire de piéger le CO  2 dans un absorbeur interne 
renfermant un produit alcalin ou d'utiliser un dispositif externe d'ab ­
sorption du CO  2 (détermination directe du  14 CO 2 ; voir annexe 3). 
Pour la détermination de la cinétique de biodégradation, les concen ­
trations de la substance d'essai doivent être inférieures à la solubilité 
de cette dernière dans l'eau. Remarquons, toutefois, que les valeurs 
d'hydrosolubilité mentionnées dans les publications peuvent dépasser de beaucoup la solubilité de la substance d'essai dans les eaux natu ­
relles. Il est possible, le cas échéant, de déterminer la solubilité des 
substances d'essai particulièrement peu solubles dans l'eau en utili ­
sant les eaux naturelles mises à l'essai.
 
La méthode permet de simuler la biodégradation dans des eaux 
superficielles exemptes de particules grossières («essai pélagique») ou dans des eaux superficielles troubles, comme celles qui peuvent 
se trouver à proximité d'une interface eau-sédiments («essai en 
suspension de sédiments»).
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1188
 
1.4. PRINCIPE DE L'ESSAI  
On réalise l'essai par lots, en incubant la substance d'essai dans l'eau 
superficielle uniquement («essai pélagique»), ou dans l'eau superficielle enrichie d'une suspension de solides/sédiments de 0,01 à 1 g/l de poids 
sec («essai en suspension de sédiments») pour simuler un plan d'eau 
contenant des solides en suspension ou des sédiments resuspendus. La plupart des eaux superficielles renferment des solides/sédiments en suspension à une concentration correspondant aux valeurs inférieures 
de cette gamme. Les flacons d'essai sont incubés dans l'obscurité à la 
température de l'environnement étudié, en aérobiose et sous agitation. Il faut utiliser au moins deux concentrations différentes de la substance 
d'essai pour déterminer la cinétique de dégradation. Les concentrations 
devraient être espacées d'un facteur de 5 à 10 et représenter la gamme de concentrations supposée régner dans l'environnement. La concentration maximale de la substance d'essai ne devrait pas excéder 100 μg/l, mais il 
est préférable d'appliquer des concentrations maximales inférieures 
à 10 μg/l pour s'assurer que la biodégradation obéit à une cinétique de 
premier ordre. La concentration la plus faible ne devrait pas dépasser 10 μg/l, mais il vaut mieux choisir une concentration minimale de 1 
à 2 μg/l ou inférieure à 1 μg/l. En règle générale, une concentration 
aussi faible peut être correctement analysée en utilisant des substances marquées au
 14 C vendues dans le commerce. Compte tenu des limites 
analytiques, il est souvent impossible de mesurer la concentration de la 
substance d'essai avec la précision requise si cette substance est appli ­
quée à une concentration ≤ 100 μg/l (voir deuxième alinéa du 
paragraphe 1.7.2). Des concentrations plus élevées de la substance d'essai (>100 μg/l et quelquefois > 1 mg/l) peuvent être utilisées pour 
l'identification et la quantification des principaux produits de transfor ­
mation, ou s'il n'existe pas de méthode d'analyse spécifique pourvue d'un seuil de détection bas. En testant des concentrations élevées de la subs ­
tance d'essai, on risque de ne pas pouvoir utiliser les résultats pour 
estimer la constante de dégradation de premier ordre et la demi-vie, 
car la dégradation n'obéira probablement pas à une cinétique de premier ordre.
 
La dégradation est suivie, à des intervalles de temps appropriés, par 
la mesure du  14 C résiduel ou de la concentration résiduelle de la 
substance d'essai lorsqu'on utilise une méthode spécifique d'analyse 
chimique. Le marquage au  14 C de la partie la plus stable de la 
molécule permet de déterminer la minéralisation totale, tandis que le marquage d'une partie moins stable de la molécule, de même que le recours à une analyse spécifique, ne permettra d'évaluer que la 
biodégradation primaire. Néanmoins, la partie la plus stable n'inclut 
pas nécessairement le groupement fonctionnel pertinent de la molé ­
cule (qui peut lui conférer une propriété particulière, telle que la toxicité, la bioaccumulation, etc.). Si c'est le cas, il peut être utile 
d'utiliser une substance d'essai, marquée au
 14 C, dans le groupement 
fonctionnel, afin de suivre l'élimination de la propriété particulière.  
1.5. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Cet essai convient aussi bien aux substances radiomarquées qu’aux 
substances non marquées. Le marquage recommandé est celui au  14 C 
et devrait normalement s'effectuer sur la ou les parties les plus stables de la molécule (voir également paragraphe 1.4). Pour les substances renfermant plus d’un cycle aromatique, il est préférable 
de marquer un ou plusieurs atomes de carbone de chaque cycle. En 
outre, il est préférable de marquer au
 14 C un ou plusieurs atomes de 
carbone situés de part et d'autre d'une liaison chimique facilement dégradable. La pureté chimique et/ou radiochimique de la substance 
d'essai devrait être supérieure à 95 %. En ce qui concerne les subs ­
tances radiomarquées, une activité spécifique d'au moins quelque 50 μCi/mg (1,85 MBq) est préférable pour faciliter la mesure du
 
14 C dans les essais réalisés avec de faibles concentrations initiales. 
Les informations suivantes sur la substance d'essai devraient être 
connues:  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1189
 
— solubilité dans l'eau [méthode A.6],  
— solubilité dans un ou plusieurs solvants organiques (substances 
appliquées avec un solvant ou peu solubles dans l'eau),  
— constante de dissociation (pKa) si la substance est sujette à la 
protonation ou à la déprotonation [ligne directrice TG 112 de 
l'OCDE] (5),  
— pression de vapeur [méthode A.4] et constante de Henry,  
— stabilité chimique dans l'eau et dans l'obscurité (hydrolyse) 
[méthode C.7].  
Si des substances peu solubles dans l'eau sont mises à l'essai dans de 
l'eau de mer, il peut aussi être utile de connaître la constante de 
désalination (ou «constante de Setschenow») Ks, définie par l'expres ­
sion suivante: log (S/S') = K  s . C m , où S et S' représentent respecti ­
vement la solubilité de la substance dans l'eau douce et dans l'eau de 
mer, et C  m la concentration molaire des sels.  
Si l'essai est un «essai en suspension de sédiments», on devrait 
également disposer des informations suivantes:  
— coefficient de partage n-octanol/eau [méthode A.8],  
— coefficient d’adsorption [méthode C.18],  
Parmi les autres renseignements utiles, citons:  
— la concentration dans la nature, si elle est connue ou estimée,  
— la toxicité de la substance d'essai pour les microorganismes 
[méthode C.11],  
— la biodégradabilité immédiate et/ou intrinsèque [méthodes C.4 A- 
F, C.12, C.9, ligne directrice TG 302 de l’OCDE (5)],  
— la biodégradabilité aérobie ou anaérobie dans le sol et les études 
de transformation sédiment/eau [méthodes C.23, C.24].  
1.6. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Il convient d'utiliser une substance de référence qui, normalement, se 
dégrade facilement en aérobiose (aniline ou benzoate de sodium, par 
exemple). La dégradation de l'aniline et du benzoate de sodium prend généralement moins de deux semaines. L'emploi de substances de référence sert à vérifier que l'activité microbienne de l'eau d'essai 
se situe dans une certaine gamme, autrement dit, que l'eau renferme 
une flore microbienne active.
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1.7. CRITÈRES DE QUALITÉ  
1.7.1.  Récupération  
Immédiatement après l'ajout de la substance d'essai, chaque concen ­
tration expérimentale initiale devrait être vérifiée par une mesure de 
l'activité du  14 C, ou par des analyses chimiques s'il s'agit de subs ­
tances non marquées, dans au moins deux échantillons. Cette mesure nous renseigne sur l'applicabilité et la répétabilité de la méthode d'analyse et sur l'homogénéité de la répartition de la substance d'es ­
sai. Normalement, on utilise l'activité du
 14 C initiale mesurée, équi ­
valant à la concentration de la substance d'essai, dans les analyses ultérieures des résultats plutôt que la concentration nominale, ce qui 
compense les pertes par sorption et les erreurs de dosage. Pour les 
substances d'essai marquées au
 14 C, le taux de récupération à la fin 
de l'expérience est fourni par le bilan massique (voir dernier alinéa du paragraphe 1.8.9.4). Idéalement, le bilan massique radiomarqué 
devrait se situer entre 90 % et 110 %, tandis que la méthode d'ana ­
lyse devrait donner un taux de récupération initial compris entre 70 % et 110 % pour les substances d'essai non marquées. Ces inter ­
valles sont donnés à titre indicatif et ne devraient pas servir de 
critères d'acceptation pour l'essai. On peut, si on le souhaite, déter ­
miner l'exactitude de la méthode d'analyse pour la substance d'essai à une concentration inférieure à la concentration initiale et pour les principaux produits de transformation.
 
1.7.2.  Répétabilité et sensibilité de la méthode analytique  
La répétabilité de la méthode analytique (notamment l'efficacité de 
l'extraction initiale) pour quantifier la substance d'essai, et les produits de transformation le cas échéant, devrait être vérifiée par 
cinq analyses identiques d'extraits de l'eau superficielle.
 
Le seuil de détection de la méthode analytique pour la substance 
d'essai et les produits de transformation devrait, si possible, atteindre 
au moins 1 % de la quantité introduite initialement dans le système 
expérimental. La limite de quantification devrait être inférieure ou égale à 10 % de la concentration appliquée. Les analyses chimiques de nombreuses substances organiques et de leurs produits de trans ­
formation exigent souvent des concentrations relativement élevées de 
la substance d'essai, à savoir > 100 μg/l.
 
1.8. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI  
1.8.1.  Matériel  
L'essai peut être effectué dans des flacons cylindriques ou coniques 
d'une capacité adéquate (0,5 ou 1,0 litre, par exemple), fermés par des bouchons en silicone ou en caoutchouc, ou dans des bouteilles à 
sérum munies de couvercles étanches au CO
 2 (avec des bouchons 
cloisonnés (septa) en caoutchouc butylique, par exemple). Une autre possibilité consiste à pratiquer l'essai avec plusieurs flacons et à prélever des flacons entiers (au moins deux identiques) à chaque 
intervalle de prélèvement (voir dernier alinéa du 
paragraphe 1.8.9.1). Pour les substances d'essai non volatiles et non radiomarquées, il n'est pas nécessaire d'employer des bouchons ou des couvercles étanches aux gaz; des tampons d'ouate empêchant 
la contamination par l'air suffisent (voir deuxième alinéa du 
paragraphe 1.8.9.1). Les substances légèrement volatiles devraient être testées dans un système de type biomètre fournissant une agita ­
tion douce à la surface de l'eau. Si l'on veut être sûr d'empêcher toute 
contamination bactérienne, on peut éventuellement stériliser les réci ­
pients en les chauffant ou en les autoclavant avant l'emploi. En outre, les instruments courants de laboratoire suivants sont nécessaires:
 
— une table tournante ou des agitateurs magnétiques pour agiter en 
continu les flacons expérimentaux,  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1191
 
— une centrifugeuse,  
— un pH-mètre,  
— un turbidimètre pour les mesures néphélométriques de la 
turbidité,  
— un four ou un four à micro-ondes pour les déterminations pondé ­
rales,  
— un appareil de filtration à membrane,  
— un autoclave ou un four pour stériliser la verrerie,  
— des instruments permettant de manipuler les substances 
marquées au  14 C, 
— un appareil permettant de quantifier l'activité du  14 C dans des 
échantillons de solutions piégeant le CO  2 et, si nécessaire, dans 
des échantillons de sédiment,  
— des instruments analytiques pour doser la substance d'essai (et de 
référence) si l'on pratique une analyse chimique spécifique (chro ­
matographie en phase gazeuse, en phase liquide à haute pression, 
par exemple).  
1.8.2.  Solutions mères de la substance d'essai  
Les solutions mères de la substance d'essai et de la substance de 
référence sont préparées avec de l'eau désionisée (voir premier alinéa du paragraphe 1.8.7). L'eau désionisée devrait être exempte de subs ­
tances susceptibles d'être toxiques pour les microorganismes et la 
teneur en carbone organique dissous (COD) ne devrait pas dépasser 
1 mg/l (6).
 
1.8.3.  Prélèvement et transport de l'eau de surface  
Quelle que soit la situation, le site de prélèvement de l'eau super ­
ficielle sera choisi en fonction de la finalité de l'essai. Il faut se renseigner sur le déversement antérieur d'éventuels effluents agri ­
coles, industriels ou domestiques et en tenir compte dans la sélection 
du site. S'il s'avère qu'un milieu aquatique a été contaminé par la substance d'essai ou l'un de ses analogues de structure au cours des quatre dernières années, l'eau d'essai ne doit pas y être prélevée, à 
moins que l'expérimentateur n'étudie précisément la vitesse de dégra ­
dation dans des sites précédemment exposés. Le pH et la température de l'eau sont à mesurer sur le lieu de prélèvement. On notera égale ­
ment la profondeur de prélèvement et l'aspect de l'échantillon d'eau 
(couleur et turbidité, par exemple) (voir paragraphe 3). Il faut 
mesurer la concentration d'oxygène et/ou le potentiel redox dans l'eau et dans la couche superficielle du sédiment afin de démontrer l'aérobiose, sauf si cette condition est patente à en juger par l'appa ­
rence et une connaissance préalable du site. L'eau superficielle doit 
être transportée dans un récipient très bien nettoyé. Durant le trans ­
port, la température de l'échantillon n'excédera guère la température appliquée dans l'essai. Le refroidissement à 4 °C est recommandé si 
le transport dure plus de deux ou trois heures. Il ne faut pas congeler 
l'échantillon d'eau.
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1.8.4.  Stockage et préparation de l'eau superficielle  
Il est préférable de commencer l'essai au plus tard le lendemain du 
prélèvement de l'échantillon. Le cas échéant, le stockage de l'eau sera réduit au minimum et n'excédera en aucun cas quatre semaines. 
L'échantillon d'eau devrait être conservé à 4 °C, sous aération, 
jusqu'à utilisation. Les particules grossières devront être éliminées de l'échantillon d'eau avant son utilisation, par exemple par filtration à travers une toile de nylon dont les mailles mesurent quelque 
100 μm ou un papier filtre grossier, ou par sédimentation.
 
1.8.5.  Préparation de l'eau additionnée de sédiment (facultatif)  
Pour l'essai en suspension de sédiment, on ajoute le sédiment super ­
ficiel aux flacons contenant l'eau naturelle (filtrée pour être exempte de particules grossières, comme décrit au paragraphe 1.8.4), afin 
d'obtenir une suspension; la concentration des solides suspendus 
devrait être comprise entre 0,01 et 1 g/l. Le sédiment superficiel devrait provenir du même site que l'échantillon d'eau. Suivant les particularités du milieu aquatique, le sédiment superficiel peut se 
caractériser soit par une teneur élevée en carbone organique (2,5- 
7,5 %) et une texture fine, soit par une faible teneur en carbone organique (0,5-2,5 %) et une texture grossière (3). Le sédiment superficiel peut être préparé de la façon suivante: extraire plusieurs 
carottes de sédiment au moyen de tubes en plastique transparent, 
découper les tranches contenant les couches supérieures aérobies (à une profondeur maximale de 5 mm à partir de la surface) immédia ­
tement après le prélèvement, et les réunir. L'échantillon de sédiment 
ainsi obtenu devrait être transporté dans un récipient muni d'un vaste 
espace libre au-dessus du contenu, de façon à maintenir le sédiment en aérobiose (refroidir à 4 °C si le transport dure plus de deux à trois heures). L'échantillon de sédiment devrait être suspendu dans 
l'eau d'essai dans une proportion de 1/10 et conservé à 4 °C sous 
aération jusqu'à son utilisation. Le cas échéant, le stockage du sédi ­
ment sera réduit au minimum et n'excédera en aucun cas quatre semaines.
 
1.8.6.  Procédé semi-continu (facultatif)  
Une incubation prolongée (plusieurs mois) peut s’avérer nécessaire 
lorsqu’il s’écoule une longue période de latence avant qu’il ne soit 
possible de mesurer une dégradation sensible de la substance d'essai. Si des expérimentations antérieures ont révélé que tel était le cas de la substance d'essai, l'essai peut débuter par un procédé semi-continu 
qui permet le renouvellement périodique d'une partie de l'eau ou de 
la suspension d'essai (voir annexe 2). Par ailleurs, l'essai normal par lots peut être converti en essai semi-continu si aucune dégradation de la substance d'essai n'est observée après une soixantaine de jours 
d'essai (voir deuxième alinéa du paragraphe 1.8.8.3).
 
1.8.7.  Ajout de la substance d'essai (ou de référence)  
Pour les substances dont l'hydrosolubilité est élevée (> 1 mg/l) et la 
volatilité faible (constante de Henry < 1 Pa.m  3 /mol ou 
< 10  –5 atm.m  3 /mol), la solution mère peut être préparée dans de 
l'eau désionisée (voir paragraphe 1.8.2): on verse le volume néces ­
saire de solution mère dans les récipients expérimentaux pour obtenir 
la concentration voulue. Le volume de solution mère ajouté ne devrait pas excéder le minimum pratique (< 10 % du volume de liquide final, si possible). Un autre procédé consiste à dissoudre la 
substance d'essai dans un plus grand volume d'eau d'essai, au lieu de 
recourir à des solvants organiques, par exemple.
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S'il est impossible de procéder autrement, les solutions mères de 
substances non volatiles et peu solubles dans l'eau sont préparées à 
l'aide d'un solvant organique volatil, mais la quantité de solvant ajoutée au système expérimental ne doit pas dépasser 1 % v/v, ni nuire à l'activité microbienne. Le solvant ne devrait pas affecter la 
stabilité de la substance d'essai dans l'eau. On enlève le solvant 
jusqu'à ce qu'il n'en subsiste qu'une quantité extrêmement faible, de façon à ce qu'il n'augmente pas sensiblement la teneur en COD de l'eau ou de la suspension d'essai. Ce point est à vérifier par une 
analyse de la substance d'essai ou, si possible, du COD (6). On 
veillera à limiter la quantité de solvant transférée au strict minimum pour dissoudre la quantité de substance d'essai dans le volume final d'eau d'essai. D'autres techniques permettant d'intro ­
duire la substance d'essai dans les récipients expérimentaux 
peuvent être utilisées, comme cela a été décrit dans les références (7) et (8). Lorsqu'on utilise un solvant organique pour appliquer la substance d'essai, les témoins au solvant contenant l'eau d'essai (sans 
aucun ajout) et l'eau d'essai additionnée de la substance de référence 
devraient être traités de la même manière que les récipients expéri ­
mentaux renfermant la substance d'essai véhiculée par le solvant. Les témoins au solvant servent à mettre en évidence d'éventuels effets 
nocifs de ce dernier pour la flore microbienne, d'après la dégradation 
de la substance de référence.
 
1.8.8.  Conditions expérimentales  
1.8.8.1.  Température  
L'incubation devrait avoir lieu dans l'obscurité (de préférence) ou 
sous une lumière diffuse, à une température réglée (± 2 °C) qui peut être la température relevée sur le site ou une température stan ­
dard de 20-25 °C. La température du site peut être la température de 
l'échantillon au moment du prélèvement ou une température 
moyenne du site de prélèvement.
 
1.8.8.2.  Agitation  
Il convient de fournir une agitation continue, afin de maintenir les 
particules et les microorganismes en suspension. L'agitation facilite 
également le transfert d'oxygène de l'espace libre situé au-dessus du 
liquide vers le liquide, ce qui permet de maintenir correctement l'aérobiose. Les flacons sont placés sur une table tournante (agitation 
d'environ 100 rpm) ou munis d'agitateurs magnétiques. L'agitation 
doit être continue, mais aussi douce que possible, de façon à main ­
tenir l'homogénéité de la suspension.
 
1.8.8.3.  Durée de l'essai  
La durée de l'essai ne devrait normalement pas dépasser 60 jours, à 
moins que l'on n'ait opté pour le procédé semi-continu avec renou ­
vellement périodique de la suspension expérimentale (voir paragraphe 1.8.6 et annexe 2). Toutefois, l'essai par lots peut-être prolongé jusqu'à 90 jours au maximum si la dégradation de la subs ­
tance d'essai a débuté au cours des 60 premiers jours. La dégradation 
est contrôlée, à intervalles appropriés, par la détermination de l'acti ­
vité du
 14 C résiduel ou du  14 CO 2 dégagé (voir paragraphe 1.8.9.4) 
et/ou par analyse chimique (paragraphe 1.8.9.5). Le temps d'incuba ­
tion doit être suffisamment long pour permettre d'évaluer le 
processus de dégradation. Il serait préférable que la dégradation excède 50 %; pour les substances lentement dégradables, le degré de dégradation doit être suffisant (normalement supérieur à 20 %) 
pour permettre l'estimation d'une constante cinétique de la vitesse de 
dégradation.
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Le pH et la concentration d'oxygène sont à mesurer périodiquement 
dans le système expérimental, à moins que l'expérience acquise par 
des essais identiques menés sur des échantillons d'eau et de sédi ­
ments prélevés sur le même site ne rende ces mesures superflues. Dans certaines conditions, le métabolisme de substrats primaires 
présents à des concentrations bien plus élevées dans l'eau ou le 
sédiment pourrait engendrer un dégagement de CO
 2 et une diminu ­
tion d'oxygène tels qu'ils modifieraient sensiblement les conditions expérimentales durant l'essai.
 
1.8.9.  Mode opératoire  
1.8.9.1.  Préparation des flacons destinés à l'essai pélagique  
On transfère un volume approprié d'au moins quelque 100 ml d'eau 
d'essai dans les flacons expérimentaux, de façon à les remplir 
environ au tiers. Si on utilise plusieurs flacons (de façon à prélever des flacons entiers à chaque moment de prélèvement), le volume approprié d'eau d'essai s'élève aussi à environ 100 ml, les petits 
volumes risquant d'influencer la longueur de la phase de latence. 
La substance d'essai est ajoutée à partir d'une solution mère, comme décrit aux paragraphes 1.8.2 et 1.8.7. Il faudrait utiliser au moins deux concentrations de la substance d'essai, espacées d'un 
facteur de 5 à 10, pour déterminer la cinétique de dégradation et 
calculer la constante cinétique de la vitesse de dégradation. Les deux concentrations choisies devraient être inférieures à 100 μg/l et de 
préférence comprises dans l'intervalle 1-10 μg/l.
 
Les flacons sont fermés avec des bouchons ou des couvercles 
étanches à l'air et au CO  2 . Pour les substances d'essai non volatiles 
et non marquées au  14 C, des tampons d'ouate empêchant la conta ­
mination par l'air suffisent (voir paragraphe 1.8.1), à condition que les principaux produits de dégradation soient notoirement non vola ­
tils et que l’on procède à une détermination indirecte du CO
 2 (voir 
annexe 3).  
Les flacons sont incubés à la température choisie (voir 
paragraphe 1.8.8.1). Les échantillons destinés à l'analyse chimique ou à la détermination du
 14 C sont prélevés au début de l'essai (avant 
le début de la biodégradation; voir paragraphe 1.7.1), puis à une 
fréquence appropriée au cours de l'essai. Le prélèvement peut s'ef ­
fectuer par l'extraction de sous-échantillons (aliquotes de 5 ml, par exemple) de chaque expérience identique ou par la collecte de 
flacons entiers à chaque moment de prélèvement. La minéralisation 
de la substance d'essai se détermine directement ou indirectement (voir annexe 3). Habituellement, il est nécessaire d'inclure au moins cinq points de prélèvement durant la phase de dégradation 
(après la fin de la phase de latence) pour estimer une constante de 
vitesse fiable, sauf si l'on peut justifier que trois points de prélève ­
ment suffisent pour les substances rapidement dégradables. Les subs ­
tances à dégradation lente se prêtent aisément à plus de mesures 
durant la phase de dégradation, si bien qu'il faut inclure plus de 
points pour l'estimation de k. Il est impossible de prescrire un calen ­
drier fixe pour les prélèvements puisque la vitesse de biodégradation varie; on recommande toutefois d'effectuer un prélèvement par 
semaine si la dégradation est lente. Si la substance d'essai se 
dégrade rapidement, les prélèvements devraient avoir lieu une fois par jour durant les trois premiers jours, puis tous les deux ou trois jours. Dans certaines circonstances, notamment dans le cas de subs ­
tances s'hydrolysant très rapidement, il pourra être nécessaire de 
pratiquer un prélèvement horaire. On recommande d’effectuer une étude préliminaire avant l'essai, afin de déterminer le rythme de prélèvement approprié. Si l'on doit conserver des échantillons en 
vue d'autres analyses spécifiques, il est préférable de prélever davan ­
tage d'échantillons et de sélectionner ensuite ceux à analyser à la fin de l'expérience suivant une logique d’ordre inverse, c'est-à-dire que les derniers échantillons seront analysés en premier (le deuxième 
alinéa du paragraphe 1.8.9.5 donne des conseils sur la façon de 
préserver la stabilité des échantillons durant le stockage).
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1.8.9.2.  Nombre de flacons et d'échantillons  
Préparer suffisamment de flacons expérimentaux de façon à disposer:  
— de flacons d'essai: au moins deux flacons pour chaque concen ­
tration de la substance d'essai (de préférence au moins trois) ou 
une série de flacons d'essai pour chaque concentration si des flacons entiers sont prélevés à chaque moment de prélèvement (symbolisés par F
 T ), 
— de flacons d'essai pour le calcul du bilan massique: au moins 
deux flacons pour chaque concentration expérimentale (symbo ­
lisés par F  M ), 
— de témoins sans substance d'essai: au moins un flacon ne conte ­
nant que l'eau d'essai (symbolisé par F  B ), 
— de témoins de référence: deux flacons contenant la substance de 
référence (aniline ou benzoate de sodium, par exemple, 
à 10 μg/l) (symbolisés par F  C ). Le témoin de référence sert à 
confirmer l'existence d'une activité microbienne minimale. S'il y a lieu, une substance de référence radiomarquée peut être utilisée, 
y compris lorsque la dégradation de la substance d'essai est 
suivie par des analyses chimiques,
 
— de témoins stériles: un ou deux flacons contenant de l'eau d'essai 
stérilisée pour vérifier l'existence éventuelle d'une dégradation 
abiotique ou d’une autre élimination non biologique de la subs ­
tance d'essai (symbolisés par F  S ). L'activité biologique peut être 
supprimée par autoclavage (121 °C; 20 min) de l'eau d'essai ou 
par ajout d'un toxique [par exemple, azoture de sodium (NaN  3 ) 
à 10-20 g/l, chlorure de mercure (HgCl  2 ) à 100 mg/l ou forma ­
line à 100 mg/l] ou par irradiation gamma. Si l'on utilise du HgCl
 2 , il faudra l'éliminer comme un déchet toxique. Il est diffi ­
cile de stériliser une eau renfermant une grande quantité de sédi ­
ments ajoutés; dans ce cas, un autoclavage répété est recom ­
mandé (par exemple, trois fois). Il faut tenir compte du fait que les caractéristiques de sorption du sédiment peuvent être 
altérées par l'autoclavage,
 
— de témoins au solvant contenant l'eau d'essai ainsi que l'eau 
d'essai et la substance de référence: des flacons en double exem ­
plaire contenant la même quantité de solvant, appliquée de la 
même façon que la substance d'essai. Ces témoins servent à détecter une éventuelle nocivité du solvant, d'après la dégradation de la substance de référence.
 
En concevant l'essai, l'expérimentateur doit apprécier l'importance 
relative de l'augmentation du nombre d'expériences identiques au regard de l'augmentation de la fréquence des prélèvements. Le nombre exact de flacons requis dépendra de la méthode employée 
pour mesurer la dégradation (voir troisième alinéa du 
paragraphe 1.8.9.1 et du paragraphe 1.8.9.4, ainsi que l'annexe 3).
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On prélève deux sous-échantillons (par exemple, des aliquotes de 
5 ml) dans chaque flacon expérimental, à chaque moment de prélè ­
vement. Si on utilise une série de flacons afin de prélever des flacons entiers, il faut sacrifier au moins deux flacons à chaque moment de prélèvement (voir premier alinéa du paragraphe 1.8.9.1).
 
1.8.9.3.  Préparation des flacons destinés à l'essai en suspension de sédi ­
ments (facultatif)  
On verse les volumes nécessaires d'eau d'essai et de sédiments, le cas 
échéant, dans les flacons expérimentaux (voir paragraphe 1.8.5). Les 
flacons destinés à l'essai en suspension de sédiments sont préparés de 
la même façon que les flacons pour l'essai pélagique (voir paragraphes 1.8.9.1 et 1.8.9.2). On utilise de préférence des bouteilles à sérum ou des flacons ayant la même forme. Les 
flacons fermés sont placés horizontalement sur un agitateur. Il va 
de soi que les flacons ouverts contenant les substances non volatiles, non marquées au
 14 C, doivent être placés en position verticale; dans 
ce cas, il est recommandé d'utiliser des agitateurs magnétiques et des 
barres magnétiques enrobées de verre. Si nécessaire, on aère les 
bouteilles pour maintenir une aérobiose adéquate.  
1.8.9.4.  Déterminations radiochimiques  
Le 14 CO 2 dégagé se mesure directement et indirectement (voir 
annexe 3). Le  14 CO 2 est mesuré indirectement d'après la différence 
entre l'activité initiale du  14 C dans l'eau d'essai ou la suspension et 
l'activité résiduelle totale au moment du prélèvement, mesurée après avoir acidifié l'échantillon à pH 2-3 et extrait le CO
 2 . Le carbone 
minéral est ainsi éliminé et l'activité résiduelle mesurée provient des 
composés organiques. Le  14 CO 2 ne doit pas être déterminé indirec ­
tement s'il y a des composés volatils parmi les principaux produits de transformation qui se forment (voir annexe 3). Si possible, le déga ­
gement de
 14 CO 2 est mesuré directement (voir annexe 3) à chaque 
moment de prélèvement dans au moins un flacon expérimental; ce mode opératoire permet de vérifier le bilan massique et le processus de biodégradation, mais il ne convient qu'aux essais réalisés avec des 
flacons fermés.
 
Si le  14 CO 2 dégagé est mesuré directement au cours de l'essai, il 
convient de prévoir un plus grand nombre de flacons à cet effet au 
début de l'essai. La détermination directe du  14 CO 2 est recommandée 
s'il y a des composés volatils parmi les principaux produits de trans ­
formation de la substance d'essai. À chaque point de mesure, les 
flacons expérimentaux supplémentaires sont acidifiés à pH 2-3 et 
le 14 CO 2 est collecté dans un absorbeur interne ou externe (voir 
annexe 3).  
On peut, si on le souhaite, déterminer les concentrations de la subs ­
tance d'essai marquée au  14 C et des principaux produits de trans ­
formation par radiochromatographie (par exemple, chromatographie 
en couche mince, RAD-TLC) ou HPLC couplée à une détection 
radiochimique.  
On peut aussi, si on le souhaite, déterminer la répartition entre les 
phases de la radioactivité restante (voir annexe 1), ainsi que de la 
substance d'essai résiduelle et des produits de transformation.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1197
 
À la fin de l'essai, le bilan massique devrait être établi par une 
mesure directe du  14 CO 2 , effectuée à l'aide de flacons expérimentaux 
distincts d'où aucun échantillon n'a été prélevé au cours de l'essai (voir annexe 3).
 
1.8.9.5.  Analyse chimique spécifique  
Si l'on dispose d'une méthode analytique spécifique sensible, la 
biodégradation primaire peut être évaluée par une mesure de la 
concentration résiduelle totale de la substance d'essai, plutôt que par des techniques de radiomarquage. Si l'on utilise une substance d'essai radiomarquée (pour mesurer la minéralisation totale), des 
analyses chimiques spécifiques peuvent être pratiquées en parallèle 
pour fournir des informations supplémentaires utiles et vérifier le procédé. Des analyses chimiques spécifiques peuvent aussi être utili ­
sées pour mesurer les produits de transformation formés durant la 
dégradation de la substance d'essai, et cette procédure est recom ­
mandée pour les substances dont la demi-vie de minéralisation dépasse soixante jours. La concentration de la substance d'essai et des produits de transformation à chaque moment de prélèvement 
devrait être mesurée et rapportée (en termes de concentration et de 
pourcentage appliqué). En général, les produits de transformation détectés à ≥ 10 % de la concentration appliquée, à un quelconque 
moment de prélèvement, doivent être identifiés, à moins que le 
contraire ne se justifie. On envisagera aussi d'identifier les produits 
de transformation dont les concentrations s'accroissent continuelle ­
ment au cours de l'étude, même si leur concentration n'atteint pas le seuil susmentionné, car cela pourrait être un signe de persistance. On 
envisagera d'analyser les produits de transformation présents dans les 
témoins stériles si une transformation abiotique rapide de la subs ­
tance d'essai (par hydrolyse, par exemple) est jugée possible. La nécessité de quantifier et d'identifier les produits de transformation 
est à évaluer cas par cas et à justifier dans le rapport. Les techniques 
d'extraction faisant appel à un solvant organique doivent être appli ­
quées selon les instructions données pour le procédé d'analyse respectif.
 
Tous les échantillons doivent être stockés à une température de 2 
à 4 °C dans des récipients étanches à l'air si l'analyse est réalisée dans les vingt-quatre heures, ce qui est préférable. Si la période de 
stockage est plus longue, les échantillons doivent être congelés à – 
18 °C ou conservés chimiquement. Il est déconseillé d'acidifier les échantillons pour les conserver, car l'acidification risque de les rendre instables. Si les échantillons ne sont pas analysés dans les 
vingt-quatre heures et sont conservés au-delà de ce délai, une étude 
de stabilité du stockage doit être effectuée pour démontrer la stabilité des produits chimiques en question à – 18 °C ou dans des conditions 
de conservation. Si la méthode d'analyse requiert une extraction au 
solvant ou une extraction de la phase solide, l'extraction doit être menée immédiatement après le prélèvement ou après le stockage de l'échantillon au réfrigérateur durant vingt-quatre heures au maximum.
 
Suivant la sensibilité de la méthode analytique, il pourra être néces ­
saire de prélever des échantillons d'un volume supérieur à celui indiqué au paragraphe 1.8.1. Il est facile de réaliser l'essai avec des volumes d'un litre contenus dans des flacons d'une capacité de 
2 à 3 litres, ce qui permet de recueillir des échantillons d'environ 
100 ml.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1198
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS  
2.1.1.  Représentation graphique des résultats  
Il convient d'arrondir les intervalles de prélèvement à un nombre 
d'heures entier (sauf si la substance se dégrade fortement en l'espace 
de quelques heures ou minutes), mais pas à un nombre de jours entier. On produit un tracé linéaire et un tracé semi-logarithmique des estimations de l'activité résiduelle de la substance d'essai (pour 
les substances marquées au
 14 C) ou de la concentration résiduelle 
(pour les substances non marquées) en fonction du temps (voir figures 1a et 1b). S'il y a eu une dégradation, on compare les résul ­
tats des flacons F
 T à ceux des flacons F  S . Si les moyennes des 
résultats des flacons contenant la substance d'essai (F  T ) et des 
flacons stériles (F  S ) s'écartent de moins de 10 %, on peut supposer 
que la dégradation observée est principalement abiotique. Si la 
dégradation mesurée dans les flacons F  S est inférieure, les résultats 
peuvent être utilisés pour corriger ceux obtenus dans les flacons F  T 
(par soustraction), en vue d'estimer l'ampleur de la biodégradation. Si 
des analyses facultatives sont effectuées sur les principaux produits 
de transformation, il faut fournir un tracé de leur formation et 
disparition en fonction du temps, en plus d'un tracé de la disparition de la substance d'essai.
 
On estime la durée de la phase de latence t  L à partir de la courbe de 
dégradation (tracé semi-logarithmique), en extrapolant sa partie 
linéaire jusqu'à une dégradation nulle ou en déterminant la durée d'une dégradation d'environ 10 % (voir figures 1a et 1b). À partir du tracé semi-logarithmique, on estime la constante de vitesse de 
premier ordre, k, et son écart-type par régression linéaire du 
ln (activité résiduelle du
 14 C ou concentration de la substance d'es ­
sai) en fonction du temps. Avec les mesures du  14 C en particulier, on 
n'utilisera que les résultats se rapportant à la partie linéaire initiale de 
la courbe, située après la phase de latence, et l'on s'attachera à 
sélectionner un petit nombre de résultats représentatifs, plutôt qu'un grand nombre de résultats incertains. Ici, l'incertitude comprend les erreurs inhérentes à l'utilisation directe recommandée des activités 
résiduelles du
 14 C mesurées (voir plus bas). Il peut parfois s'avérer 
pertinent de calculer deux constantes de vitesse différentes, si la dégradation suit un mode biphasique. À cet effet, on délimite deux phases différentes de la courbe de dégradation. Il convient de 
calculer la constante de vitesse, k, et la demi-vie, t
 1/2 = ln2/k, 
pour chacun des flacons des expériences identiques, lorsque des sous-échantillons sont prélevés à partir du même flacon, ou en utili ­
sant les valeurs moyennes, lorsqu'on recueille des flacons entiers à 
chaque moment de prélèvement (voir paragraphe 1.8.9.2). Si l'on 
applique le premier procédé mentionné, la constante de vitesse et la demi-vie doivent être rapportées individuellement pour chacun des flacons en double et exprimées sous la forme d'une moyenne avec un 
écart-type. Si les concentrations de la substance d'essai sont élevées, 
la courbe de dégradation pourrait s'écarter considérablement d'une droite (tracé semi-logarithmique) et la cinétique de premier ordre risque de ne pas être valable. Dans ces circonstances, la détermina ­
tion d'une demi-vie n'aurait pas de sens. Cependant, il est possible 
d'appliquer une cinétique de pseudo-premier ordre à une gamme limitée de résultats et d'estimer la demi-vie de dégradation TD
 50 
(temps nécessaire pour atteindre 50 % de dégradation). On gardera 
toutefois à l'esprit qu'il est impossible de prédire la durée de la 
dégradation au-delà de la gamme limitée de résultats en utilisant la TD
 50 , qui n'est qu’un descripteur d'un ensemble donné de résultats. 
Les outils analytiques facilitant les calculs statistiques et l'ajustement 
des courbes sont faciles à se procurer et l'usage de ce type de logiciel 
est recommandé.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1199
 
Si des analyses chimiques spécifiques sont pratiquées, on estime les 
constantes de vitesse et les demi-vies pour la dégradation primaire 
comme indiqué plus haut pour la minéralisation totale. Si la dégra ­
dation primaire est le processus limitant, les résultats ponctuels se rapportant à la totalité du processus de dégradation peuvent quelque ­
fois être utilisés. Et ce, parce qu'il s'agit de mesures directes, contrai ­
rement aux mesures de l'activité du
 14 C. 
Si l'on utilise des substances marquées au  14 C, le bilan massique 
devrait être exprimé en pourcentage de la concentration initiale appli ­
quée, au moins à la fin de l'essai.  
2.1.2.  Activité résiduelle  
Lorsque le fragment marqué au  14 C d'une substance organique est 
biodégradé, la majeure partie du  14 C est convertie en  14 CO 2 , tandis 
qu'une autre partie est mobilisée par la croissance de la biomasse 
et/ou la synthèse de métabolites extra-cellulaires. Aussi, la biodégra ­
dation complète, «finale», d'une substance ne correspond-elle pas à une conversion à 100 % de son carbone en
 14 CO 2 . Le  14 C intégré 
aux produits biosynthétisés est ensuite libéré lentement sous la forme 
de 14 CO 2 à la suite d'une «minéralisation secondaire». C'est pourquoi 
les tracés de l'activité du  14 C organique résiduel (mesurée après 
l'extraction du CO  2 ) ou du  14 CO 2 produit en fonction du temps se 
prolongent au-delà de la fin de la dégradation. Cela complique l'in ­
terprétation cinétique des résultats, de sorte que seule la première partie de la courbe (juste après la fin de la phase de latence et avant que la dégradation atteigne environ 50 %) devrait normalement être 
utilisée pour l'estimation de la constante de vitesse de dégradation. Si 
la substance d'essai est dégradée, l'activité du
 14 C résiduel organique 
total est toujours supérieure à l'activité du  14 C associée à la substance 
d'essai intacte restante. Si la substance d'essai est dégradée par une 
réaction de premier ordre et qu'une fraction constante α est minéra ­
lisée en CO  2 , la pente initiale de la courbe de disparition du  14 C ( 14 C 
organique total en fonction du temps) sera égale à α fois la pente de 
la courbe correspondante de concentration de la substance d'essai 
(ou, plus précisément, du fragment de la substance d'essai marqué 
au 14 C). Les mesures de l'activité du  14 C organique total utilisées 
n'étant pas corrigées, la constante de vitesse de dégradation sera calculée avec une marge de sécurité. Des procédés permettant d'es ­
timer les concentrations de la substance d'essai à partir des activités 
radiochimiques mesurées, sur la base de diverses hypothèses simpli ­
ficatrices, ont été décrits dans des publications (2)(9)(10)(11). Ces procédés s'appliquent le plus facilement aux substances rapidement 
dégradables.
 
2.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS  
S'il s'avère que k est indépendant de la concentration (si le k calculé 
est à peu près identique aux différentes concentrations de la subs ­
tance d'essai), on peut supposer que la constante de vitesse de premier ordre est représentative des conditions expérimentales appli ­
quées, à savoir la substance d'essai, l'échantillon d'eau et la tempé ­
rature de l'essai. Il appartient à un expert d'apprécier dans quelle 
mesure les résultats peuvent être généralisés ou extrapolés à d'autres systèmes. Si la substance d'essai est testée à une concentration élevée et que, de ce fait, la dégradation n'obéit pas à une cinétique de 
premier ordre, les résultats ne peuvent servir à estimer directement 
une constante de vitesse de premier ordre ou la demi-vie corres ­
pondante. Cependant, les données fournies par un essai mené à une concentration élevée de la substance d'essai peuvent toujours 
être utilisées pour estimer le degré de minéralisation totale et/ou 
détecter et quantifier les produits de transformation.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1200
 
Si les vitesses de phénomènes de disparition autres que la biodégra ­
dation sont connues (hydrolyse ou volatilisation, par exemple), elles 
peuvent être soustraites de la vitesse de disparition nette relevée durant l'essai, pour fournir une estimation approximative de la vitesse de biodégradation. Les valeurs concernant l'hydrolyse 
peuvent, par exemple, être obtenues à partir du témoin stérile ou 
d'un essai parallèle mené à une concentration plus élevée de la subs ­
tance d'essai.
 
Les déterminations indirecte et directe du  14 CO 2 (paragraphes 1.8.9.4 
et annexe 3) ne peuvent être utilisées que pour mesurer l'ampleur de la minéralisation de la substance d'essai en CO
 2 . La radiochromato ­
graphie en couche mince (RAD-TLC) ou la chromatographie en 
phase liquide à haute performance (HPLC) peuvent servir à analyser la concentration de la substance d'essai marquée au
 14 C et la forma ­
tion des principaux produits de transformation (troisième alinéa du 
paragraphe 1.8.9.4). La demi-vie ne peut être estimée directement 
qu'en l'absence de tous les principaux produits de transformation (définis comme étant ≥10 % de la quantité de substance d'essai 
appliquée). En présence de produits de transformation principaux 
(selon la définition ci-dessus), une évaluation détaillée des résultats 
est requise. Cette évaluation peut inclure l'essai et/ou l'identification répétés des produits de transformation (voir premier alinéa du paragraphe 1.8.9.5), à moins que le devenir des produits de trans ­
formation ne puisse être raisonnablement évalué d'après l'expérience 
antérieure (par exemple, des informations sur les voies de dégrada ­
tion). La proportion de carbone de la substance d'essai convertie en CO
 2 variant (en grande partie en fonction de la concentration de la 
substance d'essai et des autres substrats disponibles, des conditions 
expérimentales et de la flore microbienne), cet essai ne permet pas d'estimer directement la biodégradation finale, comme dans un essai de disparition du carbone organique dissous; mais le résultat est 
similaire à celui obtenu avec l'essai au respiromètre. Le degré de 
minéralisation sera donc inférieur ou égal au degré minimal de biodégradation finale. Pour obtenir un tableau plus complet de la biodégradation finale (minéralisation et incorporation dans la 
biomasse), il faudrait analyser la répartition du
 14 C entre les 
phases à la fin de l'essai (voir annexe 1). Le  14 C présent dans les 
matières particulaires consistera en  14 C incorporé dans la biomasse 
bactérienne et en  14 C sorbé sur les particules organiques.  
2.3. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
Si la substance de référence ne se dégrade pas au cours de la période 
prévue (pour l'aniline et le benzoate de sodium, généralement moins de deux semaines), la validité de l'essai est incertaine et demande à 
être vérifiée; sinon, l'essai peut aussi être répété avec un nouvel 
échantillon d'eau. À l'issue d'un essai tournant de la méthode, orga ­
nisé par l'ISO, auquel sept laboratoires européens ont participé, les constantes de vitesse de dégradation adaptées de l'aniline s'échelon ­
naient entre 0,3 et 1,7 jour
 –1 , avec une moyenne de 0,8 jour  –1 
à 20 °C et un écart-type de ± 0,4 jour  –1 (t 1/2 = 0,9 jour). Les périodes 
de latence étaient généralement comprises entre un et sept jours. Les 
eaux examinées renfermaient une biomasse bactérienne correspon ­
dant à 10  3 -10 4 unités formant colonie par ml. Les eaux riches en 
éléments nutritifs de l'Europe tempérée accusaient des vitesses de dégradation supérieures aux eaux oligotrophes de l'Europe septen ­
trionale, probablement à cause d'une différence d'état trophique ou 
d'une exposition préalable à des substances chimiques.
 
La récupération totale (bilan massique) à la fin de l'expérience 
devrait se situer entre 90 % et 110 % pour les substances radio ­
marquées, tandis que le taux de récupération au début de l'expé ­
rience devrait être compris entre 70 % et 110 % pour les subs ­
tances non marquées. Toutefois, ces gammes ne sont mentionnées 
qu'à titre indicatif et ne devraient pas servir de critère d'acceptation 
pour l'essai.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1201
 
3. RAPPORT D'ESSAI  
Le type d'essai, à savoir pélagique ou en suspension de sédiments, 
doit être stipulé clairement dans le rapport d'essai, qui fournira égale ­
ment, au minimum, les informations suivantes:  
Substance d'essai et substance(s) de référence:  
— noms courants, noms chimiques (suivant la nomenclature recom ­
mandée par l'IUPAC et/ou le CAS), numéros CAS, formule structurale (indiquant la position du
 14 C, dans le cas d'une subs ­
tance radiomarquée) et propriétés physico-chimiques pertinentes 
de la substance d'essai et de la (des) substance(s) de référence 
(voir paragraphes 1.5 et 1.6),  
— noms chimiques, numéros CAS, formule structurale (indiquant la 
position du  14 C, dans le cas d'une substance radiomarquée) et 
propriétés physico-chimiques pertinentes des substances servant d'étalon pour l'identification et la quantification des produits de transformation,
 
— pureté (impuretés) de la substance d'essai et de la (des) subs ­
tance(s) de référence,  
— pureté radiochimique de la substance marquée et activité spéci ­
fique (le cas échéant).  
Eau superficielle:  
Il convient de fournir, au minimum, les informations suivantes sur 
l'échantillon d'eau prélevé:  
— localisation et description du site de prélèvement et, si possible, 
son histoire en matière de contamination,  
— date et heure du prélèvement de l'échantillon,  
— éléments nutritifs (N total, ammonium, nitrite, nitrate, P total, 
orthophosphate dissous),  
— profondeur du prélèvement,  
— aspect de l'échantillon (couleur et turbidité, par exemple),  
— carbone organique dissous et carbone organique total,  
— demande biologique en oxygène,  
— température et pH sur le lieu et à l’heure du prélèvement,  
— oxygène ou potentiel redox (obligatoire seulement si l'aérobiose 
n'est pas évidente),  
— salinité ou conductivité (dans le cas d’une eau de mer ou d’une 
eau saumâtre),  
— solides en suspension (dans le cas d’un échantillon trouble),  
— éventuellement, autres informations pertinentes sur le lieu de 
prélèvement au moment du prélèvement (par exemple, données 
actuelles ou antérieures sur le débit des cours d'eau ou les courants marins, présence d'importantes sources de rejets à proxi ­
mité et nature des rejets, conditions météorologiques précédant le 
moment du prélèvement),
 
et, à titre facultatif:  
— biomasse microbienne (comptage direct à l'orangé d'acridine ou 
unités formant colonie, par exemple),  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1202
 
— carbone minéral,  
— estimation de la biomasse des algues d'après la concentration en 
chlorophylle a.  
De surcroît, si l'essai est réalisé en suspension de sédiments, il 
faudrait fournir les renseignements suivants sur le sédiment:  
— profondeur de prélèvement du sédiment,  
— aspect du sédiment (coloré, boueux, vaseux ou sableux, par 
exemple),  
— texture (pourcentages de sable grossier, de sable fin, de limon et 
d'argile, par exemple),  
— poids sec en g/l des solides suspendus, concentration du carbone 
organique total ou mesure de la teneur en matière organique 
d'après la perte de poids à l'inflammation,  
— pH,  
— oxygène ou potentiel redox (obligatoire seulement si l'aérobiose 
n'est pas évidente).  
Conditions expérimentales:  
— temps écoulé entre le prélèvement de l’échantillon et son utilisa ­
tion dans l'essai en laboratoire, stockage et traitement préalable 
de l'échantillon, dates auxquelles les études ont été menées,  
— quantité de substance d'essai appliquée, concentration expérimen ­
tale et substance(s) de référence,  
— méthode d'application de la substance d'essai, notamment utilisa ­
tion de solvants, le cas échéant,  
— volume d'eau superficielle utilisé, et de sédiment le cas échéant, 
et volume prélevé à chaque moment d'analyse,  
— description du système expérimental utilisé.  
Si l'obscurité ne s'impose pas, informations sur les paramètres de la 
lumière diffuse,  
— informations sur la ou les méthodes utilisées pour préparer des 
témoins stériles (température, durée et nombre d'autoclavages, 
par exemple),  
— température d'incubation,  
— renseignements sur les techniques analytiques et la ou les 
méthodes appliquées pour les mesures radiochimiques, la vérifi ­
cation du bilan massique et la détermination de la répartition 
entre les phases (le cas échéant),  
— nombre d'expériences identiques.  
Résultats:  
— pourcentages de récupération (voir paragraphe 1.7.1),  
— répétabilité et sensibilité des méthodes analytiques employées, y 
compris les seuils de détection et de quantification (voir 
paragraphe 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1203
 
— toutes les données mesurées (y compris les heures de prélève ­
ment), les valeurs calculées présentées sous forme de tableau et 
les courbes de dégradation; pour chaque concentration expéri ­
mentale et chaque flacon en double, indiquer le coefficient de corrélation linéaire de la pente du tracé logarithmique, la durée 
estimée de la phase de latence, une constante de vitesse de 
premier ordre ou de pseudo-premier ordre (si possible) et la demi-vie de dégradation correspondante (ou le temps de demi- vie, t
 1/2 ), 
— consigner les valeurs importantes telles que les moyennes des 
résultats observés pour chaque double, par exemple la longueur 
de la phase de latence, la constante de vitesse de dégradation et 
la demi-vie de dégradation (ou t  1/2 ), 
— déterminer si le système est adapté ou non, d'après l'aspect de la 
courbe de dégradation et l'influence éventuelle de la concentra ­
tion d'essai,  
— résultats de la vérification du bilan massique final et résultats des 
mesures de la répartition entre les phases (le cas échéant),  
— fraction de  14 C minéralisé et, si des analyses spécifiques ont été 
menées, niveau final de la dégradation primaire,  
— identification, concentration molaire et pourcentage des princi ­
paux produits de transformation (voir premier alinéa du paragraphe 1.8.9.5), le cas échéant,
 
— proposition d’un chemin réactionnel pour la transformation, s'il y 
a lieu,  
— analyse des résultats.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
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— Simulation Biodegradation Test  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999). Qualité de l'eau — évaluation de la 
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faibles concentrations — partie 1: essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface ou des suspensions eaux de surface/sédiments.
 
3. Méthode d’essai C.23. Transformation aérobie et anaérobie dans 
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biodégradabilité aérobie des composés organiques présents en faibles concentrations — partie 1: essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface ou des suspensions eaux de 
surface/sédiments.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1205
 
Appendice 1  
Répartition du  14 C entre les phases  
Afin de contrôler le procédé employé, il convient de compléter les mesures 
systématiques de l'activité totale du  14 C organique (AOT) résiduel par des 
mesures du bilan massique comportant une détermination directe du  14 CO 2 
émis après piégeage dans un absorbeur (voir annexe 3). En soi, la formation 
de 14 CO 2 constitue une preuve directe de biodégradation, par opposition à la 
dégradation abiotique ou à d'autres mécanismes de disparition, tels que la vola ­
tilisation et la sorption. D'autres renseignements utiles caractérisant la biodégra ­
dabilité peuvent être tirés des mesures de la répartition de l'AOT entre la phase 
dissoute (activité du  14 C organique dissous, AOD) et la phase particulaire (acti ­
vité du  14 C organique particulaire, AOP), après la séparation des particules par 
filtration sur membrane ou centrifugation. L'AOP se rapporte à la substance 
d'essai sorbée sur la biomasse microbienne et sur d'autres particules ainsi qu'au 
carbone de la substance d'essai qui a été mobilisé pour synthétiser de nouveaux matériaux cellulaires et incorporé de ce fait dans la fraction particulaire de la biomasse. La formation du
 14 C organique dissous peut être estimée d'après 
l'AOD à la fin de la biodégradation (plateau sur la courbe de dégradation en 
fonction du temps).  
On estime la répartition du  14 C résiduel entre les phases dans des échantillons 
choisis en filtrant les échantillons sur un filtre à membrane composé d'un maté ­
riau qui n'adsorbe, le cas échéant, que des quantités négligeables de la substance 
d'essai (les filtres en polycarbonate, par exemple, conviennent) et dont les pores 
mesurent 0,22 μm ou 0,45 μm. Si la sorption de la substance d'essai sur le filtre 
est trop importante pour être négligée (à vérifier avant l'expérience), la filtration peut être remplacée par une centrifugation à grande vitesse (2 000 g; 10 min).
 
Le filtrat ou le centrifugat sont traités comme les échantillons non filtrés (voir à 
l'annexe 3). Les membranes des filtres sont dissoutes dans un liquide à scintil ­
lation approprié, et le comptage s'effectue comme d'habitude, en principe unique ­
ment à l'aide de la méthode du quotient avec un étalon externe pour corriger 
l'extinction, ou à l'aide d'un dispositif oxydant l'échantillon. Si l'on a utilisé la 
centrifugation, il faut de nouveau suspendre la boulette formée par la fraction particulaire dans 1 à 2 ml d'eau distillée et transférer le tout dans un petit tube à scintillation. Après deux rinçages du tube à centrifuger avec 1 ml d'eau distillée, 
l'eau de rinçage est transférée dans le petit tube à scintillation. Si nécessaire, la 
suspension peut être incorporée à un gel pour le comptage par scintillation liquide.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1206
 
Appendice 2  
Procédé semi-continu  
Il est parfois nécessaire de prolonger l'incubation durant plusieurs mois afin de 
dégrader suffisamment les substances récalcitrantes. L'essai ne doit normalement pas dépasser 60 jours, sauf si les caractéristiques de l'échantillon d'eau original 
sont maintenues grâce au renouvellement de la suspension d'essai. Cependant, la 
durée de l'essai peut être prolongée jusqu'à 90 jours maximum sans renouvelle ­
ment de la suspension d'essai si la dégradation de la substance d'essai a débuté au cours des 60 premiers jours.
 
Si l'incubation couvre une longue période, la diversité de la flore microbienne 
risque de s'amenuiser, du fait de divers mécanismes de disparition et de l'appau ­
vrissement possible de l'échantillon d'eau en éléments nutritifs essentiels et en substrats carbonés primaires. Il est donc recommandé de recourir à l'essai semi- continu pour déterminer correctement la vitesse de dégradation des substances 
qui se dégradent lentement. L'essai devrait débuter par un procédé semi-continu 
si des données expérimentales laissent supposer qu'une période d'incubation de trois mois est nécessaire pour que la substance se dégrade à 20 %. Sinon, l'essai en lots peut être converti en essai semi-continu si la substance d'essai ne s'est pas 
dégradée au terme d'un essai en lots mené sur une soixantaine de jours. Il est 
possible de mettre fin à un essai semi-continu et de poursuivre l'expérience selon le procédé en lots si une dégradation substantielle a été enregistrée (> 20 %, par exemple).
 
Dans l'essai semi-continu, toutes les deux semaines, environ un tiers du volume 
de la suspension d'essai est remplacé par un volume d'eau venant d'être prélevé, dans lequel a été ajoutée la quantité requise de substance d'essai pour rétablir sa concentration initiale. De la même façon, on ajoute la quantité nécessaire de 
sédiment dans l'eau de remplacement pour rétablir la concentration initiale de 
sédiment (entre 0,01 et 1 g/l) si l'on effectue l'essai facultatif en suspension de sédiments. Si l'essai est mené avec des sédiments solides en suspension, il importe que le système demeure totalement suspendu et ce, également lors du 
renouvellement de l'eau, et il convient d'appliquer un temps de séjour identique 
pour les solides et l'eau, sinon on risquerait de perdre la similarité voulue avec un système aqueux homogène sans phases fixes. C'est pourquoi, il est préférable que la concentration initiale des sédiments suspendus se situe dans la partie inférieure 
de l'intervalle spécifié lorsqu'on utilise un procédé semi-continu.
 
L'ajout de la substance d'essai, tel qu'il est prescrit, implique que le renouvelle ­
ment partiel de la suspension d'essai n’entraîne pas de dépassement de la concen ­
tration initiale de la substance d'essai, et que l'on évite par conséquent l'adapta ­
tion couramment observée avec des concentrations élevées de la substance d'es ­
sai. Le procédé prévoyant une réinoculation et une compensation des carences en 
éléments nutritifs et en substrats primaires, la diversité microbienne originale est rétablie et la durée de l'essai peut, en principe, être prolongée à l'infini. Lorsqu'on applique le procédé semi-continu, il est important de noter que la concentration 
résiduelle de la substance d'essai doit être corrigée en fonction des quantités de 
substance d'essai ajoutées et ôtées à chaque renouvellement. La concentration totale de la substance d'essai et sa concentration à l'état dissous peuvent être utilisées de façon interchangeable pour les composés peu sujets à la sorption. La 
sorption est négligeable (< 5 %) dans les conditions spécifiées (0,1-1 g solides/l) 
pour les substances dont le log K
 oe < 3 (valable pour les substances neutres, 
lipophiles). L'exemple de calcul présenté ci-dessous illustre ce qui précède. En 
gros, 0,1 g/l de solides correspond à 10 mg de carbone par litre (fraction de 
carbone f  C = 0,01). Soit:  
Log K  oe (de la substance d'essai) = 3  
K co = 0,42 × K  oe 
Coefficient de partage, K  d = f C × K  co 
alors, la fraction dissoute de la concentration totale (C-eau (C  e )/C-total (C  t )) est 
égale à:  
C e /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  co × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 
× 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1207
 
Appendice 3  
Détermination du  14 CO  2 
Détermination indirecte du  14 CO  2 
Pour les mesures systématiques, la méthode indirecte est normalement la plus 
rapide et la plus précise, si la substance d'essai est non volatile et ne se trans ­
forme pas en produits volatils. Pour ce faire, il suffit de transférer des échan ­
tillons non filtrés, d'un volume de 5 ml, par exemple, dans des tubes à scintil ­
lation. L'activité initiale adéquate des échantillons est comprise entre 5 000 dpm et 10 000 dpm (80-170 Bq) et l'activité initiale minimale est de quelque 
1 000 dpm. Le CO
 2 doit être extrait après acidification à pH 2-3 avec une ou 
deux gouttes d'H  3 PO 4 ou d'HCl concentrés. L'extraction du CO  2 peut se faire par 
barbotage à l'air durant une demi-heure à une heure. Sinon, les flacons peuvent être agités vigoureusement durant une à deux heures (par exemple, sur un agita ­
teur à microplaque) ou plus doucement, mais jusqu'au lendemain. Il faut vérifier 
l'efficacité du procédé d'extraction du CO
 2 (en prolongeant l'aération ou la durée 
de l'agitation). Ensuite, un liquide à scintillation approprié au comptage des échantillons aqueux est ajouté et l'échantillon est homogénéisé au moyen d'un 
mélangeur rotatif; on détermine la radioactivité par comptage en scintillation 
liquide en retranchant l'activité de fond relevée sur les témoins (F
 B ). À moins 
que l'eau d'essai ne soit très colorée ou renferme une concentration élevée de particules, les échantillons présentent normalement une extinction uniforme et il 
suffit de corriger l'extinction à l'aide d'un étalon externe. Si l'eau d'essai est très 
colorée, il peut être nécessaire de corriger l'extinction par ajout d'un étalon interne. Si la concentration des particules est élevée, il peut s’avérer impossible d'obtenir une solution ou un gel homogène, ou la variation d'extinction entre les 
échantillons risque d'être importante. Dans ce cas, la méthode de comptage 
décrite ci-après pour les boues d'essai peut être utilisée. Si l'essai est mené en suspension de sédiments, on peut mesurer le
 14 CO 2 indirectement en prenant un 
échantillon homogène de 10 ml de l'eau/suspension d'essai et en séparant les 
phases par centrifugation à une vitesse appropriée (par exemple à 40 000 m/s  2 
durant 15 min). La phase aqueuse doit ensuite être traitée comme décrit plus 
haut. On détermine l'activité du  14 C de la phase particulaire (AOP) en suspendant 
de nouveau le sédiment dans un petit volume d'eau distillée, en le transférant 
dans des tubes à scintillation et en ajoutant un liquide à scintillation de façon à 
obtenir un gel (il existe des liquides à scintillation spécialement destinés à cet usage). Selon la nature des particules (par exemple, leur teneur en matières organiques), il peut être possible de faire digérer l'échantillon par un solubilisant 
pour tissus en le laissant agir jusqu'au lendemain et de l'homogénéiser ensuite 
avec un mélangeur rotatif, avant d'ajouter le liquide à scintillation. Sinon, l'AOP peut être déterminée par combustion en excès d'oxygène au moyen d'un dispositif oxydant l'échantillon. Des étalons internes doivent toujours être inclus lors du 
comptage, et il est parfois nécessaire de corriger l'extinction en ajoutant un étalon 
interne pour chaque échantillon.
 
Détermination directe du  14 CO  2 
Si le  14 CO 2 dégagé est mesuré directement, il faut prévoir un plus grand nombre 
de flacons au début de l'essai, prélever les flacons d'essai à chaque moment de 
mesure, acidifier leur contenu à pH 2-3 et recueillir le  14 CO 2 dans un absorbeur 
interne (disposé dans chaque flacon d'essai au début de l'essai) ou externe. Un milieu absorbant alcalin (par exemple, une solution 1 N de NaOH ou une pastille 
de NaOH), ou constitué d'éthanolamine ou à base d'éthanolamine, ainsi que les 
absorbeurs vendus dans le commerce peuvent être utilisés. Pour la mesure directe du
 14 CO 2 , les flacons doivent être fermés au moyen de bouchons cloisonnés 
(septa) en caoutchouc butylique, par exemple.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1208
 
Figure 1a  
Exemple d’un tracé arithmétique des résultats (activité résiduelle en fonction du temps)
  
Figure 1b  
Exemple de tracé semi-logarithmique des résultats (ln de l’activité résiduelle en fonction du temps)
  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1209
 
C.26.  LEMNA  SP. ESSAI D’INHIBITION DE LA CROISSANCE  
1. MÉTHODE  
La présente méthode est équivalente à la ligne directrice TG 
221 (2006) de l'OCDE (1). Il existe un vaste consensus des autorités de l’UE sur le fait que l’essai sur les Lemna constitue une solution 
de substitution acceptable à un essai sur les algues pour les subs ­
tances fortement colorées (2) (3).
 
1.1. INTRODUCTION  
Cette méthode d’essai est destinée à évaluer la toxicité de substances 
sur des plantes dulcicoles du genre  Lemna  (lentille d'eau). Conçue à 
partir de lignes directrices existantes (4)(5)(6)(7)(8)(9), elle a fait l’objet de modifications afin de tenir compte des dernières avancées en recherche et des consultations d'experts sur un certain nombre de 
points essentiels. La méthode proposée ici a été validée par un essai 
tournant international (10).
 
Cette méthode d'essai décrit des essais de toxicité sur  Lemna gibba  
et Lemna minor , deux espèces abondamment étudiées et visées par 
les références susmentionnées. La taxonomie des espèces du genre  
Lemna  est complexe, notamment à cause de l’existence des 
nombreux phénotypes. Bien qu'il puisse y avoir une variation géné ­
tique pour la réaction des espèces de  Lemna  aux toxiques, nous ne 
sommes pas encore en mesure de recommander l'usage d'un clone particulier pour cette méthode d’essai, faute de données suffisantes sur cette source de variabilité. Notons que cet essai n'est pas réalisé 
dans des conditions axéniques, mais qu'à différentes étapes du mode 
opératoire, il inclut des mesures permettant de limiter au minimum la contamination par d'autres organismes.
 
Les procédés avec renouvellement (semi-statique et à écoulement 
continu dit «dynamique») et sans renouvellement (statique) de la solution expérimentale sont décrits en détail. En fonction des objec ­
tifs de l'essai et des exigences réglementaires, on envisagera d'appli ­
quer les méthodes semi-statique et dynamique, par exemple pour les 
substances qui disparaissent rapidement de la solution par volatilisa ­
tion, photodégradation, précipitation ou biodégradation. Des orienta ­
tions supplémentaires sont fournies dans la référence (11).
 
1.2. DÉFINITIONS  
Les définitions et abréviations suivantes sont utilisées aux fins de la 
présente méthode d’essai:  
Biomasse : poids sec de la matière vivante présente dans une popu ­
lation. Dans cet essai, la biomasse est mesurée indirectement, en général par le nombre de thalles et la superficie des thalles, si bien que le terme «biomasse» recouvre également ces paramètres.
 
Chlorose : jaunissement du tissu des thalles.  
Clone : organisme ou cellule issu d'un seul individu par reproduction 
asexuée. D'où l'identité génétique entre les individus issus d'un même 
clone.  
Colonie : agrégat de thalles mères et filles (généralement 2 à 4) 
attachés les uns aux autres. Quelquefois désignée par le terme 
«plante».  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1210
 
CE x : concentration de la substance d'essai dissoute dans le milieu 
d'essai entraînant une réduction de x % (par exemple 50 %) de la 
croissance de  Lemna  durant une période d'exposition définie (à 
mentionner explicitement si elle dépasse la durée normale ou totale de l'essai). Afin de distinguer les valeurs de la CE mesurées en 
fonction du taux de croissance de celles mesurées en fonction du 
rendement, on utilise les abréviations CE
 t , s'agissant du taux de 
croissance, et CE  r , s'agissant du rendement, suivies par la mention 
de la variable utilisée, par exemple CE  t (nombre de thalles).  
Dynamique : qualifie un essai dans lequel les solutions expérimen ­
tales sont renouvelées en continu.  
Thalle : désigne l'appareil végétatif de la lentille d'eau réduit à une 
petite lame ovale individuelle. Il représente la plus petite unité (indi ­
vidu) capable de reproduction.  
Gibbosité : bosse ou renflement apparaissant sur les thalles.  
Croissance : augmentation de la variable mesurée, par exemple le 
nombre de thalles, le poids sec, le poids frais ou la superficie des thalles, au cours de l'essai.
 
Taux de croissance (taux de croissance spécifique moyen) : 
accroissement logarithmique de la biomasse durant la période d'ex ­
position.  
Concentration minimale avec effet observé (CMEO) : concentra ­
tion d'essai la plus faible à laquelle on observe que la substance exerce un effet statistiquement significatif de réduction de croissance 
(à p < 0,05) par comparaison avec le témoin, durant une période 
d'exposition donnée. Néanmoins, toutes les concentrations supé ­
rieures à la CMEO doivent avoir un effet néfaste supérieur ou égal à celui observé à la CMEO. Lorsque ces deux conditions ne peuvent 
pas être remplies, il faut expliquer en détail la façon dont la CMEO 
(et donc la CSEO) a été choisie.
 
Variable mesurée : tout type de variable mesurée pour exprimer 
l'effet étudié au cours de l'essai par une ou plusieurs variables étudiées. Dans cette méthode, le nombre de thalles, la superficie des thalles, le poids frais et le poids sec sont des variables mesurées.
 
Monoculture : culture monospécifique.  
Nécrose : tissu (des thalles) mort (c'est-à-dire blanc ou gorgé d'eau).  
Concentration sans effet observé (CSEO) : concentration d'essai 
immédiatement inférieure à la CMEO.  
Phénotype : caractéristiques observables d'un organisme, déterminées 
par l'interaction de ses gènes avec l'environnement.  
Variables étudiées : variables permettant d'estimer la toxicité à partir 
de n’importe quelle variable mesurée décrivant la biomasse, selon différentes méthodes de calcul. Dans cette méthode, les taux de 
croissance et le rendement représentent les variables étudiées 
déduites de variables mesurées telles que le nombre de thalles, la superficie des thalles, le poids frais ou le poids sec.
 
Essai semi-statique : essai dans lequel la solution d'essai est renou ­
velée périodiquement à intervalles définis durant l'essai.  
Essai statique : essai sans renouvellement de la solution d'essai 
durant l'essai.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1211
 
Effet étudié : décrit le facteur général qui sera modifié, par rapport 
au témoin, par la substance d'essai. Dans cette méthode, l'effet étudié 
est l'inhibition de la croissance qui peut être exprimée par différentes variables étudiées déduites d'une ou de plusieurs variables mesurées.
 
Milieu expérimental : milieu de croissance synthétique complet dans 
lequel les plantes mises à l'épreuve se développent pendant qu'elles sont exposées à la substance d'essai. La substance d'essai sera norma ­
lement dissoute dans le milieu expérimental.
 
Rendement : valeur de la variable mesurée choisie pour exprimer la 
biomasse à la fin de la période d'exposition, moins la valeur de cette 
variable au début de la période d'exposition.  
1.3. PRINCIPE DE L'ESSAI  
Des monocultures du genre  Lemna , en phase de croissance exponen ­
tielle, sont exposées à différentes concentrations de la substance d'essai sur une période de sept jours. Cet essai vise à quantifier les effets de la substance sur la multiplication végétative des lentilles 
d'eau durant cette période, d'après l’évaluation de plusieurs variables 
choisies. Le nombre de thalles représente la première variable mesu ­
rée, mais on en détermine au moins une autre (superficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) car certaines substances sont suscep ­
tibles d'avoir un impact beaucoup plus prononcé sur des variables 
autres que le nombre de thalles. Afin de quantifier les effets de la substance, la croissance des lentilles d'eau dans les solutions expé ­
rimentales est comparée à celle des témoins, et la concentration 
induisant un pourcentage défini x % d'inhibition de la croissance 
(par exemple, 50 %) est déterminée et exprimée sous la forme de CE
 x (par exemple, CE  50 ). 
Dans cet essai, l'effet observé est l'inhibition de la croissance, 
exprimé en termes d'accroissement logarithmique de la variable 
mesurée (taux de croissance spécifique moyen) durant la période 
d'exposition. La concentration entraînant un pourcentage donné d'inhibition du taux de croissance (par exemple, 50 %) est déter ­
minée en fonction des taux de croissance spécifiques moyens 
relevés dans une série de solutions expérimentales et exprimée 
sous la forme C
 x E t (par exemple, C  50 E t ). 
Cette méthode d’essai comporte également une variable étudiée 
supplémentaire, le rendement, requise par la réglementation de certains pays. Il est défini comme étant la différence entre la valeur des variables mesurées à la fin de la période d'exposition et 
la valeur des variables mesurées au début de la période d'exposition. 
La concentration entraînant un pourcentage donné d'inhibition du rendement (par exemple, 50 %) est calculée à partir du rendement enregistré dans une série de solutions expérimentales et exprimée en 
termes de C
 x E r (par exemple, C  50 E r ). 
En outre, la concentration minimale avec effet observé (CMEO) et la 
concentration sans effet observé (CSEO) peuvent être déterminées par un calcul statistique.
 
1.4. INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D'ESSAI  
Il faudrait disposer d'une méthode analytique suffisamment sensible 
pour quantifier la substance d'essai dans le milieu expérimental.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1212
 
Les informations sur la substance d'essai pouvant être utiles à l'éta ­
blissement des conditions expérimentales comprennent la formule 
structurale, la pureté, l'hydrosolubilité, la stabilité dans l'eau et à la lumière, le pK
 a , le K  oe , la pression de vapeur et la biodégradabilité. 
L'hydrosolubilité et la pression de vapeur peuvent être utilisées pour 
calculer la constante de Henry, qui indiquera si des pertes apprécia ­
bles de la substance d'essai risquent de se produire durant la période de l’essai. On saura ainsi s'il y a lieu de prendre des mesures parti ­
culières afin de limiter ces pertes. Si la solubilité et la stabilité de la 
substance d'essai ne sont pas connues avec certitude, il est recom ­
mandé de les évaluer dans les conditions de l'essai, c'est-à-dire dans le milieu expérimental ainsi qu'à la température et sous le régime d'éclairage appliqués durant l'essai.
 
Lorsque la maîtrise du pH du milieu expérimental est particulière ­
ment importante, par exemple lorsqu'on teste des métaux ou des 
substances hydrolytiquement instables, il est recommandé d'ajouter 
un tampon au milieu de croissance (voir premier alinéa du paragraphe 1.7.4). D'autres indications sur le traitement des subs ­
tances qui se prêtent difficilement à cet essai en raison de leurs 
propriétés physico-chimiques sont données dans la référence (11).
 
1.5. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE  
Des substances de référence telles que le 3,5-dichlorophénol utilisé 
dans l'essai tournant international (10) peuvent servir à vérifier le 
procédé expérimental. Il est conseillé de tester la substance de réfé ­
rence au moins deux fois par an ou, si l'essai est mené moins fréquemment, parallèlement à la détermination de la toxicité de la 
substance d'essai.
 
1.6. VALIDITÉ DE L'ESSAI  
Pour que l'essai soit valable, le temps de dédoublement du nombre 
de thalles chez les témoins doit être inférieur à 2,5 jours (60 heures), 
ce qui correspond approximativement à une multiplication par sept de ce nombre en sept jours et à un taux de croissance spécifique moyen de 0,275 par jour. Si l'on utilise le milieu et les conditions 
expérimentales décrits dans cette méthode d’essai, ce critère peut être 
atteint avec une méthode d'essai statique (8). Ce critère devrait aussi pouvoir être rempli dans des conditions semi-statiques et dyna ­
miques. Le calcul du temps de dédoublement est exposé au 
paragraphe 2.1.
 
1.7. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
1.7.1.  Appareillage  
Tout le matériel entrant en contact avec le milieu expérimental doit 
être en verre ou fait d'un autre matériau chimiquement inerte. La verrerie destinée aux cultures et à l'essai doit être stérile et exempte de tous les contaminants chimiques risquant d'être lessivés 
dans le milieu d'essai. Les récipients d'essai doivent être suffisam ­
ment larges pour permettre aux thalles des différentes colonies dans les récipients témoins de croître sans se recouvrir à la fin de l'essai. Il importe peu que les racines touchent le fond des récipients d'essai, 
mais il est conseillé d'utiliser des récipients d'essai d'une profondeur 
minimale de 20 mm et d'un volume minimal de 100 ml. Tout réci ­
pient répondant à ces critères peut être utilisé. Des béchers en verre, des cristallisoirs et des boîtes de Petri en verre aux dimensions 
appropriées se sont avérés adéquats. Les récipients d'essai seront 
couverts pour minimiser l'évaporation et la contamination acciden ­
telle, tout en autorisant les échanges nécessaires avec l'air. Les réci ­
pients d'essai, et en particulier leurs couvercles, ne doivent pas 
réduire l'intensité lumineuse ni modifier les caractéristiques spec ­
trales de la lumière.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1213
 
Les récipients expérimentaux et ceux contenant les cultures ne 
doivent pas être conservés ensemble. Le meilleur moyen d'y parvenir 
consiste à les garder dans des enceintes de croissance, des incuba ­
teurs ou des pièces séparés. Il faut pouvoir régler l'éclairage et la température et les maintenir à un niveau constant (voir 
paragraphe 1.7.8).
 
1.7.2.  Organisme expérimental  
Cet essai se pratique sur  Lemna gibba  ou  Lemna minor . 
L'appendice 1 fournit une brève description condensée des espèces de lentilles d'eau ayant servi à des essais de toxicité. Le matériel 
végétal peut être obtenu auprès d'une collection de cultures d'un 
autre laboratoire ou être récolté sur le terrain. Dans ce dernier cas, les plantes doivent être maintenues dans le même milieu que celui qui servira à l'essai durant au moins huit semaines avant leur utili ­
sation. Les cultures de départ ne seront prélevées que sur des sites 
manifestement non contaminés. Si les cultures proviennent d'un autre laboratoire ou d'une collection de cultures, elles seront également maintenues dans le même milieu que celui de l'essai durant au 
moins trois semaines. La source du matériel végétal ainsi que l'es ­
pèce et le clone (s'il est connu) utilisés pour l'essai doivent toujours figurer sur le rapport.
 
Il convient d'utiliser des monocultures visiblement non contaminées 
par d'autres organismes tels que des algues et des protozoaires. Les représentants sains de  L. minor  forment des colonies de deux à cinq 
thalles tandis que les colonies saines de  L. gibba  peuvent 
comprendre jusqu'à sept thalles.
 
La qualité et l'uniformité des plantes utilisées pour l'essai sont 
susceptibles d'avoir une influence sensible sur le résultat de l'essai, 
et les plantes doivent par conséquent être choisies avec soin. On 
utilisera des plantes jeunes, en croissance rapide et dépourvues de lésions visibles ou de parties décolorées (chlorose). Une fréquence élevée de colonies comprenant au moins deux thalles atteste la bonne 
qualité des cultures. Un nombre important de thalles uniques indique 
que les plantes vivent dans des conditions de stress, telles que carence en éléments nutritifs, et le matériel végétal issu de ces cultures ne peut servir à l'essai.
 
1.7.3.  Culture  
Afin d'alléger le travail d'entretien des cultures (par exemple, lorsque 
aucun essai n'est prévu sur les  Lemna  durant un certain temps), les 
cultures peuvent être maintenues à une température et sous un éclai ­
rage réduits (4-10 °C). L'appendice 2 fournit des précisions sur la 
culture. En cas de contamination visible par des algues ou d'autres 
organismes, il faut stériliser en surface un sous-échantillon de thalles de Lemna  et le transférer dans un milieu nouvellement préparé (voir 
appendice 2). Dans cette éventualité, le reste de la culture conta ­
minée est à éliminer.
 
Au moins sept jours avant l'essai, un nombre suffisant de colonies 
est transféré aseptiquement dans un milieu frais stérile et cultivé 
durant sept à dix jours dans les conditions de l'essai.  
1.7.4.  Milieu expérimental  
Les différents milieux recommandés pour  Lemna minor  et Lemna 
gibba  sont décrits ci-après. La prudence sera de rigueur en ce qui 
concerne l'ajout d'un tampon au milieu d'essai (MOPS [acide 4- 
morpholinepropanesulfonique, numéro CAS: 1132-61-2; numéro 
EINECS: 214-478-5) au milieu de  L. minor , et NaHCO  3 au milieu 
de L. gibba ] si l'on soupçonne le tampon de réagir avec la substance 
d'essai et d'influencer l'expression de sa toxicité. Le milieu de Stein ­
berg (12) est acceptable pour autant que les critères de validité soient 
respectés.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1214
 
On préconise de cultiver et de tester  L. minor  sur une version modi ­
fiée du milieu de croissance pour  Lemna  établi par la norme suédoise 
(SIS). La composition de cette version modifiée est indiquée à l'appendice 3.
 
Le milieu de croissance 20X — AAP, décrit à l'appendice 3, est 
recommandé pour la culture et l'essai de  L. gibba . 
Le milieu de Steinberg, décrit à l'appendice 3, convient à  L. minor , 
mais peut aussi être employé pour  L. gibba , à condition que les 
critères de validité soient respectés.  
1.7.5.  Solutions expérimentales  
Les solutions expérimentales sont généralement préparées par dilu ­
tion d'une solution mère, elle-même préparée par dissolution de la substance dans le milieu de croissance.
 
La plus haute concentration testée de la substance d'essai ne doit 
normalement pas dépasser l'hydrosolubilité de la substance dans les 
conditions de l'essai. Il est à noter toutefois que les espèces du genre  
Lemna  flottent à la surface et risquent d'être exposées à des subs ­
tances qui s'accumulent à l'interface eau-air (par exemple, des subs ­
tances peu solubles dans l'eau ou hydrophobes ou des tensio-actifs). 
Dans ces circonstances, l'exposition résultera de substances autres que celles qui sont en solution, de sorte que les concentrations expérimentales pourraient, suivant les caractéristiques de la substance 
d'essai, dépasser la solubilité dans l'eau. Pour les substances d'essai 
peu solubles dans l'eau, il peut être nécessaire de préparer une solu ­
tion mère concentrée ou une dispersion de la substance au moyen d'un solvant organique ou d'un dispersant, afin de faciliter l'ajout de 
quantités précises de substance d'essai au milieu expérimental et de 
favoriser sa dispersion et sa dissolution. Le recours à ces auxiliaires doit être évité dans toute la mesure du possible. Les solvants ou les dispersants auxiliaires ne doivent pas induire de phytotoxicité. L'acé ­
tone et le diméthylformamide sont des exemples de solvants courants 
qui n'engendrent aucune phytotoxicité à des concentrations allant jusqu'à 100 μl/l. Si l'on utilise un solvant ou un dispersant, sa 
concentration finale doit être limitée et ne peut pas dépasser 
100 μl/L; elle doit être identique dans tous les récipients traités et 
témoins et spécifiée dans le rapport. La référence (11) donne des indications supplémentaires sur l'utilisation des dispersants.
 
1.7.6.  Groupes traités et témoins  
Il est utile de cerner la toxicité de la substance d'essai à l'égard de  
Lemna , par exemple à l'aide d'un essai de détermination de l'ordre de 
grandeur, afin d'établir des concentrations expérimentales pertinentes. 
L'essai de toxicité proprement dit doit comprendre au moins cinq concentrations formant une série géométrique. Il est préférable que les concentrations expérimentales ne soient pas séparées par un 
facteur supérieur à 3,2, mais on peut appliquer un facteur plus 
élevé si la courbe concentration-effet a une pente nulle. L'utilisation de moins de cinq concentrations doit être justifiée. Il faut réaliser au moins trois expériences identiques à chaque concentration.
 
Le choix de la gamme des concentrations d'essai (de l'essai de 
détermination de l'ordre de grandeur ou de l'essai de toxicité) doit 
tenir compte des aspects suivants:  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1215
 
— pour déterminer la CE  x , les concentrations expérimentales 
doivent entourer la valeur de la CE  x afin que le niveau de 
confiance soit suffisant. Par exemple, s'il s'agit d'estimer la CE
 50 , la concentration expérimentale la plus élevée doit dépasser 
la valeur de la CE  50 . Si la CE  50 sort de la gamme des concen ­
trations expérimentales, les intervalles de confiance seront larges 
et il risque d'être impossible d'évaluer correctement la validité de l'ajustement statistique du modèle,
 
— s'il s'agit d'estimer la CMEO et la CSEO, la plus petite concen ­
tration expérimentale doit être suffisamment basse pour que la croissance des lentilles d'eau ne soit pas ralentie de manière significative par rapport à celle des témoins. De plus, la concen ­
tration expérimentale la plus élevée doit être suffisamment élevée 
pour que la croissance soit sensiblement inférieure à celle des témoins. Si ce n'est pas le cas, l'essai devra être répété à une gamme de concentrations différente (à moins que la concentra ­
tion la plus élevée n'atteigne la limite de solubilité ou la concen ­
tration limite supérieure autorisée, par exemple 100 mg/l).
 
Chaque essai doit inclure des témoins sans substance d'essai, mais 
identiques aux récipients traités pour ce qui est du milieu nutritif, du 
nombre de thalles et de colonies, des conditions environnementales et du procédé expérimental. Si l'on utilise un solvant ou un disper ­
sant auxiliaire, il faut inclure un témoin supplémentaire contenant le 
solvant ou le dispersant à la même concentration que dans les réci ­
pients contenant la substance d'essai. Le nombre de récipients témoins identiques (et de témoins contenant le solvant, le cas échéant) doit être au moins égal, et idéalement deux fois supérieur, 
au nombre de récipients d'essai utilisés à chaque concentration expé ­
rimentale.
 
Si la détermination de la CSEO n'est pas requise, la conception de 
l'essai peut être modifiée pour augmenter le nombre de concentra ­
tions et diminuer le nombre d'expériences identiques par concentra ­
tion. Toutefois, le nombre de témoins identiques doit être au moins égal à trois.
 
1.7.7.  Exposition  
Des colonies formées de 2 à 4 thalles visibles sont prélevées dans la 
culture de l'inoculum et réparties au hasard dans les récipients d'essai dans des conditions d’asepsie. Chaque récipient d'essai doit contenir 9 à 12 thalles au total. Le nombre de thalles et de colonies doit être 
identique dans chaque récipient d'essai. L'expérience acquise avec 
cette méthode et l'essai tournant montrent que l'utilisation de trois expériences identiques par traitement, comprenant chacune 9 à 12 thalles au départ, suffit pour détecter des différences de crois ­
sance entre les traitements équivalant à environ 4 à 7 % d'inhibition, 
si celles-ci sont calculées d'après le taux de croissance, et de 10 à 15 % si elles sont calculées d'après le rendement (10).
 
L'emplacement des récipients expérimentaux dans l'incubateur doit 
être aléatoire, afin de réduire au minimum l'influence des différences spatiales d'intensité lumineuse ou de température. La disposition des récipients au moment d'effectuer les observations (ou plus souvent de 
remettre en place les récipients) est également régie par un plan en 
blocs ou une procédure aléatoire.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1216
 
Si un essai de stabilité préliminaire montre que la concentration de la 
substance d'essai ne peut être maintenue (la concentration mesurée 
tombe en dessous de 80 % de la concentration mesurée initialement) sur la durée de l'essai (sept jours), on recommande la méthode semi- statique. Dans ce cas, les colonies doivent être exposées au moins 
deux fois durant l'essai (par exemple, les troisième et cinquième 
jours) à des solutions d'essai et à des solutions témoins nouvellement préparées. La fréquence de l'exposition à un milieu renouvelé dépendra de la stabilité de la substance d'essai: une fréquence plus 
élevée peut s'avérer nécessaire pour maintenir des concentrations 
presque constantes dans le cas de substances très instables ou vola ­
tiles. Certaines circonstances appellent une méthode dynamique (11) ­
(13).
 
La voie d'exposition par application foliaire (pulvérisation) n'est pas 
reprise dans cette méthode d’essai, mais la référence (14) donne des informations à ce sujet.
 
1.7.8.  Conditions d'incubation  
On applique un éclairage continu à fluorescence blanche, chaude ou 
froide, afin d'obtenir une intensité lumineuse comprise entre 85 
et 135 μE·m  –2 s –1 lorsqu'elle est mesurée dans le domaine de 
longueur d'onde autorisant la photosynthèse (400 à 700 nm) à des points situés à la même distance de la source lumineuse que les 
thalles de  Lemna  (équivalant à 6 500-10 000 lux). Tout écart par 
rapport à l'intensité lumineuse choisie ne doit pas dépasser ± 15 % dans la zone de l'essai. La méthode de détection et de mesure de la lumière, notamment le type de capteur, affectera la valeur mesurée. 
Les capteurs sphériques (qui détectent la lumière provenant de tous 
les angles situés au-dessus et en dessous du plan de mesure) et les capteurs «cosinus» (qui détectent la lumière provenant de tous les angles situés au-dessus du plan de mesure) sont préférables aux 
capteurs unidirectionnels et afficheront des valeurs plus élevées 
pour une source lumineuse multiple comme celle qui est décrite ici.
 
La température des récipients d'essai est maintenue à 24 ± 2 °C. Le 
pH du milieu témoin ne peut augmenter de plus de 1,5 unité au 
cours de l'essai. Toutefois, un écart supérieur à 1,5 unité n'invalidera 
pas l'essai, si le respect des critères de validité peut être démontré. Il faudra être particulièrement attentif aux variations du pH dans 
certains cas particuliers, notamment avec des substances instables 
et des métaux. La référence (11) fournit des indications supplémen ­
taires à ce sujet.
 
1.7.9.  Durée  
L'essai prend fin sept jours après le transfert des plantes dans les 
récipients expérimentaux.  
1.7.10.  Mesures et déterminations analytiques  
Au début de l'essai, on dénombre les thalles présents dans les réci ­
pients d'essai et on consigne ces valeurs en prenant soin de compter les thalles émergents bien visibles. Les nombres de thalles paraissant normaux ou anormaux sont déterminés au début de l'essai, au moins 
une fois tous les trois jours durant la période d'exposition (c'est-à- 
dire à au moins deux occasions au cours de la période de sept jours) et à la fin de l'essai. Il y a lieu de noter les changements affectant le développement des plantes, par exemple en ce qui concerne la taille 
et l'aspect des thalles, les signes de nécrose, de chlorose ou les 
gibbosités, la fragmentation des colonies ou la diminution de leur flottabilité ainsi que la longueur et l'aspect des racines. Les caracté ­
ristiques significatives du milieu d'essai (par exemple, la présence de 
matières non dissoutes, le développement d'algues dans les récipients 
d’essai) doivent également être rapportées.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1217
 
Durant l'essai, en plus de la détermination du nombre de thalles, on 
mesure aussi les effets de la substance d'essai sur une ou plusieurs 
des variables suivantes:  
i) superficie totale des thalles;  
ii) poids sec;  
iii) poids frais.  
La superficie totale des thalles présente l'avantage de pouvoir être 
déterminée pour chaque récipient traité et témoin au début, pendant 
et à la fin de l'essai. Le poids sec ou frais est déterminé au début de l'essai à partir d'un échantillon de la culture de l'inoculum représen ­
tatif du matériel utilisé pour entamer l'essai et à la fin de l'essai avec 
le matériel végétal de chaque récipient traité et de chaque récipient 
témoin. Si la superficie des thalles n'est pas mesurée, le poids sec est préférable au poids frais.
 
La superficie totale des thalles, le poids sec et le poids frais peuvent 
être déterminés comme suit:  
i) superficie totale des thalles : la superficie totale des thalles de toutes 
les colonies peut être déterminée par analyse de l'image. On saisit la 
silhouette du récipient expérimental et des plantes avec une caméra 
vidéo (en plaçant le récipient sur une boîte lumineuse) et on numé ­
rise l'image obtenue. Un étalonnage réalisé avec des formes planes de superficie connue permet ensuite de déterminer la superficie 
totale des thalles dans un récipient d'essai. On veillera à éviter 
toute interférence avec le bord du récipient d'essai. Une autre méthode plus laborieuse consiste à photocopier les récipients d'essai contenant les plantes, à découper la silhouette résultant des 
colonies et à déterminer leur superficie à l'aide d'un analyseur de la 
surface foliaire ou de papier millimétré. D'autres techniques (par exemple, le quotient du poids de la silhouette découpée dans le papier par le poids d'un morceau de papier de superficie connue) 
conviennent également;
 
ii) poids sec : toutes les colonies sont prélevées dans chaque réci ­
pient d'essai et rincées avec de l'eau distillée ou désionisée. Elles sont déposées sur un buvard qui absorbe l'excès d'eau et séchées à 60 °C jusqu'à ce qu'elles atteignent un poids constant. Tous les 
fragments de racines doivent être inclus. Le poids sec doit être 
exprimé avec une précision d'au moins 0,1 mg;
 
iii) poids frais : toutes les colonies sont transférées dans des tubes de 
polystyrène (ou d'un autre matériau inerte) tarés et percés de petits trous (1 mm) dans leur fond arrondi. Les tubes sont ensuite centrifugés à 3 000 tpm pendant 10 minutes à tempéra ­
ture ambiante. Les tubes contenant les colonies ainsi séchées 
sont repesés, et le poids frais est calculé par déduction de la tare du tube.
 
1.7.10.1.  Fréquence des mesures et des déterminations analytiques  
Avec le procédé statique, le pH de chaque récipient traité doit être 
mesuré au début et à la fin de l'essai. Si le procédé est semi-statique, le pH est mesuré dans chaque lot de «nouvelle» solution expérimen ­
tale avant chaque renouvellement ainsi que dans les solutions «uti ­
lisées» correspondantes.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1218
 
L'intensité lumineuse est mesurée dans l'enceinte de croissance, dans 
l'incubateur ou dans la pièce à des points situés à la même distance 
de la source de lumière que les thalles de  Lemna , et ce au moins une 
fois au cours de l'essai. La température du milieu est mesurée au moins une fois par jour dans un récipient d'essai supplémentaire 
gardé dans les mêmes conditions que les autres dans l'enceinte de 
croissance, l'incubateur ou la pièce.
 
Durant l'essai, les concentrations de la substance d'essai sont déter ­
minées à intervalles appropriés. Dans les essais statiques, il faut 
déterminer les concentrations au moins au début et à la fin de l'essai.  
Dans les essais semi-statiques, où l'on s'attend à ce que la concen ­
tration de la substance d'essai ne reste pas dans un intervalle de ± 20 % de la concentration nominale, il est nécessaire d'analyser 
toutes les solutions d'essai nouvellement préparées et les mêmes 
solutions à chaque renouvellement (voir troisième alinéa du paragraphe 1.7.7). Néanmoins, pour les essais où la concentration de la substance d'essai mesurée initialement ne se situe pas dans un 
intervalle de ± 20 % de la concentration nominale, mais où suffi ­
samment d'indices attestent que les concentrations initiales sont répé ­
tables et stables (c'est-à-dire dans l'intervalle de 80-120 % de la concentration initiale), les analyses chimiques peuvent n'être effec ­
tuées qu'aux concentrations expérimentales maximale et minimale. 
Dans tous les cas, la détermination des concentrations de la subs ­
tance d'essai avant le renouvellement pourra n’être effectuée que dans un seul des récipients identiques de chaque concentration expé ­
rimentale (ou dans un récipient dans lequel on aura mélangé le 
contenu de tous les récipients traités de manière identique).
 
Un régime de prélèvement identique à celui décrit pour les essais semi- 
statiques pourra être appliqué aux essais dynamiques, avec une analyse 
au début, au milieu et à la fin de l'essai, mais sans l'analyse des solutions 
«utilisées» qui ne se justifie pas dans ce cas. Dans ce type d'essai, le débit du diluant et de la substance d'essai ou de la solution mère de la subs ­
tance d'essai doit être contrôlé quotidiennement.
 
S'il s'avère que la concentration de la substance d'essai a pu se 
maintenir tout au long de l'essai dans un intervalle de ± 20 % de la concentration nominale ou mesurée initialement, l'analyse des résultats peut s'appuyer sur les valeurs nominales ou mesurées initia ­
lement. Si l'écart par rapport à la concentration nominale ou mesurée 
initialement est supérieur à ± 20 %, l'analyse des résultats devra reposer sur la moyenne géométrique de la concentration relevée durant l'exposition ou sur des modèles décrivant le déclin de la 
concentration de la substance d'essai (11).
 
1.7.11.  Essai limite  
Dans certaines circonstances, par exemple lorsqu'un essai prélimi ­
naire indique que la substance d'essai n'exerce aucun effet toxique à des concentrations allant jusqu'à 100 mg/l ou à sa limite de solu ­
bilité dans le milieu d'essai (suivant celle qui est la plus basse), on 
peut effectuer un essai limite afin de comparer les réactions d'un 
groupe témoin avec celles d'un groupe traité (à 100 mg/l ou à une concentration égale à la limite de solubilité). Il est fortement recom ­
mandé d'étayer cet essai par une analyse de la concentration d'expo ­
sition. Tous les critères de validité et conditions expérimentales 
décrits précédemment s'appliquent à l'essai limite, si ce n'est que le nombre de récipients traités de manière identique doit être doublé. La croissance des lentilles d'eau dans le groupe témoin et dans le groupe 
traité peut être analysée au moyen d'un test statistique permettant de 
comparer les moyennes, par exemple un test t de Student.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1219
 
2. RÉSULTATS ET RAPPORT  
2.1. TEMPS DE DOUBLEMENT  
La formule suivante, appliquée avec les données provenant des réci ­
pients témoins, permet de déterminer le temps de doublement (T  d ) du 
nombre de thalles et de vérifier si l'étude respecte ce critère de 
validité (paragraphe 1.6):  
T d = ln 2/μ 
où μ est le taux de croissance spécifique moyen calculé suivant les 
indications des deux premiers alinéas du paragraphe 2.2.1.  
2.2. VARIABLES ÉTUDIÉES  
Cet essai est destiné à déterminer les effets de la substance d'essai 
sur la multiplication végétative de  Lemna . Cette méthode d’essai 
décrit deux variables, de manière à répondre aux différentes préfé ­
rences et exigences réglementaires des pays membres. Pour que les 
résultats de l'essai soient acceptables dans tous les pays membres, les effets doivent être évalués en fonction des deux variables étudiées a) et b) définies ci-dessous.
 
a) taux de croissance spécifique moyen: cette variable étudiée est 
calculée d'après les changements affectant, d'une part, les loga ­
rithmes du nombre de thalles et, d'autre part, les logarithmes d'un 
autre paramètre mesuré (superficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) en fonction du temps (exprimé en jours), chez les témoins et dans chaque groupe traité. Elle est quelquefois appelée 
«taux de croissance relatif» (15).
 
b) rendement: cette variable étudiée est calculée d'après les modifi ­
cations du nombre de thalles et d’un autre paramètre mesuré 
(superficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) chez les 
témoins et dans chaque groupe traité, jusqu'à la fin de l'essai.  
Notons que les valeurs de toxicité calculées avec ces deux variables 
étudiées ne sont pas comparables et qu'il faut tenir compte de cette différence lorsqu'on utilise les résultats de l'essai. Les valeurs de la CE
 x fondées sur le taux de croissance spécifique moyen (C  x E t ) 
seront généralement supérieures à celles fondées sur le rendement 
(C x E r ), si les conditions expérimentales de cette méthode d’essai sont 
appliquées, en raison du fondement mathématique de chacune de ces approches. Cette différence n’est due qu'au calcul mathématique, il 
ne s'agit pas d'une différence de sensibilité entre les deux variables 
étudiées. Le concept du taux de croissance spécifique moyen repose sur le schéma général de croissance exponentielle des lentilles d'eau dans des cultures non limitées, où la toxicité est estimée d'après les 
effets sur le taux de croissance, sans tenir compte du niveau absolu 
du taux de croissance spécifique du témoin, de la pente de la courbe concentration-effet, ni de la durée de l'essai. En revanche, les résul ­
tats fondés sur la variable de rendement dépendent de toutes ces 
autres variables. La C
 x E r dépend du taux de croissance spécifique 
de l'espèce de lentille d'eau utilisée dans chaque essai et du taux de croissance spécifique maximal, susceptible de varier d’une espèce à une autre, voire d’un clone à l’autre. Cette variable ne doit pas être 
utilisée pour comparer la sensibilité de différentes espèces, voire de 
différents clones de lentilles d'eau. S'il est préférable, du point de vue scientifique, d'estimer la toxicité d'après le taux de croissance spéci ­
fique moyen, la présente méthode d’essai propose également des 
estimations fondées sur le rendement afin de satisfaire à la réglemen ­
tation en vigueur dans certains pays
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1220
 
Les estimations de la toxicité doivent reposer sur le nombre de 
thalles ainsi que sur une autre variable mesurée (superficie totale 
des thalles, poids sec ou poids frais), parce que certaines substances peuvent avoir un effet bien plus prononcé sur une variable autre que le nombre de thalles, qui pourrait ne pas être détecté par le seul 
calcul du nombre de thalles.
 
On dresse un tableau réunissant le nombre de thalles et toute autre 
variable mesurée (c’est à dire superficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) ainsi que les concentrations de la substance d'essai 
relevées à chaque mesure. Les analyses ultérieures, par exemple pour 
estimer la CMEO, la CSEO ou la CE
 x , doivent s'appuyer sur les 
valeurs de chaque expérience identique d'un même essai et non sur les moyennes calculées pour chaque groupe traité.
 
2.2.1.  Taux de croissance spécifique moyen  
Le taux de croissance spécifique moyen durant une période donnée 
est calculé en fonction de l'accroissement logarithmique des variables 
de la croissance — nombre de thalles et une autre variable mesurée (superficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) — au moyen 
de la formule ci-dessous pour chaque expérience identique des 
groupes traités et témoins:
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
où: 
— μ i-j : taux de croissance spécifique moyen du temps i au temps j,  
— N  i : variable mesurée dans le récipient témoin ou traité au 
temps i,  
— N  j : variable mesurée dans le récipient témoin ou traité au 
temps j,  
— t: période de temps comprise entre i et j.  
Pour chaque groupe traité et témoin, calculer un taux de croissance 
moyen et les estimations de la variance.  
On calcule le taux de croissance spécifique moyen sur l'ensemble de 
la période d'essai (le temps «i» mentionné dans la formule ci-dessus 
correspond au début de l'essai et le temps «j» à la fin de l'essai). 
Pour chaque concentration des groupes traités et des témoins, calculer la valeur moyenne du taux de croissance spécifique ainsi que les estimations de la variance. Évaluer également le taux de 
croissance section par section, afin d'apprécier les effets de la subs ­
tance d'essai durant la période d'exposition (par exemple, en analy ­
sant les courbes de croissance log-transformées). Un taux de crois ­
sance section par section sensiblement différent du taux de crois ­
sance moyen montre qu'il y a un écart par rapport à la croissance 
exponentielle constante, écart qui réclame un examen attentif des courbes de croissance. Dans ce cas, une approche prudente consis ­
terait à comparer les taux de croissance spécifiques des cultures 
traitées durant la période d'inhibition maximale avec ceux des 
témoins au cours de la même période.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1221
 
Le pourcentage d'inhibition du taux de croissance (I  t ) peut ensuite 
être calculé pour chaque concentration expérimentale (groupe traité) 
selon la formule suivante:  
% I t ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
où: 
— % I  t : pourcentage d'inhibition du taux de croissance spécifique 
moyen,  
— μ C : valeur moyenne de μ dans le groupe témoin,  
— μ T : valeur moyenne de μ dans le groupe traité.  
2.2.2.  Rendement  
Les effets sur le rendement sont déterminés en fonction de deux 
variables mesurées: le nombre de thalles et une autre variable (super ­
ficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) mesurées dans chaque récipient d'essai au début et à la fin de l'essai. En ce qui concerne le poids frais ou sec, la biomasse de départ est déterminée à 
partir d'un échantillon de thalles prélevé dans le lot qui a servi à 
ensemencer les récipients d'essai (voir deuxième alinéa du paragraphe 1.7.3). Pour chaque concentration expérimentale et le témoin, calculer un rendement moyen ainsi que les estimations de 
la variance. Le pourcentage moyen d'inhibition du rendement (%I
 r ) 
peut être calculé pour chaque groupe traité d'après la formule suivante:
 
% I r ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
où: 
— % I  r : pourcentage de réduction du rendement,  
— b  C : biomasse finale moins la biomasse de départ dans le 
groupe témoin,  
— b  T : biomasse finale moins la biomasse de départ dans le 
groupe traité.  
2.2.3.  Tracé des courbes concentration-effet  
On trace des courbes concentration-effet décrivant le pourcentage 
d'inhibition moyen de la variable étudiée (I  t ou I  r calculées comme 
indiqué au dernier alinéa des paragraphes 2.2.1 ou 2.2.2) en fonction 
du logarithme de la concentration de la substance d'essai.  
2.2.4.  Estimation de la CE  x 
Les estimations de la CE  x (par exemple, la CE  50 ) s'appuient à la fois 
sur le taux de croissance spécifique moyen (C  x E t ) et sur le rende ­
ment (C  x E r ), qui doivent, à leur tour, reposer sur le nombre de 
thalles et sur une variable mesurée supplémentaire (superficie totale des thalles, poids sec ou poids frais) puisque certaines subs ­
tances n'exercent pas le même effet sur le nombre de thalles que sur 
d'autres variables mesurées. Les paramètres de toxicité souhaités sont donc quatre valeurs de CE
 x pour chaque niveau d'inhibition x 
calculé: C  x E t (nombre de thalles); C  x E t (superficie totale des thalles, 
poids sec ou frais); C  x E r (nombre de thalles); et C  x E r (superficie 
totale des thalles, poids sec ou frais).  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1222
 
2.3. MÉTHODES STATISTIQUES  
L'objectif consiste à obtenir une relation quantitative concentration- 
effet par une analyse de la régression. Il est possible d'utiliser une régression linéaire pondérée après avoir effectué une transformation 
linéarisant les valeurs décrivant l'effet observé — par exemple en 
unités probit ou logit ou Weibull (16), mais il est préférable d'ap ­
pliquer des méthodes de régression non linéaire, celles-ci traitant mieux les irrégularités inévitables des valeurs et les écarts par 
rapport aux distributions régulières. Proches de zéro ou de l'inhibi ­
tion totale, ces irrégularités risquent d'être amplifiées par la trans ­
formation et d'interférer avec l'analyse (16). Notons que les méthodes 
d'analyse courantes faisant appel aux transformations probit, logit ou 
Weibull sont destinées à être utilisées avec des effets par tout ou rien (mortalité ou survie, par exemple) et doivent être modifiées pour pouvoir être utilisées avec les valeurs du taux de croissance ou du 
rendement. Les références (17)(18) et (19) décrivent des procédures 
permettant de déterminer les valeurs de la CE
 x à partir de données 
continues.  
Pour chaque variable étudiée à analyser, utiliser la relation concen ­
tration-effet pour calculer des estimations ponctuelles des valeurs de 
CE x . Déterminer, si possible, les limites de confiance à 95 % pour 
chaque estimation. La validité de l'ajustement des données décrivant les effets au modèle de régression est à évaluer par un procédé statistique ou graphique. L'analyse de la régression doit s'appuyer 
sur les effets relevés dans chaque récipient traité de manière iden ­
tique et non sur les moyennes des groupes traités.
 
Les estimations de la CE  50 et les limites de confiance peuvent aussi 
être obtenues par interpolation linéaire avec  bootstrap  (rééchantillon ­
nage) (20), si les modèles ou méthodes de régression disponibles ne 
conviennent pas aux données.  
Afin d'estimer la CMEO, et par conséquent la CSEO, il est néces ­
saire de comparer les moyennes des groupes traités par une analyse de la variance (ANOVA). La moyenne de chaque concentration doit 
ensuite être comparée avec la moyenne du témoin à l'aide d'un test 
approprié à comparaisons multiples ou de tendance. Les essais de Dunnett ou de William peuvent être utiles (21)(22)(23)(24). Il est nécessaire de vérifier si l'hypothèse de l’ANOVA de l'homogénéité 
de la variance se confirme. Cette vérification peut être pratiquée par 
un procédé graphique ou par un test formel (25), notamment les tests de Levene ou de Bartlett. L'infirmation de l'hypothèse de l'homogé ­
néité de la variance peut quelquefois être corrigée par une trans ­
formation logarithmique des données. Si l'hétérogénéité de la 
variance est extrême et ne peut être rectifiée par une transformation, on envisagera des méthodes d'analyse telles que les tests de tendance régressifs de Jonkheere. La référence (19) livre des renseignements 
supplémentaires sur la détermination de la CSEO.
 
Des découvertes récentes conduisent les scientifiques à préconiser 
l'abandon de la notion de CSEO au profit d’estimations ponctuelles de la CE
 x fondées sur la régression. Aucune valeur appropriée de x 
n'a encore été établie pour cet essai sur les  Lemna . Néanmoins, une 
gamme de 10 à 20 % semble convenir (suivant la variable étudiée sélectionnée) et il est préférable de mentionner à la fois la CE
 10 et la 
CE 20 dans le rapport.  
3. RAPPORT  
3.1. RAPPORT D'ESSAI  
Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes:  
Substance d'essai:  
— état physique et propriétés physico-chimiques, notamment la 
limite de solubilité dans l'eau,  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1223
 
— données d'identification chimique (par exemple, numéro CAS), y 
compris la pureté.  
Espèce soumise à l'essai:  
— nom scientifique, clone (s'il est connu) et source.  
Conditions expérimentales:  
— procédé expérimental appliqué (statique, semi-statique 
ou dynamique),  
— date du début de l'essai et durée de l'essai,  
— milieu expérimental,  
— description de la conception de l'essai (récipients d'essai et 
couvercles, volumes des solutions, nombre de colonies et de thalles par récipient au début de l'essai),
 
— concentrations expérimentales (nominales et mesurées selon les 
besoins) et nombre d'expériences identiques par concentration,  
— méthodes de préparation des solutions mères et des solutions 
d'essai, y compris l'utilisation d'un solvant ou d'un dispersant, le cas échéant,
 
— température appliquée durant l'essai,  
— source, intensité et homogénéité lumineuses,  
— valeurs du pH des milieux traités et des milieux témoins,  
— concentrations de la substance d'essai, méthode d'analyse et 
données permettant d'évaluer la qualité (études de validation, écarts-types ou limites de confiance des analyses),
 
— méthodes de détermination du nombre de thalles et des autres 
variables mesurées, par exemple le poids sec, le poids frais ou la superficie des thalles,
 
— tous les écarts par rapport à cette méthode d’essai.  
Résultats:  
— données brutes: nombre de thalles et autres variables mesurées 
dans chaque récipient traité et témoin à chaque observation et à chaque analyse,
 
— moyennes et écarts-types de chaque variable mesurée,  
— courbes de croissance à chaque concentration (il est recommandé 
d'ajouter la transformation logarithmique de la variable mesurée, voir deuxième alinéa du paragraphe 2.2.1),
 
— temps de doublement/taux de croissance chez le témoin d'après le 
nombre de thalles,  
— calcul des variables étudiées pour chaque expérience identique à 
chaque concentration, avec valeurs moyennes et coefficient de variation des expériences identiques,
 
— représentation graphique de la relation concentration-effet,  
— estimation des effets toxiques pour les variables étudiées, par 
exemple CE  50 , CE  20 , CE  10 et intervalles de confiance associés; 
si elles ont été calculées, la CMEO et/ou la CSEO ainsi que les 
méthodes statistiques utilisées pour les déterminer,  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1224
 
— si on a pratiqué une analyse de la variance, la puissance de l'effet 
détectable (par exemple, la différence la moins significative),  
— toute stimulation de la croissance, le cas échéant, dans un groupe 
traité,  
— tout signe visuel de phytotoxicité et observations des solutions 
d'essai,  
— analyse des résultats, y compris l'influence d'un éventuel écart 
par rapport à cette méthode d’essai.  
4. BIBLIOGRAPHIE  
1) OCDE LD 221 (2006)  Lemna  sp. Essais d'inhibition de la crois ­
sance.  
2) L’utilisation des études sur les  lemna  pour les substances colo ­
rées est détaillée au point 13.5.3 du Manuel des décisions de l’UE daté de juillet 2006, disponible à l’adresse http:// 
ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals
 
3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; 
Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, disponible à l’adresse
 
i. http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/infor ­
mation_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
5) USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., «Public draft». EPA 712-C-96-156. 8pp.
 
6) AFNOR — Association française de normalisation. (1996). XP 
T 90-337: détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 pages.  
7) Institut suédois de normalisation (SIS). (1995). Qualité de l'eau 
— détermination de l'inhibition de la croissance de  Lemna 
minor , lentille d'eau, sur sept jours. SS 02 82 13. 15 pages 
(en suédois).  
8) Environment Canada. (1999). Méthode d'essai biologique: essai 
de mesure de l'inhibition de la croissance de la plante macro ­
scopique dulcicole,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 pages.  
9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
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10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft 
OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
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12) ISO DIS 20079. Qualité de l'eau — détermination de l'effet 
toxique des constituants de l'eau et des eaux résiduaires vis-à- 
vis des lentilles d'eau ( Lemna minor ) — essai d'inhibition de la 
croissance des lentilles d'eau.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1225
 
13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor  L.). Environmental Research Labora ­
tory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3-77 108. September 1977.
 
14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioas ­
says with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed 
and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.  
15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, 481-483.  
16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  
17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.
 
18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
 
19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121.  
22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics, 20, 482-491.  
23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103-117.  
24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1226
 
Appendice 1  
Description de  Lemna  spp.  
La plante aquatique communément appelée «lentille d'eau»,  Lemna  spp., appar ­
tient à la famille des  Lemnaceae  représentée par quatre genres répartis dans le 
monde. Leur taxonomie et leur aspect ont été décrits de façon complète (1)(2).  
Lemna gibba  et Lemna minor  sont des espèces représentatives des zones tempé ­
rées et sont couramment utilisées dans les essais de toxicité. Ces deux espèces se caractérisent par une tige discoïde (thalle) flottante ou submergée, et une racine très fine partant du centre de la face inférieure de chaque thalle. Les  Lemna  spp. 
produisent rarement des fleurs et se reproduisent par voie végétative en engen ­
drant de nouveaux thalles (3). Comparativement aux sujets âgés, les jeunes plantes ont tendance à être plus pâles, à avoir des racines plus courtes et à comporter deux ou trois thalles de différentes tailles. De par leur petite taille, 
leur structure simple, leur reproduction asexuée et la brièveté du temps séparant 
deux générations, les plantes du genre  Lemna  se prêtent remarquablement bien 
aux essais en laboratoire (4)(5).
 
La sensibilité étant susceptible de varier d’une espèce à l’autre, seules les compa ­
raisons de sensibilités intraspécifiques sont valables.  
Exemples d'espèces de  Lemna  ayant servi à des essais: références bibliogra ­
phiques des espèces  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». 
EPA 712-C-96-156. 8 pages.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: déter ­
mination de l'inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 pages.  
Institut suédois de normalisation (SIS). (1995). Qualité de l'eau — détermination 
de l'inhibition de la croissance de  Lemna minor , lentille d'eau, sur sept jours. SS 
02 82 13. 15 pages (en suédois).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733- 
742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». EPA 
712-C-96-156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1227
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Sources d'espèces de  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, CANADA, M5S 3 B2  
Tél. + 1-416-978-3641  
Fax + 1-416-978-5878  
courriel: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
ÉTATS-UNIS D'AMÉRIQUE  
Tél. 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 Stockholm  
SUÈDE  
Tél: + 46 86747240  
Fax + 46 86747636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
ALLEMAGNE  
courriel: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Bibliographie  
1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.  
2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricul ­
tural Research Council of Norway, University of Oslo.  
4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.  
5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1228
 
Appendice 2  
Entretien d'une culture mère  
Les cultures mères peuvent être conservées à basse température (4-10 °C) durant 
de longues périodes sans qu'il soit nécessaire de les rétablir. Le milieu de crois ­
sance des  Lemna  peut être identique à celui utilisé pour les essais, mais d'autres 
milieux riches en nutriments conviennent également aux cultures mères.  
Régulièrement, plusieurs jeunes plantes vert clair sont prélevées et transférées 
aseptiquement dans de nouveaux récipients de culture contenant un milieu frais. Aux basses températures proposées ici, les sous-cultures peuvent être lancées à des intervalles allant jusqu'à trois mois.
 
Il convient d'utiliser des récipients de culture en verre stériles et chimiquement 
propres (lavés à l'acide), et d'employer des techniques de manipulation asep ­
tiques. Si la culture mère est contaminée, par des algues ou des champignons par exemple, on prendra les mesures nécessaires pour éliminer les organismes contaminants. S'agissant des algues et de la plupart des autres organismes conta ­
minants, une stérilisation en surface peut suffire. Pour ce faire, on prélève un 
échantillon des plantes contaminées et on leur coupe les racines. On agite ensuite les plantes vigoureusement dans de l'eau propre, avant de les immerger dans une 
solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 % (v/v) durant 30 secondes à 5 minutes. 
Après quoi, on rince les plantes à l'eau stérile et on les transfère en plusieurs lots dans des récipients de culture contenant du milieu de croissance frais. Ce traite ­
ment détruit beaucoup de thalles, surtout si les périodes d'exposition sont plus 
longues, mais certaines des plantes survivantes ne sont généralement plus conta ­
minées. Celles-ci peuvent alors être utilisées pour ensemencer de nouvelles cultures.
 ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1229
 
Appendice 3  
Milieux  
Différents milieux de croissance sont recommandés pour  L. minor  et L. gibba , à 
savoir une version modifiée du milieu établi par l'Institut suédois de normalisa ­
tion (SIS) pour  L. minor , et le milieu 20X AAP pour  L. gibba . Ces deux milieux, 
dont les compositions sont données ci-dessous, doivent être préparés avec des 
réactifs et des produits de qualité «réactifs» ou «pour analyse» et de l'eau désionisée.
 
Milieu de croissance pour Lemna établi d'après celui de l'Institut suédois de 
normalisation  
— Les solutions mères I-V sont stérilisées à l'autoclave (120 °C, 15 minutes) ou 
par filtration sur une membrane (à pores d'environ 0,2 μm). 
— La solution mère VI (et, si on le souhaite, la solution mère VII) ne sont 
stérilisées que par filtration sur membrane; elles ne doivent pas être autocla ­
vées.  
— Les solutions mères stériles doivent être entreposées au frais et à l'obscurité. 
Les solutions mères I-V doivent être éliminées après six mois, tandis que la 
solution mère VI et, le cas échéant, la solution mère VII, sont périmées après 1 mois.
 
Solution mère 
n o Substance Concentration 
dans la solution 
mère (g/l) Concentration 
dans le milieu 
préparé (mg/l) Milieu préparé 
Élément Concentration 
(mg/l)  
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 0,050 
0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 0,050 
0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo Zn 
Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 0,011 
0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (tampon) 490 490 — —  
— Pour préparer un litre de milieu SIS, ajouter les ingrédients suivants à 900 ml 
d'eau désionisée:  
— 10 ml de solution mère I,  
— 5 ml de solution mère II,  
— 5 ml de solution mère III,  
— 5 ml de solution mère IV,  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1230
 
— 1 ml de solution mère V,  
— 5 ml de solution mère VI,  
— 1 ml de solution mère VII (facultatif).  
Note:  la solution mère VII (tampon MOPS) peut être nécessaire pour certaines subs ­
tances d'essai (voir dernier alinéa du paragraphe 1.4).  
— Le pH est ajusté à 6,5± 0,2 avec du HCl ou du NaOH 0,1 ou 1 M, et le 
volume est porté à un litre avec de l'eau désionisée.  
Milieu de croissance 20X AAP  
Les solutions mères sont préparées dans de l'eau stérile distillée ou désionisée.  
Les solutions mères stériles doivent être entreposées au frais et à l'obscurité. Dans 
ces conditions, les solutions mères se conservent au moins 6 à 8 semaines.  
Cinq solutions mères nutritives (A1, A2, A3, B et C) sont préparées pour le 
milieu 20X AAP, avec des produits de qualité «réactifs». Le milieu de croissance 
se compose de 20 ml de chaque solution mère nutritive ajoutés à environ 850 ml d'eau désionisée. Le pH est ajusté à 7,5 ± 0,1 avec du HCl ou du NaOH 0,1 ou 1 M, et le volume est porté à un litre avec de l'eau désionisée. Le milieu est 
ensuite filtré sur une membrane à pores d'environ 0,2 μm dans un récipient 
stérile.
 
Le milieu de croissance destiné aux essais doit être préparé un à deux jours avant 
son utilisation pour que le pH ait le temps de se stabiliser. On vérifie le pH du milieu de croissance avant utilisation et on le rajuste si nécessaire par l'ajout 
d'une solution de HCl ou de NaOH 0,1 ou 1 M, comme décrit ci-dessus.
 
Solution mère 
n o Substance Concentration dans 
la solution mère (g/ 
l) (  1 ) Concentration dans 
le milieu préparé 
(mg/l) (*) Milieu préparé 
Élément Concentration 
(mg/l) (*)  
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Sauf mention contraire.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1231
 
Note:  la concentration finale de bicarbonate théoriquement appropriée (permettant d'éviter un 
ajustement appréciable du pH) est de 15 mg/l et non de 300 mg/l. Toutefois, le milieu 
20X-AAP a jusqu'à présent été utilisé avec une concentration de 300 mg/l de bicar ­
bonate, y compris dans l'essai tournant réalisé pour cette méthode [I. Sims, P. White ­
house et R. Lacey (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development 
and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc — Environment Agency].  
Milieu de Steinberg (d'après la norme ISO 20079)  
Concentrations et solutions mères  
— Dans la norme ISO 20079, le milieu modifié de Steinberg n'est utilisé que 
pour Lemna minor  (puisque seule  Lemna minor  est autorisée dans les essais 
relevant de cette norme), mais des essais ont montré que  Lemna gibba  
pouvait également donner de bons résultats.  
— Ce milieu doit être préparé avec des produits de qualité «réactifs» ou «pour 
analyse» et de l'eau désionisée.  
— Préparer le milieu nutritif à partir de solutions mères ou du milieu dix fois 
plus concentré (permettant d'atteindre une concentration maximale sans préci ­
pitation).  
Tableau 1  
Milieu de Steinberg À pH stabilisé (modifié par Altenburger)  
Substance Milieu nutritif  
Macroéléments  poids molaire mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Microéléments  poids molaire μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA dihydrate de sodium 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1232
 
Tableau 2  
Solutions mères (macroéléments)  
1. Macroéléments (concentrés cinquante fois)  g/l  
Solution mère 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Solution mère 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Solution mère 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tableau 3  
Solutions mères (microéléments)  
2. Microéléments (concentrés mille fois)  mg/l  
Solution mère 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Solution mère 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Solution mère 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Solution mère 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Solution mère 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA dihydrate de sodium 1 500,00  
— Les solutions mères 2 et 3 peuvent être réunies, de même que les solutions 
mères 4 et 7 (en tenant compte des concentrations requises).  
— Pour augmenter la durée de conservation des solutions mères, stériliser celles- 
ci en les laissant 20 minutes dans l'autoclave à 121 °C ou en les filtrant de manière stérile sur une membrane à pores de 0,2 μm. La stérilisation par 
filtration (0,2 μm) est fortement recommandée pour la solution mère 8.
 
Préparation du milieu de Steinberg (modifié) à la concentration finale  
— Ajouter 20 ml des solutions mères 1, 2 et 3 (voir tableau 2) à environ 900 ml 
d'eau désionisée afin d'éviter une précipitation.  
— Ajouter 1,0 ml des solutions mères 4, 5, 6, 7 et 8 (voir tableau 3).  
— Le pH doit être à 5,5 ± 0,2 (ajuster par ajout d'un volume minime de solution 
de NaOH ou de HCl).  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1233
 
— Porter à 1 000 ml avec de l'eau.  
— Si les solutions mères sont stérilisées et que l'on utilise une eau appropriée, 
aucune stérilisation supplémentaire n'est nécessaire. Si le milieu final est 
stérilisé, la solution mère 8 doit être ajoutée après l'autoclavage (à 121 °C pendant 20 minutes).
 
Préparation du milieu de Steinberg (modifié) concentré dix fois pour 
stockage intermédiaire  
— Ajouter 20 ml des solutions mères 1, 2 et 3 (voir tableau 2) à environ 30 ml 
d'eau afin d'éviter une précipitation.  
— Ajouter 1,0 ml des solutions mères 4, 5, 6, 7 et 8 (voir tableau 3). Porter 
à 100 ml avec de l'eau.  
— Si les solutions mères sont stérilisées et que l'on utilise une eau appropriée, 
aucune stérilisation supplémentaire n'est nécessaire. Si le milieu final est stérilisé, la solution mère 8 doit être ajoutée après l'autoclavage (à 121 °C pendant 20 minutes).
 
— Le pH du milieu (concentration finale) doit être à 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1234
 
C.27  ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN 
SYSTÉME EAU-SÉDIMENT DOPÉ  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 218 (2004) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode d’essai est 
conçue pour évaluer les effets d’une exposition prolongée à des substances 
chimiques sur des larves de  Chironomus  sp., un diptère vivant dans les 
sédiments d’eau douce. Elle s’appuie sur des protocoles d’essais de toxicité sur Chironomus riparius  et Chironomus tentans , mis au point en Europe (1) 
(2) (3) et en Amérique du Nord (4) (5) (6) (7) (8), et soumis à des essais 
circulaires (1) (6) (9). D’autres espèces de chironomes bien documentées peuvent aussi être employées, par exemple  Chironomus yoshimatsui  (10) 
(11).
 
2. Le scénario d’exposition appliqué dans cette méthode d’essai consiste à 
introduire la substance d’essai dans le sédiment. La sélection du mode d’exposition dépend de la finalité de l’essai. Le dopage du sédiment vise 
à simuler l’accumulation de produits chimiques persistants dans le sédiment. 
Ce chargement s’effectue dans un système expérimental eau-sédiment.
 
3. En général, les substances à tester sur des organismes vivant dans les 
sédiments subsistent longtemps dans ce compartiment. Ces organismes peuvent être exposés par diverses voies. L’importance relative de chaque voie d’exposition et le temps pris par chacune d’entre elles pour contribuer à 
l’effet toxique global dépendent des propriétés physico-chimiques de chaque 
substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log K
 oe > 5) ou des substances liées de façon covalente au 
sédiment, l’ingestion d’aliments contaminés peut constituer une voie d’ex ­
position non négligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicité des subs ­
tances fortement lipophiles, on envisagera d’ajouter de la nourriture au sédiment avant l’application de la substance d’essai. La présente méthode d’essai est axée sur l’exposition à long terme, de façon à couvrir toutes les 
voies d’exposition potentielles. L’essai dure de 20 à 28 jours pour  C. ripa­
rius et C. yoshimatsui  et de 28 à 65 jours pour  C. tentans . Si l’on a besoin 
de données à court terme pour un motif précis, par exemple pour étudier les effets d’une substance chimique instable, des récipients supplémentaires, 
ajoutés au dispositif expérimental, peuvent être retirés après 10 jours d’essai.
 
4. Les effets observés sont le nombre total d’adultes émergés et temps écoulé 
jusqu’à l’émergence. Si l’on a besoin de données à court terme, il est 
recommandé de ne mesurer la survie et la croissance des larves qu’après 10 jours, en ajoutant le nombre nécessaire de récipients supplémentaires.
 
5. L’utilisation d’un sédiment reconstitué est recommandée en raison de ses 
avantages par rapport aux sédiments naturels:  
— la variabilité expérimentale est réduite parce que le sédiment reconstitué 
forme une «matrice normalisée» reproductible; en outre, il n’est plus nécessaire de trouver des sources de sédiments non contaminés et non pollués,
 
— les essais peuvent être effectués à n’importe quel moment de l’année, la 
variabilité saisonnière n’intervenant plus, et il n’est pas nécessaire de traiter préalablement le sédiment afin d’éliminer la faune indigène; l’uti ­
lisation de sédiments reconstitués diminue aussi le coût associé à la 
collecte sur le terrain d’une quantité suffisante de sédiments pour les essais systématiques,
 
— les sédiments reconstitués permettent de comparer la toxicité des subs ­
tances et de les classer en conséquence.  
6. L’appendice 1 contient les définitions employées dans la présente méthode 
d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1235
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
7. Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de 
concentrations de la substance d’essai dans un système sédiment-eau. Une fois la substance d’essai incorporée au sédiment, des larves au premier stade 
sont introduites dans des béchers où les concentrations d’eau et de sédiment 
ont été stabilisées. L’émergence des chironomes et leur vitesse de dévelop ­
pement sont mesurées à la fin de l’essai. La survie des larves et leur poids peuvent aussi être mesurés après 10 jours si nécessaire (en ajoutant le 
nombre d’expériences identiques requis). Ces données sont analysées, soit 
à l’aide d’un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraî ­
nerait une réduction de x % de l’émergence ou de la survie des larves ou de 
leur croissance (par exemple CE
 15 , CE  50 , etc.), soit par la vérification d’une 
hypothèse statistique afin de déterminer une CSEO/CMEO. Cette dernière nécessite une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des témoins à l’aide de tests statistiques.
 
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
8. Il faudrait connaître l’hydrosolubilité de la substance d’essai, sa pression de 
vapeur, son coefficient de partage mesuré ou calculé dans le sédiment et sa 
stabilité dans l’eau et le sédiment. Il convient de disposer d’une méthode 
d’analyse fiable pour quantifier la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, dans l’eau des pores et dans le sédiment, et pour laquelle la précision et le seuil de détection sont connus. Il est également utile de connaître la formule 
structurale et la pureté de la substance d’essai ainsi que son devenir 
chimique (par exemple sa dissipation, sa dégradation abiotique et biotique, etc.). Des indications complémentaires pour tester les substances se prêtant difficilement à l’essai en raison de leurs propriétés physico-chimiques sont 
fournies à la référence (12).
 
SUBSTANCES CHIMIQUES DE RÉFÉRENCE  
9. Des substances de référence pourront être testées régulièrement afin de 
démontrer, la fiabilité du protocole et des conditions de l’essai. Voici 
quelques exemples de toxiques de référence ayant fait leurs preuves dans des essais circulaires et des études de validation: lindane, trifluraline, penta ­
chlorophénol, chlorure de cadmium et chlorure de potassium (1) (2) (5) (6) 
(13).
 
VALIDITÉ DE L’ESSAI  
10. Pour que l’essai soit valide, les conditions suivantes doivent être remplies:  
— l’émergence chez les témoins doit atteindre au moins 70 % à la fin de 
l’essai (1) (6),  
— s’agissant de  C. riparius  et C.  yoshimatsui , l’émergence au stade adulte 
dans les récipients témoins doit avoir lieu entre 12 et 23 jours après leur introduction dans les récipients expérimentaux;  C. tentans  nécessite une 
période de 20 à 65 jours,
 
— à la fin de l’essai, le pH et la concentration d’oxygène dissous seront 
mesurés dans chaque récipient. La concentration d’oxygène devrait 
atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) à la température appliquée et le pH de l’eau sus-jacente devrait être compris entre 6 et 9 dans tous les récipients expérimentaux,
 
— la température de l’eau ne devrait pas varier de plus de ± 1,0 °C et 
pourrait être contrôlée grâce à une chambre isotherme, auquel cas la 
température de la chambre devra être confirmée à intervalles appropriés.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1236
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Récipients expérimentaux  
11. L’essai se déroule dans des béchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de 
diamètre. D’autres récipients peuvent être utilisés à condition qu’ils permet ­
tent de garantir une profondeur adéquate d’eau et de sédiment. Le sédiment doit offrir une superficie de 2 à 3 cm
 2 par larve. Le quotient de la profon ­
deur de la couche de sédiment par la profondeur de la couche d’eau 
sus-jacente doit être égal à 1/4. Les récipients et les autres appareils qui entreront en contact avec le système d’essai doivent être composés unique ­
ment de verre ou d’un autre matériau chimiquement inerte (par exemple du 
Téflon).
 
Sélection des espèces  
12. Chironomus riparius  est l’espèce qui convient le mieux.  Chironomus 
tentans  peut aussi être utilisé, mais il est plus difficile à manipuler et néces ­
site une période d’essai plus longue.  Chironomus yoshimatsui  convient 
également. La méthode de culture de  Chironomus riparius  est détaillée à 
l’appendice 2. D’autres documents décrivent les conditions de culture des autres espèces:  Chironomus tentans  (4) et  Chironomus yoshimatsui  (11). 
L’identification de l’espèce est à confirmer avant l’essai, mais n’est pas 
requise avant chaque essai si les organismes proviennent d’un élevage 
interne.
 
Sédiment  
13. Il est préférable d’employer un sédiment reconstitué (également dénommé 
sédiment artificiel ou synthétique). Néanmoins, si l’on opte pour un sédi ­
ment naturel, il faudrait le caractériser, au moins quant au pH et à la teneur 
en carbone organique, (la détermination d’autres paramètres, tels que le rapport C/N et la granulométrie est aussi recommandée) et s’assurer qu’il n’est pas contaminé et n’abrite pas d’autres organismes qui pourraient entrer 
en compétition avec les chironomes ou les consommer. Avant d’utiliser un 
sédiment naturel dans un essai de toxicité sur les chironomes, il est égale ­
ment recommandé de le maintenir durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai (conditionnement). 
Le sédiment reconstitué décrit ci-dessous, basé sur le sol artificiel utilisé 
dans la méthode d’essai C.8, est recommandé (14) (1) (15) (16):
 
a) 4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 
5,5 à 6,0; il est important d’utiliser une tourbe sous forme de poudre, 
finement broyée (dimension des particules ≤ 1 mm) et séchée unique ­
ment à l’air;  
b) 20 % (poids sec) d’argile kaolinique (teneur en kaolinite de préférence 
supérieure à 30 %);  
c) 75-76 % (poids sec) de sable quartzique (composé en majorité de sable 
fin, plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm); 
d) ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que la teneur en humidité du 
mélange final atteigne 30 à 50 %;  
e) ajouter du carbonate de calcium de qualité chimiquement pure (CaCO  3 ) 
pour ajuster le pH du mélange final composant le sédiment à 7,0 ± 0,5. Il convient d’obtenir 2 % (± 0,5 %) de carbone organique dans le mélange final en y ajoutant les quantités appropriées de tourbe et de sable, comme 
indiqué en a) et en c).
 
14. Les sources de tourbe, de kaolin et de sable doivent être connues. On 
vérifiera que les composants du sédiment ne sont pas contaminés par des substances chimiques (par exemple des métaux lourds, des composés orga ­
nochlorés, des composés organophosphorés, etc.). Un exemple de prépara ­
tion de sédiment reconstitué est décrit à l’appendice 3. Les composants peuvent aussi être mélangés à l’état sec, à condition de démontrer qu’après l’ajout de l’eau sus-jacente, les composants du sédiment ne se séparent pas 
(flottement de particules de tourbe, par exemple) et que la tourbe ou le 
sédiment sont suffisamment conditionnés.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1237
 
Eau 
15. Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d’une eau de dilution 
acceptable selon les critères spécifiés aux appendices 2 et 4 peut servir à l’essai. Toute eau appropriée, naturelle (eau superficielle ou souterraine), 
reconstituée (voir appendice 2) ou eau du robinet déchlorée, est acceptable 
comme eau pour l’élevage et les essais si les chironomes y survivent sur toute la durée de l’élevage et de l’essai sans manifester de signes de stress. Au début de l’essai, le pH de l’eau d’essai se situera entre 6 et 9 et sa dureté 
totale ne dépassera pas 400 mg/l en CaCO
 3 . Néanmoins, si l’on suspecte 
une interaction entre les ions qui provoquent la dureté et la substance d’essai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le 
milieu Elendt M4 dans ce cas). Le même type d’eau doit être utilisé tout 
au long de l’étude. Les caractéristiques de la qualité de l’eau énumérées à l’appendice 4 sont à mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que ses caractéristiques sont susceptibles d’avoir été significativement modifiées.
 
Solutions mères – sédiments dopés  
16. Les sédiments dopés sont généralement préparés à la concentration souhaitée 
en ajoutant directement une solution de la substance d’essai au sédiment. 
Une solution mère de la substance d’essai dissoute dans de l’eau désionisée est mélangée au sédiment reconstitué à l’aide d’un agitateur à rouleaux, d’un mélangeur pour aliments ou mélangée à la main. Si la substance d’essai est 
peu soluble dans l’eau, elle peut être dissoute dans un volume aussi petit 
que possible d’un solvant organique adéquat (hexane, acétone ou chloro ­
forme, par exemple). Cette solution est ensuite mélangée à 10 g de sable quartzique fin par récipient d’essai. Il faut attendre que le solvant s’évapore 
jusqu’à ce qu’il soit totalement éliminé du sable; le sable est ensuite 
mélangé avec la quantité appropriée de sédiment par bécher. Seuls des agents très volatils peuvent être utilisés pour solubiliser, disperser ou émul ­
sifier la substance d’essai. On n’oubliera pas de tenir compte de la quantité 
de sable apportée avec le mélange de la substance d’essai et du sable lors de 
la préparation du sédiment (ce dernier sera préparé avec moins de sable). Il faudra veiller à mélanger complètement la substance d’essai au sédiment et à l’y répartir uniformément. Si nécessaire, on analysera des sous-échantillons 
afin de déterminer le degré d’homogénéité.
 
CONCEPTION DE L’ESSAI  
17. La conception de l’essai définit le nombre et l’espacement des concentra ­
tions expérimentales, le nombre de récipients à chaque concentration et le nombre de larves par récipient. La marche à suivre pour estimer une valeur 
de CE, la CSEO et mener un essai limite est décrite.
 
Conduite d’une analyse de régression  
18. La concentration efficace (par exemple, CE  15 , CE  50 ) et la gamme de 
concentrations dans laquelle l’effet produit par la substance d’essai est d’in ­
térêt doivent être couvertes par les concentrations incluses dans l’essai. Généralement, l’exactitude, et plus particulièrement la validité, de l’estima ­
tion des concentrations efficaces (CE
 x ) s’accroissent lorsque la concentration 
efficace se situe dans la gamme des concentrations testées. Il faut éviter d’extrapoler des résultats très en dessous de la concentration efficace la plus faible ou au-dessus de la concentration maximale. Il est utile de conduire un 
essai préliminaire pour déterminer la gamme des concentrations à utiliser 
(voir paragraphe 27).
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1238
 
19. S’il faut estimer la CE  x , au moins cinq concentrations et trois répétitions par 
concentration doivent être mises à l’essai. En tout état de cause, il est 
recommandé de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne estimation du modèle. Le facteur séparant les concentrations ne doit pas excéder deux (sauf dans les cas où la courbe dose-effet présente 
une pente faible). Le nombre de répétitions par traitement peut être diminué 
si le nombre de concentrations expérimentales entraînant différents effets est augmenté. L’augmentation du nombre de répétitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations expérimentales tend à réduire les inter ­
valles de confiance pour l’essai. Le nombre de répétitions sera augmenté s’il 
y a lieu d’estimer le taux de survie et la croissance des larves après dix jours.
 
Procédure d’estimation d’une CSEO/CMEO  
20. S’il faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concen ­
trations expérimentales et au moins quatre répétitions par concentration, le 
facteur séparant les concentrations n’excédant pas deux. Le nombre d’expé ­
riences identiques doit être tel qu’il fournit une puissance statistique permet ­
tant de détecter une différence de 20 % avec le témoin, au seuil de signi ­
fication statistique de 5 % (p = 0,05). S’agissant de la vitesse de dévelop ­
pement, une analyse de la variance (ANOVA) convient généralement, telle que le test de Dunnett ou le test de Williams (17) (18) (19) (20). S’agissant du taux d’émergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher 
(avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent 
être utilisés.
 
Essai limite  
21. Si l’essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur des concen ­
trations n’a engendré aucun effet, un essai limite peut être conduit (une 
concentration expérimentale et un témoin). L’essai limite se pratique avec une concentration suffisamment élevée pour permettre aux décideurs d’ex ­
clure tout effet toxique possible de la substance d’essai et la limite est fixée 
à une concentration censée ne jamais être atteinte dans les conditions réelles. 
Une concentration de 1 000 mg/kg (poids sec) est recommandée. Il est généralement nécessaire de mener au moins six répétitions pour les orga ­
nismes traités et les témoins. Il y a lieu de démontrer que la puissance 
statistique est suffisante pour détecter une différence de 20 % avec les 
témoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne l’effet sur la vitesse de développement et sur le poids, le test t constitue une méthode statistique appropriée, si les données respectent les 
conditions exigées par ce test (normalité, variances homogènes). On pourra 
recourir au test t à variance inégale ou à un test non paramétrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. S’agissant du taux d’émergence, le test exact de Fisher convient.
 
MODE OPÉRATOIRE  
Conditions d’exposition  
Préparation du système sédiment dopé – eau  
22. La procédure de mélange de la substance d’essai au sédiment décrite dans la 
méthode d’essai C.8, Toxicité pour les vers de terre, est recommandée pour 
cet essai (14). Les sédiments dopés sont placés au fond des récipients avant d’y verser l’eau, de façon à obtenir un ratio volumique sédiment-eau de 1/4 (voir paragraphes 11 et 15). La profondeur de la couche de sédiment doit 
être comprise entre 1,5 et 3 cm. Afin d’éviter la séparation des constituants 
du sédiment et la resuspension des particules fines pendant le remplissage de la colonne d’eau, on peut recouvrir le sédiment d’un disque en plastique durant cette opération et retirer le disque juste après. D’autres dispositifs 
conviennent également.
 
23. Les récipients expérimentaux doivent être couverts (par des plaques de 
verre, par exemple). On prendra soin de remplacer les volumes d’eau 
évaporée durant l’étude, le cas échéant, et ce avec de l’eau distillée ou 
désionisée afin d’empêcher l’accumulation de sels.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1239
 
Stabilisation  
24. Une fois que le sédiment dopé surmonté d’une couche d’eau a été préparé, il 
est souhaitable de laisser la substance d’essai se répartir entre la phase aqueuse et le sédiment (3) (4) (6) (13), et ce, de préférence, dans les 
mêmes conditions de température et d’aération que durant l’essai. L’équi ­
libre met de quelques heures à quelques jours à s’établir, voire 4-5 semaines dans de rares cas, selon le sédiment et la substance chimique. Il ne faut pas attendre que l’équilibre soit atteint, car beaucoup de substances risquent de 
se dégrader durant cette période, mais un temps d’attente de 48 heures est 
recommandé. Au terme de cette période d’équilibrage, on mesure la concen ­
tration de la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, les pores et le sédi ­
ment, au moins pour la concentration la plus élevée et la plus faible (voir 
paragraphe 38). Ces déterminations analytiques de la substance d’essai permettent de calculer le bilan massique et d’exprimer les résultats en fonc ­
tion des concentrations mesurées.
 
Introduction des organismes d’essai  
25. Quatre à cinq jours avant d’introduire les organismes d’essai dans les réci ­
pients, des amas d’œufs sont prélevés dans les cultures et déposés dans de 
petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de 
la culture mère tout comme un milieu fraîchement préparé peuvent être utilisés. Si ce dernier est utilisé, on ajoutera une petite quantité de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat d’une suspen ­
sion de paillettes pour poissons finement broyées, au milieu de culture (voir 
appendice 2). Seuls des amas d’œufs fraîchement pondus peuvent être utili ­
sés. Normalement, les larves commencent à éclore quelques jours après la ponte (2 à 3 jours pour  Chironomus riparius  à 20 °C et 1 à 4 jours pour  
Chironomus tentans  à 23 °C et  Chironomus yoshimatsui  à 25 °C) et le 
développement des larves se déroule en quatre stades, dont chacun dure 4 à 8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours après l’éclosion). Il est possible de vérifier le stade de développement des 
moucherons d’après la largeur de la capsule céphalique (6).
 
26. Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont déposées dans 
chaque récipient contenant le sédiment dopé et l’eau, à l’aide d’une pipette émoussée. L’aération de l’eau doit être interrompue dès qu’on intro ­
duit les larves dans les récipients expérimentaux, et ce durant 24 heures 
après l’ajout des larves (voir paragraphes 25 et 32). Selon le protocole expérimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilisées par concentration s’élève au moins à 60 pour l’estimation d’une valeur de 
concentration efficace (CE) et à 80 pour la détermination de la CSEO.
 
Concentrations d’essai  
27. Il peut être utile de conduire un essai de détermination de l’ordre de gran ­
deur pour délimiter la gamme de concentrations à appliquer dans l’essai 
proprement dit. À cet effet, on utilise une série de concentrations largement espacées de la substance d’essai. Afin de reproduire la même densité de surface par chironome que dans l’essai proprement dit, les chironomes sont 
exposés à chaque concentration de la substance d’essai durant une période 
permettant d’estimer les concentrations expérimentales appropriées et aucune expérience identique n’est nécessaire.
 
28. Les concentrations pour l’essai définitif sont choisies en fonction des résul ­
tats de l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. Au moins cinq 
concentrations doivent être appliquées et sélectionnées comme décrit aux 
paragraphes 18 à 20.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1240
 
Témoins  
29. L’essai inclura le nombre nécessaire de récipients témoins pourvus du sédi ­
ment mais exempts de toute substance d’essai (voir paragraphes 19-20). Si la substance d’essai a été appliquée à l’aide d’un solvant (voir paragraphe 
16), il convient d’ajouter un témoin dont le sédiment contient également le 
solvant.
 
Système expérimental  
30. Des systèmes statiques sont utilisés. Des systèmes semi-statiques ou à écou ­
lement continu avec renouvellement intermittent ou continu de l’eau sus-jacente peuvent être utilisés dans des cas exceptionnels, par exemple 
si les spécifications de la qualité de l’eau deviennent inappropriées pour 
l’organisme d’expérience ou affectent l’équilibre chimique (si, par exemple, la concentration d’oxygène dissous devient trop basse, la concentration des excréta augmente de façon trop importante ou si des minéraux lessivés à 
partir du sédiment affectent le pH et/ou la dureté de l’eau). Néanmoins, 
d’autres méthodes d’amélioration de la qualité de l’eau sus-jacente, telles que l’aération, seront normalement suffisantes et préférables.
 
Alimentation  
31. Les larves ont besoin d’être nourries, de préférence quotidiennement Tetra ­
Phyll; ou au moins trois fois par semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 à 0,5 mg (0,35-0,5 mg 
pour C. yoshimatsui ) de nourriture pour poissons (suspendue dans l’eau ou 
finement moulue, par exemple TetraMin ou TetraPhyll; voir les détails à l’appendice 2). Il peut être nécessaire d’augmenter légèrement cette quantité pour les larves plus âgées: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour 
le reste de l’essai. On diminuera la ration alimentaire de tous les organismes 
traités et témoins si des champignons se développent ou si des organismes témoins meurent. Si la croissance fongique s’avère impossible à enrayer, l’essai doit être renouvelé. Si l’essai porte sur des substances fortement 
adsorbantes (par exemple avec un log K
 oe > 5) ou des substances liées de 
façon covalente au sédiment, la quantité de nourriture nécessaire à la survie et à la croissance naturelle des organismes peut être ajoutée au sédiment reconstitué avant la période de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour 
poissons est remplacée par une ration végétale, par exemple 0,5 % (poids 
sec) de feuilles finement broyées d’ortie ( Urtica dioica ), de mûrier ( Morus 
alba), de trèfle blanc ou rampant ( Trifolium repens ), d’épinard ( Spinacia 
oleracea ), par exemple, ou d’un autre matériau végétal ( Cerophyl  ou 
alpha-cellulose).
 
Conditions d’incubation  
32. L’eau sus-jacente est soumise à une légère aération, mise en route de préfé ­
rence 24 heures après l’introduction des larves et maintenue jusqu’à la fin de l’essai (il faut veiller à ce que la concentration d’oxygène dissous ne tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). L’air est insufflé à 
travers une pipette Pasteur en verre fixée 2 à 3 cm au-dessus de la couche 
de sédiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance d’essai est volatile, il faudra éventuellement supprimer l’aération.
 
33. L’essai est mené à température constante (20 °C ± 2 °C). Pour  C. tentans  et 
C. yoshimatsui , les températures recommandées s’élèvent respectivement à 
23 °C et 25 °C (± 2 °C). La photopériode est de 16 heures et l’éclairement 
compris entre 500 et 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1241
 
Durée de l’exposition  
34. L’exposition débute avec l’introduction des larves dans les récipients traités 
et témoins. La durée maximale de l’exposition s’élève à 28 jours pour  C. 
riparius  et C. yoshimatsui  et à 65 jours pour  C. tentans . Si les moucherons 
émergent plus tôt, l’essai peut s’achever au moins cinq jours après l’émer ­
gence du dernier adulte témoin.  
Observations  
Émergence  
35. La durée du développement et le nombre total de moucherons mâles et 
femelles adultes totalement émergés sont à déterminer. Les mâles sont 
faciles à identifier grâce à leurs antennes plumeuses.  
36. Au moins trois fois par semaine, on vérifiera que les organismes des réci ­
pients expérimentaux ne manifestent aucun comportement anormal (sortie 
du sédiment, nage inhabituelle par exemple) par rapport aux témoins. 
Chaque jour, durant la période supposée de l’émergence, on comptera le nombre de moucherons émergés et on consignera le sexe et le nombre de moucherons complètement émergés. Après identification, les moucherons 
sont retirés des récipients. Tout amas d’œufs déposé avant la fin de 
l’essai doit être recensé puis enlevé afin d’empêcher la réintroduction de larves dans le sédiment. Le nombre de pupes visibles n’ayant pas réussi à émerger est aussi enregistré. Des indications sur la façon de mesurer l’émer ­
gence sont données à l’appendice 5.
 
Croissance et survie  
37. S’il faut fournir des données sur la survie et la croissance des larves après 
10 jours, des récipients d’essai supplémentaires seront ajoutés dès le début de l’essai, pour pouvoir être utilisés ultérieurement. Le sédiment de ces 
récipients supplémentaires sera tamisé à travers des mailles de 250 μm 
pour retenir les larves. La mort est déterminée par deux critères: l’immobi ­
lité et l’absence de réaction à un stimulus mécanique. Les larves non récu ­
pérées doivent aussi être comptabilisées parmi les mortes (les larves qui sont 
mortes au début de l’essai ont pu être dégradées par des microbes). Après avoir déterminé le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par réci ­
pient expérimental, on calcule le poids sec individuel moyen par récipient. Il 
est utile d’établir à quel stade se trouvent les larves survivantes, et ce 
d’après la largeur de la capsule céphalique de chaque individu.
 
Mesures analytiques  
Concentration de la substance d’essai  
38. Avant le début de l’essai (c’est-à-dire avant l’introduction des larves), on 
prélève des échantillons du sédiment d’au moins un récipient par traitement, afin de déterminer analytiquement la concentration de la substance d’essai 
dans le sédiment. Il est recommandé d’analyser, au minimum, des échan ­
tillons de l’eau sus-jacente, de l’eau des pores, et du sédiment, au début (voir paragraphe 24) et à la fin de l’essai, et ce de la concentration la plus élevée et d’une concentration plus basse. Les concentrations de la substance 
d’essai nous renseignent sur le comportement et la répartition de la subs ­
tance d’essai dans le système eau-sédiment.
 
39. Lorsqu’on effectue des mesures intermédiaires (par exemple au septième 
jour) et si l’analyse requiert des échantillons volumineux qui ne peuvent 
être prélevés des récipients sans influencer le système expérimental, les analyses seront pratiquées sur des échantillons provenant de récipients expé ­
rimentaux supplémentaires traités de la même façon (y compris par la 
présence des organismes d’essai), mais non utilisés pour des observations 
biologiques.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1242
 
40. Pour isoler l’eau interstitielle, on recommande de centrifuger les échantillons 
à 10 000 g et à 4 °C durant 30 minutes. Cependant, s’il est démontré que la 
substance d’essai ne s’adsorbe pas sur les filtres, la filtration est également acceptable. Avec des échantillons trop petits, il arrive que les concentrations dans l’eau des pores soient impossibles à analyser.
 
Paramètres physico-chimiques  
41. Le pH de l’eau et la température des récipients d’essai doivent être mesurés 
de façon appropriée (voir paragraphe 10). La dureté de l’eau et la teneur en ammoniac sont mesurées dans les récipients témoins et dans un récipient 
traité à la concentration la plus élevée, au début et à la fin de l’essai.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
42. Cet essai vise à déterminer l’effet de la substance d’essai sur la vitesse de 
développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles totale ­
ment émergés ou, dans le cas de l’essai de 10 jours, les effets sur la survie 
et le poids des larves. Si rien n’indique que les deux sexes présentent des 
différences statistiques de sensibilité, les résultats obtenus sur les mâles et les femelles peuvent être regroupés pour l’analyse statistique. Les diffé ­
rences de sensibilité entre les sexes peuvent être jugées statistiquement 
par un test (de tableau) χ
 2 - r × 2, par exemple. La survie des larves et 
le poids sec individuel moyen par récipient doivent être déterminés après dix jours, le cas échéant.
 
43. Il est préférable de calculer les concentrations efficaces, exprimées en fonc ­
tion du poids sec, à partir des concentrations mesurées dans le sédiment au début de l’essai (voir paragraphe 38).
 
44. Pour estimer ponctuellement la CE  50 ou une quelconque CE  x , les statistiques 
par récipient peuvent être utilisées comme des expériences identiques 
proprement dites. Lorsqu’on calcule un intervalle de confiance pour une quelconque CE
 x , il faut tenir compte de la variabilité entre les récipients 
ou montrer que celle-ci est négligeable. Si le modèle est ajusté par la 
méthode des moindres carrés, il convient d’appliquer une transformation 
des données pour les statistiques par récipient afin d’accroître l’homogénéité de la variance. Toutefois, les valeurs de la CE
 x sont à calculer après que les 
résultats ont été «retransformés» de façon à recouvrer leur valeur originale.  
45. Si l’analyse statistique vise à déterminer la CSEO/CMEO par la vérification 
d’une hypothèse, la variabilité entre les récipients doit être prise en compte, 
par exemple à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) «emboîtée». 
Par contre, des tests plus robustes (21) peuvent être utilisés au cas où les hypothèses habituelles de l’analyse de la variance ne se vérifient pas.
 
Taux d’émergence  
46. Le taux d’émergence donne une réponse par tout ou rien et peut être analysé 
par le test de Cochran-Armitage appliqué de façon régressive si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de 
Mantel-Haenszel avec des valeurs de p corrigées selon Bonferroni-Holm 
peuvent être employés. S’il s’avère que la variabilité entre expériences identiques à la même concentration est supérieure à ce qu’une distribution binomiale indiquerait (variation souvent qualifiée d’«extra-binomiale»), on 
appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test exact de Fisher) 
comme proposé à la référence (21).
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1243
 
La somme des moucherons émergés par récipient, n  e , est déterminée et 
divisée par le nombre de larves introduites, n  a : 
TE ¼ n e 
n a 
où: 
TE = taux d’émergence  
n e = nombre de moucherons émergés par récipient  
n a = nombre de larves introduites par récipient  
47. Une variante plus appropriée aux échantillons de grande taille, lorsque la 
variance est extra-binomiale, consiste à traiter le taux d’émergence comme 
une réponse continue et à appliquer une méthode telle que le test de William si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Le test de Dunnett convient dans le cas où la 
relation ne s’avère pas monotone. Ici, on considère qu’un échantillon est de 
grande taille lorsque le nombre de moucherons émergés et le nombre de chironomes non émergés dépassent chacun cinq, par récipient expérimental.
 
48. Pour réaliser l’analyse de la variance (ANOVA), il convient d’appliquer aux 
valeurs de TE une transformation «arcsinus-racine carrée» ou «Freeman- 
Tukey» afin d’obtenir une distribution proche de la normale et d’égaliser 
les variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction de Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être employés lorsqu’on utilise des fréquences absolues. La transformation 
arcsinus-racine carrée consiste à calculer l’inverse du sinus (sinus
 -1 ) de la 
racine carrée du TE.  
49. Pour les taux d’émergence, les valeurs de la CE  x sont calculées par une 
analyse de régression [ou par probit (22), logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropriés, etc.]. Si l’analyse de la régression échoue (par 
exemple, lorsqu’il y a moins de deux réponses partielles), on fait appel à 
d’autres méthodes non paramétriques telles que la moyenne mobile ou une simple interpolation.
 
Vitesse de développement  
50. La période de développement moyenne représente le temps moyen écoulé 
entre l’introduction des larves (jour 0 de l’essai) et l’émergence de la cohorte expérimentale de moucherons (pour calculer la période de dévelop ­
pement réelle, il faut tenir compte de l’âge des larves au moment de l’in ­
troduction). La vitesse de développement est l’inverse de la période de développement (unité: 1/jour) et représente la partie du développement larvaire qui s’effectue par jour. Pour évaluer la toxicité dans les sédiments, 
il est préférable de choisir la vitesse de développement, car sa variance est 
plus faible et ses valeurs sont plus homogènes et plus proches d’une distri ­
bution normale, en comparaison avec la période de développement. C’est pourquoi les tests paramétriques puissants conviennent mieux à la vitesse de 
développement qu’à la période de développement. Si la vitesse de dévelop ­
pement est traitée comme une réponse continue, les valeurs de la CE
 x 
peuvent être estimées par l’analyse de la régression, par exemple (23), (24).  
51. Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observés le 
jour × sont considérés comme ayant émergé au milieu de l’intervalle de 
temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de l’intervalle d’observation, habituellement 1 jour). La vitesse de développement moyenne par récipient ( x) est calculée comme suit:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1244
 
où: 
x: vitesse de développement moyenne par récipient  
i: indice de l’intervalle d’observation  
m: nombre maximal d’intervalles d’observation  
ƒ i : nombre de moucherons émergés durant l’intervalle d’observation i  
n e : nombre total de moucherons émergés à la fin de l’expérience (=  P ƒ i ) 
x i : vitesse de développement des moucherons émergés durant l’intervalle i  
x i ¼ 1 Í 
jour  i Ä 1 i 
2 Î 
où: 
jour  i : jour d’observation (compté depuis l’application)  
l i : durée de l’intervalle d’observation I (exprimé en jours, habituellement 
1 jour)  
Rapport d’essai  
52. Le rapport d’essai doit fournir au moins les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (hydrosolu ­
bilité, pression de vapeur, coefficient de partage dans le sol (ou dans le 
sédiment s’il est connu), stabilité dans l’eau, etc.),  
— identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structu ­
rale, numéro CAS, etc.), pureté et méthode d’analyse pour la quantifi ­
cation de la substance d’essai.  
Espèce d’essai:  
— animal d’essai utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions 
d’élevage,  
— informations sur la manipulation des amas d’œufs et des larves,  
— âge des animaux d’expérience au moment où ils ont été déposés dans les 
récipients expérimentaux.  
Conditions expérimentales:  
— sédiment utilisé, c’est-à-dire naturel ou reconstitué,  
— pour les sédiments naturels: localisation et description du site de prélè ­
vement et notamment, si possible, son histoire en matière de contami ­
nation; caractéristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N et granulométrie, le cas échéant,
 
— préparation du sédiment reconstitué: ingrédients et caractéristiques 
(teneur en carbone organique, pH, humidité, etc. au début de l’essai),  
— préparation de l’eau d’essai (si l’eau est reconstituée) et caractéristiques 
(concentration d’oxygène, pH, conductivité, dureté, etc. au début de l’essai),
 
— profondeur du sédiment et de l’eau sus-jacente,  
— volume de l’eau sus-jacente et de l’eau des pores; poids du sédiment 
humide avec et sans eau des pores,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1245
 
— récipients expérimentaux (matériau et dimension),  
— méthode de chargement du sédiment: concentrations expérimentales 
appliquées, nombre d’expériences identiques et utilisation d’un solvant, le cas échéant,
 
— phase de stabilisation du système sédiment dopé-eau: durée et condi ­
tions,  
— conditions d’incubation: température, cycle et intensité de lumière, aéra ­
tion (fréquence et intensité),  
— informations détaillées sur la nourriture: type, préparation, quantité et 
régime d’administration.  
Résultats:  
— concentrations d’essai nominales, concentrations d’essai mesurées et 
résultats de toutes les analyses conduites pour déterminer la concentra ­
tion de la substance d’essai dans le récipient expérimental,  
— qualité de l’eau dans les récipients expérimentaux: pH, température, 
oxygène dissous, dureté et teneur en ammoniac,  
— remplacement de l’eau d’essai évaporée, le cas échéant,  
— nombre de moucherons mâles et femelles émergés par récipient et par 
jour, 
— nombre de larves non émergées sous la forme de moucherons par réci ­
pient,  
— poids sec individuel moyen des larves par récipient, et par stade larvaire, 
s’il y a lieu,  
— pourcentage d’émergence par expérience identique et concentration 
d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et 
femelles),  
— vitesse de développement moyenne des moucherons totalement émergés 
par expérience identique et concentration d’essai (regroupement des 
résultats pour les moucherons mâles et femelles),  
— estimation des effets toxiques observés, par exemple CE  x (et intervalles 
de confiance associés), CSEO et/ou CMEO, et méthodes statistiques 
employées pour les déterminer,  
— analyse des résultats, y compris les répercussions sur les résultats d’un 
écart éventuel à la présente méthode d’essai.  
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Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Les définitions suivantes s’appliquent aux fins de la présente méthode d’essai:  
Le sédiment reconstitué , ou artificiel ou synthétique, désigne le mélange de 
matériaux utilisés pour reproduire au mieux les composants physiques d’un sédiment naturel.
 
L’eau sus-jacente  est l’eau surmontant le sédiment dans le récipient expérimen ­
tal. 
L’eau interstitielle , ou l’eau des pores, se réfère à l’eau qui occupe les vides 
laissés entre le sédiment et les particules de sol.  
Le sédiment dopé  est un sédiment auquel on a ajouté la substance d’essai.  
Une substance d’essai  est toute substance ou tout mélange soumis à un essai 
réalisé suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1248
 
Appendice 2  
Recommandations pour la culture de  Chironomus riparius  
1. Les larves de  Chironomus  peuvent être élevées dans des cristallisoirs ou de 
grands récipients. Du sable quartzique fin est déposé en couche mince (environ 5 à 10 mm d’épaisseur) sur le fond du récipient. Le Kieselguhr (par exemple l’art. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une 
couche encore plus mince de quelques millimètres à peine suffit). Une 
eau de qualité appropriée, profonde de plusieurs centimètres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas d’évaporation, le niveau d’eau doit toujours être ramené à sa hauteur initiale, afin de prévenir toute dessiccation. L’eau 
peut être remplacée, si nécessaire. Une légère aération est fournie. Les 
récipients d’élevage des larves doivent être placés dans des cages appro ­
priées, afin d’empêcher la fuite des adultes émergeant. La cage sera suffi ­
samment grande pour permettre aux adultes émergés d’essaimer, sans quoi 
la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions minimales: 30 × 30 × 
30 cm).
 
2. Les cages doivent être gardées à température ambiante, ou à 20 ± 2 °C si 
elles sont installées dans une chambre à ambiance constante, avec une photopériode de 16 heures de lumière (intensité: environ 1 000 lux) et 8 
heures d’obscurité. Une humidité relative de l’air inférieure à 60 % serait 
susceptible d’empêcher la reproduction.
 
Eau de dilution  
3. Toute eau naturelle ou reconstituée appropriée peut être utilisée. L’eau d’un 
puits, de l’eau du robinet déchlorée et un milieu artificiel (Elendt «M4» ou 
«M7», voir ci-après) sont souvent utilisés. L’eau doit être aérée avant 
emploi. Si nécessaire, on peut renouveler l’eau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement l’eau usée des récipients expérimentaux, sans détruire les tubes des larves.
 
Alimentation des larves  
4. Les larves de  Chironomus  reçoivent des paillettes pour poissons (Tetra ­
Min®, TetraPhyll® ou une autre marque déposée équivalente), à raison d’environ 250 mg par récipient et par jour. Cette nourriture peut être admi ­
nistrée sous la forme d’une poudre moulue à sec ou d’une suspension dans 
l’eau: 1,0 g de paillettes ajoutées à 20 ml d’eau de dilution et agitées de façon à obtenir un mélange homogène. Cette préparation peut être adminis ­
trée à raison d’environ 5 ml par récipient et par jour (agiter avant emploi). 
Les larves plus âgées peuvent en recevoir plus.
 
5. La nourriture est ajustée en fonction de la qualité de l’eau. Si le milieu de 
culture devient trouble, il convient de réduire la ration. Les quantités de 
nourriture données sont soigneusement notées. Un manque de nourriture fera émigrer les larves vers la colonne d’eau, tandis qu’un excès de nour ­
riture intensifiera l’activité microbienne et abaissera la concentration d’oxy ­
gène. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes.
 
6. Certaines cellules d’algues vertes ( Scenedesmus subspicatus, Chlorella 
vulgaris ) peuvent aussi être ajoutées lors de la préparation de nouveaux 
récipients de culture.  
Alimentation des adultes émergents  
7. Certains expérimentateurs ont suggéré de nourrir les adultes émergés au 
moyen d’un tampon d’ouate imbibé d’une solution de sucrose saturée.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1249
 
Émergence  
8. À 20 ± 2 °C, les adultes commencent à émerger des récipients d’élevage 
des larves après environ 13 à 15 jours. Il est facile de distinguer les mâles d’après leurs antennes plumeuses.
 
Amas d’œufs  
9. Dès que des adultes sont présents dans la cage d’élevage, il faut vérifier 
trois fois par semaine, dans tous les récipients d’élevage de larves, si des 
amas d’œufs gélatineux n’ont pas été déposés. Le cas échéant, les amas 
d’œufs doivent être soigneusement enlevés et transférés dans un petit réci ­
pient contenant un échantillon de l’eau d’élevage. Les amas d’œufs servent à préparer un nouveau récipient de culture (2 à 4 amas d’œufs par récipient, 
par exemple) ou à pratiquer des essais de toxicité.
 
10. Les larves au premier stade devraient éclore après 2-3 jours.  
Préparation de nouveaux récipients de culture  
11. Une fois que les cultures ont été lancées, il devrait être possible de préparer 
un nouveau récipient de culture de larves, une fois par semaine ou moins 
souvent, suivant les besoins de l’essai, et de retirer les récipients plus 
anciens après que les moucherons adultes ont émergé. Ce système permet d’obtenir régulièrement un contingent d’adultes, avec une organisation mini ­
male.
 
Préparation des solutions d’essai «M4» et «M7»  
12. Elendt (1990) a décrit le milieu «M4». Le milieu «M7» est préparé comme 
le milieu «M4», sauf pour les substances reprises au tableau 1, dont les 
concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu «M7» que dans le 
milieu «M4». Une publication sur le milieu «M7» est en préparation (Elendt, communication personnelle). La solution d’essai ne doit pas être préparée selon les instructions d’Elendt et Bias (1990), car les concentra ­
tions de NaSiO
 3 5H 2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 et K  2 HPO  4 indiquées pour la 
préparation des solutions mères ne conviennent pas.  
Préparation du milieu «M7»  
13. Chaque solution mère (I) est préparée séparément et une solution mère 
combinée (II) est préparée à partir de ces solutions mères (I) (voir tableau 1). Cinquante millilitres de la solution mère combinée (II) addi ­
tionnés de la quantité de chaque solution mère de macronutriments indiquée 
au tableau 2 sont amenés à 1 litre avec de l’eau désionisée pour préparer le 
milieu «M7». On prépare une solution mère de vitamines en ajoutant trois vitamines à de l’eau désionisée, comme indiqué au tableau 3 et on verse 0,1 ml de la solution mère combinée de vitamines au milieu «M7» final, peu 
avant l’emploi (la solution mère de vitamines est stockée congelée par 
petites aliquotes). Le milieu est aéré et stabilisé.
 
BIBLIOGRAPHIE:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1250
 
Tableau 1  
Solutions mères d’éléments en traces pour les milieux M4 et M7  
Solutions mères (I) Quantité (mg) 
pour former une 
solution d’1 litre 
avec de l’eau 
désionisée Pour préparer la solution mère 
combinée (II): mélanger les quantités 
suivantes (ml) de solutions mères (I) 
et compléter à 1 litre avec de l’eau 
désionisée Concentrations finales dans les 
solutions expérimentales (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Ces substances sont dosées différemment en M4 et M7, comme indiqué plus haut. 
( 2 ) Ces solutions sont préparées séparément, puis mélangées et autoclavées immédiatement après.  
Tableau 2  
Solutions mères de macronutriments pour les milieux M4 et M7  
Quantité (mg) pour 
former une solution 
d’1 litre avec de l’eau 
désionisée Quantités de solutions 
mères de macronutriments 
ajoutées pour préparer les 
milieux M4 et M7 
(ml/l) Concentrations finales 
dans les solutions 
expérimentales M4 et 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1251
 
Tableau 3  
Solution mère de vitamines pour les milieux M4 et M7. Les trois solutions de vitamines seront 
mélangées de façon à ne former qu’une solution mère de vitamines  
Quantité pour former 
une solution d’un litre 
avec de l’eau désionisée 
(mg) Quantité de solution mère de 
vitamines ajoutée pour 
préparer les milieux M4 et 
M7 
(ml/l) Concentrations finales 
dans les solutions 
d’essai M4 et M7 
(mg/l)  
Hydrochlorure de thia ­
mine 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamine (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotine 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAPHIE:  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25- 
33. 
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1252
 
Appendice 3  
PRÉPARATION DU SÉDIMENT RECONSTITUÉ  
Composition du sédiment  
Le sédiment sera reconstitué comme suit:  
Ingrédient Caractéristiques % du sédiment 
poids sec  
Tourbe Tourbe de sphaigne, pH aussi 
proche que possible de 5,5- 6,0, pas de résidus de plantes visibles, finement 
broyée, particules ( ≤ 1 mm) 
et séchée à l’air 4 - 5 
Sable quartzique Dimension des particules: > 
50 % des particules doivent mesurer entre 50 et 200 μm 75 - 76 
Argile kaolinique Taux de kaolinite ≥ 30 % 20 
Carbone organique Ajusté par l’addition de 
tourbe et de sable 2 (± 0,5) 
Carbonate de calcium CaCO
 3 , pulvérisé, chimique ­
ment pur 0,05 - 0,1 
Eau Conductivité ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Préparation  
La tourbe est séchée à l’air et broyée en poudre fine. Une suspension de la 
quantité requise de poudre de tourbe dans de l’eau désionisée est préparée à l’aide d’un homogénéisateur à haute performance. Le pH de cette suspension est ajusté à 5,5 ± 0,5 avec du CaCO
 3 . La suspension est conditionnée durant au 
moins deux jours en l’agitant doucement à 20 ± 2 °C, afin de stabiliser le pH et 
d’établir une flore microbienne stable. Le pH est vérifié à nouveau; il devrait atteindre 6,0 ± 0,5. Ensuite la suspension de tourbe est mélangée avec les autres ingrédients (sable et argile kaolinique) et de l’eau désionisée pour former un 
sédiment homogène avec une teneur en eau de 30 à 50 % du poids sec du 
sédiment. Le pH du mélange final est encore mesuré et ajusté à 6,5-7,5 avec du CaCO
 3 , si nécessaire. On prélève des échantillons de sédiment afin de déter ­
miner le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant d’utiliser le 
sédiment reconstitué dans l’essai de toxicité sur les chironomes, il est recom ­
mandé de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai subséquent.
 
Stockage  
Les ingrédients secs destinés à la préparation du sédiment artificiel peuvent être 
entreposés dans un endroit sec et frais, à température ambiante. Le sédiment 
reconstitué (humide) ne doit pas être stocké avant son utilisation dans l’essai. Il doit être utilisé immédiatement après la période de conditionnement de sept jours qui achève sa préparation.
 
BIBLIOGRAPHIE:  
Chapitre C.8 de la présente annexe: Toxicité pour les vers de terre.  
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1253
 
Appendice 4  
Caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable  
Substance Concentrations  
Matières particulaires < 20 mg/l 
Carbone organique total < 2 mg/l Ammoniac non ionisé < 1 μg/l 
Dureté en CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Chlore résiduel < 10 μg/l 
Totalité des pesticides organophosphorés < 50 ng/l Totalité des pesticides organochlorés et des biphényles 
polychlorés < 50 ng/l 
Chlore organique total < 25 ng/l
 
(*) S’il risque d’y avoir une interaction entre les ions qui provoquent la dureté de l’eau et la 
substance d’essai, il convient d’utiliser une eau moins dure (auquel cas, le milieu Elendt 
M4 ne pourra pas être utilisé).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1254
 
Appendice 5  
Conseils pour suivre l’émergence des larves de chironomes  
Les béchers expérimentaux sont coiffés par des pièges à émergence, du 20  e jour 
jusqu’à la fin de l’essai. Le schéma ci-dessous illustre un exemple de piège:
  
A: toile de nylon.  
B: coupelles en plastique renversées.  
C: bécher expérimental sans bec.  D: ouvertures recouvertes de toile par où s’effec ­
tuent les échanges.  
E: eau.  
F: sédiment.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1255
 
C. 28.  ESSAI DE TOXICITÉ SUR LES CHIRONOMES DANS UN 
SYSTÈME EAU CHARGÉE-SÉDIMENT  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 219 de 
l’OCDE (2004) pour les essais de produits chimiques. Elles est conçue 
pour évaluer les effets d’une exposition prolongée à des substances chimiques sur des larves de  Chironomus  sp., un diptère vivant dans les 
sédiments d’eau douce. Elle s’inspire principalement de la ligne directrice 
du BBA, dans laquelle l’exposition s’effectue à l’aide d’un système expé ­
rimental sédiment-eau, composé de sol artificiel et d’une colonne d’eau (1). Elle tient compte également des protocoles d’essais de toxicité sur  Chiro­
nomus riparius  et Chironomus tentans , mis au point en Europe et en 
Amérique du Nord (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) et soumis à des essais circu ­
laires (1) (6) (9). D’autres espèces de chironomes bien documentées peuvent aussi être employées, par exemple  Chironomus yoshimatsui  (10) (11).
 
2. Le scénario d’exposition appliqué dans la présente méthode d’essai consiste 
à introduire la substance d’essai dans l’eau. La sélection du scénario d’ex ­
position dépend de la finalité de l’essai. Le scénario d’exposition qui 
consiste à doper la colonne d’eau, vise à simuler des pertes par dispersion lors de l’épandage de pesticides et couvre le pic de concentrations initial dans l’eau interstitielle. Il s’applique également à d’autres types d’exposition 
(notamment des fuites de produits chimiques), à l’exclusion des processus 
d’accumulation d’une durée supérieure à celle de l’essai.
 
3. En général, les substances à tester sur des organismes vivant dans les 
sédiments subsistent longtemps dans ce compartiment. Ces organismes peuvent être exposés par diverses voies. L’importance relative de chaque 
voie d’exposition et le temps pris par chacune d’entre elles pour contribuer à 
l’effet toxique global dépendent des propriétés physico-chimiques de chaque substance chimique. Dans le cas des substances fortement adsorbantes (par exemple avec un log K
 oe > 5) ou des substances liées de façon covalente au 
sédiment, l’ingestion d’aliments contaminés peut constituer une voie d’ex ­
position non négligeable. Afin de ne pas sous-estimer la toxicité des subs ­
tances fortement lipophiles, on envisagera d’ajouter de la nourriture au sédiment avant l’application de la substance d’essai. La présente méthode 
d’essai est axée sur l’exposition à long terme, de façon à couvrir toutes les 
voies d’exposition potentielles. L’essai dure de 20 à 28 jours pour  C. ripa­
rius et C. yoshimatsui  et de 28 à 65 jours pour  C. tentans . Si l’on a besoin 
de données à court terme pour un motif précis, par exemple pour étudier les 
effets de substances chimiques instables, des récipients supplémentaires, 
ajoutés au dispositif expérimental, peuvent être retirés après 10 jours d’essai.
 
4. Les effets mesurés sont le nombre total d’adultes émergés et temps écoulé 
jusqu’à l’émergence. Si l’on a besoin de données à court terme, il est recommandé de ne mesurer la survie et la croissance des larves qu’après 
10 jours, en ajoutant le nombre nécessaire de récipients supplémentaires.
 
5. L’utilisation d’un sédiment reconstitué est recommandée en raison de ses 
avantages par rapport aux sédiments naturels:  
— la variabilité expérimentale est réduite parce que le sédiment reconstitué 
forme une «matrice normalisée» reproductible; en outre, il n’est plus nécessaire de trouver des sources de sédiments non contaminés et non 
pollués,
 
— les essais peuvent être effectués à n’importe quel moment de l’année, la 
variabilité saisonnière n’intervenant plus et il n’est pas nécessaire de traiter préalablement le sédiment afin d’éliminer la faune indigène; l’uti ­
lisation de sédiments reconstitués diminue aussi le coût associé à la 
collecte sur le terrain d’une quantité suffisante de sédiments pour les 
essais systématiques,
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1256
 
— les sédiments reconstitués permettent de comparer la toxicité des subs ­
tances et de les classer en conséquence; les essais pratiqués sur des 
sédiments naturels et artificiels ont fourni des données de toxicité comparables pour plusieurs substances chimiques (2).
 
6. L’appendice 1 contient les définitions applicables à la présente méthode 
d’essai.  
PRINCIPE DE L’ESSAI  
7. Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de 
concentrations de la substance d’essai dans un système sédiment-eau. L’essai débute par l’introduction de larves au premier stade dans les béchers expérimentaux contenant le système sédiment-eau et l’ajout de la 
substance d’essai à l’eau. L’émergence des chironomes et leur vitesse de 
développement sont mesurées à la fin de l’essai. La survie des larves et leur poids peuvent aussi être mesurés après 10 jours si nécessaire (en ajoutant le 
nombre d’expériences identiques requis). Ces données sont analysées, soit à 
l’aide d’un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraî ­
nerait une réduction de x % de l’émergence ou de la survie des larves ou de leur croissance (par exemple CE
 15 , CE  50 , etc.), soit par la vérification d’une 
hypothèse statistique afin de déterminer une CSEO/CMEO. Cette dernière 
requiert une comparaison entre les valeurs efficaces et les valeurs des témoins à l’aide de tests statistiques.
 
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
8. Il faudrait connaître l’hydrosolubilité de la substance d’essai, sa pression de 
vapeur, son coefficient de partage mesuré ou calculé dans le sédiment et sa 
stabilité dans l’eau et le sédiment. Il convient de disposer d’une méthode 
d’analyse fiable pour quantifier la substance d’essai dans l’eau sus-jacente, l’eau interstitielle et le sédiment, et pour laquelle la précision et le seuil de détection sont connus. Il est également utile de connaître la formule struc ­
turale et la pureté de la substance d’essai ainsi que son devenir chimique 
(par exemple dissipation, dégradation abiotique et biotique, etc.). Des indi ­
cations complémentaires pour tester les substances se prêtant difficilement à l’essai en raison de leurs propriétés physico-chimiques sont fournies à la 
référence (12).
 
SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
9. Des substances de référence pourront être testées régulièrement pour démon ­
trer la fiabilité du protocole et des conditions de l’essai. Voici quelques exemples de toxiques de référence ayant fait leurs preuves dans des essais 
circulaires et des études de validation: lindane, trifluraline, pentachlorophé ­
nol, chlorure de cadmium et chlorure de potassium (1) (2) (5) (6) (13).
 
VALIDITÉ DE L’ESSAI  
10. Pour que l’essai soit valide, les conditions suivantes doivent être remplies:  
— l’émergence chez les témoins doit atteindre au moins 70 % à la fin de 
l’essai (1) (6),  
— s’agissant de  C. riparius  et C. yoshimatsui , l’émergence au stade adulte 
dans les récipients témoins doit avoir lieu entre 12 et 23 jours après leur introduction dans les récipients expérimentaux;  C. tentans  nécessite une 
période de 20 à 65 jours,
 
— à la fin de l’essai, le pH et la concentration d’oxygène dissous seront 
mesurés dans chaque récipient. La concentration d’oxygène devrait atteindre au moins 60 % de la valeur de saturation en air (VSA) à la 
température appliquée et le pH de l’eau sus-jacente devrait être compris 
entre 6 et 9 dans tous les récipients expérimentaux,
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1257
 
— la température de l’eau ne devrait pas varier de plus de ± 1,0 °C et 
pourrait être contrôlée grâce à une chambre isotherme, auquel cas la 
température de la chambre devra être confirmée à intervalles appropriés.  
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Récipients expérimentaux  
11. L’essai se déroule dans des béchers en verre de 600 ml, mesurant 8 cm de 
diamètre. D’autres récipients peuvent être utilisés à condition qu’ils permet ­
tent de garantir une profondeur adéquate d’eau et de sédiment. Le sédiment doit offrir une superficie de 2 à 3 cm
 2 par larve. Le quotient de la profon ­
deur de la couche de sédiment par la profondeur de la couche d’eau 
sus-jacente doit être égal à 1/4. Les récipients et les autres appareils qui entreront en contact avec le système d’essai doivent être composés unique ­
ment de verre ou d’un autre matériau chimiquement inerte (par exemple du 
Téflon).
 
Sélection des espèces  
12. Chironomus riparius  est l’espèce qui convient le mieux.  Chironomus 
tentans  peut aussi être utilisé, mais il est plus difficile à manipuler et néces ­
site une période d’essai plus longue.  Chironomus yoshimatsui  convient 
également. La méthode de culture de  Chironomus riparius  est détaillée à 
l’appendice 2. D’autres documents décrivent les conditions de culture des 
autres espèces:  Chironomus tentans  (4) et  Chironomus yoshimatsui  (11). 
L’identification des espèces est à confirmer avant l’essai, mais n’est pas requise avant chaque essai si les organismes proviennent d’un élevage 
interne.
 
Sédiment  
13. Il est préférable d’employer un sédiment reconstitué (également dénommé 
sédiment artificiel ou synthétique). Néanmoins, si l’on opte pour un sédi ­
ment naturel, il faudrait le caractériser, au moins quant au pH et à la teneur en carbone organique (la détermination d’autres paramètres, tels que le 
rapport C/N et la granulométrie est aussi recommandée), et s’assurer qu’il 
n’est pas contaminé et n’abrite pas d’autres organismes qui pourraient entrer en compétition avec les chironomes ou les consommer. Avant d’utiliser un 
sédiment naturel dans un essai de toxicité sur les chironomes, il est égale ­
ment recommandé de le maintenir durant sept jours dans des conditions identiques à celles qui seront appliquées durant l’essai (conditionnement). Le sédiment reconstitué décrit ci-dessous, basé sur le sol artificiel utilisé 
dans la méthode d’essai C.8 est recommandé (14) (1) (15) (16):
 
a) 4-5 % (poids sec) de tourbe, avec un pH aussi proche que possible de 
5,5 à 6,0; il est important d’utiliser une tourbe sous forme de poudre, finement broyée (dimension des particules ≤ 1 mm) et séchée unique ­
ment à l’air;
 
b) 20 % (poids sec) d’argile kaolinique (teneur en kaolinite de préférence 
supérieure à 30 %);  
c) 75-76 % (poids sec) de sable quartzique (composé en majorité de sable 
fin, plus de 50 % des particules mesurant entre 50 et 200 μm); 
d) ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que la teneur en humidité du 
mélange final atteigne 30 à 50 %;  
e) ajouter du carbonate de calcium de qualité chimiquement pure (CaCO  3 ) 
pour ajuster le pH du mélange final de sédiments à 7,0 ± 0,5;  
f) il convient d’obtenir 2 % (± 0,5 %) de carbone organique dans le 
mélange final en y ajoutant les quantités appropriées de tourbe et de 
sable, comme indiqué en a) et en c).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1258
 
14. Les sources de tourbe, d’argile kaolinique et de sable doivent être connues. 
On vérifiera que les composants du sédiment ne sont pas contaminés par des 
substances chimiques (par exemple des métaux lourds, des composés orga ­
nochlorés, organophosphorés, etc.). Un exemple de préparation de sédiment reconstitué est décrit à l’appendice 3. Les composants peuvent aussi être 
mélangés à l’état sec, à condition de démontrer qu’après l’ajout de l’eau 
sus-jacente, les composants du sédiment ne se séparent pas (flottement de particules de tourbe, par exemple) et que la tourbe ou le sédiment sont suffisamment conditionnés.
 
Eau 
15. Toute eau conforme aux caractéristiques chimiques d’une eau de dilution 
acceptable selon les critères spécifiés aux appendices 2 et 4 convient à l’essai. Toute eau appropriée, naturelle (eau superficielle ou souterraine), reconstituée (voir appendice 2) ou eau du robinet déchlorée, est acceptable 
comme eau pour l’élevage et les essais si les chironomes y survivent sur 
toute la durée de l’élevage et de l’essai sans manifester de signes de stress. Au début de l’essai, le pH de l’eau d’essai se situera entre 6 et 9 et sa dureté totale ne dépassera pas 400 mg/l en CaCO
 3 . Néanmoins, si l’on suspecte 
une interaction entre les ions qui provoquent la dureté et la substance 
d’essai, il faudra utiliser une eau moins dure (et ne pas employer le milieu Elendt M4 dans ce cas). Le même type d’eau doit être utilisé tout au long de l’étude. Les caractéristiques de la qualité de l’eau énumérées à 
l’appendice 4 sont à mesurer au moins deux fois par an ou chaque fois que 
ses caractéristiques sont susceptibles d’avoir été significativement modifiées.
 
Solutions mères – eau chargée  
16. Les concentrations expérimentales sont calculées en fonction des concen ­
trations dans la colonne d’eau recouvrant le sédiment. Les solutions d’essai 
sont généralement préparées aux concentrations choisies par dilution d’une 
solution mère. Il est préférable de préparer les solutions mères en dissolvant la substance d’essai dans le milieu d’essai. Dans certains cas, il sera néces ­
saire d’utiliser des solvants ou des dispersants pour obtenir une solution 
mère à la concentration voulue. Voici quelques exemples de solvants appro ­
priés: acétone, éthanol, méthanol, éthylèneglycol, monoéthyléther, diméthy ­
léther d’éthylèneglycol, diméthylformamide et triéthylèneglycol. Les disper ­
sants qui peuvent être utilisés sont le Cremophor RH40, le Tween 80, la 
méthylcellulose à 0,01 % et l’HCO-40. La concentration de l’agent solubi ­
lisant dans le milieu d’essai final doit être minimale ( ≤ 0,1 ml/l) et identique 
dans tous les traitements. L’agent solubilisant, s’il est utilisé, ne doit pas avoir d’effets significatifs sur la survie, ni d’effet nocif visible sur les larves 
de chironomes, et ce d’après l’observation des organismes du récipient 
témoin traité uniquement au solvant. Néanmoins, l’utilisation de ces subs ­
tances est à éviter dans la mesure du possible.
 
CONCEPTION DE L’ESSAI  
17. La conception de l’essai définit le nombre et l’espacement des concentra ­
tions expérimentales, le nombre de récipients à chaque concentration et le 
nombre de larves par récipient. La marche à suivre pour estimer une valeur de CE, la CSEO et effectuer un essai limite est décrite. L’analyse de régres ­
sion est préférable à une approche par vérification d’hypothèses.
 
Conduite d’une analyse de régression  
18. La concentration efficace (par exemple, CE  15 , CE  50 ) et la gamme de 
concentrations dans laquelle l’effet de la substance d’essai est d’intérêt doivent être couvertes par les concentrations incluses dans l’essai. Généra ­
lement, l’exactitude, et plus particulièrement la validité, de l’estimation des 
concentrations efficaces (CE
 x ) s’accroissent lorsque la concentration efficace 
se situe dans la gamme des concentrations testées. Il faut éviter d’extrapoler  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1259
 
des résultats très en dessous de la concentration efficace la plus faible ou 
au-dessus de la concentration maximale. Il est utile de conduire un essai 
préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur afin de délimiter la gamme des concentrations à appliquer (voir paragraphe 27).
 
19. S’il faut estimer la CE  x , au moins cinq concentrations et trois répétitions par 
concentration doivent être testées. En tout état de cause, il est recommandé 
de tester suffisamment de concentrations pour obtenir une bonne estimation du modèle. Le facteur séparant les concentrations ne doit pas excéder deux (sauf dans les cas où la courbe dose-effet présente une pente faible). Le 
nombre de répétitions par traitement peut être diminué si le nombre de 
concentrations expérimentales entraînant différents effets est augmenté. L’augmentation du nombre de répétitions ou la contraction des intervalles entre les concentrations expérimentales tend à réduire les intervalles de 
confiance pour l’essai. Le nombre de répétitions sera augmenté s’il y a 
lieu d’estimer le taux de survie et la croissance des larves après dix jours.
 
Procédure d’estimation d’une CSEO/CMEO  
20. S’il faut estimer la CMEO ou la CSEO, il convient de tester cinq concen ­
trations expérimentales et au moins quatre répétitions par concentration, le 
facteur séparant les concentrations n’excédant pas deux. Le nombre d’expé ­
riences identiques doit être tel qu’il fournit une puissance statistique permet ­
tant de détecter une différence de 20 % avec le témoin, au seuil de signi ­
fication statistique de 5 % (p = 0,05). S’agissant de la vitesse de dévelop ­
pement, une analyse de la variance (ANOVA) convient généralement, telle 
que le test de Dunnett ou le test de Williams (17) (18) (19) (20). S’agissant du taux d’émergence, le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher (avec correction selon Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent 
être utilisés.
 
Essai limite  
21. Si l’essai préliminaire de détermination de l’ordre de grandeur des concen ­
trations n’a engendré aucun effet, un essai limite peut être conduit (une concentration expérimentale et un témoin). L’essai limite vise à montrer que la concentration toxique de la substance d’essai est supérieure à la 
concentration limite testée. Aucune concentration ne peut être recommandée 
pour cette méthode d’essai; cela est laissé à l’appréciation des instances réglementaires. Généralement, il est nécessaire de mener au moins six répé ­
titions pour les organismes traités et les témoins. Il y a lieu de démontrer 
que la puissance statistique est suffisante pour révéler une différence de 
20 % avec les témoins, au seuil de signification statistique de 5 % (p = 0,05). En ce qui concerne l’effet sur la vitesse de développement et sur le poids, le test t constitue une méthode statistique appropriée, si les données 
respectent les conditions exigées par ce test (normalité, variances homo ­
gènes). On pourra recourir au test t à variance inégale ou à un test non paramétrique, tel que le test de Wilcoxon-Mann-Whitney si ces conditions ne sont pas remplies. S’agissant du taux d’émergence, le test exact de Fisher 
est approprié.
 
MODE OPÉRATOIRE  
Conditions d’exposition  
Préparation du système eau chargée-sédiment  
22. Une quantité appropriée de sédiment reconstitué (voir paragraphes 13-14 et 
appendice 3) est déposée dans les récipients expérimentaux, de façon à 
former une couche d’au moins 1,5 cm. La profondeur de l’eau versée sur 
ce sédiment atteindra 6 cm (voir paragraphe 15). Le ratio entre la profon ­
deur du sédiment et la profondeur de l’eau n’excédera pas 1/4 et la couche de sédiment ne dépassera pas 3 cm. Le système sédiment-eau sera laissé 
sous aération légère pendant 7 jours avant l’ajout des organismes d’essai 
(voir paragraphe 14 et appendice 3). Afin d’éviter la séparation des consti ­
tuants du sédiment et la resuspension des particules fines durant le remplis ­
sage de la colonne d’eau, on peut recouvrir le sédiment d’un disque en 
plastique et retirer le disque juste après le remplissage. D’autres dispositifs 
conviennent également.
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23. Les récipients expérimentaux doivent être couverts (par des plaques de 
verre, par exemple). On prendra soin de remplacer les volumes d’eau 
évaporée durant l’étude, le cas échéant, et ce avec de l’eau distillée ou désionisée afin d’empêcher l’accumulation de sels.
 
Introduction des organismes d’essai  
24. Quatre à cinq jours avant d’introduire les organismes d’essai dans les réci ­
pients, des amas d’œufs sont prélevés dans les cultures et déposés dans de 
petits flacons contenant du milieu de culture. Un milieu plus ancien issu de 
la culture mère tout comme un milieu fraîchement préparé peuvent être utilisés. Si ce dernier est utilisé, on ajoutera une petite quantité de nourriture, par exemple des algues vertes et/ou quelques gouttes du filtrat d’une suspen ­
sion de paillettes pour poissons finement broyées, au milieu de culture (voir 
appendice 2). Seuls des amas d’œufs fraîchement pondus peuvent être utili ­
sés. Normalement, les larves commencent à éclore quelques jours après la ponte (2 à 3 jours pour  Chironomus riparius  à 20 °C et 1 à 4 jours pour  
Chironomus tentans  à 23 °C et  Chironomus yoshimatsui  à 25 °C) et le 
développement des larves se déroule en quatre stades, dont chacun dure 4 à 8 jours. Cet essai se pratique au premier stade larvaire (2-3 ou 1-4 jours après l’éclosion). Il est possible de vérifier le stade de développement des 
moucherons d’après la largeur de la capsule céphalique (6).
 
25. Vingt larves au premier stade, choisies au hasard, sont déposées dans 
chaque récipient contenant le sédiment chargé et l’eau, à l’aide d’une pipette émoussée. L’aération de l’eau doit être interrompue dès qu’on intro ­
duit les larves dans les récipients expérimentaux, et ce durant 24 heures 
après l’ajout des larves (voir paragraphes 24 et 32). Selon le protocole expérimental suivi (voir paragraphes 19 et 20), le nombre de larves utilisées par concentration s’élève au moins à 60 pour l’estimation d’une valeur de 
concentration efficace (CE) et à 80 pour la détermination de la CSEO.
 
26. Vingt-quatre heures après l’introduction des larves dans les récipients expé ­
rimentaux, la substance d’essai est ajoutée à la colonne d’eau sus-jacente et une légère aération est à nouveau dispensée. De petits volumes de la solu ­
tion contenant la substance d’essai sont injectés en dessous de la surface de 
la colonne d’eau à l’aide d’une pipette. Ensuite, il convient de mélanger l’eau sus-jacente en prenant soin de ne pas remuer le sédiment.
 
Concentrations d’essai  
27. Il peut être utile de conduire un essai de détermination de l’ordre de gran ­
deur pour délimiter la gamme de concentrations à appliquer dans l’essai 
proprement dit. À cet effet, on utilise une série de concentrations largement 
espacées de la substance d’essai. Afin de reproduire la même densité de surface par chironome que dans l’essai proprement dit, les chironomes sont exposés à chaque concentration de la substance d’essai durant une période 
permettant d’estimer les concentrations expérimentales appropriées et aucune 
expérience identique n’est nécessaire.
 
28. Les concentrations expérimentales pour l’essai définitif sont choisies en 
fonction des résultats de l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. 
Au moins cinq concentrations doivent être appliquées et sélectionnées 
comme indiqué aux paragraphes 18 à 20.  
Témoins  
29. L’essai comportera le nombre nécessaire de récipients témoins pourvus du 
sédiment mais exempts de toute substance d’essai (voir paragraphes 19-20). Si la substance d’essai a été appliquée à l’aide d’un solvant (voir paragraphe 
16), il convient d’ajouter un témoin dont le sédiment contient également le 
solvant.
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Système expérimental  
30. Des systèmes statiques sont utilisés. Des systèmes semi-statiques ou à écou ­
lement continu avec renouvellement intermittent ou continu de l’eau sus-jacente peuvent être utilisés dans des cas exceptionnels, par exemple 
si les spécifications de la qualité de l’eau deviennent inappropriées pour 
l’organisme d’expérience ou affectent l’équilibre chimique (si, par exemple, la concentration d’oxygène dissous devient trop basse, la concentration des excréta augmente de façon trop importante ou si des minéraux lessivés à 
partir du sédiment affectent le pH et/ou la dureté de l’eau). Néanmoins, 
d’autres méthodes d’amélioration de la qualité de l’eau sus-jacente, telles que l’aération, seront normalement suffisantes et préférables.
 
Alimentation  
31. Les larves ont besoin d’être nourries, de préférence quotidiennement ou au 
moins trois fois par semaine. Durant les dix premiers jours, chaque jeune larve recevra quotidiennement 0,25 à 0,5 mg (0,35-0,5 mg pour  C. yoshi ­
matsui ) de nourriture pour poissons (suspendue dans l’eau ou finement 
broyée, par exemple TetraMin ou TetraPhyll; voir les détails à l’appendice 
2). Il peut être nécessaire d’augmenter légèrement cette quantité pour les larves plus âgées: 0,5-1 mg par larve et par jour devrait suffire pour le reste 
de l’essai. On diminuera la ration alimentaire de tous les organismes traités 
et témoins si des champignons se développent ou si des organismes témoins meurent. Si la croissance fongique s’avère impossible à enrayer, l’essai doit être renouvelé. Si l’essai porte sur des substances fortement adsorbantes (par 
exemple avec un log K
 oe > 5) ou des substances liées de façon covalente au 
sédiment, la quantité de nourriture nécessaire à la survie et à la croissance naturelle des organismes peut être incorporée au sédiment reconstitué avant la période de stabilisation. Dans ce cas, la nourriture pour poissons est 
remplacée par une ration végétale, par exemple 0,5 % (poids sec) de feuilles 
finement broyées d’ortie ( Urtica dioica ), de mûrier ( Morus alba ), de trèfle 
blanc ou rampant ( Trifolium repens ), d’épinard ( Spinacia oleracea ) ou d’un 
autre matériau végétal ( Cerophyl  ou alpha-cellulose).
 
Conditions d’incubation  
32. L’eau sus-jacente est soumise à une légère aération, mise en œuvre de 
préférence 24 heures après l’introduction des larves et maintenue jusqu’à la fin de l’essai (il faut veiller à ce que la concentration d’oxygène dissous 
ne tombe pas en dessous de 60 % de la valeur de saturation en air). L’air est 
insufflé à travers une pipette Pasteur en verre fixée 2 à 3 cm au-dessus de la couche de sédiment (une ou quelques bulles par seconde). Si la substance d’essai est volatile, il faudra éventuellement supprimer l’aération.
 
33. L’essai est mené à température constante (20 °C ± 2 °C). Pour  C. tentans  et 
C. yoshimatsui , les températures recommandées s’élèvent respectivement à 
23 °C et 25 °C (± 2 °C). La photopériode est de 16 heures et l’éclairement 
compris entre 500 et 1 000 lux.  
Durée de l’exposition  
34. L’exposition débute avec l’introduction des larves dans les récipients traités 
et témoins. La durée maximale d’exposition atteint 28 jours pour  C. riparius  
et C. yoshimatsui  et 65 jours pour  C. tentans . Si les moucherons émergent 
plus tôt, l’essai peut s’achever au moins cinq jours après l’émergence du dernier adulte témoin.
 
OBSERVATIONS  
Émergence  
35. La durée du développement et le nombre total de moucherons mâles et 
femelles adultes totalement émergés sont à déterminer. Les mâles sont 
faciles à identifier grâce à leurs antennes plumeuses.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1262
 
36. Au moins trois fois par semaine, on vérifiera que les organismes des réci ­
pients d’essai ne manifestent aucun comportement anormal (sortie du sédi ­
ment, nage inhabituelle, par exemple) par rapport aux témoins. Chaque jour, durant la période supposée de l’émergence, il faut compter le nombre de moucherons émergés et consigner le sexe et le nombre de moucherons 
complètement émergés. Une fois identifiés, les moucherons sont retirés 
des récipients. Tout amas d’œufs déposé avant la fin de l’essai doit être recensé puis enlevé afin d’empêcher la réintroduction de larves dans le sédiment. Le nombre de pupes visibles n’ayant pas réussi à émerger est 
aussi enregistré. Des indications sur la façon de mesurer l’émergence sont 
données à l’appendice 5.
 
Croissance et survie  
37. S’il faut fournir des données sur la survie et la croissance des larves après 
10 jours, des récipients expérimentaux supplémentaires seront inclus dès le 
début de l’essai, pour pouvoir être utilisés ultérieurement. Le sédiment de ces récipients supplémentaires est tamisé à travers des mailles de 250 μm 
pour retenir les larves. La mort est déterminée par deux critères: l’immobi ­
lité et l’absence de réaction à un stimulus mécanique. Les larves non récu ­
pérées doivent aussi être comptabilisées parmi les mortes (les larves qui sont mortes au début de l’essai ont pu être dégradées par des microbes). Après avoir déterminé le poids sec (sans cendres) des larves survivantes par réci ­
pient expérimental, on calcule le poids sec individuel moyen par récipient. Il 
est utile d’établir à quel stade se trouvent les larves survivantes, et ce d’après la largeur de la capsule céphalique de chaque individu.
 
Mesures analytiques  
Concentration de la substance d’essai  
38. Il est recommandé d’analyser, au minimum, des échantillons de l’eau 
sus-jacente, de l’eau interstitielle, et du sédiment, au début (de préférence 
une heure après l’application de la substance d’essai) et à la fin de l’essai, et ce pour la concentration la plus élevée et pour une concentration plus faible. La concentration de la substance d’essai nous renseigne sur le comportement 
et la répartition de la substance d’essai dans le système eau-sédiment. Le 
prélèvement d’échantillons de sédiment au début de l’essai risque de perturber le système d’essai (enlèvement de larves, par exemple), il faut donc inclure des récipients expérimentaux supplémentaires pour effectuer 
des déterminations analytiques au début de l’essai et, s’il y a lieu, au 
cours de l’essai (voir paragraphe 39). Il n’est pas forcément nécessaire d’analyser le sédiment si la répartition de la substance d’essai entre l’eau et le sédiment a été clairement déterminée par une étude eau/sédiment 
menée dans des conditions comparables (par exemple, quotient sédiment/ 
eau, type d’application, teneur en carbone organique du sédiment).
 
39. Lorsqu’on effectue des mesures intermédiaires (par exemple au septième 
jour) et si l’analyse requiert des échantillons volumineux qui ne peuvent être prélevés des récipients sans influencer le système expérimental, les analyses seront pratiquées sur des échantillons provenant de récipients expé ­
rimentaux supplémentaires traités de la même façon (y compris par la 
présence des organismes d’essai), mais non utilisés pour les observations biologiques.
 
40. Pour isoler l’eau interstitielle, on recommande de centrifuger des échan ­
tillons à 10 000 g et à 4 °C durant 30 minutes. Cependant, s’il est démontré que la substance d’essai ne s’adsorbe pas sur les filtres, la filtration est 
également acceptable. Avec des échantillons trop petits, il arrive que les 
concentrations dans l’eau interstitielle soient impossibles à analyser.
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Paramètres physico-chimiques  
41. Le pH, l’oxygène dissous dans l’eau d’essai et la température des récipients 
expérimentaux doivent être mesurés de façon appropriée (voir paragraphe 10). La dureté de l’eau et la teneur en ammoniac sont mesurées dans les 
récipients témoins et dans un récipient traité à la concentration la plus 
élevée, au début et à la fin de l’essai.
 
RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
42. Cet essai vise à déterminer l’effet de la substance d’essai sur la vitesse de 
développement et le nombre total de moucherons mâles et femelles totale ­
ment émergés ou, dans le cas de l’essai de 10 jours, les effets sur la survie 
et le poids des larves. Si rien n’indique que les deux sexes présentent des 
différences statistiques de sensibilité, les résultats obtenus sur les mâles et les femelles peuvent être regroupés pour l’analyse statistique. Les diffé ­
rences de sensibilité entre les sexes peuvent être appréciées statistiquement 
par un test (de tableau) a χ
 2 - r x 2, par exemple. La survie des larves et le 
poids sec individuel moyen par récipient doivent être déterminés après dix jours, le cas échéant.
 
43. Il est préférable de calculer les concentrations efficaces, exprimées en 
concentrations dans l’eau sus-jacente, en fonction des concentrations mesu ­
rées au début de l’essai (voir paragraphe 38).  
44. Pour estimer ponctuellement la CE  50 ou une quelconque CE  x , les statistiques 
par récipient peuvent être utilisées comme des expériences identiques 
proprement dites. Lorsqu’on calcule un intervalle de confiance pour une quelconque CE
 x , il faut tenir compte de la variabilité entre les récipients 
ou montrer que celle-ci est négligeable. Si le modèle est ajusté par la 
méthode des moindres carrés, il convient d’appliquer une transformation 
des données pour les statistiques par récipient afin d’accroître l’homogénéité de la variance. Toutefois, les valeurs de la CE
 x sont à calculer après que les 
résultats ont été «retransformés» de façon à recouvrer leur valeur originale.  
45. Si l’analyse statistique vise à déterminer la CSEO/CMEO par la vérification 
d’hypothèses, la variabilité entre les récipients doit être prise en compte, par exemple à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) «emboîtée». Par contre, des tests plus robustes (21) peuvent être utilisés au cas où les 
hypothèses habituelles de l’analyse de la variance ne se vérifient pas.
 
Taux d’émergence  
46. Le taux d’émergence donne une réponse par tout ou rien et peut être analysé 
par le test de Cochran-Armitage appliqué de façon régressive si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les taux d’émergence corroborent 
cette hypothèse. Dans le cas contraire, un test exact de Fisher ou un test de 
Mantel-Haenszel avec des valeurs de p corrigées selon Bonferroni-Holm peuvent être employés. S’il s’avère que la variabilité entre expériences identiques à la même concentration est supérieure à ce qu’une distribution 
binomiale indiquerait (variation souvent qualifiée d’«extra-binomiale»), on 
appliquera un test plus robuste (Cochran-Armitage ou test exact de Fisher) comme proposé à la référence (21).
 
47. La somme des moucherons émergés par récipient, n  e , est déterminée et 
divisée par le nombre de larves introduites, n  a : 
TE ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1264
 
où: 
TE = taux d’émergence  
n e = nombre de moucherons émergés par récipient  
n e = nombre de larves introduites par récipient  
48. Une variante plus appropriée aux échantillons de grande taille, lorsque la 
variance est extra-binomiale, consiste à traiter le taux d’émergence comme 
une réponse continue et à appliquer une méthode telle que le test de 
Williams, si la relation dose-effet est supposée être monotone et si les résultats du taux d’émergence corroborent cette hypothèse. Le test de Dunnett convient dans le cas où la relation ne s’avère pas monotone. Ici, 
on considère qu’un échantillon est de grande taille lorsque le nombre de 
moucherons émergés et le nombre de chironomes non émergés dépassent chacun cinq, par récipient d’essai.
 
49. Pour appliquer l’analyse de la variance (ANOVA), il convient d’appliquer 
aux valeurs de TE une transformation «arcsinus-racine carrée» ou «Free ­
man-Tukey» afin d’obtenir une distribution proche de la normale et d’éga ­
liser les variances. Le test de Cochran-Armitage, le test exact de Fisher 
(avec correction de Bonferroni) ou le test de Mantel-Haenszel peuvent être employés lorsqu’on utilise des fréquences absolues. La transformation 
arcsinus-racine carrée consiste à calculer l’inverse du sinus (sinus
 -1 ) de la 
racine carrée du TE.  
50. Pour les taux d’émergence, les valeurs de la CE  x sont calculées par une 
analyse de régression [ou par probit (22), logit, Weibull, des logiciels commerciaux appropriés, etc.]. Si l’analyse de la régression échoue (par exemple, lorsqu’il y a moins de deux réponses partielles), on fait appel à 
d’autres méthodes non paramétriques telles que la moyenne mobile ou une 
simple interpolation.
 
Vitesse de développement  
51. La période moyenne de développement représente le temps moyen écoulé 
entre l’introduction des larves (jour 0 de l’essai) et l’émergence de la cohorte expérimentale de moucherons (pour calculer la période réelle de développement, il faut tenir compte de l’âge des larves au moment de 
l’introduction). La vitesse de développement est l’inverse de la période de 
développement (unité: 1/jour) et représente la partie du développement larvaire qui s’effectue par jour. Pour évaluer la toxicité dans les sédiments, il est préférable de choisir la vitesse de développement car sa variance est 
plus faible et ses valeurs sont plus homogènes et plus proches d’une distri ­
bution normale, en comparaison avec la période de développement. C’est pourquoi les tests paramétriques puissants conviennent mieux à la vitesse de développement qu’à la période de développement. Si la vitesse de dévelop ­
pement est traitée comme une réponse continue, les valeurs de la CE
 x 
peuvent être estimées par l’analyse de la régression, par exemple (23), (24).  
52. Pour les tests statistiques suivants, le nombre de moucherons observés le 
jour x sont considérés comme ayant émergé au milieu de l’intervalle de temps compris entre le jour x et le jour x - 1 (1 = longueur de l’intervalle 
d’observation, habituellement 1 jour). La vitesse de développement moyenne 
par récipient ( x) est calculée comme suit:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
où: 
x: vitesse de développement moyenne par récipient  
i: indice de l’intervalle d’observation  
m: nombre maximal d’intervalles d’observation  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1265
 
ƒ i : nombre de moucherons émergés durant l’intervalle d’observation i  
n e : nombre total de moucherons émergés à la fin de l’expérience (=  P ƒ i ) 
x i : vitesse de développement des moucherons émergés durant l’intervalle i  
x i ¼ 1= Í 
jour  i Ä l i 
2 Î 
où: 
jour  i : jour d’observation (compté à partir de l’application)  
l i : durée de l’intervalle d’observation i (exprimée en jours, habituelle ­
ment 1 jour)  
Rapport d’essai  
53. Le rapport d’essai doit fournir au moins les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— état physique et, s’il y a lieu, propriétés physico-chimiques (hydrosolu ­
bilité, pression de vapeur, coefficient de partage dans le sol (ou dans le 
sédiment s’il est connu), stabilité dans l’eau, etc.),  
— identification chimique (nom courant, nom chimique, formule structu ­
rale, numéro CAS, etc.), pureté et méthode d’analyse pour la quantifi ­
cation de la substance d’essai.  
Espèce d’essai:  
— animal d’essai utilisé: espèce, nom scientifique, source et conditions 
d’élevage,  
— informations sur la manipulation des amas d’œufs et des larves,  
— âge des animaux d’expérience au moment où ils ont été déposés dans les 
récipients d’essai.  
Conditions expérimentales:  
— sédiment utilisé, c’est-à-dire naturel ou reconstitué,  
— pour les sédiments naturels: localisation et description du site de prélè ­
vement et notamment, si possible, son histoire en matière de contami ­
nation; caractéristiques: pH, teneur en carbone organique, quotient C/N 
et granulométrie, le cas échéant,  
— préparation du sédiment reconstitué: ingrédients et caractéristiques 
(teneur en carbone organique, pH, humidité, etc. au début de l’essai),  
— préparation de l’eau d’essai (si l’eau est reconstituée) et caractéristiques 
(concentration d’oxygène, pH, conductivité, dureté, etc. au début de l’essai),
 
— profondeur du sédiment et de l’eau sus-jacente,  
— volume de l’eau sus-jacente et de l’eau interstitielle; poids du sédiment 
humide avec et sans eau interstitielle,  
— récipients expérimentaux (matériau et dimension),  
— méthode de préparation des solutions mères et des concentrations expé ­
rimentales,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1266
 
— application de la substance d’essai: concentrations expérimentales utili ­
sées, nombre d’expériences identiques et utilisation d’un solvant, le cas 
échéant,  
— conditions d’incubation: température, cycle et intensité de lumière, aéra ­
tion (fréquence et intensité),  
— informations détaillées sur la nourriture: type de nourriture, préparation, 
quantité et régime d’administration.  
Résultats:  
— concentrations d’essai nominales, concentrations d’essai mesurées et 
résultats de toutes les analyses conduites pour déterminer la concentra ­
tion de la substance d’essai dans le récipient expérimental,  
— qualité de l’eau dans les récipients expérimentaux: pH, température, 
oxygène dissous, dureté et teneur en ammoniac,  
— remplacement de l’eau d’essai évaporée, le cas échéant,  
— nombre de moucherons mâles et femelles émergés par récipient et par 
jour, 
— nombre de larves non émergées sous la forme de moucherons par réci ­
pient,  
— poids sec individuel moyen des larves par récipient, et par stade larvaire, 
s’il y a lieu,  
— pourcentage d’émergence par expérience identique et par concentration 
d’essai (regroupement des résultats pour les moucherons mâles et femelles),
 
— vitesse de développement moyenne des moucherons totalement émergés 
par expérience identique et par concentration d’essai (regroupement des 
résultats pour les moucherons mâles et femelles),  
— estimation des effets toxiques observés, par exemple CE  x (et intervalles 
de confiance associés), CSEO et/ou CMEO, et méthodes statistiques employées pour les déterminer,
 
— analyse des résultats, y compris les répercussions sur les résultats d’un 
écart éventuel à la présente méthode d’essai.  
BIBLIOGRAPHIE:  
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Appendice 1  
DÉFINITIONS  
Les définitions suivantes s’appliquent aux fins de la présente méthode d’essai:  
Le sédiment reconstitué , ou artificiel ou synthétique, désigne le mélange de 
matériaux utilisés pour reproduire au mieux les composants physiques d’un sédiment naturel.
 
L’eau sus-jacente  est l’eau recouvrant le sédiment dans le récipient d’essai.  
L’eau interstitielle , ou l’eau des pores, se réfère à l’eau qui occupe les vides 
laissés entre le sédiment et les particules de sol.  
L’eau chargée  est l’eau d’essai à laquelle on a ajouté la substance d’essai.  
Une substance d’essai  est toute substance ou tout mélange soumis à un essai 
réalisé suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1269
 
Appendice 2  
Recommandations pour la culture de  Chironomus riparius  
1. Les larves de  Chironomus  peuvent être élevées dans des cristallisoirs ou de 
grands récipients. Du sable quartzique fin est déposé en couche mince (environ 5 à 10 mm d’épaisseur) sur le fond du récipient. Le Kieselguhr (par exemple l’art. 8117 de Merck) convient aussi comme substrat (une 
couche encore plus mince de quelques millimètres à peine suffit). Une 
eau de qualité appropriée, profonde de plusieurs centimètres, vient ensuite recouvrir le substrat. En cas d’évaporation, le niveau d’eau doit toujours être ramené à sa hauteur initiale, afin de prévenir toute dessiccation. L’eau 
peut être remplacée, si nécessaire. Une légère aération est fournie. Les 
récipients d’élevage des larves doivent être placés dans des cages appro ­
priées, afin d’empêcher la fuite des adultes émergeant. La cage sera suffi ­
samment grande pour permettre aux adultes émergés d’essaimer, sans quoi 
la copulation risque de ne pas avoir lieu (dimensions minimales: 30 × 30 × 
30 cm).
 
2. Les cages doivent être gardées à température ambiante, ou à 20 ± 2 °C si 
elles sont placées dans une chambre à ambiance constante, avec une photo ­
période de 16 heures de lumière (intensité: environ 1 000 lux) et 8 heures 
d’obscurité. Une humidité relative de l’air inférieure à 60 % pourrait empê ­
cher la reproduction.  
Eau de dilution  
3. Toute eau naturelle ou reconstituée appropriée peut être utilisée. L’eau d’un 
puits, de l’eau du robinet déchlorée et un milieu artificiel (Elendt «M4» ou 
«M7», voir ci-après) sont souvent utilisés. L’eau doit être aérée avant 
l’emploi. Si nécessaire, on peut renouveler l’eau de culture en versant ou en siphonnant soigneusement l’eau usée des récipients expérimentaux, sans détruire les tubes des larves.
 
Alimentation des larves  
4. Les larves de  Chironomus  reçoivent des paillettes pour poissons (Tetra 
Min®, Tetra Phyll® ou une autre marque déposée équivalente), à raison d’environ 250 mg par récipient et par jour. Cette nourriture peut être admi ­
nistrée sous la forme d’une poudre moulue à sec ou d’une suspension dans 
l’eau: 1,0 g de paillettes ajoutées à 20 ml d’eau de dilution et agitées de façon à obtenir un mélange homogène. Cette préparation peut être adminis ­
trée à raison d’environ 5 ml par récipient et par jour (agiter avant emploi). 
Les larves plus âgées peuvent en recevoir plus.
 
5. La nourriture est ajustée en fonction de la qualité de l’eau. Si le milieu de 
culture devient trouble, il convient de réduire la ration. Les quantités de 
nourriture données sont soigneusement notées. Un manque de nourriture fera émigrer les larves vers la colonne d’eau, tandis qu’un excès de nour ­
riture intensifiera l’activité microbienne et abaissera la concentration d’oxy ­
gène. Ces deux conditions sont susceptibles de ralentir la croissance des organismes.
 
6. Certaines cellules d’algues vertes ( Scenedesmus subspicatus, Chlorella 
vulgaris ) peuvent aussi être ajoutées lors de la préparation de nouveaux 
récipients de culture.  
Alimentation des adultes émergeant  
7. Certains expérimentateurs ont suggéré de nourrir les adultes émergés au 
moyen d’un tampon d’ouate imbibé d’une solution de sucrose saturée.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1270
 
Émergence  
8. À 20 ± 2 °C, les adultes commencent à émerger des récipients d’élevage 
des larves après environ 13 à 15 jours. Il est facile de distinguer les mâles d’après leurs antennes plumeuses.
 
Amas d’œufs  
9. Dès que des adultes sont présents dans la cage d’élevage, il faut vérifier 
trois fois par semaine, dans tous les récipients d’élevage de larves, si des 
amas d’œufs gélatineux n’ont pas été déposés. Le cas échéant, les amas 
d’œufs doivent être soigneusement enlevés et transférés dans un petit réci ­
pient contenant un échantillon de l’eau d’élevage. Les amas d’œufs sont utilisés pour préparer un nouveau récipient de culture (2 à 4 amas d’œufs 
par récipient, par exemple) ou pratiquer des essais de toxicité.
 
10. Les larves au premier stade devraient éclore après 2-3 jours.  
Préparation de nouveaux récipients de culture  
11. Une fois que les cultures ont été lancées, il devrait être possible de préparer 
un nouveau récipient de culture de larves, une fois par semaine ou moins souvent, suivant les besoins de l’essai, et de retirer les récipients plus anciens après que les moucherons adultes ont émergé. Ce système permet 
d’obtenir régulièrement un contingent d’adultes, avec une organisation mini ­
male.
 
Préparation des solutions d’essai «M4» et «M7»  
12. Elendt (1990) a décrit le milieu «M4». Le milieu «M7» est préparé comme 
le milieu «M4», sauf pour les substances reprises au tableau 1, dont les concentrations sont quatre fois plus faibles dans le milieu «M7» que dans le milieu «M4». Une publication sur le milieu «M7» est en préparation 
(Elendt, communication personnelle). La solution d’essai ne doit pas être 
préparée selon les instructions d’Elendt et Bias (1990), car les concentra ­
tions de NaSiO
 3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 et K  2 HPO  4 indiquées pour la 
préparation des solutions mères ne conviennent pas.  
Préparation du milieu «M7»  
13. Chaque solution mère (I) est préparée séparément et une solution mère 
combinée (II) est préparée à partir de ces solutions mères (I) (voir 
tableau 1). 50 ml de la solution mère combinée (II) additionnés de la 
quantité de chaque solution mère de macronutriments indiquée au tableau 2 sont amenés à 1 l avec de l’eau désionisée pour composer le milieu «M7». On prépare une solution mère de vitamines en ajoutant trois vita ­
mines à de l’eau désionisée, comme indiqué au tableau 3 et on verse 0,1 ml 
de la solution mère combinée de vitamines au milieu «M7» final, peu avant l’emploi (la solution mère de vitamines est stockée congelée par petites aliquotes). Le milieu est aéré et stabilisé
 
Tableau 1  
Solutions mères d’éléments en traces pour les milieux M4 et M7  
Solutions mères (I) Quantité (mg) 
pour former une 
solution d'un litre 
avec de l’eau 
désionisée Pour préparer la solution mère 
combinée (II): mélanger les quantités 
suivantes (ml) de solutions mères (I) 
et compléter à un litre avec de l’eau 
désionisée Concentrations finales dans les 
solutions expérimentales (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 • 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1271
 
Solutions mères (I) Quantité (mg) 
pour former une 
solution d'un litre 
avec de l’eau 
désionisée Pour préparer la solution mère 
combinée (II): mélanger les quantités 
suivantes (ml) de solutions mères (I) 
et compléter à un litre avec de l’eau 
désionisée Concentrations finales dans les 
solutions expérimentales (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 • 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 • 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 • 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 • 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA • 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 • 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Ces substances sont dosées différemment dans M4 et M7, comme indiqué plus haut. 
( 2 ) Ces solutions sont préparées séparément, puis mélangées et autoclavées immédiatement après.  
Tableau 2  
Solutions mères de macronutriments pour les milieux M4 et M7  
Quantité pour former 
une solution d’un litre 
avec de l’eau 
désionisée 
(mg) Quantités de solutions 
mères de macronutriments 
ajoutées pour préparer les 
milieux M4 et M7 
(ml/l) Concentrations finales 
dans les solutions 
expérimentales M4 et 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 • 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 • 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 • 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1272
 
Tableau 3  
Solution mère de vitamines pour les milieux M4 et M7  
Les trois solutions de vitamines sont mélangées de façon à ne former qu’une solution mère de 
vitamines.  
Quantité pour former 
une solution d’un litre 
avec de l’eau désionisée 
(mg) Quantités de solutions mères 
de vitamines ajoutées pour 
préparer les milieux M4 et 
M7 
(ml/l) Concentrations finales 
dans les solutions 
d’essai M4 et M7 
(mg/l)  
Hydrochlorure de thia ­
mine 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamine (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotine 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAPHIE:  
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 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1273
 
Appendice 3  
PRÉPARATION DU SÉDIMENT RECONSTITUÉ  
Composition du sédiment  
Le sédiment sera reconstitué comme suit:  
Ingrédient Caractéristiques % du sédiment 
poids sec  
Tourbe Tourbe de sphaigne, pH aussi 
proche que possible de 5,5- 
6,0, pas de résidus de 
plantes visibles, finement broyée, particules ( ≤ 1 mm) 
et séchée à l’air 4-5 
Sable quartzique Dimension des particules: > 
50 % des particules doivent 
mesurer entre 50 et 200 μm 75-76 
Argile kaolinique Taux de kaolinite ≥ 30 % 20 
Carbone organique Ajusté par l’addition de 
tourbe et de sable 2 (± 0,5) 
Carbonate de calcium CaCO
 3 , pulvérisé, chimique ­
ment pur 0,05 - 0,1 
Eau Conductivité ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Préparation  
La tourbe est séchée à l’air et broyée en poudre fine. Une suspension de la 
quantité requise de poudre de tourbe dans de l’eau désionisée est préparée à 
l’aide d’un homogénéisateur à haute performance. Le pH de cette suspension 
est ajusté à 5,5 ± 0,5 avec du CaCO  3 . La suspension est conditionnée durant au 
moins deux jours en l’agitant doucement à 20 ± 2 °C, afin de stabiliser le pH et d’établir une flore microbienne stable. Le pH est vérifié à nouveau; il devrait 
atteindre 6,0 ± 0,5. Ensuite la suspension de tourbe est mélangée avec les autres 
ingrédients (sable et argile kaolinique) et de l’eau désionisée pour former un sédiment homogène avec une teneur en eau de 30 à 50 % du poids sec du sédiment. Le pH du mélange final est encore mesuré et ajusté à 6,5-7,5 avec 
du CaCO
 3 , si nécessaire. On prélève des échantillons de sédiment afin de déter ­
miner le poids sec et la teneur en carbone organique. Ensuite, avant d’utiliser le sédiment reconstitué dans l’essai de toxicité sur les chironomes, il est recom ­
mandé de le conditionner durant sept jours dans des conditions identiques à 
celles qui seront appliquées durant l’essai subséquent.
 
Stockage  
Les ingrédients secs destinés à la préparation du sédiment artificiel peuvent être 
entreposés dans un endroit sec et frais, à température ambiante. Le sédiment 
reconstitué (humide) ne doit pas être stocké avant son utilisation dans l’essai. Il doit être utilisé immédiatement après la période de conditionnement de sept jours qui achève sa préparation.
 
BIBLIOGRAPHIE:  
Chapitre C.8 de la présente annexe: Toxicité pour les vers de terre.  
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1274
 
Appendice 4  
Caractéristiques chimiques d’une eau de dilution acceptable  
Substance Concentrations  
Matières particulaires < 20 mg/l 
Carbone organique total < 2 mg/l Ammoniac non ionisé < 1 μg/l 
Dureté en CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Chlore résiduel < 10 μg/l 
Totalité des pesticides organophosphorés < 50 ng/l Totalité des pesticides organochlorés et des biphényles 
polychlorés < 50 ng/l 
Chlore organique total < 25 ng/l
 
(*) S’il risque d’y avoir une interaction entre les ions qui provoquent la dureté de l’eau et la 
substance d’essai, il convient d’utiliser une eau moins dure (auquel cas, le milieu Elendt 
M4 ne pourra pas être utilisé).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1275
 
Appendice 5  
Conseils pour suivre l’émergence des larves de chironomes  
Les béchers expérimentaux sont coiffés par des pièges à émergence, du 20  e jour 
jusqu’à la fin de l’essai. Le schéma ci-dessous illustre un exemple de piège:
  
A: toile de nylon.  
B: coupelles en plastique renversées.  
C: bécher expérimental sans bec.  D: ouvertures recouvertes de toile par où s’effec ­
tuent les échanges d’eau.  
E: eau.  
F: sédiment.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1276
 
C.29.  BIODÉGRADABILITÉ FACILE – DÉGAGEMENT DE CO  2 DANS 
DES FLACONS HERMÉTIQUEMENT CLOS (ESSAI DE L’ESPACE DE 
TÊTE AU-DESSUS DU LIQUIDE)  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 310 (2006) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode de criblage permet de classer les substances chimiques en fonction de leur biodégrada ­
bilité facile et fournit des informations semblables à celles exposées dans les 
six méthodes d’essai (A à F) décrites au chapitre C.4 de la présente annexe. 
Par conséquent, une substance chimique livrant un résultat positif pour cet essai de l’espace de tête peut être considérée comme facilement biodégra ­
dable et donc rapidement dégradable dans l’environnement.
 
2. L’essai, désormais bien mis au point, de dégagement de CO  2 (1), basé sur 
l’essai original de Sturm (2), qui permet d’évaluer la biodégradabilité des 
produits chimiques organiques d’après la mesure du dioxyde de carbone 
produit par l’activité microbiologique, est normalement celui qui se prête le mieux à l’essai des substances chimiques peu solubles et celles fortement 
adsorbantes. Il est également choisi pour les substances solubles (mais non 
volatiles) puisque beaucoup considèrent que le dégagement de dioxyde de carbone constitue la seule preuve irréfutable de l’activité microbiologique. La disparition du carbone organique dissous peut faire intervenir des 
processus physico-chimiques (adsorption, volatilisation, précipitation, hydro ­
lyse) ainsi que l’action microbiologique et de nombreuses réactions non-biologiques consommant de l’oxygène; il est rare que le CO
 2 soit 
produit à partir de produits chimiques organiques par un processus abio ­
tique. Dans les essais original et modifié de Sturm (1) (2), le CO  2 est extrait 
de la phase liquide et envoyé dans des récipients absorbants par barbotage (passage bulle à bulle d’air traité à travers le milieu liquide pour éliminer le CO
 2 ), alors que dans la version de Larson (3) (4), lors de son transfert du 
réacteur vers l’absorbeur, le CO  2 traverse un espace de tête contenant de 
l’air exempt de CO  2 , tandis que le réacteur est agité en continu. Le réacteur 
n’est agité que dans la version de Larson modifiée; l’agitation n’est prescrite que pour les substances insolubles dans la norme ISO 9439 (5) et dans la 
version originale des États-Unis (6), qui prescrivent toutes deux le barbotage 
plutôt que le remplacement de l’espace de tête. Dans une autre méthode officielle (7) de l’Agence des États-Unis pour la protection de l’environne ­
ment (US EPA), basée sur la méthode de Gledhill (8), le réacteur agité est 
fermé à l’atmosphère et le CO
 2 produit est directement recueilli de la phase 
gazeuse dans un piège alcalin interne, comme dans les respiromètres clas ­
siques de Warburg/Barcroft.  
3. Il a toutefois été démontré que le carbone inorganique s’accumule dans le 
milieu durant l’application de l’essai standard modifié de Sturm à plusieurs 
substances chimiques (9). La dégradation de l’aniline à 20 mg C/l a produit 
une concentration assez élevée de carbone inorganique, à savoir 8 mg/l. Autrement dit, la collecte de CO
 2 dans les pièges alcalins n’a pas reflété 
la quantité réelle de CO  2 produite par des processus microbiologiques à des 
moments intermédiaires au cours de la dégradation. Par conséquent, la pres ­
cription selon laquelle une production de CO  2 supérieure à 60 % de la 
production maximale théorique (ThCO  2 ) doit être atteinte dans un intervalle 
de 10 jours (les dix jours suivant immédiatement le franchissement du seuil 
de 10 % de biodégradation) pour une substance d’essai à classer comme 
facilement biodégradable, ne pourra être respectée pour certaines substances qui rentreraient dans cette classification d’après la disparition du carbone organique dissous.
 
4. Lorsque le pourcentage de dégradation est inférieur au niveau attendu, il est 
probable que du carbone inorganique se soit accumulé dans la solution 
expérimentale. À ce moment-là, la dégradabilité peut être évaluée avec les 
autres essais de biodégradabilité facile.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1277
 
5. D’autres inconvénients de la méthode de Sturm (laborieuse, longue, davan ­
tage sujette à des erreurs expérimentales et non applicable aux substances 
volatiles) avaient déjà incité les chercheurs à s’orienter vers une technique en flacon hermétiquement clos, autre que celle de Gledhill, plutôt que d’utiliser un écoulement gazeux continu (10) (11). Boatman  et al.  (12) 
ont réexaminé les méthodes précédentes et adopté un système d’espace de 
tête fermé dans lequel le CO
 2 est libéré dans l’espace de tête à la fin de 
l’incubation moyennant une acidification du milieu. Le CO  2 était mesuré par 
chromatographie gazeuse (carbone inorganique) dans des échantillons 
prélevés automatiquement de l’espace de tête, mais le carbone inorganique 
dissous dans la phase liquide n’était pas pris en compte. En outre, les récipients utilisés étaient très petits (20 ml) et ne contenaient que 10 ml de milieu, ce qui engendrait des problèmes, par exemple lorsqu’on ajoutait 
des quantités forcément très petites de substances d’essai insolubles, et/ou 
du fait que le milieu inoculé risquait de ne pas renfermer (suffisamment) de micro-organismes capables de dégrader les substances d’essai.
 
6. Ces problèmes ont été résolus par les études indépendantes de Struijs et 
Stoltenkamp (13) et de Birch et Fletcher (14), ces derniers s’étant inspirés de 
leur expérience avec les appareils utilisés dans l’essai de biodégradation 
anaérobie (15). Dans la première méthode (13), le CO  2 est mesuré dans 
l’espace de tête après acidification et équilibrage, tandis que dans la seconde (14), le carbone inorganique dissous est mesuré dans les phases gazeuse et 
liquide, sans traitement; plus de 90 % du carbone inorganique formé était 
présent dans la phase liquide. Ces deux méthodes présentent des avantages sur l’essai de Sturm du fait que le système expérimental est plus compact et 
maniable, qu’elles s’appliquent aussi aux substances volatiles et que le 
risque de retard dans la mesure du CO
 2 produit est écarté.  
7. Ces deux approches ont été combinées dans la norme ISO (essai au CO  2 – 
espace de tête) (16) qui a fait l’objet d’un essai circulaire (17) et qui forme la base de la présente méthode d’essai. Ces deux approches ont également 
été appliquées dans la méthode de l’US EPA (18). Deux méthodes de 
mesure du CO
 2 ont été recommandées, à savoir le CO  2 dans l’espace de 
tête après acidification (13) et le carbone inorganique dans la phase liquide après l’ajout d’un excès de base. Cette dernière méthode a été introduite par 
Peterson au cours de l’essai circulaire, conduit par le CONCAWE (19), de 
cette méthode de l’espace de tête modifiée pour mesurer la biodégradabilité intrinsèque. Les changements apportés par la révision effectuée en 1992 (20) des méthodes contenues dans le chapitre C.4 de la présente annexe pour les 
essais de biodégradabilité facile ont été incorporés dans la présente méthode 
d’essai, si bien que les conditions (milieu, durée, etc.) sont par ailleurs identiques à celles de l’essai modifié de Sturm (20). Birch et Fletcher (14) ont montré que, sur les mêmes substances, l’essai de l’espace de tête 
livrait des résultats très proches de ceux de l’essai circulaire organisé par 
l’OCDE des méthodes d’essai révisées (21).
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
8. Une population mixte de micro-organismes est ensemencée dans un milieu 
tampon composé de sels minéraux, où la substance d’essai, généralement à une concentration de 20 mg C/l, représente la seule source de carbone et 
d’énergie. L’essai est conduit dans des flacons hermétiquement clos compor ­
tant un espace de tête d’air, qui sert de réserve d’oxygène pour la biodé ­
gradation aérobie. On détermine le CO
 2 dégagé par la biodégradation 
aérobie finale de la substance d’essai en mesurant l’excédent de carbone 
inorganique produit dans les flacons d’essai par rapport au carbone inorga ­
nique produit dans les flacons témoins à blanc ne renfermant que le milieu ensemencé. Le degré de biodégradation est exprimé en pourcentage de la production maximale théorique de carbone inorganique (ThCI), d’après la 
quantité de substance d’essai (en carbone organique) ajoutée au départ.
 
9. La disparition de carbone organique dissous et/ou le niveau de la biodégra ­
dation primaire de la substance d’essai peuvent aussi être mesurés (20).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1278
 
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI  
10. Il faut connaître la teneur (% poids) en carbone organique de la substance 
d’essai, d’après sa structure chimique ou par une mesure, de façon à pouvoir calculer le pourcentage de dégradation. Dans le cas des substances d’essai 
volatiles, il est utile de mesurer ou de calculer la constante de Henry afin de 
déterminer un rapport volumique espace de tête/liquide approprié. Les infor ­
mations sur la toxicité de la substance d’essai à l’égard des micro-organismes permettent de choisir une concentration d’essai appropriée 
et facilitent l’interprétation des résultats lorsque la biodégradabilité est 
faible: on recommande d’inclure un témoin d’inhibition, sauf si l’on sait que la substance d’essai n’inhibe pas l’activité des micro-organismes (voir 
paragraphe 24).
 
CHAMP D’APPLICATION DE LA MÉTHODE  
11. Cet essai convient aux substances insolubles et solubles dans l’eau, cepen ­
dant la substance d’essai doit être bien dispersée. Si l’on applique le rapport 
volumique espace de tête/liquide recommandé de 1/2, les substances vola ­
tiles dont la constante de Henry ne dépasse pas 50 Pa.m  3 .mol  -1 peuvent être 
testées puisque la proportion de la substance d’essai dans l’espace de tête n’excèdera pas 1 % (13). Un volume plus petit d’espace de tête peut être 
utilisé pour tester des substances plus volatiles, mais dont la biodisponibilité 
risque d’être limitante, surtout si elles sont peu solubles dans l’eau. Toute ­
fois, les expérimentateurs doivent s’assurer que le rapport volumique espace de tête/liquide et la concentration de la substance d’essai laissent suffisam ­
ment d’oxygène disponible pour permettre à la biodégradation aérobie d’être 
complète (en évitant, par exemple, d’utiliser un substrat très concentré et un petit espace de tête). Des orientations sur ce point figurent dans les réfé ­
rences (13) et (23).
 
SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE  
12. Il faut vérifier le procédé expérimental en testant en parallèle une substance 
de référence de biodégradabilité connue. À cet effet, l’aniline, le benzoate de sodium ou l’éthylèneglycol peuvent être utilisés pour les substances d’essai 
solubles dans l’eau et le 1-octanol pour les substances d’essai peu solubles 
(13). La biodégradation de ces substances doit être supérieure à 60 % de la ThCI au bout de 14 jours.
 
REPRODUCTIBILITÉ  
13. L’essai circulaire réalisé par l’ISO de la méthode (17) a produit les résultats 
suivants, pour les conditions recommandées, notamment une concentration de la substance d’essai de 20 mg C/l:
 
Substance d’essai Pourcentage moyen 
de biodégradation 
(28 jours) Coefficient de 
variation 
(%) Nombre de labora ­
toires  
Aniline 90 16 17 
1-octanol 85 12 14  
Avec l’aniline, la variabilité interne de l’essai était faible, les coefficients de 
variabilité ne dépassant pas 5 % dans presque tous les essais. Dans les deux cas où la répétabilité a été moins bonne, la plus grande variabilité a proba ­
blement été due à une production élevée de carbone inorganique dans les 
témoins à blanc. Le 1-octanol a donné lieu à une moins bonne répétabilité, mais avec une variabilité néanmoins inférieure à 10 % dans 79 % des essais. Cette plus grande variabilité interne de l’essai pourrait résulter d’erreurs de 
dosage, le volume de 1-octanol à injecter dans les flacons expérimentaux 
hermétiquement clos étant faible (3 à 4 μl). Des concentrations plus faibles 
de la substance d’essai engendreraient des coefficients de variation plus élevés, en particulier aux concentrations inférieures à 10 mg C/l. Ce 
problème pourrait être en partie résolu par la diminution de la concentration 
du carbone inorganique total dans l’inoculum.
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14. Un essai circulaire de cinq agents tensioactifs à 10 mg C/L, organisé par 
l’Union européenne (24), a livré les résultats suivants:  
Substance d’essai Pourcentage moyen 
de biodégradation 
(28 jours) Coefficient de 
variation 
(%) Nombre de 
laboratoires  
Benzènesulfonate de 
tétrapropylène 17 45 10 
Diisooctylsulfosucci ­
nate 
(anionique) 72 22 9 
Chlorure d’ammonium 
hexadécyl-trimé ­
thyique (*) 
(cationique) 75 13 10 
(éthoxylate d’)  9 isono­
nylphénol 
(non ionique) 41 32 10 
Cocoamidepropyl- 
diméthylhydroxy- 
sulfobétaïne 
(amphotère) 60 23 11  
(*) Le SiO  2 a été ajouté pour neutraliser la toxicité.  
Les résultats montrent qu’en général, les agents tensioactifs les moins bien 
dégradés présentent une plus grande variabilité. La variabilité interne de l’essai, qui était inférieure à 15 % dans plus de 90 % des cas, n’a pas dépassé 30-40 %.
 
Note:  la plupart des agents tensioactifs ne se composent pas d’une seule 
espèce moléculaire, mais sont des mélanges d’isomères, d’homo ­
logues, etc. qui se dégradent à l’issue de différentes périodes de 
latence et à différentes vitesses, et qui génèrent des courbes «brouil ­
lées», atténuées, de sorte que le seuil de 60 % risque de n’être pas atteint dans la fenêtre de dix jours, même si chaque espèce molécu ­
laire atteindrait plus de 60 % en l’espace de dix jours si elle avait été 
testée isolément. Ce phénomène peut aussi s’observer avec d’autres mélanges complexes.
 
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Appareillage  
15. Appareils courants de laboratoire et:  
a) flacons à sérum en verre fermés avec des bouchons en caoutchouc buty ­
lique sertis de surcapsules en aluminium. La capacité recommandée est 
de 125 ml, soit un volume total d’environ 160 ml (dans ce cas, le 
volume de chaque flacon doit atteindre 160 ml avec une précision de 1 ml). Des flacons plus petits peuvent être utilisés si les résultats remplis ­
sent les conditions décrites aux paragraphes 66 et 67;
 
b) analyseur de carbone ou autre instrument (chromatographe en phase 
gazeuse, par exemple) pour mesurer le carbone inorganique;  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1280
 
c) seringues à haute précision pour les échantillons gazeux et liquides;  
d) agitateur orbital dans un environnement thermostaté;  
e) source d’air exempt de CO  2 – on peut la préparer en faisant passer l’air à 
travers des granules de chaux sodée ou en utilisant un mélange gazeux à 80 % de N
 2 et 20 % d’O  2 (facultatif) (voir paragraphe 28);  
f) appareil à membrane filtrante à pores de 0,20 à 0,45 μm (facultatif);  
g) analyseur de carbone organique (facultatif).  
Réactifs  
16. Tous les réactifs doivent être de qualité pour analyse.  
Eau 
17. On utilise de l’eau distillée ou désionisée dont la teneur en carbone orga ­
nique total est ≤ 1 mg/l. Cela représente une quantité ≤ 5 % de la teneur 
initiale en carbone organique introduite par la dose recommandée de subs ­
tance d’essai.  
Solutions mères pour le milieu composé de sels minéraux  
18. Les solutions mères et le milieu minéral sont similaires à ceux de la norme 
ISO 14593 (16) et des essais de «biodégradabilité facile» du chapitre C.4 (20). L’utilisation d’une concentration plus élevée de chlorure d’ammonium 
(2,0 g/l au lieu de 0,5 g/l) ne devrait être nécessaire que dans des cas très 
exceptionnels, par exemple lorsque la concentration de la substance d’essai est > 40 mg C/l. Les solutions mères doivent être gardées au froid et éliminées après six mois, ou avant si l’on remarque une précipitation ou 
une prolifération bactérienne. Préparer les solutions mères suivantes:
 
a) Dihydrogénophosphate de potassium (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
Hydrogénophosphate de potassium (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
Hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na  2 HPO  4 .2H  2 0) 33,40 g  
Chlorure d’ammonium (NH  4 Cl) 0,50 g  
Dissoudre dans l’eau et porter le volume à 1 litre. Le pH de la solution 
doit être égal à 7,4 (± 0,2). Si ce n’est pas le cas, préparer une autre 
solution;  
b) Chlorure de calcium dihydraté (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Dissoudre dans l’eau et porter le volume à 1 litre;  
c) Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Dissoudre dans l’eau et porter le volume à 1 litre;  
d) Chlorure de fer (III) hexahydraté (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Dissoudre dans l’eau, porter le volume à 1 litre et ajouter une goutte de 
HCl concentré.  
Préparation du milieu minéral  
19. Mélanger 10 ml de la solution a) avec environ 800 ml d’eau (paragraphe 
17), puis ajouter 1 ml des solutions b), c) et d) et compléter le volume à 1 litre avec de l’eau (paragraphe 17).
 
Autres réactifs  
20. Acide phosphorique concentré (H  3 PO 4 ) (> 85 % masse par volume).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1281
 
Solution d’hydroxyde de sodium 7M  
21. Dissoudre 280 g d’hydroxyde de sodium (NaOH) dans 1 litre d’eau (para ­
graphe 17). Déterminer la teneur en carbone inorganique dissous de cette solution et tenir compte de cette valeur dans le calcul du résultat de l’essai 
(voir paragraphes 55 et 61), notamment en fonction du critère de validité 
mentionné au paragraphe 66 b). Préparer une nouvelle solution si la concen ­
tration en carbone inorganique dissous est trop élevée.
 
Substance d’essai  
22. Préparer une solution mère d’une substance d’essai suffisamment hydroso ­
luble, dans l’eau (paragraphe 17) ou dans le milieu d’essai (paragraphe 19), 
à une concentration de préférence 100 fois supérieure à la concentration finale à utiliser dans l’essai; il peut être nécessaire d’ajuster le pH de la solution mère. La solution mère doit être ajoutée au milieu minéral de telle 
sorte que la concentration finale de carbone organique atteigne entre 2 et 40 
mg C/l, de préférence 20 mg C/l. Des concentrations plus faibles que celles mentionnées ci-dessus risquent de diminuer la précision. Les substances liquides solubles et insolubles peuvent être introduites directement dans 
les récipients à l’aide de seringues à haute précision. Les substances 
d’essai peu solubles et insolubles peuvent requérir un traitement spécial (25), à choisir parmi les suivants:
 
a) ajout direct de quantités de poids connu;  
b) dispersion aux ultrasons avant l’ajout;  
c) dispersion à l’aide d’agents émulsifiants dont il y a lieu d’établir, avant 
d’ajouter la substance d’essai, s’ils exercent une action inhibitrice ou 
stimulante sur l’activité microbiologique;  
d) adsorption des substances d’essai liquides, ou d’une solution de la subs ­
tance d’essai dans un solvant volatil approprié, sur un milieu ou un support inerte (par exemple un filtre en fibres de verre), suivie par 
l’évaporation du solvant, le cas échéant, et ajout direct de quantités 
connues;
 
e) ajout d’un volume connu d’une solution de la substance d’essai dans un 
solvant suffisamment volatil pour qu’il s’évapore complètement du réci ­
pient, suivi par l’évaporation du solvant.  
Il faut vérifier par un essai si les agents ou les solvants utilisés aux points c), 
d) et e) ont un effet stimulant ou inhibiteur sur l’activité microbiologique 
[voir paragraphe 42 b)].  
Substance de référence  
23. Préparer une solution mère de la substance de référence (soluble) dans l’eau 
(paragraphe 17) à une concentration de préférence 100 fois supérieure à la concentration finale (20 mg C/l) à utiliser dans l’essai.
 
Vérification de l’inhibition  
24. Il arrive souvent que les substances d’essai ne se dégradent pas de façon 
significative dans les conditions appliquées aux évaluations de la biodégra ­
dation immédiate. Cela peut résulter du fait que la substance d’essai exerce 
un effet inhibiteur sur l’inoculum à la concentration à laquelle elle est testée. Une vérification de l’effet inhibiteur peut être incluse dans la conception de l’essai pour faciliter l’identification (rétrospective) de l’inhibition comme 
l’une des causes possibles ou l’un des facteurs contributifs, soit, au 
contraire, pour éliminer cette possibilité d’interférences, ce qui démontrerait que la dégradation faible ou nulle n’est imputable qu’au fait que les micro-organismes n’attaquent pas la substance dans les conditions de l’essai. 
Afin d’obtenir des informations sur la toxicité de la substance d’essai à 
l’égard des micro-organismes (aérobies), on prépare une solution contenant la substance d’essai et la substance de référence dans le milieu d’essai (paragraphe 19), chacune à la même concentration que celle à laquelle 
elles ont été ajoutées dans le milieu d’essai lors de l’essai (voir paragraphes 
22 et 23).
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Inoculum  
25. L’inoculum peut provenir de différentes sources: boues activées, effluents 
d’eaux usées (non chlorés); eaux de surface et sols; ou d’un mélange de ces milieux (20). Il convient de vérifier l’activité biodégradante de la source à 
l’aide d’une substance de référence. Quelle que soit la source, il ne faut pas 
utiliser de micro-organismes ayant déjà été exposés à la substance d’essai pour l’essai de biodégradabilité facile.
 
Attention: les boues activées, les eaux usées et les effluents d’eaux usées 
renferment des organismes pathogènes et doivent être manipulés 
avec précaution.  
26. On sait empiriquement que le volume optimal de l’inoculum est celui qui:  
— suffit pour fournir une activité biodégradante adéquate,  
— dégrade la substance de référence dans le pourcentage stipulé (voir 
paragraphe 66),  
— fournit 10  2 à 10  5 unités formant colonie par millilitre dans le mélange 
final,  
— donne normalement une concentration de 4 mg/l de solides en suspen ­
sion dans le mélange final lorsqu’on utilise de la boue activée; des 
concentrations allant jusqu’à 30 mg/l peuvent être utilisées, mais elles risquent d’augmenter sensiblement la production de CO
 2 dans les 
témoins à blanc (26),  
— représente moins de 10 % de la concentration initiale de carbone orga ­
nique introduite par la substance d’essai,  
— équivaut généralement à 1 à 10 ml d’inoculum par litre de solution 
expérimentale.  
Boues activées  
27. Prélever un échantillon de boue activée dans le bassin d’aération d’une 
station d’épuration ou d’une installation à l’échelle du laboratoire traitant 
principalement des eaux usées domestiques. Éliminer, si nécessaire, les grosses particules à l’aide d’un tamis (possédant des orifices de 1 mm
 2 , 
par exemple) et conserver ensuite la boue en aérobiose jusqu’à son utilisa ­
tion. 
28. Une autre possibilité consiste, après avoir éliminé toutes les grosses parti ­
cules, à laisser décanter la boue ou à la centrifuger (par exemple à 1 100 g 
pendant 10 minutes). Éliminer le surnageant. La boue peut être lavée dans la solution minérale. Suspendre la boue concentrée dans le milieu minéral de façon à obtenir une concentration de 3 à 5 g/l de matières en suspension. 
Aérer ensuite la suspension jusqu’à son utilisation.
 
29. La boue doit provenir d’une station d’épuration ordinaire en bon état de 
fonctionnement. Les boues issues d’une station d’épuration dont le débit est 
important, ainsi que les boues susceptibles de contenir des inhibiteurs, 
doivent être lavées. Décanter ou centrifuger la boue remise en suspension après agitation vigoureuse, éliminer le liquide surnageant et resuspendre la boue lavée dans un volume de milieu minéral frais. Répéter cette opération 
jusqu’à ce que la boue puisse être considérée comme exempte de substrat en 
excès ou d’inhibiteur.
 
30. Prélever un échantillon de boue remise en suspension (lorsque la resuspen ­
sion est complète) ou de boue non traitée juste avant le moment de son utilisation afin de déterminer le poids sec des matières en suspension.
 
31. Une autre possibilité consiste à homogénéiser la boue activée (entre 3 et 5 
g/l de solides en suspension). Passer la boue dans un mélangeur mécanique réglé sur une vitesse moyenne pendant 2 minutes. Laisser reposer la boue homogénéisée pendant 30 minutes, ou plus longtemps si nécessaire, et 
prélever la phase liquide, qui sera utilisée comme inoculum à raison d’en ­
viron 10 ml par litre de milieu minéral.
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32. Il est possible d’obtenir une réduction plus importante du dégagement de 
CO 2 dans le témoin à blanc en aérant la boue toute une nuit avec de l’air 
exempt de CO  2 . Dans cet essai, la concentration de l’inoculum doit s’élever 
à 4 mg/l de solides de boue activée (13).  
Effluent secondaire d’eaux usées  
33. L’inoculum peut également provenir de l’effluent secondaire d’une station 
d’épuration ou d’une installation à l’échelle du laboratoire recevant princi ­
palement des eaux usées domestiques. Conservé en aérobiose, l’échantillon 
sera utilisé le jour de son prélèvement ou préconditionné si nécessaire. 
L’effluent doit être filtré à travers un filtre grossier et son pH est mesuré.  
34. Pour réduire la teneur en carbone inorganique du filtrat, on fait barboter 
dans celui-ci de l’air exempt de CO  2 [paragraphe 15 e)] durant 1 heure tout 
en maintenant le pH à 6,5 avec de l’acide phosphorique (paragraphe 20). La 
valeur du pH est ramenée à sa valeur de départ avec de l’hydroxyde de sodium (paragraphe 21) et on laisse reposer le filtrat pendant environ 1 heure, avant d’y prélever un volume approprié de surnageant pour l’inocu ­
lation. Ce processus de barbotage diminue la teneur de l’inoculum en 
carbone inorganique. Par exemple, si on utilise le volume maximal recom ­
mandé d’effluent filtré et barboté (100 ml) par litre comme inoculum, la quantité de carbone inorganique présente dans les flacons témoins à blanc 
est comprise entre 0,4 et 1,3 mg/l (14), ce qui représente 2 à 6,5 % du 
carbone de la substance d’essai à 20 mg C/l et 4 à 13 % à 10 mg C/l.
 
Eaux de surface  
35. Dans une eau de surface adéquate, on prélève un échantillon qui sera 
conservé en aérobiose et utilisé le jour même. Si nécessaire, l’échantillon est concentré par filtration ou centrifugation. Le volume d’inoculum à utiliser dans chaque récipient expérimental doit satisfaire aux critères 
énoncés au paragraphe 26.
 
Sols 
36. Prélever un échantillon dans un sol approprié à une profondeur allant 
jusqu’à 20 cm en dessous de la surface du sol. Il convient d’enlever les pierres, les débris végétaux et les invertébrés de l’échantillon de sol avant de le passer au travers d’un tamis pourvu d’orifices de 2 mm (si l’échantillon 
est trop mouillé pour pouvoir être tamisé immédiatement, on le sèche 
partiellement à l’air). Il faut le garder en aérobiose et l’utiliser le jour même (si l’échantillon est transporté dans un sac noir de polythène fermé de manière non hermétique, il peut être conservé à 2 à 4 °C dans ce sac 
jusqu’à un mois).
 
Préconditionnement de l’inoculum  
37. L’inoculum peut être préconditionné aux conditions expérimentales, mais 
non préadapté à la substance d’essai. Le préconditionnement peut diminuer 
le dégagement de CO  2 dans le témoin à blanc. Le préconditionnement 
consiste à aérer la boue activée, après l’avoir diluée dans le milieu expéri ­
mental à 30 mg/l, avec de l’air humide exempt de CO  2 durant 5 à 7 jours à 
la température de l’essai.  
MODE OPÉRATOIRE  
Nombre de flacons  
38. Le nombre de flacons [paragraphe 15 a)] requis pour un essai dépendra de la 
fréquence des analyses et de la durée de l’essai.  
39. On recommande d’analyser les flacons en trois exemplaires, après un 
nombre suffisant d’intervalles de temps pour pouvoir identifier la fenêtre des dix jours. On analyse également au moins cinq flacons expérimentaux [paragraphe 15 a)] des séries a), b) et c) (voir paragraphe 42) à la fin de 
l’essai, afin de pouvoir calculer les intervalles de confiance à 95 % pour le 
pourcentage moyen de biodégradation.
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Milieu ensemencé  
40. L’inoculum est utilisé à une concentration de 4 mg/l en solides secs de boue 
activée. Juste avant l’utilisation, préparer une quantité suffisante de milieu ensemencé en ajoutant, par exemple, 2 ml de boue activée traitée comme il 
convient (paragraphes 27 à 32) à une concentration de 2 000 mg/l à 1 litre 
de milieu minéral (paragraphe 19). Si l’on utilise un effluent secondaire d’eaux usées, ajouter jusqu’à 100 ml d’effluent (paragraphe 33) à 900 ml de milieu minéral (paragraphe 19) et porter à 1 litre avec du milieu.
 
Préparation des flacons  
41. Verser des aliquotes de milieu ensemencé dans des flacons identiques en 
plusieurs exemplaires, de telle sorte que le rapport espace de tête/liquide soit 
de 1/2 (introduire, par exemple 107 ml dans des flacons de 160 ml de 
capacité). D’autres rapports peuvent être appliqués, mais il faut tenir compte de l’avertissement donné au paragraphe 11. Quel que soit le type d’inoculum utilisé, on veillera à mélanger correctement le milieu ensemencé 
pour qu’il se répartisse uniformément dans les flacons d’essai.
 
42. Préparer des séries de flacons [paragraphe 15 a)] destinés aux usages 
suivants:  
a) flacons d’essai (F  T ) contenant la substance d’essai;  
b) flacons témoins à blanc (F  B ) ne contenant que le milieu expérimental et 
l’inoculum; tous les produits chimiques, solvants, agents ou filtres en fibres de verre utilisés pour introduire la substance d’essai dans les récipients expérimentaux doivent aussi y être ajoutés;
 
c) flacons contenant la substance de référence (F  C ) pour vérifier le procédé;  
d) si nécessaire, flacons (F  I ) pour vérifier un éventuel effet inhibiteur de la 
substance d’essai contenant à la fois la substance d’essai et la substance 
de référence aux mêmes concentrations (paragraphe 24) que dans les flacons F
 T et F  C respectivement;  
e) flacons (F  S ) pour vérifier une éventuelle dégradation abiotique; il s’agit 
des flacons (F  T ) auxquels on a ajouté 50 mg/l de HgCl  2 ou qu’on a 
stérilisés d’une autre manière (à l’autoclave, par exemple).  
43. Les substances d’essai et de référence solubles dans l’eau sont ajoutées aux 
flacons sous la forme de leurs solutions mères aqueuses (paragraphes 22, 23 
et 24), de manière à fournir une concentration de 10 à 20 mg C/l.  
44. Les substances d’essai et de référence insolubles sont ajoutées aux flacons 
de différentes façons [voir paragraphe 22 a) à e)] en fonction de la nature de la substance, avant ou après l’ajout du milieu ensemencé, selon la méthode 
de traitement de la substance. Si l’on utilise l’une des procédures exposées 
au paragraphe 22 a) à e), les flacons témoins à blanc (F
 B ) [paragraphe 42 b)] 
doivent être traités de manière identique, si ce n’est qu’ils ne contiendront ni la substance d’essai ni la substance de référence.
 
45. Les substances d’essai volatiles doivent être introduites dans des flacons 
hermétiquement clos (paragraphe 47) au moyen d’une microseringue. La 
dose est calculée en fonction du volume injecté et de la densité de la substance.
 
46. Si nécessaire, on ajoutera de l’eau aux flacons, afin que le volume de liquide 
soit identique dans tous les flacons. On s’assurera que le rapport espace de tête/liquide (généralement de 1/2) et la concentration de la substance d’essai 
sont tels que l’espace de tête renferme suffisamment d’oxygène pour 
permettre une biodégradation totale.
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47. Tous les flacons sont ensuite fermés hermétiquement, par exemple au moyen 
de bouchons en caoutchouc butylique et de surcapsules en aluminium. Les 
substances d’essai volatiles doivent être ajoutées à ce stade (paragraphe 45). S’il y a lieu de mesurer la baisse de concentration du carbone organique dissous dans la solution expérimentale et d’analyser au temps zéro la 
concentration initiale de carbone inorganique ou d’autres paramètres 
[témoins stériles, paragraphe 42 e)], on prélève un échantillon approprié du flacon d’essai. Le flacon d’essai et son contenu sont ensuite éliminés.
 
48. Les flacons hermétiquement clos sont placés sur un agitateur rotatif [para ­
graphe 15 d)], réglé sur une vitesse d’agitation suffisante pour que le 
contenu du flacon reste bien mélangé et en suspension (par exemple 150 à 200 tpm), et mis à incuber dans l’obscurité à température constante (20 °C ± 1 °C).
 
Prélèvement  
49. Le programme de prélèvement dépendra de la période de latence et de la 
vitesse de biodégradation de la substance d’essai. Des flacons sont retirés 
définitivement du dispositif expérimental afin d’être analysés le jour du 
prélèvement, lequel intervient au moins une fois par semaine ou plus fréquemment (par exemple deux fois par semaine), si une courbe de dégra ­
dation complète est requise. On retire le nombre nécessaire de flacons 
identiques de l’agitateur dans chaque catégorie: F
 T , F B et F  C et, le cas 
échéant F  I et F  S (voir paragraphe 42). L’essai dure normalement 28 jours. 
Si la courbe de biodégradation atteint un plateau avant 28 jours, l’essai peut 
s’arrêter avant 28 jours. Prélever des échantillons dans les cinq flacons 
réservés aux analyses à effectuer le 28  e jour et utiliser les résultats pour 
calculer les limites de confiance ou le coefficient de variation du pourcen ­
tage de biodégradation. Les flacons destinés à vérifier l’inhibition et la 
dégradation abiotique ne doivent pas faire l’objet de prélèvements aussi 
fréquents que les autres flacons; il suffira de deux prélèvements effectués respectivement le 1
 er jour et le 28  e jour. 
Analyse du carbone inorganique  
50. On détermine la production de CO  2 dans les flacons en mesurant l’augmen ­
tation de la concentration de carbone inorganique durant l’incubation. Deux méthodes, décrites ci-après, sont recommandées pour mesurer la quantité de 
carbone inorganique produite durant l’essai. Au cours d’un même essai, il ne 
faudra utiliser qu’une seule méthode, car ces méthodes risquent de donner des résultats légèrement différents.
 
51. On recommande la méthode (a) si le milieu est susceptible de contenir des 
résidus, par exemple de papier filtre en verre et/ou d’une substance d’essai 
insoluble. Cette analyse peut être pratiquée au moyen d’un chromatographe en phase gazeuse, à défaut d’un analyseur de carbone. Il est important de maintenir les flacons à une température assez proche de la température de 
l’essai durant l’analyse du gaz de l’espace de tête. La méthode (b) peut 
s’avérer plus facile à appliquer par les laboratoires qui mesurent le carbone inorganique à l’aide d’un analyseur de carbone. Il importe que la solution d’hydroxyde de sodium (paragraphe 21) utilisée pour convertir le CO
 2 en 
carbonate soit fraîchement préparée ou que sa teneur en carbone inorganique 
soit connue, de telle sorte que ce paramètre puisse être pris en compte lors du calcul des résultats de l’essai [voir paragraphe 66 b)].
 
Méthode (a): acidification à pH < 3  
52. Avant chaque lot d’analyses, l’analyseur de carbone inorganique est 
étalonné au moyen d’un étalon de carbone inorganique approprié (par 
exemple une dilution 1 % poids/poids de CO  2 dans du N  2 ). Injecter de 
l’acide phosphorique concentré (paragraphe 20) à travers le bouchon de chaque flacon destiné à un prélèvement, afin d’abaisser le pH du milieu à une valeur < 3 (ajouter, par exemple, 1 ml à 107 ml de milieu expérimen ­
tal). Remettre les flacons sur l’agitateur. Après avoir subi une agitation 
d’une heure à la température expérimentale, les flacons sont retirés de l’agitateur. On prélève des aliquotes de gaz (1 ml, par exemple) dans l’es ­
pace de tête de chaque flacon et on les injecte dans l’analyseur de carbone 
inorganique. Les concentrations de carbone inorganique mesurées sont 
notées en mg C/l.
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53. Cette méthode repose sur le principe suivant lequel après l’acidification à 
pH < 3 et l’équilibrage à 20 °C, la constante d’équilibre de la répartition du 
CO 2 entre les phases liquide et gazeuse des flacons d’essai est égale à 1,0 
lorsqu’elle est mesurée sous forme de concentration (13). Cette relation doit être démontrée au moins une fois pour le système expérimental, de la façon 
suivante:
 
Préparer des flacons contenant 5 et 10 mg/l de carbone inorganique à l’aide 
d’une solution de carbonate de sodium anhydre (Na  2 CO 3 ) dans de l’eau 
exempte de CO  2 [préparer cette eau en l’acidifiant à pH 6,5 avec de 
l’acide phosphorique concentré (paragraphe 20), en y faisant barboter de 
l’air exempt de CO  2 toute une nuit et en ramenant le pH à une valeur neutre 
avec un produit alcalin]. S’assurer que le rapport volumique espace de tête/liquide est le même que dans les essais (1/2, par exemple). Acidifier 
et équilibrer comme indiqué au paragraphe 52 et mesurer les concentrations 
de carbone inorganique dans l’espace de tête et dans la phase liquide. Vérifier que les deux concentrations sont identiques, à l’erreur expérimentale près. Si elles ne le sont pas, l’expérimentateur devra réexaminer les procé ­
dures. Il n’est pas nécessaire de vérifier la répartition du carbone inorga ­
nique entre les phases liquide et gazeuse à chaque essai; cette vérification pourrait être effectuée au cours de l’étalonnage
 
54. S’il y a lieu de mesurer la disparition de carbone organique dissous (subs ­
tances d’essai hydrosolubles uniquement), des échantillons sont prélevés 
dans la phase liquide de flacons séparés (non acidifiés), filtrés sur une membrane et injectés dans l’analyseur de carbone organique dissous. Ces flacons peuvent servir à d’autres analyses, si nécessaire, permettant de 
mesurer la biodégradation primaire.
 
Méthode (b): conversion du CO  2 en carbonate  
55. Avant chaque lot d’analyses, l’analyseur de carbone inorganique est 
étalonné au moyen d’un étalon adéquat, par exemple une solution de bicar ­
bonate de sodium (NaHCO  3 ) dans de l’eau exempte de CO  2 (voir para ­
graphe 53), à une concentration de 0 à 20 mg de carbone inorganique/litre. 
Injecter une solution d’hydroxyde de sodium (7M, paragraphe 21) (par 
exemple à raison d’1 ml pour 107 ml de milieu) à travers le bouchon de chaque flacon destiné à un prélèvement et agiter les flacons durant une heure à la température de l’essai. On utilise la même solution de NaOH 
dans tous les flacons retirés définitivement un jour donné, mais pas néces ­
sairement pour tous les prélèvements effectués tout au long de l’essai. Si les valeurs absolues de la teneur en carbone inorganique des témoins à blanc sont requises à chaque prélèvement, il faudra déterminer la teneur en 
carbone inorganique de la solution de NaOH chaque fois qu’elle est utilisée. 
Enlever les flacons de l’agitateur et laisser reposer. Extraire un volume approprié (50 à 1 000 μl, par exemple) de la phase liquide de chaque 
flacon à l’aide d’une seringue. Injecter les échantillons dans l’analyseur 
de carbone inorganique et enregistrer les concentrations de carbone inorga ­
nique. On s’assurera que l’analyseur employé se prête au traitement des échantillons alcalins obtenus par cette méthode.
 
56. Cette méthode repose sur le principe selon lequel après l’ajout d’une solu ­
tion alcaline et agitation, la concentration de carbone inorganique dans l’es ­
pace de tête est négligeable. Cela doit être vérifié au moins une fois pour le système expérimental. Il faut, pour ce faire, utiliser des étalons de carbone inorganique, ajouter une solution basique et équilibrer, et mesurer la concen ­
tration de carbone inorganique dans l’espace de tête et dans la phase liquide 
(voir paragraphe 53). La concentration dans l’espace de tête devrait avoi ­
siner zéro. Il n’est pas nécessaire de vérifier cette absorption pratiquement complète de CO
 2 à chaque essai.  
57. Si la disparition de carbone organique dissous (substances d’essai hydroso ­
lubles uniquement) est à mesurer, des échantillons sont prélevés dans la phase liquide de flacons séparés (ne contenant pas de produit alcalin ajouté), filtrés sur une membrane et injectés dans l’analyseur de carbone organique 
dissous. Ces flacons peuvent servir à d’autres analyses, si nécessaire, pour 
mesurer la biodégradation primaire.
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RÉSULTATS ET RAPPORT  
Calcul des résultats  
58. En supposant que la substance d’essai a été minéralisée à 100 % en CO  2 , la 
production maximale théorique de carbone inorganique (ThCI) des flacons d’essai excédant celle des témoins à blanc est égale au carbone organique total (COT) ajouté dans chaque flacon d’essai au début de l’essai, autrement 
dit:
 
ThCI ¼ COT  
La masse totale (mg) de carbone inorganique (CIT) dans chaque flacon est: 
CIT ¼ ðmg de C dans le liquide  þ mg de C dans l’espace de tête Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Équation [1]  
où: 
V L = volume de liquide dans le flacon (litre);  
C L = concentration de carbone inorganique dans le liquide (carbone en 
mg/l);  
V H = volume de l’espace de tête (litre);  
C H = concentration de carbone inorganique dans l’espace de tête (carbone 
en mg/l).  
Les calculs du CIT pour les deux méthodes analytiques utilisées pour 
mesurer le carbone inorganique dans cet essai sont décrits ci-dessous aux paragraphes 60 et 61. Le pourcentage de biodégradation (% D) dans chaque 
cas est donné par l’équation suivante: 
%D ¼
 ðCIT  t Ä CIT  b Þ 
COT Ü 100 Équation [2]  
où: 
CIT  t = mg de CIT dans le flacon d’essai au temps t;  
CIT  b = la moyenne des mg de CIT dans les flacons témoins à blanc au 
temps t;  
COT = mg de COT ajoutés initialement au flacon d’essai.  
Le pourcentage de biodégradation (% D) est calculé pour les flacons d’essai 
(F T ) et de référence (F  C ) et, le cas échéant, les flacons (F  I ) destinés à la 
vérification d’un éventuel effet inhibiteur, à partir des quantités respectives 
de carbone inorganique total produites jusqu’à chaque temps de prélève ­
ment.  
59. Une augmentation significative de la teneur en CIT dans les témoins stériles 
(F S ) durant l’essai permet de conclure à une dégradation abiotique de la 
substance d’essai et il faut en tenir compte dans le calcul de D dans l’équa ­
tion [2].  
Acidification à pH < 3  
60. L’acidification à pH < 3 et l’équilibrage entraînant l’égalisation de la 
concentration de CIT entre les phases liquide et gazeuse, seule la concen ­
tration de carbone inorganique dans la phase gazeuse doit être mesurée. 
Aussi, d’après l’équation [1],  CIT ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , où V  B 
= est le volume du flacon de sérum.  
Conversion du CO  2 en carbonate  
61. Dans cette méthode, les calculs sont effectués conformément à l’équation 
[1], mais la quantité négligeable de carbone inorganique dans la phase 
gazeuse est ignorée, de sorte que  V H Ü C H ¼ 0, et  CIT ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1288
 
Expression des résultats  
62. On trace une courbe de biodégradation en reportant le pourcentage de 
biodégradation, D, en fonction du temps d’incubation, courbe qui indiquera, si possible, la phase de latence, la phase de biodégradation, la fenêtre des 
dix jours et la phase plateau, c’est-à-dire la phase durant laquelle la dégra ­
dation a atteint son maximum et où la courbe de biodégradation marque un palier. Si des résultats comparables sont obtenus pour les flacons d’essai (F
 T ) testés en parallèle (< 20 % de différence), on trace une courbe moyenne 
(voir appendice 2, figure 1); dans le cas contraire, on trace une courbe pour 
chaque flacon d’essai. On détermine la valeur moyenne du pourcentage de biodégradation dans la phase plateau ou on évalue sa valeur maximale (par 
exemple si la courbe fléchit dans la phase plateau), mais il est important 
d’estimer si, dans ce dernier cas, la valeur n’est pas nettement divergente. Ce niveau maximal de biodégradation doit être mentionné en tant que «degré de biodégradation de la substance d’essai» dans le rapport d’essai. 
Si le nombre de flacons d’essai s’est avéré insuffisant pour préciser une 
phase plateau, on utilise les données mesurées du dernier jour de l’essai pour calculer une valeur moyenne. Cette dernière valeur, la moyenne de cinq essais identiques, sert à indiquer la précision avec laquelle le pourcen ­
tage de biodégradation a été déterminé. La valeur obtenue au terme de la 
fenêtre des dix jours doit également figurer dans le rapport.
 
63. Tracer, de la même manière, une courbe pour la substance de référence, F  C , 
et, le cas échéant, pour la vérification de la dégradation abiotique F  S et pour 
le contrôle de l’inhibition, F  I . 
64. Les quantités de CIT présentes dans les témoins à blanc (F  B ) sont consi ­
gnées, de même que celles présentes dans les flacons F  S , si ces flacons sont 
inclus dans le système expérimental.  
65. Calculer D pour les flacons F  I , d’après le rendement théorique escompté en 
carbone inorganique provenant uniquement de la substance de référence du 
mélange. Si, au 28  e jour, ([D  FC ( ( 1 )) – DF  I ( ( 2 ))]/D  FC ) × 100 > 25 %, il est 
permis de supposer que la substance d’essai a inhibé l’activité de l’inocu ­
lum, ce qui peut expliquer les faibles valeurs de D  FT obtenues dans les 
conditions de l’essai. Dans ce cas, l’essai pourrait être répété avec une 
concentration d’essai plus faible, et en réduisant de préférence le carbone inorganique dissous (CID) dans l’inoculum et le CIT formé dans les témoins à blanc, car une diminution de la concentration de la substance d’essai 
amoindrit la précision de la méthode. Un autre inoculum peut également 
être utilisé. Si la quantité de CIT dans le flacon F
 S (dégradation abiotique) 
montre une augmentation significative (> 10 %), il se peut qu’une dégrada ­
tion abiotique ait eu lieu.  
Validité des résultats  
66. Un essai est considéré comme valable si:  
a) le pourcentage moyen de dégradation dans les flacons F  C contenant la 
substance de référence est > 60 % au 14  e jour de l’incubation; et  
b) la quantité moyenne de CIT présente dans les témoins à blancs F  B à la 
fin de l’essai est > 3 mg C/l.  
Si ces limites ne sont pas atteintes, on répétera l’essai avec un inoculum 
provenant d’une autre source et/ou on révisera les procédures appliquées. 
Par exemple, si une production élevée de carbone inorganique dans le 
témoin à blanc pose un problème, il convient de suivre la procédure exposée aux paragraphes 27 à 32.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1289  
( 1 ) Le pourcentage de dégradation dans les flacons F  C contenant la substance de référence. 
( 2 ) Le pourcentage de dégradation dans les flacons F  I .
 67. Si la substance d’essai ne fournit pas 60 % de la production maximale 
théorique de carbone inorganique (ThCI) et qu’il a été démontré qu’elle 
n’exerce aucun effet inhibiteur (paragraphe 65), l’essai peut être répété avec une concentration accrue d’inoculum (jusqu’à 30 mg/l de boue activée et 100 ml d’effluent/l) ou avec un inoculum provenant d’autres 
sources, en particulier si la dégradation a atteint une valeur comprise 
entre 20 et 60 %.
 
Interprétation des résultats  
68. Si une substance d’essai atteint une biodégradation > 60 % de la ThCI dans 
la fenêtre des dix jours au cours de cet essai, cela démontre qu’elle est 
facilement biodégradable en aérobiose.  
69. Si la valeur de seuil de 60 % de la ThCI n’a pas été atteinte, on mesure le 
pH du milieu des flacons qui n’ont pas été acidifiés ou alcalinisés; une 
valeur inférieure à 6,5 pourrait indiquer qu’une nitrification a eu lieu. Dans ce cas, on répète l’essai avec une solution tampon plus concentrée.
 
Rapport d’essai  
70. Dresser un tableau du pourcentage de dégradation (% D) relevé dans chaque 
flacon d’essai (F  T ), de référence (F  C ) et, le cas échéant, de vérification de 
l’inhibition (F  I ) pour chaque jour de prélèvement. Si les flacons identiques 
livrent des résultats comparables, tracer une courbe du % D moyen en 
fonction du temps. Noter la quantité de carbone inorganique total dans les 
témoins à blanc (F  B ) et dans les témoins stériles (F  S ), de même que le 
carbone organique dissous et/ou d’autres paramètres, ainsi que leur pour ­
centage de disparition.  
71. Déterminer la valeur moyenne du % D dans la phase plateau ou utiliser la 
valeur maximale si la courbe de biodégradation fléchit dans la phase plateau 
et rapporter cette valeur en tant que «degré de biodégradation de la subs ­
tance d’essai». Il importe de vérifier que dans ce dernier cas, la valeur la plus élevée n’est pas nettement divergente.
 
72. Le rapport d’essai doit mentionner les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— nom courant, nom chimique, numéro CAS, formule structurale et 
propriétés physico-chimiques pertinentes,  
— pureté (impuretés) de la substance d’essai.  
Conditions expérimentales:  
— référence à la présente méthode d’essai,  
— description du système expérimental utilisé (par exemple, volume du 
flacon, rapport espace de tête/liquide, méthode d’agitation, etc.),  
— ajout de la substance d’essai et de la substance de référence dans le 
système expérimental: concentration appliquée et quantité de carbone mesurée dans chaque flacon d’essai, et, le cas échéant, solvants utilisés,
 
— détails sur l’inoculum utilisé, traitement préalable et préconditionnement 
éventuels,  
— température d’incubation,  
— validation du principe de l’analyse du carbone inorganique,  
— principales caractéristiques de l’analyseur de carbone inorganique 
employé (et de toute autre méthode d’analyse utilisée),  
— nombre de répétitions.  
Résultats:  
— données brutes et valeurs calculées de la biodégradabilité présentées 
dans un tableau,  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1290
 
— graphique du pourcentage de dégradation en fonction du temps pour les 
substances d’essai et de référence, phase de latence, phase de dégrada ­
tion, fenêtre des dix jours et pente,  
— pourcentage de disparition au niveau du plateau, à la fin de cet essai et 
après la fenêtre des dix jours,  
— justification en cas de rejet des résultats expérimentaux,  
— tout autre fait se rapportant à la procédure utilisée,  
— analyse des résultats.  
BIBLIOGRAPHIE:  
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«facile» - Essai de dégagement de CO  2 (Méthode C.4-C).  
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biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1291
 
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Chemosphere 38: 3219-3235.  
(20) Chapitre C.4 de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité 
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(21) OCDE (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. 
Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.  
(22) Chapitre C.11 de la présente annexe, Boues activées: essai d’inhibition de la 
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Biodegradation 6: 319-327.  
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
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et le traitement des composés organiques peu solubles dans l’eau en vue de 
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Appendice 1  
ABRÉVIATIONS ET DÉFINITIONS  
CI: carbone inorganique.  
ThCO  2 : production théorique de CO  2 (mg); correspond à la quantité de dioxyde 
de carbone calculée à partir de la teneur en carbone connue ou mesurée de la substance d’essai, qui doit se dégager lors de la minéralisation complète de 
celle-ci; également exprimée en mg de dioxyde de carbone dégagé par mg de 
substance d’essai.
 
COD:  le carbone organique dissous est le carbone organique présent en solution 
ou qui traverse un filtre à pores de 0,45 micron ou encore qui reste dans le surnageant après une centrifugation de 15 minutes à environ 4 000 g (40 000 m 
sec
 -2 ). 
CID:  carbone inorganique dissous.  
ThCI:  production théorique de carbone inorganique.  
CIT:  carbone inorganique total.  
Facilement biodégradable:  classification arbitraire des produits chimiques qui 
ont répondu positivement à certains essais de dépistage spécifiques portant sur la 
biodégradabilité ultime; du fait de la rigueur de ces essais, on admet que de tels 
composés se dégraderont rapidement et complètement en milieu aquatique dans des conditions aérobies.
 
Fenêtre des dix jours:  les dix jours qui suivent immédiatement le moment où le 
taux de biodégradation atteint 10 %.  
Biodégradabilité intrinsèque:  classification des produits chimiques pour 
lesquels une biodégradation (primaire ou finale) se manifeste sans ambiguïté 
au cours d’un quelconque essai de biodégradabilité.  
Biodégradation ultime en aérobiose:  niveau de dégradation atteint lorsque la 
totalité de la substance d’essai a été utilisée par des micro-organismes pour 
produire du dioxyde de carbone, de l’eau, des sels minéraux et de nouveaux 
constituants cellulaires microbiologiques (biomasse).  
Minéralisation:  dégradation complète d’un composé organique en CO  2 et en 
H 2 O dans des conditions aérobies, et en CH  4 , CO  2 et H  2 O dans des conditions 
anaérobies.  
Phase de latence:  correspond à la période qui commence au début de l’essai et 
s’achève au moment où les micro-organismes dégradants se sont acclimatés et/ou adaptés et où le degré de biodégradation d’une substance chimique ou d’une matière organique a atteint un niveau détectable (par exemple 10 % de la biodé ­
gradation maximale théorique, ou moins, suivant la précision de la technique de 
mesure).
 
Phase de dégradation:  correspond à la période qui commence à la fin de la 
phase de latence et se termine au moment où on atteint 90 % du taux maximal de dégradation.
 
Phase plateau:  phase au cours de laquelle la dégradation atteint sa valeur maxi ­
male et où la courbe de biodégradation marque un palier.  
Substance d’essai:  toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé 
suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1293
 
Appendice 2  
Exemple de courbe de biodégradation  
Figure 1  
Biodégradation du 1-octanol au cours de l’essai de l’espace de tête 
(dégagement de CO  2 )
 
Glossaire  
biodégradation.  
phase de dégradation.  
niveau maximal de biodégradation.  
phase plateau.  
fenêtre de dix jours.  
durée de l’essai (jours).  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1294
 
C. 30.  BIOACCUMULATION CHEZ LES OLIGOCHÈTES TERRES ­
TRES  
INTRODUCTION  
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 317 (2010) 
de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Parmi les méthodes 
d’essai relatives au devenir environnemental, celles intitulées «Bioconcen ­
tration: essai avec renouvellement continu sur les poissons» [chapitre C.13 de la présente annexe (49)] et «Bioaccumulation chez les oligochètes 
benthiques fouisseurs» (53) ont été publiées, respectivement, en 1996 et 
en 2008. Il est difficile voire impossible d’extrapoler aux organismes terres ­
tres comme les vers de terre les données sur la bioaccumulation en milieu aquatique. Des calculs de modèles fondés sur la lipophilie d’une substance 
d’essai, voir par exemple (14) ou (37), sont actuellement utilisés pour 
évaluer la bioaccumulation des substances chimiques dans le sol, notamment dans le document d’orientation technique de l’Union européenne (19). La nécessité d’appliquer une méthode d’essai comportant des compartiments 
spécifiques a déjà été exposée (55). Une telle méthode est particulièrement 
importante pour évaluer l’empoisonnement secondaire dans les chaînes alimentaires terrestres (4). Plusieurs méthodes d’essai nationales portent sur la bioaccumulation chez les organismes autres que les poissons, par 
exemple (2) et (72). Une méthode d’évaluation de la bioaccumulation 
chez les vers de terre ( Eisenia fetida , Savigny) et les enchytrées dans des 
sols contaminés a été élaborée par l’American Society for Testing and Materials (ASTM) (3). Une méthode internationalement reconnue visant à 
déterminer la bioaccumulation dans un sol chargé permettra de mieux 
évaluer les risques des produits chimiques pour les écosystèmes terrestres, notamment (25) et (29).
 
2. Les invertébrés géophages sont exposés aux substances chimiques présentes 
dans le sol. Au nombre de ces animaux, les oligochètes terrestres jouent un 
rôle important dans la structure et la fonction des sols (15) (20). Les oligo ­
chètes terrestres vivent dans le sol et, partiellement, à sa surface (notamment sur la litière); ils représentent fréquemment l’espèce la plus abondante en termes de biomasse (54). Leur rôle dans la bioturbation du sol et leur 
fonction de proies confèrent à ces animaux une influence considérable sur 
la biodisponibilité des substances chimiques pour d’autres organismes comme les prédateurs invertébrés [dont les acariens et les coléoptères; voir notamment (64)] ou vertébrés [dont les renards et les mouettes (18) 
(62)]. Certaines espèces d’oligochètes terrestres actuellement utilisées dans 
les essais écotoxicologiques sont décrites à l’appendice 5.
 
3. Le guide de l’ASTM sur les essais en laboratoire consacrés à la toxicité du 
sol ou à la bioaccumulation chez les vers de terre  Eisenia fetida  et les 
enchytrées  Enchytraeus albidus  (3) fournit nombre d’informations essen ­
tielles qui ont servi à mettre en œuvre la méthode d’essai exposée ici sur 
la bioaccumulation dans le sol. Parmi les autres références citées dans la présente méthode d’essai figurent le chapitre C.13 de la présente annexe, intitulé «Bioconcentration: essai avec renouvellement continu sur les pois ­
sons» (49) et la ligne directrice 315 de l’OCDE intitulée «Bioaccumulation 
chez les oligochètes benthiques fouisseurs» (53). Des expériences pratiques tirées d’études et de diverses publications sur la bioaccumulation dans le sol, dont (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79), ont 
également largement inspiré la présente méthode d’essai.
 
4. Cette méthode d’essai s’applique essentiellement aux substances chimiques 
organiques neutres, stables, qui ont tendance à être adsorbées dans le sol. 
Elle permet également d’évaluer la bioaccumulation de composés organo ­
métalliques stables, associés au sol. Cette méthode s’applique aussi aux métaux et autres éléments présents à l’état de traces.
 
PRÉREQUIS  
5. Les essais visant à mesurer la bioaccumulation d’une substance dans les 
oligochètes terrestres ont été réalisés avec des métaux lourds [voir notam ­
ment (63)] et des substances organiques persistantes dont le log K  ow (K oe ) 
se situe entre 3,0 et 6,0 (40). Ces essais s’appliquent également aux:  
— substances dont le log K  ow est supérieur à 6,0 (substances 
super-hydrophobes),  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1295
 
— substances appartenant à la classe des substances organiques connues 
pour leur potentiel de bioaccumulation dans les organismes vivants, par 
exemple les substances fortement adsorbantes ou tensio-actives,  
— substances qui présentent un potentiel de bioaccumulation de par leurs 
caractéristiques structurelles (analogues des substances dont le potentiel de bioaccumulation est connu),
 
— métaux.  
6. Avant de débuter toute étude, il convient de disposer de certaines informa ­
tions sur la substance d’essai, comme le nom courant, le nom chimique (de préférence le nom IUPAC), la formule structurale, le numéro CAS, la pureté, les mesures de sécurité, les conditions de stockage appropriées et 
les méthodes d’analyse. Il faut aussi connaître les propriétés suivantes de la 
substance:
 
a) solubilité dans l’eau;  
b) coefficient de partage octanol-eau, K  ow ; 
c) coefficient de partage sol-eau, exprimé par K  oc ; 
d) pression de vapeur;  
e) dégradabilité (dans le sol ou l’eau notamment);  
f) métabolites connus.  
7. Il est possible d’utiliser des substances d’essai radiomarquées ou non. 
Cependant, l’utilisation de substances radiomarquées est recommandée car elle facilite l’analyse. La décision d’y recourir dépendra des limites de détection ou de la nécessité de mesurer le composé parent et les métabolites. 
Dans le cas où une substance radiomarquée est utilisée et où le total des 
résidus radioactifs est mesuré, il est important que les résidus radiomarqués tant dans le sol que dans les organismes d’essai soient définis en pourcen ­
tages de la substance d’essai parente et de la substance marquée 
non-parente, par exemple dans des échantillons prélevés à un état station ­
naire ou à la fin de la phase d’absorption, pour permettre de calculer le facteur de bioaccumulation (FBA) pour la substance d’essai parente et les 
métabolites du sol pertinents (voir paragraphe 50). Il peut s’avérer nécessaire 
de modifier la méthode décrite ici, en particulier en vue de disposer d’une biomasse suffisante pour mesurer les substances d’essai organiques non-radiomarquées ou les métaux. Lorsque le total des résidus radioactifs 
est mesuré (par comptage en scintillation liquide après extraction, combus ­
tion ou solubilisation des tissus), le facteur de bioaccumulation est basé sur la susbtance d’essai parente et sur les métabolites. Il est préférable que le FBA soit calculé sur la base de la concentration de la substance d’essai 
parente dans les organismes et du total des résidus radioactifs. Ensuite, le 
facteur d’accumulation biota-sol (BSAF) ( biota-soil accumulation factor ), 
normalisé par rapport à la teneur en lipides des vers et à la teneur en carbone organique (CO) du sol, est calculé à partir du FBA pour garantir 
la comparabilité des résultats de différents essais de bioaccumulation.
 
8. Il convient que la toxicité de la substance d’essai envers les espèces utilisées 
dans l’essai soit connue, notamment la concentration d’effet (CE  x ) ou la 
concentration létale (CL  x ) pour la durée de la phase d’absorption [(19) par 
exemple]. La concentration de la substance d’essai représente de préférence 
environ 1 % de sa CL  50 aiguë asymptotique, et elle est au moins dix fois 
supérieure à sa limite de détection dans le sol par la méthode d’analyse utilisée. La préférence est donnée, lorsqu’elles sont disponibles, aux valeurs de toxicité issues d’études à long terme sur les effets sublétaux observés 
(51) et (52). Si ces données ne sont pas disponibles, un essai de toxicité 
aiguë apportera des informations utiles [voir notamment (23)].
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1296
 
9. Il est nécessaire de disposer d’une méthode d’analyse appropriée, dont on 
connaît l’exactitude, la précision et la sensibilité pour quantifier la substance 
dans les solutions d’essai, dans le sol et dans le matériel biologique; il est aussi nécessaire de disposer des détails de la préparation et du stockage des échantillons, et des fiches de données de sécurité des substances. Il convient 
également de connaître les limites de détection analytiques de la substance 
d’essai dans le sol et les tissus du ver. Si une substance d’essai marquée au
 
14 C est utilisée, il est nécessaire de connaître aussi la radioactivité spécifique 
(c’est-à- dire en Bq.mol-1) et le pourcentage de radioactivité associé aux 
impuretés. La radioactivité spécifique de la substance d’essai sera suffisam ­
ment élevée pour faciliter l’analyse et les concentrations d’essai utilisées ne provoqueront pas d’effets toxiques.
 
10. L’essai peut être réalisé sur sol naturel ou artificiel. Avant le début de 
l’essai, il convient de connaître les caractéristiques du sol naturel utilisé, 
par exemple son origine ou ses constituants, son pH, sa teneur en carbone 
organique, sa distribution granulométrique (pourcentages de sable, de limon et d’argile), et sa capacité de rétention d’eau (CRE) (3) (48).
 
PRINCIPE DE L’ESSAI  
11. Les paramètres qui caractérisent la bioaccumulation d’une substance d’essai 
se composent du facteur de bioaccumulation (FBA), de la constante de vitesse d’absorption (k
 s ) et de la constante de vitesse d’élimination (k  e ). 
L’appendice 1 donne des définitions détaillées de ces paramètres.  
12. L’essai consiste en deux phases, la phase d’absorption (exposition) et la 
phase d’élimination (postexposition). Durant la phase d’absorption, des 
groupes répliqués de vers sont exposés au sol chargé avec la substance d’essai. En plus des animaux d’essai, des groupes témoins de vers sont conservés dans des conditions identiques, sans la substance d’essai. Le 
poids sec et la teneur en lipides des organismes d’essai sont mesurés. 
Pour ce faire, on peut utiliser des vers du groupe témoin. Les valeurs de fond analytiques (essai à blanc) peuvent être obtenues en analysant des échantillons des vers et du sol témoins. Pour la phase d’élimination, les 
vers sont transférés dans un sol dépourvu de la substance d’essai. Une 
phase d’élimination est toujours nécessaire sauf si l’absorption de la subs ­
tance d’essai au cours de la phase d’exposition s’avère être non significative. Elle permet de recueillir des informations sur la vitesse à laquelle la subs ­
tance d’essai est excrétée par l’organisme d’essai (27). Si un état stationnaire 
n’a pas été atteint durant la phase d’absorption, il est préférable de déter ­
miner les paramètres cinétiques – constantes de vitesse d’absorption et d’élimination, facteur de bioaccumulation cinétique FBAk – en s’appuyant 
sur l’ajustement simultané des résultats des phases d’absorption et d’élimi ­
nation. La concentration de la substance d’essai dans ou sur les vers est contrôlée pendant toute la durée des deux phases de l’essai.
 
13. Durant la phase d’absorption, des mesures sont effectuées pendant des temps 
de prélèvement pouvant durer jusqu’à 14 jours (enchytrées) ou 21 jours 
(vers de terre) jusqu’à ce que l’état stationnaire soit atteint (11) (12) (67). 
On identifie un état stationnaire lorsque le tracé de la concentration dans les vers en fonction du temps est parallèle à l’axe du temps, et lorsque trois analyses successives de la concentration réalisées sur des échantillons 
prélevés à des intervalles d’au moins deux jours ne diffèrent pas de plus 
de ± 20 % l’une par rapport à l’autre sur la base de comparaisons statis ­
tiques (par exemple, analyse de la variance, analyse de la régression).
 
14. La phase d’élimination consiste à transférer les organismes d’essai dans des 
récipients qui contiennent un substrat identique, mais sans la substance 
d’essai. Durant la phase d’élimination, les mesures sont réalisées pendant 
des durées pouvant aller jusqu’à 14 jours (enchytrées) ou 21 jours (vers de terre), à moins qu’une détermination analytique antérieure n’ait mis en évidence une diminution de 90 % des résidus de substance d’essai dans 
les vers. La concentration de la substance d’essai dans les vers à la fin de 
la phase d’élimination est consignée comme résidus non éliminés. Le facteur
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de bioaccumulation à l’état stationnaire ( steady state ) (FBAss) est calculé de 
préférence à la fois comme le rapport de la concentration dans les vers (C  a ) 
à celle dans le sol (C  s ) à un état stationnaire apparent, et comme un facteur 
de bioaccumulation cinétique (FBAK), c’est-à-dire comme le rapport de la constante de vitesse d’absorption à partir du sol (k
 s ) à la constante de vitesse 
d’élimination (k  e ) (voir l’appendice 1 pour les définitions) en supposant une 
cinétique du premier ordre (voir l’appendice 2 pour les calculs). Si la ciné ­
tique du premier ordre n’est manifestement pas applicable, il convient d’em ­
ployer d’autres modèles.  
15. La constante de vitesse d’absorption, la constante de vitesse d’élimination 
(ou les constantes, si d’autres modèles ont été utilisés), le facteur de bioac ­
cumulation cinétique (FBAK), et lorsque cela est possible, les limites de 
confiance de chacun de ces paramètres, sont calculés à partir d’équations de modèles à l’aide de programmes informatiques (voir l’appendice 2). La qualité de l’ajustement d’un modèle peut être déterminée à partir du coef ­
ficient de corrélation ou du coefficient de détermination (des coefficients 
proches de 1 indiquent une bonne qualité d’ajustement) ou de la loi du chi-deux. De plus la grandeur de l’écart-type ou de l’intervalle de confiance autour des paramètres estimés peut donner une bonne indication de la 
qualité de l’ajustement du modèle.
 
16. Pour réduire la variabilité des résultats pour les substances de lipophilie 
élevée, les facteurs de bioaccumulation sont exprimés par rapport à la 
teneur en lipides et à la teneur en carbone organique [teneur en kg de 
carbone organique (CO) du sol par teneur en kg de lipides des vers]. Cette approche s’appuie sur le fait que, pour certaines classes chimiques, 
il existe une relation claire entre le potentiel de bioaccumulation et la lipo ­
philie; cette relation a été clairement établie pour le poisson (47). Il existe une relation entre la teneur en lipides du poisson et la bioaccumulation de ces substances. Pour les organismes benthiques, des corrélations similaires 
ont été trouvées [voir notamment (30) (44)]. Cette corrélation a également 
été démontrée pour les oligochètes terrestres (5) (6) (7) (14). Si on dispose de suffisamment de tissu de vers, il est possible de déterminer la teneur en lipides des animaux d’essai sur le même matériel biologique que celui utilisé 
pour déterminer la concentration de la substance d’essai. Il est également 
possible de mesurer la teneur en lipides en utilisant des animaux témoins.
 
VALIDITÉ DE L’ESSAI  
17. Pour qu’un essai soit valable, les critères suivants seront remplis tant concer ­
nant les animaux témoins que les animaux traités:  
— à l’issue de l’essai, la mortalité totale au cours des phases d’absorption 
et d’élimination ne dépasse pas 10 % (vers de terre) ou 20 % (enchy ­
trées) du nombre total de vers introduits,  
— avec  Eisenia fetida  et Eisenia andrei , la perte de poids moyenne 
mesurée à la fin des phases d’absorption et d’élimination ne dépasse 
pas 20 % du poids frais initial au début de chaque phase.  
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE  
Espèces d’essai  
18. Différentes espèces d’oligochètes terrestres sont recommandées pour les 
essais sur la bioaccumulation. Les espèces les plus couramment employées,  
Eisenia fetida  ou Eisenia andrei  (vers de terre) ou encore  Enchytraeus 
albidus , Enchytraeus crypticus  ou Enchytraeus luxuriosus  (enchytrées), 
sont décrites à l’appendice 5.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1298
 
Appareillage  
19. Il convient d’éviter avec soin d’utiliser pour l’appareillage des matériaux 
susceptibles de dissoudre ou d’adsorber la substance d’essai ou de laisser s’échapper des substances ayant un effet délétère sur les animaux d’essai. Il 
est possible d’utiliser des récipients rectangulaires ou cylindriques standard, 
faits dans un matériau chimiquement inerte et d’une capacité adaptée, conforme au taux de charge, c’est-à- dire au nombre de vers d’essai. De l’acier inoxydable, du plastique ou du verre peut être utilisé pour tout 
équipement entrant en contact avec le milieu d’essai. Les récipients 
d’essai devront être fermés de manière appropriée, pour éviter que les vers ne s’échappent, tout en assurant un apport d’air suffisant. Du verre 
silanisé peut s’avérer nécessaire pour des substances de coefficient d’adsorp ­
tion élevé comme les pyréthroïdes synthétiques. Dans ces cas de figure, l’équipement devra être jeté après usage (49). Il conviendra d’éviter l’éva ­
poration des substances radiomarquées et des substances chimiques vola ­
tiles. On utilisera des pièges (par exemple des flacons de lavage des gaz) 
contenant un absorbant permettant de capter d’éventuels résidus susceptibles de s’évaporer des récipients d’essai.
 
Sol 
20. Il convient que le sol d’essai soit être d’une qualité permettant la survie et 
de préférence la reproduction des organismes d’essai durant les périodes 
d’acclimatation et d’essai, sans qu’ils ne présentent un aspect ou un compor ­
tement anormal. Les vers devront pouvoir s’enfouir dans le sol.  
21. Il est recommandé d’utiliser comme substrat lors des essais le sol artificiel 
décrit au chapitre C.8 de la présente annexe (48). La préparation du sol 
artificiel en vue d’essais sur la bioaccumulation est décrite à l’appendice 4, où figurent également des recommandations relatives au stockage de ce sol artificiel. Tout sol artificiel séché à l’air peut être stocké à température 
ambiante jusqu’à son utilisation.
 
22. Toutefois, il est possible d’utiliser des sols naturels provenant de sites non 
pollués comme sol d’essai et/ou d’élevage. Les sols naturels sont caracté ­
risés au moins par leur origine (site de prélèvement), leur pH, leur teneur en 
carbone organique, leur distribution granulométrique (pourcentage de sable, de limon et d’argile), leur capacité maximale de rétention d’eau (CREmax), et leur teneur en eau (3). La recherche de micropolluants dans le sol ou dans 
ses constituants, préalablement à son utilisation, devrait fournir des infor ­
mations utiles. En cas d’utilisation d’un sol naturel prélevé sur des terres agricoles, il convient que ce dernier n’ait pas été traité avec des produits phytopharmaceutiques ou n’ait pas fait l’objet d’un épandage de fumier 
d’animaux traités pendant au moins un an avant l’échantillonnage, ou 
d’un épandage d’engrais organiques pendant au moins six mois avant l’échantillonnage (50). Les procédures de manipulation des sols naturels 
avant utilisation dans le cadre d’essais écotoxicologiques sur des oligochètes 
en laboratoire sont décrites dans le document de l’ASTM (3). La durée de stockage des sols naturels au laboratoire est aussi courte que possible.
 
Application de la substance d’essai  
23. La substance d’essai est incorporée dans le sol. Il convient de prendre en 
compte les propriétés physico-chimiques de cette substance. Une substance 
d’essai soluble dans l’eau est entièrement dissoute dans l’eau avant d’être 
mélangée au sol. La procédure de chargement recommandée pour les subs ­
tances d’essai peu solubles dans l’eau consiste à enrober un ou plusieurs des constituants du sol (artificiel) avec la substance d’essai. Par exemple, le 
sable de quartz, ou une portion de celui-ci, peut être trempé dans une 
solution de la substance d’essai dans un solvant organique adapté, lequel
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est ensuite lentement évaporé jusqu’à dessiccation. La fraction enrobée peut 
ensuite être mélangée avec le sol mouillé. Cette procédure a pour principal 
avantage de n’introduire aucun solvant dans le sol. En cas d’utilisation d’un sol naturel, la substance d’essai peut être ajoutée soit par chargement d’une portion du sol séchée à l’air comme décrit précédemment pour le sol arti ­
ficiel, soit par mélange avec le sol mouillé, puis évaporation si un agent de 
solubilisation est utilisé. En règle générale, il conviendra d’éviter autant que possible tout contact du sol mouillé avec les solvants. Les éléments suivants sont à prendre en considération (3):
 
— si un solvant autre que l’eau est utilisé, il convient qu’il soit miscible à 
l’eau et/ou puisse être éliminé (par évaporation notamment) pour ne 
laisser que la substance chimique d’essai sur le sol,  
— si un témoin solvant est utilisé, aucun témoin négatif n’est nécessaire. Le 
témoin solvant présentera la plus forte concentration de solvant ajouté au 
sol et le solvant en question sera issu du même lot que celui utilisé pour la solution mère. La toxicité et la volatilité du solvant ainsi que la solubilité de la substance d’essai dans le solvant sélectionné constituent 
les principaux critères de choix pour l’agent de solubilisation.
 
24. Pour les substances peu solubles dans l’eau et les solvants organiques, 2,0 à 
2,5 g de sable quartzique finement broyé par récipient d’essai peuvent être mélangés, au moyen d’un mortier et d’un pilon par exemple, à la quantité nécessaire de la substance d’essai pour obtenir la concentration expérimen ­
tale voulue. Ce mélange de sable quartzique et de la substance d’essai est 
ajouté au sol préhumidifié, auquel il est mélangé complètement après l’ajout de la quantité nécessaire d’eau désionisée pour atteindre l’humidité requise. Le mélange final est réparti entre les récipients d’essai. On répète la procé ­
dure pour chaque concentration expérimentale et on prépare un témoin 
approprié de 2,0 à 2,5 g de sable quartzique finement broyé par récipient d’essai.
 
25. La concentration de la substance d’essai dans le sol est déterminée après 
chargement. La répartition homogène de la substance d’essai dans le sol est contrôlée avant l’introduction des organismes d’essai. La méthode de char ­
gement choisie et les raisons de ce choix sont notées (24).
 
26. Idéalement, il convient d’établir un équilibre entre le sol et l’eau interstitielle 
avant l’ajout des organismes; une période de quatre jours à 20 °C est recommandée. Pour un grand nombre de substances chimiques organiques faiblement solubles dans l’eau, le laps de temps nécessaire pour qu’un 
véritable équilibre soit atteint entre les parties adsorbées et dissoutes peut 
s’étendre sur plusieurs jours ou plusieurs mois. Selon l’objectif de l’étude, par exemple lorsqu’il s’agit de simuler des conditions environnementales, il peut être nécessaire de «vieillir» plus longtemps le sol chargé [trois 
semaines à 20 °C pour les métaux notamment (22)].
 
Élevage des animaux d’essai  
27. Il est préférable de conserver les vers en élevage de laboratoire permanent. 
Des conseils sur les méthodes d’élevage en laboratoire concernant  Eisenia 
fetida  et Eisenia andrei , et les espèces enchytrées figurent à l’appendice 5 
[voir aussi (48), (51) et (52)].  
28. Il convient que les vers utilisés dans les essais ne présentent pas de mala ­
dies, anomalies ou parasites observables.  
DÉROULEMENT DE L’ESSAI  
29. Les organismes d’essai sont exposés à la substance d’essai durant la phase 
d’absorption. La phase d’absorption dure 14 jours (enchytrées) ou 21 jours 
(vers de terre) sauf s’il est prouvé que l’état stationnaire a été atteint.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1300
 
30. Pour la phase d’élimination, les vers sont transférés sur un sol dépourvu de 
la substance d’essai. Le premier échantillon est prélevé de 4 à 24 h après le 
début de la phase d’élimination. L’appendice 3 donne des exemples de programme d’échantillonnage pour une phase d’absorption de 21 jours et une phase d’élimination de 21 jours.
 
Organismes d’essai  
31. Chez de nombreuses espèces d’oligochètes terrestres, le poids individuel est 
très faible (5 à 10 mg de poids humide par individu pour  Enchytraeus 
albidus  et moins pour  Enchytraeus crypticus  ou Enchytraeus luxuriosus ); 
la pesée et l’analyse chimique peuvent nécessiter de réunir les vers des récipients de réplicats (tous les vers d’un récipient de réplicat sont utilisés 
afin d’obtenir un seul résultat pour les tissus analysés). Vingt enchytrées 
sont ajoutés à chaque réplicat, et au moins trois réplicats sont utilisés. Si la limite de détection analytique de la substance d’essai est élevée, il peut être nécessaire d’utiliser un plus grand nombre de vers. Pour les espèces d’essai 
de poids individuel supérieur ( Eisenia fetida  et Eisenia andrei ), il est 
possible de recourir à des récipients de réplicats contenant un seul individu.
 
32. Il convient que les vers de terre utilisés lors d’un essai soient de poids 
similaire ( Eisenia fetida  et Eisenia andrei  ont par exemple un poids indivi ­
duel de 250 à 600 mg). Les enchytrées ( Enchytraeus albidus  notamment) 
mesurent environ 1 cm de long. Tous les vers utilisés pour un même essai proviennent de la même source et sont adultes (avec un clitellum) (appen ­
dice 5). Le poids et l’âge d’un animal pouvant influer sur les valeurs de 
FBA (par exemple, du fait d’une teneur en lipides variable et/ou de la présence d’œufs), ces paramètres sont consignés avec précision, et pris en compte dans l’interprétation des résultats. De plus, des cocons sont suscep ­
tibles d’apparaître pendant la période d’exposition, ce qui a également des 
répercussions sur les valeurs de FBA. Il est recommandé de peser un sous-échantillon des vers avant l’essai afin d’estimer les poids humides et secs moyens.
 
33. Un rapport sol/vers élevé est utilisé afin de minimiser la baisse de la concen ­
tration de la substance d’essai dans le sol durant la phase d’absorption. Il est recommandé que ce rapport s’élève au minimum, pour  Eisenia fetida  et 
Eisenia andrei , à 50 g de poids sec de sol par ver et, pour les enchytrées, 
à 10-20 g de poids sec de sol par récipient d’essai. La couche de sol 
contenu dans les récipients a une épaisseur de 2 à 3 cm (enchytrées) ou de 4 à 5 cm (vers de terre).
 
34. Les vers utilisés lors d’un essai sont extraits du milieu d’élevage (les enchy ­
trées par exemple à l’aide de pinces de joaillier). Les animaux adultes sont transférés pour acclimatation sur un sol d’essai non traité, puis nourris (voir le paragraphe 36). Si les conditions d’essai diffèrent des conditions d’éle ­
vage, une phase d’acclimatation de 24 à 72 h devrait suffire à l’adaptation 
des vers aux conditions d’essai. Une fois acclimatés, les vers de terre sont transférés dans des récipients en verre (des boîtes de Petri par exemple) contenant une eau propre pour y être rincés, puis ils sont pesés avant 
d’être déposés sur le sol d’essai. Avant la pesée, tout excès d’eau est 
enlevé en tapotant délicatement les vers contre le bord du récipient ou en les séchant précautionneusement à l’aide d’une serviette en papier légère ­
ment humidifiée.
 
35. Le comportement d’enfouissement des organismes d’essai est observé et 
consigné. Dans les essais menés avec des vers de terre, les animaux (témoins et traités) s’enfouissent dans le sol normalement en quelques heures; ceci est vérifié 24 h maximum après l’ajout des vers dans le réci ­
pient d’essai. Si ce n’est pas le cas (par exemple, plus de 10 % ne s’enfouis ­
sent pas pendant plus de la moitié de la phase d’absorption), soit les
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conditions d’essai ne sont pas appropriées, soit les organismes d’essai ne 
sont pas en bonne santé. Il conviendra alors d’arrêter l’essai et de le répéter. 
Les enchytrées vivant essentiellement dans les pores interstitiels du sol, il arrive souvent que leur tégument soit seulement partiellement en contact avec le substrat environnant. On suppose que l’exposition des enchytrées 
enfouis et non enfouis est équivalente, et le non-enfouissement des enchy ­
trées n’exige pas nécessairement de répéter l’essai.
 
Alimentation  
36. L’alimentation des organismes d’essai est envisagée si le sol utilisé présente 
une faible teneur en carbone organique total. Avec un sol artificiel, il est 
recommandé d’alimenter les vers suivant une fréquence hebdomadaire (une fois par semaine) à raison de 7 mg de fumier séché par gramme de masse sèche du sol pour les vers de terre, et de 2 à 2,5 mg de flocons d’avoine 
moulus par gramme de masse sèche du sol pour les enchytrées (11). La 
première ration est mélangée au sol immédiatement avant l’ajout des orga ­
nismes d’essai. Il convient d’employer, de préférence, le même type d’ali ­
mentation que pour l’élevage (appendice 5).
 
Régime d’éclairage et température  
37. Les essais sont menés suivant un cycle contrôlé de 16/8 heures de lumière/ 
obscurité, avec une intensité lumineuse comprise de préférence entre 400 et 
800 lx au niveau des récipients d’essai (3). La température est maintenue à 
20 ± 2 °C tout au long de l’essai.  
Concentrations d’essai  
38. Une seule concentration est utilisée. Les cas où une ou plusieurs concen ­
trations seraient requises font l’objet d’une justification. Si la toxicité (CE  x ) 
de la substance d’essai est voisine de la limite de détection analytique, on recommande l’utilisation d’une substance d’essai radiomarquée, de radioac ­
tivité spécifique élevée. Pour les métaux, la concentration devra être supé ­
rieure à la concentration de fond dans les tissus et le sol.
 
Réplicats  
39. Concernant les mesures de cinétique (phase d’absorption et d’élimination), 
le nombre minimum de récipients de réplicats traités devra être de trois par 
point d’échantillonnage. Le nombre total de réplicats préparés suffira à couvrir tous les temps de prélèvement prévus au cours des phases d’absorp ­
tion et d’élimination.
 
40. Pour les observations et les mesures biologiques (rapport poids sec/poids 
humide, teneur en lipides) et pour l’analyse des concentrations de fond dans 
les vers et le sol, au moins 12 récipients de réplicats d’un témoin négatif (quatre échantillons prélevés au démarrage, quatre à la fin de la phase d’absorption et quatre à la fin de la phase d’élimination) sont fournis, si 
aucun solvant autre que l’eau n’a été utilisé. Si un agent de solubilisation est 
utilisé pour l’application de la substance d’essai, il convient de prévoir, en plus des réplicats traités, des témoins solvant (quatre récipients de réplicats devront faire l’objet d’un prélèvement au démarrage, quatre à la fin de la 
phase d’absorption et quatre à la fin de la phase d’élimination) contenant 
tous les constituants, à l’exception de la substance d’essai. Dans ce cas, quatre récipients supplémentaires de réplicats d’un témoin négatif (sans solvant) pourront également être fournis pour procéder à un nouvel échan ­
tillonnage à la fin de la phase d’absorption. Ces réplicats pourront être 
comparés biologiquement avec le témoin solvant afin d’obtenir des infor ­
mations sur une éventuelle influence du solvant sur les organismes d’essai. Il est recommandé de prévoir un nombre suffisant de récipients supplémen ­
taires de réplicats de réserve (huit, par exemple) pour les vers traités et les 
vers témoins.
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Fréquence des mesures de la qualité du sol  
41. Le pH et le taux d’humidité du sol sont mesurés au début et à la fin des 
phases d’absorption et d’élimination. La température de la chambre d’essai est relevée en continu. Il convient de contrôler l’humidité du sol une fois par 
semaine en pesant les récipients d’essai et en comparant leur poids au 
moment des contrôles avec leur poids en début d’essai. Les pertes d’humi ­
dité sont compensées par l’ajout d’eau désionisée.
 
Échantillonnage et analyse des vers et du sol  
42. L’appendice 3 donne un exemple de programme d’échantillonnage pour les 
phases d’absorption et d’élimination des essais de bioaccumulation sur les 
vers de terre et les enchytrées.  
43. Un échantillon du sol est prélevé dans les récipients d’essai pour déterminer 
la concentration de la substance d’essai avant l’introduction des vers, puis durant les phases d’absorption et d’élimination. Pendant l’essai, les concen ­
trations de la substance d’essai sont déterminées dans les vers et dans le sol. 
En règle générale, on mesure les concentrations totales dans le sol. On peut 
également mesurer les concentrations dans l’eau interstitielle; dans ce cas, il convient de justifier ce choix et de décrire les méthodes appropriées prévues avant le début de l’étude, puis de consigner ces informations dans le rapport.
 
44. Les vers et le sol sont échantillonnés au moins à six reprises durant les 
phases d’absorption et d’élimination. Si la stabilité d’une substance d’essai est démontrée, le nombre d’analyses du sol peut être réduit. Il est recom ­
mandé d’analyser au moins trois réplicats au début et à la fin de la phase 
d’absorption. Si la concentration mesurée dans le sol à la fin de la phase 
d’absorption s’écarte de la concentration initiale de plus de 30 %, les échan ­
tillons de sol prélevés à d’autres dates sont également analysés.
 
45. Enlever du sol les vers d’un réplicat donné à chaque temps de prélèvement 
(par exemple, après avoir étalé le sol du réplicat sur un plateau peu profond 
et prélevé les vers à l’aide d’une pince de joaillier), les rincer rapidement à 
l’eau dans un récipient peu profond en verre ou en acier. Enlever l’eau en excès (voir le paragraphe 34). Transférer délicatement les vers dans un récipient préalablement taré, et les peser immédiatement, en incluant le 
contenu de l’intestin.
 
46. Les vers de terre ( Eisenia  sp.) doivent pouvoir purger leur intestin pendant 
la nuit, par exemple sur un papier filtre humide dans une boîte de Petri fermée (voir paragraphe 34). Après la purge, il convient de déterminer le 
poids des vers afin d’évaluer la perte éventuelle de biomasse pendant l’essai 
(voir les critères de validité au paragraphe 17). La pesée et l’analyse des tissus des enchytrées sont effectuées sans purge, ceci étant techniquement difficile en raison de la petite taille de ces vers. Une fois le poids final 
déterminé, les vers sont tués immédiatement, en utilisant la méthode la plus 
appropriée (par exemple avec de l’azote liquide, ou en congelant les vers à une température inférieure à - 18 °C).
 
47. Durant la phase d’élimination, les vers remplacent le contenu contaminé de 
leur intestin par des éléments du sol propre. Autrement dit, les mesures 
réalisées sur un échantillon de vers qui ne se sont pas purgés (les enchytrées 
en l’occurrence) immédiatement avant la phase d’élimination incluent le sol contaminé présent dans l’intestin. S’agissant des oligochètes aquatiques, on suppose qu’après les 4 à 24 h initiales de la phase d’élimination, l’essentiel 
du contenu intestinal contaminé a été remplacé par du sédiment propre [voir 
notamment (46)]. Des observations similaires ont été rapportées pour les vers de terre lors d’études sur l’accumulation de cadmium et de zinc radio ­
marqués (78). Chez les enchytrées ne s’étant pas purgés, la concentration de 
ce premier échantillon de la phase d’élimination peut être considérée comme 
la concentration dans les tissus après la purge de l’intestin. Pour tenir compte de la dilution de la concentration de la substance d’essai par du sol non contaminé durant la phase d’élimination, il est possible d’estimer le 
poids du contenu de l’intestin à partir des rapports poids des vers humides/ 
poids des cendres de vers ou poids des vers secs/poids des cendres de vers.
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48. Il est préférable d’analyser les échantillons de sol et de vers immédiatement 
après extraction (c’est-à-dire dans les 1 à 2 jours suivants) afin d’éviter des 
dégradations ou d’autres pertes, et il est recommandé de calculer les vitesses approximatives d’absorption et d’élimination pendant le déroulement de l’essai. Si l’analyse est retardée, les échantillons devront être stockés 
suivant une méthode appropriée, par exemple, en procédant à leur congéla ­
tion (≤ - 18 °C).
 
49. Il conviendra de vérifier que la précision et la reproductibilité de l’analyse 
chimique, ainsi que la récupération de la substance d’essai dans les échan ­
tillons de sol et de vers sont satisfaisantes pour la méthode donnée; l’effi ­
cacité d’extraction, la limite de détection et la limite de quantification devront être consignées. De même, il faudra s’assurer que la substance 
d’essai n’est pas détectable dans les récipients témoins à des concentrations 
supérieures à la concentration de fond. Si la concentration de la substance d’essai dans l’organisme d’essai C
 a est > 0 pour les vers témoins, il faudra 
l’inclure au calcul des paramètres cinétiques (appendice 2). Pendant toute la 
durée de l’essai, tous les échantillons sont manipulés de façon à réduire au 
minimum les contaminations et les pertes (résultant, par exemple, de l’ad ­
sorption de la substance d’essai sur le dispositif d’échantillonnage).  
50. En cas d’utilisation de substances d’essai radiomarquées, il est possible 
d’analyser le produit parent et les métabolites. Une quantification de la substance d’essai parente et des métabolites à l’état stationnaire ou à la 
fin de la phase d’absorption fournit des informations importantes. Les 
échantillons sont alors nettoyés de façon à pouvoir quantifier séparément la substance d’essai parente. Si des métabolites simples excèdent 10 % de la radioactivité totale du ou des échantillons analysés, l’identification de ces 
métabolites est recommandée.
 
51. La récupération globale et la récupération de la substance d’essai dans les 
vers, le sol, et le cas échéant, dans les pièges contenant des absorbants 
permettant de retenir la substance d’essai évaporée, sont consignées et 
rapportées.  
52. Le regroupement d’individus échantillonnés à partir d’un récipient d’essai 
donné est acceptable pour les enchytrées, plus petits que les vers de terre. Si ce regroupement implique de réduire le nombre de réplicats, cela restreint les procédures statistiques pouvant s’appliquer aux données. Si une procé ­
dure et une puissance statistiques spécifiques sont requises, alors l’essai 
comprend un nombre adéquat de récipients de réplicats, adapté aux quanti ­
tés, à la procédure et à la puissance voulues.
 
53. Il est recommandé d’exprimer le FBA à la fois comme une fonction du 
poids sec total et, si nécessaire (à savoir pour des substances fortement hydrophobes), comme une fonction de la teneur en lipides. La teneur en lipides est déterminée par des méthodes appropriées [certaines méthodes 
existantes, voir par exemple (31) ou (58), ont besoin d’être adaptées à 
cette fin]. Ces méthodes s’appuient sur une technique d’extraction au chlo ­
roforme/méthanol. Toutefois, afin d’éviter l’utilisation de solvants chlorés, il convient d’utiliser une version modifiée de la méthode de Bligh et Dyer (9) 
qui est décrite dans (17). Comme les diverses méthodes ne conduisent pas 
forcément à des valeurs identiques, il est important de détailler la méthode employée. Lorsque cela est possible, c’est-à-dire si on dispose de suffisam ­
ment de tissu de vers, la teneur en lipides est, idéalement, analysée à partir 
du même échantillon ou extrait que la substance d’essai, l’extrait devant 
souvent être débarrassé de ses lipides avant d’être analysé par chromatogra ­
phie (49). Une autre possibilité consiste à mesurer la teneur en lipides sur des animaux témoins et à utiliser la valeur obtenue pour normaliser les 
valeurs de FBA. Cette dernière approche réduit la contamination de l’équi ­
pement par la substance d’essai.
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RÉSULTATS ET RAPPORT  
Traitement des résultats  
54. On obtient la courbe d’absorption de la substance d’essai en portant la 
concentration de la substance d’essai dans/sur les vers durant la phase d’absorption en fonction du temps, en échelle arithmétique. Lorsque la courbe atteint un plateau ou état stationnaire (voir les définitions à l’appen ­
dice 1), le facteur de bioaccumulation à l’état stationnaire (FBAss) est 
calculé à l’aide de la formule suivante:
 
C a à l’état stationnaire ou à la fin de la phase d’absorption  ðmoyenneÞ 
C s à l’état stationnaire ou à la fin de la phase d’absorption  ðmoyenneÞ 
C a représente la concentration de la substance d’essai dans l’organisme 
d’essai, et  
C s la concentration de la substance d’essai dans le sol.  
55. Si la courbe n’atteint pas de plateau, le FBA  K , fondé sur les constantes de 
vitesse, devra être déterminé à la place du BAFss comme suit:  
— déterminer le facteur d’accumulation (FBA  K ) comme le rapport k  s /k e , 
— les vitesses d’absorption et d’élimination sont calculées de préférence 
simultanément (voir l’équation 11 à l’appendice 2),  
— La constante de vitesse d’élimination (k  e ) est généralement déterminée à 
partir de la courbe d’élimination (c’est-à-dire du tracé de la concentra ­
tion de la substance d’essai dans les vers durant la phase d’élimination). 
La constante de vitesse d’absorption k  s est ensuite calculée en fonction 
de k  e et d’une valeur de C  a qui est dérivée de la courbe d’absorption – 
voir la description de ces méthodes à l’appendice 2. La méthode préférée 
pour l’obtention du FBAK et des constantes de vitesse, k  s et k  e , consiste 
à utiliser des méthodes informatisées non linéaires d’estimation des paramètres. Si la courbe d’élimination n’obéit manifestement pas à 
une cinétique du premier ordre, des modèles plus complexes devront 
alors être utilisés.
 
Rapport d’essai  
56. Le rapport d’essai comporte les informations suivantes:  
Substance d’essai:  
— toute information disponible sur la toxicité aiguë ou à long terme (par 
exemple CE  x , CL  x , CSEO) de la substance d’essai vis-à-vis des oligo ­
chètes fouisseurs,  
— pureté, état physique et propriétés physico-chimiques, par exemple log 
K ow , solubilité dans l’eau,  
— données d’identification de la substance; provenance de la substance 
d’essai, identité et concentration des solvants éventuellement utilisés,  
— en cas d’utilisation d’une substance d’essai radiomarquée, position 
précise des atomes marqués, radioactivité spécifique et pureté radiochi ­
mique.  
Espèces d’essai:  
— nom scientifique, souche, source, traitement préalable éventuel, acclima ­
tation, âge, taille, etc.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1305
 
Conditions d’essai:  
— procédure d’essai utilisée,  
— type et caractéristiques de l’éclairage utilisé et photopériode(s),  
— protocole d’essai (par exemple, nombre et dimension des récipients 
d’essai, masse du sol et épaisseur de la couche de sol, nombre de réplicats, nombre de vers par réplicat, nombre de concentrations d’essai, 
durée des phases d’absorption et d’élimination, fréquence d’échantillon ­
nage),
 
— justification du matériau choisi pour les récipients d’essai,  
— méthode de préparation et d’application de la substance d’essai, ainsi 
que raisons du choix de la méthode,  
— concentrations d’essai nominales, moyennes et écarts-types des valeurs 
mesurées dans les récipients d’essai, et méthode d’obtention de ces valeurs,
 
— source des constituants du sol artificiel ou – si un milieu naturel est 
utilisé – origine du sol, description d’un éventuel traitement préalable, résultats des contrôles (survie, augmentation de la biomasse, reproduc ­
tion), caractéristiques du sol [pH, teneur totale en carbone organique, 
distribution granulométrique (pourcentage de sable, de limon et d’argile), capacité maximale de rétention d’eau (CRE
 max ), teneur en eau au début 
et à la fin de l’essai, et toutes autres mesures réalisées],  
— informations détaillées sur le traitement des échantillons de sol et de 
vers, y compris les détails concernant la préparation, le stockage, les 
procédures de chargement en substance d’essai, l’extraction et les procé ­
dures analytiques (et leur précision) pour la substance d’essai dans les vers et le sol, la teneur en lipides (si mesurée), et les méthodes de 
récupération de la substance d’essai.
 
Résultats:  
— mortalité des vers témoins et des vers dans chaque récipient d’essai et 
éventuel comportement anormal observé (par exemple, évitement du sol, 
absence de reproduction lors d’un essai de bioaccumulation chez les enchytrées),
 
— rapport poids sec/poids humide du sol et des organismes d’essai (utiles 
pour la normalisation),  
— poids humides des vers à chaque temps de prélèvement; pour les vers de 
terre, poids humides au début de l’essai, et à chaque temps de prélève ­
ment avant et après la purge de l’intestin,  
— teneur en lipides des organismes d’essai (si déterminée),  
— courbes montrant les constantes cinétiques d’absorption et d’élimination 
de la substance d’essai chez les vers, et la durée pour atteindre l’état 
stationnaire,  
— C  a et C  s (avec écart-type et fourchette, si nécessaire) pour tous les temps 
de prélèvement (C  a exprimé en g.kg  -1 de poids humide et sec du corps 
entier, C  s exprimé en g.kg  -1 du poids humide et sec). Si un facteur 
d’accumulation biote-sol (BSAF) est nécessaire (par exemple, pour 
une comparaison des résultats entre deux essais ou plus réalisés avec 
des animaux de teneurs en lipides différentes), C  a est en plus être 
exprimé en g.kg  -1 de teneur en lipides de l’organisme et C  s est 
exprimé en g.kg  -1 de carbone organique (CO) du sol,  
— FBA (exprimé en kg de sol kg  -1 de ver), constante de vitesse d’absorp ­
tion du sol k  s (exprimée en g de sol kg  -1 de vers j  -1 ), et constante de 
vitesse d’élimination k  e (exprimée en j  -1 ); éventuellement, BSAF 
(exprimé en kg de CO du sol kg  -1 de teneur en lipides des vers),  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1306
 
— le cas échéant: pourcentages de substance parente, de métabolites et de 
résidus liés (c’est-à-dire le pourcentage de substance d’essai ne pouvant 
être extraite par les méthodes d’extraction courantes) détectés dans le sol et les animaux d’essai,
 
— méthodes utilisées pour les analyses statistiques des données.  
Évaluation des résultats:  
— conformité des résultats avec les critères de validité tels qu’énoncés au 
paragraphe 17,  
— résultats inattendus ou inhabituels, par exemple élimination incomplète 
de la substance d’essai des animaux d’essai.  
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(48) Chapitre C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre.  
(49) Chapitre C.13 de la présente annexe, Bioconcentration: essai avec renou ­
vellement continu sur les poissons.  
(50) Chapitre C.21 de la présente annexe, Microorganismes du sol: essai de 
transformation de l’azote.  
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Appendice 1  
DÉFINITIONS  
La bioaccumulation  est l’augmentation de concentration de la substance d’essai 
dans ou sur un organisme, par rapport à la concentration de la substance d’essai dans le milieu environnant. La bioaccumulation est le résultat combiné des processus de bioconcentration et de bioamplification (voir ci-dessous).
 
La bioconcentration  est l’augmentation de concentration de la substance d’essai 
dans ou sur un organisme, résultant de l’absorption de la substance exclusive ­
ment depuis le milieu environnant (à savoir via la surface du corps et le sol 
ingéré), par rapport à la concentration de la substance d’essai dans le milieu 
environnant.  
La bioamplification  est l’augmentation de concentration de la substance d’essai 
dans ou sur un organisme, résultant principalement de l’absorption d’aliments ou 
de proies contaminés, par rapport à la concentration de la substance d’essai dans 
l’alimentation ou la proie. La bioamplification peut conduire à un transfert ou à une accumulation de la substance d’essai dans les réseaux trophiques.
 
L’élimination  d’une substance est la perte de cette substance par les tissus de 
l’organisme d’essai selon des processus actifs ou passifs survenant indépendam ­
ment de la présence ou de l’absence de la substance d’essai dans le milieu environnant.
 
Le facteur de bioaccumulation  (FBA) à n’importe quel instant de la phase 
d’absorption de l’essai de bioaccumulation, est la concentration de la substance d’essai dans ou sur l’organisme d’essai (C
 a en g.kg  -1 de poids humide ou sec de 
ver) divisée par la concentration de la substance dans le milieu environnant (C  s 
en g.kg  -1 de poids de sol humide ou sec). Le FBA est exprimé en kg de sol kg  -1 
de ver.  
Le facteur de bioaccumulation à l’état stationnaire  (FBAss), qui est le FBA à 
l’état stationnaire, ne varie pas de façon significative pendant une longue période, 
la concentration de la substance d’essai dans le milieu environnant (C  s en g kg  -1 
de poids de sol sec) étant constante pendant cette période.  
Les facteurs de bioaccumulation  calculés directement à partir du rapport de la 
constante de vitesse d’absorption du sol divisée par la constante de vitesse 
d’élimination (k  s et k  e , voir ci-dessous), sont appelés  facteurs de bioaccumulation  
cinétiques (FBA  K ). 
Le facteur d’accumulation biote-sol  (BSAF) est la concentration de la subs ­
tance d’essai normalisée par rapport aux lipides dans/sur l’organisme d’essai, 
divisée par la concentration de la substance d’essai normalisée par rapport au carbone organique, dans le sol à l’état stationnaire. C
 a est alors exprimée en g.kg  - 
1 de teneur en lipides de l’organisme, et C  s en g.kg  -1 de teneur en carbone 
organique du sol; le BSAF est exprimé en kg de CO.kg  -1 de lipides.  
Un plateau ou état stationnaire  est défini comme l’équilibre entre les processus 
d’absorption et d’élimination survenant simultanément durant la phase d’exposi ­
tion. L’état stationnaire est atteint, dans le tracé du FBA en fonction du temps, 
lorsque la courbe devient parallèle à l’axe des temps et que trois analyses succes ­
sives de FBA réalisées sur des échantillons pris à intervalles d’au moins deux jours ne diffèrent pas de plus de 20 % les uns des autres et qu’il n’y a pas de 
différence statistique significative entre les trois périodes d’échantillonnage. Pour 
les substances d’essai absorbées lentement, des intervalles plus appropriés seraient de sept jours (49).
 
Le coefficient de partage carbone organique-eau  (K  co ) est le rapport de la 
concentration d’une substance dans/sur la fraction de carbone organique d’un sol 
et de la concentration de substance dans l’eau à l’équilibre.  
Le coefficient de partage octanol-eau  (K  ow ) est le rapport des solubilités de la 
substance dans le n-octanol et dans l’eau à l’équilibre; il est parfois exprimé par 
P ow . Le logarithme de K  ow (log K  ow ) est utilisé comme indicateur du potentiel de 
bioaccumulation de la substance par les organismes aquatiques.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1312
 
La phase d’absorption ou d’exposition  est la durée pendant laquelle les orga ­
nismes d’essai sont exposés à la substance d’essai.  
La constante de vitesse d’absorption du sol  (k  s ) est la valeur numérique 
définissant la vitesse d’augmentation de la concentration de la substance d’essai dans/sur l’organisme d’essai résultant de l’absorption de la phase du sol. k
 s est exprimé en g de sol kg  -1 de ver j  -1 . 
La phase d’élimination  est la durée, suite au transfert des organismes d’essai 
depuis un milieu contaminé dans un milieu dépourvu de la substance d’essai, 
durant laquelle est étudiée l’élimination (ou la perte nette) de la substance par les organismes d’essai.
 
La constante de vitesse d’élimination  (k e ) est la valeur numérique définissant la 
vitesse de réduction de la concentration de la substance d’essai dans/sur l’orga ­
nisme d’essai, suite au transfert des organismes d’essai depuis un milieu conte ­
nant l’élément d’essai vers un milieu dépourvu de cette substance. k  e est exprimé 
en j  -1 . 
Une substance d’essai  est toute substance ou tout mélange soumis à un essai 
réalisé suivant la présente méthode d’essai.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1313
 
Appendice 2  
Calcul des paramètres d’absorption et d’élimination  
Le principal effet observé d’un essai de bioaccumulation est le facteur de bioac ­
cumulation, FBA. Il est possible de calculer le FBA en divisant la concentration dans l’organisme d’essai, C
 a , par la concentration dans le sol, C  s , à l’état station ­
naire. Si l’état stationnaire n’est pas atteint durant la phase d’absorption, le FBA  K 
est calculé à partir des constantes de vitesse et non du FBAss. Il convient 
d’indiquer si le FBA est basé, ou non, sur des concentrations à l’état stationnaire.  
La procédure habituelle pour obtenir le facteur de bioaccumulation cinétique 
(FBA  K ), la constante de vitesse d’absorption du sol (k  s ) et la constante de 
vitesse d’élimination (k  e ) consiste à faire à appel à des méthodes informatisées 
non linéaires d’estimation des paramètres, par exemple à partir des modèles 
décrits dans (68). D’après un ensemble de valeurs séquentielles de la concen ­
tration en fonction du temps et les équations de modèles: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [équation 1]  
ou 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [équation 2]  
où: 
C a = concentration de la substance dans les vers [g.kg  -1 de poids humide ou sec]  
k s = constante de vitesse d’absorption dans les tissus [g de sol kg  -1 de ver j - 1]  
C s = concentration de la substance dans le sol [g.kg  -1 de poids humide ou sec]  
k e = constante de vitesse d’élimination [j - 1]  
t c = temps à la fin de la phase d’absorption,  
ces programmes informatiques calculent les valeurs de FBA  K , k s et k  e . 
Lorsque la concentration de fond dans les vers non exposés, par exemple au jour 
0, diffère sensiblement de zéro (cela peut être le cas pour les métaux notamment), cette concentration (C
 a,0 ) est incluse dans ces équations comme suit: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [équation 3]  
et 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [équation 4]  
Dans les cas où l’on observe une forte baisse de la concentration de la substance 
d’essai dans le sol durant la phase d’absorption, il est possible de recourir aux 
modèles suivants (par exemple, (67) et (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [équation 5]  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1314
 
où: 
C s = concentration de la substance dans le sol [g.kg  -1 de poids humide ou sec]  
k 0 = constante de vitesse de dégradation dans le sol [d  -1 ] 
C 0 = concentration initiale de la substance dans le sol [g.kg  -1 de poids humide 
ou sec] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [équation 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [équation 7]  
où: 
C a = concentration de la substance dans les vers [g.kg  -1 de poids humide ou sec]  
k s = constante de vitesse d’absorption dans les tissus [g de sol kg  -1 de vers j  -1 ] 
k 0 = constante de vitesse de dégradation dans le sol [j - 1]  
k e = constante de vitesse d’élimination [j - 1]  
t c = temps à la fin de la phase d’absorption.  
Lorsqu’on a atteint un état stationnaire durant la phase d’absorption (c’est-à-dire t 
= ∞), il est possible de réduire l’équation 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [équation 1]  
à: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
ou à 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [équation 8]  
Ensuite k  s /k e × C  s donne une valeur approchée de la concentration de la subs ­
tance d’essai dans le tissu du ver à l’état stationnaire (C  a,ss ). 
Le facteur d’accumulation biote-sol (BSAF) peut se calculer comme suit: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [équation 9]  
où f  oc est la fraction de carbone organique dans le sol, et f  lip est la fraction de 
lipides dans le ver, toutes deux étant déterminées, de préférence, sur des échan ­
tillons prélevés de l’essai, et basées respectivement soit sur le poids sec, soit sur 
le poids humide.  
Il est possible de modéliser les constantes cinétiques d’élimination en utilisant les 
données issues de la phase d’élimination et en appliquant l’équation de modèle suivante et une méthode informatisée non linéaire d’estimation des paramètres. Si le tracé des données en fonction du temps indique une décroissance exponentielle 
constante de la concentration de la substance d’essai dans les animaux, le dérou ­
lement temporel de l’élimination peut être décrit par un modèle à un comparti ­
ment (équation 9). 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [équation 10]  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1315
 
Les processus d’élimination semblent parfois se dérouler en deux étapes, 
montrant une décroissance rapide de C  a au cours des premières étapes, qui 
évolue vers une perte plus lente des éléments d’essai dans les étapes ultérieures de l’élimination [par exemple (27), (68)]. Les deux étapes peuvent être inter ­
prétées en faisant l’hypothèse de l’existence de deux compartiments dans l’orga ­
nisme, compartiments à partir desquels la substance d’essai est éliminée à diffé ­
rentes vitesses. Dans ces cas particuliers, il convient d’étudier la littérature perti ­
nente, par exemple (38), (39), (40), (78).
 
À l’aide des équations de modèles ci-dessus, on peut également calculer les 
paramètres cinétiques (k  s et k  e ) en une seule fois, en appliquant un modèle de 
cinétique du premier ordre à toutes les données des phases d’absorption et 
d’élimination simultanément. Pour une description d’une méthode pouvant permettre un tel calcul combiné des constantes de vitesse d’absorption et d’éli ­
mination, consulter (41), (73) et (70). 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[équation 11]  
Note:  quand les paramètres d’absorption et d’élimination sont estimés simulta ­
nément à partir des données combinées d’absorption et d’élimination, 
«m» tel que mentionné dans l’équation 11 est un descripteur qui 
permet au programme informatique d’attribuer les sous-termes de l’équa ­
tion aux ensembles de données de la phase correspondante et de faire une évaluation correcte (m = 1 pour la phase d’absorption; m = 2 pour la 
phase d’élimination).
 
Quoi qu’il en soit, ces équations de modèles seront utilisées avec précaution, en 
particulier lorsque des modifications de la biodisponibilité de la substance d’es ­
sai, ou (bio)dégradation, surviennent durant l’essai [voir notamment (79)].  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1316
 
Appendice 3  
EXEMPLES DE PROGRAMMES D’ÉCHANTILLONNAGE POUR DES 
ESSAIS DE BIOACCUMULATION DANS LE SOL  
Essai sur des vers de terre  
a) Phase d’absorption avec 8 dates d’échantillonnage pour le calcul des para ­
mètres cinétiques  
Jour Activité  
- 6 Conditionnement du sol préparé durant 48 h. 
- 4 Chargement d’une fraction du sol avec la solution de la substance 
d’essai; évaporation de tout solvant; mélange des constituants du sol; répartition du sol dans les récipients d’essai; équilibration 
dans les conditions d’essai durant 4 jours (3 semaines pour les 
sols chargés en métaux). 
- 3 à - 1 Séparation des organismes d’essai du milieu d’élevage pour accli ­
matation; préparation et humidification des constituants du sol. 
0 Mesure de la température et du pH du sol; retrait d’échantillons 
de sol des récipients traités et des témoins au solvant pour la 
détermination de la concentration de la substance d’essai; ajout d’une ration alimentaire; pesée et distribution aléatoire des vers 
dans les récipients d’essai; conservation d’un nombre suffisant de 
sous-échantillons de vers pour la détermination des valeurs de fond analytiques, des poids humide et sec, ainsi que de la teneur en lipides; pesée de tous les récipients d’essai pour le contrôle de 
l’humidité du sol; contrôle de l’alimentation en air, en cas de 
système en circuit fermé. 
1 Contrôle de l’alimentation en air, consignation du comportement 
des vers et de la température; prélèvement d’échantillons de sol 
et de vers pour la détermination de la concentration de la subs ­
tance d’essai. 
2 Comme le 1
 er jour. 
3 Contrôle de l’alimentation en air, du comportement des vers et de 
la température. 
4 Comme le 1  er jour. 
5 – 6 Comme le 3  e jour. 
7 Comme le 1  er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de 
l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée. 
8 – 9 Comme le 3
 e jour. 
10 Comme le 1  er jour. 
11 – 13 Comme le 3  e jour. 
14 Comme le 1  er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de 
l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée. 
15 – 16 Comme le 3
 e jour. 
17 Comme le 1  er jour. 
18 – 20 Comme le 3  e jour. ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1317
 
Jour Activité  
21 Comme le 1  er jour; mesure de la température et du pH du sol; 
contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients 
d’essai; fin de la phase d’absorption; transfert des vers des répli ­
cats exposés restants vers des récipients contenant du sol propre pour la phase d’élimination (sans purge de l’intestin); échantillon ­
nage du sol et des vers des témoins au solvant. 
Les activités préalables à l’exposition (phase d’équilibration) sont 
programmées en tenant compte des propriétés de la substance 
d’essai. 
Les activités décrites pour le 3
 e jour sont réalisées quotidienne ­
ment (au moins les jours ouvrés).  
b) Phase d’élimination  
Jour Activité  
- 6 Préparation et humidification des constituants du sol; condition ­
nement du sol préparé durant 48 h. 
- 4 Mélange des constituants du sol; répartition du sol dans les réci ­
pients d’essai; incubation dans les conditions d’essai durant 4 
jours. 
0 (fin de la phase 
d’absorption) Mesure de la température et du pH du sol; pesée et distribution 
aléatoire des vers dans les récipients d’essai; ajout d’une ration 
alimentaire; transfert des vers des réplicats exposés restants vers des récipients contenant du sol propre; prélèvement d’échan ­
tillons de sol et de vers après 4 à 6 h pour la détermination de 
la concentration de la substance d’essai. 
1 Contrôle de l’alimentation en air, consignation du comportement 
des vers et de la température; prélèvement d’échantillons de sol 
et de vers pour la détermination de la concentration de la subs ­
tance d’essai. 
2 Comme le 1
 er jour. 
3 Contrôle de l’alimentation en air, du comportement des vers et de 
la température. 
4 Comme le 1  er jour. 
5 – 6 Comme le 3  e jour. 
7 Comme le 1  er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de 
l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et 
en compensant l’eau évaporée. 
8 – 9 Comme le 3  e jour. 
10 Comme le 1  er jour. 
11 – 13 Comme le 3  e jour. 
14 Comme le 1  er jour; ajout d’une ration alimentaire; contrôle de 
l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée. 
15 – 16 Comme le 3
 e jour. 
17 Comme le 1  er jour. ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1318
 
Jour Activité  
18 – 20 Comme le 3  e jour. 
21 Comme le 1  er jour; mesure de la température et du pH du sol; 
contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients 
d’essai; échantillonnage du sol et des vers des témoins au 
solvant. 
La préparation du sol avant le début de la phase d’élimination 
intervient de la même manière qu’avant la phase d’absorption. 
Les activités décrites pour le 3  e jour sont réalisées quotidienne ­
ment (au moins les jours ouvrés).  
Essai sur des enchytrées  
a) Phase d’absorption avec 8 dates d’échantillonnage pour le calcul des para ­
mètres cinétiques  
Jour Activité  
- 6 Conditionnement du sol préparé durant 48 h. 
- 4 Chargement d’une fraction du sol avec la solution de la substance 
d’essai; évaporation de tout solvant; mélange des constituants du sol; répartition du sol dans les récipients d’essai; équilibration 
dans les conditions d’essai durant 4 jours (3 semaines pour les 
sols chargés en métaux). 
- 3 à - 1 Séparation des organismes d’essai du milieu d’élevage pour accli ­
matation; préparation et humidification des constituants du sol. 
0 Mesure de la température et du pH du sol; retrait d’échantillons 
de sol des récipients traités et des témoins au solvant pour la détermination de la concentration de la substance d’essai; ajout 
d’une ration alimentaire dans le sol; pesée et distribution aléatoire 
des vers dans les récipients d’essai; conservation de suffisamment de sous-échantillons de vers pour la détermination des valeurs de fond analytiques, du poids sec et humide et de la teneur en 
lipides; pesée de tous les récipients d’essai pour le contrôle de 
l’humidité du sol; contrôle de l’alimentation en air, en cas de système en circuit fermé. 
1 Contrôle de l’alimentation en air, consignation du comportement 
des vers et de la température; prélèvement d’échantillons de sol et de vers pour la détermination de la concentration de la subs ­
tance d’essai. 
2 Comme le 1
 er jour. 
3 Contrôle de l’alimentation en air, du comportement des vers et de 
la température. 
4 Comme le 1  er jour. 
5 – 6 Comme le 3  e jour. 
7 Comme le 1  er jour; ajout d’une ration alimentaire dans le sol; 
contrôle de l’humidité du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai et en compensant l’eau évaporée. 
9 Comme le 1
 er jour. 
10 Comme le 3  e jour. ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1319
 
Jour Activité  
11 Comme le 1  er jour. 
12 – 13 Comme le 3  e jour. 
14 Comme le 1  er jour; ajout d’une ration alimentaire dans le sol; 
mesure de la température et du pH du sol; contrôle de l’humidité 
du sol en pesant de nouveau les récipients d’essai; fin de la phase 
d’absorption; transfert des vers des réplicats exposés restants vers des récipients contenant du sol propre pour la phase d’élimination (sans purge de l’intestin); échantillonnage du sol et des vers des 
témoins au solvant. 
Les activités préalables à l’exposition (phase d’équilibration) sont 
programmées en tenant compte des propriétés de la substance 
d’essai. 
Les activités décrites pour le 3
 e jour sont réalisées quotidienne ­
ment (au moins les jours ouvrés)  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1320
 
Appendice 4  
Sol artificiel – recommandations pour la préparation et le stockage  
Les sols naturels provenant d’une source particulière ne sont pas toujours 
disponibles tout au long de l’année, et des organismes indigènes ainsi que la 
présence de micropolluants peuvent influer sur l’essai; il est donc recommandé d’utiliser un substrat artificiel, le sol artificiel décrit au chapitre C.8 de la présente annexe, Toxicité pour les vers de terre (48). Plusieurs espèces d’essai peuvent 
survivre, se développer et se reproduire dans ce sol, et une normalisation 
maximum doublée d’une comparabilité intra- et interlaboratoire des conditions d’essai et d’élevage est proposée.
 
Constituants du sol: 
Tourbe: 10 % Tourbe de sphaigne, conformément à la 
ligne directrice 207 de l’OCDE (48). 
Sable quartzique: 70 % Sable quartzique industriel (séché à l’air); 
taille des grains: plus de 50 % des particules seront dans une fourchette comprise entre 50 et 200 μm, mais toutes seront ≤ 2 mm. 
Argile kaolinique: 20 % Teneur en kaolinite ≥ 30 %. 
Carbonate de 
calcium: ≤ 1 % CaCO
 3 , pulvérisé, chimiquement pur.  
Il est également possible de réduire la teneur en carbone organique du sol 
artificiel, notamment en abaissant la teneur en tourbe à 4-5 % de sol sec et en 
augmentant la teneur en sable en conséquence. Cette réduction de la teneur en carbone organique est susceptible de diminuer les possibilités d’adsorption de la substance d’essai sur le sol (carbone organique) et d’augmenter la disponibilité 
de la substance d’essai pour les vers (74). Il a été démontré que  Enchytraeus 
albidus  et Eisenia fetida  peuvent satisfaire aux critères de validité concernant la 
reproduction lorsqu’ils sont testés sur des sols naturels dont la teneur en carbone organique est inférieure (2,7 %, par exemple) (33) et (61), et on a constaté 
expérimentalement qu’il pouvait en aller de même sur un sol artificiel renfermant 
5 % de tourbe.
 
Préparation  
Les constituants secs du sol sont soigneusement mélangés (par exemple, dans un 
grand mélangeur de laboratoire). Ce mélange est réalisé environ une semaine avant le début de l’essai. Le mélange sec de constituants du sol est humidifié 
avec de l’eau désionisée au moins 48 h avant l’application de la substance d’essai 
de manière à équilibrer/stabiliser l’acidité. Pour déterminer le pH, on utilisera un mélange de sol et d’une solution de 1 M KCl suivant un rapport de 1/5. Si le pH ne se trouve pas dans la plage requise (6,0 ± 0,5), soit on ajoute au sol une 
quantité suffisante de CaCO
 3 , soit on prépare un nouveau lot de sol.  
La capacité maximale de rétention d’eau (CRE) du sol artificiel est déterminée 
conformément à la norme ISO 11268-2 (35). Au moins deux jours avant de démarrer l’essai, on humidifie le sol artificiel sec en ajoutant suffisamment d’eau désionisée ou reconstituée pour obtenir approximativement la moitié de 
la teneur finale en eau. Cette teneur finale en eau devrait représenter 40 % à 
60 % de la CRE maximale. Au début de l’essai, on divise le sol préalablement humidifié en lots d’un nombre égal à celui des concentrations d’essai et des témoins utilisés pour l’essai, et, en employant la solution de la substance 
d’essai et/ou en ajoutant de l’eau désionisée ou reconstituée, on ajuste le taux 
d’humidité pour qu’il se trouve entre 40 et 60 % de la CRE
 max . Le taux d’hu ­
midité est déterminé au début et à la fin de l’essai (à 105 °C). Il sera optimal pour satisfaire les exigences des espèces (le taux d’humidité peut aussi être 
contrôlé comme suit: le sol légèrement pressé dans la main doit laisser apparaître 
de petites gouttes d’eau entre les doigts).
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1321
 
Stockage  
Les constituants secs du sol artificiel peuvent être stockés à température ambiante 
jusqu’à leur utilisation. Le sol préparé, préhumidifié peut être stocké dans un 
endroit frais pendant maximum trois jours avant d’être chargé; il convient de veiller à minimiser l’évaporation de l’eau. Un sol chargé avec la substance d’essai sera utilisé immédiatement, sauf si des informations spécifient qu’il est 
possible de stocker ce sol sans affecter la toxicité et la biodisponibilité de la 
substance d’essai. Des échantillons de sol chargé peuvent alors être stockés dans les conditions recommandées pour la substance d’essai donnée jusqu’à l’analyse.
 ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1322
 
Appendice 5  
Espèces d’oligochètes terrestres recommandées pour les essais de 
bioaccumulation dans le sol  
Vers de terre  
L’espèce d’essai recommandée est  Eisenia fetida  (Savigny, 1826), qui appartient 
à la famille des  Lumbricidae . Depuis 1972, on la divise en deux sous-espèces 
[Eisenia fetida  et Eisenia andrei  (10)]. Selon Jaenike (36), il s’agit là de deux 
espèces à part entière.  Eisenia fetida  est facilement reconnaissable à ses larges 
bandes jaunes entre les segments alors qu’ Eisenia andrei  présente une couleur 
rouge foncé uniforme. Probablement originaires de la région de la mer Noire, elles sont aujourd’hui présentes partout dans le monde, surtout dans les habitats 
modifiés par les activités anthropiques comme les tas de compost. Toutes deux se 
prêtent à la réalisation d’essais écotoxicologiques et d’essais de bioaccumulation.
 
Eisenia fetida  et Eisenia andrei  sont disponibles dans le commerce, notamment 
comme appât pour la pêche. Par rapport à d’autres vers de terre de la même famille, ces deux espèces ont un cycle de vie court et atteignent leur maturité en 
2 à 3 mois (à température ambiante). Leur température optimale oscille entre 20 
et 24 °C. Elles préfèrent les substrats relativement humides, d’un pH presque neutre et à forte teneur en matière organique. Ces espèces étant largement utili ­
sées dans les essais écotoxicologiques normalisés depuis environ 25 ans, leur 
élevage est bien établi (48) (77).
 
Ces deux espèces peuvent être élevées dans des déjections animales très diverses. 
Le milieu d’élevage recommandé par l’ISO (35) est un mélange 50/50 de crottin de cheval ou de bouse de vache et de tourbe. Le milieu aura un pH d’environ 6 à 7 (ajusté avec du carbonate de calcium), une faible conductivité ionique (une 
concentration de sels inférieure à 0,5 % ou à 6 mS/cm) et ne sera pas trop 
contaminé par de l’ammoniac ou des urines animales. Il est également possible d’utiliser de la terre de jardin, vendue dans le commerce, qui soit sans additifs, un sol artificiel tel que défini par l’OCDE (48), ou encore un mélange des deux, 
à parts égales (50/50). Le substrat sera humide, mais pas mouillé. Des boîtes 
d’élevage d’une capacité de 10 à 50 litres conviennent.
 
Pour obtenir une population de vers homogène quant à l’âge et à la masse, il vaut 
mieux commencer l’élevage avec des cocons. À cet effet, des vers adultes sont 
ajoutés à une boîte d’élevage qui contient du substrat frais pour produire des 
cocons. L’expérience a montré qu’une densité démographique d’environ 100 vers adultes par kg de substrat (poids humide) donne de bons taux de reproduction. Après 28 jours, les vers adultes sont retirés. Les vers de terre éclos sont utilisés 
pour les essais une fois adultes, soit 2 mois plus tard au moins mais pas au-delà 
de 12 mois.
 
Les vers des espèces décrites précédemment peuvent être considérés comme sains 
s’ils se déplacent dans le substrat, ne tentent pas de s’en échapper et se repro ­
duisent continuellement. Une extrémité postérieure qui bouge très lentement ou 
qui est jaune (s’agissant d’ E. fetida ) indique un épuisement du substrat. Il est 
alors recommandé d’utiliser du substrat frais et/ou de réduire le nombre d’ani ­
maux par boîte.  
Références bibliographiques complémentaires  
Gerard B.M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J., Egeler P., Füll C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell J.E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1323
 
Sims R.W. and Gerard B.M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin A.D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earth ­
worm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & 
Hall, London. 331-338 pp.  
Enchytrées  
L’espèce d’essai recommandée est  Enchytraeus albidus , Henle 1837 (ver blanc).  
Enchytraeus albidus  est l’une des plus grosses espèces (jusqu’à 15 mm) de la 
famille des annélides oligochètes ( Enchytraeidae ) et c’est la plus répandue dans 
le monde (8).  Enchytraeus albidus  colonise des habitats marins, dulcicoles et 
terrestres, constitués la plupart du temps de matière organique en décomposition 
(algues, compost), et fréquente rarement les prairies (42). Le fait qu’il tolère une gamme étendue de conditions écologiques et certaines variations morphologiques 
indiquent qu’il pourrait exister différentes races.
 
Enchytraeus albidus  est disponible dans le commerce, plus particulièrement sous 
forme de nourriture pour les poissons. Il convient de vérifier si l’élevage est 
contaminé par d’autres espèces, généralement plus petites (60). Dans l’affirma ­
tive, tous les vers sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri. De grands spécimens adultes d’ Enchytraeus albidus  sont ensuite sélectionnés (à l’aide d’un stéréomi ­
croscope) pour commencer un nouvel élevage. Tous les autres vers sont éliminés. 
Le cycle de vie de ces vers est court puisqu’ils arrivent à maturité entre 33 jours (à 18 °C) et 74 jours (à 12 °C). Seuls les vers ayant été conservés en laboratoire pendant au moins 5 semaines (une génération) sans problème devront être utilisés 
pour des essais.
 
D’autres espèces du genre  Enchytraeus  conviennent également, notamment  
Enchytraeus luxuriosus . L’univers de vie de cette espèce est le sol, comme 
récemment décrit dans (65). Si on utilise d’autres espèces d’ Enchytraeus , il 
faut les identifier clairement et justifier ce choix dans le rapport.  
L’espèce  Enchytraeus crypticus  (Westheide et Graefe, 1992) appartient au même 
groupe qu’ E. luxuriosus . L’existence ďEnchytraeus crypticus  dans la nature n’est 
pas certaine, cette espèce n’ayant été décrite que dans les élevages de lombrics et 
les tas de compost (Römbke, 2003). Par conséquent, on ne connaît pas ses besoins écologiques d’origine. Cependant, des études récemment menées en laboratoire avec différents sols naturels ont confirmé la grande tolérance de 
cette espèce vis-à-vis de propriétés du sol telles que le pH et la texture 
(Jänsch  et al. , 2005). Ces dernières années, cette espèce a souvent été utilisée 
dans des études écotoxicologiques en raison de sa facilité d’élevage et de mise à l’essai (Kuperman  et al. , 2003). Néanmoins, elle est petite (3-12 mm; 7 mm en 
moyenne) (Westheide et Müller, 1996), ce qui la rend plus difficile à manipuler 
qu’Enchytraeus albidus . Si on utilise cette espèce et non  Enchytraeus albidus , les 
récipients d’essai peuvent être de plus petite taille, mais cela n’est pas nécessaire. En outre, il convient de considérer que cette espèce se reproduit très rapidement, 
son temps de génération étant inférieur à 20 jours à 20 ± 2 °C (Achazi  et al. , 
1999), voire encore plus court à des températures supérieures.
 
Les Enchytraeidae  de l’espèce  Enchytraeus albidus  (comme d’autres espèces 
d’enchytrées) peuvent être élevés dans de grandes boîtes en plastique (par exem ­
ple: 30 × 60 × 10 cm ou 20 × 12 × 8 cm, ce qui convient à la culture de vers de petite taille) remplies d’un mélange de sol artificiel et d’une terre de jardin, 
vendue dans le commerce, non contaminée et sans additifs. L’emploi de compost, 
qui risque de contenir des substances toxiques, telles que des métaux lourds, est à éviter. La faune est retirée du sol d’élevage avant usage par triple congélation. Un sol entièrement artificiel est également envisageable, mais le taux de repro ­
duction pourrait être moindre par rapport à celui obtenu avec des substrats 
mixtes. Il convient que le substrat présente un pH de 6,0 ± 0,5. Les vers sont conservés dans un incubateur à une température de 15 ± 2 °C sans lumière. Dans tous les cas, il convient d’éviter une température supérieure à 23 °C. Ce sol 
artificiel/naturel sera humide, mais pas mouillé. Légèrement pressé dans la 
main, il laissera apparaître de petites gouttes d’eau. Dans tous les cas, on évite de créer des conditions anoxiques (si on utilise un couvercle, ce dernier devra comporter un nombre de trous suffisamment élevé pour assurer un échange d’air 
approprié). Il convient d’aérer le sol d’élevage en le remuant délicatement une 
fois par semaine.
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Les vers sont nourris au moins une fois par semaine ad libitum avec des flocons 
d’avoine placés dans une cavité à la surface du sol et recouverte de sol. Si de la 
nourriture reste de la fois précédente, il convient d’ajuster la ration alimentaire à ajouter. Si la nourriture restante est infestée de champignons, elle est remplacée par une nouvelle ration de flocons d’avoine. Pour favoriser la reproduction, les 
flocons d’avoine peuvent être remplacés toutes les deux semaines par une poudre 
protéique du commerce, enrichie en vitamines. Après trois mois, les animaux sont transférés vers un substrat d’élevage fraîchement préparé. Les flocons d’avoine, qui sont conservés dans des récipients hermétiquement fermés, sont 
passés à l’autoclave ou chauffés avant l’emploi afin de prévenir toute infection 
par des acariens de stockage ( Glycyphagus  sp., Astigmata, Acarina, par exemple) 
ou des acariens prédateurs [ Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida, Acarina, 
par exemple]. Une fois désinfectée, la nourriture est moulue de façon à pouvoir 
être facilement parsemée à la surface du sol. Il est également possible de nourrir 
les vers avec de la levure de boulanger ou de la nourriture pour poissons Tetra ­
Min
 ® . 
En règle générale, les conditions d’élevage sont satisfaisantes si les vers ne 
tentent pas de quitter le substrat, se déplacent rapidement dans le sol, présentent 
une surface brillante sur laquelle les particules de sol n’adhèrent pas, ont une 
couleur plus ou moins blanchâtre, et représentent diverses tranches d’âge. On peut considérer que les vers sont sains s’ils se reproduisent continuellement.
 
Références bibliographiques complémentaires  
Achazi R.K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.  
Jänsch S., Amorim M.J.B., Römbke J. (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. 
Reviews 13: 51-83.  
Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., 
Kurnas C.W., Sunahara G.I. (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus 
crypticus  (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with 
the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.  
Römbke J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W. and Graefe U. (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W. and Müller M.C. (1996). Cinematographic documentation of 
enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — FR — 22.03.2014 — 004.001 — 1325