01991R2568 — FR — 20.10.2019 — 032.001

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▼B

RÈGLEMENT (CEE) No 2568/91 DE LA COMMISSION

du 11 juillet 1991

►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄







▼M20

Article premier

1. Sont considérées comme huiles d'olive vierges, au sens du point 1 a), et b) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, les huiles dont les caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, points 1 et 2, du présent règlement.

2. Est considérée comme huile d'olive lampante, au sens du point 1 c) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 3, du présent règlement.

3. Est considérée comme huile d'olive raffinée, au sens du point 2 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 4, du présent règlement.

4. Est considérée comme huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huiles d'olive vierges, au sens du point 3 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 5, du présent règlement.

5. Est considérée comme huile de grignons d'olive brute, au sens du point 4 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 6, du présent règlement.

6. Est considérée comme huile de grignons d'olive raffinée, au sens du point 5 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 7, du présent règlement.

7. Est considérée comme huile de grignons d'olive, au sens du point 6 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 8, du présent règlement.

▼M26

Article 2

1. Les caractéristiques des huiles définies à l'annexe I sont déterminées selon les méthodes d'analyse suivantes:

a) pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcentage d'acide oléique, la méthode figurant à l'annexe II;

b) pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode figurant à l'annexe III;

c) pour la détermination de la teneur en cires, la méthode figurant à l'annexe IV;

d) pour la détermination de la composition et de la teneur en stérols et en diols triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire, la méthode figurant à l’annexe V;

e) pour la détermination du pourcentage de 2-glycéril monopalmitate, la méthode figurant à l’annexe VII;

f) pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode figurant à l'annexe IX;

▼M28

g) pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode figurant à l'annexe X;

▼M26

h) pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode figurant à l'annexe XI;

i) pour l'évaluation des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges, la méthode figurant à l'annexe XII;

j) pour la détermination des stigmastadiènes, la méthode figurant à l'annexe XVII;

k) pour la détermination de la composition des triglycérides à ECN 42, la méthode figurant à l'annexe XVIII;

▼M32

l) pour la détermination de la composition stérolique et de la teneur en stérols et pour la détermination des composés alcooliques, par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire, la méthode définie à l'annexe XIX;

▼M26

m) pour la détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques ou éthyliques d'acides gras, la méthode figurant à l'annexe XX.

▼M28 —————

▼M26

2. La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges est réalisée par des jurys de dégustateurs agréés par les États membres.

Les caractéristiques organoleptiques d'une huile d'olive visée au premier alinéa sont considérées comme conformes à la catégorie d'huile d'olive déclarée, si un jury agréé par l'État membre concerné confirme le classement à cet égard.

▼M32

Dans le cas où le jury ne confirme pas la catégorie déclarée en ce qui concerne les caractéristiques organoleptiques, les autorités nationales ou leurs représentants font procéder sans tarder, à la demande de l'intéressé, à deux contre-analyses par d'autres jurys agréés, dont au moins un est un jury agréé par l'État membre producteur concerné. Les caractéristiques en question sont considérées comme conformes à celles qui sont déclarées si les deux contre-analyses confirment le classement déclaré. Si tel n'est pas le cas, quel que soit le type des irrégularités constatées lors des contre-analyses, le classement est déclaré comme ne correspondant pas aux caractéristiques et les frais des contre-analyses sont à la charge de l'intéressé.

▼M26

3. Pour la vérification des caractéristiques des huiles par les autorités nationales ou leurs représentants suivant les dispositions du paragraphe 1, le prélèvement des échantillons s'effectue conformément aux normes internationales EN ISO 661 et EN ISO 5555 concernant respectivement la préparation des échantillons pour essai et l'échantillonnage. Toutefois, par dérogation au point 6.8 de la norme EN ISO 5555, dans le cas de lots desdites huiles, en conditionnement primaire, le prélèvement des échantillons s'effectue conformément à l'annexe I bis du présent règlement. Dans le cas des huiles en vrac où l’échantillonnage ne peut être réalisé conformément à la norme EN ISO 5555, les échantillons sont prélevés conformément aux instructions fournies par l’autorité compétente de l’État membre.

Sans préjudice des dispositions de la norme EN ISO 5555 et du chapitre 6 de la norme EN ISO 661, les échantillons sont mis à l’abri de la lumière et des fortes chaleurs dans les plus brefs délais et sont envoyés au laboratoire pour les analyses au plus tard le cinquième jour ouvrable suivant celui de leur prélèvement, ou bien sont conservés de manière à éviter leur dégradation ou leur endommagement lors du transport ou du stockage avant d'être envoyés au laboratoire.

4. Aux fins de la vérification prévue au paragraphe 3, les analyses visées aux annexes II, III, IX, XII et XX, ainsi que, le cas échéant, les contre-analyses requises en vertu de la législation nationale, sont effectuées, dans le cas des produits conditionnés, avant la date de durabilité minimale. En cas d'échantillonnage d'huiles en vrac, ces analyses sont effectuées au plus tard le sixième mois suivant celui du prélèvement.

Aucun délai ne s'applique pour les autres analyses prévues par ledit règlement.

Sauf si l'échantillon a été prélevé moins de deux mois avant la date de durabilité minimale, lorsque les résultats des analyses ne correspondent pas aux caractéristiques de la catégorie d'huile d'olive ou de grignons d'olive déclarée, l'intéressé en est informé au plus tard un mois avant la fin du délai visé au premier alinéa.

5. Pour la détermination des caractéristiques des huiles d'olive par les méthodes prévues au paragraphe 1, premier alinéa, les résultats des analyses sont directement comparés avec les limites fixées par le présent règlement.

▼M25

Article 2 bis

1. Aux fins du présent article, on entend par «huile d’olive commercialisée», la quantité totale d’huile d’olive et d’huile de grignons d’olive d’un État membre qui est consommée dans cet État membre ou exportée à partir de cet État membre.

2. Les États membres veillent à ce que des contrôles de conformité soient réalisés de manière sélective, sur la base d’une analyse de risques et à une fréquence appropriée, afin de garantir que l’huile d’olive commercialisée correspond à la catégorie déclarée.

3. Les critères d’évaluation du risque peuvent porter sur:

a) la catégorie de l’huile, la période de production, le prix des huiles par rapport à celui des autres huiles végétales, les opérations de mélange et de conditionnement, les installations et conditions de stockage, le pays d’origine, le pays de destination, le moyen de transport ou le volume du lot;

b) la position des opérateurs dans la chaîne de commercialisation, le volume et/ou la valeur, ainsi que la gamme de catégories d’huiles qu’ils commercialisent, le type d’activité économique menée telle que le pressage, le stockage, le raffinage, le mélange, le conditionnement ou la vente au détail;

c) les constatations faites lors des contrôles précédents, notamment en ce qui concerne le nombre et le type d’irrégularités constatés, la qualité habituelle des huiles commercialisées et le niveau de performance de l’équipement technique utilisé;

d) la fiabilité des systèmes d’assurance qualité des opérateurs ou de leurs systèmes d’autocontrôle, au regard de la conformité aux normes de commercialisation;

e) le lieu où le contrôle est effectué, en particulier s’il s’agit du premier point d’entrée dans l’Union, du dernier point de sortie de l’Union ou du lieu où les huiles sont produites, conditionnées, chargées ou vendues au consommateur final;

f) toute autre information susceptible d’indiquer un risque de non-conformité.

4. Les États membres arrêtent à l’avance:

a) les critères d’évaluation du risque de non-conformité des lots;

b) sur la base d’une analyse des risques portant sur chaque catégorie de risques, le nombre minimal d’opérateurs ou de lots et/ou les quantités minimales qu’il y a lieu de soumettre à un contrôle de conformité.

Au moins un contrôle annuel de conformité est effectué pour mille tonnes d’huile d’olive commercialisée dans l’État membre.

5. Les États membres vérifient la conformité:

a) en procédant, dans n’importe quel ordre, aux analyses prévues à l’annexe I, ou

▼M32

b) dans l'ordre prévu par le diagramme figurant à l'annexe I ter, jusqu'à aboutir à l'une des décisions prévues par ledit diagramme.

▼M19 —————

▼M25

Article 3

Lorsqu’il est constaté qu’une huile ne correspond pas à la description de sa catégorie, les États membres concernés appliquent, sans préjudice d’autres sanctions éventuelles, des sanctions effectives, proportionnées et dissuasives arrêtées en fonction de la gravité de l’irrégularité constatée.

Si les contrôles font apparaître des irrégularités importantes, les États membres renforcent la fréquence des contrôles portant sur le stade de commercialisation, la catégorie de l’huile, son origine ou d’autres critères.

▼M5

Article 4

▼M19

1. Aux fins de l'appréciation et du contrôle par les autorités nationales ou leur représentant des caractéristiques organoleptiques, les États membres peuvent agréer des jurys de dégustateurs.

Les conditions d'agrément sont établies par les États membres, notamment de façon à:

— répondre aux conditions de l'annexe XII, point 4.

— assurer que la formation du chef du jury soit effectuée par un établissement et dans des conditions, reconnus à cet effet par l'État membre.

— soumettre la validité de l'agrément aux résultats des performances obtenues dans le cadre d'un système de contrôle annuel institué par l'État membre.

Chaque État membre communique à la Commission la liste des jurys agréés ainsi que les mesures prises en conformité avec le présent paragraphe.

▼M5

2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer un jury de dégustateurs sur son territoire, il peut recourir à un jury de dégustateurs agréé dans un autre État membre.

3. Chaque État membre établit la liste des jurys de dégustateurs institués par des organisations professionnelles ou interprofessionnelles conformément aux conditions décrites au paragraphe 1 et veille au respect de ces conditions.

▼M19 —————

▼B

Article 6

1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extraction de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 est déterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.

2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcentage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.

▼M20

Article 7

Les dispositions communautaires concernant la présence de contaminants sont applicables.

En ce qui concerne la teneur en solvants halogénés les limites pour toutes les catégories d'huiles d'olive sont les suivantes:

— teneur maximale de chaque solvant halogéné détecté: 0,1 mg/kg,

— teneur maximale de la somme des solvants halogénés détectés: 0,2 mg/kg

▼M25

Article 7 bis

Les personnes et groupes de personnes physiques ou morales qui détiennent, à quelque titre que ce soit, pour l’exercice de leur profession ou à des fins commerciales, de l’huile d’olive et de l’huile de grignons d’olive, depuis le stade de l’extraction au pressoir jusqu’à l’embouteillage inclus, sont tenus de tenir des registres d’entrée et de sortie pour chaque catégorie de ces huiles.

Les États membres veillent à ce que l’obligation prévue au premier paragraphe soit respectée.

▼M25

Article 8

1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures qui mettent en œuvre le présent règlement. Ils informent la Commission de toute modification ultérieure de ces mesures.

2. Le 31 mai de chaque année au plus tard, les États membres transmettent à la Commission un rapport sur l’application du présent règlement au cours de l’année civile écoulée. Ce rapport contient au moins les résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d’olive, présentés suivant les tableaux figurant à l’annexe XXI.

3. Les notifications visées dans le présent règlement sont effectuées conformément au règlement (CE) no 792/2009 de la Commission ( 1 ).

▼B

Article 9

Le règlement (CEE) no 1058/77 est abrogé.

Article 10

1. Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. Toutefois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partir du ►M1 1er novembre 1992 ◄ , sauf en ce qui concerne les opérations liées à l'intervention.

▼M5

Cette méthode ne s'applique pas aux huiles d'olive vierges conditionnées avant le 1er novembre 1992.

▼B

2. Le présent règlement ne s'applique pas aux huiles d'olive et de grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur du présent règlement et commercialisées jusqu'au 31 octobre 1992.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

▼M32









ANNEXES

SOMMAIRE

Annexe I Caractéristiques des huiles d'olive Annexe I bis Échantillonnage des huiles d'olive ou des huiles de grignons d'olive livrées en conditionnement primaire Annexe I ter Diagramme des procédures de vérification de la conformité d'un échantillon d'huile d'olive avec la catégorie déclarée Annexe II Détermination des acides gras libres, méthode à froid Annexe III Détermination de l'indice de peroxyde Annexe IV Détermination de la teneur en cires par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire Annexe VII Détermination du pourcentage de 2-glycéryl monopalmitate Annexe IX Analyse spectrophotométrique dans l'ultraviolet Annexe X Détermination des esters méthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse Annexe XI Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils de l'huile d'olive Annexe XII Méthode du conseil oléicole international pour l'évaluation organoleptique des huiles d'olive vierges Annexe XV Teneur en huile des grignons d'olive Annexe XVI Détermination de l'indice d'iode Annexe XVII Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales Annexe XVIII Détermination de l'écart entre la teneur réelle et la teneur théorique en triglycérides à ECN 42 Annexe XIX Détermination de la composition stérolique, et de la teneur en stérols et de la teneur en composés alcooliques par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire Annexe XX Méthode de détermination de la teneur en cires, en esters méthyliques d'acides gras et en esters éthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire Annexe XXI Résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d'olive visés à l'article 8, paragraphe 2









ANNEXE I

CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE

Caractéristiques de qualité







Catégorie Acidité (%) (*) Indice de peroxyde (mEq O2/kg) K232 K268 ou K270 Delta-K Évaluation organoleptique Esters éthyliques d'acides gras (mg/kg) Médiane du défaut (Md) (*) Médiane du fruité (Mf) 1. Huile d'olive vierge extra ≤ 0,80 ≤ 20,0 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0,0 Mf > 0,0 ≤ 35 2. Huile d'olive vierge ≤ 2,0 ≤ 20,0 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0,0 — 3. Huile d'olive lampante > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Huile d'olive raffinée ≤ 0,30 ≤ 5,0 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — 5. Huile d'olive composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges ≤ 1,00 ≤ 15,0 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — 6. Huile de grignons d'olive brute — — — — — — — 7. Huile de grignons d'olive raffinée ≤ 0,30 ≤ 5,0 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Huile de grignons d'olive ≤ 1,00 ≤ 15,0 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) La médiane du défaut peut être inférieure ou égale à 3,5 lorsque la médiane du fruité est égale à 0,0.

Caractéristiques de pureté







Catégorie Composition en acides gras (1) Somme des isomères transoléiques (%) Somme des isomères translinoléiques + translinoléniques (%) Stigmastadiènes (mg/kg) (2) Écart: ECN42 (CLHP) et ECN42 (calcul théorique) 2-glycéril monopalmitate (%) Myristique (%) Linolénique (%) Arachidique (%) Eicosénoïque (%) Béhénique (%) Lignocérique (%) 1. Huile d'olive vierge extra ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ |0,20| ≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 % ≤ 1,0 si acide palmitique total en % > 14,00 % 2. Huile d'olive vierge ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ |0,20| ≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 % ≤ 1,0 si acide palmitique total en % > 14,00 % 3. Huile d'olive lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ≤ |0,30| ≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 % ≤ 1,1 si acide palmitique total en % > 14,00 % 4. Huile d'olive raffinée ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ≤|0,30| ≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 % ≤ 1,1 si acide palmitique total en % > 14,00 % 5. Huile d'olive composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ≤ |0,30| ≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 % ≤ 1,0 si acide palmitique total en % > 14,00 % 6. Huile de grignons d'olive brute ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ≤ |0,60| ≤ 1,4 7. Huile de grignons d'olive raffinée ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ≤ |0,50| ≤ 1,4 8. Huile de grignons d'olive ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ≤ |0,50| ≤ 1,2 (1) Teneur en autres acides gras (%): palmitique: 7,50-20,00; palmitoléique: 0,30-3,50; heptadécanoïque: ≤ 0,40; heptadécénoïque ≤ 0,60; stéarique: 0,50-5,00; oléique: 55,00-83,00; linoléique: 2,50-21,00. (2) Sommes des isomères qui pourraient (ou ne pourraient pas) être séparés par colonne capillaire.







Catégorie Composition en stérols Stérols totaux (mg/kg) Érythrodiol et uvaol (%) (*) Cires mg/kg (**) Cholestérol (%) Brassicastérol (%) Campestérol (1) (%) Stigmastérol (%) β-sitostérol apparent (2) (%) Delta-7-stigmasténol (1) (%) 1. Huile d'olive vierge extra ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Huile d'olive vierge ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Huile d'olive lampante ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) 4. Huile d'olive raffinée ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Huile d'olive composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Huile de grignons d'olive brute ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (4) 7. Huile de grignons d'olive raffinée ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Huile de grignons d'olive ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (1) Voir l'appendice de la présente annexe. (2) β-sitostérol app.: delta-5,23-stigmastadiénol+clérostérol+bêta-sitostérol+sitostanol+delta-5-avenastérol+delta-5,24-stigmastadiénol. (3) Les huiles ayant une teneur en cires comprise entre 300 mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles d'olive lampantes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est inférieure ou égale à 350 mg/kg, ou si leur teneur en érythrodiol et en uvaol est inférieure ou égale à 3,5 %. (4) Les huiles ayant une teneur en cires comprise entre 300 mg/kg et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles de grignons d'olive brutes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est supérieure à 350 mg/kg et si leur teneur en érythrodiol et en uvaol est supérieure à 3,5 %.

Remarques:

a) Les résultats des analyses doivent être exprimés en indiquant le même nombre de décimales que ceux prévus pour chaque caractéristique. Le dernier chiffre doit être augmenté d'une unité si le chiffre suivant dépasse 4.

b) Il suffit qu'une seule caractéristique ne corresponde pas aux valeurs indiquées pour que l'huile change de catégorie ou soit déclarée non conforme aux fins du présent règlement.

c) Pour l'huile d'olive lampante, les deux caractéristiques de qualité marquées d'un astérisque (*) peuvent différer simultanément des limites définies pour cette catégorie.

d) Les caractéristiques marquées de deux astérisques (**) indiquent, pour l'huile de grignons d'olive brute, qu'il est possible que les deux limites applicables diffèrent simultanément des valeurs indiquées. Pour l'huile de grignons d'olive et l'huile de grignons d'olive raffinée, l'une des limites applicables peut différer des valeurs indiquées.









Appendice

Schémas décisionnels

Schéma décisionnel relatif au campestérol pour les huiles d'olive vierges et les huiles d'olive vierges extra:

Les autres paramètres sont conformes aux limites définies dans le présent règlement.

Schéma décisionnel relatif au delta-7-stigmasténol pour:

— les huiles d'olive vierges et les huiles d'olive vierges extra —

Les autres paramètres sont conformes aux limites définies dans le présent règlement.

— les huiles de grignons d'olive (brutes et raffinées) —

Les autres paramètres sont conformes aux limites définies dans le présent règlement.

▼M26









ANNEXE I bis

ÉCHANTILLONNAGE DES HUILES D'OLIVE OU DES HUILES DE GRIGNONS D'OLIVE LIVRÉES EN CONDITIONNEMENT PRIMAIRE

La présente méthode d’échantillonnage s’applique aux lots d’huile d’olive ou de grignons d’olive en conditionnement primaire. Des méthodes d’échantillonnage différentes s’appliquent selon que le conditionnement primaire dépasse ou non 5 litres.

On entend par «lot», un ensemble d'unités de vente qui sont produites, fabriquées et conditionnées dans des circonstances telles que l'huile contenue dans chacune de ces unités de vente est considérée comme homogène pour toutes les caractéristiques analytiques. L'individualisation d’un lot doit être réalisée conformément à la directive 2011/91/UE du Parlement européen et du Conseil ( 2 ).

On entend par «prélèvement élémentaire», la quantité d’huile contenue dans un conditionnement primaire et prélevée en un point aléatoire du lot.

1. CONTENU D'UN ÉCHANTILLON ÉLÉMENTAIRE

1.1. Conditionnement primaire ne dépassant pas 5 litres

on entend par «échantillon élémentaire», dans le cas d'un conditionnement primaire ne dépassant pas 5 litres, le nombre de prélèvements élémentaires effectués sur un lot et conformes au tableau 1.







Tableau 1 Taille minimale des prélèvements élémentaires Si le conditionnement primaire a une capacité L'échantillon primaire doit être constitué de l'huile provenant de a) égale ou supérieure à 1 litre a) 1 conditionnement primaire; b) inférieure à 1 litre b) le nombre minimal de conditionnements donnant une capacité totale d’au moins 1,0 litre

Le nombre de conditionnements visé au tableau 1, constituant un échantillon primaire, peut être augmenté par chaque État membre, en fonction de ses propres besoins (par exemple, évaluation organoleptique réalisée par un laboratoire différent de celui qui a effectué les analyses chimiques, les contre-analyses, etc.).

1.2. Conditionnement primaire de plus de 5 litres

On entend par «échantillon élémentaire», dans le cas d'un conditionnement primaire de plus de 5 litres, une partie représentative de l'ensemble des prélèvements élémentaires, obtenue par un processus de réduction et conforme au tableau 2. L’échantillon élémentaire doit être composé de plusieurs exemplaires.

On entend par «exemplaire» d’un échantillon élémentaire, chacun des conditionnements composant l’échantillon élémentaire.







Tableau 2 Nombre minimal de prélèvements élémentaires à sélectionner Nombre de conditionnements compris dans le lot Nombre minimal de prélèvements élémentaires à sélectionner Jusqu’à 10 1 Entre … 11 et 150 2 Entre … 151 et 500 3 Entre … 501 et 1 500 4 Entre … 1 501 et 2 500 5 > 2 500 pour 1 000 conditionnements 1 prélèvement élémentaire supplémentaire

Afin de réduire le volume d'échantillonnage des conditionnements primaires, le contenu des prélèvements élémentaires est homogénéisé pour préparer l’échantillon élémentaire. Les fractions des différents prélèvements élémentaires sont versées dans un même conteneur en vue d'une homogénéisation par agitation, de façon à garantir une protection optimale contre l'air.

Le contenu de l'échantillon élémentaire doit être versé dans une série de conditionnements d'une capacité minimale de 1,0 litre, constituant chacun un exemplaire de l’échantillon élémentaire.

Le nombre d'échantillons élémentaires peut être augmenté par chaque État membre, en fonction de ses propres besoins (par exemple, évaluation organoleptique réalisée par un laboratoire différent de celui qui a effectué les analyses chimiques, les contre-analyses, etc.).

Chaque conditionnement doit être rempli de manière à réduire au minimum la couche d’air superficielle, puis convenablement fermé et scellé afin de protéger le produit contre toute falsification.

Ces exemplaires doivent être étiquetés afin de permettre leur identification.

2. ANALYSES ET RÉSULTATS

▼M32

2.1. Chaque échantillon élémentaire doit être subdivisé en échantillons de laboratoire, conformément au point 2.5 de la norme EN ISO 5555, puis soumis à des analyses dans l'ordre indiqué par le diagramme figurant à l'annexe I ter ou dans un ordre aléatoire.

▼M26

2.2. Lorsque tous les résultats des analyses concordent avec les caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot est déclaré conforme.

Il suffit qu'un seul résultat d'analyse ne concorde pas avec les caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée pour que l'ensemble du lot soit déclaré non conforme.

3. VÉRIFICATION DE LA CATÉGORIE DU LOT

3.1. Afin de vérifier la catégorie du lot, l’autorité compétente peut augmenter le nombre d’échantillons élémentaires prélevés en différents points du lot conformément au tableau suivant:







Tableau 3 Nombre d'échantillons élémentaires, déterminé par la taille du lot Taille du lot (en litres) Nombre d'échantillons élémentaires moins de 7 500 2 entre 7 500 et moins de 25 000 3 entre 25 000 et moins de 75 000 4 entre 75 000 et moins de 125 000 5 125 000 et plus 6 + 1 tous les 50 000 litres supplémentaires

Chaque prélèvement élémentaire constituant un échantillon élémentaire doit être prélevé au même endroit dans le lot; il est nécessaire de relever l'emplacement de chaque échantillon élémentaire et de repérer celui-ci sans ambiguïté.

Chaque échantillon élémentaire doit être constitué conformément aux procédures visées aux points 1.1 et 1.2.

Chaque échantillon élémentaire est ensuite soumis aux analyses visées à l’article 2, paragraphe 1.

3.2. Lorsqu’un des résultats des analyses visées à l’article 2, paragraphe 1, d’au moins un échantillon élémentaire ne correspond pas aux caractéristiques de la catégorie d’huile déclarée, l’ensemble du lot est déclaré non conforme.

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ANNEXE I ter

DIAGRAMME DES PROCÉDURES DE VÉRIFICATION DE LA CONFORMITÉ D'UN ÉCHANTILLON D'HUILE D'OLIVE AVEC LA CATÉGORIE DÉCLARÉE

Tableau général

Tableau 1 — Huile d'olive vierge extra — Critères de qualité

Tableau 2 – Huile d'olive vierge – Critères de qualité

Tableau 3 — Huile d'olive vierge extra et huile d'olive vierge — Critères de pureté

Tableau 4 – Huile d'olive lampante – Critères de pureté

Tableau 5 – Huile d'olive raffinée – Critères de qualité

Tableau 6 – Huile d'olive (constituée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges) – critères de qualité

Tableau 7 – Huile d'olive raffinée et huile d'olive constituée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges – critères de pureté

Tableau 8 – Huile de grignons d'olive brute – Critères de pureté

Tableau 9 – Huile de grignons d'olive raffinée – Critères de qualité

Tableau 10 – Huile de grignons d'olive – Critères de qualité

Tableau 11 — Huile de grignons d'olive raffinée et huile de grignons d'olive — Critères de pureté

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ANNEXE II

DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS LIBRES, MÉTHODE À FROID

1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION

Cette méthode décrit la détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive et les huiles de grignons d'olive. La teneur en acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée en pourcentage de l'acide oléique.

2. PRINCIPE

Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution d'hydroxyde de potassium ou d'hydroxyde de sodium.

3. RÉACTIFS

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.

3.1. Éther diéthylique; oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume. Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydroxyde de potassium (3.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de phénolphtaléine (3.3) pour 100 millilitres de mélange. Note 1: l'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions particulières. Note 2: s'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si nécessaire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.

3.2. Hydroxyde de potassium ou hydroxyde de sodium, solution éthanolique titrée ou solution aqueuse, c(KOH) [ou c(NaOH)] – 0,1 mole par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) [ou c(NaOH)] – 0,5 mole par litre environ. Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi. La concentration exacte de la solution d'hydroxyde de potassium (ou de solution d'hydroxyde de sodium) doit être connue et vérifiée avant l'emploi. Utiliser une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solution doit être incolore ou jaune paille. Si une séparation de phases est observée en utilisant une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium), remplacer la solution aqueuse par une solution éthanolique. Note 3: une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) peut être préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol ou d'eau avec 8 grammes d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) et 0,5 gramme de rognures d'aluminium. Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité requise d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium). Laisser reposer durant plusieurs jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbonate de potassium (ou du carbonate de sodium). La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon suivante: à 1 000 millilitres d'éthanol (ou d'eau), ajouter 4 millilitres de butylite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité requise d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium). Cette solution est prête pour l'emploi.

3.3. Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V) ou bleu alcalin 6B ou thymolphtaléine, solution à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V). Dans le cas d'huiles fortement colorées, du bleu alcalin ou de la thymolphthaléine doit être utilisé.

4. APPAREILLAGE

Matériel courant de laboratoire, et notamment:

4.1. Balance analytique

4.2. Fiole conique de 250 millilitres de capacité

4.3. Burette de 10 millilitres de capacité classe A, graduée en 0,05 millilitre, ou burette automatique équivalente.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de l'échantillon pour essai

Lorsque l'échantillon est trouble, il doit être filtré.

5.2. Prise d'essai

Prélever une prise d'essai, selon l'acidité présumée, d'après les indications du tableau suivant.







Acidité attendue (acidité oléique en g/100 g) Masse de la prise d'essai (en g) Précision de la pesée de la prise d'essai (en g) 0 à 2 10 0,02 > 2 à 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Peser la prise d'essai dans la fiole conique (4.2).

5.3. Détermination

Dissoudre la prise d'essai (5.2) dans 50 à 100 millilitres du mélange oxyde diéthylique/éthanol (3.1), préalablement neutralisé.

Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) à 0,1 mole par litre (3.2) (voir note 4) jusqu'à virage de l'indicateur (la couleur de l'indicateur persistant durant au moins 10 secondes).

Note 4: si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) à 0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à 0,5 mole par litre ou modifier la masse de l'échantillon en fonction de l'acidité libre escomptée et du tableau proposé.

Note 5: si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une quantité suffisante du mélange de solvants (3.1) pour donner une solution claire.

Effectuer une deuxième détermination uniquement si le premier résultat est supérieur à la valeur limite spécifiée pour la catégorie de l'huile.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

L'acidité, exprimée en pourcentage d'acide oléique, en poids, est égale à:

dans laquelle:

V = volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) utilisée;

c = concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) utilisée;

M = 282 g/mol, masse molaire, en grammes par mole, de l'acide oléique;

m = masse de la prise d'essai, en grammes.

L'acidité oléique est déclarée comme suit:

a) à la deuxième décimale pour les valeurs allant de 0 à 1 compris;

b) à la première décimale pour les valeurs allant de 1 à 100 compris.

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ANNEXE III

DÉTERMINATION DE L'INDICE DE PEROXYDE

1. Champ d'application

La présente annexe décrit une méthode de détermination de l'indice de peroxyde dans les huiles et matières grasses animales et végétales.

2. Définition

L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon (exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.

3. Principe

La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré avec une solution de thiosulfate de sodium.

4. Appareillage

Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances oxydantes ou réductrices.

Nota bene: ne pas graisser les surfaces rodées.

4.1. Cuiller en verre de 3 millilitres.

4.2. Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence, dioxyde de carbone).

4.3. Burette d'une capacité de 5, 10 ou 25 millilitres, avec graduations de 0,05 millilitre au minimum, de préférence avec mise à zéro automatique, ou burette automatique équivalente.

4.4. Balance analytique.

5. Réactifs

5.1. Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

5.2. Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

5.3. Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente, exempte d'iode et d'iodates. Dissoudre environ 14 g d'iodure de potassium dans environ 10 ml d'eau à température ambiante.

5.4. Solution aqueuse de thiosulfate de sodium à 0,01 mole par litre (équivalant à 0,01 N), soigneusement normalisée juste avant l'emploi.

Préparer, chaque jour et avant emploi, la nouvelle solution de thiosulfate de sodium à 0,01 mole par litre à partir d'une solution étalon de thiosulfate de sodium à 0,1 mole par litre, ou déterminer la molarité exacte. Comme l'expérience le montre, la stabilité est limitée et dépend de la valeur du pH et de la teneur en dioxyde de carbone libre. Pour la dilution, utiliser exclusivement de l'eau fraîchement portée à ébullition, éventuellement purgée à l'azote.

La procédure suivante est recommandée pour déterminer la molarité exacte de la solution de thiosulfate de sodium:

peser, à 0,001 g près, 0,27 g à 0,33 g d'iodate de potassium (mKIO3) dans une fiole jaugée (de 250 ml ou 500 ml) et compléter au volume avec de l'eau fraîchement portée à ébullition (V2), refroidie à température ambiante. Au moyen d'une pipette, transvaser 5 ml ou 10 ml de cette solution d'iodate de potassium (V1) dans un Erlenmeyer de 250 ml. Ajouter 60 ml d'eau fraîchement portée à ébullition, 5 ml d'acide chlorhydrique à 4 moles par litre, et 25 à 50 mg d'iodure de potassium ou 0,5 ml de la solution aqueuse saturée d'iodure de potassium. Titrer ensuite cette solution avec la solution de thiosulfate de sodium (V3) pour déterminer la molarité exacte de celle-ci.

où:

mKIO3 est la masse d'iodate de potassium, en grammes

V1 est le volume de la solution d'iodate de potassium, en millilitres (5 ml ou 10 ml)

V2 est le volume total de la solution d'iodate de potassium, en millilitres (250 ml ou 500 ml)

V3 est le volume de la solution de thiosulfate de sodium, en millilitres

wKIO3 est la pureté de l'iodate de potassium, en grammes/100 g

MKIO3 est la masse moléculaire de l'iodate de potassium (214 g/mol)

T désigne la molarité exacte de la solution de thiosulfate de sodium (mol/l).

5.5. Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment préparée à partir d'amidon naturel soluble. Des réactifs équivalents peuvent également être utilisés.

6. Échantillon

Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière, conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entièrement et fermés hermétiquement à l'aide de bouchons de liège ou de verre rodé.

7. Mode opératoire

L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou artificielle. Dans une cuiller en verre (4.1) ou, à défaut, dans une fiole (4.2), peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le tableau ci-après,en fonction de l'indice de peroxyde prévu.







Indice de peroxyde prévu (en meq) Poids de la prise d'essai (en g) de 0 à 12 de 5,0 à 2,0 de 12 à 20 de 2,0 à 1,2 de 20 à 30 de 1,2 à 0,8 de 30 à 50 de 0,8 à 0,5 de 50 à 90 de 0,5 à 0,3

Déboucher une fiole (4.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (5.1). Dissoudre rapidement la prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (5.2) puis 1 millilitre de solution d'iodure de potassium (5.3). Remettre le bouchon rapidement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5 minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 °C.

Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la solution de thiosulfate de sodium (5.4) en agitant vigoureusement et en employant la solution d'amidon (5.5) comme indicateur.

Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.

Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier excède 0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium 0,01 N (5.4), remplacer les réactifs impurs.

8. Expression des résultats

L'indice de peroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme, est fourni par la formule:

où:

V = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium normalisée (5.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de l'essai à blanc;

T = molarité exacte de la solution de thiosulfate de sodium utilisée (5.4), en mol/l.

m = poids (en grammes) de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.

Indiquer le résultat de la détermination à la première décimale.

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ANNEXE IV

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN CIRES AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

Cette méthode décrit un procédé pour la détermination de la teneur en cires des huiles d’olive. Les cires sont séparées en fonction du nombre d’atomes de carbone. La méthode peut être employée notamment pour différencier l’huile d’olive de pression de celle d’extraction (huile de grignons).

2. PRINCIPE

La matière grasse, additionnée d’un étalon interne approprié, est fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté; la fraction éluée en premier dans les conditions de l’essai (à polarité inférieure à celle des triglycérides) est récupérée puis analysée directement par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. MATÉRIEL

3.1. Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Colonne en verre pour chromatographie en phase gazeuse, diamètre intérieur 15,0 mm, hauteur 30 à 40 cm, équipée d’un robinet.

3.3. Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié pour le fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d’un système d’introduction directe dans la colonne, constitué par: 3.3.1. Chambre à thermostat pour les colonnes, équipée d’un programmateur de température. 3.3.2. Injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne. 3.3.3. Révélateur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur. 3.3.4. Enregistreur-intégrateur approprié pour le fonctionnement avec le convertisseur-amplificateur (3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et vitesse de déroulement du papier variable. (Il est également possible d’utiliser des systèmes informatisés qui prévoient l’acquisition des données de chromatographie en phase gazeuse au moyen d’un PC.) 3.3.5. Colonne capillaire en verre ou silice fondue, longueur 8 à 12 m, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l’intérieur de liquide de répartition, à l’épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm. (Liquides de répartition adaptés à l’emploi, du type SE52 ou SE 54 dans le commerce.)

3.4. Microseringue pour introduction directe dans la colonne de 10 μl, équipée d’une aiguille cémentée.

3.5. Vibrateur électrique.

3.6. Évaporateur rotatif.

3.7. Four à moufle.

3.8. Balance analytique garantissant une précision de la mesure de ± 0,1 mg.

3.9. Verrerie normale de laboratoire.

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice d’une granulométrie comprise entre 60 et 200 μm. Le gel de silice doit être placé dans le four à 500 °C pendant au moins 4 heures. Après refroidissement, y ajouter 2 % d’eau par rapport à la quantité de gel de silice prélevée. Agiter convenablement afin d’homogénéiser la masse. Conserver à l’obscurité pendant au moins 12 heures avant emploi.

4.2. n-hexane, pour chromatographie.

4.3. Éther éthylique, pour chromatographie.

4.4. n-Heptane, pour chromatographie.

4.5. Solution étalon d’arachidate laurique, solution à 0,1 % (m/V) dans l’hexane (étalon interne). (Il est également possible d’utiliser du palmitate de palmityle ou du stéarate de myristyle) 4.5.1. Soudan 1 (1-phenyl-azo-2-naphthol).

4.6. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.7. Gaz auxiliaires: — hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse, — air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de la colonne chromatographique

Suspendre 15 g de gel de silice (4.1) dans le n-hexane (4.2) et l’introduire dans la colonne (3.2). Après tassement spontané, le compléter à l’aide d’un agitateur électrique (3.5) pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Percoler 30 ml de n-hexane afin d’éliminer les impuretés éventuelles. Peser exactement à l’aide de la balance (3.8) 500 mg de l’échantillon dans l’Erlenmeyer de 25 ml (3.1), ajouter la quantité appropriée d’étalon interne (4.5), en fonction du contenu présumé de cires. Par exemple, ajouter 0,1 mg d’arachidate laurique dans le cas de l’huile d’olive et 0,25 à 0,5 mg dans le cas de l’huile de grignons. Transférer l’échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatographique à l’aide de deux portions de 2 ml chacune de n-hexane (4.2).

Laisser s’écouler le solvant jusqu’à 1 mm au-dessus du niveau supérieur de l’absorbant puis percoler 70 ml de n-hexane supplémentaires afin d’éliminer les n-alcanes naturellement présents. Commencer alors l’élution chromatographique en recueillant 180 ml du mélange n-hexane/éther éthylique, rapport 99:1, tout en respectant un débit d’environ 15 gouttes toutes les 10 secondes. L’élution de l’échantillon doit être effectuée à une température ambiante de 22 °C ± 4.

Notes:

— Le mélange n-hexane/éther éthylique (99:1) doit être préparé chaque jour.

— Pour contrôler visuellement l’élution correcte des cires, il est possible d’ajouter à l’échantillon en solution 100 μl de soudan à 1 % dans le mélange d’élution. Le colorant ayant une rétention intermédiaire entre les cires et les triglycérides, lorsque la coloration atteint le fonds de la colonne chromatographique, il convient de suspendre l’élution car toutes les cires ont été éluées.

La fraction ainsi obtenue est séchée dans l’évaporateur rotatif (3.6) jusqu’à élimination pratiquement totale du solvant. Les deux derniers ml du solvant sont éliminés à l’aide d’un faible courant d’azote; ajouter ensuite 2-4 ml de n-heptane

5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.2.1. Opérations préliminaires

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse (3.3), en branchant le terminal d’entrée au système «on-column» et le terminal de sortie au révélateur. Effectuer les contrôles généraux de l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse (tenue des circuits des gaz, efficience du révélateur et du système d’enregistrement, etc.).

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est recommandé de procéder à son conditionnement. Laisser s’écouler un léger débit de gaz à travers la colonne, puis allumer l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse. Chauffer graduellement jusqu’à atteindre, au bout d’environ 4 heures, une température de 350 °C. Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis procéder au réglage de l’appareillage aux conditions de fonctionnement [réglage du débit des gaz, allumage de la flamme, branchement à l’enregistreur électronique (3.3.4), réglage de la température de la chambre pour la colonne, du révélateur, etc.] et enregistrer le signal à une sensibilité au moins 2 fois supérieure à celle prévue pour l’exécution de l’analyse. Le tracé de la ligne de base doit être linéaire, exempt de pics de toute nature, et ne doit pas présenter de déviation.

Une déviation rectiligne négative indique une tenue imparfaite des connexions de la colonne; une déviation positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

5.2.2. Choix des conditions opératoires

D’une manière générale, les conditions opératoires à observer sont les suivantes:

— température de la colonne: —



20 °C/minute 5 °C/minute 20 °C/minute au départ 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— température du révélateur: 350 °C,

— quantité de matière injectée: 1 μl de la solution (2-4 ml) de n-heptane,

— gaz vecteur: hélium ou hydrogène à la vitesse linéaire optimale pour le gaz sélectionné (voir appendice),

— sensibilité instrumentale: en mesure de répondre aux conditions ci-dessous:

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et de l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, de manière à obtenir une séparation de toutes les cires, une résolution satisfaisante des pics (voir figure) et un temps de rétention de l’étalon interne C32 qui doit être de 18 ± 3 minutes. Le pic des cires le plus représentatif doit avoir mesuré au moins 60 % du fond de l’échelle.

Les paramètres d’intégration des pics doivent être déterminés de façon à obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.

Note:Vu la température finale élevée, on admet une dérive positive qui de doit pas être supérieure à 10 % du fonds de l’échelle.

5.3. Exécution de l’analyse

Prélever 1 μl de la solution à l’aide de la microseringue de 10 μl; retirer le piston de la seringue de manière à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l’aiguille dans le dispositif d’injection et, après 1-2 secondes, injecter rapidement; au bout d’environ 5 secondes, extraire lentement l’aiguille.

Effectuer l’enregistrement jusqu’à élution complète des cires.

La ligne de base doit toujours répondre aux conditions requises.

5.4. Identification des pics

L’identification des différents pics doit être effectuée à partir des temps de rétention et par comparaison avec des mélanges de cires aux temps de rétention connus, analysés dans les mêmes conditions.

La figure ci-après représente un chromatogramme des cires d’une huile d’olive vierge.

5.5. Évaluation quantitative

Procéder au calcul des aires des pics de l’étalon interne et des esters aliphatiques de C40 à C46 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur en cires de chacun des esters, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

Où:

Ax = aire du pic de chaque ester, en millimètres carrés;

As = aire du pic de l’étalon interne, en millimètres carrés;

ms = masse d’étalon interne ajoutée, en milligrammes;

m = masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Indiquer la somme des teneurs des différentes cires de C40 à C46, en mg/kg de matière grasse (ppm).

Note:Les composants à quantifier font référence aux pics à nombre de carbone paires compris entre les esters C40 et C46, selon l’exemple de chromatogramme des cires de l’huile d’olive reporté dans la figure ci-après. Si l’ester C46 apparaît en double, il est conseillé, pour l’identifier, d’analyser la fraction des cires d’une huile de grignons d’olive où le pic C46 est facilement identifiable car nettement majoritaire.

Les résultats sont exprimés avec une décimale.

Figure

Chromatogramme des cires d’une huile d’olive ( 3 )

Légende:

I.S. = Arachidate laurique

1. = Esters diterpéniques

2 + 2′ = Esters C40

3 + 3′ = Esters C42

4 + 4′ = Esters C44

5. = Esters C46

6. = Esters stérols et alcool triterpéniques









APPENDICE

Détermination de la vitesse linéraire du gaz

Injecter de 1 à 3 μl de méthane (ou propane) dans l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, après son réglage aux conditions opératoires normales. Chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, à partir du moment de son injection jusqu'au moment de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire, en cm/s, est donnée par la formule L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

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ANNEXE VII

DÉTERMINATION DU POURCENTAGE DU 2-GLYCÉRIL MONOPALMITATE

1. OBJET ET DOMAINE D’APPLICATION

Cette méthode décrit la procédure analytique pour la détermination du pourcentage d’acide palmitique en position 2 des triglycérides au moyen de l’évaluation du 2-glycéril monopalmitate.

Cette méthode est applicable aux huiles végétales liquides à température ambiante (20 °C).

2. PRINCIPE

Après préparation, l’échantillon d’huile est soumis à l’action de la lipase pancréatique: une hydrolyse partielle et spécifique dans les positions 1 et 3 de la molécule de triglycéride entraîne l’apparition des monoglycérides en position 2. Le pourcentage de 2-glycéril monopalmitate dans la fraction monoglycéridique est déterminé, après silylation, par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE ET MATÉRIEL COURANT

3.1. Erlenmeyer, 25 ml

3.2. Béchers 100, 250 et 300 ml

3.3. Colonne en verre pour chromatographie, diamètre intérieur 21-23 mm, longueur 400 mm, équipée d’une plaque en verre fritté et d’un robinet

3.4. Éprouvettes graduées de 10, 50, 100 et 200 ml

3.5. Ballons de 100 et 250 ml

3.6. Évaporateur rotatif

3.7. Tubes de centrifugeuse à fond conique de 10 ml, avec bouchon rodé

3.8. Centrifugeuse pour des tubes de 10 et 100 ml

3.9. Thermostat permettant de maintenir la température à 40 ± 0,5 °C

3.10. Pipettes graduées de 1 et 2 ml

3.11. Seringue hypodermique de 1 ml

3.12. Microseringue de 100 μl

3.13. Entonnoir, 1 000 ml

3.14. Chromatographe en phase gazeuse pour colonnes capillaires, équipé d’un dispositif d’injection «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne et d’un four susceptible de maintenir la température choisie à 1 °C près

3.15. Injecteur «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne

3.16. Détecteur à ionisation de flamme et électromètre

3.17. Enregistreur-intégrateur adapté à l’électromètre avec une vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et une vitesse variable de déroulement du papier

3.18. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue de 8 à 12 mètres, d’un diamètre intérieur de 0,25 à 0,32 mm, recouverte de methylpolysiloxane ou de phényl méthylpolysiloxane 5 %, d’une épaisseur de 0,10-0,30 μm, pouvant être utilisée à 370 °C

3.19. Microseringue de 10 μl munie d’une aiguille cémentée, d’au moins 7,5 cm de long, pour injection directe sur colonne

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice ayant une granulométrie comprise entre 0,063 et 0,200 mm (70/280 mesh), préparé comme suit: mettre le gel de silice dans une capsule de porcelaine, sécher à l’étuve à 160 °C pendant 4 heures, puis laisser refroidir à température ambiante dans un dessiccateur. Ajouter un volume d’eau équivalent à 5 % du poids du gel de silice, comme suit: dans un Erlenmeyer de 500 ml, peser 152 g de gel de silice et ajouter 8 g d’eau distillée, boucher et agiter délicatement pour obtenir une répartition uniforme de l’eau. Laisser reposer au moins 12 heures avant l’emploi.

▼M32

4.2. n-hexane (pour chromatographie). L'hexane peut être remplacé par de l'iso-octane (2,2,4-triméthylpentane dans la chromatographie), à condition que des valeurs de précision comparables puissent être obtenues.

▼M21

4.3. Isopropanol

4.4. Isopropanol, solution aqueuse 1/1 (V/V)

4.5. Lipase pancréatique. La lipase utilisée doit avoir une activité comprise entre 2,0 et 10 unités de lipase par mg. (Il existe dans le commerce des lipases pancréatiques ayant une activité comprise entre 2 et 10 unités par mg d’enzyme.)

4.6. Solution tampon de tris-hydroxy-méthylaminométhane: solution aqueuse 1 M amenée jusqu’à pH 8 (contrôle potentiométrique) par du HCI concentré (1/1 V/V)

4.7. Cholate de sodium, qualité enzymatique, solution aqueuse à 0,1 % (cette solution doit être utilisée dans les 15 jours suivant sa préparation)

4.8. Chlorure de calcium, solution aqueuse à 22 %

4.9. Éther diéthylique pour chromatographie

4.10. Solvant de développement: mélange n-hexane/éther diéthylique (87/13) (V/V)

4.11. Hydroxyde de sodium, solution à 12 % en poids

4.12. Phénolphtaléine, solution à 1 % dans l’éthanol

4.13. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium, pour chromatographie en phase gazeuse

4.14. Gaz auxiliaires: hydrogène, à 99 % minimum, exempt d’humidité et de substances organiques; et air, pour chromatographie en phase gazeuse de la même pureté

4.15. Réactif de silanisation: mélange pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V). (Des solutions prêtes à l'emploi existent dans le commerce. D’autres réactifs de silylation peuvent être employés, notamment bis-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilués avec un volume identique de pyridine anhydre.)

4.16. Échantillons de référence: monoglycérides purs ou mélanges de monoglycérides ayant une composition en pourcentage connue similaire à celle de l’échantillon.

5. PROCÉDURE

5.1. Préparation de l’échantillon

5.1.1. Les huiles ayant une acidité libre inférieure à 3 % n’ont pas besoin d’être neutralisées avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Les huiles ayant une acidité libre supérieure à 3 % devront être soumises à la neutralisation conformément au point 5.1.1.1. 5.1.1.1. Dans l’entonnoir de 1 000 ml (3.13), verser 50 g d’huile et 200 ml de n-hexane. Ajouter 100 ml d’isopropanol et une quantité de la solution d’hydroxyde de sodium à 12 % (4.11) correspondant à l’acidité libre de l’huile majorée de 5 %. Agiter énergiquement pendant une minute. Ajouter 100 ml d’eau distillée, agiter de nouveau et laisser reposer. Après décantation, éliminer la couche inférieure contenant les savons. Éliminer les éventuelles couches intermédiaires (mucilage et substances insolubles). Laver la solution hexanique de l’huile neutralisée avec des portions successives de 50-60 ml de la solution isopropanol/eau 1/1 (V/V) (4.4) jusqu’à disparition de la coloration rosée de la phénolphtaléine. Éliminer la plus grande partie de l’hexane par distillation sous vide (utiliser par exemple un évaporateur rotatif) et transférer l’huile dans un ballon de 100 ml (3.5). Sécher l’huile sous vide jusqu’à élimination totale du solvant. À la fin de cette opération, l’acidité de l’huile doit être inférieure à 0,5 %.

5.1.2. Introduire 1,0 g d’huile préparée comme indiqué ci-dessus dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1) et dissoudre dans 10 ml de mélange de développement (4.10). Laisser reposer la solution pendant au moins 15 minutes avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Si la solution est trouble, la centrifuger pour garantir des conditions optimales pour la chromatographie. (Des cartouches de gel de silice SPE de 500 mg prêtes à l’emploi peuvent être utilisées.)

5.1.3. Préparation de la colonne chromatographique Verser dans la colonne (3.3) environ 30 ml du solvant de développement (4.10), introduire un morceau de coton dans la partie inférieure de la colonne à l’aide d’une baguette de verre; presser pour éliminer l’air. Dans un bécher, préparer une suspension de 25 g de gel de silice (4.1) dans environ 80 ml de solvant de développement et le verser dans la colonne à l’aide d’un entonnoir. Vérifier que tout le gel de silice a été introduit dans la colonne; laver avec le solvant de développement (4.10), ouvrir le robinet et laisser le niveau du liquide atteindre environ 2 mm au-dessus du niveau supérieur du gel de silice.

5.1.4. Chromatographie sur colonne Dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1), peser exactement 1,0 g d’échantillon préparé conformément au point 5.1. Dissoudre l’échantillon dans 10 ml de solvant de développement (4.10). Verser la solution dans la colonne chromatographique préparée conformément au point 5.1.3. Éviter de remuer la surface de la colonne. Ouvrir le robinet et laisser s’écouler la solution de l’échantillon jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau du gel de silice. Développer avec 150 ml de solvant de développement. Ajuster le débit à 2 ml/min (de façon à ce que 150 ml s’écoulent dans la colonne en 60-70 minutes environ). Récupérer l’éluat dans un ballon de 250 ml préalablement taré. Évaporer le solvant sous vide et enlever les dernières traces de celui-ci sous un courant d’azote. Peser le ballon et calculer l’extrait récupéré [En cas d’utilisation de cartouches SPE de silice prêtes à l’emploi, procéder comme suit: introduire 1 ml de solution (5.1.2) dans les cartouches préalablement préparées avec 3 ml de n-hexane. Après percolation de la solution, développer avec 4 ml de n-hexane/éther diéthylique 9/1 (V/V). Récupérer l’éluat dans un tube de 10 ml et le soumettre à évaporation sous un courant d’azote jusqu’à siccité. Soumettre le résidu sec à l’action de la lipase pancréatique (5.2). Il est fondamental de vérifier la composition en acide gras avant et après passage sur cartouche SPE].

5.2. Hydrolyse par la lipase pancréatique

5.2.1. Dans le tube de la centrifugeuse, peser 0,1 g de l’huile préparée conformément au point 5.1. Ajouter 2 ml de solution tampon (4.6), 0,5 ml de la solution de cholate de sodium (4.7) et 0,2 ml de la solution de chlorure de calcium, en agitant bien après chaque addition. Fermer le tube par le bouchon rodé et le placer dans le thermostat à 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Ajouter 20 mg de lipase, agiter soigneusement (en évitant de mouiller le bouchon) et mettre le tube dans le thermostat pendant exactement 2 minutes, puis le retirer, agiter énergiquement pendant 1 minute exactement et laisser refroidir.

5.2.3. Ajouter 1 ml d’éther diéthylique, boucher et agiter énergiquement, puis centrifuger et transférer la solution d’éther dans un tube propre et sec, à l’aide d’une microseringue.

5.3. Préparation des dérivés silanisés et de la chromatographie en phase gazeuse

5.3.1. À l’aide d’une microseringue, introduire 100 μl de solution (5.2.3) dans un tube à fond conique de 10 ml.

5.3.2. Éliminer le solvant sous un léger courant d’azote, ajouter 200 μl de réactif de silanisation (4.15), boucher le tube et laisser reposer pendant 20 minutes.

5.3.3. Après 20 minutes, ajouter 1 à 5 ml de n-hexane (en fonction des conditions chromatographiques): la solution résultant est prête pour la chromatographie en phase gazeuse.

5.4. Chromatographie en phase gazeuse

Les conditions d’opération sont les suivantes:

— température de l’injecteur (injecteur «on-column») inférieure à la température d’ébullition du solvant (68 °C),

— température du détecteur: 350 °C,

— température de la colonne: programmation de la température du four: 60 °C pendant 1 minute, en augmentant de 15 °C par minute jusqu’à 180 °C, puis de 5 °C par minute jusqu’à 340 °C, puis 340 °C pendant 13 minutes,

— gaz vecteur: hydrogène ou hélium, réglé à la vitesse linéaire adéquate en vue d’obtenir la résolution reflétée dans la figure 1. Le temps de rétention du triglycéride C54 doit être de 40 ± 5 minutes (voir figure 2). (Les conditions d’opérations indiquées ci-dessus sont proposées à titre indicatif. Chaque opérateur devra les optimiser pour atteindre la résolution désirée. La hauteur du pic correspondant au 2-glycéryl monopalmitate doit avoir une hauteur minimale égale à 10 % de l’échelle de l’enregistreur),

— quantité de substance injectée: 0,5-1 μl de la solution (5 ml) de n-hexane (5.3.3).

5.4.1. Identification des pics

Les monoglycérides individuels sont identifiés en fonction des temps de rétention obtenus et par rapport à ceux obtenus avec les mélanges standards de monoglycérides analysés dans les mêmes conditions.

5.4.2. Évaluation quantitative

L’aire de chaque pic est calculée au moyen d’un intégrateur électronique.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Le pourcentage de glycéril monopalmitate est calculé à partir du rapport entre l’aire du pic correspondant et la somme des aires des pics de tous les monoglycérides (voir figure 2), selon la formule:

Glycéryl monopalmitate (%):

Où:

Ax = aire du pic correspondant au glycéryl monopalmitate;

ΣA = somme des aires de la totalité des pics des monoglycérides.

Le résultat doit être donné avec une décimale.

7. COMPTE RENDU DE L’ANALYSE

Le compte rendu de l’analyse devra spécifier:

— la référence à cette méthode,

— toute information nécessaire à l’identification complète de l’échantillon,

— le résultat de l’analyse,

— tout écart de cette méthode, qu’il s’agisse d’une décision des parties concernées ou pour une autre raison,

— les détails d’identification du laboratoire, la date de l’analyse et la signature des responsables de celle-ci.

Figure 1

Chromatogramme des produits de la réaction de silanisation obtenus par l’action de la lipase sur une huile d’olive raffinée additionnée de 20 % d’huile estérifiée (100 %)

Figure 2

Chromatogramme de:

A) huile d’olive non estérifiée, après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après. Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %. Légende: 1 = Acides gras libres 2 = Monoglycérides 3 = Diglycérides 4 = Triglycérides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

Chromatogramme de:

B) huile estérifiée après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après. Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %. Légende: 1 = Acides gras libres 2 = Monoglycérides 3 = Diglycérides 4 = Triglycérides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

8. NOTES

PRÉPARATION DE LA LIPASE

Il existe dans le commerce des lipases ayant une activité satisfaisante. Il est également possible de les préparer au laboratoire de la façon suivante:

Refroidir à 0 °C 5 kg de pancréas frais de porc. Débarrasser de la graisse solide et du tissu conjonctif qui les entourent et les triturer dans un moulin à lames jusqu’à obtention d’une pâte fluide. Agiter cette pâte pendant 4 à 6 heures avec 2,5 litres d’acétone anhydre puis centrifuger. Extraire le résidu trois autres fois avec le même volume d’acétone anhydre, puis deux fois avec un mélange acétone/éther diéthylique (1/1) (V/V) et deux fois avec de l’éther diéthylique.

Sécher le résidu pendant 48 heures sous vide pour obtenir une poudre stable qui se conservera longtemps au réfrigérateur et à l’abri de l’humidité.

CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ LIPASIQUE

Préparer une émulsion d’huile d’olive comme suit:

Agiter pendant 10 minutes dans un mélangeur un mélange constitué de 165 ml d’une solution de gomme arabique à 100 g/l, 15 g de glace pilée et 20 ml d’une huile d’olive préalablement neutralisée.

Introduire successivement 10 ml de cette émulsion dans un bécher de 50 ml puis 0,3 ml d’une solution de cholate de sodium à 0,2 g/ml et 20 ml d’eau distillée.

Placer le bécher dans un thermostat régulé à 37 °C; introduire les électrodes du pH-mètre et l’agitateur à hélice.

Ajouter goutte à goutte, à l’aide d’une burette, une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N jusqu’à obtention d’un pH de 8,3.

Ajouter un volume de suspension de poudre de lipase dans l’eau (0,1 g/ml de lipase). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3, mettre en marche le chronomètre et ajouter la solution d’hydroxyde de sodium, goutte à goutte, au rythme nécessaire pour maintenir le pH à la valeur de 8,3. Noter chaque minute le volume de solution consommé.

Reporter les données dans un système d’axes de coordonnées en portant en abscisses les temps et en ordonnées les millilitres de solution alcaline 0,1 N consommés pour maintenir le pH constant. Un graphique linéaire doit être obtenu.

L’activité de la lipase, mesurée en unités lipase par mg, est donnée par la formule suivante:

où:

A est l’activité en unités lipase/mg;

V est le nombre de millilitres de solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N par minute (calculé à partir du graphique);

N est la normalité de la solution d’hydroxyde de sodium;

m est la masse en mg de la lipase d’essai.

L’unité lipase est définie comme la quantité d’enzyme qui libère 10 micro-équivalents d’acide par minute.

▼M20 —————

▼M28









ANNEXE IX

ANALYSE SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DANS L'ULTRAVIOLET

AVANT-PROPOS

L'analyse spectrophotométrique dans l'ultraviolet peust fournir des indications sur la qualité d'une matière grasse, sur son état de conservation et sur les modifications subies du fait de processus technologiques. L'absorption aux longueurs d'onde spécifiées dans la méthode est due à la présence de systèmes de diènes et triènes conjugués résultant de processus d'oxydation et/ou de pratiques de raffinage. Les valeurs de cette absorption sont exprimées comme l'extinction spécifique

(l'extinction d'une solution de matière grasse à 1 % m/v dans le solvant spécifié, dans une cuve de 10 mm), notée de façon conventionnelle K (également dénommé «coefficient d'extinction»).

1. CHAMP D'APPLICATION

La présente annexe décrit la procédure à suivre pour réaliser une analyse spectrophotométrique dans le domaine de l'ultraviolet de l'huile d'olive.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

Un échantillon est dissous dans le solvant requis, puis l'absorbance de la solution est mesurée aux longueurs d'onde spécifiées, par rapport au solvant pur.

Les valeurs de l'extinction spécifique à 232 nm et à 268 nm dans de l'iso-octane ou à 232 nm et 270 nm dans du cyclohexane sont calculées pour une concentration de 1 % m/v dans une cuve de 10 mm.

3. APPAREILLAGE

3.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer des mesures à des longueurs d'onde UV (220 nm à 360 nm), avec capacité de lecture nanométrique. Un contrôle régulier est recommandé pour la précision et la reproductibilité des échelles des longueurs d'onde et d'absorbance ainsi que pour la lumière parasite. 3.1.1. Échelle des longueurs d'onde: ce contrôle peut être réalisé à l'aide d'un matériau de référence consistant en un filtre de verre optique contenant de l'oxyde d'holmium ou une solution d'oxyde d'holmium (scellée ou non), qui possède des bandes d'absorption distinctes. Ces matériaux de référence sont destinés à la vérification et à l'étalonnage de l'échelle des longueurs d'onde des spectrophotomètres UV-visible dont la largeur de bande spectrale nominale est inférieure ou égale à 5 nm. Les mesures sont effectuées en comparaison avec un blanc à l'air, sur la plage de longueurs d'onde comprise entre 640 et 240 nm, selon les instructions qui accompagnent les matériaux de référence. Une correction des valeurs de base est effectuée à l'aide d'un faisceau canalisé vide à chaque altération de la largeur de fente. Les longueurs d'onde de la norme sont énumérées dans le certificat du matériau de référence. 3.1.2. Échelle d'absorbance: le contrôle peut être effectué au moyen de matériaux de référence scellés disponibles dans le commerce, consistant en solutions de dichromate de potassium, avec certaines concentrations et valeurs certifiées d'absorbance à λmax (quatre solutions de dichromate de potassium dans de l'acide perchlorique, scellées dans quatre cuves UV en quartz, qui sont utilisées pour mesurer la linéarité et la précision photométrique de référence dans l'UV). Les solutions de dichromate de potassium sont mesurées en comparaison avec un blanc contenant l'acide utilisé, après correction des valeurs de base, conformément aux instructions accompagnant le matériel de référence. Les valeurs d'absorbance sont énumérées dans le certificat du matériau de référence. Pour le contrôle de la cellule photoélectrique et du photomultiplicateur, il est également possible de procéder ainsi: peser 0,2 gramme de chromate de potassium pur pour spectrophotométrie et dissoudre dans une solution d'hydroxyde de potassium 0,05 N et compléter au volume dans une fiole jaugée de 1 000 millilitres. Prélever ensuite 25 millilitres exactement de la solution obtenue, transférer dans une fiole jaugée de 500 millilitres et compléter au volume avec la même solution d'hydroxyde de potassium. Mesurer l'extinction à 275 nm de la solution ainsi obtenue, en se servant de la solution d'hydroxyde de potassium comme référence. L'extinction mesurée avec une cuve optique de 1 centimètre devra être de 0,200 ± 0,005.

3.2. Cuves en quartz rectangulaires, avec couvercle, pour les mesures aux longueurs d'onde UV (220 à 360 nm) et d'une longueur optique de 10 mm. Lorsqu'elles sont remplies d'eau ou d'un autre solvant approprié, les cuves ne doivent pas présenter entre elles de différence supérieure à 0,01 unité d'extinction.

3.3. Fioles jaugées à un trait, d'une capacité de 25 ml, classe A.

3.4. Balance analytique, permettant une lecture au 0,0001 g près.

4. RÉACTIFS

Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, n'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.

Solvant: iso-octane (2,2,4-triméthylpentane) pour les mesures à 232 nm et à 268 nm et cyclohexane pour les mesures à 232 nm et à 270 nm, présentant une absorbance inférieure à 0,12 à 232 nm et inférieure à 0,05 à 270 nm par rapport à l'eau distillée, mesurée dans une cuve de 10 mm.

5. PROCÉDURE

5.1. L'échantillon doit être parfaitement homogène et exempt d'impuretés en suspension. Dans le cas contraire, il doit être filtré sur papier à une température d'environ 30 °C.

5.2. Introduire environ 0,25 g (au mg près) de l'échantillon ainsi préparé dans une fiole jaugée de 25 ml, compléter avec le solvant spécifié et homogénéiser. La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier. REMARQUE: en général, une masse de 0,25 à 0,30 g est suffisante pour des mesures d'absorbance d'huiles d'olive vierge et vierge extra à 268 nm et 270 nm. Pour des mesures à 232 nm, 0,05 g d'échantillon est habituellement nécessaire, de sorte que deux solutions distinctes sont généralement préparées. Pour les mesures d'absorbance d'huiles de grignons d'olive, d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive frelatées, une plus petite partie de l'échantillon (0,1 g) est généralement nécessaire du fait de leur plus forte absorbance.

5.3. Le cas échéant, corriger les valeurs de base (220-290 nm) avec un solvant dans les deux cuves de quartz (échantillon et référence), puis remplir la cuve en quartz de l'échantillon avec la solution d'essai et mesurer les valeurs d'extinction à 232, 268 ou 270 nm par comparaison avec le solvant servant de référence. Les valeurs d'extinction enregistrées doivent être comprises dans l'intervalle 0,1 à 0,8 ou dans la plage de linéarité du spectrophotomètre qui doit être vérifiée. Dans le cas contraire, il faut répéter les mesures en utilisant des solutions plus concentrées ou plus diluées, selon le cas.

5.4. Après la mesure de l'absorbance à 268 nm ou à 270 nm, mesurer l'absorbance à λmax, λmax + 4 et λmax – 4. Ces valeurs d'absorbance sont utilisées pour déterminer la variation de l'extinction spécifique (ΔΚ). REMARQUE: λmax est fixé à 268 nm pour l'iso-octane utilisé comme solvant et à 270 nm pour le cyclohexane.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1. Relever les extinctions spécifiques (coefficients d'extinction) aux diverses longueurs d'onde, calculées comme suit: où: Kλ = extinction spécifique à la longueur d'onde λ, Eλ = extinction mesurée à la longueur d'onde λ, c = concentration de la solution en g/100 ml, s = épaisseur de la cuve en quartz, en cm. Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6.2. Variation de l'extinction spécifique (ΔΚ) La variation de la valeur absolue de l'extinction (ΔΚ) est donnée par la formule: où Km est l'extinction spécifique à la longueur d'onde correspondant à l'absorption maximale à 270 nm et 268 nm en fonction du solvant utilisé. Les résultats sont exprimés avec deux décimales.









ANNEXE X

DÉTERMINATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

1. CHAMP D'APPLICATION

La présente annexe fournit des directives pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse des acides gras libres et liés dans les matières grasses et les huiles végétales après leur conversion en esters méthyliques d'acides gras (EMAG).

Les acides gras liés des triglycérides (TG) et, en fonction de la méthode d'estérification, les acides gras libres (AGL), sont convertis en esters méthyliques d'acides gras (EMAG), qui sont déterminés par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

La méthode décrite dans la présente annexe permet la détermination des EMAG de C12 à C24, y compris les esters méthyliques d'acides gras saturés, mono-insaturés cis et trans et poly-insaturés cis et trans.

2. PRINCIPE

La chromatographie en phase gazeuse (CG) est utilisée pour l'analyse quantitative des EMAG. Les EMAG sont préparés conformément à la partie A. Ils sont ensuite injectés et vaporisés dans l'injecteur. La séparation des EMAG est effectuée sur des colonnes analytiques de polarité et de longueur particulières. Un détecteur à ionisation de flamme (FID) est utilisé pour la détection des EMAG. Les conditions d'analyse sont décrites dans la partie B.

L'hydrogène ou l'hélium peuvent être utilisés comme gaz vecteur (phase mobile) dans la chromatographie en phase gazeuse des EMAG avec FID. L'hydrogène accélère la séparation et fournit des pics plus marqués. La phase stationnaire est une couche microscopique d'un mince film liquide sur une surface solide inerte de silice fondue.

Lors de leur passage le long de la colonne capillaire, les composés volatiles en cours d'analyse interagissent avec la phase stationnaire tapissant la surface interne de la colonne. En raison de cette interaction différente de divers composés, l'élution de ces derniers s'effectue à des moments différents, qui représentent chacun le temps de rétention du composé pour un ensemble de paramètres d'analyse donné. La comparaison des temps de rétention sert à l'identification des différents composés.

PARTIE A

PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS DE L'HUILE D'OLIVE ET DE L'HUILE DE GRIGNONS D'OLIVE

1. CHAMP D'APPLICATION

La présente partie définit la préparation des esters méthyliques d'acides gras. Elle présente des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive.

2. DOMAINE D'APPLICATION

La préparation des esters méthyliques d'acides gras des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive est effectuée par transestérification avec une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium à température ambiante. La nécessité de purification de l'échantillon avant la transestérification dépend de la teneur de l'échantillon en acides gras libres et du paramètre analytique à déterminer; la méthode peut être choisie conformément au tableau ci-après:







Catégorie d'huile Méthode Huile d'olive vierge avec une acidité inférieure ou égale à 2,0 %. 1. Acides gras 2. Acides gras trans 3. ΔECN42 (après purification par SPE avec gel de silice) Huile d'olive raffinée Huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huiles d'olive vierges Huile de grignons d'olive raffinée Huile de grignons d'olive Huile d'olive vierge avec une acidité supérieure à 2,0 %. Huile de grignons d'olive brute 1. Acides gras (après purification par SPE avec gel de silice) 2. Acides gras trans (après purification par SPE avec gel de silice) 3. ΔECN42 (après purification par SPE avec gel de silice)

3. MÉTHODOLOGIE

3.1. Transestérification dans une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium à température ambiante

3.1.1. Principe

Les esters méthyliques se forment par transestérification dans une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium comme phase intermédiaire avant la saponification.

3.1.2. Réactifs

3.1.2.1. Méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau.

3.1.2.2. Hexane pour chromatographie.

3.1.2.3. Heptane pour chromatographie.

3.1.2.4. Éther diéthylique, stabilisé pour analyses.

3.1.2.5. Acétone pour chromatographie.

3.1.2.6. Solvant d'élution pour la purification de l'huile par chromatographie sur colonne ou par SPE, mélange hexane/éther diéthylique dans les proportions 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Hydroxyde de potassium, solution méthanolique d'environ 2 M: dissoudre 11,2 g d'hydroxyde de potassium dans 100 ml de méthanol.

3.1.2.8. Cartouches de gel de silice, 1 g (6 ml), pour l'extraction en phase solide.

3.1.3. Appareillage

3.1.3.1. Éprouvettes à bouchon vissant (de 5 ml de capacité) avec un bouchon muni d'un joint de PTFE.

3.1.3.2. Pipettes graduées ou automatiques de 2 ml et 0,2 ml.

3.1.4. Purification des échantillons d'huile

Si nécessaire, les échantillons seront purifiés par passage de l'huile dans une cartouche de gel de silice pour l'extraction en phase solide. Placer une cartouche de gel de silice (3.1.2.8) dans un appareil d'élution à vide et laver avec 6 ml d'hexane (3.1.2.2); le lavage est effectué sans vide. Charger ensuite dans la colonne une solution d'huile (environ 0,12 g) dans 0,5 ml d'hexane (3.1.2.2). Faire descendre la solution pour élution avec 10 ml d'hexane/d'éther diéthylique (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogénéiser la totalité des éluats et diviser en deux volumes similaires. Faire évaporer un des volumes jusqu'à dessiccation dans un évaporateur rotatif sous pression réduite et à température ambiante. Dissoudre le résidu dans 1 ml d'heptane. La solution obtenue est prête pour l'analyse des acides gras par CG. Faire évaporer le second volume et dissoudre le résidu dans 1 ml d'acétone pour l'analyse des triglycérides par CLHP si nécessaire.

3.1.5. Procédure

Dans une éprouvette à bouchon vissant de 5 ml (3.1.3.1), peser environ 0,1 g de l'échantillon d'huile. Ajouter 2 ml d'heptane (3.1.2.2) et agiter. Ajouter 0,2 ml de la solution méthanolique d'hydroxyde de potassium (3.1.2.7), boucher à l'aide du bouchon muni d'un joint en PTFE, bien fermer et agiter énergiquement pendant 30 secondes. Laisser reposer jusqu'à ce que la partie supérieure de la solution devienne claire. Décanter la couche supérieure, qui est celle qui contient les esters méthyliques. La solution d'heptane est prête pour injection dans le chromatographe. Il est conseillé de maintenir la solution au réfrigérateur jusqu'au moment de l'analyse chromatographique. Il n'est pas recommandé de stocker la solution pendant plus de 12 heures.

PARTIE B

ANALYSE DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

1. CHAMP D'APPLICATION

La présente partie donne des directives générales pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse par colonne capillaire de la composition qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides gras obtenu selon la méthode spécifiée dans la partie A.

La partie ne s'applique pas aux acides gras polymérisés.

2. RÉACTIFS

2.1. Gaz vecteur

Gaz inerte (hélium ou hydrogène) soigneusement desséché et contenant moins de 10 mg/kg d'oxygène.

Note 1: l'hydrogène peut doubler la vitesse d'analyse mais présente des dangers. Il existe cependant des dispositifs de sécurité.

2.2. Gaz auxiliaires

2.2.1. Hydrogène (pureté ≥ 99,9 %), ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.2.2. Air ou oxygène ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.2.3. Azote (pureté > 99 %).

2.3. Produits d'étalonnage

Mélange d'esters méthyliques d'acides gras purs, ou esters méthyliques d'un corps gras, de composition connue, si possible voisine de celle du corps gras à analyser. Les isomères cis et trans d'esters méthyliques octadécénoïques, octadécadiénoïques et octadécatriénoïques sont utiles pour l'identification des isomères trans des acides insaturés.

Prendre toutes précautions afin d'éviter l'oxydation des acides gras polyinsaturés.

3. APPAREILLAGE

Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromatographie en phase gazeuse utilisant des colonnes capillaires et un détecteur à ionisation de flamme.

3.1. Chromatographie en phase gazeuse

L'appareil de chromatographie en phase gazeuse comprend les éléments suivants.

3.1.1. Système d'injection

Utiliser un système d'injection avec des colonnes capillaires, auquel cas il importe que le dispositif soit spécialement conçu pour l'utilisation de telles colonnes. Il peut s'agir d'un système d'injection à division de flux ou d'un système d'injection sans division dans la colonne (injecteur on-column).

3.1.2. Four

Le four doit être en mesure de porter la colonne capillaire à une température d'au moins 260 °C et de maintenir la température choisie à 0,1 °C près. Cette dernière exigence est particulièrement importante lorsqu'un tube en silice fondue est utilisé.

L'utilisation d'un appareil équipé d'un programmateur de température est recommandée dans tous les cas et, en particulier, en présence d'acides gras à moins de 16 atomes de carbone.

3.1.3. Colonne capillaire

3.1.3.1. Tube en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser, généralement en verre ou en silice fondue. Le diamètre interne doit être compris entre 0,20 et 0,32 mm. Intérieurement, il devra subir des traitements appropriés (préparation de l'état de surface, inactivation) avant de recevoir le film de phase stationnaire. Une longueur de 60 m est suffisante pour les acides gras et les isomères cis et trans des acides gras.

3.1.3.2. Phase stationnaire, polysiloxanes polaires (cyanopropylsilicone). Les colonnes greffées ou réticulées conviennent. Note 2: toutefois les polysiloxanes polaires peuvent compliquer l'identification et la séparation de l'acide linolénique et des acides en C20. Les épaisseurs de film doivent être faibles: 0,1 à 0,2 μm.

3.1.3.3. Montage et conditionnement de la colonne Respecter les précautions habituelles de montage des colonnes capillaires, c'est-à-dire la disposition de la colonne dans le four (support), le choix et le montage des joints (étanchéité), le positionnement des extrémités de la colonne dans l'injecteur et le détecteur (réduction des volumes morts). Mettre la colonne sous gaz vecteur [par exemple, 0,3 bar (30 kPa) pour une colonne de 25 mètres de longueur et d'un diamètre intérieur de 0,3 millimètre]. Conditionner la colonne par programmation de la température du four à 3 °C par minute depuis la température ambiante jusqu'à une température inférieure de 10 °C à la limite de décomposition de la phase stationnaire. Maintenir à cette température 1 heure, jusqu'à stabilisation de la ligne de base. Revenir à 180 °C pour travailler dans des conditions isothermes. Note 3: des colonnes préconditionnées adéquates sont disponibles dans le commerce.

3.1.4. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur

3.2. Seringue

La seringue doit avoir une capacité de 10 microlitres au maximum et être graduée en 0,1 μl.

3.3. Système d'acquisition des données

Système d'acquisition des données connecté en ligne avec les détecteurs et utilisé avec un logiciel adapté pour l'intégration et la normalisation des pics.

4. PROCÉDURE

Les détails opératoires présentés aux points 4.1 à 4.3 concernent l'utilisation d'un détecteur à ionisation de flamme.

4.1. Conditions d'essai

4.1.1. Choix des conditions opératoires optimales pour colonnes capillaires

Compte tenu des caractéristiques d'efficacité et de perméabilité des colonnes capillaires, la séparation entre les constituants et la durée de l'analyse dépendent en grande partie du débit du gaz vecteur dans la colonne. Il sera donc nécessaire d'optimiser les conditions opératoires en ajustant ce paramètre (ou plus simplement sur la perte de charge en tête de colonne) selon que l'on cherche à améliorer la séparation ou à accélérer l'analyse.

Les conditions suivantes se sont révélées utilisables pour la séparation des EMAG (C4 à C26). Des exemples de chromatogrammes figurent à l'appendice B:







Température de l'injecteur: 250 °C Température du détecteur: 250 °C Température du four: de 165 °C (8 min) à 210 °C à 2 °C/min Gaz vecteur hydrogène: pression de la tête de colonne: 179 kPa Débit total: 154,0 ml/min Ratio de la division: 1:100 Volume d'injection: 1 μl

4.1.2. Détermination de la résolution (voir appendice A)

Calculer la résolution R, de deux pics voisins I et II, au moyen de la formule suivante:

R = 2 × ((dr(II) – dr(I) )/(ω(I) + ω(II))) ou R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),

ou

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée européenne), BP (British Pharmacopeia))

où:

d r(I) est la distance de rétention du pic I;

d r(II) est la distance de rétention du pic II;

t r(I) est le temps de rétention du pic I;

t r(II) est le temps de rétention du pic II;

ω(I) est la largeur de la base du pic I;

ω(II) est la largeur de la base du pic II;

ω0,5 est la largeur du pic du composé donné, à mi-hauteur du pic;

Si ω(I) ≈ ω(II), calculer R en utilisant les formules suivantes:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

où:

σ est l'écart type (voir appendice A, figure 1).

Si la distance dr entre les deux pics d r(II) – d r(I) est égale à 4σ, le facteur de résolution R = 1.

Si deux pics ne sont pas complètement séparés, les tangentes aux points d'inflexion des deux pics se coupent au point C. Afin de séparer complètement les deux pics, la distance entre eux doit être égale à:

d r(II) – d r(I) = 6 σ d'où R = 1,5 (voir appendice A, figure 3).

5. EXPRESSION DES RÉSULTATS

5.1. Analyse qualitative

Identifier les pics d'ester méthylique de l'échantillon à partir du chromatogramme de l'appendice B, figure 1, si nécessaire par interpolation ou par comparaison avec ceux des mélanges d'esters méthyliques de référence (comme indiqué au point 2.3).

5.2. Évaluation quantitative

5.2.1. Détermination de la composition

Calculer la fraction massique wi des esters méthyliques d'acides gras, exprimée en pourcentage en masse des esters méthyliques, comme suit:

5.2.2. Méthode de calcul

5.2.2.1. Cas général

Calculer la teneur en un constituant donné i, exprimée en pourcentage en masse, des esters méthyliques, en déterminant le pourcentage représenté par le rapport de l'aire du pic correspondant à la somme des aires de la totalité des pics, à l'aide de la formule:

wi = (Ai/ΣA) × 100

où:

Ai est l'aire du pic de chaque ester méthylique d'acide gras i;

ΣA est la somme des aires de la totalité des pics de tous les esters méthyliques d'acides gras.

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

Note 4: pour les matières grasses et les huiles, la fraction massique des esters méthyliques d'acides gras est égale à la fraction massique des triglycérides en grammes par 100 g. Pour le cas où cette hypothèse n'est pas permise, voir le point 5.2.2.2.

5.2.2.2. Cas de l'emploi des facteurs de correction

Dans certains cas, par exemple en présence d'acides gras à moins de huit atomes de carbone ou d'acides avec des groupes secondaires, les aires doivent être corrigées à l'aide de facteurs de correction spécifiques (Fci). Ces facteurs sont déterminés pour chaque instrument. À cet effet, des matériaux de référence appropriés, avec une composition en acides gras certifiée dans la fourchette correspondante, doivent être utilisés.

Note 5: ces facteurs de correction ne sont pas identiques aux facteurs de correction FID théoriques, qui sont indiqués dans l'appendice A, étant donné qu'ils comprennent également les performances du système d'injection, etc. Toutefois, dans le cas de plus grandes différences, le système dans son ensemble devrait faire l'objet d'un contrôle de performance.

Pour ce mélange témoin, le pourcentage en masse de l'EMAG i est donné par la formule:

wi = (mi /Σm) × 100

où

mi est la masse de l'EMAG i dans le mélange témoin;

Σm est la somme des masses des divers constituants comme les EMAG du mélange témoin.

À partir du chromatogramme du mélange témoin, calculer le pourcentage par aire de l'EMAG i comme suit:

wi = (Ai/ΣA) × 100

où:

Ai est l'aire de l'EMAG i dans le mélange témoin;

ΣA est la somme de toutes les aires de tous les EMAG du mélange témoin.

Le facteur de correction Fc est alors

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Pour l'échantillon, le pourcentage en masse de chaque EMAG i est:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

Note 6: la valeur calculée correspond au pourcentage en masse de chaque acide gras calculé en triglycérides par 100 g de matières grasses.

5.2.2.3. Cas de l'emploi d'un étalon interne

Dans certaines analyses (par exemple, lorsque tous les acides gras ne sont pas quantifiés, et que des acides en C4 et en C6 sont présents à côté d'acides en C16 et en C18, ou bien lorsqu'il est nécessaire de déterminer la quantité absolue d'acides gras dans un échantillon), il est nécessaire d'utiliser un étalon interne. Des acides gras en C5, C15 ou C17 sont utilisés fréquemment. Le facteur de correction de l'étalon interne doit être déterminé (s'il y a lieu).

Le pourcentage en masse du composé i, exprimé en esters méthyliques, est par suite donné par la formule:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

où:

Ai est l'aire de l'EMAG i;

A IS est l'aire de l'étalon interne;

F i est le facteur de correction de l'acide gras i, exprimé en EMAG;

F IS est le facteur de correction de l'étalon interne;

m est la masse, en milligrammes, de la prise d'essai;

m IS est la masse, en milligrammes, de l'étalon interne;

Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6. RAPPORT D'ANALYSE

Le rapport d'essai doit indiquer les méthodes utilisées pour la préparation des esters méthyliques et pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse. Il doit, en outre, mentionner tous les détails opératoires non prévus dans la présente méthode standard, ou facultatifs, ainsi que les incidents éventuels susceptibles d'avoir influé sur les résultats.

Le rapport d'analyse doit comporter toutes les informations permettant une identification complète de l'échantillon.

7. PRÉCISION

7.1. Résultats de l'essai interlaboratoire

Les détails d'un essai interlaboratoire sur la précision de la méthode sont présentés à l'annexe C de la norme COI/T.20/Doc. no 33. Les valeurs dérivées de l'essai interlaboratoire peuvent ne pas être applicables aux gammes de concentration et aux matrices autres que celles données.

7.2. Répétabilité

La différence absolue entre les résultats de deux tests distincts, obtenus selon la même méthode, sur du matériel d'essai identique, dans le même laboratoire, par un seul opérateur utilisant le même équipement et effectués dans un bref intervalle de temps sera supérieure, dans 5 % des cas au maximum, à la valeur R présentée dans les tableaux 1 à 14 de l'annexe C de la norme COI/T.20/Doc. no 33.

7.3. Reproductibilité

La différence absolue entre les résultats de deux tests individuels, obtenus selon la même méthode, sur du matériel d'essai identique, dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents utilisant un équipement différent sera supérieure, dans 5 % des cas au maximum, à la valeur R présentée dans les tableaux 1 à 14 de l'annexe C de la norme COI/T.20/Doc. no 33.









Appendice A

Figure 1

Avec ω0,5 pour la largeur à mi-hauteur du triangle (ABC) et b pour la largeur à mi-hauteur du triangle (NPM).







Figure 2 Figure 3









Appendice B

Figure 1

Profil chromatographique en phase gazeuse d'une huile de grignons d'olive, obtenu par la méthode de méthylation à froid.

Les pics chromatographiques correspondent aux esters méthyliques et éthyliques, sauf indication contraire.

▼B









ANNEXE XI

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN SOLVANTS HALOGÉNÉS VOLATILS DANS L'HUILE D'OLIVE

1. PRINCIPE

Analyse par chromatographie en phase gazeuse selon la technique de l'espace de tête (head space).

2. APPAREILLAGE

2.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse, équipé d'un détecteur à capture d'électrons (ECD).

2.2. Appareillage pour espace de tête (head space).

2.3. Colonne de chromatographie en phase gazeuse en verre de 2 mètres de long et de 2 millimètres de diamètre, phase stationnaire. OV101 à 10 % ou équivalent, imprégnant une terre de diatomée calcinée, lavée aux acides et silanisée, de granulométrie de 80 à 100 Mesh.

2.4. Gaz vecteur et gaz auxiliaire: azote pour chromatographie en phase gazeuse, adaptée à la détection par capture d'électrons.

2.5. Flacons en verre de 10 à 15 millimètres munis d'une garniture en téflon et d'un bouchon en aluminium muni d'un office pour prélèvement par seringue.

2.6. Pinces à fermeture hermétique.

2.7. Seringue pour gaz de 0,5 à 2 millilitres.

3. RÉACTIFS

Standard: solvants halogénés volatils à un degré de pureté approprié à un usage de chromatographie en phase gazeuse.

4. PROCÉDURE D'ANALYSE

4.1. Peser exactement environ 3 grammes d'huile dans un flacon en verre (à ne pas réutiliser), boucher le flacon jusqu'à fermeture hermétique. Introduire le flacon dans un thermostat à 70 °C pendant 1 heure. Prélever avec précision au moyen de la seringue un volume de 0,2 à 0,5 millilitre de l'espace de tête. L'injecter dans la colonne de l'appareil de chromatographie en phase gazeuse réglé comme suit: — température injecteur: 150 °C, — température colonne: 70 à 80 °C, — température détecteur: 200 à 250 °C.

4.2. Solutions de référence. Préparer des solutions standard, en utilisant de l'huile d'olive raffinée sans trace de solvants, à des concentrations variables entre 0,05 et 1 milligramme par kilogramme et en rapport à la teneur présumée de l'échantillon. La dilution éventuelle doit être effectuée avec du pentane.

4.3. Évaluation quantitative. Faire le rapport entre les surfaces ou les hauteurs des pics de l'échantillon et de la solution standard ayant la concentration présumée le plus proche. Si l'écart relatif est supérieur à 10 %, il est nécessaire de refaire l'analyse par comparaison avec une nouvelle solution standard jusqu'à ce que sa concentration respecte l'écart relatif susmentionné. La teneur est établie sur la base d'une moyenne d'injections élémentaires.

4.4. Expression des résultats. Les résultats sont exprimés en milligrammes par kilogramme (ppm). La limite de détection de la méthode est de 0,01 milligramme par kilogramme.

▼M26









ANNEXE XII

MÉTHODE DU CONSEIL OLÉICOLE INTERNATIONAL POUR L'ÉVALUATION ORGANOLEPTIQUE DES HUILES D'OLIVE VIERGES

▼M28

1. OBJET ET CHAMP D'APPLICATION

L'objet de la méthode internationale décrite dans la présente annexe est de déterminer la procédure d'évaluation des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges au sens de l'annexe VII, partie VIII, point 1, du règlement (UE) no 1308/2013 du Parlement européen et du Conseil ( 4 ) et d'établir la méthode à utiliser pour le classement de ces huiles sur la base de ces caractéristiques. Elle fournit également des indications concernant l'étiquetage facultatif.

La méthode décrite ne s'applique qu'aux huiles d'olive vierges et à leur classement ou à leur étiquetage en fonction de l'intensité des défauts perçus et du fruité, déterminés par un groupe de dégustateurs sélectionnés, entraînés et testés, constitués en jury.

Les normes COI mentionnées dans la présente annexe sont utilisées dans leur dernière version disponible.

▼M26

2. VOCABULAIRE GÉNÉRAL DE BASE POUR L’ANALYSE SENSORIELLE

Voir la norme COI/T.20/Doc. no 4 «Analyse sensorielle: vocabulaire général de base»

3. VOCABULAIRE SPÉCIFIQUE

3.1. Attributs négatifs

Chômé/lies Flaveur caractéristique de l’huile tirée d’olives entassées ou stockées dans des conditions telles qu'elles se trouvent dans un état avancé de fermentation anaérobie, ou de l'huile restée en contact avec les boues de décantation, ayant elles aussi subi un processus de fermentation anaérobie, dans les piles et les cuves.

Moisi – humidité-terre Flaveur caractéristique des huiles obtenues à partir de fruits attaquées