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►B Règlement (CE) no86/94 de la Commission
du 19 janvier 1994
établissant une méthode de référence pour la détermination du sitostérol et du stigmastérol dans le
beurre
(JO L 17 du 20.1.1994, p. 7)
Modifié par:
Journal officiel
no page date
►M1Règlement (CE) no175/1999 de la Commission du 26 janvier 1999 L 20 22 27.1.1999
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Règlement (CE) no86/94 de la Commission
du 19 janvier 1994
établissant une méthode de référence pour la détermination du
sitostérol et du stigmastérol dans le beurre
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté européenne,
vu le règlement (CEE) no804/68 du Conseil, du 27 juin 1968, portant
organisation commune des marchés dans le secteur du lait et desproduits laitiers (
1), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no
2071/92 (2), et notamment son article 6 paragraphe 7,
considérant que le beurre peut être marqué et que les produits marqués
doivent être contrôlés en vertu des articles 3 et 6 du règlement (CEE) no
570/88 de la Commission (3), modifiée en dernier lieu par le règlement
(CE) no3049/93 (4);
considérant que le strict respect des conditions relatives au marquage du
beurre est indispensable pour prévenir tout risque d’utilisation illicite dubeurre subventionné;
considérant que, compte tenu de l’importance du marquage dans le bon
fonctionnement de ces systèmes, il convient de définir des méthodescommunes de détection de tous les marqueurs exigés dans le cadre deces systèmes; que cela permettrait notamment d’assurer une égalité detraitement entre tous les opérateurs utilisant ces systèmes et d’éliminertoute inégalité dans les conditions de concurrence pouvant actuellementrésulter des différences dans les méthodes d’analyse nationales;
considérant que le règlement (CEE) n
o3942/92 de la Commission (5)
définit une méthode de référence pour la détermination du sitostérol etdu stigmastérol dans le butter oil; que cette méthode peut être appliquée
sous une forme légèrement modifiée pour déterminer les marqueursstérol dans le beurre;
considérant qu’il convient de définir la précision de la méthode et ses
limites de tolérance;
considérant que les mesures prévues dans le présent règlement sont
conformes à l’avis du comité de gestion du lait et des produits laitiers,
A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:
Article premier
La méthode d’analyse de référence à appliquer pour la détermination de
la teneur du beurre en stigmastérol ou en β-sitostérol conformément à
l’article 6 du ►M1règlement (CE) no2571/97 ◄figure en annexe.
Le beurre a été marqué correctement si les résultats obtenus satisfont
aux conditions précisées au point 8 de l’annexe.
Article 2
Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de
sa publication au Journal officiel des Communautés européennes .
Il est applicable à partir du 1eravril 1994.
Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directe-
ment applicable dans tout État membre.
(1)J OnoL 148 du 28. 6. 1968, p. 13.
(2)J OnoL 215 du 30. 7. 1992, p. 64.
(3)J OnoL 55 du 1. 3. 1988, p. 31.
(4)J OnoL 273 du 5. 11. 1993, p. 7.
(5)J OnoL 399 du 31. 12. 1992, p. 29.
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ANNEXE
DÉTERMINATION DU SITOSTÉROL OU DU STIGMASTÉROL DANS
LE BEURRE PAR LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
AVEC COLONNE CAPILLAIRE
1. OBJET ET DOMAINE D’APPLICATION
La méthode décrit une procédure permettant la détermination quantita-
tive du sitostérol ou du stigmastérol dans le beurre. Le sitostérol est lasomme du β-sitostérol et du 22-dihydro- β-sitostérol, les autres sitosté-
rols étant considérés comme peu importants. Cette méthode s’appliqueaux échantillons obtenus dans le cadre du règlement (CEE) n
o570/88.
2. PRINCIPE
Le beurre est saponifié à l’aide d’hydroxyde de potassium dans une
solution d’éthanol et les insaponifiables sont extraits à l’aide d’éther.
Les stérols sont transformés en triméthyl-silyl-éthers et sont analysés par
chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire par rapport àun étalon interne: la bétuline.
3. APPAREILLAGE
3.1. Ballon de saponification de 150 ml équipé d’un réfrigérant à reflux à
embouts rodés.
3.2. Ampoules à décanter de 500 ml.3.3. Ballons de 250 ml.3.4. Ampoules d’égalisation de la pression, de 250 ml ou d’une contenance
similaire, destinées à recueillir l’éther à jeter.
3.5. Colonne de verre, de 350 mm × 20 mm, dotée d’un raccord en verre
fritté.
3.6. Bain-marie ou manchon isotherme.3.7. Flacons à réaction, de 2 ml.3.8. Appareil de chromatographie en phase gazeuse pouvant être utilisé avec
une colonne capillaire, muni d’un dispositif de fonctionnement composé:
3.8.1. d’un four thermostaté pour les colonnes pouvant maintenir la tempéra-
ture souhaitée avec une précision de ± 1 °C;
3.8.2. d’un injecteur thermoréglable;
3.8.3. d’un détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur;3.8.4. d’un intégrateur-enregistreur pouvant être utilisé avec le convertisseur-
amplificateur (3.8.3).
3.9. Colonne capillaire en verre de silice entièrement recouverte de BP 1 ou
d’une substance équivalente d’une épaisseur uniforme de 0,25 µm; lacolonne doit être en mesure de résoudre les dérivés triméthyl-silyl dulanostérol et du sitostérol. Une colonne BP 1 de 12 m de longueur et dediamètre interne de 0,2 mm est appropriée.
3.10. Microseringue à aiguille en acier trempé pour chromatographie en phase
gazeuse de 1 µl.
4. RÉACTIFS
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L’eau
utilisée doit être de l’eau distillée ou de l’eau d’une pureté au moinséquivalente.
4.1. Éthanol, pur au moins à 95 %.4.2. Hydroxyde de potassium, solution à 60 %, dissoudre 600 g d’hydroxyde
de potassium (minimum 85 %) dans de l’eau et compléte rà1lavec de
l’eau.
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4.3. Bétuline d’une pureté d’au moins 99 %.
4.3.1. Solutions de bétuline dans l’éther diéthylique (4.4).
4.3.1.1. La concentration de la solution de bétuline utilisée pour la détermination
du sitostérol doit être de 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. La concentration de la solution de bétuline utilisée pour la détermination
du stigmastérol doit être de 0,4 mg/ml.
4.4. Éther diéthylique, de pureté analytique (exempt de péroxydes ou de
résidus).
4.5. Sulfate de sodium, anhydre, en granulés, préalablement séché à 102 °C
pendant 2 heures.
4.6. Réactif de silylation, par exemple, TRI-SIL (pouvant être obtenu auprès
de Pierce Chemical Co., Cat no49001) ou équivalent. (ATTENTION: le
TRI-SIL est inflammable et toxique, corrosif et peut être carcinogène.Le personnel de laboratoire doit bien connaître les règles de sécuritéapplicables au TRI-SIL et prendre les précautions qui s’imposent).
4.7. Lanostérol.4.8. Sitostérol, de pureté connue, égale ou supérieure à 90 % (P).
Note 1: La pureté des matériaux étalons utilisés pour le calibrage doit
être déterminée à l’aide de la méthode de normalisation. On part del’hypothèse que tous les stérols présents dans l’échantillon sont repré-sentés dans le chromatogramme, que la surface totale des pics représente100 % des constituants stéroliques et que les stérols donnent la mêmeréponse au détecteur. La linéarité du système doit être vérifiée pour lesniveaux de concentrations considérés.
4.8.1. Solution étalon de sitostérol: préparer une solution à 0,001 mg/ml près,
contenant environ 0,5 mg/ml (W
1) de sitostérol (4.8) dans de l’éther
diéthylique (4.4).
4.9. Stigmastérol, d’une pureté connue, égale ou supérieure à 90 % (P).4.9.1. Solution étalon de stigmastérol: préparer une solution à 0,001 mg/ml
près, contenant environ 0,2 mg/ml (W
1) de stigmastérol (4.9) dans de
l’éther diéthylique (4.4).
4.10. Mélange pour le test de résolution: préparer une solution contenant 0,05
mg/ml de lanostérol (4.7) et 0,5 mg/ml de sitostérol (4.8) dans de l’étherdiéthylique (4.4).
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Préparation des solutions étalons pour la chromatographie: ajouter la
solution étalon interne (4.3.1) à la solution étalon de stérol appropriée enmême temps qu’à l’échantillon saponifié (5.2.2).
5.1.1. Solution chromatographique étalon de sitostérol: transférer 1 ml de
solution étalon de sitostérol (4.8.1) dans chacun des deux flacons àréaction (3.7) et éliminer l’éther sous un flux d’azote. Ajouter 1 ml desolution étalon interne (4.3.1.1) et éliminer l’éther sous un flux d’azote.
5.1.2. Solution chromatographique étalon de stigmastérol: transférer 1 ml de
solution étalon de stigmastérol (4.9.1) dans chacun des deux flacons àréaction (3.7) et éliminer l’éther sous un flux d’azote. Ajouter 1 ml desolution étalon interne (4.3.1.2) et éliminer l’éther sous un flux d’azote.
5.2. Préparation des insaponifiables.
5.2.1. Faire fondre l’échantillon de beurre à une température de 35 °Ca u
maximum; le mélanger soigneusement en le remuant.
Peserà1m gp r ès , environ1gd e beurre (W
2) dans un flacon de 150 ml
(3.1). Ajouter 50 ml d’éthanol (4.1) et 10 ml de solution d’hydroxyde depotassium (4.2). Adapter le réfrigérant à reflux et porter à environ 75 °C
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pendant 30 minutes. Détacher le réfrigérant et laisser refroidir le ballon à
la température ambiante.
5.2.2. Ajouter 1,0 ml de solution étalon interne dans le ballon (4.3.1.1 s’il
s’agit de déterminer le sitostérol ou 4.3.1.2 s’il s’agit de déterminer lestigmastérol). Mélanger soigneusement. Transférer le contenu du ballonquantitativement dans une ampoule à décanter de 500 ml (3.2). Rincer leballon avec 50 ml d’eau, puis 250 ml d’éther diéthylique (4.4). Agitervigoureusement l’ampoule à décanter pendant 2 minutes et laisser lesphases se séparer. Éliminer la phase aqueuse inférieure et laver la phaseéthérée en agitant avec 4 parties aliquotes successives de 100 ml d’eau.
Note 2: Pour éviter la formation d’une émulsion, il est indispensable
que les deux premiers rinçages à l’eau soient effectués délicatement (10inversions). Pour le troisième rinçage, on peut agiter vigoureusementpendant 30 secondes. Si une émulsion se forme, elle peut être éliminéepar l’addition d e5à1 0m l d’éthanol. Si de l’éthanol est ajouté, il est
indispensable de procéder à deux nouveaux et vigoureux lavages à l’eau.
5.2.3. Faire passer la phase éthérée limpide et exempte de savon sur une
colonne en verre (3.5) contenant 30 g de sulfate de sodium anhydre(4.5). Collecter l’éther dans un ballon de 250 ml (3.3). Ajouter des billesantiprojection et évaporer jusqu’à la quasi-dessication dans un bain-marie ou un manchon isotherme en prenant soin de collecter les solvantsà éliminer.
Note 3: Si des extraits d’échantillons sont évaporés à sec à une tempé-
rature trop élevée, il peut y avoir des pertes de stérol.
5.3. Préparation des triméthyl-silyl-éthers.
5.3.1. Transférer la solution d’éther restant dans le ballon dans un flacon à
réaction de 2 ml (3.7) à l’aide de 2 ml d’éther et éliminer l’éther sous unflux d’azote. Laver le ballon avec deux parties aliquotes supplémentairesde 2 ml d’éther en transférant dans le flacon et en éliminant l’éther sousazote à chaque fois.
5.3.2. Silyler l’échantillon en ajoutant 1 ml de TRI-SIL (4.6). Fermer le flacon
et agiter vigoureusement pour dissoudre. Si la dissolution est incom-plète, porter à 65-70 °C. Laisser reposer pendant au moins 5 minutes
avant d’injecter dans le chromatographe en phase gazeuse. Silyler lesétalons de la même manière que les échantillons. Silyler le mélange pourle test de résolution (4.10) de la même manière que les échantillons.
Note 4: La silylation doit se faire dans un environnement anhydre. Une
silylation incomplète de la bétuline est indiquée par un second picproche de celui de la bétuline.
La présence d’éthanol lors de la silylation interférera avec la silylation.
Ceci peut résulter d’un lavage insuffisant lors de l’extraction. Si ceproblème persiste, un cinquième rinçage, avec agitation vigoureusependant 30 secondes, peut être introduit à l’étape de l’extraction.
5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse.
5.4.1. Choix des conditions opératoires.
Programmer le chromatographe en phase gazeuse selon les instructions
du fabricant.
Les conditions opératoires indicatives sont les suivantes:
— température de la colonne: 265 °C
— température de l’injecteur: 280 °C
— température du détecteur: 300 °C
— débit du gaz vecteur: 0,6 ml/min.— pression de l’hydrogène: 84 kPa— pression de l’air: 155 kPa
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— Injection fractionnée: de 10/1 à 50/1; le rapport de fuite doit être
optimisé en fonction des instructions du fabricant et la linéarité de laréponse du détecteur validée ensuite pour l’étendue des concentrationsqui nous intéressent.
Note 5: Il est particulièrement important que la chambre de vaporisa-
tion soit régulièrement nettoyée.
— quantité de substance injectée: 1 µl de solution TMSE.
Laisser le système s’équilibrer jusqu’à l’obtention d’une réponse suffi-
samment stable avant d’entreprendre toute analyse.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de
la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de manière à obtenirdes chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:
— le pic du sitostérol doit présenter une résolution suffisante par
rapport au lanostérol. La figure 1 présente un chromatogrammetypique tel qu’il doit être obtenu à partir d’un mélange silylé du testde résolution (4.10)
— les temps de rétention relatifs des stérols suivants devraient être
d’environ:
cholestérol 1,0
stigmastérol 1,3sitostérol 1,5bétuline 2,5
— le temps de rétention de la bétuline devrait être d’environ 24
minutes.
5.4.2. Mode opératoire analytique:
Injecter 1 µl de solution étalon silylée (stigmastérol ou sitostérol) et
ajuster les paramètres de calibration de l’intégrateur.
Injecter de nouveau 1 µl de solution étalon silylée pour déterminer le
coefficient de réponse par rapport à la bétuline.
Injecter 1 µl de solution d’échantillon silylée et mesurer la surface des
pics. Chaque série d’échantillons doit être précédée et suivie d’uneinjection d’étalons.
En règle générale, l’injection d’étalons peut être effectuée après une
série de six échantillons.
Note 6: L’intégration du pic du stigmastérol devrait comporter les
traînées indiquées par les points, 1, 2 et 3 de la figure 2b.
L’intégration du pic du sitostérol devrait englober la surface du pic du
22-dihydro- β-sitostérol (stigmastanol) élué immédiatement après le
sitostérol, (figure 3b) lors de l’évaluation du sitostérol total.
6. CALCUL DES RÉSULTATS
6.1. Déterminer la surface des pics de stérol et des pics de bétuline dans les
deux étalons en début et fin de chaque série et calculer R
1:
R1=surface moyenne du pic du stérol dans l’étalon
surface moyenne du pic de la bétuline dans l’étalon
Déterminer la surface du pic du stérol (stigmastérol ou sitostérol) et du
pic de bétuline dans l’échantillon et calculer R2:
R2=surface du pic du stérol dans l’échantillon
surface du pic de la bétuline dans l’échantillon
W1= teneur en stérol de l’étalon (mg) contenu dans 1 ml de solution
étalon (4.8.1 ou 4.9.1)
W2= poids de l’échantillon (g) (5.2.1)
P = pureté du stérol étalon (4.8 ou 4.9)
Teneur de l’échantillon en stérol (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
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▼B
7. PRÉCISION DE LA MÉTHODE
7.1. Répétabilité
7.1.1. Stigmastérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées dans
l’intervalle de temps le plus court possible pour un opérateur utilisant lemême appareillage, sur du matériel d’essai identique, ne doit pasdépasser 19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitostérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées dans
l’intervalle le plus court possible, par un seul opérateur utilisant le mêmeappareillage, sur du matériel d’essai identique ne doit pas dépasser 23,0mg/kg.
7.2. Reproductibilité
7.2.1. Stigmastérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par
des opérateurs dans des laboratoires différents utilisant des appareillagesdifférents sur du matériel d’essai identique, ne doit pas dépasser 31,9mg/kg.
7.2.2. Sitostérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par
des opérateurs dans des laboratoires différents utilisant des appareillagesdifférents, sur du matériel d’essai identique, ne doit pas dépasser 8,7 %par rapport à la moyenne des déterminations.
7.3. Source de données de précision
Les données de précision ont été déterminées à partir d’une expérience
menée en 1992 dans huit laboratoires et concernant six échantillons(trois en double aveugle) pour le stigmastérol et six échantillons (troisen double aveuble) pour le sitostérol.
8. LIMITES DE TOLÉRANCE
▼
M1
8.1. Pour vérifier si le produit a été tracé correctement, il faut prélever trois
échantillons du produit tracé.
▼B
8.2. Stigmastérol
8.2.1. Le taux d’incorporation pour le stigmastérol est de 150 g de stigmas-
térol, pur au moins à 95 %, par tonne de beurre, c’est-à-dire 142,5mg/kg; ou de 170 g de stigmastérol pur au moins à 85 % par tonne debeurre, soit 144,5 mg/kg.
▼
M1
8.2.2. On utilise les résultats obtenus pour les trois échantillons à partir de
l’analyse du produit pour vérifier le taux et l’homogénéité de l’incorpo-ration du traceur, et on compare le plus faible de ces résultats avec leslimites suivantes [en prenant en considération la différence critique pourune probabilité de 95 % (DCr
95)]:
— 116,0 mg/kg (95 % du taux d’incorporation minimal pour du stig-
mastérol pur à 95 %),
— 118,0 mg/kg (95 % du taux d’incorporation minimal pour du stig-
mastérol pur à 85 %),
— 81,0 mg/kg (70 % du taux d’incorporation minimal pour du stigmas-
térol pur à 95 %),
— 82,0 mg/kg (70 % du taux d’incorporation minimal pour du stigmas-
térol pur à 85 %).
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▼M1
La concentration du traceur dans l’échantillon donnant le résultat le plus
faible est utilisée par interpolation entre 116,0 mg/kg et 81,0 mg/kg ouentre 118,0 mg/kg et 82,0 mg/kg
▼
B
8.3. Sitostérol
8.3.1. Le taux d’incorporation du sitostérol est de 600 g de sitostérol pur à au
moins 90 % par tonne de beurre, c’est-à-dire 540 mg/kg.
▼M1
8.3.2. On utilise les résultats obtenus pour les trois échantillons à partir de
l’analyse du produit pour vérifier le taux et l’homogénéité de l’incorpo-ration du traceur, et on compare le plus faible de ces résultats avec leslimites suivantes [en prenant en considération la différence critique pourune probabilité de 95 % (DCr
95)]:
— 486,0 mg/kg (95 % du taux d’incorporation minimal pour du sitos-
térol pur à 90 %),
— 358,0 mg/kg (70 % du taux d’incorporation minimal pour du sitos-
térol pur à 90 %).
La concentration du traceur dans l’échantillon donnant le résultat le plus
faible est utilisée par interpolation entre 486,0 mg/kg et 358,0 mg/kg
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