1991R2568 — FR — 01.10.2008 — 022.001

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►B RÈGLEMENT (CEE) No 2568/91 DE LA COMMISSION du 11 juillet 1991 ►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄ (JO L 248, 5.9.1991, p.1)

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RÈGLEMENT (CEE) No 2568/91 DE LA COMMISSION

du 11 juillet 1991

►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄







LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu le règlement no 136/66/CEE du Conseil, du 22 septembre 1966, portant établissement d'une organisation commune des marchés dans le secteur des matières grasses ( 1 ), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 3577/90 ( 2 ), et notamment son article 35 bis, considérant que l'annexe du règlement no 136/66/CEE prévoit les dénominations et définitions des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive commercialisées à l'intérieur de chaque État membre ainsi que dans les échanges intracommunautaires et avec les pays tiers; considérant que, pour pouvoir distinguer les divers types d'huile, il y a lieu de définir les caractéristiques physico-chimiques de chacun d'eux ainsi que les caractéristiques organoleptiques des huiles vierges, de manière à assurer la pureté et la qualité des produits en cause, sans préjudice d'autres dispositions existant en la matière; considérant qu'il convient de déterminer de manière uniforme dans toute la Communauté la présence des caractéristiques des différents types d'huile; que, à cette fin, il y a lieu d'établir les méthodes communautaires d'analyse chimique et d'appréciation organoleptique; qu'il convient cependant de permettre, pendant une période transitoire, l'utilisation d'autres méthodes d'analyse appliquées dans les États membres, tout en prévoyant que, en cas de divergence des résultats, ceux obtenus selon la méthode commune soient déterminants; considérant que la définition des caractéristiques physico-chimiques des huiles d'olives et des méthodes d'analyse entraîne l'adaptation des notes complémentaires du chapitre 15 de la nomenclature combinée; considérant que la méthode d'évaluation des caractéristiques organoleptiques des huiles vierges comporte la création de jurys de dégustateurs sélectionnés et entraînés; qu'il convient, dès lors, de prévoir le délai nécessaire pour la mise en place d'une telle structure; que, compte tenu des difficultés que rencontreront certains États membres pour la constitution des jurys de dégustateurs, il convient d'autoriser le recours aux jurys existant dans d'autres États membres; considérant que, pour assurer le fonctionnement correct du système des prélèvements applicables à l'importation de grignons d'olive, il convient de prévoir une méthode unique pour la détermination de la teneur en huile de ces produits; considérant que, pour ne pas causer un préjudice au commerce, il est opportun de prévoir une période limitée pour l'écoulement de l'huile conditionnée avant l'entrée en vigueur du présent règlement; considérant qu'il y a lieu d'abroger le règlement (CEE) no 1058/77 de la Commission ( 3 ), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no 1858/88 ( 4 ); considérant que le comité de gestion des matières grasses n'a pas émis d'avis dans le délai imparti par son président, A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:







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Article premier

1. Sont considérées comme huiles d'olive vierges, au sens du point 1 a), et b) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, les huiles dont les caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, points 1 et 2, du présent règlement.

2. Est considérée comme huile d'olive lampante, au sens du point 1 c) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 3, du présent règlement.

3. Est considérée comme huile d'olive raffinée, au sens du point 2 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 4, du présent règlement.

4. Est considérée comme huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huiles d'olive vierges, au sens du point 3 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 5, du présent règlement.

5. Est considérée comme huile de grignons d'olive brute, au sens du point 4 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 6, du présent règlement.

6. Est considérée comme huile de grignons d'olive raffinée, au sens du point 5 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 7, du présent règlement.

7. Est considérée comme huile de grignons d'olive, au sens du point 6 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 8, du présent règlement.

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Article 2

1. La détermination des caractéristiques des huiles prévues à l'annexe I est effectuée selon les méthodes d'analyse suivantes:

— pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcentage d'acide oléique, la méthode reprise à l'annexe II,

— pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode reprise à l'annexe III,

▼M19

— pour la détermination de la teneur en cires, la méthode reprise à l'annexe IV,

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— pour la détermination du contenu en stérols, la méthode reprise à l'annexe V,

— pour la détermination de l'érythrodiol et de l'uvaol, la méthode reprise à l'annexe VI,

▼M21

— pour la détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate, la méthode reprise à l’annexe VII,

▼M20 —————

▼B

— pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode reprise à l'annexe IX,

— pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode reprise aux annexes X «A» et X «B».

— pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode reprise à l'annexe XI,

— pour l'appréciation des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges, la méthode reprise à l'annexe XII, appliquée conformément au paragraphe 2,

▼M20 —————

▼M11

— pour la détermination des stigmastadiènes, la méthode reprise à l'annexe XVII,

▼M13

— pour la détermination de la composition des triglycérides à ECN42, la méthode reprise à l'annexe XVIII,

▼M19

— pour la détermination du contenu en alcools aliphatiques, la méthode reprise à l'annexe XIX.

▼M19

2. La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges est réalisée par des jurys de dégustateurs agréés par les États membres.

Les caractéristiques organoleptiques d'une huile d'olive visée au premier alinéa sont considérées comme conformes à la catégorie d'huile d'olive déclarée, si un jury agréé par l'État membre concerné confirme le classement à cet égard.

Dans le cas où le jury agréé ne confirme pas la déclaration en ce qui concerne les caractéristiques organoleptiques de la catégorie d'huile d'olive déclarée, les autorités nationales ou leurs représentants font procéder à la demande de l'intéressé à deux contre analyses, par d'autres jurys agréés, dont au moins une est effectuée par un jury agréé par l'État membre producteur concerné. Les caractéristiques en question sont considérées comme conformes à celles qui sont déclarées si les deux contre analyses confirment le classement déclaré. Dans le cas contraire les frais des contre analyses, sans préjudice des sanctions encourues, sont imputées à l'intéressé.

▼M17

3. En ce qui concerne la vérification par les autorités nationales ou leurs représentants des caractéristiques des huiles, prévues au paragraphe 1, le prélèvement des échantillons est effectué selon les normes internationales EN ISO 661 et EN ISO 5555 relatives à la préparation des échantillons pour essai et à l'échantillonnage. Toutefois, par dérogation au point 6.8 de la norme EN ISO 5555, pour les lots constitués par lesdites huiles, en emballages immédiats inférieurs ou égaux à 100 litres, le prélèvement de l'échantillon s'effectue conformément à l'annexe I bis du présent règlement.

▼M19

Sans préjudice des dispositions de la norme EN ISO 5555 et du chapitre 6 de la norme EN ISO 661, les échantillons sont mis à l'abri de la lumière et des fortes chaleurs dans le plus bref délai et sont envoyés au laboratoire pour les analyses au plus tard:

— le dixième jour ouvrable suivant celui du prélèvement, pendant les mois d'octobre à mai et

— le cinquième jour ouvrable suivant celui du prélèvement, pendant les mois de juin à septembre.

▼M17

4. ►M20 Pour la vérification prévue au paragraphe 3, les analyses visées aux annexes II, III, IX, X et XII, ainsi que, le cas échéant, les contre-analyses prévues par les législations nationales, sont effectuées avant la date de durabilité minimale. Dans le cas où la prise de l'échantillon s'effectue plus de quatre mois avant la date de durabilité minimale, lesdites analyses sont effectuées au plus tard le quatrième mois suivant celui de la prise de l'échantillon. Aucun délai ne s'applique pour les autres analyses prévues par ledit règlement. ◄

Sauf si la prise d'échantillon a eu lieu moins d'un mois avant la date de durabilité minimale, dans le cas où les résultats des analyses ne correspondent pas aux caractéristiques de la catégorie d'huile d'olive ou de grignons d'olive déclarée, l'intéressé en reçoit notification au plus tard un mois avant la fin du délai visé au premier alinéa.

▼M19

5. Pour la détermination des caractéristiques des huiles d'olive effectuée selon les méthodes prévues au paragraphe 1, les résultats des analyses sont directement comparés avec les limites prévues par le présent règlement.

▼M20

Article 2 bis

La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants de la conformité d'un échantillon des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive avec la catégorie déclarée peut s'effectuer:

a) soit en réalisant, dans n'importe quel ordre, les analyses prévues à l'annexe I;

b) soit suivant l'ordre prévu à l'annexe I ter relatif au schéma décisionnel, jusqu'à aboutir à une des décisions mentionnées par ledit schéma.

▼M19 —————

▼M5

Article ►M19 3 ◄

Au cas où il est constaté que les caractéristiques organoleptiques d'une huile sont différentes de celles résultant de sa dénomination, l'État membre concerné applique, sans préjudice des autres sanctions éventuelles, des sanctions pécuniaires administratives, dont le montant est déterminé en fonction de la gravité de l'irrégularité constatée.

Aux fins de l'évaluation de l'irrégularité, il est tenu compte, notamment, de l'évolution naturelle des caractéristiques d'une huile qui a été conservée dans des conditions normales.

Les États informent la Commission, au début de chaque semestre, du nombre et de la nature des irrégularités constatées ainsi que des sanctions appliquées au cours du semestre précédent.

▼M5

Article 4

▼M19

1. Aux fins de l'appréciation et du contrôle par les autorités nationales ou leur représentant des caractéristiques organoleptiques, les États membres peuvent agréer des jurys de dégustateurs.

Les conditions d'agrément sont établies par les États membres, notamment de façon à:

— répondre aux conditions de l'annexe XII, point 4.

— assurer que la formation du chef du jury soit effectuée par un établissement et dans des conditions, reconnus à cet effet par l'État membre.

— soumettre la validité de l'agrément aux résultats des performances obtenues dans le cadre d'un système de contrôle annuel institué par l'État membre.

Chaque État membre communique à la Commission la liste des jurys agréés ainsi que les mesures prises en conformité avec le présent paragraphe.

▼M5

2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer un jury de dégustateurs sur son territoire, il peut recourir à un jury de dégustateurs agréé dans un autre État membre.

3. Chaque État membre établit la liste des jurys de dégustateurs institués par des organisations professionnelles ou interprofessionnelles conformément aux conditions décrites au paragraphe 1 et veille au respect de ces conditions.

▼M19 —————

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Article 6

1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extraction de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 est déterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.

2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcentage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.

▼M20

Article 7

Les dispositions communautaires concernant la présence de contaminants sont applicables.

En ce qui concerne la teneur en solvants halogénés les limites pour toutes les catégories d'huiles d'olive sont les suivantes:

— teneur maximale de chaque solvant halogéné détecté: 0,1 mg/kg,

— teneur maximale de la somme des solvants halogénés détectés: 0,2 mg/kg

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Article 8

1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures prises pour l'application du présent règlement.

2. Les États membres communiquent à la Commission, au début de chaque semestre, un état récapitulatif des données analytiques des déterminations effectuées au cours du semestre précédent.

Ces résultats sont examinés par le comité de gestion des matières grasses selon la procédure prévue à l'article 39 du règlement no 136/66/CEE.

Article 9

Le règlement (CEE) no 1058/77 est abrogé.

Article 10

1. Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. Toutefois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partir du ►M1 1er novembre 1992 ◄ , sauf en ce qui concerne les opérations liées à l'intervention.

▼M5

Cette méthode ne s'applique pas aux huiles d'olive vierges conditionnées avant le 1er novembre 1992.

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2. Le présent règlement ne s'applique pas aux huiles d'olive et de grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur du présent règlement et commercialisées jusqu'au 31 octobre 1992.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.









ANNEXES

Sommaire







Annexe I: Caractéristiques des huiles d'olive Annexe I bis: Échantillonnage des lots d'huile d'olive ou d'huile de grignons d'olive en emballages immédiats de 100 litres au maximum Annexe I ter: Schéma décisionnel Annexe II: ►M21 Détermination des acides gras libres, méthode à froid ◄ Annexe III: Détermination de l'indice de peroxyde Annexe IV: ►M6 Détermination de la teneur en cires au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire ◄ Annexe V: Détermination de la composition et du contenu en stérols au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire Annexe VI: Détermination de la teneur en érythrodiol et en uvaol Annexe VII: ►M21 Détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate ◄ Annexe VIII: Détermination de la teneur en trilinoléine Annexe IX: Analyse spectrophotométrique Annexe X «A»: Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras Annexe X «B»: Préparation des esters méthyliques d'acides gras Annexe XI: Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils dans l'huile d'olive Annexe XII: Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge Annexe XIII: ►M6 Neutralisation et décoloration de l'huile d'olive en laboratoire ◄ Annexe XIV: Notes complémentaires 2, 3 et 4 du chapitre 15 de la nomenclature combinée Annexe XV: Teneur en huile des grignons d'olive Annexe XVI: Détermination de l'indice d'iode Annexe XVII: Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales Annexe XVIII: Méthode de détermination de la composition des triglycérides à ECN42 Annexe XIX: Méthode de détermination du contenu en alcools aliphatiques

▼M21









ANNEXE I

CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE







Catégorie Acidité (%) (*) Indice de peroyxide mEq O2/kg (*) Cires mg/kg (**) 2 glyceril monopalmitate (%) Stigmastadiène mg/kg (1) Différence: ECN42 (HPLC) et ECN42 (calcul théorique) K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Évaluation organoleptique Médiane du défaut (Md) (*) Évaluation organoleptique Médiane du fruité (Mf) (*) 1. Huile d'olive vierge extra ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 1,0 si % Acide palmitique total > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Huile d'olive vierge ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 1,0 si % Acide palmitique total > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ ►M22 3,5 ◄ Mf > 0 3. Huile d'olive lampante > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 1,1 si % Acide palmitique total > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > ►M22 3,5 ◄ (2) — 4. Huile d'olive raffinée ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 1,1 si % Acide palmitique total > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Huile d'olive — composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vièrges ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 si % Acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 1,0 si % Acide palmitique total > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Huile de grignons d'olive brute — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Huile de grignons d'olive raffinée ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Huile de grignons d'olive ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Catégorie Teneur en acides (1) Sommes des isomères transo- léiques (%) Sommes des isomères translinoléiques + translinoléniques (%) Composition des stérols Stérols totaux (mg/kg) Erythrodiol et uvaol (%) (**) Myristique (%) Linolénique (%) Arachidique (%) Eicosenoïque (%) Béhénique (%) Lignocérique (%) Cholestérol (%) Brassicastérol (%) Campestérol (%) Stigmastérol (%) Bétasitostérol (%) (2) Delta-7- Stigmasténol (%) 1. Huile d'olive vierge extra ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Huile d'olive vierge ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Huile d'olive lampante ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Huile d'olive raffinée ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Huile d'olive-composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Huile de grignons d'olive brute ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Huile de grignons d'olive raffinée ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Huile de grignons d'olive ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

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ANNEXE I bis

Échantillonnage d'huile d'olive ou d'huile de grignons d'olive livrées en emballages immédiats de 100 litres au maximum

La présente méthode d'échantillonnage s'applique pour des livraisons d'huiles d'olive ou de grignons d'olive de 125 000 litres au maximum, conditionnées en emballages immédiats de 100 litres au maximum.

Lorsque la livraison comporte plus de 125 000 litres, elle est subdivisée en lots de quantités égales ou inférieures à 125 000 litres. Lorsque la livraison est inférieure à 125 000 litres, elle constitue un lot. La méthode s'applique alors à chaque lot.

En fonction de la taille du lot, il est établi le nombre minimal de prélèvements élémentaires, conformément au tableau figurant au point 1.

L'importance du prélèvement élémentaire est établie en fonction de la capacité des emballages immédiats, selon le tableau prévu au point 2.1.

On entend par «livraison», «prélèvement élémentaire» et «échantillon de laboratoire», les définitions visées à la norme EN ISO 5555.

On entend par «lot» un ensemble d'unités de vente qui sont produites, fabriquées et conditionnées dans des circonstances telles que l'huile contenue dans chacune de ces unités de vente est considérée comme homogène pour toutes les caractéristiques analytiques.

1. NOMBRE DE PRÉLÈVEMENTS ÉLÉMENTAIRES

Le nombre minimal de prélèvements élémentaires est établi en fonction de la taille du lot conformément au tableau suivant:







Taille du lot inférieure à (en litres) Nombre minimal de prélèvements élémentaires 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Les emballages immédiats d'un même prélèvement élémentaire doivent être choisis de façon contiguë dans le lot.

En cas de doute, l'État membre augmente le nombre de prélèvements élémentaires à effectuer.

2. CONTENU D'UN PRÉLÈVEMENT ÉLÉMENTAIRE

2.1. Chaque prélèvement élémentaire est constitué par:







Dans le cas où les emballages immédiats ont une capacité: Le prélèvement élémentaire porte sur l'huile de: a) Supérieure ou égale à 5 litres a) 3 emballages immédiats b) Supérieure ou égale à 3 litres et inférieure à 5 litres b) 3 emballages immédiats c) Supérieure ou égale à 2 litres et inférieure à 3 litres c) 3 emballages immédiats d) Supérieure ou égale à 1 litre et inférieure à 2 litres d) 6 emballages immédiats e) Supérieure ou égale à 0,75 litre et inférieure à 1 litre e) 6 emballages immédiats f) Inférieure à 0,75 litre f) 3 fois l'huile du nombre minimal d'emballages dont la capacité totale dépasse 1,5 litre

2.2. Les prélèvements élémentaires devront être maintenus dans les emballages immédiats jusqu'au moment des analyses. L'huile des prélèvements élémentaires est en suite, le cas échéant, subdivisée en trois échantillons de laboratoire en vue d'effectuer:

a) les analyses visées aux annexes II, III, IX et X;

b) l'analyse visée à l'annexe XII;

c) les autres analyses.

2.3. Les emballages qui constituent un prélèvement élémentaire sont subdivisés selon les procédures de contrôle prévues par les législations nationales.

3. ANALYSES ET RÉSULTATS

a) Chacun des prélèvements élémentaires visés au point 1 est subdivisé en échantillons de laboratoire, conformément au point 2.5 de la norme EN ISO 5555, pour être soumis aux analyses suivantes: — détermination des acides gras libres, visée à l'article 2, paragraphe 1, premier tiret, — détermination de l'indice de peroxydes, visée à l'article 2, paragraphe 1, deuxième tiret, — analyse spectrophotométrique, visée à l'article 2, paragraphe 1, huitième tiret, — composition en acides gras, visée à l'article 2, paragraphe 1, neuvième tiret.

b) Dans le cas où, pour au moins un des prélèvements élémentaires pris sur le même lot, les résultats d'analyses visées au point a) ne sont pas tous conformes aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot concerné est déclaré non conforme. Dans le cas où, pour chacun des prélèvements élémentaires pris sur le même lot, les résultats des analyses visées au point a) ne sont pas tous homogènes, compte tenu des caractéristiques de répétabilité des méthodes concernées, l'ensemble du lot est déclaré non homogène et chaque prélèvement élémentaire doit être soumis aux autres analyses requises. Dans le cas contraire, un seul des prélèvements élémentaires sur ledit lot est soumis aux autres analyses requises.

c) Dans les cas où un des résultats d'analyses visées au point b), deuxième alinéa, n'est pas conforme aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot concerné est déclaré non conforme. Dans le cas où tous les résultats des analyses visées au point b), deuxième alinéa, sont conformes aux caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot concerné est déclaré conforme.

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ANNEXE I ter

SCHÉMA DÉCISIONNEL POUR LA VÉRIFICATION DE LA CONFORMITÉ D'UN ÉCHANTILLON D'HUILE D'OLIVE AVEC LA CATÉGORIE DÉCLARÉE

L'analyse de la conformité d'une huile d'olive ou de grignons d'olive à la catégorie déclarée peut s'effectuer:

a) soit en réalisant dans n'importe quel ordre les analyses prévues pour vérifier le respect des caractéristiques stipulées à l'annexe I;

b) soit en réalisant dans l'ordre indiqué par le schéma décisionnel les analyses qui y sont prévues, jusqu'à aboutir à une des décisions mentionnées par ledit schéma décisionnel.

Les analyses relatives aux contaminants nécessaires pour vérifier la conformité avec les normes de la Communauté européenne sont à réaliser indépendamment.

Le schéma décisionnel s'applique à toutes les catégories d'huiles d'olive et de grignons d'olive. Il se compose de tableaux numérotés de 1 à 11 qui doivent être abordés en fonction de la déclaration de la catégorie de l'huile en présence selon l'ordre prévu dans le tableau général.

Pour la lecture du tableau général au tableau 11:

— La double ligne (=) indique le chemin à suivre en cas de conformité (réponse positive) avec les conditions prévues dans la case qui précède. La ligne pointillée (…) indique à l'inverse le chemin à suivre en cas de non conformité.

— Les titres des cases figurant dans les tableaux 1 à 11 se réfèrent aux analyses prévues par le présent règlement selon les correspondances mentionnées à l'appendice 1 de la présente annexe.

— Les lettres de renvoi figurant dans les cercles de décision négative des tableaux 1 à 11 correspondent à des informations indicatives mentionnées à l'appendice 2 de la présente annexe. Elles n'impliquent pas par elles-même l'obligation de poursuivre les analyses ou la certitude des présomptions mentionnées.

Tableau général

Tableau 1

Tableau 2

Tableau 3

Tableau 4

Tableau 5

Tableau 6

Tableau 7

Tableau 8

Tableau 9

Tableau 10

Tableau 11









Appendice 1

Correspondance entre les annexes du présent règlement et les analyses visées par le schéma décisionnel







▼M21 — Acidité Annexe II Détermination des acides gras libres, méthode à froid ▼M20 — Indice de peroxydes Annexe III Détermination de l'indice de peroxyde — Spectrophotométrie dans l'ultraviolet Annexe IX Analyse spectrophotométrique — Évaluation organoleptique Annexe XII Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge — Stigmasta-3,5-diène Annexe XVII Méthode de détermination des stigamastadiènes dans les huiles végétales — Isomères trans des acides gras Annexe X a et Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras Annexe X b Préparation des esters méthyliques d'acides gras — Composition en acides gras Annexe X a et Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras Annexe X b Préparation des esters méthyliques d'acides gras — ΔECN42 Annexe XVIII Détermination de la composition des triglycérides à ECN42 (différence entre composition réelle et composition théorique) — Composition en stérols et stérols totaux Annexe V Détermination de la composition et du contenu en stérols au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire — Érythrodiol et uvaol Annexe VI Détermination de la composition en érythrodiol et en uvaol — Cires Annexe IV Détermination de la teneur en cires au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire — Alcools aliphatiques Annexe XIX Détermination du contenu en alcools aliphatiques au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire ▼M21 — Acides gras saturés en position 2 Annexe VII Détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate ▼M20









Appendice 2

Tableau 1

a) Voir huile d'olive vierge ou lampante (critères de qualité, tableau 2, ou critères de qualité et de pureté, tableau 4)

b) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4)

Tableau 2

a) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4)

b) Voir huile d'olive vierge extra (critères de qualité, tableau 1)

Tableau 3

a) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)

b) Présence d'huile de grignons d'olive

Tableau 4

a) Voir huile d'olive vierge extra et huile d'olive vierge (critères de qualité, tableaux 1 et 2)

b) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)

c) Présence d'huile de grignons d'olive

d) Présence d'huiles estérifiées

Tableau 7

a) Présence d'huile de grignons d'olive

b) Présence d'huiles estérifiées

Tableau 8

a) Présence d'huile raffinée (olive ou autres)

b) Voir huile d'olive lampante (critères de qualité et de pureté, tableau 4)

c) Présence d'huiles estérifiées

Tableau 11

a) Présence d'huiles estérifiées

▼B









ANNEXE II

▼M21

DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS LIBRES, MÉTHODE À FROID

▼B

1. OBJET

Détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive. La teneur en acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée conventionnellement.

1.1. Principe

Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution éthanolique d'hydroxyde de potassium.

1.2. Réactifs

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.

1.2.1. Oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume. Note: L'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions particulières. Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydroxyde de potassium (1.2.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de phénolphtaléine (1.2.3) pour 100 millilitres de mélange. Note: S'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si nécessaire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.

1.2.2. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique titrée c(KOH) - 0,1 mole par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) - 0,5 mole par litre environ. La concentration exacte de la solution éthanolique d'hydroxyde de potassium doit être connue et vérifiée immédiatement avant l'emploi. Utiliser une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solution doit être incolore ou jaune paille. Note: Une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium peut être préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol avec 8 grammes d'hydroxyde de potassium et 0,5 gramme de rognures d'aluminium. Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité requise d'hydroxyde de potassium. Laisser reposer durant plusieurs jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbonate de potassium. La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon suivante. À 1 000 millilitres d'éthanol, ajouter 4 millilitres de butylite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité requise d'hydroxyde de potassium. Cette solution est prête pour l'emploi.

1.2.3. Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V) ou bleu alcalin (dans le cas de corps gras fortement coloré) solution à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V).

1.3. Appareillage

Matériel courant de laboratoire, et notamment:

1.3.1. Balance analytique

1.3.2. Fiole conique de 250 millilitres de capacité

1.3.3. Burette de 10 millilitres de capacité, graduée en 0,05 millilitre.

1.4. Mode opératoire

1.4.1. Préparation de l'échantillon pour essai La détermination est effectuée sur l'échantillon filtré. Si la teneur globale en humidité et en impuretés est inférieure à 1 %, la détermination est effectuée sur l'échantillon tel quel.

1.4.2. Prise d'essai Prélever une prise d'essai, selon l'indice d'acide présumé, d'après les indications du tableau suivant.



Indice d'acide présumé Masse de la prise d'essai (en g) Précision de la pesée de la prise d'essai (en g) < 1 20 0,05 1 à 4 10 0,02 4 à 15 2,5 0,01 15 à 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Peser la prise d'essai dans la fiole conique (1.3.2).

1.4.3. Détermination Dissoudre la prise d'essai (4.5.2) dans 50 à 150 millilitres du mélange oxyde diéthylique/éthanol (1.2.1), préalablement neutralisé. Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole par litre (1.2.2) (voir note 2) jusqu'à virage de l'indicateur (coloration rose de la phénolpthaléine persistant durant au moins 10 secondes). Note 1: La solution éthanolique titrée d'hydroxyde de potassium (1.2.2) peut être remplacée par une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium ou de sodium lorsque le volume d'eau introduit n'entraîne pas une séparation de phases. Note 2: Si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium à 0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à 0,5 mole par litre. Note 3: Si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une quantité suffisante du mélange de solvants (1.2.1) pour donner une solution claire.

1.5. Expression de l'acidité en pourcentage de l'acide oléique

L'acidité, exprimée en pourcentage en poids, est égale à:

où:

V : volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium utilisée;

c : concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium utilisée;

M : poids molaire, en grammes par mole, de l'acide adopté pour l'expression du résultat (= 282);

m : poids en grammes, de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique ►M6 de deux déterminations ◄ .









ANNEXE III

DÉTERMINATION DE L'INDICE DE PEROXYDE

1. OBJET

La présente norme décrit une méthode de détermination de l'indice de peroxyde dans les huiles et matières grasses.

2. CHAMP D'APPLICATION

La présente norme est applicable aux huiles et matières grasses animales et végétales.

3. DÉFINITION

L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon (exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.

4. PRINCIPE

La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré avec une solution de thiosulfate de sodium.

5. APPAREILLAGE

Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances oxydantes ou réductrices.

Nota bene:

ne pas graisser les surfaces rodées.

5.1. Cuiller en verre de 3 millilitres.

5.2. Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence, dioxyde de carbone).

5.3. Burette de 25 ou 50 millilitres avec graduations de 0,1 millilitre.

6. RÉACTIFS

6.1. Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

6.2. Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz sec et pur).

6.3. Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente, exempte d'iode et d'iodates.

6.4. Solution aqueuse de thiosulfate de sodium 0,01 ou 0,002 N, soigneusement normalisée juste avant l'emploi.

6.5. Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment préparée à partir d'amidon naturel soluble.

7. ÉCHANTILLON

Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière, conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entièrement et fermés hermétiquement à l'aide de bouchons de liège ou de verre rodé.

8. MODE OPÉRATOIRE

L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou artificielle. Dans une cuiller en verre (5.1) ou, à défaut, dans une fiole (5.2), peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le tableau ci-après en fonction de l'indice de péroxyde prévu.







Indice de peroxyde prévu (en meq 02/kg) Poids de la prise d'essai (en g) de 0 à 12 de 5,0 à 2,0 de 12 à 20 de 2,0 à 1,2 de 20 à 30 de 1,2 à 0,8 de 30 à 50 de 0,8 à 0,5 de 50 à 90 de 0,5 à 0,3

Déboucher une fiole (5.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (6.1). Dissoudre rapidement la prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (6.2) puis 1 millilitre de solution d'iodure de potassium (6.3). Remettre le bouchon rapidement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5 minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 °C.

Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la solution de thiosulfate de sodium (6.4) (solution 0,002 N, si les indices prévus sont inférieurs à 12, et 0,001 N, s'ils sont supérieurs à 12) en agitant vigoureusement et en employant la solution d'amidon (6.5) comme indicateur.

Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.

Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier exède 0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium (6.4) 0,001 N, remplacer les réactifs impurs.

9. EXPRESSION DES RÉSULTATS

L'indice de péroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme, est fourni par la formule:

où:

V: = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium normalisée (6.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de l'essai à blanc;

T: = facteur de normalité exact de la solution de thiosulfate de sodium (6.4) utilisée;

m: = poids (en grammes) de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.

▼M21









ANNEXE IV

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN CIRES AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

Cette méthode décrit un procédé pour la détermination de la teneur en cires des huiles d’olive. Les cires sont séparées en fonction du nombre d’atomes de carbone. La méthode peut être employée notamment pour différencier l’huile d’olive de pression de celle d’extraction (huile de grignons).

2. PRINCIPE

La matière grasse, additionnée d’un étalon interne approprié, est fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté; la fraction éluée en premier dans les conditions de l’essai (à polarité inférieure à celle des triglycérides) est récupérée puis analysée directement par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. MATÉRIEL

3.1. Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Colonne en verre pour chromatographie en phase gazeuse, diamètre intérieur 15,0 mm, hauteur 30 à 40 cm, équipée d’un robinet.

3.3. Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié pour le fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d’un système d’introduction directe dans la colonne, constitué par: 3.3.1. Chambre à thermostat pour les colonnes, équipée d’un programmateur de température. 3.3.2. Injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne. 3.3.3. Révélateur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur. 3.3.4. Enregistreur-intégrateur approprié pour le fonctionnement avec le convertisseur-amplificateur (3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et vitesse de déroulement du papier variable. (Il est également possible d’utiliser des systèmes informatisés qui prévoient l’acquisition des données de chromatographie en phase gazeuse au moyen d’un PC.) 3.3.5. Colonne capillaire en verre ou silice fondue, longueur 8 à 12 m, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l’intérieur de liquide de répartition, à l’épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm. (Liquides de répartition adaptés à l’emploi, du type SE52 ou SE 54 dans le commerce.)

3.4. Microseringue pour introduction directe dans la colonne de 10 μl, équipée d’une aiguille cémentée.

3.5. Vibrateur électrique.

3.6. Évaporateur rotatif.

3.7. Four à moufle.

3.8. Balance analytique garantissant une précision de la mesure de ± 0,1 mg.

3.9. Verrerie normale de laboratoire.

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice d’une granulométrie comprise entre 60 et 200 μm. Le gel de silice doit être placé dans le four à 500 °C pendant au moins 4 heures. Après refroidissement, y ajouter 2 % d’eau par rapport à la quantité de gel de silice prélevée. Agiter convenablement afin d’homogénéiser la masse. Conserver à l’obscurité pendant au moins 12 heures avant emploi.

4.2. n-hexane, pour chromatographie.

4.3. Éther éthylique, pour chromatographie.

4.4. n-Heptane, pour chromatographie.

4.5. Solution étalon d’arachidate laurique, solution à 0,1 % (m/V) dans l’hexane (étalon interne). (Il est également possible d’utiliser du palmitate de palmityle ou du stéarate de myristyle) 4.5.1. Soudan 1 (1-phenyl-azo-2-naphthol).

4.6. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.7. Gaz auxiliaires: — hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse, — air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de la colonne chromatographique

Suspendre 15 g de gel de silice (4.1) dans le n-hexane (4.2) et l’introduire dans la colonne (3.2). Après tassement spontané, le compléter à l’aide d’un agitateur électrique (3.5) pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Percoler 30 ml de n-hexane afin d’éliminer les impuretés éventuelles. Peser exactement à l’aide de la balance (3.8) 500 mg de l’échantillon dans l’Erlenmeyer de 25 ml (3.1), ajouter la quantité appropriée d’étalon interne (4.5), en fonction du contenu présumé de cires. Par exemple, ajouter 0,1 mg d’arachidate laurique dans le cas de l’huile d’olive et 0,25 à 0,5 mg dans le cas de l’huile de grignons. Transférer l’échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatographique à l’aide de deux portions de 2 ml chacune de n-hexane (4.2).

Laisser s’écouler le solvant jusqu’à 1 mm au-dessus du niveau supérieur de l’absorbant puis percoler 70 ml de n-hexane supplémentaires afin d’éliminer les n-alcanes naturellement présents. Commencer alors l’élution chromatographique en recueillant 180 ml du mélange n-hexane/éther éthylique, rapport 99:1, tout en respectant un débit d’environ 15 gouttes toutes les 10 secondes. L’élution de l’échantillon doit être effectuée à une température ambiante de 22 °C ± 4.

Notes:

— Le mélange n-hexane/éther éthylique (99:1) doit être préparé chaque jour.

— Pour contrôler visuellement l’élution correcte des cires, il est possible d’ajouter à l’échantillon en solution 100 μl de soudan à 1 % dans le mélange d’élution. Le colorant ayant une rétention intermédiaire entre les cires et les triglycérides, lorsque la coloration atteint le fonds de la colonne chromatographique, il convient de suspendre l’élution car toutes les cires ont été éluées.

La fraction ainsi obtenue est séchée dans l’évaporateur rotatif (3.6) jusqu’à élimination pratiquement totale du solvant. Les deux derniers ml du solvant sont éliminés à l’aide d’un faible courant d’azote; ajouter ensuite 2-4 ml de n-heptane

5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.2.1. Opérations préliminaires

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse (3.3), en branchant le terminal d’entrée au système «on-column» et le terminal de sortie au révélateur. Effectuer les contrôles généraux de l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse (tenue des circuits des gaz, efficience du révélateur et du système d’enregistrement, etc.).

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est recommandé de procéder à son conditionnement. Laisser s’écouler un léger débit de gaz à travers la colonne, puis allumer l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse. Chauffer graduellement jusqu’à atteindre, au bout d’environ 4 heures, une température de 350 °C. Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis procéder au réglage de l’appareillage aux conditions de fonctionnement [réglage du débit des gaz, allumage de la flamme, branchement à l’enregistreur électronique (3.3.4), réglage de la température de la chambre pour la colonne, du révélateur, etc.] et enregistrer le signal à une sensibilité au moins 2 fois supérieure à celle prévue pour l’exécution de l’analyse. Le tracé de la ligne de base doit être linéaire, exempt de pics de toute nature, et ne doit pas présenter de déviation.

Une déviation rectiligne négative indique une tenue imparfaite des connexions de la colonne; une déviation positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

5.2.2. Choix des conditions opératoires

D’une manière générale, les conditions opératoires à observer sont les suivantes:

— température de la colonne: —



20 °C/minute 5 °C/minute 20 °C/minute au départ 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— température du révélateur: 350 °C,

— quantité de matière injectée: 1 μl de la solution (2-4 ml) de n-heptane,

— gaz vecteur: hélium ou hydrogène à la vitesse linéaire optimale pour le gaz sélectionné (voir appendice),

— sensibilité instrumentale: en mesure de répondre aux conditions ci-dessous:

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et de l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, de manière à obtenir une séparation de toutes les cires, une résolution satisfaisante des pics (voir figure) et un temps de rétention de l’étalon interne C32 qui doit être de 18 ± 3 minutes. Le pic des cires le plus représentatif doit avoir mesuré au moins 60 % du fond de l’échelle.

Les paramètres d’intégration des pics doivent être déterminés de façon à obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.

Note: Vu la température finale élevée, on admet une dérive positive qui de doit pas être supérieure à 10 % du fonds de l’échelle.

5.3. Exécution de l’analyse

Prélever 1 μl de la solution à l’aide de la microseringue de 10 μl; retirer le piston de la seringue de manière à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l’aiguille dans le dispositif d’injection et, après 1-2 secondes, injecter rapidement; au bout d’environ 5 secondes, extraire lentement l’aiguille.

Effectuer l’enregistrement jusqu’à élution complète des cires.

La ligne de base doit toujours répondre aux conditions requises.

5.4. Identification des pics

L’identification des différents pics doit être effectuée à partir des temps de rétention et par comparaison avec des mélanges de cires aux temps de rétention connus, analysés dans les mêmes conditions.

La figure ci-après représente un chromatogramme des cires d’une huile d’olive vierge.

5.5. Évaluation quantitative

Procéder au calcul des aires des pics de l’étalon interne et des esters aliphatiques de C40 à C46 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur en cires de chacun des esters, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

Où:

Ax = aire du pic de chaque ester, en millimètres carrés;

As = aire du pic de l’étalon interne, en millimètres carrés;

ms = masse d’étalon interne ajoutée, en milligrammes;

m = masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Indiquer la somme des teneurs des différentes cires de C40 à C46, en mg/kg de matière grasse (ppm).

Note: Les composants à quantifier font référence aux pics à nombre de carbone paires compris entre les esters C40 et C46, selon l’exemple de chromatogramme des cires de l’huile d’olive reporté dans la figure ci-après. Si l’ester C46 apparaît en double, il est conseillé, pour l’identifier, d’analyser la fraction des cires d’une huile de grignons d’olive où le pic C46 est facilement identifiable car nettement majoritaire.

Les résultats sont exprimés avec une décimale.

Figure

Chromatogramme des cires d’une huile d’olive ( 5 )

Légende:

I.S. = Arachidate laurique

1. = Esters diterpéniques

2 + 2′ = Esters C40

3 + 3′ = Esters C42

4 + 4′ = Esters C44

5. = Esters C46

6. = Esters stérols et alcool triterpéniques









APPENDICE

Détermination de la vitesse linéraire du gaz

Injecter de 1 à 3 μl de méthane (ou propane) dans l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, après son réglage aux conditions opératoires normales. Chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, à partir du moment de son injection jusqu'au moment de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire, en cm/s, est donnée par la formule L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

▼B









ANNEXE V

DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION ET DU CONTENU EN STÉROLS AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

La méthode décrit le procédé de détermination du contenu en stérols, simples et totaux, des matières grasses.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse, additionnée d'α-cholestanol comme standard interne, est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique. La fraction stérolique est séparée de l'extrait insaponifiable par chromatographie sur plaque de gel de silice basique; les stérols récupérés dans le gel de silice sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse en colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE

3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts rodés.

3.2. ►C1 Ampoules ◄ à décanter de 500 millilitres.

3.3. Ballons de 250 millilitres.

3.4. Équipement complet pour chromatographie en phase solide, avec plaques de verre de 20 × 20 centimètres.

3.5. Lampe à lumière ultraviolette, de longueur d'onde de 366 ou 254 nm.

3.6. Microseringues de 100 et 500 microlitres.

3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 micromètres) de 2 centimètres de diamètre environ et de 5 centimètres de hauteur, avec embout approprié pour filtration sous vide et embout rodé mâle 12/21.

3.8. Fiole à vide 50 millilitres avec embout rodé femelle 12/21 adaptable à l'ampoule filtrante (3.7).

3.9. Tube à fond conique, de 10 millilitres, avec bouchon hermétique.

3.10. Chromatographe en phase gazeuse approprié au fonctionnement avec colonne capillaire, doté d'un système de séparation, constitué de: 3.10.1. Enceinte thermostatée pour la colonne, permettant de maintenir la température désirée avec une précision d'environ 1° C 3.10.2. Ensemble de vaporisation thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilanisé 3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur 3.10.4. Enregistreur-intégrateur approprié au fonctionnement avec un convertisseur-amplificateur.

3.11. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue, de 20 à 30 mètres de long, de 0,25 à 0,32 millimètres de diamètre intérieur, recouverte intérieurement de liquide. SE-52 ou SE-54 ou équivalent, avec une épaisseur comprise entre 0,10 et 0,30 micromètre.

3.12. Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse de 10 ►C1 microlitres ◄ avec aiguille cémentée.

4. RÉACTIFS

4.1. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à environ 2N: dissoudre, tout en refroidissant, 130 grammes d'hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %) dans 200 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol. La solution se conserve dans des bouteilles de verre opaque bien bouchées (éthanol 95 % V/V).

4.2. Éther éthylique pur, pour analyses.

4.3. Sulfate de sodium anhydre pur, pour analyses.

4.4. Plaques de verre recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluorescence, de 0,25 millimètre d'épaisseur (elles sont disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.5. Hydroxyde de potassium, solution éthanolique à 0,2N: dissoudre 13 grammes d'hydroxyde de potassium dans 20 millilitres d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol.

4.6. Benzène, pour chromatographie (5.2.2).

4.7. Acétone, pour chromatographie (5.2.2).

4.8. Hexane pour chromatographie (5.2.2).

4.9. Éther éthylique, pour chromatographie (5.2.2).

4.10. Chloroforme pur, pour analyses.

4.11. ►C1 Solution de référence ◄ pour la chromatographie sur plaque: cholestérol ou phytostérol, solution à ►M6 2 % ◄ dans le chloroforme.

4.12. Dichloro-2′ -7′ fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solution alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium.

4.13. Pyridine anhydre, pour chromatographie.

4.14. Hexaméthyldisilazane.

4.15. Triméthylchlorosilane.

4.16. Solution échantillon des triméthylsilyléthers des stérols: à préparer au moment de l'emploi à partir des stérols tirés des huiles qui les contenaient.

4.17. α-cholestanol, solution à 0,2 % (m/V) dans le chloroforme (standard interne).

4.18. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.19. Gaz auxiliaire: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. PROCÉDÉ

5.1. Préparation de l'insaponifiable 5.1.1. Introduire dans le ballon de 250 millilitres, au moyen de la microseringue de 500 microlitres, un volume de solution d'α-cholestanol à 0,2 % dans le chloroforme (4.17) qui contienne une quantité d'α-cholestanol correspondant à environ 10 % des stérols contenus dans l'aliquote d'échantillon à prélever pour la détermination. Par exemple, pour 5 grammes d'échantillon, il faut ajouter 500 microgrammes de la solution d'α-cholestane à 0,2 % s'il s'agit d'un échantillon d'huile d'olive et 1 500 microlitres s'il s'agit ►M6 ————— ◄ d'huile de grignons d'olive. Évaporer dans un courant d'azote jusquà dessication, puis peser exactement 5 grammes d'échantillon sec et filtré dans le même ballon. Dans le cas d'huiles ►M6 ————— ◄ qui contiennent des quantités considérables de cholestérol, un pic ayant un temps de rétention identique à celui du cholestanol peut être présent. Dans de tels cas, il faut analyser la fraction stérolique en double, avec et sans standard interne ►M6 ou utiliser, au lieu de choléstanol, le betulinol ◄ . 5.1.2. Ajouter 50 millilitres de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium à 2N, mettre en marche le réfrigérant à reflux, chauffer au bain-marie jusqu'à légère ébullition tout en maintenant une agitation énergique jusqu'à que la saponification se soit produite (la solution devient limpide). Continuer à réchauffer pendant 20 minutes, puis ajouter 50 millilitres d'eau distillée que l'on fait descendre du haut du réfrigérant, débrancher le réfrigérant et refroidir le ballon à environ 30° C. 5.1.3. Transvaser le contenu du ballon de façon quantitative, dans une ampoule à décanter de 500 millilitres, en s'aidant d'eau distillé à plusieurs reprises, en utilisant au total environ 50 millilitres. Ajouter environ 80 millilitres d'éther éthylique, agiter énergiquement durant environ 30 secondes et laisser la séparation se faire (note 1). Séparer la phase aqueuse inférieure en la recueillant dans une autre ampoule à décanter. Faire encore deux extractions sur la phase aqueuse, selon les mêmes modalités en utilisant à chaque fois 60 à 70 millilitres d'éther éthylique. Note 1: Des éventuelles émulsions peuvent être éliminées en ajoutant, avec une pissette, une petite quantité d'alcool éthylique ou méthylique. 5.1.4. Réunir les extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter et laver à l'eau distillée (50 ml à chaque fois) jusqu'à réaction neutre de l'eau de lavage. Éliminer l'eau de lavage, dessécher au sulfate de sodium anhydre et filtrer, sur sulfate de sodium anhydre, dans un ballon de 250 ml pesé au préalable, en lavant ampoule et filtre avec de petites quantités d'éther éthylique. 5.1.5. Distiller l'éther jusqu'à ce qu'il en reste de petites quantités, puis porter à sec sous un léger vide ou dans un courant d'azote, parfaire le séchage à l'étuve à 100° C durant un quart d'heure environ et peser après refroidissement dans un dessicateur.

5.2. Séparation de la fraction stérolique. 5.2.1. Préparation des plaques basiques: immerger les plaques au gel de silice (4.4), complètement, dans la solution éthanolique 0,2 N d'hydroxyde de potassium (4.5) durant 10 secondes, laisser les ensuite enfermées sous hotte pendant deux heures et mettre finalement à l'étuve à 100° C pendant une heure. Retirer de l'étuve et conserver dans un dessicateur à chlorure de calcium jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours). Note 2: L'emploi des plaques de gel de silice basiques pour la séparation de la fraction stérolique élimine le besoin du traitement de l'insaponifiable avec l'alumine. De cette manière, tous les composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt. On obtient ainsi la bande des stérols nettement séparée de la bande des alcools aliphatiques et terpéniques. 5.2.2. Introduire dans la cuve de développement un mélange benzène-acétone 95/5 (V/V) jusqu'à une hauteur d'environ 1 centimètre. On peut utiliser à la place un mélange hexane-éther éthylique 55/35 (V/V). Fermer la cuve à l'aide d'une couvercle approprié et laisser ainsi pendant une demi-heure au moins, de façon à ce que l'équilibre liquide/vapeur s'établisse. Il est possible de fixer sur les surfaces intérieures de la cuve des bandes de papier filtré qui plongent dans l'éluant: cette précaution permet de réduire d'un tiers environ le temps de migration du front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants. Note 3: Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être chargé à chaque essai. 5.2.3. Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (5.1.5) dans le chloroforme et, avec la microseringue de ►C1 100 microlitres ◄ , déposer sur la plaque chromatographique (5.2.1), à 2 centimètres environ d'un bord, 0,3 millilitre de la solution susdite en une ligne continue, la plus fine et uniforme possible. Dans l'alignement de la ligne de dépôt, déposer, à une des extrémités de la plaque, 2 à 3 microlitres de la solution de référence des stérols (4.11), dans le but d'identifier la bande des stérols lors du dernier développement. 5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement, préparée comme décrit en (5.2.2). La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20° C. Fermer aussitôt la chambre avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment. 5.2.5. Vaporiser légèrement la plaque et de façon uniforme avec la solution de dichloro-22-72 fluorescéine. Identifier la bande des stérols par alignement avec la tache obtenue avec la solution de référence; délimiter la bande avec un crayon noir le long des bords de la fluorescence. 5.2.6. Racler avec une spatule métallique le gel de silice compris dans la zone délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans l'ampoule filtrante (3.7); ajouter 10 millilitres de chloroforme chaud, mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer à l'aide du vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (3.8) reliée à l'ampoule filtrante. Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (environ 10 millilitres à chaque fois) et recueillir de même le filtrat dans la fiole adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à l'amener à un volume d'environ 4 à 5 millilitres, transvaser la solution résiduelle dans le tube de 10 millilitres (3.9) pesé au préalable, porter à sec en chauffant légèrement dans un léger courant d'azote, reprendre avec quelques gouttes d'acétone, amener à nouveau à sec, mettre 10 minutes environ à l'étuve à 105° C, puis laisser refroidir au dessicateur et peser. Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction stérolique.

5.3. Préparation des triméthylsilyléthers 5.3.1. Ajouter, dans le tube contenant la fraction stérolique, le réactif de silylation, constitué d'un mélange de pyridine-hexaméthyldisilazane-triméthylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (note 4) dans une proportion de 50 microlitres par milligramme de stérols, en évitant toute absorption d'humidité (note 5). Note 4: Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi; en outre, d'autres réactifs silanisants, tels que, par exemple, le bis-triméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosilane à diluer par un même volume de pyridine anhydre. 5.3.2. Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à complète solubilisation des stérols. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes: la solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse. Note 5: La formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucun dérangement. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou de l'altération du réactif. Dans ce cas, l'essai doit être répété.

5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse 5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne 5.4.1.1. Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse, en reliant l'extrémité d'entrée à l'évaporateur connecté au système de séparation et l'extrémité de sortie au détecteur. Effectuer les contrôles généraux du complexe de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système de séparation et du système d'enregistrement, etc.). 5.4.1.2. Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est conseillé de procéder à son conditionnement. Faire passer un léger flux de gaz au travers de cette colonne, puis allumer le complexe de chromatographie en phase gazeuse et commencer un chauffage graduel jusqu'à rejoindre une température d'au moins 20° C supérieure à celle d'exercice (note 6). Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis porter le complexe aux conditions de fonctionnement (régulation du flux gazeux et du fractionnement, allumage de la flamme, jonction avec l'enregistreur électronique, régulation de la température de la chambre pour la colonne du détecteur et de l'initiateur, etc.) et enregistrer le signal à une sensibilité d'au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'exécution de l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive. Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne. Note 6: La température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20° C à la température maximale prévue pour le liquide de répartition employé. 5.4.2. Choix des conditions opératoires 5.4.2.1. Les conditions opératoires maximales sont les suivantes: — température de la colonne: 260° C ± 5° C, — température de l'évaporateur: 280° C, — température du détecteur: 290° C, — vitesse linéaire du gaz de transport: hélium, 20 à 35 centimètres par seconde; hydrogène, 30 à 50 centimètres par seconde, — ►C1 rapport de division ◄ : de 1/50 à 1/100, — sensibilité instrumentale: de 4 à 16 fois l'atténuation minimale, — sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 millivolts sur échelle de fond, — vitesse du papier: 30 à 60 centimètres par heure, — quantité de substance injectée: 0,5 à 1 microlitre de solution de TMSE. Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de façon à obtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes: — le temps de rétention du β-sitostérol doit être de 20 ± 5 minutes, — le pic de campestérol doit être: pour l'huile d'olive (contenu moyen 3 %) 15 ± 5 % de l'échelle de fond, pour l'huile de soja (contenu moyen 20 %) 80 ± 10 % de l'échelle de fond, — il doit y avoir séparation de tous les stérols présents; il est nécessaire que les autres pics séparés soient aussi complètement résolus, ce qui veut dire que le tracé du pic doit rejoindre la ligne de base avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toutefois tolérée à condition, cependant, qu'elle soit quantifiable selon la perpendiculaire au pic à TRR 1,02. 5.4.3. Exécution de l'analyse 5.4.3.1. Prélever, avec la microseringue de 10 microlitres, 1 microlitre d'hexane, aspirer 0,5 microlitre d'air et successivement 0,5 et 1 microlitre de la solution de l'échantillon; tirer encore le piston de la seringue de façon à ce que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille au travers de la membrane du complexe d'injection et, après 1 à 2 secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, après 5 secondes environ. 5.4.3.2. Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des TMSE des stérols présents. La ligne de base doit toujours correspondre aux qualités requises (5.4.1.2). 5.4.4. Identification des pics L'identification des pics uniques est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des stérols, analysés dans les mêmes conditions. Les stérols sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol, 24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, Δ 7 campestérol, Δ 5,23 stigmastadiénol, chlérostérol, β-sitostérol, sitostanol, Δ 5-avénastérol, 5,24 stigmastadiénol, Δ 7-stigmasténol, Δ 7-avénastérol. Dans le tableau 1 sont reportés les temps de rétention relatifs au sitostérol pour les colonnes SE 52 et SE 54. Les figures 1 et 2 illustrent les chromatogrammes typiques de quelques huiles. 5.4.5. Évaluation quantitative 5.4.5.1. Procéder, avec l'intégrateur, au calcul de l'aire des pics de l'α-cholestanol et des stérols. Ne pas considérer les pics éventuels de compositions non comprises dans celles énumérées dans le tableau 1. Le coefficient de réponse GLC de l'α-cholestanol s'entend égal à 1. 5.4.5.2. Calculer le contenu en chaque stérol simple, en milligrammes par 100 grammes de matière grasse, comme suit: où: Ax = aire du pic du stérol x ►M6 ————— ◄ ; As = aire du pic d'α-cholestanol ►M6 ————— ◄ ; ms = poids d'α-cholestanol ajouté, en milligrammes; m: = poids de l'échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1. Rapporter les contenus de chaque stérol en milligrammes par 100 grammes de matière grasse et leur somme comme «stérols totaux».

6.2. On calcule le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre l'aire du pic correspondant et la somme des aires des pics des stérols. Ax = aire du pic x. A = somme des aires de tous les pics.









APPENDICE

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

Dans le chromatographe en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires normales, injecter 1 à 3 microlitres de méthane (ou propane) et chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de l'injection et celui de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire en centimètres par seconde est donnée par L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.







Tableau I Temps de rétention relatifs des stérols Pic Identification Temps de rétention relatif Colonne SE 54 Colonne SE 52 1 cholestérol Δ-5-cholestène-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestane 0,68 0,64 3 brassicastérol [24S]-24-méthyl-Δ-5,22-cholestadiène-3β-ol 0,73 0,71 4 24-méthylène-cholestérol 24-méthylén-Δ-5,24-cholestadiène-3β-ol 0,82 0,80 5 campestérol [24R]-24-méthyl-Δ-5-cholestène-3β-ol 0,83 0,81 6 campestanol [24R]-24-méthyl-cholestane-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmastérol [24S]-24-éthyl-Δ-5,22-cholestadiène-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-campestérol [24R]-24-méthyl-Δ-7-cholestène-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadiénol [24S,R]-24-éthyl-Δ-5,23-cholestadiène-3β-ol 0,95 0,95 10 chlérostérol [24S]-24-éthyl-Δ-5,25- ►C1 cholestadiène ◄ -3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitostérol [24R]-24-éthyl-Δ-5-cholestène-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-éthyl-cholestane-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avénastérol [24Z]-24-éthyliden-5-cholestène-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadiénol [24S,R]-24-éthyl-Δ-5,24-cholestadiène-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmasténol [24S,R]-24-éthyl- ►C1 Δ-7-cholestène ◄ -3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avénestérol [24Z]-24-éthyliden-Δ-7-cholestène-3β-ol 1,16 1,16

Figure 1

Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive brute

Figure 2

Chromatographie en phase gazeuse de la fraction stérolique d'une huile d'olive raffinée









ANNEXE VI

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ÉRYTHRODIOL ET EN UVAOL

AVANT-PROPOS

L'érythrodiol (terme générique qui désigne conventionnellement l'ensemble des diols érythrodiol et uvaol) est un élément constitutif de l'insaponifiable que l'on trouve dans certains types de matières grasses. Son dosage peut servir à vérifier la présence d'huile d'olive d'extraction, sa concentration y étant nettement plus élevée que dans d'autres huiles (huiles d'olive de pression, huiles de pépins de raisin).

1. OBJET

La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en érythrodiol des matières grasses.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans de l'éthanol. L'insaponifiable est ensuite extrait avec de l'éther éthylique, purifié par passage sur une colonne d'alumine et fractionné par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice. Les bandes des fractions stérolique et érythrodiolique sont alors isolées.

Les stérols et l'érythrodiol récupérés sur la plaque sont transformés en triméthylsilyléthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse.

Le résultat est exprimé en pourcentage d'érythrodiol par rapport à l'ensemble érythrodiol + stérols.

3. APPAREILLAGE

3.1. Appareillage décrit à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).

4. RÉACTIFS

4.1. Réactifs énumérés à l'annexe V (détermination de la teneur en stérols).

4.2. Solution de référence d'érythrodiol à 0,5 % dans du chloroforme.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de l'insaponifiable

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.1.2 de l'annexe V.

5.2. Séparation de l'érythrodiol et des stérols

5.2.1. Voir paragraphe 5.2.1 de la méthode de l'annexe V.

5.2.2. Voir paragraphe 5.2.2 de la même méthode.

5.2.3. Préparer une solution d'insaponifiable (à 5 %) dans le chloroforme. Avec la microseringue de 0,1 millilitre, déposer sur une plaque chromatographique, à environ 1,5 centimètre du bord inférieur, 0,3 millilitre de la solution susmentionnée, en une ligne la plus fine et la plus uniforme possible. À une extrémité de la plaque, déposer, pour référence, quelques microlitres des solutions de cholestérol et d'érythrodiol.

5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indiquée au paragraphe 5.2.1. La température ambiante doit être d'environ 20° C. Fermer aussitôt avec le couvercle et éluer jusqu'à ce que le niveau du solvant arrive à environ 1 centimètre du bord supérieur de la plaque. Enlever ensuite la plaque de la cuve de développement et évaporer le solvant dans un courant d'air chaud.

5.2.5. Vaporiser uniformément la solution de dichloro-2′ 7′ fluorescéine sur la plaque. En examinant cette dernière à la lumière ultraviolette, identifier les bandes de stérols et de l'érythrodiol par alignement avec les éléments de référence, puis délimiter avec une pointe légèrement en dehors des bords de la fluorescence.

5.2.6. Avec une spatule métallique, racler le gel de silice compris dans les zones délimitées. Introduire le matériau retiré de la plaque dans une fiole de 50 millilitres. Ajouter 15 millilitres de chloroforme chaud, bien agiter et filtrer dans l'ampoule à filtre poreux en transférant le gel de silice sur le filtre même. Laver par trois fois au chloroforme chaud (environ 10 millilitres à chaque fois) et receuillir le filtrat dans un ballon de 100 millilitres. Évaporer jusqu'à obtention d'un volume de 4 à 5 millilitres, transvaser, dans un tube centrifugeur à fond conique de 10 millilitres préalablement pesé, porter à sec en chauffant légèrement dans un courant d'azote, et peser.

5.3. Préparation des triméthylsilyléthers

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.3 de la méthode de l'annexe V.

5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

Procéder comme indiqué au paragraphe 5.4 de la même méthode.

L'analyse par chromatographie en phase gazeuse doit être réalisée dans des conditions permettant le respect des exigences de l'analyse des stérols et la séparation des TMSE de l'érythrodiol et de l'uvaol.

Après avoir injecté l'échantillon, laisser le papier se dérouler jusqu'à élution complète des stérols présents, de l'érythrodiol et de l'uvaol. Identifier ensuite les pics (les temps de rétention relatifs de l'érythrodiol et de l'uvaol, par rapport au β-sitostérol, sont respectivement de 1,4 et 1,55 environ).

Calculer ensuite les aires comme indiqué pour les stérols.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

où:

A1 : aire du pic de l'érythrodiol ►M6 ————— ◄ ;

A2 : aire du pic de l'uvaol ►M6 ————— ◄ ;

Astérols : somme des aires des stérols présents ►M6 ————— ◄ .

Indiquer le résultat avec une décimale.

▼M21









ANNEXE VII

DÉTERMINATION DU POURCENTAGE DU 2-GLYCÉRIL MONOPALMITATE

1. OBJET ET DOMAINE D’APPLICATION

Cette méthode décrit la procédure analytique pour la détermination du pourcentage d’acide palmitique en position 2 des triglycérides au moyen de l’évaluation du 2-glycéril monopalmitate.

Cette méthode est applicable aux huiles végétales liquides à température ambiante (20 °C).

2. PRINCIPE

Après préparation, l’échantillon d’huile est soumis à l’action de la lipase pancréatique: une hydrolyse partielle et spécifique dans les positions 1 et 3 de la molécule de triglycéride entraîne l’apparition des monoglycérides en position 2. Le pourcentage de 2-glycéril monopalmitate dans la fraction monoglycéridique est déterminé, après silylation, par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE ET MATÉRIEL COURANT

3.1. Erlenmeyer, 25 ml

3.2. Béchers 100, 250 et 300 ml

3.3. Colonne en verre pour chromatographie, diamètre intérieur 21-23 mm, longueur 400 mm, équipée d’une plaque en verre fritté et d’un robinet

3.4. Éprouvettes graduées de 10, 50, 100 et 200 ml

3.5. Ballons de 100 et 250 ml

3.6. Évaporateur rotatif

3.7. Tubes de centrifugeuse à fond conique de 10 ml, avec bouchon rodé

3.8. Centrifugeuse pour des tubes de 10 et 100 ml

3.9. Thermostat permettant de maintenir la température à 40 ± 0,5 °C

3.10. Pipettes graduées de 1 et 2 ml

3.11. Seringue hypodermique de 1 ml

3.12. Microseringue de 100 μl

3.13. Entonnoir, 1 000 ml

3.14. Chromatographe en phase gazeuse pour colonnes capillaires, équipé d’un dispositif d’injection «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne et d’un four susceptible de maintenir la température choisie à 1 °C près

3.15. Injecteur «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne

3.16. Détecteur à ionisation de flamme et électromètre

3.17. Enregistreur-intégrateur adapté à l’électromètre avec une vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et une vitesse variable de déroulement du papier

3.18. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue de 8 à 12 mètres, d’un diamètre intérieur de 0,25 à 0,32 mm, recouverte de methylpolysiloxane ou de phényl méthylpolysiloxane 5 %, d’une épaisseur de 0,10-0,30 μm, pouvant être utilisée à 370 °C

3.19. Microseringue de 10 μl munie d’une aiguille cémentée, d’au moins 7,5 cm de long, pour injection directe sur colonne

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice ayant une granulométrie comprise entre 0,063 et 0,200 mm (70/280 mesh), préparé comme suit: mettre le gel de silice dans une capsule de porcelaine, sécher à l’étuve à 160 °C pendant 4 heures, puis laisser refroidir à température ambiante dans un dessiccateur. Ajouter un volume d’eau équivalent à 5 % du poids du gel de silice, comme suit: dans un Erlenmeyer de 500 ml, peser 152 g de gel de silice et ajouter 8 g d’eau distillée, boucher et agiter délicatement pour obtenir une répartition uniforme de l’eau. Laisser reposer au moins 12 heures avant l’emploi.

4.2. n-hexane (pour chromatographie)

4.3. Isopropanol

4.4. Isopropanol, solution aqueuse 1/1 (V/V)

4.5. Lipase pancréatique. La lipase utilisée doit avoir une activité comprise entre 2,0 et 10 unités de lipase par mg. (Il existe dans le commerce des lipases pancréatiques ayant une activité comprise entre 2 et 10 unités par mg d’enzyme.)

4.6. Solution tampon de tris-hydroxy-méthylaminométhane: solution aqueuse 1 M amenée jusqu’à pH 8 (contrôle potentiométrique) par du HCI concentré (1/1 V/V)

4.7. Cholate de sodium, qualité enzymatique, solution aqueuse à 0,1 % (cette solution doit être utilisée dans les 15 jours suivant sa préparation)

4.8. Chlorure de calcium, solution aqueuse à 22 %

4.9. Éther diéthylique pour chromatographie

4.10. Solvant de développement: mélange n-hexane/éther diéthylique (87/13) (V/V)

4.11. Hydroxyde de sodium, solution à 12 % en poids

4.12. Phénolphtaléine, solution à 1 % dans l’éthanol

4.13. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium, pour chromatographie en phase gazeuse

4.14. Gaz auxiliaires: hydrogène, à 99 % minimum, exempt d’humidité et de substances organiques; et air, pour chromatographie en phase gazeuse de la même pureté

4.15. Réactif de silanisation: mélange pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V). (Des solutions prêtes à l'emploi existent dans le commerce. D’autres réactifs de silylation peuvent être employés, notamment bis-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilués avec un volume identique de pyridine anhydre.)

4.16. Échantillons de référence: monoglycérides purs ou mélanges de monoglycérides ayant une composition en pourcentage connue similaire à celle de l’échantillon.

5. PROCÉDURE

5.1. Préparation de l’échantillon

5.1.1. Les huiles ayant une acidité libre inférieure à 3 % n’ont pas besoin d’être neutralisées avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Les huiles ayant une acidité libre supérieure à 3 % devront être soumises à la neutralisation conformément au point 5.1.1.1. 5.1.1.1. Dans l’entonnoir de 1 000 ml (3.13), verser 50 g d’huile et 200 ml de n-hexane. Ajouter 100 ml d’isopropanol et une quantité de la solution d’hydroxyde de sodium à 12 % (4.11) correspondant à l’acidité libre de l’huile majorée de 5 %. Agiter énergiquement pendant une minute. Ajouter 100 ml d’eau distillée, agiter de nouveau et laisser reposer. Après décantation, éliminer la couche inférieure contenant les savons. Éliminer les éventuelles couches intermédiaires (mucilage et substances insolubles). Laver la solution hexanique de l’huile neutralisée avec des portions successives de 50-60 ml de la solution isopropanol/eau 1/1 (V/V) (4.4) jusqu’à disparition de la coloration rosée de la phénolphtaléine. Éliminer la plus grande partie de l’hexane par distillation sous vide (utiliser par exemple un évaporateur rotatif) et transférer l’huile dans un ballon de 100 ml (3.5). Sécher l’huile sous vide jusqu’à élimination totale du solvant. À la fin de cette opération, l’acidité de l’huile doit être inférieure à 0,5 %.

5.1.2. Introduire 1,0 g d’huile préparée comme indiqué ci-dessus dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1) et dissoudre dans 10 ml de mélange de développement (4.10). Laisser reposer la solution pendant au moins 15 minutes avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Si la solution est trouble, la centrifuger pour garantir des conditions optimales pour la chromatographie. (Des cartouches de gel de silice SPE de 500 mg prêtes à l’emploi peuvent être utilisées.)

5.1.3. Préparation de la colonne chromatographique Verser dans la colonne (3.3) environ 30 ml du solvant de développement (4.10), introduire un morceau de coton dans la partie inférieure de la colonne à l’aide d’une baguette de verre; presser pour éliminer l’air. Dans un bécher, préparer une suspension de 25 g de gel de silice (4.1) dans environ 80 ml de solvant de développement et le verser dans la colonne à l’aide d’un entonnoir. Vérifier que tout le gel de silice a été introduit dans la colonne; laver avec le solvant de développement (4.10), ouvrir le robinet et laisser le niveau du liquide atteindre environ 2 mm au-dessus du niveau supérieur du gel de silice.

5.1.4. Chromatographie sur colonne Dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1), peser exactement 1,0 g d’échantillon préparé conformément au point 5.1. Dissoudre l’échantillon dans 10 ml de solvant de développement (4.10). Verser la solution dans la colonne chromatographique préparée conformément au point 5.1.3. Éviter de remuer la surface de la colonne. Ouvrir le robinet et laisser s’écouler la solution de l’échantillon jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau du gel de silice. Développer avec 150 ml de solvant de développement. Ajuster le débit à 2 ml/min (de façon à ce que 150 ml s’écoulent dans la colonne en 60-70 minutes environ). Récupérer l’éluat dans un ballon de 250 ml préalablement taré. Évaporer le solvant sous vide et enlever les dernières traces de celui-ci sous un courant d’azote. Peser le ballon et calculer l’extrait récupéré [En cas d’utilisation de cartouches SPE de silice prêtes à l’emploi, procéder comme suit: introduire 1 ml de solution (5.1.2) dans les cartouches préalablement préparées avec 3 ml de n-hexane. Après percolation de la solution, développer avec 4 ml de n-hexane/éther diéthylique 9/1 (V/V). Récupérer l’éluat dans un tube de 10 ml et le soumettre à évaporation sous un courant d’azote jusqu’à siccité. Soumettre le résidu sec à l’action de la lipase pancréatique (5.2). Il est fondamental de vérifier la composition en acide gras avant et après passage sur cartouche SPE].

5.2. Hydrolyse par la lipase pancréatique

5.2.1. Dans le tube de la centrifugeuse, peser 0,1 g de l’huile préparée conformément au point 5.1. Ajouter 2 ml de solution tampon (4.6), 0,5 ml de la solution de cholate de sodium (4.7) et 0,2 ml de la solution de chlorure de calcium, en agitant bien après chaque addition. Fermer le tube par le bouchon rodé et le placer dans le thermostat à 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Ajouter 20 mg de lipase, agiter soigneusement (en évitant de mouiller le bouchon) et mettre le tube dans le thermostat pendant exactement 2 minutes, puis le retirer, agiter énergiquement pendant 1 minute exactement et laisser refroidir.

5.2.3. Ajouter 1 ml d’éther diéthylique, boucher et agiter énergiquement, puis centrifuger et transférer la solution d’éther dans un tube propre et sec, à l’aide d’une microseringue.

5.3. Préparation des dérivés silanisés et de la chromatographie en phase gazeuse

5.3.1. À l’aide d’une microseringue, introduire 100 μl de solution (5.2.3) dans un tube à fond conique de 10 ml.

5.3.2. Éliminer le solvant sous un léger courant d’azote, ajouter 200 μl de réactif de silanisation (4.15), boucher le tube et laisser reposer pendant 20 minutes.

5.3.3. Après 20 minutes, ajouter 1 à 5 ml de n-hexane (en fonction des conditions chromatographiques): la solution résultant est prête pour la chromatographie en phase gazeuse.

5.4. Chromatographie en phase gazeuse

Les conditions d’opération sont les suivantes:

— température de l’injecteur (injecteur «on-column») inférieure à la température d’ébullition du solvant (68 °C),

— température du détecteur: 350 °C,

— température de la colonne: programmation de la température du four: 60 °C pendant 1 minute, en augmentant de 15 °C par minute jusqu’à 180 °C, puis de 5 °C par minute jusqu’à 340 °C, puis 340 °C pendant 13 minutes,

— gaz vecteur: hydrogène ou hélium, réglé à la vitesse linéaire adéquate en vue d’obtenir la résolution reflétée dans la figure 1. Le temps de rétention du triglycéride C54 doit être de 40 ± 5 minutes (voir figure 2). (Les conditions d’opérations indiquées ci-dessus sont proposées à titre indicatif. Chaque opérateur devra les optimiser pour atteindre la résolution désirée. La hauteur du pic correspondant au 2-glycéryl monopalmitate doit avoir une hauteur minimale égale à 10 % de l’échelle de l’enregistreur),

— quantité de substance injectée: 0,5-1 μl de la solution (5 ml) de n-hexane (5.3.3).

5.4.1. Identification des pics

Les monoglycérides individuels sont identifiés en fonction des temps de rétention obtenus et par rapport à ceux obtenus avec les mélanges standards de monoglycérides analysés dans les mêmes conditions.

5.4.2. Évaluation quantitative

L’aire de chaque pic est calculée au moyen d’un intégrateur électronique.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Le pourcentage de glycéril monopalmitate est calculé à partir du rapport entre l’aire du pic correspondant et la somme des aires des pics de tous les monoglycérides (voir figure 2), selon la formule:

Où:

Ax = aire du pic correspondant au glycéryl monopalmitate;

ΣA = somme des aires de la totalité des pics des monoglycérides.

Le résultat doit être donné avec une décimale.

7. COMPTE RENDU DE L’ANALYSE

Le compte rendu de l’analyse devra spécifier:

— la référence à cette méthode,

— toute information nécessaire à l’identification complète de l’échantillon,

— le résultat de l’analyse,

— tout écart de cette méthode, qu’il s’agisse d’une décision des parties concernées ou pour une autre raison,

— les détails d’identification du laboratoire, la date de l’analyse et la signature des responsables de celle-ci.

Figure 1

Chromatogramme des produits de la réaction de silanisation obtenus par l’action de la lipase sur une huile d’olive raffinée additionnée de 20 % d’huile estérifiée (100 %)

Figure 2

Chromatogramme de:

A) huile d’olive non estérifiée, après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après. Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %. Légende: 1 = Acides gras libres 2 = Monoglycérides 3 = Diglycérides 4 = Triglycérides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

Chromatogramme de:

B) huile estérifiée après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après. Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %. Légende: 1 = Acides gras libres 2 = Monoglycérides 3 = Diglycérides 4 = Triglycérides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

8. NOTES

Il existe dans le commerce des lipases ayant une activité satisfaisante. Il est également possible de les préparer au laboratoire de la façon suivante:

Refroidir à 0 °C 5 kg de pancréas frais de porc. Débarrasser de la graisse solide et du tissu conjonctif qui les entourent et les triturer dans un moulin à lames jusqu’à obtention d’une pâte fluide. Agiter cette pâte pendant 4 à 6 heures avec 2,5 litres d’acétone anhydre puis centrifuger. Extraire le résidu trois autres fois avec le même volume d’acétone anhydre, puis deux fois avec un mélange acétone/éther diéthylique (1/1) (V/V) et deux fois avec de l’éther diéthylique.

Sécher le résidu pendant 48 heures sous vide pour obtenir une poudre stable qui se conservera longtemps au réfrigérateur et à l’abri de l’humidité.

Préparer une émulsion d’huile d’olive comme suit:

Agiter pendant 10 minutes dans un mélangeur un mélange constitué de 165 ml d’une solution de gomme arabique à 100 g/l, 15 g de glace pilée et 20 ml d’une huile d’olive préalablement neutralisée.

Introduire successivement 10 ml de cette émulsion dans un bécher de 50 ml puis 0,3 ml d’une solution de cholate de sodium à 0,2 g/ml et 20 ml d’eau distillée.

Placer le bécher dans un thermostat régulé à 37 °C; introduire les électrodes du pH-mètre et l’agitateur à hélice.

Ajouter goutte à goutte, à l’aide d’une burette, une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N jusqu’à obtention d’un pH de 8,3.

Ajouter un volume de suspension de poudre de lipase dans l’eau (0,1 g/ml de lipase). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3, mettre en marche le chronomètre et ajouter la solution d’hydroxyde de sodium, goutte à goutte, au rythme nécessaire pour maintenir le pH à la valeur de 8,3. Noter chaque minute le volume de solution consommé.

Reporter les données dans un système d’axes de coordonnées en portant en abscisses les temps et en ordonnées les millilitres de solution alcaline 0,1 N consommés pour maintenir le pH constant. Un graphique linéaire doit être obtenu.

L’activité de la lipase, mesurée en unités lipase par mg, est donnée par la formule suivante:

où:

A est l’activité en unités lipase/mg;

V est le nombre de millilitres de solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N par minute (calculé à partir du graphique);

N est la normalité de la solution d’hydroxyde de sodium;

m est la masse en mg de la lipase d’essai.

L’unité lipase est définie comme la quantité d’enzyme qui libère 10 micro-équivalents d’acide par minute.

▼M20 —————

▼B









ANNEXE IX

ANALYSE SPECTROPHOTOMÉTRIQUE

PRÉLIMINAIRES

L'examen spectrophotométrique dans l'ultraviolet peut fournir des indications sur la qualité d'une matière grasse, sur son état de conservation et sur les modifications dues aux processus technologiques.

Les absorptions aux longueurs d'onde prévues dans la méthode sont dues à la présence de systèmes dièniques et trièniques conjugués. Les valeurs de ces absorptions sont exprimées comme extinction spécifique E1 cm 1 % (extinction d'une solution de matière grasse à 1 % dans le solvant prescrit, pour une épaisseur de 1 % cm) noté de façon conditionnelle par K (dit également coefficient d'extinction).

1. OBJET

La méthode décrit le procédé de l'exécution de l'examen spectrophotométrique dans l'ultraviolet des matières grasses.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La matière grasse étudiée est dissoute dans le solvant requis, puis on détermine l'extinction de la solution à la longueur d'onde prescrite, par rapport au solvant pur. On calcule les extinctions spécifiques à partir des lectures spectrophotométriques.

3. APPAREILLAGE

3.1. Spectrophotomètre pour mesure des extinctions dans l'ultraviolet entre 220 et 360 nm, avec possibilité de lecture pour chaque unité nanométrique.

3.2. ►C1 Cuves de quartz ◄ , avec couvercle, de parcours optique de 1 centimètre. Les cuves, remplies d'eau ou d'un autre solvant idoine, ne doivent pas présenter de différences supérieures à 0,01 unité d'extinction.

3.3. Fioles jaugées de 25 millilitres.

▼M6

3.4. Colonne pour chromatographie ayant une partie supérieure de 270 mm de long et 35 mm de diamètre ainsi qu'une partie inférieure de 270 mm de long et 10 mm de diamètre.

▼B

4. RÉACTIFS

4.1. Isooctane (2,2,4-triméthylpentane) spectrophotométriquement pur: il doit avoir, par rapport à l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 60 % à 220 nm et non inférieure à 95 % à 250 nm ou bien — cyclohexane spectrophotométriquement pur: il doit avoir, par rapport à l'eau distillée, une transmittance non inférieure à 40 % à 220 nm et non inférieure à 95 % à 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Alumine basique pour chromatographie sur colonne, préparée et contrôlée comme décrit dans l'appendice I.

4.3. n-Hexane pour chromatographie.

5. PROCÉDÉ

5.1. L'échantillon examiné doit être parfaitement homogène et exempt d'impuretés en suspension. Les huiles liquides à température ambiante sont filtrées sur papier à une température d'environ 30° C, les graisses solides sont homogénéisées et filtrées à une température non supérieure à 10° C au-dessus de leur température de fusion.

5.2. Peser 0,25 gramme environ de l'échantillon ainsi préparé dans une fiole jaugée de 25 millilitres, compléter avec le solvant prescrit et homogénéiser. La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier.

5.3. Remplir une cuve avec la solution obtenue et mesurer les extinctions, en employant comme référence le solvant employé, aux longueurs d'onde comprises entre 232 et 276 nm. Les valeurs d'extinction lues doivent être comprises dans l'intervalle de 0,1 à 0,8; dans le cas contraire, il est nécessaire de répéter les mesures en utilisant les solutions plus concentrées ou plus diluées appropriées.

5.4. Au cas ou serait requise la détermination des extinctions spécifiques après passage sur alumine, on procède de la façon suivante: introduire dans la colonne chromatographique 30 grammes d'alumine basique en suspension dans l'hexane; éliminer l'excès d'hexane après tassement de l'absorbant, ou au moins jusqu'à 1 centimètre environ au dessus du niveau supérieure de l'alumine. Dissoudre 10 grammes de matière grasse, homogénéisée et filtrée comme décrit au point 5.1, dans 100 millilitres d'hexane et verser cette solution dans la colonne. Recueillir l'éluant et évaporer le solvant sous vide et à une température inférieure à 25° C. Procéder immédiatement sur la matière grasse obtenue comme décrit au point 5.2.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1. Rapporter les extinctions spécifiques (coefficients d'extinction) aux différentes longueurs d'onde, calculées comme suit: où: Kλ : extinction spécifique à la longueur d'onde λ; Eλ : extinction mesurée à la longueur d'onde λ; c : concentration de la solution en grammes par 100 millilitres; s : épaisseur de la cuvette en centimètres Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6.2. L'examen spectrophotométrique de l'huile d'olive selon la méthode officielle des règlements officiels de la Communauté économique européenne prévoit la détermination de l'extinction spécifique, en solution dans l'isooctane, aux longueurs d'onde de 232 et 270 nm et la détermination du Δ K exprimé comme: où Km est l'extinction spécifique à la longueur d'onde m, longueur d'onde d'absorbance maximale aux environs de 270 nm.









APPENDICE I

Préparation de l'alumine et contrôle de son activité

A.1.1. Préparation de l'alumine

Mettre dans un récipient, qui ferme hermétiquement, l'alumine au préalable desséchée au four à 380-400° C pendant 3 heures, ajouter de l'eau distillée à raison de 5 millilitres pour 100 grammes d'alumine, fermer rapidement le récipient, agiter à plusieurs reprises, puis laisser reposer pendant au moins 12 heures avant emploi.

A.1.2. Contrôle de l'activité de l'alumine

Préparer une colonne chromatographique avec 30 grammes d'alumine. Opérer comme décrit au paragraphe 5.4. Faire passer à travers la colonne un mélange constitué de:

— 95 % d'huile d'olive vierge, ayant une extinction spécifique à 268 nm inférieure à 0,18,

— 5 % d'huile d'arachide traitée avec des terres décolorantes lors de son raffinage, ayant une extinction spécifique à 268 nm supérieure ou égale à 4.

Si le mélange après passage sur colonne présente une extinction spécifique à 268 nm supérieure à 0,11, l'alumine est acceptable, sinon, il faut augmenter le taux d'hydratation.









APPENDICE II

Étalonnage du spectrophotomètre

A.2. L'appareillage doit être contrôlé périodiquement (au moins tout les six mois), que ce soit pour la correspondance de la longueur d'onde ou pour l'exactitude de la réponse. A.2.1. Le contrôle de la réponse de la longueur d'onde peut être fait au moyen d'une lampe à vapeur de mercure ou de filtres appropriés. A.2.2. Pour le contrôle de la cellule photoélectrique et du photomultiplicateur, procéder ainsi: peser 0,2 gramme de chromate de potassium pur pour spectrophotométrie et dissoudre dans une solution d'hydroxyde de potassium 0,05 N et compléter au volume dans une fiole jaugée de 1 000 millilitres. Prélever ensuite 25 millilitres exactement de la solution obtenue, transférer dans une fiole jaugée de 500 millilitres et compléter au volume avec la même solution d'hydroxyde de potassium. Mesurer l'extinction à 275 nm de la solution ainsi obtenue, en se servant de la solution d'hydroxyde de potassium comme référence. L'extinction mesurée avec une cuve optique de 1 centimètre devra être de 0,200 ± 0,005.









ANNEXE X «A»

ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS

1. DOMAINE D'APPLICATION

La présente méthode donne des directives générales pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse de la composition qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides gras obtenu selon la méthode visée à l'annexe X B.

La méthode n'est pas applicable aux acides gras polymérisés.

2. RÉACTIFS

2.1. Gaz vecteur

Gaz inerte (azote, hélium, argon, hydrogène, etc.) soigneusement desséché et contenant moins de 10 milligrammes par kilogramme d'oxygène.

Note 1:

L'hydrogène que l'on utilise comme gaz vecteur uniquement avec les colonnes capillaires permet de doubler la vitesse d'analyse mais présente des dangers. Il existe cependant des dispositifs de sécurité.

2.2. Gaz auxiliaires

2.2.1. Hydrogène (de pureté ≥ 99,9 %), ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.2.2. Air ou oxygène ne contenant pas d'impuretés organiques.

2.3. Produits d'étalonnage

Mélange d'esters méthyliques d'acides gras purs, ou esters méthyliques d'un corps gras, de composition connue, si possible voisine de celle du corps gras à analyser.

Prendre toutes précautions afin d'éviter l'oxydation des acides gras polyinsaturés.

3. APPAREILLAGE

Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromatographie en phase gazeuse utilisant des colonnes remplies et/ou capillaires et un détecteur à ionisation de flamme. Tout appareillage ayant la même efficacité et la même résolution que celles définies au point 5.1.2 convient.

3.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse

L'appareil de chromatographie en phase gazeuse doit comprendre les éléments suivants.

3.1.1. Dispositif d'injection

Utiliser un dispositif d'injection:

a) soit avec des colonnes remplies, le dispositif ayant le plus faible volume mort possible (dans ce cas, il doit pouvoir être porté à une température supérieure, de 20° C à 50° C, à celle de la colonne);

b) soit avec des colonnes capillaires, auquel cas le dispositif doit être spécialement conçu pour l'utilisation de telles colonnes. Il peut être du type diviseur ou du type à injection totale en tête de colonne refroidie (injecteur «non column»).

Note 2:

En l'absence de corps gras contenant des acides gras à moins de 16 atomes de carbone, un injecteur à aiguille mobile peut être utilisé.

3.1.2. Four

Le four doit être en mesure de porter la colonne à une température d'au moins 260° C et de maintenir la température choisie à 1° C près avec une colonne remplie et à 0,1° C près avec une colonne capillaire. Cette dernière caractéristique est particulièrement importante lorsqu'on utilise un tube en silice fondue.

L'utilisation d'un appareil équipé d'un programmateur de température est recommandée dans tous les cas et, en particulier, en présence d'acides gras à moins de 16 atomes de carbone.

3.1.3. Colonne remplie

3.1.3.1. Colonne, en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser: verre ou, à défaut, acier inoxydable, ayant les dimensions suivantes: a) longueur: de 1 à 3 mètres. Une colonne relativement courte sera utilisée dans le cas où des acides gras à longue chaîne (> C20) sont présents. Dans le cas de la détermination des acides en C4 et en C6, il est recommandé d'utiliser une colonne de 2 m; b) diamètre intérieur: de 2 à 4 millimètres. Note 3: Si des constituants polyinsaturés à plus de trois doubles liaisons sont présents, une colonne en acier inoxydable peut provoquer leur décomposition. Note 4: Un système à double colonne remplie peut être utilisé.

3.1.3.2. Remplissage, comprenant les éléments suivants: a) support: terre de diatomées lavée aux acides et silanisée, ou tout autre support inerte pouvant convenir, avec un étroit intervalle de granulométrie (25 micromètres entre 125 et 200 micromètres), la dimension moyenne étant liée au diamètre intérieur et à la longueur de la colonne; b) phase stationnaire: phase polair