1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 1
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►BHUITIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 15 juin 1978
portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des
animaux
(78/633/CEE)
(JO L 206 du 29.7.1978, p. 43)
Modifiée par:
Journal officiel
nopage date
►M1Directive 81/680/CEE de la Commission du 30 juillet 1981 L 246 32 29.8.1981
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HUITIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 15 juin 1978
portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le
contrôle officiel des aliments des animaux
(78/633/CEE)
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,vu la directive 70/373/CEE du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant
l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes
d'analyses communautaires pour le contrôle officiel des aliments des
animaux(
1), modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion, et notam-
ment son article 2,
considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels
des aliments des animaux visant à constater que les conditionsprescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ouadministratives concernant la qualité et la composition des aliments
des animaux sont respectées, sont effectuées selon des modes de prélè-
vement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;
considérant que les directives de la Commission 71/250/CEE du 15
juin 1971(
2), 71/393/CEE du 18 novembre 1971(3), 72/199/CEE du
27 avril 1972(4), 73/46/CEE du 5 décembre 1972(5), 74/203/CEE du
25 mars 1974(6), 75/84/CEE du 20 décembre 1974(7) et 76/372/CEE
du 1ermars 1976(8) ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'ana-
lyse communautaires; que, compte tenu de l'état d'avancement destravaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une huitième sériede méthodes;
considérant que les mesures prévues à la présente directive sont
conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux,
A ARRÊTE LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premier
1. Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles
officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne leur teneur en
bacitracine-zinc, flavophospholipol, fer, cuivre, manganèse et zinc,
sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe de la présentedirective.
Article 2
Les États membres mettent en vigueur, le 1erjanvier 1979, les disposi-
tions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se
conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent
immédiatement la Commission.
Article 3
Les États membres sont destinataires de la présente directive.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)J O noL 170 du 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O noL 155 du 12. 7. 1971, p. 13.
(3)J O noL 279 du 20. 12. 1971, p. 7.
(4)J O noL 123 du 29. 5. 1972, p. 6.
(5)J O noL 83 du 30. 3. 1973, p. 21.
(6)J O noL 108 du 22. 4. 1974, p. 7.
(7)J O noL 32 du 5. 2. 1975, p. 26.
(8)J O noL 102 du 15. 4. 1976, p. 8.▼M1
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ANNEXE
1.DOSAGE DE LA BACITRACINE-ZINC PAR DIFFUSION SUR
GÉLOSE
1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
La méthode permet de doser la bacitracine-zinc dans les aliments, les
concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de
5 mg/kg (5 ppm)(*). La méthode n'est pas valable en présence de
substances perturbatrices, en particulier de fortes quantités de cuivre
ou d'acide ascorbique.
2. PRINCIPE
L'échantillon est soumis à une extraction à pH 2 par un mélange de
méthanol/eau/acide chlorhydrique. L'extrait obtenu est amené à pH 6,5,
concentré si nécessaire, et dilué. Son activité antibiotique est déter-
minée par mesure de la diffusion de la bactracine-zinc dans un milieu
gélosé, ensemencé avec Micrococcus luteus ( syn.:M. flavus) . La diffu-
sion se révèle par la formation de zones d'inhibition du micro-
organisme. Le diamètre de ces zones est considéré comme étant direc-
tement proportionnel au logarithme de la concentration en antibiotique
pour la gamme des concentrations utilisées.
3 MICRO-ORGANISME: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1.Entretien de la souche
Ensemencer le milieu de culture (4.1), en tubes inclinés, par Micro-
coccus luteus . Incuber 24 h à 30—37 ºC, conserver en réfrigérateur à
4 ºC environ et renouveler l'ensemencement toutes les deux semaines.
3.2.Préparation de la suspensionbactérienne (a)
Récolter les germes d'un tube de gélose (3.1), de préparation récente, à
l'aide de 2 à 3 ml de solution de chlorure de sodium (4.3). Ensemencer
en surface avec cette suspension 250 ml du milieu de culture (4.1) dans
une fiole de Roux et incuber 18 à 20 h à 30—37 ºC. Récolter les
germes dans 25 ml de solution de chlorure de sodium (4.3) et homogé-
néiser. Diluer la suspension à 1/10 à l'aide de la solution de chlorure de
sodium (4.3). La transmission lumineuse de la suspension, mesurée à
650 nm sous une épaisseur de 1 cm par comparaison avec la solution
de chlorure de sodium (4.3), doit être de 75 % environ.
4. MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS
4.1.Milieu d'entretien de la souche (b)
Peptone de viande 6,0 g
Tryptone 4,0 gExtrait de levure 3,0 g
Extrait de viande 1,5 g
Glucose 1,0 gGélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
pH 6,5—6,6 (après stérilisation)
4.2.Milieu de base du dosage (
b)
Tryptone 10,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Extrait de viande 1,5 gGlucose 1,0 g
Gélose 20,0 g
Tween 80 1 mlEau 1 000 ml
pH 6,5 (après stérilisation)
4.3. Solution à 0,8 % (p/v) de chlorure de sodium: dissoudre dans l'eau 8 g
de chlorure de sodium p.a.; diluer à 1 000 ml et stériliser.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 3
(*) 1 mg de bacitracine-zinc (qualité pour aliments des animaux) équivaut à 42 unités
internationales (UI).
(a) D'autres méthodes peuvent être utilisées dans la mesure où il est prouvé qu'elles produi-
sent une suspension bactérienne analogue.
(b) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé.
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4.4. Mélange de méthanol pur/eau/acide chlorhydrique p.a. (d: 1,18—1,19):
80/17,5/2,5 (v/v/v).
4.5.Tampon phosphate, pH 6,5:
Phosphate bipotassique K2HPO4p.a. 22,15 g
Phosphate monopotassique KH2PO4p.a. 27,85 g
Eau jusqu'à 1 000 ml
4.6. Acide chlorhydrique p.a., d: 1,18—1,19
4.7. Acide chlorhydrique p.a. 0,1 N4.8. Solution 1 N d'hydroxyde de sodium p.a.4.9. Solution à 0,04 % (p/v) de pourpre de bromocrésol:
dissoudre 0,1 g de pourpre de bromocrésol dans 18,5 ml de solution
0,01 N d'hydroxyde de sodium. Compléter à 250 ml avec de l'eau et
homogénéiser.
4.10. Substance étalon: bacitracine-zinc d'activité connue (en UI).
5. SOLUTIONS ÉTALONS
Peser une quantité de bacitracine-zinc étalon (4.10) correspondant à
1 050 UI (selon le titre indiqué). Ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique
0,1 N (4.7) et laisser reposer 15 minutes. Ajouter 30 ml d'eau, ajuster
le pH à 4,5 à l'aide du tampon phosphate pH 6,5 (4.5) (4 ml environ),
compléter à 50 ml avec de l'eau et homogénéiser (1 ml = 21 UI).
Préparer à partir de cette solution et par dilutions successives à l'aide du
tampon phosphate pH 6,5 (4.5) les solutions suivantes:
S
80,42 UI/ml
S40,21 UI/ml
S20,105 UI/ml
S10,0525 UI/ml
6. PRÉPARATION DE L'EXTRAIT
6.1.Extraction
6.1.1.Concentrats, prémélanges et aliments minéraux
Peser une quantité d'échantillon de 2 à 5 g, ajouter 30 ml du mélange
(4.4) et agiter brièvement. Vérifier que le pH est de 2 environ. Agiter
durant 10 minutes, ajouter 30 ml de tampon phosphate pH 6,5 (4.5) et
agiter durant 15 minutes. Diluer à l'aide du tampon phosphate (4.5)
pour obtenir une concentration présumée en bacitracine-zinc de
0,42 UI/ml (= U8).
6.1.2.Concentrés protéiniques
Peser une quantité d'échantillon de 10 g, ajouter 50 ml du mélange (4.4)
et agiter brièvement. Vérifier que le pH est de 2 environ. Agiter durant
10 minutes, ajouter 50 ml de tampon phosphate pH 6,5 (4.5) et agiter
durant 15 minutes. Diluer à l'aide du tampon phosphate (4.5) pour
obtenir une concentration présumée en bacitracine-zinc de 0,42 UI/ml
(= U8).
6.1.3.Autres aliments
Peser une quantité d'échantillon de 10 g (20 g pour une concentration
présumée en bacitracine-zinc de 5 mg/kg), ajouter 25 ml du mélange
(4.4) et homogénéiser durant 10 minutes environ. Ajouter 25 ml de
tampon phosphate pH 6,5 (4.5), agiter durant 15 minutes et centrifuger.
Prélever 20 ml de la solution surnageante et ajuster le pH à 6,5 à l'aide
de la solution 1 N d'hydroxyde de sodium (4.8) en utilisant comme
indicateur la solution de pourpre de bromocrésol (4.9). Évaporer jusqu'à
4 ml environ dans un évaporateur rotatif à une température ne dépassant
pas 35 ºC. Diluer le résidu avec de l'eau pour obtenir une concentration
présumée en bacitracine-zinc de 0,42 UI/ml (= U8).
6.2.Solutions de l'extrait
Préparer à partir de la solution U8et par dilutions successives (1 + 1) à
l'aide du tampon phosphate (4.5) les solutions U4(concentration
présumée 0,21 UI/ml), U2(concentration présumée: 0,105 UI/ml) et U1(concentration présumée: 0,0525 UI/ml).1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 4
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7. MODALITÉS DU DOSAGE
7.1.Inoculation du milieu de culture
Ensemencer à 50 ºC environ le milieu de base du dosage (4.2) par la
suspension bactérienne (3.2). Par des essais préliminaires sur plaques
avec le milieu (4.2), déterminer la quantité de suspension bactérienne
permettant d'obtenir pour les différentes concentrations en bacitracine-
zinc des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient
encore nettes.
7.2.Préparation des boîtes
La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les quatre
concentrations de la solution étalon (S8,S4,S2,S1) et les quatre concen-
trations de l'extrait (U8,U4,U2,U1). Chaque boîte doit nécessairement
recevoir les quatre concentrations de l'étalon et de l'extrait. À cet effet,
choisir la dimension des boîtes de telle sorte qu'on puisse creuser dans
le milieu gélosé au moins huit cavités de 10 à 13 mm de diamètre, dont
les centres ne sont pas distants de moins de 30 mm. On peut utiliser
comme boîtes des plaques de verre planes, surmontées d'un anneau
d'aluminium ou de matière plastique de 200 mm de diamètre et 20 mm
de hauteur.
Introduire dans les boîtes une quantité du milieu (4.2), ensemencé
comme indiqué en 7.1, permettant d'obtenir une couche de 2 mm
environ d'épaisseur (50 ml pour une boîte de 200 mm de diamètre).
Laisser solidifier, creuser les cavités et y déposer des volumes exacte-
ment mesurés des solutions de l'étalon et de l'extrait (0,10 à 0,15 ml par
cavité, selon le diamètre).
Faire au moins quatre répétitions de chaque concentration de façon que
chaque détermination fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibi-
tion.
7.3.Incubation
Incuber les boîtes 16 à 18 heures à 30 ºC environ.
8. ÉVALUATION
Mesurer le diamètre des zones d'inhibition à 0,1 mm près. Pour chaque
concentration, enregistrer les mesures moyennes sur papier semi-loga-
rithmique en portant le logarithme des concentrations en regard des
diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites les mieux ajustées
pour la solution étalon et pour l'extrait en procédant, par exemple,
comme suit.
Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus bas de la solu-
tion étalon (SL) à l'aide de la formule:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus élevé de la solu-
tion étalon (SH) à l'aide de la formule:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Déterminer de la même façon les points les plus appropriés de l'extrait
pour le niveau le plus bas (UL) et le niveau le plus élevé (UH) en
remplaçant S1,S2,S4et S8dans les formules susmentionnées par U1,
U2,U4et U8.
Inscrire les valeurs SL et SH sur le même graphique. En joignant les
deux points, on obtient la droite la mieux ajustée pour la solution
étalon. En procédant de la même façon pour UL et UH, on obtient la
droite la mieux ajustée pour l'extrait.
En l'absence de toute interférence, les droites devraient être parallèles.
En pratique, on les considère comme étant parallèles lorsque (SH - SL)
et (UH - UL) ne diffèrent pas de plus de 10 % de leur moyenne.
Si les droites ne sont pas parallèles, on peut éliminer soit U1et S1, soit
U8et S8. Les valeurs SL, SH, UL et UH permettant d'obtenir les droites
les mieux ajustées sont alors calculées à l'aide des formules suivantes:1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 5
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(a′)5S1þ2S2/C0S4
6ou5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)5S4þ2S2/C0S1
6ou5S8þ2S4/C0S2
6
et de formules analogues pour UL et UH. L'utilisation de cette alterna-
tive doit également faire l'objet d'une vérification quant au parallélisme
des droites, comme indiqué plus haut. L'obtention d'un résultat prove-
nant de trois niveaux doit être mentionné sur le bulletin d'analyse.
Lorsquelesdroitessontconsidéréescommeétant parallèles , calculer le
logarithme de l'activité relative (log. A) par l'une des formules ci-après.
Pour 4 niveaux
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Pour 3 niveaux
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′)l og :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Activité réelle = activité présumée × activité relative.
Lorsque les droites sont considérées comme n'étant pas parallèles ,
répéter la détermination. Si celle-ci ne permet toujours pas d'atteindrele parallélisme, calculer le logarithme de l'activité relative (log. A) à
l'aide de la formule (c). Le résultat obtenu devra toutefois être considéré
comme étant une approximation et il y aura lieu d'en faire mention sur
le bulletin d'analyse.
9. RÉPÉTABILITÉ
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées sur le
même échantillon par le même analyste ne devrait pas dépasser:
20 % du résultat le plus élevé pour les teneurs en bacitracine-zinc de 5
à 25 mg/kg,
5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 25 mg/kg et
jusqu'à 50 mg/kg,
10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 mg/kg.
2.DOSAGE DU FLAVOPHOSPHOLIPOL PAR DIFFUSION SUR
GÉLOSE
1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
La méthode permet de doser le flavophospholipol dans les aliments, les
concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de
1 mg/kg (1 ppm).
2. PRINCIPE
L'échantillon est soumis à une extraction par du méthanol dilué sous
chauffage à reflux. L'extrait est centrifugé, purifié si nécessaire sur
résines échangeuses d'ions et dilué. Son activité antibiotique est déter-
minée par mesure de la diffusion du flavophospholipol dans un milieu
gélosé, ensemencé avec Staphylococcus aureus . La diffusion se révèle
par la formation de zones d'inhibition du micro-organisme. Le diamètre
de ces zones est considéré comme étant directement proportionnel au
logarithme de la concentration en antibiotique pour la gamme des
concentrations utilisées.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 6
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3. MICRO-ORGANISME: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538
P
3.1.Entretien de la souche
Ensemencer le milieu de culture (4.1), en tubes inclinés, par Staphylo-
coccus aureus . Incuber 24 heures à 37 ºC, conserver en réfrigérateur à
4 ºC environ et renouveler l'ensemencement tous les mois.
3.2.Préparation de la suspensionbactérienne (a)
Prélever deux tubes contenant la culture-mère (3.1) et renouveler l'ense-
mencement toutes les semaines. Incuber 24 heures à 37 ºC et conserver
en réfrigérateur à 4 ºC environ.
24 heures avant le dosage, ensemencer à l'aide de ces cultures deux à
quatre tubes inclinés contenant le milieu de culture (4.1).
Incuber 16 à 18 heures à 37 ºC. Mettre ensuite les germes en suspen-
sion dans la solution de chlorure de sodium (4.3). La transmission
lumineuse de la suspension, mesurée à 578 nm sous une épaisseur de
1 cm par comparaison avec la solution de chlorure de sodium, doit
être de 40 % environ.
4. MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS
4.1.Milieu d'entretien de la souche (b)
Peptone de viande 6,0 g
Tryptone 4,0 gExtrait de levure 3,0 gExtrait de viande 1,5 g
Glucose 1,0 g
Gélose 15,0 gEau 1 000 mlpH 6,5 (après stérilisation)
4.2.Milieu de base du dosage
4.2.1.Couche inférieure (
c)
Peptone de viande 6,0 g
Extrait de levure 3,0 gExtrait de viande 1,5 gGélose 10,0 gEau 1 000 mlpH 6,5 (après stérilisation)
4.2.2.Couche à ensemencer
Milieu (4.1) additionné de 2 g d'émulsion antimousse de silicone(
d).
4.3. Solution à 0,4 % (p/v) de chlorure de sodium: dissoudre dans l'eau 4 g
de chlorure de sodium p.a., diluer à 1000 ml et stériliser.
4.4. Méthanol pur.
4.5. Méthanol à 50 % (v/v): diluer 500 ml de méthanol (4.4) par 500 ml
d'eau.
4.6. Méthanol à 80 % (v/v): diluer 800 ml de méthanol (4.4) par 200 ml
d'eau.
4.7. Tris(hydroxyméthyl)aminométhane p.a.
4.8. Solution méthanolique à 1,5 % (p/v) de chlorure de potassium:
dissoudre 1,5 g de chlorure de potassium p.a. dans 20 ml d'eau,
compléter à 100 ml par du méthanol (4.4).
4.9. Échangeur de cations: Dowex 50 WX8, 20—50 mesh, forme Na (cat.
Serva no41600) ou équivalent.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 7
(a) D'autres méthodes peuvent être utilisées dans la mesure où il est prouvé qu'elles produi-
sent une suspension bactérienne analogue.
(b) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé, par exemple Oxoid Antibiotic Medium (CM 327) additionné
de gélose Oxoid no3 (L 13).
(c) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé, par exemple Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) addi-tionné de gélose Oxoid n
o3 (L 13).
(d) Par exemple SE 2 de Wacker Chemie GmbH, Munich.
▼B
4.10. Échangeur d'anions: Dowex 1X2, 50—100 mesh, forme Cl (cat. Serva
no41010) ou équivalent. Avant l'emploi, maintenir le produit durant 12
à 14 heures dans le méthanol à 80 % (4.6).
4.11. Laine de verre.4.12. Papier indicateur de pH (pH 6,6—8,1).4.13. Acide ascorbique.
4.14. Substance étalon: flavophospholipol d'activité connue.
5. APPAREILLAGE
5.1. Tube pour chromatographie, en verre, diamètre intérieur: 9 mm,
longueur: 150 à 200 mm, muni d'un robinet à la partie effilée de l'extré-
mité inférieure et d'un rodage normalisé (pour branchement de
l'entonnoir 5.2) à l'extrémité supérieure.
5.2. Entonnoir avec réservoir de 250 ml, à robinet et rodage normalisé.5.3. Fiole conique de 250 ml, à rodage normalisé.
5.4. Réfrigérant à reflux, à rodage normalisé.
6. SOLUTIONS ÉTALONS
Dissoudre une quantité exactement pesée de substance étalon (4.14)
dans du méthanol à 50 % (4.5) et diluer pour obtenir une solution
mère de flavophospholipol à 100 µg/ml. Conservée en flacon bouché à
4 ºC, cette solution est stable durant deux mois.
Préparer à partir de cette solution et par dilutions successives à l'aide de
méthanol à 50 % (4.5) les solutions suivantes:
S
80,2 µ g/ml
S40,1 µ g/ml
S20,05 µ g/ml
S10,025µ g/ml
7. PRÉPARATION DE L'EXTRAIT
7.1.Extraction
7.1.1.Concentrats, prémélanges et aliments minéraux
Peser une quantité d'échantillon de 2 à 5 g et y ajouter 150 mg environ
d'acide ascorbique (4.13). Mélanger à 150 mg de méthanol à 50 % (4.5)
dans une fiole (5.3) et ajuster le pH à 8,1—8,2 à l'aide de 400 mg
environ de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (4.7). Contrôler le pH au
moyen du papier indicateur (4.12). Laisser macérer 15 minutes, ajuster
à nouveau le pH à 8,1—8,2 à l'aide de tris(hydroxyméthyl)aminomé-
thane (4.7) et faire ensuite bouillir durant 10 minutes sous réfrigérant
à reflux (5.4) en remuant constamment. Laisser refroidir, puis centri-
fuger et décanter l'extrait.
7.1.2Autres aliments
Peser une quantité d'échantillon de 5 à 30 g contenant au moins 30 µg
de flavophospholipol. Mélanger à 150 ml de méthanol à 50 % (4.5)
dans une fiole (5.3) et ajuster le pH à 8,1—8,2 à l'aide de 400 mg
environ de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (4.7). Contrôler le pH au
moyen du papier indicateur (4.12). Laisser macérer 15 minutes, ajuster
à nouveau le pH à 8,1—8,2 à l'aide de tris(hydroxyméthyl)aminomé-
thane (4.7) et faire ensuite bouillir durant 10 minutes sous réfrigérant
à reflux (5.4) en remuant constamment. Laisser refroidir, puis centri-
fuger et décanter l'extrait.
7.2Purification(cettemodalitépeutêtreomisepourlesconcentrats,les
prémélanges et les aliments minéraux)
Mélanger 110 ml de l'extrait à 11 g d'échangeur de cations (4.9), faire
bouillir durant une minute sous réfrigérant à reflux (5.4) en remuant
constamment. Séparer l'échangeur de cations par centrifugation ou
filtration. Mélanger 100 ml de l'extrait à 150 ml de méthanol (4.4) et
laisser reposer la solution 12 à 15 heures à 4 ºC. Éliminer la matière
floculente par filtration à froid.
Munir l'extrémité inférieure d'un tube (5.1) d'un tampon de laine de
verre (4.11), verser dans le tube 5 ml d'échangeur d'anions (4.10) et
laver la colonne par 100 ml de méthanol à 80 % (4.6). Transvaser
ensuite dans la colonne à l'aide de l'entonnoir (5.2) un volume de filtrat
de 100 ml au moins supposé contenir 16 µg de flavophospholipol1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 8
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(200 ml pour un échantillon de 30 g d'aliment à 1 ppm). Si nécessaire,
diluer le filtrat avant de le transvaser dans la colonne par du méthanol à
80 % (4.6) pour obtenir une concentration présumée en flavophospho-
lipol de 16 µg par 100 ml. Régler le débit d'écoulement du liquide à
2 ml environ par minute. Éliminer la totalité du filtrat. Laver ensuite
la colonne à l'aide de 50 ml de méthanol à 80 % (4.6) et éliminer le
filtrat.
Éluer le flavophospholipol par la solution méthanolique de chlorure de
potassium (4.8) en maintenant le débit d'écoulement à 2 ml environ par
minute. Recueillir 50 ml d'éluat dans une fiole graduée, ajouter 30 ml
d'eau et homogénéiser. Cette solution devrait avoir une teneur en flavo-
phospholipol de 0,2 µg/ml (= U8).
7.3.Solutions de l'extrait
Si nécessaire (notamment dans les cas où la purification a été omise),
diluer l'extrait obtenu en 7.1.1 par du méthanol à 50 % (4.5) pour
obtenir une concentration présumée en flavophospholipol de 0,2 µg/ml
(= U8).
Préparer à partir de la solution U8et par dilutions successives (1 + 1) à
l'aide de méthanol à 50 % (4.5) les solutions U4(concentration
présumée: 0,1 µg/ml), U2(concentration présumée: 0,05 µg/ml) et U1(concentration présumée: 0,025 µg/ml).
8. MODALITÉS DU DOSAGE
8.1.Inoculation du milieu de culture
Ensemencer à 50 ºC environ le milieu de base du dosage (4.2.2) par la
suspension bactérienne (3.2). Par des essais préliminaires sur plaques
avec le milieu (4.2.2), déterminer la quantité de suspension bactérienne
permettant d'obtenir pour les différentes concentrations en flavophos-
pholipol des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui
soient encore nettes (30 ml environ par litre).
8.2.Préparation des boîtes
La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les quatre
concentrations de la solution étalon (S8,S4,S2,S1) et les quatre concen-
trations de l'extrait (U8,U4,U2,U1). Chaque boîte doitnécessairement
recevoir les quatre concentrations de l'étalon et de l'extrait. À cet effet,
choisir la dimension des boîtes de telle sorte qu'on puisse creuser dans
le milieu gélosé au moins huit cavités de 10 à 13 mm de diamètre, dont
les centres ne sont pas distants de moins de 30 mm. On peut utiliser
comme boîtes des plaques de verre planes, surmontées d'un anneau
d'aluminium ou de matière plastique de 200 mm de diamètre et 20 mm
de hauteur.
Introduire dans les boîtes une quantité du milieu (4.2.1) permettant
d'obtenir une couche de 1,5 mm environ d'épaisseur (45 ml pour une
boîte de 200 mm de diamètre). Laisser solidifier et ajouter une quantité
du milieu (4.2.2), ensemencé comme indiqué au point 8.1, permettant
d'obtenir une couche de 1 mm d'épaisseur (30 ml pour une boîte de
200 mm de diamètre). Laisser solidifier, creuser les cavités et y déposer
des volumes exactement mesurés des solutions de l'étalon et de l'extrait
(0,10 à 0,15 ml par cavité, selon le diamètre).
Faire au moins quatre répétitions de chaque concentration de façon que
chaque détermination fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibi-
tion.
8.3.Incubation
Incuber les boîtes 16 à 18 heures à 28—30 ºC.
9. ÉVALUATION
Mesurer le diamètre des zones d'inhibition à 0,1 mm près. Pour chaque
concentration, enregistrer les mesures moyennes sur papier semi-loga-
rithmique en portant le logarithme des concentrations en regard des
diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites les mieux ajustées
pour la solution étalon et pour l'extrait en procédant, par exemple,
comme suit.
Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus bas de la solu-
tion étalon (SL) à l'aide de la formule:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
101978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus élevé de la solu-
tion étalon (SH) à l'aide de la formule:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Déterminer de la même façon les points les plus appropriés de l'extrait
pour le niveau le plus bas (UL) et le niveau le plus élevé (UH) en
remplaçant S1,S2,S4et S8dans les formules susmentionnées par U1,
U2,U4et U8.
Inscrire les valeurs SL et SH sur le même graphique. En joignant les
deux points, on obtient la droite la mieux ajustée pour la solution
étalon. En procédant de la même façon pour UL et UH, on obtient la
droite la mieux ajustée pour l'extrait.
En l'absence de toute interférence, les droites devraient être parallèles.
En pratique, on les considère comme étant parallèles lorsque (SH—SL)
et UH—UL) ne diffèrent pas de plus de 10 % de leur moyenne.
Si les droites ne sont par parallèles, on peut éliminer soit U1et S1soit
U8et S8. Les valeurs SL, SH, UL et UH permettant d'obtenir les droites
les mieux ajustées sont alors calculées à l'aide des formules suivantes:
(a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6ou5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6ou5S8þ2S4/C0S2
6
et de formules analogues pour UL et UH. L'utilisation de cette alterna-
tive doit également faire l'objet d'une vérification quant au parallélisme
des droites, comme indiqué plus haut. L'obtention d'un résultat prove-
nant de trois niveaux doit être mentionnée sur le bulletin d'analyse.
Lorsquelesdroitessontconsidéréescommeétant parallèles , calculer le
logarithme de l'activité relative (log. A) par l'une des formules ci-après.
Pour 4 niveaux
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Pour 3 niveaux
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C20;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′)l og :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Activité réelle = activité présumée × activité relative.
Lorsque les droites sont considérées comme n'étant pas parallèles ,
répéter la détermination. Si celle-ci ne permet toujours par d'atteindre
le parallélisme, calculer le logarithme de l'activité relative (log. A) à
l'aide de la formule (c). Le résultat obtenu devra toutefois être considéré
comme étant une approximation et il y aura lieu d'en faire mention sur
le bulletin d'analyse.
10. RÉPÉTABILITÉ
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées sur le
même échantillon par le même analyste ne devrait pas dépasser:
0,5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en flavophospholipol de
1 à 2 mg/kg,
25 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 2 mg/kg et
jusqu'à 10 mg/kg,
20 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 10 mg/kg
et jusqu'à 25 mg/kg,
5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 25 mg/kg et
jusqu'à 50 mg/kg,
10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 mg/kg.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
3.DOSAGE DES OLIGO-ÉLÉMENTS FER, CUIVRE,MANGANÈSEET
ZINC
1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
La méthode permet de doser les oligo-éléments fer, cuivre, manganèse
et zinc dans les aliments des animaux. Les limites inférieures de déter-
mination sont les suivantes:
fer (Fe) 20 mg/kg
cuivre (Cu) 10 mg/kgmanganèse (Mn) 20 mg/kgzinc (Zn) 20 mg/kg
2. PRINCIPE
L'échantillon est mis en solution dans l'acide chlorhydrique après
destruction éventuelle des matières organiques. Les éléments fer,
cuivre, manganèse et zinc sont déterminés, après dilution appropriée,
par spectrométrie d'absorption atomique.
3. RÉACTIFS
Remarques préliminairesL'eau utilisée pour la préparation des réactifs et des solutions requises
au cours de l'analyse doit être exempte des cations à déterminer. Elle
est obtenue soit par double distillation de l'eau dans un appareil en
borosilicate ou en quartz, soit par double permutation sur résine échan-
geuse d'ions.
Les réactifs doivent être au moins de qualité «pour analyse» (p.a.).
L'absence de l'élément à déterminer doit être contrôlée par un essai à
blanc. Si nécessaire, les réactifs seront soumis à une purification plus
poussée.
Les solutions étalons décrites ci-après peuvent être remplacées par des
solutions étalons commerciales à condition que celles-ci soient garanties
et contrôlées avant l'emploi.
3.1. Acide chlorhydrique p.a., d: 1,19.3.2. Acide chlorhydrique p.a., 6 N.
3.3. Acide chlorhydrique p.a., 0,5 N.
3.4. Acide fluorhydrique à 38 — 40 % (v/v), ayant une teneur en fer infé-
rieure à 1 mg/l et dont le résidu d'évaporation est inférieur à 10 mg
(exprimés en sulfates)/l.
3.5. Acide sulfurique p.a., d: 1,84.3.6. Eau oxygénée p.a., à 100 vol. environ d'oxygène (30 % en poids).3.7. Solution étalon de fer (1000 µg Fe/ml): dissoudre 1 g de fer en fil p.a.
dans 200 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2), ajouter 16 ml d'eau
oxygénée (3.6.) et compléter à 1 l par de l'eau.
3.7.1. Solution étalon de travail (100 µg Fe/ml): diluer la solution étalon (3.7)
à 1 + 9 par de l'eau.
3.8. Solution étalon de cuivre (100 µg Cu/ml): dissoudre 1 g de cuivre en
poudre p.a. dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2), ajouter 5 ml
d'eau oxygénée (3.6) et compléter à 1 l par de l'eau.
3.8.1. Solution étalon de travail (10 µg Cu/ml): diluer la solution étalon (3.8)
à 1 + 9 par de l'eau; diluer ensuite la solution obtenue à 1 + 9 par de
l'eau.
3.9. Solution étalon de manganèse (1000 µg Mn/ml): dissoudre 1 g de
manganèse en poudre p.a. dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2)
et compléter à 1 l par de l'eau.
3.9.1. Solution étalon de travail (10 µg Mn/ml): diluer la solution étalon (3.9)
à 1 + 9 par de l'eau; diluer ensuite la solution obtenue à 1 + 9 par de
l'eau.
3.10. Solution étalon de zinc (1 000 µg Zn/ml): dissoudre 1 g de zinc en
ruban ou en plaque p.a. dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et
compléter à 1 l par de l'eau.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
3.10.1. Solution étalon de travail (10 µg Zn/ml): diluer la solution étalon (3.10)
à 1 + 9 par de l'eau; diluer ensuite la solution obtenue à 1 + 9 par de
l'eau.
3.11. Solution de chlorure de lanthane: dissoudre 12 g d'oxyde de lanthane
dans 150 ml d'eau, ajouter 100 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et
compléter à 1 l par de l'eau.
4. APPAREILLAGE
4.1. Four à moufle, à température réglable et contrôlée.
4.2. Verrerie en borosilicate, résistante. Il est recommandé d'utiliser un
matériel servant exclusivement aux dosages des oligo-éléments.
4.3. Capsules de platine et, éventuellement, de quartz.4.4. Spectrophotomètre d'absorption atomique, répondant aux exigences de
la méthode en ce qui concerne la sensibilité et la précision dans la
gamme des mesures utiles.
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1.Échantillon contenant des composés organiques
5.1.1.Incinération et préparation de la solution à analyser (*)
i) Placer 5 à 10 g de l'échantillon, pesés à 0,2 mg près, dans une
capsule de quartz ou de platine (4.3) [voir note b)] sécher à l'étuve
à 105 ºC et introduire la capsule dans le four à moufle (4.1) froid.
Fermer le four [voir note c)] et élever progressivement sa tempéra-
ture pour atteindre 450 à 475 ºC en 90 minutes environ. Maintenir
cette température durant 4 à 16 h (par exemple, durant la nuit) de
façon à éliminer la matière charbonneuse, ouvrir ensuite le four et
laisser refroidir [voir note d)].
Humecter les cendres avec de l'eau, puis les transvaser dans un
becher de 250 ml. Rincer la capsule à l'aide de 5 ml d'acide chlor-
hydrique (3.1) et transvaser lentement et avec précaution la solution
de rinçage dans le becher (une réaction violente peut se produire par
formationde CO
2). Ajouter ensuite goutte à goutte de l'acide chlor-
hydrique (3.1), tout en remuant le contenu du becher, jusqu'à
cessation de l'effervescence. Évaporer à sec en remuant périodique-
ment à l'aide d'une tige de verre.
Ajouter au résidu 15 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et ensuite
120 ml environ d'eau. Mélanger à l'aide d'une tige de verre, laisser
celle-ci dans le becher et recouvrir d'un verre de montre. Porter le
liquide à ébullition douce et maintenir l'ébullition jusqu'à ce que
les cendres ne se dissolvent apparemment plus. Filtrer sur un papier
filtre sans cendres et recueillir le filtrat dans un ballon jaugé de
250 ml. Laver le becher et le filtre avec 5 ml d'acide chlorhydrique
6 N (3.2) chaud et à deux reprises avec de l'eau bouillante.
Compléter au volume par de l'eau (la concentration en HCl est de
0,5 N environ).
ii) Si le résidu se trouvant dans le filtre apparaît noir (charbonneux), le
placer à nouveau dans le four et incinérer à 450 — 475 ºC. Cette
incinération, qui requiert seulement quelques heures (3 à 5 heures
environ), est complétée lorsque les cendres apparaissent blanches
ou presque blanches. Dissoudre le résidu dans 2 ml environ d'acide
chlorhydrique (3.1), évaporer à sec et ajouter 5 ml d'acide chlorhy-
drique 6 N (3.2). Chauffer, filtrer la solution dans le ballon jaugé et
compléter au volume avec de l'eau (la concentration en HCl est de
0,5 N environ).1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 12
(*) Les fourrages verts (frais ou déshydratés) sont susceptibles de contenir de grandes
quantités de silice végétale pouvant retenir des oligo-éléments et qui doivent êtreéliminés. Les échantillons de ces aliments doivent être soumis au traitement suivant.Effectuer l'opération 5.1.1 i) jusqu'au stade de la filtration. Laver le papier filtre conte-
nant le résidu insoluble à deux reprises avec de l'eau bouillante et le placer dans une
capsule de platine (4.3). Incinérer dans le four à moufle (4.1) à une température infé-rieure à 550 ºC jusqu'à ce que toute la matière charbonneuse ait complètementdisparu. Laisser refroidir, ajouter quelques gouttes d'eau puis 10 à 15 ml d'acide fluo-rhydrique (3.4) et évaporer à sec à 150 ºC environ. Si le résidu contient encore de la
silice, dissoudre celle-ci dans quelques ml d'acide fluorhydrique (3.4) et évaporer à
sec. Ajouter 5 gouttes d'acide sulfurique (3.5) et chauffer jusqu'à disparition desfumées blanches. Ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et 30 ml environd'eau, chauffer, filtrer la solution dans un ballon jaugé de 250 ml et compléter auvolume par de l'eau (la concentration en HCl est de 0,5 N environ). Poursuivre le
procédé à partir du point 5.1.3.
▼B
Notes:
a) Lors du dosage des oligo-éléments, il y a lieu d'attirer l'attention sur
les risques de contamination, notamment par le zinc, le cuivre et le
fer. C'est pourquoi les instruments utilisés pour la préparation des
échantillons doivent être exempts de ces métaux.
Pour réduire les risques de contamination, il convient de travailler en
atmosphère exempte de poussières avec un matériel rigoureusement
propre et une verrerie soigneusement lavée. Le dosage du zinc est
particulièrement sensible aux contaminations provenant notamment
de la verrerie, des réactifs, de la poussière, etc.
b) Calculer le poids de l'échantillon à incinérer en fonction de la teneur
approximative de l'aliment en oligo-élément à doser et de la sensibi-
lité du spectrophotomètre utilisé. Pour certains aliments pauvres en
oligo-éléments, il peut être nécessaire de prélever un échantillon de
10 à 20 g et de limiter le volume de la solution finale à 100 ml.
c) Incinérer dans un four fermé sans injection d'air ou d'oxygène.
d) La température indiquée par le pyromètre ne doit pas dépasser
475 ºC.
5.1.2.Détermination spectrophotométrique
5.1.2.1. Préparation des solutions d'étalonnage
Préparer pour chaque oligo-élément à doser une gamme de solutions
d'étalonnage à partir des solutions étalons de travail 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1
et 3.10.1, de façon que chaque solution d'étalonnage ait une concentra-
tion en HCl de 0,5 N environ et, dans le cas du fer, du manganèse et du
zinc, une concentration en chlorure de lanthane correspondant à 0,1 %
de lanthane (p/v). Les concentrations choisies en oligo-éléments doivent
se trouver dans la zone de sensibilité du spectrophotomètre utilisé. Les
tableaux ci-après donnent, à titre d'exemple, des types de composition
de solution d'étalonnage; selon le type et la sensibilité du spectrophoto-
mètre utilisé, il peut être nécessaire de choisir d'autres concentrations.
Fer
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml de solution
étalon de travail
(3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11); compléter à 100 ml
par de l'eau.
Cuivre
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solution
étalon de travail
(3.8.1)
(1 ml = 10 µg Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Compléter à 100 ml par de l'eau.
Manganèse
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solution
étalon de travail
(3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11); compléter à 100 ml
par de l'eau.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 13
▼B
Zinc
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml de solution
étalon de travail
(3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11); compléter à 100 ml
par de l'eau.
5.1.2.2. Préparation de la solution à analyser
Pour le dosage du cuivre, la solution préparée selon 5.1.1 peut, en règle
générale, être utilisée directement. S'il est nécessaire d'amener sa
concentration dans la gamme des concentrations des solutions d'étalon-
nage, une partie aliquote peut être introduite à la pipette dans un ballon
jaugé de 100 ml et complétée au volume par de l'acide chlorhydrique
0,5 N (3.3).
Pour le dosage du fer, du manganèse et du zinc, introduire à la pipette
une portion aliquote de la solution préparée selon 5.1.1 dans un ballon
jaugé de 100 ml; ajouter 10 ml de solution de chlorure de lanthane
(3.11) et compléter au volume par de l'acide chlorhydrique 0,5 N (3.3)
(voir aussi point 8 «Observation»).
5.1.2.3. Essai à blanc
Effectuer un essai à blanc comportant toutes les étapes prescrites du
mode opératoire, en excluant la présence de l'échantillon.
La solution d'étalonnage «O» ne doit pas être utilisée comme «blanc».
5.1.2.4. Mesure de l'absorption atomique
Mesurer l'absorption des solutions d'étalonnage et de la solution à
analyser, en utilisant une flamme oxydante air-acétylène, aux longueurs
d'onde ci-après:
Fe 248,3 nm
Cu 324,8 nm
Mn 279,5 nm
Zn 213,8 nm.
Effectuer chaque mesure quatre fois.
5.2.Composésminéraux
En l'absence de matière organique, l'incinération préalable est inutile.
Appliquer le mode opératoire à partir du deuxième paragraphe du point
5.5.1 i). L'évaporation en présence d'acide fluorhydrique peut être
omise.
6. CALCUL DES RÉSULTATS
Calculer la concentration en oligo-éléments dans la solution à analyser
à l'aide d'une courbe d'étalonnage et exprimer le résultat en mg d'oligo-
élément par kg d'échantillon (ppm).
7. RÉPÉTABILITÉ
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effec-
tuées sur le même échantillon par le même analyste ne devrait pas
dépasser:
— 5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en oligo-éléments
concernés allant jusqu'à 50 mg/kg,
— 10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 et
jusqu'à 100 mg/kg,
— 10 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 100 et
jusqu'à 200 mg/kg,
— 5 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 200 mg/
kg.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
8. OBSERVATION
La présence de grandes quantités de phosphates peut interférer dans le
dosage du fer, du manganèse et du zinc. Cette interférence doit être
corrigée par addition de solution de chlorure de lanthane (3.11). Cepen-
dant, si l'échantillon a un rapport pondéralCaþMg
P>2;l'addition de
solution de chlorure de lanthane (3.11) à la solution à analyser et aux
solutions d'étalonnage peut être omise.1978L0633 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 15