2009R0152 — FR — 01.01.2014 — 003.001

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►B RÈGLEMENT (CE) No 152/2009 DE LA COMMISSION du 27 janvier 2009 portant fixation des méthodes d'échantillonnage et d'analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE) (JO L 054, 26.2.2009, p.1)

Modifié par:









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RÈGLEMENT (CE) No 152/2009 DE LA COMMISSION

du 27 janvier 2009

portant fixation des méthodes d'échantillonnage et d'analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)







LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté européenne, vu le règlement (CE) no 882/2004 du Parlement européen et du Conseil du 29 avril 2004 relatif aux contrôles officiels effectués pour s'assurer de la conformité avec la législation sur les aliments pour animaux et les denrées alimentaires et avec les dispositions relatives à la santé animale et au bien-être des animaux ( 1 ), et notamment son article 11, paragraphe 4, points a), b) et c), considérant ce qui suit: (1) Les actes suivants ont été adoptés aux fins de l'application de la directive 70/373/CEE et restent en vigueur conformément à l'article 61, paragraphe 2, du règlement (CE) no 882/2004: — première directive 71/250/CEE de la Commission du 15 juin 1971 portant fixation de méthodes d'analyse communautaire pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 2 ), — deuxième directive 71/393/CEE de la Commission du 18 novembre 1971 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 3 ), — troisième directive 72/199/CEE de la Commission du 27 avril 1972 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 4 ), — quatrième directive 73/46/CEE de la Commission du 5 décembre 1972 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 5 ), — première directive 76/371/CEE de la Commission du 1er mars 1976 portant fixation de modes de prélèvement communautaires d'échantillons pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 6 ), — septième directive 76/372/CEE de la Commission du 1er mars 1976 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 7 ), — huitième directive 78/633/CEE de la Commission du 15 juin 1978 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 8 ), — neuvième directive 81/715/CEE de la Commission du 31 juillet 1981 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 9 ), — dixième directive 84/425/CEE de la Commission du 25 juillet 1984 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 10 ), — directive 86/174/CEE de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énergétique des aliments composés destinés à la volaille ( 11 ), — onzième directive 93/70/CEE de la Commission du 28 juillet 1993 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 12 ), — douzième directive 93/117/CE de la Commission du 17 décembre 1993 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux ( 13 ), — directive 98/64/CE de la Commission du 3 septembre 1998 portant fixation des méthodes d'analyse communautaires pour la détermination des acides aminés, des matières grasses brutes et de l'olaquindox dans les aliments des animaux et modifiant la directive 71/393/CEE ( 14 ), — directive 1999/27/CE de la Commission du 20 avril 1999 portant fixation des méthodes communautaires d'analyse pour le dosage de l'amprolium, du diclazuril et du carbadox dans les aliments des animaux, modifiant les directives 71/250/CEE, 73/46/CEE et abrogeant la directive 74/203/CEE ( 15 ), — directive 1999/76/CE de la Commission du 23 juillet 1999 portant fixation d'une méthode communautaire pour le dosage du lasalocide-sodium dans les aliments des animaux ( 16 ), — directive 2000/45/CE de la Commission du 6 juillet 2000 établissant des méthodes communautaires d'analyse pour la détermination de la vitamine A, de la vitamine E et du tryptophane dans les aliments pour animaux ( 17 ), — directive 2002/70/CE de la Commission du 26 juillet 2002 établissant des prescriptions pour la détermination des teneurs en dioxines et en PCB de type dioxine des aliments des animaux ( 18 ), — directive 2003/126/CE de la Commission du 23 décembre 2003 relative à la méthode d'analyse applicable en matière d'identification des constituants d'origine animale pour le contrôle officiel des aliments pour animaux ( 19 ). (2) La directive 70/373/CEE ayant été remplacée par le règlement (CE) no 882/2004, il convient de remplacer les actes d'application de cette directive par un règlement unique. Il convient également d'adapter les méthodes à la lumière de l'évolution des connaissances scientifiques et techniques. Les méthodes obsolètes doivent être supprimées. Il est prévu d'actualiser en temps utile les dispositions relatives au prélèvement d'échantillons pour qu'il y soit tenu compte des évolutions récentes de la manière de produire, d'entreposer, de transporter et de commercialiser les aliments pour animaux, mais il convient pour l'instant de maintenir les dispositions en vigueur dans ce domaine. (3) Il convient par conséquent d'abroger les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE et 2003/126/CE. (4) Les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité permanent de la chaîne alimentaire et de la santé animale, considérant ce qui suit: A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:







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Article premier

Les prélèvements d’échantillons destinés au contrôle officiel des aliments pour animaux sont effectués conformément aux méthodes décrites à l’annexe I, notamment pour ce qui concerne la détermination des constituants – y compris les matières premières contenant des organismes génétiquement modifiés (OGM), consistant en de tels organismes ou produites à partir de ceux-ci –, des additifs pour l’alimentation animale tels que définis par le règlement (CE) no 1831/2003 du Parlement européen et du Conseil ( 20 ) et des substances indésirables telles que définies par la directive 2002/32/CE du Parlement européen et du Conseil ( 21 ).

La méthode d’échantillonnage établie à l’annexe I est applicable pour le contrôle des aliments pour animaux en ce qui concerne la détermination des résidus de pesticides tels que définis par le règlement (CE) no 396/2005 du Parlement européen et du Conseil ( 22 ) et la conformité au règlement (UE) no 619/2011.

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Article 2

La préparation des échantillons en vue de l'analyse et l'expression des résultats sont effectuées conformément aux méthodes décrites à l'annexe II.

Article 3

L'analyse réalisée aux fins du contrôle officiel des aliments pour animaux est effectuée conformément aux méthodes décrites à l'annexe III (méthodes d'analyse relatives au contrôle de la composition des matières premières pour aliments des animaux et des aliments composés), à l'annexe IV (méthodes d'analyse relatives au contrôle des teneurs en additifs autorisés des aliments pour animaux), à l'annexe V (méthodes d'analyse relatives au contrôle des substances indésirables dans les aliments pour animaux) et à l'annexe VI (méthodes d'analyse applicables en matière d'identification des constituants d'origine animale pour le contrôle officiel des aliments pour animaux).

Article 4

La valeur énergétique des aliments composés destinés à la volaille est calculée conformément à la méthode décrite à l'annexe VII.

Article 5

Les méthodes d'analyse relatives à la détection d'additifs dont la présence n'est plus autorisée dans les aliments pour animaux, décrites à l'annexe VIII, sont appliquées à des fins de confirmation.

Article 6

Les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE et 2003/126/CE sont abrogées.

Les références faites aux directives abrogées s'entendent comme faites au présent règlement et sont à lire selon le tableau de correspondance figurant à l'annexe IX.

Article 7

Le présent règlement entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l'Union européenne.

Il s'applique à partir du 26 août 2009

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

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ANNEXE I

MÉTHODES D’ÉCHANTILLONNAGE

1. OBJET ET CHAMP D’APPLICATION

Les échantillons destinés au contrôle officiel des aliments pour animaux sont prélevés conformément aux modalités indiquées ci-après. Les échantillons ainsi obtenus sont considérés comme étant représentatifs des portions échantillonnées.

Le but de l’échantillonnage représentatif est d’obtenir une petite fraction d’un lot de façon que la détermination d’une caractéristique particulière de cette fraction représente la valeur moyenne de la caractéristique considérée pour l’ensemble du lot. Le lot est échantillonné par le prélèvement répété d’échantillons élémentaires en différents points du lot. Ces échantillons élémentaires sont combinés par mélange pour former un échantillon global dont sont tirés, par division représentative, des échantillons finals représentatifs.

Si un examen visuel révèle que la qualité de certaines portions de l’aliment pour animaux devant être soumis à l’échantillonnage diffère de celle du reste du même lot, ces portions sont séparées du reste et traitées comme un sous-lot distinct. S’il n’est pas possible de le diviser en sous-lots distincts, l’aliment pour animaux est échantillonné en tant que lot unique. Dans de tels cas, il en est fait mention dans le rapport d’échantillonnage.

Lorsqu’il est constaté que des aliments pour animaux soumis à un échantillonnage conformément aux dispositions du présent règlement, et qui font partie d’un lot de la même catégorie ou correspondant à la même description, ne satisfont pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

2. DÉFINITIONS

— Lot : quantité identifiée d’aliment pour animaux dont il est établi qu’elle présente des caractéristiques communes, telles que l’origine, la variété, le type d’emballage, l’emballeur, l’expéditeur ou l’étiquetage, et, dans le cas d’un processus de production, une quantité de produit fabriquée dans une seule usine en utilisant des paramètres de production uniformes ou plusieurs de ces quantités lorsqu’elles sont produites en ordre continu et entreposées ensemble.

— Portion échantillonnée : lot ou partie identifiée du lot ou du sous-lot.

— Échantillon scellé : échantillon scellé de manière à ce qu’il soit impossible d’accéder à l’échantillon sans briser ou retirer le scellé.

— Échantillon élémentaire : quantité prélevée en un point de la portion échantillonnée.

— Échantillon global : ensemble d’échantillons élémentaires prélevés sur la même portion échantillonnée.

— Échantillon réduit : partie de l’échantillon global, obtenue par réduction représentative de celui-ci.

— Échantillon final : partie de l’échantillon réduit ou de l’échantillon global homogénéisé.

— Échantillon de laboratoire : échantillon destiné au laboratoire (tel que reçu par le laboratoire) qui peut être l’échantillon final, l’échantillon réduit ou l’échantillon global.

3. DISPOSITIONS GÉNÉRALES

— Personnel chargé du prélèvement des échantillons: les prélèvements sont effectués par des personnes mandatées à cet effet par l’autorité compétente.

— L’échantillon doit être scellé de sorte qu’il soit impossible d’y accéder sans briser ou retirer le scellé. La marque du scellé doit être clairement identifiable et visible. L’échantillon peut également être placé dans un récipient pouvant être fermé de manière à ce qu’il soit impossible de l’ouvrir sans endommager irréversiblement le réceptacle ou le contenant, afin d’éviter sa réutilisation.

— Identification de l’échantillon: l’échantillon doit être pourvu d’une marque indélébile et être identifié de façon à établir un lien non équivoque avec le rapport d’échantillonnage.

— Au moins deux échantillons finals sont prélevés sur chaque échantillon global: au moins un à des fins de contrôle (surveillance du respect de la loi) et un autre destiné à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale (à des fins de recours). Un échantillon final peut éventuellement être prélevé à des fins de référence. Si l’échantillon global complet est homogénéisé, les échantillons finals sont prélevés sur celui-ci, à moins que cette procédure ne soit contraire à la législation des États membres concernant le droit des exploitants du secteur de l’alimentation animale.

4. APPAREILLAGE

4.1. Les appareils destinés aux prélèvements doivent être construits en matériaux qui ne contaminent pas les produits à prélever. Les appareils destinés à être utilisés à plusieurs reprises doivent être faciles à nettoyer pour éviter toute contamination croisée.

4.2. Appareils recommandés pour le prélèvement d’échantillons d’aliments pour animaux solides 4.2.1. Prélèvement manuel 4.2.1.1. Pelle à fond plat et à bords verticaux 4.2.1.2. Sonde à fente longue ou compartimentée. Les dimensions de la sonde doivent être adaptées aux caractéristiques de la portion échantillonnée (profondeur du récipient, dimensions du sac, etc.) et à la taille des particules composant l’aliment. Si la sonde présente plusieurs orifices, ces derniers doivent être séparés par des compartiments ou répartis de façon séquentielle afin de garantir que l’échantillon est prélevé en divers points autour de la sonde. 4.2.2. Prélèvement mécanique Des appareils mécaniques appropriés peuvent être utilisés pour prélever des échantillons d’aliments en mouvement. «Appropriés» signifie que ces appareils permettent de prélever au moins une section complète du flot. Le prélèvement d’aliments pour animaux en mouvement (à des débits élevés) peut être effectué au moyen d’échantillonneurs automatiques. 4.2.3. Diviseur Le cas échéant, des appareils destinés à diviser l’échantillon en parts approximativement égales devraient être utilisés pour la préparation d’échantillons réduits représentatifs.

5. EXIGENCES QUANTITATIVES CONCERNANT LE NOMBRE D’ÉCHANTILLONS ÉLÉMENTAIRES

— Les exigences quantitatives relatives au nombre d’échantillons élémentaires figurant aux points 5.1 et 5.2 s’appliquent à des portions échantillonnées n’excédant pas 500 tonnes et qui peuvent faire l’objet d’un échantillonnage représentatif. La procédure d’échantillonnage décrite est aussi valable pour des quantités supérieures à la taille maximale prescrite pour la portion échantillonnée, à condition de ne pas tenir compte du nombre maximal d’échantillons élémentaires indiqué dans les tableaux ci-après – le nombre d’échantillons élémentaires étant déterminé grâce à la formule mathématique indiquée dans la partie pertinente de la procédure (voir le point 5.3) – et d’augmenter proportionnellement la taille minimale de l’échantillon global. Il est néanmoins possible de diviser un lot de grande taille en sous-lots plus petits et d’échantillonner chaque sous-lot conformément à la procédure décrite aux points 5.1 et 5.2.

— La dimension de la portion échantillonnée doit être telle que toutes les parties qui la composent puissent être échantillonnées.

— Pour les lots ou sous-lots de très grande taille (> 500 tonnes) et les lots qui sont transportés ou stockés d’une manière qui ne permet pas d’effectuer l’échantillonnage conformément à la procédure prévue aux points 5.1 et 5.2 du présent chapitre, la procédure d’échantillonnage prévue au point 5.3 doit être appliquée.

— Si la législation impose à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale de se conformer au présent règlement dans le cadre d’un système de contrôle obligatoire, l’exploitant peut s’écarter des exigences quantitatives prévues par le présent chapitre afin de tenir compte de caractéristiques opérationnelles, à la condition qu’il ait démontré, à la satisfaction de l’autorité compétente, l’équivalence de la procédure d’échantillonnage du point de vue de la représentativité, et après avoir obtenu l’autorisation de l’autorité compétente.

— Dans des cas exceptionnels, s’il n’est pas possible d’appliquer la méthode d’échantillonnage décrite en ce qui concerne les exigences quantitatives, parce qu’elle entraînerait une dégradation inacceptable de la valeur commerciale du lot (à cause des formes d’emballage, des moyens de transport, du mode de stockage, etc.), un autre mode de prélèvement peut être appliqué, à condition qu’il soit aussi représentatif que possible et qu’il soit décrit en détail et bien documenté.

5.1. Exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires en rapport avec le contrôle des substances ou produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux

5.1.1. Aliments solides en vrac







Taille de la portion échantillonnée Nombre minimal d’échantillons élémentaires ≤ 2,5 tonnes 7 > 2,5 tonnes √ 20 fois le nombre de tonnes constituant la portion échantillonnée (1), jusqu’à 40 échantillons élémentaires (1) Lorsque le résultat obtenu est un nombre décimal, il doit être arrondi au nombre entier immédiatement supérieur.

5.1.2. Aliments liquides en vrac







Taille de la portion échantillonnée Nombre minimal d’échantillons élémentaires ≤ 2,5 tonnes ou ≤ 2 500 litres 4 (1) > 2,5 tonnes ou > 2 500 litres 7 (1) (1) S’il n’est pas possible d’homogénéiser le liquide, le nombre d’échantillons élémentaires doit être augmenté.

5.1.3. Aliments emballés

Les aliments pour animaux (solides et liquides) peuvent être emballés dans des sachets, des sacs, des boîtes, des barils, etc., qui sont désignés comme des unités dans le tableau ci-après. Les unités de grande taille (≥ 500 kg ou litres) doivent être échantillonnées conformément aux dispositions prévues pour les aliments pour animaux en vrac (voir points 5.1.1 et 5.1.2).







Taille de la portion échantillonnée Nombre minimal d’unités sur lesquelles (au moins) un échantillon élémentaire doit être prélevé (1) De 1 à 20 unités 1 unité (2) De 21 à 150 unités 3 unités (2) De 151 à 400 unités 5 unités (2) > 400 unités ¼ du √ nombre d’unités constituant la portion échantillonnée (3), jusqu’à 40 unités (1) Si l’ouverture d’une unité est susceptible d’avoir une incidence sur l’analyse (par exemple s’il s’agit d’aliments pour animaux humides et périssables), l’unité non ouverte constitue un échantillon élémentaire. (2) S’agissant des unités dont le contenu n’excède pas 1 kg ou 1 litre, le contenu d’une unité d’origine constitue un échantillon élémentaire. (3) Lorsque le résultat obtenu est un nombre décimal, il doit être arrondi au nombre entier immédiatement supérieur.

5.1.4. Aliments en briques et pierres à lécher

Au minimum une brique ou pierre à prélever par portion échantillonnée de 25 unités, jusqu’à quatre briques ou pierres au maximum.

Pour les briques ou pierres à lécher d’un poids unitaire n’excédant pas 1 kg, le contenu d’une brique ou d’une pierre constitue un échantillon élémentaire.

5.1.5. Fourrages grossiers/fourrage







Taille de la portion échantillonnée Nombre minimal d’échantillons élémentaires (1) ≤ 5 tonnes 5 > 5 tonnes √ 5 fois le nombre de tonnes constituant la portion échantillonnée (2), jusqu’à 40 échantillons élémentaires (1) Il est admis que dans certains cas (par exemple, celui des ensilages), il n’est pas possible de prélever les échantillons élémentaires requis sans endommager le lot de façon inacceptable. Dans de telles situations, une autre méthode d’échantillonnage peut être appliquée; des orientations pour l’échantillonnage de ce type de lots seront élaborées avant l’entrée en application du présent règlement. (2) Lorsque le résultat obtenu est un nombre décimal, il doit être arrondi au nombre entier immédiatement supérieur.

5.2. Exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires en rapport avec le contrôle des constituants ou substances susceptibles d’être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux

Ces exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires s’appliquent dans les situations suivantes:

— contrôle de la présence d’aflatoxines, d’ergot de seigle, d’autres mycotoxines et impuretés botaniques nuisibles dans les matières premières des aliments pour animaux,

— contrôle de la contamination croisée par un constituant, y compris le matériel génétiquement modifié, ou une substance susceptibles d’être répartis non uniformément dans les matières premières des aliments pour animaux.

Si l’autorité de contrôle suspecte fortement qu’une telle répartition non uniforme existe également dans le cas d’une contamination croisée par un constituant ou une substance dans un aliment composé pour animaux, les exigences quantitatives figurant dans le tableau ci-dessous peuvent être appliquées.







Taille de la portion échantillonnée Nombre minimal d’échantillons élémentaires < 80 tonnes Voir les exigences quantitatives au point 5.1. Le nombre d’échantillons élémentaires à prélever doit être multiplié par 2,5. ≥ 80 tonnes 100

5.3. Exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires dans les cas de lots de très grande taille

Dans le cas de portions échantillonnées de grande taille (> 500 tonnes), le nombre d’échantillons élémentaires à prélever = 40 échantillons élémentaires + √ tonnes pour le contrôle des substances ou produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux, ou 100 échantillons élémentaires + √ tonnes pour le contrôle des constituants ou substances susceptibles d’être répartis non uniformément dans les matières premières pour aliments des animaux.

6. EXIGENCES QUANTITATIVES CONCERNANT LES ÉCHANTILLONS GLOBAUX







Un seul échantillon global par portion échantillonnée est requis. Nature des aliments pour animaux Taille minimale de l’échantillon global (1) (2) 6.1. Aliments en vrac 4 kg 6.2. Aliments emballés 4 kg (3) 6.3. Aliments liquides ou semi-liquides 4 litres 6.4. Aliments en briques ou pierres à lécher: 6.4.1. d’un poids unitaire excédant 1 kg 4 kg 6.4.2. d’un poids unitaire n’excédant pas 1 kg poids de quatre briques ou pierres d’origine 6.5. Fourrage/fourrage grossier 4 kg (4) (1) Si la valeur des aliments pour animaux est élevée, il est possible de prélever une plus petite quantité pour l’échantillon global, pour autant que cela soit décrit et documenté dans le rapport d’échantillonnage. (2) Conformément aux dispositions du règlement (UE) no 619/2011 de la Commission du 24 juin 2011 fixant les méthodes d’échantillonnage et d’analyse du contrôle officiel des aliments pour animaux en vue de la détection de matériel génétiquement modifié faisant l’objet d’une procédure d’autorisation ou dont l’autorisation a expiré (JO L 166 du 25.6.2011, p. 9), l’échantillon global pour le contrôle de la présence de matériel génétiquement modifié doit contenir au moins 35 000 graines/semences. Cela signifie que l’échantillon global doit peser au moins 10,5 kg pour le maïs et 7 kg pour le soja. Pour d’autres graines ou semences telles que l’orge, le millet, l’avoine, le riz, le seigle, le blé et le colza, un échantillon global de 4 kg correspond à plus de 35 000 graines. (3) Dans le cas des aliments pour animaux emballés, il peut également s’avérer impossible de constituer un échantillon global de 4 kg, en fonction de la taille des unités individuelles. (4) S’il s’agit de fourrage grossier ou de fourrage de faible densité relative (par exemple, de foin ou de paille), l’échantillon global doit peser au moins 1 kg.

7. EXIGENCES QUANTITATIVES CONCERNANT LES ÉCHANTILLONS FINALS

Échantillons finals

L’analyse d’au moins un échantillon final est requise. La quantité de l’échantillon final destinée à l’analyse ne peut être inférieure aux valeurs suivantes:







Aliments solides 500 g (1) (2) (3) Aliments liquides ou semi-liquides 500 ml (1) (1) Conformément aux dispositions du règlement (UE) no 619/2011, l’échantillon final pour le contrôle de la présence de matériel génétiquement modifié doit contenir au moins 10 000 graines/semences. Cela signifie que l’échantillon final doit peser au moins 3 000 g pour le maïs et 2 000 g pour le soja. Pour d’autres graines ou semences telles que l’orge, le millet, l’avoine, le riz, le seigle, le blé et le colza, un échantillon final de 500 g correspond à plus de 10 000 graines. (2) Si la taille de l’échantillon global est sensiblement inférieure à 4 kg ou 4 litres (voir notes de bas de page du point 6), il est possible de prélever une plus petite quantité pour l’échantillon final, pour autant que cela soit décrit et documenté dans le rapport d’échantillonnage. (3) En cas d’échantillonnage de légumineuses, de grains de céréales et de fruits à coque visant à déterminer la présence de résidus de pesticides, l’échantillon final doit peser au moins 1 kg conformément aux dispositions de la directive 2002/63/CE de la Commission (JO L 187 du 16.7.2002, p. 30).

8. MÉTHODE D’ÉCHANTILLONNAGE POUR LES LOTS DE TRÈS GRANDE TAILLE OU LES LOTS STOCKÉS OU TRANSPORTÉS DE TELLE MANIÈRE QU’UN ÉCHANTILLONNAGE DANS L’ENSEMBLE DU LOT N’EST PAS POSSIBLE

8.1. Principes généraux

Si le mode de transport ou de stockage d’un lot ne permet pas de prélever des échantillons élémentaires dans l’ensemble du lot, l’échantillonnage doit de préférence être effectué lorsque ce lot est en mouvement.

Dans le cas des grands entrepôts destinés au stockage d’aliments pour animaux, il convient d’encourager les opérateurs à installer dans l’entrepôt des équipements permettant de prélever (automatiquement) des échantillons dans l’ensemble du lot stocké.

Si les procédures d’échantillonnage prévues dans le présent chapitre sont appliquées, l’exploitant du secteur de l’alimentation animale ou son représentant en sont informés. Si l’exploitant du secteur de l’alimentation animale ou son représentant remettent en cause la procédure d’échantillonnage, ils autorisent l’autorité compétente à prélever des échantillons dans l’ensemble du lot, à leurs propres frais.

8.2. Lots de grande taille transportés par bateau

8.2.1. Échantillonnage dynamique de lots de grande taille transportés par bateau

L’échantillonnage de lots de grande taille transportés par bateau est effectué de préférence lorsque le produit est en mouvement (échantillonnage dynamique).

L’échantillonnage doit être fait par cale (entité qui peut être physiquement séparée). Cependant, les cales sont vidées partiellement l’une après l’autre, de sorte que la séparation physique initiale n’existe plus après le transfert dans les installations de stockage. L’échantillonnage peut donc être réalisé en fonction de la séparation physique initiale ou en fonction de la séparation après transfert dans les installations de stockage.

Le déchargement d’un bateau peut durer plusieurs jours. Normalement, l’échantillonnage doit être effectué à intervalles réguliers tout au long du déchargement. Toutefois, la présence d’un inspecteur officiel chargé de l’échantillonnage pendant toute l’opération de déchargement n’est pas toujours possible ou appropriée. Par conséquent, la réalisation d’un échantillonnage sur une partie (portion échantillonnée) du lot est autorisée. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée.

Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

Même si l’échantillon officiel est prélevé automatiquement, la présence d’un inspecteur est nécessaire. Cependant, si l’échantillonnage automatique est effectué selon des paramètres préétablis qui ne peuvent être modifiés durant l’échantillonnage et si les échantillons élémentaires sont collectés dans un réceptacle scellé prévenant toute fraude, la présence d’un inspecteur n’est requise qu’au début de l’échantillonnage, chaque fois que le réceptacle contenant les échantillons doit être changé, ainsi qu’à la fin de l’échantillonnage.

8.2.2. Échantillonnage statique de lots transportés par bateau

Si l’échantillonnage est effectué de façon statique, la procédure prévue pour les installations de stockage (silos) accessibles par le haut doit être appliquée (voir le point 8.4.1).

L’échantillonnage doit être effectué sur la partie accessible (par le haut) du lot/de la cale. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.3. Échantillonnage de lots de grande taille stockés dans des entrepôts

L’échantillonnage doit être effectué sur la partie accessible du lot. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.4. Échantillonnage dans des installations de stockage (silos)

8.4.1. Échantillonnage dans des silos (facilement) accessibles par le haut

L’échantillonnage doit être effectué sur la partie accessible du lot. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.4.2. Échantillonnage dans des silos inaccessibles par le haut (silos fermés)

8.4.2.1. Silos inaccessibles par le haut (silos fermés) d’une capacité supérieure à 100 tonnes

Les aliments pour animaux entreposés dans des silos de ce type ne peuvent faire l’objet d’un échantillonnage statique. Par conséquent, si les aliments pour animaux entreposés dans le silo doivent faire l’objet d’un échantillonnage et s’il n’est pas possible de déplacer le lot, il doit être convenu avec l’opérateur qu’il informe l’inspecteur du moment où le silo sera déchargé afin de permettre l’échantillonnage des aliments en mouvement.

8.4.2.2. Silos inaccessibles par le haut (silos fermés) d’une capacité inférieure à 100 tonnes

La procédure d’échantillonnage consiste à transférer dans un réceptacle une quantité comprise entre 50 et 100 kg et à y prélever l’échantillon. La taille de l’échantillon global correspond au lot entier et le nombre d’échantillons élémentaires dépend de la quantité transférée du silo vers le réceptacle en vue de l’échantillonnage. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.5. Échantillonnage d’aliments pour animaux en vrac dans des conteneurs fermés de grande taille

Il est fréquent que de tels lots ne puissent faire l’objet d’un échantillonnage que quand ils sont déchargés. Dans certains cas, il est impossible de décharger ce type de conteneurs au point d’importation ou de contrôle; c’est pourquoi l’échantillonnage devrait avoir lieu lorsqu’ils sont déchargés.

9. INSTRUCTIONS CONCERNANT LE PRÉLÈVEMENT, LA PRÉPARATION ET LE CONDITIONNEMENT DES ÉCHANTILLONS

9.1. Généralités

Prélever et préparer les échantillons sans délai indu en tenant compte des précautions requises pour éviter que le produit ne soit altéré ou contaminé. Les instruments ainsi que les surfaces et les récipients destinés à recevoir les échantillons doivent être propres et secs.

9.2. Échantillons élémentaires

Les échantillons élémentaires doivent être prélevés au hasard dans l’ensemble de la portion échantillonnée et être approximativement égaux en poids.

La taille minimale de l’échantillon élémentaire est de 100 g ou de 25 g dans le cas de fourrage grossier ou fourrage de faible densité relative.

Si, conformément aux règles de la procédure d’échantillonnage établie au point 8, moins de 40 échantillons élémentaires doivent être prélevés, la taille des échantillons élémentaires doit être déterminée en fonction de la taille requise pour l’échantillon global à constituer (voir le point 6).

En cas d’échantillonnage de petits lots d’aliments pour animaux emballés sur lesquels, conformément aux exigences quantitatives, un nombre limité d’échantillons élémentaires doit être prélevé, le contenu d’une unité d’origine n’excédant pas 1 kg ou 1 litre constitue un échantillon élémentaire.

En cas d’échantillonnage d’aliments pour animaux emballés composés de petites unités (par exemple < 250 g), la taille de l’échantillon élémentaire dépend de la taille de l’unité.

9.2.1. Aliments en vrac

Selon le cas, l’échantillonnage peut avoir lieu lors de la mise en mouvement de la portion échantillonnée (chargement ou déchargement).

9.2.2. Aliments emballés

Le nombre requis d’unités à échantillonner étant délimité comme indiqué au chapitre 5, prélever une partie du contenu de chaque unité au moyen d’une sonde ou d’une pelle. Si nécessaire, prélever les échantillons après avoir vidé séparément les unités.

9.2.3. Aliments liquides ou semi-liquides homogènes ou homogénéisables

Le nombre requis d’unités à échantillonner étant délimité comme indiqué au chapitre 5, effectuer un prélèvement dans chaque unité après en avoir homogénéisé le contenu, si nécessaire.

Les échantillons élémentaires peuvent être prélevés lors du soutirage du contenu.

9.2.4. Aliments liquides ou semi-liquides non homogénéisables

Le nombre requis d’unités à échantillonner étant délimité comme indiqué au chapitre 5, prélever les échantillons à différents niveaux.

Les échantillons peuvent également être prélevés lors du soutirage du contenu, après élimination des premières fractions.

Dans les deux cas, le volume total prélevé ne peut être inférieur à 10 litres.

9.2.5. Aliments en briques et pierres à lécher

Le nombre requis de briques ou de pierres à échantillonner étant délimité comme indiqué au chapitre 5, une partie de chaque brique ou pierre peut être prélevée. En cas de suspicion de non-homogénéité d’une brique ou d’une pierre, l’intégralité de cette dernière peut faire office d’échantillon.

Pour les briques ou pierres à lécher dont le poids unitaire n’excède pas 1 kg, une brique ou une pierre constituent un échantillon élémentaire.

9.3. Préparation des échantillons globaux

Mélanger les échantillons élémentaires pour constituer un seul échantillon global.

9.4. Préparation des échantillons finals

Mélanger soigneusement l’échantillon global ( 23 ).

— Introduire chaque échantillon dans un récipient/réceptacle approprié. Prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter toute modification de la composition de l’échantillon ou toute contamination ou altération pouvant survenir au cours du transport ou du stockage.

— Pour le contrôle des constituants ou substances répartis uniformément dans les aliments pour animaux, l’échantillon global peut être réduit de façon représentative à 2 kg ou 2 litres au moins (échantillon réduit) ( 24 ), de préférence au moyen d’un diviseur mécanique ou automatique. Pour le contrôle de la présence de résidus de pesticides dans les légumineuses, les grains de céréales et les fruits à coque, la taille minimale de l’échantillon réduit est de 3 kg. Si la nature des aliments pour animaux ne permet pas d’utiliser un diviseur ou si ce dernier n’est pas disponible, l’échantillon peut être réduit par la méthode des quartiers. À partir des échantillons réduits, préparer ensuite des échantillons finals (à des fins de contrôle, de recours et de référence) de quantité approximativement égale et conformes aux exigences quantitatives figurant au chapitre 7. En cas de contrôle des constituants, y compris le matériel génétiquement modifié, ou substances susceptibles d’être répartis non uniformément dans les matières premières pour aliments des animaux, l’échantillon global est: — — complètement homogénéisé puis divisé en échantillons finals, ou — réduit à 2 kg ou 2 litres au moins ( 25 ) au moyen d’un diviseur mécanique ou automatique. Si la nature des aliments pour animaux ne permet pas d’utiliser un diviseur, et dans ce cas uniquement, l’échantillon peut, si nécessaire, être réduit par la méthode des quartiers. Pour le contrôle de la présence de matériel génétiquement modifié dans le cadre du règlement (UE) no 619/2011, l’échantillon réduit doit contenir au moins 35 000 graines/semences pour permettre d’obtenir des échantillons finals à des fins de contrôle, de recours et de référence comportant au moins 10 000 graines/semences [voir la note de bas de page (**) au chapitre 6 et la note de bas de page (*) au chapitre 7].

9.5. Conditionnement des échantillons

Sceller et étiqueter les récipients ou emballages de façon à ce qu’il soit impossible de les ouvrir sans briser le scellé. L’étiquette générale doit être incorporée dans le scellé.

9.6. Envoi des échantillons au laboratoire

Transmettre l’échantillon sans délai indu au laboratoire d’analyse désigné, avec les indications nécessaires à l’analyse.

10. PROCÈS-VERBAL D’ÉCHANTILLONNAGE

Pour chaque échantillon, établir un procès-verbal d’échantillonnage permettant d’identifier sans ambiguïté la portion échantillonnée et sa taille.

Mentionner également dans le procès-verbal tout écart par rapport à la procédure d’échantillonnage prévue par le présent règlement.

Mettre le procès-verbal à la disposition du laboratoire de contrôle officiel ainsi que de l’exploitant du secteur de l’alimentation animale et/ou du laboratoire désigné par ce dernier.









ANNEXE II

DISPOSITIONS GÉNÉRALES CONCERNANT LES MÉTHODES D’ANALYSE DES ALIMENTS POUR ANIMAUX

A. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS EN VUE DE L’ANALYSE

1. Objet

Les procédures décrites ci-après portent sur la préparation, en vue de leur analyse, des échantillons envoyés aux laboratoires de contrôle après leur prélèvement conformément aux dispositions de l’annexe I.

La préparation des échantillons de laboratoire doit permettre que les prises d’essais prévues dans les méthodes d’analyse soient homogènes et représentatives des échantillons finals.

2. Précautions à prendre

La procédure à suivre pour préparer des échantillons dépend des méthodes d’analyse à appliquer et des constituants ou substances à contrôler. Il est donc essentiel de veiller à ce que la procédure suivie en la matière soit adaptée à la méthode d’analyse appliquée ainsi qu’aux constituants ou substances à contrôler.

Effectuer toutes les opérations de façon à éviter autant que possible une contamination de l’échantillon ou des modifications de sa composition.

Effectuer les broyages, les mélanges et les tamisages sans délai, en exposant au minimum l’échantillon à l’air et à la lumière. Éviter l’utilisation de moulins ou de broyeurs susceptibles de produire un échauffement notable de l’échantillon.

Le broyage manuel est recommandé pour les aliments particulièrement sensibles à la chaleur. Veiller, en outre, à ce que l’appareillage même ne soit pas une source de contamination.

Si la préparation entraîne inévitablement une modification significative de la teneur en humidité de l’échantillon, déterminer sa teneur en humidité avant et après la préparation selon la méthode prévue à l’annexe III, point A.

3. Procédure

3.1. Procédure générale

L’aliquote de test est prélevée sur l’échantillon final. La méthode des quartiers opposés n’est pas recommandée, car elle peut aboutir à des aliquotes de test présentant une erreur de division élevée.

3.1.1. Aliments pouvant être moulus en l’état

— Mélanger l’échantillon final tamisé et le recueillir dans un récipient approprié, propre et sec, muni d’une fermeture hermétique. Mélanger de nouveau pour garantir une homogénéisation complète, immédiatement avant de prélever la prise d’essai (aliquote de test).

3.1.2. Aliments pouvant être moulus après dessiccation

— Sauf indication spécifique dans les méthodes d’analyse, dessécher l’échantillon final, de façon à ramener sa teneur en humidité à un niveau compris entre 8 et 12 %, en appliquant le procédé de prédessiccation décrit au point 4.3 de la méthode de dosage de l’humidité mentionnée à l’annexe III, point A. Procéder ensuite comme indiqué au point 3.1.1.

3.1.3. Aliments liquides ou semi-liquides

— Recueillir l’échantillon final dans un récipient approprié, propre et sec, muni d’une fermeture hermétique. Mélanger soigneusement pour garantir une homogénéisation complète, immédiatement avant de prélever la prise d’essai (aliquote de test).

3.1.4. Autres aliments

— Si l’échantillon final ne peut être préparé selon l’un des procédés indiqués ci-dessus, appliquer tout autre procédé de préparation approprié permettant d’obtenir des prises d’essai (aliquotes de test) homogènes et représentatives des échantillons finals.

3.2. Procédure spécifique en cas d’examen visuel ou microscopique ou dans les cas où l’échantillon global est entièrement homogénéisé

— En cas d’examen visuel (sans microscope), l’échantillon de laboratoire est examiné dans son intégralité.

— En cas d’examen au microscope, le laboratoire peut réduire l’échantillon global ou réduire encore davantage l’échantillon réduit. Les échantillons finals destinés à des fins de recours et, éventuellement, à des fins de référence sont prélevés selon une procédure équivalente à la procédure appliquée pour prélever l’échantillon final destiné à des fins de contrôle.

— Si l’échantillon global est entièrement homogénéisé, les échantillons finals sont prélevés sur l’échantillon global homogénéisé.

4. Conservation et stockage des échantillons

Conserver les échantillons à une température ne pouvant modifier leur composition. Conserver les échantillons destinés à l’analyse de vitamines ou de substances particulièrement sensibles à la lumière dans des conditions telles qu’ils ne soient pas altérés par la lumière.

B. DISPOSITIONS CONCERNANT LES RÉACTIFS ET L’APPAREILLAGE UTILISÉS DANS LES MÉTHODES D’ANALYSE

1. Sauf indication spécifique dans les méthodes d’analyse, tous les réactifs doivent être de qualité «pour analyse» (p.a.). Pour l’analyse des oligoéléments, la pureté des réactifs doit être contrôlée par un essai à blanc. Selon le résultat obtenu, une purification supplémentaire des réactifs peut être requise.

2. Les opérations de mise en solution, de dilution, de rinçage ou de lavage mentionnées dans les méthodes d’analyse sans indication quant à la nature du solvant ou du diluant impliquent qu’il faut utiliser de l’eau. En règle générale, l’eau doit être déminéralisée ou distillée. Dans des cas particuliers, indiqués dans les méthodes d’analyse, elle doit être soumise à des procédés spécifiques de purification.

3. Compte tenu de l’équipement usuel des laboratoires de contrôle, seuls les instruments et appareils spéciaux ou devant répondre à des conditions spécifiques sont mentionnés dans les méthodes d’analyse. Ce matériel doit être propre, tout particulièrement pour les déterminations de très faibles quantités de substances.

C. APPLICATION DES MÉTHODES D’ANALYSE ET EXPRESSION DES RÉSULTATS

1. Procédé d’extraction

Plusieurs méthodes déterminent un procédé d’extraction spécifique. En règle générale, des procédés d’extraction autres que celui visé dans la méthode peuvent être appliqués à condition que le procédé d’extraction appliqué ait une efficacité d’extraction équivalente avérée, pour la matrice analysée, à celle du procédé mentionné dans la méthode.

2. Procédé de purification

Plusieurs méthodes déterminent un procédé de purification spécifique. En règle générale, des procédés de purification autres que celui visé dans la méthode peuvent être appliqués, à condition qu’il soit prouvé que le procédé de purification appliqué donne des résultats d’analyse équivalents, pour la matrice analysée, à ceux que donne le procédé mentionné dans la méthode.

3. Nombre de déterminations

Si, lors de l’analyse de substances indésirables, le résultat de la première détermination est nettement (> 50 %) inférieur à la spécification à contrôler, il n’est pas nécessaire de procéder à une détermination supplémentaire, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies. Dans les autres cas, une double analyse (deuxième détermination) est nécessaire pour exclure la possibilité d’une contamination croisée interne ou un mélange accidentel des échantillons. La moyenne des deux déterminations, compte tenu de l’incertitude de mesure, sert à vérifier la conformité.

Si, lors du contrôle de la teneur déclarée en une substance ou un ingrédient donné, le résultat de la première détermination confirme l’exactitude de la teneur déclarée (ce qui signifie que l’écart entre le résultat de l’analyse et la teneur déclarée se situe dans la plage admissible), il n’est pas nécessaire de procéder à des déterminations supplémentaires, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies. Dans les autres cas, une double analyse (deuxième détermination) est nécessaire pour exclure la possibilité d’une contamination croisée interne ou un mélange accidentel des échantillons. La moyenne des deux déterminations, compte tenu de l’incertitude de mesure, sert à vérifier la conformité.

Dans certains cas, l’écart admissible est défini par la législation, comme dans le règlement (CE) no 767/2009 du Parlement européen et du Conseil du 13 juillet 2009 concernant la mise sur le marché et l’utilisation des aliments pour animaux, modifiant le règlement (CE) no 1831/2003 du Parlement européen et du Conseil et abrogeant la directive 79/373/CEE du Conseil, la directive 80/511/CEE de la Commission, les directives 82/471/CEE, 83/228/CEE, 93/74/CEE, 93/113/CE et 96/25/CE du Conseil, ainsi que la décision 2004/217/CE de la Commission ( 26 ).

4. Mention de la méthode d’analyse appliquée

Le bulletin d’analyse doit mentionner la méthode d’analyse appliquée.

5. Indication du résultat de l’analyse

Le résultat de l’analyse doit être exprimé conformément aux indications données dans la méthode d’analyse avec un nombre approprié de chiffres significatifs, et être corrigé, si nécessaire, en fonction de la teneur en humidité de l’échantillon final avant sa préparation.

6. Incertitude de mesure et taux de récupération en cas d’analyse de substances indésirables

En ce qui concerne les substances indésirables au sens de la directive 2002/32/CE, un produit destiné à l’alimentation animale est considéré comme ne satisfaisant pas à la teneur maximale fixée lorsque le résultat de l’analyse, rapporté à un aliment d’une teneur en humidité de 12 %, est jugé supérieur à la teneur maximale, compte tenu de l’incertitude de mesure élargie et de la correction de la récupération. La concentration analysée, corrigée au titre de la récupération et après soustraction de l’incertitude de mesure élargie, est utilisée pour l’évaluation de la conformité. Ce procédé est applicable uniquement dans les cas où la méthode d’analyse autorise l’estimation de l’incertitude de mesure et de la correction de la récupération (ce qui n’est pas possible, par exemple, dans le cas d’une analyse microscopique).

Le résultat de l’analyse est rapporté comme suit (lorsque la méthode d’analyse appliquée permet d’estimer l’incertitude de mesure et le taux de récupération):

a) corrigé au titre de la récupération, le taux de récupération étant indiqué. La correction de la récupération n’est pas nécessaire lorsque le taux de récupération est compris entre 90 et 110 %;

b) sous la forme «x +/– U», où x est le résultat de l’analyse et U l’incertitude de mesure élargie, calculée à l’aide d’un coefficient de couverture 2 qui donne un niveau de confiance d’environ 95 %.

Néanmoins, si le résultat de l’analyse est nettement (> 50 %) inférieur à la spécification à contrôler, et à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies et que l’analyse vise uniquement à contrôler si les dispositions légales sont respectées, ce résultat peut être mentionné sans correction de la récupération, et la mention du taux de récupération et de l’incertitude de mesure peut être omise dans ce cas.

▼B









ANNEXE III

MÉTHODES D'ANALYSE RELATIVES AU CONTRÔLE DE LA COMPOSITION DES MATIÈRES PREMIÈRES POUR ALIMENTS DES ANIMAUX ET DES ALIMENTS COMPOSÉS

A. DOSAGE DE L'HUMIDITÉ

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité des aliments pour animaux. Dans le cas d'aliments pour animaux contenant des substances volatiles telles que des acides organiques, il a été observé qu'une quantité significative de substances volatiles était dosée en même temps que la teneur en humidité.

Elle ne concerne pas l'analyse des produits laitiers en tant que matières premières pour aliments des animaux, l'analyse des substances minérales et des mélanges essentiellement composés de substances minérales, l'analyse des graisses et des huiles animales et végétales, ni l'analyse des graines et des fruits oléagineux.

2. Principe

L'échantillon est soumis à la dessiccation dans des conditions définies, variant en fonction de la nature de l'aliment pour animaux. La perte de poids est déterminée par pesée. Il est nécessaire de procéder à une prédessiccation lorsqu'il s'agit d'aliments solides qui ont une teneur en humidité élevée.

3. Appareillage

3.1. Broyeur construit en matériau n'absorbant pas l'humidité, facile à nettoyer, permettant un broyage rapide et uniforme sans provoquer d'échauffement sensible, évitant au maximum le contact avec l'air extérieur et permettant de satisfaire aux exigences énoncées aux points 4.1.1 et 4.1.2 (par exemple, microbroyeurs à marteaux ou à refroidissement à eau, moulins à cônes démontables, broyeurs à mouvement lent ou à disques dentés).

3.2. Balance d'analyse d'une précision de 1 mg.

3.3. Récipients secs en métal inoxydable ou en verre munis d'un couvercle hermétique; surface utile permettant d'obtenir une répartition de la prise d'essai de 0,3 g par cm2.

3.4. Étuve isotherme (± 2 oC) à chauffage électrique, assurant une régulation rapide de la température et convenablement ventilée ( 27 ).

3.5. Étuve à vide, à chauffage électrique réglable, munie d'une pompe à huile et soit d'un dispositif à introduction d'air chaud déshydraté, soit d'un déshydratant (par exemple, de l'oxyde de calcium).

3.6. Dessiccateur à plaque en métal ou en porcelaine, épaisse, perforée, contenant un déshydratant efficace.

4. Mode opératoire

NB: Les opérations décrites au présent point doivent être effectuées immédiatement après l'ouverture des emballages contenant les échantillons. Les analyses doivent être effectuées au moins en double.

4.1. Préparation

4.1.1. Aliments pour animaux autres que ceux visés aux points 4.1.2 et 4.1.3

Prélever au moins 50 g de l'échantillon. Si nécessaire, broyer ou diviser de façon appropriée pour éviter toute variation de la teneur en humidité (voir point 6).

4.1.2. Céréales et gruaux

Prélever au moins 50 g de l'échantillon. Moudre en particules dont au moins 50 % passent par un tamis à mailles de 0,5 mm et ne laissent pas plus de 10 % de refus sur le tamis à mailles rondes de 1 mm.

4.1.3. Aliments liquides ou pâteux, aliments constitués essentiellement de matières grasses

Prélever et peser, à 10 mg près, 25 g environ de l'échantillon, y ajouter une quantité appropriée de sable anhydre, pesée à 10 mg près, et mélanger jusqu'à obtention d'un produit homogène.

4.2. Dessiccation

4.2.1. Aliments pour animaux autres que ceux visés aux points 4.2.2 et 4.2.3

Tarer, à 1 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l'étuve préchauffée à 103 oC. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Laisser sécher durant quatre heures à partir du moment où l'étuve a de nouveau atteint la température de 103 oC. Remettre le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l'étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (3.6) et peser à 1 mg près.

Dans le cas des aliments constitués essentiellement de matières grasses, effectuer une dessiccation complémentaire de 30 minutes dans l'étuve à 130 oC. L'écart entre les deux pesées ne peut excéder 0,1 % d'humidité.

4.2.2. Céréales, farines, gruaux et semoules

Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon broyé et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l'étuve préchauffée à 130 oC. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Laisser sécher durant deux heures à partir du moment où l'étuve a de nouveau atteint la température de 130 oC. Remettre le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l'étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (3.6) et peser à 1 mg près.

4.2.3. Aliments composés pour animaux contenant plus de 4 % de saccharose ou de lactose: matières premières pour aliments des animaux tels que caroube, produits céréaliers hydrolysés, germes de malt, cossettes de betteraves, solubles de poisson et sucres; aliments composés pour animaux contenant plus de 25 % de sels minéraux renfermant de l'eau de cristallisation Tarer, à 0,5 mg près, un récipient (3.3) muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l'échantillon et répartir uniformément la prise d'essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l'étuve à vide (3.5) préchauffée à une température comprise entre 80 et 85 oC. Pour éviter que la température de l'étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Amener la pression à 100 torrs et laisser sécher à cette pression durant quatre heures, soit sous un courant d'air sec et chaud, soit à l'aide d'un déshydratant (300 g environ pour 20 échantillons). Dans ce dernier cas, couper la connexion avec la pompe à vide lorsque la pression prescrite est atteinte. Compter la durée de séchage à partir du moment où l'étuve a de nouveau atteint la température de 80 à 85 oC. Ramener ensuite avec précaution l'étuve à la pression atmosphérique. Ouvrir l'étuve, couvrir immédiatement le récipient de son couvercle, retirer le récipient de l'étuve, laisser refroidir durant 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (3.6) et peser à 1 mg près. Procéder à une dessiccation complémentaire de 30 minutes dans l'étuve à vide à la température de 80 à 85 oC et peser de nouveau. L'écart entre les deux pesées ne peut excéder 0,1 % d'humidité.

4.3. Prédessiccation

4.3.1. Aliments pour animaux autres que ceux mentionnés au point 4.3.2

Les aliments solides, dont la teneur en humidité est élevée et rend le broyage difficile, doivent être prédesséchés comme suit.

Peser, à 10 mg près, 50 g de l'échantillon non broyé (une division grossière peut être effectuée, si nécessaire, dans le cas des aliments comprimés ou agglomérés) dans un récipient approprié (par exemple, une plaque en aluminium de 20 × 12 cm munie d'un bord de 0,5 cm). Laisser sécher dans une étuve à la température de 60 à 70 oC, jusqu'à ce que la teneur en humidité soit ramenée à une valeur comprise entre 8 et 12 %. Retirer de l'étuve, laisser refroidir à découvert dans le laboratoire durant une heure et peser à 10 mg près. Broyer immédiatement après comme indiqué au point 4.1.1 et effectuer la dessiccation comme indiqué au point 4.2.1 ou 4.2.3, selon la nature de l'aliment.

4.3.2. Céréales

Les grains dont la teneur en humidité est supérieure à 17 % doivent être prédesséchés comme suit.

Peser, à 10 mg près, 50 g du grain non moulu dans un récipient approprié (par exemple, une plaque en aluminium de 20 × 12 cm munie d'un bord de 0,5 cm). Laisser sécher dans une étuve pendant 5 à 7 minutes à la température de 130 oC. Retirer de l'étuve, laisser refroidir à découvert dans le laboratoire durant deux heures et peser à 10 mg près. Moudre immédiatement après, comme indiqué au point 4.1.2 et effectuer la dessiccation comme indiqué au point 4.2.2.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité (X), exprimée en pourcentage de l'échantillon, est donnée par les formules suivantes.

5.1. Dessiccation sans prédessiccation

où:

m = poids initial, en grammes, de la prise d'essai,

m0 = poids, en grammes, de la prise d'essai sèche.

5.2. Dessiccation avec prédessiccation

où:

m = poids initial, en grammes, de la prise d'essai,

m1 = poids, en grammes, de la prise d'essai après prédessiccation,

m2 = poids, en grammes, de la prise d'essai après broyage ou mouture,

m0 = poids, en grammes, de la prise d'essai sèche.

5.3. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser 0,2 % de l'humidité (valeur absolue).

6. Observation

Si un broyage se révèle nécessaire et s'il s'avère que celui-ci entraîne une variation de la teneur en humidité du produit, les résultats de l'analyse des composants de l'aliment doivent être corrigés en fonction de la teneur en humidité de l'échantillon initial.

B. DOSAGE DE L'HUMIDITÉ DANS LES GRAISSES ET LES HUILES ANIMALES ET VÉGÉTALES

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité (eau et autres matières volatiles) des graisses et des huiles animales et végétales.

2. Principe

L'échantillon est soumis à la dessiccation à 103 oC jusqu'à cessation de la diminution de la masse (la perte de masse entre deux pesées successives doit être inférieure ou égale à 1 mg). La perte de poids est déterminée par pesée.

3. Appareillage

3.1. Récipient à fond plat, en matériau résistant à la corrosion, d'un diamètre de 8 à 9 cm et d'une hauteur de 3 cm environ.

3.2. Thermomètre, avec bulbe renforcé, et chambre de dilatation à l'extrémité supérieure, gradué de 80 oC environ à 110 oC au moins, d'une longueur de 10 cm environ.

3.3. Bain de sable ou plaque chauffante électrique.

3.4. Dessiccateur, contenant un déshydratant efficace.

3.5. Balance d'analyse.

4. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 20 g de l'échantillon homogénéisé dans le récipient (3.1) sec et taré contenant le thermomètre (3.2). Chauffer sur le bain de sable ou la plaque chauffante (3.3), en agitant constamment à l'aide du thermomètre, de façon à ce que la température atteigne 90 oC en 7 minutes environ.

Réduire l'intensité du chauffage en suivant la fréquence avec laquelle les bulles montent du fond du récipient. La température ne peut dépasser 105 oC. Continuer à agiter en raclant le fond du récipient jusqu'à cessation de la formation de bulles.

Pour assurer l'élimination complète de l'humidité, répéter à plusieurs reprises le chauffage à 103 oC ± 2 oC, en refroidissant à 93 oC entre les chauffages successifs. Laisser refroidir ensuite dans le dessiccateur (3.4) jusqu'à température ambiante et peser. Répéter cette opération jusqu'à ce que la perte de poids entre deux pesées successives n'excède plus 2 mg.

NB: Une augmentation de poids de l'échantillon après chauffage répété indique une oxydation de la graisse. Si cela se produit, calculer le résultat à partir de la pesée effectuée immédiatement avant le début de l'augmentation de poids.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité (X), exprimée en pourcentage de l'échantillon, est donnée par la formule suivante.

où:

m = poids, en grammes, de la prise d'essai,

m1 = poids, en grammes, du récipient avec son contenu, avant le chauffage,

m2 = poids, en grammes, du récipient avec son contenu, après le chauffage.

Les résultats inférieurs à 0,05 % doivent être rapportés par la mention «moins de 0,05 %».

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser 0,05 % en valeur absolue.

C. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN PROTÉINES BRUTES

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en protéines brutes des aliments pour animaux à partir de la teneur en azote dosée selon la méthode de Kjeldahl.

2. Principe

L'échantillon est minéralisé à l'acide sulfurique en présence d'un catalyseur. La solution acide est alcalinisée par une solution d'hydroxyde de sodium. L'ammoniac est entraîné par distillation et recueilli dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré par une solution étalon d'hydroxyde de sodium.

Autre possibilité: l'ammoniac libéré est distillé dans un excès de solution d'acide borique, après quoi l'ammoniac combiné avec l'acide borique est titré par une solution d'acide chlorhydrique ou d'acide sulfurique.

3. Réactifs

3.1. Sulfate de potassium.

3.2. Catalyseur: oxyde de cuivre (II) CuO ou sulfate de cuivre (II) pentahydraté CuSO45H2O.

3.3. Zinc en granulés.

3.4. Acide sulfurique, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Rouge de méthyle (indicateur): dissoudre 300 g de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Solution d'hydroxyde de sodium (utilisation possible de la qualité technique) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Hydroxyde de sodium, solution étalon volumétrique, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Hydroxyde de sodium, solution étalon volumétrique, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Granulés de pierre ponce lavés à l'acide chlorhydrique et calcinés.

3.13. Acétanilide (point de fusion = 114 oC, teneur N = 10,36 %).

3.14. Saccharose (exempt d'azote).

3.15. Acide borique (H3BO3).

3.16. Solution d'indicateur de rouge de méthyle: dissoudre 100 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol ou de méthanol.

3.17. Solution de vert de bromocrésol: dissoudre 100 mg de vert de bromocrésol dans 100 ml d'éthanol ou de méthanol.

3.18. Solution d'acide borique (de 10 g/l à 40 g/l en fonction de l'appareillage utilisé). En cas de détection colorimétrique au point d'équivalence, les indicateurs (rouge de méthyle et vert de bromocrésol) doivent être ajoutés aux solutions d'acide borique. Si 1 l de solution d'acide borique est préparé, avant ajustement du volume, ajouter 7 ml de solution d'indicateur de rouge de méthyle (3.16) et 10 ml de solution de vert de bromocrésol (3.17). En fonction de l'eau utilisée, le pH de la solution d'acide borique peut varier d'un lot à l'autre. Il est fréquent qu'il faille opérer un ajustement au moyen d'un petit volume d'alcali pour obtenir un blanc positif. NB: L'ajout d'environ 3 à 4 ml de NaOH (3.11) dans 1 l de solution d'acide borique à 10 g/l donne généralement de bons ajustements. Conserver la solution à température ambiante et la protéger de la lumière et des sources de vapeurs d'ammoniac pendant sa conversation.

3.19. Acide chlorhydrique, solution étalon volumétrique, c(HCL) = 0,10 mol/l. NB: Il est permis de modifier les concentrations des solutions volumétriques (points 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, et 3.19), à condition d'apporter les corrections nécessaires dans les calculs. Les concentrations devraient toujours être exprimées par des chiffres à quatre décimales.

4. Appareillage

Appareils permettant de réaliser les opérations de minéralisation, de distillation et de titrage selon la méthode de Kjeldahl.

5. Mode opératoire

5.1. Minéralisation

Peser, à 0,001 g près, 1 g de l'échantillon et introduire la prise d'essai dans le ballon de l'appareil de minéralisation. Ajouter 15 g de sulfate de potassium (3.1), une quantité appropriée de catalyseur (3.2) [0,3 à 0,4 g d'oxyde de cuivre (II) ou 0,9 à 1,2 g de sulfate de cuivre (II) pentahydraté], 25 ml d'acide sulfurique (3.4) et, si nécessaire, quelques grains de pierre ponce (3.12) et mélanger.

Chauffer le ballon, avec modération dans un premier temps, en agitant de temps en temps, si nécessaire, jusqu'à carbonisation de la masse et disparition de l'écume; chauffer ensuite plus intensément jusqu'à ébullition régulière du liquide. Le chauffage est approprié si l'acide en ébullition se condense sur la paroi du ballon. Éviter la surchauffe des parois et l'adhérence de particules organiques.

Lorsque la solution apparaît limpide et vert clair, maintenir l'ébullition durant 2 heures puis laisser refroidir.

5.2. Distillation

Ajouter avec précaution une quantité suffisante d'eau pour garantir une dissolution complète des sulfates. Laisser refroidir et ajouter, s'il le faut, quelques grains de zinc (3.3). Procéder conformément au point 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1. Distillation dans de l'acide sulfurique

Introduire, dans le flacon collecteur de l'appareil à distiller, 25 ml exactement mesurés d'acide sulfurique 3.5 ou 3.7, selon la teneur présumée en azote. Introduire quelques gouttes d'indicateur au rouge de méthyle (3.8).

Connecter le ballon de minéralisation au réfrigérant de l'appareil à distiller et plonger l'extrémité du réfrigérant sur une hauteur de 1 cm au moins dans le liquide du flacon collecteur (voir observation 8.3). Verser lentement 100 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.9) dans le ballon de minéralisation sans provoquer de perte d'ammoniac (voir observation 8.1). Chauffer le ballon jusqu'à distillation complète de l'ammoniac.

5.2.2. Distillation dans de l'acide borique

Lorsque le titrage de la teneur en ammoniac du distillat est effectué manuellement, le mode opératoire décrit ci-après est applicable. Lorsque l'unité de distillation est entièrement automatisée, y compris pour ce qui concerne le titrage de la teneur en ammoniac du distillat, suivre les instructions d'utilisation de l'unité de distillation fournies par le fabricant.

Placer un flacon collecteur contenant de 25 à 30 ml de solution d'acide borique (3.18) en sortie du réfrigérant de manière telle que le tube d'évacuation soit plongé dans l'excès de solution d'acide borique. Régler l'unité de distillation pour obtenir 50 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.9). Manier l'unité de distillation conformément aux instructions du fabricant et éliminer l'ammoniac libéré par distillation en ajoutant la solution d'hydroxyde de sodium. Recueillir le distillat dans la solution d'acide borique. La quantité de distillat (durée de distillation à la vapeur) dépend de la quantité d'azote dans l'échantillon. Suivre les instructions du fabricant.

NB: Une unité de distillation semi-automatique effectue automatiquement l'addition d'excès d'hydroxyde de sodium et la distillation à la vapeur.

5.3. Titrage

Procéder conformément au point 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1. Acide sulfurique

Titrer, dans le flacon collecteur, l'excès d'acide sulfurique par la solution d'hydroxyde de sodium (3.10 ou 3.11), selon la concentration de l'acide sulfurique utilisé, jusqu'à atteindre le point d'équivalence.

5.3.2. Acide borique

Titrer le contenu du flacon collecteur par la solution étalon volumétrique d'acide chlorhydrique (3.19) ou par la solution étalon volumétrique d'acide sulfurique (3.6) au moyen d'une burette et lire la quantité de solution titrée utilisée.

En cas de détection colorimétrique au point d'équivalence, le point d'équivalence est atteint dès la première trace de couleur rose dans le contenu. Estimer le contenu de la burette à 0,05 ml près. Un agitateur magnétique illuminé ou un détecteur photométrique peut faciliter la visualisation du point d'équivalence.

Cette étape peut être réalisée automatiquement au moyen d'une unité de distillation à titrage automatique.

Suivre les instructions du fabricant lors de l'utilisation d'une unité de distillation ou d'une unité de distillation avec titreur.

NB: En cas d'utilisation d'un système de titrage automatique, le titrage débute immédiatement après le démarrage de la distillation et la solution d'acide borique à 1 % (3.18) est utilisée. En cas d'utilisation d'une unité de distillation entièrement automatique, le titrage automatique de l'ammoniac peut se faire par détection au point d'équivalence au moyen d'un système potentiométrique (pH). Dans ce cas, un titreur automatique à pH-mètre est utilisé. Le pH-mètre doit être correctement étalonné dans une plage allant de pH 4 à pH 7 conformément aux procédures d'étalonnage habituelles. Le point d'équivalence du titrage est atteint à pH 4,6, qui est le point d'inflexion de la courbe de titrage.

5.4. Essai à blanc

Pour confirmer que les réactifs sont exempts d'azote, effectuer un essai à blanc (minéralisation, distillation et titrage) en utilisant 1 g de saccharose (3.14) en lieu en place de l'échantillon.

6. Calcul des résultats

Les calculs sont effectués conformément au point 6.1 ou 6.2.

6.1. Calcul pour le titrage conformément au point 5.3.1

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

V0 = volume (ml) de NaOH (3.10 ou 3.11) utilisé dans l'essai à blanc,

V1 = volume (ml) de NaOH (3.10 ou 3.11) utilisé pour le titrage de l'échantillon,

c = concentration (mol/l) de l'hydroxyde de sodium (3.10 ou 3.11),

m = poids (g) d'échantillon.

6.2. Calcul pour le titrage conformément au point 5.3.2

6.2.1. Titrage par une solution d'acide chlorhydrique

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

m = poids (g) de la prise d'essai,

c = concentration (mol/l) de la solution étalon volumétrique d'acide chlorhydrique (3.19),

V0 = volume (ml) d'acide chlorhydrique utilisé dans l'essai à blanc,

V1 = volume (ml) d'acide chlorhydrique utilisé dans la prise d'essai.

6.2.2. Titrage par une solution d'acide sulfurique

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

m = poids (g) de la prise d'essai,

c = concentration (mol/l) de la solution étalon volumétrique d'acide sulfurique (3.6),

V0 = volume (ml) d'acide sulfurique (3.6) utilisé dans l'essai à blanc,

V1 = volume (ml) d'acide sulfurique (3.6) utilisé dans la prise d'essai.

7. Vérification de la méthode

7.1. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne peut dépasser:

— 0,2 % en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes inférieures à 20 %,

— 1,0 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en protéines brutes comprises entre 20 et 40 %,

— 0,4 % en valeur absolue pour les teneurs supérieures à 40 %.

7.2. Exactitude

Effectuer l'analyse (minéralisation, distillation et titrage) à l'aide de 1,5 à 2,0 g d'acétanilide (3.13) en présence de 1 g de saccharose (3.14); 1 g d'acétanilide consomme 14,80 ml d'acide sulfurique (3.5). La récupération doit être de 99 % au moins.

8. Observations

8.1. L'appareil peut être de type manuel, semi-automatique ou automatique. Si l'appareil nécessite un transfert entre les étapes de minéralisation et de distillation, ce transfert doit être effectué sans perte. Si le ballon de l'appareil à distiller n'est pas équipé d'un entonnoir à robinet, ajouter l'hydroxyde de sodium immédiatement avant la connexion du ballon au réfrigérant en versant lentement le liquide le long de la paroi.

8.2. Si le produit minéralisé se solidifie, recommencer la détermination en utilisant une quantité d'acide sulfurique (3.4) plus grande que celle indiquée ci-dessus.

8.3. Pour les produits à faible teneur en azote, le volume d'acide sulfurique (3.7) à mettre dans le ballon collecteur peut être réduit, si nécessaire, à 10 ou à 15 ml et porté à 25 ml par addition d'eau.

8.4. Pour les analyses de routine, d'autres méthodes d'analyse peuvent être appliquées pour le dosage des protéines brutes, mais la méthode de Kjeldahl décrite au présent point C est la méthode de référence. L'équivalence entre les résultats de la méthode de substitution (par exemple, la méthode de Dumas) et ceux de la méthode de référence doit être démontrée pour chaque matrice séparément. Étant donné que, même après vérification de l'équivalence, les résultats obtenus au moyen d'une méthode de substitution peuvent s'écarter légèrement des résultats qui auraient été obtenus au moyen de la méthode de référence, il est nécessaire de mentionner sur le bulletin d'analyse la méthode d'analyse appliquée pour le dosage des protéines brutes.

D. DOSAGE DE L'URÉE

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en urée des aliments pour animaux.

2. Principe

L'échantillon est mis en suspension dans de l'eau en présence d'un défécant. La suspension est filtrée. La teneur en urée du filtrat est déterminée, après addition de 4-diméthylaminobenzaldéhyde (4-DMAB), par mesure de la densité optique à la longueur d'onde de 420 mm.

3. Réactifs

3.1. Solution de 4-diméthylaminobenzaldéhyde: dissoudre 1,6 g de 4-DMAB dans 100 ml d'éthanol à 96 % et ajouter 10 ml d'acide chlorhydrique (ρ201,19 g/ml). Ce réactif se conserve au maximum deux semaines.

3.2. Solution de Carrez I: dissoudre dans l'eau 21,9 g d'acétate de zinc Zn(CH3COO)2 2H2O, et 3 g d'acide acétique glacial. Ajuster à 100 ml avec de l'eau.

3.3. Solution de Carrez II: dissoudre dans l'eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4 Fe (CN)6 3 H2O. Ajuster à 100 ml avec de l'eau.

3.4. Charbon actif n'adsorbant pas l'urée (à contrôler).

3.5. Urée, solution à 0,1 % (p/v).

4. Appareillage

4.1. Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Tubes à essais: 160 × 16 mm, à bouchon rodé.

4.3. Spectrophotomètre.

5. Mode opératoire

5.1. Analyse de l'échantillon

Peser, à 1 mg près, 2 g de l'échantillon et les introduire avec 1 g de charbon actif (3.4) dans un flacon jaugé de 500 ml. Ajouter 400 ml d'eau et 5 ml de solution de Carrez I (3.2), agiter pendant environ 30 secondes et ajouter ensuite 5 ml de solution de Carrez II (3.3). Mélanger durant trente minutes dans le culbuteur. Ajuster au trait de jauge avec de l'eau, agiter et filtrer.

Prélever 5 ml des filtrats limpides et incolores, les introduire dans les tubes à essais à bouchon rodé, ajouter 5 ml de solution de 4-DMAB (3.1) et mélanger. Placer les tubes dans un bain d'eau à 20 oC (+/- 4 oC). Après quinze minutes, mesurer la densité optique de la solution d'échantillon au spectrophotomètre à 420 nm par comparaison avec la solution de l'essai à blanc des réactifs.

5.2. Courbe d'étalonnage

Prélever des volumes de 1, 2, 4, 5 et 10 ml de la solution d'urée (3.5), les introduire dans des fioles jaugées de 100 ml et ajuster au trait de jauge avec de l'eau. Prélever 5 ml de chaque solution, y ajouter chaque fois 5 ml de solution de 4-DMAB (3.1), homogénéiser et mesurer la densité optique comme indiqué plus haut par comparaison avec une solution de référence contenant 5 ml de 4-DMAB et 5 ml d'eau exempte d'urée. Tracer la courbe d'étalonnage.

6. Calcul des résultats

Déterminer la quantité d'urée de la prise d'essai en se référant à la courbe d'étalonnage.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l'échantillon.

7. Observations

7.1. Pour les teneurs en urée supérieures à 3 %, réduire la prise d'essai à 1 g ou diluer la solution initiale pour ne pas avoir plus de 50 mg d'urée dans 500 ml.

7.2. Pour les faibles teneurs en urée, augmenter la prise d'essai pour autant que le filtrat reste limpide et incolore.

7.3. Si l'échantillon contient des composés azotés simples, tels que les acides aminés, il convient d'effectuer la mesure de la densité optique à 435 nm.

E. DOSAGE DES BASES AZOTÉES VOLATILES

I. PAR MICRODIFFUSION

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en bases azotées volatiles, exprimées en ammoniac, des aliments pour animaux.

2. Principe

L'échantillon est extrait par l'eau et la solution est déféquée et filtrée. Les bases azotées volatiles sont déplacées à l'aide d'une solution de carbonate de potassium par microdiffusion, recueillies dans une solution d'acide borique et titrées par l'acide sulfurique.

3. Réactifs

3.1. Acide trichloracétique, solution à 20 % (p/v).

3.2. Indicateur: dissoudre 33 mg de vert de bromocrésol et 65 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol à 95-96 % (v/v).

3.3. Solution d'acide borique: dans une fiole jaugée de 1 l, dissoudre 10 g d'acide borique dans 200 ml d'éthanol à 95-96 % (v/v) et 700 ml d'eau. Ajouter 10 ml d'indicateur (3.2). Mélanger et ajuster si nécessaire la coloration de la solution au rouge clair par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. 1 ml de cette solution permet de fixer au maximum 300 μg de NH3.

3.4. Solution saturée de carbonate de potassium: dissoudre 100 g de carbonate de potassium dans 100 ml d'eau en ébullition. Laisser refroidir et filtrer.

3.5. Acide sulfurique 0,01 mol/l.

4. Appareillage

4.1. Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Cellules de Conway (voir schéma), en verre ou en plastique.

4.3. Microburettes, graduées au 1/100 ml.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 10 g de l'échantillon et les introduire avec 100 ml d'eau dans une fiole jaugée de 200 ml. Mélanger ou agiter durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajouter 50 ml de solution d'acide trichloracétique (3.1), ajuster au trait de jauge avec de l'eau, agiter vigoureusement et filtrer sur un filtre à plis.

Introduire à la pipette, dans la partie centrale de la cellule de Conway, 1 ml de solution d'acide borique (3.3) et dans la couronne de la cellule 1 ml du filtrat de l'échantillon. Couvrir partiellement à l'aide du couvercle graissé. Laisser tomber rapidement dans la couronne 1 ml de solution saturée de carbonate de potassium (3.4) et fermer le couvercle de façon hermétique. Remuer avec précaution la cellule en lui donnant un mouvement de rotation dans un plan horizontal, afin d'assurer le mélange des deux réactifs. Laisser incuber soit durant quatre heures au moins à température ambiante, soit durant une heure à 40 oC.

Titrer les bases volatiles dans la solution d'acide borique par l'acide sulfurique (3.5) en utilisant une microburette (4.3).

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire, en l'absence d'échantillon à analyser.

6. Calcul des résultats

1 ml de H2SO40,01 mol/l correspond à 0,34 mg d'ammoniac.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser:

— 10 % en valeur relative pour les teneurs en ammoniac inférieures à 1,0 %,

— 0,1 % en valeur absolue pour les teneurs en ammoniac égales ou supérieures à 1,0 %.

7. Observation

Si la teneur en ammoniac de l'échantillon est supérieure à 0,6 %, diluer le filtrat initial.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. PAR DISTILLATION

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de déterminer la teneur en bases azotées volatiles, exprimées en ammoniac, des farines de poisson ne contenant presque pas d'urée. Elle n'est applicable que pour des teneurs en ammoniac inférieures à 0,25 %.

2. Principe

L'échantillon est extrait par l'eau et la solution est déféquée et filtrée. Les bases azotées volatiles sont déplacées à l'ébullition par addition d'oxyde de magnésium et recueillies dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré en retour par une solution d'hydroxyde de sodium.

3. Réactifs

3.1. Acide trichloracétique, solution à 20 % (p/v).

3.2. Oxyde de magnésium.

3.3. Émulsion antimousse (silicone, par exemple).

3.4. Acide sulfurique 0,05 mol/l.

3.5. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 mol/l.

3.6. Solution à 0,3 % de rouge de méthyle dans l'éthanol à 95-96 % (v/v).

4. Appareillage

4.1. Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2. Appareil à distiller de type Kjeldahl.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 10 g de l'échantillon et les introduire avec 100 ml d'eau dans une fiole jaugée de 200 ml. Mélanger ou agiter durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajouter 50 ml de solution d'acide trichloracétique (3.1), ajuster au trait de jauge avec de l'eau, agiter vigoureusement et filtrer sur un filtre à plis.

Prélever une quantité de filtrat limpide approprié à la teneur présumée en bases azotées volatiles (100 ml conviennent en général). Diluer à 200 ml et ajouter 2 g d'oxyde de magnésium (point 3.2) et quelques gouttes d'émulsion antimousse (3.3). La solution doit être alcaline au papier de tournesol; si elle ne l'est pas, ajouter de l'oxyde de magnésium (3.2). Procéder conformément aux points 5.2 et 5.3 de la méthode de détermination de la teneur en protéines brutes (point C de la présente annexe).

Effectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire, en l'absence d'échantillon à analyser.

6. Calcul des résultats

1 ml de H2SO40,05 mol/l correspond à 1,7 mg d'ammoniac.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l'échantillon.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser, en valeur relative, 10 % d'ammoniac.

F. DOSAGE DES ACIDES AMINÉS (À L'EXCEPTION DU TRYPTOPHANE)

1. Objet et champ d'application

La méthode permet de doser les acides aminés libres (de synthèse et naturels) et totaux (liés dans des peptides et libres) dans les aliments pour animaux au moyen d'un analyseur d'acides aminés. Elle s'applique aux acides aminés suivants: cyst(é)ine, méthionine, lysine, thréonine, alanine, arginine, acide aspartique, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, phénylalanine, proline, serine, tyrosine et valine.

La méthode ne fait pas de distinction entre les sels des acides aminés et ne permet pas de différencier les formes D et L des acides aminés. Elle ne convient pas pour le dosage du tryptophane et des analogues hydroxylés des acides aminés.

2. Principe

2.1. Acides aminés libres

Les acides aminés libres sont extraits à l'aide d'acide chlorhydrique dilué. Les macromolécules azotées coextraites sont précipitées à l'aide d'acide sulfosalicylique et éliminées par filtration. La solution filtrée est ajustée à pH 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d'ions et dosés par réaction avec la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm.

2.2. Acides aminés totaux

Le mode opératoire dépend des acides aminés à examiner. La cyst(é)ine et la méthionine doivent être oxydées pour devenir respectivement de l'acide cystéique et de la méthionine sulfone avant hydrolyse. La tyrosine doit être dosée dans l'hydrolysat d'échantillons non oxydés. Tous les autres acides aminés mentionnés au point 1 peuvent être dosés soit dans un échantillon oxydé, soit dans un échantillon non oxydé.

L'oxydation s'effectue à 0 oC à l'aide d'un mélange d'acide performique et de phénol. L'excédent de réactif d'oxydation est décomposé à l'aide de disulfite de sodium. L'échantillon oxydé ou non oxydé est hydrolysé à l'aide d'acide chlorhydrique (3.20) pendant 23 heures. L'hydrolysat est ajusté à pH 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d'ions et dosés par réaction à la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm (440 nm pour la proline).

3. Réactifs

Utiliser de l'eau bidistillée ou de l'eau de qualité équivalente (conductivité < 10 μS)

3.1. Peroxyde d'hydrogène, p (p/p) = 30 %.

3.2. Acide formique, p (p/p) = 98-100 %.

3.3. Phénol.

3.4. Disulfite de disodium.

3.5. Hydroxyde de sodium.

3.6. Acide 5-sulfosalicylique dihydraté.

3.7. Acide chlorhydrique, densité approximative de 1,18 g/ml.

3.8. Citrate de tri-sodium dihydraté.

3.9. 2,2'-Thiodiéthanol (thiodiglycol).

3.10. Chlorure de sodium.

3.11. Ninhydrine.

3.12. Éther de pétrole, intervalle d'ébullition: 40-60 oC.

3.13. Norleucine ou autre composé pouvant être utilisé comme étalon interne.

3.14. Azote gazeux (< 10 ppm d'oxygène).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Acides aminés.

3.16.1. Substances étalons visées au point 1. Composés purs ne contenant pas d'eau de cristallisation. Sécher sous vide sur P2O5 ou H2SO4 pendant une semaine avant utilisation.

3.16.2. Acide cystéique.

3.16.3. Méthionine sulfone.

3.17. Solution d'hydroxyde de sodium, c = 7,5 mol/l: dissoudre 300 g de NaOH (3.5) dans de l'eau et ajuster à 1 l.

3.18. Solution d'hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l: dissoudre 40 g de NaOH (3.5) dans de l'eau et ajuster à 1 l.

3.19. Solution d'acide formique — phénol: mélanger 889 g d'acide formique (3.2) et 111 g d'eau en ajoutant 4,73 g de phénol (3.3).

3.20. Mélange à hydrolyser, c = 6 mol HCl/l contenant 1 g de phénol/l: ajouter 1 g de phénol (3.3) à 492 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l'eau.

3.21. Mélange d'extraction, c = 0,1 mol HCl/l contenant 2 % de thiodiglycol: prendre 8,2 ml de HCl (3.7), diluer dans environ 900 ml d'eau, ajouter 20 ml de thiodiglycol (3.9) et ajuster à 1 l avec de l'eau (ne pas mélanger directement 3.7 et 3.9).

3.22. Acide 5-sulfosalicylique, ß = 6 %: dissoudre 60 g d'acide 5-sulfosalicylique (3.6) dans de l'eau et ajuster à 1 l avec de l'eau.

3.23. Mélange d'oxydation (acide performique-phénol): mélanger 0,5 ml de peroxyde d'hydrogène (3.1) avec 4,5 ml d'une solution de phénol et d'acide formique (3.19) dans un petit bécher. Incuber à une température de 20 à 30 oC pendant une heure pour obtenir de l'acide performique, laisser refroidir ensuite sur un bain d'eau glacée (15 minutes) avant de l'ajouter à l'échantillon. Attention: éviter tout contact avec la peau et porter des vêtements de protection.

3.24. Tampon au citrate, c = 0,2 mol de Na+/l, pH= 2,20: dissoudre 19,61 g de citrate de sodium (3.8), 5 ml de thiodiglycol (3.9), 1 g de phénol (3.3) et 16,50 ml de HCl (3.7) dans environ 800 ml d'eau. Ajuster le pH à 2,20. Ajuster à 1 l avec de l'eau.

3.25. Tampons d'élution préparés conformément aux prescriptions prévues pour l'analyseur (4.9).

3.26. Réactif à la ninhydrine préparé conformément aux prescriptions prévues pour l'analyseur (4.9).

3.27. Solutions étalons d'acides aminés. Conserver ces solutions à une température inférieure à 5 oC.

3.27.1. Solution mère étalon d'acides aminés (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml de chacun dans l'acide chlorhydrique. S'obtient dans le commerce.

3.27.2. Solution mère étalon d'acide cystéique et de méthionine sulfone, c = 1,25 μmol/ml. Dissoudre 0,2115 g d'acide cystéique (3.16.2) et 0,2265 g de méthionine sulfone (3.16.3) dans du tampon au citrate (3.24) dans une fiole jaugée de 1 l et ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 12 mois au maximum. Cette solution n'est pas utilisée si la solution mère de l'étalon (3.27.1) contient de l'acide cystéique et de la méthionine sulfone.

3.27.3. Solution de l'étalon interne, par exemple norleucine. c = 20 μmol/ml. Dissoudre 0,6560 g de norleucine (3.13) dans du tampon au citrate (3.24) dans une fiole jaugée et ajuster à 250 ml à l'aide du tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 6 mois au maximum.

3.27.4. Solution d'étalonnage des acides aminés à utiliser avec des hydrolysats, c = 5 nmol/50 μl d'acide cystéique et de méthionine sulfone et c = 10 nmol/50 μl des autres acides aminés. Dissoudre 2,2 g de chlorure de sodium (3.10) dans un bécher de 100 ml avec 30 ml de tampon au citrate (3.24). Ajouter 4,00 ml de la solution étalon d'acides aminés (3.27.1), 4,00 ml de solution étalon d'acide cystéique et de méthionine de sulfone (3.27.2) et 0,50 ml de solution de l'étalon interne (3.27.3) le cas échéant. Ajuster le pH à 2,20 avec de l'hydroxyde de sodium (3.18). Transférer dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au trait de jauge de jauge avec du tampon au citrate (3.24) et mélanger. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 3 mois au maximum. Voir aussi les observations du point 9.1.

3.27.5. Solution d'étalonnage des acides aminés à utiliser avec des hydrolysats préparés conformément au point 5.3.3.1 et destinés à être utilisés avec des extraits (5.2). Préparer la solution d'étalonnage conformément au point 3.27.4, mais sans chlorure de sodium. Conserver à une température inférieure à 5 oC pendant 3 mois au maximum.

4. Appareillage

4.1. Ballon sphérique de 100 ou de 250 ml pourvu d'un réfrigérant à reflux.

4.2. Flacon en verre de borosilicate de 100 ml avec bouchon à vis avec garniture de caoutchouc/téflon (par exemple Duran, Schott) pouvant être utilisé dans une étuve.

4.3. Étuve à ventilation forcée et régulation de la température d'une précision supérieure à ± 2 oC.

4.4. pH-mètre (à graduation à trois décimales).

4.5. Filtre à membrane (0,22 μm).

4.6. Centrifugeuse.

4.7. Évaporateur rotatif sous vide.

4.8. Agitateur mécanique ou magnétique.

4.9. Analyseur d'acides aminés ou équipement pour CLHP avec colonne échangeuse d'ions, dispositif pour ninhydrine, dérivatisation postcolonne et détecteur photométrique. La colonne est remplie avec des résines de polystyrène sulfonées capables de séparer les différents acides aminés les uns des autres et d'autres produits réagissant à la ninhydrine. Le flux du tampon et du réactif de ninhydrine est assuré par des pompes dont le degré de stabilité du flux est de ±0,5 % dans la période couvrant l'analyse de la solution d'étalonnage et l'analyse de l'échantillon. Avec certains analyseurs d'acides aminés, on peut utiliser des méthodes d'hydrolyse dans lesquelles l'hydrolysat a une concentration de sodium de c = 0,8 mol/l et contient tout l'acide formique résiduel provenant de l'oxydation. D'autres appareils ne donnent pas une séparation satisfaisante de certains acides aminés si l'hydrolysat contient trop d'acide formique et/ou présente des concentrations élevées d'ions sodium. Dans ce cas, le volume de l'acide est réduit par évaporation à environ 5 ml après l'hydrolyse et avant l'ajustement du pH. L'évaporation doit être faite sous vide à 40 oC au maximum.

5. Mode opératoire

5.1. Préparation de l'échantillon

Broyer l'échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à forte teneur en humidité doivent être séchés à l'air à une température de 50 oC au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent être extraits par l'éther de pétrole (3.12) avant broyage.

5.2. Dosage des acides aminés libres dans les aliments pour animaux et les prémélanges

Peser, à 0,2 mg près, une quantité adéquate (1-5 g) de l'échantillon préparé (5.1) dans un erlenmeyer et ajouter 100,0 ml du mélange d'extraction (3.21). Agiter le mélange pendant 60 min à l'aide d'un agitateur mécanique ou magnétique (4.8). Laisser décanter le sédiment et introduire à la pipette 10,0 ml de la solution surnageante dans un bécher de 100 ml.

Ajouter 5,0 ml de la solution d'acide sulfosalicylique (3.22) tout en remuant et poursuivre l'agitation pendant 5 min à l'aide de l'agitateur magnétique. Filtrer ou centrifuger la phase surnageante en vue d'en séparer le précipitat éventuel. Verser 10,0 ml de la solution obtenue dans un bécher de 100 ml, ajuster le pH à 2,20 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium (3.18), transférer le tout dans une fiole jaugée d'un volume approprié à l'aide du tampon au citrate (3.24) et ajuster au trait de jauge avec la solution tampon (3.24).

Si un étalon interne est utilisé, ajouter 1,00 ml de l'étalon interne (3.27.3) par fraction de 100 ml de la solution finale et ajuster au trait de jauge avec la solution tampon (3.24).

Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Si les extraits ne sont pas chromatographiés le même jour, les conserver à une température inférieure à 5 oC.

5.3. Dosage des acides aminés totaux

5.3.1. Oxydation

Peser, à 0,2 mg près, entre 0,1 et 1 g de l'échantillon préparé (5.1) dans:

— un ballon sphérique de 100 ml (4.1) pour hydrolyse ouverte (5.3.2.3), ou

— un ballon sphérique de 250 ml (4.1) si l'on a besoin d'une faible concentration de sodium (5.3.3.1), ou

— un flacon de 100 ml à bouchon à vis (4.2) (pour hydrolyse fermée 5.3.2.4).

La portion d'échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg et une teneur en humidité de 100 mg au plus.

Placer le ballon sphérique ou le flacon dans un bain d'eau glacée et refroidir à 0 oC; ajouter 5 ml du mélange à oxyder (3.23) et mélanger à l'aide d'une spatule de verre à bout courbé. Fermer hermétiquement le ballon/le flacon contenant la spatule à l'aide d'un film hermétique à l'air, placer le bain d'eau glacée avec le récipient ainsi fermé dans un réfrigérateur à 0 oC et l'y laisser séjourner pendant 16 heures. Enlever ensuite le produit du réfrigérateur et décomposer l'excès de réactif d'oxydation par addition de 0,84 g de disulfite de sodium (3.4).

Passer à l'opération du point 5.3.2.1.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1. Hydrolyse des échantillons oxydés

À l'échantillon oxydé préparé conformément au point 5.3.1, ajouter 25 ml du mélange d'hydrolyse (3.20) en prenant soin d'éliminer par rinçage tout résidu de l'échantillon adhérant aux parois du récipient et à la spatule.

Selon la méthode d'hydrolyse utilisée, appliquer la méthode visée au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydrolyse des échantillons non oxydés

Peser dans un ballon sphérique de 100 ml ou de 250 ml (4.1) ou dans un tube de 100 ml pourvu d'un bouchon à vis (4.2), à 0,2 mg près, de 0,1 à 1 g de l'échantillon préparé (5.1). La portion d'échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg. Ajouter avec précaution 25 ml du mélange à hydrolyser (3.20) et mélanger avec l'échantillon. Procéder conformément au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hydrolyse ouverte

Ajouter 3 billes de verre au mélange contenu dans le ballon (préparé conformément au point 5.3.2.1 ou 5.3.2.2) et faire bouillir sous reflux en bouillonnement constant pendant 23 heures. Après l'hydrolyse, rincer le réfrigérant au moyen de 5 ml du tampon au citrate (3.24). Déconnecter le ballon et le faire refroidir dans un bain glacé.

Poursuivre conformément au point 5.3.3.

5.3.2.4. Hydrolyse fermée

Placer le flacon contenant le mélange préparé conformément au point 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 dans une étuve (4.3) chauffée à 110 oC. Pendant la première heure, placer le bouchon à vis sur le récipient de manière à éviter une élévation de la pression (due à l'évolution des substances gazeuses) et une explosion. Ne pas fermer le récipient en vissant le bouchon. Après 1 heure, fermer le récipient à l'aide du bouchon à vis et laisser reposer dans l'étuve (4.3) pendant 23 heures. Après l'hydrolyse, enlever le flacon de l'étuve, ouvrir avec précaution le bouchon et placer le flacon dans un bain d'eau glacée. Laisser refroidir.

Selon la procédure adoptée pour l'ajustement du pH (5.3.3), transférer quantitativement le contenu du flacon dans un bécher de 250 ml ou dans un ballon sphérique de 250 ml à l'aide du tampon au citrate (3.24).

Poursuivre conformément au point 5.3.3.

5.3.3. Ajustement du pH

En fonction de la tolérance en sodium de l'analyseur d'acides aminés (4.9), procéder conformément aux points 5.3.3.1 ou 5.3.3.2 pour l'ajustement du pH.

5.3.3.1. Pour des systèmes chromatographiques (4.9) demandant une faible concentration de sodium

Il est recommandé d'utiliser un étalon interne (3.27.3) si on utilise des analyseurs d'acides aminés demandant une faible concentration de sodium (lorsque le volume d'acide doit être réduit).

Dans ce cas, ajouter 2,00 ml de la solution de l'étalon interne (3.27.3) à l'hydrolysat avant évaporation.

Ajouter 2 gouttes de 1-Octanol (3.15) à l'hydrolysat obtenu conformément à la procédure du point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

À l'aide d'un évaporateur rotatif (4.7), réduire sous vide à 40 oC le volume à un niveau compris entre 5 et 10 ml. Si le volume est accidentellement réduit à moins de 5 ml, l'hydrolysat doit être rejeté et l'analyse recommencée.

Ajuster le pH à 2,20 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium (3.18) et poursuivre conformément au point 5.3.4.

5.3.3.2. Pour tous les autres analyseurs d'acides aminés (4.9)

Recueillir les hydrolysats obtenus conformément au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 et les neutraliser partiellement en ajoutant avec précaution, tout en agitant, 17 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium (3.17), la température restant inférieure à 40 oC.

L'ajustement du pH final à 2,20 s'effectue à température ambiante au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium conforme au point 3.17 et, enfin, d'une solution d'hydroxyde de sodium conforme au point 3.18. Poursuivre conformément au point 5.3.4.

5.3.4. Solution d'échantillon pour chromatographie

Transférer quantitativement l'hydrolysat à pH ajusté (5.3.3.1 ou 5.3.3.2) avec le tampon au citrate (3.24) dans une fiole jaugée de 200 ml et ajuster au trait de jauge à l'aide du tampon (3.24).

Si l'étalon interne (3.27.3) n'a pas encore été utilisé, en ajouter 2,00 ml et ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate (3.24). Mélanger soigneusement.

Poursuivre par la chromatographie (5.4).

Si les solutions des échantillons ne sont pas chromatographiées le même jour, les conserver à une température inférieure à 5 oC.

5.4. Chromatographie

Avant la chromatographie, porter l'extrait (5.2) ou l'hydrolysat (5.3.4) à température ambiante. Agiter le mélange et filtrer une partie appropriée à travers un filtre à membrane de 0,22 μm (4.5). La solution claire obtenue est soumise à une chromatographie par échange d'ions au moyen d'un analyseur d'acides aminés (4.9).

L'injection peut être opérée manuellement ou automatiquement. Il importe que la même quantité de solution (± 0,5 %) soit toujours ajoutée à la colonne pour l'analyse des étalons et des échantillons, sauf lorsqu'un étalon interne est utilisé, et que les rapports sodium/acide aminé dans les solutions étalons et les solutions des échantillons soient aussi identiques que possible.

En général, la fréquence des injections de la solution d'étalonnage dépend de la stabilité du réactif ninhydrine et du système d'analyse. La solution étalon ou d'échantillon est diluée avec un tampon au citrate (3.24) pour donner une surface de pic de la solution étal