1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 1
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►BQUATRIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 5 décembre 1972
portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des
animaux
(73/46/CEE)
(JO L 83 du 30.3.1973, p. 21)
Modifiée par:
Journal officiel
nopage date
►M1 Directive 81/680/CEE de la Commission du 30 juillet 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Directive 92/89/CEE de la Commission du 3 novembre 1992 L 344 35 26.11.1992
►M3 Directive 98/54/CE de la Commission du 16 juillet 1998 L 208 49 24.7.1998
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QUATRIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 5 décembre 1972
portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le
contrôle officiel des aliments des animaux
(73/46/CEE)
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,
vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction
de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analysecommunautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (
1),
modifée par la directive no72/275/CEE du 20 juillet1972 (2), etnot am-
mentson art icle 2,
considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels
des aliments des animaux, pour constater si les conditions prescrites en
vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administrativesconcernant la qualité et la composition des aliments des animaux sontrespectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantil-lons et des méthodes d'analyse communautaires;
considérantque les direct ives n
o71/250/CEE, no71/393/CEE etno72/
199/CEE de la Commission, des 15 juin 1971 (3), 18 novembre 1971 (4)
et27 avril 1972 (5), ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'ana-
lyse communautaires; que, compte tenu de l'état d'avancement destravaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une quatrième sériede méthodes;
considérant que les mesures prévues à la présente directive sont
conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux,
A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premier
Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles offi-
ciels des aliments des animaux, en ce qui concerne les teneurs en
humidité des graisses et des huiles animales et végétales, ainsi que les
teneurs en magnésium et en cellulose brute des aliments sont effectuéesselon les méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.
Article 2
Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles offi-
ciels des aliments des animaux, en ce qui concerne leurs teneurs enrétinol (vitamine A) ►
M3 ◄sonteffect uées selon les
méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.
Article 3
Les États membres mettent en vigueur, le 1erjanvier 1974 au plus tard,
les dispositions législatives, réglementaires ou administratives néces-saires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ilsen informentimmédiat ementla Commission.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 2
(1)J O noL 170 du 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O noL 171 du 29. 7. 1972, p. 39.
(3)J O noL 155 du 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O noL 279 du 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O noL 123 du 29. 5. 1972, p. 6.▼M1
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Article 4
Les États membres sont destinataires de la présente directive.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 3
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ANNEXE I
1.DOSAGE DE L'HUMIDITÉ DANS LES GRAISSES ET LES HUILES
ANIMALES ET VÉGÉTALES
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de déterminer la teneur en humidité (eau et autres
matières volatiles) des graisses et des huiles animales et végétales.
2.Principe
L'échantillon est soumis à la dessiccation à 103 ºC jusqu'à cessation de la
diminution de masse. La perte de masse est déterminée par pesée.
3.Appareillage
3.1. Récipient à fond plat, en matériau résistant à la corrosion, diamètre: 8 à
9 cm, hauteur: 3 cm environ
3.2. Thermomètre à mercure, avec bulbe renforcé, et chambre de dilatation à
l'extrémité supérieure, gradué de 80 ºC environ à 110 ºC au moins,
longueur: 10 cm environ
3.3. Bain de sable ou plaque chauffante électrique3.4. Dessiccateur, contenant un déshydratant efficace3.5. Balance analytique
4.Mode opératoire
Peser, à 1 mg près, 20 g environ de l'échantillon homogénéisé dans le réci-
pient (3.1) sec et taré, contenant le thermomètre (3.2). Chauffer sur le bain de
sable ou la plaque chauffante (3.3), en agitant constamment à l'aide du ther-
momètre, de façon que la température atteigne 90 ºC en 7 minutes environ.
Réduire l'intensité du chauffage en suivant la fréquence avec laquelle les
bulles montent du fond du récipient. La température ne doit pas dépasser
105 ºC. Continuer à agiter en raclant le fond du récipient jusqu'à cessation
de la formation de bulles.
Pour assurer l'élimination complète de l'humidité, répéter à plusieurs reprises
le chauffage à 103 ºC ± 2 ºC, en refroidissantà 93 ºC ent re les chauffages
successifs. Laisser refroidir ensuite dans le dessiccateur (3.4) jusqu'à tempé-
rature ambiante et peser. Répéter cette opération jusqu'à ce que la perte de
masse entre deux pesées successives n'excède plus 2 mg.
N.B. Une augmentation de masse de l'échantillon après chauffage répété
indique une oxydation de la graisse. Dans ce cas, calculer le résultat à
partir de la pesée effectuée immédiatement avant le début de l'augmen-
tation de masse.
5.Calcul des résultats
La teneur en humidité pour cent d'échantillon est donnée par la formule:
M
1/C0M2 ðÞ /C1100
Mo
dans laquelle:
Mo= masse, en grammes, de la prise d'essai,
M1= masse, en grammes, du récipientavec son cont enu, avantle chauf-
fage,
M2= masse, en grammes, du récipientavec son cont enu, après le chauf-
fage.
Les résultats inférieurs à 0,05 p. cent doivent être rapportés par la mention
«moins de 0,05 p. cent».
RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,05 p. cent en valeur absolue.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 4
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2.DOSAGE DU MAGNÉSIUM
— par spectrophotométrie d'absorption atomique —
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser le magnésium dans les aliments des animaux.
Elle est particulièrement indiquée pour déterminer les teneurs en magnésium
inférieures à 5 p.cent.
2.Principe
L'échantillon est incinéré et mis en solution dans l'acide chlorhydrique dilué.
S'il ne contient pas de substances organiques, il est mis directement en solu-
tion dans l'acide chlorhydrique dilué. La solution est diluée et la teneur en
magnésium est déterminée par spectrophotométrie d'absorption atomique à
285,2 nm, par comparaison avec des solutions étalon.
3.Réactifs
3.1. Acide chlorhydrique p.a., d: 1,163.2. Acide chlorhydrique p.a., d: 1,193.3. Magnésium, en ruban ou en fil, ou sulfate de magnésium MgSO
4.7H2O
p.a. séché sous vide à la température ambiante
3.4. Solution de sel de strontium (chlorure ou nitrate) à 2,5 p.cent (p/v) de
strontium (= 76,08 g de SrCl2.6H2O p.a./1 ou 60,38 g de Sr (NO3)2p.a./1)
3.5. Solution étalon de magnésium: peser, à 1 mg près, 1 g de magnésium
(3.3), préalablementdébarrassé avec soin de sa pellicule d'oxyde, ou
une quantité correspondante de sulfate de magnésium (3.3), l'introduire
dans un ballon jaugé de 1 000 ml, ajouter 80 ml d'acide chlorhydrique
(3.1), laisser dissoudre etcomplét er à 1 000 ml par de l'eau. 1 ml de
cette solution contient 1,000 mg de magnésium.
4.Appareillage
4.1. Creusets à incinération en platine, quartz ou porcelaine4.2. Four à moufle électrique, avec thermostat4.3. Spectrophotomètre d'absorption atomique
5.Mode opératoire
5.1.Mise en solution
5.1.1.Aliments constitués exclusivement de substances minérales
Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon et les introduire dans un
ballon jaugé de 500 ml avec 250 à 300 ml d'eau. Ajouter 40 ml
d'acide chlorhydrique (3.1), amener à ébullition et maintenir le
liquide en ébullition douce durant 30 minutes. Laisser refroidir,
compléter au volume par de l'eau, homogénéiser et filtrer dans
un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers
ml du filtrat.
En présence de silice, traiter 5 g de l'échantillon par une quantité
suffisante (15 à 30 ml) d'acide chlorhydrique (3.2) et évaporer à
sec sur un bain d'eau. Poursuivre comme indiqué en 5.1.2, à partir
de la troisième phrase.
5.1.2.Aliments constitués essentiellement de substances minérales
Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon dans un creuset à inciné-
ration et incinérer à 550 ºC au four à moufle jusqu'à obtention de
cendres exemptes de particules charbonneuses. Pour éliminer la
silice, ajouter aux cendres une quantité suffisante (15 à 30 ml)
d'acide chlorhydrique (3.2) etévaporer à sec sur un bain d'eau.
Sécher ensuite durant une heure à l'étuve à 105 ºC. Reprendre le
résidu par 10 ml d'acide chlorhydrique (3.1) ett ransférer à l'aide
d'eau chaude dans un ballon jaugé de 500 ml. Amener à ébulli-
tion, laisser refroidir et compléter au volume par de l'eau.
Homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à
plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 5
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5.1.3.Aliments constitués essentiellement de substances organiques
Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon dans un creuset à inciné-
ration et incinérer à 550 ºC dans un four à moufle, jusqu'à
obtention de cendres exemptes de particules charbonneuses.Reprendre les cendres par 5 ml d'acide chlorhydrique (3.2),
évaporer à sec sur un bain d'eau etsécher ensuit e durantune
heure à l'étuve à 105 ºC, pour insolubiliser la silice. Reprendre
le résidu par 5 ml d'acide chlorhydrique (3.1), transférer à l'aide
d'eau chaude dans un ballon jaugé de 250 ml, amener à ébullition,
laisser refroidir etcomplét er au volume par de l'eau. Homogé-
néiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec.
Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.
5.2.Mesure de l'absorption atomique
Préparer, en diluant la solution étalon (3.5) par de l'eau, au moins 5
solutions de référence de concentrations croissantes, choisies en fonction
de la zone de mesure optimum du spectrophotomètre. Ajouter à chaque
solution 10 ml de solution de sel de strontium (3.4) et compléter ensuite
au volume à 100 ml par de l'eau.
Diluer par de l'eau une partie aliquote du filtrat obtenu en 5.1.1, 5.1.2.
ou 5.1.3 de façon à obtenir une concentration en magnésium comprise
dans les limites de concentration des solutions de référence. La concen-
tration en acide chlorhydrique de cette solution ne doit pas dépasser
0,4 N. Ajouter 10 ml de solution de sel strontium (3.4) et compléter
ensuite au volume à 100 ml par de l'eau.
Mesurer l'absorption de la solution à doser et des solutions de référence
à la longueur d'onde de 285,2 nm.
6.Calcul des résultats
Calculer la quantité de magnésium de l'échantillon à partir des solutions de
référence. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.
RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur le même échantillon ne doit pas dépasser 5 p.cent, en valeur relative.
3.DOSAGE DE LA CELLULOSE BRUTE
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser, dans les aliments des animaux, les matières
organiques exempt es de graisses etinsolubles en milieu acide eten milieu
alcalin, conventionnellement désignées sous le nom de cellulose brute.
2.Principe
L'échantillon, éventuellement dégraissé, est traité successivement par des
solutions bouillantes d'acide sulfurique et d'hydroxyde de potassium de
concentrations déterminées. Le résidu est séparé par filtration sur un filtre
en verre, lavé, séché, pesé puis calciné entre 475 et 500 ºC. La perte de poids
résultant de la calcination correspond à la cellulose brute présente dans
l'échantillon d'essai.
3.Réactifs
3.1. Acide sulfurique, c = 0,13 mol/l
3.2. Antimousse (n-octanol par exemple)3.3. Adjuvant de filtration (Celite 545 ou équivalent) chauffé à 500 ºC
pendant4 heures (8.6)
3.4. Acétone
3.5. Éther de pétrole (point d'ébullition 40-60 ºC)
3.6. Acide chlorhydrique, c = 0,5 mol/l3.7. Solution d'hydroxyde de potassium, c = 0,23 mol/l
4.Appareillage
4.1. Unité de chauffage pour la digestion par des solutions d'acide sulfurique
ou d'hydroxyde de potassium. Cette unité est munie d'un support à1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 6
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▼M2
creuset filtrant (4.2) et pourvue d'un tuyau avec vanne vers le vide et la
vidange. Elle estévent uellementpourvue d'air comprimé. Avantchaque
utilisation journalière, préchauffer l'unité avec de l'eau bouillante
pendant5 minut es.
4.2. Creuset filtrant en verre de 50 ml avec un filtre en verre fritté de poro-
sité 40-90 µm. Avant la première utilisation chauffer à 500 ºC pendant
quelques minutes et refroidir (8.6).
4.3. Cylindre d'au moins 270 ml avec un réfrigérantà reflux, approprié à
l'ébullition
4.4. Étuve avec thermostat4.5. Four à moufle avec thermostat4.6. Unité d'extraction comprenant un support pour le creuset filtrant (4.2) et
un tuyau d'évacuation avec vanne vers le vide et la vidange
4.7. Joints pour assembler l'unité de chauffage (4.1), le creuset (4.2) et le
cylindre (4.3), et pour connecter l'unité d'extraction (4.6) à froid et le
creuset
5.Mode opératoire
Peser à 0,001 g près 1 g de l'échantillon préparé, le mettre dans le creuset
(4.2) (voir observations 8.1, 8.2, 8.3) et ajouter 1 g d'adjuvant de filtration
(3.3).
Assembler l'unité de chauffage (4.1) et le creuset filtrant (4.2), puis attacher
le cylindre (4.3) au creuset. Remplir de 150 ml d'acide sulfurique bouillant
(3.1) l'ensemble cylindre-creuset et si nécessaire ajouter quelques gouttes
d'antimousse (3.2). Porter le liquide à ébullition en 5 ± 2 minutes et bouillir
vivement pendant 30 minutes exactement.
Positionner la vanne vers le tuyau de vidange (4.1) et, sous vide, filtrer
l'acide sulfurique à travers le creuset filtrant et laver le résidu avec trois fois
30 ml d'eau bouillante, en veillant à ce que le résidu aille à sec après chaque
lavage.
Fermer la vanne de vidange et mettre 150 ml de solution bouillante d'hydro-
xyde de potassium (3.7) dans l'ensemble cyclindre-creuset filtrant et ajouter
quelques gouttes d'antimousse (3.2). Porter le liquide à ébullition en 5 ± 2
minutes et bouillir vivement pendant exactement 30 minutes. Filtrer et
répéter la procédure de lavage comme pour l'acide sulfurique.
Après le lavage final etle séchage, disjoindre le creusetetson cont enu etle
reconnecter à l'unité d'extraction à froid (4.6). Mettre le vide et laver le
résidu dans le creuset avec trois portions successives de 25 ml d'acétone
(3.4) en veillantà ce que le résidu aille à sec après chaque lavage.
Sécher le creuset jusqu'à poids constant à l'étuve à 130 ºC. Après chaque
séchage, refroidir dans un dessiccateur et peser rapidement. Placer le creuset
dans un four à moufle et réduire en cendres jusqu'à poids constant entre 475
et500 ºC pendantau moins 30 minut es.
Après chaque chauffage, refroidir d'abord dans le four puis dans le dessicca-
teur avant de peser.
Effectuer un essai à blanc sans l'échantillon. La perte de poids résultant de la
minéralisation ne doit pas excéder 4 mg.
6.Calcul des résultats
La teneur en cellulose brute pour cent d'échantillon est donnée par la
formule:
b/C0c ðÞ /C2 100
a
dans laquelle:
a = masse de l'échantillon (en g),
b = perte de masse (en g) à la calcination, lors du dosage,
c = perte de masse (en g) à la calcination, lors de l'essai à blanc.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 7
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7.Répétabilité
La différence entre deux déterminations parallèles effectuées sur le même
échantillon ne doit pas dépasser:
— 0,3 dans la valeur absolue pour contenu des fibres brutes plus faible que
10 %,
— 3 % par rapport au résultat plus élevé, pour le contenu des fibres brutes
égal ou supérieur à 10 %.
8.Observations
8.1. Les aliments des animaux contenant plus de 10 % de matières grasses
doivent être dégraissés avant analyse par l'éther de pétrole (3.5).
Connecter le creuset filtrant (4.2) et son contenu à l'unité d'extraction à
froid (4.6), appliquer le vide etlaver le résidu avec t rois fois 30 ml
d'éther de pétrole. S'assurer que le résidu est sec. Connecter le creuset
et son contenu à l'unité de chauffage (4.1) et continuer comme décrit
en 5.
8.2. Les aliments des animaux contenant des matières grasses qui ne peuvent
être directement extraites par l'éther de pétrole (3.5) doivent être
dégraissés comme en 8.1 puis dégraissés de nouveau après ébullition
avec l'acide.
Après ébullition avec l'acide et les lavages qui suivent, connecter le
creuset et son contenu à l'unité d'extraction à froid (4.6) et laver trois
fois avec 30 ml d'acétone et ensuite trois fois avec 30 ml d'éther de
pétrole. Filtrer sous vide jusqu'au séchage et continuer l'analyse comme
décrite en 5, au niveau du traitement par l'hydroxyde de potassium.
8.3. Si l'échantillon contient plus de 5 % de carbonates, exprimés en carbo-
nate de calcium, connecter le creuset (4.2) avec l'échantillon pesé à
l'unité de chauffage (4.1). Laver l'échantillon avec trois fois 30 ml
d'acide chlorhydrique (3.6). Après chaque addition, attendre environ 1
minute avant de filtrer. Laver une fois avec 30 ml d'eau et puis conti-
nuer comme décriten 5.
8.4. Si un appareil en forme de dressoir est utilisé (plusieurs creusets atta-
chés à la même unité de chauffage), ne pas effectuer deux essais du
même échantillon dans la même série.
8.5. Si, après ébullition, il est difficile de filtrer les solutions acide et
basique, utiliser l'air comprimé par le tuyau de vidange de l'unité de
chauffage puis continuer la filtration.
8.6. La température de calcination ne devrait pas dépasser 500 ºC de façon à
allonger la durée de vie des creusets filtrants en verre. Prendre soin
d'éviter les chocs thermiques pendant les cycles de chauffage et de
refroidissement.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 8
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ANNEXE II
1.DOSAGE DU RÉTINOL (VITAMINE A)
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser le rétinol (vitamine A) dans les aliments, les
concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de
10 000 UI/kg pour les aliments fortement pigmentés et de 4 000 UI/kg pour
les autres produits (1). Les produits y sont classés en deux groupes, selon leur
teneur présumée en rétinol:
Groupe A: teneurs inférieures à 200 000 UI/kg,
Groupe B: teneurs égales ou supérieures à 200 000 UI/kg.
2.Principe
L'échantillon est hydrolysé à chaud par une solution d'hydroxyde de potas-
sium en milieu éthanolique et en présence d'un antioxygène ou en
atmosphère d'azote. Le mélange est soumis à l'extraction par le 1,2-dichloré-
thane. L'extrait est évaporé à sec et repris parl'éther de pétrole. La solution
est chromatographiée sur colonne d'oxyde d'aluminium (pour les produits du
groupe B, la chromatographie n'est requise que dans certains cas). Le rétinol
est dosé par spectrophotométrie à 610 nm après développement d'un
complexe coloré selon la réaction de Carr-Price, dans le cas des produits du
groupe A; par spectrophotométrie dans l'UV à 325 nm dans le cas des
produits du groupe B.
3.Réactifs
a)utilisés pour l'analyse des produits des groupes A et B
3.1. Éthanol à 96 p.cent (v/v)
3.2. Solution à 10 p.cent (p/v) d'ascorbate de sodium p.a., ou3.3. Azote, purifié
3.4. Solution à 50 p.cent (p/v) d'hydroxyde de potassium p.a.
3.5. Solution d'hydroxyde de potassium 1 N3.6. Solution d'hydroxyde de potassium 0,5 N
3.7. 1,2-dichloréthane p.a.
3.8. Éther de pétrole, pur, ébullition 30—50 ºC. Si nécessaire, purifier
comme suit. Agiter 1 000 ml d'éther de pétrole avec des portions
de 20 ml d'acide sulfurique concentré jusqu'à ce que l'acide reste
incolore. Éliminer l'acide etlaver l'ét her successivementpar 500 ml
d'eau, deux fois 250 ml d'une solution à 10 p.cent d'hydroxyde de
sodium ett rois fois 500 ml d'eau. Éliminer la couche aqueuse,
sécher l'éther durant 1 h sur charbon actif et sulfate de sodium
anhydre, filtrer et distiller
3.9. Oxyde d'aluminium, standardisé selon Brockmann: calciner durant
8 h à 750 ºC, refroidir en dessiccateur et conserver en flacon de
verre brun, à bouchon rodé. Avant l'utilisation en chromatographie,
humidifier comme suit: introduire dans un flacon de verre brun 10 g
d'oxyde d'aluminium et 0,7 ml d'eau, boucher hermétiquement,
réchauffer durant 5 minutes dans un bain d'eau bouillante tout en
agitant énergiquement. Laisser refroidir en agitant. Vérifier l'activité
de l'oxyde d'aluminium ainsi préparé en soumettant à l'analyse selon
5.3 et 5.4 une quantité connue de rétinol étalon (3.17)
3.10. Oxyde d'aluminium basique, degré d'activité I3.11. Éther diéthylique, pur. Éliminer les peroxydes et les traces d'eau par
chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium basique (3.10)
(25 g d'oxyde d'aluminium pour 250 ml d'éther diéthylique)
3.12. Solutions d'éther de pétrole (3.8) à 4, 8, 12, 16 et 20 p.cent (v/v)
d'éther diéthylique (3.11)
3.13 Solution de sulfure de sodium 0,5 mole dans la glycérine à 70
p.cent(v/v), préparée à part ir de sulfure de sodium p.a.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 9
(1) 1 UI = 0,3 µg de rétinol.
▼B
b)utilisés exclusivement pour l'analyse des produits du groupe A
3.14. Benzène p.a., cristallisable3.15. Chloroforme p.a. Éliminer l'éthanol, le phosgène et les traces d'eau
par chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium basique
(3.10) (50 g d'oxyde d'aluminium pour 200 ml de chloroforme) il
convientde chromat ographier une seconde fois les 50 premiers ml
d'éluat)
3.16. Réactif selon Carr-Price: Agiter 25 g environ de trichlorure d'anti-
moine p.a. (conservé en dessiccateur) avec 100 ml de chloroforme
(3.15) jusqu'à saturation de la solution. Un faible dépôt de trichlo-
rure d'antimoine ne gêne pas. Ajouter 2 ml d'anhydride acétique p.a.
Conserver en glacière dans un flacon de verre brun à bouchon rodé.
Durée de conservation: plusieurs semaines
3.17. Rétinol étalon, contrôlé par spectrophotométrie
c)utilisés exclusivement pour l'analyse des produits du groupe B
3.18. Isopropanol, pour chromatographie
4.Appareillage
4.1. Bain d'eau
4.2. Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballons ronds de diffé-
rentes capacités
4.3. Tubes pour chromatographie, en verre (longueur: 300 mm, diamètre in-
térieur: 13 mm environ)
4.4. Spectrophotomètre avec cuvettes de 10 mm d'épaisseur (en quartz pour
mesures dans l'UV)
4.5. Lampe UV, 365 nm
5.Mode opératoire
N.B. Toutes les manipulations doivent se faire à l'abri de la lumière directe,
éventuellement dans un appareillage de verre brun
5.1.Prise d'essai
Prélever une prise d'essai de l'échantillon finement divisé, proportion-
nelle à la teneur présumée en vitamine A, soit:
0,1 à 1,0 g pour les concentrats (teneurs supérieures à 20 000 UI/g),3,0 à 5,0 g pour les prémélanges (teneurs comprises entre 400 et
20 000 UI/g),
10 à 20 g pour les mélanges minéraux,30 g pour les produits du groupe A.Introduire immédiatement la prise d'essai dans un ballon de 500 ml à
bouchon rodé.
5.2.Hydrolyse et extraction (
1)
Ajouter successivement à la prise d'essai 40 ml d'éthanol (3.1), 2 ml de
solution d'ascorbate de sodium (3.2) (2), 10 ml de solution d'hydroxyde
de potassium (3.4) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (3.13).
Chauffer durant30 minut es à 70-80 ºC sous réfrigérantà reflux et
laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 50 ml d'éthanol
(3.1) et 100 ml (prélevés à la pipette) de 1,2-dichloréthane (3.7). Agiter
énergiquementetdécant er le liquide surnageantdans une ampoule à
décanter. Ajouter dans l'ampoule 150 ml de solution d'hydroxyde de
potassium (3.5), agiter durant 10 secondes et laisser reposer jusqu'à
séparation des phases. Recueillir la phase dichloréthanique (phase infé-
rieure) dans une ampoule à décanter, ajouter 40 ml de solution
d'hydroxyde de potassium (3.6), agiter durant 10 secondes et laisser
reposer jusqu'à séparation des phases. Recueillir la phase dichlorétha-
nique dans une ampoule à décanter et laver 6 à 8 fois à l'aide de
portions de 40 ml d'eau, jusqu'à absence d'alcali (essai à la phénolphta-1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 10
(1) Pour les aliments d'allaitement et les produits tendant à s'agglomérer ou à gonfler,
doubler la quantité des réactifs indiqués sous 5.2 premier et deuxième alinéas.
(2) L'addition d'ascorbate de sodium n'est pas nécessaire lorsque l'hydrolyse est effectuée
en atmosphère d'azote.
▼B
léine). Recueillir la phase dichloréthanique et éliminer les dernières
traces d'eau à l'aide de bandes de papier-filtre.
Évaporer à sec une partie aliquote de la solution, sous vide et sur bain
d'eau à la température de 40 ºC. Reprendre rapidement le résidu par 5 ml
d'éther de pétrole (3.8).
Pour les produits du groupe A , chromatographier comme indiqué en
5.3.1.
Pour les produits du groupe B , transférer la solution dans un ballon
jaugé de 50 ml, compléter au volume par de l'éther de pétrole (3.8)
homogénéiser et mesurer la densité optique comme indiqué en 5.4.2.
5.3.Chromatographie
5.3.1.Produits du groupe A
Remplir un tube pour chromatographie (4.3), jusqu'à une hauteur
de 200 mm, d'oxyde d'aluminium (3.9) préalablementimprégné
d'éther de pétrole (3.8). Introduire dans le tube la solution
obtenue en 5.2 et ajouter immédiatement20 ml d'éther de pétrole
(3.8). Éluer successivementpar des port ions de 10 ml des solu-
tions d'éther de pétrole à 4, 8, 12, 16 et 20 p.cent d'éther
diéthylique (3.12), sous vide partiel ou sous pression, la vitesse
d'écoulement étant de 2 à 3 gouttes par seconde.
Le carotène est élué en premier lieu (1). Le rétinol est générale-
ment élué par la solution d'éther de pétrole à 20 p.cent d'éther
diéthylique (3.12). L'éluation est contrôlée sous lumière UV
(brève irradiation de la colonne par une lampe au mercure). La
bande fluorescente du rétinol se sépare nettement des bandes
jaunes de xanthophylle qui la suivent. Recueillir la fraction de
l'éluat contenant le rétinol dans un erlenmeyer.
5.3.2.Produits du groupe B
La chromatographie ne doit être effectuée que si les mesures de
la densité optique obtenues en 5.4.2 ne sont pas conformes aux
prescriptions indiquées en 5.4.2.
Si la chromatographie s'avère nécessaire, introduire dans la
colonne chromatographique une partie aliquote de la solution
dans l'éther de pétrole obtenue en 5.2, contenant environ 500 UI
de rétinol, et chromatographier comme indiqué en 5.3.1.
5.4.Mesure de la densité optique
5.4.1.Produits du groupe A
Évaporer à sec, sous vide, l'éluat contenant le rétinol, obtenu en
5.3.1. Reprendre le résidu par 2 ml de benzène (3.14). Prélever
0,3 ml de cette solution et ajouter 3 ml du réactif selon Carr-Price
(3.16). Il se développe une coloration bleue. Mesurer la densité
optique au spectrophotomètre à 610 nm, 30 secondes exactement
après le début de la réaction. Déterminer la teneur en rétinol, en
se référant à une courbe d'étalonnage obtenue à partir de solutions
benzéniques de concentrations croissantes en rétinol étalon trai-
tées par le réactif selon Carr-Price (2 à 16 UI de vitamine A
étalon (3.17) par 0,3 ml de benzène (3.14) + 3 ml du réactif selon
Carr-Price (3.16). La courbe d'étalonnage doit être contrôlée régu-
lièrement et à brefs intervalles de temps à l'aide de l'étalon et
d'une solution fraîchement préparée du réactif selon Carr-Price.
5.4.2.Produits du groupe B
Prélever une partie aliquote de la solution dans l'éther de pétrole
obtenue en 5.2, contenant environ 200 UI de rétinol. Évaporer à
sec, sous vide, etreprendre le résidu par 25 ml d'isopropanol
(3.18). Mesurer la densité optique au spectrophotomètre à 325,
310 et 334 nm. Le maximum d'absorption se situe à 325 nm. La
teneur en rétinol A de la solution est calculée comme suit:
E325· 18,30 = UI de rétinol1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 11
(1) La teneur en carotène peut être déterminée par la mesure de la densité optique à
450 nm; E1c m1%= 2 600.
▼B
Toutefois, les rapports des densités optiques
E310:E325etE334:E325
doiventêt re de 6 : 7 = 0,857.
Si l'un de ces rapports s'écarte sensiblement de cette valeur
(<0,830 ou> 0,880), la mesure des densités optiques doit être
précédée d'une chromatographie, selon le procédé indiqué en
5.3.2. Si la mesure des densités optiques effectuée après la chro-
matographie indique que les rapports ci-dessus mentionnés
s'écartent encore sensiblement de la valeur 0,857 (<0,830 ou
>0,880), le dosage doit être effectué selon le procédé indiqué
pour les produits du groupe A.
6.Calcul des résultats
Calculer la teneur en rétinol de l'échantillon en tenant compte du poids de la
prise d'essai et des dilutions effectuées au cours de l'analyse. Exprimer le
résultat en UI de rétinol par kg.
Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur le même échantillon ne doit pas dépasser:
— 20 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs en rétinol inférieures à
75 000 UI/kg,
— 15 000 UI pour les teneurs comprises entre 75 000 et 150 000 UI/kg,— 10 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs comprises entre 150 000 et
250 000 UI/kg,
— 25 000 UI pour les teneurs comprises entre 250 000 et 500 000 UI/kg,
— 5 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs supérieures à 500 000 UI/kg.1973L0046 — FR — 13.08.1998 — 003.001 — 12
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