3.

L'annexe XVIII suivante est ajoutée:



«ANNEXE XVIII DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION DES TRIGLYCÉRIDES À ECN42 (DIFFÉRENCE ENTRE COMPOSITION THÉORIQUE ET COMPOSITION RÉELLE) 1. Objet Détermination de la composition des triglycérides (TAG) dans les huiles d'olive, en terme d'indice d'équivalent carbone, par les différences entre les résultats d'analyse obtenus par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) et la composition théorique, calculée au départ de la composition en acides gras. 2. Champ d'application La norme s'applique aux huiles d'olive. La méthode vise à détecter la présence de faibles quantités d'huiles de graines (riches en acide linoléique) dans chaque catégorie d'huile d'olive. 3. Principe La composition des triglycérides à ECN42 déterminée par HPLC et la composition théorique des triglycérides à ECN42 (calculée sur la base de la détermination GLC de la composition en acides gras) correspondent dans une certaine limite pour les huiles pures. Une différence supérieure aux valeurs mentionnées dans le règlement pour chaque catégorie d'huile indique que l'huile contient des huiles de graines. 4. Méthode La méthode permettant de calculer la composition théorique des triglycérides à ECN42 et la différence entre les données HPLC et celle-ci est constituée par la coordination des données d'analyse obtenues par d'autres méthodes; on peut distinguer trois phases: détermination de la composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse, calcul de la composition théorique des triglycérides à ECN42, détermination HPLC des triglycérides à ECN42. 4.1. Appareillage 4.1.1. Ballons à fond rond de 250 et 500 ml. 4.1.2. Béchers de 100 ml. 4.1.3. Colonne en verre pour chromatographe (diamètre intérieur: 21 mm, longueur 450 mm) avec robinet et cône normalisé (femelle) au sommet. 4.1.4. Ampoules à décanter de 250 ml avec cône normalisé (mâle) à la base, pouvant s'adapter au sommet de la colonne. 4.1.5. Baguette en verre de 600 mm de longueur. 4.1.6. Entonnoir en verre de 80 mm de diamètre. 4.1.7. Ballons tarés de 50 ml. 4.1.8. Ballons tarés de 20 ml. 4.1.9. Évaporateur rotatif. 4.1.10. Chromatographe en phase liquide à haute performance, équipé d'un contrôle thermostatique de la température de la colonne. 4.1.11. Vannes d'injection pour 10 μl. 4.1.12. Détecteur: réfractomètre différentiel. La sensibilité pleine échelle doit atteindre au moins 10−4 unités d'indice de réfraction. 4.1.13. Colonne: tube en acier inoxydable de 250 mm de longueur et de 4,5 mm de diamètre intérieur, rempli de particules de silice de 5 μm de diamètre, avec 22 à 23 % de carbone sous forme d'octadécylsilane (note 2). 4.1.14. Enregistreur et/ou intégrateur. 4.2. Réactifs Les réactifs doivent être de pureté analytique. Les solvants d'élution doivent être dégazés et peuvent être recyclés plusieurs fois sans que les séparations n'en soient affectées. 4.2.1. Éther de pétrole 40-60 °C pour chromatographie. 4.2.2. Éther éthylique, exempt de peroxydes, fraîchement distillé. 4.2.3. Solvant d'élution pour chromatographe en verre: mélange d'éther de pétrole/éther éthylique selon les proportions 87/13 (v/v). 4.2.4. Gel de silice, granulométrie 70-230, type Merck 7734, normalisé avec 5 % d'eau (m/m) 4.2.5. Laine de verre. 4.2.6. Acétone. 4.2.7. Acétonitrile. 4.2.8. Solvant d'élution HPLC: acétonitrile + acétone (dont les proportions doivent être ajustées pour obtenir la séparation souhaitée; commencer avec le mélange 50:50). 4.2.9. Solvant de solubilisation: acétone. 4.2.10. Triglycérides de référence: soit des triglycérides que l'on trouve dans le commerce (tripalmitine, trioléine, etc.) et les temps de rétention sont alors reportés conformément à l'indice d'équivalent carbone, soit des chromatogrammes de référence obtenus à partir d'huile de soja, d'un mélange d'huile de soja-huile d'olive 30:70 et d'huile d'olive pure (voir notes 3 et 4 et figures 1, 2, 3 et 4). 4.3. Préparation des échantillons Étant donné qu'un certain nombre de substances peuvent provoquer une interférence et donner ainsi des résultats positifs erronés, l'échantillon doit toujours être purifié selon la méthode IUPAC 2.507, utilisée pour la détermination des substances polaires dans les huiles oxydées. 4.3.1. Préparation de la colonne de chromatographie Remplir la colonne (4.1.3) avec 30 ml environ de solvant d'élution (4.2.3); introduire ensuite un tampon de laine de verre (4.2.5) dans la colonne, l'enfoncer jusqu'au fond de la colonne au moyen de la baguette en verre (4.1.5). Préparer dans un bécher de 100 ml une suspension avec 25 g de gel de silice (4.2.4) dans 80 ml de mélange d'élution (4.2.3); la transférer ensuite dans la colonne au moyen d'un entonnoir en verre (4.1.6). Afin d'être sûr que la totalité du gel de silice a été transférée dans la colonne, laver le bécher avec le mélange d'élution et transférer également le liquide de lavage dans la colonne. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s'écouler jusqu'à ce que son niveau se situe à 1 cm au-dessus du gel de silice. 4.3.2. Chromatographie sur colonne Peser, avec un degré de précision de 0,001 g, 2,5 +/−0,1 g d'huile, préalablement filtrée, homogénéisée et, si nécessaire, déshydratée dans un ballon taré de 50 ml (4.1.7). Diluer dans 20 ml environ de solution d'élution (4.2.3); si nécessaire, chauffer légèrement pour faciliter la dissolution. Refroidir à température ambiante et porter au volume avec du solvant d'élution. À l'aide d'une pipette jaugée, introduire 20 ml de solution dans la colonne préparée conformément au point 4.3.1, ouvrir le robinet et faire éluer le solvant jusqu'au niveau de la couche de gel de silice. Éluer ensuite avec 150 ml de solvant d'élution (4.2.3), en réglant le débit du solvant à la vitesse de 2 ml par minute environ (de telle sorte que 150 ml passent par la colonne en 60-70 minutes). Recueillir l'éluat dans un ballon à fond rond de 250 ml (4.1.1) préalablement taré et pesé avec précision. Éliminer le solvant sous pression réduite (Rotavapor) et peser le résidu qui sera utilisé pour préparer la solution pour l'analyse HPLC et pour la préparation des esters méthyliques. Après passage dans la colonne, l'échantillon doit être récupéré au moins à 90 % pour les catégories d'huile d'olive extra-vierges, vierges et raffinées normalement et à 80 % pour les huiles lampantes et les huiles de grignons. 4.4. Analyse HPLC 4.4.1. Préparation de l'échantillon pour l'analyse chromatographique Préparer une solution à 5 % de l'échantillon à analyser en pesant 0,5 +/− 0,001 g de l'échantillon dans une fiole jaugée de 10 ml et complétée à 10 ml avec le solvant de solubilisation (4.2.9). 4.4.2. Procédure Mettre en marche le système chromatographique. Pomper du solvant d'élution (4.2.8) à un débit de 1,5 ml par minute de façon à purger l'ensemble du système. Attendre d'avoir une ligne de base stable. Injecter 10 μl des échantillons préparés selon le point 4.3. 4.4.3. Calcul et expression des résultats Utiliser la méthode de normalisation interne, c'est-à-dire admettre que la somme des aires des pics correspondant aux triglycérides (TAG) de ECN 42 à ECN 52 est égale à 100 %. Calculer le pourcentage relatif de chaque triglycéride selon la formule: % triglycéride = aire du pic × 100 / somme des aires des pics. Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule. Note 1: L'ordre d'élution peut être déterminé en calculant les indices d'équivalent carbone, souvent définis par la relation ECN = CN−2n, dans laquelle CN est l'indice de carbone et n le nombre de doubles liaisons; il peut être calculé de manière plus précise en tenant compte de l'origine de la double liaison. Si no, nl et nln sont les nombres de doubles liaisons attribuées respectivement aux acides oléique, linoléique et linolénique, l'indice d'équivalent carbone peut être calculé selon la formule: ECN = CN − dono − dlnl − dlnnln, dans laquelle les coefficients do, dl et dln peuvent être calculés à partir des triglycérides de référence. Dans les conditions énoncées dans cette méthode, la relation obtenue sera voisine de: ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln) Note 2:



Exemples: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333 Lichrosphere ou équivalent (Merck) 100 CH18 Art 50377. Note 3: Avec plusieurs triglycérides de référence, il est également possible de calculer la résolution par rapport à la trioléine: α = TR' / TR de trioléine en utilisant le temps de rétention réduit TR' = TR − TR du solvant. Le graphique représentant le logarithme α en fonction de f (nombre de doubles liaisons) permet de déterminer les valeurs de rétention pour tous les triglycérides des acides gras contenus dans les triglycérides de référence — voir figure 2. Note 4: L'efficacité de la colonne doit permettre de séparer nettement le pic de la trilinoléine des pics des triglycérides dont le TR est proche. L'élution est effectuée jusqu'au pic ECN 52. Note 5: Une mesure correcte des aires de tous les pics intéressants pour la présente détermination est garantie si le deuxième pic correspondant à ECN 50 est égal à 50 % du maximum de l'échelle. 4.5. Détermination de la composition des triglycérides (moles %) au départ des données relatives aux acides gras GLC 4.5.1. Détermination de la composition des acides gras La composition des acides gras est déterminée par chromatographie en phase gazeuse selon la méthode CEE décrite à l'annexe X A du règlement (CEE) no 2568/91 au moyen d'une colonne capillaire. Les esters méthyliques sont préparés selon la méthode décrite à l'annexe X B (méthylate de sodium en solution méthanolique). 4.5.2. Acides gras intervenant dans le calcul Les glycérides sont regroupés par leur indice d'équivalent carbone (ECN), compte tenu des équivalences suivantes entre ECN et acides gras. Seuls les acides gras ayant 16 ou 18 atomes de carbone ont été pris en considération, car ce sont les seuls qui sont importants pour l'huile d'olive.



Acide gras (AG) Abréviation Poids moléculaire (PM) ECN Acide palmitique P 256,4 16 Acide palmitoléique Po 254,4 14 Acide stéarique S 284,5 18 Acide oléique O 282,5 16 Acide linoléique L 280,4 14 Acide linolénique Ln 278,4 12 4.5.3. Conversion en moles du % de l'aire pour tous les acides gras

4.5.4. Normalisation des acides gras à 100 %

Le résultat indique le pourcentage de chaque acide gras en moles dans la position globale (1,2,3-) des TAG. Calculer alors la somme des acides gras saturés P et S (SAG) et les acides gras insaturés Po, O, L et Ln (AGI):

4.5.5. Calcul de la composition des TAG en acides gras en positions 2 et 1-3 Les acides gras sont répartis en trois ensembles de la manière suivante: deux ensembles identiques pour les positions 1 et 3 et un pour la position 2, avec différents coefficients pour les acides saturés (P et S) et les acides insaturés (Po, O, L et Ln). 4.5.5.1. Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)]

4.5.5.2. Acides gras insaturés en position 2 [Po(2), O(2), L(2) et Ln(2)]

4.5.5.3. Acides gras en positions 1 et 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)]

4.5.6. Calcul des triglycérides 4.5.6.1. TAG avec un acide gras (AAA, ici LLL, PoPoPo)



moles % AAA = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % A1,310 000 (7) 4.5.6.2. TAG avec deux acides gras (AAB, ici PoPoL, PoLL)

4.5.6.3. TAG avec trois acides gras différents (ABC, ici OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn)

4.5.6.4. Triglycérides avec ECN42 Les triglycérides suivants avec ECN42 sont calculés selon l'équation 7, 8 et 9, par ordre de l'élution attendue dans la HPLC (normalement trois pics seulement). LLL PoLL et l'isomère de position LPoL OLLn et les isomères de position OLnL et LnOL PoPoL et l'isomère de position PoLPo PoOLn et les isomères de position OPoLn et OLnPo PLLn et les isomères de position LLnP et LnPL PoPoPo SLnLn et l'isomère de position LnSLn PPoLn et les isomères de position PLnPo et PoPLn Les triacylglycérides avec ECN42 s'obtiennent en calculant la somme des neuf triglycérides, y compris leurs isomères de position. Les résultats doivent comporter au moins deux chiffres après la virgule. 5. Évaluation des résultats Comparer la composition théorique calculée et celle déterminée par HPLC. Si la différence “données HPLC moins données théoriques” est supérieure aux valeurs mentionnées dans le règlement pour la catégorie d'huile appropriée, l'échantillon contient de l'huile de graines. Note: Les résultats sont donnés avec un chiffre derrière la virgule. 6. Exemple (Les nombres se réfèrent aux sections du texte de la méthode.) 4.5.1. Calcul des acides gras par le % de moles à partir des données de la GLC (% de l'aire) On obtient les données suivantes pour la composition en acides gras par GLC:



AG PM P 256,4 S 284,5 Po 254,4 O 282,5 L 280,4 Ln 278,4 % de l'aire 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0 4.5.3. Conversion du % de l'aire en moles pour tous les acides gras



moles P = 10256,4 = 0,03900 moles P voir formule (1) moles S = 3284,5 = 0,01054 moles S voir formule (1) moles Po = 1254,4 = 0,00393 moles Po voir formule (1) moles O = 75282,5 = 0,26549 moles O voir formule (1) moles L = 10280,4 = 0,03566 moles L voir formule (1) moles Ln = 1278,4 = 0,003594 moles Ln voir formule (1)

4.5.4. Normalisation des acides gras à 100 %



moles % P1,2,3 = 0,03900 moles P * 1000,35822 moles = 10,888 % voir formule (2) moles % S1,2,3 = 0,01054 moles S * 1000,35822 moles = 2,944 % voir formule (2) moles % Po1,2,3 = 0,00393 moles Po * 1000,35822 moles = 1,097 % voir formule (2) moles % O1,2,3 = 0,26549 moles O * 1000,35822 moles = 74,113 % voir formule (2) moles % L1,2,3 = 0,03566 moles L * 1000,35822 moles = 9,956 % voir formule (2) moles % Ln1,2,3 = 0,00359 moles Ln * 1000,35822 moles = 1,003 % voir formule (2)

La somme des acides gras saturés et insaturés dans la position 1, 2, 3 des TAG:



moles % SAG = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % voir formule (3) moles % AGI = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % voir formule (3) 4.5.5. Calcul de la composition en acides gras dans les positions 2 et 1-3 des TAG 4.5.5.1. Acides gras saturés en position 2 [P(2) et S(2)]



moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % voir formule (4) moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % voir formule (4) 4.5.5.2. Acides gras insaturés en positions 1-3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)]



moles % Po2 = 1,097 %86,169 % * 100 − − 0,659 − 0,177 = 1,263 moles % voir formule (5) moles % O2 = 74,113 %86,169 % * 100 − − 0,659 − 0,177 = 85,295 moles % voir formule (5) moles % L2 = 9,956 %86,169 % * 100 − − 0,659 − 0,177 = 11,458 moles % voir formule (5) moles % Ln2 = 1,003 %86,169 % * 100 − − 0,659 − 0,177 = 1,154 moles % voir formule (5) 4.5.5.3. Acides gras en positions 1-3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) et Ln(1,3)]



moles % P1,3 = 10,888 − 0,659210,888 = 16,005 moles % voir formule (6) moles % S1,3 = 2,944 − 0,17722,944 = 4,327 moles % voir formule (6) moles % Po1,3 = 1,097 − 1,26321,097 = 1,015 % moles voir formule (6) moles % O1,3 = 74,113 − 85,295274,113 = 68,522 moles % voir formule (6) moles % L1,3 = 9,956 − 11,45829,956 = 9,205 moles % voir formule (6) moles % Ln1,3 = 1,003 — 1,15421,003 = 0,927 moles % voir formule (6) 4.5.6. Calcul des triglycérides À partir de la composition calculée en acides gras dans les positions sn-2 et sn-1,3 (voir tableau suivant):



AG en position 1-3 position 2 P 16,005 % 0,653 % S 4,327 % 0,177 % Po 1,015 % 1,263 % O 68,522 % 85,295 % L 9,205 % 11,458 % Ln 0,927 % 1,154 % Total 100,0 % 100,0 % Calculer les triglycérides suivants: LLL PoPoPo PoLL avec 1 isomère de position SLnLn avec 1 isomère de position PoPoL avec 1 isomère de position PPoLn avec 2 isomères de position OLLn avec 2 isomères de position PLLn avec 2 isomères de position PoOLn avec 2 isomères de position 4.5.6.1. TAG avec un acide gras (LLL, PoPoPo) voir formule (7)



moles % LLL = 9,205 % * 11,458 % * 9,205 %10 000 = 0,09708 mol LLL moles % PoPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 1,015 %10 000 = 0,00013 mol PoPoPo 4.5.6.2. TAG avec deux acides gras (PoLL, SLnLn, PoPoL) voir formule (8)



moles % PoLL + LLPo = 1,015 % * 11,458 % * 9,205 % * 210 000 = 0,02141 moles % LPoL = 9,205 % * 1,263 % * 9,205 %10 000 = 0,01070 0,03211 mol PoLL moles % SLnLn + LnLnS = 4,327 % * 1,154 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00093 moles % LnSLn = 0,927 % * 0,177 % * 0,927 %10 000 = 0,00002 0,00095 mol SLnLn moles % PoPoL + LPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00236 moles % PoLPo = 1,015 % * 11,458 % * 1,015 %10 000 = 0,00118 0,00354 mol PoPoL 4.5.6.3. TAG avec trois acides gras différents (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) voir formule (9)



moles % PPoLn = 16,005 % * 1,263 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00375 moles % LnPPo = 0,927 % * 0,653 % * 1,015 % * 210 000 = 0,00012 moles % PoLnP = 1,015 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,00375 0,00762 mol PPoLn moles % OLLn = 68,522 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,14577 moles % LnOL = 0,927 % * 85,295 % * 9,205 % * 210 000 = 0,14577 moles % LLnO = 9,205 % * 1,154 % * 68,522 % * 210 000 = 0,14577 0,43671 mol OLLn moles % PLLn = 16,005 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,03400 moles % LnPL = 0,927 % * 0,653 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00111 moles % LLnP = 9,205 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,03400 0,06911 mol PLLn moles % PoOLn = 1,015 % * 85,295 % * 0,927 % * 210 000 = 0,01605 moles % LnPoO = 0,927 % * 1,263 % * 68,522 % * 210 000 = 0,01605 moles % OLnPo = 68,522 % * 1,154 % * 1,015 % * 210 000 = 0,01605 0,04815 mol PoOLn ECN42 = 0,69540 mol TAG»