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►B RÈGLEMENT (CEE) No3942/92 DE LA COMMISSION
du 22 décembre 1992
établissant une méthode de référence pour la détermination du sitostérol et du stigmastérol dans le
butter-oil
(JO L 399 du 31.12.1992, p. 29)
Modifié par:
Journal officiel
nopage date
►M1Règlement (CEE) no2539/93 de la Commission du 15 septembre 1993 L233 1 16.9.1993
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RÈGLEMENT (CEE) No3942/92 DE LA COMMISSION
du 22 décembre 1992
établissant une méthode de référence pour la détermination du
sitostérol et du stigmastérol dans le butter-oil
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,
vu le règlement (CEE) no804/68 du Conseil, du 27 juin 1968, portant
organisation commune des marchés dans le secteur du lait et desproduits laitiers(
1), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) no
2071/92(2), et notamment son article 6,
considérant que le butter-oildoit être marqué et que le butter-oil
marquédoitêtrecontrôléconformémentaurèglement(CEE)no3143/85
delaCommission(3),modifiéendernierlieuparlerèglement(CEE)no
1264/92(4), et notamment ses articles 5 et 6;
considérant que le butter-oildoit être marqué et que les produits
marqués doivent être contrôlés conformément au règlement (CEE) no570/88 de la Commission(
5), modifié en dernier lieu par le règlement
(CEE) no124/92(6), et notamment ses articles 3 et 6;
considérant que le butter-oildoit être marqué et que le butter-oil
marqué doit être contrôlé conformément au règlement (CEE) no429/90
delaCommission(7),modifiéendernierlieuparlerèglement(CEE)no
1264/92, et notamment ses articles 10 et 11;
considérantquelestrictrespectdesconditionsrelativesaumarquagedu
butter-oilest indispensable pour prévenir tout risque d’utilisation inter-
dite de beurre susmentionné;
considérantque,comptetenudel’importancedumarquagedanslebon
fonctionnement de ces systèmes, il convient de définir des méthodescommunes de détection de tous les marqueurs exigés dans le cadre deces systèmes; que cela permettrait notamment d’assurer une égalité detraitement entre tous les opérateurs utilisant ces systèmes et d’éliminertouteinégalitédanslesconditionsdeconcurrencequipeutactuellementen résulter du fait des différences dans les méthodes d’analyse natio-nales;
considérantqu’ilestdifficilededéfinirdesméthodesderéférenced’une
manière simultanée pour tous les marqueurs; que la définition d’uneméthode de référence pour la détermination du stigmastérol et du sitos-térol dans le butter-oilconstitue un premier pas dans cette direction;
considérant que les mesures prévues au présent règlement sont
conformes à l’avis du comité de gestion du lait et des produits laitiers,
A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:
(1)J OnoL 148 du 28. 6. 1968, p. 13.
(2)J OnoL 215 du 30. 7. 1992, p. 64.
(3)J OnoL 298 du 12. 11. 1985, p. 9.
(4)J OnoL 135 du 19. 5. 1992, p. 5.
(5)J OnoL 55 du 1. 3. 1988, p. 31.
(6)J OnoL 14 du 21. 1. 1992, p. 28.
(7)J OnoL 45 du 21. 2. 1990, p. 8.
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Article premier
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La méthode d’analyse de référence à appliquer pour déterminer lateneurdubutter oilenstigmastérol,conformémentàl’article6durègle-
ment(CEE)n
o3143/85,àl’article6durèglement(CEE)no570/88ouà
l’article 11 du règlement (CEE) no429/90, et pour déterminer la teneur
dubutter oilenβ-sitostérol, conformément à l’article 6 du règlement
(CEE) no570/88, est indiquée en annexe.
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Lebutter-oilaétémarquécorrectementsilesrésultatsobtenussatisfont
aux conditions précisées au point 8 de la présente annexe.
Article 2
Leprésentrèglemententreenvigueurletroisièmejoursuivantceluide
sa publication au Journal officiel des Communautés européennes .
Il est applicable à partir du 1erfévrier 1993.
Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directe-
ment applicable dans tout État membre.
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ANNEXE
DÉTERMINATION DU SITOSTÉROL OU DU STIGMASTÉROL DANS
LE BUTTER-OIL PAR LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE À L’AIDE D’UNE COLONNE CAPILLAIRE
1. OBJET ET DOMAINE D’APPLICATION
La méthode décrit une procédure permettant la détermination quantita-
tive du sitostérol ou du stigmastérol dans le butter-oil. Le sitostérol est
lasommedu β-sitostéroletdu22-dihydro- β-sitostérol,lesautressitosté-
rols étant considérés comme peu importants. Cette méthode s’appliqueaux échantillons obtenus dans le cadre des règlements (CEE) n
o3143/
85, (CEE) no570/88 et (CEE) no429/90.
2. PRINCIPE
Lebutter-oilest saponifié à l’aide d’hydroxyde de potassium dans une
solution d’éthanol et les insaponifiables sont extraits à l’aide d’éther.
Lesstérolssonttransformésentriméthyl-silyl-éthersetsontanalyséspar
chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire par rapport àun étalon interne: la bétuline.
3. APPAREILLAGE
3.1. Ballon de saponification de 150ml équipé d’un réfrigérant à reflux à
embouts rodés.
3.2. Ampoules à décanter de 500ml.3.3. Ballons de 250ml.3.4. Ampoules d’égalisation de la pression, de 250ml ou d’une contenance
semblable, destinés à recueillir l’éther à jeter.
3.5. Colonne de verre, de 350mm×20mm, dotée d’un raccord en verre
fritté.
3.6. Bain-marie ou manchon isotherme.3.7. Flacons à réaction, de 2ml.3.8. Appareildechromatographieenphasegazeusepouvantêtreutiliséavec
unecolonnecapillaire,munid’undispositifdefonctionnementcomposé:
3.8.1. d’un four thermostaté pour les colonnes pouvant maintenir la tempéra-
ture souhaitée avec une précision de ±1 °C;
3.8.2. d’un injecteur thermoréglable;3.8.3. d’un détecteur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur;3.8.4. d’un intégrateur-enregistreur pouvant être utilisé avec le convertisseur-
amplificateur (3.8.3).
3.9. Colonne capillaire en verre de silice entièrement recouverte de BP 1 ou
d’une substance équivalente d’une épaisseur uniforme de 0,25 µm; la
colonne doit être en mesure de résoudre les dérivés triméthyl-silyl dulanostéroletdusitostérol.UnecolonneBP1de12mdelongueuretdediamètre interne de 0,2mm est appropriée.
3.10. Microseringueàaiguilleenaciertrempépourchromatographieenphase
gazeuse de 1 µl.
4. RÉACTIFS
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L’eau
utilisée doit être de l’eau distillée ou de l’eau d’une pureté au moinséquivalente.
4.1. Éthanol, pur au moins à 95%.4.2. Hydroxydedepotassium,solutionà60%,dissoudre600gd’hydroxyde
de potassium (minimum 85%) dans de l’eau et compléter à 1 l avec del’eau.
4.3. Bétuline d’une pureté d’au moins 99%.4.3.1. Solutions de bétuline dans l’éther (4.4).4.3.1.1. Laconcentrationdelasolutiondebétulineutiliséepourladétermination
du sitostérol doit être de 1,0mg/ml.
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4.3.1.2. Laconcentrationdelasolutiondebétulineutiliséepourladétermination
du stigmastérol doit être de 0,4mg/ml.
4.4. Éther diéthylique, de pureté analytique (exempt de péroxydes ou de
résidus).
4.5. Sulfate de sodium, anhydre, en granulés, préalablement séché à 102 °C
pendant 2 heures.
4.6. Réactifdesilylation,parexemple,TRI-SIL(pouvantêtreobtenuauprès
dePierceChemicalCo.,Catno49001)ouéquivalent.(ATTENTION:le
TRI-SIL est inflammable et toxique, corrosif et peut être carcinogène.Le personnel de laboratoire doit bien connaître les règles de sécuritéapplicables au TRI-SIL et prendre les précautions qui s’imposent).
4.7. Lanostérol.4.8. Sitostérol, de pureté connue, égale ou supérieure à 90% (P).
Note 1:La pureté des matériaux étalons utilisés pour le calibrage doit
être déterminée à l’aide de la méthode de normalisation. On part del’hypothèse que tous les stérols présents dans l’échantillon sont repré-sentésdanslechromatogramme,quelasurfacetotaledespicsreprésente100% des constituants des stérols et que les stérols donnent la mêmeréponse au détecteur. La linéarité du système doit être vérifiée pour lesniveaux de concentrations considérés.
4.8.1. Solution étalon de sitostérol: préparer une solution à 0,001mg/ml près,
contenant environ 0,5mg/ml (W
1) de sitostérol (4.8) dans de l’éther
diéthylique (4.4).
4.9. Stigmastérol, d’une pureté connue, égale ou supérieure à 90% (P).4.9.1. Solution étalon de stigmastérol: préparer une solution à 0,001mg/ml
près, contenant environ 0,2mg/ml(W
1) de stigmastérol (4.9) dans de
l’éther diéthylique (4.4).
4.10. 4.10.Mélangepourletestderésolution:préparerunesolutioncontenant
0,05mg/ml de lanostérol (4.7) et 0,5mg/ml de sitostérol (4.8) dans del’éther diéthylique (4.4).
5. MODE OPÉRATOIRE
5.1. Préparation des solutions étalons pour la chromatographie: ajouter la
solutionétaloninterne(4.3.1)àlasolutionétalondestérolappropriéeenmême temps qu’à l’échantillon saponifié (5.2.2).
5.1.1. Solutionchromatographiqueétalondesitostérol:transférer1mldesolu-
tion étalon de sitostérol (4.8.1) dans chacun des deux flacons à réaction(3.7) et éliminer l’éther sous un flux d’azote. Ajouter 1ml de solutionétalon interne (4.3.1.1) et éliminer l’éther sous un flux d’azote.
5.1.2. Solution chromatographique étalon de stigmastérol: transférer 1ml de
solution étalon de stigmastérol (4.9.1) dans chacun des deux flacons àréaction (3.7) et éliminer l’éther sous un flux d’azote. Ajouter 1ml desolution étalon interne (4.3.1.2) et éliminer l’éther sous un flux d’azote.
5.2. Préparation des insaponifiables.5.2.1. Peser à 1mg près, environ 1g de butter-oil(W
2) dans un flacon de
150ml (3.1). Ajouter 50ml d’éthanol (4.1) et 10ml de solution d’hy-droxyde de potassium (4.2). Adapter le réfrigérant à reflux et porter àenviron 75 °Cpendant 30minutes. Détacher le réfrigérant et laisser
refroidir le ballon à la température ambiante.
5.2.2. Ajouter 1,0ml de solution étalon interne dans le ballon (4.3.1.1) s’il
s’agit de déterminer le sitostérol ou 4.3.1.2 s’il s’agit de déterminer lestigmastérol). Mélanger soigneusement. Transférer le contenu du ballonquantitativementdansuneampouleàdécanterde500ml(3.2).Rincerleballon avec 50ml d’eau, puis 250ml d’éther diéthylique (4.4). Agitervigoureusement l’ampoule à décanter pendant 2minutes et laisser lesphasesseséparer.Éliminerlaphaseaqueuseinférieureetlaverlaphaseéthérée en agitant avec 4 parties aliquotes successives de 100ml d’eau.
Note 2:Pour éviter la formation d’une émulsion, il est indispensable
quelesdeuxpremiersrinçagesàl’eausoienteffectuésdélicatement(10inversions). Pour le troisième rinçage, on peut agiter vigoureusementpendant 30 secondes. Si une émulsion se forme, elle peut être éliminéepar l’addition d e5à1 0m l d’éthanol. Si de l’éthanol est ajouté, il est
indispensable de procéder à deux nouveaux lavages à l’eau vigoureux.
5.2.3. Faire passer la phase éthérée limpide et exempte de savon sur une
colonne en verre (3.5) contenant 30g de sulfate de sodium anhydre(4.5).Collecterl’étherdansunballonde250ml(3.3).Ajouterdesbilles
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antiprojection et évaporer jusqu’à la quasi-dessication dans un bain-
marieouunmanchonisothermeenprenantsoindecollecterlessolvantsà éliminer.
Note3:Sidesextraitsd’échantillonssontévaporésàsecàunetempéra-
ture trop élevée, il peut y avoir des pertes de stérol.
5.3. Préparation des triméthyl-silyl-éthers.5.3.1. Transférer la solution d’éther restant dans le ballon dans un flacon à
réactionde2ml(3.7)àl’aidede2mld’étheretéliminerl’éthersousunfluxd’azote.Laverleballonavecdeuxpartiesaliquotessupplémentairesde2mld’étherentransférantdansleflaconetenéliminantl’éthersousazote à chaque fois.
5.3.2. Silylerl’échantillonenajoutant1mldeTRI-SIL(4.6).Fermerleflacon
et agiter vigoureusement pour dissoudre. Si la dissolution est incom-plète, porter à 65-70 °C. Laisser reposer pendant au moins 5minutes
avant d’injecter dans le chromatographe en phase gazeuse. Silyler lesétalonsdelamêmemanièrequeleséchantillons.Silylerlemélangepourle test de résolution (4.10) de la même manière que les échantillons.
Note 4:Lasilylationdoitsefairedansunenvironnementanhydre.Une
silylation incomplète de la bétuline est indiquée par un second picproche de celui de la bétuline.
La présence d’éthanol lors de la silylation interférera avec la silylation.
Ceci peut résulter d’un rinçage insuffisant lors de l’extraction. Si ceproblème persiste, un cinquième rinçage, avec agitation vigoureusependant 30 secondes, peut être introduit à l’étape de l’extraction.
5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse.5.4.1. Choix des conditions opératoires.
Installer le chromatographe en phase gazeuse selon les instructions du
fabricant.
Les conditions opératoires indicatives sont les suivantes:
—températuredelacolonne: 265 °C
—températuredel’injecteur: 280 °C
—températuredudétecteur: 300 °C
—débitdugazvecteur: 0,6ml/min.—pressiondel’hydrogène: 84kPa—pressiondel’air: 155kPa—Injectionfractionnée:de10/1à50/1;lerapportdefuitedoitêtre
optimiséenfonctiondesinstructionsdufabricantetlalinéaritédelaréponsedudétecteurvalidéeensuiteparrapportauxconcentrationsentrantenlignedecompte.
Note5:Ilestparticulièrementimportantquelachambredevaporisation
soit régulièrement nettoyée.
— quantité de substance injectée: 1 µl de solution TMSE.
Laisser le système s’équilibrer jusqu’à l’obtention d’une réponse suffi-
samment stable avant d’entreprendre toute analyse.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques
de la colonne et du chromatographe en phase gazeuse de manière àobtenir des chromatogrammes qui satisfassent aux conditions suivantes:
— le pic du sitostérol doit présenter une résolution suffisante par
rapport au lanostérol. La figure 1 présente un chromatogrammetypiquetelqu’ildoitêtreobtenuàpartird’unmélangesilylédutestde résolution (4.10)
— les temps de rétention relatifs des stérols suivants devraient être
d’environ:
cholestérol 1,0
stigmastérol 1,3sitostérol 1,5bétuline 2,5.
— le temps de rétention de la bétuline devrait être d’environ
24minutes.
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5.4.2. Protocole analytique:
Injecter 1 µl de solution étalon silylée (stigmastérol ou sitostérol) et
ajuster les paramètres de calibrage de l’intégrateur.
Injecter de nouveau 1 µl de solution étalon silylée pour déterminer le
coefficient de réponse par rapport à la bétuline.
Injecter 1 µl de solution échantillon silylée mesurer la surface des pics.
Chaque série d’échantillons doit être précédée et suivie d’une injectiond’étalons.
En règle générale, l’injection d’étalons peut être effectuée après une
série de six échantillons
Note 6:L’intégration du pic du stigmastérol devrait comporter les traî-
nées indiquées par les points 1, 2 et 3 de la figure 2b.
L’intégration du pic du sitostérol devrait englober la surface du pic du
22-dihydro- β-sitostérol (stigmastanol) élué immédiatement après le
sitostérol, (figure 3b) lors de l’évaluation du sitostérol total.
6. CALCUL DES RÉSULTATS
6.1. Déterminerlasurfacedupicdestéroletdupicdebétulinedanslesdeux
étalons en début et fin de chaque série et calculer R
1:
R1=surface moyenne du pic de la bétuline dans l’étalonsurface moyenne du pic du stérol dans l’étalon
Déterminer la surface du pic du stérol (stigmastérol ou sitostérol) et du
pic de bétuline dans l’échantillon et calculer R2:
R2=surface du pic de la bétuline dans l’échantillonsurface du pic du stérol dans l’échantillon
W1= teneur en stérol de l’étalon (mg) contenu dans 1ml de solution
étalon (4.8.1 ou 4.9.1)
W2= poids de l’échantillon (g) (5.2.1)
P = pureté du stérol étalon (4.8 ou 4.9).
Teneur de l’échantillon en stérol mg/kg =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. PRÉCISION DE LA MÉTHODE
7.1. Répétabilité7.1.1. Stigmastérol
Ladifférenceentrelesrésultatsdesdeuxdéterminationseffectuéesdans
l’intervalledetempslepluscourtpossiblepourunopérateurutilisantlamêmeappareillagesurdumatérield’essaiidentiquenedoitpasdépasser10,2mg/kg.
7.1.2. Sitostérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées dans
l’intervallelepluscourtpossibleparunseulopérateurutilisantlemêmeappareillagesurdumatérield’essaiidentiquenedoitpasdépasser3,6%par rapport à la moyenne des déterminations.
7.2. Reproductibilité7.2.1. Stigmastérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par
des opérateurs dans différents laboratoires utilisant des appareillagesdifférents sur du matériel d’essai identique ne doit pas dépasser25,3mg/kg.
7.2.2. Sitostérol
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par
desopérateursdansdeslaboratoiresdifférentsutilisantdesappareillagesdifférents sur du matériel d’essai identique ne doit pas dépasser 8,9%par rapport à la moyenne des déterminations.
7.3. Source de données de précision
Les données de précision ont été déterminées à partir d’une expérience
menée en 1991 impliquant neuf laboratoires et six échantillons (3 en
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double aveugle), pour le stigmastérol; six échantillons (3 en double
aveugle), pour le sitostérol.
8. LIMITES DE TOLÉRANCE
8.1. Pourvérifierl’homogénéité,ilfautprélevertroiséchantillonsduproduit
tracé.
8.2. Stigmastérol8.2.1. Le taux d’incorporation pour le stigmastérol est de 150g de stigmas-
térol, pur au moins à 95%, par tonne de butter-oil, c’est-à-dire
142,5mg/kg;oude170gdestigmastérolpuraumoinsà85%partonnedebutter-oil, soit 144,5mg/kg.
8.2.2. Sil’onprendenconsidérationladifférencecritiquepouruneprobabilité
de 95% (DCr
95), la moyenne des trois résultats ne doit pas être infé-
rieure:
— à128,3mg/kgdanslecasd’uneincorporationdestigmastérolpurà
95%,
— à130,3mg/kgdanslecasd’uneincorporationdestigmastérolpurà
85%.
8.2.3. Enplusdescritèresindiquésaupoint8.2.2,onutiliselerésultatleplus
bas obtenu à partir de l’analyse du produit pour vérifier l’homogénéitéde la distribution du traceur et ce, par une comparaison avec les limitesci-après:
— 120,4mg/kg (95% de taux d’incorporation minimal pour du stig-
mastérol pur à 95%, un seul échantillon des DCr
95étant pris en
considération),
— 122,3mg/kg (95% de taux d’incorporation minimal pour du stig-
mastérol pur à 85%, un seul échantillon des DCr95étant pris en
considération),
— 99,0mg/kg(80%detauxd’incorporationminimalpourdustigmas-
térolpurà95%,unseuléchantillondesDCr95étantprisenconsidé-
ration),
— 100,6mg/kg (80% de taux d’incorporation minimal pour du stig-
mastérol pur à 85%, un seul échantillon des DCr9595 étant pris en
considération).
Laconcentrationdutraceurdansl’échantillondonnantlerésultatleplus
faible est utilisée par interpolation entre respectivement 120,4mg/kg et99,0mg/kg ou 122,3mg/kg et 100,6mg/kg.
8.3. Sitostérol.8.3.1. Le taux d’incorporation du sitostérol est de 600g de sitostérol pur à au
moins 90% par tonne de butter-oil, c’est-à-dire 540mg/kg.
8.3.2. Sil’onprendenconsidérationlaDCr
95,lamoyennedestroisrésultatsne
doit pas être inférieure à 513,0mg/kg.
8.3.3. En plus du critère indiqué au point 8.3.2, on utilise le résultat le plus
faibleobtenuàpartirdel’analyseduproduitpourvérifierl’homogénéitéde la distribution du marqueur et ce, par comparaison avec les limitessuivantes:
— 484,4mg/kg (95% de taux d’incorporation minimal pour du sitos-
térolpurà90%,unseuléchantillondeDCr
95étantprisenconsidé-
ration),
— 403,4mg/kg (80% de taux d’incorporation minimal pour du sitos-
térolpurà90%,unseuléchantillondeDCr95étantprisenconsidé-
ration).
Laconcentrationdutraceurdansl’échantillondonnantlerésultatleplus
faible est utilisée par interpolation entre respectivement 484,4mg/kg et403,4mg/kg.
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Figure 1Chromatogramme du mélange pour le test de résolution
La résolution complète est préférable, c’est-à-dire que le tracé du pic
du lanostérol doit rejoindre la ligne de base avant la sortie du pic dusitostérol, quoiqu’une résolution incomplète soit tolérable.

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Figure 2a
Stigmastérol étalon

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Figure 2b
Échantillon de butter-oildénaturé avec du stigmastérol
Note: L’intégration du pic du stigmastérol devrait comporter toutes les traînées
comprises entre les points 1, 2, et 3.
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Figure 3a
Sitostérol étalon

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Figure 3b
Échantillon de butter-oildénaturé avec du β-sitostérol
Note:Leβ-sitostérol contient souvent une impureté (le stigmastanol) qui est
éluée immédiatement après le β-sitostérol. Les surfaces de ces deux pics
doivent être additionnées lorsqu’on évalue le β-sitostérol total présent.