1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 1
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►BSEPTIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 1ermars 1976
portant fixation de méhodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des
animaux
(76/372/CEE)
(JO L 102 du 15.4.1976, p. 8)
Modifiée par:
Journal officiel
nopage date
►M1 Directive 81/680/CEE de la Commission du 30 juillet 1981 L 246 32 29.8.1981
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SEPTIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 1ermars 1976
portant fixation de méhodes d'analyse communautaires pour le
contrôle officiel des aliments des animaux
(76/372/CEE)
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction
de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse
communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (
1),
modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion (2) etnot ammentson
article 2,
considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels
des aliments des animaux visant à constater que les conditionsprescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ouadministratives concernant la qualité et la composition des aliments
des animaux sontrespect ées, sonteffect ués selon des modes de prélè-
vement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;
considérantque les direct ives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE,
73/46/CEE, 74/203/CEE et75/84/CEE de la Commission, des 15 juin1971 (
3), 18 novembre 1971 (4), 27 avril 1972 (5), 5 décembre 1972 (6),
25 mars 1974 (7) et20 décembre 1974 (8) ontdéjà fixé un cert ain
nombre de méthodes d'analyse communautaires; que, compte tenu de
l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convientd'arrêter une septième série de méthodes;
considérant que les mesures prévues à la présente directive sont
conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux,
A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premier
Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles offi-
ciels des aliments des animaux, en ce qui concerne leur teneur enaflatoxine B
1sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe de
la présente directive.
Article 2
Les États membres mettent en vigueur, le 1eroctobre 1976 au plus tard,
les dispositions législatives, réglementaires ou administratives néces-saires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ilsen informentimmédiat ementla Commission.
Article 3
Les États membres sont destinataires de la présente directive.1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)J O noL 170 du 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O noL 73 du 27. 3. 1972, p. 14.
(3)J O noL 155 du 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O noL 279 du 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O noL 123 du 29. 5. 1972, p. 6.
(6)J O noL 83 du 30. 3. 1973, p. 21.
(7)J O noL 108 du 22. 4. 1974, p. 7.
(8)J O noL 32 du 5. 2. 1975, p. 26.▼M1
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ANNEXE
DOSAGE DE L'AFLATOXINE B1
A. MÉTHODE PAR CHROMATOGRAPHIE MONODIMENSIONNELLE
SUR COUCHE MINCE
1. Objet et domaine d'application
La méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B1des
aliments suivants: tourteaux d'arachides, de copra, de lin, de soja,
de sésame, de babassu etde germes de maïs, céréales etproduit s
céréaliers, farine de pois, pulpe etfécule de pommes de t erre. La
limite inférieure du dosage est de 0,01 mg/kg (10 ppb).
En présence de substances interférentes qui entravent les détermi-
nations, il y a lieu de recommencer l'analyse selon la méthode B
(par chromatographie bidimensionnelle sur couche mince).
2. Principe
L'échantillon est soumis à l'extraction par du chloroforme. L'extrait
est filtré, une partie aliquote en est prélevée et purifiée par chroma-
tographie sur colonne de gel de silice. L'éluat est évaporé et le
résidu estrepris par un volume dét erminé de chloroforme ou d'un
mélange de benzène et d'acétonitrile. Une partie aliquote de cette
solution est soumise à la chromatographie sur couche mince. La
quantité d'aflatoxine B1est déterminée sous irradiation UV du chro-
matogramme soit visuellement, soit par fluorodensitométrie, par
comparaison avec des quantités connues d'aflatoxine B1-étalon.
L'identité de l'aflatoxine B1extraite de l'aliment doit être confirmée
par les procédés indiqués.
3. Réactifs
NB: Tous les réactifs doivent être de qualité «pour analyse» dans
la mesure où aucune autre indication n'est donnée.
3.1. Acéton
3.2. Chloroforme, stabilisé par 0,5 à 1,0 pour cent d'éthanol à 96 pour
cent(v/v).
3.3. n-Hexane
3.4. Méthanol
3.5. Éther diéthylique anhydre, exempt de peroxydes.
3.6. Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v).
3.7. Mélange de chloroforme (3.2) etde mét hanol (3.4): 97/3 (v/v).
3.8. Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granulométrie:
0,05 à 0,20 mm.
3.9. Coton hydrophile, préalablement dégraissé par le chloroforme, ou
laine de verre.
3.10. Sulfate de sodium, anhydre, granulé.3.11. Gaz inerte, par exemple azote.
3.12. Acide chlorhydrique 1 N.
3.13. Acide sulfurique à 50 pour cent(v/v).
3.14. Terre de diatomées (Hyflosupercel), lavée à l'acide.
3.15. Gel de silice G-HR ou équivalent, pour chromatographie sur
couche mince.
3.16. Solution étalon à 0,1 µg environ d'aflatoxine B
1par millilitre dans
le chloroforme (3.2) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (3.6),
préparée etcont rôlée comme indiqué sous le point7.
3.17. Solution étalon qualitative à 0,1 µg environ d'aflatoxines B1etB2par ml dans le chloroforme (3.2) ou dans le mélange benzène/
acétonitrile (3.6). Ces concentrations sont données à titre indicatif.
Elles doivent être ajustées de manière à obtenir la même intensité
de fluorescence pour les deux aflatoxines.1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 3
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3.18. Solvants de développement:
3.18.1. Chloroforme (3.2)/acétone (3.1): 9/1 (v/v), cuve non saturée;
3.18.2. Éther diéthylique (3.5)/méthanol (3.4)/eau: 96/3/1 (v/v/v), cuve non
saturée;
3.18.3. Éther diéthylique (3.5)/méthanol (3.4)/eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cuve
saturée;
3.18.4. Chloroforme (3.2)/méthanol (3.4): 94/6 (v/v), cuve saturée;3.18.5. Chloroforme (3.2)/méthanol (3.4): 97/3 (v/v), cuve saturée.
4. Appareillage
4.1. Broyeur-mélangeur.4.2. Appareil à secouer ou agitateur magnétique.
4.3. Filtres plissés, Schleicher et Schüll n
o588 ou équivalent, diamètre:
24 cm.
4.4. Tubes pour chromatographie, en verre (diamètre intérieur: 22 mm,
longueur: 300 mm), avec robinetde t éflon etréservoir de 250 ml.
4.5. Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon à fond rond de
500 ml.
4.6. Fioles coniques de 500 ml, à bouchon rodé.
4.7. Appareillage pour chromatographie sur couche mince.
4.8. Plaques de verre pour chromatographie sur couche mince,
200 × 200 mm, préparées comme suit (les quantités indiquées
conviennentpour recouvrir cinq plaques): int roduire 30 g de gel
de silice G-HR (3.15) dans une fiole conique, ajouter 60 ml d'eau,
boucher et agiter une minute. Étendre la suspension sur les plaques
de manière à obtenir une couche uniforme de 0,25 mm d'épaisseur.
Laisser sécher à l'air et conserver ensuite dans un dessicateur muni
de gel de silice. Au momentde l'emploi, act iver les plaques en les
maintenant durant 1 heure dans l'étuve à 110 ºC.
Les plaques prêtes à l'emploi conviennent dans la mesure où elles
donnent des résultats semblables à ceux des plaques préparées
comme indiqué ci-dessus.
4.9. Lampe UV à ondes longues (360 nm). L'intensité d'irradiation doit
permettre de distinguer encore nettement une tache de 1,0 ng d'afla-
toxine B1sur une plaque pour chromatographie sur couche mince, à
une distance de 10 cm de la lampe.
4.10. Tubes de 10 ml, gradués, avec bouchons de polyéthylène.
4.11. Spectrophotomètre UV.
4.12. Fluorodensitomètre (éventuellement).
5. Mode opératoire
5.1. Préparation de l'échantillon (voir observations, partie C, point 1)
Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un
tamis à mailles de 1 mm (conforme à la recommandation ISO R
565).
5.2. Extraction
Introduire 50,0 g de l'échantillon moulu et homogénéisé dans une
fiole conique de 500 ml (4.6). Ajouter 25 g de terre de diatomées
(3.14), 25 ml d'eau et250 ml de chloroforme (3.2). Boucher le
flacon, secouer ou agiter durant 30 minutes à l'aide de l'appareil
(4.2) et filtrer sur filtre plissé (4.3). Éliminer les 10 premiers ml
de filtrat et recueillir ensuite 50 ml.
5.3. Purification sur colonne
Munir l'extrémité inférieure d'un tube pour chromatographie (4.4)
d'un tampon de coton ou de laine de verre (3.9), remplir les deux
tiers du tube de chloroforme (3.2) et ajouter 5 g de sulfate de
sodium (3.10).
Vérifier que la surface supérieure de la couche de sulfate de
sodium est plane puis ajouter par petites fractions 10 g de gel de
silice (3.8). Remuer avec précaution après chaque addition pour1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 4
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éliminer les bulles d'air. Laisser déposer durant15 minut es et
ajouter ensuite avec précaution 15 g de sulfate de sodium (3.10).
Laisser descendre le liquide jusqu'à proximité immédiate de la
surface supérieure de la couche de sulfate de sodium.
Mélanger les 50 ml d'extrait recueillis en 5.2 à 100 ml de n-hexane
(3.3) et transvaser quantitativement le mélange dans la colonne.
Laisser descendre le liquide jusqu'à la surface supérieure de lacouche de sulfate de sodium. Éliminer le liquide écoulé. Ajouter
ensuite 100 ml d'éther diéthylique (3.5) et laisser à nouveau
descendre le liquide jusqu'à la surface supérieure de la couche de
sulfate de sodium. Au cours de ces opérations, veiller que le débit
d'écoulementsoitde 8 à 12 ml par minut e etque la colonne ne soit
pas mise à sec. Éliminer les liquides écoulés. Éluer ensuite par
150 ml du mélange chloroforme/méthanol (3.7) et recueillir la tota-
lité de l'éluat.
Évaporer celui-ci presque à sec, sous un courantde gaz inert e
(3.11) et à une température ne dépassant pas 50 ºC, au moyen de
l'appareil rotatif à évaporation sous vide (4.5). Amener quantitative-
mentle résidu à l'aide de chloroforme (3.2) ou du mélange
benzène/acétonitrile (3.6) dans un tube de 10 ml (4.10). Concentrer
la solution sous un courant de gaz inerte (3.11) et amener ensuite le
volume à 2,0 ml à l'aide de chloroforme (3.2) ou du mélange
benzène/acétonitrile (3.6).
5.4. Chromatographie sur couche mince
Déposer ponctuellement sur une plaque pour chromatographie sur
couche mince (4.8), à 2 cm du bord inférieur età des int ervalles
de 2 cm, les volumes indiqués ci-après de la solution étalon et de
l'extrait:
— 10, 15, 20, 30 et 40 µl de la solution étalon d'aflatoxine B
1(3.16);
— 10 µl de l'extrait obtenu en 5.3 et, ensuperpositionsurlemême
point, 20 µl de la solution étalon (3.16);
— 10 et 20 µl de l'extrait obtenu en 5.3.
Développer le chromatogramme à l'abri de la lumière, à l'aide de
l'un des solvants de développement (3.18). Le choix du solvant
doit être établi au préalable en déposant sur la plaque 25 µl de la
solution étalon qualitative (3.17) et en s'assurant que, lors du déve-
loppement, les aflatoxines B1etB2sontcomplèt ementséparées.
Laisser évaporer les solvants à l'abri de la lumière et irradier
ensuite par la lumière UV en plaçant la plaque à 10 cm de la lampe
(4.9). Les taches d'aflatoxine B1donnentune fluorescence bleue.
5.5. Déterminations quantitatives
Procéder aux déterminations soit visuellement, soit par fluorodensi-
tométrie comme indiqué ci-après:
5.5.1. Mesures visuelles
Déterminer la quantité d'aflatoxine B1de l'extrait en comparant
l'intensité de fluorescence des taches de l'extrait à celle des taches
de la solution étalon. Interpoler si nécessaire. La fluorescence
obtenue par superposition de l'extrait à l'étalon doit être plus forte
que celle des 10 µl d'extrait et elle ne doit donner lieu qu'à la
perception d'une seule tache. Si l'intensité de fluorescence donnée
par les 10 µl d'extrait est plus forte que celle des 40 µl de solution
étalon, diluer l'extrait 10 ou 100 fois par du chloroforme (3.2) ou
par le mélange benzène/acétonitrile (3.6) avant de le soumettre à
une nouvelle chromatographie sur couche mince.
5.5.2. Mesures par fluorodensitométrie
Mesurer l'intensité de fluorescence des taches d'aflatoxine B1au
fluorodensitomètre (4.12) en utilisant une longueur d'onde d'excita-
tion de 365 nm et une longueur d'onde d'émission de 443 nm.
Déterminer la quantité d'aflatoxine B1des dépôts de l'extrait en
comparant les intensités de fluorescence des taches de l'extrait et
de la solution étalon.
5.6. Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B1
Confirmer l'identité de l'aflatoxine B1de l'extrait par les procédés
ci-après:1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 5
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5.6.1. Traitement par l'acide sulfurique
Pulvériser de l'acide sulfurique (3.13) sur le chromatogramme
obtenu en 5.4. La fluorescence des taches d'aflatoxine B1doitvirer
du bleu au jaune sous irradiation UV.
5.6.2. Chromatographie bidimensi onnelle impliquantla
formation d'aflatoxine B1— hémiacétal (aflatoxine B2a)
NB: Les opérations décrites ci-après doivent être effectuées en
suivantle schéma présent é dans la figure 3.
5.6.2.1. Application des solutions
Tracer sur une plaque (4.8) deux droites parallèles à deux côtés
contigus (à des distances de 6 cm de ces côtés), destinées à déli-
miter la migration des fronts de solvants. Déposer sur une plaque
à l'aide de pipettes capillaires ou de microseringues les solutions
indiquées ci-après:
—au point A: un volume d'extrait purifié de l'échantillon obtenu
en 5.3, contenant 2,5 nanogrammes environ d'aflatoxine B1;
—aux points B et C: 25 µl de la solution étalon (3.16).
5.6.2.2. Dével oppement
Développer le chromatogramme dans la direction I à l'aide du
solvantde développement(3.18.1) [couche de 1 cm dans une cuve
non saturée], à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le front de
solvant atteigne la ligne de délimitation. Retirer la plaque de la
cuve etlaisser sécher durantcinq minut es à l'abri de la lumière et
à la température ambiante. Pulvériser ensuite de l'acide chlorhy-
drique (3.12) sur une bande de 2,5 cm de hauteur couvrant les
points A et B (indiquée en traits hachurés dans la fig. 3), jusqu'à
assombrissement, en protégeant le reste de la plaque par une feuille
de verre. Laisser réagir durant dix minutes à l'obscurité et sécher à
l'aide d'un courant d'air à la température ambiante.
Développer ensuite le chromatogramme dans la direction II à l'aide
du solvantde développement(3.18.1) [couche de 1 cm dans une
cuve non saturée], à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le front de
solvant atteigne la ligne de délimitation. Retirer la plaque de la
cuve et laisser sécher à la température ambiante.
5.6.2.3. Interprétation du chromatogramme
Examiner le chromatogramme sous lumière UV (4.9) et vérifier les
observations indiquées ci-après:
a) Apparition d'une tache fluorescente bleue d'aflatoxine B1prove-
nant de la solution étalon déposée en C (migration dans la
direction I).
b) Apparition d'une tache fluorescente bleue d'aflatoxine B1(n'ayantpas réagi avec l'acide chlorhydrique) etd'une t ache
fluorescente bleue plus intense d'aflatoxine B1-hémiacétal,
provenant de la solution étalon déposée en B (migration dans
la direction II).
c) Apparition de taches similaires à celles indiquées sous b),
provenant de l'extrait de l'échantillon déposé en A. L'emplace-
ment de ces taches est défini par la distance de migration de
l'aflatoxine B1à partir du point A dans la direction I (même
distance que celle parcourue par l'étalon déposé en C) suivie
des distances de migration parcourues dans la direction II par
l'aflatoxine B1(n'ayantpas réagi avec l'acide chlorhydrique) et
par l'aflatoxine B1-hémiacétal (mêmes distances que celles
parcourues par l'étalon déposé en B). Les intensités de fluores-
cence des taches d'hémiacétal provenant de l'extrait et de
l'étalon déposé en B devraient correspondre.
6. Calcul des résultats
6.1. À partir de mesures visuelles
La teneur en microgrammes d'aflatoxine B1par kilogramme
d'échantillon (ppb) est donnée par la formule
S/C1Y/C1V
W /C1X1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 6
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dans laquelle:
Y et X sont respectivement les volumes en microlitres de solution
étalon d'aflatoxine B1(3.16) et de l'extrait, ayant une intensité de
fluorescence semblable;
S = concentration en microgrammes d'aflatoxine B1par ml de la
solution étalon (3.16);
V = volume final de l'extrait en microlitres, compte tenu des
dilutions éventuelles;
W = poids en grammes de la prise d'essai correspondantau
volume d'extrait soumis à la purification sur colonne.
6.2. À partir des mesures fluorodensitométriques
La teneur en microgrammes d'aflatoxine B1par kilogramme
d'échantillon (ppb) est donnée par la formule
S/C1V
W /C1Y
dans laquelle:
Y = volume en microlitres de l'extrait déposé sur la plaque (10
ou 20 µl);
S = quantité en nanogrammes d'aflatoxine B1du dépôtde
l'extrait (compte tenu du volume Y), déduite des détermina-
tions;
V = volume final de l'extrait en microlitres, compte tenu des
dilutions éventuelles;
W = poids en grammes de la prise d'essai, correspondantau
volume d'extrait soumis à la purification sur colonne.
7. Préparation et contrôle de la solution étalon (3.16)
7.1. Détermination de la concentration en aflatoxine B1
Préparer une solution d'aflatoxine B1étalon dans le chloroforme
(3.2) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (3.6) dont la concen-
tration est de 8 à 10 µg par millilitre. Déterminer le spectre
d'absorption entre 330 et 370 nm à l'aide du spectrophotomètre
(4.11).
Relever la densité optique (A) à 363 nm dans le cas de la solution
chloroformique; à 348 nm dans le cas de la solution dans le
mélange benzène/acétonitrile.
Calculer la concentration en microgrammes d'aflatoxine B1par
millilitre de solution à partir des formules ci-après:
312 /C1A/C11000
20 600pour la solution chloroformique;
312 /C1A/C11000
19 800pour la solution dans le mélange benzène/acétoni-
trile.
Effectuer à l'abri de la lumière les dilutions convenables pour
obtenir une solution étalon de travail dont la concentration en afla-
toxine B1estde 0,1 µg environ par millilit res. Conservée en
réfrigérateur à 4 ºC, cette solution est stable durant deux semaines.
7.2. Contrôle de la pureté chromatographique
Déposer sur une plaque (4.8) 5 µl de la solution étalon à 8 — 10 µg
d'aflatoxine B1par millilitre (voir 7.1). Développer le chromato-
gramme comme indiqué en 5.4. Sous lumière UV, la fluorescence
ne doit donner lieu qu'à la perception d'une seule tache et aucune
fluorescence ne doitêt re perçue dans la zone du dépôtd'origine.1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 7
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8. Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles
effectuées sur le même échantillon par le même analyste ne devrait
pas dépasser:
— 25 pour cent du résultat le plus élevé pour les teneurs en aflato-
xine B1de 10 à 20 µg/kg,
— 5 µg, en valeur absolue, pour les teneurs de 20 à 50 µg/kg,
— 10 pour cent du résultat le plus élevé pour les teneurs supé-
rieures à 50 µg/kg.
9. Reproductibilité
Voir observations, partie C, point 2,
B. MÉTHODE PAR CHROMATOGRAPHIE BIDIMENSIONNELLE SUR
COUCHE MINCE
1. Objet et domaine d'application
La méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B1des
aliments des animaux qui ne tombent pas dans le domaine d'appli-
cation de la méthode A. La limite inférieure du dosage est de
0,01 mg/kg (10 ppb). La méthode ne s'applique pas aux aliments
contenant des pulpes d'agrumes.
2. Principe
L'échantillon est soumis à l'extraction par du chloroforme. L'extrait
est filtré, une partie aliquote en est prélevée et purifiée par chroma-
tographie sur colonne de gel de silice. L'éluat est évaporé et le
résidu estrepris par un volume dét erminé de chloroforme ou d'un
mélange de benzène et d'acétonitrile. Une partie aliquote de cette
solution est soumise à la chromatographie bidimensionnelle sur
couche mince. La quantité d'aflatoxine B1estdét erminée sous irra-
diation UV du chromatogramme soit visuellement, soit par
fluorodensitométrie, par comparaison avec des quantités connues
d'aflatoxine B1-étalon. L'identité de l'aflatoxine B1extraite de l'ali-
mentdoitêt re confirmée par le procédé indiqué.
3. Réactifs
NB: Tous les réactifs doivent être de qualité «pour analyse» dans
la mesure où aucune autre indication n'est donnée.
3.1. Acétone.
3.2. Chloroforme, stabilisé par 0,5 à 1,0 pour cent d'éthanol à 96 pour
cent(v/v).
3.3. n-Hexane.
3.4. Méthanol.3.5. Éther diéthylique anhydre, exempt de peroxydes.
3.6. Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v).
3.7. Mélange de chloroforme (3.2) etde mét hanol (3.4): 97/3 (v/v).3.8. Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granulométrie:
0,05 à 0,20 mm.
3.9. Coton hydrophile, préalablement extrait par le chloroforme, ou
laine de verre.
3.10. Sulfate de sodium, anhydre, granulé.
3.11. Gaz inerte, par exemple: azote.3.12. Acide chlorhydrique 1 N.
3.13. Terre de diatomées (Hyflosupercel), lavée à l'acide.
3.14. Gel de silice G-HR ou équivalent, pour chromatographie sur
couche mince.
3.15. Solvants de développement.
3.15.1. Éther diéthylique (3.5)/méthanol (3.4)/eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cuve
saturée.1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
3.15.2. Chloroforme (3.2)/acétone (3.1): 9/1 (v/v), cuve non saturée.
3.16. Solution étalon à 0,1 µg environ d'aflatoxine B1par millilitre dans
le chloroforme (3.2) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (3.6),
préparée et contrôlée comme indiqué sous le point 7 de la méthode
A.
4. Appareillage
Voir point4 de la mét hode A.
5. Mode opératoire
5.1. Préparation de l'échantillon/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150voir points 5.1, 5.2 et 5.3 de la
méthode A.5.2. Extraction
5.3. Purification sur colonne
5.4. Chromatographie bidimensionnelle sur couche mince
5.4.1. Application des solutions (suivre le schéma présenté dans la
figure 1)
Tracer sur une plaque (4.8) deux droites parallèles à deux côtés
contigus (à des distances respectives de 5 et 6 cm de ces côtés),
destinées à délimiter la migration des fronts de solvants. Déposer
sur la plaque à l'aide de pipettes capillaires ou de microseringues
les solutions indiquées ci-après:
—au point A, 20 µl de l'extrait purifié de l'échantillon, obtenu en
5.3,
—au point B, 20 µl de la solution étalon (3.16),
—au point C, 10 µl de la solution étalon (3.16),
—au point D, 20 µl de la solution étalon (3.16),
—au point E, 40 µl de la solution étalon (3.16).
Sécher à l'aide d'un léger courantd'air ou de gaz inert e (3.11). Les
taches obtenues doivent avoir un diamètre de 5 mm environ.
5.4.2. Dével oppement (suivre le schéma présenté dans la figure 1)
Développer le chromatogramme dans la direction I à l'aide du
solvantde développement(3.15.1) [couche de 1 cm dans une cuve
saturée], à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le front de solvant
atteigne la ligne de délimitation. Retirer la plaque de la cuve et
laisser sécher durantquinze minut es au moins à l'abri de la lumière
et à la température ambiante.
Développer ensuite le chromatogramme dans la direction II à l'aide
du solvantde développement(3.15.2) [couche de 1 cm dans une
cuve non saturée], à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le front de
solvant atteigne la ligne de délimitation. Retirer la plaque de la
cuve etlaisser sécher à l'abri de la lumière età la t empérat ure
ambiante.
5.4.3. Interprétation du chromatogramme (suivre le schéma
présenté dans la figure 2)
Irradier le chromatogramme par la lumière UV en plaçant la plaque
à 10 cm de la lampe (4.9). Localiser l'emplacementdes t aches de
fluorescence bleue B, C, D etE d'aflat oxine B
1provenantde la
solution étalon et tracer deux droites imaginaires passant par ces
taches et perpendiculaires aux directions de développement. Le
point d'intersection P de ces droites est l'emplacement où l'on
devrait s'attendre à trouver la tache d'aflatoxine B1provenantde
l'extrait de l'échantillon déposé en A (figure 1). Toutefois, l'empla-
cement réel de cette tache peut se trouver en un point Q situé à
l'intersection de deux droites imaginaires formant entre elles un
angle de 100 degrés environ etpassantrespect ivementpar les
taches B et C. Déterminer la quantité d'aflatoxine B1de l'extrait
de l'échantillon comme indiqué en 5.5.
5.4.4. Chromatographie complémentaire
Tracer sur une nouvelle plaque (4.8) deux droites parallèles à deux
côtés contigus, comme indiqué dans le schéma de la figure 1, et
déposer au pointA (voir figure 1) 20 µl de l'ext raitpurifié de
l'échantillon obtenu en 5.3 et, ensuperposition, 20 µl de la solution1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
étalon (3.16). Développer comme indiqué en 5.4.2. Irradier le chro-
matogramme par la lumière UV (4.9) et vérifier que:
— les taches d'aflatoxine B1de l'extrait et de la solution étalon se
superposent,
— la fluorescence de cette tache est plus intense que celle de la
tache d'aflatoxine B1développée au pointQ de la première
plaque.
5.5. Déterminations quantitatives
Procéder aux déterminations soit visuellement, soit par fluorodensi-
tométrie comme indiqué ci-après:
5.5.1. Mesures visuelles
Déterminer la quantité d'aflatoxine B1de l'extrait en comparant
l'intensité de fluorescence de la tache de l'extrait à celle des taches
C, D et E de la solution étalon. Interpoler si nécessaire. Si l'inten-
sité de fluorescence donnée par les 20 µl d'extraitest plus forte que
celle des 40 µl de solution étalon, diluer l'extrait 10 ou 100 fois par
du chloroforme (3.2) ou par le mélange benzène/acétonitrile (3.6)
avant de le soumettre à une nouvelle chromatographie sur couche
mince.
5.5.2. Mesures par fluorodensitométrie
Mesurer l'intensité de fluorescence des taches d'aflatoxine B1au
fluorodensitomètre (4.12) en utilisant une longueur d'onde d'excita-
tion de 365 nm et une longueur d'onde d'émission de 443 nm.
Déterminer la quantité d'aflatoxine B1du dépôtde l'ext raiten
comparant l'intensité de fluorescence de la tache de l'extrait à celle
des taches C, D et E de la solution étalon.
5.6. Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B1
Voir point5.6 de la mét hode A.
6. Calcul des résultats
Voir point6 de la mét hode A.
7. Répétabilité
Voir point8 de la mét hode A.
8. Reproductibilité
Voir observations, partie C, point 2.
C. OBSERVATIONS CONCERNANT LES MÉTHODES A ET B
1.Dégraissage
Les échantillons contenant plus de 5 pour cent de matières grasses doivent
être dégraissés par de l'éther de pétrole (éb. 40 — 60 ºC) après la préparation
indiquée en 5.1. Dans ces cas, les résultats d'analyse doivent être rapportés au
poids de l'échantillon non dégraissé.
2.Reproductibilité des résultats
La reproductibilité des résultats, c'est-à-dire la variation entre les résultats
obtenus par deux ou plusieurs laboratoires sur le même échantillon, a été
évaluée à:
± 50 pour cent de la valeur moyenne des résultats pour les valeurs moyennes
en aflatoxine B1de 10 à 20 µg/kg;
± 10 µg/kg à partir de la valeur moyenne pour les valeurs moyennes de 20 à
50 µg/kg;
± 20 pour centde la valeur moyenne pour les valeurs moyennes supérieures à
50 µg/kg.1976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
ANNEXE
Figure 1
Figure 21976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Figure 31976L0372 — FR — 19.08.1981 — 001.001 — 12