1991R2568 — FR — 11.10.2016 — 030.001

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▼B

RÈGLEMENT (CEE) No 2568/91 DE LA COMMISSION

du 11 juillet 1991

►C1 relatif aux caractéristiques des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi qu'aux méthodes d'analyse y afférentes ◄







▼M20

Article premier

1. Sont considérées comme huiles d'olive vierges, au sens du point 1 a), et b) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, les huiles dont les caractéristiques respectives sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, points 1 et 2, du présent règlement.

2. Est considérée comme huile d'olive lampante, au sens du point 1 c) de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 3, du présent règlement.

3. Est considérée comme huile d'olive raffinée, au sens du point 2 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 4, du présent règlement.

4. Est considérée comme huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huiles d'olive vierges, au sens du point 3 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 5, du présent règlement.

5. Est considérée comme huile de grignons d'olive brute, au sens du point 4 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 6, du présent règlement.

6. Est considérée comme huile de grignons d'olive raffinée, au sens du point 5 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 7, du présent règlement.

7. Est considérée comme huile de grignons d'olive, au sens du point 6 de l'annexe du règlement no 136/66/CEE, l'huile dont les caractéristiques sont conformes à celles indiquées à l'annexe I, point 8, du présent règlement.

▼M26

Article 2

1. Les caractéristiques des huiles définies à l'annexe I sont déterminées selon les méthodes d'analyse suivantes:

a) pour la détermination des acides gras libres, exprimés en pourcentage d'acide oléique, la méthode figurant à l'annexe II;

b) pour la détermination de l'indice de peroxyde, la méthode figurant à l'annexe III;

c) pour la détermination de la teneur en cires, la méthode figurant à l'annexe IV;

d) pour la détermination de la composition et de la teneur en stérols et en diols triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire, la méthode figurant à l’annexe V;

e) pour la détermination du pourcentage de 2-glycéril monopalmitate, la méthode figurant à l’annexe VII;

f) pour l'analyse spectrophotométrique, la méthode figurant à l'annexe IX;

▼M28

g) pour la détermination de la composition en acides gras, la méthode figurant à l'annexe X;

▼M26

h) pour la détermination des solvants halogénés volatils, la méthode figurant à l'annexe XI;

i) pour l'évaluation des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges, la méthode figurant à l'annexe XII;

j) pour la détermination des stigmastadiènes, la méthode figurant à l'annexe XVII;

k) pour la détermination de la composition des triglycérides à ECN 42, la méthode figurant à l'annexe XVIII;

▼M28

l) pour la détermination du contenu en alcools aliphatiques et triterpéniques, la méthode figurant à l'annexe XIX;

▼M26

m) pour la détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques ou éthyliques d'acides gras, la méthode figurant à l'annexe XX.

▼M28 —————

▼M26

2. La vérification par les autorités nationales ou leurs représentants des caractéristiques organoleptiques des huiles d'olive vierges est réalisée par des jurys de dégustateurs agréés par les États membres.

Les caractéristiques organoleptiques d'une huile d'olive visée au premier alinéa sont considérées comme conformes à la catégorie d'huile d'olive déclarée, si un jury agréé par l'État membre concerné confirme le classement à cet égard.

Dans le cas où le jury agréé ne confirme pas la catégorie déclarée en ce qui concerne les caractéristiques organoleptiques, les autorités nationales ou leurs représentants font procéder sans tarder, à la demande de l'intéressé, à deux contre-analyses par d'autres jurys agréés, dont au moins une est effectuée par un jury agréé par l'État membre producteur concerné. Les caractéristiques en question sont considérées comme conformes à celles qui sont déclarées si les deux contre-analyses confirment le classement déclaré. Dans le cas contraire, les frais des contre-analyses sont à la charge de l'intéressé.

3. Pour la vérification des caractéristiques des huiles par les autorités nationales ou leurs représentants suivant les dispositions du paragraphe 1, le prélèvement des échantillons s'effectue conformément aux normes internationales EN ISO 661 et EN ISO 5555 concernant respectivement la préparation des échantillons pour essai et l'échantillonnage. Toutefois, par dérogation au point 6.8 de la norme EN ISO 5555, dans le cas de lots desdites huiles, en conditionnement primaire, le prélèvement des échantillons s'effectue conformément à l'annexe I bis du présent règlement. Dans le cas des huiles en vrac où l’échantillonnage ne peut être réalisé conformément à la norme EN ISO 5555, les échantillons sont prélevés conformément aux instructions fournies par l’autorité compétente de l’État membre.

Sans préjudice des dispositions de la norme EN ISO 5555 et du chapitre 6 de la norme EN ISO 661, les échantillons sont mis à l’abri de la lumière et des fortes chaleurs dans les plus brefs délais et sont envoyés au laboratoire pour les analyses au plus tard le cinquième jour ouvrable suivant celui de leur prélèvement, ou bien sont conservés de manière à éviter leur dégradation ou leur endommagement lors du transport ou du stockage avant d'être envoyés au laboratoire.

4. Aux fins de la vérification prévue au paragraphe 3, les analyses visées aux annexes II, III, IX, XII et XX, ainsi que, le cas échéant, les contre-analyses requises en vertu de la législation nationale, sont effectuées, dans le cas des produits conditionnés, avant la date de durabilité minimale. En cas d'échantillonnage d'huiles en vrac, ces analyses sont effectuées au plus tard le sixième mois suivant celui du prélèvement.

Aucun délai ne s'applique pour les autres analyses prévues par ledit règlement.

Sauf si l'échantillon a été prélevé moins de deux mois avant la date de durabilité minimale, lorsque les résultats des analyses ne correspondent pas aux caractéristiques de la catégorie d'huile d'olive ou de grignons d'olive déclarée, l'intéressé en est informé au plus tard un mois avant la fin du délai visé au premier alinéa.

5. Pour la détermination des caractéristiques des huiles d'olive par les méthodes prévues au paragraphe 1, premier alinéa, les résultats des analyses sont directement comparés avec les limites fixées par le présent règlement.

▼M25

Article 2 bis

1. Aux fins du présent article, on entend par «huile d’olive commercialisée», la quantité totale d’huile d’olive et d’huile de grignons d’olive d’un État membre qui est consommée dans cet État membre ou exportée à partir de cet État membre.

2. Les États membres veillent à ce que des contrôles de conformité soient réalisés de manière sélective, sur la base d’une analyse de risques et à une fréquence appropriée, afin de garantir que l’huile d’olive commercialisée correspond à la catégorie déclarée.

3. Les critères d’évaluation du risque peuvent porter sur:

a) la catégorie de l’huile, la période de production, le prix des huiles par rapport à celui des autres huiles végétales, les opérations de mélange et de conditionnement, les installations et conditions de stockage, le pays d’origine, le pays de destination, le moyen de transport ou le volume du lot;

b) la position des opérateurs dans la chaîne de commercialisation, le volume et/ou la valeur, ainsi que la gamme de catégories d’huiles qu’ils commercialisent, le type d’activité économique menée telle que le pressage, le stockage, le raffinage, le mélange, le conditionnement ou la vente au détail;

c) les constatations faites lors des contrôles précédents, notamment en ce qui concerne le nombre et le type d’irrégularités constatés, la qualité habituelle des huiles commercialisées et le niveau de performance de l’équipement technique utilisé;

d) la fiabilité des systèmes d’assurance qualité des opérateurs ou de leurs systèmes d’autocontrôle, au regard de la conformité aux normes de commercialisation;

e) le lieu où le contrôle est effectué, en particulier s’il s’agit du premier point d’entrée dans l’Union, du dernier point de sortie de l’Union ou du lieu où les huiles sont produites, conditionnées, chargées ou vendues au consommateur final;

f) toute autre information susceptible d’indiquer un risque de non-conformité.

4. Les États membres arrêtent à l’avance:

a) les critères d’évaluation du risque de non-conformité des lots;

b) sur la base d’une analyse des risques portant sur chaque catégorie de risques, le nombre minimal d’opérateurs ou de lots et/ou les quantités minimales qu’il y a lieu de soumettre à un contrôle de conformité.

Au moins un contrôle annuel de conformité est effectué pour mille tonnes d’huile d’olive commercialisée dans l’État membre.

5. Les États membres vérifient la conformité:

a) en procédant, dans n’importe quel ordre, aux analyses prévues à l’annexe I, ou

b) dans l’ordre prévu par l’arbre décisionnel figurant à l’annexe I ter, jusqu’à aboutir à l’une des décisions prévues par ledit arbre.

▼M19 —————

▼M25

Article 3

Lorsqu’il est constaté qu’une huile ne correspond pas à la description de sa catégorie, les États membres concernés appliquent, sans préjudice d’autres sanctions éventuelles, des sanctions effectives, proportionnées et dissuasives arrêtées en fonction de la gravité de l’irrégularité constatée.

Si les contrôles font apparaître des irrégularités importantes, les États membres renforcent la fréquence des contrôles portant sur le stade de commercialisation, la catégorie de l’huile, son origine ou d’autres critères.

▼M5

Article 4

▼M19

1. Aux fins de l'appréciation et du contrôle par les autorités nationales ou leur représentant des caractéristiques organoleptiques, les États membres peuvent agréer des jurys de dégustateurs.

Les conditions d'agrément sont établies par les États membres, notamment de façon à:

— répondre aux conditions de l'annexe XII, point 4.

— assurer que la formation du chef du jury soit effectuée par un établissement et dans des conditions, reconnus à cet effet par l'État membre.

— soumettre la validité de l'agrément aux résultats des performances obtenues dans le cadre d'un système de contrôle annuel institué par l'État membre.

Chaque État membre communique à la Commission la liste des jurys agréés ainsi que les mesures prises en conformité avec le présent paragraphe.

▼M5

2. Au cas où un État membre rencontre des difficultés pour instituer un jury de dégustateurs sur son territoire, il peut recourir à un jury de dégustateurs agréé dans un autre État membre.

3. Chaque État membre établit la liste des jurys de dégustateurs institués par des organisations professionnelles ou interprofessionnelles conformément aux conditions décrites au paragraphe 1 et veille au respect de ces conditions.

▼M19 —————

▼B

Article 6

1. La teneur en huile des grignons et des autres résidus de l'extraction de l'huile relevant des codes NC 2306 90 11 et 2306 90 19 est déterminée conformément à la méthode figurant à l'annexe XV.

2. la teneur en huile visée au paragraphe 1 est exprimée en pourcentage de son poids rapporté à celui de la matière sèche.

▼M20

Article 7

Les dispositions communautaires concernant la présence de contaminants sont applicables.

En ce qui concerne la teneur en solvants halogénés les limites pour toutes les catégories d'huiles d'olive sont les suivantes:

— teneur maximale de chaque solvant halogéné détecté: 0,1 mg/kg,

— teneur maximale de la somme des solvants halogénés détectés: 0,2 mg/kg

▼M25

Article 7 bis

Les personnes et groupes de personnes physiques ou morales qui détiennent, à quelque titre que ce soit, pour l’exercice de leur profession ou à des fins commerciales, de l’huile d’olive et de l’huile de grignons d’olive, depuis le stade de l’extraction au pressoir jusqu’à l’embouteillage inclus, sont tenus de tenir des registres d’entrée et de sortie pour chaque catégorie de ces huiles.

Les États membres veillent à ce que l’obligation prévue au premier paragraphe soit respectée.

▼M25

Article 8

1. Les États membres communiquent à la Commission les mesures qui mettent en œuvre le présent règlement. Ils informent la Commission de toute modification ultérieure de ces mesures.

2. Le 31 mai de chaque année au plus tard, les États membres transmettent à la Commission un rapport sur l’application du présent règlement au cours de l’année civile écoulée. Ce rapport contient au moins les résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d’olive, présentés suivant les tableaux figurant à l’annexe XXI.

3. Les notifications visées dans le présent règlement sont effectuées conformément au règlement (CE) no 792/2009 de la Commission ( 1 ).

▼B

Article 9

Le règlement (CEE) no 1058/77 est abrogé.

Article 10

1. Le présent règlement entre en vigueur le jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. Toutefois, la méthode reprise à l'annexe XII est mise en application à partir du ►M1 1er novembre 1992 ◄ , sauf en ce qui concerne les opérations liées à l'intervention.

▼M5

Cette méthode ne s'applique pas aux huiles d'olive vierges conditionnées avant le 1er novembre 1992.

▼B

2. Le présent règlement ne s'applique pas aux huiles d'olive et de grignons d'olive conditionnées avant la date d'entrée en vigueur du présent règlement et commercialisées jusqu'au 31 octobre 1992.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.









ANNEXES

Sommaire







Annexe I: Caractéristiques des huiles d'olive Annexe I bis: Échantillonnage des huiles d'olive ou des huiles de grignons d'olive livrées en conditionnement primaire Annexe I ter: Schéma décisionnel pour la vérification de la conformité d'un échantillon d'huile d'olive à la catégorie déclarée Annexe II: Détermination des acides gras libres, méthode à froid Annexe III: Détermination de l'indice de peroxyde Annexe IV: Détermination de la teneur en cires au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire Annexe V: Détermination de la composition et de la teneur en stérols et en diols triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire Annexe VII: ►M21 Détermination du pourcentage du 2-glycéril monopalmitate ◄ ▼M20 ————— ▼B Annexe IX: Analyse spectrophotométrique dans l’ultraviolet ▼M28 Annexe X: Détermination des esters méthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse ▼B Annexe XI: Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils dans l'huile d'olive Annexe XII: Méthode du conseil oléicole international pour l'évaluation organoleptique des huiles d'olive vierges ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Annexe XV: Teneur en huile des grignons d'olive Annexe XVI: Détermination de l'indice d'iode Annexe XVII: Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales Annexe XVIII: Détermination de la différence entre la composition réelle et la composition théorique des triglycérides à ECN 42 Annexe XIX: ►M28 Détermination du contenu en alcools aliphatiques et triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire ◄ ▼M23 Annexe XX: méthode de détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire ▼M28 ————— ▼M25 Annexe XXI: Résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d’olive visés à l’article 8, paragraphe 2

▼M27









ANNEXE I

CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE







Catégorie Esters éthyliques d'acides gras (EEAG) (*) Acidité (%) (*) Indice de peroxyde mEq O2/kg (*) Cires mg/kg (**) 2-glycéril monopalmitate (%) Stigmastadiènes mg/kg (1) Différence: ECN42 (HPLC) et ECN42 (calcul théorique) K232 (*) K268 ou K270 (*) Delta-K (*) Évaluation organoleptique Médiane du défaut (Md) (*) Évaluation organoleptique Médiane du fruité (Mf) (*) 1. Huile d'olive vierge extra EEAG ≤ 40 mg/kg (campagne 2013-2014) (2) EEAG ≤ 35 mg/kg (campagne 2014-2016) EEAG ≤ 30 mg/kg (campagnes postérieures à 2016) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 si % acide palmitique total > 14 % 2. Huile d'olive vierge — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 si % acide palmitique total > 14 % 3. Huile d'olive lampante — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1 si % acide palmitique total > 14 % 4. Huile d'olive raffinée — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 si % acide palmitique total > 14 % 5. Huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huile d'olive vierge — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 si % acide palmitique total ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 si % acide palmitique total > 14 % 6. Huile de grignons d'olive brute — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Huile de grignons d'olive raffinée — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Huile de grignons d'olive — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Somme des isomères qui pourraient (ou pas) être séparés par colonne capillaire. (2) Cette limite s'applique aux huiles d'olive produites à partir du 1er mars 2014. (3) Les huiles dont la teneur en cires est comprise entre 300 et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles d'olive lampantes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est inférieure ou égale à 350 mg/kg ou si la proportion d'érythrodiol et d'uvaol est inférieure ou égale à 3,5 %. (4) La médiane du défaut peut être inférieure ou égale à 3,5 et la médiane du fruité, égale à 0. (5) Les huiles ayant une teneur en cires comprise entre 300 et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles de grignons d'olive brutes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est supérieure à 350 mg/kg et si la proportion d'érythrodiol et d'uvaol est supérieure à 3,5 %.







Catégorie Composition en acides gras (1) Sommes des isomères transoléiques (%) Sommes des isomères translinoléiques + translinoléniques (%) Composition en stérols Stérols totaux (mg/kg) Érythrodiol et uvaol (%) (**) Myristique (%) Linolénique (%) Arachidique (%) Eicosanoïque (%) Béhénique (%) Lignocérique (%) Cholestérol (%) Brassicastérol (%) Campestérol (2) (%) Stigmastérol (%) β-sitostérol app. (3) (%) (**) Delta-7- stigmasténol (2) (%) 1. Huile d'olive vierge extra ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Huile d'olive vierge ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Huile d'olive lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Huile d'olive raffinée ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Huile d'olive composée d'huile d'olive raffinée et d'huile d'olive vierge ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Huile de grignons d'olive brute ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Huile de grignons d'olive raffinée ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Huile de grignons d'olive ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Teneur en autres acides gras (%): palmitique: 7,50-20,00; palmitoléique: 0,30-3,50; heptadécanoïque: ≤ 0,30; heptadécénoïque: ≤ 0,30; stéarique: 0,50-5,00; oléique: 55,00-83,00; linoléique: 2,50-21,00. (2) Voir l'appendice de la présente annexe. (3) β-sitostérol app.: delta-5,23-stigmastadiénol + clérostérol + bêta-sitostérol + sitostanol + delta-5-avenastérol + delta-5,24-stigmastadiénol. (4) Les huiles dont la teneur en cires est comprise entre 300 et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles d'olive lampantes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est inférieure ou égale à 350 mg/kg ou si la proportion d'érythrodiol et d'uvaol est inférieure ou égale à 3,5 %. (5) Les huiles ayant une teneur en cires comprise entre 300 et 350 mg/kg sont considérées comme des huiles de grignons d'olive brutes si leur teneur totale en alcools aliphatiques est supérieure à 350 mg/kg ou si la proportion d'érythrodiol et d'uvaol est supérieure à 3,5 %.

Notes:

a) Les résultats des analyses doivent être exprimés en indiquant le même nombre de décimales que pour les valeurs de chaque caractéristique. Le dernier chiffre doit être augmenté d'une unité si le chiffre suivant dépasse 4.

b) Il suffit qu'une seule caractéristique ne corresponde pas aux valeurs indiquées pour que l'huile change de catégorie ou soit déclarée non conforme quant à sa pureté aux fins du présent règlement.

c) Les caractéristiques marquées d'un astérisque (*), se référant à la qualité de l'huile, indiquent: — dans le cas de l'huile d'olive lampante, qu'il est possible que les deux limites pertinentes diffèrent simultanément des valeurs indiquées; — dans le cas des huiles d'olive vierges, que si au moins une de ces limites diffère des valeurs indiquées, l'huile change de catégorie tout en restant classée dans une des catégories d'huiles d'olive vierges.

d) Les caractéristiques marquées de deux astérisques (**) indiquent, pour tous les types d'huiles de grignons d'olive, qu'il est possible que les deux limites pertinentes diffèrent simultanément des valeurs indiquées.









Appendice

SCHÉMA DÉCISIONNEL

Schéma décisionnel du campestérol pour l'huile d'olive vierge et l'huile d'olive vierge extra:

Les autres paramètres sont conformes aux limites fixées dans le présent règlement.

Schéma décisionnel du delta-7-stigmasténol pour:

— les huiles d'olive vierges et vierges extra —

Les autres paramètres sont conformes aux limites fixées dans le présent règlement.

— les huiles de grignons d'olive (brutes et raffinées) —

▼M26









ANNEXE I bis

ÉCHANTILLONNAGE DES HUILES D'OLIVE OU DES HUILES DE GRIGNONS D'OLIVE LIVRÉES EN CONDITIONNEMENT PRIMAIRE

La présente méthode d’échantillonnage s’applique aux lots d’huile d’olive ou de grignons d’olive en conditionnement primaire. Des méthodes d’échantillonnage différentes s’appliquent selon que le conditionnement primaire dépasse ou non 5 litres.

On entend par «lot», un ensemble d'unités de vente qui sont produites, fabriquées et conditionnées dans des circonstances telles que l'huile contenue dans chacune de ces unités de vente est considérée comme homogène pour toutes les caractéristiques analytiques. L'individualisation d’un lot doit être réalisée conformément à la directive 2011/91/UE du Parlement européen et du Conseil ( 2 ).

On entend par «prélèvement élémentaire», la quantité d’huile contenue dans un conditionnement primaire et prélevée en un point aléatoire du lot.

1. CONTENU D'UN ÉCHANTILLON ÉLÉMENTAIRE

1.1. Conditionnement primaire ne dépassant pas 5 litres

on entend par «échantillon élémentaire», dans le cas d'un conditionnement primaire ne dépassant pas 5 litres, le nombre de prélèvements élémentaires effectués sur un lot et conformes au tableau 1.







Tableau 1 Taille minimale des prélèvements élémentaires Si le conditionnement primaire a une capacité L'échantillon primaire doit être constitué de l'huile provenant de a) égale ou supérieure à 1 litre a) 1 conditionnement primaire; b) inférieure à 1 litre b) le nombre minimal de conditionnements donnant une capacité totale d’au moins 1,0 litre

Le nombre de conditionnements visé au tableau 1, constituant un échantillon primaire, peut être augmenté par chaque État membre, en fonction de ses propres besoins (par exemple, évaluation organoleptique réalisée par un laboratoire différent de celui qui a effectué les analyses chimiques, les contre-analyses, etc.).

1.2. Conditionnement primaire de plus de 5 litres

On entend par «échantillon élémentaire», dans le cas d'un conditionnement primaire de plus de 5 litres, une partie représentative de l'ensemble des prélèvements élémentaires, obtenue par un processus de réduction et conforme au tableau 2. L’échantillon élémentaire doit être composé de plusieurs exemplaires.

On entend par «exemplaire» d’un échantillon élémentaire, chacun des conditionnements composant l’échantillon élémentaire.







Tableau 2 Nombre minimal de prélèvements élémentaires à sélectionner Nombre de conditionnements compris dans le lot Nombre minimal de prélèvements élémentaires à sélectionner Jusqu’à 10 1 Entre … 11 et 150 2 Entre … 151 et 500 3 Entre … 501 et 1 500 4 Entre … 1 501 et 2 500 5 > 2 500 pour 1 000 conditionnements 1 prélèvement élémentaire supplémentaire

Afin de réduire le volume d'échantillonnage des conditionnements primaires, le contenu des prélèvements élémentaires est homogénéisé pour préparer l’échantillon élémentaire. Les fractions des différents prélèvements élémentaires sont versées dans un même conteneur en vue d'une homogénéisation par agitation, de façon à garantir une protection optimale contre l'air.

Le contenu de l'échantillon élémentaire doit être versé dans une série de conditionnements d'une capacité minimale de 1,0 litre, constituant chacun un exemplaire de l’échantillon élémentaire.

Le nombre d'échantillons élémentaires peut être augmenté par chaque État membre, en fonction de ses propres besoins (par exemple, évaluation organoleptique réalisée par un laboratoire différent de celui qui a effectué les analyses chimiques, les contre-analyses, etc.).

Chaque conditionnement doit être rempli de manière à réduire au minimum la couche d’air superficielle, puis convenablement fermé et scellé afin de protéger le produit contre toute falsification.

Ces exemplaires doivent être étiquetés afin de permettre leur identification.

2. ANALYSES ET RÉSULTATS

2.1. Chaque échantillon élémentaire doit être subdivisé en échantillons de laboratoire, conformément au point 2.5 de la norme EN ISO 5555, puis soumis à des analyses dans l’ordre indiqué par le schéma décisionnel figurant à l’annexe IB ou dans un ordre aléatoire.

2.2. Lorsque tous les résultats des analyses concordent avec les caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée, l'ensemble du lot est déclaré conforme. Il suffit qu'un seul résultat d'analyse ne concorde pas avec les caractéristiques de la catégorie d'huile déclarée pour que l'ensemble du lot soit déclaré non conforme.

3. VÉRIFICATION DE LA CATÉGORIE DU LOT

3.1. Afin de vérifier la catégorie du lot, l’autorité compétente peut augmenter le nombre d’échantillons élémentaires prélevés en différents points du lot conformément au tableau suivant:



Tableau 3 Nombre d'échantillons élémentaires, déterminé par la taille du lot Taille du lot (en litres) Nombre d'échantillons élémentaires moins de 7 500 2 entre 7 500 et moins de 25 000 3 entre 25 000 et moins de 75 000 4 entre 75 000 et moins de 125 000 5 125 000 et plus 6 + 1 tous les 50 000 litres supplémentaires Chaque prélèvement élémentaire constituant un échantillon élémentaire doit être prélevé au même endroit dans le lot; il est nécessaire de relever l'emplacement de chaque échantillon élémentaire et de repérer celui-ci sans ambiguïté. Chaque échantillon élémentaire doit être constitué conformément aux procédures visées aux points 1.1 et 1.2. Chaque échantillon élémentaire est ensuite soumis aux analyses visées à l’article 2, paragraphe 1.

3.2. Lorsqu’un des résultats des analyses visées à l’article 2, paragraphe 1, d’au moins un échantillon élémentaire ne correspond pas aux caractéristiques de la catégorie d’huile déclarée, l’ensemble du lot est déclaré non conforme.









ANNEXE I ter

SCHÉMA DÉCISIONNEL POUR LA VÉRIFICATION DE LA CONFORMITÉ D'UN ÉCHANTILLON D'HUILE D'OLIVE À LA CATÉGORIE DÉCLARÉE

Tableau 1

Tableau 2

Tableau 3









Appendice 1







Correspondance entre les annexes du présent règlement et les analyses indiquées dans le schéma décisionnel — Acidité Annexe II Détermination des acides gras libres, méthode à froid — Indice de peroxyde Annexe III Détermination de l'indice de peroxyde — Spectrométrie UV Annexe IX Analyse spectrophotométrique — Évaluation organoleptique Annexe XII Évaluation organoleptique de l'huile d'olive vierge — Esters éthyliques Annexe XX Méthode de détermination de la teneur en cires et en esters méthyliques et éthyliques d'acides gras par chromatographie gazeuse sur colonne capillaire — 3,5-stigmastadiènes Annexe XVII Méthode de détermination des stigamastadiènes dans les huiles végétales ▼M28 — Isomères trans des acides gras Annexe X Détermination des esters méthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse — Teneur en acides gras Annexe X Détermination des esters méthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse ▼M26 — ΔECN42 Annexe XVIII Détermination de la composition des triglycérides à ECN42 (différence entre les résultats en CLHP et composition théorique) — Composition en stérols et stérols totaux — Érythrodiol et uvaol Annexe V Détermination de la composition et de la teneur en stérols et en diols triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire — Cires Annexe IV Détermination de la teneur en cires au moyen de la chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire ▼M28 — Alcools aliphatiques et triterpéniques Annexe XIX Détermination du contenu en alcools aliphatiques et triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse avec colonne capillaire ▼M26 — Acides gras saturés en position 2 Annexe VII Détermination du pourcentage de 2-glycéryl monopalmitate

▼M29









ANNEXE II

DÉTERMINATION DES ACIDES GRAS LIBRES, MÉTHODE À FROID

1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION

Cette méthode décrit la détermination des acides gras libres dans les huiles d'olive et les huiles de grignons d'olive. La teneur en acides gras libres est exprimée par l'acidité calculée en pourcentage de l'acide oléique.

2. PRINCIPE

Mise en solution d'une prise d'essai dans un mélange de solvants, puis titrage des acides gras libres présents à l'aide d'une solution d'hydroxyde de potassium ou d'hydroxyde de sodium.

3. RÉACTIFS

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et l'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté équivalente.

3.1. Éther diéthylique; oxyde diéthylique éthanol à 95 % (V/V), mélange 1-1 en volume. Neutraliser exactement au moment de l'emploi avec la solution d'hydroxyde de potassium (3.2) en présence de 0,3 millilitre de la solution de phénolphtaléine (3.3) pour 100 millilitres de mélange. Note 1: l'oxyde diéthylique est très inflammable et peut former des peroxydes explosifs. Il doit être utilisé en prenant des précautions particulières. Note 2: s'il n'est pas possible d'utiliser l'oxyde diéthylique, un mélange de solvants formé d'éthanol et de toluène peut être utilisé. Si nécessaire, l'éthanol peut être remplacé par le propanol 2.

3.2. Hydroxyde de potassium ou hydroxyde de sodium, solution éthanolique titrée ou solution aqueuse, c(KOH) [ou c(NaOH)] – 0,1 mole par litre environ ou, si nécessaire, c(KOH) [ou c(NaOH)] – 0,5 mole par litre environ. Il existe dans le commerce des solutions prêtes à l'emploi. La concentration exacte de la solution d'hydroxyde de potassium (ou de solution d'hydroxyde de sodium) doit être connue et vérifiée avant l'emploi. Utiliser une solution préparée au moins cinq jours avant emploi et décantée dans un flacon en verre brun fermé avec un bouchon de caoutchouc. La solution doit être incolore ou jaune paille. Si une séparation de phases est observée en utilisant une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium), remplacer la solution aqueuse par une solution éthanolique. Note 3: une solution incolore stable d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) peut être préparée de la façon suivante. Porter et maintenir durant une heure à ébullition à reflux 1 000 millilitres d'éthanol ou d'eau avec 8 grammes d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) et 0,5 gramme de rognures d'aluminium. Distiller immédiatement. Dissoudre dans le distillat la quantité requise d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium). Laisser reposer durant plusieurs jours et décanter le liquide clair surnageant du précipité de carbonate de potassium (ou du carbonate de sodium). La solution peut aussi être préparée sans distillation de la façon suivante: à 1 000 millilitres d'éthanol (ou d'eau), ajouter 4 millilitres de butylite d'aluminium et laisser reposer le mélange durant quelques jours. Décanter le liquide surnageant et y dissoudre la quantité requise d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium). Cette solution est prête pour l'emploi.

3.3. Phénolphtaléine, solution à 10 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V) ou bleu alcalin 6B ou thymolphtaléine, solution à 20 grammes par litre dans l'éthanol à 95-96 % (V/V). Dans le cas d'huiles fortement colorées, du bleu alcalin ou de la thymolphthaléine doit être utilisé.

4. APPAREILLAGE

Matériel courant de laboratoire, et notamment:

4.1. Balance analytique

4.2. Fiole conique de 250 millilitres de capacité

4.3. Burette de 10 millilitres de capacité classe A, graduée en 0,05 millilitre, ou burette automatique équivalente.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de l'échantillon pour essai

Lorsque l'échantillon est trouble, il doit être filtré.

5.2. Prise d'essai

Prélever une prise d'essai, selon l'acidité présumée, d'après les indications du tableau suivant.







Acidité attendue (acidité oléique en g/100 g) Masse de la prise d'essai (en g) Précision de la pesée de la prise d'essai (en g) 0 à 2 10 0,02 > 2 à 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Peser la prise d'essai dans la fiole conique (4.2).

5.3. Détermination

Dissoudre la prise d'essai (5.2) dans 50 à 100 millilitres du mélange oxyde diéthylique/éthanol (3.1), préalablement neutralisé.

Titrer, en agitant, avec la solution d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) à 0,1 mole par litre (3.2) (voir note 4) jusqu'à virage de l'indicateur (la couleur de l'indicateur persistant durant au moins 10 secondes).

Note 4: si la quantité nécessaire de solution d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) à 0,1 mole par litre dépasse 10 millilitres, utiliser une solution à 0,5 mole par litre ou modifier la masse de l'échantillon en fonction de l'acidité libre escomptée et du tableau proposé.

Note 5: si la solution devient trouble pendant le titrage, ajouter une quantité suffisante du mélange de solvants (3.1) pour donner une solution claire.

Effectuer une deuxième détermination uniquement si le premier résultat est supérieur à la valeur limite spécifiée pour la catégorie de l'huile.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

L'acidité, exprimée en pourcentage d'acide oléique, en poids, est égale à:

dans laquelle:

V = volume, en millilitres, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) utilisée;

c = concentration exacte, en moles par litre, de la solution titrée d'hydroxyde de potassium (ou d'hydroxyde de sodium) utilisée;

M = 282 g/mol, masse molaire, en grammes par mole, de l'acide oléique;

m = masse de la prise d'essai, en grammes.

L'acidité oléique est déclarée comme suit:

a) à la deuxième décimale pour les valeurs allant de 0 à 1 compris;

b) à la première décimale pour les valeurs allant de 1 à 100 compris.

▼M30









ANNEXE III

DÉTERMINATION DE L'INDICE DE PEROXYDE

1. Champ d'application

La présente annexe décrit une méthode de détermination de l'indice de peroxyde dans les huiles et matières grasses animales et végétales.

2. Définition

L'indice de peroxyde représente la quantité des substances de l'échantillon (exprimée en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme) qui oxydent l'iodure de potassium dans les conditions de travail décrites.

3. Principe

La prise d'essai en solution dans un mélange acide acétique et chloroforme est traitée par une solution d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré avec une solution de thiosulfate de sodium.

4. Appareillage

Les équipements utilisés doivent être exempts de toute trace de substances oxydantes ou réductrices.

Nota bene: ne pas graisser les surfaces rodées.

4.1. Cuiller en verre de 3 millilitres.

4.2. Fioles d'environ 250 millilitres, avec col et bouchons rodés, séchées au préalable et remplies d'un gaz inerte, sec et pur (azote ou, de préférence, dioxyde de carbone).

4.3. Burette d'une capacité de 5, 10 ou 25 millilitres, avec graduations de 0,05 millilitre au minimum, de préférence avec mise à zéro automatique, ou burette automatique équivalente.

4.4. Balance analytique.

5. Réactifs

5.1. Chloroforme de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

5.2. Acide acétique glacial de qualité analytique, exempt d'oxygène (ce dernier ayant été éliminé par barbotage d'un courant de gaz inerte, sec et pur).

5.3. Iodure de potassium en solution aqueuse saturée de préparation récente, exempte d'iode et d'iodates. Dissoudre environ 14 g d'iodure de potassium dans environ 10 ml d'eau à température ambiante.

5.4. Solution aqueuse de thiosulfate de sodium à 0,01 mole par litre (équivalant à 0,01 N), soigneusement normalisée juste avant l'emploi. Préparer, chaque jour et avant emploi, la nouvelle solution de thiosulfate de sodium à 0,01 mole par litre à partir d'une solution étalon de thiosulfate de sodium à 0,1 mole par litre, ou déterminer la molarité exacte. Comme l'expérience le montre, la stabilité est limitée et dépend de la valeur du pH et de la teneur en dioxyde de carbone libre. Pour la dilution, utiliser exclusivement de l'eau fraîchement portée à ébullition, éventuellement purgée à l'azote. La procédure suivante est recommandée pour déterminer la molarité exacte de la solution de thiosulfate de sodium: peser, à 0,001 g près, 0,27 g à 0,33 g d'iodate de potassium (mKIO3) dans une fiole jaugée (de 250 ml ou 500 ml) et compléter au volume avec de l'eau fraîchement portée à ébullition (V2), refroidie à température ambiante. Au moyen d'une pipette, transvaser 5 ml ou 10 ml de cette solution d'iodate de potassium (V1) dans un Erlenmeyer de 250 ml. Ajouter 60 ml d'eau fraîchement portée à ébullition, 5 ml d'acide chlorhydrique à 4 moles par litre, et 25 à 50 mg d'iodure de potassium ou 0,5 ml de la solution aqueuse saturée d'iodure de potassium. Titrer ensuite cette solution avec la solution de thiosulfate de sodium (V3) pour déterminer la molarité exacte de celle-ci. où: mKIO3 est la masse d'iodate de potassium, en grammes V1 est le volume de la solution d'iodate de potassium, en millilitres (5 ml ou 10 ml) V2 est le volume total de la solution d'iodate de potassium, en millilitres (250 ml ou 500 ml) V3 est le volume de la solution de thiosulfate de sodium, en millilitres wKIO3 est la pureté de l'iodate de potassium, en grammes/100 g MKIO3 est la masse moléculaire de l'iodate de potassium (214 g/mol) T désigne la molarité exacte de la solution de thiosulfate de sodium (mol/l).

5.5. Solution d'amidon (dispersion aqueuse de 10 grammes par litre) récemment préparée à partir d'amidon naturel soluble. Des réactifs équivalents peuvent également être utilisés.

6. Échantillon

Veiller à ce que l'échantillon soit prélevé et stocké hors de la lumière, conservé au frais et enfermé dans des conteneurs de verre remplis entièrement et fermés hermétiquement à l'aide de bouchons de liège ou de verre rodé.

7. Mode opératoire

L'essai doit être réalisé sous une lumière diffuse (lumière du jour) ou artificielle. Dans une cuiller en verre (4.1) ou, à défaut, dans une fiole (4.2), peser, à 0,001 gramme près, une des masses de l'échantillon visées dans le tableau ci-après,en fonction de l'indice de peroxyde prévu.







Indice de peroxyde prévu (en meq) Poids de la prise d'essai (en g) de 0 à 12 de 5,0 à 2,0 de 12 à 20 de 2,0 à 1,2 de 20 à 30 de 1,2 à 0,8 de 30 à 50 de 0,8 à 0,5 de 50 à 90 de 0,5 à 0,3

Déboucher une fiole (4.2) et introduire la cuiller en verre contenant la prise d'essai. Ajouter 10 millilitres de chloroforme (5.1). Dissoudre rapidement la prise d'essai en agitant. Ajouter 15 millilitres d'acide acétique (5.2) puis 1 millilitre de solution d'iodure de potassium (5.3). Remettre le bouchon rapidement, agiter pendant une minute et laisser reposer pendant exactement 5 minutes à l'abri de la lumière et à une température de 15 à 25 °C.

Ajouter environ 75 millilitres d'eau distillée. Titrer l'iode libéré avec la solution de thiosulfate de sodium (5.4) en agitant vigoureusement et en employant la solution d'amidon (5.5) comme indicateur.

Effectuer deux déterminations sur le même échantillon.

Effectuer simultanément un essai à blanc. Si le résultat de ce dernier excède 0,05 millilitre de solution de thiosulfate de sodium 0,01 N (5.4), remplacer les réactifs impurs.

8. Expression des résultats

L'indice de peroxyde (IP), exprimé en milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme, est fourni par la formule:

où:

V = nombre de millilitres de solution de thiosulfate de sodium normalisée (5.4) utilisé pour l'essai, corrigé en fonction des résultats de l'essai à blanc;

T = molarité exacte de la solution de thiosulfate de sodium utilisée (5.4), en mol/l.

m = poids (en grammes) de la prise d'essai.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.

Indiquer le résultat de la détermination à la première décimale.

▼M21









ANNEXE IV

DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN CIRES AU MOYEN DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE AVEC COLONNE CAPILLAIRE

1. OBJET

Cette méthode décrit un procédé pour la détermination de la teneur en cires des huiles d’olive. Les cires sont séparées en fonction du nombre d’atomes de carbone. La méthode peut être employée notamment pour différencier l’huile d’olive de pression de celle d’extraction (huile de grignons).

2. PRINCIPE

La matière grasse, additionnée d’un étalon interne approprié, est fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice hydraté; la fraction éluée en premier dans les conditions de l’essai (à polarité inférieure à celle des triglycérides) est récupérée puis analysée directement par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. MATÉRIEL

3.1. Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Colonne en verre pour chromatographie en phase gazeuse, diamètre intérieur 15,0 mm, hauteur 30 à 40 cm, équipée d’un robinet.

3.3. Appareil de chromatographie en phase gazeuse approprié pour le fonctionnement avec colonne capillaire, équipé d’un système d’introduction directe dans la colonne, constitué par: 3.3.1. Chambre à thermostat pour les colonnes, équipée d’un programmateur de température. 3.3.2. Injecteur à froid pour introduction directe dans la colonne. 3.3.3. Révélateur à ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur. 3.3.4. Enregistreur-intégrateur approprié pour le fonctionnement avec le convertisseur-amplificateur (3.3.3), vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et vitesse de déroulement du papier variable. (Il est également possible d’utiliser des systèmes informatisés qui prévoient l’acquisition des données de chromatographie en phase gazeuse au moyen d’un PC.) 3.3.5. Colonne capillaire en verre ou silice fondue, longueur 8 à 12 m, diamètre intérieur 0,25 à 0,32 mm, recouverte à l’intérieur de liquide de répartition, à l’épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm. (Liquides de répartition adaptés à l’emploi, du type SE52 ou SE 54 dans le commerce.)

3.4. Microseringue pour introduction directe dans la colonne de 10 μl, équipée d’une aiguille cémentée.

3.5. Vibrateur électrique.

3.6. Évaporateur rotatif.

3.7. Four à moufle.

3.8. Balance analytique garantissant une précision de la mesure de ± 0,1 mg.

3.9. Verrerie normale de laboratoire.

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice d’une granulométrie comprise entre 60 et 200 μm. Le gel de silice doit être placé dans le four à 500 °C pendant au moins 4 heures. Après refroidissement, y ajouter 2 % d’eau par rapport à la quantité de gel de silice prélevée. Agiter convenablement afin d’homogénéiser la masse. Conserver à l’obscurité pendant au moins 12 heures avant emploi.

4.2. n-hexane, pour chromatographie.

4.3. Éther éthylique, pour chromatographie.

4.4. n-Heptane, pour chromatographie.

4.5. Solution étalon d’arachidate laurique, solution à 0,1 % (m/V) dans l’hexane (étalon interne). (Il est également possible d’utiliser du palmitate de palmityle ou du stéarate de myristyle) 4.5.1. Soudan 1 (1-phenyl-azo-2-naphthol).

4.6. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.7. Gaz auxiliaires: — hydrogène pur, pour chromatographie en phase gazeuse, — air pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de la colonne chromatographique

Suspendre 15 g de gel de silice (4.1) dans le n-hexane (4.2) et l’introduire dans la colonne (3.2). Après tassement spontané, le compléter à l’aide d’un agitateur électrique (3.5) pour rendre la couche chromatographique plus homogène. Percoler 30 ml de n-hexane afin d’éliminer les impuretés éventuelles. Peser exactement à l’aide de la balance (3.8) 500 mg de l’échantillon dans l’Erlenmeyer de 25 ml (3.1), ajouter la quantité appropriée d’étalon interne (4.5), en fonction du contenu présumé de cires. Par exemple, ajouter 0,1 mg d’arachidate laurique dans le cas de l’huile d’olive et 0,25 à 0,5 mg dans le cas de l’huile de grignons. Transférer l’échantillon ainsi préparé dans la colonne chromatographique à l’aide de deux portions de 2 ml chacune de n-hexane (4.2).

Laisser s’écouler le solvant jusqu’à 1 mm au-dessus du niveau supérieur de l’absorbant puis percoler 70 ml de n-hexane supplémentaires afin d’éliminer les n-alcanes naturellement présents. Commencer alors l’élution chromatographique en recueillant 180 ml du mélange n-hexane/éther éthylique, rapport 99:1, tout en respectant un débit d’environ 15 gouttes toutes les 10 secondes. L’élution de l’échantillon doit être effectuée à une température ambiante de 22 °C ± 4.

Notes:

— Le mélange n-hexane/éther éthylique (99:1) doit être préparé chaque jour.

— Pour contrôler visuellement l’élution correcte des cires, il est possible d’ajouter à l’échantillon en solution 100 μl de soudan à 1 % dans le mélange d’élution. Le colorant ayant une rétention intermédiaire entre les cires et les triglycérides, lorsque la coloration atteint le fonds de la colonne chromatographique, il convient de suspendre l’élution car toutes les cires ont été éluées.

La fraction ainsi obtenue est séchée dans l’évaporateur rotatif (3.6) jusqu’à élimination pratiquement totale du solvant. Les deux derniers ml du solvant sont éliminés à l’aide d’un faible courant d’azote; ajouter ensuite 2-4 ml de n-heptane

5.2. Analyse par chromatographie en phase gazeuse

5.2.1. Opérations préliminaires

Installer la colonne dans le chromatographe en phase gazeuse (3.3), en branchant le terminal d’entrée au système «on-column» et le terminal de sortie au révélateur. Effectuer les contrôles généraux de l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse (tenue des circuits des gaz, efficience du révélateur et du système d’enregistrement, etc.).

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est recommandé de procéder à son conditionnement. Laisser s’écouler un léger débit de gaz à travers la colonne, puis allumer l’appareillage de chromatographie en phase gazeuse. Chauffer graduellement jusqu’à atteindre, au bout d’environ 4 heures, une température de 350 °C. Maintenir cette température pendant au moins 2 heures, puis procéder au réglage de l’appareillage aux conditions de fonctionnement [réglage du débit des gaz, allumage de la flamme, branchement à l’enregistreur électronique (3.3.4), réglage de la température de la chambre pour la colonne, du révélateur, etc.] et enregistrer le signal à une sensibilité au moins 2 fois supérieure à celle prévue pour l’exécution de l’analyse. Le tracé de la ligne de base doit être linéaire, exempt de pics de toute nature, et ne doit pas présenter de déviation.

Une déviation rectiligne négative indique une tenue imparfaite des connexions de la colonne; une déviation positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

5.2.2. Choix des conditions opératoires

D’une manière générale, les conditions opératoires à observer sont les suivantes:

— température de la colonne: —



20 °C/minute 5 °C/minute 20 °C/minute au départ 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— température du révélateur: 350 °C,

— quantité de matière injectée: 1 μl de la solution (2-4 ml) de n-heptane,

— gaz vecteur: hélium ou hydrogène à la vitesse linéaire optimale pour le gaz sélectionné (voir appendice),

— sensibilité instrumentale: en mesure de répondre aux conditions ci-dessous:

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et de l’appareil de chromatographie en phase gazeuse, de manière à obtenir une séparation de toutes les cires, une résolution satisfaisante des pics (voir figure) et un temps de rétention de l’étalon interne C32 qui doit être de 18 ± 3 minutes. Le pic des cires le plus représentatif doit avoir mesuré au moins 60 % du fond de l’échelle.

Les paramètres d’intégration des pics doivent être déterminés de façon à obtenir une évaluation correcte des aires des pics pris en considération.

Note:Vu la température finale élevée, on admet une dérive positive qui de doit pas être supérieure à 10 % du fonds de l’échelle.

5.3. Exécution de l’analyse

Prélever 1 μl de la solution à l’aide de la microseringue de 10 μl; retirer le piston de la seringue de manière à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l’aiguille dans le dispositif d’injection et, après 1-2 secondes, injecter rapidement; au bout d’environ 5 secondes, extraire lentement l’aiguille.

Effectuer l’enregistrement jusqu’à élution complète des cires.

La ligne de base doit toujours répondre aux conditions requises.

5.4. Identification des pics

L’identification des différents pics doit être effectuée à partir des temps de rétention et par comparaison avec des mélanges de cires aux temps de rétention connus, analysés dans les mêmes conditions.

La figure ci-après représente un chromatogramme des cires d’une huile d’olive vierge.

5.5. Évaluation quantitative

Procéder au calcul des aires des pics de l’étalon interne et des esters aliphatiques de C40 à C46 à l’aide de l’intégrateur.

Calculer la teneur en cires de chacun des esters, en mg/kg de matière grasse, par la formule:

Où:

Ax = aire du pic de chaque ester, en millimètres carrés;

As = aire du pic de l’étalon interne, en millimètres carrés;

ms = masse d’étalon interne ajoutée, en milligrammes;

m = masse de l’échantillon prélevé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Indiquer la somme des teneurs des différentes cires de C40 à C46, en mg/kg de matière grasse (ppm).

Note:Les composants à quantifier font référence aux pics à nombre de carbone paires compris entre les esters C40 et C46, selon l’exemple de chromatogramme des cires de l’huile d’olive reporté dans la figure ci-après. Si l’ester C46 apparaît en double, il est conseillé, pour l’identifier, d’analyser la fraction des cires d’une huile de grignons d’olive où le pic C46 est facilement identifiable car nettement majoritaire.

Les résultats sont exprimés avec une décimale.

Figure

Chromatogramme des cires d’une huile d’olive ( 3 )

Légende:

I.S. = Arachidate laurique

1. = Esters diterpéniques

2 + 2′ = Esters C40

3 + 3′ = Esters C42

4 + 4′ = Esters C44

5. = Esters C46

6. = Esters stérols et alcool triterpéniques









APPENDICE

Détermination de la vitesse linéraire du gaz

Injecter de 1 à 3 μl de méthane (ou propane) dans l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, après son réglage aux conditions opératoires normales. Chronométrer le temps employé par le gaz pour parcourir la colonne, à partir du moment de son injection jusqu'au moment de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire, en cm/s, est donnée par la formule L/tM, où L est la longueur de la colonne en centimètres et tM le temps chronométré en secondes.

▼M26









ANNEXE V

DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION ET DE LA TENEUR EN STÉROLS ET EN DIOLS TRITERPÉNIQUES PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE SUR COLONNE CAPILLAIRE

1. CHAMP D’APPLICATION

La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en chaque stérol et en stérols totaux ainsi qu'en diols triterpéniques des huiles d'olive et de grignons d'olive.

2. PRINCIPE

L'huile, additionnée d'α-cholestanol en tant qu'étalon interne, est saponifiée avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans de l'éthanol, puis l'insaponifiable est extrait avec de l'éther éthylique.

La fraction des stérols et des diols triterpéniques est séparée de l'insaponifiable par chromatographie en couche mince sur une plaque de gel de silice basique; les fractions récupérées dans le gel de silice sont transformées en triméthylsilyléthers qui sont ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE

Matériel courant de laboratoire, et notamment les éléments suivants:

3.1. Ballon de 250 millilitres muni d'un réfrigérant à reflux avec embouts rodés.

3.2. Ampoule à décanter de 500 ml

3.3. Ballons de 250 ml.

3.4. Équipement complet pour chromatographie en couche mince, avec plaques de verre de 20 × 20 cm.

3.5. Lampe à lumière ultraviolette d'une longueur d'onde de 254 ou 366 nm.

3.6. Microseringues de 100 et 500 μl.

3.7. Ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15-40 μm) d'environ 2 cm de diamètre et 5 cm de hauteur, appropriée pour la filtration sous vide, avec embout rodé mâle.

3.8. Fiole à vide conique de 50 ml avec embout rodé femelle, pouvant s'adapter sur l'ampoule filtrante (point 3.7).

3.9. Tube à fond conique de 10 millilitres, avec bouchon hermétique en verre.

3.10. Appareil de chromatographie en phase gazeuse pouvant être utilisé sur une colonne capillaire avec dispositif d'injection à débit divisé, composé des éléments suivants: 3.10.1. un four thermostaté pour les colonnes, pouvant maintenir la température souhaitée avec une précision de ± 1 °C; 3.10.2. un ensemble d'injection thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilylaté et système à débit divisé; 3.10.3. Détecteur à ionisation de flamme; 3.10.4. Système d’acquisition des données pouvant être utilisé avec l’analyseur FID (point 3.10.3.), avec possibilité d'intégration manuelle.

3.11. Colonne capillaire en silice fondue d'une longueur de 20 à 30 m, d'un diamètre interne compris entre 0,25 et 0,32 mm, recouverte de 5 % diphényle - 95 % diméthylpolysiloxane (phase stationnaire SE-52 ou SE-54 ou équivalent) jusqu'à obtention d'une épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm.

3.12. Microseringue d'une capacité de 10 μl, pour chromatographie en phase gazeuse, avec aiguille soudée, convenant pour l'injection à débit divisé.

3.13. Dessiccateur au dichlorure de calcium

4. RÉACTIFS

4.1. Hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %).

4.2. Hydroxyde de potassium en solution éthanolique à environ 2 N. Dissoudre, tout en refroidissant, 130 g d'hydroxyde de potassium (point 4.1) dans 200 ml d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol (point 4.10). Conserver cette solution dans des bouteilles en verre sombre bien fermées pendant deux jours au maximum.

4.3. Éther éthylique, de qualité analytique.

4.4. Hydroxyde de potassium en solution éthanolique à environ 0,2 N. Dissoudre 13 g d'hydroxyde de potassium (point 4.1) dans 20 ml d'eau distillée, puis compléter à un litre avec de l'éthanol (point 4.10).

4.5. Sulfate de sodium anhydre, de qualité analytique.

4.6. Plaques de verre (20 x 20 cm) recouvertes d'une couche de gel de silice, sans indicateur de fluorescence, d'une épaisseur de 0,25 millimètre d'épaisseur (disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.7. Toluène, de qualité chromatographique.

4.8. Acétone, de qualité chromatographique.

4.9. n-Hexane, de qualité chromatographique.

4.10. Éther éthylique, de qualité chromatographique.

4.11. Éthanol, de qualité analytique.

4.12. Acétate d’éthyle, de qualité analytique.

4.13. Solution de référence pour la chromatographie en couche mince: cholestérol ou phytostérols, et solution d'érythrodiol à 5% dans de l'acétate d'éthyle (point 4.11).

4.14. Dichloro-2′ -7′ fluorescéine, solution éthanolique à 0,2 %. Elle est rendue légèrement basique par addition de quelques gouttes d'une solution alcoolique 2N d'hydroxyde de potassium (point 4.2).

4.15. Pyridine anhydre, de qualité chromatographique (voir note 5).

4.16. Disilazane d'hexaméthyle, de qualité analytique.

4.17. Triméthylchlorosilane, de qualité analytique.

4.18. Solutions échantillons des triméthylsilyléthers des stérols. À préparer au moment de l'emploi à partir des stérols et de l'érythrodiol tirés des huiles qui les contenaient.

4.19. α-cholestanol, de pureté supérieure à 99% (la pureté doit être vérifiée par analyse chromatographique en phase gazeuse).

4.20. Solution étalon interne d'α-cholestanol à 0,2 % (m/V) dans de l'acétate d'éthyle (point 4.11).

4.21. Solution de phénolphtaléine, 10 g/l dans l’éthanol (point 4.10).

4.22. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.23. Gaz auxiliaires: hydrogène, hélium, azote et air, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.24. Mélange 65:35 (V/V) n-Hexane (point 4.9)/éther éthylique (point 4.10).

4.25. Réactif de silylation, constitué d’un mélange 9: 3: 1 (V/V/V) de pyridine/hexaméthyldisilazane/triméthylchlorosilane.

5. MODE OPÉRATOIRE

5.1. Préparation de l'insaponifiable: 5.1.1. À l’aide d’une microseringue de 500 μl (point 3.6) introduire dans le ballon de 250 ml (point 3.1) un volume de la solution étalon interne d'α-cholestanol (point 4.20) contenant une quantité de cholestanol correspondant approximativement à 10 % de la teneur en stérol de l’échantillon. Par exemple, pour 5 g d'échantillon d'huile d'olive, ajouter 500 μl de la solution d'α-cholestanol (point 4.20), et 1 500 μl dans le cas d'huile de grignons d'olive. Laisser évaporer complètement sous un léger courant d'azote dans un bain d'eau tiède, jusqu'à dessication; après refroidissement du ballon, peser 5±0,01 g d'échantillon filtré et sec dans le même ballon. Note 1: les huiles et les graisses animales ou végétales contenant de grandes quantités de cholestérol peuvent présenter un pic dont le temps de rétention est proche de celui du cholestanol. En pareil cas, la fraction stérolique devra être analysée deux fois, avec et sans étalon interne. 5.1.2. Ajouter 50 ml de solution éthanolique 2N d’hydroxyde de potassium (point 4.2) et un peu de poudre de ponce; mettre en place le réfrigérant à reflux et porter à ébullition jusqu’à la saponification (la solution devient limpide). Continuer à chauffer pendant 20 minutes, puis verser 50 ml d'eau distillée du haut du réfrigérant. Débrancher le réfrigérant et laisser refroidir le ballon à environ 30 °C. 5.1.3. Transvaser le contenu du ballon quantitativement dans une ampoule à décanter de 500 ml (point 3.2) en faisant plusieurs lavages à l’eau distillée (50 ml). Ajouter environ 80 ml d’éther éthylique (point 4.10) et agiter énergiquement durant environ 60 secondes. Décompresser régulièrement en retournant le décanteur et en ouvrant le robinet. Laisser reposer jusqu’à séparation complète des deux phases (Note 2). Extraire ensuite la solution savonneuse le plus complètement possible dans un deuxième décanteur. Faire encore deux extractions sur la phase hydro-alcoolique, selon les mêmes modalités, en utilisant 60 à 70 ml d'éther éthylique (point 4.10). Note 2: les émulsions peuvent être éliminées en ajoutant de petites quantités d’éthanol (point 4.11). 5.1.4. Verser les trois extraits d'éther dans une ampoule à décanter contenant 50 ml d’eau. Laver à l’eau (50 ml) jusqu’à ce que la coloration rose de l’eau disparaisse lorsqu’une goutte de solution de phénolphtaléine est ajoutée (point 4.21). Après élimination de l’eau de lavage, filtrer sur du sulfate de sodium anhydre (point 4.5) dans un ballon de 250 ml préalablement pesé, en lavant l’ampoule et le filtre avec de petites quantités d’éther éthylique (point 4.10). 5.1.5. Évaporer le solvant par distillation avec un évaporateur rotatif à 30 °C sous vide. Ajouter 5 ml d’acétone et éliminer complètement le solvant volatil sous un léger courant d’air. Sécher le résidu à l’étuve à 103±2 °C pendant 15 min. Faire refroidir dans un dessiccateur et peser à 0,1 mg près.

5.2. Séparation de la fraction des stérols et diols triterpéniques (érytrodiol + uvaol) 5.2.1. Préparation des plaques basiques de chromatographie sur couche mince. Enfoncer les plaques de gel de silice (point 4.6) dans environ 4 cm de solution éthanolique d’hydroxyde de potassium 0,2 N (point 4.5) pendant 10 secondes, puis les laisser sécher dans une hotte pendant deux heures avant de les placer dans une étuve à 100 °C pendant une heure. Sortir les plaques de l'étuve et les conserver dans un dessiccateur au chlorure de calcium (point 3.13) jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours). Note 3: si des plaques de gel de silice basiques sont utilisées pour la séparation de la fraction stérolique, il n’est pas nécessaire de traiter l’insaponifiable avec l’alumine. De cette manière, tous les composés acides (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt et la bande des stérols se distingue nettement de celle des alcools aliphatiques et triterpéniques. 5.2.2. Introduire le mélange hexane/éther éthylique (point 4.24) (Note 4) dans la cuve de développement, à une profondeur d’environ 1 cm. Fermer la cuve à l’aide du couvercle approprié et laisser ainsi pendant au moins une demi-heure, dans un endroit frais, de façon à ce que l’équilibre liquide/vapeur s’établisse. Il est possible de fixer sur la surface intérieure de la cuve des bandes de papier filtre et de les faire tremper dans l’éluant. Cette précaution permet de réduire d'un tiers environ le temps de développement et d'obtenir une élution plus uniforme des composants. Note 4: Afin d’avoir des conditions d’élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être renouvelé à chaque essai. Un solvant n-hexane/éther éthylique 50:50 (V/V) peut également être utilisé. 5.2.3. Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable (point 5.1.5) dans l’acétate d’éthyle (point 4.12) et, à l’aide de la microseringue de 100 μl, déposer 0,3 ml de cette solution en une ligne continue fine et uniforme à l’extrémité inférieure (2 cm) de la plaque chromatographique (point 5.2.1). À la hauteur de cette ligne, déposer 2 à 3 μl de la solution de référence (point 4.13) afin de pouvoir repérer la bande des stérols et des diols triterpéniques après développement. 5.2.4. Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indiqué au paragraphe 5.2.2. La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20 °C (Note 5). Fermer aussitôt la cuve avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 cm du bord supérieur de la plaque. Sortir ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment. Note 5: des températures plus élevées pourraient être moins favorables à la séparation. 5.2.5. Vaporiser la plaque légèrement et uniformément avec la solution de 2,7-dichlorofluorescéine (point 4.14), puis laisser sécher. Sur la plaque observée en lumière UV, les bandes des stérols et des diols triterpéniques peuvent être identifiées par alignement avec les taches obtenues à l’aide de la solution de référence (point 4.13). Délimiter les bandes avec un crayon noir en suivant les bords de la fluorescence (voir plaque chromatographique, figure 3). 5.2.6. À l'aide d'une spatule métallique, racler le gel de silice présent dans la zone délimitée. Introduire la matière finement broyée retirée dans l’ampoule filtrante (point 3.7). Ajouter 10 ml d’acétate d’éthyle chaud (point 4.12), mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer sous vide, puis recueillir le filtrat dans la fiole (point 3.8) reliée à l’ampoule filtrante. Laver le résidu dans l’ampoule par trois fois à l’éther éthylique (point 4.3) (environ 10 ml à chaque fois) et recueillir le filtrat dans la même fiole adaptée à l’ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à un volume de 4 à 5 ml, transférer la solution résiduelle dans le tube de 10 ml (point 3.9) pesé au préalable, évaporer à sec en chauffant légèrement sous léger courant d’azote, reprendre avec quelques gouttes d’acétone (point 4.8) et évaporer à sec à nouveau. Le résidu contenu dans le tube doit être constitué de la fraction stérolique et de la fraction des diols triterpéniques.

5.3. Préparation des triméthylsilyléthers (TMSE) 5.3.1. Ajouter le réactif de silylation (point 4.25) (Note 6), à raison de 50 μl par milligramme de stérols et de diols triterpéniques, dans le tube contenant la fraction des stérols et des diols triterpéniques, en évitant toute absorption d’humidité (Note 7). Note 6: des solutions prêtes à l’emploi sont disponibles dans le commerce. D'autres réactifs silylants sont également disponibles, tels que, par exemple, le bistriméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosilane à diluer par un même volume de pyridine anhydre. La pyridine peut être remplacée par la même quantité d’acétonitrile. 5.3.2. Boucher le tube, agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à solubilisation des composés. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes. La solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse. Note 7: la formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucune anomalie. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou d'altération du réactif. En pareil cas, l’essai doit être répété (uniquement en cas d'utilisation d'hexaméthyldisilazane ou de triméthylchlorosilane).

5.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse 5.4.1. Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne capillaire. 5.4.1.1. Installer la colonne (point 3.11) dans le chromatographe, en reliant l’extrémité d’entrée à l’injecteur à débit divisé et l’extrémité de sortie au détecteur. Effectuer les contrôles habituels du système de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système diviseur et du système d’enregistrement, etc.). 5.4.1.2. Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est recommandé de procéder à son conditionnement: faire passer un léger flux de gaz à travers cette colonne, puis mettre le chromatographe en marche et chauffer graduellement jusqu’à atteindre une température excédant d’au moins 20 °C la température de travail (Note 8). Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis mettre l'ensemble du système de chromatographie en mode de fonctionnement (réglage des débits gazeux et du système diviseur, allumage de la flamme, raccordement avec l’enregistreur électronique, réglage de la température de la colonne, du détecteur et de l’injecteur, etc.), puis enregistrer le signal avec une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l’analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive. Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne; une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne. Note 8: la température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20 °C à la température maximale prévue pour la phase stationnaire utilisée. 5.4.2. Choix des conditions opératoires. 5.4.2.1. Les conditions opératoires à observer sont les suivantes: — température de la colonne: 260 ± 5 °C; — température de l'injecteur: 280-300 °C; — température du détecteur: 280-300 °C; — vitesse linéaire du gaz vecteur: hélium 20 à 35 cm/s; hydrogène 30 à 50 cm/s; — ratio de division: de 1:50 à 1:100; — sensibilité instrumentale: 4 à 16 fois l'atténuation minimale; — sensibilité d'enregistrement: 1 à 2 mV pleine échelle; — quantité de substance injectée: 0,5 à 1 μl de solution de TMSE. Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et de l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, de façon à obtenir des chromatogrammes satisfaisant aux conditions suivantes: — le temps de rétention du ß-sitostérol doit être de 20 ± 5 min; — le pic du campestérol doit être: pour l’huile d’olive (teneur moyenne 3 %) 20 ± 5 % de l'échelle de l'enregistreur; pour l’huile de soja (teneur moyenne 20 %) 80 ± 10 % de l'échelle de l'enregistreur; — tous les stérols présents doivent être séparés. Les pics doivent être non seulement séparés mais aussi complètement résolus, c’est-à-dire que le tracé du pic doit rejoindre la ligne de base avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toutefois tolérée à condition toutefois que le pic à RRT 1,02 (sitostanol) soit quantifiable en utilisant la perpendiculaire. 5.4.3. Exécution de l'analyse 5.4.3.1. À l'aide de la microseringue de 10 μl, prélever 1 μl, aspirer 0,5 μl d'air, puis 0,5 à 1 μl de la solution échantillon. Tirer à nouveau le piston de la seringue de façon à ce que l’aiguille soit vide. Introduire l'aiguille à travers la membrane de l'injecteur et, après une à deux secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, au bout de cinq secondes environ. Un injecteur automatique peut également être employé. 5.4.3.2. Procéder à l’enregistrement jusqu’à élution complète des TMSE des diols triterpéniques présents. La ligne de base doit toujours satisfaire aux conditions requises (point 5.4.1.2). 5.4.4. Identification des pics L'identification des différents pics est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le mélange des TMSE des stérols et des diols triterpéniques, analysés dans les mêmes conditions (voir appendice). Les stérols et les diols triterpéniques sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol, ergostérol, 24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, Δ7-campestérol, Δ5,23-stigmastadiénol, clérosterol, ß-sistostérol, sitostanol, Δ5-avenastérol, Δ5,24-stigmastadiénol, Δ7-stigmasténol, Δ7-avenastérol, érythrodiol et uvaol. Les temps de rétention relatifs au ß-sitostérol pour les colonnes SE 52 et SE 54 sont consignés dans le tableau 1. Les figures 1 et 2 présentent des chromatogrammes typiques de quelques huiles. 5.4.5. Évaluation quantitative 5.4.5.1. Procéder au calcul des aires des pics de l'α-cholestanol, des stérols et des diols triterpéniques à l'aide du système informatique. Ne pas tenir compte des pics des composés qui ne figurent pas dans le tableau 1 (l'aire du pic de l'ergostérol ne doit pas être calculée). Le coefficient de réponse pour l'α-cholestanol doit être considéré comme étant égal à 1. 5.4.5.2. Calculer la concentration de chaque stérol, en mg/kg de matière grasse, comme suit: où: Ax = aire du pic du stérol x, en unités d'intégration; As = aire du pic d'α-cholestanol, en unités d'intégration; ms = masse d'α-cholestanol ajoutée, en milligrammes; m = masse de l'échantillon utilisé pour la détermination, en grammes.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1. La concentration de chaque stérol est exprimée en mg/kg de matière grasse, et leur somme correspond aux «stérols totaux». La composition de chacun des stérols ainsi que la teneur en érytrodiol et en uvaol sont exprimées par des nombres à une décimale. La teneur en stérols totaux doit être exprimée par un nombre entier.

▼M28

6.2. Calculer le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre l'aire du pic correspondant et la somme des aires des pics des stérols: où: Ax = aire du pic de x; ΣA = somme des aires des pics des stérols.

▼M26

6.3. β-sitostérol apparent: Δ5-23-stigmastadiénol + clérostérol + β-sitostérol + sitostanol + Δ5-avenastérol + Δ5-24-stigmastadiénol.

6.4. Calculer le pourcentage d'érytrodiol et d'uvaol: où: ΣA = somme des aires des pics des stérols, en unités d'intégration; Er = aire du pic d'érythrodiol, en unités d'intégration; Uv = aire du pic d'uvaol, en unités d'intégration;









Appendice

Détermination de la vitesse linéaire du gaz

Dans l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, réglé aux conditions opératoires normales, injecter 1 à 3 μl de méthane (ou de propane) et chronométrer le temps que met le gaz pour parcourir la colonne, entre le moment de l'injection et celui de la sortie du pic (tM).

La vitesse linéaire, exprimée en cm/s, est donnée par L/tM, où L est la longueur de la colonne, en centimètres, et tM le temps chronométré, en secondes.







Tableau 1 Temps de rétention relatifs des stérols Pic Identification Temps de rétention relatif SE 54 colonne SE 52 colonne 1 Cholestérol Δ-5-cholestén-3ß-ol 0,67 0,63 2 Cholestanol 5α-cholestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassicastérol [24S]-24-méthyl-Δ-5,22-cholestadién-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergostérol [24S] 24 méthyl Δ5-7-22 cholestatrién 3ß-ol 0,78 0,76 4 24-méthylène-cholestérol 24-méthylène-Δ-5,24-cholestadién-3ß-o1 0,82 0,80 5 Campestérol (24R)-24-méthyl-Δ-5-cholestén-3ß-ol 0,83 0,81 6 Campestanol (24R)-24-méthyl-cholestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmastérol (24S)-24-éthyl-Δ-5,22-cholestadién-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-campestérol (24R)-24-méthyl-Δ-7-cholestén-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadiénol (24R,S)-24-éthyl-Δ-5,23-choIestadién-3ß-ol 0,95 0,95 10 Clérostérol (24S)-24-éthyl-Δ-5,22-cholestadién-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitostérol (24R)-24-éthyl-Δ-5-cholestén-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-éthyl-cholestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avénastérol (24Z)-24-éthylidène-Δ-cholestén-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadiénol (24R,S)-24-éthyl-Δ-5,24-cholestadién-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmasténol (24R,S)-24-éthyl-Δ-7-cholestén-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avénastérol (24Z)-24-éthylidène-Δ-7-cholestén-3ß-ol 1,16 1,16 17 Érythrodiol 5α oléan-12en-3bß8 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3ß28 diol 1,52 1,52

Figure 1

Chromatogramme (en phase gazeuse) de la fraction des stérols et des diols triterpéniques d'une huile d’olive lampante (avec étalon interne)

Figure 2

Chromatogramme (en phase gazeuse) de la fraction des stérols et des diols triterpéniques d'une huile d’olive raffinée (avec étalon interne)

Figure 3

Plaque de chromatographie en couche mince d'une huile de grignons d’olive, montrant la zone à racler pour la détermination des stérols et des diols triterpéniques

1 — Squalène

2 — Alcools triterpéniques et aliphatiques

3 — Stérols et diols triterpéniques

4 — Acides gras initiaux et acides gras libres

▼M26 —————

▼M21









ANNEXE VII

DÉTERMINATION DU POURCENTAGE DU 2-GLYCÉRIL MONOPALMITATE

1. OBJET ET DOMAINE D’APPLICATION

Cette méthode décrit la procédure analytique pour la détermination du pourcentage d’acide palmitique en position 2 des triglycérides au moyen de l’évaluation du 2-glycéril monopalmitate.

Cette méthode est applicable aux huiles végétales liquides à température ambiante (20 °C).

2. PRINCIPE

Après préparation, l’échantillon d’huile est soumis à l’action de la lipase pancréatique: une hydrolyse partielle et spécifique dans les positions 1 et 3 de la molécule de triglycéride entraîne l’apparition des monoglycérides en position 2. Le pourcentage de 2-glycéril monopalmitate dans la fraction monoglycéridique est déterminé, après silylation, par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

3. APPAREILLAGE ET MATÉRIEL COURANT

3.1. Erlenmeyer, 25 ml

3.2. Béchers 100, 250 et 300 ml

3.3. Colonne en verre pour chromatographie, diamètre intérieur 21-23 mm, longueur 400 mm, équipée d’une plaque en verre fritté et d’un robinet

3.4. Éprouvettes graduées de 10, 50, 100 et 200 ml

3.5. Ballons de 100 et 250 ml

3.6. Évaporateur rotatif

3.7. Tubes de centrifugeuse à fond conique de 10 ml, avec bouchon rodé

3.8. Centrifugeuse pour des tubes de 10 et 100 ml

3.9. Thermostat permettant de maintenir la température à 40 ± 0,5 °C

3.10. Pipettes graduées de 1 et 2 ml

3.11. Seringue hypodermique de 1 ml

3.12. Microseringue de 100 μl

3.13. Entonnoir, 1 000 ml

3.14. Chromatographe en phase gazeuse pour colonnes capillaires, équipé d’un dispositif d’injection «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne et d’un four susceptible de maintenir la température choisie à 1 °C près

3.15. Injecteur «on-column» à froid pour l’introduction directe de l’échantillon dans la colonne

3.16. Détecteur à ionisation de flamme et électromètre

3.17. Enregistreur-intégrateur adapté à l’électromètre avec une vitesse de réponse non supérieure à 1 seconde et une vitesse variable de déroulement du papier

3.18. Colonne capillaire en verre ou en silice fondue de 8 à 12 mètres, d’un diamètre intérieur de 0,25 à 0,32 mm, recouverte de methylpolysiloxane ou de phényl méthylpolysiloxane 5 %, d’une épaisseur de 0,10-0,30 μm, pouvant être utilisée à 370 °C

3.19. Microseringue de 10 μl munie d’une aiguille cémentée, d’au moins 7,5 cm de long, pour injection directe sur colonne

4. RÉACTIFS

4.1. Gel de silice ayant une granulométrie comprise entre 0,063 et 0,200 mm (70/280 mesh), préparé comme suit: mettre le gel de silice dans une capsule de porcelaine, sécher à l’étuve à 160 °C pendant 4 heures, puis laisser refroidir à température ambiante dans un dessiccateur. Ajouter un volume d’eau équivalent à 5 % du poids du gel de silice, comme suit: dans un Erlenmeyer de 500 ml, peser 152 g de gel de silice et ajouter 8 g d’eau distillée, boucher et agiter délicatement pour obtenir une répartition uniforme de l’eau. Laisser reposer au moins 12 heures avant l’emploi.

4.2. n-hexane (pour chromatographie)

4.3. Isopropanol

4.4. Isopropanol, solution aqueuse 1/1 (V/V)

4.5. Lipase pancréatique. La lipase utilisée doit avoir une activité comprise entre 2,0 et 10 unités de lipase par mg. (Il existe dans le commerce des lipases pancréatiques ayant une activité comprise entre 2 et 10 unités par mg d’enzyme.)

4.6. Solution tampon de tris-hydroxy-méthylaminométhane: solution aqueuse 1 M amenée jusqu’à pH 8 (contrôle potentiométrique) par du HCI concentré (1/1 V/V)

4.7. Cholate de sodium, qualité enzymatique, solution aqueuse à 0,1 % (cette solution doit être utilisée dans les 15 jours suivant sa préparation)

4.8. Chlorure de calcium, solution aqueuse à 22 %

4.9. Éther diéthylique pour chromatographie

4.10. Solvant de développement: mélange n-hexane/éther diéthylique (87/13) (V/V)

4.11. Hydroxyde de sodium, solution à 12 % en poids

4.12. Phénolphtaléine, solution à 1 % dans l’éthanol

4.13. Gaz vecteur: hydrogène ou hélium, pour chromatographie en phase gazeuse

4.14. Gaz auxiliaires: hydrogène, à 99 % minimum, exempt d’humidité et de substances organiques; et air, pour chromatographie en phase gazeuse de la même pureté

4.15. Réactif de silanisation: mélange pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V). (Des solutions prêtes à l'emploi existent dans le commerce. D’autres réactifs de silylation peuvent être employés, notamment bis-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilués avec un volume identique de pyridine anhydre.)

4.16. Échantillons de référence: monoglycérides purs ou mélanges de monoglycérides ayant une composition en pourcentage connue similaire à celle de l’échantillon.

5. PROCÉDURE

5.1. Préparation de l’échantillon

5.1.1. Les huiles ayant une acidité libre inférieure à 3 % n’ont pas besoin d’être neutralisées avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Les huiles ayant une acidité libre supérieure à 3 % devront être soumises à la neutralisation conformément au point 5.1.1.1. 5.1.1.1. Dans l’entonnoir de 1 000 ml (3.13), verser 50 g d’huile et 200 ml de n-hexane. Ajouter 100 ml d’isopropanol et une quantité de la solution d’hydroxyde de sodium à 12 % (4.11) correspondant à l’acidité libre de l’huile majorée de 5 %. Agiter énergiquement pendant une minute. Ajouter 100 ml d’eau distillée, agiter de nouveau et laisser reposer. Après décantation, éliminer la couche inférieure contenant les savons. Éliminer les éventuelles couches intermédiaires (mucilage et substances insolubles). Laver la solution hexanique de l’huile neutralisée avec des portions successives de 50-60 ml de la solution isopropanol/eau 1/1 (V/V) (4.4) jusqu’à disparition de la coloration rosée de la phénolphtaléine. Éliminer la plus grande partie de l’hexane par distillation sous vide (utiliser par exemple un évaporateur rotatif) et transférer l’huile dans un ballon de 100 ml (3.5). Sécher l’huile sous vide jusqu’à élimination totale du solvant. À la fin de cette opération, l’acidité de l’huile doit être inférieure à 0,5 %.

5.1.2. Introduire 1,0 g d’huile préparée comme indiqué ci-dessus dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1) et dissoudre dans 10 ml de mélange de développement (4.10). Laisser reposer la solution pendant au moins 15 minutes avant la chromatographie sur colonne de gel de silice. Si la solution est trouble, la centrifuger pour garantir des conditions optimales pour la chromatographie. (Des cartouches de gel de silice SPE de 500 mg prêtes à l’emploi peuvent être utilisées.)

5.1.3. Préparation de la colonne chromatographique Verser dans la colonne (3.3) environ 30 ml du solvant de développement (4.10), introduire un morceau de coton dans la partie inférieure de la colonne à l’aide d’une baguette de verre; presser pour éliminer l’air. Dans un bécher, préparer une suspension de 25 g de gel de silice (4.1) dans environ 80 ml de solvant de développement et le verser dans la colonne à l’aide d’un entonnoir. Vérifier que tout le gel de silice a été introduit dans la colonne; laver avec le solvant de développement (4.10), ouvrir le robinet et laisser le niveau du liquide atteindre environ 2 mm au-dessus du niveau supérieur du gel de silice.

5.1.4. Chromatographie sur colonne Dans un Erlenmeyer de 25 ml (3.1), peser exactement 1,0 g d’échantillon préparé conformément au point 5.1. Dissoudre l’échantillon dans 10 ml de solvant de développement (4.10). Verser la solution dans la colonne chromatographique préparée conformément au point 5.1.3. Éviter de remuer la surface de la colonne. Ouvrir le robinet et laisser s’écouler la solution de l’échantillon jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau du gel de silice. Développer avec 150 ml de solvant de développement. Ajuster le débit à 2 ml/min (de façon à ce que 150 ml s’écoulent dans la colonne en 60-70 minutes environ). Récupérer l’éluat dans un ballon de 250 ml préalablement taré. Évaporer le solvant sous vide et enlever les dernières traces de celui-ci sous un courant d’azote. Peser le ballon et calculer l’extrait récupéré [En cas d’utilisation de cartouches SPE de silice prêtes à l’emploi, procéder comme suit: introduire 1 ml de solution (5.1.2) dans les cartouches préalablement préparées avec 3 ml de n-hexane. Après percolation de la solution, développer avec 4 ml de n-hexane/éther diéthylique 9/1 (V/V). Récupérer l’éluat dans un tube de 10 ml et le soumettre à évaporation sous un courant d’azote jusqu’à siccité. Soumettre le résidu sec à l’action de la lipase pancréatique (5.2). Il est fondamental de vérifier la composition en acide gras avant et après passage sur cartouche SPE].

5.2. Hydrolyse par la lipase pancréatique

5.2.1. Dans le tube de la centrifugeuse, peser 0,1 g de l’huile préparée conformément au point 5.1. Ajouter 2 ml de solution tampon (4.6), 0,5 ml de la solution de cholate de sodium (4.7) et 0,2 ml de la solution de chlorure de calcium, en agitant bien après chaque addition. Fermer le tube par le bouchon rodé et le placer dans le thermostat à 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Ajouter 20 mg de lipase, agiter soigneusement (en évitant de mouiller le bouchon) et mettre le tube dans le thermostat pendant exactement 2 minutes, puis le retirer, agiter énergiquement pendant 1 minute exactement et laisser refroidir.

5.2.3. Ajouter 1 ml d’éther diéthylique, boucher et agiter énergiquement, puis centrifuger et transférer la solution d’éther dans un tube propre et sec, à l’aide d’une microseringue.

5.3. Préparation des dérivés silanisés et de la chromatographie en phase gazeuse

5.3.1. À l’aide d’une microseringue, introduire 100 μl de solution (5.2.3) dans un tube à fond conique de 10 ml.

5.3.2. Éliminer le solvant sous un léger courant d’azote, ajouter 200 μl de réactif de silanisation (4.15), boucher le tube et laisser reposer pendant 20 minutes.

5.3.3. Après 20 minutes, ajouter 1 à 5 ml de n-hexane (en fonction des conditions chromatographiques): la solution résultant est prête pour la chromatographie en phase gazeuse.

5.4. Chromatographie en phase gazeuse

Les conditions d’opération sont les suivantes:

— température de l’injecteur (injecteur «on-column») inférieure à la température d’ébullition du solvant (68 °C),

— température du détecteur: 350 °C,

— température de la colonne: programmation de la température du four: 60 °C pendant 1 minute, en augmentant de 15 °C par minute jusqu’à 180 °C, puis de 5 °C par minute jusqu’à 340 °C, puis 340 °C pendant 13 minutes,

— gaz vecteur: hydrogène ou hélium, réglé à la vitesse linéaire adéquate en vue d’obtenir la résolution reflétée dans la figure 1. Le temps de rétention du triglycéride C54 doit être de 40 ± 5 minutes (voir figure 2). (Les conditions d’opérations indiquées ci-dessus sont proposées à titre indicatif. Chaque opérateur devra les optimiser pour atteindre la résolution désirée. La hauteur du pic correspondant au 2-glycéryl monopalmitate doit avoir une hauteur minimale égale à 10 % de l’échelle de l’enregistreur),

— quantité de substance injectée: 0,5-1 μl de la solution (5 ml) de n-hexane (5.3.3).

5.4.1. Identification des pics

Les monoglycérides individuels sont identifiés en fonction des temps de rétention obtenus et par rapport à ceux obtenus avec les mélanges standards de monoglycérides analysés dans les mêmes conditions.

5.4.2. Évaluation quantitative

L’aire de chaque pic est calculée au moyen d’un intégrateur électronique.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

Le pourcentage de glycéril monopalmitate est calculé à partir du rapport entre l’aire du pic correspondant et la somme des aires des pics de tous les monoglycérides (voir figure 2), selon la formule:

Glycéryl monopalmitate (%):

Où:

Ax = aire du pic correspondant au glycéryl monopalmitate;

ΣA = somme des aires de la totalité des pics des monoglycérides.

Le résultat doit être donné avec une décimale.

7. COMPTE RENDU DE L’ANALYSE

Le compte rendu de l’analyse devra spécifier:

— la référence à cette méthode,

— toute information nécessaire à l’identification complète de l’échantillon,

— le résultat de l’analyse,

— tout écart de cette méthode, qu’il s’agisse d’une décision des parties concernées ou pour une autre raison,

— les détails d’identification du laboratoire, la date de l’analyse et la signature des responsables de celle-ci.

Figure 1

Chromatogramme des produits de la réaction de silanisation obtenus par l’action de la lipase sur une huile d’olive raffinée additionnée de 20 % d’huile estérifiée (100 %)

Figure 2

Chromatogramme de:

A) huile d’olive non estérifiée, après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après. Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %. Légende: 1 = Acides gras libres 2 = Monoglycérides 3 = Diglycérides 4 = Triglycérides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

Chromatogramme de:

B) huile estérifiée après lipase; après silanisation; dans ces conditions (colonne capillaire 8-12 m), la fraction de cire est éluée en même temps que la fraction de diglycéride ou peu de temps après. Après lipase, la teneur en triglycérides ne devrait pas excéder 15 %. Légende: 1 = Acides gras libres 2 = Monoglycérides 3 = Diglycérides 4 = Triglycérides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

8. NOTES

PRÉPARATION DE LA LIPASE

Il existe dans le commerce des lipases ayant une activité satisfaisante. Il est également possible de les préparer au laboratoire de la façon suivante:

Refroidir à 0 °C 5 kg de pancréas frais de porc. Débarrasser de la graisse solide et du tissu conjonctif qui les entourent et les triturer dans un moulin à lames jusqu’à obtention d’une pâte fluide. Agiter cette pâte pendant 4 à 6 heures avec 2,5 litres d’acétone anhydre puis centrifuger. Extraire le résidu trois autres fois avec le même volume d’acétone anhydre, puis deux fois avec un mélange acétone/éther diéthylique (1/1) (V/V) et deux fois avec de l’éther diéthylique.

Sécher le résidu pendant 48 heures sous vide pour obtenir une poudre stable qui se conservera longtemps au réfrigérateur et à l’abri de l’humidité.

CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ LIPASIQUE

Préparer une émulsion d’huile d’olive comme suit:

Agiter pendant 10 minutes dans un mélangeur un mélange constitué de 165 ml d’une solution de gomme arabique à 100 g/l, 15 g de glace pilée et 20 ml d’une huile d’olive préalablement neutralisée.

Introduire successivement 10 ml de cette émulsion dans un bécher de 50 ml puis 0,3 ml d’une solution de cholate de sodium à 0,2 g/ml et 20 ml d’eau distillée.

Placer le bécher dans un thermostat régulé à 37 °C; introduire les électrodes du pH-mètre et l’agitateur à hélice.

Ajouter goutte à goutte, à l’aide d’une burette, une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N jusqu’à obtention d’un pH de 8,3.

Ajouter un volume de suspension de poudre de lipase dans l’eau (0,1 g/ml de lipase). Dès que le pH-mètre indique un pH de 8,3, mettre en marche le chronomètre et ajouter la solution d’hydroxyde de sodium, goutte à goutte, au rythme nécessaire pour maintenir le pH à la valeur de 8,3. Noter chaque minute le volume de solution consommé.

Reporter les données dans un système d’axes de coordonnées en portant en abscisses les temps et en ordonnées les millilitres de solution alcaline 0,1 N consommés pour maintenir le pH constant. Un graphique linéaire doit être obtenu.

L’activité de la lipase, mesurée en unités lipase par mg, est donnée par la formule suivante:

où:

A est l’activité en unités lipase/mg;

V est le nombre de millilitres de solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N par minute (calculé à partir du graphique);

N est la normalité de la solution d’hydroxyde de sodium;

m est la masse en mg de la lipase d’essai.

L’unité lipase est définie comme la quantité d’enzyme qui libère 10 micro-équivalents d’acide par minute.

▼M20 —————

▼M28









ANNEXE IX

ANALYSE SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DANS L'ULTRAVIOLET

AVANT-PROPOS

L'analyse spectrophotométrique dans l'ultraviolet peust fournir des indications sur la qualité d'une matière grasse, sur son état de conservation et sur les modifications subies du fait de processus technologiques. L'absorption aux longueurs d'onde spécifiées dans la méthode est due à la présence de systèmes de diènes et triènes conjugués résultant de processus d'oxydation et/ou de pratiques de raffinage. Les valeurs de cette absorption sont exprimées comme l'extinction spécifique

(l'extinction d'une solution de matière grasse à 1 % m/v dans le solvant spécifié, dans une cuve de 10 mm), notée de façon conventionnelle K (également dénommé «coefficient d'extinction»).

1. CHAMP D'APPLICATION

La présente annexe décrit la procédure à suivre pour réaliser une analyse spectrophotométrique dans le domaine de l'ultraviolet de l'huile d'olive.

2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

Un échantillon est dissous dans le solvant requis, puis l'absorbance de la solution est mesurée aux longueurs d'onde spécifiées, par rapport au solvant pur.

Les valeurs de l'extinction spécifique à 232 nm et à 268 nm dans de l'iso-octane ou à 232 nm et 270 nm dans du cyclohexane sont calculées pour une concentration de 1 % m/v dans une cuve de 10 mm.

3. APPAREILLAGE

3.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer des mesures à des longueurs d'onde UV (220 nm à 360 nm), avec capacité de lecture nanométrique. Un contrôle régulier est recommandé pour la précision et la reproductibilité des échelles des longueurs d'onde et d'absorbance ainsi que pour la lumière parasite. 3.1.1. Échelle des longueurs d'onde: ce contrôle peut être réalisé à l'aide d'un matériau de référence consistant en un filtre de verre optique contenant de l'oxyde d'holmium ou une solution d'oxyde d'holmium (scellée ou non), qui possède des bandes d'absorption distinctes. Ces matériaux de référence sont destinés à la vérification et à l'étalonnage de l'échelle des longueurs d'onde des spectrophotomètres UV-visible dont la largeur de bande spectrale nominale est inférieure ou égale à 5 nm. Les mesures sont effectuées en comparaison avec un blanc à l'air, sur la plage de longueurs d'onde comprise entre 640 et 240 nm, selon les instructions qui accompagnent les matériaux de référence. Une correction des valeurs de base est effectuée à l'aide d'un faisceau canalisé vide à chaque altération de la largeur de fente. Les longueurs d'onde de la norme sont énumérées dans le certificat du matériau de référence. 3.1.2. Échelle d'absorbance: le contrôle peut être effectué au moyen de matériaux de référence scellés disponibles dans le commerce, consistant en solutions de dichromate de potassium, avec certaines concentrations et valeurs certifiées d'absorbance à λmax (quatre solutions de dichromate de potassium dans de l'acide perchlorique, scellées dans quatre cuves UV en quartz, qui sont utilisées pour mesurer la linéarité et la précision photométrique de référence dans l'UV). Les solutions de dichromate de potassium sont mesurées en comparaison avec un blanc contenant l'acide utilisé, après correction des valeurs de base, conformément aux instructions accompagnant le matériel de référence. Les valeurs d'absorbance sont énumérées dans le certificat du matériau de référence. Pour le contrôle de la cellule photoélectrique et du photomultiplicateur, il est également possible de procéder ainsi: peser 0,2 gramme de chromate de potassium pur pour spectrophotométrie et dissoudre dans une solution d'hydroxyde de potassium 0,05 N et compléter au volume dans une fiole jaugée de 1 000 millilitres. Prélever ensuite 25 millilitres exactement de la solution obtenue, transférer dans une fiole jaugée de 500 millilitres et compléter au volume avec la même solution d'hydroxyde de potassium. Mesurer l'extinction à 275 nm de la solution ainsi obtenue, en se servant de la solution d'hydroxyde de potassium comme référence. L'extinction mesurée avec une cuve optique de 1 centimètre devra être de 0,200 ± 0,005.

3.2. Cuves en quartz rectangulaires, avec couvercle, pour les mesures aux longueurs d'onde UV (220 à 360 nm) et d'une longueur optique de 10 mm. Lorsqu'elles sont remplies d'eau ou d'un autre solvant approprié, les cuves ne doivent pas présenter entre elles de différence supérieure à 0,01 unité d'extinction.

3.3. Fioles jaugées à un trait, d'une capacité de 25 ml, classe A.

3.4. Balance analytique, permettant une lecture au 0,0001 g près.

4. RÉACTIFS

Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, n'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.

Solvant: iso-octane (2,2,4-triméthylpentane) pour les mesures à 232 nm et à 268 nm et cyclohexane pour les mesures à 232 nm et à 270 nm, présentant une absorbance inférieure à 0,12 à 232 nm et inférieure à 0,05 à 270 nm par rapport à l'eau distillée, mesurée dans une cuve de 10 mm.

5. PROCÉDURE

5.1. L'échantillon doit être parfaitement homogène et exempt d'impuretés en suspension. Dans le cas contraire, il doit être filtré sur papier à une température d'environ 30 °C.

5.2. Introduire environ 0,25 g (au mg près) de l'échantillon ainsi préparé dans une fiole jaugée de 25 ml, compléter avec le solvant spécifié et homogénéiser. La solution obtenue doit être parfaitement limpide. Au cas où la solution présenterait une opalescence ou un trouble, filtrer rapidement sur papier. REMARQUE: en général, une masse de 0,25 à 0,30 g est suffisante pour des mesures d'absorbance d'huiles d'olive vierge et vierge extra à 268 nm et 270 nm. Pour des mesures à 232 nm, 0,05 g d'échantillon est habituellement nécessaire, de sorte que deux solutions distinctes sont généralement préparées. Pour les mesures d'absorbance d'huiles de grignons d'olive, d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive frelatées, une plus petite partie de l'échantillon (0,1 g) est généralement nécessaire du fait de leur plus forte absorbance.

5.3. Le cas échéant, corriger les valeurs de base (220-290 nm) avec un solvant dans les deux cuves de quartz (échantillon et référence), puis remplir la cuve en quartz de l'échantillon avec la solution d'essai et mesurer les valeurs d'extinction à 232, 268 ou 270 nm par comparaison avec le solvant servant de référence. Les valeurs d'extinction enregistrées doivent être comprises dans l'intervalle 0,1 à 0,8 ou dans la plage de linéarité du spectrophotomètre qui doit être vérifiée. Dans le cas contraire, il faut répéter les mesures en utilisant des solutions plus concentrées ou plus diluées, selon le cas.

5.4. Après la mesure de l'absorbance à 268 nm ou à 270 nm, mesurer l'absorbance à λmax, λmax + 4 et λmax – 4. Ces valeurs d'absorbance sont utilisées pour déterminer la variation de l'extinction spécifique (ΔΚ). REMARQUE: λmax est fixé à 268 nm pour l'iso-octane utilisé comme solvant et à 270 nm pour le cyclohexane.

6. EXPRESSION DES RÉSULTATS

6.1. Relever les extinctions spécifiques (coefficients d'extinction) aux diverses longueurs d'onde, calculées comme suit: où: Kλ = extinction spécifique à la longueur d'onde λ, Eλ = extinction mesurée à la longueur d'onde λ, c = concentration de la solution en g/100 ml, s = épaisseur de la cuve en quartz, en cm. Les résultats sont exprimés avec deux décimales.

6.2. Variation de l'extinction spécifique (ΔΚ) La variation de la valeur absolue de l'extinction (ΔΚ) est donnée par la formule: où Km est l'extinction spécifique à la longueur d'onde correspondant à l'absorption maximale à 270 nm et 268 nm en fonction du solvant utilisé. Les résultats sont exprimés avec deux décimales.









ANNEXE X

DÉTERMINATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

1. CHAMP D'APPLICATION

La présente an