1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 1
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►BTROISIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 27 avril 1972
portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des
animaux
(72/199/CEE)
(JO L 123 du 29.5.1972, p. 6)
Modifiée par:
Journal officiel
nopage date
►M1Directive 81/680/CEE de la Commissiondu 30 juillet 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directive 84/4/CEE de la Commissiondu 20 décembre 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Directive 93/28/CEE de la Commissiondu 4 juin1993 L 179 8 22.7.1993
Rectifiée par:
►C1Rectificatif, JO L 320 du 27.11.1980, p. 43 (72/199/CEE)
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TROISIÈME DIRECTIVEDE LA COMMISSION
du 27 avril 1972
portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le
contrôle officiel des aliments des animaux
(72/199/CEE)
LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
vu le traité instituant la Communauté économique européenne,
vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction
de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analysecommunautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (
1),
et notamment son article 2,
considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels
des aliments des animaux pour constater si les conditions prescrites en
vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administrativesconcernant la qualité et la composition des aliments des animaux sontrespectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantil-lons et des méthodes d'analyse communautaires;
considérant que les directives n
o71/250/CEE et no71/393/CEE de la
Commission, du 15 juin 1971 (2) et du 18 novembre 1971 (3), ont déjà
fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires; que,
compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors,
il convient d'arrêter une troisième série de méthodes;
considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont
conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux,
A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premier
Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles offi-
ciels des aliments des animaux en ce qui concerne leurs teneurs en
amidon, protéines brutes, protéines brutes solubilisables par la pepsineet l'acide chlorhydrique et engossypol libre et total ain si que l'activitéde la pepsine, sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe Ide la présente directive.
Article 2
Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles offi-
ciels des aliments des animaux en vue de la détection et del'identification des antibiotiques du groupe des tétracyclines ainsi
qu'en ce qui concerne les teneurs des aliments en chlortétracycline,
oxytétracycline, tétracycline, oléandomycine, tylosine, virginiamycinesont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe II de la présentedirective.
Article 3
Les États membres mettent en vigueur, le 1erjuillet 1973 au plus tard,
les dispositions législatives, réglementaires ou administratives néces-saires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ilsen informent immédiatement la Commission.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 2
(1)J O noL 170 du 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O noL 155 du 12. 7. 1971, p. 13.
(3)J O noL 279 du 20. 12. 1971, p. 7.▼M1
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Article 4
Les États membres sont destinataires de la présente directive.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 3
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ANNEXE I
1.DOSAGE DE L'AMIDON
— Méthode polarimétrique —
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de déterminer la teneur en amidon et en produits de
dégradation à haut poids moléculaire de l'amidon des aliments des animaux,
à l'exception de ceux qui contiennent des cossettes, des pulpes, des feuilles
ou des collets séchés de betteraves, des pulpes de pommes de terre, des
levures déshydratées, des produits riches en inuline (par exemple, cossettes
et farine de topinambours) ou des cretons.
2.Principe
La méthode comprend une double détermination. Dans la première, l'échan-
tillonest traité à chaud par l'acide chlorhydrique dilué. Après défécationet
filtration, on mesure par polarimétrie le pouvoir rotatoire de la solution.
Dans la seconde, l'échantillon est extrait par l'éthanol à 40 %. Après acidifi-
cationdu filtrat par l'acide chlorhydrique, défécationet filtration , onmesure
le pouvoir rotatoire dans les mêmes conditions que lors de la première déter-
mination.
La différence entre les deux multipliée par un facteur connu donne la teneur
en amidon de l'échantillon.
3.Réactifs
3.1 Acide chlorhydrique à 25 % (p/p), d: 1,126.
3.2 Acide chlorhydrique à 1,128 % (p/v).
La concentration doit être vérifiée par titration à l'aide d'une solution
d'hydroxyde de sodium 0,1 N enprésen ce de rouge de méthyle à 0,1 %
(p/v) dans l'éthanol à 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 N.
3.3 Solution de Carrez I: Dissoudre dans l'eau 21,9 g d'acétate de zinc Zn
(CH3COO)2·2 H2O et 3 g d'acide acétique glacial. Compléter à 100 ml
avec de l'eau.
3.4 Solution de Carrez II: Dissoudre dans l'eau 10,6 g de ferrocyanure de
potassium K4[Fe(CN)6]·3 H2O. Compléter à 100 ml avec de l'eau.
3.5 Éthanol à 40 % (v/v), d: 0,948 à 20 ºC.
4.Appareillage
4.1 Erlenmeyer de 250 ml à rodage normalisé, avec réfrigérant à reflux.4.2 Polarimètre ou saccharimètre.
5.Mode opératoire
5.1Préparation de l'échantillon
Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un tamis
à mailles rondes de 0,5 mm de diamètre.
5.2Détermination du pouvoir rotatoire total (P ou S) (v. observation 7.1)
Peser, à 1 mg près, 2,5 g de l'échantillon broyé et les introduire dans un
ballonjaugé de 100 ml. Ajouter 25 ml d'acide chlorhydrique (3.2), agiter
pour obtenir une bonne répartition de la prise d'essai et ajouter à nouveau
25 ml d'acide chlorhydrique (3.2). Plonger le ballon dans un bain d'eau
bouillante et, durant les 3 premières minutes qui suivent, agiter énergi-
quement et régulièrement pour éviter la formation d'agglomérats. La
quantité d'eau du bain doit être suffisante pour permettre de maintenir
le bain en ébullition lorsque le ballon y est plongé. Celui-ci ne peut
être retiré du bain au cours de l'agitation. Après 15 minutes exactement,
retirer le ballondu bain , y ajouter 30 ml d'eau froide et refroidir immé-
diatement jusqu'à 20 ºC.
Ajouter 5 ml de solution de Carrez I (3.3) et agiter pendant une minute.
Ajouter ensuite 5 ml de solution de Carrez II (3.4) et agiter à nouveau
pendant une minute. Compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser
et filtrer. Si le filtrat n'est pas parfaitement limpide (ce qui est peu1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 4
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fréquent), recommencer l'analyse en utilisant une plus grande quantité
des solutions de Carrez I et II, par exemple 10 ml.
Mesurer ensuite le pouvoir rotatoire de la solution dans un tube de
200 mm au polarimètre ou au saccharimètre.
5.3Détermination du pouvoir rotatoire (P ′ou S ′) des substances solubles
dans l'éthanol à 40 %
Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon, les introduire dans un ballon
jaugé de 100 ml et ajouter 80 ml environ d'éthanol (3.5) (v. observation
7.2). Laisser le ballon en attente durant 1 h à la température ambiante; au
cours de ce laps de temps, procéder 6 fois à une agitation énergique de
façon que la prise d'essai soit bien mélangée à l'éthanol. Porter ensuite au
volume avec de l'éthanol (3.5), homogénéiser et filtrer.
Introduire à la pipette 50 ml du filtrat (= 2,5 g de l'échantillon) dans un
erlenmeyer de 250 ml, ajouter 2,1 ml d'acide chlorhydrique (3.1) et
agiter énergiquement. Ajuster un réfrigérant à reflux à l'erlenmeyer et
plonger celui-ci dans un bain d'eau bouillante. Après 15 minutes exacte-
ment, retirer l'erlenmeyer du bain, transvaser son contenu dans un ballon
jaugé de 100 ml, en rinçant avec un peu d'eau froide, et refroidir jusqu'à
20 ºC. Déféquer ensuite à l'aide des solutions de Carrez I (3.3) et II (3.4),
compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser, filtrer et mesurer le
pouvoir rotatoire comme indiqué en 5.2, deuxième et troisième alinéas.
6.Calcul des résultats
La teneur en amidon pour cent d'échantillon est calculée comme suit:
6.1Mesures effectuées au polarimètre
pourcent d’amidon ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = pouvoir rotatoire total endegrés d'arc
P′ = pouvoir rotatoire en degrés d'arc donné par les
substances solubles dans l'éthanol à 40 %
α½/C13820º
D = pouvoir rotatoire spécifique de l'amidonpur. Les
valeurs conventionnellement admises pour ce
facteur sont les suivantes:
+ 185,9º: amidonde riz
+ 185,4º: amidonde pommes de terre+ 184,6º: amidonde maïs
+ 182,7º: amidonde fromen t
+ 181,5º: amidond'orge
+ 181,3º: amidond'avoin e
+ 184,0º: autres types d'amidons, ainsi que mélanges d'amidons
des aliments composés
6.2Mesures effectuées au saccharimètre
pourcent d’amidon ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = pouvoir rotatoire total endegrés saccharimétriques.
S′= pouvoir rotatoire en degrés saccharimétriques donné par les
substances solubles dans l'éthanol à 40 %.
N = poids en g de saccharose dans 100 ml d'eau donnant sous une
épaisseur de 200 mm unpouvoir rotatoire de 100º saccharimé-
triques.
16,29 g pour les saccharimètres français,
26,00 g pour les saccharimètres allemands,
20,00 g pour les saccharimètres mixtes.
α½/C13820º
D= pouvoir rotatoire spécifique de l'amidonpur (v. 6.1).1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 5
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6.3Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effec-
tuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,4 en valeur absolue
pour les teneurs en amidon inférieures à 40 % 1,1 % en valeur relative
pour les teneurs en amidon égales ou supérieures à 40 %.
7.Observations
7.1 Lorsque l'échantillon contient plus de 6 % de carbonates, calculés en
carbonate de calcium, ceux-ci doivent être détruits par un traitement à
l'aide d'une quantité exactement appropriée d'acide sulfurique dilué,
avant la détermination du pouvoir rotatoire total.
7.2 Dans le cas des produits à forte teneur en lactose, tels que les poudres de
lactosérum ou de lait écrémé, procéder comme suit après l'additiondes
80 ml d'éthanol (3.5). Ajuster au ballon un réfrigérant à reflux, plonger
le ballon durant 30 minutes dans un bain d'eau à 50 ºC. Laisser ensuite
refroidir et poursuivre l'analyse comme indiqué en 5.3.
2.DOSAGE DES PROTÉINES BRUTES
1.Objet et domaines d'application
La méthode permet de déterminer la teneur en protéines brutes des aliments
des animaux à partir de la teneur en azote, dosée selon la méthode Kjeldahl.
2.Principe
L'échantillon est minéralisé à l'acide sulfurique en présence d'un catalyseur.
La solution acide est alcalinisée par une solution d'hydroxyde de sodium.
L'ammoniac est entraîné par distillation et recueilli dans une quantité déter-
minée d'acide sulfurique dont l'excès est titré par une solution d'hydroxyde de
sodium.
3.Réactifs
3.1 Sulfate de potassium
3.2 Catalyseur: oxyde cuivrique CuO p.a. ou sulfate cuivrique CuSO4.5H2O
p.a.
3.3 Zinc en granulés
3.4 Acide sulfurique, ρ20= 1,84 g/ml
3.5 Acide sulfurique c(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6 Acide sulfurique c(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7 Indicateur au rouge de méthyle: dissoudre 300 g de rouge de méthyl
dans 100 ml d'éthanol, σ= 95-96 % (v/v)
3.8 Solutiond'hydroxyde de sodium (utilisationpossible de la qualité tech-
nique) β= 40 g/100 ml (m/v: 40 %)
3.9 Solutiond'hydroxyde de sodium c = 0,25 mol/l
3.10 Solutiond'hydroxyde de sodium c = 0,1 mol/l
3.11 Pierre ponce en grains, lavée à l'acide chlorhydrique et calcinée
3.12 Acétanilide (point de fusion = 114 ºC, N = 10,36 %)
3.13 Saccharose (exempt d'azote)
4.Appareillage
Appareils permettant de réaliser les opérations de minéralisation, de distilla-
tionet de titrationselonKjeldahl.
5.Mode opératoire
5.1Minéralisation
Peser, à 1 mg près, 1 g de l'échantillon et introduire la prise d'essai dans
le ballon de l'appareil de minéralisation. Ajouter 15 g de sulfate de
potassium (3.1), une quantité appropriée de catalyseur (3.2) [0,3 à 0,4 g
d'oxyde cuivrique (p.a.) ou 0,9 à 1,2 g de sulfate cuivrique (p.a.)], 25 ml
d'acide sulfurique (3.4) et quelques grains de pierre ponce (3.11) et1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 6
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▼M3
mélanger. Chauffer le ballon d'abord avec modération et en agitant de
temps en temps, si nécessaire, jusqu'à carbonisation de la masse et dispa-
rition de l'écume; ensuite plus intensément jusqu'à ébullition régulière du
liquide. Le chauffage est approprié si l'acide en ébullition se condense
sur la paroi du ballon. Éviter la surchauffe des parois et l'adhérence de
particules organiques. Lorsque la solution apparaît limpide et vert clair,
maintenir l'ébullition durant 2 h encore puis laisser refroidir.
5.2Distillation
Ajouter avec précaution une quantité suffisante d'eau pour garantir une
dissolutioncomplète des sulfates. Laisser refroidir et ajouter quelques
grains de zinc (3.3).
Introduire dans le flacon collecteur de l'appareil à distiller 25 ml exacte-
ment mesurés d'acide sulfurique (3.5) ou (3.6), selon la teneur présumée
en azote. Introduire quelques gouttes d'indicateur au rouge de méthyle
(3.7).
Connecter le ballon au réfrigérant de l'appareil à distiller et plonger
l'extrémité de ce dernier sur une hauteur de 1 cm au moins dans le
liquide du flaconcollecteur (cf.observation 8.3). Verser lentement
100 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.8) dans le ballon de miné-
ralisation sans provoquer de perte d'ammoniac (cf.observation8.1).
Chauffer le ballonjusqu'à distillationcomplète de l'ammon iac.
5.3Titration
Titrer dans le flacon collecteur l'excès d'acide sulfurique par la solution
d'hydroxyde de sodium (3.9) ou (3.10) selonla n ormalité de l'acide
sulfurique utilisé jusqu'à atteindre le point final.
5.4Essai à blanc
Pour confirmer que les réactifs sont exempts d'azote, effectuer un essai à
blanc (minéralisation, distillation et titration) en utilisant 1 g de saccha-
rose (3.13) au lieu de l'échantillon.
6Calcul des résultats
Calculer la teneur en protéines brutes à l'aide de la formule suivante:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
dans laquelle
V0= volume (ml) de NaOH (3.9 ou 3.10) utilisé dans l'essai à blanc
V1= volume (ml) de NaOH (3.9 ou 3.10) utilisé pour la titrationde
l'échantillon
c = normalité (mol/l) de l'hydroxyde de sodium (3.9 ou 3.10)m = masse (g) d'échantillon.
7.Vérification de la méthode
7.1Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effec-
tuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:
— 0,2 % en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes infé-
rieures à 20 %,
— 1,0 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en
protéines brutes comprises entre 20 et 40 %,
— 0,4 % envaleur absolue pour les ten eurs supérieures à 40 %.
7.2Exactitude
Effectuer l'analyse (minéralisation, distillation et titration) à l'aide de 1,5
à 2,0 g d'acétanilide (3.12) en présence de 1 g de saccharose (3.13); 1 g
d'acétanilide consomme 14,80 ml d'acide sulfurique (3.5). La récupéra-
tiondoit être de 99 % au moin s.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 7
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8.Observations
8.1 L'appareil peut être du type manuel, semi-automatique ou automatique.
Si l'appareil nécessite un transfert entre les étapes de minéralisation et
de digestion, ce transfert doit être effectué sans perte. Si le ballon de
l'appareil à distiller n'est pas équipé d'un entonnoir à robinet, ajouter
l'hydroxyde de sodium immédiatement avant la connexion du ballon au
réfrigérant en versant lentement le liquide le long de la paroi.
8.2 Si le produit minéralisé se solidifie, recommencer la détermination en
utilisant une plus grande quantité d'acide sulfurique (3.4) que celle indi-
quée ci-dessus.
8.3 Pour les produits à faible teneur en azote, le volume d'acide sulfurique
(3.6) à mettre dans le ballon collecteur peut être réduit si nécessaire à
10 ou à 15 ml et porté à 25 ml par additiond'eau.
3.DOSAGE DES PROTÉINES BRUTES SOLUBILISÉES PAR LA
PEPSINE ET L'ACIDECHLORHYDRIQUE
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de déterminer la fraction des protéines brutes solubilisées
par la pepsine et l'acide chlorhydrique dans des conditions déterminées. Elle
est applicable à tous les aliments.
2.Principe
L'échantillon est soumis à un traitement de 48 h à 40 ºC par une solution
chlorhydrique de pepsine. La suspension est filtrée et la teneur en azote du
filtrat est déterminée selon la méthode décrite pour le dosage des protéines
brutes.
3.Réactifs
3.1 Acide chlorhydrique, d: 1,1253.2 Acide chlorhydrique 0,075 N.
3.3 Pepsine à 2,0 U/mg; cette activité est définie et doit être contrôlée selon
la méthode faisant l'objet de la partie 4 de la présente annexe.
3.4 Solution fraîchement préparée à environ 0,02 % (p/v) de pepsine dans
l'acide chlorhydrique (3.2); activité: 400 U/l.
3.5 Émulsion d'antimousse (silicone par exemple).3.6 Tous les réactifs indiqués sous le point 3 de la méthode de dosage des
protéines brutes.
4.Appareillage
4.1 Bain d'eau ou étuve à incubation, réglé à 40 ºC ± 1 ºC.4.2 Appareils à minéraliser et à distiller selon Kjeldahl.
5.Mode opératoire
5.1Mise en solution (v. observation7.2)
Peser, à 1 mg près, 2 g de l'échantillon. Introduire la prise d'essai dans
unballonjaugé de 500 ml et ajouter 450 ml de solutionchlorhydrique de
pepsine (3.4) préalablement portée à 40 ºC. Agiter de façon à éviter la
formation d'agglomérats. Vérifier que le pH de la suspension est inférieur
à 1,7. Porter le ballon dans le bain d'eau ou l'étuve à incubation (4.1) et
l'y maintenir durant 48 h. Agiter après 8, 24 et 32 h. Après 48 h, ajouter
15 ml d'acide chlorhydrique (3.1), refroidir jusqu'à 20 ºC, compléter au
volume avec de l'eau et filtrer.
5.2Minéralisation
Prélever 250 ml du filtrat et les introduire dans le ballon de l'appareil à
distiller (4.2). Ajouter les réactifs nécessaires à la minéralisation comme
indiqué dans la méthode de dosage des protéines brutes, au point 5.1,
deuxième phrase.
Homogénéiser et chauffer à ébullition. S'il y a formation de mousse,
ajouter quelques gouttes d'émulsion d'antimousse (3.5). Maintenir une
ébullitionvive jusqu'à évaporationpresque complète de l'eau. Élimin er1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 8
▼B
▼B
les dernières traces d'eau avec précaution, en réduisant l'intensité du
chauffage. Lorsque la solutionapparaît limpide et in colore (vert clair en
présence de catalyseur à base de cuivre), poursuivre l'ébullition durant 1 h
encore. Laisser ensuite refroidir.
5.3Distillation et titration
Procéder comme indiqué dans la méthode de dosage des protéines brutes,
points 5.2 et 5.3.
5.4Essai à blanc
Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire en l'absence
d'échantillon à analyser.
6.Calcul des résultats
Déduire le volume d'acide sulfurique consommé par l'essai à blanc de celui
consommé par la prise d'essai. 1 ml d'acide sulfurique 0,1 N correspond à
1,4 mg d'azote.
Multiplier la quantité d'azote par le facteur 6,25. Exprimer le résultat en pour
cent de l'échantillon.
Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur un même échantillon ne doit pas dépasser:
— 0,4 en valeur absolue, pour les teneurs inférieures à 20 %;
— 2,0 %, en valeur relative, pour les teneurs comprises entre 20 et 40 %;— 0,8, envaleur absolue, pour les ten eurs supérieures à 40 %.
7.Observations
7.1 Les valeurs obtenues par la présente méthode n'ont pas de lien direct
avec la digestibilité in vivo.
7.2 Les produits dont la teneur en matières grasses dépasse 10 % doivent
être préalablement dégraissés par extraction à l'éther de pétrole (éb.
40—60 ºC).
4.DÉTERMINATIONDE L'ACTIVITÉDE LA PEPSINE
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de contrôler l'activité de la pepsine utilisée pour le
dosage des protéines brutes solubilisées par la pepsine et l'acide chlorhy-
drique.
2.Principe
L'hémoglobine est traitée dans des conditions définies par la pepsine en
milieu chlorhydrique. La fraction non hydrolysée des protéines est précipitée
par l'acide trichloracétique. Le filtrat est additionné d'hydroxyde de sodium et
du réactif selon Folin-Ciocalteu. La densité optique de cette solution est
mesurée à 750 nm et la quantité de tyrosine qui y correspond est lue sur
une courbe d'étalonnage.
Définition: L'unité de pepsine est définie comme étant la quantité de cette
enzyme qui libère, par minute, dans les conditions de la méthode, une quan-
tité de groupements hydroxyaryl dont la coloration par le réactif selon Folin-
Ciocalteu a une densité optique correspondant à celle d'une µmole de tyro-sine, dans les mêmes conditions.
3.Réactifs
3.1 Acide chlorhydrique 0,2 N.
3.2 Acide chlorhydrique 0,06 N.
3.3 Acide chlorhydrique 0,025 N.
3.4 Solutionà 5 % (p/v) d'acide trichloracétique.
3.5 Solutiond'hydroxyde de sodium 0,5 N.3.6 Réactif selon Folin-Ciocalteu. Introduire 100 g de tungstate de sodium
(Na
2WO4.2 H2O), 25 g de molybdate de sodium (Na2MoO4.2 H2O) et
700 ml d'eau dans un ballon à fond rond de 2 l à rodage normalisé.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 9
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Ajouter 50 ml d'acide phosphorique (d: 1,71) et 100 ml d'acide chlorhy-
drique concentré (d: 1,19), ajuster au ballon un réfrigérant à reflux,
chauffer à ébullition et maintenir la solution en ébullition douce durant
10 h. Laisser refroidir, détacher le réfrigérant à reflux, ajouter 175 g de
sulfate de lithium (Li2SO4.2 H2O), 50 ml d'eau et 1 ml de brome. Faire
bouillir durant 15 minutes pour éliminer l'excès de brome.
Laisser refroidir, transvaser la solution dans un ballon jauge de 1 l,
compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer. Il ne peut
subsister de colorationverdâtre. Avan t l'emploi, diluer 1 volume du
réactif par 2 volumes d'eau.
3.7 Solution d'hémoglobine: Peser une quantité d'hémoglobine, substrat
protéique d'après Anson, (2 g environ) correspondant à 354 mg
d'azote (1) et l'introduire dans un ballon de 200 ml à rodage normalisé.
Ajouter quelques ml d'acide chlorhydrique (3.2), relier le ballonà la
pompe à vide et agiter jusqu'à dissolutioncomplète de l'hémoglobin e.
Couper le vide et ajouter tout enagitan t de l'acide chlorhydrique (3.2)
pour compléter à 100 ml. Préparer immédiatement avant l'emploi .
3.8 Solution étalon de tyrosine: Dissoudre 181,2 mg de tyrosine dans l'acide
chlorhydrique (3.1) et compléter à 1 l avec le même acide (solution
mère). Prélever 20,0 ml et diluer à 100 ml par l'acide chlorhydrique
(3.1). 1 ml de cette solution contient 0,2 µmole de tyrosine.
4.Appareillage
4.1 Baind'eau, réglé à 25 ºC ± 0,1 ºC par l'ultrathermostat.
4.2 Spectrophotomètre.
4.3 Chronomètre, précision: 1 seconde.
4.4 pH-mètre.
5.Mode opératoire
5.1Préparation de la solution (v. observation7.1)
Dissoudre 150 mg de pepsine dans 100 ml d'acide chlorhydrique (3.2).
Prélever à la pipette 2 ml de la solution, les introduire dans un ballon
jaugé de 50 ml et compléter au volume par de l'acide chlorhydrique
(3.3). Le pH, contrôlé au pH-mètre, doit être de 1,6 ± 0,1 Plonger le
ballondan s le baind'eau (4.1).
5.2Hydrolyse
Introduire à la pipette dans un tube à essai 5,0 ml de solution d'hémoglo-
bine (3.7), porter à 25 ºC dans le bain d'eau (4.1), ajouter 1,0 ml de la
solution de pepsine obtenue en 5.1 et mélanger à l'aide d'une tige de
verre, épaissie à une extrémité, par environ 10 mouvements de va-et-
vient. Maintenir le tube à essai dans le bain d'eau à 25 ºC durant 10
minutes exactement, comptées à partir de l'addition de la solution de
pepsine (la durée et la température doivent être parfaitement respectées).
Ajouter ensuite 10,0 ml de solution d'acide trichloracétique (3.4), préala-
blement portée à 25 ºC, homogénéiser et filtrer sur un filtre sec.
5.3Développement de la coloration et mesure de la densité optique
Prélever à la pipette 5,0 ml du filtrat, les introduire dans un erlenmeyer
de 50 ml, ajouter 10,0 ml de solutiond'hydroxyde de sodium (3.5) et, en
agitant constamment, 3,0 ml du réactif dilué de Folin-Ciocalteu (3.6).
Après 5 à 10 minutes, déterminer la densité optique de la solution au
spectrophotomètre à 750 nm dans des cuvettes de 1 cm d'épaisseur, par
comparaisonavec de l'eau.
5.4Essai à blanc
Pour chaque détermination, procéder à un essai à blanc comme indiqué
ci-après.
Introduire à la pipette dans un tube à essai 5,0 ml de solution d'hémoglo-
bine (3.7), porter à 25 ºC dans le bain d'eau (4.1), ajouter 10,0 ml de
solutiond'acide trichloracétique (3.4) préalablemen t portée à 25 ºC,
homogénéiser et ajouter ensuite 1,0 ml de la solution de pepsine obtenue1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 10
(1) Déterminer la teneur en azote par un semi-microkjeldahl (teneur théorique: 17,7 %
d'azote).
▼B
en 5.1. Mélanger à l'aide d'une tige de verre et maintenir le tube à essai
10 minutes exactement dans le bain d'eau (4.1) à 25 ºC. Homogénéiser et
filtrer sur unfiltre sec. Poursuivre le mode opératoire comme in diqué en
5.3.
5.5Courbe d'étalonnage
Introduire dans des erlenmeyers de 50 ml des volumes de 1,0; 2,0; 3,0;
4,0 et 5,0 ml de solution étalon de tyrosine (3.8), correspondant respecti-
vement à des quantités de tyrosine de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 et 1,0 µmoles.
Compléter la série par untémoinexempt de tyrosin e. Porter les volumes
à 5,0 ml à l'aide d'acide chlorhydrique (3.1). Ajouter 10,0 ml de solution
d'hydroxyde de sodium (3.5) et, en agitant constamment, 3,0 ml du
réactif dilué de Folin-Ciocalteu (3.6). Mesurer la densité optique comme
indiqué en 5.3, dernière phrase. Tracer la courbe d'étalonnage en portant
les densités optiques en regard des quantités de tyrosine.
6.Calcul des résultats
Lire sur la courbe d'étalonnage la quantité de tyrosine, en µmole, correspon-
dant à la densité optique de la solution colorée, corrigée de l'essai à blanc.
L'activité de la pepsine, en µmole de tyrosine, par mg et par minute, à 25 ºC,
est donnée par la formule:
Unit´es par mg U =mgðÞ ¼0;32 a
p
dans laquelle:
a = quantité de tyrosine, en µmole, lue sur la courbe d'étalonnage;
p = poids en mg de la quantité de pepsine ajoutée en 5.2.
7.Observations
7.1 La quantité de pepsine à mettre en solution doit être choisie de façon à
obtenir, lors de la mesure photométrique finale, une densité optique de
0,35 ± 0,035.
7.2 Deux unités par mg obtenues par la présente méthode correspondent à:
3,64 milliunités Anson/mg (µmole de tyrosine/mg min à 35,5 ºC) ou
36400 unités commerciales/g (µmole de tyrosine/g en 10 min à 35,5 ºC).
5.DOSAGE DU GOSSYPOL LIBRE ET TOTAL
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser le gossypol libre, le gossypol total et les
substances chimiquement apparentées dans les graines, les farines et les tour-
teaux de coton ainsi que dans les aliments composés qui en contiennent. La
limite inférieure du dosage est de 20 ppm.
2.Principe
Le gossypol est extrait en présence de 3-amino-l-propanol, soit par un
mélange d'isopropanol et d'hexane pour le dosage du gossypol libre, soit par
la diméthylformamide pour le dosage du gossypol total. Le gossypol est
transformé au moyen d'aniline en gossypol-dianiline, dont la densité optique
est mesurée à 440 nm.
3.Réactifs
3.1 Mélange isopropanol-hexane: mélanger 60 parts en volume d'isopropanol
p.a. à 40 parts en volume d'hexane normal.
3.2 Solvant A: porter dans un ballon jaugé de 1 l, 500 ml environ du
mélange isopropanol-hexane (3.1), 2 ml de 3-amino-l-propanol, 8 ml
d'acide acétique glacial et 50 ml d'eau. Compléter au volume par le
mélange isopropanol-hexane (3.1). Ce réactif est stable durant une
semaine.
3.3 Solvant B: porter à la pipette dans un ballon jaugé de 100 ml, 2 ml de 3-
amino-l-propanol et 10 ml d'acide acétique glacial. Refroidir à la tempé-
rature ambiante et compléter au volume par la N,N-diméthylformamide.
Ce réactif est stable durant une semaine.
3.4 Aniline p.a.: si la densité optique de l'essai à blanc excède 0,022 ,
distiller l'aniline sur poudre de zinc en éliminant les première et dernière1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 11
▼B
fractions de 10 % du distillat. En flacon bouché de verre brun et au réfri-
gérateur, ce réactif se conserve plusieurs mois.
3.5 SolutionétalonA de gossypol: Porter dan s unballonjaugé de 250 ml,
27,9 mg d'acétate de gossypol. Dissoudre et compléter au volume par le
solvant A (3.2). Introduire à la pipette 50 ml de cette solution dans un
ballonjaugé de 250 ml et compléter au volume par le solvan t A. La
concentration en gossypol de cette solution est de 0,02 mg/ml. Laisser
reposer durant 1 h à la température ambiante, avant l'emploi.
3.6 SolutionétalonB de gossypol: Porter dan s unballonjaugé de 50 ml,
27,9 mg d'acétate de gossypol. Dissoudre et compléter au volume par le
solvant B (3.3). La concentration en gossypol de cette solution est de
0,5 mg/ml.
Conservées à l'abri de la lumière, les solutions étalon A et B de gossypol sont
stables durant 24 h.
4.Appareillage
4.1 Mélangeur (culbuteur): environ 35 retournements par minute.
4.2 Spectrophotomètre.
5.Mode opératoire
5.1Prise d'essai
La prise d'essai est enrapport avec la ten eur présumée engossypol de
l'échantillon. Il est préférable d'opérer sur une petite prise d'essai et sur
une partie aliquote du filtrat relativement importante, de façon à obtenir
une quantité de gossypol suffisante pour effectuer une mesure photomé-
trique précise. Pour le dosage du gossypol libre dans les graines, les
farines et les tourteaux de coton, la prise d'essai ne doit pas excéder 1 g;
pour les aliments composés elle pourra atteindre 5 g. Une partie aliquote
de 10 ml de filtrat convient dans la plupart des cas; elle devra contenir
de 50 à 100 µg de gossypol. Pour le dosage du gossypol total , la prise
d'essai pourra varier de 0,5 à 5 g afinqu'un e partie aliquote de 2 ml de
filtrat contienne de 40 à 200 µg de gossypol.
L'analyse doit être effectuée à une température ambiante proche de
20 ºC.
5.2Dosage du gossypol libre
Introduire la prise d'essai dans un ballon à col rodé de 250 ml, dont le
fond est recouvert de verre pilé. Ajouter à la pipette 50 ml de solvant
A (3.2), boucher le ballon et mélanger durant 1 h dans le culbuteur.
Filtrer sur filtre sec et recueillir le filtrat dans un petit ballon à col
rodé. Au cours de la filtration, recouvrir l'entonnoir d'un verre de montre.
Introduire à la pipette respectivement dans deux ballons jaugés de 25 ml
(A et B) des parties aliquotes identiques de filtrat contenant de 50 à
100 µg de gossypol. Compléter éventuellement le volume à 10 ml à
l'aide du solvant A (3.2). Compléter ensuite au volume le contenu du
ballon (A) par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Cette solution sera
utilisée comme solutionde référen ce pour la mesure de la solutionde
l'échantillon.
Introduire à la pipette 10 ml du solvant A (3.2) respectivement dans deux
autres ballons jaugés de 25 ml (C et D). Compléter au volume le contenu
du ballon (C) par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Cette solution
sera utilisée comme solutionde référen ce pour la mesure de la solution
de l'essai à blanc.
Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) respectivement dans les ballons (D) et (B).
Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante pour développer
la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume
par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer
durant 1 h.
Déterminer au spectrophotomètre à 440 nm, dans des cuvettes en verre
de 1 cm, la densité optique de la solution de l'essai à blanc (D) par
comparaison avec la solution de référence (C) et la densité optique de
la solutionde l'échan tillon(B) par comparaisonavec la solutionde réfé-
rence (A).
Soustraire la densité optique de la solution de l'essai à blanc de celle de
la solution de l'échantillon (= densité optique corrigée). Calculer à partir
de cette valeur la teneur en gossypol libre comme indiqué en 6.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 12
▼B
5.3Dosage du gossypol total
Introduire une prise d'essai contenant de 1 à 5 mg de gossypol dans un
ballonjaugé de 50 ml et ajouter 10 ml de solvan t B (3.3). Préparer
simultanément un essai à blanc, en introduisant 10 ml de solvant B
(3.3), dans un autre ballon jaugé de 50 ml. Chauffer les 2 ballons durant
30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température
ambiante et compléter le contenu de chaque ballon au volume par le
mélange isopropanol-hexane (3.1). Homogénéiser et laisser déposer
pendant 10 à 15 minutes, filtrer ensuite et recueillir les filtrats dans des
ballons à col rodé.
Porter à la pipette 2 ml du filtrat de l'échantillon respectivement dans
deux ballons jaugés de 25 ml et 2 ml du filtrat de l'essai à blanc respec-
tivement dans deux autres ballons de 25 ml. Prélever un ballon de
chaque série et compléter les contenus respectifs à 25 ml par le mélange
isopropanol-hexane (3.1). Ces solutions seront utilisées comme solutions
de référence.
Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) respectivement dans les deux autres ballons.
Chauffer durant 30 minutes sur bain d'eau bouillante pour développer la
coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter à 25 ml par le
mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant
1h .
Déterminer la densité optique comme indiqué en 5.2 pour le gossypol
libre. Calculer à partir de cette valeur la teneur en gossypol total comme
indiqué en 6.
6.Calcul des résultats
Le calcul des résultats peut se faire soit à partir de la densité optique spéci-
fique (6.1), soit en se référant à une courbe d'étalonnage (6.2).
6.1A partir de la densité optique spécifique
Dans les conditions décrites, les densités optiques spécifiques sont les
suivantes:
gossypol libre: E1%
1c m¼625
gossypol total: E1%
1c m¼600
La teneur en gossypol libre ou total de l'échantillon est donnée par la
formule suivante:
gossypol % ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
dans laquelle:
E = densité optique corrigée, déterminée comme indiqué en 5.2,
p = prise d'essai eng,
a = partie aliquote du filtrat enml.
6.2A partir d'une courbe d'étalonnage
6.2.1 Gossypol libre
Préparer 2 séries de 5 ballons jaugés de 25 ml. Dans chaque série,
introduire à la pipette dans les ballons des volumes respectifs de
2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 et 10,0 ml de la solutionétalonA de
gossypol (3.5). Compléter les volumes à 10 ml à l'aide du solvant
A (3.2). Compléter chaque série par untémoincon stitué d'un
ballon jaugé de 25 ml contenant uniquement 10 ml de solvant A
(3.2).
Compléter à 25 ml le volume des ballons de la première série (y
compris le témoin) par le mélange isopropanol-hexane (3.1) (série
de référence).
Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) dans chaque ballon de la seconde série
(y compris le témoin). Chauffer durant 30 minutes sur un bain
d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la
température ambiante, compléter au volume par le mélange isopro-
panol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h
(série étalon).1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 13
▼B
Déterminer dans les conditions indiquées en 5.2 la densité optique
des solutions de la série étalon par comparaison avec les solutions
correspondantes de la série de référence. Tracer graphiquement la
courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des
quantités de gossypol (en µg).
6.2.2 Gossypol total
Préparer 6 ballons jaugés de 50 ml. Introduire dans le premier
ballon 10 ml de solvant B (3.3) et dans les autres respectivement
2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 et 10,0 ml de la solutionétalonB de
gossypol (3.6). Compléter le contenu de chaque ballon à 10 ml à
l'aide du solvant B (3.3). Chauffer durant 30 minutes sur un bain
d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante, compléter au
volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1) et homogénéiser.
Introduire 2,0 ml de ces solutions respectivement dans deux séries
de 6 ballons jaugés de 25 ml. Compléter à 25 ml le contenu des
ballons de la première série par le mélange isopropanol-hexane
(3.1) (série de référence).
Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) dans chaque ballon de la seconde série.
Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir
à la température ambiante, compléter au volume par le mélange
isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant
1 h (série étalon).
Déterminer dans les conditions indiquées en 5.2 la densité optique
des solutions de la série étalon par comparaison avec les solutions
correspondantes de la série de référence. Tracer graphiquement la
courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des
quantités de gossypol (en µg).
6.3Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effec-
tuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:
— 15 %, en valeur relative, pour les teneurs en gossypol inférieures à
500 ppm,
— 75 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 500 et
750 ppm,
— 10 %, envaleur relative, pour les ten eurs supérieures à 750 ppm.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 14
▼B
ANNEXE II
1.DÉTECTION ET IDENTIFICATION DES ANTIBIOTIQUES DU
GROUPE DES TÉTRACYCLINES
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de déceler et d'identifier les antibiotiques du groupe des
tétracyclines dans les aliments qui en contiennent au moins 0,1 ppm, les
concentrats et les prémélanges.
2.Principe
L'échantillon est soumis à l'extraction par un mélange de méthanol et d'acide
chlorhydrique. L'extrait est chromatographié sur papier par voie ascendante
comparativement à des solutions de référence. Les antibiotiques sont décelés
et identifiés par comparaison de leurs valeurs Rf avec celles des substances
étalon, soit par fluorescence en lumière UV (fortes teneurs en antibiotiques),
soit par bioautographie sur milieu gélosé inoculé avec B. cereus .
3.Réactifs et milieu de culture
3.1Tampon, pH 3,5
Acide citrique monohydraté p.a. 10,256 g
Phosphate disodique Na2HPO42H2O p.a. 7,45 g
Acétone p.a. 300 ml
Eau distillée ad 1000 ml
3.2Tampon phosphate, pH 5,5
Phosphate monopotassique KH2PO4p.a. 130,86 g
Phosphate disodique Na2HPO4.2H2O p.a. 6,947 g
Eau distillée ad 1000 ml
3.3 Éluant I: Mélange nitrométhane pur/chloroforme pur/ α— dichlorhy-
drine: 20/10/1,5 en volume. Préparer au moment de l'emploi.
3.4 Éluant II: Mélange nitrométhane pur/chloroforme pur/ α-picoline: 20/
10/3 envolume. Préparer au momen t de l'emploi.
3.5 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d: 1,19): 98/2 en volume.3.6 Acide chlorhydrique 0,1 N.
3.7 Ammoniaque, d: 0,91.
3.8 Substances étalon: chlortétracycline, oxytétracycline, tétracycline dont
l'activité est exprimée enchlorhydrate.
3.9Microorganisme; B. cereus ATCC n
o11.778
Entretien de la souche, préparation de la suspension de spores et inocu-
lationdu milieu de culture: appliquer les prescription s 3.1 et 3.2 de la
méthode de dosage de la chlortétracycline, de l'oxytétracycline et de la
tétracycline, par diffusion sur gélose, faisant l'objet de la partie 2 de laprésente annexe.
3.10Milieu de culture (
1)
Glucose 1 g
Peptone trypsique 10 gExtrait de viande 1,5 g
Extrait de levure 3 g
Gélose 20 g1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 15
(1) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé
▼B
Eau distillée ad 1000 ml
Ajuster le pH à 5,8 au moment de l'emploi.
3.11 Solutionà 0,1 % (p/v) de chlorure de 2,3,5-triphén yltétrazolium et 5 %
(p/v) de glucose.
4.Appareillage
4.1 Appareillage pour chromatographie ascendante sur papier (hauteur du
papier: 25 cm). Papiers Schleicher et Schüll 2040 b ou 2043 b, ou équi-
valents.
4.2 Centrifugeuse.
4.3 Étuve à incubation, réglée à 30 ºC.
4.4 Lampe UV pour détectionde la fluorescen ce.
4.5 Plaques de verre de 20 × 30 cm environ, permettant le montage d'une
boîte plate pour la bioautographie.
5.Solutions étalon
5.1Solutions-mère
Préparer, à partir des substances étalon (3.8) et à l'aide d'acide chlorhy-
drique (3.6), des solutions dont la concentration correspond
respectivement à 500 µg de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl
et de tétracycline-HCl par ml.
5.2Solutions de référence pour la détection en lumière UV
Diluer les solutions (5.1) par le tampon phosphate (3.2) pour obtenir des
solutions dont la concentration correspond à 100 µg de chlortétracycline-
HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml.
5.3Solutions de référence pour la détection par bioautographie
Diluer les solutions (5.1) par le tampon phosphate (3.2) pour obtenir des
solutions dont la concentration correspond à 5 µg de chlortétracycline-
HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml.
6.Extraction
Lorsque la teneur présumée en antibiotique est inférieure à 10 ppm, on peut
utiliser soit l'échantillon homogénéisé, soit la fraction la plus fine séparée par
tamisage, étant donné que les antibiotiques se trouvent de préférence dans
cette fraction.
Mettre l'échantillon en suspension dans le mélange (3.5) et centrifuger.
Recueillir le liquide surnageant pour l'utiliser tel quel ou le diluer, si néces-
saire, par le mélange (3.5) pour obtenir des concentrations en antibiotique de
100 µg (6.1) et 5 µg (6.2) environ par ml.
7.Détection et identification
7.1Chromatographie
Plonger le papier dans la solution tampon, pH 3,5 (3.1). Éliminer l'excès
de liquide en comprimant le papier entre des feuilles de papier filtre sec.
Déposer ensuite sur le papier desvolumes de 0,01 ml des solutions de
référence (5.2 et 5.3) et de l'extrait (6.1 et 6.2). Pour obtenir une bonne
séparation, la teneur appropriée en humidité du papier est déterminante;
le cas échéant, laisser sécher légèrement.
Développer par chromatographie ascendante. Utiliser l'éluant I (3.3) pour
la détectionpar bioautographie, l'éluan t II (3.4) pour la détectionen
lumière UV. Lorsque le front de solvant atteint 15 à 20 cm de haut
(environ 1 h 30), interrompre la chromatographie et sécher le papier.
7.2Détection en lumière UV
Lorsque la teneur en antibiotique est supérieure à 1 µg/cm2, onperçoit
des taches fluorescentes jaune or par irradiation sous la lampe UV (4.4)
après traitement du chromatogramme par des vapeurs ammoniacales
(3.7).1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 16
▼B
7.3Détection par bioautographie
Verser le milieu de culture (3.10), préalablement inoculé par B. cereus
(3.9), sur des plaques de verre (4.5) et poser le papier sur le milieu de
culture. Après 5 minutes de contact, détacher le papier et poser celui-ci
sur un autre endroit du milieu de culture, où il sera maintenu durant la
période d'incubation. Incuber ensuite durant une nuit à l'étuve à 30 ºC.
La présence d'un antibiotique du groupe des tétracyclines se marque par
des zones d'inhibition claires dans le milieu de culture trouble.
Pour fixer le chromatogramme, onvaporise la solution(3.11) sur le
papier, après incubation.
7.4Identification
Les valeurs Rf relatives des antibiotiques du groupe des tétracyclines
sont données ci-après. Ces valeurs peuvent varier légèrement selon la
qualité du papier et sa teneur en humidité.
Chlortétracycline (CTC) 0,60
Tétracycline (TC) 0,40
Oxytétracycline (OTC) 0,20
4-épi-CTC 0,154-épi-TC 0,13
4-épi-OTC 0,10
Les composés «épi» ont une activité antibiotique inférieure à celle des
composés normaux.
2.DOSAGE DE LA CHLORTÉTRACYCLINE, DE L'OXYTÉTRACY-
CLINE ET DE LA TÉTRACYCLINE
A. PAR DIFFUSION SUR GÉLOSE
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser la chlortétracycline (CTC), l'oxytétracycline
(OTC) et la tétracycline (TC) dans les aliments, les concentrats et les prélé-
manges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm. Les teneurs inférieures
à 5 ppm peuvent être estimées par interpolation graphique.
2.Principe
Pour les teneurs égales ou inférieures à 50 ppm, l'échantillon est soumis à
l'extractionpar la formamide diluée. Pour les ten eurs supérieures à 50 ppm,
il est soumis à l'extraction par un mélange d'acétone, d'eau et d'acide chlor-
hydrique pour le dosage de la CTC et par un mélange de méthanol et d'acide
chlorhydrique pour le dosage de l'OTC et de la TC.
Les extraits sont ensuite dilués et leur activité antibiotique est déterminée par
la mesure de la diffusionde la CTC, de l'OTC ou de la TC dan s unmilieu
gélosé ensemencé avec B. cereus . La diffusionest in diquée par la formation
de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces
zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de
l'antibiotique.
3.Microorganisme: B. cereus ATCC n
o11.778
3.1Entretien de la souche
Inoculer B. cereus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de
culture (4.1), exempt de bleu de méthylène et d'acide borique . Incuber
durant une nuit à 30 ºC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et
repiquer tous les 14 jours sur gélose inclinée.
3.2Préparation de la suspension de spores
Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) à l'aide de 2 à 3 ml
de sérum physiologique (4.5). Ensemencer avec cette suspension un
flacon de Roux contenant 300 ml du milieu de culture (4.1), exempt de
bleu de méthylène et d'acide borique , dont la concentration en gélose est
de 3 à 4 %. Incuber 3 à 5 jours à 28-30 ºC, récolter ensuite les spores
dans 15 ml d'éthanol (4.6), après avoir vérifié la sporulation sous le
microscope, et homogénéiser. Cette suspension peut être conservée en
réfrigérateur durant 5 mois au moins.
Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage
(4.1), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les
différentes concentrations d'antibiotique utilisées, des zones d'inhibition1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 17
▼B
aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. Cette quantité est
généralement de 0,2 à 0,3 ml/1000 ml. L'inoculation du milieu de culture
se fait entre 50 et 60 ºC.
4.Milieux de culture et réactifs
4.1Milieu de base du dosage (1)
Glucose 1 g
Peptone trypsique 10 gExtrait de viande 1,5 g
Extrait de levure 3 g
Gélose, selonla quan tité 10 à 20 gTween80 1 ml
Tamponphosphate, pH 5,5 (4.2) 10 ml
Solutionà 5 % (p/v) d'acide borique 15 mlSolutionéthan olique à 0,5 % de bleu de
méthylène 4 ml
Eau distillée ad 1000 ml
Ajuster à pH 5,8 avant l'emploi
4.2Tampon phosphate, pH 5,5
Phosphate monopotassique KH
2PO4p.a. 130,86 g
Phosphate disodique Na2HPO4.2H2O p.a. 6,947 g
Eau distillée ad 1000 ml
4.3 Tamponphosphate, pH 5,5, dilué à 1/10
4.4Tampon phosphate, pH 8
Phosphate monopotassique KH2PO4p.a. 1,407 g
Phosphate disodique Na2HPO4.2H2O p.a. 57,539 g
Eau distillée ad 1000 ml
4.5 Sérum physiologique stérile
4.6 Éthanol à 20 % (v/v)
4.7 Acide chlorhydrique 0,1 N
4.8 Formamide à 70 % (v/v): préparer fraîchement avant l'emploi et ajuster
le pH 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 2 N environ.
4.9 Mélange acétone pur/eau/acide chlorhydrique (d: 1,19): 65/33/2 en
volume.
4.10 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d: 1,19): 98/2 en volume.
4.11 Substances étalon: CTC, OTC, TC dont l'activité est exprimée en chlor-
hydrate.
5.Solutions étalon
5.1Chlortétracycline
Préparer, à partir de la substance étalon (4.11) et à l'aide d'acide chlor-
hydrique (4.7), une solution-mère dont la concentration correspond à
500 µg de chlortétracycline-HCl par ml Cette solution se conserve une
semaine en réfrigérateur.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 18
(1) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé.
▼B
A partir de cette solution-mère, préparer une solution étalon de travail S8dont la concentration correspond à 0,2 µg de chlortétracycline-HCl par
ml. La dilutionest faite à l'aide du tamponphosphate, pH 5,5 dilué à 1/
10 (4.3), additionné de 0,01 % de noir amido (1).
Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon
(4.3), les concentrations suivantes:
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2Oxytétracycline
En procédant comme indiqué en 5.1, préparer, à partir d'une solution-
mère dont la concentration correspond à 400 µg d'oxytétracycline-HCl
par ml, une solution étalon de travail S8à 1,6 µg d'oxytétracycline-HCl
par ml et les concentrations suivantes:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.2Tétracycline
En procédant comme indiqué en 5.1, préparer, à partir d'une solution-
mère dont la concentration correspond à 500 µg de tétracycline-HCl par
ml, une solution étalon de travail S8à 1,0 µg de tétracycline-HCl par ml
et les concentrations suivantes:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Extraction
6.1Teneurs égales ou inférieures à 50 ppm
Traiter la prise d'essai par la formamide (4.8), selon les indications
données dans le tableau ci-dessous. Agiter durant 30 minutes sur table à
secousses. Diluer immédiatement après à l'aide du tampon phosphate
(4.3), selon les indications données dans le tableau ci-dessous, pour
obtenir la concentration U8. La concentration en formamide de cette
solution ne doit pas dépasser 40 %. Centrifuger ou laisser décanter de
manière à obtenir une solution limpide.
Préparer ensuite les concentrations U4,U2et U1par dilutions successives
(1 + 1) à l'aide du tamponphosphate (4.3).
Antibiotique CTC OTC TC
Teneur présumée
enppm 10 50 10 50 10 50
Prise d'essai eng 10 10 24 9,6 20 10
ml de formamide
(4.8) 100 100 80 100 80 100
ml de tampon
phosphate (4.3)dil.
1: 5
(a)dil.
1: 25
(b)70 200 120dil.
1: 5
(a)
Concentration U8enµg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) Prélever 20 ml d'extrait et compléter à 100 ml par le tampondan s unballon
jaugé.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 19
(1) Le noir amido sert à caractériser les zones d'inhibition des solutions étalon (anneaux
bleus).
▼B
(b) Prélever 4 ml d'extrait et compléter à 100 ml par le tampondan s un
ballonjaugé.
6.2Teneurs supérieures à 50 ppm
6.2.1 Chlortétracycline
Traiter, selon la teneur présumée en antibiotique de l'échantillon ou
sa garantie de fabrication, une prise d'essai de 2 à 10 g par 20 fois
son volume de mélange (4.9). Agiter durant 30 minutes sur table à
secousses. Vérifier que le pH reste inférieur à 3 au cours de
l'extraction; si nécessaire, ajuster à pH 3 (pour les composés miné-
raux, à l'aide d'acide acétique à 10 %). Prélever une partie aliquote
de l'extrait et ajuster le pH à 5,5 à l'aide du tamponphosphate, pH
8 (4.4) en présence de vert de bromocrésol (virage du jaune au
bleu). Diluer à l'aide du tamponphosphate, pH 5,5 dilué à 1/10
(4.3) pour obtenir la concentration U8(v. 6.1).
Préparer ensuite les concentrations U4,U2et U1par dilutions
successives (1 + 1) à l'aide du tamponphosphate (4.3).
6.2.2 Oxytétracycline et tétracycline
Procéder comme indiqué en 6.2.1 en remplaçant le mélange (4.9)
par le mélange (4.10).
7.Modalités du dosage
7.1Inoculation du milieu de culture
Inoculer à 50-60 ºC le milieu de base du dosage (4.1) par la suspension
de spores (3.2).
7.2Préparation des boîtes
La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentra-
tions de la solution étalon (S8,S4,S2,S1) et les 4 concentrations de
l'extrait (U8,U4,U2,U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les
4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.
A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse
pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de
diamètre. Calculer la quantité de milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser
de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épais-
seur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes
munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement
plande 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.
Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées
de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le
diamètre.
Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec
chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une
évaluation de 32 zones d'inhibition.
7.3Incubation
Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 ºC.
6.Évaluation
Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence par projection.
Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme
des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les
droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les
deux droites doivent être parallèles.
Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Activité réelle = activité présumée × activité relative.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 20
▼B
9.Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.
B. PAR TURBIDIMÉTRIE
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser la chlortétracycline (CTC), l'oxytétracycline
(OTC) et la tétracycline (TC) aux concentrations supérieures à 1 g/kg, dans
la mesure où aucune autre substance n'interfère en donnant lieu à des extraits
troubles. Cette méthode est plus rapide que la méthode par diffusionsur
gélose.
2.Principe
L'échantillon est soumis à l'extraction par un mélange d'acétone, d'eau et
d'acide chlorhydrique pour le dosage de la CTC et par unmélan ge de
méthanol et d'acide chlorhydrique pour le dosage de l'OTC et de la TC.
Les extraits sont ensuite dilués et leur effet antibiotique est déterminé par la
mesure de la transmission lumineuse d'un milieu de culture ensemencé avec
Staphylococcus aureus et additionné de l'antibiotique. La transmission lumi-
neuse est fonction de la concentration de l'antibiotique.
3.Microorganisme: Staphylococcus aureus K 141 (1)
3.1Entretien de la souche
Inoculer S. aureus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de
culture (4.1), additionné de 1,5 à 3 % de gélose (selonla qualité).
Incuber durant une nuit à 37 ºC. Conserver la culture en réfrigérateur et
repiquer toutes les 4 semaines sur gélose inclinée. Préparer simultané-
ment des sous-cultures pour l'usage de laboratoire.
3.2Préparation de l'inoculum
24 h avant son utilisation, repiquer une sous-culture sur gélose inclinée
et incuber durant une nuit à 37 ºC. Mettre en suspension la totalité de
la culture d'un tube de gélose dans 2 ml environ du milieu de base
(4.1) et transvaser ensuite la suspension dans des conditions stériles
dans 100 ml environ du même milieu de base (4.1). Incuber au bain
d'eau à 37 ºC, jusqu'à ce que la croissance de la souche entre dans sa
phase logarithmique (1 h 30 à 2 h).
4.Milieux de culture et réactifs
4.1Milieu de base du dosage (2)
Peptone 5 g
Extrait de levure 1,5 gExtrait de viande 1,5 g
Chlorure de sodium 3,5 g
Glucose 1,0 gPhosphate monopotassique KH
2PO4p.a. 1,32 g
Phosphate bipotassique K2HPO4p.a. 3,68 g
Eau distillée ad 1000 ml
pH après stérilisation: 6,8 à 7,0
4.2Tampon phosphate, pH 4,5
Phosphate monopotassique KH2PO4p.a. 13,6 g
Eau distillée ad 1000 ml
4.3 Acide chlorhydrique 0,1 N1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 21
(1) Cette souche, isolée par la LUFA à Kiel, accuse une croissance plus rapide que S.
aureus ATCC 6538 P .
(2) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé.
▼B
4.4 Mélange acétone pur/eau/acide chlorhydrique (d: 1,19): 65/33/2 en
volume.
4.5 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d: 1,19): 98/2 en volume.4.6 Solutionà 10 % en viron(p/v) de formaldéhyde.
4.7 Substances étalon: OTC, OTC, TC dont l'activité est exprimée en chlor-
hydrate.
5.Solution étalon
Préparer, à partir de la substance étalon (4.7) et à l'aide d'acide chlorhydrique
(4.3) une solution-mère dont la concentration correspond à 400 à 500 µg deCTC-HCl, OTC-HCl ou TC-HCl par ml. Cette solution se conserve une
semaine en réfrigérateur.
6.Extraction
6.1Chlortétracycline
Introduire dans un ballon jaugé de 200 ou 250 ml une prise d'essai de 1 à
2 g. Ajouter 100 ml environ du mélange (4.4) et agiter durant 30 minutes
sur table à secousses. Compléter au volume par le tamponphosphate, pH
4,5 (4.2). Homogénéiser et laisser déposer.
6.2Oxytétracycline et tétracycline
Introduire dans un ballon jaugé de 200 ou 250 ml une prise d'essai de 1 à
2 g. Ajouter 100 ml environ du mélange (4.5) et agiter durant 30 minutes
sur table à secousses. Compléter au volume par le tamponphosphate, pH
4,5 (4.2). Homogénéiser et laisser déposer.
7.Modalités du dosage
7.1Préparation de séries étalon et de l'extrait
Diluer de façonappropriée à l'aide du tamponphosphate, pH 4,5 (4.2) la
solution étalon (5) et l'extrait (6) de manière à obtenir une série de
concentrations qui permette d'établir, pour chaque dosage, une courbe
d'étalonnage et l'interpolation sur cette courbe d'au moins deux valeurs
relatives à l'extrait. Les dilutions doivent être choisies en fonction des
conditions de croissance de la souche, qui peuvent varier d'un laboratoire
à l'autre. On procède généralement comme suit:
7.1.1 Chlortétracycline
Diluer la solutionétalon(5) à l'aide du tamponphosphate (4.2)
pour obtenir une solution étalon de travail dont la concentration
corresponde à 0,2 µg de CTC-HCl par ml. Préparer ensuite à l'aide
du tampon phosphate (4.2), comme indiqué ci-après et dans des
tubes destinés au dosage, 6 dilutions avec une répétition de chaque
dilution.
ml de solutionétalon
de travailml de tamponphos-
phate (4.2)Concentration en
CTT-HCl
(µg/ml/
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Diluer l'extrait (6.1) à l'aide du tamponphosphate (4.2) pour
obtenir une concentration présumée en CTC-HCl de 0,12 µg/ml.
Introduire 1 ml de cette solution dans 2 tubes et 0,75 ml
(= 0,09 µg) dans 2 autres tubes. Compléter le volume des 2
derniers tubes à 1 ml par le tampon phosphate (4.2).1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 22
▼B
7.1.2 Oxytétracycline et tétracycline
Diluer la solutionétalon(5) à l'aide du tamponphosphate (4.2)
pour obtenir une solution étalon de travail dont la concentration
corresponde à 0,6 µg d'OTC-HCl ou de TC-HCl par ml. Préparer
ensuite à l'aide du tampon phosphate (4.2) comme indiqué ci-après
et dans des tubes destinés au dosage, 7 dilutions avec une répéti-
tionde chaque dilution .
ml de solutionétalon
de travailml de tamponphos-
phate (4.2)Concentration en
OCT-HCl ou TC-HCl
(µg/ml/
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,12
Diluer l'extrait (6.2) par le tamponphosphate (4.2) pour obten ir
une concentration présumée en OTC-HCl ou TC-HCL de 0,48 µg/
ml. Introduire 1 ml de cette solution dans 2 tubes et 0,5 ml
(= 0,24 µg) dans 2 autres tubes. Compléter le volume des 2
derniers tubes à 1 ml par le tampon phosphate (4.2).
7.2Inoculation du milieu de culture
Inoculer le milieu de base du dosage (4.1) par l'inoculum (3.2) de
manière à obtenir au photomètre à 590 nm une transmission lumineuse
de 85 % dans une cuvette de 5 cm ou de 92 % dans une cuvette de
2 cm, l'appareil étant réglé à 100 % de transmission sur le milieu de
base (4.1) non inoculé.
7.3Ensemencement
Introduire dans chaque tube (7.1.1 ou 7.1.2) 9 ml du milieu de culture
inoculé (7.2). Le remplissage des tubes doit se faire proprement, mais
pas nécessairement dans des conditions stériles.
7.4Incubation
L'incubation doit se faire obligatoirement dans un bain d'eau dont la
température est maintenue homogène à 37 ºC ± 0,1 ºC par agitation. Le
temps d'incubation doit être choisi de manière à pouvoir tracer des
courbes de transmission dont la pente est appropriée à des mesures
précises (généralement 2 h 30 à 3 h). Bloquer ensuite la croissance en
injectant rapidement 1 ml de solution de formaldéhyde (4.6) dans chaquetube.
7.5Mesure de la croissance
Mesurer les transmissions au photomètre à 590 nm, en réglant l'appareil
à 100 % de transmission sur la solution étalon la plus limpide (corres-
pondant à la teneur la plus élevée en antibiotique). En raison des faibles
différences de turbidité présentées par les différents tubes, il est recom-
mandé d'utiliser des cuvettes de 2 cm au moins et, de préférence, de
5 cm.
8.Calcul des résultats
Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage sur papier millimétré en portant
les transmissions photométriques en regard des concentrations en antibio-
tique. Interpoler sur la courbe les transmissions relatives à l'extrait. Calculer
la teneur en antibiotique de l'échantillon.
9.Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 23
▼B
3.DOSAGE DE L'OLÉANDOMYCINE
— par diffusionsur gélose —
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser l'oléandomycine dans les aliments, les concen-
trats et les prémélanges, même en présence de tétracyclines. La limite
inférieure du dosage est de 0,5 ppm.
2.Principe
L'échantillon est soumis à l'extraction par une solution méthanolique diluée
de tris (hydroxyméthyl) aminométhane. Après centrifugation, l'extrait est
dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion
de l'oléandomycine dans un milieu gélosé ensemencé avec B. cereus .L a
diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du
microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au
logarithme de la concentration de l'antibiotique.
3.Microorganisme: B. cereus K 250 TR (1) (résistant aux tétracyclines)
3.1Entretien de la souche
Inoculer B. cereus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de
culture (4.1) et additionnée de 100 µg d'oxytétracycline par 5 ml. Incuber
durant une nuit à 30 ºC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et
repiquer toutes les 4 semaines sur gélose inclinée.
3.2Préparation de la suspension de spores
Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) à l'aide de 3 ml
environ du sérum physiologique (4.3). Ensemencer avec cette suspension
un flacon de Roux contenant 300 ml du milieu de culture (4.1) dont la
concentration en gélose est de 3 à 4 % . Incuber 3 à 5 jours à 28-30 ºC,
récolter ensuite les spores dans 15 ml d'éthanol (4.4), après avoir vérifié
la sporulation sous le microscope, et homogénéiser. Cette suspension
peut être conservée en réfrigérateur durant 5 mois au moins.
Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage
(4.2), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les
différentes concentrations d'oléandomycine utilisées, des zones d'inhibi-
tion aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. Cette
quantité est généralement de 0,1 à 0,2 ml/1000 ml. L'inoculation du
milieu de culture se fait à 60 ºC.
4.Milieux de culture et réactifs
4.1Milieu d'entretien de la souche (2)
Glucose 1 g
Peptone trypsique 10 gExtrait de viande 1,5 g
Extrait de levure 3 g
Gélose, selonla qualité 10 à 20 gEau distillée ad 1000 ml
Ajuster le pH à 6,5 au moment de l'emploi
4.2Milieu de base du dosage (
2)
Milieu (4.1) ajusté à pH 8,8
4.3 Sérum physiologique stérile4.4 Éthanol à 20 % (v/v)4.5 Méthanol, pur
4.6 Solution à 0,5% (p/v) de tris (hydroxyméthyl) amino-méthane p.a.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 24
(1) Souche isolée par la LUFA à Kiel.
(2) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé.
▼B
4.7Solution d'extraction
Méthanol, pur 50 ml
Eau distillée 50 ml
Tris (hydroxyméthyl)amino-méthane p.a. 0,5 g
4.8 Substance étalon: oléandomycine d'activité connue.
5.Solution étalon
Dissoudre de la substance étalon (4.8) dans 5 ml de méthanol (4.5) et diluer
par la solution (4.6) pour obtenir une concentration en oléandomycine de
100 µg/ml.
A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par la solution (4.6) une
solutionétalonde travail S
8contenant 0,1 µg d'oléandomycine par ml.
Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide de la solution
(4.6) les concentrations suivantes:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml
S10,0125 µg/ml
6.Extraction
Prélever, selon la teneur présumée en oléandomycine de l'échantillon, une
prise d'essai de 2 à 10 g, ajouter 100 ml de la solution(4.7) et agiter duran t
30 minutes sur table à secousses.
Centrifuger, prélever une partie aliquote de l'extrait et diluer par la solution
(4.6) pour obtenir une concentration présumée en oléandomycine de 0,1 µg/
ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4,U2et U1par dilutions
successives (1 + 1) à l'aide de la solution(4.6).
7.Modalités du dosage
7.1Inoculation du milieu de culture
Inoculer à 60 ºC le milieu de base du dosage (4.2) par la suspension de
spores (3.2).
7.2Préparation des boîtes
La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentra-
tions de la solution étalon (S8,S4,S2,S1) et les 4 concentrations de
l'extrait (U8,U4,U2,U1) .Chaque boîte doit recevoir nécessairement les
4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.
A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse
pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de
diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser
de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épais-
seur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes
munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement
plande 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.
Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées
de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le
diamètre.
Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec
chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une
évaluation de 32 zones d'inhibition.
7.3Incubation
Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 ºC.
8.Évaluation
Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection.
Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme
des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 25
▼B
droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les
deux droites doivent être parallèles.
Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Activité réelle = activité présumée × activité relative.
9.Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 % m, en valeur relative.
4.DOSAGE DE LA TYLOSINE
— par diffusionsur gélose —
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser la tylosine dans les aliments, les concentrats et
les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 2 ppm.
2.Principe
L'échantillon est traité par une solution tampon phosphate à pH 8, préalable-
ment portée à 80 ºC, et soumis ensuite à l'extraction par le méthanol. Après
centrifugation, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée
par la mesure de la diffusion de la tylosine dans un milieu gélosé ensemencé
avecSarcina lutea . La diffusion est indiquée par la formation de zones
d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est
directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique.
3.Microorganisme: Sarcina lutea ATCC no9341
3.1Entretien de la souche
Inoculer Sarcina lutea sur gélose inclinée en tube constituée par le
milieu de culture (4.1), ajusté à pH 7,0. Incuber durant une nuit à 35 ºC
environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les mois
sur gélose inclinée.
3.2Préparation de la suspension de germes
Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) de préparation
récente, par 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.4). Ensemencer avec
cette suspension un flacon de Roux contenant 250 ml du milieu de
culture (4.1), ajusté à pH 7,0. Incuber durant 24 h à 35 ºC, récolter les
germes à l'aide de 25 ml de sérum physiologique (4.4). Homogénéiser et
diluer cette suspension pour obtenir une transmission lumineuse de 75 %
environ à 650 nm.
Conservée en réfrigérateur, cette suspension est utilisable durant une
semaine.
Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage
(4.1), déterminer la quantité d'inocolum permettant d'obtenir pour les
différentes concentrations de tylosine utilisée des zones d'inhibition aussi
étendues que possible et qui soient encore nettes. L'inoculation du milieu
de culture se fait à 48—50 ºC.
4.Milieux de culture et réactifs
4.1Milieu de base du dosage (1)
Glucose 1 g
Peptone trypsique 10 g
Extrait de viande 1,5 g1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 26
(1) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé.
▼B
Extrait de levure 3 g
Gélose, selonla qualité 10 à 20 g
Eau distillée ad 1000 ml
Ajuster au moment de l'emploi à pH 7,0 pour l'entretien de la souche et
la préparationde la suspen sionde germes et à pH 2,0 pour le dosage.
4.2Tampon phosphate ,p H8
Phosphate monopotassique KH2PO4p.a. 0,523 g
Phosphate bipotassique K2HP O4p.a. 16,730 g
Eau distillée ad 1000 ml
4.3Tampon phosphate, pH 7
Phosphate monopotassique KH2PO4p.a. 5,5 g
Phosphate bipotassique K2HP O4p.a. 13,6 g
Eau distillée ad 1000 ml
4.4 Sérum physiologique stérile
4.5 Méthanol, pur4.6 Méthanol à 10 % (v/v)4.7 Mélange tampon phosphate (4.2)/méthanol pur: 60/40 en volume.4.8 Substance étalon: tylosine connue.
5.Solutions étalon
Sécher la substance étalon (4.8) durant 3 h à 60 ºC dans une étuve à vide
(5 mm de mercure). Peser 10 à 50 mg dans un ballon jaugé, les dissoudre
dans 5 ml de méthanol (4.5) et diluer la solution par le tampon phosphate,
pH 7 (4.3) pour obtenir une concentration en tylosine-base de 1000 µg/ml.
A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par le mélange (4.7) une
solutionétalonde travail S
8contenant 2 µg de tylosine-base par ml.
Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.7),
les concentrations suivantes:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extraction
Prélever pour les concentrats une prise d'essai de 10 g; pour les prémélanges
et les aliments une prise d'essai de 20 g. Ajouter 60 ml de tampon phosphate,
pH 8 (4.2), préalablement portés à 80 ºC, et homogénéiser durant 2 minutes
(appareil ménager, Ultra-turrax, etc.).
Laisser ensuite reposer 10 minutes, ajouter 40 ml de méthanol (4.5) et homo-
généiser durant 5 minutes. Centrifuger, prélever une partie aliquote de
l'extrait et diluer par le mélange (4.7) pour obtenir une concentration
présumée entylosin e de 2 µg/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations
U4,U2et U1par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.7).
Pour les teneurs inférieures à 10 ppm, évaporer l'extrait à sec dans un évapo-
rateur rotatif à 35 ºC et reprendre le résidu par du méthanol à 40 % (4.6).
7.Modalités du dosage
7.1Inoculation du milieu de culture
Inoculer à 48—50 ºC le milieu de base du dosage (4.1), ajusté à pH 8,0,
par la suspension de germes (3.2).1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 27
▼B
7.2Préparation des boîtes
La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentra-
tions de la solution étalon (S8,S4,S2S1) et les 4 concentrations de
l'extrait (U8,U4,U2,U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les
4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.
A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse
pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de
diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser
de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épais-
seur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes
munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement
plande 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.
Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées
de solution d'antibiotique comprise entre 0,10 et 0,15 ml, selon le
diamètre.
Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec
chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une
évaluation de 32 zones d'inhibition.
7.3Incubation
Incuber les boîtes durant une nuit à 35—37 ºC.
8.Évaluation
Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection.
Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme
des concentrations en regard des diamètres de zones d'inhibition. Tracer les
droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les
deux droites doivent être parallèles.
Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Activité réelle = activité présumée × activité relative.
9.Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées
sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.
5.DOSAGE DE LA VIRGINIAMYCINE
— par diffusionsur gélose —
1.Objet et domaine d'application
La méthode permet de doser la virginiamycine dans les aliments et les
prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 2 mg/kg (2 ppm)(1).
2.Principe
L'échantillon est soumis à une extraction par une solution méthanolique de
Tween 80. L'extrait est décanté ou centrifugé, puis dilué. Son activité antibio-
tique est déterminée par mesure de la diffusion de la virginiamycine dans un
milieu gélosé, ensemencé avec Micrococcus luteus . La diffusionse révèle par
la formation de zones d'inhibition du micro-organisme. Le diamètre de ces
zones est considéré comme étant directement proportionnel au logarithme de
la concentration en antibiotique pour la gamme des concentrations utilisées.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 28
(1) 1 mg de virginiamycine équivaut à 1 000 unités «UK».▼M2
▼M2
3.Micro-organisme: «Micrococcus luteus» ATCC9341(NCTC8340, NCIB
8553)
3.1.Entretien de la souche
Ensemencer le milieu de culture (4.1), en tubes inclinés, par Micro-
coccus luteus . Incuber pendant vingt-quatre heures à 30 ºC, conserver
en réfrigérateur à 4 ºC environ et renouveler l'ensemencement tous les
quinze jours.
3.2.Préparation de la suspension bactérienne (a)
Récolter les germes d'untube de gélose (3.1), de préparationrécen te, à
l'aide de 2 à 3 ml de solution de chlorure de sodium (4.3). Ensemencer
avec cette suspension 250 ml du milieu de culture (4.1) dans une fiole
de Roux et incuber pendant dix-huit à vingt heures à 30 ºC. Récolter les
germes dans 25 ml de solution de chlorure de sodium (4.3) et homogé-
néiser.
Diluer la suspension à 1/10 à l'aide de la solution de chlorure de sodium
(4.3). La transmission lumineuse de la suspension, mesurée à 650 nm
sous une épaisseur de 1 cm par comparaison avec la solution de chlorure
de sodium (4.3), doit être de 75 % environ. Cette suspension peut être
conservée une semaine à 4 ºC environ.
4.Milieux de culture et réactifs
4.1.Milieu d'entretien de la souche et de base du dosage (b)
Peptone de viande 6,0 g
Tryptone 4,0 g
Extrait de levure 3,0 gExtrait de viande 1,5 g
Glucose 1,0 g
Gélose 10,0 à 20,0 g
Eau 1 000 ml
pH 6,5 (après stérilisation)
4.2.Tampon phosphate, pH 6
Hydrogenophosphate de potassium, K
2HPO42,0 g
Dihydrogenophosphate de potassium, KH2PO48,0 g
Eau jusqu'à 1 000 ml
4.3. Solutionà 0,8 % (p/v) de chlorure de sodium: dissoudre dan s l'eau 8 g
de chlorure de sodium, diluer à 1000 ml et stériliser.
4.4. Méthanol.4.5. Mélange de tampon phosphate (4.2) et de méthanol (4.4): 80/20 (v/v).4.6. Solutionméthan olique à 0,5 % (p/v) de Tween80: dissoudre 5 g de
Tween 80 dans du méthanol (4.4) et diluer à 1 000 ml avec du
méthanol.
4.7. Substance étalon: virginiamycine d'activité connue.
5.Solutions étalons
Dissoudre une quantité exactement pesée de la substance étalon (4.7) dans le
méthanol (4.4) et diluer avec du méthanol (4.4) pour obtenir une solution
mère à 1 000 µg de virginiamycine/ml. Conservée en flacon bouché à 4 ºC,
cette solution est stable pendant cinq jours.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 29
(a) D'autres méthodes peuvent être utilisées dans la mesure où il est prouvé qu'elles produi-
sent des suspensions bactériennes analogues.
(b) Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes
résultats peut être utilisé.
▼M2
Préparer à partir de cette solutionet par dilution s successives à l'aide du
mélange (4.5) les solutions suivantes:
S81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Préparation de l'extrait et des solutions
6.1.Extraction
6.1.1. Produits dont la teneur en virginiamycine ne dépasse pas 100 mg/
kg
Peser une quantité d'échantillon de 50,0 g. Ajouter 200 ml de
solution (4.6), agiter durant trente minutes, puis laisser déposer
ou centrifuger. Prélever 20 ml de la solution surnageante et
évaporer jusqu'à 5 ml dans un évaporateur rotatif à une tempéra-
ture ne dépassant pas 40 ºC. Diluer le résidu à l'aide du mélange
(4.5) pour obtenir une concentration présumée en virginiamycine
de 1 µg/ml (= U8).
6.1.2. Produits dont la teneur en virginiamycine est supérieure à
100 mg/kg
Peser une quantité d'échantillon ne dépassant pas 10,0 g et conte-
nant de 1 à 50 mg de virginiamycine. Ajouter 100 ml de solution
(4.6), agiter durant trente minutes, puis laisser déposer ou centri-
fuger. Diluer la solution surnageante à l'aide du mélange (4.5)
pour obtenir une concentration en virginiamycine de 1 µg/ml (=
U8).
6.2.Solutions de l'extrait
Préparer à partir de la solutionU8et par dilutions successives (1 + 1) à
l'aide du mélange (4.5) les solutions U4(concentration présumée: 0,5 µg/
ml), U2(concentration présumée: 0,25 µg/ml) et U1(concentration
présumée: 0,125 µg/ml.)
7.Modalités du dosage
7.1.Inoculation du milieu de culture
Ensemencer à 50 ºC environ le milieu de base du dosage (4.1) par la
suspension bactérienne (3.2). Par des essais préliminaires sur plaques
avec le milieu (4.1), déterminer la quantité de suspension bactérienne
permettant d'obtenir pour les différentes concentrations en virginiamy-
cine des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient
encore nettes.
7.2.Préparation des boîtes
La diffusionsur gélose s'effectue dan s des boîtes avec les quatre
concentrations de la solution étalon (S8,S4,S2,S1) et les quatre concen-
trations de l'extrait (U8,U4,U2,U1). Chaque boîte doit nécessairement
recevoir les quatre concentrations de l'étalon et de l'extrait. À cet effet,
choisir la dimension des boîtes de telle sorte qu'on puisse creuser dans le
milieu gélosé au moins huit cavités de 10 à 13 mm de diamètre, dont les
centres ne sont pas distants de moins de 30 mm. On peut utiliser comme
boîtes des plaques de verre planes, surmontées d'un anneau d'aluminium
ou de matière plastique de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.
Introduire dans les boîtes une quantité du milieu (4.1), ensemencé
comme indiqué en 7.1, permettant d'obtenir une couche de 2 mm
environ d'épaisseur (60 ml pour une boîte de 200 mm de diamètre).
Laisser solidifier, creuser les cavités et y déposer des volumes exacte-
ment mesurés des solutions de l'étalon et de l'extrait (0,10 à 0,15 mlpar cavité, selon le diamètre). Faire au moins quatre répétitions de
chaque concentration de façon que chaque détermination fasse l'objet
d'une évaluation de 32 zones d'inhibition.
7.3.Incubation
Incuber les boîtes pendant seize à dix-huit heures à 30 ºC ± 2 ºC.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 30
▼M2
8.Évaluation
Mesurer le diamètre des zones d'inhibition à 0,1 mm près. Pour chaque
concentration, enregistrer les mesures moyennes sur papier semi-logarith-
mique en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres
des zones d'inhibition. Tracer les droites les mieux ajustées pour la solution
étalonet pour l'extrait enprocédan t, par exemple, comme suit:
Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus bas de la solution
étalon(SL) à l'aide de la formule:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus élevé de la solution-
étalon(SH) à l'aide de la formule:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Déterminer de la même façon les points les plus appropriés de l'extrait pour
le niveau le plus bas (UL) et le niveau le plus élevé (UH) en remplaçant S1,
S2,S4et S8dans les formules susmentionnées par U1,U2,U4et U8.
Inscrire les valeurs SL et SH sur le même graphique. En joignant les deux
points on obtient la droite la mieux ajustée pour la solution étalon. En procé-
dant de la même façon pour UL et UH on obtient la droite la mieux ajustée
pour l'extrait.
En l'absence de toute interférence, les droites devraient être parallèles. En
pratique, on les considère comme étant parallèles lorsque (SH — SL) et
(UH — UL) ne diffèrent pas de plus de 10 % de leur moyenne.
Si les droites ne sont pas parallèles, on peut éliminer soit U1et S1, soit U8et
S8. Les valeurs SL, SH, UL et UH permettant d'obtenir les droites les mieux
ajustées sont alors calculées à l'aide des formules suivantes:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6ou5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6ou5s8þ2s4/C0s2
6
et de formules analogues pour UL et UH. L'utilisation de cette alternative
impose que les mêmes critères de parallélisme soient respectés.
L'obtention d'un résultat provenant de trois niveaux doit être mentionnée sur
le bulletind'an alyse.
Lorsque les droites sont considérées comme étant parallèles, calculer le loga-
rithme de l'activité relative (log. A) par l'une des formules ci-après, selon le
nombre de niveaux (4 ou 3) utilisés pour l'évaluation du parallélisme.
Pour 4 niveaux:
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C20;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Pour 3 niveaux:
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
ou
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Activité de l'extrait de l'échantillon = activité de l'étalon correspondant × A:
(U8=S8×A )
Si l'activité relative se trouve endehors de la gamme des valeurs comprises
entre 0,5 et 2,0, répéter la détermination en procédant à des ajustements
appropriés des concentrations de l'extrait ou, éventuellement, des solutions
étalons. Lorsque cette activité ne peut être ramenée dans la gamme des
valeurs requises, le résultat doit être considéré comme approximatif et cette
indication doit être notée sur le bulletin d'analyse.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 31
▼M2
Lorsque les droites sont considérées comme n'étant pas parallèles, répéter la
détermination. Si le parallélisme n'est toujours pas atteint, la détermination
doit être considérée comme non satisfaisante.
Exprimer le résultat en milligrammes de virginiamycine par kilogramme
d'aliment.
9.Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées sur le
même échantillon par le même analyste ne doit pas dépasser:
2 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en virginiamycine inférieures à
10 mg/kg,
20 % du résultat le plus élevé pour les teneurs de 10 à 25 mg/kg,
5 mg/kg, envaleur absolue, pour les ten eurs de 25 à 50 mg/kg,
10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 mg/kg.1972L0199 — FR — 22.07.1993 — 003.001 — 32