Nõukogu direktiiv 98/57/EÜ,

20. juuli 1998,

haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolli kohta

EUROOPA LIIDU NÕUKOGU,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, eriti selle artiklit 43,

võttes arvesse komisjoni ettepanekut, [1]

võttes arvesse Euroopa Parlamendi arvamust, [2]

võttes arvesse majandus- ja sotsiaalkomitee arvamust [3]

ning arvestades, et:

kahjulik organism Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. oli varem tuntud nime all Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; nimi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. muutub tõenäoliselt nimetatud kahjuliku organismi üldtunnustatud nimeks; käesolevas direktiivis tuleks seda teaduslikku arengut arvesse võtta;

kartuli- ja tomatikasvatusel on ühenduse põllumajanduses oluline koht; kahjulikud organismid ohustavad pidevalt kartuli ja tomati saagikust;

kartuli- ja tomatikasvatuse kaitsmine selliste kahjulike organismide eest peaks lisaks tootmismahu säilitamisele suurendama põllumajanduse tootlikkust;

liikmesriigi territooriumile kahjulike organismide sissetoomise vastu võetavatel kaitsemeetmetel on üksnes piiratud mõju, kui selliste organismide vastu ei võidelda samal ajal ja metoodiliselt kogu ühenduses ega hoita ära nende levimist;

üks kartulile ja tomatile kahjulikke organisme on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., mis on kartuli bakter-pruunmädaniku ning kartulite ja tomatite bakteriaalse närbumise nakkusetekitaja; selle nakkusetekitaja tekitatud haiguspuhanguid on esinenud mõnes ühenduse osas ning siiani eksisteerib mõni nakkusallikas;

kogu ühenduses on kartuli- ja tomatikasvatuse jaoks märkimisväärne oht, kui nende kultuuride puhul ei võeta tõhusaid meetmeid kõnealuse kahjuliku organismi asukoha ja leviku määramiseks, haigusjuhtude ja leviku vältimiseks ning, kui haigus avastatakse, haiguse leviku takistamiseks ja tõrjeks haiguse likvideerimise eesmärgil;

selle tagamiseks tuleb kogu ühenduses võtta teatavaid meetmeid; lisaks peavad liikmesriigid olema valmis võtma vajaduse korral lisameetmeid või rangemaid meetmeid, tingimusel et see ei takista kartulite või tomatite liikumist ühenduse piires, välja arvatud nõukogu 21. detsembri 1976. aasta direktiivis 77/93/EMÜ (taimedele või taimsetele saadustele kahjulike organismide ühendusse sissetoomise ja seal levimise vastu võetavate kaitsemeetmete kohta) [4] sätestatud ulatuses; sellistest meetmetest tuleb teatada teistele liikmesriikidele ja komisjonile;

meetmete puhul tuleb arvesse võtta, et haigusetekitaja asukoha määramiseks on vaja teha korrapäraseid ametlikke uuringuid; sellised uuringud peaksid hõlmama kontrollimenetlust ja vajaduse korral ka proovivõtu- ja katsemeetodeid, sest teatavate keskkonnatingimuste juures võib haigus olla varjatud ja märkamatu nii kasvavatel kartulitaimedel kui ladustatud kartulimugulatel; haigusetekitaja levik kasvavate kultuuride hulgas ei ole kõige olulisem tegur, kuid haigusetekitaja võib levida pinnavee ja teatavate looduslike maavitsaliste taimede kaudu ning seetõttu on kartuli- ja tomatitaimede niisutamine nakatunud veega sellistele põllukultuuridele ohtlik; haigusetekitaja võib püsida üle talve isekülvanud kartuli- ja tomatitaimedes ning see võib olla nakkusallikas ühest hooajast järgmisse; haigusetekitaja levib ka kartulite kokkupuutel nakatunud kartulitega ning nakatunud kartulitega kokku puutunud istutus-, koristus- ja käitlemisvahendite või transpordi- ja ladustusmahutitega;

haigusetekitaja levikut saab vähendada või vältida selliste esemete nakkusest puhastamise teel; seemnekartuli selline saastamine on peamine oht haigusetekitaja levikul; samuti on seemnekartuli varjatud nakatumine oluline nakkusetekitaja leviku oht ning seda on võimalik vältida, kasutades ametlikult tunnustatud programmi raames toodetud seemnekartulit, mida on kontrollitud ja mis on haigusest vabaks tunnistatud;

praegused teadmised organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. bioloogiast ja epidemioloogiast on Euroopa tingimustes ebatäielikud ning eeldatakse, et ettepandud meetmete läbivaatamine on vajalik mitmel hooajal; samuti eeldatakse katsemenetluse parandamist edasiste uuringute põhjal, eriti katsemeetodite tundlikkuse ja spetsiifilisuse puhul, et valida ja standardida optimaalseid võimalikke katsemeetodeid;

selliste üldmeetmete üksikasjade kindlaksmääramiseks ning haigusetekitaja leviku vältimiseks oma territooriumil liikmesriikide poolt võetavate rangemate või täiendavate meetmete jaoks on soovitav, et liikmesriigid teevad komisjoniga tihedat koostööd alalise taimetervise komitee (edaspidi "komitee") raames,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Käesolevas direktiivis käsitletakse meetmeid, mida liikmesriigid peavad võtma organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. vastu, varem tuntud kui Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (edaspidi "organism"), et seoses I lisa 1. jaos loetletud organismi peremeestaimedega (edaspidi "loetletud taimne materjal"):

a) määrata selle asukoht ja levik;

b) vältida selle esinemist ja levikut; ning

c) haiguse avastamise korral vältida selle levikut ja tõrjuda haigust likvideerimise eesmärgil.

Artikkel 2

1. Liikmesriigid viivad igal aastal läbi korrapäraseid ametlikke uuringuid organismi leidmiseks oma territooriumilt pärit loetletud taimses materjalis. Teiste võimalike saasteallikate määratlemiseks, mis ohustavad loetletud taimse materjali tootmist, teevad liikmesriigid riskianalüüsi ning, välja arvatud juhul, kui analüüsiga ei ole kindlaks tehtud organismi leviku ohtu, viivad loetletud taimse materjali tootmise aladel läbi ametliku sihtuuringu organismi leidmiseks muust materjalist kui loetletud taimsest materjalist, sealhulgas looduslikest maavitsalistest peremeestaimedest, samuti pinnaveest, mida kasutatakse loetletud taimse materjali niisutamiseks või sellele pihustamiseks, ning vedeljäätmetest, mis väljutatakse loetletud taimset materjali käitlevatest tööstuslikest töötlemis- või pakendamiskohtadest ja mida kasutatakse loetletud taimse materjali kastmiseks või sellele niisutamiseks. Sellise sihtuuringu ulatus määratakse kindlaks vastavalt identifitseeritud ohule. Liikmesriigid võivad teha ka ametlikke uuringuid organismi leidmiseks sellisest materjalist nagu kasvusubstraat, muld ja tööstuslikest töötlemis- või pakendamiskohtadest tulevad tahked jäätmed.

2. Lõikes 1 osutatud ametlik uuring viiakse läbi:

a) loetletud taimsel materjalil kooskõlas I lisa II jao punktis 1 sätestatud üksikasjadega; ja

b) muudel peremeestaimedel kui loetletud taimne materjal ning veel, sealhulgas vedelatel jäätmetel, vastavalt asjakohastele meetoditele ning vajaduse korral võetakse proovid, millega tehakse ametlikke või ametliku järelevalve all laborikatseid;

c) vajaduse korral muul materjalil vastavalt asjakohastele meetoditele.

Nende uuringute jaoks määravad vastutavad ametiasutused direktiivis 77/93/EMÜ määratletud tähenduses kontrollimenetluse edasised üksikasjad ning proovide arvu, päritolu, stratifitseerimise ja võtmise aja, võttes arvesse usaldusväärseid teaduslikke ja statistilisi põhimõtteid ja organismi bioloogiat ning arvestades loetletud taimse materjali ja vajaduse korral organismi muude peremeestaimede konkreetseid tootmissüsteeme asjaomases liikmesriigis.

3. Lõikes 1 osutatud ametlike uuringute üksikasjadest ja tulemustest teavitatakse igal aastal teisi liikmesriike ja komisjoni vastavalt I lisa II jao punkti 2 sätetele. Need teated esitatakse 1. juuniks, välja arvatud oma ettevõttes seemnekartulina kasutatavaid kartuleid käsitlevad teated, mis esitatakse 1. septembriks. Saaki käsitlevad üksikasjad ja saagi kohta saadud tulemused esitatakse eelmise aasta toodangu kohta. Selliste teadete üksikasjad võib esitada komisjonile.

4. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võetakse vastu järgmine säte:

- lõike 2 esimese lõigu punktis b sätestatud uuringute ja laboratoorse kontrolli asjakohased meetodid.

5. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võib vastu võtta järgmised sätted:

- lõike 2 esimese lõigu punktis c sätestatud uuringute asjakohased meetodid,

- lõike 2 teises lõigus sätestatud uuringute täpsemad üksikasjad, et tagada võrreldav kindlusaste liikmesriikides.

Artikkel 3

Liikmesriigid tagavad, et organismi esinemise kahtlusest või kinnitusest nende territooriumil teatatakse nende vastutavatele ametiasutustele.

Artikkel 4

1. Haiguse esinemise kahtluse korral tagavad asjaomase liikmesriigi või asjaomaste liikmesriikide vastutavad ametiasutused, et viiakse läbi ametlikud või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorsed katsed, kasutades loetletud taimse materjali puhul II lisas sätestatud asjakohast meetodit ning vastavalt III lisa punktis 1 määratletud tingimustele, ning kõikidel muudel juhtudel mis tahes muud ametlikult heakskiidetud meetodit, et kinnitada või lükata ümber haiguse esinemise kahtlus. Kinnitamise korral kohaldatakse III lisa punktis 2 sätestatud nõudeid.

2. Kuni haiguse esinemise kahtluse kinnitamiseni või ümberlükkamiseni lõike 1 alusel sellistel esinemise kahtluste juhtudel, kus:

i) on nähtud organismi põhjustatud haiguse sümptomeid ning saadud II lisa I jao punktis 1 ja II jaos määratletud kiirmeetodi(te) positiivne tulemus; või

ii) on saadud II lisa I jao punktis 2 ja III jaos määratletud meetodi(te) positiivne tulemus,

siis seoses oma toodanguga:

a) keelavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused kõikidest saakidest, partiidest või saadetistest, kust proovid on võetud, pärit taimede ja mugulate liikumise, välja arvatud nende kontrolli all ja tingimusel, et on tehtud kindlaks organismi leviku identifitseeritava ohu puudumine;

b) võtavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused meetmeid kahtlustatava haiguse esinemise päritolu tuvastamiseks;

c) kehtestavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused asjakohased täiendavad ettevaatusabinõud vastavalt hinnatava ohu tasemele, eelkõige seoses loetletud taimse materjali tootmisega ja muude kui selliste punktis a osutatud seemnekartulipartiide liikumisega, mis on toodetud tootmiskohas, kust punktis a osutatud proovid on võetud, et vältida organismi levikut.

3. Nendel haiguse esinemise kahtluse juhtudel, kus on loetletud taimse materjali või pinnavee saastumise oht teisest liikmesriigist või teise liikmesriiki, peab liikmesriik, kus on teatatud haiguse esinemise kahtlusest, teatama viivitamata vastavalt identifitseeritud ohule kõnealuse esinemise kahtluse üksikasjad teistele asjaomastele liikmesriikidele ning need liikmesriigid teevad asjakohast koostööd. Liikmesriigid, keda on teavitatud, kehtestavad ettevaatusabinõud vastavalt lõike 2 punktile c ning võtavad vastavalt vajadusele täiendavaid meetmeid vastavalt lõigetele 1 ja 2.

4. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võetakse vastu järgmine säte:

- lõike 2 punktis c osutatud meetmed.

Artikkel 5

1. Kui ametlik või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorne katse, kasutades loetletud taimse materjali puhul II lisas sätestatud meetodit või muudel juhtudel mis tahes muud ametlikult heakskiidetud meetodit, kinnitab organismi olemasolu vastavalt käesolevale direktiivile võetud proovis, siis liikmesriigi vastutavad ametiasutused, võttes arvesse usaldusväärseid teaduslikke põhimõtteid, organismi bioloogiat ning asjakohaseid organismi peremeestaimede tootmis-, turustamis- ja töötlemissüsteeme selles liikmesriigis:

a) loetletud taimse materjali korral:

i) viivad läbi uurimise, et määrata kindlaks saastumise ulatus ja esmane allikas või esmased allikad vastavalt IV lisa sätetele koos täiendavate katsetega vastavalt artikli 4 lõikele 1 vähemalt kõikide samast kloonist pärit seemnekartuli varudega, ning

ii) tunnistavad saastunuks loetletud taimse materjali, saadetise ja/või partii, kust proov on võetud, ning seadmed, sõidukid, laevad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjali, mis on olnud kontaktis loetletud taimse materjaliga, kust proov on võetud; tunnistavad saastunuks vajaduse korral põllu(d), kasvuhoone osa(d) ja tootmiskoha(d), kust loetletud taimne materjal on koristatud ja kust proov on võetud; ning kasvuperioodil võetud proovide puhul tunnistavad saastunuks põllu(d), tootmiskoha(d) ja vajaduse korral kasvuhoone osa(d), kust proov on võetud, ning

iii) määravad kindlaks, võttes arvesse V lisa punkti 1 sätteid, tõenäolise saaste ulatuse koristamisele eelneva või järgneva kontakti kaudu või tootmise, niisutamise või pihustamise kaudu või seoses saastunuks tunnistatud taimedega samast kloonist pärinemisega, ning

iv) piiritlevad tsooni punkti ii alusel saastunuks tunnistamise, punkti iii alusel tõenäolise saastamise ulatuse määramise ja organismi võimaliku leviku põhjal vastavalt V lisa punkti 2 alapunkti i sätetele;

b) muude kui punktis a nimetatud peremeestaimede saagi korral, kui on loetletud taimse materjali tootmise identifitseeritav oht:

i) viivad läbi uurimise vastavalt punkti a alapunktile i, ja

ii) tunnistavad saastunuks organismi peremeestaimed, kust proov on võetud, ja

iii) määravad kindlaks tõenäolise saastumise ja piiritlevad tsooni vastavalt punkti a alapunktidele iii ja iv seoses loetletud taimse materjali tootmisega;

c) pinnavee korral (sealhulgas loetletud taimset materjali käitlevast tööstusliku töötlemise või pakendamise kohast pärit vedelate jäätmete korral) ning seotud looduslike maavitsaliste peremeestaimede korral, kui esineb loetletud taimse materjali identifitseeritav oht niisutamise, pihustamise või pinnavee üleujutamise kaudu:

i) viivad läbi pinnavee ja looduslike maavitsaliste peremeestaimede, kui need on olemas, proovide uurimise, mis hõlmab ametlikku uuringut asjakohastel aegadel, et määrata saastumise ulatus, ja

ii) tunnistavad vajalikus ulatuses ja punkti i alusel tehtud uurimise põhjal saastunuks pinnavee, kust proov(id) on võetud, ja

iii) määravad kindlaks tõenäolise saastumise ja piiritlevad tsooni punkti ii alusel saastunuks tunnistamise põhjal ning organismi võimaliku leviku, võttes arvesse V lisa punkti 1 ja punkti 2 alapunkti ii sätteid.

2. Liikmesriigid teavitavad viivitamata teisi liikmesriike ja komisjoni vastavalt V lisa punkti 3 sätetele mis tahes saastumisest, mis on kindlaks määratud vastavalt lõike 1 punkti a alapunktile ii ja lõike 1 punkti c alapunktile ii, ning piiritletud tsooni üksikasjadest vastavalt vajadusele kas lõike 1 punkti a alapunkti iv või lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel. Käesoleva lõike alusel edastatud teate üksikasjad võib edastada komiteele.

Liikmesriigid edastavad samal ajal komisjonile V lisa punktis 4 sätestatud täiendava teate. Käesoleva lõigu alusel edastatud teate üksikasjad edastatakse viivitamata komitee liikmetele.

3. Lõike 2 alusel saadetud teate ning selles nimetatud üksikasjade põhjal korraldavad teised teates nimetatud liikmesriigid vastavalt lõike 1 punkti a alapunktile i uurimise ning võtavad vajaduse korral täiendavaid meetmeid vastavalt lõigetele 1 ja 2.

Artikkel 6

1. Liikmesriigid näevad ette, et artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud taimset materjali ei või istutada ning nende vastutavate ametiasutuste kontrolli all ja heakskiidul kohaldatakse selle suhtes ühte VI lisa punkti 1 sätet, et tagada organismi leviku identifitseeritavaohu puudumine.

2. Liikmesriigid näevad ette, et loetletud taimset materjali, mis on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti c alapunkti iii kohaselt tõenäoliselt saastunud, sealhulgas taimset materjali, mille puhul on identifitseeritud oht, ning mis on toodetud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnistatud tootmiskohtades, ei või istutada ning see tuleb vastutavate ametiasutuste kontrolli all asjakohaselt kasutada või hävitada vastavalt VI lisa punktile 2, nii et on tagatud organismi leviku identifitseeritava ohu puudumine.

3. Liikmesriigid näevad ette, et mis tahes seadmed, sõidukid, laevad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel tunnistatud saastunuks või mille kohta on määratud kindlaks, et need on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti c alapunkti iii alusel tõenäoliselt saastunud, hävitatakse või puhastatakse saastatusest, kasutades VI lisa punktis 3 määratletud asjakohaseid meetodeid. Pärast saastatusest puhastamist ei käsitata neid objekte enam saastununa.

4. Ilma et see piiraks lõigete 1, 2 ja 3 alusel rakendatud meetmeid, näevad liikmesriigid ette, et artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja punkti c alapunkti iii alusel piiritletud tsoonis rakendatakse VI lisa punktides 4.1 ja 4.2 määratletud meetmeid. Nende meetmete üksikasjad teatatakse igal aastal teistele liikmesriikidele ja komisjonile. Selle teatamise üksikasjad võib esitada komisjonile.

Artikkel 7

1. Liikmesriigid näevad ette, et seemnekartul peab vastama direktiivi 77/93/EMÜ nõuetele ning olema pärit otse ametlikult kinnitatud programmi alusel saadud materjalist, mille kohta on II lisas sätestatud meetodit kasutades ametlike või ametliku järelevalve all tehtud katsete käigus leitud, et see on organismist vaba.

Eespool nimetatud katsed viib läbi liikmesriik:

a) juhtudel, kui selle riigi seemnekartuli toodangus on kinnitatud organismi olemasolu;

i) b) tehes katseid varasema paljundusmaterjaliga, sealhulgas esmase kloonaretusega, ning tehes süstemaatilisi katseid eliitseemnekartuli kloonidega, või

ii) juhtudel, kui on tehtud kindlaks, et taimed ei ole pärit samast kloonist, tehes katseid kõikide eliitseemnekartuli kloonidega või varasema paljundusmaterjaliga, sealhulgas esmane kloonaretus; ning

b) muudel juhtudel, kas eliitseemnekartuli esmase kloonaretuse iga taimega või esindavate proovidega või varasema paljundusmaterjaliga.

2. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võib vastu võtta järgmised meetmed:

- lõike 1 teise lõigu punkti a üksikasjalikud rakenduseeskirjad,

- lõike 1 teise lõigu punktis b sätestatud esindavaid proove käsitlevad eeskirjad.

Artikkel 8

Liikmesriigid keelavad organismi hoidmise ja käitlemise.

Artikkel 9

Ilma et see piiraks direktiivi 77/93/EMÜ sätete kohaldamist, võivad liikmesriigid direktiivis 95/44/EÜ [5] sätestatud korras lubada erandeid käesoleva direktiivi artiklites 6 ja 8 osutatud meetmetest katsete ja teaduslike eesmärkide puhul ning sordivalikualase töö puhul.

Artikkel 10

Liikmesriigid võivad seoses oma toodanguga vastu võtta selliseid lisameetmeid või rangemaid meetmeid, mis on vajalikud organismiga võitlemiseks või selle leviku vältimiseks niivõrd, kuivõrd need on kooskõlas direktiivi 77/93/EMÜ sätetega.

Nende meetmete üksikasjad teatatakse teistele liikmesriikidele ja komisjonile. Selle teate üksikasjad võib esitada komisjonile.

Artikkel 11

Käesoleva direktiivi lisade muudatused, mis tehakse teaduse ja tehnika arengut silmas pidades, võetakse vastu direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras. Käesoleva direktiivi II lisas sätestatud meetodite ja VI lisa lõigetes 4.1 ja 4.2 sätestatud meetmete korral koostab komisjon aruande, milles ta vaatab need meetodid ja meetmed üle saadud kogemustest lähtudes, ning see aruanne esitatakse komiteele enne 1. jaanuari 2002.

Artikkel 12

1. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid 21. augustil 1999. Liikmesriigid teatavad neist viivitamata komisjonile.

Kui liikmesriigid need meetmed vastu võtavad, lisavad nad meetmetesse või meetmete ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2. Liikmesriigid edastavad viivitamata komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas vastuvõetud siseriiklike põhiliste õigusnormide teksti. Komisjon teavitab sellest teisi liikmesriike.

Artikkel 13

Käesolev direktiiv jõustub Euroopa Ühenduste Teatajas avaldamise päeval.

Artikkel 14

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 20. juuli 1998

Nõukogu nimel

eesistuja

W. Molterer

[1] EÜT C 124, 21.4.1997, lk 12 ja EÜT C 108, 7.4.1998, lk 85.

[2] EÜT C 14, 19.1.1998, lk 34.

[3] EÜT C 206, 7.7.1997, lk 57.

[4] EÜT L 26, 31.1.1977, lk 20. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 98/2/EÜ (EÜT L 15, 21.1.1998, lk 34).

[5] EÜT L 184, 3.8.1995, lk 34. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/46/EÜ (EÜT L 204, 31.7.1997, lk 43).

--------------------------------------------------

I LISA

I JAGU

Bakteri Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. peremeestaimede loetelu, millele on osutatud artiklis 1

Taimed (k.a mugulad), v.a botaanilised seemned, perekonnast Solanum tuberosum L. | Kartul |

Taimed, v.a viljad ja seemned, perekonnast Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. | Tomat |

II JAGU

Uuringud

1. Artikli 2 lõike 2 punktis a osutatud ametlikud uuringud peavad põhinema organismi bioloogilistel omadustel ja asjaomase liikmesriigi konkreetsetel tootmissüsteemidel ning peavad hõlmama:

i) kartuli puhul:

- kasvava kultuuri visuaalset kontrolli asjakohasel ajal ja/või proovide võtmist nii seemne- kui teistest kartulitest kasvuperioodil või laos. Ametliku kontrolli käigus tuleb läbi viia materjali visuaalne kontroll, poolitades mugulaid, ning

- seemnekartuli puhul ja vajadusel ka teiste kartulite puhul ametlikke või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorseid katseid, kasutades II lisas esitatud meetodeid;

ii) tomati puhul:

- kasvava kultuuri visuaalset kontrolli asjakohasel ajal ning vähemalt nendel taimedel, mis on ette nähtud ümberistutamiseks nende ametialase kasvatamise eesmärgil.

2. Artikli 2 lõikes 3 osutatud ametlike uuringute aruanne peab sisaldama:

i) kartulite uuringute puhul:

- seemne- ja muu kartuli kasvatamiseks arvestatud kogupindala hektarites,

- eristamist seemne- ja söögikartuliks ja vajaduse korral kasvatuspiirkonna järgi,

- kontrollimiseks võetud proovide arvu ja aega,

- põllul tehtud visuaalsete kontrollide arvu,

- mugulate visuaalsete kontrollide arvu (ja proovi suurusi);

ii) ametialase kasvatamise jaoks ümberistutamiseks ettenähtud tomatitaimede uuringute puhul:

- taimede hinnangulist koguarvu,

- visuaalsete kontrollide arvu;

iii) muude peremeestaimede kui kartuli ja tomati, sh maavitsaliste sugukonna metsikute peremeestaimede uuringute puhul:

- liiki,

- võetud proovide arvu ja aega,

- vastavalt vajadusele piirkonda või jõge, kust proov on võetud,

- analüüsimeetodit;

iv) tööstusliku töötlemise või pakendamise koha vee ja vedelate jäätmete uuringute puhul:

- proovide arvu ja aega,

- vastavalt vajadusele piirkonda või jõge või asukohta, kust proov on võetud,

- analüüsimeetodit.

--------------------------------------------------

II LISA

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOOSIMISE, AVASTAMISE JA IDENTIFITSEERIMISE MÄÄRAMISMETOODIKA

MÄÄRAMISMETOODIKA RAKENDUSALA

Käesoleva metoodikaga kirjeldatakse eri menetlusi, mis on seotud:

i) bakter-pruunmädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimisega kartuli- ja tomatitaimedes;

ii) haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamisega kartulimugulates;

iii) haigusetekitaja Ralstonia solanacearum identifitseerimisega.

Liidetes on esitatud üksikasjalikud kirjeldused katsematerjali (kasvusöötmete, puhvrite, lahuste, reaktiivide) ettevalmistamiseks.

SISUKORD

I JAGU | Määramismetoodika rakendamine | 383 |

1.Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimine kartuli- ja tomatitaimedes | 383 |

2.Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamine ja identifitseerimine kartulimugulates | 385 |

II JAGU | Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimine kartuli- ja tomatitaimedes | 387 |

1.Sümptomid | 387 |

2.Määramise kiirmeetod(id) | 387 |

3.Bakterite isoleerimine | 388 |

4.Kontrollkatse(d) | 388 |

III JAGU | Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamine ja identifitseerimine kartulimugulates | 391 |

1.Proovi ettevalmistamine katseks | 391 |

2.IF-uuring (immunofluorestsentsuuring) | 392 |

3.ELISA-test (ensüümne immunosorbenttest) | 394 |

4.PCR-test (polümeraasi ahelreaktsioon) | 394 |

5.Bakterite kasvatamine selektiivsöötmel | 396 |

6.Biotest | 397 |

7.Rikastussöötme testid | 397 |

8.Patogeensustest | 397 |

1. liide | Kasvusöötmed haigusetekitaja Ralstonia solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks | 398 |

2. liide | Proovi ettevalmistamiseks vajalikud materjalid | 399 |

3. liide | IF-uuringuks vajalikud materjalid | 400 |

4. liide | Nakatuvuse taseme määramine IF-uuringus | 401 |

5. liide | ELISA-testiks vajalikud materjalid | 402 |

6. liide | PCR-testiks vajalikud materjalid | 403 |

7. liide | Selektiivsöötmeteks ja rikastussöötmeteks vajalikud materjalid | 403 |

Viited | 404 |

I JAGU

MÄÄRAMISMETOODIKA RAKENDAMINE

1. Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimine kartuli- ja tomatitaimedes

Määramismetoodika on ette nähtud kartulimugulate jaoks, millel on tüüpilised või oletatavad bakter-pruunmädaniku sümptomid ning kartuli- ja tomatitaimede jaoks, millel on tüüpilised või oletatavad bakteriaalse närbumise sümptomid. Siia kuuluvad kiirmeetodid, saastunud juhtkoest patogeeni isoleerimine selektiivsöötmele ja positiivse tulemuse korral haigusetekitaja identifitseerimine.

+++++ TIFF +++++

Diagrammi viidete selgitus:

() Sümptomite kirjeldus on esitatud II jao 1. punktis.

() Kiirmeetodid hõlbustavad oletatava diagnoosi määramist.

Asjakohased meetodid on:

- varre juhtkoe lima voolavuse test (II jao 2. punkt),

- polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite esinemise test (II jao 2. punkt),

- IF-uuring (III jao 2. punkt),

- ELISA-test (III jao 3. punkt),

- PCR-test (III jao 4. punkt).

() Kuigi esmaseks sammuks on tüüpiliste sümptomitega taimsest materjalist haigusetekitaja isoleerimine kasvusöötmeplaatidele, võib selline kultiveerimine ebaõnnestuda infektsiooni edasiarenenud faaside tõttu. Saprofüütsed bakterid, mis kasvavad haigestunud kudedel, võivad isoleerimissöötmel haigusetekitaja kasvu maha suruda. Kui bakteri isoleerimine annab negatiivse tulemuse, kuid haiguse sümptomid on tüüpilised, tuleb eraldamist korrata, eelistatult selektiivsöötmel.

() Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine saavutatakse vähemalt ühega nendest testidest, mis on esitatud II jao punktis 4.1, kasutades seda koos patogeensustestiga (II jao punkt 4.3). Tüve iseloomustamine ei ole kohustuslik, kuid on soovituslik iga uue juhtumi korral.

2. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamine ja identifitseerimine kartulimugulates

Määramismetoodika on ette nähtud varjatud nakkuse avastamiseks kartulimugulates kas ühe või eelistatult mitme määramismeetodiga ning positiivse tulemuse korral tuleb vastav haigusetekitaja isoleerida; juhul kui tüüpiliste kolooniate isoleerimine on võimalik, peab järgnema ka haigusetekitaja Ralstonia solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine.

+++++ TIFF +++++

Diagrammi viidete selgitus:

() Proovi suurus

Standardne proovi suurus on 200 mugulat. Siiski saab sama protseduuri kohaldada ka juhul, kui proovis on vähem kui 200 mugulat.

() Määramismeetod(id)

Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamiseks proovis ei pruugi üks test olla piisavalt tundlik või usaldusväärne. Seetõttu on soovitatav läbi viia rohkem kui üks test ning need peaksid eelistatult põhinema erinevatel bioloogilistel põhimõtetel.

() Immunofluorestsentsuuring (IF)

IF-uuring on hästi toimiv määramismeetod. Seda eelistatakse teistele testidele, mis ei ole veel täielikult välja arendatud või kinnitatud. Seda meetodit kasutatakse veel ka teiste seadusega ettenähtud haigusetekitajate avastamiseks, nt Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus'e määramisel. Arvestades kõnesoleva meetodi puhul kindlaksmääratud uuringuparameetreid on see tundlik test (tundlikkuslävi on 103–104 rakku 1 ml kartuliekstrakti bakterpelleti kohta).

Uuringu tulemuste usaldusväärsuse kriitiliseks teguriks on antiseerumi kvaliteet. Vastuvõetav on vaid kõrge tiitrimisarvuga (lahjendamata antiseerumi puhul vähemalt 2000) antiseerum ning kõik uuringud tuleb läbi viia antiseerumi tiitril või ühe lahjenduse võrra tiitrimisarvust allpool. Eelistatud on kaudne meetod. Otsest meetodit võib kasutada juhul, kui uuringu tundlikkus ja spetsiifilisus on võrdväärsed vastavate kaudse meetodi näitajatega.

IF-uuringu eelis on subjektiivne tõlgendamine rakuvärvumise morfoloogia ja fluorestseerumise intensiivsuse puhul, mis annavad teavet reaktsiooni spetsiifilisuse kohta. Võivad esineda ka ristreaktsioonid raku morfoloogialt bakteriga Ralstonia solanacearum sarnaste sellega seroloogiliselt seotud mulla bakterite või kartulikoes esinevate bakterite vahel. IF-uuringut võib kasutada ainsa määramismeetodina, kuigi juhul, kui esineb ristreaktsiooni kahtlus, tuleks läbi viia täiendav määramistest, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel. Sellisel juhul on kõige sobivam selektiivsöötmel kasvatamine.

() Bakterite kasvatamine selektiivsöötmel

Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum kasvatamine modifitseeritud SMSA-söötmel on piisavalt tundlik ja selektiivne meetod. Tulemus on nähtav 3–6 päeva järel pärast proovi ettevalmistamist. Haigusetekitaja saadakse otse söötmele, millelt on võimalik teda identifitseerida. Selle uuringu kogu potentsiaali kasutamiseks tuleb väga hoolikalt eemaldada kartulitelt basaalsed tipud, et vältida sekundaarseid baktereid kartulimugulates, mis on Ralstonia solanacearum’i konkurendid kasvusöötmel ning võivad mõjutada haigusetekitaja arengut. Mõned bakteritüved võivad kasvusöötmel kasvada väga halvasti, kuna söötme komponendid mõjutavad uuritavat organismi. Samuti nõuab suurt tähelepanu eristada haigusetekitajat Ralstonia solanacearum teistest bakteritest, mis võivad kasvusöötmel areneda. Selektiivsöötmel kasvatamist võib kasutada ainsa määramismeetodina, tingimusel et, kui on kahtlus, et haigusetekitaja Ralstonia solanacearum kasvu söötmeplaadil inhibeerivad teised bakterid ning testi tulemuseks on saadud negatiivne vastus, tuleb proovi kindlasti uuesti kontrollida, kasutades erinevat määramismeetodit, et kinnitada määratud diagnoosi või see ümber lükata. Sellisel juhul on kõige sobivam kasutada IF-uuringut.

() ELISA-test

ELISA-test on üldiselt vähem tundlik kui IF-uuring (tundlikkuse läviväärtus on 104–105 rakku 1 ml kartuliekstrakti bakterpelleti kohta). Test on odav ja kiire, kuid üldiselt vähe kaitstud eksitavate positiivsete (ristreaktsioonide tõttu) ja eksitavate negatiivsete tulemuste eest (kartuliekstraktis esinevate inhibeerivate fenoolsete ainete tõttu). Nõuded antiseerumi spetsiifilisusele on äärmiselt kõrged. ELISA-testi ei või kasutada ainsa määramismeetodina.

() PCR-test

PCR-test on väga tundlik, kuigi testi võivad pärssida taime- või mugulaekstrakti komponendid, andes eksitava negatiivse tulemuse. Mõned kartulisordid sisaldavad rohkem inhibiitoreid kui teised. Seepärast on vaja need inhibiitorid kõrvaldada. Inhibeerimist saab vähendada proovi lahjendades, kuid sel juhul väheneb ka Ralstonia solanacearum’i bakterirakkude arv proovis. Kõigis proovi ja testi ettevalmistusetappides tuleb hoolitseda, et välditakse nakatumist, mis võib viia eksitava positiivse tulemuseni. Eksitavad positiivsed tulemused võivad tuleneda ka teiste organismide järjestuse homoloogilisusest. Nendel põhjustel ei või otsest PCR-testi kasutada ainsa määramismeetodina.

() Rikastussöötme test

Inkubeerides kartuliekstrakti bakterpelleti proove poolselekteerivas kasvupuljongis, nagu näiteks modifitseeritud SMSA-puljongis, saame mitmekordistada Ralstonia solanacearum’i rakkude arvu. Veelgi olulisem, see lahjendab ka ELISA- või PCR-testi võimalikke inhibiitoreid. Nõnda saab rikastuspuljongit kasutades avastada haigusetekitaja Ralstonia solanacearum IF-uuringuga, ELISA- ja PCR-testiga. Otseseid väljakülve kasvuagaritele ei soovitata rikastuspuljongist teha. Selliseid rikastusmeetodeid ei ole veel põhjalikult uuritud ja kontrollitud. Käesolevas dokumendis on need esitatud, kuna neil on suur potentsiaal. Siiski ei tohiks neid kasutada ainsa määramismeetodina, kuna ei ole piisavalt kogemusi.

() Biotest

Biotesti kasutatakse haigusetekitaja Ralstonia solanacearum isoleerimiseks kartuliekstrakti bakterpelletist selekteeriva rikastamise abil peremeestaimes, milleks võib kasutada tomati- või baklažaanitaimi. Test eeldab optimaalseid kasvatamistingimusi, nagu on nimetatud käesoleva meetodi puhul. Bakterid, mis võivad inhibeerida haigusetekitaja Ralstoniasolanacearum kasvu SMSA-söötmel, ei mõjuta tõenäoliselt seda testi.

() Kontrollkatse(d)

Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine saavutatakse vähemalt ühega nendest testidest, mis on esitatud II jao punktis 4.1, kasutades seda koos patogeensustestiga (II jao punkt 4.3). Tüve iseloomustamine ei ole kohustuslik, kuid on soovituslik iga uue juhtumi korral.

II JAGU

Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimine kartuli- ja tomatitaimedes

1. Sümptomid

1.1. Sümptomid kartulitel

Kartulitaim. Infektsiooni varajases staadiumis võib päevaste kõrgete temperatuuride juures täheldada närbumist alates alumistest lehtedest taime tipu suunas, kuid öösel taim toibub. Närbumine muutub kiiresti pöördumatuks ning taim hukkub. Närbunud taime varre ristlõike juhtkude võib olla pruuniks muutunud ning piimjas nire võib immitseda lõikepinnalt või erituda kergesti pigistamisel. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, on näha limaniitide väljavoolamist juhtkimpudest.

Kartulimugul. Kartulimugulast tuleb teha ristläbilõige basaalsest (ehk stoolonipoolsest) tipust. Infektsiooni varajane staadium esineb juhtkoeringi klaasistumisena ja värvusemuutusena kollakast helepruunini ning ringist võib pärast mõne minuti möödumist iseeneslikult või pöialdega kergel pigistamisel erituda ristläbilõike lähedalt kahvatu kreemjas eritis. Hiljem muutub juhtkoering selgelt eristatavalt pruuniks ning kärbumine võib ulatuda põhikoeni. Edasiarenenud infektsioonifaasis võib lima eralduda ka basaalsest tipust või kartulisilmadest, mille tulemuseks on punakaspruunid sissevajunud koorekahjustused, millest võib erituda bakterilima, põhjustades mullaosakeste kleepumist mugulale.

1.2. Sümptomid tomatitel

Tomatitaim. Esimeseks nähtavaks sümptomiks on noorimate lehtede longu vajumine. Haigusetekitaja jaoks soodsate keskkonnatingimuste juures (mulla temperatuur 25 oC küllastunud niiskuse juures) esineb taime osaline või täielik närbumine, millele järgneb kogu taime kokkuvarisemine mõne päeva jooksul. Vähem soodsate tingimuste korral (mulla temperatuur alla 21 °C) võib varrel areneda suurel hulgal kõrvaljuuri. Varrel võib esineda värvuse kadumist, mis annab tunnistust juhtkoes esinevast nekroosist. Kui varrest teha ristlõige, on näha, et juhtkude on värvuselt muutunud pruunikaks ja sealt erituvad valged või kollakad bakterilima tilgad.

2. Kiirmeetodid

Kiirmeetodid hõlbustavad oletatava diagnoosi määramist. Kasutatakse üht või mitut järgmistest testidest.

Varrelima test

Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum esinemist närbunud kartuli- või tomativartes saab määrata järgmise lihtsa eeltestiga.

Taimevars lõigatakse läbi kohe ülalpool mullapinda. Lõikepind asetatakse veeklaasi. Veidi aja pärast erituvad iseeneslikult juhtkimpudest bakterilima niidid. Teised bakterid, mis kutsuvad kartuli- või tomatitaimedes esile juhtkoe infektsiooni, sellist nähtust ei põhjusta.

Polü-ß-hüdroksübutüraadi (PHB) graanulite tuvastamine

Ralstonia solanacearum’i rakkudes esinevaid polü-ß-hüdroksübutüraadi (PHB) graanuleid saab nähtavaks muuta värvainetega Niiluse sinine A ja Sudaani must B.

Mikroskoobi alusklaasil valmistatakse ette äie limasest eritisest või suspendeeritud koest või 48tunnisest bakterkultuurist, mis on kasvatatud söötmetel YPGA või SPA (vt 1. liide). Valmistatakse ette ka positiivsed haigusetekitaja kontrolläiged biotüübi 2/rassi 3 tüvega ning vajaduse korral negatiivne kontrolläie erineva baktertüvega. Lastakse kuivada. Klaasi alumine pool tõmmatakse mitu korda kiiresti läbi leegi, et äie fikseeruks objektiklaasil.

Värvimine Niiluse sinisega

1) Fikseeritud äie ujutatakse üle Niiluse sinise A 1 %lise vesilahusega.

Inkubeeritakse 10 minutit 55 °C juures.

2) Värvilahus valatakse pealt ära. Pestakse kiiresti tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

3) Äie ujutatakse üle äädikhappe 8 %lise vesilahusega.

Inkubeeritakse 1 minut toatemperatuuril.

4) Pestakse tasaselt voolava kraanivee all. Kuivatatakse kuivatuspaberiga.

5) Niisutatakse uuesti veetilgaga. Asetatakse peale katteklaas.

6) Värvitud äiet vaadeldakse mikroskoobis, millele on sobitatud epifluorestsentsvalgusallikas ja filter lainepikkusega 450 nm ning kasutatakse õliimmersiooni 1000kordsel suurendusel.

Vaadeldakse ereoranžilt fluorestseeruvaid PHB graanuleid. Vaadeldakse valgusmikroskoobis, et olla kindel, et graanulid on rakusisesed ning et rakumorfoloogia on Ralstoniasolanacearum’i bakterirakkudele tüüpiline.

Värvimine Sudaani mustaga

1) Fikseeritud äie ujutatakse üle Sudaani musta B 0,3 %lise lahusega 70 %lises etanoolis. Inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril.

2) Värvilahus valatakse pealt ära. Pestakse kiiresti kraanivee all. Eemaldatakse liigne vesi. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

3) Äie kastetakse lühikeseks ajaks ksülooli. Kuivatatakse kuivatuspaberiga.

Ettevaatust! Ksülool on ohtlik aine. Tööta tõmbekapi all.

4) Äie ujutatakse üle 0,5 %lise (mass/maht) safraniini vesilahusega ja jäetakse 10 sekundiks toatemperatuuril seisma.

Ettevaatust! Safraniin on ohtlik aine. Tööta tõmbekapi all.

5) Pestakse tasaselt voolava kraanivee all. Kuivatatakse kuivatuspaberiga. Asetatakse peale katteklaas.

6) Värvitud äiet vaadeldakse valgusmikroskoobis, millel on ülekantud valgus ning kasutatakse õliimmersiooni 1000kordsel suurendusel.

Ralstonia solanacearum’i rakkudes esinevad PHB graanulid värvuvad sinakasmustaks. Rakusein värvub kahvatupunaseks.

Teised meetodid

Teised sobilikud meetodid on IF-uuring (III jao 2. punkt), ELISA-test (III jao 3. punkt) ja PCR-test (III jao 4. punkt).

3. Bakterite isoleerimine

3.1 Kartulimugula juhtkoeringi muutunud värvusega osast või kartuli- või tomatitaime varre juhtkimpudest eemaldatakse eritist või mõned lõiked. Lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris. Jäetakse 5–10 minutiks seisma.

3.2 Suspensioonist valmistatakse rida 10kordseid lahjendusi, näiteks lahjendused 1/10 ja 1/100 või vajadusel rohkem.

3.3 Suspensioonist ja selle lahjendustest mõõdetakse kindel kogus üldsöötmele (NA, YPGA ja SPA, 1. liide) ja/või Kelmani tetrasooliumsöötmele (1. liide) ja/või SMSA-selektiivsöötmele (7. liide). Kasutatakse söötmeplaadil joonkülvi tehnikat või vastava lahjenduse laiali külvamist söötmeplaadile. Vajadusel valmistatakse iga söötmega eraldi söötmeplaadid positiivse haigusetekitaja kontrolliks, kasutades virulentse Ralstonia solanacearum’i biotüübi 2/rassi 3 tüve.

3.4 Kasvusöötme plaate inkubeeritakse 28 oC juures kolm päeva.

Üldsöötmel on virulentse Ralstonia solanacearum’i kolooniad pärljasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed ning sageli iseloomulike spiraalsete keeretega.

Kelmani tetrasooliumsöötmel on virulentse Ralstonia solanacearum’i tüüpilised kolooniad kreemikad, lamedad, ebaühtlase kujuga ja fluidaalsed ning keskelt veripunase värvusega keeretega. Ralstonia solanacearum’i avirulentse vormi kolooniad on sügavpunase värvusega.

SMSA-söötmel on virulentse Ralstonia solanacearum’i tüüpilised kolooniad piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga ja fluidaalsed, keskelt veripunase värvusega.

Avirulentse vormi kolooniad SMSA-söötmel on vähem fluidaalsed, värvuselt täiesti roosad või punased.

3.5 Iseloomuliku morfoloogiaga kolooniad puhastatakse, külvates need uuesti üldsöötmele. Välditakse regulaarset ümberkülvamist, sest see võib põhjustada virulentsuse kadumist.

4. Kontrollkatse(d)

4.1. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum identifitseerimine

Ralstonia solanacearum’i bakteri puhaskultuur identifitseeritakse vähemalt ühe järgmise protseduuri abil.

Toitumuslikud ja ensümaatilised testid

Märkus:

Igas testis tuleb kasutada vastavaid kontrolltüvesid.

Järgmised haigusetekitaja Ralstonia solanacearum fenotüübilised omadused esinevad või puuduvad:

Fluorestseeruv pigment | – |

PHB esinemine | + |

Oksüdatsiooni/fermentatsioonitest (O/F-test) | O+/F– |

Katalaas | + |

Kovaci oksüdaas | + |

Nitraatide redutseerimine | + |

Tsitraadi kasutamine | + |

Kasv 40 °C juures | – |

Kasv 1 % NaCl-s | + |

Kasv 2 % NaCl-s | – |

Arginiini dihüdrolaas | – |

Želatiini veeldamine | – |

Tärklise hüdrolüüs | – |

Aesuliini hüdrolüüs | – |

Levani tootmine | – |

Söötmed ja meetodid on esitatud kogumikus Lelliott & Stead (1987).

IF-uuring

Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Antiseerumist valmistatakse rida kahekordseid lahjendusi. Viiakse läbi IF-uuring (III jao 2. punkt). Kultuuri IF-tiiter peab olema võrdväärne positiivse kontrolli omaga.

ELISA-test

Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega rohkem kui 106 rakku milliliitri kohta. Viiakse läbi ELISA-test (III jao 3. punkt). Kultuuri ELISA-väärtus peab olema võrdväärne positiivse kontrolli omaga.

PCR-test

Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Viiakse läbi PCR-test (III jao 4. punkt). Bakterkultuuri PCR-produkt ja restrikteeriva ensüümanalüüsi (REA) mudel peavad olema sama suurusega, kui on positiivsel kontrollil.

FISH-hübridisatsioon

Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Viiakse läbi FISH-protseduur (van Beuningen et al., 1995) koos PCR-praimeriga OLI-1 (Seal et al., 1993). Bakterkultuuri reaktsioon peab olema sama, mis on positiivsel kontrollil.

Valgu profileerimine

Denatureeritud raku valgud eraldatakse elektroforeesiga polüakrüülamiidgeelis (PAGE) (Stead, 1992a).

Rasvhapete profileerimine (FAP)

Kultuuri ja positiivset kontrolltüve kasvatatakse 48 tundi 28 oC juures trüptikaas-sojaagaril ning viiakse läbi FAP-test (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Kultuuri profiil peab olema identne positiivse kontrolli omaga. Määratud tingimuste juures on iseloomulikud rasvhapped järgmised: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH.

4.2. Tüve iseloomustamine

Tüve iseloomustamine ei ole kohustuslik, kuid on iga uue juhtumi korral soovituslik, kasutades vähemalt üht järgmistest võimalustest.

Biotüübi määramine

Ralstonia solanacearum eraldatakse kaheks biotüübiks kolmest heksoosalkoholist ja kolmest suhkrust happe tootmise võime põhjal (Hayward, 1964 & 1994):

| Biotüüp |

1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

Järgmiste ainete kasutamine: | | | | | |

– maltoos | – | + | + | – | + |

– laktoos | – | + | + | – | + |

– tsellobioos | – | + | + | – | + |

– mannitool | – | – | + | + | + |

– sorbitool | – | – | + | + | – |

– dultsitool | – | – | + | + | – |

Lisatestid eristavad biotüübi 2 alamfenotüüpideks (Hayward, 1994):

| biotüüp 2 | biotüüp 2-A | biotüüp 2-T |

Trehaloosi kasutamine | – | + | + |

Inositooli kasutamine | + | – | + |

D-riboosi kasutamine | – | – | + |

Pektolüütiline aktiivsus | madal | madal | kõrge |

Rassi määramine

Rassi (Buddenhagen et al., 1962) on võimalik määrata patogeensustesti põhjal nii tomati-, baklaaani- kui ka tubakataimedel ning ülitundlikkuse reaktsioonil (HR) tubakalehtedes (Lozano & Sequeira, 1970):

| [1]Rass |

1 | 2 | 3 |

Reaktsioon järgmistel taimedel: | | | |

– tomati- või baklažaanitaimed | närbumine | reaktsiooni ei esine | närbumine |

– tubakataimed | närbumine | reaktsiooni ei esine | reaktsiooni ei esine |

– tubakalehed | kärbus (48 h) ja närbumine (7–8 päeva) | HR (12–24 h) | koltumine (2–8 päeva) |

Rassi iseloomustus, kasutades patogeensus- või ülitundlikkustesti tubakal, ei ole väga usaldusväärne, selle asemel võib tuletada päritolu biotüübist ja looduslikust peremeestaimest lähtuvalt.

Kultuuri saab iseloomustada järgmiselt.

Genoomse "sõrmejäljendi" võtmine

Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum liittüvede molekulaarse eristamise võib läbi viia:

RFLP-analüüsiga (Cook et al., 1989),

korduvjärjestusega PCRga [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995)].

4.3. Patogeensustest

See on haigusetekitaja Ralstonia solanacearum diagnoosi kinnitav test ning on ette nähtud Ralstonia solanacearum’ina identifitseeritud bakterkultuuri virulentsuse hindamiseks.

Kultuurist ja positiivsest kontrolltüvest valmistatakse inokulaat, milles on 106 rakku milliliitri kohta. Inokuleeritakse 5–10 tomati- või baklažaanitaime, eelistatult siis, kui taimel on välja kasvanud kolmas pärisleht, või hiljem (III jao 6. punkt). Inkubeeritakse kuni kaks nädalat temperatuuril 22–28 °C ning kõrge suhtelise niiskuse juures, kastes taimi iga päev. Jälgitakse taime närbumise ja/või kiduraks jäämise, koltumise ja kängumise tundemärke.

Sümptomitega taimedelt isoleeritakse järgmiselt:

- varrest eemaldatakse koelõik 2 cm inokuleerimispunktist kõrgemalt,

- see purustatakse ja lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris. Siis külvatakse see söötmeplaadile, inkubeeritakse ja kontrollitakse tüüpiliste Ralstonia soleanacearum’i kolooniate esinemist.

III JAGU

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM AVASTAMINE JA IDENTIFITSEERIMINE KARTULIMUGULATES

Märkus:

Standardne proovi suurus on 200 mugulat. Siiski saab sama protseduuri kohaldada ka juhul, kui proovis on vähem kui 200 mugulat.

1. Proovi ettevalmistamine analüüsiks

Märkus:

Bakterpelletit, mis saadakse selle meetodi käigus, kasutatakse ka haigusetekitaja Clavibacter michiganensis sub ssp. sepedonicus avastamiseks.

Enne analüüsi läbiviimist:

i) inkubeeritakse proovi 25–30 °C juures kuni kaks nädalat, et ergutada väikesearvulise Ralstonia solanacearum’i populatsiooni paljunemist;

ii) pestakse mugulaid voolava vee all koos sobiva desinfektsioonivahendiga ja puhastusvahendiga. Mugulad kuivatatakse õhu käes.

1.1 Puhta ja desinfitseeritud skalpelli või juurviljanoa abil eemaldatakse koor iga mugula basaalse tipu juurest nii, et kõigepealt tuleb nähtavale juhtkude. Ettevaatlikult eemaldatakse kartuli basaalse tipu juurest juhtkoest väike koonusjas südamik (3–5 mm diameetriga). Välditakse ülemäärast mittevaskulaarset kudet. Selliselt toimitakse proovi iga mugulaga.

Märkus:

Selles etapis saab läbi viia mugulate visuaalse vaatluse (II jao 1. punkt). Iga sümptomitega või oluliselt mädanenud mugul tuleb asetada kõrvale ja seda tuleb kontrollida teistest eraldi (II jagu).

1.2 Eemaldatud basaalsed tipud kogutakse suletavasse nõusse. Eelistatult tuleks eemaldatud basaalseid tippe töödelda kohe. Kui see ei ole võimalik, siis hoitakse neid kuni 24 tundi või 4 °C juures kuni 72 tundi.

1.3 Basaalseid tippe töödeldakse, kasutades ühte järgmistest menetlustest.

i) Basaalsed tipud asetatakse sobivasse nõusse.

Lisatakse piisav kogus matseratsioonipuhvrit (2. liide), et basaalsed tipud oleksid kaetud.

Basaalsed tipud peenestatakse köögikombaini või peenestaja Ultra Thurrax abil, kuni saavutatakse täielik homogenisatsioon. Ülemäärast homogeniseerimist tuleks vältida.

Leotisel lastakse 15–30 minutit seista.

ii) Basaalsed tipud asetatakse sobivasse nõusse.

Lisatakse piisav kogus matseratsioonipuhvrit, et basaalsed tipud oleksid kaetud.

Nõu asetatakse pöörlevale loksutile.

Inkubeeritakse kiirusel 50–100 pööret minutis nelja tunni jooksul 20–22 °C juures või 16–24 tunni jooksul 4 °C juures.

iii) Basaalsed tipud asetatakse tugevasse ühekordse kasutusega matseratsioonikotti (nt kiiritamise teel steriliseeritud Stomacheri kilekott mõõtudega 105 mm × 150 mm).

Ettevaatlikult purustatakse basaalsed tipud sobiva töövahendiga, nt haamriga, kuni on saavutatud täielik homogenisatsioon.

Lisatakse piisav kogus matseratsioonipuhvrit, et basaalsed tipud oleksid kaetud.

Leotisel lastakse 15–30 minutit seista.

1.4 Töödeldud basaalsetest tippudest ekstraheeritakse bakterid, kasutades ühte järgmistest menetlustest.

i) Leotis nõrutatakse ettevaatlikult tsentrifuugiküvetti nii, et settinud koepraht jääb nõu või koti põhja. Kui leotis on hägune, siis seda tsentrifuugitakse kuni 180 g juures 10 minutit temperatuuril alla 10 °C.

Leotist või esimesest tsentrifuugimisest saadud supernatanti tsentrifuugitakse 7000 g juures 15 minutit või 10000 g juures 10 minutit temperatuuril alla 10 °C.

Supernatant valatakse ära bakterpelleti osa segi ajamata.

ii) Leotis filtreeritakse läbi filtersüsteemi, mille poori suuruseks on 40–100 μm. Filtreerimist saab intensiivistada vaakumpumpa kasutades.

Filtraat kogutakse tsentrifuugiküvetti.

Filter pestakse matseratsioonipuhvriga.

Filtraati tsentrifuugitakse 7000 g juures 15 minutit või 10000 g juures 10 minutit temperatuuril alla 10 °C.

Supernatant valatakse ära bakterpelleti osa segi ajamata.

1.5 Bakterpellet suspendeeritakse uuesti 1 ml fosfaatpuhvris (2. liide).

Jagatakse kaheks võrdseks osaks ning asetatakse kumbki eraldi mikrokatsutisse.

Testimiseks kasutatakse üht mikrokatsutit. Ülejääki säilitatakse testimise ajal 4 °C juures.

Teisele osale lisatakse 10–25 % (mahuprotsent) steriilset glütserooli. Segatakse. Säilitatakse –18 °C juures (nädalaid) või –70 °C juures (kuid).

2. IF-uuring

Kasutatakse antiseerumit haigusetekitaja Ralstonia solanacearum jaoks, eelistatult rassile 3/biotüübile 2. Määratakse tiiter, kasutades Ralstonia solanacearum’i homoloogse tüve baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta ja vastavat FITC (fluorestsiinisotiotsüanaadi) konjugaadi lahjendust vastavalt tootja soovitustele. Lahjendamata algseerumi tiiter peaks olema vähemalt 1: 2000.

Kasutatakse mitmeaknalisi mikroskoobi alusklaase, millel on eelistatult 10 vähemalt 6 mm läbimõõduga aknavälja.

Iga objektiklaas peab sisaldama ka FITC-konjugaadi kontrolli. Kui FITC-kontrollaknas ilmneb mõni positiivne bakterirakk, siis tuleb testi korrata PBS-kontrolli kasutades.

Eraldi valmistatakse ette positiivsed Ralstonia solanacearum’i sobiva rassi/biotüübi kontroll-objektiklaasid, kasutades baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Iga uue testiseeria puhul kasutatakse üht objektiklaasi.

2.1 Valmistatakse ette objektiklaasid, kasutades üht järgmistest menetlustest.

i) Bakterpelletite puhul, mille tärklisesisaldus on suhteliselt väike:

pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 μl; suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterpelletit aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1.

ii) Muude bakterpelletite puhul:

valmistatakse lõplikust bakterpelletist 10kordsed lahjendused, nt 1/10; 1/100 ja 1/1000 pelletipuhvrisse. Pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 μl; suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterpelletit ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2.

2.2 Suspensioonitilkadel lastakse kuivada. Bakterirakud fikseeritakse objektiklaasile kuumutades, kuumutades objektiklaasi leegil või hoides 95 %lises etanoolis.

2.3 IF-uuringu käik

i) Vastavalt punkti 2.1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi ettevalmistamisele:

valmistatakse rida kahekordseid antiseerumi lahjendusi IF-puhvris (3. liide):

¼ tiiter (T/4), ½ tiiter (T/2), tiiter (T) ja 2kordne tiiter (2T).

ii) Vastavalt punkti 2.1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi ettevalmistamisele:

valmistatakse antiseerumi töölahjendus (WD) IF-puhvris. Optimaalse spetsiifilisusega antiseerumi töölahjendus on lahjendus, mis on tavaliselt ligikaudu pool IF-tiitrist.

+++++ TIFF +++++

Joonis 1Objektiklaasi ettevalmistamine vastavalt punkti 2.1 alapunktile i ja punkti 2.3 alapunktile i

+++++ TIFF +++++

Joonis 2Objektiklaasi ettevalmistamine vastavalt punkti 2.1 alapunktile ii ja punkti 2.3 alapunktile ii

2.3.1 Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile.

Vastavad aknaväljad kaetakse antiseerumi lahjendus(t)ega. PBS-puhvrit mõõdetakse FITC-konjugaadi aknaväljadesse. Aknaväljadele lisatud antiseerumi kogus peab olema ekvivalentne objektiklaasile lisatud ekstrakti kogusega.

2.3.2 Kaetud objektiklaase inkubeeritakse 30 minutit toatemperatuuril.

2.3.3 Antiseerumi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha ja objektiklaase loputatakse hoolikalt IF-puhvriga. Pestakse 5 minutit Tweeniga IF-puhvris ning seejärel 5 minutit IF-puhvris (3. liide). Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus.

2.3.4 Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile. Vastavad aknaväljad ja FITC-aknaväli kaetakse FITC-konjugaadi lahjendustega, mida kasutati tiitri määramisel. Aknaväljadele lisatud konjugaadi kogus peab olema sama, mis antiseerumi kogus.

2.3.5 Kaetud objektiklaase inkubeeritakse 30 minutit toatemperatuuril.

2.3.6 Konjugaadi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha. Loputatakse ja pestakse nagu eespool kirjeldatud (2.3.3). Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus.

2.3.7 Igasse aknavälja pipetitakse 5–10 μl 0,1 M fosfaatpuhverdatud glütseriini (3. liide) või samalaadset kattevedelikku ning objektiklaas kaetakse katteklaasiga.

2.4 IF-uuringu tulemused

Objektiklaase vaadeldakse mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja sobilikud filtrid tööks FITCiga ning kasutatakse õliimmersiooni suurendusel 500–1000 korda. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre.

Esialgu kontrollitakse positiivse tulemusega kontroll-objektiklaasi. Rakukestad peavad säravalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud. Märkus: Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb uuringut korrata.

Objektiklaaside tulemus. Esmalt vaadeldakse FITC-kontrolli aknavälju, milles peaksid puuduma fluorestseeruvad rakud. Fluorestseeruvate rakkude esinemine FITC-kontrolli aknaväljas viitab konjugaadi mittespetsiifilisele konjugeerumisele või saastumisele. Märkus: Sel juhul korratakse uuringut.

Uuritavates kontrollaknaväljades vaadeldakse eredalt fluorestseeruvaid rakke, mis on haigusetekitajale Ralstonia solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga. Fluorestseerumise intensiivsus peaks olema ekvivalentne positiivse kontrolltüve omaga sama antiseerumi lahjenduse juures. Mittetäielikult värvunud või nõrgalt fluorestseeruvate rakkude arvu ei tohiks arvesse võtta (vt IF-uuringu tulemuse tõlgendamist).

IF-uuringu tulemuse tõlgendamine

i) IF-uuringu tulemus on negatiivne, kui morfoloogiliselt tüüpilisi säravalt fluorestseeruvaid rakke ei esine.

ii) Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, siis tuleb kindlaks määrata keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutada rakkude arv (N) 1 ml lahjendamata bakterpelleti kohta (4. liide).

IF-uuringu avastamispiir on ligikaudu 103 rakku 1 milliliitris uuesti suspendeeritud bakterpelletis:

- proovide puhul, milles N > 103 rakku 1 milliliitris uuesti suspendeeritud bakterpelletis, käsitatakse IF-uuringut positiivsena;

- proovide puhul, milles N < 103 rakku 1 milliliitris uuesti suspendeeritud bakterpelletis, võib IF-testi käsitada positiivsena.

iii) Kui värvumata on jäänud väga suur hulk rakke (> 105 rakku 1 milliliitris) või nende fluorestseerumine on väga nõrk, siis tuleb läbi viia uus uuring:

- kasutades meetodit, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel, või

- korrates IF-uuringut teise antiseerumiga või kasutades bakterpelleti 10kordset lahjendust.

3. ELISA-test

Meetodi aluseks on Robinson-Smith et al., 1995.

Kasutatakse antiseerumit haigusetekitaja Ralstonia solanacearum jaoks, eelistatult rassile 3/biotüübile 2. Määratakse tiiter, kasutades bakteri Ralstonia solanacearum homoloogse tüve baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta.

Soovitatav on kasutada NUNC Polysorbi mikrotiitrimise plaate.

Testi tuleb kaasata ka negatiivse kartuliekstrakti kontroll ja fosfaatpuhverdatud soolalahuse kontroll (PBS).

Positiivse kontrollina kasutatakse Ralstonia solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Positiivset kontrolli testitakse samamoodi kui uuritavaid proove, kuid eraldi kontrollproovidest mikrotiitrimise plaadil.

3.1 100–200 μl uuesti suspendeeritud bakterpelletit pipeteeritakse mikrokatsutisse.

Kuumutatakse neli minutit 100 °C juures. Seejärel asetatakse mikrokatsuti jääle.

3.2 Lisatakse samaväärne kogus 2kordset karbonaat-kattepuhvrit (5. liide). Segatakse.

3.3 100 μl igast proovist mõõdetakse vähemalt kahte mikrotiitrimise plaadiauku. Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures või üleöö 4 °C juures.

3.4 Järsu löögiga raputatakse ekstrakt plaadiaukudest välja. Auke pestakse kolm korda PBS-Tga (5. liide), jättes viimase pesukorra lahuse vähemalt viieks minutiks plaadiaukudesse.

3.5 Valmistatakse Ralstonia solanacearum’i antiseerumi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse (5. liide). Aukudesse mõõdetakse 100 μl antiseerumit.

Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

3.6 Järsu löögiga raputatakse antiseerum plaadiaukudest välja. Auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (3.4).

3.7 Valmistatakse leeliselise fosfataaskonjugaadi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse. Aukudesse mõõdetakse 100 μl konjugaadi lahjendust.

Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

3.8 Järsu löögiga raputatakse konjugaat plaadiaukudest välja. Auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (3.4 ja 3.6).

3.9 Valmistatakse leeliseline fosfataassubstraadilahus (5. liide). Mõõdetakse 100 μl aukudesse. Inkubeeritakse 30 minutit kuni üks tund pimedas, toatemperatuuril.

3.10 Neeldumist mõõdetakse lainepikkusel 409 nm.

ELISA-testi tulemuse tõlgendamine

ELISA-test on negatiivne, kui proovi optiline tihedus on väiksem kui negatiivse kontrolli 2kordse optilise tiheduse väärtus.

ELISA-test on positiivne, kui proovi optiline tihedus on suurem kui negatiivse kontrolli 2kordse optilise tiheduse väärtus.

4. PCR-test

Meetodi aluseks on Seal et al., 1993.

Märkus:

Kõikides proovide ettevalmistusetappides ja teistes tegevustes, mis seonduvad PCR-tehnikaga, tuleb kasutada filtriga varustatud pipetiotsikuid.

Positiivseks kontrolliks valmistatakse Ralstonia solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 baktersuspensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Testitakse samamoodi kui proovi (proove).

4.1 100 μl uuesti suspendeeritud bakterpelletit pipetitakse mikrokatsutisse.

Teise võimalusena mõõdetakse 90 μl uuesti suspendeeritud bakterpelletist mikrokatsutisse, mis sisaldab 10 μl 0,5 M NaOH. Segatakse mikrokatsutit üles-alla pöörates.

4.2 Kuumutatakse neli minutit 100 °C juures. Seejärel asetatakse mikrokatsuti kohe jääle.

4.3 Valmistatakse vähemalt kaks või vajadusel rohkem 10kordset lahjendust (nt 1/10, 1/100) steriilsesse destilleeritud vette või ultrapuhtasse vette (UPW).

4.4 Valmistatakse PCR reaktsioonisegu (6. liide) steriilsesse katsutisse, lisades järgmisi komponente järgmises järjestuses:

50 μl reaktsioonikoguse kohta

Komponent | Kogus | Lõplik kontsentratsioon |

Steriilne destilleeritud vesi või UPW | 30,8–33,8 μl | |

10 × PCR-puhver | 5,0 μl | 1 × |

d-ATP | 1,0 μl | 0,2 mM |

d-CTP | 1,0 μl | 0,2 mM |

d-GTP | 1,0 μl | 0,2 mM |

d-TTP | 1,0 μl | 0,2 mM |

Praimer OLI-1 (20 μl) | 2,5 μl | 1 μM |

Praimer Y-2 (20 μl) | 2,5 μl | 1 μM |

Taq-polümeraas (5 U/μl) | 0,2 μl | 1,0 U |

Kokku | 45–48 μl | |

Suurema hulga reaktsioonide puhul

Arvutatakse iga komponendi kogus nõutava arvu reaktsioonide jaoks.

Segatakse komponendid ja mõõdetakse 45–48 μl segu steriilsetesse PCR katsutitesse.

PCR reaktsiooniseguga katsuteid hoitakse jääl.

25 μl reaktsioonikoguse puhul

Vähendatakse vastavalt komponentide koguseid.

4.5 PCR-amplifikatsioon

4.5.1 Ei ole kohustuslik: tsentrifuugitakse katsuteid, milles on keedetud proov ja positiivne kontroll.

Igasse PCR-reaktsiooniseguga katsutisse lisatakse proovid järgmises järjestuses: 2–5 μl proovi, kontroll veega ja positiivne kontroll. Katsutid asetatakse DNA termotsükleri kuumutusblokile.

4.5.2 Järgitakse järgmist menetlust:

1 tsükkel

2 minutit 96 °C juures : DNA-ahela denaturatsioon

50 tsüklit

20 sekundit 94 °C juures : denaturatsioon

20 sekundit 68 °C juures : praimerite kinnitumine

30 sekundit 72 °C juures : koopia ekstensioon

1 tsükkel

10 minutit 72 °C juures : täiendav pikenemine

1 tsükkel

vi) hoitakse 4 °C juures.

Märkus:

Need tingimused on termotsükleri Perkin Elmer 9600 jaoks. Mõne termotsükleri puhul on vaja PCR katsutitesse lisada mineraalõli ja/või on vaja modifitseerida amplifikatsiooni mõne etapi (ii, iii ja iv) kestust.

4.5.3 Katsutid võetakse termotsüklerist välja. Analüüsitakse PCR produkti. Kui ei analüüsita kohe, siis hoitakse katsuteid 4 °C juures samal päeval määramise puhul ning –18 °C juures pikemaajalise säilitamise puhul.

4.6 PCR-produkti analüüs

PCR-fragmendid tuvastatakse elektroforeesil agaroosgeelis ja värvimisega etiidiumbromiidis.

4.6.1 Valmistatakse sobiv agaroosgeel, keetes ettevaatlikult agaroosi tris-atsetaat-elektroforeesipuhvris (TAE).

4.6.2 Sulatatud agaroos jahutatakse temperatuurini 50–60 °C, valatakse elektroforeesivanni ning asetatakse paigale kamm. Agaroos jäetakse tahkestuma.

4.6.3 Kamm eemaldatakse. Geelile kallatakse TAE-puhver nii, et geel oleks 2–3 mm puhvrikihiga kaetud.

4.6.4 Parafilmile mõõdetakse 3 μl täitepuhvri tilgad. Lisatakse proovidest, positiivsest kontrollist ja kontrollist veega saadud 12 μl PCR produkti ja segatakse puhvriga pipetiotsikus sisse-välja liigutades. Etteantud koguseid võib muuta vastavalt agaroosgeeli aukude suurusele.

4.6.5 Ettevaatlikult täidetakse geeliaugud. Võrdluseks lisatakse vähemalt ühte geeliauku ka vastav DNA-marker.

4.6.6 Juhtmed ühendatakse toiteallika ja elektroforeesiseadmete külge. Elektroforees peaks kulgema 5–8 V/cm, kuni esimene osa indikaatorjoonest on 1 cm kaugusel geeli servast.

4.6.7 Toiteallikas lülitatakse välja. Juhtmed ühendatakse elektroforeesiseadmetelt lahti.

Ettevaatlikult eemaldatakse geel. Seda leotatakse 30–45 minutit etiidiumbromiidi lahuses.

Märkus:

Iga kord, kui töötatakse etiidiumbromiidiga, tuleb kanda ühekordselt kasutatavaid kummikindaid, sest see aine on tugev mutageen!

4.6.8 Eemaldatakse värvaine, leotades geeli destilleeritud vees 10–15 minutit.

4.6.9 Vaadeldakse amplifitseerunud DNA-lõike UV-valgustusallikaga. Ralstonia solanacearum’i PCR produkti pikkus, kasutades praimereid OLI-1 ja Y-2, on 288 baaspaari (bp). Võrreldakse DNA-markeri ja positiivse kontrolli PCR produkti pikkustega.

Märkus:

Kontroll veega peab igal juhul andma negatiivse tulemuse. Positiivse tulemuse puhul korratakse testi.

4.6.10 Geel fotografeeritakse, kui nõutakse püsiregistrit.

4.6.11 Amplifitseeritud fragmendi usaldatavust kinnitatakse restriktsiooniensüümi analüüsiga (REA).

4.7 Restriktsiooniensüümi analüüs (REA)

4.7.1 Mõõdetakse 8,5 μl PCR produkti (4.5.3) uude mikrokatsutisse. Lisatakse 1 μl 10kordset ensüümipuhvrit ja 0,5 μl restriktsiooniensüümi Ava II.

4.7.2 Segatakse pipetiotsikus sisse-välja liigutades. Kui tilgad jäävad mikrokatsuti seintele, tsentrifuugitakse mikrotsentrifuugis. Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

4.7.3 Lahustunud PCR-fragmenti analüüsitakse elektroforeesil agaroosgeelis, nagu on kirjeldatud eespool (4.6).

PCR-testi tulemuse tõlgendamine

PCR-test on negatiivne, kui ei avastata iseloomulikku 288 bp fragmenti, kuid avastatakse vastav fragment positiivsel Ralstonia solanacearum’i kontrolltüvel.

PCR-test on positiivne, kui avastatakse 288 bp fragment, mille REA-analüüs on identne positiivse Ralstonia solanacearum’i kontrolltüve omaga.

5. Bakterite kasvatamine selektiivsöötmel

Meetodi aluseks on Elphinstone et al., 1996.

5.1 Testi läbiviimiseks tehakse uuritava proovi lahjenduste väljakülv söötmeplaatidele, nt:

i) valmistatakse bakterpelletist vähemalt kaks 10kordset lahjendust pelletipuhvrisse, nimelt 1/10 ja 1/100, või vajadusel rohkem. Pipetitakse kindel kogus (50–100 μl) uuesti suspendeeritud bakterpelletist ja selle lahjendustest modifitseeritud SMSA-selektiivsöötmele (7. liide) ning suspensioon lükatakse klaasspaatli abil agarplaadil laiali.

Vajadusel tõmmatakse külviaasaga (mahuga 10 μl) agarplaadile külvijälg. Külvide vahel steriliseeritakse külviaas leegis kuumutamisega;

ii) pipetitakse kindel kogus (50–100 μl) uuesti suspendeeritud bakterpelletist modifitseeritud SMSA-selektiivsöötmele ning suspensioon lükatakse klaasspaatli abil agarplaadil laiali. Spaatliga viirutatakse veel vähemalt üle kahe modifitseeritud SMSA-söötmeplaadi.

5.2 Kasutades eespool kirjeldatud meetodit, tehakse eraldi väljakülvid modifitseeritud SMSA-söötmele virulentse Ralstonia solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 suspensioonist, mille sisaldus on 106 rakku milliliitri kohta ja mis on positiivseks kontrolliks.

5.3 Söötmeplaate inkubeeritakse 28 °C juures. Kui tulemus on negatiivne, inkubeeritakse edasi, kokku kuni 6 päeva. Virulentse Ralstonia solanacearum’i kolooniad on piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed, keskelt veripunase värvusega, servast iseloomulike spiraalsete keerdudega.

5.4 Iseloomuliku morfoloogiaga kolooniad puhastatakse, külvates need uuesti üldsöötmele (1. liide).

5.5 Identifitseeritakse puhaskultuurid (III jao punkt 4.1) ja kinnitatakse Ralstonia solanacearum’i kultuur patogeensustesti abil (II jao punkt 4.3).

Selektiivsöötme testi tulemuste tõlgendamine

Selektiivsöötme testi tulemus on negatiivne, kui pärast kuuepäevast inkubeerimist ei ole välja kasvanud ühtki bakterkolooniat või kui ei ole isoleeritud tüüpilisi Ralstonia solanacearum’i kolooniaid, tingimusel et teised bakterkolooniad ei pärsi Ralstonia solanacearum’i kasvu ning et tüüpilised Ralstonia solanacearum’i kolooniad on kasvanud vaid positiivsetel kontrollplaatidel.

Selektiivsöötme testi tulemus on positiivne, kui eraldatakse tüüpilised Ralstonia solanacearum’i kolooniad.

6. Biotest

Meetodi aluseks on Janse, 1988.

6.1 Iga proovi kohta võetakse kümme tundlikust sordist tomati või baklažaani testtaime, millel on välja kasvanud 3. pärisleht. Testtaimi ei tohi kasta 24 tundi enne nakatamist.

6.2 100 μl uuesti suspendeeritud bakterpelletit jagatakse testtaimede vahel. Suspensiooni süstitakse taimevarde idulehtede kõrguselt ja veel mõnesse kohta.

6.3 Samal viisil nakatatakse ka 10 taime virulentse Ralstonia solanacearum’ibiotüübi 2/rassi 3suspensiooniga 106 rakku milliliitri kohta, mis on positiivseks kontrolliks, ning negatiivseks kontrolliks nakatatakse taimi pelletipuhvriga. Positiivsed kontrolltaimed tuleb teistest taimedest isoleerida, et vältida ristnakatumist.

6.4 Testtaimi kasvatatakse kuni 4 nädalat 22–28 °C ja kõrge suhtelise niiskuse juures, kastes iga päev. Jälgitakse närbumise, kloroosi ja/või kängumise tundemärke.

6.5 Haigestunud taimed isoleeritakse (II jagu). Identifitseeritakse iseloomuliku morfoloogiaga puhaskultuurid (II jao punkt 4.1) ja kinnitatakse Ralstonia solanacearum’i kultuurid patogeensustestiga (II jao punkt 4.3).

6.6 Vajadusel võib kontrollida infektsiooni puudumist nendes testtaimedes, millel ei esine haigustunnuseid. Igalt testtaimelt eemaldatakse inokuleerimiskohast 2 cm kõrguselt 1 cm pikkune varrelõik. Varrelõigu kude homogeniseeritakse matseratsioonipuhvris. Valmistatakse lahjendused ja tehakse väljakülvid söötmeplaatidele (III jao punkt 5). Positiivse tulemuse korral identifitseeritakse iseloomuliku morfoloogiaga puhaskultuurid (II jao punkt 4.1) ja kinnitatakse Ralstonia solanacearum’i kultuurid patogeensustestiga (II jao punkt 4.3).

Biotesti tulemuse tõlgendamine

Biotesti tulemus on negatiivne, kui testtaimed ei ole saastunud Ralstonia solanacearum’i kultuuriga, tingimusel et eespool nimetatud bakter on avastatud positiivsetes kontrolltaimedes.

Biotest on positiivne, kui testtaimed on Ralstonia solanacearum’i kultuuriga saastunud.

7. Rikastussöötme testid

Meetodi aluseks on Elphinstone et al., 1996.

7.1 100 μl uuesti suspendeeritud bakterpelletit mõõdetakse 3 ml modifitseeritud SMSA-söötmesse (7. liide).

7.2 Inkubeeritakse 28 °C juures 48 tundi ja mitte kauem kui 72 tundi, kusjuures katsuti kork on lõdvalt peal, et tagada õhu juurdepääs.

7.3 Suletakse katsuti kork ja loksutatakse. Alikvooti kasutatakse IF-uuringus (käesoleva jao punkt 2), ELISA-testis (käesoleva jao punkt 3) ja/või PCR-testis (käesoleva jao punkt 4).

8. Patogeensustest

Vaata II jao punkt 4.3.

[1] Rass 4 (patogeenne ingveril ja mõnel muul peremeestaimel) ja rass 5 (patogeenne ainult mooruspuul) ei ole hõlmatud.

--------------------------------------------------

III LISA

1. Iga haigusjuhtumi kahtluse korral, mille puhul on saadud loetletud taimses materjalis kiirtesti positiivne tulemus vastavalt II lisas esitatud asjakohasele meetodile, või kõigil muudel juhtudel, kasutades muud ametlikult heakskiidetud meetodit, ning oodates tulemuste kinnitamist või ümberlükkamist, tuleb kuni eespool nimetatud meetodi lõpuleviimiseni kinni pidada ja nõuetekohaselt säilitada:

- võimaluse korral terve partii või selle osa (millest proov on võetud) etiketiga varustatud originaalpakendis,

- võimaluse korral proovide järelejäänud osa,

- kõik järelejäänud ekstraktid ja kiirtestideks valmistatud lisamaterjalid, nt immunofluorestsents-objektiklaasid, ning

- kõik asjakohased dokumendid.

2. Organismi olemasolu kinnituse puhul tuleks alles hoida ja nõuetekohaselt säilitada:

- lõikes 1 määratletud materjal,

- vajaduse korral mugula- või taimeekstraktiga nakatatud tomati- või baklažaanitaime proov ning organismi isoleeritud kultuur

vähemalt ühe kuu jooksul pärast teatamist vastavalt artikli 5 lõikele 2.

--------------------------------------------------

IV LISA

Artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis i osutatud uurimisel võetakse vajaduse korral arvesse järgmised tegurid:

i) tootmiskohad,

- kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis on klooni kaudu seotud kartulitega, mis on osutunud organismiga saastunuks,

- kus kasvatatakse või on kasvatatud tomateid, mis on samast algallikast kui tomatid, mis on osutunud organismiga saastunuks,

- kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid või tomateid, mis on ametliku kontrolli all organismi oletatava esinemise tõttu,

- kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis on klooni kaudu seotud kartulitaimedega, mis on kasvatatud organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades,

- kus kasvatatakse kartuleid või tomateid ja mis asetsevad saastunud tootmiskoha naabruses, k.a sellised tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi kasutatakse ühiselt vahetult või ühise tööettevõtja vahendusel,

- kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohas on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist,

- kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohaks on tootmiskohtade üldised veevõtukohad ning milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist,

- mis on või mis on olnud üle ujutatud pinnaveega, milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist, ning

ii) organismiga saastunud pinnavesi, mida on kasutatud tootmiskoha kastmiseks ja niisutamiseks või mis on üle ujutanud põllud ja tootmiskohad.

--------------------------------------------------

V LISA

1. Võimaliku saastuse ulatuse kindlaksmääramiseks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel võetakse vajaduse korral arvesse järgmised tegurid:

- artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks osutunud tootmiskohas kasvatatav loetletud taimne materjal,

- tootmiskoht või -kohad, mis mõnes tootmislülis on seotud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks osutunud loetletud taimse materjaliga, k.a tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi kasutatakse ühiselt vahetult või ühise tööettevõtja vahendusel,

- eelmises taandes osutatud tootmiskohas või -kohtades kasvatatud või sellises tootmiskohas või -kohtades olev loetletud taimne materjal ajavahemikul, millal vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii saastunuks tunnistatud taimne materjal oli esimeses taandes osutatud tootmiskohtades,

- eespool nimetatud tootmiskohtadest pärit loetletud taimset materjali käitlevad laod,

- seadmed, sõiduk, laev, ladu või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on võinud olla kontaktis loetletud taimse materjaliga, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel,

- kogu loetletud taimne materjal, mida on hoitud eelmises taandes loetletud objektide sees või nendega kokkupuutes enne nende objektide puhastamist ja desinfitseerimist,

- artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti i alusel toimunud uurimise ja kontrollimise tulemusena ilmneb, et klooni kaudu suguluses olevad kartulimugulad või -taimed ja sama päritoluga tomatitaimed võivad artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel osutuda organismiga saastunud loetletud taimseks materjaliks ja saastumine on tõenäoline taime kloonide kaudu, kuigi testi tulemused on võinud olla negatiivsed,

- eelmises taandes osutatud taimse materjali tootmiskoht või -kohad,

- loetletud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, kus kasutatakse artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud kastmis- ja niisutusvett,

- loetletud taimse materjali kasvatamine põldudel, mis on üle ujutatud organismiga saastunud pinnaveega.

2. Organismi võimaliku leviku kindlaksmääramine artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel hõlmab:

i) artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv osutatud juhtudel järgmiste asjaolude arvessevõtmist:

- loetletud taimse materjali muude kasvatuskohtade lähedust,

- seemnekartulivarude ühist tootmist ja kasutamist,

- tootmiskohti, kus kasutatakse pinnavett taimse materjali kastmiseks või niisutamiseks juhtudel, kus artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades esineb või on esinenud pinnavee äravoolu või üleujutuse oht;

ii) juhtudel, mil pinnavesi on artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel tunnistatud organismiga saastunuks:

- loetletud taimse materjali tootmiskohti, mis asuvad organismiga saastunuks osutunud pinnavee või üleujutusohu lähedal,

- iga eraldatud jõgikonda, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega.

3. Artikli 5 lõike 2 esimeses lõigus osutatud teates esitatud andmed hõlmavad:

- vajaduse korral kuupäeva, millal on teatavaks tehtud haiguse esinemise kahtlus artikli 4 alusel, proovivõtu kuupäevi ning organismi esinemise kinnitust artikli 5 alusel,

- saastunuks tunnistamise asjaolude kirjeldust ja tsooni piiritlemist.

4. Artikli 5 lõike 2 teises lõigus osutatud täiendavas teates esitatud andmed hõlmavad:

- iga saastunuks tunnistatud kartulisaadetise või -partii direktiivi 77/93/EMÜ artiklites 7 ja 8 ettenähtud sertifikaate, vastavalt vajadusele kartulitootjate, laomajandite või lähetuskeskuste passi- või registreerimisnumbreid,

- saastunuks tunnistatud tomatitaimede saadetise või partii puhul direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 7 või 8 ettenähtud sertifikaate ning taimepassi numbrit vastavalt direktiivi 77/93/EMÜ V lisa, A osa, I jao punktis 2.2 esitatud nõuetele,

- seemnekartulivarude puhul ja võimaluse korral kõikidel muudel juhtudel sordi nime ja kategooriat,

- muud teavet, mis on seotud kinnitatud haiguspuhanguga ja mida komisjon võib nõuda.

--------------------------------------------------

VI LISA

1. Pidades silmas artikli 6 lõiget 1, tuleb anda järgmised korraldused:

- tuhastamine, või

- loomasöödana kasutamine pärast kuumtöötlemist, nii et puudub organismi ellujäämise oht, või

- sügavale matmine hävituskohas, kus ei teki imbumise ohtu põllumajandusmaadele või millel puudub kokkupuude veega, mida võidakse kasutada põllumaa kastmiseks, või

- tööstuslik töötlemine, toimetades selleks saastunud või nakatumiskahtlusega taimse materjali vahetult ja viivitamatult töötlemisettevõttesse, kus on ametlikult heakskiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, mis on kooskõlas käesoleva direktiivi VII lisas ettenähtud sätetega, või

- muud meetmed, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest tuleb viivitamata teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele.

2. Artikli 6 lõikes 2 osutatud loetletud taimse materjali asjakohane kasutamine või hävitamine vastavate liikmesriikide vastutavate ametiasutuste kontrolli all koos vastutavate ametiasutuste infovahetusega, et tagada pidev kontroll ja selle liikmesriigi vastutavate ametiasutuste heakskiit, kus kartulid pakendatakse või neid töödeldakse esimeses ja teises taandes osutatud jäätmete kõrvaldamise seadmete jaoks, on järgmine:

i) kartulimugulate puhul:

- kasutamine tarbimiseks ettenähtud söögikartulina, mis on pakendatud kohtades, kus on vastavad jäätmete kõrvaldamise seadmed, nii et kartul on valmis otsetarnimiseks ja kasutamiseks ümber pakendamata ning on ette nähtud selliseks otsetarnimiseks ja kasutamiseks, või

- kasutamine tööstuslikuks töötlemiseks ettenähtud söögikartulina, mis tuleb otse ja viivitamata tarnida töötlemisettevõttesse, kus on nõuetekohased jäätmete kõrvaldamise seadmed, või

- muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused. Sellistest meetmetest tuleb viivitamata teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele;

ii) teiste taimeosade, k.a varre- ja leheprahi puhul,

- hävitamine, või

- muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele.

3. Artikli 6 lõikes 3 osutatud objektide saastusest puhastamise asjakohased meetodid on puhastamine ja vajaduse korral desinfitseerimine nii, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning seda tehakse liikmesriikide vastutavate ametiasutuste järelevalve all.

4. Liikmesriikide rakendatavad meetmed artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv ja punkti c alapunktis iii kehtestatud ja artikli 6 lõikes 4 osutatud piiritletud tsooni(de)s on järgmised.

4.1. Nendel juhtudel, kui tootmiskohad on tunnistatud organismiga saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel:

a) kaitstud tootmisalade põldudel või põlluosadel, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel, kas

i) vähemalt nelja kasvatusaasta jooksul pärast saastunuks tunnistamise aastat,

- võetakse meetmed isekülvanud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sealhulgas maavitsaliste sugukonda kuuluva umbrohu kõrvaldamiseks, ning

- ei panda maha, istutata ega külvata järgmist:

- kartulimugulaid või -taimi,

- tomatitaimi ja -seemneid,

- võttes arvesse organismi bioloogiat,

- teisi organismi peremeestaimi,

- ristõieliste taimeliike, mille puhul on identifitseeritav organismi ellujäämise oht,

- teisi põllukultuure, millel on identifitseeritav oht organismiga nakatuda;

- esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud vaba isekülvanud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb:

- kartulite puhul kasutada ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit üksnes söögikartuli tootmiseks, ja

- viia läbi ametlik uuring koos artikli 2 lõikes 1 määratletud katsetega,

- eelmises taandes osutatud kartuli- või tomatikasvatushooajale ja asjakohasele külvikordade tsüklile järgneval hooajal pannakse ametlikult sertifitseeritud seemnekartul maha kas seemne- või söögikartuli tootmiseks ning kartulite ja tomatite puhul viiakse läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik uuring, või

ii) saastunuks tunnistamise aastale järgneva viie kasvatusaasta jooksul:

- võetakse meetmed isekülvanud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluva umbrohu kõrvaldamiseks, ning

- tuleb esimese kolme aasta jooksul põld vastavalt identifitseeritavale ohule kas sööti jätta või külvata sinna teravilja või säilitada püsikarjamaana, mida sagedasti madalalt niidetakse või kasutatakse intensiivselt karjatamiseks, või kasvatada rohuseemet ja kahe järgneva aasta jooksul järgneb muude kui organismi peremeestaimede kasvatamine, mille puhul ei ole organismi ellujäämise või leviku identifitseeritavat ohtu,

- esimesel kartuli- või tomatikasvatushooajal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule,

- kasutatakse kartuli puhul ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit seemne- või söögikartuli tootmiseks,

ning viiakse läbi ametlik uuring koos artikli 2 lõikes 1 määratletud katsetega;

b) muudel põldudel:

- saastunuks tunnistamise aastale järgneval kasvatusaastal:

- ei või põllule maha panna või istutada kartulimugulaid või -taimi või muid organismi peremeestaimi ning tuleb võtta meetmed, et kõrvaldada isekülvanud kartuli- või tomatitaimed ja muud organismi peremeestaimed, sh maavitsaliste sugukonda kuuluv umbrohi, või

- kartulimugulate puhul tohib ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit kasutada üksnes söögikartuli tootmiseks, tingimusel et vastutavad ametiasutused on veendunud, et isekülvanud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluva umbrohu oht on kõrvaldatud. Kasvavat kultuuri kontrollitakse asjakohaste ajavahemike järel ning isekülvanud kartulitaimedel kontrollitakse organismi esinemist; lisaks kontrollitakse kartuli puhul koristatud mugulaid;

- esimeses taandes määratletud aastale järgneval esimesel kasvuaastal:

- kasutatakse kartulite puhul üksnes ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit seemne- või söögikartuli tootmiseks,

- vähemalt esimeses taandes määratletud aastale järgneval teisel kasvuaastal:

- kasutatakse kartulite puhul üksnes ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit või ametliku kontrolli all ametlikult sertifitseeritud seemnekartulist kasvatatud seemnekartulit seemne- või söögikartuli tootmiseks,

- igal kasvuaastal, millele on osutatud eelmistes taanetes, võetakse meetmed, et kõrvaldada isekülvanud kartuli- ja tomatitaimed ja muud organismi peremeestaimed, sh maavitsaliste sugukonda kuuluv umbrohi, ning viiakse läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik uuring ning juhtudel, kui seemnekartul pannakse maha seemnekartuli tootmiseks, viiakse läbi mugulate kontroll;

c) kohe pärast saastunuks tunnistamist vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii ning igal järgmisel kasvuaastal, sh esimesel lubatud kartuli- või tomatikasvatushooajal, tuleb põldudel, mis on tunnistatud saastunuks vastavalt lõigus a määratletule:

- kõik tootmiskohas ja kartuli- või tomatikasvatusel kasutatud masinad ja ladustamisrajatised puhastada ja vajadusel desinfitseerida, kasutades nõuetekohaseid meetodeid, mida on kirjeldatud punktis 3,

- ametlikult kontrollida kastmis- ja niisutamiskavasid ja vajadusel need keelata, et vältida organismi levikut;

d) artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud kaitstud tootmisala osal, kus on võimalik kasvusubstraadi täielik vahetus:

- on kartulimugulate või -taimede või muude organismi peremeestaimede, sh tomatitaimede ja -seemnete mahapanek, istutamine või külvamine lubatud, kui kõnealusel tootmisala osal on kehtestatud ametlikud järelevalvemeetmed organismi kõrvaldamiseks ja kõikide organismi peremeestaimede kõrvaldamiseks, sh täielikuks kasvusubstraadi vahetamiseks ja tootmisala osa ja kõikide seadmete põhjalikuks puhastamiseks ning vajadusel desinfitseerimiseks, ning millele seejärel on vastutavad ametiasutused andnud loa toota kartuleid või tomateid, ning

- kasvatatakse kartuleid ametlikult sertifitseeritud seemnekartulist või väikestest mugulatest või mikrotaimedest, mis on saadud kontrollitud allikatest,

- kontrollitakse ametlikult kastmis- ja niisutamiskavasid ja vajadusel need keelatakse, et vältida organismi levikut.

4.2 Ilma et see piiraks punktis 4.1 määratletud meetmeid, peavad liikmesriigid piiritletud tsoonis:

a) viivitamata ja vähemalt kolme kasvatushooaja jooksul pärast saastunuks tunnistamist:

aa) juhtudel, kui piiritletud tsoon on kindlaks määratud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv alusel:

- tagama oma vastutavate ametiasutuste järelevalve kartulimugulate või tomatite kasvatus-, ladustamis- või käitlemisruumides ning lepingu alusel kasutatavate kartuli- või tomatikasvatusseadmete ruumides,

- nõudma seadmete ja ladude puhastamist ja vajadusel desinfitseerimist sellistes ruumides, kasutades asjakohaseid meetodeid, mis on määratletud punktis 3,

- nõudma ainult sertifitseeritud seemnekartuli või sellise seemnekartuli mahapanemist, mida on kasvatatud ametliku kontrolli all vastavas piirkonnas, ning pärast saagikoristust selle seemnekartuli kontrollimist, mis on kasvatatud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnistatud kohtades,

- nõudma, et koristatud kartuliseemnevarusid hoitakse söögikartulist eraldi kõikides ruumides selles tsoonis,

- viima läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametliku uuringu,

ab) juhtudel, kui pinnavesi on saastunuks tunnistatud artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel või on organismi võimaliku leviku allikaks vastavalt V lisa punktile 2:

- viima läbi iga-aastase uuringu asjakohasel ajal, sh proovide võtmise pinnaveest ja vastavatest organismi maavitsalistest peremeestaimedest, mis on seotud vastavate veeallikatega, ja tegema katsed kooskõlas:

- II lisas esitatud asjakohase meetodiga loetletud taimse materjali puhul, või

- mõne muu ametlikult heakskiidetud meetodiga teistel juhtudel,

- kehtestama kastmis- ja niisutuskavade ametliku kontrolli, sh keelama saastunuks tunnistatud vee kasutamise loetletud taimse materjali ja vajadusel muude peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, et vältida organismi levikut. Selle keelu võib uuesti läbi vaadata, toetudes iga-aastasel uuringul saadud tulemustele,

- juhtudel, kui vedelate jäätmete äravoolukohad on saastunud, tuleb kehtestada ametlik kontroll loetletud taimset materjali kasutava töötleva tööstuse või pakendamiskohtade jäätmete kõrvaldamise jaoks;

b) kehtestama vajaduse korral kava kõikide seemnekartuli varude asendamiseks asjakohase ajavahemiku jooksul.

--------------------------------------------------

VII LISA

Ametlikult heakskiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, millele on osutatud VI lisa lõike 1 neljandas taandes, peavad vastama järgmistele tingimustele, et vältida organismi leviku ohtu:

i) kartulite ja tomatite töötlemisjäätmed (k.a väljapraagitud kartulid, kartulikoored ja tomatid) ning muud kartulite ja tomatitega seotud tahked jäätmed tuleb hävitada kas

- sügavale matmisega töötlemispaigas, kus puudub vee imbumise oht põllumajandusmaale või kokkupuude veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaa kastmiseks. Jäätmed tuleb toimetada otse töötlemispaika sellistel tingimustel, et ei ole ohtu jäätmete kadumiseks, või

- tuhastamisega;

ii) vedelate jäätmete töötlemine: enne äravoolu tuleb hõljuvaineid sisaldavad vedelad jäätmed filtreerida või setitada selliste ainete eemaldamiseks. Need ained tuleb hävitada vastavalt lõigus i sätestatule.

Vedelad jäätmed tuleb seejärel kas:

- enne hävitamist kuumutada vähemalt 70 oC-ni vähemalt 30 minuti jooksul või

- hävitada muul ametlikult heakskiidetud viisil või ametliku järelevalve all, nii et ei ole ohtu jäätmete kokkupuuteks põllumajandusmaaga või veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaade kastmiseks. Nende meetmete üksikasjadest teavitatakse teisi liikmesriike ja komisjoni.

--------------------------------------------------