I LISA

Analüüsimeetodid artikli 3 lõikes 2 osutatud määratletud taimekahjustaja avastamiseks ja määramiseks

1. Analüüsimine spooridega

Avastamiseks ja määramiseks kasutatakse suviseid sporangiume ja endospoore, mis saadakse mullast pärast sõelumist või otse taimsest materjalist.

2. Avastamismeetodid

Määratletud taimekahjustaja spooride ekstraheerimiseks mullast kasutatakse üht järgmistest meetoditest:

a) mullasõelumismeetod, nagu on kirjeldanud Pratt (1976) (1);

b) mullasõelumismeetod, nagu on kirjeldanud van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) tsonaalse tsentrifuugimise meetod suure jõudlusega proovitöötluse jaoks, nagu on kirjeldanud Wander et al. (2007) (3).

3. Määramismeetodid

Pärast ekstraheerimist määratakse määratletud taimekahjustaja spoorid ühe järgmise meetodi abil:

a) morfoloogiline identifitseerimine valgusmikroskoobi all 100–400kordse suurenduse juures;

b) klassikaline PCR, mille puhul kasutatakse praimereid, Lévesque et al. (2001) (4) ja van den Boogert et al. (2005) (5) põhjal;

c) reaalajas jälgitav PCR, mille puhul kasutatakse praimereid ja sonde, van Gent-Pelzer et al. (2010) (6) järgi;

d) reaalajas jälgitav PCR, mille puhul kasutatakse praimereid ja sonde, Smith et al. (2014) (7) järgi.

4. Endospooride eluvõimelisus

Endospooride eluvõimelisuse võib kindlaks määrata mikroskoopilise analüüsi või bioanalüüsiga. Sporangiumide eluvõimelisuse võib kindlaks määrata laktofenooli või vette pandud sporangiumide mikroskoopilise uurimisega (Przetakiewicz 2015) (8). Teralise sisuga või kergelt ümara protoplasmaga sporangiume võib pidada eluvõimelisteks. Need, mille puhul toimub pidev plasmolüüs või millel ei ole nähtavat sisu, loetakse surnuks.

Alternatiivina või kahtluse korral võib teha IV lisa punktis 3 kirjeldatud bioanalüüsi.

5. Patotüüpide kindlaksmääramine

Patotüüpide kindlaksmääramiseks on vaja värskeid köbrulise pinnaga väljakasveid.

Analüüsi inokulum saadakse ühega järgmistest meetoditest:

a) SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture) meetod, mis koosneb kahest järgmisest etapist: i) inokulumi valmistamine Vana (pruun) köbrukkärnakude purustatakse väiksemateks tükkideks ja kuivatatakse õhu käes toatemperatuuril, kuni see muutub kõvaks. Kõva kude jahvatatakse käsitsi või mehaaniliselt. Jahvatatud materjal kuivsõelutakse, kogutakse fraktsioonid (25–75 μm) ja seejärel ekstraheeritakse Pratti kloroformi meetodil (1976)1; ii) uute köbrukkärnade moodustamine Umbes 10 mg ekstraheeritud endospoore piserdatakse väikeses plastist Petri tassis 10 ml steriilse destilleeritud vee pinnale ja inkubeeritakse pimedas 20 °C juures kuni idanemiseni. Väikeste, umbes 1–2 mm idudega kartulimugulad asetatakse niiske kuivatuspaberiga vooderdatud läbipaistvatesse plastkarpidesse, märgistatud idud ülalpool. Süstalt kasutades ümbritsetakse idud sulatatud vaseliiniga. Vaseliiniring peab olema katkematu ja piisavalt kõrge, et hoida ära spoorsuspensiooni lekkimine. 10 ml idanevaid endospoore lahjendatakse steriilse veega veel 20 milliliitrini ja tilgutatakse pipeti või pigistuspudeli abil ringi sisse seni, kuni idu on spoorsuspensiooniga täielikult kaetud. Plastkarbid kaetakse kaanega ja inkubeeritakse neli päeva 10 °C juures; seejärel karbid avatakse, inokulum ja vaseliinirõngad eemaldatakse ning kastid viiakse niisutatava õhuga kasvuhoonesse, mille temperatuur on 15–18 °C (16 tundi valgust);

b) Spiekermanni ja Kothoffi meetod (1924) (9);

c) Potoček et al. meetod (1991) (10);

d) Glynne-Lemmerzahli meetod (Glynne 1925, (11) Lemmerzahl 1930, (12) Noble ja Glynne 1970) (13).

Kõigi liidu jaoks teadaolevalt asjakohaste patotüüpide (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) ja 38(Nevşehir)) kindlaksmääramiseks kasutatakse diferentseeritud nakkuse testi määratletud taime eri sortidega, nagu on näidatud tabelis. Nakkustest tehakse vastavalt punktis d (Glynne-Lemmerzahli meetod) nimetatud protokollile.

Kartulisortide selektiivne tundlikkus S. endobioticum’i patotüüpide kindlaksmääramiseks

Sort S. endobioticum’i patotüübid 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S“: vastuvõtlik „R“: resistentne *: osutab sordi vähesele vastuvõtlikkusele S. endobioticum’i suhtes („mittenekrootiliste sporangiumide kogumikega kaetud piirkondade esinemine ilma kärnade moodustumiseta“).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82, lk 21–29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35, lk 25–31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119, lk 165–174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: lk 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113, lk 47–57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126, lk 129–133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: lk 422–432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92, lk 704–708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51, lk 114–115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27, lk 191–205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12, lk 34–60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2, lk 288–297.

(13) Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18, lk 125–135.