3)

Lisatakse alljärgnev VIII peatükk: „VIII. KOGUSUHKUR 1. Kohaldamisala HPLC-RI meetodit kasutatakse kogusuhkru (väljendatuna invertsuhkruna) määramiseks piiritusjookides, välja arvatud muna ja piimatooteid sisaldavad liköörid. Meetod on valideeritud pastis'i, destilleeritud anis'i, kirsilikööri, crème de (millele järgneb kasutatud puuvilja või tooraine nimetus) ja Crème de Cassis'i laboritevahelisel katsel, kontsentratsioonivahemikus 10,86–509,7 g/l. Seadme näidu lineaarsust kontrolliti kontsentratsioonivahemikus 2,5–20,0 g/l. Kõnealune meetod ei ole ette nähtud suhkru vähese sisalduse määramiseks. 2. Viited normidele ISO 3696:1987 Vesi analüütiliseks kasutamiseks – Spetsifikatsioon ja katsemeetodid. 3. Põhimõte Suhkrulahuseid analüüsitakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil, et määrata kindlaks nende glükoosi, fruktoosi, sahharoosi, maltoosi ja laktoosi kontsentratsioon. Osutatud meetod on esitatud näitena; selle puhul kasutatakse statsionaarset alküülamiinifaasi ja diferentsiaalrefraktomeetrilist detektorit. Statsionaarse faasina oleks samuti võimalik kasutada anioonivahetusvaiku. 4. Reaktiivid ja materjalid 4.1. Glükoos (CAS 50-99-7), puhtusega vähemalt 99 %. 4.2. Fruktoos (CAS 57-48-7), puhtusega vähemalt 99 %. 4.3. Sahharoos (CAS 57-50-1), puhtusega vähemalt 99 %. 4.4. Laktoos (CAS 5965-66-2), puhtusega vähemalt 99 %. 4.5. Maltoosmonohüdraat (CAS 6363-53-7), puhtusega vähemalt 99 %. 4.6. Puhas atsetonitriil (CAS 75-05-8) HPLC analüüsi jaoks. 4.7. Destilleeritud või demineraliseeritud vesi, eelistatavalt mikrofiltritud. 4.8. Lahustid (näide) Eluendi koostis on järgmine: 75 mahuosa atsetonitriili (4.6), 25 mahuosa destilleeritud vett (4.7). Enne kasutamist eluent degaseeritakse; selleks juhitakse eluendist aeglase vooluna 5–10 minuti jooksul läbi heeliumi. Kui kasutatavat vett ei ole mikrofiltritud, tuleks eluent filtrida orgaaniliste lahustite filtriga, mille poori suurus on kuni 0,45 μm. 4.9. Absoluutne etanool (CAS 64-17-5) 4.10. Etanoolilahus (5 %, v/v). 4.11. Standardpõhilahuse (20 g/l) valmistamine Kaalutakse 2 g analüüsitavat suhkrut (4.1–4.5) ja viiakse ilma kadudeta üle 100 ml mõõtekolbi. (NB! 2 g maltoosile vastab 2,11 g maltoosmonohüdraati.) Täiendatakse kuni 100 ml-ni 5-mahuprotsendilise alkoholilahusega (4.10), loksutatakse ja säilitatakse temperatuuril üle + 4 °C. Uus põhilahus valmistatakse kord nädalas. 4.12. Standardtöölahuste (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ja 20,0 g/l) valmistamine Põhilahust (20 g/l) lahjendatakse sobivas vahekorras 5-mahuprotsendilise alkoholilahusega (4.10), et saada viis standardtöölahust (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ja 20,0 g/l). Filtritakse filtriga, mille poori suurus on kuni 0,45 μm (5.3). 5. Seadmed ja aparatuur 5.1. Kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) süsteem, mille abil on võimalik saavutada kõikide suhkrute lahutumist kuni nulljooneni. 5.1.1. Kõrgefektiivne vedelikkromatograaf, millel on kuuekäiguline injektsiooniventiil, mille sisestussilmus on 10 μl, või mis tahes muu automaatne või manuaalne seade mikrokoguste täpseks sissesüstimiseks. 5.1.2. Pumbasüsteem, mis võimaldab saavutada ja hoida püsivat või programmeeritud voolukiirust suure täpsusega. 5.1.3. Diferentsiaalrefraktomeeter. 5.1.4. Integreeriv arvutisüsteem või isekirjutaja, mille tase vastab ülejäänud seadmete tasemele. 5.1.5. Eelkolonn Analüütilisele kolonnile soovitatakse lisada sobiv eelkolonn. 5.1.6. Kolonn (näide): Materjal: roostevaba teras või klaas Siseläbimõõt: 2–5 mm. Pikkus: 100–250 mm (sõltuvalt pakendi osakeste suurusest), näiteks 250 mm, kui osakeste läbimõõt on 5 μm. Statsionaarne faas: ränidioksiidiga seotud alküülamiinfunktsionaalrühmad, osakeste suurus kuni 5 μm. 5.1.7. Kromatografeerimistingimused (näide): Eluent (4.8), voolukiirus: 1 milliliiter minutis. Tuvastamine: diferentsiaalrefraktomeetria. Detektori täieliku stabiilsuse tagamiseks tuleks see sisse lülitada paar tundi enne kasutamist. Võrdlusküvett tuleb täita eluendiga. 5.2. Analüütilised kaalud täpsusega 0,1 mg. 5.3. Seade väikeste lahusekoguste filtrimiseks, milles kasutatakse mikromembraane 0,45 μm. 6. Proovi säilitamine Pärast kättesaamist säilitatakse proove kuni analüüsimiseni toatemperatuuril. 7. Määramise käik 7.1. A OSA: proovi ettevalmistamine 7.1.1. Proovi loksutatakse. 7.1.2. Proov filtritakse läbi filtri, mille poori suurus on kuni 0,45 μm (5.3). 7.2. B OSA: HPLC 7.2.1. Määramine Kolonni süstitakse 10 μl standardlahuseid (4.12) ja proove (7.1.2). Tehakse analüüs sobivatel kromatograafilistel tingimustel, näiteks nagu eespool kirjeldatud. 7.2.2. Kui proovi mõne piigi pindala (või kõrgus) on suurem kui vastava piigi kõige kontsentreeritum standard, tuleb proovi lahjendada destilleeritud veega ja teha kordusanalüüs. 8. Arvutamine Võrreldakse kaht kromatogrammi, mis on saadud standardlahuse ja kange alkohoolse joogiga. Piigid määratakse nende retentsiooniaja järgi. Mõõdetakse iga piigi pindala (või kõrgus) ja arvutatakse välisstandardi meetodi abil suhkru kontsentratsioon. Arvesse võetakse proovi kõiki lahjendamisi. Lõpptulemuseks on sahharoosi, maltoosi, laktoosi, glükoosi ja fruktoosi summa, väljendatuna invertsuhkruna (g/l). Invertsuhkrusisaldus arvutatakse proovis sisalduvate monosahhariidide ja taandavate disahhariidide summana, millele lisatakse glükoosi ja fruktoosi stöhhiomeetrilised kogused, mis arvutatakse olemasolevast sahharoosisisaldusest. Invertsuhkur (g/l) = glükoos (g/l) + fruktoos (g/l) + maltoos (g/l) + laktoos (g/l) + (sahharoos (g/l) × 1,05) 1,05 = (fruktoosi molekulmass + glükoosi molekulmass) / sahharoosi molekulmass 9. Meetodi suutlikkuse näitajad (täpsus) 9.1. Laboritevahelise katse statistilised tulemused Vastavalt rahvusvaheliselt kokku lepitud eeskirjadele [1] [2] tehtud meetodi suutlikkuse rahvusvahelise uuringu põhjal saadi järgmised andmed. Laboritevahelise katse tegemise aasta: 2000 Laborite arv 24 Proovide arv 8 [1] „Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studies“ Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332–343. [2] Horwitz, W. (1982) Analytical Chemistry 54, 67A–76A. Tabel 1 Fruktoos, glükoos, maltoos Analüüt Fruktoos Glükoos Maltoos Proovid (2 proovi) Crème de Cassis Standard (50 g/l) Aniisimaitselised piiritusjoogid Crème de Cassis Standard (50 g/l) Aniisimaitselised piiritusjoogid Standard (10 g/l) Keskväärtus [g/l] 92,78 50,61 15,62 93,16 50,06 15,81 9,32 Laborite arv (ilma võõrväärtusteta) 21 22 21 23 19 21 22 Korratavuse standardhälve sr [g/l] 2,34 2,12 0,43 3,47 1,01 0,48 0,54 Korratavuse suhteline standardhälve RSDr [%] 2,53 4,2 2,76 3,72 2,03 3,02 5,77 Korratavuse piirnorm r [g/l] (r = 2,8 × sr) 6,56 5,95 1,21 9,71 2,84 1,34 1,51 Reprodutseeritavuse standardhälve sR [g/l] 7,72 3,13 0,84 9,99 2,7 0,88 1,4 Reprodutseeritavuse suhteline standardhälve RSDR [%] 8,32 6,18 5,37 10,72 5,4 5,54 15,06 Reprodutseeritavuse piirnorm R [g/l] (R = 2,8 × sR) 21,62 8,76 2,35 27,97 7,57 2,45 3,93

Tabel 2 Sahharoos Analüüt Sahharoos Proovid Pastis Ouzo Cherry liqueur Crème de Menthe Crème de Cassis Standard (100 g/l) Keskväärtus [g/l] 10,83 29,2 19,7 (*) 103,33 349,96 319,84 99,83 Laborite arv (ilma võõrväärtusteta) 19 19 20 18 18 18 Korratavuse standardhälve sr [g/l] 0,09 0,75 2,17 5,99 4,31 1,25 Korratavuse suhteline standardhälve RSDr [%] 0,81 3,07 2,1 1,71 1,35 1,25 Korratavuse piirnorm r [g/l] (r = 2,8 × sr) 0,25 2,1 6,07 16,76 12,06 3,49 Reprodutseeritavuse standardhälve sR [g/l] 0,79 0,92 4,18 9,94 16,11 4,63 Reprodutseeritavuse suhteline standardhälve RSDR [%] 7,31 3,76 4,05 2,84 5,04 4,64 Reprodutseeritavuse piirnorm R [g/l] (R = 2,8 × sR) 2,22 2,57 11,7 27,84 45,12 12,97

Tabel 3 Kogusuhkur (Märkus: kõnealused andmed arvutati kogusuhkru kohta, mitte invertsuhkru kohta, nagu on määratletud eespool 8. punktis.)

Proovid Pastis Ouzo Aniisimaitselised piiritusjoogid Cherry liqueur Crème de Menthe Crème de Cassis Standard (220 g/l) Keskväärtus [g/l] 10,86 29,2 19,7 (**) 31,59 103,33 349,73 509,69 218,78 Laborite arv (ilma võõrväärtusteta) 20 19 20 20 18 18 19 Korratavuse standardhälve sr [g/l] 0,13 0,75 0,77 2,17 5,89 5,59 2,71 Korratavuse suhteline standardhälve RSDr [%] 1,16 3,07 2,45 2,1 1,69 1,1 1,24 Korratavuse piirnorm r [g/l] (r = 2,8 × sr) 0,35 2,1 2,17 6,07 16,5 15,65 7,59 Reprodutseeritavuse standardhälve sR [g/l] 0,79 0,92 1,51 4,18 9,98 14,81 8,53 Reprodutseeritavuse suhteline standardhälve RSDR [%] 7,25 3,76 4,79 4,04 2,85 2,91 3,9 Reprodutseeritavuse piirnorm R [g/l] (R = 2,8 × sR) 2,21 2,57 4,24 11,7 27,94 41,48 23,89