II LISA

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOOSIMISE, AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE ANALÜÜSIMETOODIKA

AANALÜÜSIMETOODIA KOHALDAMISALA

Käesoleva metoodikaga kirjeldatakse eri menetlusi, mis on seotud järgmisega:

i) pruun-baktermädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja bakteriaalse närbumistõve diagnoosimisega kartulis ja tomatis ja mõnedes teistes peremeestaimedes;

ii) bakteri Ralstonia solanacearum avastamisega kartulimugulates, kartulis ja tomatis ning mõnedes teistes peremeestaimedes, vees ja mullas;

iii) bakteri Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) kindlaksmääramisega.

SISUKORD

Lehekülg Üldpõhimõtted 40 I JAGU Analüüsimetoodika rakendamine 40 1. Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (R. solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes 40 2. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides 43 3. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides 46 II JAGU Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamismeetodid kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes, millel on pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid 48 1. Sümptomid 48 2. Kiirsõelkatsed 48 3. Bakterite isoleerimine 49 4. Haigusetekitaja R. solanacearum identifitseerimisanalüüsid 49 III JAGU 1. Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides 49 1.1. Proovi ettevalmistamine 49 1.2. Analüüsimine 51 2. Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste taimede proovides 51 2.1. Proovi ettevalmistamine 51 2.2. Analüüsimine 52 IV JAGU 1. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees 53 2. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees 55 2.1. Proovi ettevalmistamine 55 2.2. Analüüsimine 55 V JAGU 1. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas 56 2. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas 58 2.1. Proovide ettevalmistamine 58 2.2. Analüüsimine 58 VI JAGU Haigusetekitaja R. solanacearum avastamise ja kindlaksmääramise optimeeritud protokollid 58 A. Diagnostilised ja avastamisanalüüsid 58 1. Varrelima test 58 2. Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine 58 3. Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs 59 4. Selektiivne isoleerimine 60 4.1. Selektiivsöötmele väljakülvamine 60 4.2. Rikastamismenetlus 60 5. Immunofluorestsentstest (IF-analüüs) 61 6. Polümeraasi ahelreaktsiooni test (PCR-analüüs) 64 6.1. DNA puhastamismeetodid 65 a) Pastriki (2000) meetod 65 b) Muud meetodid 65 6.2. PCR-test 66 6.3. PCR-produkti analüüs 66 7. In situ fluorestsentshübridisatsioon (FISH-analüüs) 67 8. Ensüümne immunosorbenttest (ELISA-analüüs) 69 a) Kaudne ELISA 69 b) DASI ELISA (kaudne ELISA sandwich-meetodil) 70 9. Biotest 71 B. Identifitseerimisanalüüsid 72 1. Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid 72 2. IF-analüüs 72 3. ELISA-analüüs 73 4. PCR-analüüs 73 5. FISH-analüüs 73 6. Rasvhapete profileerimine (FAP) 73 7. Tüve iseloomustamise meetodid 73 7.1. Biotüübi määramine 73 7.2. Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine 74 7.3. PCR-meetodid 74 C. Kinnitusanalüüs 74 1. liide Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid 76 2. liide Söötmed haigusetekitaja R. solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks 77 3. liide A) Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid 79 B) Kontrollide ettevalmistamine 80 4. liide Analüüsimenetluste puhvrid 82 5. liide Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides 85 6. liide Valideeritud PCR-protokollid ja -reaktiivid 86 7. liide FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid 91 8. liide Baklažaani- ja tomatikultuuride kasvatamistingimused 93 Viited 94

ÜLDPÕHIMÕTTED

Erinevate meetodite optimeeritud protokollid, valideeritud reaktiivid ning üksikasjad analüüsi ja kontrollainete ettevalmistuse kohta on sätestatud liidetes. 1. liites on sätestatud nende laborite nimekiri, mis tegelesid protokollide optimeerimise ja valideerimisega.

Kuna protokollid hõlmavad ohtliku organismi avastamist ja bakteri R. solanacearum elujõuliste kultuuride kasutamist kontrollmaterjalina, tuleb menetlus läbi viia sobivates karantiinitingimustes, kus on kohased jäätmete kõrvaldamise seadmed ja ametlike taimekarantiini asutuste välja antud litsentside kohased tingimused.

Analüüsiparameetrid peavad tagama bakteri R. solanacearum järjepideva ja uuesti korratava avastamise valitud meetodites sätestatud piirmäärades.

Oluline on positiivsete kontrollproovide täpne ettevalmistamine.

Analüüside tegemisel vastavalt nõutavatele piirmääradele tuleb tähelepanu pöörata ka seadmete õigele seadistusele, hooldusele ja kalibreerimisele, reaktiivide hoolikale käitlemisele ja säilitamisele ning kõigile meetmetele, mille eesmärk on vältida proovide omavahelist saastumist, s.t positiivsete kontrollproovide eraldamisele analüüsitavatest proovidest. Tuleb kohaldada kvaliteedikontrolli standardeid, et vältida halduslikke ja muid vigu, eelkõige seoses märgistamise ja dokumentidega.

Direktiivi 98/57/EÜ artikli 4 lõikes 2 osutatud haiguse esinemise kahtlus tähendab diagrammides määratletud proovi diagnostiliste või sõelkatsete positiivset tulemust. Esimese sõelkatse (IF-analüüs, PCR/FISH, selektiivne isoleerimine) positiivset tulemust tuleb kinnitada teise sõelkatsega, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel.

Kui esimese sõelkatse tulemus on positiivne, kahtlustatakse nakatumist bakteriga R. solanacearum ning tuleb teha teine sõelkatse. Kui teine sõelkatse annab positiivse tulemuse, on kahtlus leidnud kinnituse (haiguse esinemise kahtlus) ning tuleb jätkata analüüside tegemist vastavalt metoodikale. Kui teine sõelkatse annab negatiivse tulemuse, ei peeta proovi bakteriga nakatunuks.

Direktiivi 98/57/EÜ artikli 5 lõikes 1 osutatud kinnitatud organismi olemasolu tähendab bakteri R. solanacearum puhaskultuuri isoleerimist ja identifitseerimist koos patogeensuse kinnitusega.

I JAGU

ANALÜÜSIMETOODIKA RAKENDAMINE

1. Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (Ralstonia solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes

Analüüsimetoodika on ette nähtud kartulimugulate ja -taimede puhul, millel esinevad tüüpilised või kahtlased pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid. Siia kuuluvad kiiranalüüsid, saastunud juhtkoest patogeeni isoleerimine (selektiiv)söötmele ja positiivse tulemuse korral bakteri Ralstonia solanacearum kindlaksmääramine.

2. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

Põhimõte

Analüüsimeetod on mõeldud latentsete nakkuste avastamiseks kartulimugulates. Erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhineva vähemalt kahe sõelkatse positiivse tulemuse korral3 tuleb patogeen isoleerida; kui isoleeritakse tüüpilised kolooniad, peab järgnema bakteri R. solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine. Ainult ühe määramismeetodi positiivsest tulemusest ei piisa selleks, et lugeda proov kahtlaseks.

Sõelkatsed ja isolatsioonianalüüsid peavad võimaldama avastada 103 kuni 104 rakku resuspenseeritud bakterisademe milliliitri kohta, mis kuuluvad positiivse kontrollina igasse analüüsiseeriasse.

3. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

II JAGU

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM ÜKSIKASJALIKUD AVASTAMISMEETODID KARTULIMUGULATES JA KARTULIS, TOMATIS JA TEISTES PEREMEESTAIMEDES, MILLEL ON PRUUN-BAKTERMÄDANIKU VÕI BAKTERIAALSE NÄRBUMISTÕVE SÜMPTOMID

1. Sümptomid (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Sümptomid kartulil

Kartulitaim. Infektsiooni varajast staadiumit põllul iseloomustab päevaste kõrgete temperatuuride juures närbumine alates alumistest lehtedest taime tipu suunas, kusjuures öösel taim taastub. Närbumise varajastes staadiumides jäävad lehed roheliseks, kuid hiljem muutuvad need kollaseks ja pruuniks ning kärbuvad. Esineb ka lehtede allapoole keerdumist. Ühe võrse või kogu taime närbumine muutub kiiresti pöördumatuks ning lõpeb taime kokkuvarisemise ja hukuga. Närbunud taime varre ristlõike juhtkude on tavaliselt pruuniks muutunud ning piimjas bakterilima immitseb lõikepinnalt või eritub pigistamisel. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, on näha limaniitide väljavoolamist juhtkimpudest.

Kartulimugul. Kartulimugulast tuleb teha ristläbilõige basaalse (stoolonipoolse) tipu lähedalt või lõigata pikisuunaliselt üle stooloni tipu. Infektsiooni varajane staadium on äratuntav juhtkoeringi klaasistumisena ja värvusemuutusena klaasjaskollakast helepruunini ning ringist võib lõikekohal pärast mõne minuti möödumist iseeneslikult erituda kahvatu kreemjas bakteriaalne eritis. Hiljem muutub juhtkoering selgelt eristatavalt pruuniks ning kärbumine võib ulatuda põhikoeni. Edasiarenenud infektsioonifaasis võib bakterilima erituda ka basaalsest tipust või kartulisilmadest, põhjustades mullaosakeste kleepumist mugulale. Juhtkoe sisemise kokkuvajumise tõttu võivad koorel tekkida punakaspruunid sissevajunud kahjustused. Haiguse edasiarenenud faasides on tavapärane sekundaarsete seente ja bakterite põhjustatud pehmete mädanike areng.

1.2. Sümptomid tomatil

Tomatitaim. Esimeseks nähtavaks sümptomiks on noorimate lehtede longuvajumine. Haigusetekitaja jaoks soodsate keskkonnatingimuste juures (mulla temperatuur umbes 25 °C: küllastunud niiskus) esineb lehtede allapoole keerdumine ja taime osaline või täielik närbumine, millele järgneb kogu taime kokkuvarisemine mõne päeva jooksul. Vähem soodsate tingimuste korral (mulla temperatuur alla 21 °C) esineb närbumist vähem, kuid varrel võib areneda suurel hulgal lisajuuri. Varre alaosal võib märgata vesiseid triipe, mis on juhtkoes esineva nekroosi tunnuseks. Kui varrest teha ristlõige, eritub pruuniks muutunud juhtkoest valget või kollakat bakterilima.

1.3. Sümptomid teistel peremeestaimedel

Hariliku maavitsa Solanum dulcamara ja musta maavitsa S. nigrum taimed. Kui mulla temperatuur ei ületa 25 °C ja inokulaadi tase ei ole äärmiselt kõrge (st S. nigrum ei kasva haige kartuli- või tomatitaime kõrval), täheldatakse looduslikes tingimustes nendel umbrohtudest peremeestaimedel närbumissümptomeid harva. Kui närbumine ilmneb, on sümptomid samad mis tomatil. Mittenärbunud S. dulcamara taimedel, mille varred ja juured kasvavad vees, võib ilmneda varre ala- või veealuste osade seesmine ristlõikel nähtav juhtkudede helepruuniks muutumine. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, võib läbilõigatud juhtkudedest erituda bakterilima või moodustuda limaniite, seda isegi närbumissümptomite puudumisel.

2. Kiirsõelkatsed

Kiirmääramismmeetodid võivad hõlbustada oletatava diagnoosi määramist, ent ei ole otsustava tähtsusega. Kasutatakse üht või mitut järgmistest valideeritud analüüsidest:

2.1. Varrelima test

(Vt VI jao punkt A.1.)

2.2. Polü-β-hüdroksübutüraadi (PHB) graanulite tuvastamine

Haigusetekitaja R. solanacearum rakkudes esinevaid iseloomulikke polü-β-hüdroksübutüraadi (PHB) graanuleid saab nähtavaks muuta nakatunud koe bakterilima läbi leegi fikseeritud äiete värvimisel mikroskoobi alusklaasil värvainetega Niiluse sinine A ja Sudaani must B (vt V jao punkt A.2.).

2.3. Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

(Vt VI jao punkt A.3.)

2.4. Muud analüüsid

Teised sobilikud kiirmääramismeetodid on IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.), FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.), ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.) ja PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6).

3. Bakterite isoleerimine

a) Kartulimugula juhtkoeringi muutunud värvusega osast või kartuli- või tomati- või muu närbunud peremeestaime varre juhtkimpudest eemaldatakse eritist või mõned lõiked. Lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide) ja jäetakse 5–10 minutiks seisma.

b) Suspensioonist valmistatakse rida kümnekordseid lahjendusi.

c) Suspensioonist ja selle lahjendustest mõõdetakse 50–100 µl üldsöötmele (NA, YPGA või SPA; vt 2. liide) ja/või Kelmani tetrasooliumsöötmele (2. liide) ja/või valideeritud selektiivsöötmele (nt SMSA; vt 2. liide). Kasutatakse söötmeplaadil joonkülvi tehnikat või vastava lahjenduse laiali külvamist söötmeplaadile. Vajaduse korral valmistatakse eraldi söötmeplaadid positiivse haigusetekitaja kontrolli jaoks, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 tüve.

d) Plaate inkubeeritakse 28 °C juures 2–6 päeva. — Üldsöötmel on virulentse R. solanacearum’i kolooniad kreemikasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed ning sageli iseloomulike spiraalsete keeretega keskel. R. solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti kreemjasvalged. — Kelmani tetrasoolium- või SMSA-söötmel on keerded veripunased. Ralstonia solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti sügavpunased.

4. R. solanacearum’i kindlaksmääramise analüüsid

R. solanacearum’i eeldatavad isolaadid saab kindlaks määrata VI jao punktis B esitatud analüüsidega.

III JAGU

1. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

1.1. Proovi ettevalmistamine

Märkus

— Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Intensiivsem proovivõtmine eeldab rohkem analüüse, kuid proovi suurus jääb samaks. Suurem mugulate arv proovis põhjustab tulemuste inhibeerimise või nende tõlgendamise keerukuse. Siiski saab meetodit kohaldada ka alla 200 mugulaga proovi puhul, kui rohkem mugulaid ei ole.

— Kõigi allpool kirjeldatud avastamismeetodite valideerimine põhineb analüüsidel, mis on tehtud 200 mugulast koosneva prooviga.

— Allpool kirjeldatud kartuliekstrakti saab kasutada ka kartuli-ringmädaniku bakteri Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus avastamiseks.

Vabatahtlik eeltöötlemine enne proovi valmistamist

a) Proove inkubeeritakse 25–30 °C juures kuni kaks nädalat enne analüüsimist, et ergutada R. solanacearum’i populatsioonide paljunemist.

b) Mugulad pestakse. Iga proovi järel kasutatakse kohaseid desinfektsioonivahendeid (klooriühendeid, kui kasutatakse PCR-katset, et eemaldada patogeenne DNA) ja pesuaineid. Mugulad kuivatatakse õhu käes. Pesemine on eriti kasulik (kuid mitte nõutav) nende proovide puhul, millel on liiga palju mulda, ning kui tehakse PCR-analüüsi või bakterite otsest isoleerimist.

1.1.1. Puhta ja desinfitseeritud skalpelli või juurviljanoa abil eemaldatakse koor mugula basaalse (stoolonipoolse) tipu juurest nii, et juhtkude tuleb nähtavale. Basaalse tipu juures lõigatakse väike juhtkoe südamik ettevaatlikult välja nii, et muid kudesid tuleks kaasa võimalikult vähe (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus: iga pruunmädaniku kahtlase sümptomiga mugul hoitakse alles ja sellega tehakse eraldi analüüsid.

Kui basaalse tipusüdamiku eemaldamisel ilmneb pruun-baktermädaniku kahtlaseid sümptomeid, tuleks teha selle mugula visuaalne kontroll ja mugulat lõigata basaalse tipu juures. Kõiki kahtlaste sümptomitega lõigatud mugulaid tuleks hoida korgistumiseks vähemalt kaks päeva toatemperatuuril ning seejärel säilitada jahutatult (4–10 °C) kohastes karantiinitingimustes. Kõiki mugulaid, sealhulgas kahtlaste sümptomitega, tuleks säilitada vastavalt III lisale.

1.1.2. Basaalsed tipusüdamikud kogutakse kasutamata ühekordse kasutusega mahutitesse, mida saab sulgeda ja/või pitseerida (kui mahuteid kasutatakse uuesti, tuleks need põhjalikult puhastada ja desinfitseerida, kasutades klooriühendeid). Eelistatult tuleks eemaldatud basaalseid tipusüdamikke töödelda kohe. Kui see ei ole võimalik, hoitakse neid mahutis puhvrit lisamata, jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse, kasutades üht järgmistest meetoditest.

a) Südamikud kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult.

b) Südamikud homogeenitakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) kas segistis (näiteks Waring või Ultra Thurax) või purustades need suletud ühekordse kasutusega matseratsioonikotis (näiteks Stomacheri või Bioreba tugev kilekott mõõtudega 150 mm × 250 mm; kiirgussteriilne), kasutades kummivasarat või sobivat peenestusseadet (näiteks Homex).

Märkus: kui proovid homogeenitakse segistis, on suur proovide ristsaastumise oht. Tuleb võtta ettevaatusabinõusid, et vältida aerosooli tekkimist või proovi lekkimist ekstraktsiooni käigus. Tagatakse äsja steriliseeritud segistiterade ja -anumate kasutamine iga proovi korral. Kui kasutatakse PCR-analüüsi, välditakse DNA ülekandumist mahutites või peenestusseadmes. PCR-analüüsi tegemisel on soovitav purustada ühekordse kasutusega kottides ja kasutada ühekordse kasutusega katseklaase.

1.1.3. Supernatant dekanteeritakse. Kui lahus on liiga hägune, selitatakse see madalal kiirusel tsentrifuugides (mitte üle 180 g 10 minutit jooksul temperatuuril 4–10 °C) või vaakumfiltreerimisega (40–100 µm), pestes filtrit täiendava ektraktsioonipuhvriga (~10 ml).

1.1.4. Bakterifraktsioon kontsentreeritakse, tsentrifuugides 7 000 g juures 15 minutit (või 10 000 g juures 10 minutit) temperatuuril 4–10 °C, ning supernatant eemaldatakse bakterisadet segamata.

1.1.5. Bakterisade resuspendeeritakse 1,5 ml bakterisademe puhvris (4. liide). Haigusetekitaja R. solanacearum kontrollimise jaoks kasutatakse 500 µl, haigusetekitaja Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jaoks 500 µl ja võrdluseesmärgil 500 µl. 500 µl võrdlusalikvoodile ja ülejäänud analüüsialikvoodile lisatakse steriilset glütserooli lõppkontsentratsiooni 10–25 % (v/v) saamiseks, loksutatakse ja säilitatakse temperatuuril –16 kuni –24 °C (nädalaid) või –68 kuni –86 °C (kuid). Analüüside tegemise ajal hoitakse analüüsialikvoote 4–10 °C juures.

Korduv külmutamine ja sulatamine ei ole soovitav.

Kui ekstrakti tuleb transportida, tuleb seda teha külmkastis 24–48 tunni jooksul.

1.1.6. Kõiki R. solanacearum’i positiivseid kontrolle ja proove tuleb käsitleda eraldi, et vältida saastumist. Seda tuleb järgida IF-objektiklaaside ja kõigi analüüside korral.

1.2. Analüüsimine

Vaata diagramme ja analüüsikirjeldusi ning optimeeritud protokolle vastavates liidetes.

Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.)

IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.)

PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.)

FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.)

ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.)

Biotest (vt VI jao punkt A.9.)

2. Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

2.1. Proovi ettevalmistamine

Märkus: haigusetekitaja R. solanacearum latentsete populatsioonide avastamiseks on soovitav kasutada liitproove. Meetodit saab mugavalt kasutada kuni 200 varreosast koosnevate liitproovide puhul. Seirete läbiviimisel peaksid seired põhinema uuritavat taimepopulatsiooni statistiliselt esindaval proovil.

2.1.1. 1–2 cm pikkused varreosad kogutakse suletud streriilsesse mahutisse järgmise proovivõtumenetluse kohaselt.

Tomatiseemikud. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse puhta desinfitseeritud noaga 1 cm pikkune osa.

Avamaal või kasvuhoones kasvatatud tomatitaimed. Puhta desinfitseeritud noaga eemaldatakse iga taime kõige madalam külgvõrse, lõigates vahetult põhivarre ühenduskoha kohal. Eemaldatakse iga külgvõrse kõige alumine 1 cm pikkune osa.

Teised peremeestaimed. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse puhta desinfitseeritud noa või oksakääridega 1 cm pikkune osa. S. dulcamara’l ja teistel vees kasvavatel peremeestaimedel eemaldatakse veealuste varte või stoolonite 1–2 cm pikkused vesijuurtega osad.

Teatavas proovivõtukohas proovi võttes on soovitav analüüsida statistiliselt esindavat proovi, milleks võetakse proovivõtukohast vähemalt 10 iga võimaliku umbrohust peremeestaime taime. Patogeeni avastamine on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, vooluveekogudes kasvava mitmeaastase taime Solanum dulcamara looduslikku nakatumist saab määrata aasta ringi. Teadaolevateks peremeestaimedeks on isekülvanud kartulitaimed, harilik maavits Solanum dulcamara, must maavits S. nigrum, harilik ogaõun Datura stramonium ja teised sugukonna maavitsalised (Solanaceae) liigid. Peremeestaimedeks on ka pelargoon Pelargonium spp. ja harilik portulak Portulaca oleracea. Mõned Euroopas levinud umbrohuliigid, nagu odalehine malts Atriplex hastata, karvane ruse Bidens pilosa, kera-kadakkaer Cerastium glomeratum, valge hanemalts Chenopodium album, harilik vesikanep Eupatorium cannabinum, paljas võõrkakar Galinsoga parviflora, mürktulikas Ranunculus scleratus, kerss Rorippa spp, oblikas Rumex spp., valge põisrohi Silene alba, longus põisrohi S. nutans., paiseleht Tussilago farfara ja kõrvenõges Urtica dioica, võivad varjata teatavate keskkonnatingimuste puhul juurtes ja/või risosfääris R. solanacearum’i biotüübi 2 / rassi 3 populatsioone.

Märkus: selles etapis saab teha sisemiste sümptomite (vaskulaarne värvumine või bakterilima) visuaalse vaatluse. Iga sümptomitega varreosa pannakse kõrvale ja sellega tehakse eraldi analüüsid (vt II jagu).

2.1.2. Varreosad desinfitseeritakse kergelt 70 % etanooliga ja kuivatakse kohe kuivatuspaberiga. Seejärel töödeldakse varreosasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

a) Varreosad kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult.

b) Töödeldakse kohe, purustades osad tugevas matseratsioonikotis (näiteks Stomacher või Bioreba) koos sobiva koguse ekstratsioonipuhvriga (4. liide) kas kummivasara või kohase peenestusseadmega (näiteks Homex). Kui see ei ole võimalik, säilitatakse varreosasid jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

2.1.3. Kui lahus on seisnud 15 minutit, dekanteeritakse supernatant.

2.1.4. Ekstrakti täiendavat selitamist või bakterifraktsiooni kontsentreerimist tavaliselt ei nõuta, kuid seda võib filtreerida ja/või tsentrifuugida vastavalt III jao punktidele 1.1.3–1.1.5.

2.1.5. Lahjendamata või kontsentreeritud proov jagatakse kahte võrdsesse ossa. Üht osa säilitatakse 4–10 °C juures katsete tegemise ajal ja teist osa 10–25 % (v/v) steriilse glütserooliga temperatuuril –16 kuni –24 °C (nädalaid) või –68 kuni –86 °C (kuid) juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid.

2.2. Analüüsimine

Vaata diagramme ja analüüsikirjeldusi ja optimeeritud protokolle vastavates liidetes.

Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.)

IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.)

PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.)

FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.)

ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.)

Biotest (vt VI jao punkt A.9.).

IV JAGU

1. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees

2. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees

Põhimõte

Käesolevas jaos kirjeldatud valideeritud avastusmeetodeid kasutatakse patogeeni avastamiseks pinnavee proovides ning seda võib kohaldada ka kartulitöötlemise heitvee ja reovee proovides. Oluline on märkida, et eeldatav avastustundlikkus sõltub substraadist. Isoleerimisanalüüsi tundlikkust mõjutavad võistlevate saprofüütbakterite populatsioonid, mille sisaldus on üldiselt palju suurem kartulitöötlemisheitvees ja reovees kui pinnavees. Allpool esitatud metoodika avastab pinnavees eeldatavalt 103 rakku liitri kohta, kartulitöötlemise heitvees ja reovees on tundlikkus tõenäoliselt märgatavalt madalam. Seetõttu on soovitav analüüsida heit- ja reovett pärast puhastustoiminguid (nt sadestamist ja filtreerimist), mille käigus vähendatakse saprofüütbakterite populatsioone. Negatiivsete tulemuste usaldusväärsuse hindamisel tuleb arvesse võtta analüüsimeetodite tundlikkuspiiranguid. Käesolevat metoodikat on edukalt kasutatud pinnavees patogeeni olemasolu või puudumise kindlakstegemiseks läbi viidaval seirel, kartulitöötlemise heitvee ja reovee seirel tuleb arvestada selle piiratust.

2.1. Proovi ettevalmistamine

Märkus

— Haigusetekitaja R. solanacearum’i avastamine pinnavees on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, kui veetemperatuur on üle 15 °C.

— Korduv proovivõtt määratud proovivõtukohtades eri aegadel eespool nimetatud perioodil vähendab ilmastikutingimuste mõju ja suurendab avastamise usaldusväärsust.

— Arvesse tuleb võtta tugeva vihmasaju ja vooluveekogu geograafia mõju, et vältida patogeeni avastamist segavat ulatuslikku lahjendumist.

— Veeproove tuleb võtta peremeestaimede läheduses, kui need on olemas.

2.1.1. Kõigis valitud proovivõtukohtades võetakse veeproove ühekordse kasutusega steriilsetesse katseklaasidesse või pudelitesse võimaluse korral sügavamalt kui 30 cm ja 2 m raadiuses kaldast. Töötlemisheitvee ja reovee proove võetakse ärajuhtimiskohas. Soovitav proovisuurus on kuni 500 ml proovivõtukoha kohta. Väiksemate proovide puhul on soovitav võtta proove proovivõtukohast vähemalt 3 korda, kusjuures iga proov koosneb 2 dubleeritud vähemalt 30 ml suurusest alaproovist. Tõhusaks seireks valitakse vähemalt 3 proovivõtukohta vooluveekogu iga 3 km kohta ning võetakse proove ka vooluveekokku suubuvatest haruveekogudest.

2.1.2. Proove transporditakse jahedas (4–10 °C) ja pimedas ning analüüsitakse 24 tunni jooksul.

2.1.3. Vajaduse korral võib bakterifraktsiooni kontsentreerida, kasutades üht järgmistest meetoditest.

a) Tsentrifuugitakse 30–50 ml alaproovi 10 000 g juures 10 minutit (või 7 000 g juures 15 minutit), eelistatavalt temperatuuril 4–10 °C, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 1 ml fosfaatpuhvris (4. liide).

b) Membraanfiltreerimine (pooride läbimõõt vähemalt 0,45 µm), mille järel pestakse filter 5–10 ml fosfaatpuhvris ja pesuvesi säilitatakse. See meetod on sobiv suurte veekoguste puhul, mis sisaldavad vähe saprofüütbaktereid.

Kontsentreerimine ei ole tavaliselt soovitav kartulitöötlemise heitvee ja reovee proovide puhul, sest võistlevate saprofüütbakterite suurenenud populatsioonid inhibeerivad Ralstonia solanacearum’i avastamist.

2.2. Analüüsimine

Vaata diagrammi ja analüüsikirjeldusi vastavates liidetes.

V JAGU

1. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas

2. Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas

Põhimõtted

Käesolevas jaos kirjeldatud valideeritud avastusmeetodeid kohaldatakse patogeeni avastamiseks mullaproovides, kuid seda võib kasutada ka kartuli tahkete töötlemisjäätmete või reoveesetete proovides. Tuleb siiski märkida, et need meetodid ei ole piisavalt tundlikud, et tagada haigusetekitaja Ralstonia solanacearum madalate ja/või ebaühtlaselt hajunud populatsioonide avastamine, mis võivad esineda nende substraatide loomulikult saastunud proovides.

Negatiivsete tulemuste usaldusväärsuse hindamisel ja seire käigus patogeeni olemasolu või puudumise kindlakstegemisel mullas või setteis tuleb arvesse võtta käesoleva metoodika piiratud tundlikkust. Kõige usaldusväärsem analüüs patogeeni olemasolu kindlakstegemiseks põllumullas on vastuvõtliku peremeestaime istutamine ja selle nakatumise jälgimine, ent isegi selle meetodiga ei avastata madalat nakkustaset.

2.1. Proovi ettevalmistamine

2.1.1. Põllumullaproovide võtmisel tuleks järgida nematoodiproovi võtmise üldpõhimõtteid. Kogutakse 0,5–1 kg mulda proovi kohta 60 kohast 0,3 ha kohta 10–20 cm sügavuselt (või võrgustikul 7 × 7 meetrit). Kui kahtlustatakse patogeeni olemasolu, suurendatakse kogumiskohtade arvu 120ni 0,3 ha kohta. Enne analüüsimist hoitakse proove temperatuuril 12–15 °C. Kartuli töötlemis- ja reoveesetete proove võetakse kokku 1 kg kohtadest, mis esindavad analüüsitavate setete kogumahtu. Iga proov segatakse enne analüüsimist hoolikalt.

2.1.2. 10–25grammised mulla või sette alaproovid dispergeeritakse pöörleval loksutil (250 pööret minutis) kuni 2 tundi 60–150 milliliitris ekstraktsioonipuhvris (4. liide). 0,02 % Tween-20 ja 10–20 grammi steriilse kruusa lisamine võib vajaduse korral dispersiooni hõlbustada.

2.1.3. Analüüsimise ajal hoida suspensiooni temperatuuril 4 °C.

2.2. Analüüsimine

Vaata diagrammi ja analüüsikirjeldusi vastavates liidetes.

VI JAGU

HAIGUSETEKITAJA R. SOLANACEARUM AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE OPTIMEERITUD PROTOKOLLID

A. DIAGNOSTILISED JA AVASTAMISANALÜÜSID

1. Varrelima test

Haigusetekitaja R. solanacearum olemasolu närbuvates kartuli-, tomati- ja teiste peremeestaimede vartes saab määrata järgmise lihtsa eelanalüüsiga. Taimevars lõigatakse läbi kohe ülalpool mullapinda. Lõikepind suspendeeritakse puhta veega katseklaasis. Jälgitakse iseloomulikku bakterilima niitide iseeneslikku eritumist lõigatud juhtkimpudest mõne minuti pärast.

2. Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine

1. Mikroskoobi objektiklaasil valmistatakse äie YPGA- või SPA-söötmel (2. liide) kasvatatud nakatunud koe või 48tunnise kultuuri bakterilimast.

2. Valmistatakse positiivsed kontrolläiged haigusetekitaja R. solanacearum’i biotüübi 2 tüvega ning vajaduse korral negatiivne kontrolläie teadaoleva PHB negatiivse liigiga.

3. Lastakse kuivada õhu käes ja klaaside alumine pool tõmmatakse kiiresti läbi leegi, et äie fikseeruks.

4. Preparaat värvitakse kas Niiluse sinisega või Sudaani mustaga ning vaadeldakse mikroskoobis järgmiselt.

Värvimine Niiluse sinisega

a) Klaasid ujutatakse üle Niiluse sinise A 1 % vesilahusega ja inkubeeritakse 10 minutit 55 °C juures.

b) Värvilahus valatakse pealt ära. Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

c) Äie ujutatakse üle äädikhappe 8 % vesilahusega ja inkubeeritakse 1 minut toatemperatuuril.

d) Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

e) Niisutatakse uuesti veetilgaga ja asetatakse peale katteklaas.

f) Värvitud äiet vaadeldakse mikroskoobis, millele on sobitatud epifluorestsentsvalgusallikas, 450 nm juures ning kasutatakse õliimmersiooni 600–1 000kordsel suurendusel ja õli- või veeimmersiooni objektiivi.

g) Vaadeldakse ereoranžilt fluorestseeruvaid PHB graanuleid. Vaadeldakse ka altvalgusega valgusmikroskoobis, et olla kindel, et graanulid on rakusisesed ning et rakumorfoloogia on R. solanacearum’i bakterirakkudele tüüpiline.

Värvimine Sudaani mustaga

a) Klaasid ujutatakse üle Sudaani musta 0,3 % lahusega 70 % etanoolis ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril.

b) Värvilahus valatakse pealt ära ning loputatakse korraks kraanivee all, eemaldades liigse vee kuivatuspaberiga.

c) Klaasid kastetakse lühikeseks ajaks ksülooli ja kuivatatakse kuivatuspaberiga. Ettevaatust: ksülool on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis

d) Klaasid ujutatakse üle 0,5 % (mass/maht) safraniini vesilahusega ja jäetakse 10 sekundiks toatemperatuuril seisma. Ettevaatust: safraniin on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis.

e) Pestakse tasaselt voolava kraanivee all, kuivatatakse kuivatuspaberiga ning asetatakse peale katteklaas.

f) Värvitud äigeid vaadeldakse valgusmikroskoobis, millel on ülekantud valgus, ja kasutatakse õliimmersiooni 1 000kordsel suurendusel ja õliimmersiooni objektiivi.

g) Vaadeldakse kahvatupunaseks värvunud rakuseintega R. solanacearum’i rakkudes esinevaid sinakasmusta värvusega PHB graanuleid.

3. Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

R. solanacearum’i rakkude aglutinatsioon bakterilimas või sümptomaatilise koe ekstraktides on kõige paremini jälgitav valideeritud antikehi kasutades (vt 3. liide), mis on konjugeeritud asjakohaste värviliste märgistusainetega, nagu punased Staphylococcus aureus’e rakud või värvilised lateksiosakesed. Müügil olevaid komplekte kasutades (vt 3. liide) järgitakse tootja kasutamisjuhendeid. Muul juhul toimitakse järgnevalt:

a) konjugeeritud antikehasuspensiooni ja bakterilima tilgad (ligikaudu 5 µl kumbagi) segatakse mitmeaknaliste objektiklaaside aknaväljades;

b) valmistatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollproovid, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 suspensioone ja heteroloogset tüve;

c) pärast 15 sekundit õrna segamist jälgitakse aglutinatsiooni positiivsetes proovides.

4. Selektiivne isoleerimine

4.1. Selektiivsöötmele väljakülvamine

Märkus: enne selle meetodi esmakordset kasutamist tehakse eelanalüüsid, et tagada milliliitri kohta R. solanacearum’i 103 kuni 104 kolooniaid moodustavate osakeste taasavastamine, lisatuna varem negatiivsena analüüsitud proovide ekstraktidele.

Kasutatakse nõuetekohaselt valideeritud selektiivsöötmeid, nagu SMSA (muudetud Elphinstone et al., 1996; vt 2. liide).

Suurt tähelepanu nõuab haigusetekitaja R. solanacearum eristamine teistest bakteritest, mille kolooniad võivad kasvusöötmel areneda. Kui söötmeplaadid on bakteritega üleasustatud või leidub antagonistlikke baktereid, võib R. solanacearum’i kolooniatel esineda ebatüüpilist morfoloogiat. Võistlevate või antagonistlike bakterite mõju kahtluse korral tuleks proovi uuesti analüüsida, kasutades erinevat analüüsi.

See meetod on kõige tundlikum värskete prooviekstraktide kasutamisel. Meetodit saab siiski kasutada ka ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –68 kuni –86 °C.

Positiivseteks kontrollproovideks valmistatakse kümnekordne lahjendus virulentse Ralstonia solanacearum’i biotüübi 2 suspensioonist, mille sisaldus on 106 kolooniaid moodustavat rakku milliliitri kohta (nt NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Igasuguse saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollproovid analüüsitavatest proovidest täiesti eraldi.

Iga uuesti valmistatud selektiivsöötme partii kõlblikkust patogeeni kasvatamiseks tuleks enne tavaproovide analüüsimist kontrollida.

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui analüüsitavat proovi (analüüsitavaid proove).

4.1.1. Analüüsi läbiviimiseks tehakse uuritava proovi lahjenduste väljakülv söötmeplaatidele tagamaks, et saprofüütbakterite kolooniaid moodustavad populatsioonid on välja lahjendatud. Söötmeplaadile külvatakse 50–100 µl prooviekstrakti ja igat lahjendust.

4.1.2. Söötmeplaate inkubeeritakse temperatuuril 28 °C. Tulemused loetakse 48 tunni pärast ja seejärel iga päev kuni 6 päeva jooksul. Tüüpilised R. solanacearum’i kolooniad SMSA-söötmel on piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga ja fluidaalsed ning pärast kolmepäevast inkubeerimist on nende värv keskel roosast veripunaseni, keskosas iseloomulike spiraalsete keerdudega. (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus: mõnikord tekivad sellel söötmel R. solanacearum’i ebatüüpilised kolooniad. Need võivad olla väiksed, ümmargused, täiesti punast värvi ning mittefluidaalsed või vaid osaliselt fluidaalsed, mistõttu on neid raske eristada saprofüütbakterite kolooniatest.

4.1.3. Eeldatavad R. solanacearum'i kolooniad puhastatakse pärast joonkülvi või lahjenduse laialikülvamist üldsöötmele, et saada isoleeritud kolooniad (vt 2. liide).

4.1.4. Kultuure säilitatakse lühikest aega steriilses vees (pH 6–8, kloorivaba) toatemperatuuril ja pimedas või pikemat aega krüoprotektantses keskkonnas temperatuuril –68 kuni –86 °C või need lüofiliseeritakse.

4.1.5. Määratakse kindlaks eeldatavad kultuurid (vt VI jao punkt B) ja tehakse patogeensusanalüüs (vt VI jao punkt C).

Selektiivsöötme analüüsi tulemuste tõlgendamine

Selektiivsöötme analüüsi tulemus on negatiivne, kui pärast kuuepäevast inkubeerimist ei ole kasvanud ühtki bakterkolooniat või kui ei ole isoleeritud tüüpilisi R. solanacearum’i kolooniaid, tingimusel et teised võistlevad või antagonistlikud bakterkolooniad ei pärsi R. solanacearum’i kasvu ning et tüüpilised R. solanacearum’i kolooniad on kasvanud vaid positiivsetel kontrollplaatidel.

Selektiivsöötme analüüsi tulemus on positiivne, kui eraldatakse eeldatavad R. solanacearum’i kolooniad.

4.2. Rikastamismenetlus

Kasutatakse valideeritud rikastussöödet, näiteks Wilbrinki puljongit (vt 2.liide).

Seda menetlust võib kasutada R. solanacearum’i kolooniate valikuliseks suurendamiseks prooviekstraktides ja avastustundlikkuse tõstmiseks. Samuti lahjendab see menetlus tõhusalt PCR-reaktsiooni inhibiitoreid (1:100). Tuleb siiski märkida, et R. solanacearum’i rikastamine võib ebaõnnestuda sageli samaaegselt rikastatud saprofüütsete organismide võistlemise või antagonismi tõttu. Seepärast võib olla raske R. solanacearum’i isoleerimine rikastuspuljongi kultuuridest. Lisaks on ELISA-analüüside puhul soovitav kasutada pigem mono- kui polüklonaalseid antikehi, sest seroloogiliselt seotud saprofüütbakterite populatsioonid võivad suureneda.

4.2.1. Rikastamis-PCRi tarvis pannakse 100 µl prooviekstrakti 10 ml rikastuspuljongisse (2. liide), mille alikvoot on DNA-vabas katseklaasis või kolvis. Rikastamis-ELISA tarvis võib kasutada prooviekstrakti suuremat sisaldust (nt 100 µl ekstrakti 1,0 ml rikastuspuljongis).

4.2.2. Inkubeeritakse 27–30 °C juures 72 tundi loksutatava või staatilise kultuurina, kusjuures kork on lõdvalt peal, et tagada õhu juurdepääs.

4.2.3. Enne ELISA- või PCR-analüüsi tegemist segatakse hästi.

4.2.4. Rikastuspuljongit käsitatakse samamoodi kui proove eeltoodud analüüsides.

Märkus: kui teatavate võistlevate saprofüütbakterite suurte populatsioonide tõttu võib eeldada R. solanacearum’i rikastamise inhibitsiooni, võib paremaid tulemusi anda prooviekstraktide rikastamine enne tsentrifuugimist või muid kontsentreerimisetappe.

5. IF-analüüs

Põhimõte

IF-analüüsi tegemist peamise sõelkatsena soovitatakse sellepärast, et see annab stabiilseid tulemusi nõutavate piirväärtuste raames.

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse IF-analüüsi ja IF tulemus on positiivne, tuleb teise sõelkatsena teha PCR- või FISH-analüüs. Kui IF-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja IF tulemus on positiivne, tuleb analüüsi lõpule viimiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus: kasutatakse R. solanacearum’i antikehade valideeritud allikat (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri R. solanacearum 2 000. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade töölahuseid, mis on tiitri lähedal või sellega võrdsed.

Analüüs tuleks teha värskelt tehtud prooviekstraktidega. Vajaduse korral saab seda edukalt teha ekstraktidega, mida on säilitatud –68 kuni –86 °C juures glütserooli all. Glütserooli saab proovist eemaldada nii, et lisatakse 1 ml bakterisademe puhvrit (4. liide), tsentrifuugitakse uuesti 15 minutit 7 000 g juures ja resuspendeeritakse bakterisademe puhvriga võrdesse mahtu. Seda ei ole tihti tarvis, eriti siis, kui proovid kinnitatakse objektiklaasidele leekmeetodil.

Tehakse vastavalt liitele 3B kartuliekstraktis ja soovi korral puhvris suspendeeritud bakteri R. solanacearum homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

Võimaluse korral tuleks kasutada looduslikult nakatunud kude (mida on säilitatud lüofiliseerituna või külmutatuna –16 kuni –24 °C juures) samalaadseks kontrolliks samal objektiklaasil.

Negatiivse kontrollina võib kasutada varem bakteri R. solanacearum negatiivse tulemuse andnud proovi alikvoote.

Positiivseid ja negatiivseid standardiseeritud kontrollaineid, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liites.

Kasutatakse mitmeaknalisi mikroskoobi alusklaase, millel on eelistatult kümme vähemalt 6 mm läbimõõduga aknavälja.

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui analüüsitavat proovi (analüüsitavaid proove).

5.1. Valmistatakse ette objektiklaasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

i) Bakterisademe puhul, mille tärklisesade on suhteliselt väike: pipetitakse standardne kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) 1/100 uuesti suspendeeritud kartulisadet esimesele aknale. Seejärel pipetitakse samasugune kogus lahustamata bakterisadet (1/1) rea ülejäänud akendele. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1.

ii) Muude bakterisademete korral: valmistatakse uuesti suspendeeritud bakterisademest kümnekordsed lahjendused (1/10 ja 1/100) sademepuhvrisse. Pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterisadet ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2.

5.2. Piisad kuivatakse ümbritseva õhu temperatuuril või neid soojendades temperatuurini 40–45 °C. Bakterirakud kinnitatakse objektiklaasile kuumutades (15 minutit 60 °C juures), leekmeetodil, 95 % etanooliga või vastavalt antikehade tarnijate konkreetsetele juhistele.

Vajaduse korral võib kinnitatud objektiklaase säilitada külmutatult kuivatusainet sisaldavas karbis võimalikult vähe aega (kuni kolm kuud) enne järgmist analüüsi.

5.3. IF-meetod

i) Vastavalt punkti 5.1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele Valmistatakse rida kahekordseid lahjendusi. Esimeses augus peaks olema 1/2 tiitrist (T/2), teistes 1/4 tiitrist (T/4), 1/2 tiitrist (T/2), tiiter (T) ja kahekordne tiiter (2T).

ii) Vastavalt punkti 5.1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele Valmistatakse antikehade töölahjendus IF-puhvris. Töölahjendus mõjutab spetsiifilisust. Joonis 1. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1

Joonis 1. Alapunktile i ja punkti 5.3 alapunktile i.

Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendused 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendus (T = tiiter) T/2 T/4 T/2 T 2T  Antiseerumi/antikehade kahekordsed lahjendused Proov 1 1 2 3 4 5 Proovi 1 duplikaat või proov 2 6 7 8 9 10





Joonis 2. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1 alapunktile ii ja punkti 5.3 alapunktile ii.

Antiseerumi/antikehade töölahused 1/1 1/10 1/100 tühi tühi  Uuesti suspendeeritud bakterisademe kümnendlahjendused Proov 1 1 2 3 4 5 Proovi 1 duplikaat või proov 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile. Iga aknaväli kaetakse täielikult antikehade lahjendus(t)ega. Igale aknaväljale lisatud antikehade kogus peab olema vähemalt võrdne objektiklaasile lisatud ekstrakti kogusega.

Kui antikehade tarnijalt ei ole konkreetseid juhiseid, tuleks kasutada järgmist meetodit.

5.3.2. Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

5.3.3. Igalt objektiklaasilt raputatakse piisad ära ja need loputatakse hoolikalt IF-puhvriga. Pestakse 5 minutit IF Tween-puhvris (4. liide) ning seejärel IF-puhvris. Tuleks vältida aerosoolide ja piiskade ülakandumist, mis võiks põhjustada ristsaastumise. Kuivatuspaberiga kergelt kuivatades eemaldatakse ettevaatlikult liigne niiskus.

5.3.4. Objektiklaasid asetatakse niiskele paberile. Aknaväljad kaetakse FITC-konjugaadi lahjendusega, mida kasutati tiitri määramisel. Aknaväljadele lisatud konjugaadi kogus peab olema sama, mis on antikehade kogus.

5.3.5. Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

5.3.6. Konjugaadi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha. Loputatakse ja pestakse nagu eespool kirjeldatud (5.3.3).

Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus.

5.3.7. Igasse aknavälja pipetitakse 5–10 µl 0,1 M fosfaatpuhverdatud glütserooli (4. liide) või kaubanduslikult kättesaadavat pleekimisvastast kattevedelikku ning objektiklaas kaetakse katteklaasiga.

5.4. IF-analüüsi tulemused

5.4.1. Objektiklaase vaadeldakse mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja sobilikud filtrid tööks FITCga, ning kasutatakse õli- või vesiimmersiooni suurendusel 500–1 000 korda. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

Esialgu kontrollitakse positiivse tulemusega kontroll-objektiklaasi. Rakud peavad säravalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud kindlaksmääratud antikehade tiitris või töölahjenduses. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb IF-analüüsi (VI jao punkt A.5) korrata.

5.4.2. Vaadeldakse bakteri R. solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga säravalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peaks olema ekvivalentne positiivse kontrolltüve omaga sama antikeha lahjenduse juures. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

5.4.3. Immunofluorestsentsanalüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varre sademetes ilmuvad tõenäoliselt ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseerivate rakkude taustpopulatsioonid ning bakteriga R. solanacearum sarnase suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivad saprofüütbakterid.

5.4.4. Arvesse võetakse ainult tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke punktis 5.3 esitatud antikehade tiitris või töölahjenduses.

5.4.5. IF-tulemuste tõlgendamine

i) Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv milliliitris uuesti suspendeeritud bakterisademes (5. liide). Proovi IF-tulemus on positiivne, kui seal on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris. Proovi loetakse saastumiskahtlusega prooviks ning tuleb teha lisaanalüüse.

ii) Proovi IF-tulemus on negatiivne, kui seal on alla 5 × 103 rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris, ning proov loetakse negatiivseks. Lisaanalüüse ei ole vaja teha.

6. PCR-analüüs

Põhimõtted

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse PCR-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha isolatsiooni- või IF-analüüs. Kui PCR-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Selle meetodi kasutamist peamise sõelkatsena soovitatakse ainult siis, kui on olemas eriteadmised.

Märkus: eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama taasavastada 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum rakku milliliitris lisatuna varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele. Maksimaalse tundlikkuse ja spetsiifilisuse saavutamiseks kõigis laborites võib olla vajalik teha optimeerimisanalüüse.

Kasutatakse nõuetekohaselt valideeritud PCR-reaktiive ja protokolle (vt 6. liide). Eelistatavalt valitakse sisekontrolliga meetod.

Proovi sihtmärgi DNAga saastumise vältimiseks kasutatakse kohaseid ettevaatusabinõusid. PCR-analüüsi peaksid tegema kogenud tehnikud spetsiaalsetes molekulaarbioloogia laborites, et minimeerida sihtmärgi DNAga saastumise võimalust.

DNA ekstraheerimise ja PCR-menetluse negatiivseid kontrolle tuleks alati käsitleda menetluses viimaste proovidena, et näidata, kas on toimunud DNA ülekandmist.

PCR-analüüsi tuleks kaasata järgmised negatiivsed kontrollid:

— prooviekstrakt, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse,

— kontrollpuhvrid, mida kasutati bakterite ja DNA eraldamisel proovist,

— PCR-reaktsioonisegu.

Tuleks kaasata järgmised positiivsed kontrollid:

— resuspendeeritud bakterisegude alikvoodid, millele on lisatud bakterit R. solanacearum (valmistamist vt liites 3 B),

— bakteri R. solanacearum virulentse isolaadi (näiteks NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) vesisuspensioon (106 rakku milliliitris) (vt liide 3 B),

— võimaluse korral kasutatakse PCR-analüüsis ka positiivsetest kontrollproovidest saadud DNAd.

Võimaliku saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollid analüüsitavatest proovidest eraldi keskkonnas.

Prooviekstraktid peaksid olema võimalikult mullavabad. Seepärast on teatavatel juhtudel soovitav valmistada ekstraktid pestud kartulitest, kui soovitakse kasutada PCR-protokolle.

Positiivsed ja negatiivsed standardiseeritud kontrollained, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liites.

6.1. DNA puhastamise meetodid

Kasutatakse eespool kirjeldatud positiivseid ja negatiivseid kontrollproove (vt 3. liide).

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

Sihtmärgi DNA eraldamiseks komplekssetest prooviainetest on võimalik kasutada erinevaid meetodeid, mille käigus eemaldatakse PCRi inhibiitorid ja muud ensümaatilised reaktsioonid ning kontsentreeritakse prooviekstraktis sihtmärgi DNA. Järgmiseid meetodeid on optimeeritud 6. liites esitatud valideeritud PCR-meetoditega kasutamiseks.

a) Pastriki (2000) meetod

1) Pipetitakse 220 µl lüüsipuhvrit (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml Eppendorfi topsi.

2) Lisatakse 100 µl prooviekstrakti ja pannakse 10 minutiks kuumutusplokile või vesivanni 95 °C juures.

3) Tops pannakse 5 minutiks jääle.

4) Lisatakse 80 µl lüsosüümi põhilahust (50 mg lüsosüümi ml kohta 10 mM Tris HCl, pH 8,0) ja inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.

5) Lisatakse 220 µl Easy DNA® lahust A (Invitrogen), segatakse hästi segistil ja inkubeeritakse 30 minutit 65 °C juures.

6) Lisatakse 100 µl Easy DNA® lahust B (Invitrogen), segatakse tugevalt, kuni sade valgub topsis vabalt ja proov on ühtlaselt viskoosne.

7) Lisatakse 500 µl kloroformi ja segatakse segistil viskoossuse kadumiseni ja homogeense segu saamiseni.

8) Faaside eraldamiseks ja interfaasi moodustamiseks tsentrifuugitakse 15 000 g juures 20 minutit temperatuuril 4 °C.

9) Ülemine faas kantakse üle puhtasse Eppendorfi topsi.

10) Lisatakse 1 ml 100 % etanooli (–20 °C), segatakse lühidalt ja inkubeeritakse jääl 10 minutit.

11) Tsentrifuugitakse 20 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C ja eemaldatakse etanool bakterisademest.

12) Lisatakse 500 µl 80 % etanooli (–20 °C) ja segatakse, pöörates topsi põhjaga ülespoole.

13) Tsentrifuugitakse 10 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C, bakterisade hoitakse alles ja eemaldatakse etanool.

14) Bakterisademel lastakse kuivada õhu käes või seadmes DNA Speed Vac.

15) Bakterisade resuspendeeritakse 100 µl steriilses ultrapuhtas vees ja jäetakse toatemperatuuril seisma vähemalt 20 minutiks.

16) Säilitatakse –20 °C juures kuni PCR-analüüsi tegemiseni.

17) Igasugune valge sade tsentrifuugitakse alla ja kasutatakse 5 µl supernatanti, mis sisaldab DNAd PCR-analüüsi tarvis.

b) Muud meetodid

Võib kasutada muid DNA eraldamise meetodeid (näiteks Qiagen DNeasy Plant Kit), eeldusel et need sama tõhusalt puhastuvad välja DNA kontrollproovidest, mis sisaldavad 103 kuni 104 patogeeni rakku milliliitris.

6.2. PCR-analüüs

6.2.1. Valmistatakse ette PCR-analüüsi analüüsi- ja kontrollmatriitsid vastavalt valideeritud protokollile (VI jao punkt A.6). Valmistatakse proovi DNA ekstrakti üks kümnendlahjendus (1:10 ultrapuhtas vees).

6.2.2. Saastevabas keskkonnas valmistatakse kohane PCR-reaktsioonisegu vastavalt avaldatud protokollile (6. liide). Võimaluse korral soovitatakse kasutada mitmekordseid PCR-protokolle sisemise PCR-kontrolliga.

6.2.3. Lisatakse 2–5 µl DNA ekstrakti 25 µl PCR-reaktsioonisegu kohta steriilsetes PCR-katseklaasides vastavalt PCR-protokollidele (vt 6. liide).

6.2.4. Võetakse ainult PCR-reaktsioonisegu sisaldav negatiivne kontrollproov ja proovi kohta lisatakse sama ultrapuhta vee allikat, mida kasutati PCR-segus.

6.2.5. Katseklaasid pannakse samasse termotsüklerisse, mida kasutati eelanalüüsi tegemisel, ning see pannakse tööle kohaselt optimeeritud PCR-programmis (6. liide).

6.3. PCR-produkti analüüs

6.3.1. PCR-amplikonid eraldatakse agaroosgeelelektroforeesi teel. Võetakse igast proovist vähemalt 12 µl paljundatud DNA reaktsioonisegu, mis on segatud 3 µl täitepuhvriga (6. liide) 2,0 %lises agaroosgeelis trisatsetaat-EDTA (TAE) puhvris (6. liide) 5-8 V/cm. Kasutatakse kohast DNA markerit, näiteks 100 aluspaari.

6.3.2. DNA ribad tuuakse esile, värvides neid eetiumbromiidiga (0,5 mg liitris) 30–60 minutit, võttes kohaseid ettevaatusabinõusid selle mutageeni käitlemisel.

6.3.3. Värvunud geeli vaadeldakse lühilaine ultraviolett valgustusallikaga (λ = 302 nm) oodatava suurusega amplifitseerunud PCR-produktide (6. liide) leidmiseks ja need dokumenteeritakse.

6.3.4. Kõigi uute leidude/juhtumite korral tõendatakse PCR-amplikoni usaldatavust ülejäänud amplifitseeritud DNA proovi restriktsiooniensüümi analüüsiga, inkubeerides optimaalsel temperatuuril ja optimaalse aja jooksul kohase ensüümi ja puhvriga (vt 6. liide). Lahustunud fragmendid eraldatakse elektroforeesil agaroosgeelis nagu varem ja vaadeldakse pärast värvimist eetiumbromiidiga ultraviolett valgustusallikaga iseloomulikku restriktsioonifragmendi pilti ning võrreldakse seda lahustamata ja lahustunud positiivse kontrolliga.

PCR-analüüsi tulemuse tõlgendamine

PCR-analüüs on negatiivne, kui kõnealuses proovis ei avastata bakterile R. solanacearum spetsiifilist PCR-amplikoni, kuid see avastatakse kõigis positiivse kontrolli proovides (mitmekordse PCR-produkti puhul, millel on taimele spetsiifilised sisekontrolli praimerid: oodatava suurusega teine PCR-produkt peab amplifeeruma kõnealuse prooviga).

PCR-analüüs on positiivne, kui avastatakse oodatava suuruse ja restriktsioonipildiga (kui see on nõutav) bakterile R. solanacearum spetsiifiline PCR-amplikon, eeldusel et see ei amplifitseerunud mõnest negatiivse kontrolli proovist. Positiivse tulemuse usaldusväärse kinnituse saab ka siis, kui analüüsi korratakse teiste PCR-praimeritega (6. liide).

Märkus: PCR inhibeerumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse positiivse kontrolli proovist, mis sisaldab bakterit R. solanacearum vees, kuid negatiivseid tulemusi saadakse positiivsetest kontrollidest, mis sisaldavad bakterit R. solanacearum kartuliekstraktis. Mitmekordsetes PCR-protokollides sisemiste PCR-konrollidega viitab reaktsiooni inhibeerumisele see, kui ei saada kumbagi amplikoni.

Saastumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse ühest või mitmest negatiivsest kontrollist.

7. FISH-analüüs

Põhimõte

Kui esimese sõelkatsena kasutatakse FISH-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha isolatsiooni- või IF-analüüs. Kui FISH-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus: kasutatakse valideeritud bakterile R. solanacearum spetsiifilisi oligosonde (vt 7. liide). Eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama taasavastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud vähemalt 103–104 bakteri R. solanacearum rakku milliliitris.

Järgmist meetodit tuleks eelistatavalt kasutada värskelt valmistatud prooviekstraktiga, kuid seda võib edukalt kasutada ka prooviekstraktiga, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –16 kuni –24 °C või –68 kuni –86 °C.

Negatiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem bakteri R. solanacearum negatiivse tulemuse.

Positiivseteks kontrollideks valmistatakse 3–5 päeva vanusest bakteri R. solanacearum biotüübi 2 kultuurist (näiteks tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857, vt 3. liide) suspensioonid, mis sisaldavad 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta 0,01 M fosfaatpuhvris. Valmistatakse vastavalt liitele 3 B kartuliekstraktis suspendeeritud bakteri R. solanacearum homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

FITC-värvainega konjugeeritud eubakteriaalsete oligoproovide kasutamine võimaldab kontrollida hübridisatsiooniprotsessi, sest see värvib kõik proovis olevad eubakterid.

Positiivne ja negatiivne standardiseeritud kontrollmaterjal, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liite punktis A.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

7.1. Kartuliekstrakti fikseerimine

Järgmine protokoll põhineb allikal Wullings et al. (1998).

7.1.1. Valmistatakse kinnitilahus (vt 7. liide).

7.1.2. Igast prooviekstraktist pipetitakse 100 µl Eppendorfi topsi ja tsentrifuugitakse 7 minutit 7 000 g juures.

7.1.3. Eemaldatakse supernatant ja bakterisade lahustatakse 200 µl kinnitis, mis valmistati kuni 24 tundi varem. Loksutatakse vorteksil ja inkubeeritakse 1 tund külmikus.

7.1.4. Tsentrifuugitakse 7 minutit 7 000 g juures, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 75 µl 0,01 M fosfaatpuhvris (vt 7. liide).

7.1.5. Fikseeritud suspensioonidest tilgutatakse 16 µl puhtale mitmeaknalisele objektiklaasile vastavalt joonisele 7.1. Igale objektiklaasile pannakse 2 erinevat lahjendamata proovi ning 10 µl kasutatakse 1:100 lahjenduse tegemiseks (0,01 M fosfaatpuhvris). Ülejäänud proovilahust (49 µl), millele on eelnevalt lisatud 1 maht 96 % etanooli, võib säilitada –20 °C juures. Juhul kui FISH-analüüsi tuleb uuesti teha, eemaldatakse etanool tsentrifugeerimise teel ja lisatakse sellega võrdne kogus 0,01 fosfaatpuhvrit (loksutakse vorteksil).

Joonis 7.1. FISH-objektiklaasi joonis

Proov 1 Tühi Tühi Tühi Proov 2 aknaväli 1 aknaväli 2 aknaväli 3 aknaväli 4 aknaväli 5 Proov 1 Tühi Tühi Tühi Proov 2 aknaväli 6 aknaväli 7 aknaväli 8 aknaväli 9 aknaväli 10 Katteklaas 1 Katteklaas 2

7.1.6. Objektiklaasid kuivatatakse õhu käes (või objektiklaaside kuivatis 37 °C juures) ja fikseeritakse, kuumutades klaase läbi leegi.

Selles etapis võib menetluse katkestada ja jätkata hübridiseerimist järgmisel päeval. Objektiklaase tuleb hoida tolmuvabas ja kuivas kohas toatemperatuuril.

7.2. Hübridiseerimine

7.2.1. Rakud veetustatakse 50 %, 80 % ja 96 % etanooli reas, igas etapis 1 minut. Objektiklaasid kuivatatakse objektiklaaside hoidikul õhu käes.

7.2.2. Valmistatakse ette niiske inkubatsioonikamber, kattes õhukindla kasti põhja kuivatus- või filterpaberiga, mis on kastetud 1x hybmix-lahusesse (7. liide). Kast eelinkubeeritakse hübridisatsiooniahjus 45 °C juures vähemalt 10 minutit.

7.2.3. Pannakse 10 μl hübridisatsioonilahust (7. liide) 8 aknavälja (aknaväljad 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10, vt joonis 7.1) igale objektiklaasile, jättes kaks keskmist aknavälja (3 ja 8) tühjaks.

7.2.4. Esimesele ja viimasele neljale aknale asetatakse katteklaas (24 × 24 mm) nii, et vahele ei jää õhku. Objektiklaasid pannakse eelsoojendatud niiskesse kambrisse ja hübridiseeritakse 5 tunni jooksul ahjus 45 °C juures pimedas.

7.2.5. Valmistatakse ette 3 keeduklaasi, mis sisaldavad 1 l Milli Q (molekulaarbioloogias kasutatava puhtusastmega) vett, 1 l 1x hybmix-lahust (334 ml 3x hybmix-lahust ja 666 ml Milli Q vett) ja 1 l 1/8x hybmix-lahust (42 ml 3x hybmix-lahust ja 958 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett). Iga keeduklaasi eelinkubeeritakse vesivannis 45 °C juures.

7.2.6. Objektiklaasidelt eemaldatakse katteklaasid ja objektiklaasid asetatakse objektiklaaside hoidikule.

7.2.7. Ülemäärane oligoproov pestakse ära, inkubeerides 15 minutit 45 °C juures keeduklaasis, milles on 1x hybmix-lahus.

7.2.8. Objektiklaaside hoidik pannakse 1/8 hybmix-pesulahusesse ja inkubeeritakse veel 15 minutit.

7.2.9. Objektiklaasid kastetakse lühidalt Milli Q vette ja pannakse filterpaberile. Liigne niiskus eemaldatakse, kattes pinna õrnalt filterpaberiga. Igale aknaväljale pipetitakse 5–10 μl pleekimisvastast kattevedelikku (näiteks Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA või samaväärset) ja üle terve objektiklaasi pannakse suur katteklaas (24 × 60 mm).

7.3. FISH-analüüsi tulemused

7.3.1. Objektiklaase vaadeldakse viivitamatult mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja kasutatakse õliimmersiooni suurendusel 630 või 1 000 korda. Fluorestseiinisotiotsüanaadile (FITC) sobiva filtriga värvuvad proovis olevad eubakterite rakud (sealhulgas enamik gramnegatiivseid rakke) fluorestseeruvroheliseks. Kasutades tetrametüülrodamiin-5-isotiotsüanaadile sobivat filtrit, paistavad bakteri R. solanacearum Cy3-ga värvunud rakud fluorestseeruvpunastena. Raku morfoloogiat võrreldakse positiivsete kontrollidega. Rakukestad peavad eredalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb FISH-analüüsi (VI jao punkt A.7) korrata. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

7.3.2. Vaadeldakse bakteri R. solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga eredalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peab olema positiivse kontrolli fluorestseerumise intensiivsusega võrdne või sellest parem. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

7.3.3. Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

7.3.4. FISH-analüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varreosa kontsentreeritud bakterisademetes võib esineda ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseeruvate rakkude taustpopulatsioone ning bakteriga R. solanacearum sarnase suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivaid saprofüütbaktereid, kuigi palju harvem kui IF-analüüsis.

7.3.5. Arvesse võetakse üksnes tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke.

7.3.6. FISH-analüüsi tulemuse tõlgendamine

i) FISH-analüüsi valiidsed tulemused saadakse siis, kui FITC-filtrit kasutades vaadeldakse bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga ererohelisi fluorestseeruvaid rakke ja rodamiinfiltrit kasutades erepunaseid fluorestseeruvaid rakke kõigis positiivsetes kontrollides ja mitte üheski negatiivses kontrollis. Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv resuspendeeritud bakterisademe milliliitris (4. liide). Saastumiskahtlusega proovideks loetakse proove, milles on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris. Tuleb teha täiendavaid analüüse. Proovid, milles on alla 5 × 103 tüüpilise raku uuesti suspendeeritud bakterisadema milliliitris, loetakse negatiivseteks.

ii) FISH-analüüs on negatiivne siis, kui rodamiinfiltrit kasutades ei vaadelda bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga erepunaseid fluorestseeruvaid rakke, tingimusel et rodamiinfiltrit kasutades vaadeldakse erepunaseid fluorestseeruvaid rakke positiivsete kontrollide preparaatides.

8. ELISA-analüüs

Põhimõte

Suhteliselt madala tundlikkuse tõttu võib ELISA-analüüsi kasutada vabatahliku lisana IF-, PCR- või FISH-analüüsile. DASI ELISA kasutamisel on rikastamine ja monokloonsete antikehade kasutamine kohustuslik (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Proovide rikastamine enne ELISA-analüüsi võib olla analüüsi tundlikkuse tõstmiseks kasulik, kuid see võib ebaõnnestuda teiste võistlevate organismide tõttu proovis.

Märkus: kasutatakse R. solanacearum'i antikehade valideeritud allikat (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri R. solanacearum homoloogse tüve rakku milliliitris, ja kasutatakse kohast sekundaarse antikeha konjugaati vastavalt tootja soovitustele. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade lahjendusi, mis on kaubandusliku valmistise tiitri lähedal või sellega võrdsed.

Määratakse antikehade tiiter, kasutades R. solanacearum’i homoloogse tüve suspensiooni sisaldusega 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta.

Negatiivsete kontrollidena kasutatakse prooviekstrakti, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse, ja ristuvalt mittereageeriva bakteri suspensiooni fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS).

Positiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem negatiivse tulemuse segatuna bakteri R. solanacearum biotüübi 2 tüvedega 103 kuni 104 rakku milliliitris (näiteks tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857, vt 2. liite punktid A ja B). Tulemuste võrdlemiseks kasutatakse kõigil söötmeplaatidel R. solanacearum’i standardlahust 105 kuni 106 rakku milliliitris fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Positiivsed kontrollid peavad olema mikrotiiterplaadil kindlalt eraldatud analüüsitavast proovist (analüüsitavatest proovidest).

Positiivne ja negatiivne standardiseeritud kontrollmaterjal, mida saab kasutada nende analüüside puhul on loetletud 3. liite punktis A.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

Valideeritud on kaks ELISA protokolli.

a) Kaudne ELISA (Robinson-Smith et al., 1995)

1) Võetakse 100–200 µl prooviekstrakti alikvooti. (Kuumutamine 4 minuti jooksul temperatuuril 100 °C vesivannis või kuumutusplokil võib mõnel juhul vähendada mittespetsiifilisi tulemusi.)

2) Lisatakse samaväärne kogus kahekordset kattepuhvrit (4. liide) ja loksutatakse vorteksil.

3) Igast proovist mõõdetakse vähemalt 100 µl kahte mikrotiiterplaadi auku (nt Nunc-Polysorp või samaväärne) ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures või öö jooksul 4 °C juures.

4) Järsu löögiga raputatakse ekstrakt plaadiaukudest välja. Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide), jättes viimase pesukorra lahuse vähemalt viieks minutiks plaadiaukudesse.

5) Valmistatakse R. solanacearum’i antikehade sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse (4. liide). Valideeritud, müügil olevate antikehade puhul kasutatakse soovitatud lahjendust (tavaliselt kaks korda kontsentreeritum kui tiiter).

6) Lisatakse 100 µl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

7) Järsu löögiga raputatakse antikehalahus plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4).

8) Valmistatakse sekundaarse antikeha leeliselise fosfataaskonjugaadi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse. Lisatakse 100 µl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

9) Järsu löögiga raputatakse konjugeeritud antikeha plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4).

10) Lisatakse 100 µl leeliselise fosfataassubstraadi lahust (4. liide) igasse auku. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 405 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul.

b) DASI ELISA

1) Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks polükloonsete antikehade sobiv lahjendus kattepuhvris pH 9,6 (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 µl. Inkubeeritakse 4–5 tundi 37 °C juures või 16 tundi 4 °C juures.

2) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide). Lisatakse 190 µl prooviekstrakti vähemalt kahte auku. Positiivseid ja negatiivseid kontrolle lisatakse kumbagi kahte auku igal plaadil. Inkubeeritakse 16 tundi 4 °C juures.

3) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

4) Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks spetsiifiliste monokloonsete antikehade sobiv lahjendus fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS) (4. liide), mis sisaldab ka 0,5 % veise albumiinseerumit (BSA), ja lisatakse 190 µl igasse auku. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures.

5) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

6) Valmistatakse hiirevastase immunoglobuliini sobiv lahus, mis on konjugeeritud leeliselise fosfataassubstraadiga fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Igasse auku lisatakse 190 µl. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures.

7) Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

8) Valmistatakse leeliseline fosfataassubstraadilahus, mis sisaldab 1 mg p-nitrofenüülfosfaati substraatpuhvri milliliitri kohta (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 µl. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 40 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul.

ELISA-analüüsi tulemuste tõlgendamine

ELISA-analüüs on negatiivne, kui kahe proovi augu arvutatud keskmine optiline tihedus on väiksem kui negatiivse kontrolli prooviekstrakti augu kahekordse optilise tiheduse väärtus, tingimusel et kõigi positiivsete kontrollide optiline tihedus on üle 1,0 (pärast 90minutilist inkubatsiooni substraadis) ning see on suurem kui negatiivsete prooviekstraktide kahekordne optiline tihedus.

ELISA-analüüs on positiivne, kui kahe proovi augu arvutatud keskmine optiline tihedus on suurem kui negatiivse kontrolli prooviekstrakti augu kahekordse optilise tiheduse väärtus, tingimusel et kõigi negatiivse kontolli aukude optiline tihedus on väiksem kui positiivse kontrolli aukude kahekordne optiline tihedus.

ELISA-analüüsi positiivse kontrolli aukude negatiivsed näidud osutavad, et analüüs ei ole korrektselt läbi viidud või seda on inhibeeritud. ELISA-analüüsi negatiivse kontrolli aukude positiivsed näidud osutavad, et on toimunud ristsaastumine või mittespetsiifiline antikehade sidumine.

9. Biotest

Märkus: eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum kolooniaid moodustavat üksust milliliitris (valmistamist vt 2. liites).

Suurimat avastustundlikkust võib loota siis, kui kasutatakse äsja valmistatud prooviekstrakti ja optimaalseid kasvutingimusi. Meetodit saab siiski kasutada edukalt nende ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –68 kuni –86 °C.

Järgneva protokolli aluseks on Janse (1988).

9.1. Iga proovi kohta võetakse kümme tundliku tomatisordi (nt “Moneymaker” või sort, mille tundlikkuse on testlabor määranud olevat samaväärse) testtaime, millel on välja kasvanud 3. pärisleht. Andmed kultuuris kasvatamise kohta on 8. liites. Teise võimalusena võib kasutada baklažaani (nt sort “Black Beauty” või samasuguse tundlikkusega sort), kasutatakse ainult neid taimi, mis on 2–3 lehe faasis kuni kolmanda pärislehe täieliku väljakasvamiseni. On ilmnenud, et baklažaanil on sümptomid vähem tõsised ja arenevad aeglasemalt. Seetõttu soovitatakse võimaluse korral kasutada tomatiseemikuid.

100 µl prooviekstrakti jagatakse testtaimede vahel.

9.2.1. Inokulatsioon süstla abil

Taimede varsi inokuleeritakse idulehtede kohal hüpodermilise nõelaga süstlaga (vähemalt 23G). Proov jaotatakse testtaimede vahel.

9.2.2. Inokulatsioon sisselõike kaudu

Taime kahe sõrme vahel hoides pipetitakse suspendeeritud bakterisademe tilk (ligikaudu 5–10 µl) varrele idulehtede ja esimese lehe vahele.

Steriilse skalpelliga tehakse 1 cm pikkune diagonaalne sisselõige, mille sügavus on ligikaudu 2/3 varre paksusest, alustades sisselõiget bakterisademe tilga kohast.

Sisselõige kaetakse süstla abil steriilse vaseliiniga.

9.3. Samal viisil nakatatakse viis taime 48tunnise virulentse R. solanacearum biotüübi 2 vesisuspensiooniga 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta, mis on positiivseks kontrolliks, ning negatiivseks kontrolliks nakatatakse taimi bakterisademe puhvriga (4. liide). Positiivsed ja negatiivsed kontrolltaimed tuleb teistest taimedest isoleerida, et vältida ristnakatumist.

9.4. Testtaimi kasvatatakse karantiiniruumides kuni neli nädalat 25–30 °C ja kõrge suhtelise niiskuse juures ja neid kastetakse nii, et ei tekiks ülekastmist või taimede närbumist veepuuduse tõttu. Saastumise vältimiseks inkubeeritakse positiivseid ja negatiivseid kontrolltaimi selgelt eraldatud lavadel kasvuhoones või kasvukambris või, kui ruumi on vähe, tagatakse rangelt eristatus töötlemiste vahel. Kui erinevate proovide taimi tuleb inkubeerida lähestikku, eraldatakse need kohaste varjetega. Väetamisel, kastmisel, kontrollimisel ja mis tahes muude tegevuste juures pööratakse suurt tähelepanu ristsaastumise vältimisele. Oluline on puhastada kasvuhooned ja kasvukambrid kõigist putukkahjureist, sest need võivad kanda bakteri ühelt taimelt teisele.

Jälgitakse närbumise, lehtede keerdumise, kloroosi ja/või kängumise tundemärke.

9.5. Isoleeritakse haigestunud taimedest (II jao punkt 3) ja identifitseeritakse eeldatavad R. solanacearum’i puhastatud kultuurid (VI jao punkt B).

9.6. Kui kolme nädala möödumisel sümptomeid ei ilmne, tehakse IF/PCR/isolatsioonianalüüsid liitproovist, mis koosneb igalt katsetaimelt ülalpool inokulatsioonikohta võetud 1 cm varreosadest. Kui analüüsid on positiivsed, valmistatakse lahjendused ja tehakse väljakülvid söötmeplaatidele (punkt 4.1).

9.7. Määratakse kindlaks bakteri R. solanacearum eeldatavad puhastatud kultuurid.

Biotesti tulemuste tõlgendamine

Valiidsed biotesti tulemused saadakse siis, kui positiivsetel kontrolltaimedel on tüüpilised sümptomid, nendest taimedest saab uuesti isoleerida bakterid ja negatiivsetel kontrollidel ei leita sümptomeid.

Biotesti tulemus on negatiivne, kui testtaimed ei ole saastunud R. solanacearum’i kultuuriga, tingimusel et R. solanacearum on avastatud positiivsetes kontrolltaimedes. Biotest on positiivne, kui testtaimed on R. solanacearum’i kultuuriga saastunud.

B. IDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID

Bakteri R. solanacearum eeldatavad puhaskultuurid määratakse kindlaks, kasutades vähemalt kaht järgmistest analüüsidest, mis põhinevad erinevatel bioloogilistel põhimõtetel.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane (vt 3. liide).

1. Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid

Määratakse järgmised fenotüübilised omadused, mis esinevad või puuduvad bakteril R. solanacearum, kasutades järgmistes allikates kirjeldatud meetodeid: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Analüüs Oodatav tulemus Fluorestseeruv pigment – Polü-β-hüdroksübutüraadi esinemine + Oksüdatsiooni/fermentatsioonianalüüs (O/F-analüüs) O+/F– Katalaasi aktiivsus + Kovaci oksüdaasianalüüs + Nitraatide redutseerimine + Tsitraadi kasutamine + Kasv 40 °C juures – Kasv 1 % NaCl-s + Kasv 2 % NaCl-s – Arginiini dihüdrolaas – Želatiini veeldamine – Tärklise hüdrolüüs – Aesuliini hüdrolüüs – Levani tootmine –

2. IF-analüüs

2.1. Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris IF-puhvris (4. liide).

2.2. Valmistatakse kohase antiseerumi kahekordsete lahjenduste rida (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Tehakse IF-analüüs (VI jao punkt A.5).

2.4. IF-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuuri IF-tiiter võrdub positiivse kontrolli tiitriga.

3. ELISA-analüüs

Märkus: kui kasutatakse vaid kaht määramisanalüüsi, ei tohi lisaks sellele meetodile kasutada teist seroloogilist analüüsi.

3.1. Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 108 rakku milliliitris 1X PBS-puhvris (4. liide).

3.2. Tehakse sobiv ELISA-analüüs R. solanacearum’i spetsiifilise monoklonaalse antikehaga.

3.3. ELISA-analüüs on positiivne, kui kultuuri ELISA-analüüsi tulemus on vähemalt pool positiivse kontrolli tulemusest.

4. PCR-analüüs

4.1. Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris molekulaarbioloogias kasutatava puhtusastmega steriilses vees.

4.2. 100 µl suletud katseklaasides olevat rakususpensiooni kuumutatakse kuumutusplokil või keevas veevannis 100 °C juures 4 minutit. Seejärel võib proove säilitada –16 kuni –24 °C juures, kuni neid on tarvis.

4.3. Bakteri R. solanacearum spetsiifiliste amplikonide amplifitseerimiseks tehakse kohane PCR-analüüs (nt Seal et al. (1993), Pastrik ja Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4. Bakterit R. solanacearum saab positiivselt kindlaks määrata siis, kui PCR-amplikonidel on positiivse kontrolli tüvega sama suurus ja neil esineb sama pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfism.

5. FISH-analüüs

5.1. Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris ultrapuhtas vees.

5.2. Tehakse FISH-analüüs (VI jao punkt A.7) vähemalt kahe R. solanacearum-spetsiifilise oligoprooviga (7. liide).

5.3. FISH-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuur ja positiivne kontroll annavad samad reaktsioonid.

6. Rasvhapete profileerimine (FAP)

6.1. Kultuuri kasvatatakse trüptikaas-sojaagaril (Oxoid) 48 tundi temperatuuril 28 °C.

6.2. Tehakse kohane FAP-analüüs (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. FAP-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui eeldatava kultuuri profiil on identne positiivse kontrolli profiiliga. Tüüpiline rasvhapete esinemine on järgmine: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH ning tüüpiline on 16:0 3OH puudumine. Selline profiil osutab suure tõenäosusega bakterile Ralstonia sp.

7. Tüve iseloomustamise meetodid

R. solanacearum’i iga uue isoleerimisjuhtumi puhul on soovitav kasutada üht järgmistest tüve iseloomustamise meetoditest.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane (vt 3. liide).

7.1. Biotüübi määramine

R. solanacearum jagatakse biotüüpidesse selle põhjal, kuidas see suudab kasutada ja/või oksüdeerida kolme disahhariidi ja kolme heksoosalkoholi (Hayward, 1964 ja Hayward et al., 1990). Biotüübi kasvusöödet kirjeldatakse 2. liites. Analüüsi saab edukalt teha, inokuleerides söödet R. solanacearum’i puhaskultuuridega ja inkubeerides 28 °C juures. Kui steriilsele 96 auguga rakukultuuri söötmeplaadile (200 µl augu kohta) jaotatud sööde muutub 72 tunni jooksul oliivrohelisest kollaseks, on analüüsi tulemus positiivne.

Biotüüp 1 2 3 4 5 Järgmiste ainete kasutamine: maltoos – + + – + laktoos – + + – + D (+) tsellobioos – + + – + mannitool – – + + + sorbitool – – + + – dultsitool – – + + –

Lisaanalüüsidega eristatakse biotüübi 2 alamfenotüüpe

Biotüüp 2A (Levinud üle maailma) Biotüüp 2A (Leitud Tšiilis ja Kolumbias) Biotüüp 2T (Leitud troopilistel aladel) Trehhaloosi kasutamine – + + Meso-inositooli kasutamine + – + D-riboosi kasutamine – – + Pektolüütiline aktiivsus (1) madal madal kõrge

7.2. Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine

Haigusetekitaja R. solanacearum liittüvede molekulaarseks eristamiseks võib kasutada erinevaid meetodeid, sealhulgas järgmised.

7.2.1. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi (RFLP) analüüs (Cook et al., 1989).

7.2.2. Korduvjärjestusega PCR, kasutades REP, BOX ja ERIC praimereid (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. Amplifitseeritud fragmentide pikkuse polümorfismi (AFLP) analüüs (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. PCR-meetodid

Eristamaks tüvesid, mis kuuluvad RFLP analüüsi (Cook et al., 1989) ja 16S rDNA järjestuse määramise (Taghavi et al., 1996) kohaselt R. solanacearum’i 1. (biotüübid 3, 4 ja 5) ja 2. rühma (biotüübid 1, 2A ja 2T), võib kasutada spetsiifilisi PCR-praimerid (Pastrik et al, 2002; vt 6. liide).

C. KINNITUSANALÜÜS

R. solanacearum’i diagnoosi lõplikuks kinnitamiseks ning R. solanacearum’ina identifitseeritud bakterkultuuri virulentsuse hindamiseks tuleb teha patogeensusanalüüs.

1) Analüüsitava isolaadi 24–28 tunni vanusest isolaadist ja bakteri R. solanacearum kohasest positiivse kontrolli tüvest (nt NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857; vt 3. liide) tehakse inokulaat, milles on umbes 106 rakku milliliitris.

2) Inokuleeritakse 5–10 tundlikku tomati- või baklažaaniseemikut, millel on välja kasvanud kolmas pärisleht (vt VI jao punkt A.9).

3) Inkubeeritakse kuni kaks nädalat temperatuuril 25–28 °C ning kõrge suhtelise niiskuse juures ja kastetakse parajal määral, et oleks välditud ülekastmine ja kuivamine. Puhaskultuuriga taimedel peaksid tekkima tüüpilised närbumissümptomid 15 päeva jooksul. Kui selle aja jooksul ei ole sümptomeid, ei saa kultuuri pidada R. solanacearum’i patogeenseks vormiks.

4) Jälgitakse närbumise ja/või lehtede keerdumise, kloroosi ja kängumise tundemärke.