Official Journal L 248 , 05/09/1991 P. 0001 - 0083

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 38 P. 0174

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 38 P. 0174



KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 2568/91,11. juuli 1991, oliiviõlide ja pressimisjääkide omaduste ja asjakohaste analüüsimeetodite kohta EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 22. septembri 1966. aasta määrust nr 136/66/EMÜ õli- ja rasvaturu ühise korralduse kehtestamise kohta,1 viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 3577/90,2 eriti selle artiklit 35a, ning arvestades, et: määruse nr 136/66/EMÜ lisas on kirjeldatud kõigis liikmesriikides turustatud ning liikmesriikide vahel, ühendusesiseses ja kolmandate riikidega peetava kaubavahetuse objektiks olevate oliiviõlide ja pressjääkoliiviõlide kirjeldused ja määratlused; ilma, et see piiraks olemasolevate sätete kohaldamist tuleks erinevat liiki õlide eristamiseks iga õli füüsikalised ja keemilised omadused ning neitsioliiviõli organoleptilised omadused määratleda asjaomaste toodete puhtuse ja kvaliteedi tagamiseks; erinevat liiki õlide omadused tuleks kogu ühenduses kindlaks määrata ühtsetel alustel; selleks tuleks kehtestada ühenduse keemilise analüüsi ja organoleptilise hindamise meetodid; üleminekuajal tuleks lubada kasutada ka teisi liikmesriikides kohaldatavaid analüüsimeetodeid tingimusel, et erinevate tulemuste korral on otsustavaks ühenduse meetodil saadud tulemused; seoses oliiviõli füüsikaliste ja keemiliste omaduste määratluse ja analüüsimeetoditega tuleb kaupade koondnomenklatuuri grupi 15 lisamärkusi muuta; neitsioliiviõli organoleptiliste omaduste hindamismeetod näeb ette valitud ja koolitatud degustaatorite hindamiskomisjonide loomise; seetõttu tuleks kindlaks määrata sellise struktuuri loomiseks vajalik ajavahemik; võttes arvesse raskusi, millega mõned liikmesriigid degustaatorite hindamiskomisjonide koostamisel kokku puutuvad, tuleks lubada ka teiste liikmesriikide hindamiskomisjonide kasutamist; oliiviõli pressimisjääkide impordi suhtes kohaldatava impordimaksusüsteemi nõuetekohase toimimise tagamiseks tuleks sätestada nende toodete õlisisalduse kindlaksmääramise ühtne meetod; selleks, et vältida kaubandushäireid, tuleks sätestada enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud õli müümine teatud aja jooksul; komisjoni määrust (EMÜ) nr 1058/77,3 viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 1858/884 on asjakohane muuta; õli- ja rasvaturu korralduskomitee ei ole oma eesistuja määratud tähtaja jooksul arvamust esitanud, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE: Artikkel 1 1. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktides 1, 2 ja 3 sätestatutele, käsitatakse neitsioliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunktide a, b ja c tähenduses. 2. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 4 sätestatutele, käsitatakse lambiõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunkti d tähenduses. 3. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 5 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 2 tähenduses. 4. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 6 sätestatutele, käsitatakse puhta oliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 3 tähenduses. 5. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 7 sätestatutele, käsitatakse oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 4 tähenduses. 6. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 8 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 5 tähenduses. 7. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 9 sätestatutele, käsitatakse oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 6 tähenduses. Artikkel 2 1. I lisas sätestatud õlide omadused määratakse kindlaks järgmiste analüüsimeetoditega: - oleiinhappe protsendina väljendatud vabad rasvhapped määratakse kindlaks II lisas sätestatud meetodil, - peroksiidarv määratakse kindlaks III lisas sätestatud meetodil, - alifaatsed alkoholid määratakse kindlaks IV lisas sätestatud meetodil, - steroolisisaldus määratakse kindlaks V lisas sätestatud meetodil, - erütrodiool ja uvalool määratakse kindlaks VI lisas sätestatud meetodil, - triglütseriidi 2. positsioonis olevad küllastunud rasvhapped määratakse kindlaks VII lisas sätestatud meetodil, - trilinoleiini sisaldus määratakse kindlaks VIII lisas sätestatud meetodil, - spektrofotomeetriline analüüs tehakse IX lisas sätestatud meetodil, - rasvhapete koostis määratakse kindlaks X A ja X B lisas sätestatud meetodil, - halogeenitud lenduvad lahustid määratakse kindlaks XI lisas sätestatud meetodil, - neitsioliiviõli organoleptilisi omadusi hinnatakse XII lisas sätestatud meetodil, - tõendid rafineerimise kohta saadakse XIII lisas sätestatud meetodil. 2. Organoleptiliste omaduste hindamine tehakse XII lisas nimetatud degusteerimisjuhendis kirjeldatud korras analüüsija ja vajaduse korral spetsialisti abil. Kui analüüsi käigus ilmnevad toote kirjeldusest erinevad omadused, peab proovi hindama degustaatorite hindamiskomisjon XII lisa sätetele vastavalt. Hindamiskomisjon teeb nimetatud sätetele vastavalt teise analüüsi. Kui organoleptiliste omaduste analüüs tehakse seoses sekkumissüsteemiga seotud toimingutega, teeb degustaatorite komisjon selle hindamise XII lisa sätetele vastavalt. Artikkel 3 Kuni 31. oktoobrini 1992 ei takista artiklis 2 sätestatud analüüsimeetodite kasutuselevõtmine liikmesriikidel kasutada teisi kontrollitud ja teaduslikult usaldusväärseid meetodeid tingimusel, et ühenduse meetoditega kehtivatele eeskirjadele vastavaks tunnistatavad tooted võivad vabalt liikuda. Enne teiste meetodite kasutamist teatavad asjaomased liikmesriigid sellest komisjonile. Kui mõne teise meetodiga saadakse ühenduse meetodiga saadud tulemustest erinev tulemus, on otsustav ühenduse meetodiga saadud tulemus. Artikkel 4 1. Liikmesriigid loovad XII lisas sätestatud meetodiga ettenähtud eeskirjade alusel organoleptiliste omaduste hindamiseks koolitatud ja valitud degustaatorite hindamiskomisjonid. 2. Kui liikmesriigil on oma riigis hindamiskomisjoni moodustamisel raskusi, võib see liikmesriik kasutada teises liikmesriigis töötavat hindamiskomisjoni. Artikkel 5 Kaupade koondnomenklatuuri grupi 15 lisamärkused 2, 3 ja 4 asendatakse XIV lisa märkustega. Artikkel 6 1. Oliiviõli ekstraheerimisest tulenev õlikoogi ja muude jääkide õlisisaldus (CN-koodid 2306 90 11 ja 2306 90 19) määratakse kindlaks XV lisas sätestatud meetodil. 2. Lõikes 1 osutatud õlisisaldus väljendatakse õli massiprotsendina kuivaine massist. Artikkel 7 Kohaldatakse ühenduse sätteid, mis käsitlevad muude ebasoovitavate ainete esinemist, kui XI lisas osutatud. Artikkel 8 1. Liikmesriigid teatavad komisjonile käesoleva määruse rakendamiseks võetud meetmetest. 2. Liikmesriigid saadavad komisjonile iga poolaasta alguses aruande eelmise poolaasta jooksul tehtud katsete analüütiliste andmete kohta. Õli- ja rasvaturu korralduskomitee võtab tulemusi arvesse määruse nr 136/66/EMÜ artiklis 39 sätestatud korras. Artikkel 9 Määrus (EMÜ) nr 1058/77 tunnistatakse kehtetuks. Artikkel 10 1. Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas. XII lisas sätestatud meetodit kohaldatakse siiski 1. jaanuarist 1992, välja arvatud sekkumissüsteemiga seotud toimingute puhul. 2. Käesolevat määrust ei kohaldata enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud ja kuni 31. oktoobrini 1992 turustatava oliiviõli ja oliivijääkõli suhtes. Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides. Brüssel, 11. juuli 1991 Komisjoni nimel komisjoni liige RAY MAC SHARRY 1 EÜT 172, 30.9.1966, lk 3025/66. 2 EÜT L 353, 17.12.1990, lk 23. 3 EÜT L 128, 24.5.1977, lk 6. 4 EÜT L 166, 1.7.1988, lk 10. LISAD Kokkuvõte Lehekülg I lisa: Oliiviõli omadused II lisa: Vabade rasvhapete määramine III lisa: Peroksiidarvu määramine IV lisa: Alifaatsete alkoholide sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga V lisa: Steroolide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga VI lisa: Erütrodiooli ja uvalooli määramine VII lisa: Triglütseriidi 2. positsioonis olevate küllastunud rasvhapete määramine VIII lisa: Trilinoleiinkoostise määramine IX lisa: Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas X A lisa: Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs X B lisa: Rasvhapete metüülestrite ettevalmistamine XI lisa: Oliiviõli halogeenitud lenduvate lahustite määramine XII lisa: Neitsioliiviõli organoleptiline hindamine XIII lisa: Õli rafineerimise tõendamine XIV lisa: Kaupade koondnomenklatuuri grupi 15 lisamärkused 2, 3 ja 4 XV lisa: Oliiviõli pressimisjääkide õlisisaldus XVI lisa: Joodiarvu määramine I LISA OLIIVIÕLI OMADUSED Liik Happesus % Peroksiidarv meq/O2/kg Halogeenitud lahustid mg/kg1 Alifaatsed alkoholid mg/kg Küllastunud rasvhapped 2. positsioonis triglütseriidide % arvestuses Erütrodiool + uvalool % Trilinoleiin % Kolesterool % Brassikasterool % Kampesterool % Stigmasterool % -sitosterool %2 Delta-7-stigmasterool % Steroolid kokku mg/kg 1. Ekstra neitsioliiviõli M l,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000 2. Neitsioliiviõli M 2,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m l 000 3. Tavaline neitsioliiviõli M 3,3 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m l 000 4. Lambiõli > 3,3 > 20 > 0,20 M 400 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 m 93,0 M 0,5 m l 000 5. Rafineeritud oliiviõli M 0,5 M 10 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m l 000 6. Oliiviõli M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000 7. Töötlemata oliivijääkõli M 2,0 M 1,8 M 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 m 93,0 M 0,5 m 2 500 8. Rafineeritud oliivijääkõli: M 0,5 M 10 M 0,20 M 2,0 M 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4.0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800 9. Oliivijääkõli: M 1,5 M 15 M 0,20 M 2,0 > 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800 M = maksimaalne, m = minimaalne. 1 Elektronihaarde detektoriga kindlakstehtud ühendite ülempiir kokku. Üksikult kindlakstehtud komponentide ülempiir on 0,10 mg/kg. 2 Delta-5-23-stigmastadiernool + klerosterool + sitosterool + sitostanool + delta-5-avenosterool + delta-5-24 stigmastadienool. Märkus: Kui mõni õli omadustest ei ole sätestatud piirides, ei võeta õli vastu. Liik Happesisaldus K232 K270 K270 koos alumiiniumoksiidiga1 Delta K Eksperthinnang Müristhape % Linoleenhape % Arahiinhape % Eikoseenhape % Beheenhape % Lignotseriinhape % 1. Ekstra neitsioliiviõli M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 2,40 M 0,20 M 0,10 M 0,01 6,5 2. Neitsioliiviõli M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 5,5 3. Tavaline neitsioliiviõli M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 3,5 4. Lambiõli M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 3,70 > 0,25 M 0,11 < 3,5 5. Rafineeritud oliiviõli M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 3,40 M 1,20 M 0,16 6. Oliiviõli M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 3,30 M 1,00 M 0,13 7. Töötlemata oliivijääkõli M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 8. Rafineeritud oliivijääkõli: M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 5,50 M 2,50 M 0,25 __ 9. Oliivijääkõli: M 0,l M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 M 5,30 M 2,00 M 0,20 Märkus: 1 Õlide puhul, mille happesus on suurem kui 3,3 %, on juhul, kui K270 on pärast alumiiniumoksiidiga töötlemist üle 0,11, on vaja teha XIII lisas osutatud rafineerimiskatse. Puhtuse kindlaksmääramisel määratakse juhul, kui K270 ületab asjaomase kategooria piiri, puhtus kindlaks pärast alumiiniumoksiidiga töötlemist. II LISA VABADE RASVHAPETE MÄÄRAMINE 1.HAPPESUSE MÄÄRAMINE Vabade rasvhapete määramine oliiviõlis. Vabade rasvhapete sisaldust väljendatakse tavapärasel viisil arvutatud happesusena. 1.1. Põhimõte Proov lahustatakse lahustite segus ja vabad rasvhapped tiitritakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuses. 1.2. Reaktiivid Kõik reaktiivid peaksid olema tunnustatud analüütilise kvaliteediga ja vesi peaks olema kas destilleeritud või samaväärse puhtusega. 1.2.1. Dietüüleetri ja 95 % etanooli (V/V) segu võrdsetes osades. Märkus: Dietüüleeter on väga kergesti süttiv ning võib moodustada plahvatusohtlikke peroksiide. Selle kasutamisel tuleks olla ettevaatlik. Segu neutraliseeritakse kasutamise hetkel kaaliumhüdroksiidi lahusega (1.2.2) lisades 100 ml segu kohta 0,3 ml fenoolftaleiini lahust (1.2.3). Märkus: Kui dietüüleetrit ei ole võimalik kasutada, võib kasutada etanooli ja tolueeni sisaldavate lahustite segu. Vajaduse korral võib etanooli asendada 2-propanool. 1.2.2. Kaaliumhüdroksiid, tiitritud etanoolilahusena, c(KOH) 0,1 mol/l või vajaduse korral c(KOH) 0,5 mol/l. Kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuse täpne kontsentratsioon peab olema teada ning seda tuleb enne kasutamist vahetult kontrollida. Kasutatakse lahust, mis on valmistatud vähemalt viis päeva enne kasutamist, ning see dekanteeritakse kummist punniga tumedasse klaaspudelisse. Lahus peaks olema värvitu või helekollast värvi. Märkus: Kaaliumhüdroksiidi stabiilset värvusetut lahust saab valmistada järgmiselt: 1 000 ml etanooli lastakse koos 8 g kaaliumhüdroksiidi ja 0,5 g alumiiniumilaastudega keema ning keedetakse püstjahutiga kolvis tund aega. Destilleeritakse kohe. Destillaadis lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus jäetakse mitmeks päevaks seisma ja kaaliumkarbonaadi sademest dekanteeritakse selge supernatant. Lahuse võib valmistada ilma destilleerimiseta järgmiselt: 1 000 ml etanoolile lisatakse 4 ml alumiiniumbutülaati ja segu jäetakse mitmeks päevaks seisma. Supernatant dekanteeritakse ja selles lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus on kasutamisvalmis. 1.2.3. Fenoolftaleiin, 10 g/l lahus 95-96 % etanoolis (V/V) või alkalisinises, (väga tugeva värviga rasvade puhul) 20 g/l lahus 95-96 % etanoolis (V/V). 1.3. Seadmed Tavalised laboriseadmed, sealhulgas: 1.3.1. analüütilised kaalud; 1.3.2. 250 ml Erlenmeyeri kolb; 1.3.3. 10 ml bürett, mõõtskaala ühikutega 0,05 ml. 1.4. Menetlus 1.4.1. Proovi ettevalmistamine analüüsiks (Katse tehakse filtreeritud prooviga. Kui niiskus ja lisandid on kokku alla 1 %, kasutatakse proovi ilma täiendava töötlemiseta; kui need on üle 1 %, tuleks proov filtreerida.) 1.4.2. Proovi võtmine Proov võetakse sõltuvalt eeldatavast happearvust järgmise tabeli alusel: Hinnanguline happearv Proovi mass (g) Kaalumistäpsus (g) < 1 20 0,05 1-4 10 0,02 4-15 2,5 0,01 15-75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Proov kaalutakse Erlenmeyeri kolvis (1.3.2). 1.4.3. Määramine Proov (1.4.2) lahustatakse 50-150 ml dietüüleetri ja etanooli (1.2.1) varem neutraliseeritud segus. Lahus tiitritakse, segades sellesse kaaliumhüdroksiidi 0,1 mol/l lahusega (1.2.2) (vt märkus 2), kuni indikaator muutub (fenoolftaleiini roosa värvus püsib vähemalt 10 sekundit). Märkus 1. Kaaliumhüdroksiidi tiitritud etanoolilahuse (1.2.2) võib asendada kaalium- või naatriumhüdroksiidi vesilahusega tingimusel, et lisatud vee maht ei põhjusta faaside eraldumist. Märkus 2. Kui 0,1 mol/l kaaliumhüdroksiidilahust on vaja rohkem kui 10 ml, kasutatakse 0,5 mol/l lahust. Märkus 3. Kui lahus muutub tiitrimise ajal häguseks, tuleb lisada nii palju lahustit (1.2.1) kui on vaja selge lahuse saamiseks. 1.5. Happesus: väljendatud oleiinhappe protsendina Happesus massiprotsendina on võrdne: [INSERT FORMULA] kus: V on kasutatud tiitritud kaaliumhüdroksiidi maht milliliitrites; c on täpne kontsentratsioon moolides kasutatud kaaliumhüdroksiidi tiitritud lahuse liitri kohta; M on molaarmass grammides tulemuse väljendamiseks (= 282) kasutatud happe mooli kohta; m on proovi mass grammides. Tulemuseks loetakse kahe arvutuse aritmeetiline keskmine. III LISA PEROKSIIDARVU MÄÄRAMINE 1. KOHALDAMISALA Käesolevas standardis kirjeldatakse õlide ja rasvade peroksiidarvu määramise meetodit. 2. KASUTUSVALDKOND Standardit kohaldatakse loomsete ja taimsete õlide ja rasvade suhtes. 3. MÄÄRATLUS Peroksiidarv on nende proovis olevate ainete kogus aktiivse hapniku milliekvivalendina kilogrammi kohta, mis kirjeldatud töötamistingimustel kaaliumjodiidi oksüdeerivad. 4. PÕHIMÕTE Katsekogust töödeldakse äädikhappe ja kloroformi lahuses kaaliumjodiidi lahusega. Eraldunud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi standardlahusega. 5. SEADMED Seadmetel ei tohi olla redutseerivaid või oksüdeerivaid aineid. Märkus: Lihvitud pindu ei tohi määrdeainega määrida. 5.1. 3 ml klaasist kühvel. 5.2. Lihvitud kaela ja punniga 250 ml mahuga kolvid, enne kuivatatud ja täidetud puhta kuiva väärisgaasiga (lämmastik või soovitatavalt süsinikdioksiid). 5.3. 25 või 50 ml bürett, jaotatud 0,1 ml ühikuteks. 6. REAKTIIVID 6.1. Analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga kloroform, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi barboteerimisel. 6.2. Analüütiliselt puhta kvaliteediga jää-äädikas, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi voolu barboteerimisel. 6.3. Kaaliumjodiidi küllastunud vesilahus, vahetult ette valmistatud ning joodi ja jodaatideta. 6.4. Naatriumtiosulfaat, 0,01 või 0,002 Mol/L täpsusega vahetult enne kasutamist standarditud vesilahust. 6.5. Tärklise lahus, 10 g/l vesilahus, värskelt looduslikust lahustuvast tärklisest valmistatud. 7. PROOV Tagatakse proovi võtmine ja selle säilitamine varjus, jahedas ja täielikult täidetud klaasmahutites, mis on hermeetiliselt lihvkorgi või korgist punniga suletud. 8. TÖÖ KÄIK Katsed tehakse hämara päevavalguse või kunstliku valgustusega. Klaasist kühvlisse (5.1) või selle puudumise korral kolbi (5.2) kaalutakse 0,001 g täpsusega järgmisele tabelile vastava massiga proov, mille aluseks on eeldatav peroksiidarv: Hinnanguline peroksiidarv (meq) Katsekoguse mass (g) 0-2 5,0-2,0 12-20 2,0-1,2 20-30 1,2-0,8 30-50 0,8-0,5 50-90 0,5-0,3 Kolvilt (5.2) eemaldatakse punn ning sellesse pannakse klaasist kühvel, millel on katsekogus. Lisatakse 10 ml kloroformi (6.1). Katsekogus lahustatakse kiiresti segamise teel. Lisatakse 15 ml äädikhapet (6.2) ja seejärel 1 ml kaaliumjodiidi lahust (6.3). Kolvile pannakse kiiresti punn, loksutatakse üks minut ja jäetakse siis viieks minutiks temperatuurile 15-25 C varju seisma. Lisatakse umbes 75 ml destilleeritud vett. Vabastatud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (6.4) (0,002 Mol/L lahus eeldatava väärtuse < 12 puhul ja 0,01 Mol/L eeldatava väärtuse > 12 puhul), loksutatakse kõvasti, kasutades indikaatorina tärklise lahust (6.5). Ühe ja sama prooviga tehakse 2 määramist. Samal ajal tuleb teha ka pimekatse. Kui pimekatse tulemus on suurem kui 0,05 ml 0,01 Mol/L naatriumtiosulfaadi lahust (6.4), asendatakse puhastamata reaktiivid. 9. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE Peroksiidarv aktiivse hapniku milliekvivalentidena kilogrammi kohta saadakse valemiga: [INSERT FORMULA] kus V on katses kasutatud naatriumtiosulfaadi standardlahuse (6.4) milliliitrite arv, mida on pimekatse arvesse võtmiseks parandatud; T on kasutatud naatriumtiosulfaadi lahuse (6.4) täpne molaarsus; m on katsekoguse mass grammides. Tulemus on kahe määramise aritmeetiline keskmine. IV LISA ALIFAATSETE ALKOHOLIDE SISALDUSE MÄÄRAMINE KAPILAARGAASIKROMATOGRAAFIA TEEL 1. EESMÄRK Käesolev meetod kirjeldab alifaatsete alkoholide sisalduse määramist õlides ja rasvades. 2. PÕHIMÕTE Rasvaine, millele on sisestandardina lisatud 1-eikosanooli, seebistatakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ning seebistumatu aine ekstraheeritakse dietüüleetriga. Alkoholfraktsioon eraldatakse seebistumatust ainest kromatograafiaga kaaliumhüdroksiidi kihiga immutatud silikageeliga; silikageelist saadud alkohol muundatakse trimetüülsilüülestriteks ja analüüsitakse kapillaargaasikromatograafiaga. 3. SEADMED 3.1. 250 ml ümarapõhjaline püstjahutiga ja klaasist lihvkorgiga kolb. 3.2. 500 ml mahuga jaotuslehtrid. 3.3. Kolvid mahuga 250 ml. 3.4. Kromatograafiline ilmutusnõu planaarkromatograafililiseks (ÕKK) analüüsiks klaasplaatidega mõõtmetes 20 × 20. 3.5. UV-valgus lainepikkusega 366 või 254 nm, ÕKK-plaatide uurimiseks. 3.6. 100 l ja 500 l mikrosüstal doseerimiseks. 3.7. Klaasist filterlehter poorse filtriga G 3 (15-40 m), mille ligikaudne diameeter on 2 cm ja ligikaudne kõrgus 5 cm ning mis sobib filtreerimiseks vaakumis ja millel on 12/21 lihvkern. 3.8. 50 ml vaakumkolb, millel on 12/21 lihvmuhv kasutamiseks koos filterlehtriga (3.7). 3.9. 10 ml katseklaas koonusekujulise põhja ja tropiga. 3.10. Gaasikromatograaf, mida kasutatakse kapillaarkolonniga ja mis on varustatud järgmistest seadistest koostatud jaotussüsteemiga: 3.10.1. termostaatiline kolonnikamber (kolonnahi), mis hoiab nõutavat temperatuuri 1 C täpsusega; 3.10.2. reguleeritava temperatuuriga aurustamisseade silaniseeritud klaasist aurustajaga; 3.10.3. leekionisatsioonidetektor ja muundurvõimendi; 3.10.4. koos muundurvõimendiga kasutatav integraatormeerik (3.10.3), mille reageerimisaeg ei ületa 1 sekundit ja mille paberi kiirust saab muuta. 3.11. Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 20-30 cm, sisediameetriga 0,25-0,32 mm, millel on SE-52 või SE-54 vedelfaas või samaväärne ja mille statsionaarse faasi kile paksus on 0,10-0,30 m. 3.12. 10 l karastatud nõelaga gaasikromatograafias kasutatav mikrosüstal. 4. REAKTIIVID 4.1. Kaaliumhüdroksiid, umbes 2 mol/L etanoolilahus: 130 g kaaliumhüdroksiidi (miinimumkontsentratsiooniga 85 %) lahustatakse samal ajal 200 ml destilleeritud vees jahutades ja täiendatakse etanooliga kuni 1 l märgini. Lahust tuleks hoida õhukindlalt suletud tumedat värvi klaaspudelis. 4.2. Dietüüleeter, analüüsipuhas. 4.3. Veevaba naatriumsulfaat, analüüsipuhas. 4.4. Silikageeliga kaetud ÕKK-plaadid, ilma fluorestsentsindikaatorita, paksusega 0,25 mm (võib osta valmiskujul). 4.5. Kaaliumhüdroksiid, umbes 0,2 mol/L etanoolilahus; 13 g kaaliumhüdroksiidi lahustatakse 20 ml destilleeritud vees ja täiendatakse etanooliga 1 l märgini. 4.6. Benseen, kromatograafia jaoks. (Vt 5.2.2). 4.7. Atsetoon, kromatograafia jaoks. (Vt 5.2.2). 4.8. Heksaan, kromatograafia jaoks. (Vt 5.2.2). 4.9. Dietüüleeter, kromatograafia jaoks. (Vt 5.2.2). 4.10. Kloroform, kromatograafia jaoks. 4.11. Võrdluslahus, planaarkromatograafia jaoks: 5 % C20-C28 alkoholide segu kloroformis. 4.12. 0,2 % 2,7-deklorofluorestseiini lahus etanoolis. Lahust muudetakse veidi aluseliseks mõne tilga 2 mol/L kaaliumhüdroksiidi lahuse lisamisega. 4.13. Veevaba püridiin, kromatograafia jaoks. 4.14. Heksametüüldisilasaan. 4.15. Trimetüülklorosilaan. 4.16. Alifaatsete alkoholide (C20-C28) trimetüülsilüüleetrite standardlahused. Standardlahused võivad olla valmistatud puhaste alkoholide segudest vahetult enne kasutamist. 4.17. 0,1 % (m/V) 1-araiinhappe lahus CHCl3-s (sisestandard). 4.18. Kandegaasid: vesinik ja heelium, gaasikromatograafia kvaliteediga. 4.19. Abigaasid: - vesinik, gaasikromatograafia kvaliteediga, - õhk, gaasikromatograafia kvaliteediga. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. Seebistumatu aine ettevalmistamine. 5.1.1. 500 l mikrosüstlaga pannakse 250 ml ümarapõhjalisse kolbi 0,1protsendilist 1-eikosanooli (kasutada võib ka 1-heneikosanooli) lahust (4.17), milles sisalduva 1-eikosanooli määr on ligikaudu 10 % analüüsimiseks võetud proovi alifaatse alkoholi sisaldusest. Näiteks 5 g oliiviõli või seemneõli proovile lisatakse 250 l ja 5 g oliivijääkõlile lisatakse 1 500 l 0,1protsendilist 1-eikosanooli lahust. Sisestandardi lahus aurustatakse atmosfääril N2 kuivaks. Kolbi kantakse kvantitatiivselt 5 g kuiva filtreeritud proovi. 5.1.2. Lisatakse 50 ml 2 mol/L kaaliumhüdroksiidi etanoolilahust, seejärel käivitatakse püstjahuti ja lahust kuumutatakse auruvannil tasakesi keemiseni ning segatakse kogu keemisprotsessi ajal pidevalt, kuni toimub seebistamine (lahus muutub selgeks). Kuumutatakse veel 20 minutit ning siis lisatakse kondensaatori kaudu 50 ml destilleeritud vett, seejärel ühendatakse kondensaator lahti ning kolb jahutatakse temperatuurile ligikaudu 30 C. 5.1.3. Kolvi sisu kantakse kvantitatiivselt 500 ml jaotuslehtrisse ja kolbi loputatakse 2 × 25 ml destilleeritud veega. Lisatakse ligikaudu 80 ml dietüüleetrit, loksutatakse tugevasti 30 sekundit ja need kaks faasi jäetakse siis kihistuma (vt märkus 1). Madalam vesifaas kantakse teise lehtrisse. Veefaasi ekstraheeritakse samal viisil veel kaks korda, kasutades mõlemal korral 60-70 ml dietüüleetrit. Märkus 1. Emulsioonid võib eraldada, lisades sisse pihustades väikse koguse etüülalkoholi või metüülalkoholi. 5.1.4. Dietüüleetri ekstraktid koondatakse jaotuslehtrisse ja pestakse destilleeritud veega (50 ml korraga), kuni pesuvesi annab neutraalse reaktsiooni. Vesifaas visatakse ära, eetrifaas kuivatatakse veevaba naatriumsulfaadiga ja filtreeritakse enne kaalutud 250 ml kolbi, seejärel pestakse lehter ja filter väikse koguse dietüüleetriga, mis liidetakse kogumassile. 5.1.5. Eeter aurustatakse aeglaselt kuumutades, kuni seda on järel vaid mõni milliliiter, ja kuivatatakse nõrgas vaakumis või lämmastikuvoolus; lõpuks kuivatatakse ahjus temperatuuril 100 C umbes 15 minutit ning jääk kaalutakse pärast eksikaatoris jahutamist. 5.2. Alkoholifraktsioonide eraldamine. 5.2.1. Aluseliste TLC-plaatide (4.4) ettevalmistamine. Plaadid immutatakse 10 sekundi jooksul täielikult 0,2 mol/L kaaliumhüdroksiidi lahuses, jäetakse seejärel kaheks tunniks katte all kuivama ning lõpuks asetatakse need ahju üheks tunniks temperatuurile 100 C. Plaadid võetakse ahjust ning neid hoitakse kuni kasutamiseni kaltsiumkloriidi eksikaatoris. Selliselt töödeldud plaadid tuleb kasutada kahe nädala jooksul. Märkus 2. Kui aluselisi silikageeli plaate kasutatakse alkohoolse fraktsiooni eraldamiseks, ei ole seebistumatuid aineid vaja A1203-ga töödelda. Selliselt on kõik happeühendid (rasvhapped ja muud) algsel kujul, sisaldades nii alifaatse alkoholi ja eeterliku alkoholi sidemeid, mis on mõlemad selgelt steroolsidemest eraldatud. 5.2.2. Ilmutusnõusse viiakse ligikaudu 1 cm-ni benseeni ja atsetooni 95 : 5 lahus. Selle asemel võib kasutada ka heksaani ja dietüüleetri 65 : 35 lahust. Ilmutusnõu suletakse ja lahus jäetakse auru ja vedeliku tasakaalustumiseks sinna vähemalt pooleks tunniks. Selleks et vähendada ilmutusaega umbes ühe kolmandiku võrra ja saavutada komponentide ühtsem ja korrapärasem eluent, võib ilmutusnõu sisepinnale kinnitada eluendiga kastetud filterpaberiribad. Märkus 3. Reprodutseeritavate ilmutustingimuste saamiseks tuleb igaks analüüsiks kasutada uut ilmutuslahust. 5.2.3. Kloroformis valmistatakse umbes 5 % seebistamatu aine (5.1.5) lahus ja 300 l lahust kantakse 100 l mikrosüstlaga võimalikult õhukese ja ühtlase kihina ÕKK-plaadile 2 cm kaugusele ÕKK-plaadi alumisest servast. Selleks et alifaatse alkoholi sidet oleks pärast ilmutamist lihtsam identifitseerida, pannakse 2-3 l alifaatse alkoholi võrdluslahust (4.11) ühele plaadi servale eelmisega samale tasandile. 5.2.4. Plaat asetatakse ilmutusnõusse, nagu punktis 5.2.2 ette nähtud. Temperatuuri hoitakse vahemikus 15-20 C. Ilmutusnõu suletakse kohe ning proov jäetakse elueeruma, kuni lahusti piir on jõudnud plaadi ülemisest servast 1 cm kaugusele. Seejärel võetakse plaat ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus või lastakse plaadil natuke aega kaane all seista. 5.2.5. Plaadile pritsitakse õhukese ja ühtlase kihina 2,7-diklorofluorestseiini lahust; kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on alifaatse alkoholi vööndit võimalik identifitseerida võrdlemisel vahetult selle kohal oleva triterpeenalkoholide vööndi alifaatsete alkoholidega; alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide vöönd märgistatakse musta pliiatsiga. Märkus 4. Alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide vööndi eemaldamise nõude tingib mõningate alifaatsete alkoholide võimalik migreerumine triterpeenalkoholide vööndisse. 5.2.6. Märgistatud piirkonnas olev silikageel kraabitakse metallist spaatliga ära. Eemaldatud materjal jagatakse väikesteks osakesteks ning kantakse filterlehtrisse (3.7), seejärel lisatakse 10 ml kuuma kloroformi, lehtri sisu segatakse põhjalikult metallist spaatliga, filtreeritakse vaakumis ning filtraat kogutakse filterlehtriga seotud kolbi (3.8). Lehtris olevat jääki pestakse 3 × 10 ml etüüleetriga ning filtraat kogutakse samasse lehtris olevasse kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4-5 ml mahuni ning jääklahus juhitakse 10 ml enne kaalutud katseklaasi (3.9); katseklaas kuivatakse nõrgas lämmastiku voolus aeglaselt kuumutades. Jääk lahustatakse uuesti mõne tilga atsetooni lisamise teel, kuivatatakse ning asetatakse 10 minutiks ahju temperatuuril 105 C, võetakse seejärel välja, jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse. Katseklaasis olev jääk koosneb alkoholifraktsioonist. 5.3. Trimetüülsilüüleetrite valmistamine. 5.3.1. Niiskuse imendumist (märkus 6) vältides lisatakse alkoholifraktsiooni sisaldavasse katseklaasi iga alkoholi milligrammi kohta 50 l silüülivat reagenti, mis koosneb 9 : 3 : 1 mahuga (märkus 5) püridiin-heksametüüldisilasaan-trimetüülklorosilaani segust. Märkus 5. Müügil on kasutusvalmid lahused; näiteks silüülivad reagendid nagu N,0-bis-trimetüülsilüültrifluoratsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaan segamiseks sama mahu veevaba püridiiniga. 5.3.2. Katseklaas suletakse punniga ning loksutatakse hoolikalt kuni alkoholide lahustumiseni, ilma et katseklaas ümber läheks. Seejärel jäetakse see vähemalt 15 minutiks toatemperatuurile ning tsentrifuugitakse mõni minut; selge lahus on gaasikromatograafiliseks analüüsiks valmis. Märkus 6. Kerge opalestsentsi tekkimine on tavaline ning ei sega. Valge helbelise massi tekkimine või roosa värvuse ilmumine on niiskuse esinemise või reaktiivi halvenemise märgiks. Sel juhul katset korratakse. 5.4. Gaasikromatograafiline analüüs. 5.4.1. Esialgsed toimingud ja kapilaarkolonni ettevalmistamine. 5.4.1.1. Kapillaarkolonn paigaldatakse gaasikromatograafi nii, et kolonni algus ühendatakse aurustiga, mis on seotud jaotussüsteemiga, ning kolonni lõpp ühendatakse detektoriga. Tehakse gaasikromatograafi üldine kontroll (gaasiseadmete lekkekindlus, detektori, jaotussüsteemi ja registreerimise süsteem jne tõhusus). 5.4.1.2. Tuleks ette valmistada kapillaarkolonnid, mida kasutatakse esimest korda. Kapillaarkolonni suunatakse natuke kandegaasi ning seejärel lülitatakse sisse gaasikromatograaf ning kuumutatakse järkjärguliselt kuni saavutatakse temperatuur, mis on töötemperatuurist vähemalt 20 C kõrgem (vt märkus 7). Seda temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi ning seejärel viiakse gaasikromatograaf töötingimustele vastavaks (gaasi juurdevoolu ja jaotumise reguleerimine, leegi süütamine, elektrilise meerikuga ühendamine, kolonnahju temperatuuri kohandamine, detektor ja injektor jne) ning signaali tundlikkus kohandatakse vähemalt kaks korda suuremaks, kui analüüsi tegemiseks kavandatud. Nulljoon peab olema sirge, selles ei tohi olla mingisuguseid piike ning see ei tohi triivida. Negatiivne rektilineaarne/sirgjooneline triiv osutab kolonniühenduste puudulikule tihedusele, samas kui positiivne triiv osutab kolonni puudulikule ettevalmistamisele. Märkus 7. Ettevalmistamisel on temperatuur kasutatava vedelfaasi maksimaalsest temperatuurist vähemalt 20 C madalam. 5.4.2. Töötingimuste valik. 5.4.2.1. Üldised töötingimused on järgmised: - kolonni temperatuur: alguses määratakse isoterm kaheksaks minutiks temperatuurile 180 C ja seadistatakse seejärel iga minuti järel 5 C võrra ning 15 minuti pärast temperatuurini 260 C tõusma, - aurusti temperatuur: 280 C, - aurusti temperatuur: 290 C, - kandegaasi voolukiirus: heelium 20-35 cm/s, vesinik 30-50 cm/s, - jaotussuhe: 1 : 50 1 : 100 juures, - seadme tundlikkus: 4-16-kordne minimaalne sumbumine, - registreerimise tundlikkus: 1-2 mV fs, - paberi kiirus: 30-60 cm/h, - süstitava aine kogus: 0,5-1 l TMSE lahust. Selleks et kromatogrammid vastaksid alljärgnevatele tingimustele, võib eespool nimetatud tingimusi kooskõlas kolonni ja gaasikromatograafi omadustega muuta: - alkoholi peetumisaeg C26 on 18 5 minutit, - alkoholi C22 piik on 80 20 % oliiviõli skaala lõppväärtusest ja 40 20 % seemneõli skaala lõppväärtusest. 5.4.2.2. Eespool nimetatud tingimusi kontrollitakse TMSE alkoholide standardlahuse korduva sissepritse teel ning töötingimusi kohandatakse parimate võimalike tulemuste saamiseks. 5.4.2.3. Piikide integreerimise parameetrid määratakse selliselt, et saavutatakse arvessevõetavate piigipindalade õige hindamine. 5.4.3. Analüüsi käik. 5.4.3.1. 10 l mikrosüstlasse tõmmatakse 1 ml heksaani, seejärel 0,5 l õhku ning lõpuks 0,5-1 l proovilahust; nõel tõmmatakse mikrosüstla kolbiga tühjaks. Nõel torgatakse läbi vaheseina sissepritseosasse ja 1-2 sekundi järel süstitakse kiiresti lahus ning umbes viie sekundi möödumisel tõmmatakse nõel aeglaselt välja. 5.4.3.2. Registreerimine meerikuga jätkub, kuni lahuses sisalduvate alkoholide TMSE on täielikult elueeritud. Nulljoon peab alati vastama punkti 5.4.1.2 nõuetele. 5.4.4. Piikide määramine. Üksikpiigid määratakse peetumisaja alusel ning neid võrreldakse samadel tingimustel analüüsitud alifaatsete alkoholide TMSE-seguga. Neitsioliiviõli alkoholifraktsiooni kromatogramm on esitatud joonisel 1. 5.4.5. Kvantitatiivne hindamine. 5.4.5.1. 1-eikosanooli ja alifaatsete alkoholide C22-C28 piigipindala arvutatakse integraatoriga. 5.4.5.2. Iga alkoholi sisaldus milligrammides 100 g rasvaine kohta arvutatakse järgmiselt: [INSERT FORMULA] kus Ax = alkoholipiigi x pindala (mm2); As = 1-eikosanooli pindala (mm2); ms = 1-eikosanooli mass milligrammides; m = määramiseks võetud proovi mass grammides. 6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE Märgitakse üksikute alifaatsete alkoholide sisaldus milligrammides 100 g rasvaine kohta ja alifaatsete alkoholide kogusumma. LIIDE Gaasi voolukiiruse määramine Tavapärastel töötingimustel süstitakse gaasikromatograafi 1-3 l metaani või propaani ning stopperiga mõõdetakse aeg, mille jooksul metaan või propaan süstimise hetkest kuni piigi moodustumiseni (tM) läbi kolonni läheb. Voolukiirus (cm/s) määratakse valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on stopperiga mõõdetud aeg sekundites. [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] Joonis 1 Neitsioliiviõli alkoholifraktsiooni kromatogramm. 1 = eikosanool (SI) 2 = dokosanool, 3 = trikosanool, 4 = tetrakosanool, 5 = pentakosanool, 6 = heksakosanool, 7 = heptakosanool, 8 = oktakosanool. V LISA STEROOLIDE KOOSTISE JA SISALDUSE GAASIKROMATOGRAAFILINE MÄÄRAMINE KAPILLAARKOLONNIGA 1. KOHALDAMISALA Meetod kirjeldab rasvainete steroolide individuaalse- ja üldsisalduse määramist. 2. PÕHIMÕTE Rasvaine, millele on sisestandardina lisatud -kolestanooli, seebistatakse kaaliumhüdroksiidiga etanoolilahuses ja seebistumatud komponendid ekstraheeritakse dietüüleetriga. Steroolifraktsioon eraldatakse seebistamatust ekstraktist kromatograafiaga aluselise silikageeli plaadi põhjal. Silikageelist saadud steroolid töödeldakse trimetüülsilüüleetriteks ja neid analüüsitakse gaasikromatograafiliselt kapillaarkolonniga. 3. SEADMED 3.1. Püstjahutiga varustatud lihvühendustega 250 ml kolb. 3.2. 500 ml jaotuslehtrid. 3.3. 250 ml kolvid. 3.4. Täielikud seadmed planaarkromatograafiaga analüüsimiseks, kasutades 20 × 20 cm klaasplaate. 3.5. Ultraviolettlamp lainepikkusega 366 või 254 nm. 3.6. 100 ja 500 l mikrosüstlad. 3.7. Silindriline filterlehter, mille poorne septum on G3 (15-40 m), diameeter ligikaudu 2 cm ja sügavus 5 cm ning milles on vaakumfiltreerimiseks sobiv liide ja 12/21 lihvkern. 3.8. 50 ml vaakumkolb 12/21 lihvmuhviga, mida on võimalik paigaldada filterlehtrisse (3.7). 3.9. 10 ml katseklaas koonusekujulise põhja ja tihenduskitiga. 3.10. Gaasikromatograaf, mis võimaldab kasutada kapillaarkolonni ja on varustatud järgmistest seadistest koostatud jaotussüsteemiga: 3.10.1. termostateeritav kolonnikamber, mis hoiab nõutavat temperatuuri täpsusega 1 °C; 3.10.2. reguleeritava temperatuuriga aurustamisseade, millel on silaniseeritud klaasist aurustaja; 3.10.3. leekionisatsioonidetektor ja muundurvõimendi; 3.10.4. meerikuga integraator, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.10.3), mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberikiirust on võimalik muuta. 3.11. Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn, mille pikkus on 20-30 m, sisediameeter 0,25-0,32 mm, üleni ühtlase 0,10-0,30 m kihina kaetud SE-52 või SE-54 vedeliku või samaväärse vedelikuga. 3.12. l0 l karastatud nõelaga gaasikromatograafias kasutatav mikrosüstal. 4. REAKTIIVID 4.1. Kaaliumhüdroksiid, umbes 2 mol/L etanoolilahus. 130 g kaaliumhüdroksiidi (väikseim kontsentratsioon 85 %) lahustatakse 85 % destilleeritud vees samal ajal jahutades ning täiendatakse kuni 1 liitri märgini etanooliga. Lahust tuleb hoida õhukindlalt suletud tumedates klaaspudelites. 4.2. Dietüüleeter, analüütiliselt puhas. 4.3. Veevaba naatriumsulfaat, analüütiliselt puhas. 4.4. Silikageeliga kaetud klaasplaadid, fluorestsentsindikaatorita, paksusega 0,25 mm (müügil kasutusvalmina). 4.5. Kaaliumhüdroksiid, 0,2 mol/L etanoolilahus. 13 g kaaliumhüdroksiidi lahustatakse 20 ml destilleeritud vees ning täiendatakse kuni 1 liitri märgini etanooliga. 4.6. Benseen, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2) 4.7. Atsetoon, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2) 4.8. Heksaan, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2) 4.9. Dietüüleeter, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2) 4.10. Kloroform, analüütiliselt puhas. (Vt. 5.2.2) 4.11. Planaarkromatograafia võrdluslahus: kolesterool või fütosteroolid, 5 % kloroformilahus. 4.12. 2,7-diklorofluorestseiin, 0,2 % etanoolilahus. Muudetakse kergelt aluseliseks mõne tilga 2 mol/L alkohoolse kaaliumhüdroksiidilahuse lisamisega. 4.13. Veevaba püridiin, kromatograafia jaoks. 4.14. Heksametüül disilasaan. 4.15. Trimetüülklorosilaan. 4.16. Sterooltrimetüülsilüüleetrite võrdluslahused. Valmistatakse kasutamise ajal puhastest steroolidest või steroole sisaldavatest õlidest saadud steroolisegudest. 4.17. -kolestanool, 0,2 % kloroformilahus (m/V) (sisestandard). 4.18. Kandegaas: lämmastik või heelium, gaasikromatograafiliselt puhas. 4.19. Abigaasid: - vesinik, gaasikromatograafiliselt puhas, - õhk, gaasikromatograafiliselt puhas. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine. 5.1.1. 250 ml kolbi viiakse 500 l mikrosüstlaga selline kogus 0,2 % -kolestanooli kloroformilahust (4.17), milles sisalduv kolestanooli kogus on umbes 10 % kolbis määratava alikvoodi steroolisisaldusest. Näiteks lisatakse 5grammise oliiviõli proovi puhul 500 l 0,2protsendilist -kolestanooli lahust ja seemneõli või oliivijääkõli proovi puhul 1 500 l. Proov aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks ning samasse kolbi kaalutakse 5 grammi kuiva filtreeritud proovi. Loomsete või taimsete õlide ja rasvade puhul, mis sisaldavad palju kolesterooli, võib tekkida piik, mille peetumisaeg on sama kui kolestanooli peetumisaeg. Sellisel juhul tuleb steroolifraktsiooni analüüsida kaks korda, sisestandardiga ja ilma. 5.1.2. Lisatakse 50 ml 2 mol/L kaaliumhüdroksiidi etanoolilahust, käivitatakse püstjahuti ning kuumutatakse pidevalt kiiresti segades veevannil tasase keemiseni kuni seebistumiseni (lahus muutub selgeks). Kuumutatakse veel 20 minutit, seejärel lisatakse kondensaatori ülaosasse 50 ml destilleeritud vett, eemaldatakse püstjahuti ning kolb jahutatakse ligikaudu temperatuurini 30 C. 5.1.3. Kolvi sisu valatakse kvantitatiivselt 500 ml jaotuslehtrisse ning seda loputatakse mitu korda kokku 50 ml destilleeritud veega. Lisatakse ligikaudu 80 ml dietüüleetrit, loksutatakse tugevasti umbes 30 sekundit ning jäetakse seisma (märkus 1). Põhjas olev veefaas kogutakse teise jaotuslehtrisse. Veefaasi ekstraheeritakse samal viisil veel kaks korda, kasutades selleks mõlemal korral 60-70 ml dietüüleetrit. Märkus 1. Võimalikku emulsiooni on võimalik eemaldada väikse koguse etanooli või metanooli sissepritsimisega. 5.1.4. Etüüleetri ekstraktid koondatakse jaotuslehtrisse ja pestakse destilleeritud veega (50 ml korraga), kuni pesuvesi annab neutraalse reaktsiooni. Kui pesuvesi on eemaldatud, kuivatatakse veevaba naatriumsulfaadiga ja filtreeritakse veevabal naatriumsulfaadil enne kaalutud 250 ml kolbi, pestes lehtrit ja filtrit väikse koguse dietüüleetriga. 5.1.5. Eeter destilleeritakse selliselt, et seda on vaid mõni ml, ning seejärel kuivatakse seda kerges vaakumis või lämmastikuvoolus ning lõpuks umbes veerand tundi ahjus temperatuuril 100 C ning seejärel kaalutakse pärast jahutamist eksikaatoris. 5.2. Steroolifraktsiooni eraldamine. 5.2.1. Aluseliste plaatide ettevalmistamine. Silikageeli plaadid (4.4) kastetakse 10 sekundiks täielikult 0,2 mol/L kaaliumhüdroksiid etanoolilahusesse (4.5), lastakse kaks tundi tõmbekapis kuivada ning lõpuks asetatakse üheks tunniks ahju temperatuurile 100 C. Seejärel võetakse silikageeli plaadid ahjust ning neid hoitakse kuni kasutamiseni kaltsiumkloriidi eksikaatoris (selliselt töödeldud plaadid tuleb kasutada 15 päeva jooksul). Märkus 2. Kui aluselisi silikageeli plaate kasutatakse steroolfraktsiooni eraldamiseks, ei ole mitteseebistuvaid komponente vaja alumiiniumoksiidiga töödelda. Selliselt jäävad kõik happelised ühendid (rasvhapped ja muud) lähtejoonele ja steroolivöönd eraldub selgelt alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide vööndist. 5.2.2. 95 (V/V) benseeni/atsetooni segu pannakse plaatide ilmutusnõusse umbes 1 cm sügavusele. Kasutada võib ka 65/35 (V/V) heksaani/etüüleetri segu. Ilmutusnõu suletakse nõuetekohase kaanega ning jäetakse umbes pooleks tunniks seisma, et tekiks vedeliku ja auru tasakaal. Ilmutusnõu siseseintele võib kinnitada filterpaberi ribad, mis ulatuvad eluendini. See vähendab ilmutusaega ligikaudu kolmandiku võrra ning komponentide elueerumine on ühtlasem ja korrapärasem. Märkus 3. Täielikult korratavate elueerimistingimuste saavutamiseks tuleb igaks katseks võtta uus ilmutussegu. 5.2.3. Valmistatakse umbes 5 % seebistumatute komponentide kloroformilahus (5.1.5) ning 100 l mikrosüstlaga tõmmatakse 300 l kromatograafiaplaadile (5.2.1) umbes 2 cm kaugusele plaadi servast võimalikult õhuke ja ühtlane viir. 2-3 l sterooli võrdluslahust (4.11) asetatakse samale joonele plaadi ühte serva nii, et steroolivööndit oleks võimalik pärast ilmutamist identifitseerida. 5.2.4. Vastavalt punktile 5.2.2 ettevalmistatud plaat asetatakse ilmutusnõusse. Temperatuuri tuleks hoida vahemikus 15-20 C. Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueeruda, kuni lahusti serv ulatub umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus või jättes selle lühikeseks ajaks ilma katteta. 5.2.5. Plaati pritsitakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahusega. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on sterooli vööndit võimalik identifitseerida selliselt, et see on samas kohas kui võrdluslahuse vöönd. Vööndi piirid märgitakse musta pliiatsiga mööda fluorestsentsi servi. 5.2.6. Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Eemaldamisel saadav hästi peenestatud materjal pannakse filterlehtrisse (3.7). Lisatakse 10 ml kuuma kloroformi, segatakse hoolikalt metallist spaatliga ning filtreeritakse vaakumi all, seejärel kogutakse filtraat filterlehtriga ühendatud Erlenmeyeri kolbi (3.8). Jääki pestakse lehtris kolm korda dietüüleetriga (iga kord umbes 10 ml) ning filtraat kogutakse samasse lehtriga ühendatud kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4-5 ml mahuni ning jääklahus valatakse enne kaalutud 10 ml katseklaasi (3.9), seejärel aurustatakse madala kuumutamise teel õrna lämmastiku voolu all kuivaks, täidetakse uuesti paari tilga atsetooniga, aurustatakse taas kuivaks ning asetatakse umbes 10 minutiks ahju temperatuurile 105 C, lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Katseklaasis olev jääk koosneb sterooli fraktsioonist. 5.3. Trimetüülsilüüleetrite ettevalmistamine. 5.3.1. Katseklaasis olevale steroolifraktsioonile lisatakse 50 l igas katseklaasis oleva sterooli milligrammi kohta silüüliv reagent, mis koosneb mahus 9 : 3 : 1 (V/V/V) püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segust (märkus 4), selliselt, et niiskus ei pääseks ligi (märkus 5). Märkus4. Müügil on kasutusvalmid lahused. Müügil on ka muud silüülivad reagendid, näiteks bis-trimetüülsilüültrifluoratsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaan, mida tuleb lahjendada sama mahu veevaba püridiiniga. 5.3.2. Katseklaas suletakse punniga, loksutatakse hoolikalt (ilma et see ümber läheks), kuni steroolid on täielikult lahustunud. Lastakse ümbritseva õhu temperatuuril vähemalt 15 minutit seista ning seejärel tsentrifuugitakse paar minutit. Selge lahus on gaasikromatograafiliseks analüüsiks valmis. Märkus 5. Kerge opalestsentsi tekkimine on tavaline ning ei sega. Valge helbelise massi tekkimine või roosa värvuse ilmumine on niiskuse esinemise või reaktiivi halvenemise märgiks. Nende esinemise korral tuleb katset korrata. 5.4. Gaasikromatograafiline analüüs. 5.4.1. Eeltoimingud, kolonnide täitmine. 5.4.1.1. Kolonn pannakse gaasikromatograafi, sisselaskepunkt ühendatakse aurustiga, mis on seotud jaotussüsteemiga, ning väljalaskepunkt ühendatakse detektoriga. Tehakse gaasikromatograafi üldine kontroll (lekked gaasiliidetes, detektori, jaotussüsteemi ja registreerimissüsteemi toimimine jne). 5.4.1.2. Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitav see ette valmistada. Kolonni lastakse kerge gaasivool, seejärel lülitatakse tööle gaasikromatograaf ning alustatakse järkjärgulist kuumutamist temperatuurini, mis on vähemalt 20 C võrra kõrgem kui töötemperatuur (märkus 6). Seda temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel pannakse terve seade tööasendisse (gaasi juurdevoolu ja jaotumise reguleerimine, leegi süütamine, elektrilise meerikuga ühendamine, kolonnahju, detektori ja injektori temperatuuri kohandamine jne) ning signaal tundlikkus reguleeritakse vähemalt kaks korda suuremaks, kui analüüsiks tegemiseks kavandatud. Tekkiv nulljoon peab olema lineaarne, ilma igasuguste piikideta, ja see ei tohi triivida. Negatiivne sirgjooneline triiv osutab lekkele kolonniühendustes. Positiivne triiv osutab kolonni puudulikule ettevalmistamisele. Märkus6. Ettevalmistamisel on temperatuur kasutatava vedelfaasi maksimaalsest temperatuurist vähemalt 20 C madalam. 5.4.2. Töötingimuste valik. 5.4.2.1. Töö põhitingimused on järgmised: - kolonni temperatuur: 260 5 C, - detektori temperatuur: 280 C, - detektori temperatuur: 290 C, - kandegaasi voolukiirus: heelium 20-35 cm/s, vesinik 30-50 cm/s, - jaotussuhe: 1 : 50 - 1 : 100, - seadme tundlikkus: 4-16-kordne minimaalne sumbumine, - registreerimise tundlikkus: 1-2 mV fs, - paberi kiirus: 30-60 cm/h, - süstitava aine kogus 0,5-1 l TMSE lahust. Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi karakteristikutest võib neid tingimusi muuta, nii et kromatogrammid vastaksid järgmistele nõuetele: - -sitosterooli peetumisaeg peaks olema 20 5 minutit, - kampesterooli piik peaks olema: oliiviõli puhul (keskmine sisaldus 3%) 15 5 % kogu mõõtepiirkonnast; sojaõli puhul (keskmine sisaldus 20 %) 80 10 % kogu mõõtepiirkonnast, - kõik olemasolevad steroolid peavad olema eraldatud. Lisaks sellele peavad piigid olema ka täielikult eraldunud, see tähendab, et piigi jälg peab enne järgmise piigi juurde liikumist minema tagasi piigi nulljoonele. Puudulik resolutsioon on siiski lubatud tingimusel, et piiki on TRR 1,02 juures võimalik mõõta risti. 5.4.3. Analüüsi käik. 5.4.3.1. 10 l mikrosüstlaga tõmmatakse 1 l heksaani, seejärel 0,5 l õhku ning lõpuks 0,5-1 l proovilahust. Nõela kolbi tõstetakse veelgi nii, et nõel tühjendatakse. Nõel surutakse läbi injektorseadme kesta ning ühe või kahe sekundi pärast süstitakse kiiresti, seejärel tõmmatakse nõel umbes 5 sekundi pärast aeglaselt välja. 5.4.3.2. Jätkatakse registreerimist, kuni olemasolevate steroolide TMSE on täielikult elueeritud. Nulljoon peab vastama nõuetele (5.4.1.2). 5.4.4. Piigi määramine. Piigid määratakse peetumisaja põhjal ning samadel tingimusel analüüsitud steroolide TMSE segudega võrdlemise teel. Steroolid elueeritakse sellises järjekorras: kolesterool, brassikasterool, 24-metüleenkolesterool, kampesterool, kampestanool, stigmasterool, 7-kampesterool, 5,23-stigmastadienool, klerosterool, -sitosterool, sitostanool, 5-avenasterool, 5,24-stigmastadienool, 7-stigmastenool, 7-avenasterool. Sitosterooli peetumisajad SE-52 ja SE-54 kolonnide puhul on esitatud tabelis 1. Joonised 1 ja 2 kirjeldavad mõnede õlide tüüpilisi kromatogramme. 5.4.5. Kvantitatiivne hindamine. 5.4.5.1. -kolestanooli ja steroolipiikide pindala arvutatakse integraatoriga. Välja tuleb jätta nende ühendite piigid, mida ei ole tabelis 1 loetletud. -kolestanooli kalibreerimistegur peab olema 1. 5.4.5.2. Iga sterooli kontsentratsioon milligrammides 100 g rasvaine kohta arvutatakse järgmiselt: [INSERT FORMULA] kus Ax = sterooli x piigipindala (mm2); As = -kolestanooli piigipindala (mm2); ms = lisatud -kolestanooli mass (mg); m = määramisel kasutatud proovi mass grammides. 6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE 6.1 Registreeritakse sterooli kontsentratsioonid milligrammides 100 g rasvaine kohta ning nende summa steroolide üldsisaldusena. Iga sterooli protsent arvutakse vastava piigipindala ja steroolide piikide kogupindala suhtena. [INSERT FORMULA] kus Ax = x'i piigi pindala; A = steroolide piigipindala kokku. LIIDE Gaasi voolukiiruse määramine Normaalsetel töötingimustel gaasikromatograafi süstitakse 1-3 ml metaani (või propaani) ja mõõdetakse aeg, mis kulub gaasi voolamiseks läbi kolonni alates süstimisest kuni piigi ilmumiseni (tM). Voolukiirus cm/S on esitatud valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on mõõdetud aeg sekundites. Tabel 1 Steroolide suhtelised peetumisajad Piik Identifitseerimine Suhteline peetumisaeg SE 54 kolonn SE 52 kolonn 1 kolesterool -5-kolesteen-3(-ool 0,67 0,63 2 kolestanool 5-kolestaan-3(-ool 0,68 0,64 3 brassikasterool [24S]-24-metüül-?-5,22-kolestadieen-3(-ool 0,73 0,71 4 24-metüleen-kolesterool 24-metüleen--5,24-kolesteen-3(-ool 0,82 0,80 5 kampesterool [24R]-24-metüül--5-kolestadieen-3(-ool 0,83 0,81 6 kampestanool [24R]-24-metüül-kolestaan-3(-ool 0,85 0,82 7 stigmasterool [24R]-24-etüül--5,22-kolestadieen-3(-ool 0,88 0,87 8 -7-kampesterool [24R]-24-metüül--7-kolesteen-3(-ool 0,93 0,92 9 -5,23-stitmastadienool [24S,R]-24-etüül--5,23-kolestadieen-3(-ool 0,95 0,95 10 klerosterool [24S]-24-etüül--5,25-kolestadieen-3(-ool 0,96 0,96 11 (-sitosterool [24R]-24-etüül--5-kolestaan-3(-ool 1,00 1,00 12 sitostanool 24-etüül-kolestaan-3(-ool 1,02 1,02 13 -5-avenasterool [24R]-24-etülideen-5-kolesteen-3(-ool 1,03 1,03 14 -5,24-stitmastadienool [24R,S]-24-etüül--5,24-kolestadieen-3(-ool 1,08 1,08 15 -7-stigmastenool [24R,S]-24-etüül--7,24-kolestadieen-3(-ool 1,12 1,12 16 -7-avenasterool [24Z]-24-etülideen--7-kolesteen-3(-ool 1,16 1,16 Joonis 1 Rafineerimata oliiviõli sterooli fraktsiooni gaasikromatogramm [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] Joonis 2 Rafineeritud oliiviõli sterooli fraktsiooni gaasikromatogramm [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] VI LISA ERÜTRODIOOLI JA UVALOOLI MÄÄRAMINE SISSEJUHATUS Erütrodiool (üldiselt mõeldakse selle all koos glükoole erütrodiool ja uvalool) on mõnele rasvainele iseloomulik seebistumatu fraktsiooni komponent. Erütrodiooli leidub ekstraheeritud oliiviõlis märkimisväärselt suuremas kontsentratsioonis kui teistes erütrodiooli sisalduvates õlides (pressitud oliiviõli ja viinamarjaseemneõli, jne) ning seetõttu võib selle esinemine osutada sellele, et lisatud on ekstraheeritud oliiviõli. 1. KOHALDAMISALA Käesolev meetod kirjeldab erütrodiooli määramist rasvainetes. 2. PÕHIMÕTE Rasvaine seebistatakse etanoolilahuses kaaliumhüdroksiidiga. Mitteseebistuvad fraktsioonid ekstraheeritakse dietüüleetriga ja puhastatakse läbi alumiiniumoksiidi kolonni juhtimise teel. Seebistumatutele komponentidele tehakse silikageeli plaadil planaarkromatograafia, kuni sterooli ja erütrodiooli fraktsioonide vööndid on eraldunud. Plaadilt saadud steroolid ja erütrodiool muundatakse trimetüülsilüüleetriteks ning seda segu analüüsitakse gaasikromatograafiliselt. Tulemus väljendatakse erütrodiooli protsendina erütrodiooli ja steroolide segus. 3. SEADMED 3.1. V lisas (steroolide sisalduse määramine) kirjeldatud seadmed. 4. REAKTIIVID 4.1. V lisas (steroolide sisalduse määramine) kirjeldatud reaktiivid. 4.2. Erütrodiooli standardlahus, 0,5 % lahus kloroformis. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine. Nagu V lisa lõikes 5.1.2 kirjeldatud. 5.2. Erütrodiooli ja steroolide eraldamine. 5.2.1. Vaata V lisa lõiget 5.2.1. 5.2.2. Vaata V lisa lõiget 5.2.2. 5.2.3. Valmistatakse seebistumatute komponentide 5 % kloroformilahus. 0,1 ml mikrosüstlaga tõmmatakse 0,3 ml kromatograafiaplaadile umbes 1,5 cm kaugusele plaadi alumisest servast võimalikult õhuke ja ühtlane viir. Ühele plaadiservale pannakse võrdluseks mõned mikroliitrid kolesterooli ja erütrodiooli lahust. 5.2.4. Vastavalt punktile 5.2.1 ette valmistatud plaat pannakse ilmutusnõusse. Ümbritseva õhu temperatuur peaks olema umbes 20 C. Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueerida, kuni lahusti serv ulatub umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus. 5.2.5. Plaati pritsitakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahusega. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on sterooli ja erütrodiooli vööndit võimalik identifitseerida selliselt, et see on samas kohas kui võrdluslahuste vööndid. See vöönd tähistatakse täpiga vahetult fluorestsentsi piiridest väljapool. 5.2.6. Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Plaadilt saadud materjal pannakse 50 ml kolbi. Lisatakse 15 ml kuuma kloroformi, loksutatakse hoolikalt ning filtreeritakse läbi lehtri, millel on paagutatud klaasketas nii, et silikageel jääb filtrisse. Pestakse kolm korda kuuma kloroformiga (iga kord 10 ml) ning filtraat kogutakse 100 ml kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4-5 ml mahuni ning valatakse 10 ml tsentrifuugiküvetti, seejärel kuivatatakse õrna lämmastiku voolu all ning kaalutakse. 5.3. Trimetüülsilüülestrite valmistamine Nagu V lisa lõikes 5.3 kirjeldatud. 5.4. Gaasikromatograafiline analüüs Nagu V lisa punktis 5.4 kirjeldatud. Gaasikromatograafilise analüüsi tegemise tingimused peavad olema sellised, et need võimaldavad läbi viia sterooli analüüsi ning eraldada TMSE erütrodioolist ja uvaloolist. Kui proov on injekteeritud, jätkatakse registreerimist, kuni proovis olevad steroolid, erütrodiool ja uvalool on elueeritud. Seejärel tehakse kindlaks piigid (erütrodiooli ja uvalooli peetumisajad on suhtes -sitosterooliga vastavalt 1,45 ja 1,55) ning piigipindala arvutatakse nagu steroolide puhul. 6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE [INSERT FORMULA] kus A1 = erütrodiooli piigipindala (mm2); A2 = uvalooli piigipindala (mm2); Asteroolid = steroolide piigipindala kokku (mm2). Tulemus väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega. VII LISA TRIGLÜTSERIIDI 2. POSITSIOONIS OLEVATE RASVHAPETE MÄÄRAMINE 1. KOHALDAMISALA Käesolevas standardis kirjeldatakse meetodit, millega määratletakse selliste rasvade ja õlide rasvhapped, mida on esterdatud glütserooli 2. positsioonis (või keskmises positsioonis). 2. KASUTUSVALDKOND Käesolevat standardit kohaldatakse nende õlide ja rasvade suhtes, mille sulamispunkt on pankrease lipaasi toime eripäradest tulenevalt alla 45 C. Käesolevat meetodit ei kohaldata õlide ja rasvade suhtes, mis sisaldavad märkimisväärset kogust: rasvhappeid, millel on 12 süsinikuaatomit või vähem (kookospähkli- ja palmituumaõlid, piimarasv), või enam kui nelja kaksiksidemega rasvhappeid, mis sisaldavad 20 aatomit või rohkem (kala- ja mereimetajate õli), või rasvhappeid, mis sisaldavad hapnikuga küllastatud rühmi, välja arvatud happerühmad. 3. PÕHIMÕTE Happelised õlid ja rasvad neutraliseeritakse vajaduse korral lahustis. Rasva või õli puhastamiseks juhitakse see alumiiniumoksiidi kolonni. Triglütseriidid hüdrolüüsitakse osaliselt pankrease lipaasi abil etteantud aja jooksul. Tekkivad monoglütseriidid eraldatakse planaarkromatograafiaga ning esterdatakse metanooliga. Metüülestreid analüüsitakse gaasikromatograafiaga. 4. SEADMED 4.1. 100 ml ümarapõhjaline kolb. 4.2. 25 ml ümarapõhjaline kolb, lihvühendusega. 4.3. 1 m õhkjahuti, mis sobib kolbi 4.2. 4.4. 250 ml Erlenmeyeri kolb. 4.5. 50 ml keeduklaas. 4.6. 500 ml jaotuslehter. 4.7. Klaaskolonn kromatograafia jaoks, sisediameetriga 13 mm, pikkusega 400 mm, kuhu on paigutatud paagutatud klaasketas ja kraan. 4.8. 10 ml lihvkorgiga tsentrifuugiküvett. 4.9. 5 ml bürett skaalajaotise väärtusega 0,05 ml. 4.10. 1 ml hüpodermiline peene nõelaga süstal. 4.11. Mikrosüstal, millega saadakse 3-4 l tilgad. 4.12. Statsionaarse faasi plaadile kandmise seade. 4.13. Klaasplaadid planaarkromatograafia jaoks, 20 × 20 cm. 4.14. Klaasist ilmutusnõu planaarkromatograafia jaoks, millel on lihvkork ja mis sobib 20 × 20 plaatidele. 4.15. Planaarkromatograafia ilmutusreagent. 4.16. Ahi, mis on reguleeritud temperatuurile 103 2 C. 4.17. Termostaat, mida on võimalik 5 C täpsusega reguleerida vahemikku 30-45 C. 4.18. Vaakumpöördaurusti. 4.19. Vibratsioonsegisti, mis võimaldab tsentrifuugiküvetti tugevalt loksutada. 4.20. Ultraviolettlamp planaarplaatide uurimiseks. Lipaasi aktiivsuse kontrollimiseks: 4.21. pH-meeter. 4.22. Spiraalsegisti. 4.23. 5 ml bürett. 4.24. Stopper. Lipaasi võimalikuks ettevalmistamiseks: 4.25. Laborisegisti, mis sobib heterogeensete materjalide hajutamiseks ja segamiseks. 5. REAKTIIVID 5.1. n-heksaan, või selle puudumise korral petrooleeter (bp 30-50 C), kromatograafilise kvaliteediga. 5.2. 95 % 2-propanool või etanool (V/V), analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga. 5.3. 2-propanool või etanool, 1/1 vesilahus. 5.4. Dietüüleeter, peroksiidivaba. 5.5. Atsetoon. 5.6. Sipelghape, vähemalt 98 protsendiline (m/m). 5.7. Ilmutuslahus: n-heksaani (5.1), dietüüleetri (5.4) ja sipelghappe (5.6) segu proportsioonis 70/30/1 (V/V/V). 5.8. Aktiveeritud alumiiniumoksiid kromatograafia jaoks, neutraalne, Brockmann I kvaliteediga. 5.9. Silikageel, koos sideainega, mille kvaliteet on sobiv planaarkromatograafia jaoks. 5.10. Pankrease lipaas, sobiva kvaliteediga (märkused 1 ja 2). 5.11. Naatriumhüdroksiid, 120 g/l vesilahus. 5.12. Soolhape, vesilahus 6 mol/L. 5.13. Kaltsiumkloriid (CaCl2), 220 g/l vesilahus. 5.14. Naatriumkolaat (ensümaatilise kvaliteediga), 1 g/l vesilahus. 5.15. Puhverlahus: 1 M tris-hüdroksümetüülaminometaani lahus reguleeritakse väärtusele pH 8, lisades selleks soolhapet (5.12) (kontrollitakse potentsiomeetriga). 5.16. Fenoolftaleiin, 10 g/l lahus 95protsendilises (V/V) etanoolis. 5.17. 2´,7´-diklorofluorestseiin, 2 g/l lahus 95protsendilises (V/V) etanoolis, muudetud pisut aluseliseks ühe tilga 1 N naatriumhüdroksiidilahuse lisamisega 100 ml kohta. Lipaasi aktiivsuse kontrollimiseks: 5.18. Neutraliseeritud õli. 5.19. 0,1 M naatriumhüdroksiidi vesilahus. 5.20. Naatriumkolaat (ensümaatilise kvaliteediga), 200 g/l vesilahus. 5.21. Kummiaraabik, 100 g/l vesilahus. 6. PROOVI ETTEVALMISTAMINE Kui proovi happesus on vastavalt II lisale määramisel alla 3 %, puhastatakse proovi alumiiniumoksiidi kohal, nagu punktis 6.2 ette nähtud. Kui proovi happesus on vastavalt II lisale määramisel üle 3 %, neutraliseeritakse proov leelisega lahusti juuresolekul punktile 6.1 vastavalt ja seejärel alumiiniumoksiidiga punktile 6.2 vastavalt. 6.1. Leelisega neutraliseerimine lahusti juuresolekul Jaotuslehtrisse (4.6) pannakse umbes 10 g toorõli ning lisatakse 100 ml heksaani (5.1), 50 ml 2-propanooli (5.2), paar tilka fenoolftaleiini lahust (5.16) ja selline kogus naatriumhüdroksiidi lahust (5.11), mis vastab õli 0,3 % võrra suuremale vabade rasvhapete sisaldusele. Loksutatakse tugevasti 1 minuti jooksul, lisatakse 50 ml destilleeritud vett, loksutatakse uuesti ning lastakse settida. Pärast eraldamist eemaldatakse alumine seebistunud kiht. Eemaldatakse ka keskmised kihid (taimeliim, lahustumatud ained). Neutraliseeritud õli heksaanilahust pestakse korduvalt 25-30 ml 2-propanoolilahuse (5.3) kogustega, kuni fenoolftaleiini roosa värvus on kadunud. Enamus heksaanist eemaldatakse vaakumi all vaakumpöördaurustis (4.18) destilleerimise teel, seejärel kuivatakse õli 30-40 C juures vaakumi all puhta lämmastiku vooluga, kuni heksaan on täielikult eemaldatud. 6.2. Puhastamine alumiiniumoksiidiga Valmistatakse ette 15 g aktiveeritud alumiiniumoksiidi (5.8) suspensioon 50 ml heksaanis (5.1) ja valatakse samal ajal segades kromatograafia kolonni peale (4.7). Alumiiniumoksiidil lastakse ühtlaseks kihiks vajuda ning lahustikihil lastakse valguda selliselt, et see on 1-2 mm absorbendist ülalpool. Kolonni valatakse ettevaatlikult 5 g õli ja 25 ml heksaani (5.1) lahus; heitvesi kogutakse kolonnist ümarapõhjalisse kolbi (4.1). 7. Kromatograafiliste plaatide ettevalmistamine Klaasplaadid (4.13) puhastatakse võimalike rasvainete eemaldamiseks korralikult etanooli, petrooleetri ja atsetooniga. Erlenmeyeri kolbi (4.4) pannakse 30 g silikageeli (5.9). Lisatakse 60 ml destilleeritud vett. Suletakse punniga ning loksutatakse tugevasti ühe minuti jooksul. Suspensioon kantakse kohe seadmele (4.12) ja puhtad plaadid kaetakse 0,25 mm paksuse kihiga. Plaate kuivatatakse õhu käes 15 minutit ja siis tund aega ahjus (4.16) temperatuuril 103 2 C. Plaadid jahutatakse enne kasutamist eksikaatoris toatemperatuurile. Ettevalmistatud plaadid on müügil. 8. TÖÖ KÄIK 8.1. Hüdrolüüs pankrease lipaasiga. Tsentrifuugiküvetti (4.8) kaalutakse umbes 0,1 g ettevalmistatud proovi; kui prooviks on vedel õli, toimitakse alljärgnevalt. Lisatakse 20 ml lipaasi (5.10) ja 2 ml puhvrit (5.15). Segatakse hoolega, kuid ettevaatlikult, ning seejärel lisatakse 0,5 ml naatriumkolaadi lahust (5.14) ja 0,2 ml kaltsiumkloriidi lahust (5.13). Katseklaas suletakse lihvkorgiga, loksutatakse ettevaatlikult (välditakse korgi kokkupuutumist lahusega) ja katseklaas pannakse kohe termostaati (4.17), mida hoitakse temperatuuril 40 0,5 C, ning loksutatakse käega täpselt üks minut. Katseklaas võetakse termostaadist välja ning loksutatakse tugevasti täpselt 2 minutit elektrilise loksutiga (4.19). Jahutatakse kohe jooksva vee all; lisatakse 1 ml soolhapet (5.12) ja 1 ml dietüüleetrit (5.4). Suletakse korgiga ja segatakse tugevasti elektrilise loksutiga. Lastakse seista ning orgaaniline kiht eemaldatakse süstlaga (4.10), vajaduse korral pärast tsentrifuugimist. 8.2. Monoglütseriidide eraldamine planaarkromatograafiaga Ekstrakt kantakse mikrosüstlaga (4.11) kromatograafilisele plaadile umbes 1,5 cm kaugusele alumisest servast võimalikult õhukese, kitsa ja ühtlase joonena. Plaat asetatakse hästi küllastunud ilmutusnõusse (4.14) ja proovi ilmutatakse ilmutuslahusega (5.7) tempeatuuril ligikaudu 20 C kuni 1 sentimeetrini plaadi ülemisest servast. Plaati kuivatatakse õhu käes ilmutusnõu temperatuuril ning sellele pihustatakse 2´,7´ diklorofluorestseiini lahust (5.17). Monoglütseriidi vöönd (Rf umbes 0,035) määratakse ultraviolettvalguses (4.20). 8.3. Monoglütseriidide analüüsimine gaasikromatograafiaga Punktis 8.2 saadud vöönd eemaldatakse spaatliga (vältida tuleks nulljoonel olevate komponentide eemaldamist) ning pannakse metüülimiskolbi (4.2). Kogutud silikageel töödeldakse X B lisas kirjeldatud meetodil selliselt, et monoglütseriidid muudetakse metüülestriteks, ning seejärel uuritakse estreid gaasikromatograafiaga, nagu X A lisas kirjeldatud. 9. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE Rasvhappe koostis 2. positsioonis arvutatakse ühe kümnendkoha täpsusega (märkus 3). 10. MÄRKUSED Märkus 1: Lipaasi aktiivsuse kontrollimine Valmistatakse ette emulsioon, milleks loksutatakse sobivas segistis 165 ml kummiaraabiku lahuse (5.21), 15 g purustatud jää ja 20 ml neutraliseeritud õli (5.18) segu. Keeduklaasi (4.5) pannakse 10 ml nimetatud emulsiooni, sellele lisatakse 0,3 ml naatriumkolaadi lahust (5.20) ja 20 ml destilleeritud vett. Keeduklaas pannakse termostaati, mida hoitakse temperatuuril 37 0,5 C (märkus 4); vedelikku pannakse pH-meetri (4.21) elektroodid ning spiraalne segisti (4.22). Büretiga (4.23) lisatakse tilkhaaval naatriumhüdroksiidi lahus (5.19) kuni pH on 8,5. Lisatakse piisav kogus lipaasi vesisuspensiooni (vaata allpool). Kui pH-meetri näit on 8,3, pannakse tööle stopper (4.24) ning katseklaasi tilgutatakse naatriumhüdroksiidilahust (5.19) sellise kiirusega, et pH oleks jätkuvalt 8,3. Kasutatud leeliselahuse maht pannakse kirja iga minuti kohta. Vaatlustulemused märgitakse graafikule, märkides abtsissteljele aja ja ordinaatteljele pH taseme püsimiseks vajaliku leeliselahuse koguse milliliitrites. Selle tulemusel peaks tekkima sirgjoon. Eespool nimetatud lipaasi suspensioon on 1/1 000 (m/m) suspensioon vees. Iga katse puhul tuleks kasutada sellist kogust suspensiooni, et leeliselahust kuluks umbes 1 ml 4-5 minutis. Tavaliselt kulub umbes 1-5 mg pulbrit. Lipaasiühik on selline ensüümikogus, mida on vaja selleks, et vabastada 10 happe -ekvivalenti minutis. Kasutatud pulbri aktiivsus lipaasiühikutes mg kohta saadakse valemiga: [INSERT FORMULA] kus V on naatriumhüdroksiidilahuse (5.19) kulumine minutis (arvutatud graafiku põhjal), m on pulbriproovi mass (mg). Märkus2: Lipaasi ettevalmistamine Müügil on piisava lipaasiaktiivsusega lipaase. Lipaase on siiski võimalik ka laboratooriumis järgmisel viisil valmistada: 5 kg värsket sea kõhunääret jahutatakse temperatuurile 0 C; eemaldatakse ümbritsev tahke rasv ja sidekude ning jahvatatakse segistis kuni taignataolise vedeliku saamiseni. Tekkinud pastat ja 2,5 l veevaba atsetooni segatakse segistiga (4.25) 4-6 tundi ja seejärel tsentrifuugitakse. Jääki ekstraheeritakse veel kolm korda sama koguse atsetooniga, siis kaks korda 1/1 (V/V) atsetooni ja dietüüleetri seguga, ning kaks korda dietüüleetriga. Stabiilse pulbri saamiseks tuleks jääki vaakumis 48 tundi kuivatada ning seejärel tuleks seda hoida külmikus. Märkus3: Rasvhapete üldmass tuleks soovitavalt määrata alati samas proovis, kuna tulemuste tõlgendamine on lihtsam, kui 2. positsioonis olevate hapete määra on võimalik võrrelda rasvhapete üldmassiga. Märkus 4: Vedela õli puhul on hüdrolüüsi temperatuur 37 C. Selleks et uurida kuni 45kraadise sulamistemperatuuriga rasvu, määratakse hüdrolüüsi temperatuuriks 40 C. VIII LISA TRILINOLEIINI SISALDUSE MÄÄRAMINE 1. KOHALDAMISALA Triglütseriidi koostise määramine oliiviõlis nende ekvivalentse süsinikuarvu alusel kõrgrõhuvedelikkromatograafiaga. Käesolevas meetodis kirjeldatakse meetodit, millega on võimalik eraldada ja määrata kvantitatiivselt triglütseriidide koostis taimsetes õlides nende molekulmassi ja küllastumatusastmega ekvivalentse süsinikuarvu funktsioonina (vt märkus 1). 2. KASUTUSVALDKOND Käesolevat meetodit kohaldatakse kõikide pikaahelalisi rasvhapete triglütseriide sisaldavate taimsete õlide suhtes. See meetod sobib eelkõige selleks, et teha valdava küllastamata rasvhappena oleiinhapet sisaldavates taimsetes õlides (näiteks oliiviõli) kindlaks väikeste koguste poolkuivavate õlide (mis sisaldavad palju linoolhapet) esinemine. 3. PÕHIMÕTE Triglütseriidid eraldatakse vastavalt nende ekvivalentsele süsinikuarvule kõrgrõhuvedelikkromatograafiaga (muudetud polaarsus) ja kromatogrammide tõlgendamise teel. 4. SEADMED 4.1. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia, mis võimaldab kolonni temperatuuri reguleerida. 4.2. 10 l süstal injekteerimiseks. 4.3. Detektor: diferentsiaalrefraktomeeter. Kogu mõõtepiirkonna tundlikkus peaks olema vähemalt 10-4 murdumisnäitaja ühikust. 4.4. Kolonnid: roostevabast terasest katseklaas kõrgusega on 250 mm ja sisediameetriga 4,5 mm, kus on 5 m diameetriga ränidioksiidiosakesed, milles on 22-23 % süsinikku oktadeküülsilaani kujul (märkus 2). 4.5. Meerik ja/või integraator. 5. REAKTIIVID Kõik reaktiivid peaksid olema analüütiliselt puhtad. Elueerimislahustid peaksid olema degaseeritud ja neid võib korduvalt kasutada, ilma et see eraldamist mõjutaks. 5.1. Kloroform. 5.2. Atsetoon. 5.3. Atsetonitriil. 5.4. Elueerimislahusti: atsetonitriil + atsetoon (vahekordi tuleb soovitud eraldumise saamiseks kohandada; alustada tuleks 50 : 50 seguga). 5.5. Lahusti: atsetoon või 1 : 1 atsetooni ja kloroformi segu. 5.6. Võrdlustriglütseriidid: võib kasutada müügil olevaid triglütseriidide (tripalmittiin, trioleiin, jne) ning nende peetumisaeg tuleb määrata kooskõlas vastava ekvivalentse süsinikuarvuga, või sojaõli põhjal saadud võrdluskromatogrammi (vt märkus 3 ja 4 ning joonised 1 ja 2). 6. PROOVIDE ETTEVALMISTAMINE Valmistatakse ette uuritava proovi 5 % lahus, milleks kaalutakse 10 ml mõõtekolbi 0,5 0,001 g proovi ja katseklaas täidetakse lahustiga (5.5) kuni 10 ml märgini. 7. TÖÖ KÄIK 7.1. Valmistatakse ette kromatograaf. Kogu süsteemi puhastamiseks pumbatakse sellesse elueerimislahustit (5.4) kiirusega 1,5 ml/mm. Oodatakse, kuni tekib stabiilne nulljoon. Süstitakse 10 l proovi, mis on ette valmistatud vastavalt punktile 6. 8. TULEMUSTE ARVUTAMINE JA ESITAMINE Kasutatakse sisestandardiseerimise meetodit, see tähendab, et eeldatakse, et erinevatele triglütseriidide piikide pindalade summa on 100 %. Vastavate triglütseriidide protsendid arvutatakse järgmise valemiga: [INSERT FORMULA] Tulemus väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega. Märkus 1. Elueerimisjärjekorda võib määrata ekvivalentse süsinikuarvu arvutamise teel, mida väljendab sageli suhe ECN = CN - 2n, kus CN on süsinikuarv ja n on kaksiksidemete arv; seda on võimalik kaksiksideme päritolu arvesse võttes täpsemalt arvutada. Kui n0, n1 ja n1n on vastavalt oleiinhappe, linoolhappe ja linoleenhappe kaksiksidemete arvud, on ekvivalentseid süsinikuarvusid võimalik arvutada järgmise valemiga: ECN = CN - dono - d1n1 - d1nn1n kus koefitsiente do, d1 ja d1n on võimalik arvutada võrdlustriglütseriididega. Käesolevas meetodis täpsustatud tingimustel sarnaneb valem järgmise valemiga: ECN = CN - [2,60 no] - [2,35 n1] - [2,17 n1n] Märkus 2. Näited: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333; Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 või samaväärne. Märkus 3. Mitme võrdlustriglütseriidiga on võimalik arvutada trioleiini resolutsioon. = RT' / RT'oleiin kasutades korrigeeritud peetumisaega RT´ = RT - RTlahusti. Graafik log muutumine (kaksiksidemete arv) funktsioonina võimaldab määrata kindlaks kõikide võrdlustrigütseriidides sisalduvate rasvhapete triglütseriidide peetumisväärtuse (vt joonis 2). Märkus 4. Kolonn peab olema nii tõhus, et trilinoleiini piik eristub selgelt nende triglütseriidide piikidest, mille peetumisaeg on peaaegu sama. Joonis 1 Sojaõli proovi kromatogramm [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] Monoglütseriidid and diglütseriidid P = palmitiinhape St = steariinhape O = oleiinhape L = linoolhape ln = linoleenhape Joonis 2 Graafik log muutumine (kaksiksidemete arvu) funktsioonina [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] Kaksiksidemete arv (n) La = lauriinhape My = müristiinhape P = palmitiinhape St = steariinhape O = oleiinhape L = linoolhape Ln = linoleenhape IX LISA SPEKTROFOTOMEETRILINE ANALÜÜS ULTRAVIOLETTPIIRKONNAS EESSÕNA Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas võib anda teavet rasva kvaliteedi, selle säilivuse ja tehnoloogilistest protsessidest tulenevate muutuste kohta. Käesolevas meetodis kirjeldatud lainepikkustel esinev neeldumine on tingitud konjugeeritud dieeni ja trieeni süsteemide olemasolust. Need neeldumised on väljendatud eri-ekstinktsioonina E1 %1 cm (ekstinktsioon, mis leiab aset teatud lahustist valmistatud 1protsendilise rasvalahuse 1 cm paksuses kihis), mida tavaliselt väljendatakse tähisega K (samuti tuntud ekstinktsiooni koefitsiendina). 1. KOHALDAMISALA Käesolevas meetodis kirjeldatakse oliiviõli spektrofotomeetrilist analüüsi ultraviolettpiirkonnas. 2. PÕHIMÕTE Rasv lahustatakse ettenähtud lahustis ja lahusti ekstinktsioon määratakse kindlaks teatud lainepikkusel kasutades võrdluslahusena puhast lahustit. Üksikekstinktsioonid arvutatakse spektrofotomeetri tulemuste põhjal. 3. VAHENDID 3.1. Spektrofotomeeter ekstinktsiooni mõõtmiseks ultraviolettpiirkonnas 220-360 nm vahel, mis võimaldaks tulemusi märkida ühe nanomeetri täpsusega. 3.2. Risttahukakujulised kaanega kvartsküvetid optilise pikkusega 1 cm. Vee või mõne muu sobiva lahustiga täitmise korral ei tohiks küvettide tulemuste erinevus olla suurem kui 0,01 ekstinktsiooniühikut. 3.3. 25 ml mõõtekolvid. 3.4. Kromatograafia kolonn, pikkusega 450 mm ja läbimõõduga 35 mm, väljalasketoru läbimõõduga umbes 10 mm. 4. REAKTIIVID 4.1. Spektrofotomeetriliselt puhas iso-oktaan (2,2,4-trimetüülpentaan). Võrreldes destilleeritud veega peab selle läbitustegur olema vähemalt 60 % 220 nm juures ja mitte alla 95 % 250 nm juures, või - spektrofotomeetriliselt puhas tsükloheksaan: võrreldes destilleeritud veega peab selle läbitustegur olema vähemalt 40 % 220 nm juures ja mitte alla 95 % 250 nm juures, või - muu sobiv lahusti, milles rasv täielikult lahustub (näiteks etanool või kastoorõli). 4.2. Aluseline alumiiniumoksiid kolonnkromatograafia jaoks, mis on valmistatud ja kontrollitud, nagu I liites kirjeldatud. 4.3. n-heksaan kromatograafia jaoks. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. Kõnealune proov peab olema täiesti homogeenne ja heljuvate lisanditeta. Ümbritseva õhu temperatuuril vedelad õlid filtreeritakse läbi paberi temperatuuril ligikaudu 30 C, tahked rasvad homogeniseeritakse ja filtreeritakse temperatuuril, mis võib olla rasva sulamistemperatuurist kuni 10 C kõrgem. 5.2. 25 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,25 g eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud proovi, täidetakse kuni märgini ettenähtud lahustiga ning homogeniseeritakse. Tekkiv lahus peab olema täiesti selge. Opalestsentsi või hägususe korral tuleb proov kiiresti läbi paberi filtreerida. 5.3. Küvett täidetakse saadud lahusega ning ekstinktsioonid mõõdetakse nõutavatel lainepikkustel vahemikus 232-276 nm, kasutades selleks võrdluslahustina kasutatud lahustit. Registreeritud ekstinktsiooniväärtused peavad jääma vahemikku 0,1-0,8. Vastasel korral tuleb mõõtmisi korrata ja kasutada vajaduse korral suurema kontsentratsiooniga või rohkem lahjendatud lahuseid. 5.4. Kui pärast alumiiniumoksiidiga töötlemist on vaja määrata konkreetne ekstinktsioon, tehakse seda järgmiselt. Kromatograafia kolonni pannakse 30 grammi aluselist alumiiniumoksiidi heksaani suspensioonis. Pärast adsorbendi settimist eemaldatakse üleliigne heksaan selliselt, et seda on alumiiniumoksiidi peal umbes 1 cm. 10 g rasva, mis on punktis 5.1 kirjeldatud viisil homogeniseeritud ja filtreeritud, lahustatakse 100 ml heksaanis ning lahus valatakse kolonni. Eluaat kogutakse kokku ning lahusti aurustatakse vaakumi all temperatuuril alla 25 C. Saadud rasva kasutades järgitakse punktis 5.2 kirjeldatud korda. 6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE 6.1. Registreeritakse individuaalsed ekstinktsioonid (ekstinktsiooni koefitsiendid) eri lainepikkustel, mis arvutatakse järgmise valemi alusel: [INSERT FORMULA] kus K on konkreetne ekstinktsioon lainepikkusel ; E on ekstinktsioon lainepikkusel ; c on lahuse kontsentratsioon g/100 ml; s küveti paksus (cm). Tulemused väljendatakse kahe kümnendikkoha täpsusega. 6.2. Oliiviõli spektrofotomeetriline analüüs kooskõlas EMÜ ametliku meetodiga näeb ette konkreetse ekstinktsiooni määramise iso-oktaani lahuses lainepikkusel 232 ja 270 nm ning K määramist järgmise valemiga: [INSERT FORMULA] kus Km on konkreetne ekstinktsioon lainepikkusel m, maksimaalse neeldumise lainepikkus on umbes 270 nm. I LIIDE Alumiiniumoksiidi ettevalmistamine ja selle aktiivsuse kontrollimine A.1.1. Alumiiniumoksiidi ettevalmistamine Ahjus temperatuuril 380-400 C kolm tundi enne kuivatatud alumiiniumoksiid asetatakse hermeetiliselt suletavasse mahutisse, lisatakse destilleeritud vett 5 ml iga 100 g alumiiniumoksiidi kohta, seejärel suletakse mahuti kohe, loksutatakse korduvalt ning lastakse enne kasutamist vähemalt 12 tundi seista. A.1.2. Alumiiniumoksiidi aktiivsuse kontrollimine 30 grammi alumiiniumoksiidiga valmistatakse ette kromatograafia kolonn. Toimitakse, nagu lõikes 5.4 kirjeldatud, ning läbi kolonni lastakse segu, mis koosneb: - 95 % neitsioliiviõlist, mille konkreetne ekstinktsioon on 268 nm juures alla 0,18, -5 % maapähkliõlist, mida on rafineerimise ajal aktiivmullaga töödeldud ja mille konkreetne ekstinktsioon on 268 nm jooksul mitte vähem kui 4. Kui segu konkreetne ekstinktsioon on pärast kolonni läbimist 268 nm juures üle 0,11, on alumiiniumoksiid sobiv, kui ei, tuleb dehüdraatimise taset suurendada. II LIIDE Spektrofotomeetri kalibreerimine A.2. Seadmeid tuleb korrapäraselt (vähemalt iga kuue kuu järel) kontrollida nii lainepikkuse vastavuse kui täpsuse suhtes. A.2.1. Lainepikkust võib kontrollida elavhõbe-kvartslambi või sobivate filtritega. A.2.2. Fotoelemendi ja fotokordisti tulemusi kontrollitakse järgmiselt: 1 000 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,2000 g puhast kaaliumkromaati, see lahustatakse 0,05 N kaaliumhüdroksiidi lahuses ning täidetakse kuni 1 000 ml märgini. Seejärel võetakse 25 ml saadud lahust, kantakse 500 ml mõõtekolbi, ning täidetakse sama kaaliumhüdroksiidi lahusega märgini. Saadud lahuse ekstinktsioon mõõdetakse 275 nm juures, kasutades võrdluslahusena kaaliumhüdroksiidi lahust. 1 cm küvetiga mõõtmisel peaks ekstinktsioon olema 0,200 0,5000. X A LISA RASVHAPETE METÜÜLESTRITE GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS 1. KOHALDAMISALA Käesoleva meetodiga antakse üldjuhised täidetud või kapilaarkolonniga gaaskromatograafia kohaldamiseks kooskõlas X B lisaga saadud rasvhapete metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise kindlakstegemisel. Seda meetodit ei kohaldata polümeriseeritud rasvhapete suhtes. 2. REAKTIIVID 2.1. Kandegaas Inertgaas (lämmastik, heelium, argoon, vesinik), põhjalikult kuivatatud ja hapnikusisaldusega kuni 10 mg/kg. Märkus 1. Vesinik, mida kasutatakse kandegaasina ainult kapilaarkolonnidega, võib analüüsi kiirust kahekordistada, kuid on ohtlik. Saadaval on ohutusseadmed. 2.2. Abigaasid 2.2.1. Lämmastik (puhtus 99,9 %), orgaaniliste lisanditeta. 2.2.2. Õhk või hapnik, orgaaniliste lisanditeta. 2.3. Võrdlusstandard Puhaste rasvhapete metüülestrite segu või teadaoleva, eelistatult analüüsitava rasvainega sarnase koostisega rasva metüülestrid. Tuleb tagada, et polüküllastumata rasvhapped ei oksüdeeruks. 3. SEADMED Juhendid käsitlevad tavapäraseid gaasikromatograafia seadmeid, rakendades täidetud ja/või kapillaarkolonne ja leekionisatsioonidetektorit. Sobivad kõik punktis 4.1.2 nimetatud efektiivsuse ja resolutsiooniga seadmed. 3.1. Gaasikromatograaf Gaasikromatograaf koosneb järgmistest elementidest. 3.1.1. Sissepritsesüsteem Kasutatakse sissepritsesüsteemi, millel on: a) täidetud kolonnid, väikseima võimaliku tühimahuga (sellisel juhul peab sissepritsesüsteemi olema võimalik kuumutada 20-50 °C kuumemaks kui kolonni); või b) kapillaarkolonnid, sellisel juhul peab sissepritsesüsteem olema spetsiaalselt vastavaks otstarbeks kavandatud. See võib olla jaotatud või jaotamata vooluga injektor. Märkus 2. Vähem kui 16 süsinikuaatomiga rasvhapete puudumise korral võib kasutada liikuva nõelaga injektorit. 3.1.2. Ahi Kolonni peab olema võimalik ahjus kuumutada vähemalt temperatuurini 260 C ning ahi peab soovitud temperatuuri hoidma täidetud kolonniga 1 C ja kapillaarkolonniga 0,1 C täpsusega. Viimane nõue on eriti oluline juhul, kui kasutatakse kvartsklaasist kolonni. Temperatuuriregulaatoriga kuumutamine on kõikidel juhtudel soovitav, eelkõige rasvhapete puhul, millel on vähem kui 16 süsinikuaatomit. 3.1.3. Täidetud kolonn 3.1.3.1. Kolonn, analüüsitava ainega inertsest materjalist (klaasist või roostevabast terasest), millel on järgmised mõõtmed. a) pikkus: 1-3 m. Kui esineb pikaahelalisi rasvhappeid (üle C20), tuleks kasutada suhteliselt lühikest kolonni. 4-6 süsinikuaatomiga hapete analüüsimisel on soovitav kasutada 2 m pikkust kolonni; b) sisediameeter: 2-4 mm. Märkus 3. Kui esineb rohkem kui kolme kaksiksidemega polüküllastumata komponente, võib need lagundada roostevabast terasest kolonnis. Märkus 4. Kasutada võib kahe täidetud kolonniga süsteemi. 3.1.3.2. Täitmine, kasutatakse järgmisi komponente: a) tugiaine: happega pestud ja silaanitud kobediatomiit või muu sobiv inertne kandegaas, millel on kitsas terasuuruste väärtus (25 m ulatus 125-200 m) ning tera keskmine suurus on seotud kolonni sisediameetri ja pikkusega; b) statsionaarne faas: polüestri tüüpi polaarne vedelik (nt detüleen-glükool-polüsuktsinaat, butanediool-polüsuktsinaat, etüleenglükool-polüadipaat jne), tsüanosilikoonid või mõni muu vedeldi, mis võimaldab vajaliku kromatograafilist eraldamist (vt punkt 4). Statsionaarse faasi osakaal peaks kolonni täitmisest moodustama 5-20 %. Teatavate eraldamiste puhul võib kasutada ka mittepolaarset statsionaarset faasi. 3.1.3.3. Kolonni tasakaalustamine Kui kolonn on võimaluse korral detektorist eraldatud, kuumutatakse ahju järk-järgult temperatuurini 185 C ning vahetult ettevalmistatud kolonni lastakse sellel temperatuuril vähemalt 16 tunni jooksul inertgaasi vool kiirusega 20-60 ml/min ja täiendavalt 2 tunni jooksul temperatuuril 195 C. 3.1.4. Kapillaarkolonn 3.1.4.1. Katseklaas, mis on valmistatud analüüsitava ainega inertsest materjalist (tavaliselt klaas või kvartsklaas). Sisediameeter on 0,2-0,8 mm. Sisekülge tuleb enne statsionaarse faasi kihiga katmist nõuetekohaselt töödelda (nt pinna ettevalmistamine, inaktiveerimine). Enamikul juhtudel on piisavaks pikkuseks 25 mm. 3.1.4.2. Statsionaarne faas, tavaliselt polüglükooli (polü(etüleenglükool)20 000), polüestri (butanediool-polüsuktsinaat) või polaar-polüsiloksaani (tsüanosilikoonide) tüüpi. Sobivad seotud (võrkstruktuuriga) kolonnid. Märkus 5. Polaar-polüsiloksaanid võivad raskendada linoleenhappe ja C20 hapete identifitseerimist ja eraldamist. Kiht peab olema õhuke, st 0,1-0,2 m. 3.1.4.3. Kolonni monteerimine ja tasakaalustamine Järgitakse kapilaarkolonnide tavapäraseid ettevaatusabinõusid, st kolonni asetust ahjus (tugirajatised), liitekohtade valik ja paigaldus (lekkekindlus), kolonni otste asetus injektoris ja detektoris (võimalikult vähe tühja ruumi). Läbi kolonni juhitakse kandegaas (nt 0,3 baari (30 kPa) läbi 25 mm pikkuse ja 0,3 mm sisediameetriga kolonni). Kolonn tasakaalustatakse ahju reguleerides selliselt, et temperatuur tõuseb ümbritseva õhu temperatuurilt 3 C minutis, saavutades sellise temperatuuri, mis on 10 C madalam kui statsionaarse faasi hajumistemperatuur. Ahju hoitakse sellisel temperatuuril tund aega, kuni nulljoon stabiliseerub. Temperatuuri alandatakse taas tagasi 180 C-le ja katset jätkatakse isotermilistel tingimustel. Märkus 6. Nõuetekohaselt tasakaalustatud kolonnid on müügil. 3.1.5. Detektor, mida on soovitavalt võimalik kuumutada temperatuurini, mis on kolonni omast kõrgem. 3.2. Süstal Süstla ülemine mõõtepiir on 10 ml ning mõõtskaala jagatud 0,1-milliliitristeks ühikuteks. 3.3. Meerik Kui meeriku kõverat kasutatakse analüüsitava segu koostise arvutamiseks, on vaja väga täpset elektrimeerikut, mis sobib kokku kasutatavate seadmetega. Meerikul peavad olema järgmised omadused: a) vastamisaeg alla 1,5 s, soovitavalt 1 s (vastamisaeg on aeg, mis kulub meeriku nõelal liikumiseks vahemikus 0-90 % pärast seda kui ootamatult antakse 100 % signaal; b) paberi laius, vähemalt 20 cm; c) paberi kiirus, mida on võimalik kohandada kiiruseni 0,4-2,5 cm/min. 3.4. Integraator Elektroonilise integraatoriga on võimalik kiiresti ja täpselt arvutada. Elektroonilise integraatoriga on võimalik saavutada piisava tundlikkusega lineaarne vastus ning nulljoone kõrvalekalde korrektsioon on rahuldav. 4. TÖÖ KÄIK Punktides 4.1-4.3 kirjeldatud toimingud käsitlevad leekionisatsioonidetektori kasutamist. Kasutada võib ka gaasikromatograafi, milles on kataromeeter (töötab soojusjuhtivuse põhimõttel). Töötingimusi kohandatakse, nagu punktis 6 kirjeldatud. 4.1. Katsetingimused 4.1.1. Optimaalsete töötingimuste valik 4.1.1.1. Täidetud kolonn Katsetingimuste valimisel tuleks arvesse võtta järgmisi muutujaid: a) kolonni pikkus ja diameeter; b) statsionaarse faasi laad ja kogus; c) kolonni temperatuur; d) kandegaasi vool; e) nõutav resolutsioon; f) katsekoguse suurus, mis on valitud selliselt, et detektor ja elektromeeter annavad lineaarse tulemuse; g) analüüsi kestus. Tavaliselt annavad tabelis 1 ja 2 esitatud väärtused soovitud tulemuse, st vähemalt 2 000 teoreetilist plaati ühe kolonnimeetri kohta metüülstearaadile selle elueerimiseks 15 minutiga. Kui seadmed võimaldavad, peaks injektor olema temperatuuril ligikaudu 200 C ja detektor kolonni temperatuuriga võrdsel või kõrgemal temperatuuril. Sõltuvalt kolonni diameetrist on leekionisatsioonidetektorisse suunatud lämmastiku voolukiiruse suhe võrreldes kandegaasi omaga reeglina 1 : 2 kuni 1 : 1. Hapniku voolukiirus on umbes 5-10 korda vesiniku omast kiirem. Tabel 1 Kolonni sisediameeter mm Kandegaasi voolukiirus ml/min 2 15-25 3 20-40 4 40-60 Tabel 2 Statsionaarse faasi kontsentratsioon % (m/m) Kolonni temperatuur C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapillaarkolonn Kapillaarkolonni tõhusus- ja täituvusomadused tingivad selle, et koostisosade eraldamine ja analüüsi kestvus sõltuvad suuresti kandegaasi voolukiirusest kolonnis. Seetõttu on vaja töötingimusi optimeerida, muutes seda parameetrit (ehk kolonni survekadu) sõltuvalt sellest, kas soovitakse tõsta eraldamise kvaliteeti või muuta analüüsid kiiremaks. 4.1.2. Teoreetiliste plaatide arvu (tõhususe) ja resolutsiooni määramine (vt joonis 1). Tehakse võrdsetes kogustes oleva metüülstearaadi ja metüüloleaadi segu analüüs (näiteks kakaovõis olevad metüülestrid). Kolonni temperatuur ja kandegaasi voolukiirus valitakse selliselt, et umbes 15 minutit pärast lahusti piigi registreerimist registreeritakse võimalikult suur metüülstearaadi piik. Kasutada tuleb piisavat kogust metüülestrite segu, mis võimaldab metüülstearaadi piigil moodustada kogu skaalast. Arvutatakse teoreetiliste plaatide arv, n (tõhusus), kasutades järgmist valemit: [INSERT FORMULA] ja resolutsioon, R, kasutades valemit: [INSERT FORMULA] kus dr1 on peetumisdistants millimeetrites, kromatogrammi algusest kuni metüülstearaadi piigi maksimumini; 1 ja 2 on vastavalt metüülstearaadi ja metüüloleaadi piigilaiused millimeetrites, mis mõõdetakse kohas, kus piigikõvera lõikepunktid lõikuvad nulljoonega; D on metüülstearaadi ja metüüloleaadi piigimaksimumide distants millimeetrites. Joonis 1 Kromatogramm teoreetiliste plaatide arvu (tõhususe) ja resolutsiooni määramiseks. [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] Alguspunkt Õhk Lahusti Metüülstearaat Metüüloleaat Töötingimused tuleb valida selliselt, et metüülstearaadi jaoks saadakse vähemalt 2 000 teoreetilist plaati kolonnimeetri kohta ning resolutsioon on vähemalt 1,25. 4.2. Katsekogus Süstlaga (3.2) võetakse 0,1-2 l metüülestrite lahust, mis on valmistatud kooskõlas X B lisaga, ning süstitakse kolonni. Kui estrid ei ole lahusena, valmistatakse ligikaudu 100 mg/ml kromatograafilise kvaliteediga heptaanilahust ja süstitakse seda lahust 0,1-1 ml. Kui analüüsi käigus määratakse koostisosi, mida on vähe, võib katsekogust suurendada (kuni kümnekordseks). 4.3. Analüüs Üldjuhul on töötingimused sellised, nagu punktis 4.1.1 kirjeldatud. Siiski on võimalik töötada ka madalama kolonnitemperatuuriga juhul, kui on vaja määrata rasvhappeid, millel on vähem kui 12 süsinikuaatomit, või kõrgemal temperatuuril, kui on vaja määrata rasvhappeid, millel on rohkem kui 20 süsinikuaatomit. Nendel juhtudel on võimalik kasutada temperatuuri programmeerimist. Näiteks kui proov sisaldab rasvhapete metüülestreid, millel on vähem kui 12 süsinikuaatomit, süstitakse proov temperatuuril 100 C (või 50-60 C võihapet) ja tõstetakse kohe temperatuuri 4-8 C võrra minutis, kuni saavutatakse optimaalne temperatuur. Teatavatel juhtudel on neid kahte meetodit võimalik ühendada. Pärast programmeeritud kuumutamist jätkatakse elueerimist püsival temperatuuril, kuni kõik komponendid on elueeritud. Kui seade ei võimalda programmeeritud kuumutamist, kasutatakse kahte 100-195 C vahel olevat kindlaksmääratud temperatuuri. Vajaduse korral soovitatakse teha analüüs kahel erineva polaarsusega kindlaksmääratud faasil, et kontrollida varjatud piigi puudumist, näiteks kui proovis on üheaegselt konjugeeritud C18:3 ja C20:0, või C18:3 ja C18:2. 4.4. Võrdluskromatogrammi ja -graafikute ettevalmistamine Analüüsitakse võrdlusstandardi lahust (2.3), kasutades selleks samu töötingimusi nagu proovi puhul, ning mõõdetakse lahuse rasvhapete peetumisajad või peetumisdistantsid. Iga küllastamatusmäära kohta konstrueeritakse poollogaritmilisel paberil graafikud, kus oleks süsinikuaatomite arvu funktsioonina näha peetumisaja või -distantsi logaritm. Isotermilistel tingimustel peaksid sama küllastamatusmääraga hargnemata ahelaga hapete graafikuteks olema sirgjooned. Need jooned peaksid olema enam-vähem paralleelsed. Tuleks vältida tingimusi, milles võib esineda varjatud piike, st kus resolutsioon ei ole kahe koostisosa eraldamiseks piisav. 5. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE 5.1. Kvalitatiivne analüüs Proovi metüülestripiigid määratakse proovis punktis 4.4 koostatud graafikutega, vajaduse korral interpolatsiooni abil. 5.2. Kvantitatiivne analüüs 5.2.1. Koostise määramine Välja arvatud erandjuhud, kasutatakse sisemise normaliseerimise meetodit, st oletatakse, et kromatogrammil on kõik proovi koostisosad ja kogu piigi pindala vastab koostisosadele 100protsendiliselt (täielik elueerumine). Kui seadmed sisaldavad ka integraatoreid, kasutatakse integraatoriga saadud tulemusi. Kui integraator puudub, määratakse konkreetsed piigipindalad piigi kõrguse korrutamisega piigi laiusega kõrguse keskkohas, vajaduse korral võetakse arvesse erinevaid registreerimise ajal kasutatud sumbumisi. 5.2.2. Arvutamine 5.2.2.1. Üldjuhul Teatava komponendi i sisaldus väljendatuna metüülestrite massiprotsendina arvutatakse selliselt, et määratakse piigipindala suhteline osa kõikide piikide pindalast järgmise valemi alusel. [INSERT FORMULA] kus Ai on komponendi i piigipindala; A on piikide pindala summa. Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega. Märkus 7: Üldjuhul põhineb arvutustulemus sellel, et suhtelised pindalad vastavad massi protsentuaalsetele suhtetele. Kui seda üldistust ei saa kohaldada, vaadata punkti 5.2.2.2. 5.2.2.2. Parandustegurite kasutamine Teatavatel juhtudel, näiteks kui rasvhapetes on vähem kui kaheksa süsinikuaatomit või kui happes on sekundaarsed rühmad, või kui kasutatakse soojusjuhtivuse detektorit või kui on vaja maksimaalset täpsust, tuleks kasutada parandustegurit, et arvestada piigipindalade protsent ümber komponentide massiprotsentideks. Parandustegur määratakse kindlaks kromatogrammiga, mis saadakse teadaoleva koostisega metüülestrite võrdlussegu analüüsimisel proovi töötingimustega samadel töötingimustel. Selle võrdlussegu komponendi i massiprotsent määratakse järgmise valemiga: [INSERT FORMULA] kus mi on komponendi i massi võrdlussegus; m on võrdlussegu erinevate komponentide üldmass. Võrdlussegu (4.4) kromatogrammi alusel arvutatakse komponendi i protsent (pindala/pindala) järgmiselt: [INSERT FORMULA] kus Ai on komponendi i piigipindala; A on piikide pindalade summa. Parandustegur arvutatakse järgmiselt: [INSERT FORMULA] Tavaliselt väljendatakse parandustegureid suhtes KC16-ga, nii et parandustegurid on järgmised: [INSERT FORMULA] Proovi iga komponendi i määr metüülestrite massiprotsendina on järgmine: [INSERT FORMULA] Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega. 5.2.2.3. Sisestandardi kasutamine Teatavate analüüside puhul (nt kui kõikide rasvhapete määr ei ole teada, juhul kui nelja ja kuue süsinikuga hapete kõrval esinevad ka 16 ja 18 süsinikuga happed, või kui on vaja määrata proovis olevate rasvhapete absoluutsumma) on vaja kasutada sisestandardit. Sageli kasutatakse viie, 15 või 16 süsinikuga rasvhappeid. Tuleks kindlaks määrata sisestandardi parandustegur (juhul kui see on vajalik). Komponendi i massiprotsent väljendatuna metüülestritena, arvutatakse valemiga: [INSERT FORMULA] kus Ai on komponendi i piigipindala; As on sisestandardi piigipindala; K´i on komponendi iparandustegur (suhtes KC16-ga); K´i on sisestandardi parandustegur (suhtes KC16-ga); m on katsekoguse mass (mg); ms on sisestandardi mass (mg). Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega. 6. ERIJUHT - KATAROMEETRI KASUTAMINE (SOOJUSJUHTIVUSE MUUTUSTE PÕHIMÕTTEL) Rasvhappe metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise määramisel võib kasutada gaasikromatograafi, milles on soojusjuhtivuse muutuste põhimõttel töötav detektor (kataromeeter). Kataromeetri kasutamisel tuleb lõike 3 ja 4 tingimusi tabeli 3 alusel kohandada. Kvantitatiivse analüüsi puhul tuleb kasutada punktis 5.2.2.2 määratletud parandustegureid. Tabel 3 Muutujad Väärtus/tingimus Kolonn Pikkus: 2-4 m Sisediameeter: 4 mm Tugiaine Tera suurus 160-200 m Statsionaarse faasi kontsentratsioon 15-25 % (m/m) Kandegaas Heelium või selle puudumisel vesinik, võimalikult madala hapnikusisaldusega Abigaasid Puuduvad Injektori temperatuur 40-60 C kolonni temperatuurist kõrgem Kolonni temperatuur 180-200 °C Kandegaasi vool Tavaliselt 60-80 ml/min Süstitava katsekoguse suurus Tavaliselt 0,5-2 l 7. KATSEPROTOKOLL Katseprotokolli märgitakse metüülestrite valmistamisel ja gaasikromatograafilisel analüüsimisel kasutatud meetodid ning saadud tulemused. Selles märgitakse samuti kõik üksikasjad, mida ei ole nimetatud käesolevas rahvusvahelises standardis või mis on valikulised, samuti üksikasjad tulemust mõjutada võinud asjaolude kohta. Analüüsiprotokoll sisaldab kõiki proovi täielikuks tuvastamiseks vajalikke andmeid. X B LISA RASVHAPETE METÜÜLESTRITE ETTEVALMISTAMINE KOOSKÕLAS MÄÄRUSE (EMÜ) nr 72/77 VI LISA I JA II JAOTISEGA VÕI ALLJÄRGNEVALT KIRJELDATUD MEETODIGA EESSÕNA Protsessi valik sõltub uuritava rasvaine happekoostisest ja happesusest ning tehtavast gaasikromatograafilisest analüüsist. Täpsemalt tähendab see järgmist: - rasvainete puhul, mis sisaldavad kuni 12 süsinikuaatomiga rasvhappeid, sobivad ainult suletud anumas toimuvad protsessid või protsessid, milles kasutatakse dimetüülsulfaati, - rasvainete puhul, mille happesus on üle 3 %, sobivad ainult need protsessid, kus kasutatakse metanooli, soolhapet või metüülsulfaati, - trans-isomeeride gaasikromatograafiliseks mõõtmiseks sobivad ainult need protsessid, milles kasutatakse naatriummetülaati või dimetüülsulfaati, - metüülestrite valmistamisel väikestest rasvainekogustest, mis on eraldatud planaarkromatograafiaga, sobivad protsessid, milles kasutatakse metanooli, heksaani või väävelhapet. Seebistumatute komponentide esinemist ei pea arvesse võtma juhul, kui nende kogus ei ületa 3 %, vastasel juhul tuleb metüülestrid valmistada rasvhapetest. 1. RAKENDUSALA JA -ULATUS Kirjeldatakse viit protsessi, mille käigus valmistatakse rasvainetest metüülestreid koos: a) naatriummetülaadiga; b) naartriummetülaadiga suletud anumas; c) metanooli ja soolhappega suletud anumas; d) dimetüülsulfaadiga; e) metanooli, heksaani ja väävelhappega. Protsess A 2. PÕHIMÕTE Analüüsitavat rasvainet kuumutatakse püstjahutiga kolvis metanooli ja naatriummetülaadiga. Saadud metüülestrid ekstraheeritakse etüüleetriga. 3. SEADMED 3.1. 100 ml püstjahutiga ja lihvühendusega kolb, mille peal on kaltsiumkloriiditoru. 3.2. 50 ml mõõtesilindrid. 3.3. 5 ml mõõtepipett, skaalajaotise väärtusega 0,1 ml. 3.4. 250 ml jaotuslehtrid. 3.5. 200 ml kolb. 4. REAKTIIVID 4.1. Veevaba metanool. 4.2. Naatriummetülaadi 15 % lahus metanoolis; selleks lahustatakse 100 ml veevabas metanoolis 0,34 g metallilist naatriumi. 4.3. Etüüleeter. 4.4. 10 % naatriumkloriidi lahus. 4.5. 40-60 C petrooleeter. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. 100 ml kolbi pannakse 2 g rasvainet, mis on enne naatriumsulfaadil kuivatatud ja filtreeritud. Lisatakse 35 ml metanooli, paigaldatakse kondensaator ning kolbi keedetakse mõni minut püstjahuti all. 5.2. Kuumutamine lõpetatakse, eemaldatakse kondensaator ning lisatakse kiiresti 3,5 ml naatriummetülaadi lahust; kondensaator pannakse tagasi ning lahust keedetakse püstjahutis vähemalt kolm tundi. Metüülimine on lõppenud, kui kogu rasvaine on veeldatud ja reaktiivisegu on toatemperatuuril täiesti selge. 5.3. Kolb jahutatakse ning reaktiivisegu kallatakse 250 ml jaotuslehtrisse, lisatakse 35-40 ml etüüleetrit, 100 ml vett ja 5-6 ml 10protsendilist naatriumkloriidi lahust. Loksutatakse ning kihtidel lastakse eralduda. Vesifaas viiakse teise jaotuslehtrisse ning ekstraheeritakse veel kord 25 ml etüüleetriga. Koondatud etüüleetri ekstraktidele lisatakse 50 ml 40-60 C petrooleetrit. Eraldub vesi ning seda on võimalik eemaldada. Seejärel pestakse eetrifaasi kolm korda 10-15 ml veega, kuivatatakse naatriumsulfaadil, filtreeritakse läbi paberi ning filtraat kogutakse 200 ml kolbi. Lahustit aurustatakse veevannil puhta lämmastiku voolus seni, kuni seda on 20 ml. Protsess B 2. PÕHIMÕTE Analüüsitavat rasvainet töödeldakse naatriummetülaadiga metanoolilahuses, kaanega anumas temperatuuril 85-90 C. 3. SEADMED 3.1. Tugevad klaasist anumad, mille maht on ligikaudu 5 ml (kõrgus 40-45 mm, diameeter 14-16 mm). 3.2. 1 ml mõõtesilinder, skaalajaotise väärtusega 0,1 ml. 4. REAKTIIVID 4.1. Naartiummetülaadi 1,5 % metanoolilahus. Selleks lahustatakse 100 ml veevabas metanoolis 0,50 g metallilist naatriumi. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. 2 g klaasanumasse pannakse 2 ml rasvainet, mis on enne naatriumsulfaadiga kuivatatud ja filtreeritud. Lisatakse 0,3 g (ligikaudu 0,4 ml) naatriummetülaadi lahust ja anuma kaas kuumutatakse kinni. 5.2. Anumat kuumutatakse kaks tundi temperatuuril 85-90 C, loksutades seda aeg-ajalt. Esterdamine on lõppenud, kui anuma sisu on pärast glütseriini ja reaktiivide jäägi sadestumist selge. 5.3. Jahutatakse toatemperatuuril. Anum avatakse alles siis, kui hakatakse kasutama metüülestreid. Metüülestreid ei ole vaja enne gaasikromatograafi panemist täiendavalt töödelda. Protsess C 2. PÕHIMÕTE Analüüsitavat rasvainet töödeldakse suletud anumas soolhappemetülaadiga temperatuuril 100 C. 3. SEADMED 3.1. Tugevad klaasanumad mahuga ligikaudu 5 ml (kõrgus 40-45 mm, diameeter 14-16 mm). 3.2. 1- ja 2-milliliitrised kalibreeritud pipetid. 4. REAKTIIVID 4.1. Soolhappe lahus 2protsendilises metanoolis. Valmistatakse gaasilisest soolhappest ja veevabast metanoolist (märkus 1). 4.2. Heksaan gaasikromatograafiaks. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. Klaasanumasse pannakse 0,2 g enne naatriumsulfaadil kuivatatud ja filtreeritud rasvainet ja 2 ml soolhappe ja metanooli lahust. Anum kuumutatakse kinni. 5.2. Anumat kuumutatakse temperatuuril 100 C 40 minutit. 5.3. Anumat jahutatakse jooksva vee all, avatakse, lisatakse 2 ml destilleeritud vett ja 1 ml heksaani. Tsentrifuugitakse ja eemaldatakse heksaanifaas, mis on kasutamiseks valmis. Protsess D 2. PÕHIMÕTE Analüüsitav rasvaine seebistatakse kaaliumhüdroksiidi metanoolilahusega ning töödeldakse dimetüülsulfaadiga. Soolhappe lisamisel eraldatakse automaatselt tekkinud metüülestrid. Pärast alumiiniumoksiidiga töötlemist saadakse väga puhtad metüülestrid. 3. SEADMED 3.1. Tugev katseklaas, mille maht on ligikaudu 20 ml ning millel on 10/19 lihvkork ja kaitseklambrid. 3.2. Püstjahutid, 10/19 lihvühendusega. 3.3. Klaasfiltrid, millel on paagutatud ketas, suurus G 2 ja läbimõõt 20 mm. 3.4. Ligikaudu 10-milliliitrised koonilise põhjaga klaasist katseklaasid. 3.5. 1- ja 5-milliliitrised süstlad. 4. REAKTIIVID 4.1. Kaaliumhüdroksiid, 10 % metanoolilahus gaasikromatograafia jaoks. 4.2. Bromokresoolroheline indikaator: 0,05 % metanoolilahus. 4.3. Dimetüülsulfaat (p = 1,335 temperatuuril 15 C). 4.4. Kontsentreeritud soolhape (p = 1,19) lahjendatud 1 : 1 vahekorras metanooliga gaasikromatograafia jaoks. 4.5. Alumiiniumoksiid, mida on standarditud vastavalt Brockmannile adsorptsiooni kromatograafia jaoks. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. 20milliliitrisesse katseklaasi pannakse 2,2 ml rasvainet, mis on enne naatriumsulfaadiga kuivatatud ja filtreeritud. Lisatakse 5 ml kaaliumhüdroksiidi lahust ja mõned kvartsigraanulid keemise kontrollimiseks. Kinnitatakse püstjahuti ja kuumutatakse madalal leegil viis minutit, samal ajal raputades. Seebistamine on lõpetatud, kui lahus on selge. Lõpuks jahutatakse jooksva vee all ning eemaldatakse kondensaator. 5.2. Lisatakse paar tilka indikaatorit ning süstlaga aeglaselt 1 ml dimetüülsulfaati. Katseklaas suletakse hermeetiliselt ning seda raputatakse 2-3 minutit, katseklaasi põhi kastetakse korrapäraste ajavahemike järel keevasse veevanni. Reaktsioon on täielik, kui indikaatori värv muutub sinisest kollaseks. Lõpuks jahutatakse katseklaas jooksva vee all, avatakse ning lisatakse 5 ml soolhappe metanoolilahust. 5.3. Pärast mõneminutilist raputamist asetatakse katseklaas kaldu ning seda koputatakse õrnalt. See aitab metüülestritel õlitaolise massina pinnale tõusta (märkus A). Metüülestrid eemaldatakse süstlaga, asetatakse koonilise põhjaga katseklaasi, lisatakse ulatuses metüülestrite mahust alumiiniumoksiidi, raputatakse ja filtreeritakse filterpa