I LISA

Artiklite 3, 4, 5, 7 ja 8 kohaselt tehtavate analüüside kava

1. ÜLDISED PÕHIMÕTTED MÄÄRATLETUD TAIMEKAHJUSTAJA ESINEMISE KOHTA

1.1. Määratletud taimekahjustaja esinemist kahtlustatakse juhul, kui määratletud taimega tehtud esimese avastamisanalüüsi tulemused on positiivsed. Sümptomitega taimse materjali puhul võib esimene avastamisanalüüs olla selektiivne isoleerimine.

1.2. Määratletud taimekahjustaja esinemist määratletud taimede sümptomaatilistel proovidel kinnitatakse järgmistel juhtudel: a) kui esimene avastamisanalüüs on selektiivne isoleerimine, mille tulemuseks on tüüpilise morfoloogiaga kolooniad: positiivsed tulemused saadakse kahe määramisanalüüsiga; b) kui esimene avastamisanalüüs on muu analüüs kui selektiivne isoleerimine: i) positiivsed tulemused saadakse kahe määramisanalüüsiga pärast proovi selektiivset isoleerimist; ii) positiivsed tulemused saadakse teises avastamisanalüüsis mis on muu analüüs kui selektiivne isoleerimine.

1.3. Määratletud taimekahjustaja esinemist määratletud taimede asümptomaatilistel proovidel kinnitatakse järgmistel juhtudel: a) kui teises avastamisanalüüsis saadakse positiivne tulemus, tingimusel et esimene või teine avastamisanalüüs on molekulaarne (DNA-põhine) analüüs (TaqMan® reaalaja PCR analüüs või klassikaline PCR); b) proovide puhul, mis on võetud liikmesriigis või liikmesriigi alal, kus määratletud taimekahjustajat teadaolevalt ei esine, ja proovide puhul, mis on pärit teisest liikmesriigist: kui punkti a kohaselt on teises avastamisanalüüsis saadud positiivne tulemus ja pärast proovi selektiivset isoleerimist tehtud kahe määramisanalüüsi tulemused on positiivsed.

2. ANALÜÜSID

2.1. Avastamisanalüüsid

Avastamisanalüüsidega peab olema võimalik järjepidevalt avastada vähemalt 104 rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitri kohta.

Teine avastamisanalüüs peab põhinema esimese omadest erinevatel bioloogilistel põhimõtetel või teistsugustel nukleotiidipiirkondadel.

Avastamisanalüüsid on järgmised:

a) rahvusvahelistes diagnostikastandardites kirjeldatud immunofluorestsentstestid;

b) FISH test (van Beuningen et al. (1995)), (1) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

c) rahvusvahelistes diagnostikastandardites kirjeldatud isoleerimine. Tuleb kasutada üht kahest järgmisest võimalusest: i) otsene isoleerimine poolselektiivses (või mitteselektiivses) kasvukeskkonnas, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; ii) biotesti abil rikastamise järgne isoleerimine, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

d) klassikaline PCR analüüs, milles kasutatakse Pastriki (2000) (2) praimereid, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

e) TaqMan® reaalaja PCR analüüsid, milles kasutatakse järgmisi praimereid ja proove: i) Schaad et al. (1999), (3) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (nn NYtor test), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iii) Gudmestad et al. (2009), Vreeburg et al. poolt kohandatud (2018)4, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iv) Massart et al. (2014), (5) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

2.2. Määramisanalüüsid

Määramisanalüüsid on järgmised:

a) rahvusvahelistes diagnostikastandardites kirjeldatud immunofluorestsentstestid;

b) klassikaline PCR analüüs (Pastrik (2000)), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

c) TaqMan® reaalaja PCR analüüsid, milles kasutatakse järgmisi praimereid ja proove: i) Schaad et al. (1999), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; ii) Vreeburg et al. (2018) (nn NYtor test), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iii) Gudmestad et al. (2009), Vreeburg et al. poolt kohandatud (2018), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iv) Massart et al. (2014), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

d) DNA triipkoodistamine, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011)) (6), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

3. MEETODITE VOOSKEEMID

Vooskeem nr 1. Diagnostiline meetod määratletud taimekahjustaja esinemise tuvastamiseks määratletud taime sümptomaatilistes proovides.

a Esimese või teise avastamisanalüüsina võib kasutada isoleerimist. Kui kahtlustatakse määratletud taimekahjustaja esinemist kasvukeskkonnas, puhastatakse kolooniad, et saada puhaskultuurid, millega tehakse kaks määramisanalüüsi. Taimekahjustaja esinemise kinnitamiseks on vaja kahe määramisanalüüsi positiivset tulemust.

b Kolmas avastamisanalüüs põhineb erinevatel bioloogilistel põhimõtetel või teistsugustel nukleotiidipiirkondadel.

Vooskeem nr 2. Diagnostiline meetod määratletud taimekahjustaja esinemise tuvastamiseks määratletud taime asümptomaatilistes proovides.

a Isoleerimist ei tohi kasutada.

b Kolmas avastamisanalüüs põhineb erinevatel bioloogilistel põhimõtetel või teistsugustel nukleotiidipiirkondadel. Isoleerimist ei tohi kasutada.

c Punkti 1.3 alapunktis b osutatud proovide puhul tuleb pärast määratletud taimekahjustaja esinemise kinnitamise teist positiivset avastamistanalüüsi määratletud taimekahjustaja proovist eraldada, millele järgneb kaks positiivset määramisanalüüsi.

4. PROOVI ETTEVALMISTAMINE

4.1. Asümptomaatilistest mugulatest võetud proovid

Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Asjakohast laboritoimingut basaalse tipu südamiku töötlemiseks, et saada ekstrakt määratletud taimekahjustaja avastamiseks, on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

4.2. Asümptomaatilisest taimsest materjalist (v.a mugulad) võetud proovid

Latentseid infektsioone avastatakse varresegmentide koondproovides. Toimingut võib kohaldada ühe proovi kuni 200 erinevate taimede varreosale. Asjakohast laboritoimingut varresegmentide desinfitseerimiseks ja töötlemiseks, et saada ekstrakt määratletud taimekahjustaja avastamiseks, on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

4.3. Sümptomaatilistest määratletud taimedest võetud proovid

Koelõiked eemaldatakse aseptiliselt mugula juhtkoeringist või määratletud taimede närbumissümptomitega varre juhtkimpudest. Asjakohast laboritoimingut kudede töötlemiseks, et saada ekstrakt määratletud taimekahjustaja avastamiseks, on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, lk 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, lk 155–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, lk 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, lk 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, lk 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400–7.10.1016/j.syapm.2011.05.001.