Komisjoni direktiiv 96/54/EÜ,

30. juuli 1996,

millega kohandatakse kahekümne teist korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta, [1] viimati muudetud komisjoni direktiiviga 94/69/EÜ, [2] eriti selle artiklit 28,

ning arvestades, et:

direktiivi 67/548/EMÜ I lisa sisaldab ohtlike ainete loetelu, nende liigitamist, märgistamist ja vajaduse korral nende kontsentratsioonipiire ja muid parameetreid, mis võimaldavad hinnata nende ohtu inimeste tervisele ja keskkonnale; I lisa ohtlike ainete loetelu tuleks praeguseid teadus- ja tehnikaalaseid teadmisi silmas pidades kohandada; seetõttu on vaja muuta I lisa eessõna, lisades sellesse märkused valmististe märgistuste kohta ning lisades tabelisse B uue rühma orgaanilisi aineid; I lisa ohtlike ainete loetelus on ained, mille osas on Austriale ja Rootsile Austria, Soome ja Rootsi ühinemisakti alusel ette nähtud konkreetsed ajutised erandid liigituse ja märgistamise osas; ühinemisakt näeb nende ainete osas ette liigutuse ja märgistuse uuesti läbivaatamise; mõne sellise aine liigitus on vastavalt sellele nõudele uuesti läbi vaadatud;

direktiivi 67/548/EMÜ III lisa sisaldab ohtlikele ainetele ja valmististele omistatavate eriohtude laadile osutavate väljendite loetelu; sellesse loetellu tuleks lisada lause, mis osutaks teatavate ainete ja valmististe tervisele ohtlikkusele juhul, kui neid sisse hingatakse;

direktiivi 67/548/EMÜ V lisas sätestatakse ainete ja valmististe füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramise meetodid; mistõttu on kõnealust lisa vaja kohandada tehnika arenguga;

direktiivi 67/548/EMÜ VI lisa sisaldab ohtlike ainete ja valmististe liigitamise ja märgistamise üldiseid kriteeriumeid; on vaja kehtestada kriteeriumid nende ainete ja valmististe jaoks, mis on sissehingamisel tervisele ohtlikud; on vaja muuta sensibiliseerivate ainete ja valmististe kriteeriume; on vaja kehtestada propaani, butaani või veeldatud naftagaasi (LPG) jaoks ettenähtud gaasimahutite märgistamise kriteeriumid;

käesoleva direktiivi sätted on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe tehniliste kaubandustõkete kõrvaldamist käsitlevate direktiivide tehnika arengule kohandamise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 67/548/EMÜ muudetakse järgmiselt.

1. I lisa muudetakse järgmiselt:

a) eessõna märkus 4 asendatakse järgmisega:

"Märkus 4

Neid aineid sisaldavad valmistised tuleb liigitada kahjulikeks R65 märgistusega juhul, kui nad vastavad VI lisa punkti 3.2.3 kriteeriumidele.";

b) lisatakse märkus 5:

"Märkus 5

Gaasiliste valmististe kontsentratsioonipiire väljendatakse mahuprotsentides.";

c) direktiivi 67/548/EMÜ I lisa eessõna tabelisse B lisatakse järgmine orgaaniliste ainete eriliigitus:

+++++ TIFF +++++

d) käesoleva direktiivi I lisa kanded asendavad vastavaid kandeid;

e) käesoleva direktiivi II lisa kanded lisatakse esimest korda;

f) järgmiste viitenumbritega kanded jäetakse välja:

008-002-00-3

612-045-00-9

648-011-00-5

648-025-00-1

648-157-00-X

648-158-00-5

648-159-00-0

649-192-00-3

g) käesoleva direktiivi III lisa kandeid muudetakse nii, et kõik "R22" viited asendatakse viitega "R65".

2. III lisasse lisatakse järgmine lause:

+++++ TIFF +++++

3. V lisa B osa muudetakse järgmiselt:

a) käesoleva direktiivi IVA lisa tekst asendab B osa pealkirja ja üldise sissejuhatuse: Toksilisuse määramise meetodid;

b) IVB lisa tekst lisatakse pärast peatükki B.1 bis;

c) IVC lisa tekst asendab peatükki B.6;

d) IVD lisa tekst asendab peatükki B.7;

e) käesoleva direktiivi IVE lisa tekst lisatakse lõppu.

4. VI lisas märgitud kohad asendatakse käesoleva direktiivi V lisas esitatud tekstiga.

Artikkel 2

1. Ilma et see piiraks lõike 2 sätete kohaldamist, jõustavad liikmesriigid käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 31. mail 1998. Liikmesriigid teatavad sellest viivitamata komisjonile.

2. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi punktide F, I ja J järgimiseks vajalikud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 31. oktoobril 1997. Liikmesriigid teatavad sellest viivitamata komisjonile.

3. Kui liikmesriigid võtavad lõigetes 1 ja 2 nimetatud normid vastu, lisavad nad nendesse normidesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

Artikkel 3

Käesolev määrus jõustub 20. päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 30. juuli 1996

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Ritt Bjerregaard

[1] EÜT L 196, 16.8.1967, lk 1.

[2] EÜT L 381, 31.12.1994, lk 1.

--------------------------------------------------

ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III

Index No

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

IVA LISA

B OSA: TOKSILISUSE JA TEISTE TERVIST MÕJUTAVATE TOIMETE MÄÄRAMISE MEETODID

ÜLDINE SISSEJUHATUS: B OSA

A. SELGITAV MÄRKUS

Käesolevas üldises sissejuhatuses kasutatakse järgmist numeratsiooni:

B.15. Geenmutatsioon – Saccharomyces cerevisiae

B.16. Mitootiline rekombinatsioon – Saccharomyces cerevisiae

B.17. Imetajate rakkude geenmutatsiooni katse in vitro

B.18. DNA kahjustused ja nende parandamine – planeerimata DNA-süntees imetajate rakkudes in vitro

B.19. Õdekromatiidivahetuse katse in vitro

B.20. Sooga aheldatud retsessiivsete letaalsete mutatsioonide katse Drosophila melanogaster’is

B.21. Imetajate rakkude transformatsiooni katsed in vitro

B.22. Näriliste dominantne letaalne katse

B.23. Imetajate idurakkude tsütogeneetiline katse in vivo

B.24. Hiirte täppkatse

B.25. Hiirte päriliku translokatsiooni katse

B.26. Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse: 90päevane korduv suukaudne närilistele manustamine

B.27. Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse: 90päevane korduv suukaudne muudele liikidele kui närilistele manustamine

B.28. Subkroonilise nahakaudse toksilisuse uuring: 90päevane korduv nahakaudne närilistele manustamine

B.29. Subkroonilise inhalatsiooni toksilisuse uuring: närilistega tehtud 90päevane korduva inhalatsioonidoosi uuring

B.30. Kroonilise toksilisuse katse

B.31. Teratogeensuse katse – närilistega ja muude liikide kui närilistega

B.32. Kantserogeensuse katse

B.33. Kombineeritud kroonilise toksilisuse/kantserogeensuse katse

B.34. Ühe põlvkonna paljunemisvõimet kahjustava toksilisuse katse

B.35. Kahe põlvkonna paljunemisvõimet kahjustava toksilisuse katse

B.36. Toksikokineetika

B. KÄESOLEVA LISA UURIMISMEETODITES KASUTATAVATE MÕISTETE ÜLDISED MÄÄRATLUSED

i) Äge toksilisus – kahjustav toime mingi kindla aja jooksul (tavaliselt 14 päeva) pärast ühe ainedoosi manustamist.

ii) Ilmne toksilisus – üldmõiste, mis osutab pärast uuritava aine manustamist selgetele toksilisuse märkidele. Kõnealused märgid peaksid võimaldama ohtu hinnata ning peaksid olema sellised, et manustatava doosi suurendamise tõenäoliseks tulemuseks on tugev toksilisus ning tõenäoliselt ka surm.

iii) Doos – manustatava uuritava aine kogus. Doosi väljendatakse massina (grammides või milligrammides) või uuritava aine massina katselooma kaaluühiku kohta (nt milligrammides kehakaalu kilogrammi kohta) või püsikontsentratsioonina toidus (miljondikuna (ppm) või milligrammides toidu kilogrammi kohta).

iv) Kriitiline doos – neljast kinnitatud doositasemest kõrgeim, mida võib manustada ilma doseeritud ainest tuleneva suremuseta (humaansetel põhjustel surmamine).

v) Doseerimine – üldmõiste, mis hõlmab doosi, selle manustamise sagedust ja doseerimise kestust.

vi) LD50 (keskmine surmav annus) – aine statistiliselt tuletatud ühekordne doos, mis põhjustab eeldatavasti surma 50 %l loomadest, kellele doos manustatakse. LD50 väärtust väljendatakse uuritava aine massina katselooma kaaluühiku kohta (milligrammi kilogrammi kohta).

vii) LC50 (keskmine surmav sisaldus) – statistiliselt tuletatud ainesisaldus, mis eeldatavasti põhjustab kokkupuutumisel või pärast kokkupuutumist mingi fikseeritud aja jooksul surma 50 %l loomadest, kes ainega teatava aja jooksul kokku puutusid.

LC50 väärtust väljendatakse uuritava aine massina õhu standardruumala kohta (milligrammi liitri kohta).

viii) NOAEL (täheldatava kahjuliku toimeta doos) – lühend, mida kasutatakse täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme puhul, ning see on suurim doos või kõrgeim kokkupuutetase, mille korral ei tuvastata aine manustamisega seotud kahjulikke leidusid.

ix) Kordusdoosi toksilisus/subkrooniline toksilisus – korduvatest igapäevastest, loomade eeldatava elueaga võrreldes lühiajalistest doseerimistest või kokkupuudetest kemikaaliga tulenevad kahjulikud mõjud katseloomadel.

x) Maksimaalne talutav doos (MTD) – kõrgeim doositase, mis kutsub loomadel esile toksilisuse märke, ilma et see avaldaks vastava katse puhul märkimisväärset mõju ellujäämisele.

xi) Nahaärritus – uuritava aine kasutamisest põhjustatud põletikuliste nahamuutuste tagajärg.

xii) Silmade ärritus – silma pealispinnal uuritava aine kasutamisest põhjustatud muutuste tagajärg.

xiii) Naha sensibiliseerimine (allergiline kontaktne dermatiit) – immunoloogiliselt vahendatud nahareaktsioon mingi aine suhtes.

xiv) Nahasöövitus – 3 minuti kuni 4 tunni jooksul uuritava aine kasutamisest tulenev pöördumatu kahju nahakudedele.

xv) Toksikokineetika – uuritavate ainete imendumise, jaotumise, omastatavuse ja väljutamise uurimine.

xvi) Imendumine – protsess, mille käigus manustatud aine kehasse jõuab.

xvii) Väljutamine – protsess, mille käigus manustatud aine ja/või selle ainevahetuse saadused kehast eemaldatakse.

xviii) Jaotumine – protsess, mille käigus manustatud aine ja/või selle ainevahetuse saadused kehas jaotuvad.

xix) Ainevahetus – protsess, mille käigus manustatud ainete struktuuri kehas ensümaatiliste või mitteensümaatiliste reaktsioonidega muudetakse.

B.I Äge – kordusdoosi toksilisus/subkrooniline ja krooniline toksilisus

Aine ägedat toksilist toimet ja toksilisust organite või süsteemide suhtes on võimalik hinnata erinevate toksilisuse katsetega (meetodid B.1–B.5), mille põhjal on esialgselt võimalik toksilisust määrata juba esimese doosi põhjal.

Sõltuvalt aine toksilisusest võib kasutada piirsisalduse katset kuni täieliku LD50ni välja, olgugi et inhalatsiooniuuringu puhul ei ole piirsisalduse katset ette nähtud, kuna ühe inhalatsiooni käigus saadava kokkupuute piirväärtust ei ole olnud võimalik määratleda.

Eelistada tuleks meetodeid, milles kasutatakse võimalikult vähe loomi ja kus loomadele tekitatakse minimaalselt kannatusi, näiteks kinnitatud doosi meetod (meetod B.1 bis) ja ägeda toksilisusastme meetod (meetod B.1 tris). Esimese taseme katsete puhul võivad teise loomaliigiga läbiviidud uuringud täiendada esimeses uuringus tehtud järeldusi. Sellisel juhul võib kasutada standardset uurimismeetodit või kohandada meetodit väiksemale loomade arvule.

Kordusdoosi toksilisuse katse (meetodid B.7, B.8 ja B.9) sisaldab korduvast kokkupuutest tuleneva toksilise toime hindamist. Selleks, et saada võimalikult palju teavet, rõhutatakse loomade põhjaliku kliinilise vaatlemise vajadust. Need katsed peaksid aitama kindlaks teha organeid, millele toksilisus eelkõige mõjub, ning samuti toksilisi ja mittetoksilisi doose. Pikaajalistes uuringutes võib olla vajalik nende aspektide täiendav põhjalikum uurimine (meetodid B.26–B.30 ja B.33).

B.II Mutageensus – genotoksilisus

Mutageensus osutab püsivate edasikantavate muutuste esilekutsumisele rakkude või organismide geneetilise materjali koguses või struktuuris. Need muutused – "mutatsioonid" – võivad hõlmata ühte geeni või selle osasid, geenirühma või terveid kromosoome. Toime tervetele kromosoomidele võib olla seotud muutustega struktuuris ja/või arvus.

Aine mutageenset aktiivsust hinnatakse in vitro geen(punkt)mutatsiooni bakteriaalse analüüsiga (meetod B.13/14) ja/või imetajate rakkude kromosoomide struktuurilise aberratsiooniga (meetod B.10).

Kasutada võib ka in vivo meetodeid, nt pisituuma katset (meetod B.12) ja luuüdirakkude metafaasi analüüsi (meetod B.11). Vastunäidustuste puudumise korral eelistatakse siiski in vitro meetodeid.

Suuremate tootmismahtude puhul ja/või riskianalüüsi läbiviimiseks või selle järeluurimiseks võib olla vaja lisauuringuid, et uurida täiendavalt mutageensust või viia kantserogeensuse osas läbi eelsõelumist ning neid uuringuid võib kasutada mitmel eesmärgil: baaskogumiga läbi viidud katse tulemuste kinnitamiseks; baaskogumi puhul uurimata lõpp-punkti uurimiseks; in vivo uuringute alustamiseks või laiendamiseks.

Sel eesmärgil sisaldavad B.15–B.25 meetodid nii in vivo kui ka in vitro eukarüootseid süsteeme ja laiemat bioloogiliste lõpp-punktide ulatust. Kõnealused katsed annavad teavet punktmutatsiooni ja teiste lõpp-punktide kohta organismides, mis on keerulisemad kui baaskogumi puhul kasutatud bakterid.

Üldjuhul tuleks mutageensuse uurimise täiendav programm kavandada selliselt, et see annaks lisateavet selle aine mutageensuse ja kantserogeensuse kohta.

Teatavatel juhtudel sõltuvad sobivad konkreetsed uuringud arvukatest teguritest, sealhulgas aine keemilis-füüsikalistest omadustest, esialgse bakteriaalse ja tsütogeneetilise katse tulemustest, aine metaboolsest profiilist, teiste toksilisuse uuringute tulemustest ja aine teadaolevatest kasutustest. Pidades silmas erinevaid tegureid, mida tuleb arvestada, ei ole seetõttu sobiv ette näha ranget katsete valimise kava.

Mõned uurimisstrateegia põhialused on sätestatud direktiivis 93/67/EMÜ, kuid selged uurimisstrateegiad on esitatud riski hindamist käsitlevas tehnilises suunisdokumendis, mis on paindlik ja mida on võimalik vajadusel eriolukordadele kohandada.

Täiendavate uurimuste meetodid on nende põhilise geneetilise lõpp-punkti alusel rühmitatud alljärgnevalt:

Uuringud geen(punkt)mutatsioonide uurimiseks

a) Otse- või pöördmutatsiooni uuringud, milles kasutatakse eukarüootseid mikroorganisme (Saccharomyces cerevisiae) (meetod B.15).

b) Imetajate rakkude otsemutatsiooni uuringud in vitro, (meetod B.17)

c) Sooga aheldatud retsessiivsete letaalsete mutatsioonide katse Drosophila melanogaster’is, (meetod B.20).

d) Keharakkude mutatsiooni katse in vivo, hiirte täppkatse, (meetod B.24)

Kromosoomide aberratsiooni uuringud

a) Imetajate tsütogeensusuuringud in vivo; kaaluda tuleks in vivo metafaasi analüüsi luuüdirakkudes juhul, kui seda ei ole tehtud esialgse hindamise käigus (meetod B.11). Lisaks sellele võib uurida iduraku tsütogeneetikat in vivo (meetod B.23).

b) Imetajate rakkude in vitro tsütogeensusuuringud juhul, kui neid ei ole tehtud esialgse hindamise käigus (meetod B.10).

c) Dominantsed letaalsusuuringud närilistel (meetod B.22).

d) Hiirte päriliku translokatsiooni katse (meetod B.25).

Genotoksiline toime – toime DNA-le

Genotoksilisus – geneetilisele materjalile võimalik kahjulik toime, mis ei ole tingimata seotud mutageensusega – võib ilmneda DNA kahjustusena, ilma et esineks otseseid tõendeid mutatsioonidest. Sellise uurimise jaoks võivad sobida järgmised meetodid, milles kasutatakse eukarüootseid mikroorganisme või imetajate rakke:

a) mitootiline rekombinatsioon saccharomyces cerevisiae’l (meetod B.16);

b) DNA kahjustused ja nende parandamine – imetajate rakkude planeerimata DNA-süntees in vitro (meetod B.18);

c) õdekromatiidivahetus imetajate rakkudes – in vitro (meetod B.19).

Alternatiivsed kantserogeensuse uurimise meetodid

Võimalik on kasutada imetajate rakkude transformatsiooni katseid, mis mõõdavad aine võimet kutsuda rakukultuurides esile morfoloogilisi ja käitumuslikke muutusi, mis arvatakse olevat seotud pahaloomulise in vivo transformatsiooniga, (meetod B.21). Kasutada võib erinevaid rakutüüpe ja transformatsioonipõhimõtteid.

Pärilike mõjude riski hindamine imetajatel

Võib kasutada meetodeid, millega mõõdetakse imetajale geen(punkt)mutatsiooniga (näiteks hiirte spetsiifiline lookuse katse) põhjustatud pärilikku mõju, idurakkude mutatsiooni esimesel põlvkonnal (käesoleva lisaga hõlmamata) või kromosoomaberratsiooni (näiteks hiirte päriliku translokatsiooni katse) (meetod B.25). Selliseid meetodeid võib kasutada siis, kui hinnatakse aine võimalikku pärilikkusriski inimesele. Nende uuringute keerukust ja katsetega hõlmatavate loomade suurt arvu silmas pidades (eelkõige spetsiifilise lookuse katse puhul) peab nende uuringute läbiviimine siiski olema mõjuvalt põhjendatud.

B.III Kantserogeensus

Kemikaale saab sõltuvalt nende eeldatavast toimemehhanismist kirjeldada kui genotoksilisi või mittegenotoksilisi kantserogeene.

Eelsõelumisteavet aine genotoksilise kantserogeensuse kohta saadakse mutageensuse/genotoksilisuse uuringute käigus. Lisateavet on võimalik saada kordusdoosi, subkroonilise või kroonilise toksilisuse katsetega. Kordusdoosi toksilisuse katse (meetod B.7) ja pikaajalisemad kordusdoosi uuringud hõlmavad kordusdoosi toksilisuse katsete käigus täheldatud histopatoloogiliste (nt teatavates kudedes muret tekitav hüperplaasia) muutuste hindamist. Sellised uuringud ja toksikokineetiline teave võivad aidata identifitseerida kantserogeenseid kemikaale, mida on vaja põhjalikumalt kantserogeensuse katsetega (meetod B.32) või kombineeritud kroonilise toksilisuse/kantserogeensuse uuringutega (meetod B.33) uurida.

B.IV Paljunemisvõimet kahjustav toksilisus

Paljunemisvõimet kahjustav toksilisus võib avalduda erinevatel viisidel, näiteks emas- ja isasloomade paljunemisvõime halvenemises – "toimena viljakusele" või mittepäritavas kahjulikus toimes järglaskonnale – "arengut mõjutavat toksilisusena", mis hõlmab ka teratogeensust ja toimet laktatsiooni ajal.

Arengutoksilisuse toime katsete raamesse kuuluvate teratogeensuse uuringute puhul on uurimismeetod (meetod B.31) põhiliselt suunatud suukaudsele manustamisele. Sõltuvalt uuritava aine füüsikalistest omadustest või sellest, millisel viisil inimene sellega kokku puutub, võib kasutada ka teisi manustamisviise. Sellistel juhtudel tuleks uurimismeetodit vastavalt kohandada, võttes arvesse 28päevaste uurimismeetodite asjakohaseid elemente.

Kui on vaja läbi viia paljunemise (viljakuse) katse kolme põlvkonnaga, võib paljunemisvõimet mõjutava toksilisuse katset kahe põlvkonnaga (meetod B.35) laiendada nii, et see hõlmaks ka kolmandat põlvkonda.

B.V Neurotoksilisus

Neurotoksilisust võib tuvastada erinevatel viisidel, näiteks kesk- või perifeerse närvisüsteemi toimimise, struktuuri ja biokeemiliste muutustega. Neurotoksilisust on esialgselt võimalik tuvastada ägeda toksilisuse katsetega. Kordusdoosi toksilisuse katse (meetod B.7) hõlmab neurotoksilisuse hindamist ning seejuures rõhutatakse loomade põhjaliku kliinilise vaatlemise vajadust, et saada võimalikult palju teavet. Meetod peaks aitama identifitseerida neurotoksilisi kemikaale, mis võivad nõuda neurotoksilisuse osas täiendavat ja põhjalikumat uurimist. Lisaks sellele on oluline kaaluda ainete spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla teiste toksilisuse uuringutega võimalik tuvastada. Näiteks on teatavatel fosfororgaanilistel ühenditel tuvastatud viivistoimega neurotoksilisust ning seda on pärast ühekordset või korduvat manustamist võimalik hinnata meetoditega B.37 ja B.38.

B.VI Immuuntoksilisus

Immuuntoksilisust võib tuvastada erinevatel viisidel, näiteks immuunvastuse mahasurumise ja/või esilekutsumisega, mis põhjustab kas ülitundlikkust või autoimmuunsust. Kordusdoosi toksilisuse katse (meetod B.7) hõlmab immuuntoksilisuse hindamist. Meetod peaks aitama identifitseerida immuuntoksilisi kemikaale, mis võivad nõuda immuuntoksilisuse osas täiendavat ja põhjalikumat uurimist.

B.VII Toksikokineetika

Toksikokineetilised uuringud aitavad tõlgendada ja hinnata toksilisust käsitlevaid andmeid. Nende uuringute eesmärk on selgitada uuritava kemikaali toksilisuse eriaspekte ning nende uuringute tulemused võivad aidata kavandada täiendavaid toksilisuse uuringuid. Kõikidel juhtudel ei ole siiski vaja kõiki parameetreid kindlaks määrata. Kõikide toksikokineetilisuse uuringute (imendumine, eritumine, jaotumine ja metabolism) läbiviimine on vajalik ainult harvadel juhtudel. Teatavate ühendite puhul on uuringutes soovitav teha muudatusi või piirduda ühekordse doosi uuringuga (meetod B.36).

Teave keemilise struktuuri (SAR) ning füüsikalis-keemiliste omaduste kohta võib samuti viidata aine imendumisomadustele kavandataval manustamisviisil ning samuti aine metabolismile ja kudedes jaotumisele. Samuti võib teavet toksikokineetiliste parameetrite kohta saada varasematest toksilisuse ja toksikokineetilisuse uuringutest.

C. UURITAVA AINE ISELOOMUSTUS

Uuritava aine koostis, sealhulgas peamised lisandid ja selle vastavad füüsikalis-keemilised omadused (sealhulgas stabiilsus) peaksid olema teada enne toksilisuse uuringu alustamist.

Uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused annavad olulist teavet manustamisviisi valimise, iga konkreetse uuringu kavandamise ning uuritava aine käitlemise ja säilitamise jaoks.

Doseeritavas aines ja bioloogilises materjalis oleva uuritava aine (sealhulgas võimaluse korral peamiste lisandite) kindlakstegemiseks kasutatav kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüsimeetod tuleks välja töötada enne uuringu alustamist.

Katsearuanne peaks hõlmama kogu teavet uuritava aine identifitseerimise, selle füüsikalis-keemiliste omaduste, selle puhtuse ja käitumise kohta.

D. LOOMADE HOOLDAMINE

Toksilisuse uurimisel on oluline keskkonnatingimuste range kontroll ja õiged loomade hooldamise tehnikad.

i) Pidamistingimused

Katsealuste loomade ruumide või piirdeaedade keskkonnatingimused peaksid olema katseliikide jaoks sobivad. Rottide, hiirte ja merisigade puhul on sobiv toatemperatuur 22 ± 3ºC ning suhteline õhuniiskus peaks olema 30–70 %; küülikute puhul peaks temperatuur olema 20 ± 3ºC ning suhteline õhuniiskus peaks olema 30–70 %.

Mõned uurimismeetodid on temperatuuri suhtes eriti tundlikud ning sellistel puhkudel on sobivate temperatuuritingimuste üksikasjad lisatud uurimismeetodi kirjeldusse. Kõikide toksilise toime uuringute puhul tuleks jälgida temperatuuri ja niiskust, samuti tuleks need andmed registreerida ning uuringu lõpparuandesse lisada.

Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valget ja 12 tundi pimedat aega. Valgustustsükli üksikasjad tuleks registreerida ja märkida uuringu lõpparuandesse.

Kui meetodis ei ole teisiti sätestatud, võib loomi pidada üksikult või väikeste rühmadena, kus emas- ja isasloomad on eraldi; kui puuris on mitu looma, ei tohiks koos olla rohkem kui viis looma.

Loomkatsete aruannetes on oluline ära märkida, millist tüüpi puure kasutati ning mitu looma igas puuris nii keemilise ainega kokkupuutumise kui ka järgneva vaatlusperioodi jooksul oli.

ii) Söötmistingimused

Toiduvalik peaks vastama kõikidele katses kasutatava liigi toitainevajadustele. Kui uuritavat ainet manustatakse loomadele toidu kaudu, võib toidu toiteväärtust vähendada vastava uuritava aine ja toidukomponendi võrra. Sellise reaktsiooni võimalikkust tuleks katse tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta. Kasutada võib ka tavapärast katseloomadele mõeldud toitu ning joogivee hulk peab olema piiramatu. Toidu valikut võib mõjutada vajadus tagada sobiv segu, mis võimaldab uuritava aine manustamist koos toiduga.

Toksilisust mõjutavaid toidu saasteaineid ei tohiks olla sellises kontsentratsioonis, et see segaks katse läbiviimist.

E. LOOMADE HEAOLU

Uurimismeetodite väljatöötamisel võetakse asjakohaselt arvesse loomade heaolu. Alljärgnevalt on lühidalt esitatud mõned näited, kuid see loetelu ei ole täielik. Täpset sõnastust ja/või tingimusi tuleks lugeda järgmiste meetodite tekstidest:

- Ägeda suukaudse toksilisuse määramiseks tuleb kaaluda kahte alternatiivset meetodit: kinnitatud doosi menetlust ja ägeda toksilisusastme meetodit. Kinnitatud doosi menetluses ei ole surm konkreetne lõpptulemus ja selles menetluses kasutatakse vähem loomi. Ägeda toksilisusastme meetodis kasutatakse keskmiselt 70 % vähem loomi kui meetodis B.1 ägeda suukaudse toksilisuse kohta. Mõlema alternatiivse meetodi käigus tekitatakse katseloomadele vähem piinu ning stressi kui tavapäraste meetodite puhul.

- Kasutatud loomade arvu vähendatakse teaduslikult heakskiidetud miinimumini: meetodite B.1 ja B.3 puhul viiakse ühel doositasemel katse läbi viie samast soost loomaga; merisigade puhul kasutatakse naha sensibiliseerimise kindlaksmääramiseks maksimeerimise katsega (meetod B.6) ainult kümmet looma (ja ainult viite negatiivse võrdlusrühma puhul); vähendatakse ka in vivo mutageensuse uurimisel positiivseks kontrolliks vajalike loomade arvu (meetodid B.11 ja B.12).

- Katsete ajal loomadele tekitatavat valu ja stressi vähendatakse miinimumini: loomad, kellel esineb raskeid ja püsivaid stressi ja valu märke, tuleb võib-olla humaanselt tappa; doseeritavat uuritavat ainet ei pea manustama viisil, mis põhjustab aine söövitavate või ärritavate omaduste tõttu märkimisväärset valu ja stressi (meetodid B.1, B.2 ja B.3).

- Mitteotstarbeliselt suure doosiga uurimist välditakse piirsisalduse katse kasutuselevõtmisega mitte ainult ägeda toksilisuse katsetes (meetodid B.1, B.2 ja B.3), vaid ka mutageensuse in vivo katsetes (meetodid B.11 ja B.12).

- Ärritavuse uurimine võimaldab katse kõrvale jätta või vähendada selle kohaldamist ühe loomaga uuringute puhul, kui selleks on olemas piisavad teaduslikud tõendid.

Sellised teaduslikud tõendid võivad tugineda aine füüsikalis-keemilistele omadustele, teiste juba läbiviidud katsete tulemustele või hästi valideeritud in vitro katsetele. Näiteks kui aine osas on piirsisalduse katse doosiga läbi viidud nahakaudse ägeda toksilisuse uuring (meetod B.3) ja nahaärritust ei tuvastatud, ei pruugi täiendav nahaärrituse uurimine (meetod B.4) enam vajalik olla; materjale, mille puhul on nahaärrituse uuringu (meetod B.4) käigus ilmnenud selge söövitavus või tugev nahaärritus, ei tohiks silmade ärritavuse katsetes enam uurida (meetod B.5).

F. ALTERNATIIVSED KATSED

Euroopa Liidu teaduseesmärk on töötada välja ja kinnitada alternatiivmeetodid, mis annaksid loomkatsetest saadud teabega tasemelt samaväärset teavet, kuid kus kasutataks vähem loomi ja mis põhjustaksid vähem kannatusi või milles välditakse üldse loomade kasutamist.

Selliste meetodite olemasolu korral tuleb neid kasutada igal võimalusel ohu kirjeldamisel ja seejärel loomuomase ohtlikkuse liigitamisel ja märgistamisel.

G. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE

Katsete hindamisel ja tõlgendamisel tuleb arvesse võtta seda, millisel määral on loomkatsete ja in vitro uuringute tulemusi võimalik ekstrapoleerida vahetult inimesele, ning seetõttu võib võimaluse korral kasutada katse tulemuste kinnitamiseks tõendeid kahjulikust toimest inimese tervisele.

Neid tulemusi võib kasutada uute kemikaalide liigitamiseks ja märgistamiseks selle põhjal, kuidas nad mõjutavad inimeste tervist seoses oluliste omadustega, mis on nende meetoditega kindlaks tehtud. Vastava VI lisa liigitamis- ja märgistamiskriteeriumid on samuti seotud nende uurimismeetodite katseprotokollide lõpp-punktidega.

Neid tulemusi on samuti võimalik kasutada uute ja olemasolevate kemikaalide riski hindamise uuringutes ning selleks eesmärgiks sobivad uurimisstrateegiad on ära toodud vastavates juhendmaterjalides.

H. VIITED KIRJANDUSELE

Enamus nendest meetoditest on töötatud välja OECD "Testing Guidelines" programmi raames ning neid tuleks kasutada kooskõlas heade laboritavadega, et tagada võimalikult laialdane "andmete vastastikune heakskiitmine".

Lisateavet võib leida OECD suunistes olevatest viidetest ja muust asjakohasest kirjandusest.

--------------------------------------------------

IVB LISA

"

B.1 tris ÄGE (SUUKAUDNE) TOKSILISUS – ÄGE TOKSILISUSASTME MEETOD

1. MEETOD

1.1. Sissejuhatus

Ägeda toksilisusastme meetod annab teavet nii ohu hindamise kui ka ohu liigitamise kohta.

Selle meetodi puhul kasutatakse kolme üksteisest piisaval viisil eristuvat fikseeritud doosi, mis võimaldavad ühendit uuringu tulemuste põhjal liigitada. See uurimismeetod võimaldab valida täiendavalt kolm fikseeritud doosi, mida võib kasutada kas alternatiivse võimalusena mingil konkreetsel otsustamise hetkel või lisakatsete läbiviimiseks. Lisadoosi(de) kasutamist võib kaaluda juhul, kui soovitakse või vajatakse täiendavaid täpsustusi.

Selle meetodi puhul kasutatakse määratletud algdoosi ning see ei ole ette nähtud täpse LD50 doosi arvutamiseks; see võimaldab määrata kindlaks kokkupuute ulatust juhul, kui suremus on tõenäoline, kuna osade loomade surm on endiselt käesoleva katse üks peamine lõpp-punkt. Katse tulemused peaksid võimaldama liigitamist VI lisa kriteeriumide alusel. Lähenemisviisi järgnevuse tõttu võib katse kestus olla pikem kui punktis B.1 kirjeldatud meetodi puhul. Käesoleva meetodi peamine eelis on see, et katse läbiviimiseks on vaja vähem loomi kui ägeda (suukaudse) toksilisuse (B.1) ja kindla annuse meetodi (B.1 bis) puhul.

Vt samuti üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. Mõisted

Vt üldise sissejuhatuse B osa.

1.3. Uurimismeetodi põhimõte

Katseloomadele manustatakse suu kaudu üks määratletud ainedoos. Ainet kontrollitakse etapilise menetluse käigus, igas etapis kasutatakse kolme ühest soost looma. Eelvaatlust ei ole vaja läbi viia. Doseeritud ainest tulenevast loomade suremusest mingis etapis sõltub järgmine samm, st kas:

- edasised katsed ei ole vajalikud,

- järgmine samm viiakse läbi sama doosiga, kuid teisest soost loomadega,

- järgmine samm viiakse läbi ühe võrra kõrgemal või madalamal doositasemel.

1.4. Uurimismeetodi kirjeldus

1.4.1. Valmistised

Täiskasvanud terved noorloomad valitakse juhuslikkuse alusel, märgistatakse identifitseerimiseks ning hoitakse vähemalt 5 päeva enne katse algust puurides, et loomad jõuaksid laboritingimustega kohaneda. Loomad võivad olla rühmitatud soo ja manustatud doosi alusel, kuid loomade arv puuris ei tohi takistada iga looma vaatlemist.

Uuritav aine manustatakse ühekordse doosina sondi või sobiva (intubatsiooni)kanüüliga.

Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/-emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised omadused ning kui need ei ole teada, tuleb need enne katse läbiviimist kindlaks teha.

Loomadele ei tohiks enne doseerimist süüa anda (rottide puhul öö jooksul ja hiirte puhul 3–4 tundi enne katse läbiviimist); vett peaks olema piisavalt.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.1. Katseloomad

Kui vastunäidustusi ei ole, eelistatakse närilistest rotti. Emasloomad peaksid olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.

Uuringu alguses peaks loomade kaaluerinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kaalust.

1.4.2.2. Arv ja sugu

Iga etapi puhul kasutatakse kolme ühest soost looma. Esimesena võib kasutada ükskõik kumba sugu.

1.4.2.3. Doositasemed

Algdoosina kasutatav doositase valitakse kolme fikseeritud taseme seast, st 25, 200 ja 2000 mg kehakaalu kg kohta. Algdoosi tase peaks vähemalt mõnel doosi saanud loomal tõenäoliselt surma põhjustama. Sõltuvalt algdoosist võib kasutada ühte lisas 1 kirjeldatud menetluse voolskeemi.

Loomade soo ja algdoosi valimisel tuleks kasutada olemasolevat teavet, sealhulgas teavet struktuuriaktiivsuse suhte kohta. Kui teave osutab sellele, et loomade suremus on kõrgeimal doositasemel (2000 mg kehakaalu kg kohta) ebatõenäoline, tuleks läbi viia piirsisalduskatse. Kui uuritava aine kohta ei ole teavet, soovitatakse loomade heaoluga seotud põhjustel kasutada algdoosina 200 mg kehakaalu kg kohta.

Vahel soovitatakse saada täpsemat teavet, kui seda katsed kolme fikseeritud doosiga (25, 200 ja 2000 mg kehakaalu kg kohta) võimaldavad. Sellistel juhtudel võib kaaluda lisakatseid täiendavatel fikseeritud tasemetel, milleks on 5, 50 või 500 mg kehakaalu kg kohta.

Doose, mis põhjustavad aine söövitavate või ärritavate omaduste tõttu märkimisväärset valu ja stressi, ei ole vaja manustada.

Katserühmade intervallid määratakse toksiliste märkide ilmnemise, kestuse ja raskusastme põhjal. Katsed teisest soost loomadega või järgmisel doositasemel tuleks edasi lükata seniks, kuni eelmisel doositasemel on loomade ellujäämine kindel.

1.4.2.4. Piirsisalduskatse

Piirsisalduskatse ühel doositasemel 2000 mg eluskaalu kg kohta võib läbi viia kolme emas- ja kolme isasloomaga. Kui esineb ainega seotud suremust, on võib-olla vaja läbi viia lisakatsed doositasemel 200 mg (või 500 mg) eluskaalu kg kohta.

1.4.2.5. Vaatlusperiood

Loomi tuleks tavaliselt vaadelda 14 päeva, välja arvatud juhul, kui loomi on vaja uuringust eemaldada ja nende heaolu eesmärgil humaanselt tappa või kui loomad leitakse surnult. Vaatlusperioodi ei tuleks siiski rangelt kindlaks määrata. Vaatlusperioodi kindlaksmääramisel tuleks arvesse võtta toksilist reaktsiooni, ilmnemisaega ja taastumisperioodi pikkust ning seda võib vajaduse korral pikendada. Toksilisuse märkide ilmnemise ja kadumise aeg on oluline eelkõige juhul, kui toksilisuse märkidel on kalduvus ilmneda viitmõjuna. Kõik vaatlustulemused märgitakse korrapäraselt iga looma kohta eraldi peetavasse registrisse.

1.4.3. Analüüsi käik

Pärast paastumisaega tuleks loomi enne uuritava aine manustamist kaaluda. Pärast uuritava aine manustamist võib toidu andmist edasi lükata veel 3–4 tunniks. Kui doos manustatakse osadena mingi ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest olla vajalik anda loomadele süüa ja juua.

Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta; vesilahuste korral võib siiski kaaluda ka suhet 2 ml kehakaalu 100 g kohta. Katsemahu varieeruvust tuleks vähendada miinimumini, kohandades püsiva mahu tagamiseks sisaldust kõikidel doositasemetel. Kui ühekordse doosi manustamine ei ole võimalik, võib doosi anda väiksemates kogustes kuni 24 tunni jooksul.

Katsemenetluse üksikasjad on kirjeldatud lisas 1.

1.4.3.1. Üldised märkused

Loomi tuleks doseerimise päeval vähemalt kaks korda põhjalikult kliiniliselt vaadelda, või ka sagedamini, kui loomade reaktsioon doosile seda nõuab, ning seejärel vähemalt kord päevas. Suremas olevad loomad või loomad, kes kannatavad tugeva valu all ja kellel esineb püsivaid märke tugevast stressist, tuleks humaanselt tappa. Humaansetel põhjustel tapetud loomi käsitletakse samamoodi kui katse käigus surnud loomi.

Kui loomad tapetakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt üles märkida. Täiendavad vaatlused on vajalikud juhul, kui loomadel esineb jätkuvalt toksilisuse märke. Tuleks vaadelda muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestas, ja samuti hingamis-, vereringe-, autonoomses ja kesknärvisüsteemis, somato-motoorset tegevust ja käitumisviisi. Tähelepanu tuleks pöörata sellele, kas loomadel esineb värinaid, krampe, süljeeritust, kõhulahtisust, letargiat, unisust ja kas nad langevad koomasse.

Kõik märkused märgitakse korrapäraselt iga looma kohta peetavatesse individuaalsetesse registritesse.

1.4.3.2. Kehakaal

Kõiki loomi tuleks kaaluda vahetult pärast uuritava aine manustamist ning seejärel vähemalt kord nädalas. Kaalumuutused tuleks välja arvutada ja registreerida. Katse lõpus kaalutakse ellujäänud loomad enne humaanset tapmist.

1.4.3.3. Täielik lahang

Kõik katseloomad, sealhulgas need, kes surevad katse ajal või eemaldatakse katsest, tuleb täielikult lahata. Iga looma puhul tuleks üles märkida patoloogilised muutused. Samuti võib vähemalt 24 või enam tundi elus püsinud loomade puhul makroskoopilisel teel tuvastatud patoloogilisi organeid kasuliku teabe saamiseks mikroskoopiliselt uurida.

2. ANDMED

Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, konkreetsete loomade suremise aeg, toksilise toime kirjeldus ja kestus ning pööratavus ning lahangu tulemused.

Üldised suunised tulemuste tõlgendamiseks liigitamise eesmärgil on esitatud lisas 2.

3. ARUANDLUS

Katsearuanne

Katseruanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:

Katseloomad:

- liik/aretusliin;

- loomade mikrobioloogiline staatus, kui see on teada;

- loomade arv, vanus ja sugu;

- päritolu, pidamistingimused, toit jne;

- iga looma kaal katse alguses, seejärel iga nädala järel ning katse lõpus.

Katsetingimused:

- vehiikeli valiku põhjendamine, kui vehiikeliks ei ole vesi;

- uuritav aine manustamise üksikasjad, sealhulgas doseerimismahud ja doseerimisaeg;

- toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad (sealhulgas liik/allikas, veeallikas);

- algdoosi valimise põhjendus.

Tulemused:

- doosile reageerimise andmete tabel soo ja doositaseme järgi iga looma kohta (näiteks loomad, kellel esineb toksilisust, sealhulgas suremus, toksilise toime iseloom, raskusaste ja kestus);

- toksilisuse märkide ilmnemise kestus ja see, kas toime oli konkreetsete loomade puhul pöörduv;

- lahkamise tulemused ja võimaluse korral histopatoloogilised leiud iga looma kohta.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED

Käesolev meetod on analoogne OECD TG 423 meetodiga.

LISA 1

KATSEPROTSEDUUR

1. Nagu punktis 1.4.2.3 osutatud, peaks algdoos põhjustama surma vähemalt osadel loomade, kellele doos manustatakse. Teave, mille alusel algdoosi võib valida, hõlmab järgmist:

- füüsikalis-keemiliste omaduste andmed;

- struktuuri-aktiivsuse suhe;

- kõikide teiste toksilisuse uuringute andmed; ja

- uuritava aine eeldatav kasutus.

2. Kohaldatav menetlus on iga algdoosi puhul esitatud käesoleva lisa katsekavades. Sõltuvalt humaanselt tapetud loomade või katse ajal surnud loomade arvust järgitakse nooltega osutatud suunda.

3. Kui algdoosiga, milleks on 25 või 200 mg kehakaalu kg kohta, läbiviidud katse käigus sureb vaid üks teisest soost loom, ei viida tavaliselt läbi lisakatseid. Kui ülejäänud viiel loomal ei täheldata toksilisuse märke, tuleks lahangu käigus tähelepanu pöörata võimalusele, et suremus ei pruukinud olla seotud uuritava ainega. Sellisel juhul tuleks katset jätkata aste kõrgema doositasemega.

4. Kui doositasemel 2000 mg kehakaalu kg kohta, sureb üks loom kuuest, ületab LD50 väärtus eeldatavasti 2000 mg kehakaalu kg kohta. Kuna see tulemus on siiski piiripealne, tuleks hoolikalt analüüsida ülejäänud kahe emas- ja isaslooma reaktsiooni ning nendel loomadel esinevad selgelt eristuvad ja tugevad toksilised märgid võivad sellisel juhul tingida liigituse, mis vastab LD50 väärtusele kuni 2000 mg eluskaalu kg kohta või mis õigustab samal tasemel lisakatsete läbiviimist.

5. See võimaldab uurimisel kasutada kolme täiendavat doosi (võimalus 2). Seda võimalust võib kasutada alternatiivse doosi valimiseks konkreetsel valikuhetkel või selleks, et viia pärast tegelikku katset läbi lisakatseid (võimalus 1). Võimaluse 1 puhul on katse käik näidatud poolpaksude nooltega, võimaluse 2 puhul peenikeste nooltega.

a) Katse algdoosiga 25 mg kehakaalu kg kohta

+++++ TIFF +++++

b) Katse algdoosiga 200 mg kehakaalu kg kohta

+++++ TIFF +++++

c) Katse algdoosiga 2000 mg kehakaalu kg kohta

+++++ TIFF +++++

LISA 2

TULEMUSTE TÕLGENDAMINE, KUI UURIMINE VIIAKSE LÄBI VÕIMALUSE 1 ALUSEL

Hallid kastid, mis jäävad kastist "katsete jätkamine ei ole vajalik" allapoole, sisaldavad lõppväärtusi liigitamise kohta. Järgides võimaluse 1 puhul kirjeldatud katsemenetlust, tuleks õiget noolt järgida kuni vajaliku halli kastini.

a) Tulemuste tõlgendamine, kui uurimine viiakse läbi võimaluse 1 alusel

Algdoos: 25 mg kehakaalu kg kohta

+++++ TIFF +++++

b) Tulemuste tõlgendamine, kui uurimine viiakse läbi võimaluse 1 alusel

Algdoos: 200 mg kehakaalu kg kohta

+++++ TIFF +++++

c) Tulemuste tõlgendamine, kui uurimine viiakse läbi võimaluse 1 alusel

Algdoos: 2000 mg kehakaalu kg kohta

+++++ TIFF +++++

"

--------------------------------------------------

IVC LISA

"

B.6 NAHA SENSIBILISEERIMINE

1. MEETOD

1.1. Sissejuhatus

Märkused:

Katsete tundlikkust ja võimet tuvastada inimeste naha võimalikke sensibiliseerijaid loetakse inimese tervisega seotud toksilisuse liigitamise seisukohalt oluliseks.

Ei ole olemas uurimismeetodit, mis identifitseeriks adekvaatselt kõik ained, mis võivad inimese nahka sensibiliseerida, ja mis sobiks kõikide ainete puhul.

Katse valimisel tuleb kaaluda aine füüsikalisi omadusi, sealhulgas aine võimet tungida läbi naha.

Välja on töötatud kahte liiki katsed, milles kasutatakse merisigu: abiainega katsed, milles võimendatakse allergiaseisundit sellega, et uuritavat ainet lahustatakse või suspendeeritakse Freundi täielikus abiaines (Freund’s Complete Adjuvant – FCA), ja abiaineta katsed.

Abiainega katsed on tõenäoliselt konkreetse aine võimaliku nahka sensibiliseeriva toime ennustamisel täpsemad kui need meetodid, mis ei kasuta Freundi täielikku abiainet, ning seega tuleks selliseid meetodeid eelistada.

Merisigade maksimeerimise katse (GPMT) on laialdaselt kasutatud abiainega katse. Olgugi, et on olemas mitmeid meetodeid, millega on võimalik tuvastada aine potentsiaali kutsuda esile naha sensibiliseeriv reaktsioon, loetakse GPMT katset eelistatud abiainega katseks.

Paljude keemiliste ainete klasside puhul peetakse abiaineta katseid (millest eelistatakse Buehleri katset) vähem tundlikuks.

Teatavatel juhtudel võib Buehleri katse valimine olla põhjendatud, kuna selles katses manustatakse aine paikselt, mitte nahasisese süstimise teel nagu GPMT puhul. Buehleri katse kasutamist tuleks teaduslikult põhjendada.

Käesolevas meetodis kirjeldatakse GPMTd ja Buehleri katset. Kasutada võib ka teisi meetodeid tingimusel, et need on hästi valideeritud ja teaduslikult põhjendatud.

Kui tunnustatud sõelkatsega saadakse positiivne tulemus, võib uuritava aine määrata võimalikuks sensibiliseerijaks ning täiendava meriseakatse läbiviimine ei pruugi olla vajalik. Kui sellisel katsel on siiski negatiivne tulemus, tuleb meriseakatse läbi viia käesolevas uurimismeetodis kirjeldatud korras.

Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. Mõisted

Naha sensibiliseerimine – (allergiline kontaktne dermatiit) on mingi aine poolt põhjustatud immunoloogiliselt vahendatud nahareaktsioon. Inimestel võib vastureaktsiooniks olla sügelemine, punetus, paistetus, paapulid, vesivillid või nende kombinatsioon. Teiste liikide puhul võivad reaktsioonid erineda ning esineda võib ainult punetust ja paistetust.

Induktsioonkokkupuude – katsealuse kokkupuude uuritava ainega, mille eesmärk on kutsuda esile ülitundlik seisund.

Induktsiooniperiood – pärast induktsioonkokkupuudet vähemalt nädal aega kestev periood, mille ajal võib kujuneda ülitundlik seisund.

Nakatumist esile kutsuv kokkupuude – eelnevalt käsitletud katsealuse kokkupuude uuritava ainega pärast induktsiooniperioodi selleks, et määrata kindlaks, kas katsealune reageerib ülitundlikult.

1.3. Võrdlusmaterjal

Kasutatud uurimismeetodi tundlikkust ja usaldusväärsust tuleks hinnata kord kuue kuu jooksul, kasutades selleks aineid, mille puhul on teada, et neil on nõrga või keskmise toimega nahka sensibiliseerivad omadused.

Nõuetekohaselt läbi viidud abiainega katses peaks eeldatavasti reageerima vähemalt 30 % ja abiaineta katses vähemalt 15 % nõrga või keskmise toimega sensibiliseerijat.

Eelistatakse järgmisi aineid:

CAS number | EINECS number | EINECSi nimed | Üldnimetused |

101-86-0 | 202-983-3 | α-heksüülkaneelaldehüüd | α-heksüülkaneelaldehüüd |

149-30-4 | 205-736-8 | bensotiasool-2-tiool (merkaptobensotiasool) | kaptaks |

94-07-7 | 202-303-5 | bensokaiin | nordkaiin |

Teatavas olukorras võib piisavate põhjenduste korral kasutada ka teisi eespool nimetatud kriteeriumidele vastavaid võrdlusaineid.

1.4. Uurimismeetodi põhimõte

Katseloomad puutuvad uuritava ainega esimest korda kokku nahasisese süstimise ja/või nahale määrimise kaudu (induktsioonkokkupuude). Pärast 10–14päevast puhkeaega (induktsiooniperioodi), mille jooksul võib välja kujuneda immuunsusreaktsioon, puutuvad loomad kokku nakatumist esile kutsuva doosiga. Katseloomade naha reaktsiooni määra ja ulatust võrreldakse võrdlusloomade omaga, kes saavad induktsiooni ajal platseeboravi ning kellele seejärel manustatakse neile nakatumist esile kutsuv doos.

1.5. Uurimismeetodite kirjeldus

Kui uuritava aine eemaldamist peetakse vajalikuks, tuleks seda teha vee või sobiva lahustiga, ilma et see muudaks olemasolevat reaktsiooni või kahjustaks naha pinda.

1.5.1. Merisigade maksimeerimise katse (GPMT)

1.5.1.1. Valmistised

Terveid albiinomeresigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt 5 päeva jooksul enne katse läbiviimist. Enne katse läbiviimist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.

1.5.1.2. Katsetingimused

1.5.1.2.1. Katseloomad

Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade laboratoorseid aretusliine.

1.5.1.2.2. Arv ja sugu

Kasutada võib isas- ja/või emasloomi. Kui kasutatakse emasloomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.

Katserühmas on vähemalt 10 looma ning võrdlusrühmas vähemalt 5 looma. Kui katserühmas ja võrdlusrühmas on kasutatud vastavalt vähem kui 20 ja 10 merisiga ning kui ei ole võimalik järeldada, et uuritav aine on sensibilisaator, soovitatakse tungivalt täiendavate loomad uurimist, et kokku oleks vähemalt 20 katse- ja 10 võrdluslooma.

1.5.1.2.3. Doositasemed

Uuritava aine kontsentratsioon peaks iga induktsioonkokkupuute kohta olema süsteemselt hästi talutav ning kasutada tuleks kõrgeimat kerget kuni keskmist nahaärritust tekitavat kontsentratsiooni. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga läbi viidud prooviuuringute põhjal. Sellisel juhul tuleks kaaluda selliste loomade kasutamist, kellele on ainet manustatud FCA abil.

1.5.1.3. Analüüsi käik

1.5.1.3.1. Induktsioon

Katserühma 0-päev

Abaluude piirkonda, kust on eemaldatud karvad, süstitakse naha alla 3 × 2 korda 0,1 ml selliselt, et kolm süsti tehakse keskjoonest vasakule ja kolm keskjoonest paremale.

Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest

Injektsioon 2: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine sobivas vehiikelis

Injektsioon 3: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine 1:1 segus (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest

Injektsioonis 3 lahustatakse vees lahustuvad ained vesifaasis enne FCAga segamist. Rasvades lahustuvad või lahustumatud ained suspendeeritakse FCAs enne vesifaasiga segamist. Uuritava aine lõppkontsentratsioon peab olema võrdne sellega, mida on kasutatud injektsioonis 2.

Injektsioonid 1 ja 2 tehakse lähestikku ning peale kõige lähemale, samas aga injektsioon 3 tehakse piirkonna kõige tagapoolsemasse osasse.

Võrdlusrühma 0-päev

3 × 2 korda 0,1 ml süstitakse naha alla samadesse kohtadesse kui katseloomade puhul.

Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest

Injektsioon 2: lahjendamata vehiikel

Injektsioon 3: 50 %line w/v segu vehiikelit FCA ja vee või füsioloogilise keedusoolalahuse segus 1:1 (v/v).

Katse- ja võrdlusrühma 5.–7. päev

Kui aine ei ärrita nahka, manustatakse katsepinda ligikaudu 24 tundi enne paikset induktsioonkokkupuudet ja pärast karvade lõikamist ja/või raseerimist 0,5 ml 10 %list naatriumlaurüülsulfaati vaseliinis kohaliku ärrituse tekitamiseks.

Katserühma 6. päev

Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Sobivas vehiikelis oleva uuritava ainega täielikult küllastatud filterpaber (2 × 4 cm) asetatakse katsepiirkonnale ning kaetakse 48 tunniks oklusioonmähisega. Vehiikeli valikut tuleb põhjendada. Tahked ained pulbristatakse peeneks ja lisatakse sobivasse vehiikelisse. Vedelikke võib kasutada vajaduse korral lahjendamata kujul.

Võrdlusrühma 6.–8. päev

Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Vehiikel asetatakse samal viisil uuritava ainega katsepiirkonnale ja kaetakse 48 tunniks oklusioonmähisega.

1.5.1.3.2. Vaidlustamine

Katse- ja võrdlusrühma 20.–22. päev

Katserühma ja võrdlusrühma loomade küljed puhastatakse karvadest. Uuritava ainega immutatud lapp või uuritavat ainet sisaldav nõu pannakse looma ühele küljele ja vajaduse korral võib teisele küljele panna vehiikeliga immutatud lapi või seda sisaldava nõu. Lappe hoitakse oklusioonmähisega 24 tundi naha vastas.

1.5.1.3.3. Vaatlus ja hindamine: katse- ja võrdlusrühm

- umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist nakatatud ala puhastatakse, pügatakse ja/või raseeritakse ning vajaduse korral depileeritakse;

- umbes 3 tundi hiljem (umbes 48 tundi pärast nakatumise esilekutsumise alustamist) vaadeldakse naha reaktsiooni ning see registreeritakse liites esitatud hindamisskaala põhjal;

- umbes 24 tundi pärast vaatlust viiakse läbi teine vaatlus (72 tunni pärast) ning tulemused märgitakse üles.

Soovitav on hinnata katse tulemusi pimemeetodiga.

Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsustada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise nakatumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) läbiviimist umbes nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib läbi viia ka esialgse võrdlusrühmaga.

Vaadelda tuleks kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid reaktsioone, ja need tuleks üles märkida Magnusson/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta nahavoldi paksust.

1.5.2. Buehleri katse

1.5.2.1. Valmistised

Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt 5 päeva jooksul enne katse läbiviimist. Enne katse läbiviimist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.

1.5.2.2. Katsetingimused

1.5.2.2.1. Katseloomad

Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade laboratoorseid aretusliine.

1.5.2.2.2. Arv ja sugu

Kasutada võib isaseid ja/või emaseid loomi. Kui kasutatakse emasloomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.

Katserühmas on vähemalt 20 looma ning võrdlusrühmas vähemalt 10 looma.

1.5.2.2.3. Doositasemed

Uuritava aine kontsentratsioon iga induktsioonkokkupuute kohta peaks olema kõrgeim kontsentratsioon, mis kutsub esile kerge, kuid mitte ülemäärase ärrituse. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga läbiviidud prooviuuringute põhjal.

Vees lahustuvate uuritavate ainete puhul on vehiikelina asjakohane kasutada vett või lahjendatud mitteärritavat pindaktiivse aine lahust. Teiste uuritavate ainete vehiikeliks sobib induktsioonkokkupuute 80 %line etanooli ja vee lahus ning nakatumise esilkutsumise puhul atsetoon.

1.5.2.3. Analüüsi käik

1.5.2.3.1. Induktsioon

Katserühma 0-päev

Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Katselapp peab olema sobivas vehiikelis uuritava ainega põhjalikult immutatud (vehiikeli valikut tuleks põhjendada; vedelaid uuritavaid aineid võib vajaduse korral kasutada lahjendamata kujul).

Katselapid pannakse katsepiirkonda ning hoitakse 6 tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõu ja sobiva mähisega naha peal.

Katselapid peavad olema oklusiivsed. Kasutamiseks sobib umbes 4–6 cm2 suurune puuvillalapike ning see võib olla ümmargune või kandiline. Oklusiooni tagamiseks soovitatakse sobivat kinnitusmehhanismi. Mähise kasutamisel võib olla vaja täiendavat kokkupuudet.

Võrdlusrühma 0-päev

Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Vehiikel asetatakse katsepinnale samal viisil kui katserühma puhul. Katselappe hoitakse 6 tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõuga ja sobiva mähisega naha peal. Kui on võimalik tõestada, et platseeboravi saavat võrdlusrühma ei ole vaja, võib kasutada varem kasutamata võrdlusrühma.

Katse- ja võrdlusrühma 6.–8. ja 13.–15. päev

Samas katsepiirkonnas, 6.–8. ja siis jälle 13.–15. päevaga samal küljel viiakse läbi samasugune kokkupuude nagu 0-päeval (vajaduse korral puhastatakse nahk karvadest).

1.5.2.3.2. Nakatumise esilekutsumine

Katse- ja võrdlusrühma 27.–29. päev

Katserühma ja võrdlusrühma loomade külg, mis ei ole seni uuritava ainega kokkupuutes olnud, puhastatakse karvadest. Oklusioonlapp või nõu, milles on piisaval määral kõrgeima mitteärritava kontsentratsiooniga uuritavat ainet, pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade selle külje tagaosale, millel ei ole veel katset läbi viidud.

Vajaduse korral pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade käsitlemata külje tagaosale vehiikelit sisaldav oklusioonlapp või -nõu. Neid lappe või nõusid hoitakse sobiva mähisega 6 tundi naha vastas.

1.5.2.3.3. Vaatlus ja hindamine:

- umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist puhastatakse karvadest ala, millel nakatumine esile kutsuti;

- umbes kolm tundi hiljem (umbes 30 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi katsepiirkonda asetamist) vaadeldakse nahareaktsioone ning need märgitakse üles vastavalt liites esitatud hindamisskaalale;

- umbes 24 tundi pärast 30 tundi kestnud vaatlusperioodi (umbes 54 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi nahapinnale asetamist) vaadeldakse nahareaktsioone uuesti ning tulemused märgitakse üles.

Katse tulemusi tuleks hinnata soovitatavalt pimemeetodiga.

Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsustada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise nakatumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) läbiviimist umbes nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib läbi viia ka esialgse võrdlusrühmaga.

Kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid mõjusid, tuleks vaadelda ja need tuleks üles märkida Magnusson/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta nahavoldi paksust.

2. ANDMED (GPMT JA BUEHLER)

Andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga looma kohta märgitud kõikidel vaatlustel täheldatud nahareaktsioonid.

3. ARUANDLUS (GPMT JA BUEHLER)

Kui enne merisigade maksimeerimise katset viiakse läbi sõeluuring, tuleb koos katse- ja võrdlusrühmaga saadud tulemustega esitada ka katse (nt paikne lümfisõlmede uuring (LLNA), hiire kõva turse määratlemise katse (MEST)) kirjeldus või viide sellele, sealhulgas meetodi üksikasjad.

Katsearuanne (GMPT ja Buehleri katse)

Katseruanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:

Katseloomad:

- kasutatud merisea aretusliin;

- loomade arv, vanus ja sugu;

- päritolu, pidamistingimused, toit jne;

- iga looma kaal katse alguses.

Katsetingimused:

- lapi asetuskoha ettevalmistamise meetod;

- lapi materjali ja lappide asetamise meetodi üksikasjad;

- prooviuuringu tulemused ning järeldused katses kasutatavate induktsiooni- ja nakatumist esile kutsuvate kontsentratsioonide kohta;

- uuritava aine ettevalmistamise, kasutamise ja eemaldamise üksikasjad;

- vehiikeli valiku põhjendus;

- induktsioonkokkupuutes ja nakatumise esilekutsumisel kasutatud vehiikeli ja uuritava aine kontsentratsioonid ning induktsiooni ja nakatumise esilekutsumise ajal kasutatud aine kogumäär.

Tulemused:

- kokkuvõte kõige värskemate tundlikkuse ja usaldusväärsuse kontrollide tulemuste kohta (vt 1.3), sealhulgas teave kasutatud aine, kontsentratsiooni ja vehiikeli kohta;

- iga looma kohta, sealhulgas hindamissüsteem;

- täheldatud toime iseärasuse ja määra kirjeldus;

- histopatoloogilised leiud.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED

Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 406.

Liide

TABEL:

Magnusson/Kligmani hindamisskaala mähiskatsega esilekutsutava reaktsiooni hindamiseks

0 = | nähtavat muutust ei esine |

1 = | juhuslik või laiguline punetus |

2 = | mõõdukas ja kokkuvalgunud punetus |

3 = | intensiivne punetus ja paistetus |

"

--------------------------------------------------

IVD LISA

B.7 TOKSILINE TOIME KORDUSDOOSI TÕTTU (28 PÄEVA) (SUUKAUDNE)

1. MEETOD

1.1. Sissejuhatus

Vt üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. Mõisted

Vt üldise sissejuhatuse B osa.

1.3. Uurimismeetodi põhimõte

Uuritav aine manustatakse erinevatele katseloomade rühmadele suu kaudu kord päevas astmeliselt suureneva koguse kaupa selliselt, et üks rühm saaks 28 päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamisperioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.

Selleks et saada võimalikult palju teavet, asetab see meetod lõpp-punktina suuremat rõhku neuroloogilistele mõjudele ning loomade põhjaliku kliinilise vaatlemise vajadusele. Meetod peaks identifitseerima neurotoksilisi kemikaale, mis võivad nõuda neurotoksilisuse osas täiendavat ja põhjalikumat uurimist. Lisaks sellele võib meetod anda teavet immunoloogiliste mõjude ja paljunemisorganeid kahjustava toksilisuse kohta.

1.4. Uurimismeetodi kirjeldus

1.4.1. Valmistised

Terved ja noored täiskasvanud loomad määratakse võrdlus- ja katserühmadesse juhuslikult. Puurid peaksid asetsema selliselt, et nende asukohast tingitud võimalikud mõjud oleksid minimaalsed. Loomad märgistatakse eristamise eesmärgil ning neid hoitakse vähemalt 5 päeva enne katse algust puurides, et nad jõuaksid laboritingimustega kohaneda.

Uuritav aine manustatakse kunstlikult või koos toidu või joogiveega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja aine füüsikalis-keemilistest omadustest.

Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peab teadma vehiikeli toksilisi omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava aine stabiilsus vehiikelis.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.1. Katseloomad

Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi. Katseloomadena tuleks kasutada üldkasutatavate tervete täiskasvanud laboratooriumiloomade aretusliine. Emasloomad peaksid olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Doseerimisega tuleks alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist.

Uuringu alguses peaks loomade kaaluerinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kaalust.

Kui korduva suukaudse manustamisega uuringule järgneb pikaajaline uuring, tuleks mõlemas uuringus kasutada samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.

1.4.2.2. Arv ja sugu

Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt 10 looma (5 emaslooma ja 5 isaslooma). Kui osa loomi on kavas katse käigus tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada.

Lisaks sellele võib 10 loomast (5 emaslooma ja 5 isaslooma) koosnevale satelliitrühmale 28 päeva jooksul manustada suure doositaseme ning jälgida 14 päeva jooksul pärast selle manustamist, kas toksiline toime on pöörduv, püsiv või kas toksilise toime avaldumine hilineb. Kasutatakse ka 10 võrdlusloomast (5 emaslooma ja 5 isaslooma) koosnevat satelliitrühma.

1.4.2.3. Doositasemed

Üldiselt tuleks kasutada kolme katserühma ja ühte võrdlusrühma. Võrdlusrühma loomi tuleks käsitleda samal viisil kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava aine manustamisel. Kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehiikelit, tuleb võrdlusrühmale manustada vehiikelit suurimas kasutatud mahus.

Kui muude andmete hindamise põhjal võib arvata, et päevadoosil 1000 mg eluskaalu kg kohta ei ole eeldatavasti mõju, võib läbi viia piirsisalduskatse. Kui vajalikke andmeid ei ole, võib kasutatavate dooside kindlaksmääramise hõlbustamiseks läbi viia doosipiirkonna määramise katse.

Doosimäärade valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava aine või sellega seotud ainete toksilisust käsitlevaid ja (toksikoloogilis)kineetilisi andmeid. Toksilise toime esilekutsumise eesmärgil tuleks valida kõrgeim doositase, kuid vältida tuleks surma või tõsiseid kannatusi esile kutsuvat doositaset. Seejärel tuleks doosist tuleneva reaktsiooni ja madalaimal doositasemel täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) demonstreerimiseks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed. Kahanevate doositasemete puhul on tavaliselt optimaalsed kahe- kuni neljakordsed intervallid ja väga pikkadele intervallidele (nt kui koefitsient on suurem kui 10) eelistatakse tavaliselt neljanda katserühma lisamist.

Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tavalist toitumise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse. Kui ainet manustatakse kunstlikult, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase.

Kui pärast kordusdoosi uuringut viiakse läbi pikaajaline uuring, tuleks mõlema uuringu puhul kasutada samasugust toitu.

1.4.2.4. Piirsisalduskatse

Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil vähemalt 1000 mg kehakaalu kg kohta, või uuritava aine manustamisel (kehakaalu määramistele tuginedes) protsentuaalselt samal määral söögi või toidu kaudu, märkimisväärset toksilist mõju ja kui toksilisus ei ole sarnase struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta täielikku kolme doositasemega uuringut vajalikuks. Läbi võib viia piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.

1.4.2.5. Vaatlusperiood

Vaatlusperiood peaks olema 28 päeva. Satelliitrühma kuuluvatele loomadele, kelle osas viiakse läbi järelvaatlus, ei tohiks uuritavat ainet toksilise toime hilinenud ilmnemise, selle püsimise või sellest toibumise tuvastamise eesmärgil veel vähemalt 14 päeva jooksul manustada.

1.4.3. Analüüsi käik

Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 28 päeva jooksul; nädalas viiepäevase doseerimismeetodi kasutamist tuleb põhjendada. Kui uuritavat ainet manustatakse kunstlikult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mille puhul on lubatud 2 ml kehakaalu 100 g kohta. Välja arvatud ärritavate või söövitavate ainete puhul, millel on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu varieeruvus muuta minimaalseks sellega, et kõikidel doositasemetel kohandatakse ühesuguse mahu tagamiseks kontsentratsiooni.

1.4.3.1. Üldised märkused

Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks läbi viia vähemalt kord päevas, soovitavalt iga kord samal ajal ning võttes arvesse, et oodatud tulemusi esineb kõige rohkem pärast doseerimist. Üles tuleks märkida loomade tervislik seisund. Vähemalt kaks korda päevas tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud. Haigestunud loomad ja loomad, kellele esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.

Kõikide loomade puhul tuleks üksikasjalik kliiniline vaatlus läbi viia enne seda, kui loomale esimest korda uuritavat ainet manustatakse (selleks, et oleks võimalik teha võrdlusi ühe looma põhjal) ning seejärel vähemalt kord nädalas. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, selleks ettenähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori poolt fikseeritud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimuste varieeruvus oleks võimalikult minimaalne ja et eelistatult poleks vaatlejad uuritava aine manustamisest teadlikud. Tuvastatud märgid peaksid hõlmama lisaks muule muutusi nahal, karvades, silmades, limaskestas, ekstraktide ja eritiste esinemist ning autonoomseid toiminguid (nt pisarate vool, piloerektsioon, pupillide suurus, ebaregulaarne hingamine). Samuti tuleks üles märkida muudatused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldus, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, vastupidine käitumine).

Neljandal kokkupuutenädalal tuleks hinnata sensoorseid reaktsioone erinevat liiki ärritustele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele), samuti haardetugevust ja motoorset tegevust. Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud kirjanduse loetelus (vt üldise sissejuhatuse B osa).

Neljandal kokkupuutenädalal läbiviidud funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta juhul, kui uuring viiakse läbi subkroonilise toksilisuse 90päevase uuringu eeluuringuna. Sellisel juhul tuleks funktsionaalsed vaatlused hõlmata käesolevasse järeluuringusse. Teiselt poolt võivad kordusdoosi uuringu käigus saadud funktsionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgneva subkroonilise uuringu jaoks doositasemete valimist.

Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta rühmade puhul, millel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see takistaks märkimisväärselt funktsionaalsete katsete läbiviimist.

1.4.3.2. Kehakaal ja toidu/vee tarbimine

Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu ja vee tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta.

1.4.3.3. Hematoloogia

Katseperioodi lõpus tuleks läbi viia järgmised hematoloogilised uuringud: hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja diferentseeritud arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine.

Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja vahetult enne loomade tapmist või selle ajal ning neid tuleks säilitada sobivates tingimustes.

1.4.3.4. Kliiniline biokeemia

Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uurimiseks kudedes ja eelkõige nende toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks läbi viia vereproovidega, mis on võetud loomadelt vahetult enne tapmist või selle ajal (välja arvatud loomad, kes leiti surevana ja/või tapeti katse ajal). Loomadele soovitatakse vereproovi võtmisele eelneval ööl süüa mitte anda. [1] Plasma- või seerumiuuringud peavad hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldkolesterooli, karbamiidi, kreatiniini, üldvalku ja albumiini, vähemalt kahte hepatotsellulaarsele toimele osutavat ensüümi (näiteks alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, aluseline fosfataas, gamma-glutamüültranspeptidaas, ja sorbitooldehüdrogenaas). Muude maksaensüümide või muud päritolu ensüümide ja sapphapete mõõtmised võivad teatavatel tingimustel anda kasulikku teavet.

Alternatiivselt on uuringu viimasel nädalal võimalik loomadelt uriiniproovide kogumise teel läbi viia järgmisi uriinianalüüse: välised tunnused, maht, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valgud, glükoos ja veri/vererakud.

Lisaks sellele tuleks uurida, kas seerumis on üldistele koekahjustustele osutavaid markereid. Muud määramised, mis tuleks läbi viia juhul, kui uuritava aine teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõjutavad eeldatavasti sellega seotud ainevahetuse profiili, hõlmavad kaltsiumi, fosfaati, triglütseriide, mis on määratud enne sööki, teatavaid hormoone, methemoglobiini ja koliinesteraasi. Need on vaja määrata teatavatesse klassidesse kuuluvate ainete puhul või konkreetsete juhtude põhiselt.

Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi, mis sõltub vastava aine liigist ja selle täheldatud ja/või oodatud toimest.

Kui varasemad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks enne doseerimise alustamist määrata hematoloogilised ja kliinilis-biokeemilised muutujad.

1.4.3.5. Täielik lahang

Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade maksalt, neerudelt, neerupealsetelt, munanditelt, munandimanustelt, harknäärmelt, põrnalt, ajult ja südamelt tuleb vajaduse korral kõik koed eemaldada ning nende märgkaal määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast dissekteerimist.

Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju, ajusild), seljaaju, magu, jämesool ja peensool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, neerud, neerupealsed, põrn, süda, harknääre, kilpnääre, hingetoru ja kopsud (kopsud pumbatakse fiksaatorit täis ja pannakse fiksaatorisse), sugunäärmed, suguelundid (nt emakas, eesnääre), põis, lümfisõlmed (eelistatult üks lümfisõlm, mis hõlmab manustamiskohta, ja teine lümfisõlm, mis on manustamiskohast eemal, et anda teavet süsteemse toime kohta), perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv), mis on eelistatult lihase lähedal, ning osa luuüdi (või alternatiivselt väike kogus toorest luuüdi). Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tulenevalt tõenäoliselt sihtorganid.

1.4.3.6. Histopatoloogiline uuring

Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. Histopatoloogilised uuringud tuleks läbi viia ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud muudatusi.

Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.

Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuring viia läbi nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime kui katserühma puhul.

2. ANDMED

Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, kellel neid esines.

Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.

3. ARUANDLUS

Katsearuanne

Katseruanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:

Katseloomad:

- kasutatud liik/aretusliin;

- loomade arv, vanus ja sugu;

- päritolu, pidamistingimused, toit jne;

- iga looma kaal katse alguses, pärast iga nädalat ning katse lõpus.

Katsetingimused:

- vehiikeli valiku põhjendamine, kui vehiikeliks ei ole vesi;

- doositaseme valimise põhjendus;

- üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmistises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;

- uuritava aine manustamise üksikasjad;

- vajaduse korral toidus/joogivees oleva uuritava aine määra (ppm) muundamine tegelikuks päevadoosiks (mg kehakaalu kg kohta);

- toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.

Tulemused:

- eluskaal/muutused eluskaalus;

- toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;

- toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas toksilisuse märgid;

- kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);

- sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamine;

- hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;

- kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;

- kehakaal tapmise ajal ja organite kaal;

- lahkamise tulemused;

- histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;

- võimaluse korral andmed imendumise kohta;

- vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED

Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 407.

[1] Mitmete seerumi ja plasma, peamiselt glükoosi mõõtmiste korral ei tohiks loomadele eelneva öö jooksul toitu anda. Selle peamiseks põhjuseks on see, et toidu andmise korral oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning muudaks tõlgendamise raskeks. Teisest küljest võib see aga häirida loomade tavapärast üldist ainevahetust ja eelkõige toitumise uuringute puhul võib see häirida igapäevaseid kokkupuuteid uuritava ainega. Kui loomadele ei anta öö jooksul toitu, tuleks uuringu neljandal nädalal läbiviidud funktsionaalsete vaatluste järel läbi viia kliinilis-biokeemilised määramised.

--------------------------------------------------

IVE LISA

"

B.37 FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUS PÄRAST ÄGEDAT KOKKUPUUTUMIST

1. MEETOD

1.1. Sissejuhatus

Ainete toksilise toime iseloomustamisel ja hindamisel on oluline vaadelda teatavate aineklasside potentsiaali põhjustada spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla võimalik teiste toksilisuse uuringutega tuvastada. Teatavad fosfororgaanilised ained põhjustavad viivistoimega neurotoksilisust ja neid tuleks pidada võimalikeks uurimisobjektideks.

Viivistoimega polüneuropaatiat põhjustada võivate ainete tuvastamiseks tuleks kasutada in vitro sõelumiskatseid; in vitro uuringute negatiivsed leiud ei tõenda, et uuritav aine ei ole neurotoksiline.

Vt üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. Mõisted

Fosfororgaanilised ained sisaldavad laenguta fosfororgaanilisi estreid või fosfororgaaniliste või fosfoonorgaaniliste või orgaaniliste fosforamidohapete või analoogsete fosfortio, fosfoontio või fosfortioamidohapete tioestrid või anhüdriide, mis võivad põhjustada selle aineklassi puhul täheldatavat viivistoimega neurotoksilisust.

Viivistoimega neurotoksilisus on sündroom, mis on seotud pika viivitusega ataksia, seljaaju ja perifeerse närvi distaalse aksonopaatia ilmnemisel ja närvikoes neuropaatia siht-esteraasi (NTE) takistamise ja vananemisega.

1.3. Võrdlusmaterjal

Võrdlusmaterjali võib uurida positiivse võrdlusrühmaga tõestamaks, et uuritava liigi vastus ei ole laboratoorsetel katsetingimustel märkimisväärselt muutunud.

Üks näide laialdaselt kasutatud neurotoksilisest ainest on o-tolüül-3-fosfaat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS nomenklatuur: fosforhape, tris(2-metüülfenüül)ester), samuti tuntud kui tris-o-kresüülfosfaat.

1.4. Uurimismeetodi põhimõte

Uuritav aine manustatakse suu kaudu ühekordse doosina kanadele, keda on vajaduse korral kaitstud ägedate kolinergiliste mõjude eest. Loomi vaadeldakse käitumuslike kõrvalekallete, ataksia ja paralüüsi tuvastamiseks 21 päeva. Biokeemilised mõõtmised, eelkõige neuropaatia siht-esteraasi pidurdamine (NTE), viiakse läbi tavaliselt 24 ja 48 tundi pärast doosi andmist igast rühmast juhuslikkuse printsiibil valitud kanadel. 21 päeva pärast kokkupuudet tapetakse ülejäänud kanad ning seejärel viiakse läbi valitud närvikudede histopatoloogiline uuring.

1.5. Uurimismeetodi kirjeldus

1.5.1. Valmistised

Noored terved täiskasvanud kanad, kellel ei esine takistavaid viirushaigusi, kellele ei manustata ravimeid ja kelle kõnnakus ei esine kõrvalekaldeid, jagatakse juhuslikkuse printsiibil katse- ja võrdlusrühmadesse ning seejärel lastakse neil vähemalt 5 päeva enne uuringu algust laboritingimustega kohaneda.

Kasutada tuleks puure või piirdeaedu, mis on piisavalt suured, et kanad saaksid vabalt liikuda ja et neid saaks kergesti vaadelda.

Uuritav aine tuleks tavaliselt manustada sondi, želatiinikapslite või mõne samaväärse meetodi abil suu kaudu. Vedelikke võib anda lahjendamata kujul või sobivas vehiikelis (nt maisiõli) lahustatuna; tahked ained tuleks võimaluse korral lahustada, kuna suured kogused ei pruugi želatiinikapslites täielikult absorbeeruda. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised omadused ning kui need ei ole teada, tuleks need enne katse läbiviimist kindlaks teha.

1.5.2. Katsetingimused

1.5.2.1. Katseloomad

Soovitatakse kasutada noori, 8–12 kuu vanuseid täiskasvanud munakanu (Gallus gallus domesticus). Kasutada tuleks normaalsuuruses ja -aretusliini kanu ning kanad peaksid üldjuhul olema kasvatatud tingimuses, kus neil oli võimalik vabalt liikuda.

1.5.2.2. Arv ja sugu

Lisaks katserühmale tuleks kasutada nii võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, kui ka positiivset võrdlusrühma. Võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, tuleks käsitada samal viisil kui katserühma, välja arvatud uuritava aine manustamise osas.

Igas lindude rühmas peab olema piisav arv kanu, et biokeemiliste määramiste tegemiseks oleks võimalik tappa vähemalt kuus lindu (kolm lindu kahel eri ajahetkel) ja et kuus lindu jääksid ellu 21päevase vaatlusperioodi ajaks patoloogiauuringu läbiviimiseks.

Positiivset võrdlusrühma võib uurida samaaegselt või hilisema võrdlusrühmana. Positiivses võrdlusrühmas peaks olema vähemalt kuus kana, kellele on manustatud tuntud viivistoimega neurotoksilist ainet, kolme kana puhul viiakse läbi biokeemiline uuring ja kolmel kanal patoloogiline uuring. Varasemaid andmeid tuleks korrapäraselt ajakohastada. Uued positiivse võrdlusrühma andmed on vajalikud siis, kui katset läbi viiv laboratoorium on mõnda katse läbiviimiseks olulist elementi (aretusliin, toit, pidamistingimused) muutnud.

1.5.2.3. Doositasemed

Põhiuuringus kasutatav doositase tuleb määrata kindlaks eeluuringus, milles kasutatakse asjakohasel arvul kanu ja doositasemerühmasid. Selleks et määrata kindlaks piisav doos põhiuuringu jaoks, peab eeluuringus tavaliselt mõni lind surema. Vältimaks surma ägedate kolinergiliste mõjude tagajärjel, võib siiski kasutada atropiini või mõnda teist uuritavat ainet, mis teadaolevalt ei mõjuta viivistoimega neurotoksilisi reaktsioone. Uuritava aine mittesurmava maksimaalse doosi (vt meetod B.1 bis) määramiseks võib kasutada erinevaid uurimismeetodeid. Doosi valikul võib abi olla varasematest andmetest või muust toksikoloogilisest teabest.

Uuritava aine doositase peaks põhiuuringus olema võimalikult kõrge, võttes võimaluse korral arvesse doosivaliku eeluuringu tulemusi ja ülemist piirdoosi 2000 mg kehakaalu kg kohta. Suremus ei tohiks olla nii suur, et see takistaks 21. päeval allesjäävate loomadega läbi viia biokeemilist uuringut (kuus katselooma) ja histoloogilist uuringut (kuus katselooma). Vältimaks surma ägedate kolinergiliste mõjude tagajärjel, võib kasutada atropiini või mõnda teist kaitseainet, mis teadaolevalt ei mõjuta viivistoimega neurotoksilisi reaktsioone.

1.5.2.4. Piirsisalduskatse

Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil 2000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole sarnase struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga uuringut vajalikuks. Läbi võib viia piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.

1.5.2.5. Vaatlusperiood

Vaatlusperiood peaks olema 21 päeva.

1.5.3. Analüüsi käik

Pärast kaitseaine manustamist ägedast kolinergilisest toimest tuleneva surma vältimiseks manustatakse uuritav aine ühekordse doosina.

1.5.3.1. Üldine vaatlus

Vaatlused peaksid algama kohe pärast kokkupuudet. Kõiki kanu tuleks esimese kahe päeva jooksul mitu korda hoolikalt vaadelda ning seejärel 21 päeva jooksul või kuni kavandatud tapmiseni vähemalt kord päevas. Kõik toksilisuse märgid tuleks üles märkida, sealhulgas ilmnemise aeg, liik, raskusaste ja käitumuslike kõrvalekallete kestus. Ataksiat tuleks mõõta ordinaalse hindamisskaalaga, milles on vähemalt neli taset, ja paralüüsi esinemine tuleks registreerida. Patoloogilise uuringu jaoks välja valitud kanu tuleks vähemalt kaks korda nädalas puurist välja lasta ning neid tuleks väiksemate toksiliste mõjude hindamise hõlbustamiseks liikuma sundida (näiteks redelil ronimine). Haigestunud loomad ja loomad, kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.

1.5.3.2. Kehakaal

Kõiki kanu tuleks kaaluda vahetult enne uuritava aine manustamist ning seejärel vähemalt kord nädalas.

1.5.3.3. Biokeemia

Kuus juhuslikult valitud kana igast katserühmast ja võrdlusrühmast, millele antakse vehiikelit, ja kolm kana positiivsest võrdlusrühmast (kui katse viiakse läbi samaaegselt) tuleks tappa mõne päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist ning ajust ja nimmelülidest valmistatud valmistist hinnatakse neuropaatia siht-esteraasi (NTE) pidurdamisaktiivsuse osas. Lisaks sellele tuleks neuropaatia siht-esteraasi pidurdamisaktiivsuseks ette valmistada ja analüüsida istmikunärvi kude. Tavaliselt tapetakse 24 ja 48 tunni pärast kolm võrdlusrühma ja iga katserühma lindu ning 24 tunni pärast tuleks tappa ka kolm positiivsesse võrdlusrühma kuuluvat lindu. Kui toksilisuse kliiniliste märkide vaatlus (mida on võimalik hinnata kolinergiliste märkide ilmnemise aja vaatlemisel) viitab toksilise aine eriti aeglasele kõrvaldamisele, on soovitav võtta kahel erineval ajahetkel 24–72 tunni jooksul pärast manustamist kolmelt linnult koeproov.

Vajaduse korral võib nende proovidega läbi viia ka atsetüülkoliinesteraasi analüüsi (AChE). AChE võib siiski spontaanselt in vivo reaktiveeruda ja tuua kaasa selle, et aine potentsiaali AChE inhibiitorina alahinnatakse.

1.5.3.4. Täielik lahang

Kõikide loomade (kelle tapmine oli kavatsetud ja kes olid suremas) täielik lahang peaks hõlmama aju ja seljaaju väliste tunnuste vaatlemist.

1.5.3.5. Histopatoloogiline uuring

Vaatlusperioodil ellujäänud ja biokeemilistes uuringutes kasutamata loomade närvikude tuleks mikroskoopiliselt uurida. Koed tuleks kinnitada perfusiooni abil kohapeal. Lõiked tuleks võtta väikeajust (keskmiselt pikitasandilt), piklikajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest. Seljaaju puhul tuleb lõiked võtta ülemistest kaelalülidest, kesktorakaalosast ja lumbosakraalosast. Tuleks võtta lõiked ka tibiaalnärvi distaalsest osast ja selle kaksiksääremarjalihase harudest ja istmikunärvist. Lõiked tuleks katta sobivate müeliini- ja aksonispetsiifiliste ainetega.

2. ANDMED

Käesolevas meetodis valitud lõpp-punktide (biokeemia, histopatoloogia ja käitumuslik vaatlus) negatiivsed tulemused ei nõua tavapäraselt täiendavat uurimist viivistoimega neurotoksilisuse osas. Nendes lõpp-punktides saadud ebaselged või poolikud tulemused võivad nõuda täiendavat hindamist.

Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, vigastustega loomade arv, toime käitumisele või biokeemiline toime, kahjustuste või toime liik ja raskusaste, loomade protsent iga tüüpi vigastuste ja raskusastmete kohta.

Käesoleva uuringu tulemusi tuleks hinnata käitumuslike, biokeemiliste ja histopatoloogiliste mõjude esinemise, raskusastme ja korrelatsiooni põhjal ja katse- või võrdlusrühmas täheldatud muude mõjude suhtes.

Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistiliste meetoditega. Kasutatavad statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.

3. ARUANDLUS

Katsearuanne

Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:

Katseloomad:

- kasutatud aretusliin;

- loomade arv ja vanus;

- päritolu, pidamistingimused, toit jne;

- iga looma kaal katse alguses.

Katsetingimused:

- uuritava aine ettevalmistamise, stabiilsuse ja homogeensuse üksikasjad; vajaduse korral;

- vehiikeli valiku põhjendus;

- uuritava aine manustamise üksikasjad;

- toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad;

- doosi valimise põhjendused;

- manustatud dooside üksikasjad, sealhulgas andmed vehiikeli, mahu ja manustatud aine füüsilise vormi kohta;

- võimalike kaitseainete identifitseerimine ja nende manustamise üksikasjad.

Tulemused:

- kehakaalu andmed;

- toksilise reaktsiooni andmed vastavalt rühmale, sealhulgas suremus;

- kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);

- biokeemiliste meetodite ja leidude üksikasjalik kirjeldus;

- lahkamise tulemused;

- histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;

- vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED

Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 418.

B.38 FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUSE 28PÄEVANE KORDUSDOOSI UURING

1. MEETOD

1.1. Sissejuhatus

Ainete toksilise toime iseloomustamisel ja hindamisel on oluline vaadelda teatavate aineklasside potentsiaali põhjustada spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla võimalik teiste toksilisuse uuringutega tuvastada. Teatavad fosfororgaanilised ained põhjustavad viivistoimega neurotoksilisust ja neid tuleks pidada võimalikeks uurimisobjektideks.

Nende ainete tuvastamiseks, mis võivad põhjustada viivistoimega polüneuropaatiat, tuleks kasutada in vitro sõelumiskatseid; in vitro uuringute negatiivsed leiud ei tõenda, et uuritav aine ei ole neurotoksiline.

Käesolev 28päevane viivistoimega neurotoksilisuse katse annab teavet võimalike ohtude kohta tervisele, mis võivad tõenäoliselt tuleneda korduvatest kokkupuudetest piiratud ajavahemiku jooksul. Nimetatud uuringuga saab teavet doosireaktsiooni kohta ning selle abil on võimalik hinnata täheldatava kahjuliku toimeta doosi taset, mis aitaks määrata kokkupuute ohutuskriteeriumeid.

Vt samuti üldise sissejuhatuse B osa.

1.2. Mõisted

Fosfororgaanilised ained sisaldavad laenguta fosfororgaanilisi estreid või fosfororgaaniliste või fosfoonorgaaniliste või orgaaniliste fosforamidohapete või analoogsete fosfortio, fosfoontio või fosfortioamidohapete tioestreid või anhüdriide, mis võivad põhjustada selle aineklassi puhul täheldatavat viivistoimega neurotoksilisust.

Viivistoimega neurotoksilisus on sündroom, mis on seotud pika viivitusega ataksia, seljaaju ja perifeerse närvi distaalse aksonopaatia ilmnemisel ja närvikoes neuropaatia siht-esteraasi (NTE) takistamise ja vananemisega.

1.3. Uurimismeetodi põhimõte

Uuritava aine päevaseid doose manustatakse kanadele suu kaudu 28 päeva jooksul. Loomi vaadeldakse vähemalt kord päevas käitumuslike kõrvalekallete, ataksia ja paralüüsi tuvastamiseks 14 päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist. Biokeemilised mõõtmised, eelkõige neuropaatia siht-esteraasi pidurdamine (NTE), viiakse läbi igast rühmast juhuslikkuse printsiibil valitud kanadel tavaliselt 24 ja 48 tundi pärast viimase doosi andmist. Kaks nädalat pärast kokkupuudet tapetakse ülejäänud kanad ning viiakse läbi valitud närvikudede histopatoloogiline uuring.

1.4. Uurimismeetodi kirjeldus

1.4.1. Valmistised

Noortel tervetel täiskasvanud kanadel, kellel ei esine takistavaid viirushaigusi, kellele ei manustata ravimeid ja kelle kõnnakus ei esine kõrvalekaldeid, jagatakse juhuslikkuse põhimõtte alusel katse- ja võrdlusrühmadesse ning seejärel lastakse neil vähemalt 5 päeva enne uuringu algust laboritingimustega kohaneda.

Kasutada tuleks puure või piirdeaedu, mis on piisavalt suured, võimaldades kanadel vabalt liikuda ja neid kergesti vaadelda.

Doosid tuleks manustada suu kaudu seitsmel päeval nädalas ning eelistatult sondi või želatiinikapslite abil. Vedelikke võib anda lahjendamata kujul või sobivas vehiikelis (nt maisiõli) lahustatuna; tahked ained tuleks võimaluse korral lahustada, kuna suured kogused ei pruugi želatiinikapslites täielikult absorbeeruda. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised omadused ning kui need ei ole teada, tuleks need enne katse läbiviimist kindlaks teha.

1.4.2. Katsetingimused

1.4.2.1. Katseloomad

Soovitatakse kasutada noori, 8–12 kuu vanuseid täiskasvanud munakanu (Gallus gallus domesticus). Kasutada tuleks normaalsuuruses ja -aretusliini kanu ning kanad peaksid üldjuhul olema kasvatatud tingimuses, kus neil oli võimalik vabalt liikuda.

1.4.2.2. Arv ja sugu

Üldiselt tuleks kasutada kolme katserühma ja ühte vehiikeli võrdlusrühma. Võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, tuleks käsitada samal viisil kui katserühma, välja arvatud uuritava aine manustamise osas.

Igas lindude rühmas peab olema piisav arv kanu selleks, et biokeemiliste määramiste tegemiseks oleks võimalik tappa vähemalt kuus lindu (kolm lindu kahel eri ajahetkel) ja et kuus lindu jääksid ellu 14päevase vaatlusperioodi ajaks patoloogiauuringu läbiviimiseks.

1.4.2.3. Doositasemed

Doositasemete valimisel tuleks arvesse võtta kolme viivistoimega neurotoksilisuse ägeda toksilisuse katse tulemusi ja teisi uuritava ühendi toksilisi või kineetilisi andmeid. Tuleks valida kõrgeim doositase, mille eesmärgiks oleks toksilise toime esilekutsumine, eelistatult viivistoimega neurotoksilisus, kuid vältida tuleks doositaset, mis kutsub esile surma või tõsised kannatused. Seejärel tuleks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed doosist tuleneva reaktsiooni ja madalaimal doositasemel täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) demonstreerimiseks.

1.4.2.4. Piirsisalduskatse

Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil 1000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole sarnase struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga uuringut vajalikuks. Läbi võib viia piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese eeldatav kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.

1.4.2.5. Vaatlusperiood

Kõiki loomi tuleks kokkupuuteperioodi ajal vaadelda vähemalt kord päevas ja pärast seda 14 päeva jooksul kuni kavandatava lahkamiseni.

1.4.3. Analüüsi käik

Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 28 päeva jooksul.

1.4.3.1. Üldised märkused

Vaatlused peaksid algama kohe pärast katse algust. Kõiki kanu tuleks põhjalikult vaadelda 28päevase katseaja jooksul vähemalt kord päevas ja seejärel 14 päeva jooksul pärast manustamist või kuni kavandatava tapmiseni. Kõik toksilisuse märgid tuleks üles märkida, sealhulgas ilmnemise aeg, liik, raskusaste ja kestus. Vaatluste käigus tuleks vaadelda lisaks muule kõrvalekaldeid käitumises. Ataksiat tuleks mõõta ordinaalse hindamisskaalaga, milles on vähemalt neli taset ja paralüüsi esinemine tuleks registreerida. Kanad tuleks vähemalt kaks korda nädalas puurist välja lasta ning neid tuleks väiksemate toksiliste mõjude hindamise hõlbustamiseks liikuma sundida (näiteks redelil ronimine). Haigestunud loomad, kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.

1.4.3.2. Kehakaal

Kõiki kanu tuleks kaaluda vahetult enne uuritava aine esmakordset manustamist ning seejärel iga nädala järel.

1.4.3.3. Biokeemia

Kuus juhuslikult valitud kana igast katserühmast ja võrdlusrühmast, millele antakse vehiikelit, tuleks tappa mõne päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist ning ajust ja nimmelülidest valmistatud valmistist hinnatakse neuropaatia siht-esteraasi (NTE) pidurdamisaktiivsuse osas. Lisaks sellele tuleks ette valmistada ja analüüsida istmikunärvi kude neuropaatia siht-esteraasi (NTE) pidurdamisaktiivsuse osas. Tavaliselt tapetakse kolm võrdlusrühma ja katserühma kuuluvat lindu 24 tunni pärast ja kolm lindu pärast viimase doosi manustamist. Kui ägeda toksilisuse uuringute või muude uuringute (nt toksikokineetika) andmed osutavad sellele, et loomade tapmine peaks toimuma muul ajal kui pärast viimase doosi andmist, tuleks neid aegu järgida ning põhjendused dokumenteerida.

Vajaduse korral võib nende proovidega läbi viia ka atsetüülkoliinesteraasi analüüsi (AChE). AChE võib siiski spontaanselt in vivo reaktiveeruda ja tuua kaasa selle, et aine potentsiaali AChE inhibiitorina alahinnatakse.

1.4.3.4. Täielik lahang

Kõikide loomade (kelle tapmine oli kavatsetud ja kes olid suremas) täielik lahang peaks hõlmama aju ja seljaaju väliste tunnuste vaatlemist.

1.4.3.5. Histopatoloogiline uuring

Vaatlusperioodil ellujäänud ja biokeemilistes uuringutes kasutamata loomade närvikude tuleks mikroskoopiliselt uurida. Koed tuleks kinnitada kohapeal perfusiooni abil. Lõiked tuleks võtta väikeajust (keskmiselt pikitasandilt), piklikajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest. Seljaaju puhul tuleb lõiked võtta ülemistest kaelalülidest, kesktorakaalosast ja lumbosakraalosast. Tuleks võtta lõiked ka tibiaalnärvi distaalsest osast ja selle kaksiksääremarjalihase harudest ja istmikunärvist. Lõiked tuleks katta sobivate müeliini- ja aksonispetsiifiliste ainetega. Alguses tuleks kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud kudesid mikroskoopiliselt uurida. Kui kõrge doosiga rühmade puhul on toime kohta tõendid olemas, tuleks mikroskoopiline uuring viia läbi ka keskmise ja madala doosiga rühmade puhul.

2. ANDMED

Käesolevas meetodis valitud lõpp-punktide (biokeemia, histopatoloogia ja käitumuslik vaatlus) negatiivsed tulemused ei nõua tavapäraselt täiendavat uurimist viivistoimega neurotoksilisuse osas. Nendes lõpp-punktides saadud ebaselged või poolikud tulemused võivad nõuda täiendavat hindamist.

Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, vigastustega loomade arv, toime käitumisele või biokeemiline toime, kahjustuste või toime liik ja raskusaste, loomade protsent iga tüüpi vigastuste ja raskusastmete kohta.

Käesoleva uuringu tulemusi tuleks hinnata käitumuslike, biokeemiliste ja histopatoloogiliste mõjude esinemise, raskusastme ja korrelatsiooni põhjal ja katse või võrdlusrühmas täheldatud muude mõjude suhtes.

Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistiliste meetoditega. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.

3. ARUANDLUS

Katsearuanne

Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:

Katseloomad:

- kasutatud aretusliin;

- loomade arv ja vanus;

- päritolu, pidamistingimused, toit jne;

- iga looma kaal katse alguses.

Katsetingimused:

- uuritava aine ettevalmistamise, stabiilsuse ja homogeensuse üksikasjad, kui see on asjakohane;

- vehiikeli valiku põhjendus;

- uuritava aine manustamise üksikasjad;

- toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad;

- doosi valimise põhjendused;

- manustatud dooside üksikasjad, sealhulgas andmed vehiikeli, mahu ja manustatud aine füüsilise vormi kohta;

- teiste biokeemiliste määramiste aegade valimise põhjendus, kui selleks ei ole 24 või 48 tundi.

Tulemused:

- kehakaalu andmed;

- toksilise reaktsiooni andmed vastavalt doositasemele, sealhulgas suremus;

- täheldatava kahjuliku toimeta doos;

- kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);

- biokeemiliste meetodite ja leidude üksikasjalik kirjeldus;

- lahkamise tulemused;

- histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;

- vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.

Tulemuste üle arutlemine.

Järeldused.

4. VIITED

Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 419.

"

--------------------------------------------------

V LISA

Vt komisjoni direktiiv 2001/59/EÜ, EÜT L 225, 21.8.2001 lk 1.

--------------------------------------------------