KOMISJONI DIREKTIIV 2006/56/EÜ,

12. juuni 2006,

millega muudetakse kartuli-ringmädaniku tõrjet käsitleva nõukogu direktiivi 93/85/EMÜ lisasid

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse kartuli-ringmädaniku tõrjet käsitlevat nõukogu 4. oktoobri 1993. aasta direktiivi 93/85/EMÜ, (1) eriti selle artiklit 12,

ning arvestades järgmist:

Üks kartulile kahjulikke organisme on Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., kartuli-ringmädaniku haigusetekitaja (edaspidi “organism”).

Direktiivis 93/85/EMÜ on sätestatud üksikasjalikud meetmed, mida liikmesriigid peavad võtma organismi vastu, et kindlaks teha selle asukoht ja levik; vältida selle esinemist ja levikut; avastamise korral vältida selle levikut ja tõrjuda haigust likvideerimise eesmärgil.

Avastamis- ja kindlaksmääramismenetlusse on inkorporeeritud sellised hiljuti väljatöötatud menetlused nagu fluorestsents in situ hübridisatsioon (FISH) ja polümeraasi ahelreaktsioon (polymerase chain reaction – PCR) ning praeguse avastamis- ja kindlaksmääramismenetluse erinevate tehniliste osade täiustused.

Tõrjemeetmete tehniliste osade puhul on täiendatud järgmisi osi: laboratoorselt analüüsitud kontrollproovide säilitamine nii, et oleks võimalik tagada organismi tagantjärele kindlakstegemine, võimaliku saastumise ulatuse kindlaksmääramiseks vajalikud tegurid, organismi mis tahes kinnitatud esinemisest ja asjaomasest saastunud tsoonist teatamise üksikasjad, saastunuks tunnistatud tootmiskohtades ja piiritletud tsoonides rakendatavad meetmed.

ON VASTU VÕTNUD JÄRGMISE DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 93/85/EMÜ lisad asendatakse käesoleva direktiivi lisas olevate vastavate tekstidega.

Artikkel 2

1. Liikmesriigid võtavad vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 31. märtsiks 2007. Liikmesriigid edastavad viivitamata komisjonile kõnealuste normide teksti ning nende normide ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli.

Liikmesriigid kohaldavad neid norme alates 1. aprillist 2007.

Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse normidesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2. Liikmesriigid edastavad viivitamata komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastu võetud põhiliste riigisiseste õigusnormide teksti.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

(1) EÜT L 259, 18.10.1993, lk 2.

I LISA

RINGMÄDANIKU BAKTERI CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. DIAGNOOSIMISE, AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE ANALÜÜSIMETOODIKA

ANALÜÜSIMETOODIKA RAKENDUSALA

Käesoleva metoodikaga kirjeldatakse eri menetlusi, mis on seotud:

i) ringmädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja -taimedes;

ii) bakteri Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus avastamisega kartulimugulates ja -taimedes;

iii) bakteri Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus) kindlaksmääramisega.

ÜLDPÕHIMÕTTED

Erinevate meetodite optimeeritud protokollid, valideeritud reaktiivid ning üksikasjad analüüsi ja kontrollainete ettevalmistuse kohta on sätestatud liidetes. Liites 1 on sätestatud laborite nimekiri, mis tegelesid protokollide optimeerimise ja valideerimisega.

Kuna protokollid hõlmavad ohtliku organismi avastamist ja bakteri C. m. subsp. sepedonicus elujõuliste kultuuride kasutamist kontrollmaterjalina, tuleb menetlus läbi viia sobivates karantiinitingimustes, kus on kohased jäätmete kõrvaldamise seadmed ning ametlike taimekarantiini asutuste välja antud litsentside kohased tingimused.

Analüüsiparameetrid peavad tagama bakteri C. m. subsp. sepedonicus järjepideva ja uuesti korratava avastamise valitud meetodites sätestatud piirmäärades.

Oluline on positiivsete kontrollproovide täpne ettevalmistamine.

Analüüside tegemisel vastavalt nõutavatele piirmääradele tuleb tähelepanu pöörata ka seadmete õigele seadistusele, hooldusele ja kalibreerimisele, reaktiivide hoolikale käitlemisele ja säilitamisele ning kõigile meetmetele, mille eesmärk on vältida proovide omavahelist saastumist, s.t positiivsete kontrollproovide eraldamisele analüüsitavatest proovidest. Tuleb kohaldada kvaliteedikontrolli standardeid, selleks et vältida halduslikke ja muid vigu, eelkõige seoses märgistamise ja dokumentidega.

Direktiivi 93/85/EMÜ artikli 4 lõikes 2 osutatud haiguse esinemise kahtlus tähendab proovi diagrammides määratletud diagnostiliste või sõelkatsete positiivset tulemust.

Kui esimene sõelkatse (IF või PCR/FISH) on positiivne, kahtlustatakse nakatumist bakteriga ja tuleb teha teine sõelkatse. Kui teine sõelkatse on positiivne, on kahtlus leidnud kinnituse (haiguse esinemise kahtlus) ning tuleb jätkata analüüside tegemist vastavalt metoodikale. Kui teine sõelkatse on negatiivne, ei peeta proovi bakteriga nakatunuks.

Seetõttu on artikli 4 lõikes 2 osutatud positiivne IF-analüüs määratletud teises sõelkatses (PCR/FISH) kinnitust leidnud positiivse IF-tulemuse kaudu.

Direktiivi 93/85/EMÜ artikli 5 lõikes 1 osutatud kinnitatud organismi olemasolu tähendab bakteri C. m. subsp. sepedonicus puhaskultuuri isoleerimist ja identifitseerimist koos patogeensuse kinnitusega.

1. PROTSESSI TUTVUSTUS DIAGRAMMINA

1.1. avastusmetoodika ringmädaniku diagnoosimiseks ringmädaniku sümptomitega kartulimugulates ja -taimedes

Analüüsimetoodika on ette nähtud kartulimugulate ja -taimede puhul, millel esinevad tüüpilised või kahtlased ringmädaniku sümptomid. Siia kuuluvad kiiranalüüs, saastunud juhtkoest patogeeni isoleerimine diagnostilisele söötmele ja positiivse tulemuse korral bakterikultuuri C. m. subsp. sepedonicus kindlaksmääramine.

1.2. Bakteri Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus asümptomaatiliste kartulimugulate proovides avastamise ja kindlaksmääramise metoodika

Põhimõte

Analüüsimeetod on mõeldud latentsete nakkuste avastamiseks kartulimugulates. Erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhineva vähemalt kahe sõelkatse positiivse tulemuse korral tuleb patogeen isoleerida; kui isoleeritakse tüüpilised kolooniad, peab järgnema bakteri C. m. subsp. sepedonicus puhaskultuuri kindlaksmääramine. Ainult ühe sõelkatse positiivsest tulemusest ei piisa selleks, et lugeda proov kahtlaseks.

Sõelkatsed ja isolatsioonianalüüsid peavad võimaldama avastada 103 kuni 104 rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitri kohta, mis kuuluvad positiivse kontrollina igasse analüüsiseeriasse.

1.3. haigusetekitaja Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus asümptomaatiliste kartulitaimede proovides avastamise ja kindlaksmääramise metoodika

2. RINGMÄDANIKU SÜMPTOMITE VISUAALNE KONTROLL

2.1. Kartulitaimed

Euroopa kliimatingimustes leitakse sümptomeid põllul harva, tihti ilmnevad need alles hooaja lõpus. Lisaks sellele takistavad sageli sümptomite äratundmist muud haigused, lehtede vananemine või mehhaanilised vigastused. Seetõttu võivad sümptomid põllu kontrollimisel kergesti märkamata jääda. Närbumissümptomid on pruunmädaniku närbumissümptomitest väga erinevad; närbumine on tavaliselt aeglane ja piirdub alguses leheservadega. Noored nakatunud lehed kasvavad sageli edasi, kuid kasv on nakatunud leheosas aeglasem. Selle tulemusel on lehe kuju ebakorrapärane. Varre alaosas olevatel lehtedel, mida mõjutab varre juhtkudede sulgumine, on leheroodude vaheline ala sageli klorootiline, värvusega kollasest oranžini. Nakatunud lehekesed, lehed ja isegi varred võivad hävida. Lehed ja mugulad on sageli lihtsalt väiksemad. Mõnikord taimed känguvad. Paljude sümptomite värvilised pildid on veebilehel http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2.2. Kartulimugulad

Esimesed sümptomid on koe kerge klaasistumine või poolläbipaistvus ilma pehmenemiseta juhtkoe ümbruses, eriti basaalse tipu lähedal. Juhtkoering basaalses tipus võib olla veidi tumedama värvusega kui tavaliselt. Esimene kindlalt identifitseeritav sümptom on see, kui juhtkoering on kollaka värvusega ning kui mugula kergel pigistamisel ilmuvad soontest juustulaadse aine sambad. See eritis sisaldab miljoneid baktereid. Juhtkude võib muutuda pruunikaks ning selles etapis sarnanevad sümptomid mugulal pruunmädaniku sümptomitega, mida põhjustab Ralstonia solanacearum. Esialgu võivad need sümptomid olla üksnes ühes juhtkoeringi osas ning ei pruugi olla basaalse tipu lähedal ning võivad järk-järgult laieneda kogu ringile. Haiguse süvenedes juhtkude hävib; koore välimine osa võib eralduda sisemisest. Haiguse lõppjärgus ilmuvad mugula pinnale praod, mis on sageli äärtest punakaspruunid. Hiljuti on Euroopas olnud mitu juhtumit, kus koore keskosa mädaneb juhtkoeringiga üheaegselt, mille tulemuseks on sekundaarne invasioon koos sisemuse õõnsaks muutumise ja nekroosiga. Sekundaarse seenhaiguse või bakteri levik võib sümptomeid varjata ning lõppjärgus võib olla raske või isegi võimatu eristada ringmädaniku sümptomeid teistest mugulamädanikest. Võib esineda ebatüüpilisi sümptomeid. Paljude sümptomite värvilised pildid on veebilehel http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

3. PROOVI ETTEVALMISTAMINE

3.1. kartulimugulad

Märkus:

— Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Intensiivsem proovivõtmine eeldab rohkem analüüse, kuid proovi suurus jääb samaks. Suurem mugulate arv proovis põhjustab tulemuste inhibeerimise või nende tõlgendamise keerukuse. Siiski saab meetodit kasutada ka alla 200 mugulaga proovi puhul, kui rohkem mugulaid ei ole.

— Kõigi allpool kirjeldatud avastamismeetodite valideerimine põhineb analüüsidel, mis on tehtud 200 mugulast koosneva prooviga.

— Allpool kirjeldatud kartuliekstrakti saab kasutada ka kartuli pruun-baktermädaniku bakteri Ralstonia solanacearum avastamiseks.

Vabatahtlik eeltöötlemine enne proovi valmistamist:

Mugulad pestakse. Iga proovi järel kasutatakse kohaseid desinfektsioonivahendeid (klooriühendeid, kui kasutatakse PCR-analüüsi, et eemaldada võimalik patogeenne DNA) ja pesuaineid. Mugulad kuivatatakse õhu käes. Eriti on pesemine kasulik (kuid mitte kohustuslik) nende proovide puhul, millel on liiga palju mulda, ning kui tehakse PCR-analüüsi või bakterite otsest isoleerimist.

3.1.1. Puhta ja desinfitseeritud skalpelli või juurviljanoa abil eemaldatakse koor mugula basaalse tipu juurest nii, et juhtkude tuleb nähtavale. Basaalse tipu juures lõigatakse väike juhtkoe südamik ettevaatlikult välja nii, et muid kudesid tuleks kaasa võimalikult vähe (vt veebilehekülge http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus:

Iga kahtlaste ringmädaniku sümptomitega mugul pannakse kõrvale ja analüüsitakse eraldi.

Kui basaalse tipusüdamiku eemaldamisel ilmneb kahtlaseid sümptomeid, tuleks teha selle mugula visuaalne kontroll pärast mugula lõikamist basaalse tipu juurest. Kõiki kahtlaste sümptomitega lõigatud mugulaid tuleks hoida korgistumiseks vähemalt kaks päeva toatemperatuuril ning seejärel säilitada jahutatud mugulad (4–10 °C) kohastes karantiinitingimustes, kuni kõik analüüsid on tehtud. Kõiki proovideks võetud mugulaid (sealhulgas kahtlaste sümptomitega mugulad) tuleks säilitada vastavalt II lisale.

3.1.2. Basaalsed tipusüdamikud kogutakse kasutamata ühekordse kasutusega mahutitesse, mida saab sulgeda ja/või pitseerida (kui mahuteid kasutatakse uuesti, tuleks need põhjalikult puhastada ja desinfitseerida, kasutades klooriühendeid). Eelistatult tuleks eemaldatud basaalseid tipusüdamikke töödelda kohe. Kui see ei ole võimalik, hoitakse neid mahutis puhvrit lisamata, jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni. Ringmädaniku bakteri avastamist võivad takistada südamike kuivamine ja korgistumine ning saprofüütide kasv ladustamise ajal.

3.1.3. Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse, kasutades ühte järgmistest meetoditest.

a) Südamikud kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (3. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi külmutatult.

b) Südamikud homogeenitakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (3. liide) kas segistis (näiteks Waring või Ultra Thurax) või purustatakse need suletud ühekordse kasutusega matseratsioonikotis (näiteks Stomacheri või Bioreba tugev kilekott mõõtudega 150 mm × 250 mm; kiirgussteriilne), kasutades kummivasarat või sobivat peenestusseadet (näiteks Homex).

Märkus:

Kui proovid homogeenitakse segistis, on suur proovide ristsaastumise oht. Võetakse ettevaatusabinõusid, et vältida aerosooli tekkimist või proovi lekkimist ekstraktsiooni käigus. Tagatakse äsja steriliseeritud segistiterade ja -anumate kasutamine iga proovi korral. Kui kasutatakse PCR-analüüsi, välditakse DNA ülekandumist mahutites või peenestusseadmes. PCR-analüüsi tegemisel on soovitav purustada ühekordse kasutusega kottides ja kasutada ühekordse kasutusega katseklaase.

3.1.4. Supernatant dekanteeritakse. Kui lahus on liiga hägune, selitatakse see madalal kiirusel tsentrifuugides (mitte üle 180 g 10 minuti jooksul temperatuuril 4–10 °C) või vaakumfiltreerimisega (40–100 µm), pestes filtrit (10 ml) täiendava ekstraktsioonipuhvriga (3. liide).

3.1.5. Bakterifraktsioon kontsentreeritakse, tsentrifuugides 7 000 g juures 15 minutit (või 10 000 g juures 10 minutit) temperatuuril 4–10 °C ning supernatant eemaldatakse bakterisadet segamata.

3.1.6. Bakterisade resuspendeeritakse 1,5 ml bakterisademe puhvris (3. liide). Bakteri C. m. subsp. sepedonicus analüüsiks kasutatakse 500 µl, bakteri Ralstonia solanacearum analüüsiks 500 µl ja võrdluseesmärgil 500 µl. 500 µl võrdlusalikvoodile ja ülejäänud analüüsialikvoodile lisatakse steriilset glütserooli lõppkontsentratsiooni 10–25 % (v/v) saamiseks, loksutatakse ja säilitatakse temperatuuril –16 kuni –24 °C (nädalaid) või –68 kuni –86 °C (kuid). Analüüside tegemise ajal hoitakse analüüsialikvoote 4–10 °C juures.

Korduv külmutamine ja sulatamine ei ole soovitatav.

Kui ekstrakti tuleb transportida, tuleb seda teha külmkastis 24–48 tunni jooksul.

3.1.7. Kõiki bakteri C. m. subsp. sepedonicum positiivseid kontrolle ja proove käsitletakse eraldi, et vältida saastumist. Seda järgitakse IF-objektiklaaside ja kõigi analüüside korral.

3.2. Kartulitaimed

Märkus:

Bakteri C. m. subsp. sepedonicus latentsete populatsioonide avastamiseks on soovitav kasutada liitproove. Meetodit saab mugavalt kasutada kuni 200 varreosast koosnevate liitproovide puhul. (Seirete läbiviimisel peaksid seired põhinema uuritavat taimepopulatsiooni statistiliselt esindaval proovil.)

3.2.1. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse desinfitseeritud noa või oksakääridega 1–2 cm pikkune osa.

Varreosad desinfitseeritakse kergelt 70 % etanooliga ja kuivatakse kohe kuivatuspaberiga.

Varreosad kogutakse suletud steriilsesse mahutisse järgmise proovivõtumenetluse kohaselt.

3.2.2. Varreosasid töödeldakse, kasutades ühte järgmistest meetoditest.

a) Varreosad kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (3. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi külmutatult.

b) Töödeldakse kohe, purustades osad tugevas matseratsioonikotis (näiteks Stomacher või Bioreba) koos sobiva koguse ekstraktsioonipuhvriga (3. liide) kas kummivasara või kohase peenestusseadmega (näiteks Homex). Kui see ei ole võimalik, säilitatakse varreosasid jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

3.2.3. Kui lahus on seisnud 15 minutit, dekanteeritakse supernatant.

3.2.4. Ekstrakti täiendavat selitamist või bakterifraktsiooni kontsentreerimist tavaliselt ei nõuta, kuid seda võib teha, filtreerides või tsentrifuugides vastavalt punktidele 3.1.4–3.1.6.

3.2.5. Lahjendamata või kontsentreeritud proov jagatakse kahte võrdsesse ossa. Ühte osa säilitatakse 4–10 °C juures analüüside tegemise ajal ja teist osa 10–25 % (v/v) steriilse glütserooliga temperatuuril –16 kuni –24 °C (nädalaid) või –68 kuni –86 °C (kuid) juhuks, kui on vaja teha täiendavaid analüüse.

4. IF-ANALÜÜS

Põhimõte

IF-analüüsi tegemist peamise sõelkatsena soovitatakse sellepärast, et see annab stabiilseid tulemusi nõutavate piirväärtuste raames.

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse IF-analüüsi ja IF-tulemus on positiivne, tuleb teise sõelkatsena teha PCR- või FISH-analüüs. Kui IF-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja IF-tulemus on positiivne, tuleb analüüsi lõpuleviimiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus:

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse IF-analüüsi, kasutatakse alati polükloonset antikeha. Positiivse IF-tulemuse korral polükloonse antikehaga võib proovi täiendav analüüsimine monokloonse antikehaga anda täpsemaid tulemusi, kuid need võivad olla vähem tundlikud.

Kasutatakse bakteri C. m. subsp. sepedonicus referenttüve antikehasid. On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri C. m. subsp. sepedonicus homoloogse tüve rakku milliliitris, ja kasutatakse kohast fluorestseiinisotiotsüanaadi (FITC) konjugaati vastavalt tootja soovitustele. Lahjendamata polükloonsete või monokloonsete antikehade IF-tiiter peaks olema vähemalt 1: 2 000. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade töölahjendust (töölahjendusi), mis on tiitri lähedal või sellega võrdsed. Kasutatakse valideeritud antikehasid (vt veebilehekülge http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Analüüs tuleks teha äsja valmistatud prooviekstraktidega. Vajaduse korral saab seda edukalt teha ekstraktidega, mida on säilitatud –68 kuni –86 °C juures glütserooli all. Glütserooli saab proovist eemaldada nii, et lisatakse 1 ml bakterisademe puhvrit (4. liide), tsentrifuugitakse uuesti 15 minutit 7 000 g juures ja resuspendeeritakse bakterisademe puhvriga võrdesse mahtu. Seda ei ole tihti tarvis, eriti siis, kui proovid fikseeritakse objektiklaasidele, kuumutades klaase läbi leegi (vt punkti 2.2).

Valmistatakse vastavalt 2. liitele kartuliekstraktis ja soovi korral puhvris suspendeeritud bakteri C. m. subsp. sepedonicus homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

Võimaluse korral tuleks kasutada looduslikult nakatunud kudet (mida on säilitatud lüofiliseerituna või külmutatuna –16 kuni –24 °C juures) samalaadseks kontrolliks samal objektiklaasil.

Negatiivsete kontrollidena kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem negatiivse tulemuse.

Kasutatakse mitmeaknalisi mikroskoobi objektiklaase, millel on eelistatult kümme vähemalt 6 mm läbimõõduga aknavälja.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

4.1. Valmistatakse ette objektiklaasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

i) Bakterisademete puhul, mille tärklisesade on suhteliselt väike: Pipetitakse standardne kogus (6 mm läbimõõduga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) resuspendeeritud kartuli bakterisademe 1/100 lahjendust esimesele aknale. Seejärel pipetitakse samasugune kogus lahjendamata bakterisadet (1/1) rea ülejäänud akendele. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1.

ii) Muude bakterisademete korral: Resuspendeeritud bakterisademest valmistatakse kümnekordsed lahjendused (1/10 ja 1/100) kartulisademe puhvrisse. Pipetitakse standardne kogus (6 mm läbimõõduga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) resuspendeeritud bakterisadet ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2.

4.2. Piisad kuivatakse ümbritseva õhu temperatuuril või neid soojendades temperatuuril 40–45 °C. Bakterirakud fikseeritakse objektiklaasile kuumutades (15 minutit 60 °C juures), läbi leegi tõmmates, 95 % etanooliga või vastavalt antikehade tarnijate konkreetsetele juhistele.

Vajaduse korral võib fikseeritud objektiklaase säilitada külmutatult kuivatusainet sisaldavas karbis võimalikult vähe aega (kuni kolm kuud) enne järgmist analüüsi.

IF-meetod

i) Vastavalt punkti 4.1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele: valmistatakse rida kahekordseid antikehade lahjendusi IF-puhvris. Esimeses augus peaks olema 1/2 tiitrist (T/2), teistes 1/4 tiitrist (T/4), 1/2 tiitrist (T/2), tiiter (T) ja kahekordne tiiter (2T).

ii) Vastavalt punkti 4.1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele: valmistatakse antikehade töölahjendus IF-puhvris. Töölahjendus mõjutab spetsiifilisust.

Joonis 1. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 4.1 alapunktile i ja punkti 4.3 alapunktile i.

Resuspendeeritud bakterisademe lahjendused 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Resuspendeeritud bakterisademe lahjendus (T = tiiter) T/2 T/4 T/2 T 2T  Antiseerumi/anti-keha kahekordsed lahjendused Proov 1 1 2 3 4 5 Proovi 1 duplikaat või proov 2 6 7 8 9 10





Joonis 2. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 4.1 alapunktile ii ja punkti 4.3 alapunktile ii.

Antiseerumi/antikeha töölahjendused 1/1 1/10 1/100 tühi tühi  Resuspendeeritud bakterisademe kümnendlahjendused Proov 1 1 2 3 4 5 Proovi 1 duplikaat või proov 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Objektiklaasid asetatakse niiskele paberile. Iga aknaväli kaetakse täielikult antikeha lahjendus(t)ega. Igale aknaväljale lisatud antikeha kogus peab olema vähemalt võrdne objektiklaasile lisatud ekstrakti kogusega.

Kui antikehade tarnijatelt ei ole konkreetseid juhiseid, tuleks kasutada järgmist meetodit.

4.3.2. Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

4.3.3. Igalt objektiklaasilt raputatakse piisad ära ja need loputatakse hoolikalt IF-puhvriga. Pestakse 5 minutit IF Tween-puhvris (3. liide) ning seejärel 5 minutit IF-puhvris. Välditakse aerosoolide tekkimist ja piiskade ülekandmist, mis võiks põhjustada ristsaastumise. Kuivatuspaberiga kergelt kuivatades eemaldatakse ettevaatlikult liigne niiskus.

4.3.4. Objektiklaasid asetatakse niiskele paberile. Aknaväljad kaetakse FITC-konjugaadi lahjendusega, mida kasutati tiitri määramisel. Aknaväljadele lisatud konjugaadi kogus peab olema sama, mis on kasutatud antikeha kogus.

4.3.5. Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

4.3.6. Konjugaadi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha. Loputatakse ja pestakse nagu eespool kirjeldatud (punkt 4.3.3).

Eemaldatakse ettevaatlikult liigne niiskus.

4.3.7. Igasse aknavälja pipetitakse 5–10 µl 0,1 M fosfaatpuhverdatud glütserooli (3. liide) või müügil olevat fluorestseerumise tuhmumise vastast kattevedelikku ning objektiklaas kaetakse katteklaasiga.

IF-analüüsi tulemused

4.4.1. Objektiklaase vaadeldakse mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja sobilikud filtrid tööks FITCga, ning kasutatakse õli- või vesiimmersiooni suurendusel 500 – 1 000 korda. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

Esialgu kontrollitakse positiivset kontrollobjektiklaasi. Rakud peavad eredalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud kindlaksmääratud antikehade tiitris või töölahjenduses. Kui värvumine ei ole täielik, tuleb IF-analüüsi (punkt 4) korrata.

4.4.2. Vaadeldakse bakteri C. m. subsp. sepedonicus iseloomuliku morfoloogiaga eredalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebilehekülge http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peaks olema sama antikeha lahjenduse juures positiivse kontrolltüve fluorestseerumise intensiivsusega võrdne või sellest parem. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

4.4.3. Immunofluorestsentsanalüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varreosa bakterisademetes ilmuvad tõenäoliselt ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseeruvate rakkude taustpopulatsioonid ning bakteriga C. m. ssp. sepedonicus sama suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivad saprofüütbakterid.

4.4.4. Arvesse võetakse ainult tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke punktis 4.3 esitatud antikeha tiitris või töölahjenduses.

4.4.5. IF-tulemuste tõlgendamine:

i) Kui esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine tüüpiliste rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv (N) resuspendeeritud bakterisademe milliliitris (4. liide). Proovi IF-tulemus on positiivne, kui seal on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris. Proovi loetakse saastumiskahtlusega prooviks ning tuleb teha lisaanalüüse.

ii) Proovi IF-tulemus on negatiivne, kui seal on alla 5 × 103 rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris, ning proov loetakse negatiivseks. Lisaanalüüse ei ole vaja teha.

5. FISH-ANALÜÜS

Põhimõte

Kui esimese sõelkatsena kasutatakse FISH-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha IF-analüüs. Kui FISH-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus:

Kasutatakse ainult valideeritud bakteri C. m. subsp. sepedonicus spetsiifilisi oligoproove (7. liide). Eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud vähemalt 103 kuni 104 bakteri C. m. subsp. sepedonicus rakku milliliitris.

Järgmist meetodit tuleks eelistatavalt kasutada äsja valmistatud prooviekstraktiga, kuid seda võib edukalt kasutada ka prooviekstraktiga, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –16 kuni –24 °C või –68 kuni –86 °C.

Negatiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem bakteri C. m. subsp. sepedonicus osas negatiivse tulemuse.

Positiivseteks kontrollideks valmistatakse 3–5 päeva vanusest kultuurist (valmistamist vt 2. liitest) bakteri C. m. subsp. sepedonicus (näiteks tüvi NCPPB 4053 või PD 406) suspensioonid, mis sisaldavad 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta 0,01 M fosfaatpuhvris. Valmistatakse vastavalt 2. liitele kartuliekstraktis suspendeeritud bakteri C. m. subsp. sepedonicus homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

FITC-värvainega konjugeeritud eubakteriaalsete oligoproovide kasutamine võimaldab kontrollida hübridisatsiooniprotsessi, sest see värvib kõik proovis olevad eubakterid.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

5.1. Kartuliekstrakti fikseerimine

Järgmine protokoll põhineb allikal Wullings et al., (1998).

5.1.1. Valmistatakse kinnitilahus (vt 7. liidet).

5.1.2. Igast prooviekstraktist pipetitakse 100 µl Eppendorfi topsi ja tsentrifuugitakse 8 minutit 7 000 g juures.

5.1.3. Eemaldatakse supernatant ja bakterisade vedeldatakse 500 µl kinnitis, mis valmistati kuni 24 tundi varem. Loksutatakse vorteksil ja inkubeeritakse öö jooksul 4 °C juures.

Alternatiivseks kinnitiks on 96 % etanool. Selle kasutamiseks vedeldatakse punkti 5.1.2 bakterisade 50 µl 0,01 M fosfaatpuhvris ja 50 µl 96 % etanoolis. Loksutatakse vorteksil ja inkubeeritakse 4 °C juures vähemalt 30–60 minutit.

5.1.4. Tsentrifuugitakse 8 minutit 7 000 g juures, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 75 µl 0,01 M fosfaatpuhvris (vt 3. liidet).

5.1.5. Kinnitatud suspensioonidest tilgutatakse 16 µl puhtale mitmeaknalisele objektiklaasile vastavalt joonisele 3. Igale objektiklaasile pannakse kaks erinevat lahjendamata proovi ning 10 µl kasutatakse 1:100 lahjenduse tegemiseks (0,01 M fosfaatpuhvris). Ülejäänud proovilahust (49 µl), millele on eelnevalt lisatud üks maht 96 % etanooli, võib säilitada –20 °C juures Juhul kui FISH-analüüsi tuleb uuesti teha, eemaldatakse etanool tsentrifuugimise teel ja lisatakse sellega võrdne kogus 0,01 M fosfaatpuhvrit (loksutatakse vorteksil).

Joonis 3. FISH-objektiklaasi joonis

Proov 1 Tühi Tühi Tühi Proov 2 aknaväli 1 aknaväli 2 aknaväli 3 aknaväli 4 aknaväli 5 Proov 1 Tühi Tühi Tühi Proov 2 aknaväli 6 aknaväli 7 aknaväli 8 aknaväli 9 aknaväli 10 Katteklaas 1 Katteklaas 2

5.1.6. Objektiklaasid kuivatatakse õhu käes (või objektiklaaside kuivatis 37 °C juures) ja fikseeritakse, kuumutades klaase läbi leegi.

Selles etapis võib menetluse katkestada ja jätkata hübridiseerimist järgmisel päeval. Objektiklaase tuleb hoida tolmuvabas ja kuivas kohas toatemperatuuril.

5.2. Eelhübridisatsioon ja hübridisatsioon

5.2.1. Valmistatakse lüsosüümilahus, mis sisaldab 10 mg lüsosüümi (Sigma L-6876) 10 ml puhvris (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Lahust võib säilitada, kuid külmutada-sulatada tohiks seda vaid ühe korra. Iga proov kaetakse hoolikalt umbes 50 µl lüsosüümilahusega ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril. Seejärel kastetakse objektiklaasid ainult ühe korra demineraliseeritud vette ja kuivatatakse filterpaberiga.

Lüsosüümi asemel võib igasse auku lisada 50 µl 40–100 µg ml–1 proteinaas K-d puhvris (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) ja inkubeerida 37 °C juures 30 minutit.

5.2.2. Rakud veetustatakse 50 %, 80 % ja 96 % etanooli reas, igas etapis 1 minut. Objektiklaasid kuivatatakse objektiklaaside hoidikul õhu käes.

5.2.3. Valmistatakse ette niiske inkubatsioonikamber, kattes õhukindla kasti põhja kuivatus- või filterpaberiga, mis on kastetud 1x hybmix-lahusesse (7. liide). Kasti eelinkubeeritakse hübridisatsiooniahjus 55 °C juures vähemalt 10 minutit.

5.2.4. Valmistatakse hübridisatsioonilahus (7. liide), 45 µl iga objektiklaasi kohta ning seda eelinkubeeritakse 5 minutit 55 °C juures.

5.2.5. Objektiklaasid asetatakse 45 °C kuumutusplaadile ja lisatakse 10 µl hübridisatsioonilahust igasse nelja auku objektiklaasi(de)l.

5.2.6. Igale objektiklaasile asetatakse kaks katteklaasi (24 × 24 mm) nii, et vahele ei jää õhku. Objektiklaasid pannakse eelsoojendatud niiskesse kambrisse ja hübridiseeritakse öö jooksul ahjus 55 °C juures pimedas.

5.2.7. Valmistatakse ette kolm keeduklaasi, milles on 1 l ultrapuhast vett, 1 l 1x hybmix-lahust (334 ml 3x hybmix-lahust ja 666 ml ultrapuhast vett) ja 1 l 1/2x hybmix-lahust (167 ml 3x hybmix-lahust ja 833 ml ultrapuhast vett). Iga keeduklaasi eelinkubeeritakse veevannis 55 °C juures.

5.2.8. Objektiklaasidelt eemaldatakse katteklaasid ja objektiklaasid pannakse objektiklaaside hoidikule.

5.2.9. Ülemäärane oligoproov pestakse ära, inkubeerides 15 minutit 55 °C juures keeduklaasis, milles on 1x hybmix-lahus.

5.2.10. Objektiklaaside alus pannakse 1/2 hybmix-pesulahusesse ja inkubeeritakse veel 15 minutit.

5.2.11. Objektiklaasid kastetakse lühidalt ultrapuhtasse vette ja pannakse filterpaberile. Eemaldatakse liigne niiskus, kattes pinna õrnalt filterpaberiga. Igale aknaväljale pipetitakse 5–10 μl fluorestseerumise tuhmumise vastast kattevedelikku (näiteks Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA või samaväärne) ja üle terve objektiklaasi pannakse suur katteklaas (24 × 60 mm).

5.3. FISH-analüüsi tulemused

5.3.1. Objektiklaase vaadeldakse viivitamatult mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas, ja kasutatakse õliimmersiooni suurendusel 630 või 1 000 korda. Fluorestseiinisotiotsüanaadile (FITC) sobiva filtriga värvuvad proovis olevad eubakterite rakud (sealhulgas enamik gramnegatiivseid rakke) fluorestseeruvroheliseks. Kasutades tetrametüülrodamiin-5-isotiotsüanaadile sobivat filtrit, paistavad bakteri C. m. subsp. sepedonicus Cy3-ga värvunud rakud fluorestseeruvpunastena. Raku morfoloogiat võrreldakse positiivsete kontrollidega. Rakud peavad eredalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb FISH-analüüsi (punkt 9.4) korrata. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

5.3.2. Vaadeldakse bakteri C. m. subsp. sepedonicus iseloomuliku morfoloogiaga eredalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebilehekülge http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peab olema positiivse kontrolli fluorestseerumise intensiivsusega võrdne või sellest parem. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

5.3.3. Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

5.3.4. FISH-analüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varreosa bakterisademetes võib esineda ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseeruvate rakkude taustpopulatsioone ning bakteriga C. m. subsp. sepedonicus sama suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivaid saprofüütbaktereid, kuigi palju harvem kui IF-analüüsis.

5.3.5. Arvesse võetakse üksnes tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke, vt punkti 5.3.2.

5.3.6. FISH-analüüsi tulemuse tõlgendamine

i) FISH-analüüsi valiidsed tulemused saadakse siis, kui FITC-filtrit kasutades vaadeldakse bakterile C. m. subsp. sepedonicus omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga ererohelisi fluorestseeruvaid rakke ja rodamiinfiltrit kasutades erepunaseid fluorestseeruvaid rakke kõigis positiivsetes kontrollides ja mitte üheski negatiivses kontrollis. Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv (N) resuspendeeritud bakterisademe milliliitris (4. liide). Saastumiskahtlusega proovideks loetakse proove, milles on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris. Tuleb teha täiendavaid analüüse. Proove, milles on alla 5 × 103 tüüpilise raku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris, loetakse negatiivseteks.

ii) FISH-analüüs on negatiivne siis, kui rodamiinfiltrit kasutades ei vaadelda bakterile C. m. subsp. sepedonicus omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga erepunaseid fluorestseeruvaid rakke, tingimusel et rodamiinfiltrit kasutades vaadeldakse erepunaseid fluorestseeruvaid rakke positiivsete kontrollide preparaatides.

6. PCR-ANALÜÜS

Põhimõtted

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse PCR-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha IF-analüüs. Kui PCR-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Selle meetodi kasutamist peamise sõelkatsena soovitatakse ainult siis, kui on olemas eriteadmised.

Märkus:

Eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud 103 kuni 104 bakteri C. m. subsp. sepedonicus rakku milliliitris. Maksimaalse tundlikkuse ja spetsiifilisuse saavutamiseks kõigis laborites võib olla vajalik teha optimeerimisanalüüse.

Kasutatakse valideeritud PCR-reaktiive ja -protokolle. Eelistatavalt valitakse sisekontrolliga meetod.

Proovi saastumise vältimiseks sihtmärk-DNAga kasutatakse kohaseid ettevaatusabinõusid. PCR-analüüsi peaksid tegema kogenud tehnikud spetsiaalsetes molekulaarbioloogia laborites, et minimeerida sihtmärk-DNAga saastumise võimalust.

Negatiivseid kontrolle (DNA ekstraheerimise ja PCR-protseduurid) tuleks alati käsitleda menetluses viimaste proovidena, et kontrollida, kas on toimunud DNA ülekandmist.

PCR-analüüsis peaksid olema järgmised negatiivsed kontrollid:

— prooviekstrakt, mis andis varem bakteri C. m. subsp. sepedonicus osas negatiivse tulemuse,

— kontrollpuhvrid, mida kasutati bakterite ja DNA eraldamisel proovist,

— PCR-reaktsioonisegu.

Tuleks kasutada järgmisi positiivseid kontrolle:

— resuspendeeritud bakterisademete alikvoodid, millele on lisatud bakterit C. m. subsp. sepedonicus (valmistamist vt 2. liitest),

— virulentsest isolaadist (näiteks NCPPB 2140 või NCPPB 4053) bakteri C. m. subsp. sepedonicus vesisuspensioon (106 rakku milliliitris),

— võimaluse korral kasutatakse PCR-analüüsis ka positiivsetest kontrollproovidest saadud DNAd.

Võimaliku saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollid analüüsitavatest proovidest eraldi keskkonnas.

Prooviekstraktid peaksid olema võimalikult mullavabad. Seepärast on teatavatel juhtudel soovitatav valmistada ekstraktid pestud kartulitest, kui soovitakse kasutada PCR-protokolle.

6.1. DNA puhastamismeetodid

Kasutatakse eespool kirjeldatud positiivseid ja negatiivseid kontrollproove.

Kontrollmaterjal valmistatakse samamoodi kui proov (proovid).

Sihtmärk-DNA eraldamiseks komplekssetest prooviainetest on võimalik kasutada erinevaid meetodeid, mille käigus eemaldatakse PCRi inhibiitorid ja muud ensümaatilised reaktsioonid ning kontsentreeritakse prooviekstraktis sihtmärk-DNA.

Järgmist meetodit on optimeeritud 6. liites esitatud valideeritud PCR-meetodiga kasutamiseks.

6.1. a) Pastriki (2000) meetod:

1. Pipetitakse 220 µl lüüsipuhvrit (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml Eppendorfi topsi.

2. Lisatakse 100 µl prooviekstrakti ja pannakse 10 minutiks kuumutusplokile või vesivanni 95 °C juures.

3. Tops pannakse 5 minutiks jääle.

4. Lisatakse 80 µl lüsosüümi põhilahust (50 mg lüsosüümi ml kohta 10 mM Tris HCl-is, pH 8,0) ja inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.

5. Lisatakse 220 µl Easy DNA® lahust A (Invitrogen), segatakse hästi vorteksil ja inkubeeritakse 30 minutit 65 °C juures.

6. Lisatakse 100 µl Easy DNA® lahust A (Invitrogen), loksutatakse tugevalt vorteksil, kuni sade valgub topsis vabalt ja proov on ühtlaselt viskoosne.

7. Lisatakse 500 µl kloroformi ning loksutatakse vorteksil viskoossuse kadumiseni ja homogeense segu saamiseni.

8. Faaside eraldamiseks ja interfaasi moodustamiseks tsentrifuugitakse 15 000 g juures 20 minutit temperatuuril 4 °C.

9. Ülemine faas kantakse üle puhtasse Eppendorfi topsi.

10. Lisatakse 1 ml 100 % etanooli (–20 °C), segatakse lühidalt ja inkubeeritakse jääl 10 minutit.

11. Tsentrifuugitakse 20 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C ja eemaldatakse etanool bakterisademest.

12. Lisatakse 500 µl 80 % etanooli (–20 °C) ja segatakse, pöörates topsi põhjaga ülespoole.

13. Tsentrifuugitakse 10 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C, bakterisade hoitakse alles ja eemaldatakse etanool.

14. Bakterisademel lastakse kuivada õhu käes või DNA Speed Vac’i seadmes.

15. Bakterisade resuspendeeritakse 100 µl steriilses ultrapuhtas vees ja jäetakse toatemperatuuril seisma vähemalt 20 minutiks.

16. Säilitatakse –20 °C juures kuni PCR-analüüsi tegemiseni.

17. Igasugune valge sade tsentrifuugitakse alla ja kasutatakse 5 µl supernatanti, mis sisaldab DNAd PCR-analüüsi tarvis.

6.1. b) Muud meetodid

Võib kasutada muid DNA ekstraheerimise meetodeid (näiteks Qiagen DNeasy Plant Kit), eeldusel et need sama tõhusalt puhastavad välja DNA kontrollproovidest, mis sisaldavad 103 kuni 104 patogeeni rakku milliliitris.

6.2. PCR-analüüs

6.2.1. Valmistatakse ette PCR-analüüsi analüüsi- ja kontrollmaatriksid vastavalt valideeritud protokollile (6. liide). Valmistatakse proovi DNA ekstrakti üks kümnendlahjendus (1:10 ultrapuhtas vees).

6.2.2. Saastevabas keskkonnas valmistatakse kohane PCR-reaktsioonisegu vastavalt avaldatud protokollile (6. liide). Valideeritud PCR-protokoll on mitmeetapiline reaktsioon, milles sisaldub ka sisemine PCR-kontroll.

6.2.3. Lisatakse 5 µl DNA ekstrakti 25 µl PCR-reaktsioonisegu kohta steriilsetes PCR-katseklaasides.

6.2.4. Võetakse ainult PCR-reaktsioonisegu sisaldav negatiivne kontrollproov ja proovi kohta lisatakse sama ultrapuhast vett, mida kasutati PCR-segus.

6.2.5. Katseklaasid pannakse samasse termotsüklerisse, mida kasutati eelanalüüsi tegemisel, ning see pannakse tööle kohaselt optimeeritud PCR-programmis (6. liide).

6.3. PCR-produkti analüüs

6.3.1. PCR-amplikonid eraldatakse elektroforeesil agaroosgeelis. Võetakse igast proovist vähemalt 12 µl amplifitseerunud DNA reaktsioonisegu, mis on segatud 3 µl täitepuhvriga (6. liide) 2,0 % (w/v) agaroosgeelis trisatsetaat-EDTA (TAE) puhvris (6. liide) 5–8 V/cm. Kasutatakse kohast DNA markerit, näiteks 100 aluspaari redel.

6.3.2. DNA ribad tuuakse esile, värvides neid eetiumbromiidiga (0,5 mg liitris) 30–45 minutit, võttes kohaseid ettevaatusabinõusid selle mutageeni käitlemisel.

6.3.3. Värvunud geeli vaadeldakse lühilaine ultraviolettvalgustusallikaga (näiteks λ = 302 nm) oodatava suurusega amplifitseeritud PCR-produktide (6. liide) leidmiseks ja need dokumenteeritakse.

6.3.4. Kõigi uute leidude/juhtumite korral tõendatakse PCR-amplikoni usaldatavust ülejäänud amplifitseeritud DNA proovi restriktsiooniensüümi analüüsiga, inkubeerides optimaalsel temperatuuril ja aja jooksul kohase ensüümi ja puhvriga (vt 6. liidet). Lahustunud fragmendid eraldatakse elektroforeesil agaroosgeelis nagu varem ja vaadeldakse pärast värvimist eetiumbromiidiga ultraviolett-valgustusallikaga iseloomulikku restriktsioonifragmendi pilti ning võrreldakse seda lahustamata ja lahustunud positiivse kontrolliga.

PCR-analüüsi tulemuse tõlgendamine

PCR-analüüs on negatiivne, kui kõnealuses proovis ei avastata bakterile C. m. subsp. sepedonicus spetsiifilist oodatava suurusega PCR-amplikoni, kuid see avastatakse kõigis positiivse kontrolli proovides (mitmeetapilise PCR-produkti puhul, millel on taimele spetsiifilised sisekontrolli praimerid: oodatava suurusega teist PCR-produkti tuleb amplifitseerida kõnealuse prooviga).

PCR-analüüs on positiivne, kui avastatakse bakterile C. m. subsp. sepedonicus spetsiifiline oodatava suuruse ja restriktsioonipildiga (kui see on nõutav) PCR-amplikon, eeldusel et seda ei amplifitseeritud mõnest negatiivse kontrolli proovist. Positiivse tulemuse usaldusväärse kinnituse saab ka siis, kui analüüsi korratakse teiste PRC-praimeritega (punkt 9.3).

Märkus:

PCR inhibeerimist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse positiivse kontrolli proovist, mis sisaldab bakterit C. m. subsp. sepedonicus vees, kuid negatiivseid tulemusi saadakse positiivsetest kontrollidest, mis sisaldavad bakterit C. m. subsp. sepedonicus kartuliekstraktis. Mitmekordsetes PCR-protokollides sisemiste PCR-kontrollidega viitab reaktsiooni inhibeerimisele see, kui ei saada kumbagi amplikoni.

Saastumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse ühest või mitmest negatiivsest kontrollist.

7. BIOTEST

Märkus:

Eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud 103 kuni 104 bakteri C. m. subsp. sepedonicus kolooniat moodustavat üksust milliliitris (valmistamist vt 2. liitest).

Suurimat avastustundlikkust võib loota siis, kui kasutatakse äsja valmistatud prooviekstrakti ja optimaalseid kasvutingimusi. Meetodit saab siiski kasutada edukalt nende ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –68 kuni –86 °C.

Mõned baklažaanisordid on väga hea selektiivne rikastussööde bakteri C. m. subsp. sepedonicum kasvamiseks isegi sümptomite puudumisel ning ka peremeestaime kontrollanalüüsi jaoks.

Valede negatiivsete analüüsitulemuste riski vähendamiseks peaksid kasvutingimused olema optimaalsed.

Andmed kasvatamistingimuste kohta on 8. liites.

7.1. Punktidest 3.1.6 või 3.2.5 järelejäänud resuspendeeritud bakterisademe kogu analüüsialikvoot jagatakse baklažaanide vahel ühel allpool kirjeldatud meetodil (punkt 7.3 või 7.4). Kasutatakse ainult neid taimi, mis on 2–3 lehe faasis kuni kolmanda pärislehe täieliku väljakasvamiseni. Selleks et tagada resuspendeeritud bakterisademe täielik ärakasutamine ning tõhus inokulatsioon, on allpool kirjeldatud menetlusteks vaja 15–25 baklažaani proovi kohta.

7.2. Baklažaane ei kasteta 1–2 päeva enne inokulatsiooni, et vähendada raku siserõhku.

Inokulatsioon sisselõike kaudu

7.3.1. Taime kahe sõrme vahel hoides pipetitakse suspendeeritud bakterisademe tilk (ligikaudu 5–10 µl) varrele idulehtede ja esimese lehe vahele.

7.3.2. Steriilse skalpelliga tehakse 1 cm pikkune diagonaalne sisselõige, mille sügavus on ligikaudu 2/3 varre paksusest, alustades sisselõiget bakterisademe tilga kohast.

7.3.3. Sisselõige kaetakse süstla abil steriilse vaseliiniga.

7.4. Inokulatsioon süstla abil

Baklažaanide varsi inokuleeritakse idulehtede kohalt hüpodermilise nõelaga süstlaga (vähemalt 23G). Proov jaotatakse baklažaanide vahel.

7.5. Positiivsete kontrollidena inokuleeritakse sama inokulatsioonimeetodiga (punkt 7.3 või 7.4) viis taime bakteri C. m. subsp. sepedonicus teadaoleva kultuuri vesisuspensiooniga, milles on 105 kuni 106 rakku milliliitris, ja võimaluse korral looduslikul teel nakatunud mugula koega (vt punkti 4).

7.6. Negatiivse kontrollina inokuleeritakse sama inokulatsioonimeetodiga (punkt 7.3 või 7.4) viis taime steriilse bakterisademe puhvriga.

7.7. Taimi inkubeeritakse karantiiniruumides kuni neli nädalat temperatuuril 18–24 °C. Taimi inkubeeritakse piisava valguse ja suure niiskuse (70–80 %) juures ja neid kastetakse nii, et ära hoida ülekastmist või taimede närbumist veepuuduse tõttu. Bakteri C. m. sepedonicus rakud hävivad temperatuuril üle 30 °C ja optimaalne temperatuur on 21 °C. Saastumise vältimiseks inkubeeritakse positiivse kontrolli ja negatiivse kontrolli taimi selgelt eraldatud lavadel kasvuhoones või kasvukambris või, kui ruumi on vähe, tagatakse rangelt eraldi töötlemine. Kui erinevate proovide taimi tuleb inkubeerida lähestikku, eraldatakse need kohaste varjetega. Väetamisel, kastmisel, kontrollimisel ja mis tahes muude tegevuste juures pööratakse suurt tähelepanu ristsaastumise vältimisele. Oluline on puhastada kasvuhooned ja kasvukambrid kõigist putukkahjureist, sest need võivad kanda bakteri ühelt taimelt teisele.

7.8. Sümptomeid kontrollitakse regulaarselt alates nädala möödumisest. Loetakse üle sümptomitega taimed. C. m. subsp. sepedonicum põhjustab baklažaani lehtede närbumist, mis võib alata leheservade või leheroodude vahelise osa lõtvusena. Närbunud kude võib alguses olla tumeroheline või laiguline, kuid muutub kahvatumaks enne suremist. Leheroodude-vahelise ala närbunud kohad on rasvase ja lödise välimusega. Surnud koel on sageli erekollane serv. Taimed ei pruugi hukkuda; mida pikem on periood enne sümptomite tekkimist, seda suurem on ellujäämise võimalus. Taimed võivad infektsioonist välja kasvada. Noored baklažaanid on palju vastuvõtlikumad bakteri C. m. subsp. sepedonicum väheste populatsioonide suhtes kui vanemad taimed, seepärast tuleb kasutada taimi 3. lehe faasis või vahetult enne seda.

Närbumist võivad põhjustada ka mugula koe bakterisademes olevate muude bakterite või seente populatsioonid. Need hõlmavad bakterite Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora ja E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, samuti saprofüütbakterite ulatuslikke populatsioone. Eelkõige võib Erwinia chrysanthemi põhjustada lehesümptomeid ja närbumist, mis on väga sarnased bakteri C. m. sepedonicus sümptomitega. Ainus erinevus on varre tumenemine bakteri Erwinia chrysanthemi infektsioonide korral. Muid närbumisi on võimalik eristada bakteri C. sepedonicum põhjustatud närbumisest, sest kõik lehed või taimed närbuvad kiiresti. Võib teha ka värvimise Grami järgi: selle analüüsiga saab eristada baktereid C. m. subsp. sepedonicus ja Erwinia spp.

7.9. Niipea kui baklažaanidel ilmnevad sümptomid, tuleks teha uus isoleerimine, kasutades närbunud lehekoe osasid või taimede varrekudet (vt koe leotamist punktis 3.1.3). Baklažaani lehed ja varred desinfitseeritakse pindmiselt, pühkides neid 70 % etanooliga. Baklažaanimahlaga tehakse IF- või PCR-analüüsi ning isoleeritakse sobivale (selektiivsele) söötmele (vt punkti 8). Võib teha ka värvimise Grami järgi (9. liide). Bakteri C. m. subsp. sepedonicus eeldatavad puhaskultuurid määratakse kindlaks ja kinnitatakse nende patogeensus (vt punkte 9 ja 10).

7.10. Teatavatel tingimustel, eriti kui kasvutingimused ei ole optimaalsed, võib olla võimalik, et bakter C. m. subsp. sepedonicus eksisteerib varjatud nakkusena baklažaanis isegi pärast kuni nelja nädala pikkust inkubeerimist. Kui nelja nädala möödumisel sümptomeid ei ilmne, tehakse IF/PCR-analüüsid liitproovist, mis koosneb igalt katsetaimelt ülalpool inokulatsioonikohta võetud 1 cm varreosast. Kui analüüs on positiivne, tuleks teha uuesti isoleerimine sobival (selektiivsel) söötmel, kasutades punktis 8 kirjeldatud meetodit. Bakteri C. m. subsp. sepedonicus eeldatavad puhaskultuurid määratakse kindlaks ja kinnitatakse nende patogeensus (punktid 9 ja 10).

Biotesti tulemuse tõlgendamine

Valiidsed biotesti tulemused saadakse siis, kui positiivsetel kontrolltaimedel on tüüpilised sümptomid, nendest taimedest saab uuesti isoleerida bakterid ja negatiivsetel kontrolltaimedel ei leita sümptomeid.

Biotesti tulemus on negatiivne, kui katsetaimed ei ole saastunud bakteriga C. m. subsp. sepedonicus, tingimusel et bakterit C. m. subsp. sepedonicus on avastatud positiivsetes kontrollides.

Biotest on positiivne, kui katsetaimed on nakatunud bakteriga C. m. subsp. sepedonicus.

8. BAKTERI C. M. SUBSP. SEPEDONICUS ISOLEERIMINE

Märkus:

Diagnoosi saab lõplikult panna ainult siis, kui bakter C. m. subsp. sepedonicus on isoleeritud, seejärel kindlaks määratud (vt punkti 9) ja kinnitatud patogeensusanalüüsiga (punkt 10). Kuigi C. m. subsp. sepedonicus on nõudlik organism, saab seda isoleerida sümptomaatilisest koest.

Siiski võivad bakterist C. m. subsp. sepedonicus üle kasvada kiiresti kasvavad saprofüütbakterid ning seega on raske isoleerida otse mugula koe bakterisademest (punkt 3.1.6 või 3.2.5). Bakteri C. m. subsp. sepedonicus otsene isoleerimine võib olla võimalik, kui kasutada selektiivsöödet ja kartuli basaalsetest tipusüdamikest või vartest saadud resuspendeeritud bakterisademe kohast lahjendust.

Isoleerimine tehakse kõigist sümptomitega kartulimugulatest või varreosadest ja baklažaanidest, millel ei ilmne sümptomeid, kuid mille liitproovi IF/PCR-analüüs oli positiivne (vt punkti 7.10). Baklažaanivarte leotamine tuleb vajaduse korral läbi viia vastavalt punktile 3.1.3.

Positiivsete kontrollidena valmistatakse ette kümnendlahjendused bakteri C. m. subsp. sepedonicus (näiteks NCPPB 4053 või PD 406) suspensioonist, milles on 106 kolooniaid moodustavat osakest milliliitris. Igasuguse saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollid analüüsitavatest proovidest täiesti eraldi.

Iga uuesti valmistatud selektiivsöötme partii kõlblikkust patogeeni kasvatamiseks tuleks enne tavaproovide analüüsimist kontrollida.

Kontrollainet analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

8.1. Selektiivsöötmele väljakülvamine

8.1.1. Kartuli resuspendeeritud bakterisademe või baklažaani mahla 100 µl alikvoodist tehakse bakterisademe puhvris kümnekordsed lahjendused (3. liide).

8.1.2. Kartuli lahjendamata bakterisademest isoleerimine tavaliselt ebaõnnestub, sest bakter C. m. subsp. sepedonicus on kasvutingimuste suhtes nõudlik ja saprofüüdid võistlevad sellega. Kuna bakter on tavaliselt suurte populatsioonidena nakatunud kudedes olemas, saab saprofüüdid tavaliselt välja lahjendada, kuid patogeen jääb alles. Seetõttu soovitatakse laiali külvata igast proovist 100 µl, 1/100 kuni 1/10 000 lahjendused MTNA-söötmele või NCP-88-söötmele (5. liide) (kui kasutatakse 90 mm diameetriga Petri tasse; muude tassisuuruste puhul kohandatakse kogust), kasutades spaatlit (hokikepikujulist) ja söötmeplaadile laialikülvamise meetodit.

Märkus:

Alternatiivseks võimaluseks on laiali külvata 100 µl esialgset kartuli bakterisademe alikvooti esimesele agariplaadile spaatliga ning seejärel viia spaatel teisele agariplaadile, tõmmates sellele spaatlile jäänud jäägid; lõpuks korratakse seda kolmandal plaadil ning lahjenduse laialikülvamine saavutatakse spaatliga.

8.1.3. Tasse inkubeeritakse pimedas temperatuuril 21–23 °C.

8.1.4. Tasside esmane uuring, võrreldes kontrolltassidega, tehakse kolme päeva möödumisel ja loetakse üle kõik bakteri C. m. subsp. sepedonicus sarnased kolooniad, seejärel loetakse kolooniad viie, seitsme ja lõpuks kümne päeva möödumisel.

8.2. Kahtlaste kolooniate puhastamine

Märkus:

Bakteri C. m. subsp. sepedonicus sarnased kolooniad tuleks ümber külvata YGM-söötmele baklažaanide inokuleerimiseks ja/või järgnevaks kindlaksmääramiseks; külvata tuleks enne seda, kui tassid kasvavad liiga täis, s.o eelistatavalt 3–5 päeva möödumisel.

8.2.1. Bakteri C. m. subsp. sepedonicus sarnased kolooniad kantakse ühele järgnevaist söötmeist (valemid on esitatud 5. liites):

glükoostoiteagar (üksnes subkultuuri jaoks),

pärmiekstraktiga glükoospeptoonagar,

pärmiekstrakti ja mineraalsooladega agar.

Inkubeeritakse 21–24 °C juures kuni kümme päeva.

C. m. subsp. sepedonicus kasvab aeglaselt, tekitades tavaliselt kümne päeva jooksul nööpnõelapeasuuruseid kreemjaid kuplikujulisi kolooniaid. Bakteri C. m. subsp. sepedonicus tüüpiliste kolooniate fotosid vt veebileheküljelt http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

8.2.2. Puhtuse saavutamiseks kanda uuesti.

Kasvumäärad paranevad subkultuuriga. Tüüpilised kolooniad on kreemjad või elevandiluuvärvi, mõnikord kollased, ümmargused, siledad, kõrgemad, kumera kupli kujuga, limased-vedelad, tervete servadega ning tavaliselt läbimõõduga 1–3 mm.

Lihtne värvimine Grami meetodil (9. liide) võib aidata pesade valimisel edasiste analüüside tegemiseks.

8.2.3. Määratakse kindlaks eeldatavad kultuurid (vt punkti 9) ja tehakse patogeensusanalüüs (vt punkti 10).

9. IDENTIFITSEERIMINE

Bakteri C. m. subsp. sepedonicus eeldatavad puhaskultuurid määratakse kindlaks, kasutades vähemalt kahte järgmistest analüüsidest, mis põhinevad erinevatel bioloogilistel põhimõtetel.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane.

9.1. Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid

Määratakse järgmised fenotüübilised omadused, mis esinevad või puuduvad bakteril C. m. subsp. sepedonicus, kasutades järgmistes allikates kirjeldatud meetodeid: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), anonüümne (1987).

Kõiki söötmeid tuleks inkubeerida 21 °C juures ja kontrollida kuue päeva pärast. Kui kasvu ei ole, inkubeeritakse kuni 20 päeva.

Kõigis analüüsides peab olema tuntud bakteri C. sepedonicum kontroll. Toite- ja füsioloogilised analüüsid tuleb teha, kasutades agarsöötme subkultuuride inokulaate. Glükoostoiteagari kultuuridelt tuleb teha morfoloogilisi võrdlusi.

Analüüsid Oodatav tulemus Oksüdatsiooni/fermentatsiooni katse Inertne või nõrgalt oksüdatiivne Oksüdaasi aktiivsus – Kasv 37 °C juures – Ureaasi aktiivsus – Eskuliini hüdrolüüs + Tärklise hüdrolüüs puudub või nõrk 7 % NaCl taluvus – Indooli tekkimine – Katalaasi aktiivsus + H2S tekkimine – Tsitraadi kasutamine – Želatiini vedeldamine – Happe glütserool – Happe moodustumine laktoosist puudub või nõrk Happe moodustumine ramnoosist – Happe moodustumine salitsiinist – Värvimine Grami järgi (9. liide) +

9.2. IF-analüüs

a) Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris IF-puhvris (3. liide).

b) Valmistatakse kohase antiseerumi kahekordsete lahjenduste rida.

c) Tehakse IF-analüüs (punkt 4).

d) IF-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuuri IF-tiiter võrdub positiivse kontrolli tiitriga.

9.3. PCR-analüüs

a) Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris ultrapuhtas vees.

b) 100 µl suletud katseklaasides olevat rakususpensiooni kuumutatakse kuumutusplokil või keevas veevannis 100 °C juures 4 minutit. Vajaduse korral võib äsja valmistatud NaOH lisamine 0,05 M lõppkontsentratsioonile aidata kaasa rakulüüsile. Seejärel võib proove säilitada –16 kuni –24 °C juures, kuni neid on tarvis.

c) Bakteri C. m. subsp. sepedonicus spetsiifiliste amplikonide amplifitseerimiseks tehakse kohane PCR-analüüs (näiteks Pastrik, 2000; vt 4. liidet; Li ja de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik ja Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

d) Bakterit C. m. subsp. sepedonicus saab positiivselt kindlaks määrata siis, kui PCR-amplikonidel on positiivse kontrolli tüvega sama suurus ja neil esineb sama pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfism.

9.4. FISH-analüüs

a) Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris ultrapuhtas vees.

b) Tehakse FISH-analüüs (punkt 5).

c) FISH-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuur ja positiivne kontroll annavad samad reaktsioonid.

9.5. Rasvhapete profileerimine (Fatty acid profiling – FAP)

a) Kultuuri kasvatatakse trüptikaas-sojaagaril (Oxoid) 72 tundi temperatuuril 21 °C (+/– 1°).

b) Tehakse kohane FAP-analüüs (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) FAP-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui eeldatava kultuuri profiil on identne positiivse kontrolli profiiliga. Tüüpiline rasvhapete esinemine on järgmine: 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 ja 17:0 Anteiso. Selline profiil osutab suure tõenäosusega bakterile C. m. sepedonicus. Muudel perekondadel, nagu Curtobacterium, Arthrobacter ja Micrococcus, esineb ka selliseid happeid, kuid 15:1 Anteiso A on neis bakterites harva esinev hape, mida on kõigis bakterites Clavibacter spp. umbes 1–5 %. Bakteris C. m. sepedonicus on seda tavaliselt umbes 5 %.

9.6. BOX-PCR-analüüs

a) Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris ultrapuhtas vees.

b) Tehakse analüüs vastavalt menetlusele (Smith et al., 2001).

10. KINNITUSANALÜÜS

Bakteri C. m. subsp. sepedonicus diagnoosi lõplikuks kinnitamiseks ja bakteri C. m. subsp. sepedonicus kindlaksmääratud kultuuride virulentsuse hindamiseks tuleb teha patogeensusanalüüs.

10.1. Analüüsitava isolaadi kolme päeva vanusest isolaadist ja bakteri C. m. subsp. sepedonicus kohasest positiivse kontrolli tüvest tehakse inokulaat, milles on umbes 106 rakku milliliitris.

10.2. Inokuleeritakse 5–10 kolmandas leheetapis noore baklažaaniseemiku vart (punkt 7.3 või 7.4).

10.3. Inkubeeritakse temperatuuril 18–24 °C piisava valguse ja suure suhtelise niiskuse juures ning kastetakse parajal määral, et vältida ülekastmist ja kuivamist (punkt 7.7). Puhaste kultuuridega peaks tüüpiline närbumine toimuma kahe nädala jooksul, kuid taimi, millel ei ole selle aja järel sümptomeid (vt punkti 7.8), tuleks seejärel inkubeerida kuni kolm nädalat temperatuuril, mis soosib baklažaanide kasvu, kuid ei ole üle 25 °C (8. liide). Kui kolme nädala pärast ei ole sümptomeid, ei saa kultuuri pidada bakteri C. m. subsp. sepedonicus patogeenseks vormiks.

10.4. Isoleeritakse sümptomitega taimedest, eraldades varreosa 2 cm kõrguselt inokulatsioonipunktist. Purustatakse ja lahustatakse väheses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (3. liide). Isoleeritakse suspensioonist, hõõrudes spaatliga laiali või tehes joonkülvi MTNA- ja YPGA-söötmele (5. liide), inkubeeritakse 3–5 päeva temperatuuril 21–23 °C ja vaadeldakse bakterile C. m. subsp. sepedonicus tüüpiliste pesade tekkimist.

1. liide Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid Labor (1) Asukoht Riik Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Viin ja Linz Austria Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgia Plantedirektoratet Lyngby Taani Central Science Laboratory York Inglismaa Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Šotimaa Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers France Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu France Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Saksamaa Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Saksamaa State Laboratory Dublin Iirimaa Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Holland Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Norra Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lissabon Portugal Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Sloveenia Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Hispaania (1) Kontaktteadurid – vt veebilehekülge http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2. liide Positiivsete ja negatiivsete kontrollide valmistamine südamike PCR/IF ja FISH-sõelkatsete jaoks Tehakse bakteri C. m. subsp. sepedonicus virulentse tüve [NCPPB 4053 või PD 406] 72-tunnine kultuur MTNA-põhisöötmel ja suspendeeritakse 10 mM fosfaatpuhvris, et saada rakkude tiheduseks umbes 1–2 × 108 kolooniaid moodustavat osakest milliliitris. See saadakse tavaliselt veidi häguses suspensioonis, mis mõõtmisel 600 nanomeetri juures vastab optilisele tihedusele 0,20. Eemaldatakse basaalsed tipusüdamikud 200 mugulalt, mis on pärit valgekoorelise sordi saagist, mille kohta on teada, et selles ei ole bakterit C. m. subsp. sepedonicus. Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse tavaliselt ja bakterisade resuspendeeritakse 10 milliliitris. Valmistatakse kümme steriilset 1,5 ml mikroampulli 900 µl resuspendeeritud bakterisademega. 100 µl bakteri C. m. subsp. sepedonicus suspensiooni pannakse esimesse mikroampulli. Loksutatakse vorteksil. Saastetase määratakse lahjenduste kümnendreaga järgmises viies mikroampullis. Kuut saastunud mikroampulli kasutatakse positiivsete kontrollidena. Nelja saastumata mikroampulli kasutatakse negatiivsete kontrollidena. Mikroampullid märgistatakse vastavalt. Steriilsetes 1,5 ml mikroampullides valmistatakse 100 µl alikvoodid ning saadakse seega iga kontrollproovi üheksa koopiat. Säilitatakse –16 kuni –24 °C juures kuni kasutamiseni. Bakteri C. m. subsp. sepedonicus olemasolu ja kvantifikatsioon kontrollproovides tuleks esmalt kinnitada IF-analüüsiga. PCR-analüüsiks ekstraheeritakse DNA positiivsetest ja negatiivsetest kontrollproovidest iga analüüsitavate proovide seeria puhul. IF- ja FISH-analüüsideks analüüsitakse positiivseid ja negatiivseid kontrollproove iga analüüsitavate proovide seeria puhul. IF-, FISH- ja PCR-analüüsides tuleb avastada bakteri C. m. subsp. sepedonicus vähemalt 106 ja 104 rakku milliliitris positiivsetes kontrollides ning bakterit ei tohi olla üheski negatiivses kontrollis.

3. liide Analüüsimenetluste puhvrid ÜLDNÕUE: Avamata steriilseid puhvreid võib säilitada kuni ühe aasta. 1. Ekstraktsioonimenetluse puhvrid 1.1. Ekstraktsioonipuhver (50 mM fosfaatpuhver, pH 7,0) Seda puhvrit kasutatakse bakteri eraldamiseks taimekudedest homogeenimise või loksutamise teel. Na2HPO4 (veevaba) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Destilleeritud vesi 1,00 l Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit. Võib lisada muid aineid järgmiselt: Eesmärk Kogus (liitri kohta) Lubrol-helbed Deflokulant (1) 0,5 g DC-silikooniga vahutamisvastane aine Vahutamisvastane aine (1) 1,0 ml Tetranaatriumpürofosfaat Antioksüdant 1,0 g Polüvinüülpürrolidoon-40 000 (PVP-40) PCR-inhibiitorite siduja 50 g 1.2. Kontsentreeritud bakterisademe puhver (10 mM fosfaatpuhver, pH 7,2) Seda puhvrit kasutatakse kartulimugula basaalse tipusüdamiku ekstraktide resuspendeerimiseks pärast kontsentreerimist bakterisademeks tsentrifuugimise teel. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Destilleeritud vesi 1,00 l Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit. 2. IF-analüüsi puhvrid 2.1. IF-puhver (10 mM fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,2) Seda puhvrit kasutatakse antikehade lahjendamiseks. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Destilleeritud vesi 1,00 l Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit. 2.2. IF-puhver Tweeniga Seda puhvrit kasutatakse objektiklaaside pesemiseks. IF-puhvrile lisatakse 0,1 % Tween 20. 2.3. Fosfaatpuhvri lisandiga glütserool, pH 7,6 Seda puhvrit kasutatakse kattevedelikuna fluorestseerumise suurendamiseks IF-objektiklaaside aknaväljades. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glütserool 50 ml Destilleeritud vesi 100 ml Fluorestseerumise tuhmumise vastased kattevedelikud on müügil, näiteks Vectashield® (Vector Laboratories) või Citifluor® (Leica). (1) Kasutamiseks ekstraktsioonimenetluses homogeenimise teel.

4. liide Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides 1. Loendatakse keskmine tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv välja kohta (c). 2. Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv objektiklaasi akna kohta (C). C = c × S/s Kus S = mitmekohalise objektiklaasi aknavälja pindala ja s = objektiivi pindala

s = πi2/4G2K2 kus i = välja koefitsient (sõltub okulaari tüübist ja on 8–24) K = toru koefitsient (1 või 1,25) G = objektiivi suurendus (100x, 40x jne) 3. Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv milliliitri resuspendeeritud bakterisademe kohta (N). N = C × 1 000/y × F kus y = resuspendeeritud bakterisademe maht igas aknas ja F = resuspendeeritud bakterisademe lahjendustegur

5. liide Bakteri C. m. subsp. sepedonicus isoleerimis- ja kasvusöötmed a) Üldised kasvusöötmed Toiteagar Toiteagar (Difco) 23,0 g Destilleeritud vesi 1,0 l Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit. Glükoostoiteagar Difco Bacto agarsööde, mis sisaldab 1 % D(+)-glükoosi (monohüdraat). Steriliseeritakse autoklaavis 115 °C juures 20 minutit. Pärmiekstraktiga glükoospeptoonagar Pärmiekstrakt (Difco) 5,0 g Bacto-peptoon (Difco) 5,0 g D(+)-glükoos (monohüdraat) 10,0 g Bacto-agar (Difco) 15,0 g Destilleeritud vesi 1,0 l Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit. Pärmiekstrakti ja mineraalsoolade kasvuagar Bacto-pärmiekstrakt (Difco) 2,0 g D(+)-glükoos (monohüdraat) 2,5 K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Bacto-agar (Difco) 18 g Destilleeritud vesi 1,00 l Ained lahustatakse ja 0,5-liitrised söötmekogused steriliseeritakse autoklaavis 115 °C juures 20 minutit. b) Valideeritud selektiivsed kasvusöötmed MTNA-sööde Kõik söötmekomponendid on BDHst, kui ei ole märgitud teisiti. Pärmiekstrakt (Difco) 2,0 g Mannitool 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar (Oxoid nr 1) 16,0 g Destilleeritud vesi 1,0 l Ained lahustatakse, pH reguleeritakse 7,2-le. Pärast autoklaavimist (121 °C juures 15 minutit) ja mahajahutamist 50 °C lisatakse antibiootikumid: trimetoprimi 0,06 g, nalidiksiinhapet 0,002 g, amfoteritsiin B 0,01 g. Antibiootilised alglahused: trimetoprim (Sigma) ja nalidiksiinhape (Sigma) (mõlemat 5 mg/ml) 96 % metanoolis, amfoderitsiin B (Sigma) dimetüülsulfoksiidis. Alglahused on filter-steriliseeritud. Märkus: Põhisöötme säilivus on kolm kuud. Pärast antibiootikumide lisamist on säilivus üks kuu, kui säilitatakse külmas. NCP-88-sööde Toiteagar (Difco) 23 g Pärmiekstrakt (Difco) 2 g D-mannitool 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Destilleeritud vesi 1,00 l Ained lahustatakse, pH reguleeritakse 7,2-le. Pärast autoklaavimist ja mahajahutamist 50 °C lisatakse järgmised antibiootikumid: polümüksiin B sulfaati (Sigma) 0,003 g, nalidiksiinhapet (Sigma) 0,008 g, tsükloheksimiidi (Sigma) 0,2 g. Antibiootikumid lahustatakse alglahustes järgmiselt: nalidiksiinhape 0,01 M NaOH, tsükloheksimiid 50 % etanoolis, polümüksiin B sulfaat destilleeritud vees. Alglahused on filter-steriliseeritud. Märkus: Põhisöötme säilivus on kolm kuud. Pärast antibiootikumide lisamist on säilivus üks kuu, kui säilitatakse külmas.

6. liide Valideeritud PCR-protokoll ja -reaktiivid Märkus: Eelanalüüsid peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada vähemalt 103 kuni 104 bakteri C. m. sepedonicus rakku prooviekstrakti milliliitris. Eelanalüüsid ei tohiks anda valepositiivseid tulemusi valitud bakteritüvedega. 1. Mitmeetapiline PCR-protokoll sisemise PCR-kontrolliga (Pastrik, 2000) 1.1. Oligonukleotiidpraimerid Päripidine praimer PSA-1 5′- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3′ Äraspidine praimer PSA-R 5′- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3′ Päripidine praimer NS-7-F 5′- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3′ Äraspidine praimer NS-8-R 5′- tcc gca ggt tca cct acg ga -3′ Bakteri C. m. subsp. sepedonicus maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 502 aluspaari (PSA-praimerite komplekt) 18S rRNA sisemise PCR-kontrolli eeldatav amplikonipikkus on 377 aluspaari (NS-praimerite komplekt) 1.2. PCR-reaktsioonisegu Reaktiiv Kogus reaktsiooni kohta Lõppkontsentratsioon Steriilne ultrapuhas vesi 15,725 µl 10x PCR-puhver (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (fraktsioon V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-nTP-segu (20mM) 0,125 µl 0,1 mM Praimer PSA-1 (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Praimer PSA-R (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Praimer NS-7-F (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Praimer NS-8-R (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Taq-polümeraas (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Proovi maht 5,0 µl Kogumaht: 25,0 µl 1.3. PCR-reaktsiooni tingimused Järgitakse järgmist menetlust: 1 tsükkel: i) 3 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) 10 tsüklit: ii) 1 minut 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) iii) 1 minut 64 °C juures (praimerite anniilimine) iv) 1 minut 72 °C juures (koopia ekstensioon) 25 tsüklit: v) 30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) vi) 30 sekundit 62 °C juures (praimerite anniilimine) vii) 1 minut 72 °C juures (koopia ekstensioon) 1 tsükkel: viii) 5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon) ix) hoitakse 4 °C juures Märkus: Programm on optimeeritud kasutamiseks MJ Research PTC 200 termotsükleriga. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii, iv, v, vi ja vii kestust. 1.4. Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs Bakteri C. m. subsp. sepedonicus DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Bgl II anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 37 °C juures 30 minutit. Bakterile C. m. subsp. sepedonicus tüüpilisest fragmendist saadud restriktsioonifragmentide pikkus on 282 ja 220 aluspaari. 2. Täitepuhvri valmistamine 2.1. Bromofenoolsinine (10 % põhilahus) Bromofenoolsinine 5 g Kaks korda destilleeritud vesi 50 ml 2.2. Täitepuhver Glütserool (86 %) 3,5 ml Bromofenoolsinine (5,1) 300 µl Kaks korda destilleeritud vesi 6,2 ml 3. 10x Trisatsetaat EDTA puhver, pH 8,0 Tris-puhver 48,4 g Jää-äädikas 11,42 ml EDTA (dinaatriumsool) 3,72 g Destilleeritud vesi 1,00 l Enne kasutamist lahjendatakse 1x. On ka müügil (näiteks Invitrogen või samaväärne). (1) Meetodid valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq või Gold) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi. (2) Kartuli basaalsete tipusüdamike ekstrakti puhul optimeeriti praimerite NS-7 F ja NS-8-R kontsentratsioonid, kasutades homogeenimismeetodit ja DNA puhastamist vastavalt Pastrikule (2000) (vt punkti 6.1 lõiget a ja punkti 6.2). Kui kasutatakse loksutamise teel DNA ekstraheerimist või muid isoleerimismeetodeid, on vaja reaktiivikontsentratsioonid uuesti optimeerida.

7. liide FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid 1. Oligoproovid Cms-spetsiifiline oligoproov CMS-CY3-01: 5′- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3′ Mittespetsiifiline eubakteriaalne oligoproov EUB-338-FITC: 5′- gct gcc tcc cgt agg agt-3′ 2. Kinnitilahus [HOIATUS! KINNITI SISALDAB PARAFORMALDEHÜÜDI, MIS ON MÜRGINE. TULEB KANDA KINDAID JA SEDA EI TOHI SISSE HINGATA. ON SOOVITATAV TÖÖTADA TÕMBEKAPIS.] i) 9 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett (näiteks ultrapuhast vett) kuumutatakse umbes 60 °C ja lisatakse 0,4 g paraformaldehüüdi. Paraformaldehüüd lahustub pärast seda, kui on lisatud 5 tilka 1N NaOH ja segatud magnetsegajaga. ii) pH reguleeritakse 7,0-le, lisades 1 ml 0,1 M fosfaatpuhvrit (pH 7,0) ja 5 tilka 1N HCl. pH-d kontrollitakse indikaatorribadega ja vajaduse korral reguleeritakse HCl või NaOH-ga. [HOIATUS! PARAFORMALDEHÜÜDI LAHUSTE PUHUL EI TOHI KASUTADA PH-MEETRIT.] iii) Lahus filtreeritakse läbi 0,22 µm membraanfiltri ja säilitatakse edasiseks kasutamiseks tolmuvabalt 4 °C juures. iv) Märkus: Alternatiivne kinnistilahus: 96 % etanool. 3. 3x Hybmix-lahus NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (filter-steriliseeritud ja autoklaavitud) 15 mM Lahjendatakse 1x vastavalt vajadusele. 4. Hübridisatsioonilahus 1x Hybmix-lahus Naatriumdodetsüülsulfaat 0,01 % oligoproov EUB 338 5 ng/μl oligoproov CMSCY301 5 ng/μl Hübridisatsioonilahused valmistatakse vastavalt tabelis 1 arvutatud kogustele. Iga objektiklaasi jaoks (millel on kaks erinevat proovi kaks korda) on tarvis 90 μl hübridisatsioonilahust. Tabel. Hübridisatsioonisegu valmistamiseks soovitatavad kogused Objektiklaaside kogus: 2 8 Steriilne ultrapuhas vesi 50,1 200,4 3x Hybmix-lahus 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Oligoproov EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Oligoproov CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Kogumaht (μl) 90,0 360,0 NB. Kõiki valgustundlikke oligoproove sisaldavaid lahuseid säilitatakse pimedas –20 °C juures. Kasutamise ajal välditakse otsest päikese- või elektrivalgust. 5. 0,1M fosfaatpuhver, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Destilleeritud vesi 1,00 l Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

8. liide Baklažaani kultuuri kasvatamistingimused Baklažaani (Solanum melongena) seemned külvatakse pastöriseeritud külvikomposti. Täielikult avanenud idulehtedega (10–14 päeva) seemikud istutatakse ümber pastöriseeritud istutuskomposti. Baklažaanid peaksid olema kasvatatud kasvuhoones järgmistel keskkonnatingimustel: Päeva pikkus: 14 tundi või looduslik päevapikkus, kui see on pikem; Temperatuur: päeval: 21–24 °C, öösel: 15 °C.

Haigusele vastuvõtlikud baklažaanisordid: “Black Beauty”, “Long Tom”, “Rima”, “Balsas”. Tarnija: vt veebilehekülge http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main