15)

B osasse lisatakse järgmised peatükid: „B.59. Naha sensibiliseerimine in chemico: otsene reaktsioonivõime katse peptiididega (Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA) SISSEJUHATUS Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 442C (2015). Naha sensibilisaator on aine, mis põhjustab nahaga kokkupuutel allergilise reaktsiooni, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (ÜRO GHS) (1) ja Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (18). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse in chemico meetodit (otsene reaktsioonivõime katse peptiididega, Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA), mida tuleb kasutada, et eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest ainetest kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega. Naha sensibiliseerumise oluliste bioloogiliste etappide suhtes on olemas ühisarusaam. Olemasolev teave naha sensibiliseerimisega seotud keemiliste ja bioloogiliste mehhanismide kohta on kokku võetud kahjuliku toime raja (Adverse Outcome Pathway, AOP) käsitluses (2), milles kirjeldatakse kõiki etappe alates protsessi käivitavast molekulaarsest etapist vahestaadiumide kaudu kuni kahjuliku toimeni, nimelt allergilise kontaktdermatiidini inimeste puhul või kontakthüpersensitiivsuseni närilistel. Naha sensibiliseerimise kahjuliku toime rajas on käivitavaks molekulaarse tasandi etapiks elektrofiilsete ainete kovalentne sidumine naha valkude nukleofiilsete tsentritega. Nahka sensibiliseeriva toime hindamiseks on tavaliselt kasutatud katseloomi. Merisigu kasutatakse klassikalistes meetodites, nagu Magnussoni ja Kligmani meetodil merisea maksimeeritud nahaärritustest (Guinea Pig Maximisation Test, GMPT) ja Buehleri katse (katsemeetod B.6 (3)), millega uuritakse nii naha sensibiliseerimise induktsiooni- kui ka avaldumisfaasi. Kõigi hiirtega läbiviidavate katsetega, s.o lokaalsete lümfisõlmede katse (Local Lymph Node Assay, LLNA, katsemeetod B.42 (4)) ja selle kahe radioaktiivse märgistuseta modifikatsiooni puhul (LLNA: DA (katsemeetod B.50 (5)) ja LLNA: BrdU-ELISA (katsemeetod B.51 (6)), hinnatakse ainult induktsioonina avalduvat toimet, kuid need on samuti heaks kiidetud, sest loomade heaolu seisukohast on neil eeliseid, võrreldes merisigade kasutamisega katsetes, ja nendega saab naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi objektiivselt mõõta. Hiljuti on mehhanistlikul käsitlusel põhinevad in chemico ja in vitro katsemeetodid arvatud teaduslikult põhjendatuks kemikaalidest tuleneva naha sensibiliseerimise ohu hindamiseks. Kuna igas loomadeta tehtavas katses (in silico, in chemico, in vitro) on kahjuliku toime raja käsitlus piiratud ja mehhanistlik (2, 7), on vaja katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi (Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA, edaspidi „ühtne lähenemisviis“) raames katseid kombineerida, et saaks täielikult loobuda praegu kasutatavatest loomkatsetest. DPRA on ette nähtud naha sensibiliseerimise kahjuliku raja käivitamise molekulaarse etapi, nimelt valkudega reageerimise hindamiseks, ning sellega mõõdetakse kvantitatiivselt uuritavate kemikaalide võimet reageerida lüsiini või tsüsteiini sisaldavate sünteetiliste tehispeptiididega (8). Seejärel kasutatakse tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide sisalduse vähenemise protsendilisi väärtusi, et klassifitseerida aine ühte neljast reaktsioonivõime klassist, mis aitab eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest (9). DPRA meetodit on hinnatud Euroopa Liidu Alternatiivsete Meetodite Tõestamise Keskuse referentlabori (European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing, EURL ECVAM) juhitud valideerimisuuringus, misjärel on selle sõltumatult läbi vaadanud EURL ECVAM-i teaduslik nõuandekomitee (EURL ECVAM Scientific Advisory Committee, ESAC) ning selle kasutamist peeti teaduslikult põhjendatuks ühtse lähenemisviisi osana, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest nende ohukategooriatesse klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil. Näited DPRA andmete kasutamisest kombinatsioonis muu teabega on avaldatud teaduskirjanduses (11–14). Mõisted on esitatud 1. liites. LÄHTEKAALUTLUSED, KASUTATAVUS JA PIIRANGUD Valkudega reageerimise võime ja nahka sensibiliseeriva toime vaheline korrelatsioon on kindlalt tõendatud (15–17). Kuigi valguga seondumine on etapp, mis molekulaarsel tasandil käivitab naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja, on see siiski vaid üks olulistest etappidest, ning valkudega reageerimise võime kohta nii katsetega kui ka muude kui katsemeetoditega saadav teave ei pruugi iseendast olla piisav järelduse tegemiseks, et kemikaal ei sensibiliseeri nahka. Seepärast tuleks käesoleva meetodiga saadud andmeid käsitada ainult seoses selliste ühtsete lähenemisviisidega nagu IATA ja kombineerida neid täiendava teabega, näiteks sellisega, mis on saadud naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja teisi olulisi etappe käsitlevatest in vitro katsetest, ning kasutada peale katsemeetodite ka muid meetodeid, sealhulgas võrdlemist kemikaali analoogidega. Käesolevat katsemeetodit saab kasutada kombinatsioonis muu täiendava teabega, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid (st ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooria) nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest ühtse lähenemisviisi kontekstis. Seda meetodit ei saa kasutada eraldivõetuna, sellega ei saa kategoriseerida naha sensibilisaatoreid ÜRO GHSis / CLP-määruses määratletud alamkategooriatesse 1A ja 1B ega prognoosida toime tugevust ohutushindamisega seotud otsuste tegemiseks. Sõltuvalt õigusraamistikust võib eraldivõetuna siiski kasutada DPRA positiivset tulemust kemikaali klassifitseerimiseks ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooriasse. DPRA katsemeetod on osutunud ülekantavaks laboritesse, kes on kogenud kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (high-performance liquid chromatography, HPLC) analüüsi alal. Prognooside korratavuse tase, mida võib selle katsemeetodi puhul eeldada, on ligikaudu 85 % laborisisese ja 80 % laboritevahelise korratavuse puhul (10). Sellest valideerimisuuringust saadud (18) ja kõigist avaldatud uuringute tulemustest kokku (19) nähtub, et LLNA tulemustega võrreldes on DPRA puhul sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi /CLP-määruse 1. kategooria kemikaalide) mittesensibiliseerivatest kemikaalidest eristamise täpsus 80 % (N = 157), tundlikkus 80 % (88/109-st) ja spetsiifilisus 77 % (37/48-st). DPRA meetodiga on tõenäosem alaprognoosida nõrga kuni mõõduka nahasensibiliseerimise potentsiaaliga kemikaale (st ÜRO GHSi / CLP-määruse alamkategooria 1B) kui kemikaale, millel on tugev nahka sensibiliseeriv toime (st ÜRO GHSi/CLP-määruse alamkategooria 1A) (18, 19). Ainsa katsemeetodina kasutatava DPRA täpsuse väärtused on siinkohal siiski vaid näitlikud, sest katsemeetodit tuleb kohaldada ühtse lähenemisviisi kontekstis kombinatsioonis muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas eespool punktis 9 esitatud nõuetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, milles ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks arvestada sellega, et LLNA nagu ka muud loomkatsed ei pruugi täielikult peegeldada kemikaali tegelikku toimet huvipakkuva liigi, s.o inimese puhul. Kogu olemasoleva teabe põhjal on tõendatud, et DPRA on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide puhul, millel on erinevad orgaanilised funktsionaalrühmad, toimemehhanismid, erinev nahka sensibiliseeriva toime tugevus (in vivo katsetes määratuna) ja erinevad füüsikalis-keemilised omadused (8–10, 19). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et DPRA on kasulik meetod, mis aitab kindlaks teha naha sensibiliseerimise ohtu. Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina ja see ei ole seotud DPRA kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks. See katsemeetod ei ole kohaldatav metalliühendite testimiseks, sest teadaolevalt reageerivad need valkudega muude mehhanismide kaudu kui kovalentne sidumine. Uuritav kemikaal peab olema lahustuv asjakohases lahustis lõppkontsentratsioonini 100 mM (vt punkt 18). Uuritavaid kemikaale, mis ei ole sellel kontsentratsioonil lahustuvad, võib siiski uurida väiksemal kontsentratsioonil, millel kemikaal lahustub. Sel juhul võib positiivset tulemust siiski kasutada, et määrata uuritav kemikaal naha sensibilisaatoriks, kuid negatiivse tulemuse korral ei saa teha kindlaid järeldusi reaktsioonivõime puudumise kohta. DPRA kohaldatavusest teadaoleva koostisega segudele on praegu vähe andmeid (18, 19). DPRA meetodit käsitatakse sellele vaatamata meetodina, mis on tehniliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete ja teadaoleva koostisega segude testimiseks (vt punkt 18). Enne kui kasutada käesolevat meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist. Praegust prognoosimudelit ei saa kasutada tundmatu koostisega komplekssete segude või tundmatu või muutuva koostisega ainete, komplekssete reaktsioonisaaduste või bioloogilist päritolu materjalide (st unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials, UCVB) puhul, sest selles katses peab uuritava kemikaali ja peptiidi molaarne suhe olema määratud. Selleks tuleks välja töötada uus gravimeetrilisel meetodil põhinev prognoosimudel. Kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa kasutada muude konkreetsete kemikaalirühmade puhul, ei tohi seda nende konkreetsete kemikaalirühmade puhul kasutada. Käesolev katsemeetod on in chemico meetod, milles ei kasutata metaboolset süsteemi. Selle meetodiga ei ole võimalik määrata kemikaale, mille nahka sensibiliseeriva potentsiaali avaldumiseks on vaja bioaktivatsiooni (st prohapteenid). On näidatud, et mõnel juhul on käesoleva katsemeetodiga õigesti määratud kemikaale, mis muutuvad sensibilisaatoriks pärast abiootilist transformatsiooni (st prehapteenid) (18). Lähtudes eespool kirjeldatust, tuleb selle katsemeetodiga saadud negatiivseid tulemusi tõlgendada esitatud piirangute kontekstis ja seoses ühtse lähenemisviisi raamistiku muudest allikatest pärit teabega. Uuritavad kemikaalid, mis ei seondu peptiidiga kovalentselt, kuid soodustavad selle oksüdeerumist (st tsüsteiini dimerisatsiooni), võivad põhjustada peptiidi sisalduse vähenemise võimalikku ülehindamist, mis võib põhjustada valepositiivseid prognoose ja/või kemikaali määramist suurema reaktsioonivõimega klassi (vt punktid 29 ja 30). Nagu eespool kirjeldatud, aitab DPRA eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest. Kasutatuna sellistes ühtsetes lähenemisviisides nagu IATA, võib see siiski aidata hinnata ka sensibiliseeriva toime tugevust (11). DPRA tulemuste kasutamiseks toime tugevuse hindamisel on vaja siiski veel täiendavat analüüsi, eelistatavalt inimuuringutest saadud andmetega. KATSE PÕHIMÕTE DPRA on in chemico meetod, millega määratakse kvantitatiivselt tsüsteiini või lüsiini sisaldavate peptiidide kontsentratsioon pärast 24-tunnilist inkubeerimist uuritava kemikaaliga temperatuuril 25 ± 2,5 °C. Määramise lihtsustamiseks sisaldavad sünteetilised peptiidid fenüülalaniini. Peptiidi suhtelist kontsentratsiooni mõõdetakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades gradientelueerimist ja määramist UV-detektoriga 220 nm juures. Seejärel arvutatakse tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide sisalduse vähenemise protsendilised väärtused ja kasutatakse neid prognoosimudelis (vt punkt 29), mille alusel on võimalik määrata uuritav kemikaal ühte neljast reaktsioonivõime klassist, mida kasutatakse abivahendina, et eristada sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest. Enne käesoleval katsemeetodil põhineva meetodi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid. KATSE KÄIK Käesolev katsemeetod põhineb loomkatsetele alternatiivsete meetodite andmebaasi (DataBase on ALternative Methods, DB-ALM) DPRA katsemeetodil nr°154 (20), mis vastab EURL ECVAMi koordineeritud valideerimisuuringus kasutatud metoodikale. Käesolevat metoodikat soovitatakse kasutada selle meetodi juurutamisel ja kasutamisel laboris. Järgmiseks kirjeldatakse DPRA põhikomponente ja katse käiku. Kui kasutatakse alternatiivset HLPC süsteemi, tuleb tõendada selle samaväärsust DB-ALM metoodikas kirjeldatud süsteemiga (nt kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid). Tsüsteiini või lüsiini sisaldavate peptiidipreparaatide valmistamine Põhilahused, milles on tsüsteiini (Ac-RFAACAA-COOH) ja lüsiini (Ac-RFAAKAA-COOH) sisaldavad sünteetilised peptiidid, mille puhtus on suurem kui 85 % ja eelistatavalt vahemikus 90–95 %, tuleb valmistada ex tempore, vahetult enne uuritava kemikaaliga inkubeerimist. Tsüsteiini sisaldava peptiidi lõppkontsentratsioon fosfaatpuhvris (pH 7,5) peab olema 0,667 mM, samas kui lüsiini sisaldava peptiidi lõppkontsentratsioon peab olema 0,667 mM ammooniumatsetaatpuhvris (pH 10,2). HPLC katseseeria tuleb järjestada nii, et HPLC analüüsi kestus oleks lühem kui 30 tundi. Valideerimisuuringus kasutatud ja käesolevas katsemeetodis kirjeldatud HLPC süsteemi puhul kasutati kuni 26 proovi (mis hõlmavad uuritavat kemikaali, positiivset kontrolli ja asjakohast arvu lahusti kontrolle sõltuvalt katses kasutatud eri lahustitest, iga proovi kohta kasutati kolme paralleelproovi), mis on võimalik analüüsida ühes HLPC katseseerias. Kõikide samas katseseerias analüüsitud paralleelproovide puhul tuleb kasutada tsüsteiini ja lüsiini peptiidide samu põhilahuseid. Enne kasutamist on iga peptiidide partii puhul soovitatav kindlaks teha, et see lahustub korralikult. Uuritava kemikaali preparaadi valmistamine Uuritava kemikaali lahustuvust asjakohases lahustis tuleb hinnata enne katse tegemist, järgides lahustamismeetodit, mis on kirjeldatud DB-ALM-i DPRA metoodikas (20). Sobivas lahustis lahustub uuritav kemikaal täielikult. Kuna DPRA meetodis inkubeeritakse uuritavat kemikaali tsüsteiini või lüsiini peptiidide suures ülehulgas, siis peetakse selge lahuse tekke sedastamiseks piisavaks visuaalset kontrolli, veendumaks, et uuritav kemikaal ja kõik selle koostisosad (kui uuritav kemikaal on mitme koostisosaga aine või segu) on lahustunud. Sobivad lahustid on atsetonitriil, vesi, vee ja atsetonitriili segu suhtes 1:1, isopropanool, atsetoon või atsetooni ja atsetonitriili segu suhtes 1:1. Muid lahusteid võib kasutada, kui need ei mõjuta peptiidi stabiilsust, mida jälgitakse võrdluskontrollidega C (st proovid, mis sisaldavad ainult asjakohases lahustis lahustatud peptiidi; vt 3. liide). Kui uuritav kemikaal ei ole üheski neist lahustitest lahustuv, siis tuleb viimase võimalusena üritada lahustada seda 300 μl DMSO-s ja lahjendada saadud lahus 2 700 μl atsetonitriiliga. Kui uuritav kemikaal ei ole ka selles segus lahustuv, tuleb üritada lahustada sama kogus uuritavat kemikaali 1 500 μl DMSO-s ja lahjendada saadud lahus 1 500 μl atsetonitriiliga. Vahetult enne katse tegemist tuleb uuritav kemikaal, mis on valmis kaalutuna klaasnõus, lahustada 100 mM lahuse valmistamiseks sobivas lahustis. Segude ja mitme koostisosaga teadaoleva koostisega ainete puhul tuleb puhtus määrata kogu segu või aine kohta, liites selle koostisosade (välja arvatud vesi) osakaalud, et määrata kogu segu/aine näiline molekulmass, võttes arvesse segu iga koostisosa (välja arvatud vesi) molekulmassi ning konkreetset osakaalu. Sel viisil määratud puhtust ja näilist molekulmassi kasutatakse seejärel, et arvutada 100 mM lahuse valmistamiseks vajalik uuritava kemikaali mass. Polümeeride puhul, kui valdavalt esinevat molekulmassi on võimatu määrata, võib 100 mM lahuse valmistamiseks arvesse võtta monomeeri molekulmassi (või polümeeri moodustanud mitmesuguste monomeeride molekulmassist koosnevat näilist molekulmassi). Teadaoleva koostisega segude, mitme koostisosaga ainete või polümeeride uurimisel tuleks kaaluda ka lahjendamata uuritava kemikaali testimist. Vedelike puhul tuleb lahjendamata kemikaali testida sellisena, s.o ilma eelneva lahjenduseta, inkubeerides seda moolisuhtes 1:10 ja 1:50 vastavalt tsüsteiini ja lüsiini peptiididega. Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada maksimaalse lahustatava kontsentratsioonini samas lahustis, mida kasutatakse näiliselt 100 mM lahuse valmistamiseks. Seejärel tuleb seda testida sellisena, s.o ilma täiendava lahjenduseta, inkubeerides seda moolisuhtes 1:10 ja 1:50 vastavalt tsüsteiini ja lüsiini peptiididega. Kooskõlalised tulemused (reageeriv või mittereageeriv) näilise 100 mM lahuse ja lahjendamata kemikaali vahel peaksid võimaldama tulemuse kohta kindla järelduse tegemist. Positiivse kontrolli, võrdluskontrollide ja koelueerimise kontrollide valmistamine Kaneelaldehüüdi (CASi nr 104-55-2; toiduainele vastava puhtusastmega ≥ 95 %) kasutatakse positiivse kontrollina (PC) kontsentratsioonis 100 mM, lahustatuna atsetonitriilis. Muid sobivaid positiivseid kontrolle, millega eelistatavalt saavutatakse sisalduse vähenemise keskmise vahemiku väärtused, võib kasutada, kui on olemas varasemate katsete andmed, et tuletada võrreldavad HPLC-seeria nõuetekohasuse kriteeriumid. Lisaks tuleb HPLC-seeriasse lisada võrdluskontrollid (st proovid, milles on ainult asjakohases lahustis lahustatud peptiid) ja neid tuleb kasutada enne analüüsi, et teha kindlaks HPLC süsteemi sobivus (võrdluskontrollid A), võrdluskontrollide stabiilsus ajas (võrdluskontrollid B) ning veendumaks, et uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatav lahusti ei mõjuta peptiidi sisalduse protsendilist vähenemist (võrdluskontrollid C) (vt 3. liide). Iga kemikaali jaoks kasutatakse sobivat võrdluskontrolli, et arvutada peptiidi sisalduse vähenemine selle kemikaali puhul (vt punkt 26). Lisaks peab HPLC-seerias olema koelueerimise kontroll, mis koosneb iga analüüsitava kemikaali puhul ainult uuritavast kemikaalist, et teha kindlaks, kas uuritav kemikaal võib elueeruda koos lüsiini või tsüsteiini sisaldava peptiidiga. Uuritava kemikaali inkubeerimine tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide lahustega Tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide lahuseid tuleb inkubeerida uuritava kemikaaliga suhtes vastavalt 1:10 ja 1:50 proovi automaatsisestaja klaasist viaalides. Kui kohe pärast uuritava kemikaali lisamist peptiidilahusele täheldatakse sademe teket uuritava kemikaali vähese vesilahustuvuse tõttu, ei saa enam olla kindel, kui palju uuritavat kemikaali jäi peptiidiga reageerimiseks lahusesse. Seepärast võib sellisel juhul positiivset tulemust siiski kasutada, kuid negatiivne tulemus on ebaselge ja seda tuleb tõlgendada asjakohase ettevaatusega (vt punktis 11 esitatud katse tegemise nõuded kemikaali puhul, mis ei lahustu 100 mM kontsentratsioonini). Reaktsioonilahus tuleb jätta pimedasse 25 ± 2,5 °C juurde 24 ± 2 tunniks enne HPLC analüüsi tegemist. Iga uuritavat kemikaali tuleb analüüsida kolme paralleelprooviga mõlema peptiidi kohta. Proove peab enne HPLC analüüsi visuaalselt kontrollima. Kui täheldatakse sadet või faaside eraldumist, võib ettevaatusabinõuna proovida väikesel kiirusel (100–400 g) tsentrifuugimist, et sade jääks viaali põhja, sest suures koguses võib sade HPLC torud või kolonnid ummistada. Kui sademe teket või faaside eraldumist täheldatakse pärast inkubeerimisaja lõppu, võib peptiidide sisalduse vähenemist alahinnata ning negatiivse tulemuse puhul ei saa piisava kindlusega järeldada reaktsioonivõime puudumist. HPLC standardse kalibreerimiskõvera koostamine Standardne kalibreerimiskõver tuleb koostada nii tsüsteiini kui ka lüsiini sisaldavate peptiidide jaoks. Peptiidide standardlahused valmistatakse 20 % või 25 % atsetonitriili puhverlahuses; tsüsteiini sisaldava peptiidi jaoks kasutatakse fosfaatpuhvrit (pH 7,5) ja lüsiini sisaldava peptiidi jaoks ammooniumatsetaatpuhvrit (pH 10,2). Kasutades peptiidi põhilahuse (0,667 mM) standardlahjenduste sarja, valmistatakse 6 kalibreerimislahust, et katta vahemik 0,534–0,0617 mM. Samuti tuleb standardse kalibreerimiskõvera jaoks lisada ainult lahjenduspuhvrit sisaldav tühiproov. Sobiva kalibreerimiskõvera r2>0,99. HPLC ettevalmistus ja analüüs HPLC süsteemi sobivust tuleb kontrollida enne analüüsi tegemist. Peptiidi sisalduse vähenemist jälgitakse HPLC süsteemiga, mis on ühendatud UV neelduvuse detektoriga (fotodioodrividetektor või fikseeritud lainepikkusega neelduvuse detektor signaaliga lainepikkusel 220 nm). Sobiv kolonn paigaldatakse HPLC süsteemi. Valideeritud metoodikas kirjeldatud HPLC süsteemis kasutatakse eelistatult kolonni Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 mikronit. Selle pöördfaasi-HPLC kolonni kasutamisel tuleb kogu süsteemi tasakaalustada 30 °C juures 50 % faasiga A (0,1 % (mahuprotsent) trifluoroäädikhappe vesilahus) ja 50 % faasiga B (0,085 % (mahuprotsent) trifluoroäädikhappe lahus atsetonitriilis) vähemalt 2 tundi enne analüüsietapi alustamist. HPLC analüüsiks kasutatakse voolukiirust 0,35 ml/min ja lineaarset gradienti 10 %–25 % atsetonitriili 10 minuti jooksul, misjärel suurendatakse muu materjali eemaldamiseks atsetonitriili sisaldus kiiresti 90 %-ni. Iga standardi, proovi ja kontrolli sissesüstimisel tuleb kasutada ühesugust ruumala. Kolonn tuleb iga süstimise vahel algtingimustel 7 minuti jooksul uuesti tasakaalustada. Kui kasutatakse teistsugust pöördfaasi-HPLC kolonni, võib tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide sobiva elueerimise ning integreerimise tagamiseks olla vajalik kohandada eespool kirjeldatud süsteemi parameetreid, sealhulgas süstitava lahuse ruumala, mis võib sõltuvalt kasutatavast süsteemist erineda (tavaliselt vahemikus 3–10 μl). Kui kasutatakse alternatiivset HLPC süsteemi, on oluline tõendada selle samaväärsust eespool kirjeldatud süsteemiga (nt kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid). Neelduvust jälgitakse lainepikkusel 220 nm. Kui kasutatakse fotodioodrivi tüüpi detektorit, määratakse neelduvus lainepikkusel 258 nm. Tuleb märkida, et mõnel atsetonitriili partiil võib olla negatiivne mõju peptiidi stabiilsusele ning seda peab enne uue partii kasutusele võtmist hindama. Koelueerimise näitajana võib kasutada 220 nm ja 258 nm piigialuste pindalade suhet. Kui kontrollproovide suhte keskväärtus (19) jääb vahemikku 90–100 %, on see iga proovi puhul usaldusväärne näitaja, et koelueerumist ei ole toimunud. Mõned uuritavad kemikaalid võivad soodustada tsüsteiini sisaldavate peptiidide oksüdeerumist. Dimeerset tsüsteiini sisaldava peptiidi piik võib olla visuaalselt eristatav. Kui selgub, et on toimunud dimeriseerumine, tuleb silmas pidada, et peptiidi sisalduse vähenemist võib sel juhul ülehinnata, mis põhjustab valepositiivseid prognoose ja/või kemikaali määramist suurema reaktsioonivõimega klassi (vt punktid 29 ja 30). Tsüsteiini sisaldavate ja lüsiini sisaldavate peptiidide HPLC analüüsi võib läbi viia kas samaaegselt (kui on olemas kaks HPLC süsteemi) või eri päevadel. Kui analüüs tehakse eri päevadel, tuleb kõik uuritava kemikaali lahused mõlema katse jaoks igal päeval värskelt valmistada. Analüüs tuleb ajastada nii, et tagada esimese proovi sisestamine 22–26 tundi pärast uuritava kemikaali segamist peptiidilahusega. HPLC-seeria tuleb järjestada nii, et HPLC analüüsi kestus oleks lühem kui 30 tundi. Valideerimisuuringus kasutatud ja käesolevas meetodis kirjeldatud HPLC süsteemi puhul saab ühe HPLC-seeria kohta kasutada 26 analüüsitavat proovi (vt ka punkt 17). HPLC analüüsi seeria näide on esitatud 3. liites. ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE Andmete hindamine Tsüsteiini või lüsiini sisaldavate peptiidide kontsentratsioon igas proovis määratakse fotomeetriliselt lainepikkusel 220 nm, mõõtes asjakohaste piikide piigialust pindala (area under the curve, AUC) ning arvutades peptiidi kontsentratsiooni, kasutades selleks standarditega saadud lineaarset kalibreerimiskõverat. Iga proovi kohta määratakse peptiidi sisalduse vähenemine protsentides, selleks mõõdetakse piigialune pindala ja jagatakse see asjakohase võrdluskontrolli C piigialuse pindala keskväärtusega (vt 3. liide) vastavalt allpool kirjeldatud valemile. Katse nõuetekohasuse kriteeriumid Analüüs loetakse nõuetekohaseks, kui on täidetud järgmised kriteeriumid: a) standardse kalibreerimiskõvera r2>0,99; b) kolme paralleelproovi peptiidide sisalduse vähenemise protsendi keskväärtus positiivse kontrollina kasutatava kaneelaldehüüdi puhul peab olema vahemikus 60,8–100 % tsüsteiini sisaldava peptiidi puhul ja vahemikus 40,2–69,0 % lüsiini sisaldava peptiidi puhul ning positiivse kontrolli paralleelproovide maksimaalne standardhälve (standard deviation, SD) on tsüsteiini sisaldava peptiidi sisalduse vähenemise protsendi puhul <14,9 % ja lüsiini sisaldava peptiidi sisalduse vähenemise protsendi puhul <11,6 %; c) võrdluskontrollide (A) peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus peab jääma vahemikku 0,50 ± 0,05 mM ning atsetonitriili lahuses oleva üheksa kontrolli (B ja C) piigialuste pindalade variatsioonikordaja (coefficient of variation, CV) peab olema < 15,0 %. Kui üks nendest kriteeriumidest on täitmata, tuleb analüüsi korrata. Järgmised kriteeriumid peavad olema täidetud, et uuritava kemikaaliga saadud tulemusi saaks käsitada kehtivana: a) uuritava kemikaali paralleelproovide maksimaalne standardhälve peab olema tsüsteiini sisalduse protsendilise vähenemise korral < 14,9 % ja lüsiini sisalduse protsendilise vähenemise korral < 11,6 %; b) kolme võrdluskontrolli C peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus peab olema 0,50 ± 0,05 mM. Kui need kriteeriumid ei ole täidetud, tuleb saadud tulemused lugeda kehtetuks ning selle konkreetse kemikaali analüüsi uuesti korrata. Prognoosimudel Iga uuritava kemikaali kohta arvutatakse tsüsteiini sisalduse ja lüsiini sisalduse protsendilise vähenemise keskväärtus. Negatiivset vähenemise tulemust käsitatakse keskväärtuse arvutamisel nullina. Kasutades prognoosimudelit tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50, mis on esitatud tabelis 1, tuleb ühtse lähenemisviisi raamistikus naha sensibilisaatorite ja nahka mitte sensibiliseerivate kemikaalide eristamiseks kasutada läviväärtusena peptiidi sisalduse vähenemise keskmist protsenti 6,38 %. Ühtse lähenemisviisi raamistikus võib uuritava kemikaali reaktsioonivõime klassi (st nõrk, mõõdukas ja tugev reaktsioonivõime) määramisel osutuda kasulikuks prognoosimudeli rakendamine. Prognoosimudeli rakendamisel uuritava kemikaali reaktsioonivõime klassi (st nõrk, mõõdukas, tugev reaktsioonivõime) määramiseks võib saada kasulikku teavet, millest juhinduda reaktsioonivõime hindamisel ühtse lähenemisviisi raamistikus. Tabel 1 Prognoosimudel tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50 (20) Tsüsteiini ja lüsiini sisalduse vähenemise % keskväärtus Reaktsioonivõime klass DPRA prognoos (21) 0 % ≤ sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 6,38 % Puuduv või minimaalne reaktsioonivõime Negatiivne 6,38 % < sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 22,62 % Nõrk reaktsioonivõime Positiivne 22,62 % < sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 42,47 % Mõõdukas reaktsioonivõime 42,47 % < sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 100 % Tugev reaktsioonivõime Võib esineda juhte, kus uuritaval kemikaalil (ainel või ühest või mitmest koostisosast koosneva aine või segu mõnel koostisosal) on lainepikkusel 220 nm oluline neelduvus ning peptiidiga ühesugune retentsiooniaeg (elueeruvad koos). Koelueerumise võib kõrvaldada, kui vähesel määral kohandada HPLC süsteemi nii, et paremini lahutada uuritava kemikaali elueerimise aega peptiidi elueerimise ajast. Kui koelueerimise vältimiseks kasutatakse alternatiivset HLPC süsteemi, tuleb tõendada selle samaväärsust valideeritud süsteemiga (nt kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid). Kui esineb koelueerimine, ei saa peptiidi piiki integreerida ning on võimatu arvutada peptiidi sisalduse vähenemise protsenti. Kui sellised uuritavad kemikaalid elueeruvad koos nii tsüsteiini sisaldavate kui ka lüsiini sisaldavate peptiididega, tuleb analüüsi tulemus lugeda ebaselgeks. Kui uuritav kemikaal elueerub ainult koos lüsiini sisaldava peptiidiga, siis võib kasutada tabelis 2 esitatud prognoosimudelit tsüsteiin 1:10. Tabel 2 Prognoosimudel tsüsteiin 1:10 (22) Tsüsteiini (Cys) sisalduse vähenemise % Reaktsioonivõime klass DPRA prognoos (23) 0 % ≤ tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 13,89 % Puuduv või minimaalne reaktsioonivõime Negatiivne 13,89 % < tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 23,09 % Nõrk reaktsioonivõime Positiivne 23,09 % < tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 98,24 % Mõõdukas reaktsioonivõime 98,24 % < tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 100 % Tugev reaktsioonivõime Võib esineda muid juhte, kui uuritava kemikaali ja emma-kumma peptiidi retentsiooniaja kattumine ei ole täielik. Sellistel juhtudel võib peptiidi protsendilise sisalduse vähenemise väärtusi hinnata ning kasutada prognoosimudelit tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50, kuid uuritava kemikaali reaktsioonivõime klassi ei saa täpselt määrata. Nii lüsiini kui ka tsüsteiini puhul peaks uuritava kemikaali kohta piisama ühest HPLC analüüsist, kui tulemus on selge. Kui tulemused on lähedal läviväärtusele, millega eristatakse positiivseid tulemusi negatiivsetest (st piiripealsed tulemused), võib siiski vaja minna täiendavat testimist. Kui esineb olukordi, milles prognoosimudeli tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50 korral jääb keskmine sisalduse vähenemise protsent vahemikku 3–10 % või prognoosimudeli tsüsteiin 1:10 korral jääb tsüsteiini sisalduse vähenemise protsent vahemikku 9–17 %, kaalutakse teise katseseeria tegemist, ning juhul, kui selle tulemused erinevad esimesest seeriast, tuleb teha ka kolmas seeria. Katseprotokoll Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet: Uuritav kemikaal — Ühe koostisosaga aine — Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid; — füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses; — puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne; — uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — uuritud kontsentratsioon(id); — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; — Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud: — kirjeldatakse nii palju kui võimalik, lähtudes koostisosade keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), puhtusest, kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest; — välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses; — molekulmass või näiline molekulmass teadaoleva koostisega segude/polümeeride korral või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave; — uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — uuritud kontsentratsioon(id); — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; Kontrollid — Positiivne kontroll — Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid; — füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses; — puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne; — kontrolli kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — uuritud kontsentratsioon(id); — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; — viide varasematele positiivse kontrolli tulemustele, mis tõendavad sobivaid analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriume, kui asjakohane. — Lahusti/vehiikul — Kasutatud lahusti/vehiikul ja selle koostisosade suhe, kui asjakohane; — kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid ja/või muud identifikaatorid; — puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne; — füüsiline välimus, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused juhul, kui kasutatakse muid lahusteid/vehiikuleid kui need, mida on katsemeetodis nimetatud, kättesaadavas ulatuses; — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; — iga uuritava kemikaali puhul lahusti valimise põhjendus; — atsetonitriili puhul uuring, kuidas see mõjub peptiidi stabiilsusele. Peptiidide, positiivsete kontrollide ja uuritava kemikaali preparaatide valmistamine — Peptiidilahuste kirjeldus (tarnija, partii, peptiidi täpne mass, põhilahusele lisatud ruumala); — positiivse kontrolli lahuse kirjeldus (positiivse kontrolli aine täpne mass, katselahusele lisatud ruumala); — uuritava kemikaali lahuste kirjeldus (uuritava kemikaali täpne mass, katselahusele lisatud ruumala); HPLC seadmed ja analüüs — HPLC seadme tüüp, HPLC analüütiline kolonn ja eelkolonn, detektor, proovi automaatsisestaja; — HPLC analüüsi jaoks asjakohased parameetrid, nagu kolonni temperatuur, süstimisruumala, voolukiirus ja gradient. Süsteemi sobivus — Iga standardproovi ja võrdluskontrolli A paralleelproovi korral peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm; — lineaarse kalibreerimiskõvera graafik ja r2 väärtus; — peptiidi kontsentratsioon iga võrdluskontrolli A paralleelproovi korral; — kolme võrdluskontrolli A korral peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus (mM), SD ja CV; — peptiidi kontsentratsioon võrdluskontrollide A ja C korral. Analüüsiseeria — Võrdluskontrolli kohta: — iga võrdluskontrolli B ja C paralleelproovi peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm; — atsetonitriilis lahustatud üheksa võrdluskontrolli B ja C korral peptiidipiigi aluse pindala keskväärtus lainepikkusel 220 nm, SD ja CV (selleks, et tõendada võrdluskontrollide stabiilsust analüüsi jooksul); — iga kasutatud lahusti kohta kolme asjakohase võrdluskontrolli C korral peptiidipiigi aluse pindala keskväärtus lainepikkusel 220 nm (peptiidi sisalduse vähenemise protsendi arvutamiseks); — iga kasutatud lahusti kohta kolme asjakohase võrdluskontrolli C korral peptiidi kontsentratsioon (mM); — iga kasutatud lahusti kohta kolme asjakohase võrdluskontrolli C korral peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus (mM), SD ja CV. — Positiivse kontrolli kohta: — iga paralleelproovi peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm; — iga paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsent; — kolme paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsendi keskväärtus, SD ja CV. — Iga uuritava kemikaali kohta: — sademe tekkimine reaktsioonisegus inkubeerimisaja lõpus, kui täheldatakse; kas sade lahustati uuesti või tsentrifuugiti; — koelueerimise esinemine; — muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus, kui asjakohane; — iga paralleelproovi peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm; — iga paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsent; — kolme paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsendi keskväärtus, SD ja CV; — tsüsteiini ja lüsiini sisalduse vähenemise protsendi keskväärtused; — kasutatud prognoosimudel ja DPRA prognoos. Tasemekatsed — Kui see on asjakohane, esitage labori katsemeetodi tegemise pädevuse tõendamiseks kasutatud meetod (nt pädevuse kontrolli ainetega katsetamine) või meetod, millega tõendatakse katsemeetodi toimivuse korratavust ajas. Tulemuste arutelu — DPRA katsega saadud tulemuste arutelu; — katsemeetodiga saadud tulemuste arutelu ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui on olemas muud asjakohast teavet. Järeldus KIRJANDUS (1) United Nations (UN) (2013), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Kättesaadav aadressil: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html (2) OECD (2012), „The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence“, Series on Testing and Assessment, No. 168, OECD, Paris. (3) Käesoleva lisa peatükk B.6, „Naha sensibiliseerimine“, (4) Käesoleva lisa peatükk B.42, „Lokaalsete lümfisõlmede katse“ (5) Käesoleva lisa peatükk B.50: „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: DA“. (6) Käesoleva lisa peatükk B.51, „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse BrdU-ELISA meetodil“. (7) Adler et al. (2011), „Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010“, Archives of Toxicology, Vol. 85: 367–485. (8) Gerberick et al. (2004), „Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens“, Toxicological Sciences 81: 332–343. (9) Gerberick et al. (2007), „Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach“, Toxicological Sciences 97: 417–427. (10) EC EURL-ECVAM (2013), „Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing“. Kättesaadav aadressil: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra (11) Jaworska et al. (2013), „Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice“, Journal of Applied Toxicology, avaldatud internetis, 14. mai 2013, DOI: 10.1002/jat.2869. (12) Bauch et al. (2012), „Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential“, Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489–504. (13) Nukada et al. (2013), „Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals“, Toxicology in Vitro 27: 609-618. (14) Ball et al. (2011), „Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach“, Regulatory Toxicology and Pharmacology 60: 389–400. (15) Landsteiner and Jacobs (1936), „Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds“, Journal of Immunological Methods 64: 625–639. (16) Dupuis and Benezra (1982), Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach, New York & Basel: Marcel Dekker Inc. (17) Lepoittevin et al. (1998), Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin. (18) EC EURL ECVAM (2012), „Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report“, 74 pp. Kättesaadav aadressil: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra (19) Natsch et al. (2013), „A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation“, Journal of Applied Toxicology, avaldatud internetis, 9. aprill 2013, DOI:10.1002/jat.2868. (20) „DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing“, 17 pp. Kättesaadav aadressil: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/ (21) OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, Series on Testing and Assessment No. 34, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France. (22) FDA (Food and Drug Administration (2001), „Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation“, 22 pp. Kättesaadav aadressil: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf – 138 (23) ICCVAM (2003), „Contact sensitization: Classification according to potency“, European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). 1. liide MÕISTED Aine – keemilised elemendid ja nende ühendid, kas looduslikud või tootmisprotsessiga saadud, sealhulgas neis sisalduvad toote stabiliseerimiseks vajalikud lisaained või tootmisprotsessist tulenevad lisandid, välja arvatud lahusti, mida on võimalik eraldada aine stabiilsust mõjutamata ja selle koostist muutmata (1). Asjakohasus – huvipakkuva toime ja katse vahelise seose kirjeldus, millest nähtub, kas see seos on tähenduslik ning kasulik konkreetse eesmärgi puhul. See on ulatus, mille piires saab katsemeetodiga õigesti mõõta või prognoosida huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasusega seoses võetakse arvesse ka katsemeetodi täpsust (kordustäpsust) (21). Kahjuliku toime rada (Adverse Outcome Pathway, AOP) – sündmuste ahel alates sihtkemikaali või sarnaste kemikaalide rühma keemilisest struktuurist molekulaarse initsieerimisetapi kaudu vaadeldava toime kliinilise avaldumiseni in vivo (2). Kalibreerimiskõver – seos katses saadud toime väärtuse ja aine teadaoleva analüütilise kontsentratsiooni vahel (nimetatakse ka standardkõveraks). Katsete tegemist ja hindamist käsitlev ühtne lähenemisviis (Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA; lühendatult „ühtne lähenemisviis“) – struktureeritud lähenemisviis, mida kasutatakse kemikaali või kemikaalide rühma ohutegurite tuvastamiseks (võimalikkus), selle kirjeldamiseks (toime tugevus) ja/või ohutuse hindamiseks (võimalikkus / toime tugevus ja kokkupuude) ja millega ühendatakse strateegiliselt ning analüüsitakse kõik asjakohased andmed, et oleks olemas vajalik teave regulatiivse meetme võtmiseks seoses võimaliku ohu ja/või riskiga ja/või täiendavaks sihipäraseks (ja seega minimaalseks) katsetamiseks. Kemikaal – aine või segu. Korratavus – sama kemikaali sama metoodikaga uurimisel saadud tulemuste kokkulangevus (vt usaldusväärsus) (21). Mitme koostisosaga aine – aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on rohkem kui üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vahemikus 10 %–80 % (massiprotsent). Mitme koostisosaga aine saadakse tootmisprotsessi käigus. Erinevus segu ja mitme koostisosaga aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitme koostisosaga aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel. Molekulaarne initsieerimisetapp – bioloogilise süsteemi molekulaarsel tasandil häirumine, mis on tekitatud kemikaali poolt ja mis on tuvastatud kui kahjuliku toime raja algetapp. Ohtlikkus – mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, mis võib põhjustada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (alam-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub. Positiivne kontroll – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse ainega, mis teadaolevalt kutsub esile positiivse toime. Selleks et oleks võimalik hinnata positiivse kontrolli kemikaali tekitatud toime muutumist ajas, ei tohi positiivne toime olla liiga tugev. Segu – ainete segu või lahus, mis koosneb kahest või enamast ainest, mis omavahel ei reageeri (1). Spetsiifilisus – kõikide negatiivsete/inaktiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (21). Süsteemi sobivus – etalonainega enne katseseeria analüüside tegemist kindlaks määratud seadme toimivus (nt tundlikkus) (22). Tundlikkus – kõigi positiivsete/reaktsioonivõimeliste kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (21). Täpsus – näitab katsemeetodi tulemuste lähedust kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega (mõõtetäpsus). Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses, mis näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (21). Usaldusväärsus – katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama metoodikaga. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega (21). Uuritav kemikaal – terminit „uuritav kemikaal“ kasutatakse katseobjekti kohta. UVCB – tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid. Valiidne katsemeetod: katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul käsitatakse piisavana ning mis põhineb teaduslikult tõendatud põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi valiidne absoluutses tähenduses, vaid ainult seoses määratud eesmärgiga (21). Variatsioonikordaja – hajuvuse mõõt, mis arvutatakse paralleelandmete rühma kohta; selleks jagatakse standardhälve keskväärtusega. Seda saab väljendada protsentides, kui korrutada tulemus sajaga. Võrdluskontroll – uuritava kemikaaliga töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või vehiikulit, ja mida käideldakse samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud proovi ja muude kontrollide proove, et määrata lähtetase, mille suhtes tuleb arvutada samas lahustis või vehiikulis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide tekitatud reaktsiooni lähtetaseme väärtus. Kui seda proovi uuritakse paralleelselt negatiivse kontrolli prooviga, siis näitab see, kas lahusti või vehiikul interakteerub katsesüsteemiga. Ühe koostisosaga aine – aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vähemalt 80 % (massiprotsent). Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (United Nations Globally Harmonized System, UN GHS)) – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ained ja segud) klassifitseerimine füüsikaliste ohutegurite ning tervise- ja keskkonnaohu standarditud tüübi ja -taseme alusel ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, mille eesmärk on edastada teavet kemikaalide kahjulikest toimetest, et kaitsta inimesi (sealhulgas tööandjaid, töötajaid, vedajaid, tarbijaid ja päästetöötajaid) ning keskkonda (1). 2. liide PÄDEVUSE KONTROLLI AINED Naha sensibiliseerimine in chemico: otsene reaktsioonivõime katse peptiididega Enne käesoleva katsemeetodi rutiinset kasutamist tuleb laboritel tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades selleks kümmet tabelis 1 soovitatud pädevuse kontrolli ainet, et saada nendega õige eeldatav DPRA prognoos ning tsüsteiini ja lüsiini sisalduse vähenemise väärtused, mis kummagi peptiidi puhul jäävad asjakohasesse võrdlusvahemikku kaheksa pädevuse kontrolli aine puhul kümnest. Pädevuse kontrolli ained on valitud nii, et need esindaksid naha sensibiliseerimise ohuga seotud eri reaktsioone. Muud valiku kriteeriumid olid, et need ained on kaubanduslikult kättesaadavad, on olemas kõrgekvaliteedilised in vivo võrdlusandmed ning kõrgekvaliteedilised DPRA katsemeetodiga in vitro saadud andmed, mida on kasutatud EURL ECVAM-i koordineeritud valideerimisuuringus, et tõendada katsemeetodi edukat rakendamist selles uuringus osalenud laborites. Tabel 1 Soovitatavad pädevuse kontrolli ained DPRA katse tegemise tehnilise pädevuse tõendamiseks Pädevuse kontrolli ained CASi nr Füüsikaline olek In vivo toime prognoos (24) DPRA prognoos (25) Tsüsteiini sisalduse vähenemise protsendiline vahemik (26) Lüsiini sisalduse vähenemise protsendiline vahemik (26) 2,4-dinitroklorobenseen 97-00-7 Tahke Sensibilisaator (äärmiselt tugev) Positiivne 90–100 15–45 Oksasoloon 15646-46-5 Tahke Sensibilisaator (äärmiselt tugev) Positiivne 60–80 10–55 Formaldehüüd 50-00-0 Vedelik Sensibilisaator (tugev) Positiivne 30–60 0–24 Bensülideenatsetoon 122-57-6 Tahke Sensibilisaator (mõõdukas) Positiivne 80–100 0–7 Farnesaal 19317-11-4 Vedelik Sensibilisaator (nõrk) Positiivne 15–55 0–25 2,3-butaandioon 431-03-8 Vedelik Sensibilisaator (nõrk) Positiivne 60–100 10–45 1-butanool 71-36-3 Vedelik Sensibiliseeriva toimeta Negatiivne 0–7 0-5,5 6-metüülkumariin 92-48-8 Tahke Sensibiliseeriva toimeta Negatiivne 0–7 0-5,5 Piimhape 50-21-5 Vedelik Sensibiliseeriva toimeta Negatiivne 0–7 0–5,5 4-metoksüatsetofenoon 100-06-1 Tahke Sensibiliseeriva toimeta Negatiivne 0–7 0–5,5 3. liide HPLC ANALÜÜSI JÄRJESTUSE NÄIDE Kalibreerimisstandardid ja võrdluskontrollid STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 Lahjenduspuhver Võrdluskontroll A, 1. paralleelproov Võrdluskontroll A, 2. paralleelproov Võrdluskontroll A, 3. paralleelproov Koelueerumise kontrollid Koelueerumise 1. kontroll, esimene uuritav kemikaal Koelueerumise 2. kontroll, teine uuritav kemikaal Võrdluskontrollid: Võrdluskontroll B, 1. paralleelproov Võrdluskontroll B, 2. paralleelproov Võrdluskontroll B, 3. paralleelproov Esimene paralleelproovide komplekt: Võrdluskontroll C, 1. paralleelproov Kaneelaldehüüd, 1. paralleelproov 1. proov, 1. paralleelproov 2. proov, 1. paralleelproov Teine paralleelproovide komplekt: Võrdluskontroll C, 2. paralleelproov Kaneelaldehüüd, 2. paralleelproov 1. proov, 2. paralleelproov 2. proov, 2. paralleelproov Kolmas paralleelproovide komplekt: Võrdluskontroll C, 3. paralleelproov Kaneelaldehüüd, 3. paralleelproov 1. proov, 3. paralleelproov 2. proov, 3. paralleelproov Võrdluskontrollid: Võrdluskontroll B, 4. paralleelproov Võrdluskontroll B, 5. paralleelproov Võrdluskontroll B, 6. paralleelproov Analüüsi järjestuses tuleb kasutada kolme võrdluskontrollide (st proovid, mis koosnevad ainult asjakohases lahustis lahustatud peptiidist) komplekti. Võrdluskontroll A: kasutatakse, et kontrollida HPLC süsteemi sobivust. Võrdluskontroll B: lisatakse analüüside seeria alguses ja lõpus, et kontrollida võrdluskontrollide stabiilsust analüüsiks kulunud aja jooksul. Võrdluskontroll C: lisatakse analüüside seeriasse eesmärgiga kontrollida, et uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahusti ei mõjuta peptiidi sisalduse vähenemise protsenti. B.60. Naha sensibiliseerimine in vitro: ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetod SISSEJUHATUS Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 442D (2015). Naha sensibilisaator on aine, mis põhjustab nahaga kokkupuutel allergilise reaktsiooni, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (ÜRO GHS) (1) ja Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (27). Käesolevas katsemee todis kirjeldatakse in vitro meetodit (ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetod, ARE-Nrf2 luciferase assay)), mis aitab eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest ainetest kooskõlas ÜRO GHSi (1) ja CLP-määrusega. Naha sensibiliseerumise oluliste bioloogiliste etappide suhtes on olemas ühisarusaam. Olemasolev teave naha sensibiliseerimisega seotud keemiliste ja bioloogiliste mehhanismide kohta on kokku võetud kahjuliku toime raja (Adverse Outcome Pathway, AOP) käsitluses (2), milles kirjeldatakse kõiki etappe alates protsessi käivitavast molekulaarsest etapist vahestaadiumide kaudu kuni tervisele kahjuliku toimeni, st allergilise kontaktdermatiidini inimeste puhul või kontakthüpersensitiivsuseni närilistel (2, 3). Käivitavaks molekulaarse tasandi etapiks on elektrofiilsete ainete kovalentne sidumine naha valkude nukleofiilsete tsentritega. Kahjuliku toime raja teine oluline etapp toimub keratinotsüütides ning hõlmab nii põletikureaktsioone kui ka selliste geenide avaldumist, mis on seotud spetsiifiliste signaaliülekanderadadega, nagu antioksüdatiivse/elektrofiilse reaktsiooni elemendist (antioxidant/electrophile response element, ARE) sõltuvad rajad. Kolmas oluline etapp on dendriitrakkude aktiveerimine, mida hinnatakse tavaliselt spetsiifiliste raku pinnamarkerite kemokiinide ja tsütokiinide avaldumise alusel. Neljas oluline etapp on T-rakkude paljunemine, mida hinnatakse kaudselt hiire lokaalsete lümfisõlmede katses (4). Nahka sensibiliseeriva toime hindamiseks on tavaliselt kasutatud katseloomi. Merisigu kasutatakse klassikalistes meetodites, nagu Magnussoni ja Kligmani meetodil merisea maksimeeritud nahaärritustest (Guinea Pig Maximisation Test, GMPT) ja Buehleri katse (katsemeetod B.6 (5)), millega uuritakse nii naha sensibiliseerimise induktsiooni- kui ka avaldumisfaasi. Kõigi hiirtega läbiviidavate katsetega, s.o lokaalsete lümfisõlmede katse (Local Lymph Node Assay, LLNA, katsemeetod B.42 (4)) ja selle kahe radioaktiivse märgistuseta modifikatsiooni puhul (LLNA: DA (katsemeetod B.50 (6)) ja LLNA: BrdU-ELISA (katsemeetod B.51 (7)), hinnatakse ainult induktsioonina avalduvat toime, kuid need on samuti heaks kiidetud, sest loomade heaolu seisukohast on neil eeliseid võrreldes merisigade kasutamisega katsetes, ja nende kaudu saab naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi objektiivselt mõõta. Hiljuti on mehhanistlikul käsitlusel põhinevad in chemico ja in vitro katsemeetodid arvatud teaduslikult põhjendatuiks kemikaalidest tuleneva naha sensibiliseerimise ohu hindamiseks. Kuna igas loomadeta tehtavas katses (in silico, in chemico, in vitro) on kahjuliku toime raja käsitlus piiratud ja mehhanistlik (2, 3), on vaja katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi (Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA, edaspidi „ühtne lähenemisviis“) raames katseid kombineerida, et saaks täielikult loobuda praegu kasutatavatest loomkatsetest. Käesolev katsemeetod (ARE-Nrf2 lutsiferaasi katse) on ette nähtud 2. punktis selgitatud teise olulise etapi uurimiseks. Naha sensibilisaatorite kohta on avaldatud, et nad käivitavad geene, mida reguleerib antioksüdatiivse reaktsiooni element (ARE) (8, 9). Väikesed elektrofiilsed ained nagu naha sensibilisaatorid võivad mõjutada sensorvalku KEAP1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), näiteks selle tsüsteiinijäägi kovalentse modifitseerimise kaudu, mistõttu valk ja transkriptsioonifaktor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2) dissotsieeruvad. Dissotsieerunud Nrf2 võib seejärel aktiveerida ARE-sõltuvaid geene, näiteks neid, mis kodeerivad II faasi detoksifitseerivaid ensüüme (8, 10, 11). Praegu on KeratinoSensTM test ainuke käesoleval meetodil põhinev in vitro ARE-Nrf2 lutsiferaasi katse, mille valideerimisuuringud on lõpetatud (9, 12, 13), misjärel on sõltumatu vastastikuse hindamise läbi viinud Euroopa Alternatiivsete Meetodite Tõestamise Keskuse Euroopa Liidu referentlabor (EURL ECVAM) (14). Teaduslikult põhjendatuks loeti KeratinoSensTM testi kasutamine ühtse lähenemisviisi osana, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest ohu klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil (14). Laborid, kes soovivad seda katsemeetodit rakendada, võivad saada KeratinoSensTM testis kasutatud rekombinantse rakuliini, sõlmides litsentsilepingu selle katsemeetodi väljatöötajaga (15). Mõisted on esitatud 1. liites. LÄHTEKAALUTLUSED, KASUTATAVUS JA PIIRANGUD Kuna Keap1-Nrf2-ARE raja aktiveerimine on seotud ainult naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja teise olulise etapiga, on ebatõenäoline, et andmed, mis on saadud selle raja aktiveerimisel põhinevate katsemeetoditega, oleksid piisavad eraldi kasutamiseks, et teha järeldus kemikaali võime kohta nahka sensibiliseerida. Seepärast tuleks käesoleva meetodiga saadud andmeid käsitada ainult seoses selliste ühtsete lähenemisviisidega nagu IATA ja kombineerida neid täiendava teabega, näiteks sellisega, mis on saadud naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja teisi olulisi etappe käsitlevatest in vitro katsetest, ning kasutada peale katsemeetodite ka muid meetodeid, sealhulgas võrdlemist kemikaali analoogidega. Näited, kuidas ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodit kombinatsioonis muu teabega kasutada, on avaldatud teaduskirjanduses (13, 16–19). Käesolevat katsemeetodit kasutatakse selleks, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid (st ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooria) nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest ühtse lähenemisviisi kontekstis. Seda meetodit ei saa kasutada eraldivõetuna, sellega ei saa kategoriseerida naha sensibilisaatoreid ÜRO GHSis / CLP-määruses määratletud alamkategooriatesse 1A ja 1B ega prognoosida toime tugevust ohutushindamisega seotud otsuste tegemiseks. Sõltuvalt õigusraamistikust võib eraldivõetuna siiski kasutada positiivset tulemust kemikaali klassifitseerimiseks ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooriasse. Valideerimisuuringu andmete ning katsemeetodi sõltumatuks vastastikuseks hindamiseks kasutatud in-house testimise alusel osutus KeratinoSensTM test tõendatult ülevõetavaks rakukultuurimeetodites kogenud laborite poolt. Prognooside korratavuse tase, mida võib selle katsemeetodi puhul eeldada, on ligikaudu 85 % nii laborisisese kui ka laboritevahelise korratavuse puhul (14). KeratinoSensTM testi täpsus (77 %, 155/201), tundlikkus (78 %, 71/91) ja spetsiifilisus (76 %, 84/110) naha sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi/CLP-määruse 1. kategooria) eristamisel nahka mitte sensibiliseerivatest ainetest, võrreldes LLNA tulemustega, arvutati kõigi andmete põhjal mis esitati EURL ECVAMile katsemeetodi hindamiseks ja vastastikuseks hindamiseks (14). Need arvulised väärtused on sarnased hiljuti avaldatud ligikaudu 145 aine in-house testimise tulemustega (täpsus 77 %, tundlikkus 79 %, spetsiifilisus 72 %) (13). KeratinoSensTM testiga on tõenäosem alaprognoosida väikese kuni mõõduka naha sensibiliseerimise potentsiaaliga kemikaale (st ÜRO GHSi / CLP-määruse alamkategooria 1B) kui kemikaale, millel on tugev nahka sensibiliseeriv toime (st ÜRO GHSi/CLP-määruse alamkategooria 1A) (13, 14). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et KeratinoSensTM test on kasulik meetod, mis aitab kindlaks teha naha sensibiliseerimise ohtu. Ainsa katsemeetodina kasutatava KeratinoSensTM testi täpsuse väärtused on siinkohal siiski vaid näitlikud, sest katsemeetodit tuleb kohaldada ühtse lähenemisviisi kontekstis kombinatsioonis muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas eespool punktis 9 esitatud nõuetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, milles ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks arvestada sellega, et LLNA nagu ka muud loomkatsed ei pruugi täielikult peegeldada kemikaali tegelikku toimet huvipakkuvas liigi, s.o inimese puhul. Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina ja see ei ole seotud ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodi kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks. Praegu olemasolevast teabest nähtub, et KeratinoSensTM test on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide puhul, millel on erinevad orgaanilised funktsionaalrühmad, toimemehhanismid, erinev nahka sensibiliseeriva toime tugevus (in vivo katsetes määratuna) ja erinevad füüsikalis-keemilised omadused (9, 12–14). Põhiliselt uuriti ühe koostisosaga aineid, kuigi piiratud kogus andmeid on olemas ka katsetest segudega (20). See katsemeetod on siiski tehniliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete ja segude uurimiseks. Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb siiski kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist. Peale selle, kui uuritakse mitme koostisosaga aineid või segusid, tuleb võtta arvesse tsütotoksiliste koostisosade võimalikku segavat mõju vaadeldavatele toimetele. See katsemeetod on kohaldatav lahustuvatele uuritavatele kemikaalidele või kemikaalidele, mis moodustavad kas vees või DMSOs stabiilse dispersiooni (st kolloidi või suspensiooni, milles uuritav kemikaal ei sadestu ega eraldu lahustist eri faasideks; kui uuritakse mitme koostisosaga ainet või segu, kehtib see tingimus uuritava kemikaali kõikide koostisosade kohta). Uuritavaid kemikaale, mis ei vasta neile tingimustele suurimas nõutavas lõppkontsentratsioonis 2 000 μM (vt punkt 22), võib siiski testida väiksemates kontsentratsioonides. Sellisel juhul võib positiivsuse kriteeriumidele vastavaid tulemusi, mis on kirjeldatud punktis 39, siiski kasutada selleks, et toetada kemikaali määramist naha sensibilisaatoriks, samas kui negatiivset tulemust, mis on saadud kontsentratsioonidega < 1 000 μM, tuleb käsitada ebaselgena (vt prognoosimudel punkt 39). Üldiselt on aineid, mille log P-väärtus on kuni 5, edukalt uuritud, samas kui äärmiselt hüdrofoobsed ained, mille log P on üle 7, jäävad välja katsemeetodi teadaolevast kohaldamisalast (14). Ainete kohta, mille log P on 5–7, on olemas vaid piiratud teavet. Negatiivseid tulemusi tuleb tõlgendada ettevaatusega, sest ained, mis reageerivad vaid lüsiinijääkidega, võidakse selle katsemeetodiga määrata negatiivseks. Peale selle võivad prohapteenid (st kemikaalid, mis vajavad ensümaatilist aktiveerimist, nt P450 ensüümide abil) ja prehapteenid (st kemikaalid, mis aktiveeruvad autooksüdeerumisel), eriti need, mis on aeglase oksüdeerumiskiirusega, anda negatiivseid tulemusi kasutatava rakuliini (21) piiratud metaboliseeriva võime ja katsetingimuste tõttu. Teisalt võivad uuritavad kemikaalid, mis ei toimi sensibilisaatorina, kuid on siiski keemilised mõjurid, põhjustada valepositiivseid tulemusi (14). Peale selle ei saa alati usaldusväärselt hinnata uuritavaid kemikaale, mis on väga tsütotoksilised. Lõpuks võivad uuritavad kemikaalid, mis toimivad lutsiferaasile, moonutada lutsiferaasi aktiivsust rakupõhistes katsetes, mis põhjustab kas näilist inhibitsiooni või suurenenud luminestsentsi (22). Näiteks on teatatud, et fütoöstrogeenid suuremas kontsentratsioonis kui 1 μM segavad lutsiferaasi signaale teistes lutsiferaasipõhistes reportergeeni katsetes, sest esineb lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveerimine. Seetõttu tuleb hoolikalt uurida lutsiferaasi ekspressiooni, mis on saadud suurtes kontsentratsioonides fütoöstrogeenide või sarnaste kemikaalidega, mille suhtes kahtlustatakse, et neil on fütoöstrogeenilaadne lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveeriv toime (23). Kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa kasutada muude konkreetsete kemikaalirühmade puhul, ei tohi seda nende konkreetsete kemikaalirühmade puhul kasutada. Lisaks naha sensibilisaatorite eristamisele nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest, saab KeratinoSensTM testiga teavet ka kontsentratsiooni-toime seose kohta, mis võib aidata hinnata kemikaali sensibiliseerimise potentsiaali, kui kasutada seda selliste ühtsete lähenemisviiside puhul nagu IATA (19). Vaja on täiendavaid uuringuid, mis eelistatult põhinevad usaldusväärsetel inimpõhistel andmetel, et teha kindlaks, kuidas saab KeratinoSensTM testi tulemusi kasutada toime tugevuse hindamiseks (24) ning sensibilisaatorite jagamiseks alamkategooriatesse vastavalt ÜRO GHSile/CLP-määrusele. KATSE PÕHIMÕTE ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodis kasutatakse kasvunõu pinnale kinnituvat immortaliseeritud rakuliini, mis on saadud selektiivse plasmiidiga stabiilselt transfekteeritud inimese keratinotsüütidest HaCaT. Selles rakuliinis reguleerib lutsiferaasi geeni transkriptsiooni konstitutiivne promootor, mis on liitunud ARE-elemendiga geenist, mida teadaolevalt aktiveerivad kontaktsensibilisaatorid (25, 26). Lutsiferaasi signaal kajastab endogeensest transkriptsioonifaktorist Nrf2 sõltuvate geenide aktiveerimist sensibilisaatorite poolt ning on tõendatud, et rekombinantse rakuliini lutsiferaasi signaal sõltub transkriptsioonifaktorist Nrf2 (27). See võimaldab pärast rakkude kokkupuudet elektrofiilsete substraatidega kvantitatiivselt mõõta lutsiferaasi geeni induktsiooni Nrf2-transkriptsioonifaktori aktiivsuse näitajana (luminestsentsi määramise kaudu), kasutades üldkasutatavaid valgust tekitavaid lutsiferaasi substraate. KeratinoSens™ testis käsitatakse uuritavad kemikaale positiivsena, kui nad põhjustavad lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni statistiliselt olulise ja läviväärtust ületava suurenemise (st üle 1,5kordse või üle 50 % suurenemise) kontsentratsioonis, mis on väiksem kui kindlaks tehtud kontsentratsioon, mis ei mõjuta oluliselt rakkude eluvõimelisust (st alla 1 000 μM ja kontsentratsioonis, mille korral rakkude eluvõimelisus on üle 70 % (9, 12)). Selleks määratakse maksimaalne lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon (Imax) kordades, võrreldes lahusti (negatiivse) kontrolliga. Kuna uuritavat kemikaali lisatakse rakkudele eri kontsentratsioonide sarjana, tuleb annuse-toime kõvera alusel peale selle interpoleerida kontsentratsioon, mida on vaja, et tekitada lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni statistiliselt oluline läviväärtust ületav suurenemine (st EC1,5 väärtus) (arvutamiseks vt punkt 32). Lisaks tuleb teha paralleelsed tsütotoksilisuse mõõtmised, et hinnata, kas lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon tekib subtsütotoksilistel kontsentratsioonidel. Enne käesoleval katsemeetodil põhineva ARE-Nrf2 lutsiferaasi testi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid. Uute või muudetud in vitro ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodite valideerimise lihtsustamiseks on olemas toimivusnõuded, mis on sarnased KeratinoSens™ testiga ning võimaldavad nende lisamisega selle katsemeetodi õigeaegset muutmist (28). Vastastikune andmete tunnustamine vastavalt OECD kokkuleppele tagatakse vaid nende katsemeetodite puhul, mis on valideeritud kooskõlas toimivusnõuetega, kui need katsemeetodid on läbi vaadatud ja lisatud OECD poolt vastavasse juhendisse. KATSE KÄIK Praegu on ainus selle katsemeetodiga hõlmatud teaduslikult põhjendatud katsesüsteem KeratinoSensTM test (9, 12–14). KeratinoSensTM testi standardne töökord on kättesaadav ja seda tuleb järgida testi juurutamisel ja kasutamisel laboris (15). Labor, kes soovib seda katsemeetodit rakendada, võib saada KeratinoSensTM testis kasutatud rekombinantse rakuliini, sõlmides litsentsilepingu selle katsemeetodi väljatöötajaga. Järgmistes punktides esitatakse ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodi põhikomponendid ja katse käik. Keratinotsüütide kultuuri valmistamine Kasutada tuleb transgeenset rakuliini, mille genoomis on stabiilne lutsiferaasi geeni insertsioon, mida reguleerib ARE-element (nt KeratinoSens™ rakuliin). Pärast rakkude saamist kasvatatakse neid (nt 2–4 passaaži) ja säilitatakse külmutatult homogeense lähterakuvaruna. Sellest lähtevarust võetud rakke võib ümber külvata kuni passaaži maksimumarvuni (mis on KeratinoSensTM rakkude puhul 25) ja teha tavapäraselt katseid, kasutades asjakohast kultiveerimissöödet (KeratinoSensTM rakkude puhul DMEM, millele on lisatud seerum ja Geneticin). Katse tegemiseks peavad rakud olema saavutanud konfluentsuse 80–90 % ning tuleb tagada, et rakud ei saavutaks kunagi täielikku konfluentsust. Üks päev enne katse tegemist tuleb rakud koguda ja kanda 96-kannulisse mikrotiiterplaati (KeratinoSensTM testi puhul 10 000 rakku kannu kohta). Rakusademe teket külvi ajal tuleb hoolikalt vältida, et tagada rakkude ühetaoline arvuline jaotumine kannude vahel. Kui seda ei tehta, võib tulemuseks olla kannudevaheline suur varieeruvus. Iga korduse jaoks kasutatakse lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmiseks kolme paralleelproovi ja ühte paralleelproovi kasutatakse rakkude eluvõimelisuse hindamiseks. Uuritava kemikaali ja kontrolli ainete preparaatide valmistamine Uuritava kemikaali ja kontrolli ainete preparaadid valmistatakse katse tegemise päeval. KeratinoSensTM testi puhul lahustatakse uuritavad kemikaalid dimetüülsulfoksiidis (DMSO) soovitava lõppkontsentratsioonini (nt 200 mM). DMSO lahuseid käsitatakse isesteriliseeruvana, seepärast ei ole steriilset filtrimist vaja. Uuritav kemikaal, mis ei lahustu DMSOs, lahustatakse steriilses vees või rakusöötmes ning lahused steriliseeritakse, nt filtrimisega. Määramata molekulmassiga uuritava kemikaali puhul tehakse KeratinoSensTM testi korral põhilahus vaikimisi valitud kontsentratsioonil (40 mg/ml või 4 % (mass/ruumala)). Muude lahustite kui DMSO puhul kasutatakse vett või rakusöödet ning selle kohta tuleb esitada piisav teaduslik põhjendus. DMSOs lahustatud uuritava kemikaali põhilahusest tehakse DMSOga lahjenduste sari, et saada katse jaoks kemikaali 12 põhikontsentratsiooni (0,098 kuni 200 mM KeratinoSensTM testis). DMSOs mittelahustuva uuritava kemikaali lahjendused põhikontsentratsioonide saamiseks tehakse steriilse vee või steriilse rakusöötmega. Sõltumata kasutatud lahustist lahjendatakse põhikontsentratsioone täiendavalt 25 korda seerumit sisaldavasse rakusöötmesse ja kasutatakse lõpuks töötluseks täiendava neljakordse lahjendusteguriga, nii et uuritava kemikaali lõppkontsentratsioonid on KeratinoSensTM testi puhul vahemikus 0,98–2 000 μM. Muid kontsentratsioone võib põhjendatult kasutada (nt tsütotoksilisuse või halva lahustuvuse tõttu). KeratinoSensTM testis kasutatav negatiivne (lahusti) kontroll on DMSO (CASi nr 67-68-5,≥ puhtus 99 %), milleks valmistatakse ette kuus kannu plaadi kohta. See lahjendatakse samamoodi nagu põhikontsentratsioonid punktis 22, nii et negatiivse kontrolli (lahusti) lõppkontsentratsioon on 1 %, mis teadaolevalt ei mõjuta rakkude eluvõimelisust ja vastab sellele samale DMSO kontsentratsioonile, mida on kasutatud uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli proovides. DMSOs mitte lahustuva uuritava kemikaali korral, mille lahjendused tehti vees, peab DMSO sisaldus lõpplahuses kõigis kannudes olema kohandatud 1 %-ni, nagu muude uuritavate kemikaalide ja kontrollainete puhul. KeratinoSensTM testi puhul kasutatav positiivne kontroll on kaneelaldehüüd (CASi nr 14371-10-9, puhtus ≥ 98 %), millest on tehtud viie põhikontsentratsiooniga lahjenduste sari DMSOs, vahemikus 0,4–6,4 mM (6,4 mM põhilahusest), ja mis on lahjendatud katse põhikontsentratsioonideks, nagu on kirjeldatud punktis 22, nii et positiivse kontrolli lõppkontsentratsioonid on vahemikus 4–64 μM. Muid sobivaid positiivseid kontrolle, millega on eelistatavalt võimalik saavutada kontsentratsiooni EC1,5 keskvahemiku väärtusi, võib kasutada, kui on olemas varasematest katsetest saadud andmed, mille alusel saab tuletada katseseeria nõuetekohasuse kriteeriumid. Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete kasutamine Iga uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli aine kohta on vaja (positiivsuse või negatiivsuse) prognoosimiseks teha üks katse, mis koosneks vähemalt kahest sõltumatust korduskatsest, milles mõlemas oleks vähemalt kolm paralleelproovi (st n = 6). Kui sõltumatute korduskatsete vahel saadakse lahknevad tulemused, tuleb teha kolmas korduskatse, milles on kolm paralleelproovi (st n = 9). Iga sõltumatu korduskatse tehakse eri päeval, kasutades uuritava kemikaali värskeid põhilahuseid ning sõltumatult kogutud rakke. Rakud võivad olla siiski samast passaažist. Pärast punktis 20 kirjeldatud külvi kasvatatakse rakke 24 tundi 96-kannulistel mikrotiiterplaatidel. Sööde eemaldatakse ja asendatakse värske söötmega (KeratinoSensTM testi puhul 150 μl seerumiga söödet, milles ei ole antibiootikumi Geneticin), millele lisatakse 50 μl 25kordse lahjendusega uuritava kemikaali või kontrollainete lahust. Taustaväärtuste hindamiseks tuleb vähemalt üks kann mikrotiiterplaadi kohta jätta tühjaks (selles ei ole rakke ja seda ei töödelda kuidagi). Mikrotiiterplaate inkubeeritakse ligikaudu 48 tundi temperatuuril 37 ± 1 °C 5 % CO2 keskkonnas KeratinoSensTM testi puhul. Tuleb jälgida, et lenduvad uuritavad kemikaalid ei aurustuks ning vältida kannudevahelist uuritava kemikaaliga ristsaastumist, kattes näiteks enne uuritava kemikaaliga inkubeerimist plaadid fooliumiga. Lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmine Asjakohaste luminestsentsi näitude tagamiseks on kriitilise tähtsusega kolm tegurit: — tundliku luminomeetri valimine, — valgusega ristsaastumise vältimiseks piisavalt sügavate kannudega mikrotiiterplaatide kasutamine ja — piisava tundlikkuse ja väikese varieeruvuse tagamiseks piisavalt tugeva valgussignaaliga lutsiferaasi substraadi kasutamine. Enne katse tegemist tuleb teha 3. liites kirjeldatud kontrollkatse, et tagada nende kolme nõude täitmine. Pärast 48 tundi uuritava kemikaali ja kontrollainetega inkubeerimist KeratinoSensTM testis pestakse rakud fosfaatpuhvrit sisaldava keedusoolalahusega ja igasse kannu lisatakse 20 minutiks toatemperatuuril luminestsentsi määramiseks asjakohast rakkude lüüsimise puhvrit. Mikrotiiterplaadid rakulüsaadiga asetatakse seejärel näitude lugemiseks luminomeetrisse, mis KeratinoSensTM testi jaoks on järgmise seadistusega: i) igasse kannu lutsiferaasi substraadi (st 50 μl) lisamine, ii) 1 sekund inkubeerimist ja iii) 2 sekundit lutsiferaasi aktiivsuse integreerimine. Juhul kui kasutatakse muid seadeid, näiteks kasutatava luminomeetri mudelist sõltuvaid, tuleb neid põhjendada. Peale selle võib kasutada ka helendavat substraati, eeldusel et 3. liites esitatud kontrollkatse on õnnestunud. Tsütotoksilisuse hindamine Rakkude eluvõimelisuse määramiseks KeratinoSensTM testis vahetatakse sööde pärast 48 tundi kestnud kokkupuuteaega värske söötmega, milles on ka MTT ([3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinise tetrasooliumbromiid; CASi nr 298-93-1) ja rakke inkubeeritakse 4 tundi temperatuuril 37° C 5 % CO2 keskkonnas. Seejärel eemaldatakse MTTd sisaldav sööde ning rakud lüüsitakse üleöö (nt lisatakse igasse kannu 10 % naatriumdodetsüülsulfaati (SDS)). Pärast loksutamist mõõdetakse fotomeetriga neelduvust lainepikkusel 600 nm. ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE Andmete hindamine KeratinoSensTM testis arvutatakse järgmised näitajad: — uuritud kemikaali ja positiivse kontrolli lutsiferaasi aktiivsuse maksimaalse induktsiooni keskmine väärtus kordades (Imax); — kontsentratsiooni EC1,5 väärtus, mis on kontsentratsioon, mille korral lutsiferaasi aktiivsuse saadud induktsioon on suurem kui läviväärtus 1,5 korda (st lutsiferaasi aktiivsus on suurenenud 50 %); ja — kontsentratsioonide IC50 ja IC30 väärtused, mille korral rakkude eluvõimelisus on vähenenud vastavalt 50 % ja 30 %. — Lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni arv kordades arvutatakse valemi 1 alusel ja üldine maksimaalne induktsiooni arv kordades ((Imax) arvutatakse kõigi korduste keskmisena. Valem 1: kus: Lproov on uuritava kemikaaliga kannu luminestsentsi näit Ltühikatse on tühja, ilma rakkude ja töötlemisaineteta, kannu luminestsentsi näit Llahusti on rakke ja lahusti (negatiivset) kontrolli sisaldavate kannude keskmine luminestsentsi näit EC1,5 arvutatakse lineaarse interpoleerimise abil võrrandi 2 järgi ja üldine EC1,5 arvutatakse üksikkorduste geomeetrilise keskmisena. Valem 2: kus: Ca on vähim kontsentratsioon μM-des, mille korral induktsioon on suurem kui 1,5 korda Cb on suurim kontsentratsioon μM-des, mille korral induktsioon on väiksem kui 1,5 korda Ia induktsiooni suurenemine kordades, mis on mõõdetud vähimal kontsentratsioonil, millel induktsioon on suurem kui 1,5 korda (paralleelproovi kolme kannu keskmine) Ib induktsiooni suurenemine kordades, mis on mõõdetud suurimal kontsentratsioonil, millel induktsioon on väiksem kui 1,5 korda (paralleelproovi kolme kannu keskmine) Rakkude eluvõimelisus arvutatakse võrrandi 3 järgi. Valem 3: kus: Vproov on uuritava kemikaaliga kannu MTT-absorptsiooni näit Vtühikatse on tühja, ilma rakkude ja töötlemisaineteta, kannu MTT-absorptsiooni näit Vlahusti on rakke ja lahusti (negatiivset) kontrolli sisaldavate kannude keskmine MTT-absorptsiooni näit IC50 ja IC30 arvutatakse lineaarse interpoleerimise abil võrrandi 4 järgi ning üldine IC50 ja üldine IC30 arvutatakse üksikkorduste geomeetriliste keskmistena. Valem 4: kus: X on rakkude eluvõimelisuse vähenemise % arvutataval kontsentratsioonil (50 ja 30 vastavalt IC50 ja IC30 korral) Ca on vähim kontsentratsioon μM-des, mille korral rakkude eluvõimelisuse vähenemine on > x % Cb on suurim kontsentratsioon μM-des, mille korral rakkude eluvõimelisuse vähenemine on < x % Va on rakkude eluvõimelisuse % vähimal kontsentratsioonil, mille korral eluvõimelisuse vähenemine on > x % Vb on rakkude eluvõimelisuse % suurimal kontsentratsioonil, mille korral rakkude eluvõimelisuse vähenemine on < x % Iga kontsentratsiooni kohta, mille korral esineb > 1,5kordne lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon, arvutatakse statistiline olulisus (nt kahesuunalise Studenti t-testiga), võrreldes kolme paralleelproovi luminestsentsi väärtusi lahusti (negatiivse) kontrolliga kannudes, et määrata, kas lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon on statistiliselt oluline (p < 0.05). Vähim kontsentratsioon, millel lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon on suurem kui 1,5 korda, on väärtus, mis määrab EC1,5 väärtuse. Igal juhul kontrollitakse, kas see väärtus on väiksem IC30 väärtusest, millest nähtub, et EC1,5 määraval kontsentratsioonil on rakkude eluvõimelisuse vähenemine väiksem kui 30 %. Andmeid soovitatakse kontrollida graafikute abil. Kui selget annuse-toime kõverat ei täheldata või kui saadakse kahefaasiline annuse-toime kõver (st ületab läviväärtust 1,5 kahes kohas), tuleb katset korrata, et kontrollida, kas see on uuritavale kemikaalile iseloomulik või on seotud katse veaga. Kui kahefaasiline reaktsioon on sõltumatus katses korratav, tuleb esitada EC1,5 väiksem väärtus (esimene kontsentratsioon, millel läviväärtus 1,5 ületatakse). Harvadel juhtudel, kui täheldatakse statistiliselt ebaolulist rohkem kui 1,5kordset induktsiooni, millele järgneb statistiliselt oluline induktsioon suuremal kontsentratsioonil, tuleb selle korduskatse tulemusi käsitada kehtiva ja positiivsena vaid juhul, kui 1,5kordset läviväärtust ületav induktsioon saadi mittetsütotoksilise kontsentratsiooniga. Uuritavate kemikaalide puhul, mis põhjustavad 1,5kordse või suurema induktsiooni juba kõige väiksemal kontsentratsioonil 0,98 μM, määratakse EC1,5 väärtus < 0,98 annuse-toime kõvera visuaalse kontrollimise alusel. Katse nõuetekohasuse kriteeriumid KeratinoSensTM testi kasutamisel tuleb täita järgmised katse nõuetekohasuse kriteeriumid. Esiteks peab positiivne kontroll, kaneelaldehüüd, vähemalt ühes katsekontsentratsioonis (4–64 μM) põhjustama statistiliselt olulise (nt t-testi põhjal) läviväärtust 1,5 ületava lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni. Teiseks peab EC1,5 väärtus olema katset tegeva labori varasemate katsete keskväärtuse suhtes vahemikus, mis jääb kahe standardhälbe piiridesse (nt valideerimise andmete põhjal 7–30 μM) ning seda vahemikku tuleb korrapäraselt ajakohastada. Lisaks peab kaneelaldehüüdi kontsentratsiooni 64 μM kolme paralleelproovi keskmine induktsioon jääma vahemikku 2–8. Kui viimane kriteerium ei ole täidetud, tuleb hoolikalt kontrollida kaneelaldehüüdi annuse-toime seost ning katse tulemused võib aktsepteerida ainult juhul, kui on olemas selge annuse-toime seos, mille alusel lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon suureneb positiivse kontrolli kontsentratsiooni suurenedes. Negatiivse kontrolli (lahusti) DMSO luminestsentsi näidu variatsioonikordaja peab olema alla 20 % igas korduses, mis koosneb 6 kannust testituna kolme paralleelproovina. Kui varieeruvus on suurem, tuleb tulemused lugeda kehtetuks. Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimudel KeratinoSensTM testi prognoosi käsitatakse positiivsena, kui kahel juhul kahest või sama korduse puhul kahel juhul kolmest on täidetud kõik järgmised neli tingimust, muidu loetakse KeratinoSensTM testi põhine prognoos negatiivseks (joonis 1): 1. Imax on suurem kui (>) 1,5 korda ning erineb statistiliselt oluliselt (määratuna kahesuunalise Studenti t-testiga) lahusti (negatiivsest) kontrollist; 2. rakkude eluvõimelisus on suurem kui (>) 70 % kõige väiksemal kontsentratsioonil, millel lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon on suurem kui 1,5 korda (st kontsentratsioonil, mis määrab EC1,5); 3. EC1,5 väärtus on väiksem kui (<) 1 000 μM (või < 200 μg/ml uuritavate kemikaalide puhul, millel puudub kindlaks määratud molekulmass); 4. jälgitav on lutsiferaasi induktsiooni üldine annuse-toime sõltuvus (või bifaasiline toime, nagu on selgitatud punktis 33). Kui konkreetses korduses on täidetud kolm esimest tingimust, kuid lutsiferaasi induktsiooni selget annuse-toime sõltuvust ei ole võimalik sedastada, tuleb selle korduse tulemused lugeda ebaselgeks ning võib vaja minna täiendavaid katseid (joonis 1). Lisaks tuleb ebaselgena käsitada negatiivset tulemust kontsentratsioonidel < 1 000 μM (või <200 μg/ml uuritavate kemikaalide puhul, millel puudub kindlaks määratud molekulmass) (vt punkt 11). Joonis 1 KeratinoSensTM testi prognoosimudel. KeratinoSensTM testi prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistikus ning kooskõlas punkti 9 ja 11 nõuetega Harvadel juhtudel võib uuritav kemikaal, mis tsütotoksilisele tasemele lähedasel kontsentratsioonil indutseerib lutsiferaasi aktiivsust, olla positiivne mõnes mittetsütotoksilise tasemega korduskatses (st EC1,5 määrav kontsentratsioon on väiksem kui (<) IC30) ning on muudes korduskatsetes positiivne ainult tsütotoksilisel tasemel (st EC1,5 määrav kontsentratsioon on suurem kui (>) IC30). Sellise uuritava kemikaaliga tuleb teha uus katseseeria kitsama annuse-toime analüüsiga, kasutades väiksemat lahjendustegurit (nt 1,33 või Ö2 (= 1,41) kordset kannudevahelist lahjendust), et teha kindlaks, kas induktsioon esines tsütotoksilisel tasemel või mitte (9). Katseprotokoll Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet. Uuritav kemikaal — Ühe koostisosaga aine — Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid; — füüsiline välimus, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses; — puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne; — uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — uuritud kontsentratsioon(id); — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; — Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud: — kirjeldatakse nii palju kui võimalik, lähtudes koostisosade keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), puhtusest, kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest; — füüsiline välimus, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses; — molekulmass või näiline molekulmass teadaoleva koostisega segude/polümeeride korral või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave; — uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — uuritud kontsentratsioon(id); — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; Kontrollid — Positiivne kontroll — Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid; — füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses ja kui see on asjakohane; — puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne; — kontrollkemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — uuritud kontsentratsioon(id); — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; — viide varasematele positiivse kontrolli tulemustele, mis tõendavad sobivaid analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriume, kui asjakohane. — Negatiivne (vehiikuli) kontroll — kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid ja/või muud identifikaatorid; — puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne; — füüsiline välimus, molekulmass ja muud füüsikalis-keemilised omadused, nii palju kui võimalik, juhul, kui kasutatakse muid negatiivseid kontrolle / vehiikuleid kui need, mida on käesolevas katsemeetodis nimetatud, kättesaadavas ulatuses; — säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses; — iga uuritava kemikaali puhul lahusti valimise põhjendus. Katsemeetodi tingimused — sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress; — kasutatud katsemeetodi kirjeldus; — kasutatud rakuliin, selle säilitamistingimused ning allikas (nt asutus, kellelt rakud saadi); — katsetes kasutatud rakkude passaažide arv ning konfluentsuse tase; — enne testimist rakkude külvamiseks kasutatud rakuloendusmeetod ning võetud meetmed, millega tagati rakkude arvu homogeenne jaotus (vt punkt 20); — kasutatud luminomeeter (nt mudel), sealhulgas seadme seadistused, kasutatud lutsiferaasi substraat ja asjakohaste luminestsentsi mõõtmiste tõendus, mis põhineb 3. liites kirjeldatud kontrollkatsel; — labori kasutatud meetod, millega tõendatakse katsemeetodi tegemise pädevust (nt pädevuse kontrolli ainetega katsetamine) või meetod, millega tõendatakse katsemeetodi korratavat toimivust ajas. Katse käik — Kordus- ja paralleelproovide arv; — uuritava kemikaali kontsentratsioonid, kasutamise kord ning kasutatud kokkupuuteaeg (kui erineb soovitatust); — kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus; — kasutatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kirjeldus; — kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus. Tulemused — Iga korduskatse kohta esitatakse tabelina uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli korral saadud Imax, EC1,5 ja rakkude eluvõimelisuse tulemused (st IC50, IC30), nagu ka keskväärtused (Imax: keskmine; EC1,5 ja rakkude eluvõimelisuse väärtused: geomeetriline keskmine) ning SD, mis on arvutatud kõigi konkreetsete korduskatsete andmetest, ja prognoosimudelil põhinev uuritava kemikaali kohta antud hinnangu põhjendus; — iga katse negatiivse kontrolli luminestsentsi näitudega saadud variatsioonikordaja; — graafik, millel on lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni ja rakkude eluvõimelisuse annuse-toime seose kõverad; — mis tahes muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus, kui kohaldatav. Tulemuste arutelu — KeratinoSensTM testiga saadud tulemuste arutelu; — katsemeetodiga saadud tulemuste arvesse võtmine ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui muu asjakohane teave on kättesaadav. Järeldus KIRJANDUS (1) United Nations (UN) (2013), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Kättesaadav aadressil: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html. (2) OECD (2012), „The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence“, OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris. (3) Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011), „Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010“, Archives of Toxicology 85, 367–485. (4) Käesoleva lisa peatükk B.42, „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse“. (5) Käesoleva lisa peatükk B.6, „Naha sensibiliseerimine“. (6) Käesoleva lisa peatükk B.50: „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: DA“. (7) Käesoleva lisa peatükk B.51, „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: BrdU-ELISA“. (8) Natsch A. (2010), „The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers“, Toxicological Sciences 113, 284–292. (9) Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010), „Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro“, Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281–290. (10) Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005), „The role of Keap1 in cellular protective responses“, Chem. Res. Toxicol., 18, 1779–1791. (11) Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013), „The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer“, Redox Biol. 1(1), 45–49. (12) Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011), „The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories“. Toxicol. in Vitro 25, 733–744. (13) Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013), „A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation“, Journal of Applied Toxicology 33, 1337–1352. (14) EC EURL-ECVAM (2014), „Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing“, 42 pp. Kättesaadav aadressil: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation. (15) DB-ALM (INVITTOX) (2013), „Protocol 155: KeratinoSensTM.“, 17 pp. Kättesaadav aadressil: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index (16) Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009), „Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing“, Toxicol. Sci. 107, 106–121. (17) Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011), „Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach“, Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389–400. (18) Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012), „Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential“, Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489–504. (19) Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013), „Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice“, J Appl Toxicol. 33, 1353–1364. (20) Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013), „The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study“, Toxicology in Vitro 27, 1220–1225. (21) Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013), „Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro“, Arch. Toxicol. 87, 1683–1969. (22) Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010), „Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology“, Chemistry and Biology 17, 646–657. (23) OECD (2012), „BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists“, OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457, OECD, Paris. (24) ECETOC (2003), „Contact sensitization: Classification according to potency“, European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals, (Technical Report No. 87). (25) Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006), „Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing“, J. Invest. Assoc., 126, 1813–1822. (26) Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004), „Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen“, Toxicol. Lett. 150, 301–316. (27) Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013), „Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events“, Toxicol. in Vitro 27, 2225–2232. (28) OECD (2015), „Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods“, OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.213, OECD, Paris. (29) OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23, OECD, Paris, France. (30) NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf 1. liide MÕISTED Aine – keemilised elemendid ja nende ühendid, kas looduslikud või tootmisprotsessiga saadud, välja arvatud lahusti, mida on võimalik eraldada aine stabiilsust mõjutamata ja selle koostist muutmata (1). ARE – ehk antioksüdatiivse reaktsiooni element (kasutatakse ka lühendit EpRE (electrophile response element, elektrofiilse reaktsiooni element) on reaktsioonielement, mis esineb mitme tsütoprotektiivse ja II faasi geeni promootori ülesvoolujärjestuse piirkonnas. Kui seda aktiveerib Nrf2, vahendab ARE nende geenide transkriptsiooni signaali. Asjakohasus – huvipakkuva toime ja katse vahelise seose kirjeldus, millest nähtub, kas see seos on tähenduslik ning kasulik konkreetse eesmärgi puhul. See on ulatus, mille piires saab katsemeetodiga õigesti mõõta või prognoosida huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasusega seoses võetakse arvesse ka katsemeetodi täpsust (kordustäpsust) (29). EC1,5 – interpoleeritud kontsentratsioon, millele vastab 1,5kordne lutsiferaasi induktsioon. IC30 – kontsentratsioon, mis põhjustab rakkude eluvõimelisuse 30 % vähenemise. IC50 – kontsentratsioon, mis põhjustab rakkude eluvõimelisuse 50 % vähenemise. Imax – lutsiferaasi aktiivsuse maksimaalne induktsioonitegur, võrreldes lahusti (negatiivse) kontrolliga ja mõõdetuna ükskõik millisel uuritava kemikaali kontsentratsioonil. Kahjuliku toime rada (Adverse Outcome Pathway, AOP) – sündmuste ahel alates sihtkemikaali või sarnaste kemikaalide rühma keemilisest struktuurist molekulaarse initsieerimisetapi kaudu vaadeldava toime kliinilise avaldumiseni in vivo (2). Katsete tegemist ja hindamist käsitlev ühtne lähenemisviis (Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA; lühendatult „ühtne lähenemisviis“) – struktureeritud lähenemisviis, mida kasutatakse kemikaali või kemikaalide rühma ohutegurite tuvastamiseks (võimalikkus), selle kirjeldamiseks (toime tugevus) ja/või ohutuse hindamiseks (võimalikkus / toime tugevus ja kokkupuude) ja millega ühendatakse strateegiliselt ning analüüsitakse kõik asjakohased andmed, et oleks olemas vajalik teave regulatiivse meetme võtmiseks seoses võimaliku ohu ja/või riskiga ja/või täiendavaks sihipäraseks (ja seega minimaalseks) katsetamiseks. Keap1 – Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) on sensorvalk, mis reguleerib Nrf2 aktiivsust. Induktsiooni puudumisel on sensorvalgu Keap1 sihtmärk transkriptsioonifaktor Nrf2; sensorvalk põhjustab selle ubikvitinüleerimise ja proteolüütilise lõhustamise proteasoomis. Kui väiksed molekulid seovad end kovalentselt sensorvalgu Keap1 reaktsioonivõimeliste tsüsteiinijääkidega, võib see põhjustada Nrf2 dissotsieerumist sensorvalgust Keap1 (8) (10) (11). Kemikaal – aine või segu. Korratavus – sama kemikaali sama metoodikaga uurimisel saadud tulemuste kokkulangevus (vt usaldusväärsus) (29). Lahusti/vehiikuli kontroll – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente peale uuritava kemikaali ning millele on lisatud kasutatav lahusti. Seda kasutatakse, et määrata lähtetaseme reaktsioon samas lahustis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovides. Mitme koostisosaga aine – aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on rohkem kui üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vahemikus 10 %–80 % (massiprotsent). Mitme koostisosaga aine saadakse tootmisprotsessi käigus. Erinevus segu ja mitme koostisosaga aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitme koostisosaga aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel. Nrf2 – Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) on transkriptsioonifaktor, mis on seotud antioksüdatiivse reaktsiooni rajaga. Kui Nrf2 ei ubikvitinüleerita, siis tema kogus tsütoplasmas suureneb ning ta translotseerub tuuma, kus seondub paljude tsütoprotektiivsete geenide promootori ülesvoolujärjestuse piirkonnas asuva sensorvalguga ARE ja käivitab sellega nende transkriptsiooni (8, 10, 11). Ohtlikkus – mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, mis võib põhjustada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (alam-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub. Positiivne kontroll – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse ainega, mis teadaolevalt kutsub esile positiivse reaktsiooni. Selleks et oleks võimalik hinnata positiivse kemikaali tekitatud reaktsiooni muutumist ajas, ei tohi positiivne reaktsioon olla liiga tugev. Segu – ainete segu või lahus, mis koosneb kahest või enamast ainest, mis omavahel ei reageeri (1). Spetsiifilisus – kõikide negatiivsete / inaktiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (29). Tundlikkus – kõikide positiivsete / reaktsioonivõimeliste kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (29). Täpsus – näitab katsemeetodi tulemuste lähedust kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega (mõõtetäpsus). Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses, mis näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (29). Usaldusväärsus – katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama metoodikaga. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega (29). Uuritav kemikaal – terminit „uuritav kemikaal“ kasutatakse katsealuse kemikaali kohta. UVCB – tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid. Valiidne katsemeetod – katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul käsitatakse piisavana ning mis põhineb teaduslikult tõendatud põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi valiidne absoluutses tähenduses, vaid ainult seoses määratud eesmärgiga (29). Variatsioonikordaja – hajuvuse mõõt, mis arvutatakse paralleelandmete rühma kohta; selleks jagatakse standardhälve keskväärtusega. Seda saab väljendada protsentides, kui korrutada tulemus sajaga. Ühe koostisosaga aine – aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vähemalt 80 % (massiprotsent). Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (United Nations Globally Harmonized System, UN GHS)) – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ained ja segud) klassifitseerimine füüsikaliste ohutegurite ning tervise- ja keskkonnaohu standarditud tüübi ja -taseme alusel ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, mille eesmärk on edastada teavet kemikaalide kahjulikest toimetest, et