KOMISJONI RAKENDUSOTSUS (EL) 2016/1840,

14. oktoober 2016,

millega muudetakse nõukogu direktiivi 2009/156/EÜ IV lisa hobuste Aafrika katku diagnostikameetodite osas

(teatavaks tehtud numbri C(2016) 6509 all)

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Liidu toimimise lepingut,

võttes arvesse nõukogu 30. novembri 2009. aasta direktiivi 2009/156/EÜ hobuslaste liikumist ja kolmandatest riikidest importimist reguleerivate loomatervishoiunõuete kohta, (1) eriti selle artiklit 20,

ning arvestades järgmist:

Alates direktiivi 2009/156/EÜ vastuvõtmisest on suurenenud laborite suutlikkus teostada kõrget oskustaset nõudvaid, väga tundlikke ja tõhusaid teste hobuste Aafrika katku diagnoosimiseks. Samaaegselt on sellise arengu kajastamiseks muudetud ka Maailma Loomatervise Organisatsiooni (OIE) maismaaloomade diagnostiliste testide ja vaktsiinide käsiraamatu peatükki, mis on seotud hobuste Aafrika katku diagnoosimisega (2) .

Osana oma 2014. aasta tööprogrammist koostas Euroopa Liidu hobuste Aafrika katku referentlabor (3) aruande direktiivi 2009/156/EÜ IV lisas kirjeldatud diagnostikameetodite tehnilise hindamise kohta. Komisjonile 2015. aasta mais esitatud hinnangus tõdeti, et konkurentsivõimelist ensüüm-immunosorptsioonanalüüsi ELISA testi ei ole enam võimalik saada, kaudset ELISA testi üldiselt enam ei kasutata, kuid selle võib kätte saada 4–6 kuud pärast tellimist, ja blokeeriv ELISA test on turul kättesaadav ning seda kasutatakse harilikult Euroopa Liidu hobuste Aafrika katku referentlabori poolt läbiviidavate pädevuskontrollide käigus proovide analüüsimiseks.

Lisaks juhitakse aruandes tähelepanu sellele, et nukleiinhappe tuvastamisel pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) meetoditel on eeliseid seroloogiliste diagnostikameetodite ees, sest nad võimaldavad avastada haiguse nakatumise varajases staadiumis. Enamik Euroopa Liidu liikmesriikide riiklikest referentlaboritest kasutab reaalaja RT-PCR meetodeid muu hulgas ka hobuste Aafrika katku diagnoosimiseks ning need meetodid on tõestanud oma sobivust aastatel 2009–2014 tehtud iga-aastaste pädevuskontrollide puhul. Aruandes märgitakse ka, et väljaspool liitu on mitmeid hobuste Aafrika katku alaste eriteadmistega OIE referentlaboreid ja teisi laboreid, kes on hobuste Aafrika katku genoomi avastamiseks rakendanud vähemalt üht reaalaja RT-PCR meetodit.

Kuigi kõik kättesaadavad RT-PCR meetodid hobuste Aafrika katku genoomi avastamiseks on piisavalt tundlikud, kasutavad laborid kõige rohkem Agüero et al. (2008) (4) poolt kirjeldatud menetlust. Guthrie et al. (2013) (5) kirjeldatud meetod loodi konkreetselt selleks, et oleks tagatud hobuste Aafrika katku riskiga aladelt pärit hobuste ohutu transport pärast OIE maismaaloomade tervise koodeksis (6) nõutud minimaalset karantiiniperioodi.

Seepärast tuleks direktiivi 2009/156/EÜ IV lisa muuta, jättes sellest välja konkurentsivõimelise ELISA testi ja ajakohastades kaudse ja blokeeriva ELISA testi menetlusi kooskõlas OIE maismaaloomade diagnostiliste testide ja vaktsiinide käsiraamatu (2016. aasta väljaanne, mis põhineb OIE delegaatide ülemaailmsel assambleel 2012. aasta maikuus vastuvõetud versioonil) peatükiga 2.5.1 (7) . Samal ajal tuleks kõnealusesse lisasse lisada Agüero et al. (2008) ning ka Guthrie et al. (2013) poolt kirjeldatud reaalaja RT-PCR menetlused, et teha need haigusetekitaja tuvastamise testid loomade liikumiseelse testimise eesmärgil kättesaadavaks.

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA OTSUSE:

Artikkel 1

Direktiivi 2009/156/EÜ IV lisa asendatakse käesoleva otsuse lisas esitatud tekstiga.

Artikkel 2

Käesolev otsus on adresseeritud liikmesriikidele.

(1) ELT L 192, 23.7.2010, lk 1.

(2) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf

(3) Nõukogu 29. aprilli 1992. aasta direktiiv 92/35/EMÜ, milles sätestatakse hobuste Aafrika katku kontrollieeskirjad ja tõrjemeetmed (EÜT L 157, 10.6.1992, lk 19).

(4) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.

(5) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–35

(6) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf

(7) Vt joonealune märkus 2.

LISA

„IV LISA HOBUSTE AAFRIKA KATK DIAGNOSTIKA A OSA Seroloogilised testid Allpool kirjeldatud seroloogilised meetodid on OIE delegaatide ülemaailmsel assambleel 2012. aasta maikuus vastu võetud OIE maismaaloomade diagnostiliste testide ja vaktsiinide käsiraamatu 2016. aasta väljaande peatüki 2.5.1 B jao punktil 2 põhinevad ensüümimmuunsorptsioonanalüüsi (ELISA) meetodid. Viirusevalk VP7 on hobuste Aafrika katku viiruse (HAKV) peamine immunodominantne antigeen, mis on HAKV üheksa serotüübi lõikes konserveerunud. Rekombinantsed HAKV-VP7-valgud on osutunud stabiilseteks ja kahjututeks ning sobivad kasutamiseks antigeenidena HAKV vastaste antikehade tuvastamiseks tehtavate väga tundlike ja spetsiifiliste ELISAde puhul (Laviada et al., 1992b; (1) Maree ja Paweska, 2005). Kaks hobuste Aafrika katku seroloogiliseks diagnoosimiseks sobivat HAKV-VP7 testi on kaudne ELISA ja blokeerimisel põhinev ELISA. 1. Kaudne ELISA hobuste Aafrika katku viiruse (HAKV) vastaste antikehade tuvastamiseks Käesoleva meetodi puhul kasutatakse konjugaadina hobuse, muula ja eesli seerumiga reageerivat hobuse gammaglobuliini vastast mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud antikeha. Maree ja Paweska (2005) (2) kirjeldatud meetodi puhul kasutatakse konjugaadina proteiini G, mis reageerib ka sebra seerumiga. Antigeeni on võimalik saada Hispaaniast asutusest Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) 4–6 kuu jooksul pärast tellimist. 1.1. Katse käik 1.1.1. Tahke faas 1.1.1.1. ELISA plaadid kaetakse rekombinantse HAKV-4 VP7-ga, mis on lahjendatud karbonaadi/vesinikkarbonaadi puhverlahuses, mille pH on 9,6. Plaate inkubeeritakse öö läbi 4 °C juures. 1.1.1.2. Plaate pestakse viis korda destilleeritud veega, mis sisaldab 0,01 mahuprotsenti Tween 20 (pesulahus). Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit. 1.1.1.3. Plaatide blokeerimiseks lisatakse igasse kannu 200 μl fosfaadiga puhverdatud soolalahust (PBS), mille pH on 7,2 ja millele on lisatud 5 massiprotsenti lõssipulbrit (Nestlé Dry Skim MilkTM) ruumalaühiku kohta, ning plaate hoitakse 1 tund 37 °C juures. 1.1.1.4. Blokeeriv lahus eemaldatakse ja plaate koputatakse ettevaatlikult vastu absorbeerivat materjali. 1.1.2. Uuritavad proovid 1.1.2.1. Uuritavad seerumiproovid ning positiivsed ja negatiivsed kontrollseerumid lahjendatakse vahekorras 1:25 PBS-s, millele on lisatud 5 massiprotsenti lõssipulbrit ruumalaühiku kohta ja 0,05 mahuprotsenti Tween 20; igasse kannu kantakse 100 μl lahust. Inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures. Tiitrimiseks tehakse kahekordsete lahjenduste rida alates lahjendusastmest 1:25 (100 μl kannu kohta), plaadi iga veeru kohta üks seerum, ja sama tehakse positiivse ja negatiivse kontrollseerumiga. Inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures. 1.1.2.2. Plaate pestakse viis korda destilleeritud veega, mis sisaldab 0,01 mahuprotsenti Tween 20 (pesulahus). Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit. 1.1.3. Konjugaat 1.1.3.1. Igasse kannu kantakse 100 μl mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud hobuse gammaglobuliini vastast antikeha, mis on lahjendatud PBS-s, millele on lisatud 5 % lõssipulbrit ja 0,05 % Tween 20 ning mille pH on 7,2. Inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures. 1.1.3.2. Plaate pestakse viis korda destilleeritud veega, mis sisaldab 0,01 mahuprotsenti Tween 20 (pesulahus). Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit. 1.1.4. Kromogeen/substraat 1.1.4.1. Igasse kannu lisatakse 200 μl kromogeeni/substraadi lahust (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetüülaminobensaldehüüd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metüül-2-bensotiasoliinhüdrasoonvesinikkloriid) + 5 μl H2O2). Värvusreaktsioon peatatakse umbes 5–10 minuti pärast (enne kui negatiivne kontrollproov hakkab värvuma) 50 μl 3 N H2SO4 lisamisega. Võib kasutada ka teisi kromogeene, näiteks ABTS-i (2,2′-asino-bis-[3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape]), TMB-d (tetrametüülbensidiin) või OPD-d (ortofenüüldiamiin). 1.1.4.2. Plaatide näitusid loetakse 600 nm (või 620 nm) juures. 1.2. Tulemuste tõlgendamine 1.2.1. Arvutatakse läviväärtus; selleks liidetakse negatiivse kontrollproovi väärtusele 0,06 (0,06 on standardhälve 30 negatiivsest seerumist koosnevas rühmas). 1.2.2. Uuritavad proovid, mille absorptsiooniväärtused on allpool läviväärtust, loetakse negatiivseks. 1.2.3. Uuritavad proovid, mille absorptsiooniväärtused on suuremad kui läviväärtus + 0,15, loetakse positiivseks. 1.2.4. Uuritavate proovide puhul, mille absorptsiooniväärtused jäävad nimetatud kahe väärtuse vahele, loetakse tulemus ebaselgeks ja selle kinnitamiseks tuleb rakendada teist meetodit. 2. Blokeerimisel põhinev ELISA hobuste Aafrika katku viiruse (HAKV) vastaste antikehade tuvastamiseks Konkurentsist lähtuval blokeerimisel põhinev ELISA on ette nähtud spetsiifiliste HAKV vastaste antikehade tuvastamiseks kõikide hobuslaste, st hobuste, eeslite, sebrade ja nende ristandite seerumis ning võimaldab ära hoida kaudse ELISA kasutamisel kohati esile kerkivat vähese spetsiifilisuse probleemi. See meetod põhineb ELISA plaadile absorbeerunud rekombinantse VP7 ja HAKV-VP7 vastase spetsiifilise konjugeeritud monoklonaalse antikeha vahelise reaktsiooni blokeerimisel. Uuritavas seerumis sisalduvad antikehad pärsivad antigeeni ja monoklonaalse antikeha vahelist reaktsiooni, mille tulemusena tekib vähem värvainet. Kuna kõnealuse monoklonaalse antikeha sihtmärk on VP7, on see meetod väga tundlik ja spetsiifiline. Konkurentsist lähtuval blokeerimisel põhinev ELISA komplekt on turul kättesaadav. 2.1. Katse käik 2.1.1. Tahke faas 2.1.1.1. ELISA plaadid kaetakse 50–100 ng rekombinantse HAKV-4 VP7-ga, mis on lahjendatud karbonaadi/vesinikkarbonaadi puhverlahuses, mille pH on 9,6. Plaate inkubeeritakse öö läbi 4 °C juures. 2.1.1.2. Plaate pestakse kolm korda fosfaadiga puhverdatud, 10 korda lahjendatud soolalahusega (PBS), mis sisaldab 0,135 M NaCl ja 0,05 mahuprotsenti Tween 20 (PBST). Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit. 2.1.2. Uuritavad proovid ja kontrollid 2.1.2.1. Uuritavad seerumiproovid ning positiivsed ja negatiivsed kontrollseerumid lahjendatakse vahekorras 1:5 lahjendusvedelikus, mille koostis on järgmine: 0,35 M NaCl, 0,05 mahuprotsenti Tween 20 ja 0,1 % säilitusainet Kathon; igasse kannu kantakse 100 μl lahust. Inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures. Tiitrimiseks tehakse uuritavatest seerumitest kaheksasse kannu kahekordsete lahjenduste rida, mis hõlmab lahjendusastmeid 1:10 kuni 1:280 (100 μl kannu kohta), plaadi iga veeru kohta üks seerum, ja sama tehakse positiivse ja negatiivse kontrollseerumiga. Inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures. 2.1.2.2. Plaate pestakse viis korda fosfaadiga puhverdatud, 10 korda lahjendatud soolalahusega (PBS), mis sisaldab 0,135 M NaCl ja 0,05 mahuprotsenti Tween 20 (PBST). Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit. 2.1.3. Konjugaat 2.1.3.1. Igasse kannu viiakse 100 μl mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud VP7-vastast monoklonaalset antikeha, mis on eelnevalt lahjendatud vahekorras 1:5 000 kuni 1:15 000 stabiliseeriva aine StabiliZyme Select® (SurModics, tootekood SZ03) ja destilleeritud vee 1:1 lahuses. Inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures. 2.1.3.2. Plaate pestakse viis korda fosfaadiga puhverdatud, 10 korda lahjendatud soolalahusega (PBS), mis sisaldab 0,135 M NaCl ja 0,05 mahuprotsenti Tween 20 (PBST). Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit. 2.1.4. Kromogeen/substraat Igasse kannu lisatakse 100 μl kromogeeni/substraadi lahust, st 1 ml ABTSi (2,2′-asino-bis-[3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape]) lahust kontsentratsiooniga 5 mg/ml + 9 ml substraadi puhverlahust (0,1 M fosfaadi-tsitraadi puhverlahus, pH 4, mis sisaldab 0,03 % H2O2) ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril. Värvusreaktsiooni peatamiseks lisatakse igasse kannu 100 μl lahust, mis sisaldab 2 massiprotsenti naatriumdodetsüülsulfaati (SDS) ruumalaühiku kohta. 2.1.5. Lugemine Näitusid loetakse 405 nm juures ELISA plaadilugeja abil. 2.2. Tulemuste tõlgendamine 2.2.1. Blokeerimise protsentuaalse määra (BP) leidmiseks igas proovis kasutatakse järgmist valemit, kus „AKd“ tähistab antikehasid: 2.2.2. Proovid, mille BP väärtus on üle 50 %, tuleks lugeda HAKV vastaste antikehade suhtes positiivseks. 2.2.3. Proovid, mille BP väärtus on alla 45 %, tuleks lugeda HAKV vastaste antikehade suhtes negatiivseks. 2.2.4. Proovide puhul, mille BP väärtus jääb vahemikku 45–50 %, tuleks lugeda tulemus ebaselgeks ja proove tuleks uuesti analüüsida. Kui tulemus on jälle ebaselge, tuleks loomadelt kõige varem kaks nädalat pärast ebaselge tulemuse andnud proovi võtmist võtta uus proov ja seda analüüsida. B OSA Haigusetekitaja kindlakstegemine Pöördtranskriptsiooniga reaalajas jälgitav polümeraasi ahelreaktsioon (rRT-PCR) Nukleiinhapetega seotud meetoditel põhinevad haigusetekitaja kindlakstegemise testid peavad võimaldama tuvastada HAKV üheksa serotüübi võrdlustüved. Punktis 2.1 kirjeldatud meetod põhineb OIE delegaatide ülemaailmsel assambleel 2012. aasta maikuus vastu võetud OIE maismaaloomade diagnostiliste testide ja vaktsiinide käsiraamatu 2016. aasta väljaande peatüki 2.5.1 B jao punktil 1.2. Vere- või põrnaproovide testimiseks kasutatav mis tahes RT-PCRi meetod peab direktiivi 2009/156/EÜ kohaldamisel olema sama tundlik või tundlikum kui punktis 2 kirjeldatud meetodid. Serotüüpide 1–9 võrdlustüvede inaktiveeritud viirused on kättesaadavad hobuste Aafrika katku Euroopa Liidu referentlaborist või Hispaanias Algetes asuvast OIE hobuste Aafrika katku referentlaborist. 1. Viiruse RNA eraldamine Tõhusa reaktsiooni tagamiseks on vaja proovist eraldada kvaliteetne HAKV RNA. Nukleiinhappeid saab kliinilistest proovidest eraldada mitmesuguste kohapeal välja töötatud või turul kättesaadavate meetodite abil. Müügil olevate komplektide puhul kasutatakse erinevaid RNA eraldamise viise. Enamik neist põhineb ühel järgmistest meetoditest: — nukleiinhapete eraldamine fenooli ja kloroformi abil; — nukleiinhapete filtrile adsorbeerimise süsteem; — nukleiinhapete magnetkerakestele adsorbeerimise süsteem. Allpool on esitatud üks kohapeal välja töötatud RNA eraldamise meetod. 1.1. 1 g koeproovi homogeniseeritakse 1 ml denatureerimislahuses (4 M guanidiintiotsüanaat, 25 mM naatriumtsitraat, 0,1 M 2-merkaptoetanool, 0,5 % sarkosüüli). 1.2. Pärast tsentrifuugimist lisatakse supernatandile 1 μg pärmi RNA-d, 0,1 ml 2 M naatriumatsetaati (pH 4), 1 ml fenooli ning 0,2 ml kloroformi ja isoamüülalkoholi segu (49:1). 1.3. Suspensiooni loksutatakse tugevasti ja seda hoitakse jahutamiseks 15 minutit jääl. 1.4. Pärast tsentrifuugimist ekstraheeritakse veefaasis olev RNA fenooliga, sadestatakse etanooliga ja lahustatakse uuesti steriilses vees. 2. Reaalajas jälgitava RT-PCRi meetodid 2.1. Agüero et al. (2008) (3) kirjeldatud rühmaspetsiifiline reaalajas jälgitav RT-PCR Selle rühmaspetsiifilise reaalajas jälgitava RT-PCRi eesmärk on HAKV VP7 tuvastamine ja sellega on võimalik tuvastada kõiki teadaolevaid praegu esinevaid HAKV serotüüpe ja tüvesid. Osalevad Euroopa Liidu liikmesriikide referentlaborid on seda ajavahemikul 2009–2015 Euroopa Liidu referentlabori korraldatud iga-aastastes pädevuskontrollides kasutades saanud väga häid tulemusi. Samuti anti sellele protokollile 2015. aastal OIE referentlaborite võrgustiku raames korraldatud rahvusvahelises laboritevahelises võrdluskatses teiste seas väga kõrge hinnang. HAKV tuvastamiseks kasutatavad praimeri- ja sondijärjestused: — päripidine praimer: 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′ — äraspidine praimer: 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′ — sond MGB-TaqMan: 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′ 2.1.1. Praimeri lähtelahusest saadakse lahjendamise teel töölahus kontsentratsiooniga 8 μM (edaspidi „praimeri 8 μM töölahus“), sondi aga lahjendatakse nii, et saadakse 50 μM töölahus (edaspidi „sondi 50 μM töölahus“). Tuleks koostada katseplaadi skeem ja laadida see reaalajas jälgitava PCRi seadme tarkvarasse. Skeemi alusel lisatakse igasse kannu, mis sisaldab uuritavat RNA proovi või positiivset või negatiivset kontrollproovi, 2,5 μl kummagi praimeri 8 μM töölahust (praimerite lõppkontsentratsioon 20 μl RT-PCRi segus on 1 μM). Plaati hoitakse jää peal. 2.1.2. 2 μl eraldatud RNAd (uuritavad proovid ja positiivsed kontrollproovid) või 2 μl ribonukleaasivaba vett (negatiivsed kontrollproovid) segatakse päripidise ja äraspidise praimeriga. Segu denatureeritakse kuumutamisega 95 °C juures 5 minuti kestel ja viiakse seejärel jahutamiseks kiiresti vähemalt 5 minutiks jää peale. 2.1.3. Vastavalt tootja juhistele valmistatakse uuritavate proovide arvu jaoks piisav kogus üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi põhisegu. Igasse RNA proovi sisaldavasse kannu pannakse 0,1 μl sondi 50 μM töölahust (sondi lõppkontsentratsioon igas RNA proovi sisaldavas kannus on 0,25 μM). Igasse denatureeritud praimereid ja RNA-d sisaldavasse PCRi plaadi kannu pannakse 13 μl üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi põhisegu. 2.1.4. Plaat asetatakse reaalajas jälgitavat PCRi võimaldavasse termotsüklerisse, mis on programmeeritud töötama pöördtranskriptsiooni ja cDNA amplifitseerimise/fluorestsentssignaali tuvastamise režiimis. Amplifitseerimistingimustega nähakse ette algne 25 minuti pikkune pöördtranskriptsioonietapp 48 °C juures, millele järgneb inkubeerimine 10 minutit 95 °C juures („kuumstart“) ning 40 tsüklit, igas tsüklis 15 sekundit 95 °C juures, 35 sekundit 55 °C juures ja 30 sekundit 72 °C juures (või 40 tsüklit, igas tsüklis 2 sekundit 97 °C juures ja 30 sekundit 55 °C juures, kui kasutatakse kiireid reaktsioone võimaldavaid reaktiive ja termotsüklerit). Fluorestsentssignaali mõõdetakse 55 °C juures toimuva etapi lõpus. 2.1.5. Kui saadakse ebatüüpiline amplifikatsioonikõver, loetakse analüüs kehtetuks ja seda tuleb korrata. Proov loetakse positiivseks, kui proovi Ct-väärtus (selle tsükli järjekorranumber, mille juures reaktsioonis tekkinud fluorestsentssignaal ületab fluorestsentssignaali läviväärtuse) on 40 PCRi tsükli vältel Ct kindlaksmääratud läviväärtusest (35) väiksem või sellega võrdne (Ct ≤ 35). Tulemus loetakse ebaselgeks, kui proovi Ct-väärtus on 40 PCRi tsükli vältel Ct kindlaksmääratud läviväärtusest (35) suurem (Ct > 35). Proov loetakse negatiivseks, kui saadakse horisontaalne amplifikatsioonikõver, mis ei tõuse 40 PCRi tsükli jooksul signaali läviväärtusele vastavast sirgjoonest ülespoole. 2.2. Guthrie et al. (2013) (4) kirjeldatud rühmapetsiifiline reaalajas jälgitav RT-PCR Tegemist on reaalajas jälgitava RT-PCR-ga, mille puhul HAKV nukleiinhappe tuvastamiseks kasutatakse Försteri resonantsenergia ülekannet (FRET) võimaldavaid sonde. RT-PCR-l põhineva kirjeldatud HAKV testi väljatöötamiseks kasutati mitmesuguste praegu esinevate HAKV välitüvede järjestusi (Quan et al., 2010) (5). Testikomplekt hõlmab ka ühte omandiõigusega kaitstud sünteetilist välist kontrolli, mis võimaldab kontrollida komplekti koostisosade nõuetekohast toimimist. Üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi komplektid on turul kättesaadavad. Allpool on esitatud mõned Guthrie et al. (2013) kirjeldatud analüüsi põhietapid, mida võib muuta vastavalt kohalikele või konkreetsest juhtumist tulenevatele nõuetele, kasutatavale komplektile ja kättesaadavatele seadmetele. HAKV tuvastamiseks kasutatavad praimeri- ja sondijärjestused: — päripidine praimer: 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′ — äraspidine praimer: 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′ — sond MGB-TaqMan: 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′ 2.2.1. Praimerite ja sondi segu lähtelahus valmistatakse 25 korda kontsentreeritumana: päripidise ja äraspidise praimeri kontsentratsioon selles on 5 μΜ ning sondi kontsentratsioon 3 μΜ. Tuleks koostada katseplaadi skeem ja laadida see reaalajas jälgitava PCRi seadme tarkvarasse. Skeemi alusel lisatakse plaadi asjaomastesse kannudesse 5 μl uuritavat RNA proovi või positiivset või negatiivset kontrollproovi. 2.2.2. RNA denatureerimiseks kuumutatakse seda 5 minutit 95 °C juures ja seejärel viiakse proov jahutamiseks kiiresti vähemalt 3 minutiks jää peale. 2.2.3. Vastavalt tootja juhistele valmistatakse uuritavate proovide arvu jaoks piisav kogus üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi põhisegu, millesse on lisatud 1 μl praimerite ja sondi segu 25 korda kontsentreeritumat lähtelahust (kirjeldatud eespool punktis 2.2.1), nii et igas kannus on kummagi praimeri lõppkontsentratsioon 200 nM ja sondi lõppkontsentratsioon 120 nM. Igasse denatureeritud RNA-d sisaldavasse PCRi plaadi kannu pannakse 20 μl põhisegu. 2.2.4. Plaat asetatakse reaalajas jälgitavat PCRi võimaldavasse termotsüklerisse, mis on vastavalt tootja juhistele programmeeritud töötama pöördtranskriptsiooni ja cDNA amplifitseerimise/fluorestsentssignaali tuvastamise režiimis. Amplifitseerimistingimustega nähakse ette näiteks algne 10 minuti pikkune pöördtranskriptsioonietapp 48 °C juures, millele järgneb inkubeerimine 10 minutit 95 °C juures ning 40 tsüklit, igas tsüklis 15 sekundit 95 °C juures ja 45 sekundit 60 °C juures. 2.2.5. Proov loetakse positiivseks, kui HAKV tuvastamiseks tehtud RT-PCRi käigus saadud normaliseeritud fluorestsentssignaal ületab 36 PCRi tsükli jooksul proovi kõikides paralleelides läviväärtuse 0,1. Tulemus loetakse ebaselgeks, kui HAKV tuvastamiseks tehtud RT-PCRi käigus saadud normaliseeritud fluorestsentssignaal ületab proovi ükskõik millises paralleelis läviväärtuse 0,1 vahemikus 36 kuni 40 PCRi tsüklit. Proov loetakse negatiivseks, kui HAKV tuvastamiseks tehtud RT-PCRi käigus saadud normaliseeritud fluorestsentssignaal ei ületa 40 PCRi tsükli jooksul proovi üheski paralleelis läviväärtust 0,1 ning omandiõigusega kaitstud sünteetilise välise kontrolliga saadud normaliseeritud fluorestsentssignaal ületab 33 PCRi tsükli jooksul läviväärtuse 0,1.“

(1) Laviada, M. D., Roy, P., ja Sanchez-Vizcaino, J. M. (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. Väljaandes „Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium“. Toim. Walton, T. E., ja Osburn, B. I. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.

(2) Maree, S., ja Paweska, J. T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods 125 (1): 55–65.

(3) Agüero, M., Gomez-Tejedor, C., Angeles Cubillo, M., Rubio, C., Romero, E., ja Jimenez-Clavero, A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest. 20: 325–328.

(4) Guthrie, A. J., MacLachlan, N. J., Joone, C., Lourens, C. W., Weyer, C. T., Quan, M., Monyai, M. S., ja Gardner, I. A. (2013). Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 189 (1): 30–35.

(5) Quan, M., Lourens, C. W., MacLachlan, N. J., Gardner, I. A., ja Guthrie, A. J. (2010). Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167: 45–52.