Üheksas komisjoni direktiiv,

31. juuli 1981,

millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrollimiseks

(81/715/EMÜ)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi 70/373/EMÜ söötade ametlikuks kontrollimiseks ettenähtud ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta, [1] viimati muudetud Kreeka ühinemisaktiga, eriti selle artiklit 2,

ning arvestades, et:

kõnealuses direktiivis on ette nähtud, et söötade ametlik kontrollimine söötade kvaliteeti ja koostist reguleerivate õigusnormide nõuetele vastavuse kindlakstegemiseks peab toimuma ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetodite abil;

komisjoni direktiividega 71/250/EMÜ, [2] 71/393/EMÜ, [3] 72/199/EMÜ, [4] 73/46/EMÜ, [5] 74/203/EMÜ, [6] 75/84/EMÜ, [7] 76/372/EMÜ [8] ja 78/633/EMÜ, [9] viimati muudetud 30. juuli 1981. aasta direktiiviga, on juba sätestatud mitmed ühenduse analüüsimeetodid; võttes arvesse edusamme pärast kõnealuse direktiivi vastuvõtmist tehtud töös, on soovitatav võtta vastu üheksas rühm meetodeid;

käesolevas direktiivis ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Liikmesriigid sätestavad, et söötade ametliku kontrolli raames ettenähtud analüüsid avopartsiini ja monensiinnaatriumi sisalduse määramiseks tehakse käesoleva direktiivi lisas kirjeldatud meetodite kohaselt.

Artikkel 2

Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid 1. detsembril 1981 ning teatavad sellest viivitamata komisjonile.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 31. juuli 1981

Komisjoni nimel

president

Gaston Thorn

[1] EÜT L 170, 3.8.1970, lk 2.

[2] EÜT L 155, 12.7.1971, lk 13.

[3] EÜT L 279, 20.12.1971, lk 7.

[4] EÜT L 123, 29.5.1972, lk 6.

[5] EÜT L 83, 30.3.1973, lk 21.

[6] EÜT L 108, 22.4.1974, lk 7.

[7] EÜT L 32, 5.2.1975, lk 26.

[8] EÜT L 102, 15.4.1976, lk 8.

[9] EÜT L 206, 29.7.1978, lk 43.

--------------------------------------------------

LISA

1. AVOPARTSIINI MÄÄRAMINE AGARSÖÖTMEL DIFUSIOONI TEEL

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Käesolev meetod on avopartsiini määramiseks söötades ja eelsegudes. Alumine määramispiir on 2 mg/kg (2 miljondikku). Polüeeterantibiootikumide olemasolu võib määramist segada.

2. PÕHIMÕTE

Proov ekstraheeritakse atsetooni, vee ja soolhappe seguga. Ekstrakti antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse avopartsiini difusioon agarsöötmel, mis on nakatatud Bacillus subtilis'ega. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõtu käsitatakse otseselt võrdelisena antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud antibiootikumikontsentratsioonide vahemikus.

3. MIKROORGANISM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Söödet (4.1) sisaldavad längagariga katseklaasid nakatatakse Bacillus subtilis'ega ja inkubeeritakse järgmise päevani 30 °C juures. Kultuuri säilitatakse külmikus ligikaudu 4 °C juures. Nakatatakse uuesti iga kuu.

3.2. Spoorsuspensiooni valmistamine [1]

Hiljuti valmistatud längagarilt (3.1) kogutakse spoorid 2—3 ml steriilse vee abil. Selle suspensiooniga nakatatakse Roux' anumas 300 ml söödet (4.1) ning inkubeeritakse kolm kuni viis päeva 30 °C juures. Pärast sporulatsiooni kontrollimist mikroskoobi all kogutakse spoorid 15 ml-sse etanooli (4.2) ning segatakse hoolikalt. Suspensioon säilib vähemalt viis kuud 4 °C juures.

4. SÖÖTMED JA REAKTIIVID

4.1. Sööde [2]

Peptoon | 6,0 g |

Trüptoon | 4,0 g |

Pärmiekstrakt | 3,0 g |

Lihaekstrakt | 1,5 g |

Glükoos | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Vesi | 1000 ml |

pH 6,5 (pärast steriliseerimist). | |

4.2. 20protsendiline etanool: 200 ml etanooli lahjendatakse 800 ml veega.

4.3. Soolhape, tihedus: 1,18—1,19.

4.4. Naatriumhüdroksiidi lahus 2 M.

4.5. Fosfaatpuhverlahus, 0,1 M:

kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4, 13,6 g,

vett 1000 ml-ni,

pH reguleeritakse 4,5-le.

4.6. Atsetooni, vee ja soolhappe segu (4.3): mahuvahekorras 65/32,5/2,5.

4.7. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega avopartsiinsulfaat.

5. STANDARDLAHUSED

Ligikaudu 10 mg standardaine (4.7) täpne kaalutis lahustatakse fosfaatpuhvris (4.5) ja lahjendatakse sama puhvriga, kuni saadakse põhilahus, mis sisaldab 100 μg avopartsiini milliliitri kohta. See lahus säilib suletud kolvis 4 °C juures stabiilsena kuni seitse päeva.

5.1. Eelsegude puhul

Kõnealusest põhilahusest valmistatakse puhvriga (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:

S8 | 4,0 μg/ml |

S4 | 2,0 μg/ml |

S2 | 1,0 μg/ml |

S1 | 0,5 μg/ml |

5.2. Söötade puhul

Põhilahusest valmistatakse puhvriga (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:

S8 | 2,0 μg/ml |

S4 | 1,0 μg/ml |

S2 | 0,5 μg/ml |

S1 | 0,25 μg/ml |

6. EKSTRAKTI JA TESTLAHUSTE VALMISTAMINE

6.1. Eelsegud

10 mg täpsusega võetakse proovi kaalutis, mis sisaldab 10—100 mg avopartsiini. Kaalutis kantakse 100 ml mõõtekolbi koos 60 ml seguga (4.6) ja loksutatakse 15 minutit mehhaanilise loksutiga. Kontrollitakse pH väärtust ja reguleeritakse see vajaduse korral soolhappega 2-le. Täiendatakse seguga (4.6) kuni märgini ja segatakse hoolikalt. Osa lahust filtritakse läbi sobiva filterpaberi (nt Whatman nr 1), esimesed 5 ml filtraadist valatakse ära. Võetakse alikvoot ning reguleeritakse selle pH 4,5-le naatriumhüdroksiidi lahusega (4.4). Saadud lahust lahjendatakse puhvriga (4.5), kuni saadakse eeldatav avopartsiini kontsentratsioon 4 μg/ml (= U8).

Sellest lahusest valmistatakse lahused U4 (eeldatav sisaldus 2 μg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 1 μg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,5 μg/ml), lahjendades järjest (1 + 1) puhvriga (4.5).

6.2. Söödad

Võetakse 50 g proovi kaalutis ning loksutatakse seda koos 100 ml seguga (4.6) 30 minutit mehhaanilise loksuti abil. Ekstrakt selitatakse tsentrifuugides (kasutades suletud tsentrifuugiküvette), võetakse selitatud ekstrakti alikvoot (vt tabel allpool) ja naatriumhüdroksiidi lahusega (4.4) reguleeritakse pH 4,5-le. Saadud alikvooti lahjendatakse puhvriga (4.5), et saada U8 (vt tabel allpool).

Sellest lahusest valmistatakse lahused U4 (eeldatav sisaldus 1 μg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,5 μg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,25 μg/ml), lahjendades järjest (1 + 1) puhvriga (4.5).

Oletatav avopartsiinisisaldus (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

Proovi mass (grammides, ± 0, 1 g) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

Segu (4.6) ruumala (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Selitatud ekstrakti ruumala (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Lõplik ruumala (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

U8 eeldatav kontsentratsioon (μg/ml) | 2 | ligikaudu 2 | 2 | ligikaudu 2 | 2 | 2 |

7. ANALÜÜSI KÄIK

7.1. Analüüsi söötme nakatamine

Analüüsi sööde (4.1) nakatatakse spoorsuspensiooniga (3.2) 50—60 °C juures. Eelkatsete abil analüüsi söötmega (4.1) plaatidel määratakse kindlaks spoorsuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks avopartsiini eri kontsentratsioonide juures.

7.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel standardlahuse nelja kontsentratsiooni juures (S8, S4, S2 ja S1) ja testlahuse nelja kontsentratsiooni juures (U8, U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahuse kontsentratsiooni tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse oleks võimalik teha vähemalt kaheksa üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel asetsevat auku läbimõõduga 10—13 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.1), mis on nakatatud vastavalt punktile 7.1, nii et tekiks ligikaudu 2 mm paksune kiht (60 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda, tehakse sellesse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud test- ja standardlahuste kogused (0,10—0,15 ml augu kohta, sõltuvalt läbimõõdust). Iga kontsentratsiooni kasutatakse vähemalt neli korda, et iga määramisega oleks võimalik hinnata 32 inhibitsioonitsooni.

7.3. Inkubatsioon

Plaate inkubeeritakse 30 °C juures 16—18 tundi.

8. HINDAMINE

Inhibitsioonitsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni puhul leitakse keskmised väärtused poollogaritmilisel millimeetripaberil, kus oleks näha kontsentratsioonide logaritmi ja inhibitsioonitsoonide läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ekstrakti jaoks visandatakse "kõige sobivamad" jooned, näiteks nagu kirjeldatud allpool.

Standardlahuse madalaima taseme (SL) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SL =

10

Standardlahuse kõrgeima taseme (SH) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SH =

10

Samamoodi arvutatakse "kõige sobivamad" punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades S1, S2, S4 ja S8 eespool toodud valemis U1, U2, U4 ja U8 – ga.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse "kõige sobivam" joon. Samamoodi märgitakse UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti "kõige sobivam" joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni käsitada paralleelsetena, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine rohkem kui 10 % võrra oma keskmisest väärtusest.

Kui jooned ei ole paralleelsed, võib ära jätta kas U1 ja S1 või U8 ja S8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, mispuhul saadakse alternatiivsed "kõige sobivamad" jooned:

a ′ )SL =5S1+2S2 – S46 | alebo | 5S2+2S4 – S86 |

b ′ )SH =5S4+2S2– S16 | alebo | 5S8+2S4 – S26 |

ning samamoodi UL ja UH puhul. Sarnaselt eespool kirjeldatuga tuleb kontrollida alternatiivsete "kõige sobivamate" joonte paralleelsust. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni käsitatakse paralleelsetena, arvutatakse suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil:

Nelja kontsentratsiooni puhul:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

– S

8 × 0,602U4+ U8+ S4+ S8 – U1 – U2 – S1 – S2

Kolme kontsentratsiooni puhul:

log A =

U

+ U

+ U

− S

– S

– S

4 × 0,401U4+ S4 – U1 – S1

või

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401U8+ S8 – U2 – S2

Tegelik aktiivsus = oletatav aktiivsus × suhteline aktiivsus.

Kui suhteline aktiivsus jääb väljapoole vahemikku 0,5—2,0, korratakse katset, kohandades vastavalt vajadusele ekstrakti kontsentratsiooni või, kui see ei ole võimalik, standardlahuste kontsentratsiooni. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutud vahemikku, tuleb kõiki saadud tulemusi käsitada ligikaudsetena ning see tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni ei saa käsitada paralleelsetena, korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, tuleb määramine lugeda mitterahuldavaks.

9. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

- 2 mg/kg, kui avopartsiini sisaldus on 2—10 mg/kg,

- 20 % suurimast väärtusest, kui avopartsiini sisaldus on 10—25 mg/kg,

- 5 mg/kg, kui avopartsiini sisaldus on 25—50 mg/kg,

- 10 % suurimast väärtusest, kui avopartsiini sisaldus on üle 50 mg/kg.

2. MONENSIINNAATRIUMI MÄÄRAMINE AGARSÖÖTMEL DIFUSIOONI TEEL

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Käesolev meetod on monensiinnaatriumi määramiseks söötades ja eelsegudes. Alumine määramispiir on 10 mg/kg (10 miljondikku) [3].

2. PÕHIMÕTE

Proov ekstraheeritakse 90protsendilise metanooliga. Ekstrakti analüüsitakse vastavalt proovi monensiinnaatriumi sisaldusele. Antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse monensiinnaatriumi difusioon Bacillus subtilis'ega nakatatud agarsöötmel. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõtu käsitatakse otseselt võrdelisena antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud antibiootikumikontsentratsioonide vahemikus. Katsesüsteemi tundlikkus väheneb naatriumiioonide juuresolekul.

3. MIKROORGANISM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Söödet (4.1) sisaldavad längagariga katseklaasid nakatatakse Bacillus subtilis'ega ja inkubeeritakse järgmise päevani 30 °C juures. Kultuuri säilitatakse külmikus ligikaudu 4 °C juures. Nakatatakse uuesti igal kuul.

3.2. Spoorsuspensiooni valmistamine [4]

Hiljuti valmistatud längagarilt (3.1) kogutakse spoorid 2—3 ml steriilse vee abil. Selle suspensiooniga nakatatakse Roux' anumas 300 ml söödet (4.1) ning inkubeeritakse kolm kuni viis päeva 30 °C juures. Pärast sporulatsiooni kontrollimist mikroskoobi all kogutakse spoorid 15 ml-sse 20protsendilisse etanooli (4.3) ning segatakse hoolikalt. Suspensioon säilib vähemalt viis kuud 4 °C juures.

4. SÖÖTMED JA REAKTIIVID

4.1. Sööde [5]

Trüptoon | 10,0 g |

Pärmiekstrakt | 3,0 g |

Lihaekstrakt | 1,5 g |

Glükoos | 1,0 g |

Agar (sõltuvalt kvaliteedist) | 10,0—20,0 g |

Vesi | 1000 ml |

pH 6,5 (pärast steriliseerimist). | |

4.2. Analüüsi sööde

Glükoos | 10,0 g |

Pärmiekstrakt | 2,5 g |

Dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4 | 0,69 g |

Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4 | 0,45 g |

Agar (sõltuvalt kvaliteedist) | 10,0—20,0 g |

Vesi | 1000 ml |

pH 6 (pärast steriliseerimist). | |

4.3. 20 protsendiline etanool: 200 ml etanooli lahjendatakse 800 ml veega.

4.4. Veevaba metanool.

4.5. 90 protsendiline metanool: 900 ml metanooli (4.4) lahjendatakse 100 ml veega.

4.6. 50 protsendiline metanool: 500 ml metanooli (4.4) lahjendatakse 500 ml veega.

4.7. Alumiiniumoksiid, granuleeritud (Alcoa F, 20 meši; aktiveeritud alumiiniumoksiid UG1: F. Lancaster & Co. või selle analoog).

4.8. Standardained: teadaoleva aktiivsusega monensiinnaatrium (valmistaja nt International Laboratory for Biological Standards. Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3NB).

5. VAHENDID

5.1. Vaakumpöördaurusti 250 ml ümarkolviga.

5.2. Klaastoru kromatograafia jaoks, siseläbimõõt 25 mm, pikkus 400 mm, 2 mm avatud otsaga.

5.3. Klaastoru kromatograafia jaoks, siseläbimõõt 11 mm, pikkus ligikaudu 300 mm, 2 mm avatud otsaga.

6. STANDARDLAHUSED

Standardaine (4.8) täpne kaalutis lahustatakse metanoolis (4.4) ja lahjendatakse, kuni saadakse põhilahus, mis sisaldab 800 μg monensiinnaatriumi milliliitri kohta. See lahus säilib suletud kolvis 4 °C juures stabiilsena kuni kaks nädalat.

Kõnealusest põhilahusest valmistatakse 50protsendilise metanooliga (4.6) järjest lahjendades järgmised lahused:

S8 | 8,0 μg/ml |

S4 | 4,0 μg/ml |

S2 | 2,0 μg/ml |

S1 | 1,0 μg/ml |

7. EKSTRAKTI VALMISTAMINE

7.1. Ekstraheerimine

7.1.1. Eelsegud

Võetakse 2 g proovi kaalutis, lisatakse 100 ml 90protsendilist metanooli (4.5), homogeenitakse ja tsentrifuugitakse mõni minut. Supernatant lahjendatakse 50protsendilise metanooliga (4.6), kuni saadakse eeldatav monensiinnaatriumi kontsentratsioon 8 μg/ml (= U8).

7.1.2. Söödad, mille monensiinnaatriumi sisaldus on vähemalt 50 mg/kg

Võetakse 10—20 g proovi kaalutis, lisatakse 100 ml 90protsendilist metanooli (4.5), homogeenitakse 15 minutit ja lastakse settida.

Asetada klaastoru (5.2) kitsasse otsa vatitropp ja lisatakse kergelt raputades alumiiniumoksiidi (4.7), kuni samba kõrgus on 75—80 mm.

Ekstrakt dekanteeritakse alumiiniumoksiidi kolonni ja filtraat kogutakse kokku. 30 ml filtraati lahjendatakse 50 ml veega. Lahust lahjendatakse edasi 50protsendilise metanooliga (4.6), kuni saadakse eeldatav monensiinnaatriumi kontsentratsioon 8 μg/ml (= U8).

7.1.3. Söödad, mille monensiinnaatriumi sisaldus on alla 50 mg/kg (kuni 10 mg/kg)

Võetakse 10—20 g proovi kaalutis, lisatakse 100 ml 90protsendilist metanooli (4.5) ja homogeenitakse 15 minutit. Tsentrifuugitakse selgeks.

20 mg/kg monensiinnaatriumi sisaldava proovi kohta võetakse 40 ml supernatanti. 10 mg/kg sisaldava proovi kohta võetakse 80 ml supernatanti ja aurutatakse kuivaks vaakumis pöördaurustil (5.1) mitte üle 40 °C juures. Jääk lahustatakse 10 ml 90 % metanoolis (4.5).

Asetatakse klaastoru (5.3) kitsasse otsa vatitropp ja lisatakse kergelt raputades alumiiniumoksiidi (4.7), kuni samba kõrgus on 75—80 mm.

Jäägi metanoolilahus dekanteeritakse alumiiniumoksiidi kolonni ja filtraat kogutakse kokku. Kolonn pestakse 10 ml 90protsendilise metanooliga (4.5) ja pesuvedelik lisatakse filtraadile.

Lahus aurutatakse kuivaks vaakumis pöördaurustil (5.1) alla 40 °C juures. Jääk lahustatakse 10 ml veevabas metanoolis (4.4) ja täiendatakse veega 20 milliliitrini. Lahust tsentrifuugitakse kiirusel vähemalt 4000 pööret minutis vähemalt viis minutit. Lahust lahjendatakse edasi 50protsendilise metanooliga (4.6), kuni saadakse eeldatav monensiinnaatriumi kontsentratsioon 8 μg/ml (= U8).

7.2. Testlahused

Lahusest U8 valmistatakse lahused U4 (eeldatav sisaldus 4 μg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 2 μg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 1 μg/ml), lahjendades järjest (1 + 1) 50protsendilise metanooliga (4.6).

8. ANALÜÜSI KÄIK

8.1. Analüüsi söötme nakatamine

Analüüsi sööde (4.2) nakatatakse spoorsuspensiooniga (3.2) 50— 60 oC juures. Eelkatsete abil analüüsi söötmega (4,2) plaatidel määratakse kindlaks spoorsuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks monensiinnaatriumi eri kontsentratsioonide juures.

8.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel standardlahuse nelja kontsentratsiooni juures (S8, S4, S2 ja S1) ja testlahuse nelja kontsentratsiooni juures (U8, U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahuse kontsentratsiooni tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse oleks võimalik teha vähemalt kaheksa üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel asetsevat auku läbimõõduga 10—13 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.2), mis on nakatatud vastavalt punktile 8.1, nii et tekiks ligikaudu 2 mm paksune kiht (60 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda, tehakse sellesse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud test- ja standardlahuste kogused (0,10—0,15 ml augu kohta, sõltuvalt läbimõõdust). Iga kontsentratsiooni kasutatakse vähemalt neli korda, et iga määramisega oleks võimalik hinnata 32 inhibitsioonitsooni.

8.3. Inkubatsioon

Plaate inkubeeritakse 35—37 °C juures ligikaudu 18 tundi.

9. HINDAMINE

Inhibitsioonitsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni puhul leitakse keskmised väärtused poollogaritmilisel millimeetripaberil, kus oleks näha kontsentratsioonide logaritmi ja inhibitsioonitsoonide läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ekstrakti jaoks visandatakse "kõige sobivamad" jooned, näiteks nagu kirjeldatud allpool.

Standardlahuse madalaima taseme (SL) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SL =

10

Standardlahuse kõrgeima taseme (SH) jaoks määratakse "kõige sobivam" punkt, kasutades järgmist valemit:

SH =

10

Samamoodi arvutatakse "kõige sobivamad" punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades S1, S2, S4 ja S8 eespool toodud valemis U1, U2, U4 ja U8 – ga.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse "kõige sobivam" joon. Samamoodi märgitakse UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti "kõige sobivam" joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni käsitada paralleelsetena, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine rohkem kui 10 % võrra oma keskmisest väärtusest.

Kui jooned ei ole paralleelsed, võib ära jätta kas U1 ja S1 või U8 ja S8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, mispuhul saadakse alternatiivsed "kõige sobivamad" jooned:

aʼ )SL =5S1+2S2 – S46 | alebo | 5S2+2S4 – S86 |

bʼ )SH =5S4 +2S2 – S16 | alebo | 5S8+2S4 – S26 |

ning samamoodi UL ja UH puhul. Sarnaselt eespool kirjeldatuga tuleb kontrollida alternatiivsete "kõige sobivamate" joonte paralleelsust. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni käsitatakse paralleelsetena, arvutatakse suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil.

Nelja kontsentratsiooni puhul:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

− S

8 × 0,602U4+ U8+ S4+ S8 – U1 – U2 – S1 − S2

Kolme kontsentratsiooni puhul:

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

4 × 0,401U4+ S4 – U1 – S1

või

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401U8+ S8 – U2– S2

Tegelik aktiivsus = oletatav aktiivsus × suhteline aktiivsus.

Kui suhteline aktiivsus jääb väljapoole vahemikku 0,5—2,0, korratakse katset, kohandades vastavalt vajadusele ekstrakti kontsentratsiooni või, kui see ei ole võimalik, standardlahuste kontsentratsiooni. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutud vahemikku, tuleb kõiki saadud tulemusi käsitada ligikaudsetena ning see tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni ei saa käsitada paralleelsetena, korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, tuleb määramine lugeda mitterahuldavaks.

10. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

- 20 % suurimast väärtusest, kui monensiinnaatriumi sisaldus on 10—25 mg/kg,

- 5 mg/kg, kui monensiinnaatriumi sisaldus on 25—50 mg/kg,

- 10 % suurimast väärtusest, kui monensiinnaatriumi sisaldus on üle 50 mg/kg.

[1] Kasutada võib ka teisi meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et nendega saadakse sarnased spoorsuspensioonid.

[2] Kasutada võib kaubandusest saadaolevat söödet, mis on samalaadse koostisega ning millega saadakse samad tulemused.

[3] 1 mg monensiinnaatriumi vastab 1000 UK-ühikule.

[4] Kasutada võib ka teisi meetodeid, kui on kindlaks tehtud, et nendega saadakse samalaadsed spoorsuspensioonid.

[5] Kasutada võib kaubanduses saadaolevat söödet, mis on samalaadse koostisega ning millega saadakse samad tulemused.

--------------------------------------------------