Euroopa Liidu Teataja L 093 , 13/04/1991 Lk 0001 - 0048

Soomekeelne eriväljaanne: Peatükk 3 Köide 37 Lk 0012

Rootsikeelne eriväljaanne: Peatükk 3 Köide 37 Lk 0012



Komisjoni otsus, 14. veebruar 1991, millega sätestatakse teatavad toorpiima ja kuumtöödeldud piima analüüsi- ja katsemeetodid (91/180/EMÜ) EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 5. augusti 1985. aasta direktiivi 85/397/EMÜ ühendusesisest kuumtöödeldud piimaga kauplemist mõjutavate tervishoiu ja loomatervishoiu probleemide kohta, [1] viimati muudetud direktiiviga 89/662/EMÜ, [2] eriti selle artikli 10 lõiget 2, ning arvestades, et: artikli 10 lõikes 2 nähakse ette, et komisjon sätestab analüüsi- ja katsemeetodid, mida kasutatakse toorpiima ja kuumtöödeldud piimaga seotud standardite järgimise kontrollimiseks; toorpiima puhul on vaja sätestada meetodid eelkõige bakterite arvu, rakkude arvu, külmumistemperatuuri ja antibiootikumide olemasolu kindlakstegemiseks; pastöriseeritud piima puhul on vaja sätestada meetodid eelkõige nakkusetekitajate puudumise, kolibakterite arvu, bakterite arvu, fosfataasi puudumise, peroksidaasi olemasolu, antibiootikumide puudumise ja külmumistemperatuuri kindlakstegemiseks; steriliseeritud piima ja kõrgkuumutatud piima puhul on vaja sätestada meetodid eelkõige bakterite arvu ja antibiootikumide puudumise kindlakstegemiseks; tehnilistel põhjustel on otstarbekas esimese sammuna sätestada teatavate standardite järgimise tagamiseks analüüsi ja katse standardmeetodid; eelkõige on vaja jätkuvalt uurida tingimusi, mille alusel tavameetodeid ning analüüsi- ja katsemeetodeid tuleb kohaldada; kuni kõnealuse uurimise tulemuste selgumiseni vastutavad liikmesriigid asjakohaste tavameetodite kasutamise eest, et tagada direktiivis 85/397/EMÜ sätestatud standardite järgimine; analüüsi ja katse standardmeetodite kindlaksmääramine hõlmab analüüsimeetodite ja täpsuskriteeriumide sätestamist tulemuste ühtse tõlgendamise tagamiseks; käesoleva otsusega ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise veterinaarkomitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA OTSUSE: Artikkel 1 Toorpiima analüüsi ja katse standardmeetodid on järgmised: - külmumistemperatuuri kindlakstegemine, - mikroorganismide loendamine — mikroobide arvu loendamise katse temperatuuril 30 °C, - keharakkude loendamine, - antibiootikumide ja sulfoonamiidide avastamine. Artikkel 2 Pastöriseeritud piima analüüsi ja katse standardmeetodid on järgmised: - külmumistemperatuuri kindlakstegemine, - fosfataasi aktiivsuse kindlakstegemine, - peroksidaasi aktiivsuse kindlakstegemine, - mikroorganismide loendamine — mikroobide arvu loendamise katse temperatuuril 30 °C, - mikroorganismide loendamine — mikroobide arvu loendamise katse temperatuuril 21 °C, - kolibakterite loendamine — pesade arvu loendamine temperatuuril 30 °C, - antibiootikumide ja sulfoonamiidide avastamine, - patogeensete mikroorganismide avastamine. Artikkel 3 Kõrgkuumutatud piima ja steriliseeritud piima analüüsi ja katse standardmeetodid on järgmised: - mikroorganismide loendamine — mikroobide arvu loendamise katse temperatuuril 30 °C, - külmumistemperatuuri kindlakstegemine, - antibiootikumide ja sulfoonamiidide avastamine. Artikkel 4 Analüüsi ja katse standardmeetodid ja täpsuskriteeriumid tuleb kohaldada ning proovid võtta vastavalt I lisas sätestatud eeskirjadele. Artikkel 5 Artiklites 1, 2 ja 3 osutatud analüüsi ja katse standardmeetodid on sätestatud II lisas. Artikkel 6 Käesolev otsus vaadatakse uuesti läbi enne 31. detsembrit 1992 teaduse ja tehnika edusammude arvessevõtmiseks. Artikkel 7 Käesolev otsus on adresseeritud liikmesriikidele. Brüssel, 14. veebruar 1991 Komisjoni nimel komisjoni liige Ray Mac Sharry [1] EÜT L 226, 24.8.1985, lk 13. [2] EÜT L 395, 30.12.1989, lk 13. -------------------------------------------------- I LISA SISUKORD | | Lehekülg | I. | Üldsätted … | 187 | II. | Toorpiima ja kuumtöödeldud piima proovi võtmine… | 189 | I. ÜLDSÄTTED 1. Sissejuhatus Kirjeldatakse üldsätteid reaktiivide, seadmete, tulemuste esitamise, täpsuse ja katsearuannete kohta. Liikmesriikide pädevad asutused ja piima proovide võtmise ja analüüsimise eest vastutavad laboratooriumid peavad üldsätteid respekteerima. 2. Reaktiivid 2.1. Vesi 2.1.1. Kui vett mainitakse seoses lahuse valmistamise, lahjendamise või loputamisega, kasutatakse destilleeritud või deioniseeritud vett või vähemalt samaväärse puhtusastmega demineraliseeritud vett, kui ei ole ettenähtud teisiti. Kasutades vett mikrobioloogilisel otstarbel, peab see olema vaba ainetest, mis võivad häirida või mõjutada mikroorganismide kasvu katse tingimustes. 2.1.2. Kui viidatakse lahuse valmistamisele või lahjendamisele ilma edasiste selgitusteta, peetakse silmas lahuse valmistamist vee abil või lahjendamist veega. 2.2. Kemikaalid Kõik kasutatavad kemikaalid peavad olema tunnustatud analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga, kui ei ole ettenähtud teisiti. 3. Seadmed 3.1. Seadmete loetelud Eri standardmeetodite kirjeldustes esitatud seadmete loetelud sisaldavad üksnes spetsiaalseks otstarbeks ettenähtud ja erinõuetele vastavaid vahendeid. 3.2. Analüütilised kaalud Analüütilised kaalud on kaalud, millega on võimalik kaaluda 0,1 mg. 4. Tulemuste esitamine 4.1. Tulemused Kui ei ole ettenähtud teisiti, peaks analüüsi aruandes esitatud tulemus olema konkreetse meetodi jaoks ettenähtud korratavuse kriteeriumile (5.1) vastavast kahest katsest saadud aritmeetiline keskmine. Juhul kui korratavuse kriteerium ei ole täidetud, tuleb katset korrata või tulemus kehtetuks tunnistada. 4.2. Protsendi arvutamine Tulemus arvutatakse proovi massiprotsendina, kui ei ole ettenähtud teisiti. 5. Täpsuskriteeriumid: korratavus ja reprodutseeritavus 5.1. Iga meetodi kirjelduses esitatud täpsuskriteeriumid määratletakse järgmiselt: 5.1.1. Korratavus (r) on väärtus, mis on suurem ühel ja samal meetodil, samasuguse materjaliga ja samadel tingimustel (sama teostaja, samad seadmed, sama laboratoorium ja lühike aeg) tehtud kahe üksikkatse tulemuste absoluutsest erinevusest. 5.1.2. Reprodutseeritavus (R) on väärtus, mis on suurem ühel ja samal meetodil, samasuguse materjaliga, kuid eri tingimustel (eri teostajad, eri seadmed, eri laboratooriumid ja/või eri aeg) tehtud kahe üksikkatse tulemuste absoluutsest erinevusest. 5.1.3. Kui ei ole ettenähtud teisiti, on iga meetodi kirjelduse asjakohases punktis esitatud korratavuse ja reprodutseeritavuse kriteeriumide väärtuste usaldusnivoo vahemik 95 % vastavalt ISO standardile 5725: teine väljaanne, 1986. Kõnealused väärtused arvutatakse meetodi hindamise eesmärgil tehtud tunnustatud koostöökatsete tulemuste põhjal. Mõnede meetodite puhul ei ole aga koostöökatseid tehtud. Sellisel juhul on korratavuse ja reprodutseeritavuse väärtused antud hinnanguliselt. 5.1.4. Punktis 5.1.3 osutatud koostöökatsed ja uuringud tuleks kavandada ja teha kooskõlas rahvusvaheliste suunistega. 6. Katsearuanne Katsearuandes täpsustakse kasutatud analüüsimeetod ja saadud tulemused. Peale selle märgitakse katsearuandesse analüüsi üksikasjad, mis jäävad analüüsimeetodi all täpsustamata või mis ei ole kohustuslikud, ning samuti muud asjaolud, mis võisid saadud tulemusi mõjutada. Katsearuanne sisaldab kõiki proovi täielikuks identifitseerimiseks vajalikke andmeid. II. TOORPIIMA JA KUUMTÖÖDELDUD PIIMA PROOVI VÕTMINE 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse toorpiima ja kuumtöödeldud piima proovi võtmise standardmeetodit. Proovi võtmise, transpordi ja säilitamise korda kohaldatakse tootjate tarnetest pärit toorpiima ning säilitus- ja transpordimahutites oleva toorpiima ja kuumtöödeldud piima suhtes. Punktides 2, 4.4, 5 ja 6 kirjeldatud korda kohaldatakse otsetarbimiseks ettenähtud kuumtöödeldud piima proovi võtmiseks. 2. Üldsätted Kannudes, tsisternides jms oleva toorpiima ja kuumtöödeldud piima proovi võtab kogenud inimene, kes on enne proovi võtmist selleks vastava ettevalmistuse saanud. Vajaduse korral juhendab pädev asutus või katselabor proovi võtjaid proovi võtmise tehnikate alal, et tagada proovi representatiivsus ja vastavus kogu partiile. Vajaduse korral annab pädev asutus või katselabor proovi võtjaile juhiseid proovi märgistamise kohta, et tagada proovi üheseltmõistetav samasus. 3. Proovivõtmise vahendid 3.1. Üldsätted Proovivõtmise vahendid peavad olema tehtud roostevabast terasest või muust sobivast piisavalt tugevast materjalist ning sõltuvalt otstarbest (segamine, proovi võtmine jne) peavad need olema sobiva ehitusega. Mahutites vedelike segamiseks ettenähtud varbkolvid ja segistid peavad olema piisavalt laiad toote küllaldaseks segamiseks, põhjustamata räästunud maitse tekkimist. Proovivõtu kulpidel peavad olema kõvad, piisava pikkusega käepidemed, et oleks võimalik võtta proovi mahuti mistahes sügavusest. Kulbi maht peab olema vähemalt 50 ml. Proovinõud ja korgid peavad olema klaasist, sobivast metallist või plastikust. Materjalid, millest proovivõtmise vahendid (k.a mahutid ja korgid) valmistatud on, ei tohi põhjustada proovis muutusi, mis võivad mõjutada uuringute tulemusi. Kõik proovivõtmise vahendite ja proovinõude pinnad peavad olema puhtad, kuivad, siledad ja pragudeta, nurgad peavad olema ümarad. 3.2. Mikrobioloogiliseks uurimiseks ettenähtud proovi võtmise vahendid Proovivõtmise vahendid, sh mahutid peavad lisaks punktis 3.1 esitatud nõuetele olema steriilsed. Juhul kui järjestikusel proovide võtmisel kasutatakse ühtesid ja samu vahendeid, tuleb need puhastada ja steriliseerida pärast iga proovivõttu vastavalt katselabori või pädeva asutuse sätestatud juhistele või nõuetele nii, et säiliks järjestikku võetud proovide puutumatus. 4. Proovivõtmise tehnika 4.1. Üldsätted Olenemata tehtavatest katsetest tuleb enne proovi võtmist piima kas käsitsi või mehaanilise vahendiga põhjalikult segada. Proov võetakse kohe pärast segamist, kui piim veel segamisest liigub. Kui ühel ja samal ajal võetakse eri katsete jaoks mitu mahutites oleva piima proovi, siis esimesena võetakse proov mikrobioloogiliseks uurimiseks. Proovi kogus sõltub katse tegemise nõuetest. Kasutatavate proovinõude maht peab olema selline, et need täidetakse prooviga peaaegu täielikult, et oleks võimalik mahuti sisu nõuetekohaselt segada ja samas vältida loksumist transportimise ajal. 4.2. Käsitsi proovivõtmine 4.2.1. Proovivõtmine lüpsikutest ja kannudest Et kiiresti saavutada piima liikumist, tuleb varbkolbi lüpsikus või kannus üles-alla liigutada, samal ajal jälgides, et piim seguneks vajalikul määral ja et koor ei kleepuks kannu kaelale. 4.2.2. Proovivõtmine jahutussärgiga piimatankidest või vaatidest Segada piima mehaaniliselt või käsitsi kuni piisava ühtsuse saavutamiseni. Juhul kui piima kogus ei võimalda mehaanilisel segistil piima segada, tuleb teha seda käsitsi. 4.2.3. Proovivõtmine kaalupaagist On oluline, et piima tilgutamisel kaalupaaki segatakse seda piisavalt. Rasva ühtlaseks jaotumiseks võib osutuda vajalikuks segada piima lisaks käsitsi või mehaaniliselt. Kui partii kogus, millest proov võetakse, on paagi mahust suurem, saadakse kogu partiid esindav proov vastavalt punktile 4.2.4. 4.2.4. Proovivõtmine eri mahutites olevast kogusest Kui piima kogus, millest proov võetakse, on mitmes mahutis, tuleb igast mahutist võtta representatiivne kogus ja märkida üles mahutites olevad piimakogused, millest representatiivsed kogused võeti. Juhul kui igast mahutist pärit kogust ei analüüsita eraldi, tuleb kõnealused representatiivsed kogused segada osadena, mis on proportsionaalsed mahutites olevate kogustega. Proov või proovid võetakse kokkupandud proportsionaalsetest kogustest pärast segamist. 4.2.5. Proovivõtmine suurtest anumatest — mahutitest, paakvagunitest ja paakautodest 4.2.5.1. Enne proovi võtmist segada piim nõuetekohaselt. Suurte anumate või mahutite, paakvagunite või paakautode sisu soovitatakse segada mehaaniliselt (4.2.5.2). Segamise aeg peab olema vastavuses piima eelneva paigalseismise ajaga. Tuleb näidata, et konkreetsetes tingimustes kohaldatava segamismeetodi tõhusus vastab kavandatud analüüsi eesmärkidele; segamise tõhususe kriteerium mõjutab eelkõige kas partii eri osadest või teatavate ajavahemike järel väljalaske ajal mahuti väljalaskekohast võetud proovide analüütiliste tulemuste sarnasust. Piima segamise viisi käsitatakse tõhusana juhul, kui kõnealustel tingimustel võetud kahe proovi rasvasisaldus on väiksem kui 0,1 %. Põhjakraaniga suurtel anumatel võib väljavooluava juures olla väike kogus piima, mis isegi pärast segamist ei esinda kogu anuma sisu. Seepärast tuleks proove võtta eelistatult läbi luugiaugu. Juhul kui proovid võetakse kraanist, tuleb lasta piisavalt piima välja joosta, et tagada proovide representatiivsus. 4.2.5.2. Suurte anumate või mahutite, paakvagunite või paakautode sisu võib segada: - paakidesse sisseehitatud ja elektrimootori jõul töötava mehaanilise segistiga, - elektrimootori jõul töötava propellerseguri või segistiga, mis asetatakse luugiavale nii, et segisti asetub piimasse, - retsirkuleerides piima paagi tühjenduspumpade külge kinnitatud ja luugiava kaudu sisseasetatud ümberpumpamisvooliku abil (paakvaguni või -auto puhul), - puhta filtreeritud suruõhu abil. Sel juhul tuleks räästunud maitse tekkimise vältimiseks kasutada minimaalset õhusurvet ja -ruumala. 4.3. Automaatne või poolautomaatne proovivõtmine Tootjate tarnetest pärit toorpiima proovi võtmiseks ettenähtud automaatseid ja poolautomaatseid proovivõtmise vahendeid võib kasutada katselabori või muu pädeva asutuse juhiste järgi. Sellistele vahenditele tehakse enne nende kasutamist asjakohased testid, nagu on ette näinud vastutav asutus. Proovivõtmise meetodi sobivuses tuleb veenduda selleks, et teha kindlaks: - piima miinimumkogus, millest saab nõuetekohaselt proove võtta, - ülekandumise määr (mis on seotud proovi miinimumkogusega), - suutlikkus anda representatiivne proov pärast nõuetekohast segamist. Automaatse või poolautomaatse proovivõtmise vahendi kasutamise korral võib vastutav, pädev riiklik asutus ette näha: - piima miinimumkoguse, millest proovid tuleb võtta, - proovi miinimumkoguse, - maksimaalse ülekandumise, - millise analüüsi võib teha või millised ettevaatusabinõud tuleb võtta. 4.4. Müügipakendites otsetarbimiseks ettenähtud kuumtöödeldud piima proovivõtmine Müügipakendites otsetarbimiseks ettenähtud kuumtöödeldud piima proovid peavad olema pitseeritud pakendites. Võimaluse korral tuleb proovid võtta pakkemasinast või töötlusettevõtte külmhoones võimalikult kiiresti pärast töötlemist. Pastöriseeritud piima puhul tuleb seda teha töötlemise päeval. Igat tüüpi kuumtöödeldud piima puhul (pastöriseeritud, kõrgkuumutatud ja steriliseeritud) võetakse proovid vastavalt katselabori või muu pädeva asutuse sätestatud juhistele numbrite järgi, mis vastavad hiljem tehtavatele analüüsidele. 5. Proovi identifitseerimisandmed Proovi hõlpsaks identifitseerimiseks märgitakse sellele katselabori või pädeva asutuse juhiste järgi identifitseerimiskood, et tagada proovi samasus. 6. Proovide transportimine ja säilitamine Juhised transportimise ja säilitamise tingimuste ning proovide võtmise vahelise aja ja piima analüüsimise tingimuste kohta koostab katselabor vastavalt piima tüübile ja kasutatavale analüüsimeetodile. Kõnealused juhised sätestatakse kooskõlas pädeva riikliku asutusega. Juhised peavad sisaldama järgmisi punkte: - transportimise ja säilitamise ajal võetakse ettevaatusabinõud kahjustavate lõhnade juurdepääsu ja otsese päikesevalguse vältimiseks. Juhul kui proovide jaoks kasutatav mahuti on läbipaistev, hoitakse seda pimedas, - mikrobioloogilise analüüsi jaoks võetud toorpiima proove transporditakse ja säilitatakse temperatuuril 0–4 oC. Proovivõtmise ja analüüsi tegemise vaheline aeg peab olema võimalikult lühike, mitte mingil juhul ei tohi see olla pikem kui 36 tundi. Pädev asutus võib heaks kiita säilitustemperatuuri 0–6 oC juhul, kui proovivõtmise ja analüüsi tegemise vaheline aeg on lühem kui 24 tundi, - mikrobioloogilise analüüsi jaoks võetud pastöriseeritud piima proove transporditakse ja säilitatakse temperatuuril 0–4 oC. Proovivõtmise ja analüüsi tegemise vaheline aeg peab olema võimalikult lühike, mitte mingil juhul ei tohi see olla pikem kui 24 tundi, - mikrobioloogilise analüüsi jaoks ettenähtud piimaproove, välja arvatud toorpiima ja pastöriseeritud piima proove, säilitatakse jahutatuna laboratooriumis ning proovivõtmise ja analüüsi tegemise vaheline aeg peab olema võimalikult lühike. Mõnede analüüside eriettevaatusabinõud on esitatud eri meetodite kirjeldustes. -------------------------------------------------- II LISA SISUKORD | | Lehekülg | I. | Külmumistemperatuuri kindlakstegemine … | 193 | II. | Fosfataasi aktiivsuse kindlakstegemine … | 199 | III. | Peroksidaasi aktiivsuse kindlakstegemine … | 202 | IV. | Mikroorganismide loendamine — bakterite arvu loendamise katse temperatuuril 30 °C … | 203 | V. | Mikroorganismide loendamine — bakterite arvu loendamise katse temperatuuril 21 °C … | 208 | VI. | Kolibakterite loendamine — pesade arvu loendamine temperatuuril 30 °C … | 212 | VII. | Keharakkude loendamine … | 216 | VIII. | Antibiootikumide ja sulfoonamiidide avastamine … | 222 | IX. | Patogeensete mikroorganismide avastamine … | 231 | I. KÜLMUMISTEMPERATUURI KINDLAKSTEGEMINE 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit toorpiima, pastöriseeritud piima, kõrgkuumutatud ja steriliseeritud täispiima, madala rasvasisaldusega piima ja lõssi külmumistemperatuuri kindlakstegemiseks, kasutades seadet (termistorkrüoskoop), milles termostaadiga reguleeritav vann on elektrijahutusega ja klaaselavhõbetermomeetrit asendab termistorsond. Kasutada on võimalik kahte tüüpi vahendeid. Üks neist on vahend, millega maksimaalne külmumistemperatuur määratakse külmumiskõvera platool, ning teine vahend annab kaubanduslikel eesmärkidel näidu kindlaksmääratud ajal pärast külmutuse töölepanemist. Kuna eri piimadel ning piimal ja kalibreerimise standardlahusel võivad külmumistemperatuuri kõverad olla erinevad, nõuab see standardmeetod platood määrava vahendi kasutamist. Kindlaksmääratud aja põhimõttel töötavat vahendit võib kasutada tavapäraste sõeluuringute puhul. Külmumistemperatuuri võib kasutada piimasse lisatud vee kindlakstegemiseks tingimusel, et proovi happesus on väiksem kui 0,18 g piimhapet 100 ml kohta (vt 7.4). 2. Määratlus Piima külmumistemperatuur: kirjeldatud meetodil saadud näit Celsiuse järgi (°C). 3. Põhimõte Piima katsekogus külmutatakse nõutava temperatuurini sõltuvalt kasutatavast vahendist, ning mehaanilise vibratsiooniga kutsutakse esile kristalliseerumine, mis põhjustab temperatuuri kiire tõusu proovi külmumisele vastava tasemeni. Vahend kalibreeritakse, reguleerides selle kahe standardlahuse õigete näitude saamiseks samal meetodil, mida kasutatakse piimaproovide puhul. Nendel tingimustel annab platoo piima külmumistemperatuuri Celsiuse järgi. 4. Seadmed ja klaastarvikud Tavapärane, eelkõige järgmine laborivarustus: 4.1. Termistorkrüoskoop Krüoskoop koosneb termostaatiliselt juhitavast jahutusvannist, termistorsondist (pooljuht-takistustermomeeter) koos vooluringi ja galvanomeetri või näidikuga, proovi segistist, külmutuse alustamise seadmest ja katseklaasidest. 4.1.1. Jahutusvann Kasutada võib kahte tüüpi jahutusvanne. 4.1.1.1. Sukeljahutusega vann Hästi isoleeritud vannis olevat jahutusvedelikku segatakse nii, et vedeliku kahe punkti temperatuuride erinevus on väiksem kui 0,2 °C. Vedeliku temperatuur ei tohi kõikuda rohkem kui ±0,5 °C tootja poolt ettenähtud nominaalväärtusest. On tähtis, et vannis oleva vedeliku tase hoitakse püsivana. Kogu katseklaasi pind, mis jääb märgist allapoole, peab olema jahutusvedelikuga kaetud. 4.1.1.2. Tsirkulatsioonivann Sobivat jahutusvedelikku tsirkuleeritakse katseklaasis pideva vooluna. Vedeliku temperatuur ei tohi kõikuda rohkem kui ± 0,5°C tootja poolt ettenähtud nominaalväärtusest. Sobiv jahutusvedelik on 1,2-etaandiooli (etüleenglükooli) 33protsendine (v/v) vesilahus. 4.1.2. Termistor ja sellega ühendusesolev vooluring Termistor peab olema klaasist anduriga ja väiksema läbimõõduga kui 1,80 ± 0,2 mm ning kuulikese läbimõõt peab olema väiksem kui 0,31 mm. Termistori ajakonstant peab olema lühem kui kaks sekundit ja ß (vt märkust) väärtus peab olema kõrge. Tööpinge, elektrivool ja soojuskao konstant peaksid olema sellised, et termistori temperatuur ei tõuse rohkem kui 0,0005 °C üle termistori ümbruse temperatuuri –0,512 °C. Maksimaalne hälve takistusel on ±5 %. Kui sond on krüoskoobis tööasendis, peab klaaskuuli tipp olema katseklaasi telgjoonel ja 44,6 ± 0,1 mm katseklaasi ülemisest otsast allpool (vt joonist lk 15). Sondi asetamiseks sellesse asendisse tuleb kasutada šablooni. Märkus β tähistab termistori takistus-temperatuuri omadusi järgmise valemi järgi: — × = βT2 kus: T on temperatuur Kelvini järgi, R on takistus oomides temperatuuril T, - × 1R on temperatuuri koefitsient. β on konstant, mis sõltub termistori valmistamiseks kasutatud materjalist. Praegu soovitatakse suuremat väärtust kui 3000. 4.1.3. Mõõtevahend-näidik 4.1.3.1. Mõõtmise põhimõte Kasutatav vahend töötab esimese platoo leidmise põhimõttel külmumistemperatuuri kõveral. Platoo on kõvera osa, kus temperatuur jääb konstantseks ±0,002 °C vahel vähemalt 20 sekundiks. 4.1.3.2. Käsitsi mõõtmine Termistori stabiilsus tasakaalustatakse Wheatstone'i silla või muu samasuguse vahendiga, kasutades parima kvaliteediga stabiilseid takisteid, mille hälve on väiksem kui ±10 % ja mille temperatuuri koefitsient on väiksem kui 2 × 10–5 °C. Muudetava (tasakaalustatava) takistuse lineaarsus ei tohi kogu mõõtepinnal olla suurem kui 0,3 % selle maksimumväärtusest. Takisteid peab olema võimalik kohandada kalibreerimiseks. Mõõteskaala gradueeritakse vahemikeks, mis ei ole suuremad kui 0,001 °C. 4.1.3.3. Automaatne mõõtmine Näidik peab vahemikus 0 kuni –1°C eristama temperatuuri vahemikega vähemalt 0,001 °C. Näidik ja sellega ühendusesolev vooluring peab olema nii stabiilne, et sama temperatuuri järjestikused näidud ei erine üksteisest rohkem kui 0,001 °C. Vooluring peab olema nii lineaarne, et vahendi nõuetekohasel töötamisel ei teki vahemikus –0,400 kuni –0,600 °C suuremat viga kui ±0,001 °C. 4.1.4. Segamisvarras Katsekoguse segamiseks kasutatakse piima suhtes inertset metallvarrast läbimõõduga 11–1,5 mm. Segamisvarda amplituud tuleks reguleerida ja varras tuleb panna katseklaasi vertikaalselt nii, et selle alumine ots oleks termistorsondi tipuga samal sügavusel. Sellest asendist üles- või allapoole on lubatud hälve umbes 1,5 mm. Segamisvarras peab vibreerima lateraalselt tootja poolt ettenähtud piisava amplituudiga (rohkem kui ±1,5 mm), tagades katsekoguse ühtlase temperatuuri külmumistemperatuuri kindlakstegemise vältel. Segamisvarras ei tohi ühtki korda tavapärase segamisprotseduuri jooksul puutuda termistorsondi ega katseklaasi seina. 4.1.5. Külmutuse alustamise vahend Selleks võib olla igasugune vahend, mis kasutamisel hakkab viivitamata proovi jahutama nii, et katsekoguse temperatuur läheneb külmumistemperatuurile. Selleks võib kasutada segamisvarrast; ühe võimalusena võib suurendada vibratsiooni amplituudi üheks või kaheks sekundiks nii, et segamisvarras puudutab katseklaasi seina. 4.1.6. Katseklaasid Katseklaasid peavad olema klaasist, kõrgusega 50,8 ± 0,1 mm, välimise läbimõõduga 16,0 ± 0,1 mm ja seesmise läbimõõduga 13,5 ± 0,1 mm. Seina paksus kogu katseklaasi ulatuses ei tohi erineda rohkem kui 0,1 mm. Katseklaasidel peab olema 2,5 ± 0, 1 ml proovikoguse näitamiseks märk, mis asub 29,8 mm klaasi ülemisest servast allpool (21 mm klaasi põhjast kõrgemal). 4.1.7. Elektritoide Toitepinge stabiliseeritakse seadmesiseselt või -väliselt nii, et kõikumine ei oleks suurem kui ±1 % nominaalväärtusest, kui võrgutoide kõigub ±6 %. 4.2. Analüütilised kaalud 4.3. Ühe jaotisega mõõtekolb, maht 1000 ml, A klass. 4.4. Hästi ventileeritav kuivatuskapp, milles saab hoida temperatuuri 130 ± 1 °C või ventileeritav elektriahi, milles saab hoida temperatuuri 300 ± 25 °C. 4.5. Eksikaator 5. Reaktiivid 5.1. Boorsilikaatdestillaatoris destilleeritud vesi, mida on keedetud ja süsinikdioksiidi absorbeerimistoruga kolvis temperatuurini 20 ± 2 °C jahutatud. 5.2. Analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga, peeneks jahvatatud naatriumkloriid, mida on kuivatatud ahjus 300 ± 25 °C juures viis tundi või kuivatuskapis 130 ± 1 °C juures vähemalt 24 tundi ning jahutatud toatemperatuurini heas korras olevas eksikaatoris. 5.3. Standardlahuste valmistamine Kaaluda kaaluklaasis vastav kogus (vt tabel 1) kuiva naatriumkloriidi (5.2). Lahustada see destilleeritud vees (5.1), kanda kvantitatiivselt 1000 milliliitrisesse ühe jaotusega mõõtekolbi ning lahjendada veega temperatuuril 20 ± 2 °C kuni märgini. Säilitada mitte kauem kui kaks kuud umbes 5 °C juures hästi suletud polüetüleenpudelites, mille maht ei ole suurem kui 250 ml. Naatriumkloriidi lahuste külmumistemperatuur 20 °C juures. g NaCl/l | °C | 6,859 | –0,408 | 7,818 | –0,464 | 8,149 | –0,483 | 8,314 | –0,492 | 8,480 | –0,502 | 8,646 | –0,512 | 8,811 | –0,521 | 8,977 | –0,531 | 9,143 | –0,541 | 10,155 | –0,600 | Enne standardlahuse kasutamist kallutada ja loksutada pudelit õrnalt mitu korda selle sisu põhjalikuks segamiseks. Standardlahust ei tohiks loksutada nii agressiivselt, et see seguneks õhuga. Standardlahuse proovid tuleks võtta pudelist lahuse kallamise teel puhtasse, kuiva keeduklaasi, selleks ei tohi mitte kunagi kasutada pipette. Lahuseid ei tohiks kasutada juhul, kui need on pudelites, mis on täidetud vähem kui ühe neljandiku osas ja kui neid ei ole säilitatud fungitsiididega (näiteks tiomersaallahus, 10 g/l) ning kui need on vanemad kui kaks kuud. 6. Termistorkrüoskoobi kalibreerimine Krüoskoop tuleb seadistada nii, et ümbritseva õhu temperatuur ei erine kalibreerimise temperatuurist rohkem kui 1 °C. Krüoskoop ei tohi olla päikesevalguse või tuuletõmbe käes ega toatemperatuuril üle 26–27 °C. Veenduda, et krüoskoop on tootja juhistele vastavas heas töökorras ning et see on olnud vähemalt 12 tundi enne kalibreerimist sisselülitatud. Kontrollida sondi asendit, segamisvarda vibreermisamplituudi ja jahutusvedelike temperatuuri. Valida kaks standardlahust (vt tabelit 1 eespool), mille külmumistemperatuur on napilt suurem või napilt väiksem katsematerjaliks olevate piimaproovide külmumistemperatuuri hinnangulisest väärtusest. Kõnealuse kahe standardlahuse külmumistemperatuuride erinevus ei tohiks olla väiksem kui 0,100 °C. (Mõnede praegu saadaolevate krüoskoobi mudelite puhul tasakaalustatakse termistoriga ühendusesolev vooluring vahendi mõõtepiirkonnas teatava külmumistemperatuuri väärtuse juures. Sellise külmumistemperatuuriga standardlahuse kasutamine ühe kalibreerimislahusena hõlbustab kalibreerimise protsessi; tootja peab sellisele väärtusele osutama.) Pipettida 2,5 ± 0,1 ml ühte standardlahust puhtasse, kuiva katseklaasi ning mõõta krüoskoobiga. Märkus Kalibreerimisel kasutatavad katseklaasid peaksid olema tehtud sama tüüpi klaasist ning pestud ja loputatud demineraliseeritud veega samal ajal kui piimaproovide katsete tegemisel kasutatavad katseklaasid. Standardlahuste temperatuurid peaksid olema sarnased piimaproovide temperatuuridega. Reguleerida kalibreerimise juhtimisseadist vastavalt tootja juhistele seni, kuni krüoskoobi näit on võrdne standardlahuse külmumistemperatuuriga. Korrata protseduuri teise standardlahusega ja jätkata kõnealuste protseduuride tegemist kordamööda kahe lahusega seni, kuni mõlema lahuse järjestikused näidud annavad ilma kalibreerimise juhtimisseadist reguleerimata mõlema lahuse külmumistemperatuuri õige väärtuse. Nüüd on krüoskoop kasutuseks valmis ja annab otse, parandusi tegemata piimaproovi külmumistemperatuuri. 7. Analüüsitava proovi ettevalmistamine 7.1. Vajaduse korral säilitada proove temperatuuril 0–5 °C. 7.2. Vajaduse korral eemaldada proovist nähtavad võõrkehad või tahkunud piimarasv, filtreerides proovi puhtasse, kuiva nõusse, ning segada seda õrnalt. Kui kasutatakse filtrit, peab see olema piima suhtes inertne ja labori temperatuuril kasutamisel tõhus vahend. 7.3. Piima võib analüüsida selle säilitustemperatuuril (0–5 °C) või piimal võib lasta saavutada labori temperatuur vahetult enne katse tegemist. Sellest olenemata peavad standardlahused ja piimaproovid olema nende kasutamise ajal sama temperatuuriga. 7.4. Piima tiitritav happesus tuleb kindlaks määrata võimalikult samaaegselt külmumistemperatuuri analüüsi tegemisega. Proove, mille happesus on suurem kui 0,18 g piimhapet 100 ml piima kohta, ei saa analüüsida. 7.5. Kõrgkuumutatud ja steriliseeritud piim peavad seisma vähemalt 20 minutit enne analüüsimist lahtises mahutis. 8. Menetlus 8.1. Eelkontroll Kontrollida, et jahutusvedeliku tase ja temperatuur vastavad tootja juhistele ja et vajaduse korral on termistorsond mõõterakus olevas tühjas katseklaasis. Lülitada sisse krüoskoop ja tagada jahutusvedeliku nõuetekohane segamine või tsirkuleerimine. Kui krüoskoop on olnud sisselülitatud vähemalt 12 tundi, kontrollida jahutusvedeliku temperatuuri ning segamisvarda asendit ja vibreerimisamplituudi. 8.2. Tavapärane kalibreerimiskontroll Enne iga katset mõõta naatriumkloriidi standardlahuse külmumistemperatuuri (nt lahus külmumistemperatuuriga –0,512 °C) kuni kaks järjestikust näitu ei erine üksteisest rohkem kui 0,001 °C. Juhul kui kõnealuste väärtuste keskmine erineb standardlahuse külmumistemperatuurist rohkem kui 0,002 °C, tuleb krüoskoop uuesti kalibreerida punktis 6 kirjeldatud viisil. Krüoskoobi pideva kasutamise korral teha tavapärane kalibreerimiskontroll vähemalt kord tunni jooksul. Arvesse tuleb võtta tootja juhiseid. 8.3. Piima külmumistemperatuuri kindlakstegemine Piimaproovi pudeli sisu kallutada ja loksutada seda õrnalt mitu korda. Proovi ei tohiks loksutada nii agressiivselt, et see seguneks õhuga. Pipettida 2,5 ± 0,1 ml piima puhtasse, kuiva katseklaasi ning eemaldada liigne piim pipetiga. Veenduda, et sond ja segamisvarras on puhtad ja kuivad, vajaduse korral pühkida neid ettevaatlikult pehme, kuiva ja koenarmasteta riidega alt ülespoole. Asetada katseklaas vastavalt tootja juhistele kalibreeritud krüoskoopi. Piim jahtub ja külmumine algab tootja poolt ettenähtud temperatuuril kõikumisega 0,1 °C. (Mõnede automaatsete vahendite puhul võib kõnealust temperatuuri jälgida digitaalnäidikult; käsitsi juhitavate vahendite puhul saavutatakse vajalik täpsus sellega, et külmumine algab siis, kui galvanomeetri osuti ehk visiirjoon on vastava märgiga ühel joonel.) Juhul kui mingil põhjusel algab külmumine enne või pärast täpsustatud temperatuuri ulatust, tuleb katse pooleli jätta ja korrata katset teise katsekogusega. Juhul kui korduskatse proov külmub samuti enne täpsustatud temperatuuri saavutamist, tuleks järgmist proovikogust soojendada temperatuurini 45 °C ja hoida selliselt viis minutit, lastes kristallilisel rasval sulada. Seejärel jahutada proov uuesti katseks vajaliku temperatuurini ja teha katse kohe. Pärast külmumise algust tõuseb temperatuur kiiresti väärtuseni, mis enne langemist jääb mõneks ajaks praktiliselt konstantseks. Külmumistemperatuur vastab selle aja jooksul saavutatud kõrgeimale temperatuurile ning see väärtus ka registreeritakse. Märkus Aeg, mille jooksul püsib temperatuur konstantsena, ning külmumise alguse ja kõrgeima temperatuuri saavutamise vaheline aeg osutuvad eri proovide puhul erinevateks ning on oluliselt lühemad vee ja naatriumkloriidi standardlahuse kui piima puhul. On oluline, et registreeritakse kõrgeim temperatuur. Kui mõõtmine on rahuldavalt lõpule viidud, tuleb võtta katseklaas ja loputada seda veega, seejärel kuivatada termistorsond pehme, puhta ja koenarmasteta riidega alt ülespoole ning teha dubleeriv katse piimaproovi teise kogusega. Kui saadud temperatuuride vaheline erinevus on korratavuse väärtusest (0,004 °C) suurem, tuleb teha kaks dubleerivat katset proovi teise kogusega. Juhul kui kahe katse näidud ei erine üksteisest rohkem kui 0,004 °C, tuleks väärtused registreerida ja kasutada neid lõpptulemuse arvutamiseks. 8.4. Sondi jahutamine Pärast vahendi kasutamist asetada tühi katseklaas mõõterakku ja alandada töötemperatuuri sondi jahutamiseks. (Teatavate krüoskoobi mudelite puhul ei ole see võimalik; sellisel juhul on oluline jahutada sondi enne mõõtmisi piisavalt, näiteks tehes mitu pimekatset kuni järjekindlate näitude saamiseni.) 9. Tulemuste esitamine 9.1. Arvutamine Kui tavapärase kalibreerimiskontrolli tulemus kinnitatakse, arvutada saadud vastuvõetavate külmumistemperatuuri duplikaatväärtuste keskmine, ümardades selle kolmanda kohani pärast koma. Juhul kui kahe vastuvõetava duplikaatväärtuse summa on paaritu arv, tuleks keskmine ümardada lähima paarisarvuni järgmise näite kohaselt: Külmumistemperatuur (°C) Duplikaatväärtused | Keskmine | | | –0,544 | –0,545 | –0,544 | –0,545 | –0,546 | –0,546 | 9.2. Täpsus 9.2.1. Korratavus (r): 0,004 °C 9.2.2. Reprodutseeritavus (R): 0,006 °C +++++ TIFF +++++ Joonis 1Termistorkrüoskoobi detail 4.1 (katseklaasi asend termistori kuulikese ja segamisvarda suhtes) II. FOSFATAASI AKTIIVSUSE KINDLAKSTEGEMINE 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse pastöriseeritud piima fosfataasi aktiivsuse kindlakstegemise standardmeetodit. 2. Määratlus 2.1. Fosfataasi aktiivsus on tootes sisalduva aktiivse leeliselise fosfataasi koguse mõõt, väljendatuna fenooli kogusena mikrogrammides, mis vabastatakse meetodi kirjelduses nimetatud tingimustel 1 ml pastöriseeritud piimast. 2.2. Piima, mille fosfataasi aktiivsus on alla 4 μg/ml, käsitatakse fosfataas-negatiivsena. 3. Põhimõte Fosfataasi aktiivsust hinnatakse proovile lisatud dinaatriumfenüülfosfaadist vabastatud fenooli koguse põhjal. Reageerides dibromokinoonklorimiidiga annab vabastatud fenool dibromoindofenooli (värvuselt sinakas), mida mõõdetakse kolorimeetriliselt 610 nm juures. Võrdluskatse tehakse prooviga, kus fosfataasi ensüüm on hävitatud. 4. Reaktiivid 4.1. Baariumboraathüdroksiidpuhver 4.1.1. Lahustada 50,0 g baariumhüdroksiidi [Ba(OH)2.8H2O] vees kuni mahuni 1000 ml. 4.1.2. Lahustada 22,0 g boorhapet [H3BO3] vees kuni mahuni 1000 ml. 4.1.3. Soojendada 500 ml mõlemat lahust temperatuurini 50 °C, valada lahused kokku, segada, jahutada kiiresti temperatuurini 20 °C ning vajaduse korral reguleerida pH tasemeni 10,6 ± 0, 1, lisades punktis 4.1.1 või 4.1.2 nimetatud lahust. Filtreerida. Lahust säilitada tihedalt suletud mahutis. 4.1.4. Enne kasutust lahjendada lahus sama koguse veega. 4.2. Värviilmutuspuhver Lahustada 6,0 g naatriummetaboraati (NaBO2) või 12,6 g (NaBO2.4H2O) ja 20,0 g naatriumkloriidi (NaCl) vees kuni mahuni 1000 ml. 4.3. Värvilahjenduspuhver Lahjendada 10 ml värviilmutuspuhvrit (4.2) 100 ml veega. 4.4. Puhversubstraat Lahustada 0,1 g vee- ja fenoolivaba disoodiumfenüülfosfaati 100 ml puhvris (4.1.3) või lahustada 0,5 g disoodiumfenüülfosfaati 4,5 ml värviilmutuspuhvris (4.2), lisada kaks tilka BQC lahust (4.6) ning lasta seista toatemperatuuril 30 minutit. Ekstraheerida moodustunud värv 2,5 ml butaan-1-ooliga ja lasta seista kuni butaan-1-ooli eraldumiseni. Eemaldada butaan-1-ool ja ära visata. Vajaduse korral korrata ekstraheerimist. Lahust võib hoida mõni päev külmikus; lasta värvil tekkida ja ekstraheerida uuesti enne kasutust. Puhversubstraat valmistada vahetult enne kasutust, lahustades 1 ml kõnealust lahust baariumboraathüdroksiidpuhvriga mahuni 100 ml (4.1.3). 4.5. Tsinkvasksadesti Lahustada 3,0 g tsinksulfaati (ZnSO4, 7H2O) ja 0,6 g vask(II)sulfaati (CuSO4, 5H2O) vees kuni mahuni 100 ml. 4.6. 2,6-dibromokinoonklorimiidi lahus (BQC lahus) Lahustada 40 ± 1 mg 2,6-dibromokinoonklorimiidi (BQC) (C6H2Br2CINO6) 10 milliliitris 96protsendises (v/v) etanoolis. Säilitada tumedasse pudelisse panduna külmikus. Visata ära juhul, kui selle värv on tuhmunud või kui see on vanem kui üks kuu. 4.7. Vask(II)sulfaadi lahus Lahustada 0,05 g vask(II)sulfaati (CuSO4.5H2O) vees kuni mahuni 100 ml. 4.8. Fenooli standardlahus 4.8.1. Kaaluda 200 ± 2 mg puhast veevaba fenooli, panna 100 milliliitrisesse mõõtekolbi, lisada vett, segada ja suurendada mahtu kuni märgini. See põhilahus püsib külmikus stabiilsena mitu kuud. 4.8.2. Lahjendada 10 ml põhilahust veega kuni mahuni 100 ml ja segada. 1 ml sisaldab 200 μg fenbooli. 5. Seadmed ja klaastarvikud Märkused: a) Kõiki klaastarvikuid, korke ja proovivõtmise vahendeid tuleb hoolikalt puhastada. Soovitav on loputada neid värskelt keedetud destilleeritud veega või aurutada. b) Teatavat tüüpi plastikkorgid võivad põhjustada fenooli saastumist ja neid ei lubata kasutada. Tavapärane, eelkõige järgmine laborivarustus: 5.1. Analüütilised kaalud 5.2. Veevann, milles saab hoida temperatuuri 37 ± 1 °C. 5.3. Spektrofotomeeter, mis sobib mõõtmiseks lainepikkusel 610 nm. 5.4. Katseklaasid, 16 või 18 × 150 mm, eelistatult gradueeritud 5 ja 10 ml juures. 5.5. Pipetid 5.6. Sobiva suurusega klaaslehtrid, näiteks läbimõõduga 5 cm. 5.7. Kurdfiltrid läbimõõduga vähemalt 9 cm filtreerimiseks keskmise kiirusega. 5.8. Mõõtekolvid standardlahuste valmistamiseks. 6. Menetlus Märkused: a) Katse käigus vältida otsese päikesevalguse mõju. b) Saastumine sülje või higiga võib anda eksliku positiivse tulemuse ning seda tuleb vältida. Seepärast tuleb erilist tähelepanu pöörata pipettimisele. 6.1. Analüüsitava proovi ettevalmistamine 6.1.1. Analüüs teha kohe pärast proovi võtmist. Kui seda ei tehta, tuleb proovi hoida külmikus mitte kauem kui kaks päeva. 6.2. Katsekogus Pipettida mõlemasse katseklaasi (5.4) 1 ml analüüsitavat proovi, kasutades üht katseklaasidest kontroll- või pimekatseklaasina. 6.3. Katse tegemine 6.3.1. Kuumutada pimekatseklaasi keevas vees kaks minutit; kogu katseklaasi kuumenemise tagamiseks katta see ja keeduklaas alumiiniumfooliumiga. Jahutada kiiresti toetemperatuurini. 6.3.2. Pimekatse proovi ja katseproovi käsitleda kogu edasises menetluses ühtemoodi. Lisada 10 ml puhversubstraati (4.4) ja segada. 6.3.3. Inkubeerida kohe proove veevannis (5.2) 60 minutit neid aeg-ajalt segades (vähemalt neli korda). 6.3.4. Kuumutada keevas vees kaks minutit punktis 6.3.1 kirjeldatud viisil. Jahutada kiiresti toetemperatuurini. 6.3.5. Mõlemasse katseklaasi lisada 1 ml tsinkvasksadestit (4.5) ja segada põhjalikult. 6.3.6. Filtreerida läbi filterpaberi, visata ära esimesed 2 ml, vajaduse korral filtreerida uuesti kuni filtraat on täiesti selge ning koguda katseklaasi 5 ml. 6.3.7. Lisada 5 ml värviilmutuspuhvrit (4.2). 6.3.8. Lisada 0,1 ml BQC lahust (4.6), segada ja lasta värvil ilmuda toatemperatuuril 30 minuti jooksul. 6.3.9. Mõõta neeldumine kontroll- või pimekatse suhtes spektrofotomeetris (5.3) lainepikkusel 610 nm. 6.3.10 Korrata katset vastava proovi lahjendusega juhul, kui punkti 6.3.9 kohaselt mõõdetud neeldumine on suurem kui punkti 6.4.4 kohaselt mõõdetud standardlahuse neeldumine, mis sisaldab 20 μg fenooli katseklaasi kohta. Kõnealune lahjendus valmistada, segades ühe koguse proovi sellesama proovi vastava osakogusega, mida on fosfataasi inaktiveerimiseks ettevaatlikult keemiseni kuumutatud. 6.4. Kaliibrimiskõvera saamine 6.4.1. Valmistada sobiv hulk lahjendatud standardlahuseid, alustades fenooli standardlahustest (4.8.2), mis sisaldavad 0 (kontroll- või pimekatse), 2, 5, 10 ja 20 μg fenooli milliliitri kohta, ning pipettida vastavalt 1 ml vett ja 1 ml nelja fenooli standardlahust viide katseklaasi. 6.4.2. Igasse katseklaasi lisada 1 ml vask(II)sulfaadi lahust (4.7), 5 ml värvilahjenduspuhvrit (4.3), 3 ml vett ja 0,1 ml BQC lahust (4.6); segada. 6.4.3. Lasta värvil tekkida toatemperatuuril 30 minuti jooksul. 6.4.4. Mõõta neeldumine kontroll- või pimekatse suhtes spektrofotomeetris lainepikkusel 610 nm (5.3). 6.4.5. Iga lisatud fenoolikoguse (6.4.1) puhul saadud neeldumise (6.4.4) väärtuste alusel arvutada regressioonisirge väikseimate ruutude meetodil. 7. Tulemuste esitamine 7.1. Arvutamine ja valem 7.1.1. Fenooli kogus arvutada neeldumise näidu alusel (6.3.9), kasutades saadud regressioonisirget (6.4.5). 7.1.2. Fosfataasi aktiivsus, väljendatuna fenoolina mikrogrammides pastöriseeritud piima milliliitri kohta, arvutada järgmise valemi alusel: Fosfataasi aktiivsus = 2,4 × A × D, kus A on punkti 7.1.1 kohaselt saadud fenoolikogus mikrogrammides, D on punkti 6.3.10 kohaselt valmistatud lahjenduse lahjendusaste (kui ei lahjendata, siis D = 1), aste 2,4 on lahjendusaste (5/12 ühest milliliitrist analüüsitavast proovist) — vt punkti 6.2 seoses punktidega 6.3.2, 6.3.5 ja 6.3.6. 7.2. Täpsus 7.2.1. Korratavus (r): 2 μg fenool/ml. 7.2.2. Reprodutseeritavus (R): 3 (algne) μg fenool/ml. 7.2.3. Juhul kui lahjendust kasutatakse punkti 6.3.10 kohaselt, kehtivad punktides 7.2.1 ja 7.2.2 mainitud piirangud lahjendatud proovist saadud tulemuste kohta. III. PEROKSIDAASI AKTIIVSUSE KINDLAKSTEGEMINE 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit peroksidaasi ensüümi olemasolu või puudumise kindlakstegemiseks piimas pastöriseerimise kontrollimise eesmärgil. 2. Määratlus Positiivse peroksidaasi reaktsioon Juhul kui piima on pastöriseeritud nõuetekohaselt, ilmub sinine värvus 30 sekundi jooksul pärast segamist. Negatiivse peroksidaasi reaktsioon Värvust ei ilmu 30 sekundi jooksul pärast segamist. 3. Põhimõte Peroksidaasi ensüüm lagundab vesinikperoksiidi. Vabastatud monohapnik oksüdeerib värvitu 1,4-fenüleendiamiini purpurseks indofenooliks (Storchi test). Värvuse intensiivsus on proportsionaalne ensüümi kontsentratsiooniga. 4. Reaktiivid 4.1. 1,4-fenüleendiamiini lahus Lahustada 2 g 1,4-fenüleendiamiini (C6H8N2) soojas (50 °C) vees kuni mahuni 100 ml. Lahust hoida klaaskorgiga tumedas pudelis ning säilitada jahedas ja pimedas kohas. 1,4-fenüleendiamiini lahuses tekib ühe-kahe päeva jooksul pärast selle valmistamist sade; siis tuleb lahus ära visata. 4.2. Vesinikperoksiidi lahus Lahustada 9 ml 30protsendist vesinikperoksiidi vees kuni mahuni 100 ml. Selle stabiliseerimiseks lisada 1 ml kontsentreeritud väävelhapet liitri lahuse kohta. Vesinikperoksiidi lahus püsib stabiilsena üks kuu juhul, kui seda hoitakse jahedas ja pimedas kohas sellise klaaskorgiga pudelis, mis välistab kokkupuute orgaaniliste ühenditega. 5. Menetlus 5.1. Panna 5 ml piimaproovi sobiva korgiga puhtasse katseklaasi. 5.2. Lisada 5 ml 1,4-fenüleendiamiini lahust (4.1). 5.3. Lisada kaks tilka vesinikperoksiidi lahust (4.2). 5.4. Jälgida värvuse ilmumist 30 sekundi jooksul pärast segamist. Juhul kui sinine värvus ilmub hiljem kui 30 sekundit pärast reaktiivide lisamist, ei ole reaktsioon spetsiifiline. IV. MIKROORGANISMIDE LOENDAMINE — MIKROOBIDE ARVU LOENDAMISE KATSE TEMPERATUURIL 30 °C 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit mikroorganismide loendamiseks, kasutades pesade arvu määramise tehnikat temperatuuril 30 °C. Kõnealust meetodit kohaldatakse toorpiima ja pastöriseeritud piima ning 30 °C juures 15 päeva eelinkubeeritud kõrgkuumutatud piima ja steriliseeritud piima suhtes. 2. Määratlus Mikroorganismid on organismid, mis moodustavad loendatavaid pesasid, kui neid inkubeeritakse aeroobselt kirjeldatud tingimustel. 3. Põhimõte Määratletud piimaproovi kogus segatakse söötmega Petri tassides ja seda inkubeeritakse 30 °C juures 72 tundi. Loendatakse pesad ja arvutatakse mikroorganismid 1 ml toorpiima või pastöriseeritud piima kohta või 0,1 ml eelnevalt inkubeeritud kõrgkuumutatud või steriliseeritud piima kohta. 4. Seadmed ja klaastarvikud Tavapärane, eelkõige järgmine laborivarustus: 4.1. Seadmed 4.1.1. Kuumõhukapp, mis saab töötada temperatuuril 170–175 °C. 4.1.2. Autoklaav, mis saab töötada temperatuuril 121 ± 1 °C. 4.1.3. Inkubaator, milles saab hoida temperatuuri 30 ± 1 °C kogu seadme ulatuses. 4.1.4. Temperatuuri kompenseerimisega pH-meeter täpsusega ±0,1 pH ühikut. 4.1.5. Veevann, milles saab hoida temperatuuri 45 ± 1 °C. 4.1.6. Luup suurendusega 2–4 x. 4.1.7. Luup suurendusega 8–10 x. 4.1.8. Käsiloendur. 4.1.9. Segisti, millega saab segada 1 ml piimaproovi või kümnendlahjendust 9 ml lahjendusvedelikuga ning mis töötab katseklaasis ekstsentrilise ringliikumise põhimõttel. 4.2. Klaastarvikud 4.2.1. Sobivate korkidega katseklaasid, mis piisavalt segamisruumi jättes mahutavad 10 ml esmast lahjendust või edasisi kümnendlahjendusi. 4.2.2. Kolvid mahuga 150–250 ml või katseklaasid mahuga 20 ml söötme hoidmiseks. 4.2.3. Klaasist või steriilsest tehismaterjalist (vatiga otsast suletud) pipetid, mille kinnise otsa nominaalmaht on 1 ml ja väljalaskeava läbimõõt on 1,75–3 mm. 4.2.4. Selgest värvitust klaasist või steriilsest tehismaterjalist Petri tassid, mille puhul alumise tassi seesmine läbimõõt on umbes 90–100 mm. Seesmine sügavus peaks olema vähemalt 10 mm. Põhjas ei tohi olla pesade loendamist häirivaid ebakorrapärasusi. 4.2.5. Klaastarvikute steriliseerimine Klaastarvikuid steriliseeritakse ühel järgmistest meetoditest: a) neid hoitakse kuumõhukapis (4.1.1) temperatuuril 170–175 °C vähemalt tund; b) neid hoitakse autoklaavis (4.1.2) temperatuuril 121 ± 1 °C vähemalt 20 minutit. Autoklaavi kasutamisel tuleks tagada auru küllaldane juurdepääs, näiteks juhul, kui vahendeid steriliseeritakse mahutites, ei tohiks need olla tihedalt suletud, kolbidel peaksid kaaned olema nõrgalt pealeasetatud. Autoklaavis steriliseeritud klaastarvikuid tuleks kuivatada autoklaavist auru välja lastes. Pipette tuleb steriliseerida kuumõhukapis (4.1.1). 5. Sööde — piima mikroobide arvu loendamise agar 5.1. Koostis: Pärmiekstrakt | 2,5 g | Trüptoon | 5,0 g | D(+)-glükoos või dekstroos | 1,0 g | Lõssipulber | 1,0 g | Agar | 10–15 g, sõltuvalt kasutatava agari želeelistest omadustest | Vesi | 1000 ml | Lõssipulber peab olema vaba inhibeerivatest lisanditest. Seda tuleb kontrollida võrdluskatsetega, kasutades lõssipulbrit, milles kindla teadmise kohaselt inhibeerivad lisandid puuduvad. Valmistamine Koostisosad lahustada vees järgmises järjestuses: pärmiekstrakt, trüptoon, glükoos ja lõpuks lõssipulber. Seda protseduuri hõlbustab suspensiooni kuumutamine. Lisada agar ning pidevalt segades kuumutada keemiseni kuni agari täieliku lahustumiseni või aurutada umbes 30 minutit. Vajaduse korral filtreerida läbi filterpaberi. Kontrollida pH-d pH-meetriga (4.1.4) ning vajaduse korral reguleerida pH naatriumhüdroksiidi või soolhappe lahusega (vähemalt 0,1 mol/l) nii, et pärast steriliseerimist oleks see 25 °C juures 6,9 ± 0,1. 5.2. Söötme jaotamine, steriliseerimine ja säilitamine Jaotada sööde (5.1) 100–150 ml kogustena kolbidesse või 12–15 ml kogustena katseklaasidesse (4.2.2). Panna kolbidele või katseklaasidele korgid. Steriliseerida autoklaavi (4.1.2) 121 ± 1 °C juures 15 minutit. Kontrollida söötme pH-d. Juhul kui söödeta ei kasutata kohe, tuleb seda säilitada pimedas temperatuuril 1–5 °C mitte kauem kui kuu pärast selle valmistamist. 5.3. Müügilolev kuivsööde Söötme (5.1) võib valmistada müügilolevast kuivsöötmest. Järgida tuleb tootja juhiseid, kuid juhul kui koostisest puudub lõssipulber, tuleb see lisada enne lahustamist. Reguleerida pH 25 °C juures tasemele 6,9 ± 0,1 punktis 5.1 kirjeldatud viisil ning sööde jaotada, steriliseerida ja säilitada punktis 5.2 kirjeldatud viisil. 6. Lahjendusvedelikud 6.1. Peptooni-soola lahus Koostis: Peptoon | 1,0 g | Naatriumkloriid (NaCl) | 8,5 g | Vesi | 1000 ml | Valmistamine Lahustada koostisosad vees, vajaduse korral kuumutada. Kontrollida pH-d pH-meetriga (4.1.4) ning vajaduse korral reguleerida pH naatriumhüdroksiidi või soolhappe lahusega (vähemalt 0,1 mol/l) nii, et pärast steriliseerimist oleks see 25 °C juures 7,0 ± 0,1. 6.2. Lahjendusvedeliku jaotamine, steriliseerimine ja säilitamine Jaotada lahjendusvedelik (6.1) katseklaasidesse (4.2.1) sellistes kogustes, et pärast steriliseerimist sisaldab iga klaas 9,0 ± 0, 2 ml lahjendusvedelikku. Panna katseklaasidele korgid. Steriliseerida autoklaavi (4.1.2) 121 ± 1 °C juures 15 minutit. Kontrollida lahjendusvedeliku pH-d. Juhul kui lahjendusvedelikku ei kasutata kohe, tuleb seda säilitada pimedas temperatuuril 1–5 °C mitte kauem kui kuu pärast selle valmistamist. 6.3. Müügilolevad lahjendusvedelikud Lahjendusvedeliku (6.1) võib valmistada müügilolevatest tablettidest või pulbritest. Järgida tuleb tootja juhiseid. Reguleerida pH punktis 6.1 kirjeldatud viisil ning lahjendusvedelikud jaotada, steriliseerida ja säilitada punktis 6.2 kirjeldatud viisil. 7. Menetlus 7.1. Söötme sulatamine Enne mikrobioloogilise uurimise algust sulatada kiiresti söötme nõutud kogus ning jahutada see veevannis (4.1.5) temperatuurini 45 ± 1 °C. 7.2. Piimaproovi ettevalmistamine Segada piimaproovi põhjalikult, pöörates proovinõud ümber 25 korda nii, et mikroorganismid jaotuksid võimalikult ühtlaselt. Vältida tuleks vahutamist, vahu tekkimise korral lasta sel hajuda. Segamise ja katsekoguse võtmise vaheline aeg ei tohiks olla pikem kui kolm minutit. 7.3. Esmase lahjenduse (10-1) valmistamine (toorpiim ja pastöriseeritud piim) Kanda steriilse pipetiga (4.2.3) 1 ml toorpiima või pastöriseeritud piima proovi (7.2) 9 ml lahjendusvedelikku (6.1), vältides pipeti kokkupuutumist lahjendusvedelikuga. Lahjendusvedeliku temperatuur peab olema enam-vähem sama, mis piimaproovil. Segada esmast lahjendust hoolikalt segistis (4.1.9) 5–10 sekundit. Nii saadakse esmane lahjendus 10– 1. 7.4. Edasiste kümnendlahjenduste valmistamine (toorpiim ja pastöriseeritud piim) Kanda steriilse pipetiga (4.2.3) 1 ml esmast lahjendust (7.3) 9 ml lahjendusvedelikku (6.1), järgides punktis 7.3 esitatud juhiseid. Nii saadakse lahjendus 10– 2. Korrata neid toiminguid edasiste kümnendlahjenduste saamiseks kuni loodetakse saada kohane arv mikroorganisme (8.1.1). 7.5. Petri tasside inokuleerimine 7.5.1. Toorpiim: kanda steriilse pipetiga (4.2.3) tassi (4.2.4) 1 ml proovi ja/või vastavat kümnendlahjendust. Uurida tuleb vähemalt kahte lahjendust. Igast nõuetekohaselt valitud lahjendusest (8.1.1) valmistada üks tass. 7.5.2. Pastöriseeritud piim: kanda steriilse pipetiga (4.2.3) tassi (4.2.4) 1 ml proovi ja/või vastavat kümnendlahjendust. Uurida tuleb vähemalt kahte lahjendust. Igast nõuetekohaselt valitud lahjendusest (8.1.1) valmistada kaks tassi. 7.5.3. Kõrgkuumutatud ja steriliseeritud piim (uuritakse pärast 15-päevast inkubeerimist temperatuuril 30 °C — direktiivi A lisa, VII peatükk, punkt 5): Kanda steriilse pipetiga (4.2.3) tassi (4.2.4) 0,1 ml piimaproovi (7.2). Valmistada kaks tassi. 7.6. Söötme sissekülvamine Külvata 15–18 ml söödet (7.1) igasse inokuleeritud tassi. Segada kohe pärast külvamist, keerutades piisavalt Petri tassi ühtlaselt jaotunud pesade saamiseks pärast inkubeermist. Piimaproovi ettevalmistamise ja sõltuvalt piima tüübist kas katsekoguse või lahjenduse söötmega segamise vaheline aeg ei tohi olla pikem kui 15 minutit. Lasta tahkuda puhtal, jahedal horisontaalsel pinnal. 7.7. Petri tasside inkubeerimine Panna tassid inkubaatorisse (4.1.3). Inkubeerida ümberpööratud tasse. Panna virna mitte rohkem kui kuus tassi. Tasside virnad ei tohi puutuda üksteisest ega inkubaatori seinu ja ülaosa. Inkubeerida 30 ± 1 °C juures 72 ± 2 tundi. 7.8. Pesade loendamine Loendada pesad Petri tassides, mis ei sisalda rohkem kui 300 pesa. Uurida tasse nõrgas valguses. Loendamise hõlbustamiseks võib kasutada sobivat luupi (4.1.6) ja/või käsiloendurit (4.1.8). Vältida sadestunud aineosakeste ekslikku pidamist pisikesteks pesadeks. Uurida kahtlasi objekte tähelepanelikult, kasutades vajaduse korral pesade eristamiseks võõrkehadest suurema suurendusega luupi (4.1.7). Laatuvaid pesasid käsitatakse üksikute pesadena. Juhul kui laatuvad pesad katavad vähem kui ühe neljandiku tassist, tuleb loendada pesad tassi laatuvate pesadeta alalt ning arvutada pesade arv kogu tassi kohta. Juhul kui laatuvad pesad katavad rohkem kui ühe neljandiku tassist, tuleb tass ära visata. 8. Tulemuste arvutamine ja esitamine 8.1. Toorpiim ja pastöriseeritud piim 8.1.1. Kasutada pesade loenduse tulemust kõikide 10–300 pesa sisaldavate tasside puhul (vt 8.1.3 ja 8.1.4). 8.1.2. Mikroorganismide arvu 1 ml toorpiima või pastöriseeritud piima kohta annab järgmine valem: d kus: Σ C on punkti 8.1.1 kohaselt loendatud pesade summa, (n1 + 0,1 n2) d on võrdne proovi kogusega, kus: n1 on esimeses lahjenduses loendatud pesadega tasside arv, n2 on teises lahjenduses loendatud pesadega tasside arv, d on esimeste loenduste puhul kasutatud lahjendusaste. Tulemus esitatakse kahe tüvenumbriga. Kui ümardatav number on viis, tuleb see ümardada nii, et sellest vasakul olev number oleks paarisarv. Näide (pastöriseeritud piim): Lahjendus 10– 2: 278 ja 290 pesa Lahjendus 10– 3: 33 ja 28 pesa Arv/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210–2 | | = 6290,022 | | = 28590 | | = 29000 | | = 2,9 × 104. | 8.1.3. Juhul kui kõigi loenduste puhul on pesasid vähem kui 10, tuleb registreerida mikroorganismide arv milliliitri kohta kui "vähem kui 10 × d ml kohta", kus d on madalaima lahjendusastme pöördväärtus. 8.1.4. Juhul kui kõigi loenduste puhul on pesasid rohkem kui 300, kuid neid on võimalik loendada, tuleb arvutada hinnanguline arv ja korrutada see lahjendusastme pöördväärtusega. Tulemus registreerida kui "mikroorganismide hinnanguline arv ml kohta". 8.2. Kõrgkuumutatud ja steriliseeritud piim Mikroobide arvu puhul, mis on suurem kui 10 pesa 0,1 ml kohta, ei käsitata direktiivi 85/397/EMÜ nõudeid täidetuna. 9. Täpsus Rahvusvaheliselt heakskiidetud koostöökatsete tulemused ei ole veel kättesaadavad. V. MIKROORGANISMIDE LOENDAMINE — MIKROOBIDE ARVU LOENDAMISE KATSE TEMPERATUURIL 21 °C 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit mikroorganismide loendamiseks pastöriseeritud piimas, kasutades pesade arvu loendamise tehnikat temperatuuril 21 °C pärast piima inkubeerimist 6 °C juures viie päeva jooksul, et teha kindlaks pastöriseeritud piima saasteaste ja psühhotroopilised mikroorganismid, mis võivad piimas paljuneda temperatuuril 6 °C. 2. Määratlus Mikroorganismid on organismid, mis moodustavad loendatavaid pesasid, kui neid inkubeeritakse aeroobselt kirjeldatud tingimustel. 3. Põhimõte Pastöriseeritud piima inkubeeritakse 6 °C juures viis päeva. Määratletud piimaproovi kogus segatakse söötmega Petri tassides ja seda inkubeeritakse 21 °C juures 25 tundi. Loendatakse pesad ja arvutatakse mikroorganismide arv 1 ml pastöriseeritud piima kohta. 4. Seadmed ja klaastarvikud Tavapärane, eelkõige järgmine laborivarustus: 4.1. Seadmed 4.1.1. Kuumõhukapp, mis saab töötada temperatuuril 170–175 °C. 4.1.2. Autoklaav, mis saab töötada temperatuuril 121 ± 1 °C. 4.1.3 Inkubaatorid, milles saab hoida temperatuuri a) 6 ± 0, 2 °C b) 21 ± 1 °C kogu seadme ulatuses. 4.1.4. Temperatuuri kompenseerimisega pH-meeter täpsusega ±0,1 pH ühikut 4.1.5. Veevann, milles saab hoida temperatuuri 45 ± 1 °C. 4.1.6. Luup suurendusega 2–4 x. 4.1.7. Luup suurendusega 8–10 x. 4.1.8. Käsiloendur. 4.1.9. Segisti, millega saab segada 1 ml piimaproovi või kümnendlahjendust 9 ml lahjendusvedelikuga ning mis töötab katseklaasis ekstsentrilise ringliikumise põhimõttel. 4.2. Klaastarvikud 4.2.1. Sobivate korkidega katseklaasid, mis piisavalt segamisruumi jättes mahutavad 10 ml esmast lahjendust või edasisi kümnendlahjendusi. 4.2.2. Kolvid mahuga 150–250 ml või katseklaasid mahuga 20 ml söötme hoidmiseks. 4.2.3. Klaasist või steriilsest tehismaterjalist (vatiga otsast suletud) pipetid, mille kinnise otsa nominaalmaht on 1 ml ja väljalaskeava läbimõõt on 1,75–3 mm. 4.2.4. Selgest värvitust klaasist või steriilsest tehismaterjalist Petri tassid, mille puhul alumise tassi seesmine läbimõõt on umbes 90–100 mm. Seesmine sügavus peaks olema vähemalt 10 mm. Põhjas ei tohi olla pesade loendamist häirivaid ebakorrapärasusi. 4.2.5. Klaastarvikute steriliseerimine Klaastarvikuid steriliseeritakse ühel järgmistest meetoditest: a) neid hoitakse kuumõhukapis (4.1.1) temperatuuril 170–175 °C vähemalt tund; b) neid hoitakse autoklaavis (4.1.2) temperatuuril 121 ± 1 °C vähemalt 20 minutit. Autoklaavi kasutamisel tuleks tagada auru küllaldane juurdepääs, näiteks juhul, kui vahendeid steriliseeritakse mahutites, ei tohiks need olla tihedalt suletud, kolbidel peaksid kaaned olema nõrgalt pealeasetatud. Autoklaavis steriliseeritud klaastarvikuid tuleks kuivatada autoklaavist auru välja lastes. Pipette tuleb steriliseerida kuumõhukapis (4.1.1). 5. Sööde — piima mikroobide arvu loendamise agar 5.1. Koostis: Pärmiekstrakt | 2,5 g | Trüptoon | 5,0 g | D(+)-glükoos või dekstroos | 1,0 g | Lõssipulber | 1,0 g | Agar | 10–15 g, sõltuvalt kasutatava agari želeelistest omadustest | Vesi | 1000 ml | Lõssipulber peab olema vaba inhibeerivatest lisanditest. Seda tuleb kontrollida võrdluskatsetega, kasutades lõssipulbrit, milles kindla teadmise kohaselt inhibeerivad lisandid puuduvad. Valmistamine Koostisosad lahustada vees järgmises järjestuses: pärmiekstrakt, trüptoon, glükoos ja lõpuks lõssipulber. Seda protseduuri hõlbustab suspensiooni kuumutamine. Lisada agar ning pidevalt segades kuumutada keemiseni kuni agari täieliku lahustumiseni või aurutada umbes 30 minutit. Vajaduse korral filtreerida läbi filterpaberi. Kontrollida pH-d pH-meetriga (4.1.4) ning vajaduse korral reguleerida pH naatriumhüdroksiidi või soolhappe lahusega (vähemalt 0,1 mol/l) nii, et pärast steriliseerimist oleks see 25 °C juures 6,9 ± 0,1. 5.2. Söötme jaotamine, steriliseerimine ja säilitamine Jaotada sööde (5.1) 100–150 ml kogustena kolbidesse või 12–15 ml kogustena katseklaasidesse (4.2.2). Panna kolbidele või katseklaasidele korgid. Steriliseerida autoklaavi (4.1.2) 121 ± 1 °C juures 15 minutit. Kontrollida söötme pH-d. Juhul kui söödet ei kasutata kohe, tuleb seda säilitada pimedas temperatuuril 1–5 °C mitte kauem kui kuu pärast selle valmistamist. 5.3. Müügilolev kuivsööde Söötme (5.1) võib valmistada müügilolevast kuivsöötmest. Järgida tuleb tootja juhiseid, kuid juhul kui koostisest puudub lõssipulber, tuleb see lisada enne lahustamist. Reguleerida pH 25 °C juures tasemele 6,9 ± 0,1 punktis 5.1 kirjeldatud viisil ning sööde jaotada, steriliseerida ja säilitada punktis 5.2 kirjeldatud viisil. 6. Lahjendusvedelikud 6.1. Peptooni-soola lahus Koostis: Peptoon | 1,0 g | Naatriumkloriid (NaCl) | 8,5 g | Vesi | 1000 ml | Valmistamine Lahustada koostisosad vees, vajaduse korral kuumutada. Kontrollida pH-d pH-meetriga (4.1.4) ning vajaduse korral reguleerida pH naatriumhüdroksiidi või soolhappe lahusega (vähemalt 0,1 mol/l) nii, et pärast steriliseerimist oleks see 25 °C juures 7,0 ± 0,1. 6.2. Lahjendusvedeliku jaotamine, steriliseerimine ja säilitamine Jaotada lahjendusvedelik (6.1) katseklaasidesse (4.2.1) sellistes kogustes, et pärast steriliseerimist sisaldab iga klaas 9,0 ± 0, 2 ml lahjendusvedelikku. Panna katseklaasidele korgid. Steriliseerida autoklaavi (4.1.2) 121 ± 1 °C juures 15 minutit. Kontrollida lahjendusvedeliku pH-d. Juhul kui lahjendusvedelikku ei kasutata kohe, tuleb seda säilitada pimedas temperatuuril 1–5 °C mitte kauem kui kuu pärast selle valmistamist. 6.3. Müügilolevad lahjendusvedelikud Lahjendusvedeliku (6.1) võib valmistada müügilolevatest tablettidest või pulbritest. Järgida tuleb tootja juhiseid. Reguleerida pH punktis 6.1 kirjeldatud viisil ning lahjendusvedelikud jaotada, steriliseerida ja säilitada punktis 6.2 kirjeldatud viisil. 7. Menetlus 7.1. Söötme sulatamine Enne mikrobioloogilise uurimise algust sulatada kiiresti söötme nõutud kogus ning jahutada see veevannis (4.1.5) temperatuurini 45 ± 1 °C. 7.2. Proovi ettevalmistamine 7.2.1. Inkubeerida avamata pastöriseeritud piima pakki või kui see ei ole võimalik, siis mitte väiksemat kui 100 ml representatiivset proovi 120 ± 2 tundi inkubaatoris (4.1.3 a) temperatuuril 0,5 °C. 7.2.2. Pärast inkubeerimist segada piimaproovi põhjalikult, pöörates proovinõud ümber 25 korda nii, et mikroorganismid jaotuksid võimalikult ühtlaselt. Vältida tuleks vahutamist, vahu tekkimise korral lasta sel hajuda. Segamise ja katsekoguse võtmise vaheline aeg ei tohiks olla pikem kui kolm minutit. 7.3. Esmase lahjenduse (10– 1) valmistamine Kanda steriilse pipetiga (4.2.3) 1 ml proovi (7.2.2) 9 ml lahjendusvedelikku (6.1), vältides pipeti kokkupuutumist lahjendusvedelikuga. Lahjendusvedeliku temperatuur peab olema enam-vähem sama, mis piimaproovil. Segada esmast lahjendust hoolikalt segistis (4.1.9) 5–10 sekundit. Nii saadakse esmane lahjendus 10– 1. 7.4. Edasiste kümnendlahjenduste valmistamine Kanda steriilse pipetiga (4.2.3) 1 ml esmast lahjendust (7.3) 9 ml lahjendusvedelikku (6.1), järgides punktis 7.3 esitatud juhiseid. Nii saadakse lahjendus 10– 2. Korrata neid toiminguid edasiste kümnendlahjenduste saamiseks kuni loodetakse saada kohane arv mikroorganisme (8.1). 7.5. Petri tasside inokuleerimine Kanda steriilse pipetiga (4.2.3) tassi (4.2.4) 1 ml proovi ja/või vastavat kümnendlahjendust. Uurida tuleb vähemalt kahte lahjendust. Igast nõuetekohaselt valitud lahjendusest (8.1) valmistada kaks tassi. 7.6. Söötme sissekülvamine Külvata 15–18 ml söödet (7.1) igasse inokuleeritud tassi. Segada kohe pärast külvamist, keerutades piisavalt Petri tassi ühtlaselt jaotunud pesade saamiseks pärast inkubeermist. Piimaproovi ettevalmistamise ja lahjenduse söötmega segamise vaheline aeg ei tohi olla pikem kui 15 minutit. Lasta tahkuda puhtal, jahedal horisontaalsel pinnal. 7.7. Petri tasside inkubeerimine Panna tassid inkubaatorisse (4.1.3 b). Inkubeerida ümberpööratud tasse. Panna virna mitte rohkem kui kuus tassi. Tasside virnad ei tohi puutuda üksteisest ega inkubaatori seinu ja ülaosa. Inkubeerida 21 ± 1 °C juures 25 tundi. 7.8. Pesade loendamine Loendada pesad Petri tassides, mis ei sisalda rohkem kui 300 pesa. Uurida tasse nõrgas valguses. Loendamise hõlbustamiseks võib kasutada sobivat luupi (4.1.6) ja/või käsiloendurit (4.1.8). Vältida sadestunud aineosakeste ekslikku pidamist pisikesteks pesadeks. Uurida kahtlasi objekte tähelepanelikult, kasutades vajaduse korral pesade eristamiseks võõrkehadest suurema suurendusega luupi (4.1.7). Laatuvaid pesasid käsitatakse üksikute pesadena. Juhul kui laatuvad pesad katavad vähem kui ühe neljandiku tassist, tuleb loendada pesad tassi laatuvate pesadeta alalt ning arvutada pesade arv kogu tassi kohta. Juhul kui laatuvad pesad katavad rohkem kui ühe neljandiku tassist, tuleb tass ära visata. 8. Tulemuste arvutamine ja esitamine 8.1. Kasutada pesade loenduse tulemust kõikide 10–300 pesa sisaldavate tasside puhul (vt 8.3 ja 8.4). 8.2. Mikroorganismide arvu 1 ml pastöriseeritud piima kohta annab järgmine valem: d kus: ∑C on punkti 8.1 kohaselt loendatud pesade summa, (n1 + 0,1 n2) d on võrdne proovi kogusega, kus: n1 on esimeses lahjenduses loendatud pesadega tasside arv, n2 on teises lahjenduses loendatud pesadega tasside arv, d esimeste loenduste puhul kasutatud lahjendusaste. Tulemus esitatakse kahe tüvenumbriga. Kui ümardatav number on viis, tuleb see ümardada nii, et sellest vasakul olev number oleks paarisarv. Näide: Lahjendus 10– 2: 278 ja 290 pesa Lahjendus 10– 3: 33 ja 28 pesa Arv/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210-2 | | = 6290,022 | | = 28590 | | = 29000 | | = 2,9 × 104. | 8.3. Juhul kui kõigi loenduste puhul on pesasid vähem kui 10, tuleb registreerida mikroorganismide arv milliliitri kohta kui "vähem kui 10 × d ml kohta"; "d" on madalaima lahjendusastme pöördväärtus. 8.4. Juhul kui kõigi loenduste puhul on pesasid rohkem kui 300, kuid neid on võimalik loendada, tuleb arvutada hinnanguline arv ja korrutada see lahjendusastme pöördväärtusega. Tulemus registreerida kui "mikroorganismide hinnanguline arv ml kohta". 9. Täpsus Rahvusvaheliselt heakskiidetud koostöökatsete tulemused ei ole kättesaadavad. VI. KOLIBAKTERITE LOENDAMINE — PESADE ARVU LOENDAMINE TEMPERATUURIL 30 °C 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit kolibakterite loendamiseks pastöriseeritud piimas, kasutades pesade arvu loendamise tehnikat temperatuuril 30 °C. 2. Määratlus Kolibakterid on bakterid, mis 30 °C juures moodustavad tüüpilisi või ebatüüpilisi pesasid, mis kirjeldatud tingimustel kääritavad gaasi tootes laktoosi. 3. Põhimõte Määratletud piimaproovi kogus segatakse söötmega Petri tassides ja seda inkubeeritakse 30 °C juures 24 tundi. Loendatakse tüüpilised pesad ja vajaduse korral kontrollitakse ebatüüpiliste pesade identsust, tehes katse laktoosi kääritamise võime kontrollimiseks. Seejärel arvutatakse kolibakterite arv 1 ml pastöriseeritud piima kohta. 4. Seadmed ja klaastarvikud Tavapärane, eelkõige järgmine laborivarustus: 4.1. Seadmed 4.1.1. Kuumõhukapp, mis saab töötada temperatuuril 170–175 °C. 4.1.2. Autoklaav, mis saab töötada temperatuuril 121 ± 1 °C. 4.1.3. Inkubaator, milles saab hoida temperatuuri 30 ± 1 °C kogu seadme ulatuses. 4.1.4. Temperatuuri kompenseerimisega pH-meeter täpsusega ±0,1 pH ühikut. 4.1.5. Veevann, milles saab hoida temperatuuri 45 ± 1 °C. 4.1.6. Plaatinairiidiumist või nikkelkroomist varras. 4.2. Klaastarvikud 4.2.1. Sobivate korkidega katseklaasid mahuga 20 ml kontrollsöötme (5.2) hoidmiseks ja kohaste mõõtmetega Durhami torud, mida kasutatakse koos katseklaasidega. 4.2.2. Kolvid mahuga 150–250 ml tahke valiksöötme (5.1) hoidmiseks. 4.2.3. Klaasist või steriilsest tehismaterjalist (vatiga otsast suletud) pipetid, mille kinnise otsa nominaalmaht on 1–10 ml ja väljalaskeava läbimõõt on 1,75–3 mm. 4.2.4. Selgest värvitust klaasist või steriilsest tehismaterjalist Petri tassid, mille puhul alumise tassi seesmine läbimõõt on umbes 90–100 mm. Seesmine sügavus peaks olema vähemalt 10 mm. Põhjas ei tohi olla pesade loendamist häirivaid ebakorrapärasusi. 4.2.5. Klaastarvikute steriliseerimine Klaastarvikuid steriliseeritakse ühel järgmistest meetoditest: a) neid hoitakse kuumõhukapis (4.1.1) temperatuuril 170–175 °C vähemalt tund; b) neid hoitakse autoklaavis (4.1.2) temperatuuril 121 ± 1 °C vähemalt 20 minutit. Autoklaavi kasutamisel tuleks tagada auru küllaldane juurdepääs, näiteks juhul, kui vahendeid steriliseeritakse mahutites, ei tohiks need olla tihedalt suletud, kolbidel või pudelitel peaksid kaaned olema nõrgalt pealeasetatud. Autoklaavis steriliseeritud klaastarvikuid tuleks kuivatada autoklaavist auru välja lastes. Pipette tuleb steriliseerida kuumõhukapis (4.1.1). 5. Sööde 5.1. Violettpunase-sapi-laktoosiagar. Tahke valiksööde. Koostis: Peptoon | 7 g | Pärmiekstrakt | 3,0 g | Laktoos (C12H22O11. H2O) | 10,0 g | Naatriumkloriid (NaCl) | 5,0 g | Sapphappe sool | 1,5 g | Neutraalpunane | 0,03 g | Kristallviolett | 0,002 g | Agar | 10–15 g, sõltuvalt kasutatava agari želeelistest omadustest | Vesi | 1000 ml | Valmistamine Suspendeerida ja lahustada koostisosad vees ja jätta seisma mitmeks minutiks, seejärel segada energiliselt. Kontrollida pH-d pH-meetriga (4.1.4) ning vajaduse korral reguleerida pH naatriumhüdroksiidi või soolhappe lahusega (vähemalt 0,1 mol/l) nii, et pärast keemist oleks see 25 °C juures 7,4 ± 0,1. Ajada aeg-ajalt loksutades kiiresti keema ja jaotada kohe 100–150 ml kogustena steriilsetesse kolbidesse (4.2.2). Jahutada sööde veevannis (4.1.5) temperatuurini 45 ± 1 °C. Söötme kasutamise ajal tuleks kontrollida selle steriilsust (vt 6.4). Kasutada söödet kolme tunni jooksul pärast selle valmistamist. 5.2. Briljantrohelise-laktoosi-sapipuljong. Identifitseerimissööde. Koostis: Peptoon | 10 g | Laktoos (C12H22O11. H2O) | 10 g | Härja veetustatud sapp | 20 g | Briljantroheline | 0,0133 g | Vesi | 1000 ml | Valmistamine Lahustada koostisosad keevas vees Kontrollida pH-d pH-meetriga (4.1.4) ning vajaduse korral reguleerida pH naatriumhüdroksiidi või soolhappe lahusega (vähemalt 0,1 mol/l) nii, et pärast steriliseerimist oleks see 25 °C juures 7,2 ± 0,1. Jaotada sööde 10 ml kogustena katseklaasidesse (4.2.1), milles on Durhami torud. Panna katseklaasidele korgid. Steriliseerida autoklaavi (4.1.2) 121 ± 1 °C juures 15 minutit. Durhami torudes ei tohi pärast steriliseerimist olla õhumulle. Kontrollida söötme pH-d. Juhul kui söödet ei kasutata kohe, tuleb seda säilitada pimedas temperatuuril 0–5 °C mitte kauem kui kuu pärast selle valmistamist. 5.3. Müügilolev kuivsööde Söötme (5.1, 5.2) võib valmistada müügilolevast kuivsöötmest. Järgida tuleb tootja juhiseid. Reguleerida pH, jaotada ja keeta või steriliseerida ning säilitada sööde punktides 5.1 ja 5.2 kirjeldatud viisil. 6. Menetlus 6.1. Sööde Kasutada söödet (violettpunase-sapi-laktoosiagarit) punktis 5.1 kirjeldatud viisil. 6.2. Piimaproovi ettevalmistamine Segada piimaproovi põhjalikult, pöörates proovinõud ümber 25 korda nii, et mikroorganismid jaotuksid võimalikult ühtlaselt. Vältida tuleks vahutamist, vahu tekkimise korral lasta sel hajuda. Segamise ja katsekoguse võtmise vaheline aeg ei tohiks olla pikem kui kolm minutit. 6.3. Petri tasside inokuleerimine 3 ml piimaproovi (6.2) inokuleeritakse, kandes steriilse pipetiga (4.2.3) 1 ml piimaproovi kõigisse kolme tassi (4.2.4). 6.4. Söötme sissekülvamine Külvata violettpunase-sapi-laktoosiagarit (6.1) 12 ml kogustena igasse inokuleeritud tassi. Segada kohe pärast külvamist, keerutades piisavalt Petri tassi ühtlaselt jaotunud pesade saamiseks pärast inkubeermist. Piimaproovi ettevalmistamise ja katsekoguse söötmega segamise vaheline aeg ei tohi olla pikem kui 15 minutit. Steriilsuse kontrollimiseks valmistada inokuleerimata tass 12 ml violettpunase-sapi-laktoosiagariga, mida kasutatakse inokuleeritud tasside puhul. Lasta tahkuda puhtal, jahedal horisontaalsel pinnal kuni söötme hangumiseni. Pärast täielikku tahkumist valada vähemalt 4 ml violettpunast laktoosiga sapiagarit (6.1) inokuleeritud söötme pinnale. Lasta tahkuda. 6.5. Petri tasside inkubeerimine Panna tassid inkubaatorisse (4.1.3). Inkubeerida ümberpööratud tasse. Panna virna mitte rohkem kui kuus tassi. Tasside virnad ei tohi puutuda üksteist ega inkubaatori seinu ja ülaosa. Inkubeerida 30 ± 1 °C juures 24 ± 2 tundi. 6.6. Pesade loendamine 6.6.1. Loendada pesad Petri tassides, mis ei sisalda rohkem kui 150 pesa. Loendada purpurse värvusega pesad, mille läbimõõt on vähemalt 0,5 mm ja mida ümbritseb või ei ümbritse kolibakteritele iseloomulik sade. 6.6.2. Juhul kui mõnedel pesadel on mõni puudulik omadus (nt värvuse või suuruse erinevus, tüüpilistest pesadest erinev sade), tuleb teha identifitseerimiskatse (6.7). 6.7. Identifitseerimiskatse Vastavalt punktis 6.6.2 antud juhistele teha identifitseerimiskatse sobiva arvu (nt kolme kuni viie) ebatüüpilise pesaga, inokuleerides katseklaasidesse varrasnõelaga (4.1.6) briljantrohelise-laktoosi-sapipuljongit (5.2). Inkubeerida katseklaase 30 ± 1 °C juures 24 ± 2 tundi. Pesasid, mis toodavad Durhami torus gaasi, käsitada identifitseeritud kolibakteritena. 7. Tulemuste arvutamine ja esitamine 7.1. Loendada pesad (vt 7.4) Petri tassides, mis ei sisalda rohkem kui 150 pesa. 7.2. Juhul kui tehakse identifitseerimiskatse, tuleb kolibakterite pesade arv arvutada identifitseeritud kolibakterite pesade protsendi alusel. 7.3. Kolibakterite arvu 1 ml pastöriseeritud piima kohta annab järgmine valem: n kus: ∑C on piimaproovi (3 ml) uurimisel leitud kolibakterite pesade koguarv (7.1, samuti 7.2), n on uuritud proovi milliliitrite arv (6.3) (3 ml). Tulemus esitatakse kahe tüvenumbriga, kui pesi on rohkem kui 100. Kui ümardatav number on viis, tuleb see ümardada nii, et sellest vasakul olev number oleks paarisarv. Juhul kui kõigi loenduste puhul on pesasid rohkem kui 150, tuleb tulemus esitada kui "kolibakterite hinnanguline arv 1 ml kohta". 8. Täpsus Rahvusvaheliselt heakskiidetud koostöökatsete tulemused ei ole kättesaadavad. VII. KEHARAKKUDE LOENDAMINE Käesolevas juhendis kirjeldatakse kahte keharakkude loendamise standardmeetodit: A. Mikroskoopiline meetod B. Fluoro-optoelektrooniline meetod A. Mikroskoopiline meetod 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit keharakkude loendamiseks toorpiimas. Käesolevas juhendis kirjeldatakse meetodit rakkude loendamiseks piimaproovis fluoro-optoelektroonilise meetodi (vt B.1) täpsuse kalibreerimiseks ja kontrollimiseks. 2. Määratlus Käesolevas juhendis on keharakud sellised rakud, mille tuuma värvust saab selgelt muuta metüleensinisega, näiteks valgelibled ja epiteelirakud. 3. Põhimõte 0,01 ml piima pannakse 1 cm2 ulatuses objektiklaasile. Piimakile kuivatatakse ning selle värvi muudetakse. Rakud loendatakse mikroskoobi abil. Määratletud alalt loendatud keharakkude arv korrutatakse tööteguriga, et saada rakkude arv milliliitri kohta. 4. Reaktiivid Tuleb kasutada analüütiliselt puhtaid kemikaale. Värvilahus Koostis: Metüleensinine | 0,6 g | 99 protsendine etanool | 54,6 ml | 1,1,1-triklooretaan või tetrakloroetüleen | 40,6 ml | Jää-äädikas | 6,6 ml | Hoiatus Tetrakloroetüleen on mürgine. Selle kasutamisel tuleb värvilahus valmistada ja seda tuleb kasutada tõmbekapis. Valmistamine Segada etanool ja 1,1,1-triklooretaan või tetrakloroetüleen pudelis ning soojendada veevannis temperatuurini 60–70 °C. Lisada metüleensinine, segada hoolikalt, jahutada külmikus 12–24 tunni jooksul temperatuurini 4 °C ning lisada jää-äädikas. Filtreerida filtriga, mille poori suurus on vähemalt 10–12 mikronit, ja säilitada värvilahust õhukindlas pudelis. Osakeste või sademe tekkimise korral filtreerida uuesti enne kasutamist. 5. Seadmed ja klaastarvikud 5.1. Mikroskoop suurendusega × 500 – × 1000. 5.2. Mikrosüstal mahuga 0,01 ml, täpsusega vähemalt ±2 %. 5.3. Objektiklaas piimakile jaoks tähistatud alaga 20 × 5 mm või standardne objektiklaas ja šabloon suurusega 20 × 5 mm piimakile jaoks. 5.4. Nivelleeritud kuumutusplaat (30–50 °C) objektiklaasi kuivatamiseks. 5.5. Ventilaator (föön) piimakile kuivatamiseks. 5.6. Veevann, milles saab hoida temperatuuri 30–40 °C piimaproovi soojendamiseks. 5.7. Objektmikromeeter jagudega 0,01 mm. 6. Menetlus 6.1. Piimaproov Piimaprooviga peab katse tegema kuue tunni jooksul pärast proovi võtmist. Proovi säilitamise ajal ei tohi selle temperatuur olla kõrgem kui 6 °C. Vältida tuleks külmumist. 6.2. Proovi ettevalmistamine laboratooriumis Soojendada proovi veevannis (5.6) temperatuurini 30–40 °C. Seejärel segada hoolikalt. Jahutada temperatuurini, mille juures kalibreeriti mikrosüstal (5.2), nt 20 °C. 6.3. Objektiklaaside eeltöötlus Objektiklaasid (5.3) puhastada näiteks etanooliga, kuivatada tolmuvaba paberiga, kuumutada leegil ja jahutada. Tolmu klaasidele sattumise vältimiseks säilitada neid karbis. 6.4. Piimakile ettevalmistamine Võtta mikrosüstlaga (5.2) 0,01 ml piima eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud proovist. Puhastada hoolikalt piimaga kokkupuutes olnud mikrosüstla välispind. Asetada süstal objektiklaasile (5.3), tõmmates esmalt vormi (20 × 5 mm) välispiirid. Seejärel täita ala võimalikult ühtlaselt. Kuivatada piimakile nivelleeritud kuumutusplaadil (5.4) kuni see on täiesti kuiv. Ette valmistada ja uurida tuleb vähemalt kahte piimakile igast piimaproovist. 6.5. Piimakilede värvuse muutmine Piimakiled kasta värvilahusesse (4) kümneks minutiks. Kuivatada, vajaduse korral kasutada kuivatamise lõpus ventilaatorit (5.5). Kasta piimakilesid kraanivette seni, kuni kogu ülearune värv on ära pestud. Seejärel kuivatada uuesti ja säilitada tolmu eest kaitstult. 6.6. Mikroskoobi vaatevälja kalibreerimine Sõltuvalt valitud suurendusest (× 500 – × 1000) määrata objektmikromeetriga (5.7) mikroskoobi vaateväli. 7. Loendamine ja arvutamine 7.1. Rakkude loendamine Kasutada mikroskoopi (5.1). Rakkude loendamise asemel loendatakse üksnes rakutuumad. Need on kergesti äratuntavad ning loendamiseks peab vähemalt pool tuumast olema näha mikroskoobi vaateväljas. Loendada tuleb ribade või mikroskoobi vaateväljade kaupa piimakile keskmises kolmandikus; vältida loendamist üksnes kile äärtelt valitud ribadelt või väljadelt. Vähemalt kord kuus tuleb kontrollida piimakule hoolikat ettevalmistust ja seega tulemuste usaldusväärsust, loendades rakke piimakile eri osadelt. Rakke võib loendada ka süsteemselt jaotatud mikroskoobi väljadelt nii, et kõik kile osad on võrdselt esindatud. 7.2. Loendatavate rakkude miinimumarv Kuna keharakkude mikroskoopilist loendust võib kasutada ka automaatsete ja mehaaniliste loendusmeetodite standardiseerimiseks, ei tohi loenduste variatsioonikordaja identsete proovide puhul olla suurem kui elektroonilistel vahenditel. 400000–600000 rakku milliliitri kohta sisaldava piimaproovi variatsioonikordaja ei tohi olla suurem kui 5 %. Iga proovi puhul loendatavaid keharakke peab vastavalt Poissoni jaotuse omadustele olema vähemalt 400, et korratavuse kriteerium oleks täidetud. Poissoni jaotus eeldab, et: M = V = s2, kus M on keskväärtus, V on variatsioon ja s on standardhälve. Variatsioonikordaja on: CV = M või CV = või CV = M (keskmine) on loendatud osakeste (rakkude) arv (s.o 400, kui CV = 5 %). 7.3. Tööteguri arvutamine Töötegur arvutatakse vastavalt punktile 7.3.1 või 7.3.2, kasutades 0,01 ml piima. 7.3.1 Loendamine piimakile ribadelt Ribad, millelt rakke loendatakse, on 5 mm pikad. Riba laius võrdub objektmikromeetri (5.7) abil määratud mikroskoobi vaatevälja läbimõõduga. Töötegur = 20 × 100d × b kus: d on objektmikromeetri (5.7) abil määratud mikroskoobi vaatevälja läbimõõt millimeetrites, b on ribade arv, millelt on rakud täielikult loendatud. 7.3.2. Loendamine mikroskoobi väljadelt kile keskmises kolmandikus või võrksüsteemiga Töötegur = Π × d × s = 12 732d2× s kus: d on objektmikromeetri (5.7) abil määratud mikroskoobi vaatevälja läbimõõt millimeetrites, s on väljade arv, millelt on rakud loendatud. 7.4. Rakusisalduse arvutamine Loendatud keharakkude arv (7.1 ja 7.2) korrutatakse tööteguriga (7.3), et saada rakkude arv milliliitri kohta. 7.5. Täpsus Variatsioonikordaja (vt 7.2) ei tohi olla suurem kui 5 %. Rahvusvaheliselt heakskiidetud koostöökatsete tulemused ei ole kättesaadavad. B. Fluoro-optoelektrooniline meetod 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit, mida võib pärast nõuetekohast kalibreerimist (vt A.1) kasutada keharakkude loendamiseks keemiliselt konserveeritud või konserveerimata toorpiimas. 2. Määratlus Käesolevas juhendis on keharakud osakesed, mille tuumas on minimaalne DNA värvumisest põhjustatud fluorestsentsi intensiivsus. 3. Põhimõte Osa proovist (nt 0,2 ml) segatakse põhjalikult puhverlahuse ja fluorestseeruva lahusega. Seejärel kantakse osa kõnealusest segust õhukese kilena pöörlevale kettale, mida kasutatakse objektitasandina mikroskoobi jaoks. Iga rakk toodab elektriimpulsi, mida võimendatakse ja mis seejärel registreeritakse. Keharakkude arv trükitakse välja tuhandikes milliliitri kohta. 4. Reaktiivid Kasutada tuleb analüütiliselt puhtaid kemikaale, kui ei ole ettenähtud teisiti. Vesi peaks olema kas destilleeritud või deioniseeritud või samaväärse puhtusastmega. 4.1. Puhverlahus Koostis: Kaaliumvesinikftalaat | 51,0 g | Kaaliumhüdroksiid | 13,75 g | Polüetüleenglükool-mono-p(1,1,3,3-tetrametüülbutüül)-fenüüleeter (nt Triton X-100), 1 mahuprotsent | 10 ml | pH 5,7–5,9. Lisada vett mahuni 10000 ml. | | Valmistamine Koostisosad segatakse. Silitada õhukindlalt mitte kauem kui seitse päeva. 4.2. Fluorestseeruv lahus (põhilahus) Koostis: Etiidiumbromiid | 1,0 g | Lisada vett mahuni 1000 ml. Valmistamine Etiidiumbromiid lahustatakse vees. Säilitada valgus-ja õhukindlas pudelis mitte kauem kui kaks kuud. 4.3. Fluorestseeruv lahus (töölahus) 20 ml põhilahust (4.2) segatakse puhverlahusega (4.1) kuni mahuni 1000 ml. Töölahust ei tohiks kasutada kauem kui seitse päeva. 4.4. Pesemislahus Koostis: Puhverlahus (4.1) | 10 ml | Polüetüleenglükool-mono-p(1,1,3,3-tetrametüülbutüül)-fenüüleeter (nt Triton X-100), 1 mahuprotsent | 10 ml | Ammoniaak, 25 mahuprotsenti | 25 ml | Lisada vett mahuni 10000 ml. Valmistamine Koostisosad segatakse. Säilitada ei tohiks kauem kui 30 päeva. 5. Seadmed ja klaastarvikud 5.1. Fluorestsents-optilisel põhimõttel töötav loendamisseade. Märkus Enne kasutust tuleb seade kalibreerida. Sellega määratakse kindlaks loendatavate osakeste hulga ja selle läviväärtuse suhe, millest ülalpool rakud loendatakse. Seade kalibreeritakse tootja juhiste järgi, kasutades proove, mille rakusisaldus on määratud mikroskoopilise meetodiga (A). 5.2. Tsirkulatsiooniga veevann, milles saab hoida temperatuuri 40 ± 1 °C. 5.3. Kohase sulguriga katseklaas mahuga umbes 15 ml. 6. Piimaproov 6.1. Proovi tuleb säilitada madalal temperatuuril katseklaasis (5.3). Juhul kui proovi ei konserveerita keemiliselt, ei tohiks rakke loendada 24 tunni jooksul pärast lüpsmist, kuna rakkude arv oleks liiga väike. Säilitustemperatuur ei tohi tõusta üle 6 °C. 6.2. Konserveerimine Piima tuleb keemiliselt konserveerida 24 tunni jooksul. Konserveerida tuleb võimalikult kiiresti pärast proovi võtmist. 6.2.1. Proovi saab keemiliselt konserveerida, lisades ühe järgmistest konservantidest: - ortoboorhape: ortoboorhappe lõppkontsentratsioon proovis ei tohi olla suurem kui 0,6 g/100 ml. Sellist konserveeritud proovi võib säilitada järgnevad 24 tundi temperatuuril 6–12 °C, - kaaliumdikromaat: kaaliumdikromaadi lõppkontsentratsioon ei tohi olla suurem kui 0,2 g/100 ml. Sellist konserveeritud proovi võib säilitada kuni 72 järgnevat tundi temperatuuril 6–12 °C, - naatriumasiid: naatriumasiidiga, mille lõppkontsentratsioon võib olla kuni 0,024 g/100 ml, saab proove konserveerida tingimusel, et proov jahutatakse temperatuurini 6–12 °C kohe pärast proovi võtmist ning rakud loendatakse 48 tunni jooksul pärast proovi võtmist, - bronopol: bronopoliga, mille lõppkontsentratsioon võib olla kuni 0,05 g/100 ml, saab proove konserveerida tingimusel, et proov jahutatakse temperatuurini 6-12 °C kohe pärast proovi võtmist ning rakud loendatakse 72 tunni jooksul pärast proovi võtmist. 6.2.2. Ortoboorhappega eelnevalt konserveeritud proovi võib veel 48 tunniks konserveerida kaaliumdikromaadiga. Märkus Kaaliumdikromaadiga konserveeritud proovide puhul tuleb järgida kohalikke heitvete ärajuhtimise nõudeid. 7. Menetlus 7.1. Proovi eeltöötlus Uuritavat piima säilitatakse pärast lüpsmist vähemalt 24 tundi temperatuuril umbes 2–6 °C. Loendamist ei ole soovitatav teha lüpsmise päeval ilma proovi eeltöötluseta, kuna tulemused võivad olla liiga väikesed. Juhul kui sellisest proovist on vaja loendus teha, tuleb seda vähemalt kolm tundi enne töödelda kaaliumdikromaadiga (vt 6.2.1). 7.2. Ettevalmistus Eeltöödeldud proovi (7.1) või vähemalt päev vana töötlemata proovi soojendatakse veevannis (5.2) temperatuurini umbes 40 °C. Seejärel säilitatakse proovi toatemperatuuril seni, kuni loendused on tehtud. 7.3. Rakkude loendamine Rakud loendatakse loendamisseadmega (5.1) 15 minuti jooksul pärast soojendamist (vt 7.2). Vahetult enne loendamist segatakse proov põhjalikult, et keharakud jaotuksid võimalikult ühtlaselt. Proovi edasine lahustumine ja ettevalmistamine toimub seadmes automaatselt. 8. Täpsus Rahvusvaheliste koostöökatsete korratavuse (r) ja reprodutseeritavuse (R) väärtused ei ole kättesaadavad. Edaspidi nähakse ette täpsust iseloomustavad andmed. Riigi tasandil kättesaadavad andmed võimaldavad anda järgmised hinnangulised näitajad: 1) Rakkude arv 400000 – 500000 /ml - korratavuse standardhälve: sr = 20000 rakku/ml (samaväärne 5–4protsendise variatsioonikordajaga) - reprodutseeritavuse standardhälve: sR = 40000 rakku/ml (samaväärne 10–8protsendise variatsioonikordajaga) 9. Täpsuse kontrollimine Täpsuse kontrollimiseks kasutatakse proove, millel on mikroskoopilise rakuloendusmeetodiga riigi tugilaboris kindlakstehtud teadaolev rakusisaldus. VIII. ANTIBIOOTIKUMIDE JA SULFOONAMIIDIDE AVASTAMINE RAKENDUSALA JA -ULATUS Käesolevas juhendis kirjeldatakse standardmeetodit antibiootikumide ja sulfoonamiidide avastamiseks toorpiimas ja kuumtöödeldud piimas. Standardmeetod hõlmab järgmisi meetodeid: A. Kvalitatiivne meetod Käesolev meetod on algmeetod, mille järgi valitakse antibiootikume, k.a sulfoonamiide sisaldavad piimaproovid. Kirjeldatud meetod on üks mitmest samasugusest meetodist, mille puhul kasutatakse katseorganismi Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATTC 10149. Käesolev meetod valiti esindama kõnealuseid katseid. B. Tulemuste kinnitamise ja penitsilliini identifitseerimise meetod Käesolevat meetodit tuleb kasutada kvalitatiivse meetodi tulemuste kinnitamiseks, penitsilliini identifitseerimiseks ja selle kontsentratsiooni kindlaks tegemiseks. A. Kvalitatiivne meetod 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse antibiootikumide ja sulfoonamiidide kvalitatiivset avastamist toorpiimas ja kuumtöödeldud piimas, kui nende sisaldus on tabelis sätestatud piirväärtustest suurem. Eri antibiootikumide ja sulfoonamiidide avastatavad kontsentratsioonid [1] | Katse tundlikkus | Kõik negatiivsed | Kõik positiivsed | Bensüülpenitsilliin | 0,002 | 0,006 | Ampitsilliin | 0,002 | 0,005 | Kloksatsilliin | 0,015 | 0,035 | Naftsilliin | 0,006 | 0,011 | Tetratsükliin | 0,10 | 0,40 | Oksütetratsükliin | 0,20 | 0,45 | Kloortetratsükliin | 0,15 | 0,50 | Klooramfenikool | 7 | 15 | Dihüdrostreptomütsiin | 4 | 13 | Neomütsiin | 1 | 22 | Kanamütsiin | 9 | 28 | Bakitratsiin | 0,06 | 0,14 | Erütromütsiin | 1 | 2,25 | Rifamütsiin | 0,01 | 0,14 | Diafenüülsulfoon | 0,01 | 0,1 | Sulfametasiin (sulfadimediin) | 0,5 | 1 | Pärmiekstrakt | 2 g | Peptoon | 5 g | Lihaekstrakt | 1 g | Naatriumkloriid | 5 g | Agar | 10-15 g | Vesi | 1000 ml | Valmistamine Lahustada koostisosad vees. Lasta aeg-ajalt loksutades keema. Reguleerida pH nii, et see oleks pärast steriliseerimist 25 °C juures 7,4 ± 0, 1. Segu jaotada 10 ml kogustena katseklaasidesse längagari tegemiseks või 100 ml kogustena pudelitesse. Steriliseerida 121 ± 1 °C juures 15 minutit. 5.1.2. Agarsööde Koostis: Naatriumkloriid | 2 g | Agar | 15 g | Vesi | 1000 ml | Trimetoprimi või tetroksoprimi lahus (vt 5.1.3) | 10 ml | Valmistamine Koostisosad, välja arvatud trimetoprim või tetroksoprim, lahustada vees. Lasta aeg-ajalt loksutades keema. Lisada trimetoprim või tetroksoprim ja steriliseerida 121 ± 1 °C juures 15 minutit; reguleerida pH nii, et see oleks pärast steriliseerimist 25 °C juures 7,0 ± 0, 1. 5.1.3. Trimetoprimi või tetroksoprimi lahus Koostis: Trimetoprim | 5 mg | või tetroksoprim | 30 mg | 99 protsendine etanool | 5 ml/30 ml | Vesi | mahuni 1000 ml | Valmistamine Lahustada trimetoprim või tetroksoprim etanoolis (5 või 30 ml) ja lahjendada veega. 5.1.4. Toitaine Koostis: Pärmiekstrakt | 0,75 mg | Glükoos | 5,0 mg | Lahustuv tärklis | 8,0 mg | Bromokresoolpurpur | 0,025 g | Vesi | mahuni 50 ml | Valmistamine Lahustada toitained ja indikaator vajaduse korral kuumutades vees ja steriliseerida filtreerimise teel. Toitaine on müügil tablettidena. 5.2. Penitsilliini standardlahused 5.2.1. Sobivas steriilses korgiga pudelis valmistada penitsilliini lahus kontsentratsiooniga 60 μg/ml = (100 RÜ/ml), lahustades kristallilise naatriumi või kaaliumbensüülpenitsilliini steriilses destilleeritud vees. 5.2.2. Valmistada penitsilliini töölahus, lisades 1,25 ml penitsilliinilahusele (5.2.1) steriilset destilleeritud vett mahuni 1000 ml. See töölahus sisaldab 0,075 μg (= 0,125 RÜ/ml). 5.2.3. Valmistada 0,004 μg/ml (= 0,0067 RÜ/ml) sisaldav penitsilliini standardlahus, lisades 71 ml inhibeerivate lisanditeta piima (5.3) 4 ml penitsilliini standardlahusele (5.2.2) ning segades. 5.2.4. Punktides 5.2.1 ja 5.2.3 nimetatud penitsilliinilahused tuleb valmistada katse tegemise päeval. 5.3. Inhibeerivate lisanditeta piim Valmistada kontrollproovina inhibeerivate lisanditeta piim, lahustades steriilses destilleeritud vees lõssipulbri (10 % m/v), mille eelneva analüüsimise tulemusel on leitud, et see on vaba inhibeerivatest ainetest. Teise võimalusena võib jaotada pudelitesse piisava koguse värsket pakendamata piima, mille eelneva analüüsimise tulemusel on leitud, et see on vaba inhibeerivatest ainetest; kuumutada tund temperatuuril 100 °C ja seejärel säilitada külmikus temperatuuril 0–6 °C kuni nädal. 5.4. Katseorganism 5.4.1. Katseorganismina kasutatakse mikroobi Bacillus stearothermophilus var. calidolactus, tüvi ATCC 10149. See tüvi on identne tüvega C 953. 5.4.2. Katsekultuuri säilitamiseks valmistada tüvikultuur. Katsekultuuri hoitakse agarsöötme kaldpinnal (5.1.1). Längagar inokuleeritakse katsekultuuri silmust kasutades viirgude kaupa ning seda inkubeeritakse aeroobselt 63 ± 1 °C juures 48 tundi. Pärast inkubeerimist suletakse katseklaas steriilse kummist punniga. Sel viisil saadud tüvikultuuri võib hoida külmikus temperatuuril 0–5 °C mitu kuud. 5.5. Katsekultuur (eossuspensioon) 5.5.1. 20 ml agarsöödet (5.1.1) kantakse aseptiliselt steriilsesse Petri tassi (4.2.2) ja jahutatakse toatemperatuurini. 5.5.2. Kanda steriilse pipetiga (4.2.4) 5 ml steriilset destilleeritud vett tüvikultuuri (5.4.2) sisaldavasse katseklaasi ja pesta eosed steriilse silmusega längagarilt maha. Seda eossuspensiooni tuleb hoida temperatuuril 0–5 °C ja kasutada 36 tunni jooksul. 5.5.3. Kanda steriilse pipetiga (4.2.4) 0,5 ml eossuspensiooni (5.5.2) kultuurialusele (5.5.1) ja tõmmata inokulaat kõverdatud klaaspulgaga põhjalikult kogu pinnale. Inkubeerida 63 ± 1 °C juures (4.1.1) 16–18 tundi. Tüvikultuurist (5.4.2) või kultuurist, mis on vanem kui 36 tundi, tuleb subkultuurid valmistada vähemalt kaks korda alla 36 tunniste vahedega. 5.5.4. Kanda steriilse pipetiga (4.2.4) 10 ml destilleeritud vett kultuurialusele (5.5.3) ja eemaldada klaaspulgaga pinnalt eosed suspensioonisse. Kanda eossuspensioon pudelisse (4.2.3), mis sisaldab 250 ml steriilset destilleeritud vett. Sulgeda pudel ja loksutada põhjalikult. Kultuure, millest ei valmistata subkultuure kohe, tuleks säilitada külmikus temperatuuril 0–6 °C. 5.5.5. Eossuspensioonis peab olema 5-10 miljonit elujõulist pesa milliliitri kohta mikroobide arvu loendamise agarsöötmel, mida on inkubeeritud 63 ± 1 °C juures 16–18 tundi. Eossuspensioon peab olema ühtlaselt sogane ning juhul, kui see sisaldab kübemeid või sadet, tuleks see ära visata ja tüvikultuurist (5.4.2) uus suspensioon valmistada. 5.6. Katseklaaside/ampullide ettevalmistamine 5.6.1. Sulatada agarsööde (5.1.2) ja jahutada temperatuurini 55 °C. 5.6.2. Lisada katseklaasis või pudelis üks osa värsket eossuspensiooni (5.5.4) viiele osale agarsöötmele (5.6.1) ning segada põhjalikult. 5.6.3. Kanda 0,3 ml inokuleeritud söödet (5.6.2) steriilsesse katseklaasi või ampulli nii, et arvutuse kohaselt moodustaks see 5 mm paksuse kihi, sulgeda korgi või kapsliga või tipu kokku sulatades. Lasta katseklaasidel või ampullidel jahtuda püstises asendis, lasta söötmel tahkuda ja seejärel seista vähemalt 12 tundi. 5.6.4. Katseklaase või ampulle võib kasutada samal päeval, kuid neid võib säilitada mitu kuud tingimusel, et need jahutatakse kohe pärast valmistamist ja hoitakse temperatuuril 0–6 °C. 6. Menetlus 6.1. Proove tuleks analüüsida niipea kui võimalik, eelistatult 24 tunni jooksul pärast proovi võtmist, säilitades neid vahepeal temperatuuril 0-5 °C. Juhul kui proove ei ole võimalik analüüsida 24 tunni jooksul, tuleks neid penitsilliini inaktivatsiooni vähendamiseks säilitada sügavkülmas (–30 kuni –15°C). 6.2. Märgistada iga katseklaas/ampull (5.6) loetavalt ja kustutamatult. Eemaldada kapsel või punn. Asetada nõutav arv uuritavaid proove või kontrollproove (5.2 ja 5.3) sobivale statiivile (4.1.3). 6.3. Lisada igasse katseklaasi/ampulli 50 mikroliitrit punktis 5.1.4 nimetatud toitainet. 6.4. Segada piimaproovi põhjalikult ja kanda süstla (4.1.4) abil 0,1 ml vastavasse sildistatud katseklaasi/ampulli. Iga proovi kandmiseks kasutada puhast ühekordselt kasutatavat otsa. 6.5. Korrata punktis 6.4 kirjeldatud toimingut, kasutades piimaproovi asemel 0,004 μg/ml (= 0,0067 RÜ/ml) penitsilliini sisaldavat penitsilliini standardlahust (5.2.3). 6.6. Korrata punktis 6.4 kirjeldatud toimingut, kasutades piimaproovi asemel inhibeerivate lisanditeta piima kontrollproovi (5.3). 6.7. Sulgeda katseklaasid/ampullid ja asetada statiiv koos katseklaasidega/ampullidega veevanni temperatuuril 63 ± 1 °C (4.1.2) vähemalt 2½–2¾ tunniks. 6.8. Võtta statiiv koos katseklaasidega/ampullidega veevannist. 6.9. Vaadata katsesöötme värvust (vt 7). 7. Tulemuste tõlgendamine 7.1. Katsesöötme purpurne värvus mistahes piimaproovi või kontrollproovi katseklaasis/ampullis osutab antibiootikumide või sulfoonamiidide olemasolule proovis leheküljel 39 esitatud tabelis näidatud tasemel "positiivne". Penitsilliini standardlahust (6.5) sisaldavate katseklaaside/ampullide värvuse jäämine purpurseks osutab katsesöötme piisavale tundlikkusele. 7.2. Üksnes osaline katsesöötme purpurne värvus või mistahes piimaproovi katseklaasi/ampulli ebaühtlane värvus osutab inhibeerivate ainete olemasolule proovis leheküljel 39 esitatud tabelis näidatud positiivse ja negatiivse taseme vahel. 7.3. Katsesöötme kollane värvus mistahes piimaproovi või kontrollproovi katseklaasis/ampullis osutab katseorganismi inhibeerivate ainete puudumisele. 7.4. Juhul kui kõikides katseklaasides/ampullides, kaasa arvatud negatiivses kontrollproovis, on purpurne värvus, ei sisalda katseklaasid/ampullid elujõulisi eoseid ning proove tuleb värskelt valmistatud katsematerjalidega uuesti analüüsida. 8. Tulemuste kontrollimine 8.1. Kontrollida katse tulemused kõikide proovide puhul B meetodiga punktides 7.1 ja 7.2 kirjeldatud reaktsioonide alusel. Juhul kui piimaproove on vaja enne tulemuste kontrollimist säilitada, tuleb need antibiootikumide lagunemise vältimiseks sügavkülmutada. B. Penitsilliini olemasolu kontrollimise ja selle kontsentratsiooni kindlakstegemise meetod 1. Rakendusala ja -ulatus Käesolevas juhendis kirjeldatakse penitsilliinide või muude antibiootikumide olemasolu kontrollkatset ning meetodit penitsilliini kontsentratsiooni kindlaks tegemiseks positiivse reaktsiooniga (A.7.1) või kahtlase reaktsiooniga (A.7.2) piimaproovides. Eri antibiootikumide tundlikkus käesoleva meetodi puhul Vt A.1 2. Määratlus 2.1. Piimaproov sisaldab antibiootikume, k.a sulfoonamiidi, kui proov moodustab kirjeldatud meetodil ümber ketta vähemalt 2 mm suuruse selge inhibitsioonivööndi. 2.2. Juhul kui antibiootikume, k.a sulfoonamiidi sisaldav proov (2.1), millele on lisatud penitsillinaasi (beetalaktamaas), ei moodusta selget vööndit või moodustab väiksema läbimõõduga selge vööndi kui ilma penitsillinaasita, on inhibeerivaks aineks kas penitsilliin või penitsilliin koos muu antibiootikumiga, k.a sulfoonamiid. 2.3. Juhul kui penitsillinaas ei inaktiveeri vööndit, ei ole piimaproovis inhibeerivaks aineks penitsilliin, vaid selleks võib olla muu jääkaine (vt direktiivi 85/3397/EMÜ A lisa VI peatüki punkte A.1.f ja 2.b). Penitsillinaas ei inaktiveeri või inaktiveerib üksnes osaliselt mõnesid poolsünteetilisi penitsilliine, nt naatriumkloksatsilliini, või on poolsünteetilised penitsilliinid penitsillinaasi vastu täiesti resistentsed ning seepärast ei käsitata neid penitsilliinina (vt 7.3). 3. Põhimõte Analüüsitava piimaga immutatud imav paber asetatakse mikroobiga Bacillus stearothermophilus var. calidolactis inokuleeritud agarsöötme pinnale. Inkubeerimine, mille tulemuseks on organismi normaalne kasv, muudab agari häguseks. Organismi kasvu inhibeerivate ainete olemasolule piimas viitab puhas vöönd ümber ketta. Puhta vööndi suurus sõltub lisaks muule piimas sisalduva inhibeeriva aine kontsentratsioonist ja tüübist. 4. Seadmed, klaastarvikud ja varustus 4.1. Seadmed 4.1.1. Vt A.4.1. 4.1.2. Veevann, milles saab hoida temperatuuri 80 ± 1 °C. 4.2. Klaastarvikud Vt A.4.2. 4.3. Inhibeerivate lisanditeta (eelistatult eksikaatoris hoitud) paberkettad läbimõõduga 9–13 mm, mis imavad ligikaudu 130 mg piima. 5. Sööde, standardlahused, penitsillinaasi lahus, reaktiivid, katseorganism jne Söötme koostisosad peavad olema bakterioloogiliseks otstarbeks sobivad. Kasutada tuleb klaasnõus destilleeritud vett või vähemalt samaväärse puhtusastmega demineraliseeritud vett. Vesi ei tohi sisaldada katseorganismi inhibeerivaid aineid. 5.1. Sööde 5.1.1. Agarsööde (A.5.1.1) 5.1.2. Katsesööde inhibeerivate ainete avastamiseks Koostis: Pärmiekstrakt | 2,5 g | Trüptoon | 5 g | Glükoos | 1 g | Trimetoprimi või tetroksoprimi lahus (A.5.1.3) | 10 ml | Agar | 10–15 g (sõltuvalt želeelistest omadustest) | Vesi | 1000 ml | Valmistamine Tahked koostisosad lahustatakse täielikult enne trimetoprimi või tetroksoprimi lahuse lisamist kuumutades ja segades vees. Pärast trimetoprimi või tetroksoprimi lahuse lisamist tuleb pH reguleerida nii, et pärast steriliseerimist oleks see 25 °C juures 8,0 ± 0, 1. Söödet steriliseeritakse 121 ± 1 °C juures 15 minutit. 5.2. Penitsilliini standardlahused piimas Vt A.5.2. Inhibeerivate ainete sisalduse kindlaks määramiseks (8) teha inhibeerivate lisanditeta piimas (A.5.3) penitsilliini standardlahused järgmiste kontsentratsioonidega: a) 0,004 μg/ml (0,0067 RÜ/ml) b) 0,006 μg/ml (0,01 RÜ/ml) c) 0,03 μg/ml (0,05 RÜ/ml) d) 0,06 μg/ml (0,1 RÜ/ml) 5.3. Penitsillinaasi lahus 5.3.1. Lahustada piisavalt penitsillinaasi (beetalaktamaasi) steriilses destilleeritud vees kontsentratsiooniga 1000 Ü/ml. Seda lahust võib säilitada eelistatult väikeste kogustena temperatuuril 0–5 °C kuni neli nädalat. Märkus Penitsillinaasi kohta puudub ühtne rahvusvaheline standard. Käesoleva meetodi puhul eeldatakse, et 10 ühikut penitsillinaasi on piisav 0,6 μg (= 1 RÜ) penitsilliini inaktiveerimiseks. Penitsillinaasi puhul, mille tugevust ei teata, on vaja kontrollida selle eelduse kehtivust. Juhul, kui see ei kehti, on vaja vastavalt muuta penitsillinaasi lahuse kontsentratsiooni. 5.3.2. Penitsillinaasi lahuse asemel võib kasutada müügilolevaid penitsillinaasiga valmistatud kettaid, juhul kui kontrollimisel leitakse, et need sisaldavad vajaliku koguse penitsillinaasi. 5.4. Katseorganism Vt A.5.4. 5.5. Katsekultuur (eossuspensioon) Vt A.5.5. 5.6. Katsealuste valmistamine 5.6.1. Sulatada inhibeerivate ainete katsesööde (5.1.2) ja jahutada temperatuurini 55 °C. 5.6.2. Lisada pudelis üks osa värsket eossuspensiooni (5.5) nii mitmele osale inhibeerivate ainete avastamise katsesöötmele (5.1.2), mis annab vajaliku pesade tiheduse inokuleeritud katsesöötmes, ning segada põhjalikult. 5.6.3. Kanda inokuleeritud katsesööde steriilsesse eelnevalt temperatuurini 55 °C soojendatud Petri tassi (A.4.2.2), moodustades 0,6–0,8 mm paksuse kihi. Petri tassi puhul seesmise läbimõõduga 140 mm on 0,8 mm paksuse kihi saamiseks vaja 15 ml katsesöödet. 5.6.4. Asetada Petri tassid eelnevalt vesiloodiga kontrollitud horisontaalsele pinnale, eemalda kaaned ja lasta agarsöötmel tahkuda. Pärast söötme tahkumist asendada tassidel kaaned ja seejärel pöörata tassid ümber kondenseerumise vähendamiseks agarsöötme pinnal. 5.6.5. Sel viisil valmistatud katsealuseid kasutatakse eelistatult samal päeval, kuid neid võib ka säilitada kuni kaks nädalat tingimusel, et need pannakse kohe pärast valmistamist suletud polüetüleenkotti ja hoitakse seal temperatuuril 5 °C. 5.6.6. Proovide identifitseerimiseks märgistada katsealuste põhjad. 6. Menetlus 6.1. Proovi ettevalmistamine 6.1.1. A meetodil positiivse või kahtlase tulemuse (A.7.1 ja A.7.2) andnud proove tuleb uuesti analüüsida, identifitseerida neis penitsilliin ja määrata selle sisaldus. 6.1.2. Esmalt kuumutatakse kõnealuseid piimaproove 80 ± 1 °C juures 10 minutit, et vältida termolabiilsete mittespetsiifiliste inhibeerivate lisandite mõju. 6.1.3. Pärast põhjalikku segamist kantakse umbes 10 ml kuumutatud katsepiima sobivasse steriilsesse laia suuga pudelisse. Piimale lisatakse umbes 0,4 ml penitsillinaasi lahust (5.3) ja segatakse põhjalikult. 6.2. Inhibeerivate lisandite avastamine 6.2.1. Kasta paberketas (4.3) puhtaid tange kasutades piimaproovi (6.1.2). Eemaldada liigne piim, tõmmates ketast katsepudeli serva vastu. Asetada ketas pikali katsealuse (5.6) pinnale ja suruda see õrnalt tangidega maha. 6.2.2. Eri piimaproovidega kettad peavad olema üksteisest vähemalt 20 mm ja aluse servast vähemalt 10 mm kaugusel. 6.2.3. Tundlikkuse kontrollimiseks tuleb penitsilliini standardlahusesse (5.2) kastetud kettad (4.3) asetada korrapäratult piimaproovi ketaste vahele sellise tihedusega, et nende arv moodustaks vähemalt 2 % piimaproovi ketaste arvust; iga katse jooksul tuleb kasutada vähemalt viit standardlahuse ketast. 6.2.4. Kui kõik kettad on korrapäratult agarsöötmele pandud ja märgistatud, pöörata alused ümber ja inkubeerida 63 ± 1 °C juures 2½–5 tundi. 6.2.5. Pärast inkubeerimist uuritakse aluseid sobiva valguse käes selgete inhibitsioonivööndite olemasolu kindlakstegemiseks paberketaste ümber. Selged vööndid mõõdetakse. 6.2.6. Penitsilliini standardlahuse ketaste (6.2.3) ümber olevate selgete vööndite läbimõõt peab olema vähemalt 2 mm. 6.2.7. Vähemalt sama suured või suuremad selged vööndid ümber piimaproovi ketaste osutavad katseorganismi inhibeerivate ainete ole