Komisjoni direktiiv 92/95/EMÜ, 9. november 1992, millega muudetakse lisa seitsmendas direktiivis 76/372/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks



Euroopa Liidu Teataja L 327 , 13/11/1992 Lk 0054 - 0062

Soomekeelne eriväljaanne: Peatükk 3 Köide 45 Lk 0182

Rootsikeelne eriväljaanne: Peatükk 3 Köide 45 Lk 0182

CS.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

ET.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

HU.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

LT.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

LV.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

MT.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

PL.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

SK.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11

SL.ES Peatükk 3 Köide 46 Lk 3 - 11



Komisjoni direktiiv 92/95/EMÜ, 9. november 1992, millega muudetakse lisa seitsmendas direktiivis 76/372/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi 70/373/EMÜ sööda ametlikuks kontrolliks vajalike ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta, [1] viimati muudetud Hispaania ja Portugali ühinemisaktidega, eriti selle artiklit 2, ning arvestades, et: seitsmenda komisjoni 1. märtsi 1976. aasta direktiiviga 76/372/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks, [2] viimati muudetud direktiiviga 81/680/EMÜ, [3] nähakse ette aflatoksiin B1 määramisel kasutatavad meetodid; teaduse ja tehnika arengut silmas pidades on põhjust kõnealuseid meetodeid kohandada; kusjuures eelkõige on soovitatav kehtestada meetod eriti madalate aflatoksiini piirmäärade kontrollimiseks, mis on kindlaks määratud nõukogu 17. detsembri 1973. aasta direktiiviga 74/63/EMÜ loomasöödas sisalduvate ebasoovitavate ainete ja toodete lubatud piirmäärade kindlaksmääramise kohta, [4] viimati muudetud direktiiviga 91/132/EMÜ [5]; ühtlasi on soovitatav kehtestada meetod aflatoksiin B1 määramiseks segavate ainete (nt tsitruspulp) esinemisel; käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI: Artikkel 1 Direktiivi 76/372/EMÜ lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi lisale. Artikkel 2 Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi sätete järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 1. oktoobril 1993. Nad teatavad kõnealustest õigusnormidest viivitamata komisjonile. Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse normidesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid. Artikkel 3 Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele. Brüssel, 9. november 1992 Komisjoni nimel komisjoni liige Ray Mac Sharry [1] EÜT L 170, 3.8.1970, lk 2. [2] EÜT L 102, 15.4.1976, lk 8. [3] EÜT L 246, 29.8.1981, lk 32. [4] EÜT L 38, 11.2.1974, lk 31. [5] EÜT L 66, 13.3.1991, lk 16. -------------------------------------------------- LISA I. A osas "Ühemõõtmeline planaarkromatograafiline meetod" asendatakse tekst punktis 1 "Eesmärk ja rakendusala" järgmise tekstiga: "1. Eesmärk ja rakendusala Meetod võimaldab määrata aflatoksiin B1 taset toormaterjalides ja lihtsöötades. Käesolevat meetodit ei saa rakendada tsitruspulbi esinemisel. Määramise alampiir on 0,01 mg/kg (10 miljardikku). Segavate ainete esinemisel tuleb analüüsi korrata kasutades meetodit B (kõrgrõhuvedelikkromatograafia)." II. B osas "Kahemõõtmeline planaarkromatograafiline meetod" asendatakse tekst järgmisega: "B. AFLATOKSIIN B1 MÄÄRAMINE. KÕRGRÕHUVEDELIKKROMATOGRAAFIA 1. Eesmärk ja rakendusala Meetod võimaldab määrata aflatoksiin B1 loomasöötades, sealhulgas nendes, mis sisaldavad tsitruspulpi. Määramise alampiir on 0,001 mg/kg (1 miljardik). 2. Põhimõte Proovi ekstraheeritakse kloroformiga. Ekstrakt filtreeritakse ja alikvoot puhastatakse Florisil-padrunil ning seejärel C18-padrunil. Lõplik eraldamine ja määramine sooritatakse kõrgrõhuvedelikkromatograafiaga (HPLC) pöördfaasilise C18-kolonni kasutades, millele järgneb kolonnijärgne derivatsioon joodiga vees ja fluorestsentsavastamine. Märkus: mükotoksiinid on äärmiselt mürgised ained. Materjali tuleb käsitseda asjakohases tõmbekapis. Toksiinid esinemisel kuivas vormis tuleb võtta erilisi ettevaatusmeetmeid nende elektrostaatilise iseloomu tõttu ning sellest tuleneva kalduvuse tõttu tööruumides hajuda. 3. Reaktiivid 3.1. Kloroform, stabiliseeritud 0,5–1,0 massi- % etanooliga. Vt märkus 10.2. 3.2. Metanool, HPLC-puhas, 3.6 segu valmistamiseks. 3.3. Atsetoon. 3.4. Atsetonitriil, HPLC-puhas. 3.5. Eluendid: Valmistada kasutamisele eelneval päeval või eemaldada õhk eluendist ultraheli abil. 3.5.1. Atsetooni (3.3) ja vee segu, 98 + 2 (V + V). 3.5.2. Vee ja metanooli (3.2) segu, 80 + 20 (V + V). 3.5.3. Vee ja atsetooni (3.3) segu, 85 + 15 (V + V). 3.6. HPLC liikuv faas. Vee, metanooli (3.2) ja atsetonitriili (3.4) segu, 130 + 70 + 40 (V + V + V). NB: liikuva faasi lahusti koostis võib vajada korrigeerimist sõltuvalt kasutatava HPLC-kolonni omadustest. 3.7. Küllastatud joodilahus: lisada 2 g joodi 400 ml vette. Segada vähemalt 90 minutit ning filtreerida läbi membraanfiltri (4.15). Kaitsta küllastatud lahust valguse eest, et vältida valguslagunemist. 3.8. Happega pestud Celite 545 või samaväärne toode. 3.9. Florisil-padrun (Waters SEP-PAK) või samaväärne toode. 3.10. C18-padrun (Waters SEP-PAK) või samaväärne toode. 3.11. Inertgaas, nt lämmastik. 3.12. Aflatoksiin B1 standardlahus kloroformis, kontsentratsioon 10 μg/ml. Lahuse kontsentratsiooni kontrollitakse järgmiselt: määrata lahuse neeldumisspekter vahemikus 330–370 nm kasutades spektrofotomeetrit (4.23). Määrake absorptsioon (A) 363 nm lähedal oleva suurima väärtuse järgi. Aflatoksiin B1 kontsentratsioon mikrogrammides milliliitri lahuse kohta arvutatakse järgmise valemiga: kontsentratsioon (μg/ml) = = 13,991 × A 3.12.1. Aflatoksiin B1 lähtestandardlahus kloroformis. Viia kvantitatiivselt 2,5 ml aflatoksiin B1 standardlahust (3.12) 50 ml mõõtekolbi ja täita kolb märgini kloroformiga (3.1). Hoida lahust jahedas (4 °C) ja pimedas, hermeetiliselt suletuna ning mähituna alumiiniumfooliumi. 3.13. Aflatoksiin B1 HPLC-kaliibrimislahused. NB: Nende lahuste valmistamiseks kasutada happega pestud klaastarvikuid (vt 4. Seadmed). 3.13.1. Kaliibrimislahus 4 ng/ml. Lasta lähtestandardlahust (3.12.1) sisaldaval mõõtekolvil soojeneda toatemperatuurini alumiiniumfooliumis (mõni tund). Viia 400 μl lähtestandardlahust (200 ng aflatoksiin B1) 50 ml mõõtekolbi ning aurustada lahus inertgaasi (3.11) voolus kuivaks. Lahustada saadud jääk ligikaudu 20 ml vee-atsetooni segus (3.5.3), täita kolb märgini vee-atsetooni seguga ja segada korralikult. 3.13.2. Kaliibrimislahus 3 ng/ml. Viia kvantitatiivselt 7,5 ml kaliibrimislahust (3.13.1) 10 ml mõõtekolbi, täita kolb märgini vee-atsetooni seguga (3.5.3) ja segada korralikult. 3.13.3. Kaliibrimislahus 2 ng/ml. Viia kvantitatiivselt 25 ml kaliibrimislahust (3.13.1) 50 ml mõõtekolbi, täita kolb märgini vee-atsetooni seguga (3.5.3) ja segada korralikult. Seda lahust nimetatakse ka võrdlusstandardiks HPLC (5.5) aegsel korduvsüstimisel. 3.13.4. Kaliibrimislahus 1 ng/ml. Viia kvantitatiivselt 2,5 ml kaliibrimislahust (3.13.1) 10 ml mõõtekolbi, täita kolb märgini vee-atsetooni seguga (3.5.3) ja segada korralikult. 3.14. Ampull, mis sisaldab aflatoksiinide B1, B2, G1 ja G2 segu 1 ml kloroformis kontsentratsiooniga vastavalt ligikaudu 1, 0,5, 1 and 0,5 μg/ml. 3.14.1. Kromatograafia proovilahus. Viia ampulli (3.14) lahus lihvkorgiga katsutisse või väikesesse keeratava korgiga pudelisse. Viia 40 μl kõnealust lahust lihvkorgiga katsutisse (happega loputatud) (4.22). Aurustada kloroform inertgaasi (3.11) voolus ning lahustada uuesti 10 ml vee-atsetooni segus (3.5.3). 3.15. Kinnituskatse reagendid (6). 3.15.1. Naatriumkloriidi küllastatud lahus. 3.15.2. Naatriumsulfaat, veevaba, graanulites. 4. Seadmed Ettevaatust: happes pesemata klaastarvikute kasutamine aflatoksiinide vesilahuste jaoks võib põhjustada kadusid. Eriti hoolikas tuleb olla uute klaastarvikute ja ühekordse kasutusega klaastarvikute, nt automaatproovivõtupudelite ning Pasteuri pipettidega. Seepärast tuleb aflatoksiinide vesilahustega kokkupuutuvaid laboriklaastarvikuid leotada mitu tundi lahjendatud happes (nt väävelhappes, 2 mol/l), seejärel destilleeritud veega korralikult loputada, et eemaldada kõik happejäägid (nt kolm korda, kontrollida pH-paberiga). Praktikas on sellist käsitlemist vaja ümarkolvi (4.4), mõõtekolbide, mõõtesilindrite, väikeste pudelite või katsutite puhul, mida kasutatakse kaliibrimislahuste ja lõppekstraktide jaoks (eriti automaatproovivõtupudelid), ning Pasteuri pipettide jaoks, kui neid kasutatakse kaliibrimislahuste või ekstraktide ülekandmiseks. 4.1. Jahvatusmasin-loksuti 4.2. Sõel avasuurusega 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Mehaaniline loksuti 4.4. Vaakumpöördaurusti 150–250 ml ümarkolviga. 4.5. Kõrgrõhuvedelikkromatograaf süstekontuuriga, mis sobib 250 μl süsteks. Vt seadme kasutusjuhendist imitoru osalise või täieliku täitmise kohta. 4.6. HPLC-analüüsikolonn: 3 μm või 5 μm C18-padrunis. 4.7. Pulseerimatu pump kolonnijärgse joodireagendi väljastamiseks. 4.8. Roostevabast terasest (1/16” × 0,75 mm) Valco tühimahuta T-kolmik. 4.9. Spiraalne reaktsioonispiraal, teflonist või roostevabast terasest. Mõõtmetega 3000 × 0,5 mm kuni 5000 × 0,5 mm spiraalid on osutunud sobivateks koos 5 μm või 3 μm HPLC-kolonnidega koos kasutamiseks. 4.10. Temperatuurile 60 °C reguleeritud termostaatveevann, mille temperatuuri saab seada täpsemalt kui 0,1 °C. 4.11. Fluorestsentsdetektor ergastuslainepikkusega 365 nm ja kiirguslainepikkusega 435 nm. (Filtriga seadmetes ergastuslainepikkus > 400 nm.) Peab võimaldama avastada vähemalt 0,05 ng aflatoksiin B1. Teatav vasturõhk võib olla soovitatav läbivooluküvetis moodustuvate õhumullide tekke vältimiseks (nt detektori väljalaskeavaga ühendatud ahendi, teflonist või roostevabast terasest spiraal). 4.12. Lintmeerik. 4.13. Elektrooniline integraator (valikuline). 4.14. Kurdfilterpaber läbimõõduga 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 või samaväärne. 4.15. Membraanfilter avasuurusega 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 või samaväärne. 4.16. Lihvkorgiga 500 ml kooniline kolb. 4.17. Lueri otsakuga klaaskolonn (siseläbimõõt u 1 cm, pikkus u 30 cm). 4.18. Lueri otsakuga kloroformikindel korkkraan (nt Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 või samaväärne). 4.19. Keemiliselt inertne süstal, 10 ml Lueri ühendusega. 4.20. 250 μl HPLC-süsteks sobiv süstal (vt 4.5) 4.21. 100 μl mikrosüstal kaliibrimislahuste ettevalmistamiseks (kontrollida kaalumise teel, et täpsus on 2 % piires). 4.22. Lihvkorgiga 10 ml mõõtekolb. 4.23. Spektrofotomeeter, mis sobib mõõtmisteks spektri ultraviolettpiirkonnas. 4.24. Kinnituskatse seadmed (6). 4.24.1. Happes loputatud 100 ml jaotuslehter, teflonist korkkraaniga. 4.24.2. Soojendusseade, 40–50 °C. 5. Menetlus 5.1. Proovi ettevalmistamine. Jahvatada proovimaterjal nii, et see läbiks sõela (4.2). 5.2. Katsekogus. Kaaluda 50 g katseks ettevalmistatud proovi koonilisse kolbi (4.16). 5.3. Ekstraheerimine. Lisada katsekogusele (5.2) 25 g Celite'i (3.8), 250 ml kloroformi (3.1) ja 25 ml vett. Kinnitada kolvile kork ning raputada 30 minutit kasutades mehaanilist loksutit (4.3). Filtreerida läbi kurdfilterpaberi (4.14). Koguda 50 ml filtraati. Vajaduse korral võtta filtraadi alikvoot ja lahjendada 50 ml kloroformis, et aflatoksiin B1 kontsentratsioon ei ületaks 4 ng/ml. 5.4. Puhastamine (menetlus tuleb läbi viia ilma oluliste katkestusteta). Ettevaatust: - kaitsta laborit, kus analüüse tehakse, piisavalt päevavalguse eest. Seda võib saavutada tõhusalt kasutades: i) ultraviolettkiirgust neelavat fooliumi akendel koos nõrga valgusega (otsese päikesevalguseta); ii) kardinaid või katteid koos tehisvalgusega (päevavalguslambid on lubatud); - aflatoksiini sisaldavad lahuseid tuleb kaitsta valguse eest nii palju kui võimalik (hoida pimedas, kasutada alumiiniumfooliumi). 5.4.1. Puhastamine Florisil SEP-PAK'i abil 5.4.1.1. Kolonni-padruni koostu ettevalmistamine. Kinnitada korkkraan (4.18) Florisil-padruni (3.9) lühema varre külge (vt joonis 1). Pesta padrun ning eemaldada õhk võttes 10 ml kloroformi (3.1) ning viies 8 ml korkkraani kaudu kiirelt läbi padruni, kasutades selleks süstalt (4.19). Kinnitada padruni pikem vars klaaskolonni (4.17) külge ja viia allesjäänud 2 ml kloroformi läbi padruni kolonni. Sulgeda korkkraan. Eemaldada süstal. 5.4.1.2. Puhastamine Lisada punktis 5.3 kogutud filtraat kolonni-padruni koostu ning lasta vabalt valguda. Loputada 5 ml kloroformiga (3.1), seejärel 20 ml metanooliga (3.2). Kõrvaldada eluaadid. Nende toimingute vältel tagada, et kolonni-padruni koost ei jää kuivaks. Elueerida aflatoksiin B1 40 ml atsetooni-vee seguga (3.5.1) ja koguda kogu eluaat pöördaurusti ümarkolbi (4.4). Kontsentreerida eluaat pöördaurustil temperatuuril 40–50 °C, kuni atsetooni enam ei destilleeru. (NB: Selleks hetkeks on kolbi jäänud u 0,5 ml vedelikku. Katsed on osutanud, et edasine aurustamine ei ole kahjulik ning et 0,5 ml vedeliku allesjäämisel ei sisaldu selles enam olulises koguses atsetooni. Atsetoonijäägid võivad põhjustada aflatoksiin B1 kaod C18-padrunis.) Lisada 1 ml metanooli (3.2), loksutada kolbi, et lahustada aflatoksiin B1 kolbi seintelt, lisada 4 ml vett ja segada. Ühendada padrun lahti ja kõrvaldada. Loputada klaaskolonni veega ja hoida alles C18-puhastamise jaoks. 5.4.2. Puhastamine C18 SEP-PAK'i abil 5.4.2.1. Kolonni-padruni koostu ettevalmistamine. Kinnitada korkkraan (4.18) C18-padruni (3.9) lühema varre külge (vt joonis 1). Loputada padrun ning eemaldada õhk viies 10 ml metanooli (3.2) korkkraani kaudu kiiresti läbi padruni, kasutades selleks süstalt (4.19). (Õhumullid padrunis on nähtavad heledate täppidena muidu hallikal taustal.) Võtta 10 ml vett ja viia 8 ml läbi padruni. (Minnes metanoolilt üle veele vältida õhu sissepääs padrunisse.) Kinnitada padruni pikem vars klaaskolonni (4.17) külge ja viia allesjäänud 2 ml vett läbi padruni kolonni. Sulgeda korkkraan. Eemaldada süstal. 5.4.2.2. Puhastamine Viia punktis 5.4.1.2 kogutud ekstrakt kvantitatiivselt klaaskolonni (4.17), loputades kolbi kaks korda 5 ml vee-metanooli seguga (3.5.2) ning lasta sellel vabalt valguda. Nende toimingute vältel tagada, et kolonni-padruni koost ei jää kuivaks. (Kui padruni lähedal kitsendis tekivad õhumullid, peatada vool ning keerata õhumullide eemaldamiseks klaaskolonni ülaosa lahti. Seejärel jätkata.) Elueerida 25 ml vee-metanooli seguga. Kõrvaldada eluaat. Elueerida aflatoksiin B1 50 ml vee-atsetooni segust (3.5.3) ning koguda kogu eluaat 50 ml mõõtekolbi. Täita kolb veega märgini ja segada: tulemuseks saadud katselahust kasutatakse kromatograafial (5.5). Ettevaatust: lõppekstrakti filtreerimist enne HPLC-d ei ole tavaliselt vaja. Kui seda peetakse vajalikuks, ei tuleks kasutada tselluloosfiltreid, sest need võivad põhjustada aflatoksiin B1 kadusid. Teflonfiltreid tohib kasutada. 5.5. Kõrgrõhuvedelikkromatograafia (seadmestiku ehitus: vt joonis 2). Laske seadmetel piisavalt kaua sisekliimatingimustega kohaneda ja stabiliseeruda. Märkus 1: liikuva faasi ja kolonnijärgse reagendi voolukiirused on näitlikud. Need võivad sõltuvalt HPLC-kolonni omadustest vajada kohandamist. Märkus 2: detektori aflatoksiin B1 avastusvõime sõltub temperatuurist, seepärast tuleb kõrvalekalle kompenseerida (vt joonis 3). Süstides kindlaksmääratud koguse aflatoksiin B1 võrdlusstandardit (3.13.3) regulaarsete vahemike järel (nt igal kolmandal süstel), võib aflatoksiin B1 tippväärtusi nende võrdlusstandardite vahel korrigeerida, kasutades keskmist vastust eeldusel, et üksteisele järgnevate võrdlusstandardite vastuste vaheline erinevus on väga väike (< 10 %). Seepärast tuleb süsted läbi viia ilma katkestusteta. Kui katkestamist on vaja, peab katkestamisele eelnev süste ja sellele järgnev süste olema võrdlusstandard (3.13.3). Et kaliibrimiskõver on lineaarne ning kulgeb läbi koordinaadistiku algpunkti, määratakse aflatoksiin B1 kogused prooviekstraktides neid vahetult võrreldes külgnevate standarditega. 5.5.1. HPLC-pumba seaded Seadistada HPLC-pump (4.5) nii, et selle tootlikkus oleks 0,5 või 0,3 ml/min vastavalt 5 μm või 3 μm HPLC-kolonni (4.6) korral kasutades liikuvat faasi (3.6). 5.5.2. Kolonnijärgse pumba seaded Seadistada pump (4.7) nii, et selle joodi küllastatud vesilahuse (3.7) tootlikkus oleks 0,2–0,4 ml/min. Ligikaudne juhis: liikuva faasi (3.6) vooluga 0,5 ja 0,3 ml/min on soovitatav tootlikkus vastavalt u 0,4 või 0,2 ml/min. 5.5.3. Fluorestsentsdetektor Seadke fluorestsentsdetektori (4.11) ergastuslainepikkuseks 365 nm ja kiirguslainepikkuseks 435 nm (filtriga seadmetes > 400 nm). Seadistada detektori summuti nii, et 1 ng aflatoksiin B1 korral liigub meeriku sulg ligikaudu 80 % asendisse skaala kogu ulatusest. 5.5.4. Süsteseade Kõigi lahuste puhul süstida 250 μl kogused järgides süsteseadme tootja juhiseid. 5.5.5. Kromatograafilise eraldamise kontroll Süstida kromatograafi katselahust (3.14.1). Madalpunktid peavad olema alla 5 % külgnevate piikide kõrguste summast. 5.5.6. Süsteemi stabiilsuse kontroll Enne iga analüüsiseeriat süstida kromatograafi vastavat võrdlusstandardit (3.13.3) kuni püsivate piigipindalade saavutamiseni. (NB: piigivastused aflatoksiin B1 suhtes järjestikuste süstete vahel ei peaks erinema enam kui 6 %.) Jätkata viivitamata lineaarsuse kontrolliga (5.5.7). 5.5.7. Lineaarsuse kontroll Süstida kromatograafi aflatoksiin B1 kaliibrimislahused (3.13.1–3.13.4). Igal kolmandal süstel kasutada võrdlusstandardit (3.13.3) vastuse kõrvalekalde korrigeerimiseks. (NB: selle võrdlusstandardi piigivastused ei tohi erineda üle 10 % 90 minuti jooksul.) Korrigeerida kõrvalekalded vastavalt punktis 7 esitatud valemile. Kalibreerimisgraafik peab olema lineaarne ja kulgema läbi koordinaadistiku algpunkti, kahekordse Y-hinnangu standardvea piires. Leitud väärtused ei tohi erineda üle 3 % nimiväärtustest. Kui need tingimused on täidetud, jätkata viivitamata. Vastasel korral teha kindlaks ja korrigeerida probleemi põhjused enne jätkamist. 5.5.8. Prooviekstraktide süstimine kromatograafi Süstida kromatograafi puhastatud prooviekstraktid (5.4.2.2). Pärast iga kahte prooviekstrakti korrata võrdlusstandardi süstet (3.13.3) vastavalt järgmisele järjestusele: võrdlusstandard, ekstrakt, ekstrakt, võrdlusstandard, ekstrakt, ekstrakt, võrdlusstandard jne. 6. Kinnitav katse 6.1. Ekstrakti (5.4.2.2) edasine töötlemine Lisada 5 ml naatriumkloriidi lahust (3.15.1) punktis 5.4.2.2 saadud lõppekstrakti. Ekstraheerida kolm korda jaotuslehtris (4.24.1), iga kord 2 ml kloroformiga (3.1) ühe minuti jooksul. Kallata kloroformiekstraktid u 1 g naatriumsulfaadile (3.15.2) 10 ml katsutisse. Võib kasutada väikest lehtrit (läbimõõduga 4 cm), mille kitsendis on u 1 g naatriumsulfaadiga kaetud vatitükk. Pesta naatriumsulfaadi kiht mõne ml kloroformiga ning koguda samasse katsutisse. Aurustada kloroformiekstrakt kuivamiseni samas katsutis kasutades soojendusseadet (4.24.2) ning lahjendada uuesti 1 ml kloroformis. 6.2. Saaduse ettevalmistamine ning õhekihikromatograafia (planaarkromatograafia): vt nõukogu direktiivi 76/372/EMÜ lisa meetod A, punkt 5.6.2. 7. Tulemuste arvutamine Arvutada proovis oleva aflatoksiin B1 sisaldus (μm/kg) järgmise valemiga: aflatoksiin B1 sisaldus (μg/kg) = m × V V × M × VfVc kus: m m = P + P × 2 r st P (proov) = aflatoksiin B1 piigi pindala kõnealuses proovis; P (st1) = aflatoksiin B1 piigi pindala, mis tuleneb eelnevast võrdlusstandardi (3.13.3) süstest; P (st2) = aflatoksiin B1 piigi pindala, mis tuleneb järgnevast võrdlusstandardi (3.13.3) süstest; r (st) = süstitud aflatoksiin B1 kogus võrdlusstandardis (3.13.3), ng; Vm = süstitud prooviekstrakti maht, ml; Vext = prooviekstrakti lõplik maht (ml), mis võtab arvesse mis tahes lahjendamist (5.3); M = proovi mass, g; Vf = Florisil-padrunisse kantud filtraadi maht (5.4.1.2), ml; Vc = proovi ekstraheerimiseks kasutatud kloroformi maht, ml. Käesolevas protokollis esitatud menetluse järgimise korral saab valemi taandada järgmisele kujule: aflatoksiin B1 sisaldus (μg/kg) = 20 × m. 7.1. Tulemuste arvutusi tohib teha ka piigikõrguse mõõtmise teel. 8. Korduvus: vt punkt 10.1. 9. Korratavus: vt punkt 10.1. 10. Märkused 10.1. Kordustäpsus Rahvusvaheline ühisuuring [1] segasöötade kohta andis tabelis 1 esitatud tulemused korduvuse ja korratavuse kohta. Korduvus (r) tähendab suurimat suhtarvu, mis on kahe samast proovist samas laboris ja samadel tingimustel saadud kahe tulemuse võrdlusel 95 % tõenäosusega ebaoluline. Korratavus (R) tähendab sarnasel viisil saadud suhtarvu kahe eri laboratooriumi võrdlemisel. Kooskõlas standardiga ISO 3534-1977, 2.35 [2] ja komisjoni otsusega 89/610/EMÜ [3] on r ja R väärtused esitatud tabelis 1 variatsioonikordajatena. Tabel 1 Korduvus (r) ja korratavus (R) väljendatuna suhtarvudena ning neile vastavate variatsioonikordajatena. (15 laborit) Tase | r | R | CVr [4] | CVR | (µg/kg) | | | (%) | (%) | 8 & 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 | "CV 10.2. Kloroformi (3.1) stabiliseerimine Florisil-padruni adsorptsiooniomadused võivad muutuda muu stabiliseerija kui etanooli kasutamisel. Seda tuleb kontrollida punkti 10.3 järgi, kui kloroformi ei ole võimalik kasutada. 10.3. Täpsus Meetodi õige kohaldamise kontrollimiseks teha korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega. Kui neid ei ole võimalik kasutada, tuleb meetodi toimivust kontrollida rikastatud tühiproovidega sooritatavate saagisekatsete abil. Keskmise kõrvalekalle tegelikust väärtusest, väljendatuna protsendina tegelikust väärtusest, ei tohiks väljuda vahemikust –20 kuni + 10 %. +++++ TIFF +++++ Joonis 1: Kolonni-padruni koost +++++ TIFF +++++ Joonis 2: Vedelikkromatograafisüsteemi vooskeem koos joodi kolonnijärgse derivatiseerimisega. +++++ TIFF +++++ Joonis 3: Aflatoksiin B1 vastuse kõrvalekalde kompenseerimine regulaarsete vahemike järel võrdlusstandardi (3.13.3) kromatograafi süstimise teel" [1] Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29. [2] Standard ISO 3534-1977. [3] EÜT L 351, 2.12.1989, lk 39. [4] "variatsioonikordaja --------------------------------------------------