8)

B osasse lisatakse järgmised peatükid: „B.63. REPRODUKTIIV-/ARENGUTOKSILISUSE SÕELUURING SISSEJUHATUS 1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 421 (2016). Kemikaalide uurimist käsitlevaid OECD katsejuhendeid vaadatakse teaduse arengu arvessevõtmiseks korrapäraselt läbi. Algne sõeluuringut käsitlev katsejuhend nr 421 võeti vastu 1995. aastal ühe esialgse reproduktiivtoksilisuse sõeluuringu katse-eeskirja põhjal, mida arutati kahel ekspertide koosolekul, mis toimusid 1990. aastal Londonis (1) ja 1992. aastal Tokyos (2). 2. Käesolevat katsemeetodit on ajakohastamise eesmärgil täiendatud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivate lõppnäitajatega, mis lisati järelmeetmena lähtuvalt prioriteetsest tegevussuunast, mille OECD käivitas 1998. aastal eesmärgiga vaadata läbi olemasolevad ja töötada välja uued katsejuhendid, et võimaldada sõeluuringute tegemist võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide tuvastamiseks ja selliste kemikaalide hindamist (3). Näiteks täiendati 2008. aastal OECD katsejuhendit nr 407 (käesoleva lisa peatükk B.7 „Suukaudse kordusdoosi toksilisuse 28-päevane uuring närilistel“) parameetritega, mis sobivad uuritavate kemikaalide endokriinse toime tuvastamiseks. Katsejuhendi nr 421 ajakohastamise eesmärk oli lisada sõeluuringut käsitlevasse juhendisse teatavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida saab hinnata juhul, kui kokkupuuteperiood hõlmab mõnda tundlikku arenguperioodi (sünnieelset või varajast sünnijärgset perioodi). 3. Peale selle lisati katsejuhendisse nr 421 täiendavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida sisaldab ka katsejuhend nr 443 (käesoleva lisa peatükk B.56 „Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuring“); need lõppnäitajad valiti lähtuvalt ühest teostatavusuuringust, milles käsitletakse asjaomaste lõppnäitajate lisamisega seotud teaduslikke ja tehnilisi küsimusi, ning võimalikust vajadusest katsemeetodit nende lisamiseks kohandada (4). 4. Käesolev katsemeetod on kavandatud piiratud hulga andmete saamiseks uuritava kemikaali mõju kohta isas- ja emasloomade paljunemisvõimele, näiteks sugunäärmete talitlusele, paaritumiskäitumisele, eostumisele, sügoodi arengule ja sünnitamisele. See ei ole ette nähtud kasutamiseks olemasolevate katsemeetodite B.31, B.34, B35 või B.56 alternatiivina ega nende asendamiseks. LÄHTEKAALUTLUSED 5. Käesolevat sõeluuringumeetodit võib kasutada paljunemisvõimele ja/või arengule avalduva võimaliku mõju kohta esialgse teabe saamiseks kas kemikaalide toksikoloogiliste omaduste hindamise varajases etapis või probleemsete kemikaalide uurimisel. Seda võib kasutada ka osana esialgsete sõeluuringute seeriast, mille abil hinnatakse olemasolevaid kemikaale, mille kohta on vähe või ei ole üldse toksikoloogilisi andmeid, samuti ulatuslikumate paljunemisvõimet/arengut käsitlevate uuringute jaoks annusevahemiku kindlaksmääramiseks ning muudel asjakohaseks peetavatel juhtudel. Uuringu tegemisel tuleks järgida juhtpõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19, milles käsitletakse ohutuse hindamiseks kasutatavatel katseloomadel avalduvate kliiniliste tunnuste kindlakstegemist, hindamist ja kasutamist humaanse sekkumise vajadusele viitavate näitajatena (5). 6. Käesolev katsemeetod ei võimalda saada ammendavat teavet kõikide paljunemisvõime ja arenguga seotud aspektide kohta. Eelkõige lubab see tuvastada sünnieelse kokkupuute tagajärjel sünnijärgselt avalduvaid ilminguid ja sünnijärgsest kokkupuutest tulenevat mõju üksnes piiratud ulatuses. Käesoleva meetodiga ei saa koguda tõendeid, mis lubaksid lõplikult kinnitada mõju puudumist; see on muu hulgas tingitud loomade suhteliselt väikesest arvust annuserühmades, lõppnäitajate selektiivsusest ja uuringu lühikesest kestusest. Täheldatavaid positiivseid tulemusi aga on võimalik muudest reproduktiiv-/arengutoksilisuse uuringutest saadavate andmete puudumisel kasutada esialgseks ohuhindamiseks ning need aitavad teha otsuseid täiendavate uuringute tegemise vajaduse ja selliste uuringute ajastuse kohta. 7. Sisesekretsioonisüsteemiga seotud näitajaid käsitlevaid tulemusi tuleks vaadelda endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku (6) kontekstis. Nimetatud kontseptuaalses raamistikus on OECD täiendatud katsejuhendi nr 421 kohast meetodit käsitatud 4. taseme in vivo meetodina, mis võimaldab saada andmeid sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajate kaudu tuvastatava kahjuliku mõju kohta. Sisesekretsioonisüsteemist sõltuvat signaali ei pruugita eraldi võetuna siiski pidada piisavaks tõendiks selle kohta, et uuritava kemikaali puhul on tegemist endokriinfunktsiooni kahjustava kemikaaliga. 8. Käesoleva katsemeetodi puhul eeldatakse, et uuritavat kemikaali manustatakse suu kaudu. Muu manustamisviisi kasutamise korral võib olla vaja teha meetodis muudatusi. 9. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. 10. Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites. KATSE PÕHIMÕTE 11. Uuritavat kemikaali manustatakse astmeliselt suurenevates annustes mitme rühma isas- ja emasloomadele. Isasloomade puhul peaks manustamine toimuma vähemalt nelja nädala kestel kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani, sealhulgas surmamiseelsel päeval (see hõlmab vähemalt kahte paaritumiseelset nädalat, paaritumisperioodi ja umbes kahte paaritumisjärgset nädalat). Kuna isasloomadel on paaritumiseelne manustamisperiood piiratud kestusega, ei pruugi viljakus olla eriti tundlik munanditele avalduva mürgisuse näitaja. Seepärast on vaja teha munandite üksikasjalik histoloogiline analüüs. Kahe nädala pikkust paaritumiseelset manustamisperioodi koos järgneva paaritumise/viljakuse jälgimisega ning manustamisperioodi üldkestusega vähemalt neli nädalat, millele järgneb isaslooma sugunäärmete üksikasjalik histopatoloogiline analüüs, peetakse enamiku isasloomal täheldatavate viljakusele ja spermatogeneesile avalduva mõju ilmingute tuvastamiseks piisavaks. 12. Emasloomade puhul peaks manustamine toimuma kogu uuringu kestel. See hõlmab kahte paaritumiseelset nädalat (eesmärk on jälgida vähemalt kahte tervet innatsüklit), eostumisele eelnevat varieeruva pikkusega ajavahemikku, tiinuse kestust ja vähemalt kolmeteistkümne päeva pikkust sünnitusjärgset perioodi, mis kestab kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani ja hõlmab ka surmamiseelset päeva. 13. Kohanemisperioodile ja innatsükli manustamiseelsele hindamisele järgneva uuringu kestus sõltub emasloomade seisundist ning on umbes 63 päeva (vähemalt 14 päeva pikkune paaritumiseelne periood, (kuni) 14 päeva pikkune paaritumisperiood, 22 päeva pikkune tiinusperiood ja 13 päeva pikkune imetamisperiood). 14. Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi iga päev hoolikalt mürgisusnähtude suhtes. Uuringu kestel surnud või surmatud loomad lahatakse ning uuringu lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. MEETODI KIRJELDUS Loomaliigi valimine 15. Käesolev katsemeetod on kavandatud kasutamiseks rotil. Kui käesolevas katsemeetodis kirjeldatud näitajaid hinnatakse mõne muu liigi närilistel, tuleks seda üksikasjalikult põhjendada. Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemise rahvusvahelises valideerimisprogrammis, mille puhul on lähtutud OECD katsejuhendist nr 407 (see vastab käesoleva lisa peatükile B.7), kasutati ainsa liigina rotte. Ei tohiks kasutada liine, kus sigivus on väike või kus teadaolevalt esineb sageli arenguhäireid. Tuleks kasutada terveid varem paaritamata loomi, keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomi tuleks iseloomustada liigi, liini, soo, kehamassi ja vanuse järgi. Uuringu alguses peaksid kasutatavate loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle 20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist. Kui uuring viiakse läbi pikaajalise või tervet põlvkonda hõlmava uuringu eeluuringuna, tuleks mõlemas uuringus soovitatavalt kasutada samast liinist ja sama päritolu loomi. Pidamis- ja söötmistingimused 16. Kõik katsetoimingud peaksid vastama kohalikele laboriloomade hooldamise normidele. Katseloomade ruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Ehkki suhteline õhuniiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, on sobivaim vahemik 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. 17. Loomade pidamisel tuleks kasutada väikesi samasooliste isendite rühmi; loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud. Rühmas pidamisel ei tohiks puuris olla rohkem kui viis looma. Paaritamine peaks toimuma selleks sobivas puuris. Tiined emasloomad tuleks paigutada igaüks eraldi puuri, kus on olemas pesamaterjal. Imetavad emasloomad paigutatakse igaüks eraldi puuri koos järglaskonnaga. 18. Sööta tuleks korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes. Asjaomase sööda proov tuleks kuni katseprotokolli lõpliku valmimiseni alles hoida. Loomade ettevalmistamine 19. Terved noored täiskasvanud loomad jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Loomad idenditakse üheselt ja neil lastakse enne uuringu algust puuris vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Annuste ettevalmistamine 20. Uuritavat kemikaali on soovitatav manustada suu kaudu, välja arvatud juhul, kui mõnda muud manustamisviisi peetakse sobivamaks. Uuritava kemikaali suukaudseks manustamiseks kasutatakse tavaliselt toitmissondi; selle asemel võib siiski kasutada ka sööda või joogiveega manustamist. 21. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda vesilahuse või veepõhise suspensiooni ja seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ning pärast seda lahustamist mõnes muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul peaksid olema teada selle mürgisusnäitajad. Tuleks teha kindlaks uuritava kemikaali püsivus ja homogeensus kandeaines. KATSE KÄIK Loomade arv ja sugu 22. Soovitatavalt peaks igas rühmas olema alguses vähemalt 10 isaslooma ja 12–13 emaslooma. Emasloomi hinnatakse kokkupuute eel innatsükli alusel ja loomad, kelle innatsükkel erineb tavapärasest 4–5 päeva pikkusest tsüklist, jäetakse uuringust välja; seepärast on soovitatav kasutada suuremat arvu emasloomi, et igas rühmas oleks lõpuks 10 emaslooma. Eeldatavalt tiinestub igas rühmas vähemalt 8 emaslooma – seda peetakse tavapäraselt minimaalseks vastuvõetavaks tiinestumismääraks –, välja arvatud juhul, kui ilmneb märkimisväärne mürgine mõju. Eesmärk on saada piisav arv tiineid emasloomi, et oleks võimalik usaldusväärselt hinnata uuritava kemikaali võimet mõjutada viljakust, tiinust, ema- ja imetamiskäitumist ning F 1 -põlvkonna järglaste kasvu ja arengut eostamisest kuni kolmeteistkümnenda sünnijärgse päevani. Annused 23. Üldjuhul tuleks kasutada vähemalt kolme katserühma ja ühte kontrollrühma. Annuste valimisel võib lähtuda ägeda mürgisuse hindamise katsetega saadud andmetest või korduvannustamisel põhinevate uuringute tulemustest. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda täpselt samal viisil kui katserühma loomi; ainus erinevus seisneb uuritava kemikaali manustamata jätmises. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleks võrdlusrühma loomadele manustada kandeainet suurimas kasutatavas koguses. 24. Annuste valimisel tuleks võtta arvesse kõiki kättesaadavaid mürgisusandmeid ja (toksiko)kineetilisi andmeid. Samuti tuleks arvesse võtta, et tiinete ja mittetiinete loomade tundlikkus võib olla erinev. Suurim annus tuleks valida nii, et kemikaal avaldaks mürgist mõju, kuid ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Seejärel tuleks valida rida järk-järgult vähenevaid annuseid, mis võimaldaksid tõendada mõju sõltuvust annusest ja teha väikseima annuse põhjal kindlaks täheldatava kahjuliku toime puudumise annuse (NOAEL). Sageli on optimaalne vähenevate annuste vaheline erinevus kahe- kuni neljakordne ning üksteisest väga palju (näiteks üle 10 korra) erinevate annuste kasutamise asemel on tihti soovitatav lisada neljas katserühm. 25. Kui täheldatakse üldist mürgisust (nt kehamassi vähenemine, mõju maksale, südamele, kopsudele või neerudele jne) või muid muutusi, mis ei pruugi olla tingitud mürgisusest (nt väiksem söödatarbimine, maksa suurenemine), tuleks täheldatud mõju sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajatele tõlgendada ettevaatusega. Piirsisalduskatse 26. Kui käesoleva meetodi kohaselt läbi viidud suukaudse manustamise uuringus, milles kasutatakse ainsa annusena annust vähemalt 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas või sööda või joogiveega manustamise korral sellega samaväärset protsentuaalset sisaldust söödas või joogivees, ei täheldata mürgist mõju ja kui mürgisus ei ole uuritava kemikaaliga struktuurilt sarnaste ainetega saadud andmete põhjal ootuspärane, ei pruugita pidada mitme eri annusega täismahus uuringu tegemist vajalikuks. Piirsisalduskatse tulemused on kohaldatavad, kui inimese kokkupuutega seotud andmed ei viita vajadusele kasutada suukaudsel manustamisel suuremat annusemäära. Muu manustamisviisi korral, näiteks sissehingamise teel või naha kaudu manustamisel võib uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest tulenevalt olla tihti vaja kasutada suurimat saavutatavat kontsentratsiooni. Annuste manustamine 27. Uuritavat kemikaali manustatakse loomadele seitsmel päeval nädalas. Kui manustamiseks kasutatakse toitmissondi, tuleks kemikaali loomadele manustada ühe annusena maosondi või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Suurim korraga manustatav vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. See kogus ei tohiks olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuse puhul, mida võib manustada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Katses kasutatava vedelikukoguse varieeruvuse minimeerimiseks tuleks reguleerida uuritava kemikaali kontsentratsiooni nii, et lahuse maht oleks kõikide annuste puhul ühesugune; see ei ole nõutav ärritava või söövitava uuritava kemikaali puhul, mille mõju kontsentratsiooni suurenedes tavaliselt tugevneb. 28. Sööda või joogiveega manustatava uuritava kemikaali puhul on oluline tagada, et seda kasutatakse koguses, mis ei muuda tavapärast toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas muutumatut kontsentratsiooni söödas (ppm) või looma kehamassi suhtes muutumatut annusemäära; tuleks täpsustada, kumba võimalust kasutatakse. Toitmissondi kaudu manustatava uuritava kemikaali puhul peaks manustamine toimuma igal päeval sarnasel kellaajal ning annusemäära tuleks vähemalt kord nädalas kohandada, et see püsiks looma kehamassi suhtes muutumatuna. Katse ajakava 29. Annuste manustamist tuleks kummagi soo puhul alustada vähemalt kaks nädalat enne paaritamist pärast seda, kui loomadel on lastud vähemalt viis päeva kohaneda ja emasloomi on hinnatud lähtuvalt innatsükli tavapärasest kestusest (töötlemiseelse kahe nädala pikkuse perioodi vältel). Uuringu ajakava peaks olema selline, et innatsükli hindamist alustatakse varsti pärast seda, kui loomad on saanud täielikult suguküpseks. See aeg võib olla eri rotiliinidel ja eri laborites veidi erinev: näiteks Sprague Dawley rottidel saabub suguküpsus 10 nädala vanuses ja Wistari rottidel umbes 12 nädala vanuses. Järglastega emasloomad tuleks surmata 13. sünnitusjärgsel päeval või veidi hiljem. Sünnitamispäeva (päev, mil sünnitus lõpeb) loetakse sünnitusjärgseks 0-päevaks. Emasloomad, kellel ei täheldata paaritumise ilminguid, surmatakse 24–26 päeva pärast paaritumisperioodi viimast päeva. Paaritumisperioodi vältel jätkatakse kummastki soost loomadele kemikaali manustamist. Isasloomadele manustamist tuleks paaritumisperioodi järgselt jätkata vähemalt seni, kuni manustamisperioodi algusest on möödunud kokku minimaalselt 28 päeva. Seejärel loomad surmatakse või teise võimalusena jätkatakse neile kemikaali manustamist, et viia võimaluse korral läbi teine paaritamine, kui seda peetakse asjakohaseks. 30. Tiinestunud emasloomade puhul tuleks igapäevast manustamist jätkata kogu tiinuse vältel ning vähemalt kuni 13. sünnitusjärgse päevani, sealhulgas nimetatud päeval, või kuni surmamiseelse päevani. Uuringute puhul, kus uuritavat kemikaali manustatakse sissehingamise teel või naha kaudu, tuleks manustamist jätkata vähemalt kuni 19. tiinuspäevani, sealhulgas nimetatud päeval, ning taasalustada seda võimalikult varakult ja mitte hiljem kui 4. sünnitusjärgsel päeval. 31. Katse skemaatiline ajakava on esitatud 2. liites. Paaritamine 32. Käesoleva meetodi kohases uuringus tuleks üldjuhul kasutada paaritamisel suhet 1: 1 (üks isasloom ühe emaslooma kohta). Erandi võib teha juhul, kui isasloomad juhtuvad surema. Emaslooma tuleks hoida sama isaslooma juures seni, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid või on möödunud kaks nädalat. Emasloomi tuleks igal hommikul uurida sperma või tupekorgi esinemise suhtes. Tiinuse 0-päevaks loetakse päeva, mil paaritumise toimumine leiab kinnitust (leitakse tupekork või spermat). Kui paaritamine ebaõnnestub, võib kaaluda emaslooma uuesti paaritamist sama rühma viljakaks osutunud isasloomaga. Pesakonna suurus 33. Neljandal sünnijärgsel päeval võib iga pesakonna suurust korrigeerida; selleks kõrvaldatakse juhuvaliku alusel üleliigsed järglased nii, et pesakonda jääks sõltuvalt kasutatava rotiliini puhul tavapärasest pesakonna suurusest võimalikult täpselt neli või viis järglast kummagi soo kohta. Üleliigsetest järglastest kahelt tuleks võtta vereproov, moodustada nendest koondproov ja kasutada seda seerumi T 4 -sisalduse määramiseks. Järglaste selektiivne kõrvaldamine, näiteks kehamassi või anogenitaalse vahemaa (AGD) alusel, ei ole sobiv. Kui emaste või isaste järglaste arv ei võimalda jätta pesakonda nelja või viit järglast kummastki soost, on vastuvõetav ka osaline korrigeerimine (nt kuus isast ja neli emast). Kui pesakond jääks kõrvaldamise tagajärjel väiksemaks kui kõrvaldamisega saavutatav soovitud sihtarv (8 või 10 järglast pesakonna kohta), ei kõrvaldata ühtki järglast. Kui kõrvaldamisega saavutatava soovitud sihtarvuga võrreldes on üle ainult üks järglane, kõrvaldataksegi vaid üks järglane, kellelt võetakse vereproov võimalikuks seerumi T 4 -sisalduse hindamiseks. 34. Kui pesakonna suurust ei korrigeerita, surmatakse 4. sünnijärgsel päeval igast pesakonnast kaks järglast ning neilt võetakse vereproov seerumi kilpnäärmehormoonisisalduse mõõtmiseks. Võimaluse korral peaksid kõnealused kaks järglast igast pesakonnast olema emased, et võimaldada isaste järglaste kasutamist nisade esinemise hindamiseks; see soovitus ei kehti juhul, kui kõnealuse kahe järglase eemaldamisel ei jääks pesakonda ühtki emast, keda uuringu lõpus hinnata. Kui pesakonda jääks kõrvaldamise tagajärjel vähem kui 8 või 10 järglast (olenevalt kasutatava rotiliini puhul tavapärasest pesakonna suurusest), ei kõrvaldata ühtki järglast. Kui pesakonna tavapärase suurusega võrreldes on üle ainult üks järglane, kõrvaldataksegi vaid üks järglane, kellelt võetakse vereproov võimalikuks seerumi T 4 -sisalduse hindamiseks. Elusloomadel tehtavad vaatlused Kliinilised vaatlused 35. Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks kogu uuringuperioodi vältel teha vähemalt kord päevas ja mürgisusnähtude ilmnemisel sagedamini. Vaatlusi tuleks soovitatavalt teha igal päeval samal ajal või samadel aegadel; seejuures tuleks võtta arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise aega. Tuleks registreerida asjakohased muutused käitumises, raskele või kauakestnud sünnitusele viitavad ilmingud ja kõik mürgisusnähud, sealhulgas suremus. Registreeritavad andmed peaksid hõlmama mürgisusnähtude esinemise algusaega, ulatust ja kestust. Kehamass ja sööda/vee tarbimine 36. Isas- ja emasloomi tuleks kaaluda esimesel manustamispäeval ning seejärel vähemalt kord nädalas, samuti surmamise ajal. Tiinuse ajal tuleks emasloomi kaaluda tiinuse 0-päeval, 7., 14. ja 20. päeval, samuti tuleks neid kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Nimetatud vaatluste tulemused tuleks esitada eraldi iga täiskasvanud looma kohta. 37. Paaritumiseelsel perioodil ning tiinuse ja imetamise ajal tuleks söödatarbimist mõõta vähemalt kord nädalas. Paaritumisperioodil ei ole söödatarbimise mõõtmine kohustuslik. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks eelnimetatud perioodidel mõõta ka veetarbimist. Innatsükkel 38. Enne töötlemise alustamist tuleks jälgida innatsüklit ning valida selle alusel uuringusse emasloomad, kelle tsükkel on korrapärane (vt punkt 22). Tupeäigeid tuleks igapäevaselt hinnata ka alates töötlemisperioodi algusest kuni paaritumise ilmingute tuvastamiseni. Kui on kahtlus, et innatsükkel võib pärast manustamise alustamist ägeda stressi mõjul muutuda, võib katseloomi laboris 2 nädala vältel uuritava kemikaaliga töödelda ning seejärel koguda paaritumiseelsel perioodil innatsükli jälgimiseks vähemalt kahe nädala jooksul iga päev tupeäigeid ja jätkata jälgimist ka paaritumisperioodil, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid. Tupe-/emakakaelarakkude võtmisel tuleks olla ettevaatlik, et mitte kahjustada limaskesta, kuna see võib põhjustada pseudotiinuse teket (7, 8). Järglastega seotud näitajad 39. Tiinuse kestus tuleks registreerida; selle arvutamisel lähtutakse tiinuse 0-päevast. Iga pesakonda tuleks pärast sündi võimalikult varakult hinnata, et teha kindlaks järglaste arv ja sugu, surnultsünnid, elussünnid, kängunud järglaste (vastavatest kontrolljärglastest palju väiksemate järglaste) arv ja silmaga nähtavate kõrvalekallete esinemine. 40. Elus järglased tuleks loendada ja määrata nende sugu ning pesakonda tuleks kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Peale punktis 35 kirjeldatud vaatluste tulemuste tuleks registreerida ka kõik järglaste ebatavalise käitumise ilmingud. 41. Kõikidel järglastel tuleks ajavahemikul sünnijärgsest 0-päevast kuni 4. sünnijärgse päevani mõõta ühel ja samal päeval AGD. Järglaste kehamassi andmed tuleks koguda AGD mõõtmise päeval ja AGD tuleks normaliseerida järglase suurust kajastava näitaja, soovitatavalt kehamassi kuupjuure suhtes (9). Isastel järglastel tuleks 12. või 13. sünnijärgsel päeval loendada nisade/areoolide arv, nagu on soovitatud OECD katsejuhendis nr 151 (10). Kliiniline biokeemiline analüüs 42. Vereproovid võetakse kindlaksmääratud kohast järgmise kava alusel: — igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt 4. sünnijärgsel päeval, kui järglaste arv seda võimaldab (vt punktid 33–34), — kõikidelt järglastega emasloomadelt ja igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt surmamise ajal 13. päeval ning — kõikidelt täiskasvanud isasloomadelt surmamise ajal. Kõiki vereproove säilitatakse sobivates tingimustes. Järglastelt 13. päeval võetud vereproovides ja täiskasvanud isasloomade vereproovides analüüsitakse kilpnäärmehormoonide (T4) sisaldust seerumis. Kui see on asjakohane, hinnatakse T4 sisaldust ka järglastega emasloomade vereproovides ja järglastelt 4. päeval võetud vereproovides. Kui see on asjakohane, võib soovi korral mõõta ka muude hormoonide sisaldust. Järglaste vere võib kilpnäärmehormoonide analüüsimiseks pesakonnakaupa kokku koondada. Soovitatavalt tuleks mõõta kilpnäärmehormoonide (T4 ja TSH) üldsisaldust. 43. Hormoonide määramisel võivad varieeruvust ja absoluutset kontsentratsiooni mõjutada järgmised tegurid: — surmamise aeg tulenevalt asjaolust, et hormoonide kontsentratsioon ööpäeva jooksul muutub; — surmamisviis – tuleks hoiduda tekitamast loomadele tarbetut stressi, mis võib mõjutada hormoonide kontsentratsiooni; — hormoonide määramise komplektid, milles kasutatavad standardkõverad võivad olla erinevad. 44. Konkreetselt hormoonide määramiseks ette nähtud eri plasmaproovid tuleks koguda umbes samal kellaajal. Hormoonisisalduse analüüsimisel saadavad arvväärtused on müügilolevate eri katsekomplektide puhul erinevad. Patoloogiline analüüs Täielik lahkamine 45. Surmatud või uuringu vältel surnud täiskasvanud loomi tuleks kohe pärast surma makroskoopiliselt uurida mis tahes kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Tuleks registreerida pesastumiskohtade arv. Lahkamispäeva hommikul tuleks analüüsida tupeäiet, et teha kindlaks innatsükli etapp ja võimaldada korreleerimist munasarja histopatoloogilise analüüsi tulemustega. 46. Kõikide täiskasvanud isasloomade munandid ja munandimanused ning eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega tuleks vajaduse korral vabastada nende külge jäänud kudedest ja kuivamise ärahoidmiseks tuleks elundite märgmass määrata võimalikult kiiresti pärast nende väljalõikamist. Peale selle võib soovi korral kaaluda isasloomade puhul sellised elundid nagu pärakutõsturlihase ja sibulakäsnkeha-lihase kompleks, Cowperi näärmed ja sugutilukk ning emasloomade puhul munasarjade paar (märgmass) ja emakas (koos emakakaelaga); kui seda tehakse, peaks kaalumine toimuma võimalikult kiiresti pärast elundite väljalõikamist. 47. Surnud järglasi ja 13. sünnijärgsel päeval või varsti pärast seda surmatud järglasi tuleks miinimumnõudena väliselt hoolikalt uurida silmaga nähtavate kõrvalekallete suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata välistele suguelunditele, mida tuleks uurida arenguhäirete ilmingute suhtes. Kolmeteistkümnendal sünnijärgsel päeval tuleks võtta säilitamiseks kilpnääre iga pesakonna ühelt isaselt ja ühelt emaselt järglaselt. 48. Samuti tuleks säilitada kõikide täiskasvanud loomade munasarjad, munandid, suguelundid (emakas ja emakakael, munandimanused, eesnääre, seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega), kilpnääre ja kõik makroskoopiliste kahjustustega elundid. Munandite ja munandimanuste tavapärasel analüüsil ei soovitata kasutada fikseerimist formaliiniga. Nende kudede puhul võib vastuvõetava meetodina kasutada Bouini fikseerimislahust või muudetud Davidsoni lahust (11). Fikseerimislahuse kiire sissetungimise võimaldamiseks võib elundi kummaski otsas valkjaskesta ettevaatlikult väikese sügavuseni nõelaga läbi torgata. Histopatoloogiline analüüs 49. Suurima annusega töödeldud rühma ja kontrollrühma loomade puhul tuleks viia läbi munasarjade, munandite ja munandimanuste üksikasjalik histoloogiline uuring (seejuures tuleks pöörata erilist tähelepanu spermatogeneesi etappidele ja munandite interstitsiaalrakustruktuuri histopatoloogilisele analüüsile). Vajaduse korral võib uurida ka teisi säilitatud elundeid, sealhulgas järglastelt ja täiskasvanud loomadelt saadud kilpnääret. Kilpnäärme massi võib määrata pärast fikseerimist. Liigsed koed tuleks samuti eemaldada väga ettevaatlikult alles pärast fikseerimist, et kudesid mitte kahjustada. Koekahjustus võib mõjutada histopatoloogilise analüüsi tulemusi. Kui suurima annusega töödeldud rühmas täheldatakse muutusi, peaks analüüs hõlmama ka teiste annuserühmade loomi. Täiendav üksikasjalik teave sisesekretsioonisüsteemi kudede väljalõikamise, fikseerimise, neist lõikude tegemise ja nende histopatoloogilise analüüsi kohta on esitatud histopatoloogilise analüüsi juhendis (11). ANDMED JA ARUANDLUS Andmed 50. Andmed tuleks esitada iga looma kohta eraldi. Peale selle tuleks esitada kõik andmed kokkuvõtliku tabeli kujul, kus on iga katserühma puhul toodud ära loomade arv katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel surmatud loomade arv ning surma või humaanse surmamise aeg, viljakate loomade arv, tiinete emasloomade arv, mürgisusnähtudega loomade arv, mürgisusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise mõju ilmnemisaeg, kestus ja tugevus, histopatoloogiliste muutuste liik ja kõik asjakohased andmed pesakonna kohta. Paljunemisele/arengule avalduva mõju hindamiseks väga kasulikuks osutunud aruandevorm kokkuvõtliku tabeli kujul on esitatud 3. liites. 51. Uuringu piiratud ulatusest tulenevalt on tulemuste olulisuse tuvastamiseks tehtava statistilise analüüsi väärtus paljude lõppnäitajate, eelkõige paljunemisega seotud lõppnäitajate puhul piiratud. Statistilise analüüsi kasutamisel tuleks valida meetod, mis on uuritava muutuja väärtuste jaotuse analüüsimiseks sobiv, ning see valik tuleks teha enne uuringu alustamist. AGD ja nisade esinemise statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonnas ilmnevat mõju. Vajaduse korral käsitatakse analüüsiüksusena pesakonda. Järglaste kehamassi statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonna suurust. Ühtlasi võib rühmade väiksusest tulenevalt olla kasulik kasutada uuringutulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks varasemaid kontrollidega saadud andmeid (nt pesakonna suuruse kohta), kui need on olemas. Tulemuste hindamine 52. Käesoleva meetodi kohase mürgisusuuringu tulemusi tuleks hinnata lähtuvalt täheldatud mõjust, lahkamistulemustest ja mikroskoopilistest leidudest. Hindamine hõlmab seose kindlakstegemist uuritava kemikaali annuse ja kõrvalekallete – sealhulgas silmaga nähtavate kahjustuste, tuvastatud sihtelunditele avalduva mõju, viljatuse, kliiniliste kõrvalekallete, paljunemisvõimele ja pesakonnale avalduva mõju, kehamassi muutuste, suremusele avalduva mõju ja mis tahes muu mürgise mõju – esinemise või puudumise, esinemissageduse ja raskusastme vahel. 53. Isasloomade töötlemise lühiajalisuse tõttu tuleks isasloomade paljunemisele avalduva mõju hindamisel vaadelda munandite ja munandimanuste histopatoloogilise analüüsi tulemusi koos viljakusandmetega. Ühtlasi võib uuringutulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks olla kasulik kasutada kontrollidega saadud varasemaid paljunemist/arengut käsitlevaid andmeid (nt pesakonna suuruse, AGD, nisade esinemise või seerumi T 4 -sisalduse kohta), kui need on olemas. 54. Kvaliteedikontrolli eesmärgil on soovitatav koguda kontrolle käsitlevaid varasemaid andmeid ja arvutada arvandmete jaoks variatsioonikordajad, eriti näitajate puhul, mis on seotud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemisega. Neid andmeid võib kasutada võrdlusalusena käsiloleva uuringu tulemuste hindamiseks. Katseprotokoll 55. Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave. Uuritav kemikaal: — allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas; — uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada; ühest koostisosast koosnev aine: — füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused; — kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne; mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu: — võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest. Kandeaine (vajaduse korral): — kandeaine valimise põhjendus, kui kandeaine ei ole vesi. Katseloomad: — kasutatud liik/liin; — loomade arv, vanus ja sugu; — päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne; — iga looma kehamass katse alguses; — liigi valimise põhjendus, kui katseloom ei ole rott. Katsetingimused: — annuste valimise põhjendus; — üksikasjad uuritava kemikaali valmistise / söödavalmistise, saavutatud kontsentratsioonide ning valmistise püsivuse ja homogeensuse kohta; — uuritava kemikaali manustamise üksikasjad; — vajaduse korral andmed söödas/joogivees sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) teisendamiseks tegelikuks annuseks (mg kehamassi kilogrammi kohta päevas); — sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad; — järglaste surmamise korral üksikasjalik kirjeldus surmatavate järglaste juhusliku valimise korra kohta. Tulemused: — kehamass / kehamassi muutused; — söödatarbimine ja veetarbimise andmed, kui need on olemas; — mürgise mõju andmed kummagi soo ja iga annusemäära kohta, sealhulgas viljakusele ja tiinusele avalduva mõju ning mis tahes muude mürgisusnähtude kohta; — tiinuse kestus; — mürgisus või muu mõju paljunemisele, järglastele, sünnijärgsele kasvule jne; — kliiniliste ilmingute laad, raskusaste ja kestus (nähtude pöörduvus või pöördumatus); — normaalse või ebanormaalse innatsükliga täiskasvanud emasloomade arv ja tsükli kestus; — elussündide arv ja pesastumisjärgne kadu; — järglaste kehamassi andmed; — iga järglase AGD (ja kehamass AGD mõõtmise päeval); — nisade esinemine isastel järglastel; — kilpnäärmehormoonide sisaldus järglastelt 13. päeval võetud proovides ja täiskasvanud isasloomade proovides (ning järglastega emasloomade proovides ja järglastelt 4. päeval võetud proovides, kui seda on mõõdetud); — silmaga nähtavate kõrvalekalletega järglaste arv, väliste suguelundite makroskoopilise hindamise tulemused, kängunud järglaste arv; — katse vältel suremise aeg või teave selle kohta, et loomad olid kuni surmamiseni elus; — pesastunud embrüote arv, pesakonna suurus ja pesakonna kaal mõõtmishetkel; — andmed järglastega loomade kehamassi kohta surmamise hetkel ning selliste loomade elundite massi kohta; — lahkamistulemused; — histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus; — andmed absorbeerumise kohta (kui on olemas); — vajaduse korral tulemuste statistilise analüüsi andmed. Tulemuste arutelu Järeldused Tulemuste tõlgendamine 56. Kirjeldatud uuring võimaldab hinnata annuste korduval manustamisel täheldatavat paljunemisele/arengule avalduvat mürgist mõju (vt punktid 5 ja 6). Saadud tulemused võivad viidata vajadusele teha täiendavaid uuringuid ja hõlbustavad järgnevate uuringute kavandamist. Paljunemise ja arenguga seotud tulemuste hõlpsamaks tõlgendamiseks tuleks tutvuda OECD juhenddokumendiga nr 43 (12). Käesoleva katsemeetodi puhul võib olla kasu närilistega tehtavate sisesekretsioonisüsteemi ja paljunemisega seotud katsete tulemuste histoloogilist hindamist käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 106 (11) esitatud teabest (sisesekretsiooni)elundite ja tupeäiete ettevalmistamise ja hindamise kohta. KIRJANDUS (1) OECD (1990). Kemikaalide töörühma ja halduskomitee 14. ühiskoosoleku koosolekudokument nr 1. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis. (2) OECD (1992). Ajutise eksperdirühma esimehe aruanne reproduktiivtoksilisust käsitlevate sõeluuringumeetodite alase koosoleku kohta. Tokyo, 27.–29. oktoober 1992. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis. (3) OECD (1998). Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise (EDTA) OECD rakkerühma esimese koosoleku aruanne. 10.–11. märts 1998. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 217. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (7) Goldman, J. M., Murr, A. S., ja Cooper, R. L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies. Birth Defects Res. B 80(2): 84–97. (8) Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons. Väljaandes: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization. Auston, C. R., ja Short, R. V. (toim.), Cambridge, New York. (9) Gallavan, R. H. Jr., Holson, J. F., Stump, D. G., Knapp, J. F., ja Reynolds, V. L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights. Reprod. Toxicol. 13: 383–390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 151. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 106. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 43. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. 1. liide MÕISTED (VT KA OECD JUHENDDOKUMENT NR 150 (6)) Androgeensus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik androgeen (nt testosteroon). Annus – manustatav uuritava kemikaali kogus. Annust väljendatakse uuritava kemikaali kogusena massiühikutes katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas) või kemikaali püsiva kontsentratsioonina söödas. Annustamine – üldmõiste, mis hõlmab annust, selle manustamise sagedust ja annustamise kestust. Antiandrogeensus – kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku androgeeni (nt testosterooni) toimet. Antitüreoidne aktiivsus – kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku kilpnäärmehormooni (nt T3) toimet. Antiöstrogeensus – kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku östrogeeni (nt 17β-östradiooli) toimet. Arengutoksilisus – reproduktiivtoksilisuse ilming, mis avaldub järglaste sünnieelse, perinataalse või sünnijärgse struktuuri- või funktsioonihäirena. Emale avalduv mürgisus – tiinele emasloomale avalduv kahjulik mõju, mis on spetsiifiline (otsene mõju) või mittespetsiifiline (kaudne mõju). Ilmne mürgisus – üldmõiste, mille abil kirjeldatakse uuritava kemikaali manustamise järel täheldatavaid selgeid mürgisusnähte. Kõnealused nähud peaksid olema ohu hindamiseks piisavad ja sellised, et manustatava annuse suurendamisega kaasnevad eeldatavalt tõsised mürgisusnähud ja tõenäoliselt ka surm. Kemikaal – aine või segu. NOAEL – lühend, millega tähistatakse annusemäära, mille juures ei täheldata kahjulikku toimet. Tegemist on suurima annusega, mis ei põhjusta manustamisest tingitud kahjulikke ilminguid. Reproduktiivtoksilisus – kahjulik mõju järglastele ja/või isas- või emasloomade paljunemisfunktsioonile või paljunemisvõimele. Türeoidne aktiivsus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik kilpnäärmehormoon (nt T3). Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil. Valideerimine – teaduslik protsess, mille eesmärk on iseloomustada katsemeetodi rakendamisega seotud nõudeid ja piiranguid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja sobivust konkreetsel eesmärgil kasutamiseks. Viljakuse vähenemine – isas- või emaslooma paljunemisfunktsiooni häire või paljunemisvõime langus. Östrogeensus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik östrogeen (nt 17β-östradiool). 2. liide UURINGU MAKSIMUMKESTUSELE VASTAV TÄISPIKAL 14-PÄEVASEL PAARITUMISPERIOODIL PÕHINEV KATSE SKEMAATILINE AJAKAVA ﻿3. liide TABELI KUJUL KOKKUVÕTLIK ARUANNE PALJUNEMISELE/ARENGULE AVALDUVA MÕJU KOHTA VAATLUSED VÄÄRTUSED Annus (ühik) 0 (kontroll) … … … … Paaride arv katse alguses (N) Innatsükkel (vähemalt keskmine pikkus ja ebaregulaarsete tsüklite esinemissagedus) Emasloomad, kellel täheldatakse paaritumise ilminguid (N) Tiinestunud emasloomad (N) Eostunud 1.–5. päeval (N) Eostunud 6.–… (21) päeval (N) Tiinuse kestus ≤ 21 päeva (N) Tiinuse kestus 22 päeva (N) Tiinuse kestus ≥ 23 päeva (N) Elusalt sündinud järglastega emasloomad (N) 4. sünnijärgse päevani elus püsinud järglastega emasloomad (N) Pesastunud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta (keskmine) Elussündide arv järglastega emaslooma kohta (keskmine) 4. päevani elus püsinud järglaste arv järglastega emaslooma kohta (keskmine) Sugude vahekord (isased/emased) sünnihetkel (keskmine) Sugude vahekord (isased/emased) 4. päeval (keskmine) Pesakonna kaal sünnihetkel (keskmine) Pesakonna kaal 4. päeval (keskmine) Järglaste kehamass sünnihetkel (keskmine) Järglaste kehamass AGD mõõtmise hetkel (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine) Järglaste AGD samal sünnijärgsel päeval ajavahemikul sündimispäevast kuni 4. päevani (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine; märkida sünnijärgne mõõtmispäev) Järglaste kehamass 4. päeval (keskmine) Nisade esinemine isastel järglastel 13. päeval (keskmine) Järglaste kehamass 13. päeval (keskmine) KÕRVALEKALLETEGA JÄRGLASED Järglastega emasloomad, kellel on 0 kõrvalekalletega järglast Järglastega emasloomad, kellel on 1 kõrvalekalletega järglane Järglastega emasloomad, kellel on ≥ 2 kõrvalekalletega järglast JÄRGLASTE KADU Sünnieelne/pesastumisjärgne (pesastunud embrüote arvu ja elussündide arvu vahe) 0 järglast kaotanud emasloomad 1 järglase kaotanud emasloomad 2 järglast kaotanud emasloomad ≥ 3 järglast kaotanud emasloomad Sünnijärgne (elussündide arvu ja 13. sünnijärgse päevani elus püsinud järglaste arvu vahe) 0 järglast kaotanud emasloomad 1 järglase kaotanud emasloomad 2 järglast kaotanud emasloomad ≥ 3 järglast kaotanud emasloomad B.64 REPRODUKTIIV-/ARENGUTOKSILISUSE SÕELUURINGUT HÕLMAV KORDUVANNUSTAMISEL PÕHINEV MÜRGISUSUURING SISSEJUHATUS 1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 422 (2016). Kemikaalide uurimist käsitlevaid OECD katsejuhendeid vaadatakse teaduse arengu arvessevõtmiseks korrapäraselt läbi. Algne sõeluuringut käsitlev katsejuhend nr 422 võeti vastu 1996. aastal ühe reproduktiiv-/arengutoksilisuse hindamist hõlmava korduvannustamisel põhineva sõeluuringu katse-eeskirja põhjal, mida arutati kahel ekspertide koosolekul, mis toimusid 1990. aastal Londonis (1) ja 1992. aastal Tokyos (2). 2. Käesoleva katsemeetodi puhul on reproduktiiv-/arengutoksilisuse sõeluuring, mis põhineb liikmesriikides suures mahus toodetavate olemasolevate kemikaalide hindamiseks kasutatud algse meetodiga omandatud ja positiivseid kontrollaineid hõlmavatest ettevalmistavatest katsetest saadud kogemustel (3, 4), ühendatud korduvannustamisel avalduva mürgisuse uuringuga, mis on kooskõlas OECD katsejuhendiga nr 407 (sellele vastab käesoleva lisa peatükk B.7 „Suukaudse kordusdoosi toksilisuse 28-päevane uuring närilistel“). 3. Käesolevat katsemeetodit on ajakohastamise eesmärgil täiendatud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivate lõppnäitajatega, mis lisati järelmeetmena lähtuvalt prioriteetsest tegevussuunast, mille OECD käivitas 1998. aastal eesmärgiga vaadata läbi olemasolevad ja töötada välja uued katsejuhendid, et võimaldada sõeluuringute tegemist võimalike endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide tuvastamiseks ja selliste kemikaalide hindamist (5). Selles kontekstis täiendati 2008. aastal katsejuhendit nr 407 (sellele vastab käesoleva lisa peatükk B.7) parameetritega, mis sobivad uuritavate kemikaalide endokriinse toime tuvastamiseks. Katsejuhendi nr 422 ajakohastamise eesmärk oli lisada sõeluuringut käsitlevasse juhendisse teatavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida saab hinnata juhul, kui kokkupuuteperiood hõlmab mõnda tundlikku arenguperioodi (sünnieelset või varajast sünnijärgset perioodi). 4. Peale selle lisati katsejuhendisse nr 422 täiendavad endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimiseks sobivad lõppnäitajad, mida sisaldab ka katsejuhend nr 443 (sellele vastab käesoleva lisa peatükk B.56 „Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuring“); need lõppnäitajad valiti lähtuvalt ühest teostatavusuuringust, milles käsitletakse asjaomaste lõppnäitajate lisamisega seotud teaduslikke ja tehnilisi küsimusi, ning võimalikust vajadusest katsemeetodit nende lisamiseks kohandada (6). 5. Käesolev katsemeetod on kavandatud piiratud hulga andmete saamiseks uuritava kemikaali mõju kohta isas- ja emasloomade paljunemisvõimele, näiteks sugunäärmete talitlusele, paaritumiskäitumisele, eostumisele, sügoodi arengule ja sünnitamisele. See ei ole ette nähtud kasutamiseks olemasolevate katsemeetodite B.31, B.34, B35 või B.56 alternatiivina ega nende asendamiseks. LÄHTEKAALUTLUSED 6. Uuritava kemikaali mürgisust põhjustavate omaduste kindlakstegemiseks ja hindamiseks võib teha korduval suukaudsel manustamisel avalduva mürgisuse uuringu pärast seda, kui ägeda mürgisuse katsetest on saadud esialgsed andmed kemikaali mürgisuse kohta. Käesoleva meetodi kohane uuring võimaldab saada teavet võimalike terviseohtude kohta, mis avalduvad suhteliselt piiratud ajavahemiku jooksul toimuva korduva kokkupuute tagajärjel. Käesolev meetod hõlmab lihtsat korduvannustamisel põhinevat mürgisusuuringut, mida võib kasutada kemikaalide jaoks, mille puhul 90-päevase uuringu tegemine ei ole põhjendatud (näiteks kui tootmismaht ei ületa teatavat piiri), või eeluuringuna enne pikaajalise uuringu läbiviimist. Uuringu tegemisel tuleks järgida juhtpõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19, milles käsitletakse ohutuse hindamiseks kasutatavatel katseloomadel avalduvate kliiniliste tunnuste kindlakstegemist, hindamist ja kasutamist humaanse sekkumise vajadusele viitavate näitajatena (7). 7. Peale selle hõlmab käesolev katsemeetod ka reproduktiiv-/arengutoksilisuse sõeluuringut ning seepärast saab seda ühtlasi kasutada uuritava kemikaali toksikoloogiliste omaduste hindamise varajases etapis või probleemse kemikaali uurimisel esialgse teabe saamiseks võimaliku mõju kohta isas- ja emasloomade paljunemisvõimele, näiteks sugunäärmete talitlusele, paaritumiskäitumisele, eostumisele, sügoodi arengule ja sünnitamisele. Käesolev katsemeetod ei võimalda saada ammendavat teavet kõikide paljunemisvõime ja arenguga seotud aspektide kohta. Eelkõige lubab see tuvastada sünnieelse kokkupuute tagajärjel sünnijärgselt avalduvaid ilminguid ja sünnijärgsest kokkupuutest tulenevat mõju üksnes piiratud ulatuses. Käesoleva meetodiga ei saa koguda tõendeid, mis lubaksid lõplikult kinnitada paljunemisele/arengule avalduva mõju puudumist; see on muu hulgas tingitud lõppnäitajate selektiivsusest ja uuringu lühikesest kestusest. Täheldatavaid positiivseid tulemusi aga on võimalik muudest reproduktiiv-/arengutoksilisuse uuringutest saadavate andmete puudumisel kasutada esialgseks ohuhindamiseks ning need aitavad teha otsuseid täiendavate uuringute tegemise vajaduse ja selliste uuringute ajastuse kohta. 8. Sisesekretsioonisüsteemiga seotud näitajaid käsitlevaid tulemusi tuleks vaadelda endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku (8) kontekstis. Nimetatud kontseptuaalses raamistikus on OECD täiendatud katsejuhendi nr 422 kohast meetodit käsitatud 4. taseme in vivo meetodina, mis võimaldab saada andmeid sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajate kaudu tuvastatava kahjuliku mõju kohta. Sisesekretsioonisüsteemist sõltuvat signaali ei pruugita eraldi võetuna siiski pidada piisavaks tõendiks selle kohta, et uuritava kemikaali puhul on tegemist endokriinfunktsiooni kahjustava kemikaaliga. 9. Käesoleva katsemeetodi puhul pööratakse ühtlasi suurt tähelepanu konkreetse lõppnäitajana vaadeldavale neuroloogilisele mõjule ja rõhutatakse loomade hoolika kliinilise jälgimise vajadust, et saada võimalikult palju teavet. Meetod peaks võimaldama teha kindlaks kemikaalide võimaliku neurotoksilisuse, mida võib olla vaja täiendavalt põhjalikumalt uurida. Peale selle võib käesoleva meetodiga saada esialgset teavet immunoloogilise mõju kohta. 10. Täheldatavaid positiivseid tulemusi on võimalik muudest süsteemse mürgisuse, reproduktiiv-/arengutoksilisuse, neurotoksilisuse ja/või immunotoksilisuse uuringutest saadavate andmete puudumisel kasutada esialgseks ohuhindamiseks ning need aitavad teha otsuseid täiendavate uuringute tegemise vajaduse ja selliste uuringute ajastuse kohta. Katse tulemused võivad olla eriti kasulikud OECD sõeluuringute andmekogumi (SIDS) osana selliste olemasolevate kemikaalide hindamisel, mille kohta on vähe toksikoloogilist teavet või see puudub, ning sellist katset saab kasutada kahe eraldi katse asemel, milles hinnatakse vastavalt korduvannustamisel avalduvat mürgisust (OECD katsejuhend nr 407, mis vastab käesoleva lisa peatükile B.7) ja reproduktiiv-/arengutoksilisust (OECD katsejuhend nr 421, mis vastab käesoleva lisa peatükile B.63). Samuti võib seda kasutada ulatuslikumate paljunemisvõimet/arengut käsitlevate uuringute jaoks annusevahemiku kindlaksmääramiseks ning muudel asjakohaseks peetavatel juhtudel. 11. Üldjuhul eeldatakse, et tiinete ja mittetiinete loomade tundlikkus on erinev. Seepärast võib kõnealuses ühendkatses kahe eraldi katse läbiviimisega võrreldes olla keerulisem teha kindlaks sobivad annusemäärad, mis võimaldaksid üheaegselt hinnata nii üldist süsteemset mürgisust kui ka konkreetselt reproduktiiv-/arengutoksilisust. Peale selle võib üldise süsteemse mürgisusega seotud katsetulemuste tõlgendamine olla raskem kui korduvannustamisel põhineva eraldi katse tegemisel, eriti juhul, kui seeruminäitajaid ja histopatoloogilisi näitajaid ei analüüsita uuringus üheaegselt. Nende tehniliste aspektide keerukusest tulenevalt nõuab kõnealuse ühendatud sõeluuringu läbiviimine ulatuslikke kogemusi mürgisuse hindamisel. Teisest küljest võimaldab selline ühendkatse peale väiksema arvu loomade kasutamise paremini eristada paljunemisele/arengule avalduvat otsest mõju mõjust, mis ilmneb muu (süsteemse) mõju tagajärjel. 12. Käesoleva meetodi puhul on manustamisperiood pikem kui tavapärases 28-päevases korduvannustamisel põhinevas uuringus. Samal ajal on kummastki soost loomade arv igas rühmas väiksem kui olukorras, kus peale tavapärase 28-päevase korduvannustamisel põhineva uuringu tehakse veel ka reproduktiiv-/arengutoksilisuse sõeluuring. 13. Käesoleva katsemeetodi puhul eeldatakse, et uuritavat kemikaali manustatakse suu kaudu. Muu manustamisviisi kasutamise korral võib olla vaja teha meetodis muudatusi. 14. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. 15. Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites. KATSE PÕHIMÕTE 16. Uuritavat kemikaali manustatakse astmeliselt suurenevates annustes mitme rühma isas- ja emasloomadele. Isasloomade puhul peaks manustamine toimuma vähemalt nelja nädala kestel kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani, sealhulgas surmamiseelsel päeval (see hõlmab vähemalt kahte paaritumiseelset nädalat, paaritumisperioodi ja umbes kahte paaritumisjärgset nädalat). Kuna isasloomadel on paaritumiseelne manustamisperiood piiratud kestusega, ei pruugi viljakus olla eriti tundlik munanditele avalduva mürgisuse näitaja. Seepärast on vajateha munandite üksikasjalik histoloogiline analüüs. Kahe nädala pikkust paaritumiseelset manustamisperioodi koos järgneva paaritumise/viljakuse jälgimisega ning manustamisperioodi üldkestusega vähemalt neli nädalat, millele järgneb isaslooma sugunäärmete üksikasjalik histopatoloogiline analüüs, peetakse enamiku isasloomal täheldatavate viljakusele ja spermatogeneesile avalduva mõju ilmingute tuvastamiseks piisavaks. 17. Emasloomade puhul peaks manustamine toimuma kogu uuringu kestel. See hõlmab kahte paaritumiseelset nädalat (eesmärk on jälgida vähemalt kahte tervet innatsüklit), eostumisele eelnevat varieeruva pikkusega ajavahemikku, tiinuse kestust ja vähemalt kolmeteistkümne päeva pikkust sünnitusjärgset perioodi, mis kestab kuni kavandatud surmamispäevale eelneva päevani ja hõlmab ka surmamiseelset päeva. 18. Kohanemisperioodile ja innatsükli manustamiseelsele hindamisele järgneva uuringu kestus sõltub emasloomade seisundist ning on umbes 63 päeva (vähemalt 14 päeva pikkune paaritumiseelne periood, (kuni) 14 päeva pikkune paaritumisperiood, 22 päeva pikkune tiinusperiood ja 13 päeva pikkune imetamisperiood). 19. Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi iga päev hoolikalt mürgisusnähtude suhtes. Uuringu kestel surnud või surmatud loomad lahatakse ning uuringu lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. MEETODI KIRJELDUS Loomaliigi valimine 20. Käesolev katsemeetod on kavandatud kasutamiseks rotil. Kui katsejuhendis nr 422 kirjeldatud näitajaid hinnatakse mõne muu liigi närilistel, tuleks seda üksikasjalikult põhjendada. Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemise rahvusvahelises valideerimisprogrammis, mille puhul on lähtutud katsejuhendist nr 407, kasutati ainsa liigina rotte. Ei tohiks kasutada liine, kus sigivus on väike või kus teadaolevalt esineb sageli arenguhäireid. Tuleks kasutada terveid varem paaritamata loomi, keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomi tuleks iseloomustada liigi, liini, soo, kehamassi ja vanuse järgi. Uuringu alguses peaksid kasutatavate loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist. Kui uuring viiakse läbi pikaajalise või tervet põlvkonda hõlmava uuringu eeluuringuna, tuleks mõlemas uuringus soovitatavalt kasutada samast liinist ja sama päritolu loomi. Pidamis- ja söötmistingimused 21. Kõik katsetoimingud peaksid vastama kohalikele laboriloomade hooldamise normidele. Katseloomade ruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Suhteline õhuniiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. 22. Loomade pidamisel tuleks kasutada väikesi samasooliste isendite rühmi; loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud. Rühmas pidamisel ei tohiks puuris olla rohkem kui viis looma. Paaritamine peaks toimuma selleks sobivas puuris. Tiined emasloomad tuleks paigutada igaüks eraldi puuri, kus on olemas pesamaterjal. Imetavad emasloomad paigutatakse igaüks eraldi puuri koos järglaskonnaga. 23. Sööta tuleks korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes. Asjaomase sööda proov tuleks kuni katseprotokolli lõpliku valmimiseni alles hoida. Loomade ettevalmistamine 24. Terved noored täiskasvanud loomad jagatakse juhuvaliku alusel katserühmadesse ja puuridesse. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Loomad idenditakse üheselt ja neil lastakse enne uuringu algust puuris vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Annuste ettevalmistamine 25. Uuritavat kemikaali on soovitatav manustada suu kaudu, välja arvatud juhul, kui mõnda muu manustamisviisi peetakse sobivamaks. Uuritava kemikaali suukaudseks manustamiseks kasutatakse tavaliselt toitmissondi; selle asemel võib siiski kasutada ka sööda või joogiveega manustamist. 26. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda vesilahuse või veepõhise suspensiooni ja seejärel õlilahuse või õlipõhise suspensiooni (nt maisiõli) kasutamist ning pärast seda lahustamist mõnes muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul peaksid olema teada selle mürgisusnäitajad. Tuleks teha kindlaks uuritava kemikaali püsivus ja homogeensus kandeaines. KATSE KÄIK Loomade arv ja sugu 27. Soovitatavalt peaks igas rühmas olema alguses vähemalt 10 isaslooma ja 12–13 emaslooma. Emasloomi hinnatakse kokkupuute eel innatsükli alusel ja loomad, kelle innatsükkel erineb tavapärasest 4–5 päeva pikkusest tsüklist, jäetakse uuringust välja; seepärast on soovitatav kasutada suuremat arvu emasloomi, et igas rühmas oleks lõpuks 10 emaslooma. Eeldatavalt tiinestub igas rühmas vähemalt 8 emaslooma – seda peetakse tavapäraselt minimaalseks vastuvõetavaks tiinestumismääraks –, välja arvatud juhul, kui ilmneb märkimisväärne mürgine mõju. Eesmärk on saada piisav arv tiineid emasloomi, et oleks võimalik usaldusväärselt hinnata uuritava kemikaali võimet mõjutada viljakust, tiinust, ema- ja imetamiskäitumist ning F 1 -põlvkonna järglaste kasvu ja arengut eostamisest kuni kolmeteistkümnenda sünnijärgse päevani. Kui osa loomi on kavas surmata juba katse ajal, tuleks suurendada loomade arvu nende loomade arvu võrra, kes surmatakse plaanijärgselt enne katse lõppu. Tuleks kaaluda võimalust luua kontrollrühma ja suurima annusega töödeldava rühma juurde täiendrühm, millesse kuulub kummastki soost viis looma, et jälgida vähemalt 14 päeva jooksul pärast manustamise lõpetamist süsteemse mürgise mõju pöörduvust, püsivust või viivitusega avaldumist. Täiendrühma loomi ei paaritata ja neid ei kasutata seega reproduktiiv-/arengutoksilisuse hindamisel. Annused 28. Üldjuhul tuleks kasutada vähemalt kolme katserühma ja ühte kontrollrühma. Sobivate üldise mürgisuse andmete puudumisel võib kasutatavate annuste kindlaksmääramise hõlbustamiseks teha annusevahemiku kindlaksmääramise uuringu, kus kasutatakse samast liinist ja sama päritolu loomi. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda täpselt samal viisil kui katserühma loomi; ainus erinevus seisneb uuritava kemikaali manustamata jätmises. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleks võrdlusrühma loomadele manustada kandeainet suurimas kasutatavas koguses. 29. Annuste valimisel tuleks võtta arvesse kõiki kättesaadavaid mürgisusandmeid ja (toksiko)kineetilisi andmeid. Samuti tuleks arvesse võtta, et tiinete ja mittetiinete loomade tundlikkus võib olla erinev. Suurim annus tuleks valida nii, et kemikaal avaldaks mürgist mõju, kuid ei põhjustaks surma ega ilmseid kannatusi. Seejärel tuleks valida rida järk-järgult vähenevaid annuseid, mis võimaldaksid tõendada mõju sõltuvust annusest ja väikseima annuse puhul kahjuliku mõju puudumist. Sageli on eri annuste vaheline optimaalne erinevus kahe- kuni neljakordne ning üksteisest väga palju (näiteks üle 10 korra) erinevate annuste kasutamise asemel on tihti soovitatav lisada neljas katserühm. 30. Kui täheldatakse üldist mürgisust (nt kehamassi vähenemine, mõju maksale, südamele, kopsudele või neerudele jne) või muid muutusi, mis ei pruugi olla tingitud mürgisusest (nt väiksem söödatarbimine, maksa suurenemine), tuleks täheldatud mõju sisesekretsioonisüsteemiga seotud lõppnäitajatele tõlgendada ettevaatusega. Piirsisalduskatse 31. Kui käesoleva meetodi kohaselt läbi viidud suukaudse manustamise uuringus, milles kasutatakse ainsa annusena annust vähemalt 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas või sööda või joogiveega manustamise korral sellega samaväärset protsentuaalset sisaldust söödas või joogivees (see määratakse kindlaks kehamassi mõõtmise alusel), ei täheldata mürgist mõju ja kui mürgisus ei ole uuritava kemikaaliga struktuurilt sarnaste ainetega saadud andmete põhjal ootuspärane, ei pruugita pidada mitme eri annusega täismahus uuringu tegemist vajalikuks. Piirsisalduskatse tulemused on kohaldatavad, kui inimese kokkupuutega seotud andmed ei viita vajadusele kasutada suuremat annusemäära. Muu manustamisviisi korral, näiteks sissehingamise teel või naha kaudu manustamisel võib uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest tulenevalt olla tihti vaja kasutada suurimat saavutatavat kokkupuutemäära. Annuste manustamine 32. Uuritavat kemikaali manustatakse loomadele seitsmel päeval nädalas. Kui manustamiseks kasutatakse toitmissondi, tuleks kemikaali loomadele manustada ühe annusena maosondi või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Suurim korraga manustatav vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. See kogus ei tohiks olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuse puhul, mida võib manustada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Katseskasutatava vedelikukoguse varieeruvuse minimeerimiseks tuleks reguleerida uuritava kemikaali kontsentratsiooni nii, et lahuse maht oleks kõikide annuste puhul ühesugune; see ei ole nõutav ärritava või söövitava uuritava kemikaali puhul, mille mõju kontsentratsiooni suurenedes tavaliselt tugevneb. 33. Sööda või joogiveega manustatava uuritava kemikaali puhul on oluline tagada, et seda kasutatakse koguses, mis ei muuda tavapärast toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas muutumatut kontsentratsiooni söödas (ppm) või looma kehamassi suhtes muutumatut annusemäära; tuleks täpsustada, kumba võimalust kasutatakse. Toitmissondi kaudu manustatava uuritava kemikaali puhul peaks manustamine toimuma igal päeval sarnasel kellaajal ning annusemäära tuleks vähemalt kord nädalas kohandada, et see püsiks looma kehamassi suhtes muutumatuna. Kui ühendkatse viiakse läbi pikaajalise või täismahus reproduktiivtoksilisuse uuringu eeluuringuna, tuleks mõlemas uuringus kasutada samasugust sööta. Katse ajakava 34. Annuste manustamist tuleks kummagi soo puhul alustada kaks nädalat enne paaritamist pärast seda, kui loomadel on lastud vähemalt viis päeva kohaneda ja emasloomi on hinnatud lähtuvalt innatsükli tavapärasest kestusest (töötlemiseelse kahe nädala pikkuse perioodi vältel). Uuringu ajakava peaks olema selline, et innatsükli hindamist alustatakse varsti pärast seda, kui loomad on saanud täielikult suguküpseks. See aeg võib olla eri rotiliinidel ja eri laborites veidi erinev: näiteks Sprague Dawley rottidel saabub suguküpsus 10 nädala vanuses ja Wistari rottidel umbes 12 nädala vanuses. Järglastega emasloomad tuleks surmata 13. sünnitusjärgsel päeval või veidi hiljem. Järglastega emasloomi ja järglasi ei pea tingimata surmama samal päeval, kui järglastega emasloomadel eelistatakse lasta enne vereproovi võtmist hommikuni paastuda. Sünnitamispäeva (päev, mil sünnitus lõpeb) loetakse sünnitusjärgseks 0-päevaks. Emasloomad, kellel ei täheldata paaritumise ilminguid, surmatakse 24–26 päeva pärast paaritumisperioodi viimast päeva. Paaritumisperioodi vältel jätkatakse kummastki soost loomadele kemikaali manustamist. Isasloomadele manustamist tuleks paaritumisperioodi järgselt jätkata vähemalt seni, kuni manustamisperioodi algusest on möödunud kokku minimaalselt 28 päeva. Seejärel loomad surmatakse või teise võimalusena jätkatakse neile kemikaali manustamist, et viia võimaluse korral läbi teine paaritamine, kui seda peetakse asjakohaseks. 35. Tiinestunud emasloomade puhul tuleks igapäevast manustamist jätkata kogu tiinuse vältel ning vähemalt kuni 13. sünnitusjärgse päevani, sealhulgas nimetatud päeval, või kuni surmamiseelse päevani. Uuringute puhul, kus uuritavat kemikaali manustatakse sissehingamise teel või naha kaudu, tuleks manustamist jätkata vähemalt kuni 19. tiinuspäevani, sealhulgas nimetatud päeval, ning taasalustada seda võimalikult varakult ja mitte hiljem kui 4. sünnitusjärgsel päeval. 36. Järelvaatluste jaoks ette nähtud täiendrühma kasutamisel jäetakse sellise rühma loomad paaritamata. Neid tuleks pärast järglastega emasloomade esimest plaanijärgset surmamist pidada veel vähemalt 14 päeva ja selle aja jooksul ei tohiks neile kemikaali manustada, et oleks võimalik hinnata mürgise mõju viivitusega avaldumist või selle püsivust või mürgisest mõjust taastumist. 37. Katse skemaatiline ajakava on esitatud 2. liites. Innatsükkel 38. Enne töötlemise alustamist tuleks jälgida innatsüklit ning valida selle alusel uuringusse emasloomad, kelle tsükkel on korrapärane (vt punkt 27). Tupeäigeid tuleks igapäevaselt hinnata ka alates töötlemisperioodi algusest kuni paaritumise ilmingute tuvastamiseni. Kui on kahtlus, et innatsükkel võib pärast manustamise alustamist ägeda stressi mõjul muutuda, võib katseloomi laboris 2 nädala vältel uuritava kemikaaliga töödelda ning seejärel koguda paaritumiseelsel perioodil innatsükli jälgimiseks vähemalt kahe nädala jooksul iga päev tupeäigeid ja jätkata jälgimist ka paaritumisperioodil, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid. Tupe-/emakakaelarakkude võtmisel tuleks olla ettevaatlik, et mitte kahjustada limaskesta, kuna see võib põhjustada pseudotiinuse teket (8, 9). Paaritamine 39. Käesoleva meetodi kohases uuringus tuleks üldjuhul kasutada paaritamisel suhet 1: 1 (üks isasloom ühe emaslooma kohta). Erandi võib teha juhul, kui isasloomad juhtuvad surema. Emaslooma tuleks hoida sama isaslooma juures seni, kuni täheldatakse paaritumise ilminguid või on möödunud kaks nädalat. Emasloomi tuleks igal hommikul uurida sperma või tupekorgi esinemise suhtes. Tiinuse 0-päevaks loetakse päeva, mil paaritumise toimumine leiab kinnitust (leitakse tupekork või spermat). Kui paaritamine ebaõnnestub, võib kaaluda emaslooma uuesti paaritamist sama rühma viljakaks osutunud isasloomaga. Pesakonna suurus 40. Neljandal sünnijärgsel päeval võib iga pesakonna suurust korrigeerida; selleks kõrvaldatakse juhuvaliku alusel üleliigsed järglased nii, et pesakonda jääks sõltuvalt kasutatava rotiliini puhul tavapärasest pesakonna suurusest võimalikult täpselt neli või viis järglast kummagi soo kohta. Üleliigsetest järglastest kahelt tuleks võtta vereproov, moodustada nendest koondproov ja kasutada seda seerumi T 4 -sisalduse määramiseks. Järglaste selektiivne kõrvaldamine, näiteks kehamassi või anogenitaalse vahemaa (AGD) alusel, ei ole sobiv. Kui emaste või isaste järglaste arv ei võimalda jätta pesakonda nelja või viit järglast kummastki soost, on vastuvõetav ka osaline korrigeerimine (nt kuus isast ja neli emast). Kui pesakond jääks kõrvaldamise tagajärjel väiksemaks kui kõrvaldamisega saavutatav soovitud sihtarv (8 või 10 järglast pesakonna kohta), ei kõrvaldata ühtki järglast. Kui kõrvaldamisega saavutatava soovitud sihtarvuga võrreldes on üle ainult üks järglane, kõrvaldataksegi vaid üks järglane, kellelt võetakse vereproov võimalikuks seerumi T 4 -sisalduse hindamiseks. 41. Kui pesakonna suurust ei korrigeerita, surmatakse 4. sünnijärgsel päeval igast pesakonnast kaks järglast ning neilt võetakse vereproov seerumi kilpnäärmehormoonisisalduse mõõtmiseks. Võimaluse korral peaksid kõnealused kaks järglast igast pesakonnast olema emased, et võimaldada isaste järglaste kasutamist nisade esinemise hindamiseks; see soovitus ei kehti juhul, kui kõnealuse kahe järglase eemaldamisel ei jääks pesakonda ühtki emast, keda uuringu lõpus hinnata. Kui pesakonda jääks kõrvaldamise tagajärjel vähem kui 8 või 10 järglast (olenevalt kasutatava rotiliini puhul tavapärasest pesakonna suurusest), ei kõrvaldata ühtki järglast. Kui pesakonna tavapärase suurusega võrreldes on üle ainult üks järglane, kõrvaldataksegi vaid üks järglane, kellelt võetakse vereproov võimalikuks seerumi T 4 -sisalduse hindamiseks. Vaatlused 42. Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, igal päeval soovitatavalt samal ajal või samadel aegadel; seejuures tuleks võtta arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise aega. Tuleks registreerida loomade tervislik seisund. Kõiki loomi kontrollitakse haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks vähemalt kaks korda päevas. 43. Kõikide paaritatavate loomade puhul tuleks läbi viia üksikasjalikud kliinilised vaatlused üks kord enne uuritava kemikaali manustamist (võimaldamaks sama loomaga saadud tulemuste võrdlemist) ning seejärel vähemalt kord nädalas. Need vaatlused tuleks teha standardalal väljaspool looma pidamiseks kasutatavat puuri ja igal vaatluste tegemise päeval soovitatavalt samal kellaajal. Tulemused tuleks hoolikalt registreerida; selleks tuleks soovitatavalt kasutada katset läbi viivas laboris selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimused varieeruksid võimalikult vähe ja vaatlusi teeksid soovitatavalt isikud, kes ei ole asjaomasest töötlemisest teadlikud. Tuleks registreerida vähemalt järgmised ilmingud: nahal, karvastikus, silmades ja limaskestadel täheldatavad muutused, sekreetide ja eritiste esinemine ning autonoomse närvisüsteemiga seotud ilmingud (nt pisaravoolus, piloerektsioon, pupillide suuruse muutus, ebaharilik hingamisrütm). Peale selle tuleks registreerida muutused kõnnakus, kehahoius ja selles, kuidas loomad nendega ümberkäimisele reageerivad, samuti klooniliste ja tooniliste liigutuste esinemine, stereotüüpia (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keerlemine), raske või kauakestnud sünnitus ja kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi kõndimine) (10). 44. Uuringu kestel tuleks igast rühmast juhuvaliku alusel valitud viiel isasloomal ja viiel emasloomal hinnata ühel korral sensoorseid reaktsioone eri liiki ärritajatele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele) (8, 9, 11), haardetugevust (12) ja motoorset tegevust (13). Asjaomaste võimalike meetodite täpsem kirjeldus on esitatud vastavate viidete kohastes allikates. Viidatud meetodite asemel võib siiski kasutada ka muid meetodeid. Isasloomadel tuleks kõnealused funktsionaalsed vaatlused läbi viia manustamisperioodi lõppjärgus veidi enne plaanijärgset surmamist, kuid enne hematoloogiliseks uuringuks või kliiniliseks biokeemiliseks analüüsiks vereproovi võtmist (vt punktid 53–56, sh joonealune märkus 1). Emasloomad peaksid nende funktsionaalsete vaatluste ajal olema sarnases füsioloogilises seisundis ja neid tuleks soovitatavalt vaadelda ühel korral viimasel imetamisnädalal (nt 6.–13. imetamispäeval) veidi enne plaanijärgset surmamist. Ajavahemik, mille vältel järglased on emast eraldatud, peaks olema võimalikult lühike. 45. Uuringu lõppjärgus ühel korral tehtavad funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta, kui uuring viiakse läbi järgnevalt tehtava subkroonilise mürgisuse 90-päevase uuringu või pikaajalise uuringu eeluuringuna. Sellisel juhul tuleks kõnealused funktsionaalsed vaatlused läbi viia vastava järeluuringu käigus. Teisest küljest aga võivad käesoleva meetodi kohase korduvannustamisel põhineva uuringu käigus tehtud funktsionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgnevalt tehtava subkroonilise mürgisuse uuringu või pikaajalise uuringu jaoks annusemäärade valimist. 46. Funktsionaalsed vaatlused võib erandkorras ära jätta ka rühmade puhul, kus täheldatakse nii ulatuslikke mürgisusnähte, et see mõjutab märkimisväärselt funktsionaalse hindamise tulemuslikkust. 47. Tiinuse kestus tuleks registreerida; selle arvutamisel lähtutakse tiinuse 0-päevast. Iga pesakonda tuleks pärast sündi võimalikult varakult hinnata, et teha kindlaks järglaste arv ja sugu, surnultsünnid, elussünnid, kängunud järglaste (vastavatest kontrolljärglastest palju väiksemate järglaste) arv ja silmaga nähtavate kõrvalekallete esinemine. 48. Elus järglased tuleks loendada ja määrata nende sugu ning pesakonda tuleks kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Peale paaritatavatel loomadel tehtavate vaatluste tulemuste (vt punktid 43–44) tuleks registreerida ka kõik järglaste ebatavalise käitumise ilmingud. 49. Kõikidel järglastel tuleks ajavahemikul sünnijärgsest 0-päevast kuni 4. sünnijärgse päevani mõõta ühel ja samal päeval AGD. Järglaste kehamassi andmed tuleks koguda AGD mõõtmise päeval ja AGD tuleks normaliseerida järglase suurust kajastava näitaja, soovitatavalt kehamassi kuupjuure suhtes (14). Isastel järglastel tuleks 12. või 13. sünnijärgsel päeval loendada nisade/areoolide arv, nagu on soovitatud OECD katsejuhendis nr 151 (15). Kehamass ja sööda/vee tarbimine 50. Isas- ja emasloomi tuleks kaaluda esimesel manustamispäeval ning seejärel vähemalt kord nädalas, samuti surmamise ajal. Tiinuse ajal tuleks emasloomi kaaluda tiinuse 0-päeval, 7., 14. ja 20. päeval, samuti tuleks neid kaaluda 24 tunni jooksul pärast sünnitust (sünnitusjärgsel 0-päeval või 1. päeval) ning vähemalt 4. ja 13. sünnitusjärgsel päeval. Nimetatud vaatluste tulemused tuleks esitada eraldi iga täiskasvanud looma kohta. 51. Paaritumiseelsel perioodil ning tiinuse ja imetamise ajal tuleks söödatarbimist mõõta vähemalt kord nädalas. Paaritumisperioodil ei ole söödatarbimise mõõtmine kohustuslik. Kui uuritavat kemikaali manustatakse veega, tuleks eelnimetatud perioodidel mõõta ka veetarbimist. Hematoloogiline analüüs 52. Uuringu vältel tuleks igast rühmast juhuvaliku alusel valitud viiel emasloomal ja viiel isasloomal viia ühel korral läbi hematoloogiline analüüs järgmiste näitajate määramiseks: hematokrit, hemoglobiinisisaldus, erütrotsüütide arv, retikulotsüütide arv, leukotsüütide üldarv ja eri tüüpi leukotsüütide arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaeg/hüübimisvõime. Kui uuritav kemikaal või mõni selle võimalikest metaboliitidest on või võib olla oksüdeerivate omadustega, tuleks teha muu hulgas kindlaks veel ka methemoglobiinisisaldus ja Heinzi kehakeste esinemine. 53. Vereproov tuleks võtta kindlaksmääratud kohast. Emasloomad peaksid proovivõtu ajal olema sarnases füsioloogilises seisundis. Tiinuse algusaja varieeruvusega seotud praktilistest raskustest tulenevalt võib emasloomadelt vereproovi võtta juba paaritumiseelse perioodi lõpus, selmet võtta see loomade humaanse surmamise käigus või vahetult enne seda. Isasloomadelt tuleks vereproov võtta loomade humaanse surmamise käigus või vahetult enne seda. Teise võimalusena võib isasloomadelt vereproovi samuti võtta paaritumiseelse perioodi lõpus, kui emasloomade puhul eelistatakse seda proovivõtuaega. 54. Vereproove tuleks säilitada sobivates tingimustes. Kliiniline biokeemiline analüüs 55. Kliinilise biokeemilise analüüsi jaoks, mille eesmärk on hinnata kudedes avalduvat olulist mürgist mõju ning konkreetset mõju neerudele ja maksale, tuleks kasutada kõnealuse igast rühmast valitud viie emaslooma ja viie isaslooma vereproove. Loomadel on soovitatav enne vereproovi võtmist hommikuni paastuda ( 22 ) . Plasma või seerumi analüüs peaks hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, kolesterooli üldsisalduse, karbamiidi, kreatiniini, valgu üldsisalduse ja albumiini, vähemalt kahe maksarakkudele avalduvale toimele osutava ensüümi (näiteks alaniini aminotransferaasi, aspartaadi aminotransferaasi ja sorbitooli dehüdrogenaasi) ning sapphapete määramist. Teatavatel juhtudel võib kasulikku teavet saada veel muude (maksas või mujal toodetud) ensüümide ja bilirubiini määramisest. 56. Vereproovid võetakse kindlaksmääratud kohast järgmise kava alusel: — igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt 4. sünnijärgsel päeval, kui järglaste arv seda võimaldab (vt punktid 40-41), — kõikidelt järglastega emasloomadelt ja igas pesakonnas vähemalt kahelt järglaselt surmamise ajal 13. päeval ning — kõikidelt täiskasvanud isasloomadelt surmamise ajal. Kõiki vereproove säilitatakse sobivates tingimustes. Järglastelt 13. päeval võetud vereproovides ja täiskasvanud isasloomade vereproovides analüüsitakse kilpnäärmehormoonide (T4) sisaldust seerumis. Kui see on asjakohane, hinnatakse T4 sisaldust ka järglastega emasloomade vereproovides ja järglastelt 4. päeval võetud vereproovides. Kui see on asjakohane, võib soovi korral mõõta ka muude hormoonide sisaldust. Järglaste vere võib kilpnäärmehormoonide analüüsimiseks pesakonnakaupa kokku koondada. Soovitatavalt tuleks mõõta kilpnäärmehormoonide (T4 ja TSH) üldsisaldust. 57. Uuringu viimasel nädalal võib igast rühmast juhuvaliku alusel valitud viielt isasloomalt koguda teatud kindla aja jooksul uriiniproovi ja määrata uriinianalüüsi käigus järgmised näitajad: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valgusisaldus, glükoosisisaldus ja veresisaldus / vererakkude sisaldus. 58. Peale selle tuleks kaaluda üldistele koekahjustustele osutavate seerumimarkerite uurimist. Kui uuritav kemikaal on oma teadaolevatest omadustest tulenevalt võimeline mõjutama asjaomast ainevahetusprofiili või kui esineb sellekohane kahtlus, peaks määramine muu hulgas hõlmama veel ka kaltsiumi, fosfaati, paastumisjärgselt määratavaid triglütseriide ja glükoosi, teatavaid hormoone, methemoglobiini ja koliini esteraasi. Kõnealused näitajad tuleb igal konkreetsel juhul eraldi kindlaks määrata. 59. Hormoonide määramisel võivad varieeruvust ja absoluutset kontsentratsiooni mõjutada järgmised tegurid: — surmamise aeg tulenevalt asjaolust, et hormoonide kontsentratsioon ööpäeva jooksul muutub; — surmamisviis – tuleks hoiduda tekitamast loomadele tarbetut stressi, mis võib mõjutada hormoonide kontsentratsiooni; — hormoonide määramise komplektid, milles kasutatavad standardkõverad võivad olla erinevad. 60. Konkreetselt hormoonide määramiseks ette nähtud eri plasmaproovid tuleks koguda umbes samal kellaajal. Hormoonisisalduse analüüsimisel saadavad arvväärtused on müügilolevate eri katsekomplektide puhul erinevad. 61. Kui varasemad võrdlusandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliiniliste biokeemiliste näitajate määramist enne manustamisperioodi algust või soovitatavalt loomadel, kes ei kuulu ühessegi katserühma. Emasloomade puhul tuleb andmete saamiseks kasutada imetavaid loomi. PATOLOOGILINE ANALÜÜS Täielik lahkamine 62. Kõikidele uuringus kasutatud täiskasvanud loomadele tuleks teha täielik, põhjalik lahkamine, mille käigus uuritakse hoolikalt keha välispinda, kõiki avausi ning kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Tuleks registreerida pesastumiskohtade arv. Lahkamispäeval tuleks analüüsida tupeäiet, et teha kindlaks innatsükli etapp ja võimaldada korreleerimist emassuguelundite histopatoloogilise analüüsi tulemustega. 63. Kõikide täiskasvanud isasloomade munandid ja munandimanused ning eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega tuleks vajaduse korral vabastada nende külge jäänud kudedest ja kuivamise ärahoidmiseks tuleks elundite märgmass määrata võimalikult kiiresti pärast nende väljalõikamist. Peale selle võib soovi korral kaaluda isasloomade puhul sellised elundid nagu pärakutõsturlihase ja sibulakäsnkeha-lihase kompleks, Cowperi näärmed ja sugutilukk ning emasloomade puhul munasarjade paar (märgmass) ja emakas (koos emakakaelaga); kui seda tehakse, peaks kaalumine toimuma võimalikult kiiresti pärast elundite väljalõikamist. Kõikide täiskasvanud loomade munasarjad, munandid, munandimanused, suguelundid ja kõik makroskoopiliste kahjustustega elundid tuleks säilitada. 64. Kõikidelt täiskasvanud isas- ja emasloomadelt ning igast pesakonnast ühelt isaselt ja ühelt emaselt 13 päeva vanuselt järglaselt võetud kilpnääret tuleks säilitada fikseerimislahuses, mis on järgneva kavandatud histopatoloogilise analüüsi läbiviimiseks kõige sobivam. Kilpnäärme massi võib määrata pärast fikseerimist. Liigsed koed tuleks samuti eemaldada väga ettevaatlikult alles pärast fikseerimist, et kudesid mitte kahjustada. Koekahjustus võib mõjutada histopatoloogilise analüüsi tulemusi. Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast vahetult enne loomade humaanset surmamist või selle ajal ja neid tuleks säilitada sobivates tingimustes (vt punkt 56). 65. Peale selle tuleks igast rühmast juhuvaliku alusel valitud vähemalt viielt täiskasvanud isas- ja emasloomalt (juhuvalik ei hõlma loomi, kes on leitud olevat surmaeelses seisundis ja/või on enne uuringu lõppu humaanselt surmatud) võtta maks, neerud, neerupealised, harknääre, põrn, aju ja süda, eemaldada vastavalt vajadusele nende külge jäänud koed ning määrata kuivamise ärahoidmiseks võimalikult kiiresti pärast väljalõikamist nende märgmass. Nii koetüübi kui ka kavandatud järgneva histopatoloogilise uuringu jaoks kõige sobivamas fikseerimislahuses tuleks säilitada järgmisi kudesid: kõik silmaga nähtavate kahjustustega koed, aju (representatiivsed piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju ja ajusild), seljaaju, silm, magu, peensool ja jämesool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, neerud, neerupealised, põrn, süda, harknääre, hingetoru ja kopsud (säilitamiseks täidetakse need fikseerimislahusega ja sukeldatakseseejärel lahusesse), sugunäärmed (munandid ja munasarjad), suguelundid (emakas ja emakakael, munandimanused, eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega), tupp, kusepõis, lümfisõlmed (peale manustamiskohale kõige lähemal asuva lümfisõlme tuleks võtta labori kogemustest lähtuvalt veel teinegi lümfisõlm (16)), perifeerne närv (istmiku- või sääreluunärv), soovitatavalt lihase läheduses, skeletilihas ning luu koos luuüdiga (lõik või teise võimalusena värskelt aspireeritud luuüdi preparaat). Munandid on soovitatav fikseerida Bouini või muudetud Davidsoni fikseerimislahusesse sukeldamise teel (16, 17, 18); formaliinis fikseerimine ei ole nende kudede puhul soovitatav. Fikseerimislahuse kiire sissetungimise võimaldamiseks võib elundi kummaski otsas valkjaskesta ettevaatlikult väikese sügavuseni nõelaga läbi torgata. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Tuleks säilitada ka kõik elundid, mida uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt peetakse tõenäoliseks sihtelundiks. 66. Sisesekretsioonisüsteemiga seotud mõju kohta võib saada väärtuslikku teavet järgmiste kudede uurimisel: sugunäärmed (munasarjad ja munandid), suguelundid (emakas koos emakakaelaga, munandimanused, seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega, eesnäärme dorsolateraalne ja ventraalne osa), tupp, ajuripats, isaslooma rinnanäärmed ja neerupealised. Isaslooma rinnanäärmetes aset leidvad muutused on ebapiisavalt dokumenteeritud, kuid see näitaja võib olla väga tundlik östrogeense toimega ainete suhtes. Punktis 65 loetlemata elundite/kudede analüüsimine ei ole kohustuslik. 67. Surnud järglasi ja 13. sünnijärgsel päeval või varsti pärast seda surmatud järglasi tuleks miinimumnõudena väliselt hoolikalt uurida silmaga nähtavate kõrvalekallete suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata välistele suguelunditele, mida tuleks uurida arenguhäirete ilmingute suhtes. Histopatoloogiline analüüs 68. Kontrollrühmast ja suurima annusega töödeldud rühmast valitud loomadelt pärit säilitatud elundite ja kudede puhul tuleks viia läbi täismahus histopatoloogiline uuring (seejuures tuleks pöörata erilist tähelepanu spermatogeneesi etappidele isaslooma sugunäärmetes ja munandite interstitsiaalrakustruktuuri histopatoloogilisele analüüsile). Vajaduse korral võib uurida ka järglastelt ja ülejäänud täiskasvanud loomadelt võetud kilpnääret. Kui suurima annusega töödeldud rühmas täheldatakse manustamisega seotud muutusi, peaks kõnealune analüüs hõlmama ka teiste annuserühmade loomi. Täiendav üksikasjalik teave sisesekretsioonisüsteemi kudede väljalõikamise, fikseerimise, neist lõikude tegemise ja nende histopatoloogilise analüüsi kohta on esitatud histopatoloogilise analüüsi juhendis (10). 69. Tuleks uurida kõiki silmaga nähtavaid kahjustusi. NOAELi kindlakstegemise hõlbustamiseks tuleks analüüsida ka teiste annuserühmade loomade sihtelundeid, eelkõige sellistest rühmadest pärit sihtelundeid, mida iseloomustavate tulemuste põhjal saab väidetavalt määrata kindlaks NOAELi. 70. Täiendrühma kasutamise korral tuleks histopatoloogilise analüüsi raames hinnata neid kudesid ja elundeid, kus katserühmade loomade puhul täheldati mõju avaldumist. ANDMED JA ARUANDLUS Andmed 71. Andmed tuleks esitada iga looma kohta eraldi. Peale selle tuleks esitada kõik andmed kokkuvõtliku tabeli kujul, kus on iga katserühma puhul toodud ära loomade arv katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel surmatud loomade arv ning surma või humaanse surmamise aeg, viljakate loomade arv, tiinete emasloomade arv, mürgisusnähtudega loomade arv, mürgisusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise mõju ilmnemisaeg, kestus ja tugevus, histopatoloogiliste muutuste liik ja kõik asjakohased andmed pesakonna kohta. Paljunemisele/arengule avalduva mõju hindamiseks väga kasulikuks osutunud aruandevorm kokkuvõtliku tabeli kujul on esitatud 3. liites. 72. Numbrilisi tulemusi tuleks võimaluse korral hinnata asjakohase üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Eri annuste puhul täheldatud mõju võrdlemisel tuleks hoiduda mitme t-testi kasutamisest. Kasutatavad statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis. AGD ja nisade esinemise statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonnas ilmnevat mõju. Vajaduse korral käsitatakse analüüsiüksusena pesakonda. Järglaste kehamassi statistiline analüüs peaks põhinema iga üksiku järglase andmetel ning seejuures tuleks arvesse võtta pesakonna suurust. Uuringu piiratud ulatusest tulenevalt on tulemuste olulisuse tuvastamiseks tehtava statistilise analüüsi väärtus paljude lõppnäitajate, eelkõige paljunemisega seotud lõppnäitajate puhul piiratud. Mõned kõige sagedamini kasutatavatest meetoditest, eelkõige parameetrilised testid keskmise suundumuse näitajate analüüsimiseks, on ebasobivad. Statistilise analüüsi kasutamisel tuleks valida meetod, mis on uuritava muutuja väärtuste jaotuse analüüsimiseks sobiv, ning see valik tuleks teha enne uuringu alustamist. Tulemuste hindamine 73. Käesoleva meetodi kohase mürgisusuuringu tulemusi tuleks hinnata lähtuvalt täheldatud mõjust, lahkamistulemustest ja mikroskoopilistest leidudest. Hindamine hõlmab seose kindlakstegemist uuritava kemikaali annuse ja kõrvalekallete – sealhulgas silmaga nähtavate kahjustuste, tuvastatud sihtelunditele avalduva mõju, viljatuse, kliiniliste kõrvalekallete, paljunemisvõimele ja pesakonnale avalduva mõju, kehamassi muutuste, suremusele avalduva mõju ja mis tahes muu mürgise mõju – esinemise või puudumise, esinemissageduse ja raskusastme vahel. 74. Isasloomade töötlemise lühiajalisuse tõttu tuleks isasloomade paljunemisele avalduva mõju hindamisel vaadelda munandite ja munandimanuste histopatoloogilise analüüsi tulemusi koos viljakusandmetega. Ühtlasi võib uuringutulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks olla kasulik kasutada kontrollidega saadud varasemaid paljunemist/arengut käsitlevaid andmeid (nt pesakonna suuruse, AGD, nisade esinemise või seerumi T 4 -sisalduse kohta), kui need on olemas. 75. Kvaliteedikontrolli eesmärgil on soovitatav koguda kontrolle käsitlevaid varasemaid andmeid ja arvutada arvandmete jaoks variatsioonikordajad, eriti näitajate puhul, mis on seotud endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide kindlakstegemisega. Neid andmeid võib kasutada võrdlusalusena käsiloleva uuringu tulemuste hindamiseks. Katseprotokoll 76. Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave. Uuritav kemikaal: — allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas; — uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada; ühest koostisosast koosnev aine: — füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused; — kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne; mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu: — võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest. Kandeaine (vajaduse korral): — kandeaine valimise põhjendus, kui kandeaine ei ole vesi. Katseloomad: — kasutatud liik/liin; — loomade arv, vanus ja sugu; — päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne; — iga looma kehamass katse alguses; — liigi valimise põhjendus, kui katseloom ei ole rott. Katsetingimused: — annuste valimise põhjendus; — üksikasjad uuritava kemikaali valmistise / söödavalmistise, saavutatud kontsentratsioonide ning valmistise püsivuse ja homogeensuse kohta; — uuritava kemikaali manustamise üksikasjad; — vajaduse korral andmed söödas/joogivees sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) teisendamiseks tegelikuks annuseks (mg kehamassi kilogrammi kohta päevas); — sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad; — järglaste surmamise korral üksikasjalik kirjeldus surmatavate järglaste juhusliku valimise korra kohta. Tulemused: — kehamass / kehamassi muutused; — vajaduse korral söödatarbimine ja veetarbimine; — mürgise mõju andmed kummagi soo ja iga annusemäära kohta, sealhulgas viljakusele ja tiinusele avalduva mõju ning mis tahes muude mürgisusnähtude kohta; — tiinuse kestus; — mürgisus või muu mõju paljunemisele, järglastele, sünnijärgsele kasvule jne; — kliiniliste ilmingute laad, raskusaste ja kestus (nähtude pöörduvus või pöördumatus); — sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamise tulemused; — hematoloogilise analüüsi tulemused koos asjaomaste võrdlusväärtustega; — kliinilise biokeemilise analüüsi tulemused koos asjaomaste võrdlusväärtustega; — normaalse või ebanormaalse innatsükliga täiskasvanud emasloomade arv ja tsükli kestus; — elussündide arv ja pesastumisjärgne kadu; — silmaga nähtavate kõrvalekalletega järglaste arv; väliste suguelundite makroskoopilise hindamise tulemused, kängunud järglaste arv; — katse vältel suremise aeg või teave selle kohta, et loomad olid kuni surmamiseni elus; — pesastunud embrüote arv, pesakonna suurus ja pesakonna kaal mõõtmishetkel; — järglaste kehamassi andmed; — iga järglase AGD (ja kehamass AGD mõõtmise päeval); — nisade esinemine isastel järglastel; — kilpnäärmehormoonide sisaldus järglastelt 13. päeval võetud proovides ja täiskasvanud isasloomade proovides (ning järglastega emasloomade proovides ja järglastelt 4. päeval võetud proovides, kui seda on mõõdetud); — andmed järglastega loomade kehamassi kohta surmamise hetkel ning selliste loomade elundite massi kohta; — lahkamistulemused; — histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus; — andmed absorbeerumise kohta (kui on olemas); — vajaduse korral tulemuste statistilise analüüsi andmed. Tulemuste arutelu Järeldused Tulemuste tõlgendamine 77. Kirjeldatud uuring võimaldab hinnata annuste korduval manustamisel täheldatavat paljunemisele/arengule avalduvat mürgist mõju. Kuna rõhk on seatud nii üldise mürgisuse kui ka reproduktiiv-/arengutoksilisuse lõppnäitajate hindamisele, võimaldavad uuringu tulemused eelkõige eristada üldise mürgisuse puudumisel paljunemisele/arengule avalduvat mõju sellisest mõjust paljunemisele/arengule, mis avaldub üksnes kontsentratsioonil, mille juures kemikaal on mürgine ka järglaste vanematele (vt punktid 7–11). Saadud tulemused võivad viidata vajadusele teha täiendavaid uuringuid ja võivad hõlbustada järgnevate uuringute kavandamist. Paljunemise ja arenguga seotud tulemuste hõlpsamaks tõlgendamiseks tuleks tutvuda OECD juhenddokumendiga nr 43 (19). Käesoleva katsemeetodi puhul võib olla kasu närilistega tehtavate sisesekretsioonisüsteemi ja paljunemisega seotud katsete tulemuste histoloogilist hindamist käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 106 (16) esitatud teabest (sisesekretsiooni)elundite ja tupeäiete ettevalmistamise ja hindamise kohta. KIRJANDUS (1) OECD (1990). Kemikaalide töörühma ja halduskomitee 14. ühiskoosoleku koosolekudokument nr 1. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis. (2) OECD (1992). Ajutise eksperdirühma esimehe aruanne reproduktiivtoksilisust käsitlevate sõeluuringumeetodite alase koosoleku kohta. Tokyo, 27.–29. oktoober 1992. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis. (3) Mitsumori, K., Kodama, Y., Uchida, O., Takada, K., Saito, M., Naito, K., Tanaka, S., Kurokawa, Y., Usami, M., Kawashima, K., Yasuhara, K., Toyoda, K., Onodera, H., Furukawa, F., Takahashi, M., ja Hayashi, Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol. Sci. 19: 141–149. (4) Tanaka, S., Kawashima, K., Naito, K., Usami, M., Nakadate, M., Imaida, K., Takahashi, M., Hayashi, Y., Kurokawa, Y., ja Tobe, M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol. 18: 89–95. (5) OECD (1998). Endokriinfunktsiooni kahjustavate kemikaalide uurimise ja hindamise (EDTA) OECD rakkerühma esimese koosoleku aruanne. 10.–11. märts 1998. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist Pariisis. (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 217. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (8) Goldman, J. M., Murr, A. S., ja Cooper, R. L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies. Birth Defects Res. B 80(2): 84–97. (9) Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons. Väljaandes: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization. Auston, C. R., ja Short, R. V. (toim.), Cambridge, New York. (10) Rahvusvaheline kemikaaliohutuse programm (IPCS) (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. (11) Moser, V. C., McDaniel, K. M., ja Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. (12) Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., ja Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. (13) Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., ja MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. (14) Gallavan, R. H. Jr., Holson, J. F., Stump, D. G., Knapp, J. F., ja Reynolds, V. L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights. Reprod. Toxicol. 13: 383–390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 151. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (16) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 106. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (17) Hess, R. A., ja Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. Väljaandes: Methods in Reproductive Toxicology. Chapin, R. E., ja Heindel, J. J. (toim.), Academic Press, San Diego, CA. Lk 52–85. (18) Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., ja Creasy, D. M. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s Fluid. Toxicol . Pathol . 30: 524–533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 43. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (20) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Series on Testing and Assessment No. 150. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. 1. liide MÕISTED (VT KA OECD JUHENDDOKUMENT NR 150 (20)) Androgeensus kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik androgeen (nt testosteroon). Annus manustatav uuritava kemikaali kogus. Annust väljendatakse uuritava kemikaali kogusena massiühikutes katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas) või kemikaali püsiva kontsentratsioonina söödas. Annustamine üldmõiste, mis hõlmab annust, selle manustamise sagedust ja annustamise kestust. Antiandrogeensus kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku androgeeni (nt testosterooni) toimet. Antitüreoidne aktiivsus kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku kilpnäärmehormooni (nt T3) toimet. Antiöstrogeensus kemikaali võime pärssida imetaja organismis loodusliku östrogeeni (nt 17β-östradiooli) toimet. Arengutoksilisus reproduktiivtoksilisuse ilming, mis avaldub järglaste sünnieelse, perinataalse või sünnijärgse struktuuri- või funktsioonihäirena. Emale avalduv mürgisus tiinele emasloomale avalduv kahjulik mõju, mis on spetsiifiline (otsene mõju) või mittespetsiifiline (kaudne mõju) ning on seotud tiinusega. Ilmne mürgisus üldmõiste, mille abil kirjeldatakse uuritava kemikaali manustamise järel täheldatavaid selgeid mürgisusnähte. Kõnealused nähud peaksid olema ohu hindamiseks piisavad ja sellised, et manustatava annuse suurendamisega kaasnevad eeldatavalt tõsised mürgisusnähud ja tõenäoliselt ka surm. Kemikaal aine või segu. NOAEL lühend, millega tähistatakse annusemäära, mille juures ei täheldata kahjulikku toimet. Tegemist on suurima annusega, mis ei põhjusta manustamisest tingitud kahjulikke ilminguid. Reproduktiivtoksilisus kahjulik mõju järglastele ja/või isas- või emasloomade paljunemisfunktsioonile või paljunemisvõimele. Türeoidne aktiivsus kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik kilpnäärmehormoon (nt T3). Uuritav kemikaal iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil. Valideerimine teaduslik protsess, mille eesmärk on iseloomustada katsemeetodi rakendamisega seotud nõudeid ja piiranguid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja sobivust konkreetsel eesmärgil kasutamiseks. Viljakuse vähenemine isas- või emaslooma paljunemisfunktsiooni häire või paljunemisvõime langus. Östrogeensus – kemikaali võime toimida imetaja organismis samal viisil kui looduslik östrogeen (nt 17β-östradiool). 2. liide UURINGU MAKSIMUMKESTUSELE VASTAV TÄISPIKAL 14-PÄEVASEL PAARITUMISPERIOODIL PÕHINEV KATSE SKEMAATILINE AJAKAVA 3. liide TABELI KUJUL KOKKUVÕTLIK ARUANNE PALJUNEMISELE/ARENGULE AVALDUVA MÕJU KOHTA VAATLUSED VÄÄRTUSED Annus (ühik) 0 (kontroll) … … … … Paaride arv katse alguses (N) Innatsükkel (vähemalt keskmine pikkus ja ebaregulaarsete tsüklite esinemissagedus) Emasloomad, kellel täheldatakse paaritumise ilminguid (N) Tiinestunud emasloomad (N) Eostunud 1.–5. päeval (N) Eostunud 6.–…. (23) päeval (N) Tiinuse kestus ≤ 21 päeva (N) Tiinuse kestus 22 päeva (N) Tiinuse kestus ≥ 23 päeva (N) Elusalt sündinud järglastega emasloomad (N) 4. sünnijärgse päevani elus püsinud järglastega emasloomad (N) Pesastunud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta (keskmine) Elussündide arv järglastega emaslooma kohta (keskmine) 4. päevani elus püsinud järglaste arv järglastega emaslooma kohta (keskmine) Sugude vahekord (isased/emased) sünnihetkel (keskmine) Sugude vahekord (isased/emased) 4. päeval (keskmine) Pesakonna kaal sünnihetkel (keskmine) Pesakonna kaal 4. päeval (keskmine) Järglaste kehamass sünnihetkel (keskmine) Järglaste kehamass AGD mõõtmise hetkel (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine) Järglaste AGD samal sünnijärgsel päeval ajavahemikul sündimispäevast kuni 4. päevani (isasloomade keskmine, emasloomade keskmine; märkida sünnijärgne mõõtmispäev) Järglaste kehamass 4. päeval (keskmine) Järglaste kehamass 13. päeval (keskmine) Nisade esinemine isastel järglastel 13. päeval (keskmine) KÕRVALEKALLETEGA JÄRGLASED Järglastega emasloomad, kellel on 0 kõrvalekalletega järglast Järglastega emasloomad, kellel on 1 kõrvalekalletega järglane Järglastega emasloomad