I LISA

Artiklite 3, 4, 5 ja 7 kohaselt tehtavate analüüside kava

1. ÜLDISED PÕHIMÕTTED MÄÄRATLETUD TAIMEKAHJUSTAJA ESINEMISE KOHTA

1.1. Määratletud taimekahjustaja esinemist kahtlustatakse juhul, kui määratletud taimega või veeproovidega tehtud esimese avastamisanalüüsi tulemused on positiivsed.

1.2. Määratletud taimekahjustaja esinemist kinnitatakse järgmistel juhtudel: a) kui esimene või teine avastamisanalüüs on selektiivne isoleerimine, mille tulemuseks on tüüpilise morfoloogiaga kolooniad, ning kolooniatel tehtud kahe määramisanalüüsi tulemused on positiivsed; b) kui esimene ja teine analüüs on muud analüüsid kui selektiivne isoleerimine ning kahe määramisanalüüsi tulemused on positiivsed pärast proovi selektiivset isoleerimist, mille tulemuseks on tüüpilise morfoloogiaga kolooniad. Üks kahest määramisanalüüsist on punkti 2.2 alapunktides e, f ja g osutatud analüüs.

2. ANALÜÜSID

2.1. Avastamisanalüüsid

Avastamisanalüüsidega peab olema võimalik järjepidevalt avastada vähemalt 104 rakku asümptomaatilistest proovidest saadud resuspendeeritud bakterisademe milliliitri kohta.

Teine avastamisanalüüs peab põhinema esimese omadest erinevatel bioloogilistel põhimõtetel või teistsugustel nukleotiidipiirkondadel.

Avastamisanalüüsid on järgmised:

a) rahvusvahelistes diagnostikastandardites kirjeldatud immunofluorestsentstestid;

b) määratletud taimekahjustaja isoleerimine poolselektiivses kasvukeskkonnas mSMSA, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

c) klassikaline PCR analüüs, milles kasutatakse Pastrik et al. (2002) praimereid, (1) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

d) TaqMan® reaalaja PCR analüüsid, milles kasutatakse järgmisi praimereid ja proove: i) Weller et al. (2000), (2) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (kasutades TaqMan® proovi, mis on modifitseeritud Weller et al. 2000 poolt kirjeldatud originaalproovist), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (nn NYtor test), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iv) Massart et al. (2014), (5) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

e) LAMP (silmusvahendatud isotermilise amplifikatsiooni meetod) test, milles kasutatakse Lenarčič et al. (2014) (6) praimereid (ainult sümptomitega taimse materjali puhul), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

2.2. Määramisanalüüsid

Määramisanalüüsid on järgmised:

a) rahvusvahelistes diagnostikastandardites kirjeldatud immunofluorestsentstestid;

b) klassikaline PCR analüüs, milles kasutatakse Pastrik et al. (2002) praimereid, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

c) TaqMan® reaalaja PCR analüüsid, milles kasutatakse järgmisi praimereid ja proove: i) Weller et al. (2000), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; ii) Vreeburg et al. (2016) (kasutades TaqMan® proovi, mis on modifitseeritud Weller et al. 2000 poolt kirjeldatud originaalproovist), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iii) Vreeburg et al. (2018) (nn NYtor test), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites; iv) Massart et al. (2014), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

d) LAMP (silmusvahendatud isotermilise amplifikatsiooni meetod) test, milles kasutatakse Lenarčič et al. (2014) praimereid, nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

e) fülotüübil põhinev klassikaline multipleks PCR analüüs (Opina et al. (1997); (7) Fegan & Prior (2005)), (8) nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

f) DNA triipkoodistamine (Wicker et al. (2007)) (9), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites;

g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al.(2018)) (10), nagu on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

3. MEETODITE VOOSKEEMID

Vooskeem nr 1. Diagnostiline meetod määratletud taimekahjustaja esinemise tuvastamiseks määratletud taime proovides

a Esimese või teise avastamisanalüüsina võib kasutada isoleerimist. Kui kahtlustatakse määratletud taimekahjustaja esinemist kasvukeskkonnas, puhastatakse kolooniad, et saada puhaskultuurid, millega tehakse kaks määramisanalüüsi.

b Üks kahest määramisanalüüsist on punkti 2.2 alapunktides e, f ja g osutatud analüüs. Taimekahjustaja esinemise kinnitamiseks on vaja kahe määramisanalüüsi positiivset tulemust.

c Kolmas avastamisanalüüs põhineb erinevatel bioloogilistel põhimõtetel või teistsugustel nukleotiidipiirkondadel.

Vooskeem nr 2. Diagnostiline meetod määratletud taimekahjustaja esinemise tuvastamiseks veeproovides.

a Üks kahest määramisanalüüsist on punkti 2.2 alapunktides e, f ja g osutatud analüüs. Taimekahjustaja esinemise kinnitamiseks on vaja kahe määramisanalüüsi positiivset tulemust.

4. PROOVI ETTEVALMISTAMINE

4.1. Asümptomaatilistest mugulatest võetud proovid

Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Asjakohast laboritoimingut basaalse tipu südamiku töötlemiseks, et saada ekstrakt määratletud taimekahjustaja avastamiseks, on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

4.2. Asümptomaatilistest määratletud taimedest võetud proovid

Latentseid infektsioone avastatakse varresegmentide või leherootsude koondproovidega. Toimingut võib kohaldada kuni 200 varreosa või 200 leherootsu suhtes, mis on pärit ühe proovi eri taimedest. Asjakohast laboritoimingut varre- või leherootsusegmentide desinfitseerimiseks ja töötlemiseks, et saada ekstrakt määratletud taimekahjustaja avastamiseks, on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

4.3. Proovid määratletud taimede sümptomaatilisest materjalist

Koelõiked eemaldatakse aseptiliselt kartulimugula juhtkoeringist või närbumissümptomitega määratletud taimede varre juhtkimpudest. Asjakohast laboritoimingut kudede töötlemiseks, et saada ekstrakt määratletud taimekahjustaja avastamiseks, on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

4.4. Pinna- või ringlusvee proovid (sh kartulitöötlemise heit- ja reovesi)

Peamine analüüs, mida tehakse pinnavee-, taasringlussüsteemidest pärit vee ja (kartulitöötlemistööstusest pärit) reoveeproovides, et määratletud taimekahjustajat avastada, on selektiivne isoleerimine. Asjakohast laboritoimingut veeproovide töötlemiseks on kirjeldatud rahvusvahelistes diagnostikastandardites.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, lk 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, lk 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, lk 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, lk 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, lk 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, lk 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the „Ralstonia solanacearum species complex“. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), lk 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, lk 6790-6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.