ET Euroopa Liidu Teataja L 220/1

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 761/2009,

23. juuli 2009,

millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määrust (EÜ) nr 440/2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ja millega asutatakse Euroopa Kemikaalide Agentuur ning muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93, komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (1) eriti selle artikli 13 lõiget 3,

ning arvestades järgmist:

(1) Komisjoni määruses (EÜ) nr 440/2008 (2) on esitatud katsemeetodid määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaldamisel kasutatavate ainete füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks.

(2) Määrust (EÜ) nr 440/2008 on vaja ajakohastada, et teha muudatusi teatavates katsemeetodites ja lisada sellesse uued katsemeetodid, mille OECD on heaks kiitnud. Käesoleva ettepanekuga seoses on konsulteeritud sidusrühmadega. Muudatustega kohandatakse meetodid teaduse ja tehnika arenguga.

(3) Sätted aururõhu kohta tuleb läbi vaadata, arvestades uue efusioonmeetodi lisamist.

(4) On vaja lisada uus meetod kiudude läbimõõdu kaalutud keskmise mõõtmiseks, milles kaalude väärtustena kasutatakse pikkust.

(5) On asjakohane ajakohastada määrust (EÜ) nr 440/2008, et lisada eelistatud meetodina uus in vitro katsemeetod nahaärrituse määramiseks, et vähendada katsetes kasutatavate loomade arvu miinimumini vastavalt nõukogu 24. novembri 1986. aasta direktiivile 86/609/EMÜ katseteks ja muudel teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitsega seotud liikmesriikide õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (3). Kuigi arutelu OECDga kavandatava in vitro katsemeetodi üle nahaärituse määramiseks veel kestab, on kohane võtta meetod B 46 erandkorras käesolevasse määrusesse. Meetod B 46 tuleks ajakohastada võimalikult kiiresti pärast kokkuleppe saavutamist OECDga või siis, kui sellist läbivaatamist õigustab täiendav teave.

(6) Vetikate kasvu pidurdamise katset käsitlevad sätted vajavad läbivaatamist, et lisada täiendavaid liike ning järgida kemikaalide ohu hindamise ja klassifitseerimise nõudeid.

(7) On vaja lisada pinnavee aeroobse mineralisatsiooni mõõtmise uus meetod e biolagundavuse mudelkatse ning perekonda Lemna kuuluvaid organisme mõjutava toksilisuse hindamise uus meetod organismide kasvu pidurdamise järgi.

(8) Seepärast tuleks määrust (EÜ) nr 440/2008 vastavalt muuta.

(9) Käesoleva määrusega ette nähtud meetmed on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

Artikkel 1

Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse järgmiselt.

1) A osa muudetakse järgmiselt: a) peatükk A.4 asendatakse käesoleva määruse I lisa peatükiga A.4; b) lisatakse peatükk A.22, mis on esitatud käesoleva määruse II lisas.

2) B osa muudetakse järgmiselt: lisatakse käesoleva määruse III lisa peatükk B.46.

3) C osa muudetakse järgmiselt: a) peatükk C.3 asendatakse käesoleva määruse IV lisa peatükiga C.3; b) lisatakse käesoleva määruse V ja VI lisas esitatud peatükid C.25 ja C.26.

Artikkel 2

Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides. Brüssel, 23. juuli 2009 Komisjoni nimel komisjoni liige Stavros DIMAS

(1) ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.

(2) ELT L 142, 31.5.2008, lk 1.

(3) EÜT L 358, 18.12.1986, lk 1.

I LISA A.4. AURURÕHK 1. METOODIKA Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 104 (2004). 1.1. SISSEJUHATUS Käesolevas metoodika A.4(1) uuesti läbi vaadatud versioonis on esitatud üks täiendav mõõtemeetod, „Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria”; see on välja töötatud väga madala aururõhuga (kuni 10–10 Pa) ainete jaoks. Arvestades vajadust meetodite järele, mis võimaldavad mõõta eeskätt madala aururõhuga ainete aururõhku, on ümber hinnatud ka käesoleva metoodika muude mõõtemeetodite rakenduspiirid. Termodünaamilise tasakaalu tingimustes sõltub puhta aine aururõhk ainult temperatuurist. Asjaomased põhimõtted on esitatud mujal (2, 3). Ükski mõõtmismeetod ei ole rakendatav kogu aururõhkude vahemikus – vähem kui 10–10 Pa kuni 105 Pa. Sellepärast esitatakse käesolevas kirjelduses kaheksa aururõhu mõõtmise meetodit, mis on rakendatavad erinevates aururõhu vahemikes. Tabelis 1 on võrreldud nende meetodite rakendatavust ja mõõtevahemikke. Neid meetodeid saab kasutada üksnes ainete puhul, mis mõõtmistingimustes ei lagune. Juhul kui tehnilistel põhjustel eksperimentaalseid meetodeid ei saa kasutada, võib aururõhku ka hinnata; soovitatav hindamismeetod on esitatud liites. 1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD Aine aururõhk on tema küllastatud auru rõhk vedelas või tahkes faasis oleva aine kohal. Tuleb kasutada rahvusvahelise mõõtühikute süsteemi (SI) rõhuühikut, milleks on paskal (Pa). Varem kasutusel olnud rõhuühikud ja nende teisendustegurid on järgmised: 1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfäär = 1,013 × 105 Pa 1 baar = 105 Pa SI temperatuuriühik on kelvin (K). Celsiuse kraadid teisendatakse kelviniteks järgmise valemi abil: T = t + 273,15 kus T on kelvinites väljendatud termodünaamiline temperatuur ja t on temperatuur Celsiuse kraadides. Tabel 1 Mõõtmismeetod Aine Hinnanguline korratavus Hinnanguline reprodutseeritavus Soovitatav mõõtevahemik Tahke Vedelik Dünaamiline meetod Kergsulav Jah kuni 25 % 1–5 % kuni 25 % 1–5 % 103 Pa kuni 2 × 103 Pa, 2 × 103 Pa kuni 105 Pa Staatiline meetod Jah Jah 5–10 % 5–10 % 10 Pa kuni 105 Pa, 10–2 Pa kuni 105 Pa (1) Isoteniskoopiline meetod Jah Jah 5–10 % 5–10 % 102 Pa kuni105 Pa Efusioonmeetod: aururõhukaalud Jah Jah 5–20 % kuni 50 % 10–3 kuni 1 Pa Efusioonmeetod: Knudseni rakk Jah Jah 10–30 % — 10–10 kuni 1 Pa Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria Jah Jah 5–30 % kuni 50 % 10–10 kuni 1 Pa Gaasiküllastusmeetod Jah Jah 10–30 % kuni 50 % 10–10 kuni 103 Pa Pöörleva kuuli meetod Jah Jah 10–20 % — 10–4 kuni 0,5 Pa 1.3. MÕÕTMISE PÕHIMÕTE Üldiselt määratakse aururõhku erinevatel temperatuuridel. Kitsas temperatuurivahemikus sõltub puhta aine aururõhu logaritm lineaarselt termodünaamilisest temperatuurist vastavalt lihtsustatud Clapeyron-Clausiuse võrrandile: kus: p = aururõhk, Pa, ΔHv = aurustumissoojus, Jmol–1, R = universaalne gaasikonstant, 8,314 Jmol–1K–1, T = temperatuur, K. 1.4. STANDARDAINED Standardaineid ei ole tingimata vaja kasutada. Neid on vaja eeskätt selleks, et aeg-ajalt kontrollida meetodi suutlikkust ja võrrelda eri meetodite abil saadud tulemusi. 1.5. MEETODITE KIRJELDUS 1.5.1. Dünaamiline meetod (Cottrelli meetod) 1.5.1.1. Põhimõte Aururõhu määramiseks mõõdetakse aine keemistemperatuur erinevatel teadaolevatel rõhkudel ligikaudu 103–105 Pa vahemikus. Seda meetodit soovitatakse ka keemistemperatuuri määramiseks. Selleks saab kõnesolevat meetodit kasutada kuni temperatuurini 600 K. Vedelikusamba hüdrostaatilise rõhu tõttu on vedeliku keemistemperatuur 3–4 cm sügavusel ligikaudu 0,1 °C kõrgem kui vedeliku pinnal. Cottrelli meetodi (4) puhul asetatakse termomeeter aurudesse vedeliku pinna kohal ja keeval vedelikul lastakse pidevalt voolata üle termomeetri reservuaari. Termomeetri reservuaar on pidevalt kaetud õhukese vedelikukihiga, mis on tasakaalus atmosfäärirõhul oleva auruga. Seega vastab termomeetri näit tõelisele keemistemperatuurile, kusjuures mõõtmistulemus ei sisalda ülekuumenemisest või hüdrostaatilisest rõhust tingitud viga. Cottrelli poolt algselt kasutatud pump on kujutatud joonisel 1. Katseklaasis A on keev vedelik. Põhja külge joodetud plaatinatraat soodustab ühtlast keemist. Külgtoru C on ühendatud püstjahutiga; pritsmekaitse D ei lase termomeetril E puutuda kokku külma kondensaadiga. Kui vedelik katseklaasis A keeb, tõusevad lehtrisse sattunud mullid ja vedelik üles ning suunatakse pumba F kahte haru pidi termomeetri reservuaarile. Joonis 1 Joonis 2 Cottrelli pump (4) A: termopaar B: anum vaakumi stabiliseerimiseks C: manomeeter D: vaakumpump E: mõõtmispunkt F: kütteelement, ligikaudu 150 W 1.5.1.2. Mõõteseade Joonisel 2 on kujutatud suurt täpsust võimaldav mõõteseade, milles on kasutatud Cottrelli põhimõtet. See kujutab endast toru, mille alumises osas keeb vedelik, keskmine osa kujutab endast jahutit ning ülemises osas on väljumisava ja äärik. Cottrelli pump asub keemissektsioonis, mida kütab elektriline padrunkuumuti. Temperatuuri mõõdetakse kaetud termopaari või takistustermomeetri abil, mis on viidud torusse ülevalt läbi äärikliite. Väljumisava on ühendatud rõhu reguleerimise süsteemiga. See hõlmab vaakumpumpa, anumat vaakumi stabiliseerimiseks, manostaati, millest lastakse seadmesse rõhu reguleerimiseks vajalikku lämmastikku, ja manomeetrit. 1.5.1.3. Mõõtmise käik Aine viiakse keemissektsiooni. Kui tahke aine ei ole pulbri kujul, võib seejuures esineda raskusi, mille puhul mõnikord aitab jahutussärgi kuumutamine. Seade suletakse äärikliitega ja ainest eemaldatakse gaasid. Vahutavate ainete aururõhku ei saa selle meetodiga mõõta. Seade reguleeritakse kõige madalamale vajalikule rõhule ja lülitatakse sisse küte. Samal ajal ühendatakse temperatuuriandur registreerimisseadmega. Kui püsival rõhul registreeritakse püsiv keemistemperatuur, on saavutatud tasakaal. Eriti tuleb jälgida, et keemine ei oleks tõukeline. Lisaks sellele peab jälgima, et kondenseerumine jahutis oleks täielik. Kui määratakse kergsulava tahke aine aururõhku, tuleb jälgida, et jahuti ei ummistuks. Pärast tasakaalupunkti registreerimist reguleeritakse seade kõrgemale rõhule. Mõõtmisi jätkatakse samal viisil, kuni saavutatakse rõhk 105 Pa (aururõhk mõõdetakse kokku ligikaudu 5–10 tasakaalupunktis). Kontrolliks korratakse mõõtmist tasakaalupunktides alaneva rõhu järjekorras. 1.5.2. Staatiline meetod 1.5.2.1. Põhimõte Staatilise meetodi (5) puhul määratakse termodünaamilisele tasakaalule vastav aururõhk kindlaksmääratud temperatuuril. See meetod sobib individuaalsete ainete ning mitmekomponendiliste vedelike ja tahkete ainete segude puhul rõhuvahemikus 10–1 kuni 105 Pa ja, kui rakendatakse ettevaatusabinõusid, ka rõhuvahemikus 1–10 Pa. 1.5.2.2. Mõõteseade Mõõteseade koosneb termostateeritud vannist (täpsus ±0,2 K), vaakumsüsteemiga ühendatud proovinõust, manomeetrist ja rõhu reguleerimise süsteemist. Proovinõu (joonis 3a) ühendatakse kraani ja nullindikaatorina kasutatava diferentsiaalmanomeetri (sobiva manomeetrivedelikuga U-toru) kaudu vaakumsüsteemiga. Olenevalt rõhuvahemikust ja uuritava aine keemilistest omadustest võib diferentsiaalmanomeetris kasutada elavhõbedat, silikoonõlisid või ftalaate. Keskkonnakaitse kaalutlustel tuleks elavhõbeda kasutamisest võimaluse korral hoiduda. Uuritav aine ei tohi U-torus olevas vedelikus märgatavalt lahustuda või sellega reageerida. U-toru asemel võib kasutada ka mõnda muud rõhumõõturit (joonis 3b). Normaalrõhust kuni rõhuni 102 Pa võib manomeetrivedelikuna kasutada elavhõbedat; kui rõhk on vahemikus 10–102 Pa, võib kasutada silikoonõlisid ja ftalaate. Rõhul alla 102 Pa võib kasutada ka muid rõhumõõtureid; kuumutatava membraaniga mahtuvusmanomeetrit võib kasutada isegi rõhul alla 10–1 Pa. Temperatuuri mõõdetakse kas proovinõu seina välisküljel või proovinõus. 1.5.2.3. Mõõtmise käik Kui kasutatakse joonisel 3a kujutatud mõõteseadet, täidetakse U-toru selleks valitud vedelikuga, mis tuleb enne näidu registreerimist gaasidest kõrgendatud temperatuuri abil vabastada. Uuritav aine viiakse mõõteseadmesse ja vabastatakse gaasidest madalal temperatuuril. Kui tegemist on mitmekomponendilise prooviga, peab temperatuur olema piisavalt madal, et seejuures ei muutuks materjali koostis. Tasakaalu kiiremaks saavutamiseks võib proovi segada. Proovi võib jahutada vedela lämmastiku või kuiva jääga, kuid seejuures tuleb jälgida, et õhk ja väljapumbatav gaas ei kondenseeruks. Proovinõu kohal oleva kraani avamisega ühendatakse nõu mõneks minutiks vaakuumsüsteemiga, et eemaldada õhk. Vajaduse puhul korratakse gaaside eemaldamist mitu korda. Joonis 3a Joonis 3b Kui proovi kuumutamise ajal on kraan suletud, siis aururõhk tõuseb. See muudab U-torus oleva vedeliku tasakaaluasendit. Selle kompenseerimiseks lastakse seadmesse lämmastikku või õhku, kuni diferentsiaalrõhu indikaator on uuesti nullasendis. Selleks vajalik rõhk loetakse manomeetrilt või suurema täpsusega mõõteriistalt. See rõhk vastab aine aururõhule mõõtmistemperatuuril. Kui kasutatakse joonisel 3b kujutatud mõõteseadet, võib aururõhu näidu lugeda otse seadmelt. Aururõhk määratakse piisavalt väikeste temperatuurivahemike tagant kuni vajaliku kõrgeima temperatuurini (aururõhk mõõdetakse kokku umbes 5–10 tasakaalupunktis). Kontrolliks korratakse näitude registreerimist madalal temperatuuril. Kui kordamisel saadud väärtused ei lange kokku temperatuuri tõstmisel saadud kõveraga, võib põhjuseks olla üks järgmistest asjaoludest: i) proov sisaldab ikka veel õhku (nt suure viskoossusega materjalide puhul) või kuumutamisel eraldunud madala keemistemperatuuriga aineid; ii) uuritavas temperatuurivahemikus toimub ainega keemiline reaktsioon (nt lagunemine või polümerisatsioon). 1.5.3. Isoteniskoopiline meetod 1.5.3.1. Põhimõte Isoteniskoop (6) töötab staatilise meetodi põhimõttel. Proov viiakse termostateeritud kolbi, mis on ühendatud manomeetri ja vaakumpumbaga. Uuritavast ainest kergemini lenduvad lisandid eemaldatakse degaseerimisega alarõhul. Proovi aururõhk valitud temperatuuril tasakaalustatakse inertse gaasi rõhuga, mille väärtus on teada. Isoteniskoop töötati välja teatavate vedelate süsivesinike aururõhu määramiseks, kuid ta sobib ka tahkete ainete uurimiseks. Harilikult ei sobi kõnesolev meetod mitmekomponendiliste süsteemide puhul kasutamiseks. Mittelenduvaid lisandeid sisaldavate proovide korral on mõõtmistulemuste viga väike. Soovitatav määramisvahemik on 102–105 Pa. 1.5.3.2. Mõõteseade Mõõteseadme näidis on esitatud joonisel 4. Seadme täielik kirjeldus on standardis ASTM D 2879–86 (6). 1.5.3.3. Mõõtmise käik Vedelate ainete puhul on diferentsiaalmanomeetri vedelikuks uuritav aine ise. Isoteniskoopi viiakse vedelikukogus, mis on küllaldane reservuaari ja manomeetri lühikese haru täitmiseks. Isoteniskoop ühendatakse vaakumsüsteemiga, sellest eemaldatakse õhk ning see täidetakse seejärel lämmastikuga. Süsteemist gaasi väljapumpamist ja süsteemi täitmist lämmastikuga korratakse kaks korda, et eemaldada kogu hapnik. Täidetud isoteniskoop asetatakse horisontaalselt, nii et proov valgub õhukese kihina reservuaaris ja manomeetris laiali. Rõhk süsteemis langetatakse 133 paskalini ja proovi kuumutatakse ettevaatlikult, kuni see hakkab keema (seda tehakse lahustunud gaaside kõrvaldamiseks). Isoteniskoop asetatakse seejärel nii, et proov voolab tagasi reservuaari ja täidab manomeetri lühikese haru. Rõhku hoitakse 133 Pa juures. Proovireservuaari väljavenitatud tippu kuumutatakse väikesel leegil, kuni proovi aurud küllaldaselt paisuvad ning suruvad osa proovist reservuaari ülaosast ja manomeetri lühikesest harust manomeetri ülejäänud ossa, nii et tekib auruga täidetud lämmastikuvaba ruum. Isoteniskoop paigutatakse seejärel termostateeritud vanni ja lämmastiku rõhk võrdsustatakse proovipoolse ruumi rõhuga. Tasakaaluolekus on lämmastiku rõhk võrdne aine aururõhuga. Joonis 4 Tahkete ainete puhul kasutatakse rõhust ja temperatuurivahemikust olenevalt selliseid manomeetrivedelikke, nagu silikoonõlid ja ftalaadid. Gaasidest vabastatud manomeetrivedelik viiakse isoteniskoobi pikal harul olevasse laiemasse ossa. Uuritav tahke aine pannakse proovikolbi ja vabastatakse gaasidest kõrgendatud temperatuuril. Seejärel kallutatakse isoteniskoopi nii, et manomeetrivedelik voolab U-torusse. 1.5.4. Efusioonmeetod: aururõhukaalud (7) 1.5.4.1. Põhimõte Uuritava aine proovi kuumutatakse väikeses ahjus ja asetatakse vakumeeritud klaaskupli alla. Ahi on kaetud kaanega, milles on väikesed teadaoleva läbimõõduga avad. Ühest avast väljuv aine aur juhitakse sama vakumeeritud klaaskupli all asuva kõrgtundliku kaalu kausile. Mõne seadmetüübi puhul asub kaalukauss külmkambris, mis tagab soojuse hajumise väljapoole soojusjuhtivuse teel; kaalukauss jahtub soojuskiirguse arvel ja avast väljuv aur kondenseerub kaalukausil. Aurujoa impulss toimib kaalukausile mõjuva jõuna. Aururõhu võib arvutada kahel viisil: kas otse kaalukausile mõjuva jõu põhjal või aurustumiskiiruse alusel, kasutades Hertz-Knudseni valemit (2): kus: G = aurustumiskiirus (kgs–1m–2), M = molaarmass (gmol–1), T = temperatuur (K), R = universaalne gaasikonstant (Jmol–1K–1), p = aururõhk (Pa). Soovitatav määramisvahemik on 10–3 kuni 1 Pa. 1.5.4.2. Mõõteseade Seadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 5. Joonis 5 A: alusplaat F: külmkamber ja jahutuslatt B: magnetelektriline seade G aurustusahi C: klaaskuppel H: Dewari anum vedela lämmastikuga D: kaalud ja kaalukauss I: proovi temperatuuri mõõtur E: vaakumimõõtur J: uuritav proov 1.5.5. Efusioonmeetod: Knudseni rakk 1.5.5.1. Põhimõte Meetodi aluseks on kõrgvaakumi tingimustes Knudseni raku (8) mikroavast ajaühikus auruna väljuva uuritava aine massi määramine. Väljavoolanud auru massi võib leida kas raku massi vähenemise määramise kaudu või auru madalal temperatuuril kondenseerimise ja lendunud ainekoguse kromatograafilise määramisega. Aururõhk arvutatakse Hertz-Knudseni võrrandi abil (vt punkt 1.5.4.1), kasutades seadme parameetritest sõltuvat parandustegurit (9). Soovitatav aururõhu vahemik on 10–10 kuni 1 Pa (10, 11, 12, 13, 14). 1.5.5.2. Mõõteseade Seadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 6. Joonis 6 1: ühendus vaakumsüsteemiga 7: keermega kaas 2: pesad plaatina-takistustermomeetri või temperatuuri mõõtmise ja reguleerimise seadme jaoks 8: liblikmutrid 3: vaakummahuti kaas 9: poldid 4: O-rõngas 10: roostevabast terasest efusioonirakud 5: alumiiniumist vaakummahuti 11: padrunkuumuti 6: efusioonirakkude paigaldamise ja eemaldamise seade 1.5.6. Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria 1.5.6.1. Põhimõte Meetod põhineb uuritava aine kiirenenud aurustumise määramisel kõrgendatud temperatuuril ja normaalrõhul termogravimeetria abil (10, 15, 16, 17, 18, 19, (20). Aurustumiskiiruse vT määramiseks hoitakse uuritavat ainet aeglaselt voolava inertgaasi atmosfääris kindlaksmääratud isotermilisel temperatuuril T (kelvinites) ja jälgitakse vajaliku ajavahemiku jooksul, kuidas väheneb ainekoguse mass. Aururõhud pT arvutatakse vT väärtuste põhjal, kasutades aururõhu logaritmi ja aurustumiskiiruse logaritmi lineaarset seost. Vajaduse korral võib tulemused ekstrapoleerida temperatuuridele 20 ja 25 °C, rakendades regressioonanalüüsi koordinaatides log pT vs. 1/T. See meetod sobib ainete puhul, mille aururõhk on 10–10 Pa (10–12 mbar) ja puhtusaste on võimalikult lähedane 100 protsendile, et vältida mõõdetava massi vähenemise ekslikku tõlgendamist. 1.5.6.2. Mõõteseade Mõõteseadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 7. Joonis 7 Proov kandeplaadil, mis ripub mikrokaalul reguleeritava temperatuuriga kambris, asub kuiva lämmastiku voolus, mis kannab uuritava aine aurustunud molekulid ära. Kambrist väljuv gaas puhastatakse sorptsiooniseadmes. 1.5.6.3. Mõõtmise käik Uuritav aine kantakse ühtlase kihina karestatud klaasplaadi pinnale. Tahke aine puhul niisutatakse plaat ühtlaselt aine lahusega sobivas lahustis ja kuivatatakse inertgaasi atmosfääris. Ainekihiga klaasplaat riputatakse mõõtmiste tegemiseks termogravimeetrilisse analüsaatorisse ja mõõdetakse pidevalt klaasplaadi massi vähenemist ajas. Aurustumiskiirus vT kindlaksmääratud temperatuuril arvutatakse proovi massi vähenemise Δm alusel järgmise valemi abil: kus F on klaasplaati katva aine pindala (tavaliselt võrdne klaasplaadi pindalaga) ja t on aeg, mille jooksul mass vähenes. Aururõhk pT arvutatakse aurustumiskiirust vT väljendava funktsiooni alusel: log pT = C + D log vT kus C ja D on katseseadet iseloomustavad konstandid, mis olenevad mõõtekambri läbimõõdust ja gaasivoo kiirusest. Need konstandid määratakse üks kord, mõõtes teadaoleva aururõhuga ainete seeria aurustumiskiirused ja kasutades regressioonanalüüsi log pT vs. log vT (11, 21, 22). Aururõhu pT ja kelvinites väljendatud temperatuuri T vahelist seost kajastab võrrand log pT = A + B 1/T kus A ja B on regressioonseosest log pT vs. 1/T saadud konstandid. Selle võrrandi alusel saab arvutada aururõhu mis tahes muu temperatuuri juures ekstrapoleerimise teel. 1.5.7. Gaasiküllastusmeetod (23) 1.5.7.1. Põhimõte Üle või läbi uuritava aine proovi voolutatakse toatemperatuuril inertgaasi teadaoleva piisavalt väikese kiirusega, mis tagab gaasi küllastumise. Gaasifaasi küllastamine on väga tähtis. Kaasa kandunud aine kogutakse, kasutades püüdurina enamasti sorbenti, ja määratakse selle kogus. Auru püüdmise ja edasise analüüsi alternatiivina võib kaasa kandunud materjali koguse määramiseks kasutada ka järjestikku ühendatud analüüsiseadet, näiteks gaasikromatograafi. Aururõhu arvutamisel eeldatakse, et süsteem järgib ideaalse gaasi olekuvõrrandit ja gaasisegu üldrõhk on võrdne komponentgaaside rõhkude summaga. Uuritava aine partsiaalrõhu ehk aururõhu arvutamisel lähtutakse teadaolevast gaasi ruumalast ja kaasa kantud materjali massist. Gaasiküllastusmeetod on rakendatav nii tahkete kui ka vedelate ainete korral. Seda võib kasutada ka madalal rõhul kuni 10–10 Pa (10, 11, 12, 13, 14). Kõnesolev meetod on kõige usaldusväärsem aururõhul alla 103 Pa. Aururõhul üle 103 Pa saadakse tavaliselt õigetest suuremad väärtused, mis on tõenäoliselt tingitud aerosooli tekkimisest. Kuna aururõhu mõõtmised tehakse toatemperatuuril, ei ole vaja ekstrapoleerida kõrgetel temperatuuridel saadud andmeid; sellega välditakse sageli tõsiseid vigu põhjustavat ekstrapoleerimist kõrgetelt temperatuuridelt. 1.5.7.2. Mõõteseade Mõõtmiseks on vaja konstantse temperatuuriga kambrit. Joonisel 8 oleval skeemil on kamber, milles on kolm hoidlit tahketele proovidele ja kolm hoidlit vedelatele proovidele; see võimaldab teha tahke või vedela prooviga kolm analüüsi. Temperatuuri reguleeritakse ±0,5 °C või suurema täpsusega. Joonis 8 Üldiselt kasutatakse inertse kandegaasina lämmastikku, kuid mõnikord on vaja kasutada ka muid gaase (24). Kandegaas peab olema kuiv. Gaasivoog jaotatakse kuueks vooks, mida reguleeritakse nõelventiilide abil (ava läbimõõt ligikaudu 0,79 mm); need vood juhitakse 3,8 mm siseläbimõõduga vasktorude kaudu kambrisse. Pärast temperatuuri tasakaalustumist läbib gaas proovi ja sorbentpüünise ning väljub kambrist. Tahke proov asetatakse 5-millimeetrise siseläbimõõduga klaastorusse klaasvillast korkide vahele (vt joonis 9). Joonisel 10 on näidatud vedela proovi hoidel ja sorptsioonisõlm. Vedeliku aururõhu mõõtmised on kõige paremini reprodutseeritavad, kui vedelik kantakse klaashelmestele või mõnele muule inertsele sorbendile, nagu ränidioksiid, ning hoidel täidetakse selliselt kaetud helmestega. Alternatiivina võib kandegaasi voolutada läbi jämeda friti või barboteerida uuritava vedelikuga täidetud kolonni kandegaasiga. Joonis 9 Joonis 10 Sorptsioonisõlmes on eel- ja järeladsorptsiooni sektsioon. Väga madala aururõhu puhul võib olla tõsiseks probleemiks adsorptsioon proovi ning adsorbendi vahel oleval klaasvillal ja klaastorudel, kusjuures sorbendile jääb ainult väike kogus uuritavat ainet. Tõhus viis aurustunud materjali kogumiseks on kasutada süsihappelumega jahutatavat püüdurit. Selline püüdur ei avalda vasturõhku küllastuskolonnile ja sellest on kerge püütud materjali kvantitatiivselt eemaldada. 1.5.7.3. Mõõtmise käik Kandegaasi voolukiirust mõõdetakse toatemperatuuril. Voolukiirust kontrollitakse katse ajal sageli, et tagada kandegaasi üldmahu õige määramine. Parem on seda massivoolumõõturi abil pidevalt mõõta. Gaasifaasi küllastumiseks peab kokkupuuteaeg olema küllalt pikk ja gaasivoolu kiirus väike (25). Katse lõpus analüüsitakse eel- ja järeladsorptsiooni sektsiooni eraldi. Kummastki sektsioonist desorbeeritakse uuritav aine lahusti abil. Saadud lahuseid analüüsitakse kvantitatiivselt kummastki sektsioonist desorbeeritud massi määramiseks. Analüüsimeetodi (ja ka sorbendi ja desorbeeriva lahusti) valik oleneb uuritavast ainest. Desorptsiooni täielikkuse määramiseks kantakse teadaolev kogus uuritavat proovi sorbendile, desorbeeritakse, ja määratakse aine saagis. Desorptsiooni tõhusust on vaja kontrollida samal või ligikaudu samal uuritava proovi kontsentratsioonil, mis esineb mõõtmise puhul. Tagamaks, et kandegaas on uuritava ainega küllastunud, kasutatakse kolme erinevat gaasivoolu kiirust. Kui arvutatud aururõhk ei olene voolukiirusest, peetakse kandegaasi küllastunuks. Aururõhk arvutatakse järgmise valemi abil: kus: p = aururõhk (Pa), W = aurustunud uuritava aine mass (g), V = küllastunud kandegaasi maht (m3), R = universaalne gaasikonstant, 8,314 (Jmol–1K–1), T = temperatuur (K), M = uuritava aine molaarmass (gmol–1). Mõõdetud mahu väärtusi on vaja parandada, et arvestada rõhu ja temperatuuri erinevusi voolumõõturis ja küllastuskolonnis. 1.5.8. Pöörleva kuuli meetod 1.5.8.1. Põhimõte Selle meetodi puhul kasutatakse pöörleva kuuli põhimõttel töötavat viskoossusmõõturit, mille mõõteelement on magnetväljas hõljuv väike teraskuul, mis pannakse pöörlevate magnetväljade abil pöörlema (26, 27, 28). Kuuli pöörlemiskiirust saab mõõta andurmähiste abil. Kui kuul on jõudnud ettenähtud pöörlemiskiiruseni (tavaliselt umbes 400 pööret sekundis), lõpetatakse edasine kiirendamine ja kuuli pöörlemine hakkab hõõrdumise tõttu gaasikeskkonnas aeglustuma. Mõõdetakse pöörlemiskiiruse vähenemise sõltuvust ajast. Aururõhk tuletatakse teraskuulikese pöörlemiskiiruse vähenemisest, mis oleneb rõhust. Soovitatav määramisvahemik on 10–4 kuni 0,5 Pa. 1.5.8.2. Mõõteseade Katseseadme skeem on esitatud joonisel 11. Mõõtepea asetatakse 0,1 °C täpsusega termostateeritavasse kambrisse. Proovinõu paigutatakse 0,1 °C täpsusega termostateeritud eraldi kambrisse ning seadme kõiki ülejäänud osi hoitakse kondensatsiooni vältimiseks kõrgemal temperatuuril. Kogu seade on ühendatud kõrgvaakumsüsteemiga. Joonis 11 2. MÕÕTMISANDMED JA MÕÕTMISPROTOKOLLI KOOSTAMINE 2.1. MÕÕTMISANDMED Mis tahes eespool kirjeldatud meetodi kasutamise puhul määratakse aururõhk vähemalt kahel temperatuuril. Aururõhu sõltuvuse lineaarsuse kontrollimiseks tuleks eelistada aururõhu määramist kolmel või enamal temperatuuril vahemikus 0–50 °C. Efusioonmeetodite (Knudseni rakk ja isotermiline termogravimeetria) ning gaasiküllastusmeetodi korral on temperatuurivahemiku 0–50 °C asemel soovitatav mõõta aururõhud vahemikus 120–150 °C. 2.2. MÕÕTMISPROTOKOLL Mõõtmisprotokollis esitatakse järgmine teave: — kasutatud meetod; — aine täpne iseloomustus (identifitseerimiseks vajalikud andmed, lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldus (kui ainet puhastati); — vähemalt kaks, parem aga kolm või enam aururõhu ja temperatuuri väärtust vahemikus 0–50 °C (või 120–150 °C); — kui see valitud meetodi puhul on tehniliselt võimalik, peaks vähemalt üks temperatuur olema 25 °C või madalam; — kõik originaalandmed; — kõver log p versus 1/T; — hinnanguline aururõhu väärtus 20 või 25 °C juures. Kui esineb aine oleku muutusi (agregaatoleku muutumine, lagunemine), märgitakse järgmine teave: — muutuse laad; — atmosfäärirõhule vastav temperatuur, mille juures muutus toimub; — aururõhk 10 ja 20 °C allpool olekumuutuse temperatuuri ning 10 ja 20 °C ülalpool seda temperatuuri (välja arvatud juhtum, kui agregaatolek muutub tahkest gaasiliseks). Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad andmed ja tähelepanekud, eriti sellised, mis käsitlevad lisandeid ja aine füüsikalist olekut. 3. KIRJANDUS 1) Official Journal of the European Communities L 383 A, 26–47 (1992). 2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. 5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method. 6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. 7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. 8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. 10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532. 11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). 12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28. 13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269–278. 14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122. 15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147. 16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400. 17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168. 18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27–31. 19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310. 20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20. 21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range –25 °C to 150 °C. 22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). 23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Register, Washington DC 24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. 28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Mahtuvusmanomeetri kasutamise korral. Liide Hindamismeetod SISSEJUHATUS Hinnangulisi aururõhu väärtusi võib kasutada järgmistel juhtudel: — sobiva katsemeetodi valimiseks; — hinnangu või piirväärtuse andmiseks juhtudel, kui tehnilistel põhjustel ei saa mõõtmismeetodeid rakendada. HINDAMISMEETOD Vedelike ja tahkete ainete aururõhu hindamiseks võib kasutada teisendatud Watsoni korrelatsiooni (a). Ainus selleks vajalik eksperimentaalselt määratav väärtus on keemistemperatuur normaalrõhul. Meetod on rakendatav rõhuvahemikus 105 kuni 10–5 Pa. Meetodi üksikasjalik kirjeldus on esitatud väljaandes „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Vt ka OECD Environmental Monograph No. 67 (c). ARVUTUSKÄIK Aururõhk arvutatakse järgmise valemi abil: kus: T = aururõhu hindamise temperatuur, Tb = keemistemperatuur normaalrõhul, Pvp = aururõhk temperatuuril T, ΔHvb = aurustumissoojus, ΔZb = kokkusurutavustegur (hinnanguliselt 0,97), m = empiiriline konstant, mis oleneb aine füüsikalisest olekust aururõhu hindamise temperatuuril. Kasutatakse ka valemit kus KF on aine polaarsust arvestav empiiriline tegur. Rea ühendiklasside KF-tegurid on esitatud publikatsioonis (b). Sageli on olemas andmed keemistemperatuuri kohta madalamal rõhul. Sellisel juhul arvutatakse aururõhk järgmiselt: kus T1 on keemistemperatuur madalamal rõhul P1. PROTOKOLLI KOOSTAMINE Kui kasutatakse hindamismeetodit, tuleb protokollis esitada täielik arvutuskäik. KIRJANDUS a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

II LISA A.22. KIUDUDE PIKKUSE JÄRGI KAALUTUD GEOMEETRILINE KESKMINE DIAMEETER 1. MEETOD 1.1. SISSEJUHATUS See meetod kirjeldab protseduuri lahtiste keemiliste mineraalkiudude (MMMF, Man Made Mineral Fibres) pikkuse järgi kaalutud geomeetrilise keskmise diameetri (LWGMD, Length Weighted Geometric Mean Diameter) mõõtmiseks. Kuna kogumi LWGMD on 95 % tõenäosusega proovi 95 % usalduspiiride vahel (LWGMD ± kaks standardviga), asub esitatud väärtus (testväärtus) proovi madalamal 95 % usalduspiiril (st LWGMD – kaks standardviga). Meetod põhineb 1994. aasta juunis uuendatud HSE tööstusprotseduuri kavandil, mis kooskõlastati ECFIA ja HSE kohtumisel Chesteris 26. septembril 1993 ja mida arendati edasi teise laboritevahelise katse jaoks ja selle põhjal (1, 2). Seda mõõtmismeetodit saab kasutada selliste lahtiste ainete või toodete kiudiameetri iseloomustamiseks, mis sisaldavad MMMFisid, kaasa arvatud tulekindlad keraamilised kiud (RCF, refractory ceramic fibres), keemilised klaaskiud (MMVF, man-made vitreous fibres), kristallilised ja polükristallilised kiud. Pikkuse järgi kaalumine on viis kompenseerida diameetri jaotumist, mida põhjustab pikkade kiudude murdumine materjalist proovi võtmisel või materjali käsitsemisel. Geomeetrilist statistikat (geomeetrilist keskmist) kasutatakse MMMFide diameetri suuruse järgi jaotumise mõõtmiseks, kuna nende diameetrite jaotus suuruse järgi on tavaliselt lähedane logaritmilisele normaaljaotusele. Nii pikkuse kui diameetri mõõtmine on tüütu ja aeganõudev, aga kui mõõdetakse vaid neid kiudusid, mis puudutavad lõpmatult peenikest riba skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) vaateväljas, siis on antud kiu valimise tõenäosus võrdeline selle pikkusega. Kuna sellega võetakse arvesse pikkust pikkuse järgi kaalumise arvutustes, on ainus nõutav mõõtmine diameetri mõõtmine ja „LWGMD – kaks standardviga” võib arvutada kirjeldatud viisil. 1.2. MÕISTED Partikkel – objekt, mille pikkuse-laiuse suhe on vähem kui 3:1. Kiud – objekt, mille pikkuse-laiuse suhe (formaadisuhe) on vähemalt 3:1. 1.3. RAKENDUSALA JA PIIRANGUD Meetod on mõeldud vaatlemaks diameetri jaotumisi, keskmise diameetriga alates 0,5 μm kuni 6 μm. Suuremaid diameetreid võib mõõta, kasutades väiksemaid SEMi suurendusi, kuid meetodi täpsus väheneb peenemate kiudude jaotuste puhul ja kui keskmine diameeter on alla 0,5 μm, soovitatakse mõõtmist TEMiga (transmissiooni elektronmikroskoop). 1.4. Katsemeetodi põhimõte Kiu kihist või lahtisest kiumassist võetakse mitu representatiivset südamikuproovi. Lahtiste kiudude pikkust vähendatakse purustava protseduuri abil ja representatiivne osaproov hajutatakse vees. Eraldatakse alikvoodid ja filtreeritakse need läbi 0,2 μm poorisuurusega polükarbonaadifiltri ja valmistatakse ette uurimiseks SEMi tehnikate abil. Kiu diameeter mõõdetakse 10 000-kordse või suurema ekraanisuurendusega, (1) kasutades erapooletu keskmise diameetri hinnangu andmiseks liini katkestamise meetodit. Arvutatakse madalam 95 % usaldusvahemik (mis põhineb ühepoolsel testil), et anda hinnang materjali kiudiameetri geomeetrilise keskmise väikseima väärtuse kohta. 1.5. Katsemeetodi kirjeldus 1.5.1. Turvalisus/ettevaatusabinõud Isiklikku kokkupuudet õhus sisalduvate kiududega tuleks minimeerida ja kuivkiudude käsitsemisel tuleks kasutada tõmbekappi või laminaarboksi. Kontrollmeetodite tõhususe kindlaksmääramiseks tuleks läbi viia korrapärast isikliku kokkupuute seiret. MMMFide käsitsemisel tuleb nahaärrituse vähendamiseks ja ristsaastumise ärahoidmiseks kanda ühekordselt kasutatavaid kindaid. 1.5.2. Seadmed/vahendid — Press ja pressvormid (võimelised tekitama 10 MPa). — 0,2 μm poorisuurusega polükarbonaat-kapillaarfiltrid (25 mm diameetriga). — 5 μm poorisuurusega tselluloos-ester membraanifilter tugifiltrina kasutamiseks. — Klaasist filtreermisseadmed (või ühekordselt kasutatavad filtreerimissüsteemid) 25 mm diameetriga filtritele (nt Millipore’i klaasist mikroanalüüsikomplekt, tüüp nr XX10 025 00). — Värskelt destilleeritud vesi, mis on mikroorganismide eemaldamiseks lastud läbi 0,2 μm poorisuurusega filtri. — Pihusti kuld- või kuld/pallaadiumotsaga. — Skaneeriv elektronmikroskoop lahutamisvõimega kuni 10 nm ja 10 000-kordse suurendusega. — Muu: spaatlid, tüüp 24, skalpellitera, pintsetid, SEMi torud, süsinikliim või süsinikteip, kolloidhõbe. — Ultrahelisond või lauale asetatav ultrahelivann. — Südamiku proovivõtuvahend või korgipuur südamikuproovide võtmiseks MMMFide kihist. 1.5.3. Katsemenetlus 1.5.3.1. Proovivõtmine Mineraalvilla ja villaku puhul kasutatakse ristlõikest proovide võtmisel 25 mm südamikuproovide võtmise vahendit või korgipuuri. Proovid peaksid olema võrdselt jaotatud kihi laiuse ulatuses või võetud suvalistest kohtadest, kui käepärast on pikki kihte. Samade vahendite abil on võimalik eraldada juhuslikke proove lahtisest kiust. Võimaluse korral tuleks ruumiliste variatsioonide peegeldamiseks lahtises materjalis võtta kuus proovi. Kuus südamikuproovi purustatakse 50 mm läbimõõduga vormis 10 MPa juures. Materjal segatakse spaatliga ja pressitakse uuesti 10 MPa juures. Seejärel võetakse materjal vormist välja ja säilitatakse seda suletud klaaspudelis. 1.5.3.2. Proovi ettevalmistamine Orgaanilist sideainet saab vajaduse korral eemaldada, asetades kiu umbes tunniks 450 °C sulatusahju. Proovi jaotamiseks vormitakse see koonuseks ja lõigatakse see neljaks (seda tuleks teha tolmukapis). Spaatli abil lisatakse väike hulk (< 0,5 g) proovist 100 ml värskelt destilleeritud veele, mis on lastud läbi 0,2 μm membraaniga filtri (alternatiivina võib kasutada ultrapuhast vett muudest allikatest, kui need vastavad nõuetele). Proov hajutatakse põhjalikult ultrahelisondi abil 100 W võimsuse juures ja seda pööratakse nii, et tekiks kavitatsioon. (Kui sondi pole käepärast, kasutada järgmist meetodit: proovi raputatakse ja pööratakse korduvalt ümber 30 sekundi jooksul; hoitakse viis minutit lauale asetatavas ultrahelivannis; seejärel raputatakse ja pööratakse korduvalt veel 30 sekundi jooksul). Kohe pärast kiu hajutamist eemaldatakse teatud arv alikvoote (näit kolm 3, 6 ja 10 ml alikvooti), kasutades laiasuulist pipetti (2–5 ml mahutavusega). Iga alikvoot vaakumfiltreeritakse läbi 0,2 μm polükarbonaatfiltri, mida toetab 5 µm poorisuurusega MEC-tugifilter, kasutades 25 mm klaasist filterlehtrit silindrilise mahutiga. Umbkaudu 5 ml filtreeritud destilleeritud veest tuleks asetada lehtrisse ja alikvoot aeglaselt vette pipettida, hoides pipetiotsa allpool meniskit. Peale pipettimist tuleb pipett ja veemahuti põhjalikult läbi loputada, kuna peenikesed kiud kipuvad jääma pinnale. Filter eemaldatakse hoolikalt ja eraldatakse see tugifiltrist enne mahutisse kuivama asetamist. Filtreeritud osast lõigatakse veerand või pool tüüp 24 skalpelliga edasi-tagasi liigutuste abil. Lõigatud osa kinnitatakse ettevaatlikult SEMi esemelaua külge süsinikteibi või süsinikliimi abil. Kolloidhõbedat tuleks lisada vähemalt kolme kohta, et parandada elektrilist kontakti filtri ja esemelaua äärtel. Kui liim/kolloidhõbe on kuiv, pihustada proovi pinnale umbes 50 nm kulla või kulla/pallaadiumi kiht. 1.5.3.3. SEMi kalibreerimine ja kasutamine 1.5.3.3.1. Kalibreerimine SEMi kalibreerimist tuleks kontrollida vähemalt kord nädalas (ideaaljuhul kord päevas), kasutades sertifitseeritud kalibreerimisvõret. Kalibreerimist tuleks kontrollida sertifitseeritud standardi alusel ja kui mõõdetud väärtus (SEM) ei jää ±2 % sisse sertifitseeritud väärtusest, siis tuleb SEM-kalibreerimist kohandada ja uuesti kontrollida. SEM peaks olema võimeline lahendama vähemalt minimaalselt nähtava diameetri 0,2 µm, kasutades tegelikku proovimaatriksit, 2 000-kordse suurendusega. 1.5.3.3.2. Kasutamine SEM peaks töötama 10 000-kordse suurenduse (2) juures tingimustel, mis annavad hea lahutusvõime lubatava kujutise aeglasel skaneerimiskiirusel, näiteks 5 sekundit kaadri kohta. Kuigi erinevate SEMide kasutamisnõuded võivad varieeruda, tuleks suhteliselt väikese aatommassiga materjalide korral üldiselt parima nähtavuse ja resolutsiooni saavutamiseks kasutada kiirendavat pinget 5–10 keV, väikest laotuspunkti seadistust ja lühikest töökaugust. Lineaarse skaneerimise puhul tuleb kasutada 0o kallet, et minimeerida refokuseerimine, või kui SEMil on võimalik kohaldada kõrgust, tuleks kasutada kohaldatud kõrgusega töökaugust. Võib kasutada väiksemat suurendust, kui materjal ei sisalda väikseid (väikese diameetriga) kiude ja kiudude diameeter on suur (> 5 μm). 1.5.3.4. Suuruse järgi sorteerimine 1.5.3.4.1. Väikese suurendusega uurimine proovi hindamiseks Algselt tuleks proovi uurida väikese suurendusega, et otsida tõendust suurte kiudude pundarde kohta ning hinnata kiutihedust. Juhul kui moodustub liiga palju puntraid, on soovitatav ette valmistada uus proov. Statistilise täpsuse jaoks on vaja mõõta miinimumarv kiude ja suur kiutihedus võib tunduda soovitav, kuna tühjade väljade uurimine on aeganõudev ega oma analüüsi jaoks väärtust. Kui aga filter on üle koormatud, muutub kõigi mõõdetavate kiudude mõõtmine siiski raskeks, ja kuna väikesed kiud võivad jääda suuremate varju, võivad need jääda kahe silma vahele. Kalduvus LWGMD ülehindamisele võib tuleneda kiutihedustest enam kui 150 kiudu millimeetri kohta lineaarse sammu puhul. Teisest küljest pikendab väike kiukontsentratsioon analüüsi aega ja sageli on mõistlikum valmistada ette proov, mille kiutihendus on lähedasem optimaalsele, kui jätkata madala kontsentratsiooniga filtrite loendamist. Optimaalne kiutihedus peaks andma keskmiselt üks või kaks loendatavat kiudu vaatevälja kohta 5 000-kordse suurendusega. Siiski sõltub optimaalne tihedus kiudude suurusest (diameetrist), nii et on vajalik, et operaator kasutaks teatavat eksperdihinnangut otsustamaks, kas kiu tihedus on optimaalse lähedane või mitte. 1.5.3.4.2. Kiu diameetri kaalumine pikkuse järgi Loendatakse vaid kiude, mis puudutavad (lõpmatult) peenikest SEMi ekraanile tõmmatud joont (või lõikuvad sellega). Selleks on ekraani keskele tõmmatud horisontaalne (või vertikaalne) joon. Alternatiivina võib ekraani keskele asetada üksiku punkti ja alustada pidevat skaneeringut ühes suunas üle filtri. Mõõdetakse ja salvestatakse iga sellise kiu diameeter, mille formaadisuhe on suurem kui 3:1 ja mis puudutab või ületab seda punkti. 1.5.3.4.3. Kiudude sorteerimine suuruse järgi Soovitav on mõõta minimaalselt 300 kiudu. Iga kiudu mõõdetakse ainult korra ja selles punktis, kus ta lõikub kujutisele paigutatud joone või punktiga (või lõikumiskoha lähedal, kui kiu servad on hägused). Kui leidub ebaühtlase põiklõikega kiude, tuleks kasutada mõõtmist, mis vastab kiu keskmisele diameetrile. Hoolikas tuleb olla kiuservade määratlemisel ja nendevahelise lühima kauguse mõõtmisel. Sorteerimist võib läbi viia on-line või off-line salvestatud kujutistel või fotodel. Soovitatav on kasutada poolautomatiseeritud kujutise mõõtmise süsteeme, mis laadivad andmed otse arvutustabelisse, kuna need säästavad aega ja välistavad ümberkirjutusvead ning arvutusi on võimalik automatiseerida. Pikkade kiudude otsi tuleks kontrollida väikese suurendusega, et välistada nende tagasikeerdumine mõõtmise vaatevälja ja tagada, et neid mõõdetakse ainult üks kord. 2. ANDMED 2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE Kiudiameetritel ei esine tavaliselt normaaljaotust. Siiski on logaritmteisenduse abil võimalik saavutada normaaljaotusele lähenev jaotus. Arvutatakse n kiudiameetri (D) naturaallogaritmide (lnD) aritmeetiline keskmine (keskmine lnD) ja standardhälve (SDlnD). (1) (2) Standardhälve jagatakse mõõtmiste arvu (n) ruutjuurega, et saada standardviga (SElnD). (3) Keskmisest lahutatakse kahekordne standardviga ja arvutatakse selle väärtuse eksponent (keskmine miinus kaks standardviga), et saada geomeetriline keskmine miinus kaks geomeetrilist standardviga. (4) 3. ARUANDMINE KATSEARUANNE Katsearuanne peaks sisaldama vähemalt järgmist teavet: — avaldise LWGMD – 2SE väärtus; — mis tahes hälbed ja eriti need, mis võivad avaldada mõju tulemuste täpsusele, koos piisavate põhjendustega. 4. VIITED 1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Veebruar 1999. 2) G. Burdett ja G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) See suurendusväärtus kehtib 3 µm kiu puhul, 6 µm kiu puhul võib 5 000-kordne suurendus olla sobivam. (2) 3 μm kiudude korral vt eelmist märkust.

III LISA B.46. IN VITRO NAHAÄRRITUSKATSE: KATSE REKONSTRUEERITUD INIMEPIDERMISE MUDELIGA 1. MEETOD 1.1. SISSEJUHATUS Nahaärritus / nahka ärritav toime tähendab pöörduva nahakahjustuse tekitamist kuni neljatunnisel kokkupuutel uuritava ainega (nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS)) (1). Käesolevas katsemeetodis on esitatud in vitro meetod, millega saab, olenevalt vajatavast teabest, määrata ainete põhjustatavat nahaärritust katsestrateegiale vastava iseseisva asendustestina, kasutades tõendusmaterjali kaalukuse hindamise lähenemisviisi (2). Nahka ärritava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud laboriloomi (vt meetod B.4) (3). Loomade heaolu tagamise vajadust arvestades saab meetodiga B.4 määrata nahka söövitavat või ärritavat toimet, kohaldades järjestikuste katsete strateegiat, milleks kasutatakse valideeritud in vitro ja ex vivo meetodeid, et vältida loomadele valu ja kannatuste põhjustamist. Meetodi B.4 järjestikuste katsete strateegia rakendamisel saab söövitamise uurimiseks kasutada kolme valideeritud in vitro katsemeetodit või -eeskirja: B.40, B.40bis ja TG 435 (4, 5, 6). Käesolevas katsemeetodis on kasutatud rekonstrueeritud inimepidermise mudeleid, mis oma üldise ülesehituse poolest (rakkude allikana on nendes kasutatud inimepidermisest saadud keratinotsüüte, mudelil on epidermisesarnane kude ja rakuarhitektuur) jäljendavad nii oma biokeemiliste kui ka füsioloogiliste omaduste poolest inimnaha ülemisi kihte, s.t epidermist. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud menetlusega on võimalik kindlaks määrata ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooriale vastavate ärritavate ainetega seotud ohud. Käesolevas katsemeetodis on esitatud ka rida tulemuslikkuse nõudeid rekonstrueeritud inimepidermisel põhinevate sarnaste ja modifitseeritud katsemeetodite hindamiseks (7). Rekonstrueeritud inimepidermise mudelite kasutamisel põhinevatest in vitro katsemeetoditest (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) on kahe meetodi eelvalideerimise, optimeerimise ja valideerimise uuringud lõpetatud ning need kaks meetodit, EpiSkin™ ja EpiDerm™, on müügil. Nimetatud standardmeetodid põhinesid R 38-l. GHS-süsteemi kasutamiseks vajalike ümberarvutuste teatavaid aspekte on käsitletud viites 25. Meetodeid, mille tulemused on samaväärsed meetodi EpiSkin™ tulemustega (valideeritud standardmeetod 1), soovitatakse iseseisva asendusmeetodina küüliku in vivo katsele, mille alusel klassifitseeritakse GHS-süsteemi 2. kategooria ärritavaid aineid. Meetodeid, mille tulemused on samaväärsed EpiDerm™ (valideeritud standardmeetod 2) tulemustega, soovitatakse GHS-süsteemi 2. kategooria ärritavate ainete klassifitseerimisel ainult sõeluuringumeetodina või tõendusmaterjali kaalukuse hindamise lähenemisviisi järjestikuste katsete strateegia osana. Enne kui nahaärrituse mudelkatseks kavandatud in vitro katset rekonstrueeritud inimepidermise mudeliga võib kasutada seadusega ette nähtud katsena, tuleb kindlaks määrata selle usaldusväärsus, asjakohasus (tulemuste täpsus) ja piirangud selle tagamiseks, et meetod on vastavalt käesolevas katsemeetodis esitatud tulemuslikkuse nõuetele (vt liide) võrreldav valideeritud standardmeetodiga 1. Käesolevas katsemeetodis esitatud nõuete kohaselt on valideeritud veel kaks katsemeetodit, milles kasutatakse in vitro rekonstrueeritud inimepidermise mudelit; osutatud meetodid annavad valideeritud standardmeetodiga 1 sarnaseid tulemusi (18). Need on modifitseeritud katsemeetod EpiDerm™ (modifitseeritud standardmeetod 2) ja katsemeetod SkinEthic RHE™ (sarnane meetod 1). 1.2. MÕISTED Käesolevas katsemeetodis on kasutatud järgmisi mõisteid. Täpsus – katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse. Partii kontrollaine – võrdlusaine, mille mõju koerakkude eluvõimelisusele jääb mõõdetava vahemiku keskele. Rakkude eluvõimelisus – rakupopulatsiooni üldist aktiivust, näiteks raku mitokondrite dehüdrogenaaside võimet taandada vitaalvärvainet MTT ([3–(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine), väljendav parameeter, mis olenevalt mõõdetavast lõpp-punktist ja katseplaanist korreleerub elusrakkude koguarvu ja/või elujõulisusega. ET50 – kokkupuuteaeg, pärast mida markeraine teatava kindla kontsentratsiooni rakendamisel rakkude eluvõimelisus väheneb 50 %; vt ka IC50. Valenegatiivsete vastuste määr – kõikide selliste positiivsete ainete osakaal, mis katsemeetodi alusel on tunnistatud negatiivseteks. See on üks katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja. Valepositiivsete vastuste määr – kõikide selliste negatiivsete (mitteaktiivsete) ainete osakaal, mis katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud positiivseks. See on üks katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja. Lõpmatu annus – nahale kantud uuritava aine kogus, mis on suurem nahapinna täielikuks ja ühtlaseks katmiseks vajalikust kogusest. GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals – kemikaalide ühtne ülemaailmne klassifitseerimis- ja märgistamissüsteem) – süsteem, millega nähakse ette ainete ja segude klassifitseerimine vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste ainete kahjuliku mõju kohta (1), ja mis on ELis rakendatud määrusega (EÜ) nr 1272/2008. IC50 – kontsentratsioon, mille puhul markeraine vähendab pärast kindlaksmääratud kokkupuuteaega kudede eluvõimelisust 50 %; vt ka ET50. Tulemuslikkuse nõuded – valideeritud standardmeetodil põhinevad nõuded, mille alusel hinnatakse, kuivõrd saab kavandatud katsemeetodit võrrelda mehaaniliselt ja tööpõhimõttelt sarnase meetodiga. See hõlmab järgmist: I) olulisemad katsemeetodi osad; II) valideeritud standardmeetodi usaldusväärsuse tõendamiseks kasutatud ainete hulgast valitud etalonainete miinimumloend ja III) võrreldavad täpsuse ja usaldusväärsuse tasemed, mis põhinevad valideeritud standardmeetodiga saadud tulemustel ja mis tuleks kavandatud katsemeetodi hindamisel saavutada etalonainete miinimumloendi kasutamisel. Usaldusväärsus – sellega mõõdetakse katsemeetodi tulemuste reprodutseeritavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katseprotokolli alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamisel arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus. Tundlikkus – kõikide positiivsete ainete / toimeainete osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkus näitab selgeid tulemusi andva katsemeetodi täpsust ja on oluline katsemeetodi asjakohasuse hindamisel. Spetsiifilisus – kõikide negatiivsete/toimeta ainete osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkus näitab selgeid tulemusi andva katsemeetodi täpsust ja on oluline katsemeetodi asjakohasuse hindamisel. Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine uuritava ainega kuni neljatunnise kokkupuute tagajärjel. Nahaärritus on kohalik mitteimmunogeenne reaktsioon, mis tekib lühikese aja jooksul pärast kokkupuudet (24). Seda iseloomustab peamiselt pöörduv protsess, mis hõlmab põletikureaktsiooni ja põletikuga seotud iseloomulikke kliinilisi ärrituse tunnuseid (punetus, turse, sügelus ja valu). 1.3. KASUTUSALA JA PIIRANGUD Käesolevas katsemeetodis esitatud rekonstrueeritud inimepidermise mudeliga tehtavaid katseid piirab see, et nendega saab aineid klassifitseerida ainult nahka ärritavateks aineteks, mis vastavad ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooriale. Kuna meetod ei võimalda klassifitseerida aineid ÜRO GHS-süsteemi 3. valikkategooriasse kuuluvateks aineteks, jäävad kõik ülejäänud ained klassifitseerimata (ilma kategooriata). Olenevalt reguleerimisvajadustest ja uute lõpp-punktide võimalikust hõlmamisest tulevikus, samuti võimalikest täiustustest või samalaadsete katsemeetodite väljatöötamisest, tuleb käesolevat katsemeetodit võib-olla hakata läbi vaatama. Käesolev katsemeetod võimaldab kindlaks määrata ühest koostisosast koosnevate ärritavate ainete ohtlikkuse (19), kuid ei anna tõepärast teavet nahka söövitava toime kohta. Gaaside ja aerosoolide toimet ei ole võimalik määrata, valideerimisuuringuga ei ole veel hinnatud segusid. 1.4. KATSE PÕHIMÕTE Uuritav aine kantakse kolmemõõtmelisele rekonstrueeritud inimepidermise mudelile, mis koosneb tavalistest inimepidermisest saadud keratinotsüütidest, mida on kasvatatud nii, et need moodustavad mitmekihilise tugevalt diferentseerunud inimepidermise mudeli. See koosneb korrastatud basaalkihist, ogakihist ja sõmerkihist ning mitmekihilisest sarvkihist, mis sisaldab rakkudevahelisi õhiklipiidkihte, mille paigutus sarnaneb paigutusega in vivo. Rekonstrueeritud inimepidermise mudeli katse põhineb hüpoteesil, et ärritavad ained suudavad difusiooni teel tungida läbi sarvkihi ja on tsütotoksilised allpool asuvatele rakukihtidele. Rakkude eluvõimelisust mõõdetakse selle põhjal, kuidas dehüdrogenaas muundab vitaalvärvainet MTT [3–(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine; EINECSi number 206–069–5, CASi number 298–93–1)] siniseks formasaansoolaks, mis pärast koest ekstraheerimist määratakse kvantitatiivselt (20). Ärritavad ained tehakse kindlaks nende võime järgi vähendada rakkude eluvõimelisust allapoole kindlaksmääratud läviväärtusi (see tähendab ≤ 50 % ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooria ärritavate ainete puhul). Ained, mille puhul rakkude eluvõimelisus jääb ülespoole kindlaksmääratud läviväärtust, jäetakse klassifitseerimata (see tähendab > 50 %, ilma kategooriata). Rekonstrueeritud inimepidermise mudelsüsteeme saab kasutada tahkete ainete, vedelike, pooltahkete ainete ja vahataoliste ainete määramiseks. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Võimaluse korral tuleks tahkeid aineid alati katsetada peene pulbri kujul. Kuna rekonstrueeritud inimepidermise mudeli valideerimiseks kasutati katsesüsteemidena 58 hoolikalt valitud ainet, mis esindavad paljusid keemiliste ühendite klasse, peetakse kõnealuseid meetodeid üldiselt rakendatavaks paljude aineklasside puhul (16). Valideerimine hõlmab 13 GHS-süsteemi 2. kategooria ärritavat ainet. Tuleb märkida, et valideerimisel ei kasutatud mittesöövitavaid happeid, aluseid, sooli ja muid anorgaanilisi aineid, samuti ei kasutatud või kasutati üksnes piiratud ulatuses aineid, mis kuuluvad mõnesse teadaolevalt ärritavate orgaaniliste ainete klassi, nagu vesinikperoksiidid, fenoolid ja pindaktiivsed ained. 1.5. PÄDEVUSE TÕENDAMINE Enne käesoleval katsemeetodil põhineva valideeritud meetodi igapäevast kasutuselevõttu võivad laborid tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades tabelis 1 soovitatud kümmet ainet. Käesoleva katsemeetodi kohaselt käsitatakse ÜRO GHS-süsteemi 3. valikkategooriat kategooria puudumisena. Käesoleva katsemeetodi alusel väljatöötatavate uute samalaadsete katsemeetodite puhul, mis oma struktuuri ja tööpõhimõtte poolest sarnanevad valideeritud standardmeetoditega, samuti valideeritud meetodite modifikatsioonide puhul, tuleks kasutada käesoleva katsemeetodi liites kirjeldatud tulemuslikkuse nõudeid, et tõendada uue katsemeetodi võrreldavat usaldusväärsust ja täpsust, enne kui uus meetod võetakse kasutusele õigusnormides ette nähtud meetodina. Tabel 1 Liites esitatud etalonainete hulgast valitud ained pädevuse kontrollimiseks Aine CASi number Tulemus in vivo Füüsikaline olek GHS-kategooria naftüüläädikhape 86–87–3 0 tahke kat-ta isopropanool 67–63–0 0,3 vedelik kat-ta metüülstearaat 112–61–8 1 tahke kat-ta heptüülbutüraat 5870–93–9 1,7 vedelik 3. valikkat. heksüülsalitsülaat 6259–76–3 2 vedelik 3. valikkat. 3-p-kumenüül-2-metüülpropioonaldehüüd 103–95–7 2,3 vedelik 2. kat. 1-bromoheksaan 111–25–1 2,7 vedelik 2. kat. butüülmetakrülaat 97–88–1 3 vedelik 2. kat. 1-metüül-3-fenüül-1-piperasiin 5271–27–2 3,3 tahke 2. kat. heptanaal 111–71–7 4 vedelik 2. kat. 1.6. MEETODI KIRJELDUS Järgnevas osas kirjeldatakse nahaärrituse hindamiseks kasutatava rekonstrueeritud inimepidermise mudeliga tehtava katse koostisosi ja menetlusi. Rekonstrueeritud inimepidermise mudeli võib koostada, valmistada ise või osta (näiteks EpiSkin™, EpiDerm™ ja SkinEthic RHE™). Standardsete katsemeetodite EpiSkin™, EpiDerm™ ja SkinEthic RHE™ läbiviimise eeskirjad võib saada aadressilt http://ecvam.jrc.ec.europa.eu (21, 22, 23). Katse tuleks läbi viia järgmiselt. 1.6.1. Rekonstrueeritud inimepidermise mudeli koostisosad 1.6.1.1. Mudeli üldised tingimused Epiteelkoe ehitamiseks tuleb kasutada tavalisi inimese keratinotsüüte. Talitleva sarvkihi all peab olema mitu kihti (basaalkiht, ogakiht ja sõmerkiht) eluvõimelisi epiteelrakke. Sarvkiht peaks olema mitmekihiline ja vajaliku lipiidse koostisega, et tekiks sellise tugevusega funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste markerainete, nagu naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) või Triton X-100, kiiret läbitungimist. Nimetatud kaitsekihina toimimist saab hinnata kas sellise kontsentratsiooni määramisega, mille juures markeraine vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra (IC50) pärast kindlaksmääratud kokkupuuteaega, või sellise kokkupuuteaja määramisega, mille puhul markeraine vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra (ET50) teatava kindla kontsentratsiooni juures. Mudel peab olema selline, et aine ei saaks tungida eluskudedesse sarvkihist mööda minnes, vastasel korral ei oleks tegemist naha ja keemilise aine kokkupuute õige mudeliga. Nahamudel ei tohi olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega. 1.6.1.2. Mudeli funktsionaalsed tingimused 1.6.1.2.1. Eluvõimelisus Eluvõimelisuse määramiseks kasutatakse eelistatult värvainet MTT (20). Negatiivse kontrolli võrdlusainega töödeldud koest ekstraheeritud (lahustatud) värvaine optiline tihedus (OD) peab olema vähemalt 20 korda suurem kui ekstraheerimislahusti optiline tihedus. Peaks olema tõendatud, et negatiivse võrdlusainega töödeldud kude on kultuuris stabiilne (võimaldab saada sarnaseid eluvõimelisuse mõõtmistulemusi) katses kasutatava kokkupuuteaja jooksul. 1.6.1.2.2. Toimimine kaitsekihina Sarvkiht ja selle lipiidne koostis peavad olema piisavad, et takistada tsütotoksiliste markerainete, nagu SDSi või Triton X-100 kiiret läbitungimist; seda hinnatakse IC50 või ET50 abil. 1.6.1.2.3. Morfoloogia Vajaliku ettevalmistusega töötajad peavad tegema rekonstrueeritud naha/epidermise histoloogilise uuringu, mis peaks näitama, et on saadud inimnaha/epidermisega sarnane struktuur (kaasa arvatud mitmekihiline sarvkiht). 1.6.1.2.4. Reprodutseeritavus Konkreetse mudeli kasutamise korral peaks meetod andma ajas reprodutseeritavaid tulemusi, kusjuures partii kontrollimiseks kasutatakse eelistatavalt mingit sobivat (kontroll)ainet (vt liide). 1.6.1.2.5. Mudeli kvaliteedikontroll Epidermisemudeli iga partii peaks vastama teatavatele kindlatele toote kvaliteedikontrolli kriteeriumidele, millest kõige tähtsamad on eluvõimelisus (punkt 1.6.1.2.1) ja toimimine kaitsekihina (punkt 1.6.1.2.2). Nahamudeli tootja (või katse läbiviija, kui ta kasutab omatehtud mudelit) peaks kindlaks määrama IC50 või ET50 lubatava vahemiku (ülem- ja alampiiri). Kudede kaitsekihiomadusi tuleks laboris pärast kudede saamist kontrollida. Nahaärrituse põhjustamise usaldusväärseks ennustamiseks saab kasutada ainult sobivate omadustega kudedega saadud tulemusi. Järgmises tabelis on näitena esitatud valideeritud standardmeetodite puhul lubatavad vahemikud. Tabel 2 Partii kvaliteedi kontrollimise kriteeriumide näited Lubatav alampiir Lubatava vahemiku keskväärtus Lubatav ülempiir Valideeritud standardmeetod 1 (18-tunnine töötlus SDS-ga) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Valideeritud standardmeetod 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h 1.6.1.3. Uuritavate ja kontrollainete pealekandmine Igaks määramiseks ja kontrollkatseteks tuleb kasutada piisavat arvu koemudeleid (vähemalt kolm korduskatset iga määramise kohta). Nii vedelate kui ka tahkete ainete korral tuleb kasutada piisavat uuritava aine kogust, nii et see kataks ühtlaselt naha pinna, kuid vältida tuleb lõpmatut annust (vt punkt 1.2 „Mõisted”); see tähendab, et ainet tuleb peale kanda vähemalt 25 μl/cm2 või 25 mg/cm2. Tahkete ainete puhul tuleks epidermist niisutada enne aine pealekandmist deioniseeritud või destilleeritud veega, et tagada aine hea kontakt nahaga. Võimaluse korral tuleks tahkeid aineid alati katsetada peene pulbri kujul. Kokkupuuteaja lõpus tuleks uuritav aine nahapinnalt hoolikalt maha pesta vesipuhverlahusega või 0,9 % NaCl lahusega. Olenevalt kasutatavast rekonstrueeritud inimepidermise mudelist võib kokkupuuteaeg olla 15–60 minutit ja inkubatsioonitemperatuur 20–37 °C. Üksikasjad on esitatud kolme meetodi standardses töökorras (21, 22, 23). Iga uuringu puhul tuleb teha paralleelkatsed negatiivse kontrolli võrdlusaine ja positiivse kontrolli võrdlusainega, millega tõendatakse, et kudede eluvõimelisus (negatiivse kontrolli võrdlusaine), kaitsekihi toime ja sellega määratud kudede tundlikkus (positiivse kontrolli võrdlusaine) on kindlaksmääratud varasemates lubatud piirides. Soovitatav positiivse kontrolli võrdlusaine on SDSi 5 % vesilahus. Soovitatavad negatiivse kontrolli võrdlusained on vesi või fosfaatpuhvrit sisaldav keedusoolalahus. 1.6.1.4. Raku eluvõimelisuse mõõtmine Kõige olulisem katse läbiviimisel on see, et eluvõimelisuse mõõtmisi ei tehtaks vahetult pärast kokkupuudet uuritava ainega, vaid pärast töötlemisele järgnevat puhtaks loputatud kudede piisavalt pikka inkubeerimist värskes keskkonnas. Inkubeerimine võimaldab toibuda nõrgalt ärritavast mõjust ja ilmneda selgel tsütotoksilisel mõjul. Katse optimeerimise etapil (9, 10, 11, 12, 13) tehti kindlaks, et 42-tunnine inkubeerimine pärast töötlemist on optimaalne, ja seepärast kasutatigi seda inkubatsiooniaega määramise standardmeetodite valideerimisel. MTT muundamise katse on kvantitatiivne valideeritud meetod, mida tuleks kasutada rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks. Meetodit saab kasutada kolmemõõtmelises koekonstruktsioonis. Nahaproov asetatakse kolmeks tunniks sobiva kontsentratsiooniga (nt 0,3–1 mg/ml) MTT lahusesse sobival inkubatsioonitemperatuuril. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahustiga (näiteks isopropanool, hapestatud isopropanool) ja formasaani kontsentratsioon määratakse optilise tiheduse mõõtmisega lainepikkusel 570 nm, kasutades spektririba laiust kuni ±30 nm. Uuritava aine enda optilised omadused või selle keemiline mõju MTT-le võib segada määramist, põhjustades eluvõimelisuse hindamisel vea (kuna uuritav aine võib segada värvuse ilmumist, nõrgendada värvust või põhjustada seda). See võib juhtuda, kui uuritavat ainet ei ole nahalt täielikult maha loputatud või kui aine on tunginud epidermisesse. Kui uuritav aine reageerib otse MTTga, on ise värviline või muutub värviliseks koega kokkupuutumisel, tuleb kasutada täiendavaid kontrollkatseid, et teha kindlaks, kuivõrd segab uuritav aine eluvõimelisuse määramist, ning viia sisse asjakohane parandus. Üksikasjalik kirjeldus, kuidas kontrollida MTT otsest taandamist, on esitatud valideeritud standardmeetodite eeskirjades (21, 22, 23). Nendest segavatest mõjudest tingitud mittespetsiifiline värvus ei tohiks ületada 30 % negatiivse kontrolli värvusest (paranduste tegemiseks). Kui mittespetsiifilist värvust on üle 30 %, tehakse järeldus, et uuritavat ainet ei saa käesoleva meetodiga mõõta. 1.6.1.5. Katse kehtivuse kriteeriumid Igas katses, milles kasutatakse kõlblikku partiid (vt punkt 1.6.1.2.5), peaks negatiivse kontrolli võrdlusainega töödeldud kudede korral leitama optilise tiheduse väärtused, mis näitavad, et koed on pärast transpordi ja vastuvõtmise etappe ja ärritava toime määramist säilitanud oma kvaliteedi. Kontrollkatsete optilise tiheduse väärtused ei peaks olema allpool varem määratud alampiire. Ka positiivse kontrolli võrdlusainega, s.t 5 % SDSi lahusega töödeldud kudedel peaks olema säilinud tundlikkus ja võime reageerida ärritavale ainele iga individuaalse määramise tingimustes (näiteks peaks eluvõimelisus olema valideeritud standardmeetodi 1 puhul ≤ 40 % ja valideeritud standardmeetodi 2 puhul ≤ 20 %). Peavad olema määratletud koeproovide varieeruvusega seotud sobivad näitajad (kui kasutatakse näiteks standardhälbeid, peaksid need olema < 18 %). 2. ANDMED 2.1. ANDMED Iga töötlemise kohta tuleks tabelina esitada üksikute paralleelproovide tulemused (näiteks optilise tiheduse väärtused ja rakkude eluvõimelisuse arvutatud protsendimäära andmed iga uuritud aine kohta, kaasa arvatud klassifikatsioon); samuti tuleb vajaduse korral esitada kordusmääramiste andmed. Lisaks keskväärtusele esitatakse iga katse jaoks ka ± standardhälbe väärtused. Iga uuritava aine puhul registreeritakse tähelepanekud selle mõjude kohta MTT-reagendile, samuti märgitakse ära värvilised uuritavad ained. 2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Iga uuritava proovi kohta saadud optilise tiheduse väärtusi saab kasutada selleks, et arvutada rakkude eluvõimelisuse protsent võrreldes negatiivse kontrollprooviga, mille eluvõimelisuseks määratakse 100 %. Rakkude eluvõimelisuse protsendimäära piirväärtus, mis eraldab ärritavaid aineid klassifitseerimata uuritavatest ainetest, ning statistiline meetod (statistilised meetodid), mida kasutati tulemuste hindamiseks ja ärritavate ainete kindlakstegemiseks, peavad olema selgelt määratletud ja dokumenteeritud ning nende sobivus peab olema tõendatud. Valideeritud standardmeetoditega seotud piirväärtused, mida kasutatakse ärritava toime kindlakstegemiseks, on järgmised. Uuritav aine loetakse ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooriale vastavaks nahka ärritavaks aineks: i) kui koe eluvõimelisus pärast kokkupuudet ainega ja kokkupuutele järgnenud inkubeerimist on väiksem kui 50 % või sellega võrdne (≤). Uuritav aine loetakse aineks, millele ei ole omistatud kategooriat: ii) kui koe eluvõimelisus pärast kokkupuudet ainega ja kokkupuutele järgnenud inkubeerimist on suurem kui 50 % (>). 3. ARUANNETE ESITAMINE 3.1. KATSEARUANNE Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet: Uuritavad ained ja kontrollained: — keemiline nimetus või nimetused, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, kui see on teada; — aine puhtus või koostis (massiprotsendina); — määramise läbiviimise seisukohast olulised füüsikalis-keemilised omadused (näiteks füüsiline olek, stabiilsus ja lenduvus, pH, lahustuvus vees, kui see on teada); — uuritava aine / kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjakohane (nt soojendamine, peenestamine); — hoiutingimused. Kasutatud nahamudeli ja katse tegemise käigu põhjendus. Katsetingimused: — kasutatud rakusüsteem; — rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks kasutatud mõõteriista (nt spektrofotomeetri) kaliibrimist käsitlev teave ja spektririba laius; — kogu täiendav teave kasutatud konkreetse nahamudeli ja selle tulemuslikkuse kohta. See hõlmab vähemalt järgmist: i) eluvõimelisus; ii) toimimine kaitsekihina; iii) morfoloogia; iv) reprodutseeritavus ja ennustamisväärtus; v) mudeli kvaliteedi kontroll; — katsemetoodika üksikasjad; — määramisel kasutatud annused, kokkupuute kestus ja kokkupuutele järgnenud inkubatsiooniaeg; — kõikide katsemetoodikas tehtud muudatuste kirjeldus; — viide varasematele andmetele mudeli kohta. See hõlmab vähemalt järgmist: i) kvaliteedikontrolli andmete kehtivus, arvestades varasemaid partii andmeid; ii) positiivse ja negatiivse kontrolli väärtuste kehtivus, arvestades positiivse ja negatiivse kontrolli keskväärtusi ja vahemikke; — kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus, sealhulgas ennustamismudelis kasutamiseks valitud piirväärtus(t)e valiku põhjendus. Tulemused: — andmetabelid individuaalsete uuritud proovide kohta; — muude täheldatud toimete kirjeldus. Tulemuste arutelu. Järeldused. 4. KIRJANDUSVIITED 1) United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Vaata: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2) REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Vaata: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3) Katsemeetod B.4. ÄGE MÜRGISUS; NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS. 4) Katsemeetod B.40. NAHASÖÖVITUS IN VITRO: TRANSKUTAANSE ELEKTRITAKISTUSE (TER) MÕÕTMINE. 5) Katsemeetod B.40 BIS. NAHASÖÖVITUS IN VITRO: KATSE INIMNAHA MUDELIGA. 6) OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Vastu võetud 19.7.2006. Vaata: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7) ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Allalaaditav dokument, vaata: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57–93. 9) Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765–770. 10) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107–114. 11) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351–367. 12) Cotovio, J., Grandidier, M.–H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329–249. 13) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, 109–129. 14) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. 15) Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Allalaaditav dokument, vaata: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619. 17) J. Cotovio, M.–H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351–358. 18) ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays. 5 November 2008. 19) EÜ (2006). Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 18. detsember 2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ja millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet ning muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93, komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. Euroopa Liidu Teataja L 396/1, 30.12.2006. OPOCE, Luxembourg. 20) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. 21) EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test – 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Allalaaditav dokument, vaata: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22) EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Allalaaditav dokument, vaata: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23) SkinEthic RHE™ SOP. Avaldatakse allalaaditava dokumendina, vaata: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24) Harvell, J.D., Lammintausta, K. Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, pp 7–18. 25) Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, November 13, 2008. Liide Nahaärrituse mudelkatseks kavandatud in vitro katse rekonstrueeritud inimepidermise mudeliga: tulemuslikkuse näitajate hindamine SISSEJUHATUS Käesoleva katsemeetodi alusel kasutamiseks kavandatud menetlusi tuleks hinnata, et määrata kindlaks nende usaldusväärsus ja täpsus kõikide ainete puhul, mis esindavad kogu Draize ärritavusskaalat. Kavandatud katsemenetlusel peaksid kõigi 20 soovitatud etalonainega (tabel 2) hindamisel olema usaldusväärsuse ja täpsuse näitajad, mis oleksid võrreldavad valideeritud standardmeetodi 1 näitajatega (tabel 3) (1). Punktides II ja III on esitatud usaldusväärsuse ja täpsuse normid, mis tuleks saavutada. Tabelis on klassifitseerimata ja klassifitseeritud (ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooria) ained, mis esindavad asjaomaste keemiliste ühendite klasse, et kavandatud katsemeetodi usaldusväärsust ja tulemuslikkuse näitajaid (tundlikkus, spetsiifilisus, valenegatiivsete vastuste määr, valepositiivsete vastuste määr ja täpsus) saaks võrrelda valideeritud katsemeetodi 1 asjaomaste väärtustega. Katsemeetodi usaldusväärsust ja võimet õigesti kindlaks määrata ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooria ärritavaid aineid tuleks kontrollida enne seda, kui meetodit kasutatakse uute ainete katsetamiseks. TULEMUSLIKKUSE NÕUDED Tulemuslikkuse nõuded hõlmavad kolme järgmist elementi: I) katsemeetodi olulised koostisosad, II) etalonained ja III) kindlaksmääratud täpsuse ja usaldusväärsuse väärtused (2). Kõnealused tulemuslikkuse nõuded põhinevad, pärast ECVAMi nahaärritavuse valideerimise uuringut kindlaksmääratud tulemuslikkuse nõuetel (3). I. Katsemeetodi olulised koostisosad Mudeli üldtingimused Epiteelkoe ehitamiseks tuleb kasutada tavalisi inimese keratinotsüüte. Talitleva sarvkihi all peab olema mitu kihti (basaalkiht, ogakiht ja sõmerkiht) eluvõimelisi epiteelrakke. Sarvkiht peaks olema mitmekihiline ja vajaliku lipiidse koostisega, et tekiks sellise tugevusega funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste markerainete, nagu SDSi või Triton X-100 kiiret läbitungimist. Nimetatud kaitsekihina toimimist saab hinnata kas sellise kontsentratsiooni määramisega, mille juures markeraine vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra (IC50) pärast kindlaksmääratud kokkupuuteaega, või sellise kokkupuuteaja määramisega, mille juures markeraine vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra (ET50) teatava kindla kontsentratsiooni juures. Mudel peab olema selline, et aine ei saaks tungida eluskudedesse sarvkihist mööda minnes, vastasel korral ei oleks tegemist naha ja keemilise aine kokkupuute õige mudeliga. Nahamudel ei tohi olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega. Mudeli funktsionaalsed tingimused Eluvõimelisus Eluvõimelisuse määramiseks kasutatakse eelistatult värvainet MTT (4). Negatiivse kontrolliga töödeldud koest ekstraheeritud (lahustatud) värvaine optiline tihedus peab olema vähemalt 20 korda suurem kui ekstraheerimislahusti optiline tihedus. Peaks olema tõendatud, et negatiivse kontrolliga töödeldud kude on kultuuris stabiilne (võimaldab saada sarnaseid elujõulisuse mõõtmistulemusi) katses kasutatava kokkupuuteaja jooksul. Toimimine kaitsekihina Sarvkiht ja selle lipiidne koostis peavad olema piisavad, et takistada tsütotoksiliste markerainete, nagu SDSi või Triton X-100 kiiret läbitungimist; seda hinnatakse IC50 või ET50 abil. Morfoloogia Vajaliku ettevalmistusega töötajad peavad tegema rekonstrueeritud naha/epidermise histoloogilise uuringu, mis peaks näitama, et on saadud inimnaha/epidermisega sarnane struktuur (kaasa arvatud mitmekihiline sarvkiht). Reprodutseeritavus Konkreetse mudeli kasutamise korral peaks meetod andma ajas reprodutseeritavaid tulemusi, kusjuures partii kontrollimiseks kasutatakse eelistatavalt mingit sobivat (võrdlus)ainet (vt mõisted punktis 1.2). Mudeli kvaliteedi kontroll Epidermisemudeli iga partii peaks vastama teatavatele kindlatele toote kvaliteedi kontrolli kriteeriumidele; kõige tähtsamad nendest on eluvõimelisus ja toimimine kaitsekihina. Nahamudeli tootja (või katse läbiviija, kui ta kasutab omatehtud mudelit) peaks kindlaks määrama IC50 või ET50 lubatava vahemiku (ülem- ja alampiiri). Kudede kaitsekihiomadusi tuleks laboris pärast kudede saamist kontrollida. Nahaärrituse põhjustamise usaldusväärseks ennustamiseks saab kasutada ainult sobivate omadustega kudede abil saadud tulemusi. Järgmises tabelis on näitena esitatud valideeritud standardmeetodite puhul lubatavad vahemikud. Tabel 1 Partii kvaliteedi kontrollimise kriteeriumide näited Lubatav alampiir Lubatava vahemiku keskväärtus Lubatav ülempiir Valideeritud standardmeetod 1 (18-tunnine töötlus SDSga) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Valideeritud standardmeetod 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h II. Etalonained Etalonaineid kasutatakse selleks, et teha kindlaks, kas rekonstrueeritud inimepidermisel põhinev uus kavandatud in vitro katsemeetod, mis on nii oma ülesehituse kui põhimõtte poolest üsna sarnane valideeritud standardmeetodiga või kujutab endast üksnes viimase väikest modifikatsiooni, annab sama usaldusväärseid ja täpseid tulemusi ja on samade tulemuslikkuse näitajatega kui valideeritud standardmeetod 1 (1). Tabelis 2 loetletud 20 etalonainet esindavad erinevaid huvipakkuvaid aineklasse ja ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooria aineid. Loetelus olevatest ainetest kümme kuuluvad ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooria ainete hulka, kolm ainet on sama süsteemi 3. valikkategooria ained ja seitse on klassifitseerimata ained. Käesoleva katsemeetodi kohaselt käsitatakse 3. valikkategooriat kategooria puudumisena. Etalonained on vähimalt nõutav arv aineid, mida tuleks kasutada selleks, et hinnata, kuivõrd usaldusväärseid ja täpseid tulemusi annab nahaärrituse määramiseks kavandatud uus in vitro katsemeetod, milles kasutatakse rekonstrueeritud inimepidermist. Kui mõnda loetletud ainet ei ole saada, võib kasutada muid aineid, mille kohta in vivo katsega on määratud piisavad võrdlusandmed. Soovi korral võib etalonainetele miinimumloendisse lisada kavandatud katsemeetodi täpsuse hindamiseks muid aineid, mis esindavad teisi aineklasse ja mille kohta on in vivo katsega määratud piisavad võrdlusandmed. Tabel 2 Etalonained rekonstrueeritud inimepidermise mudelitega saadud tulemuste täpsuse ja usaldusväärsuse näitajate määramiseks Aine (1) CASi nr EINECSi nr Füüsikaline olek Tulemus in vivo GHS in vitro kat. GHS in vivo kat. 1-bromo-4-klorobutaan 6940–78–9 230–089–3 vedelik 0 2. kat. kat-ta dietüülftalaat 84–66–2 201–550–6 vedelik 0 kat-ta kat-ta naftüüläädikhape 86–87–3 201–705–8 tahke 0 kat-ta kat-ta allüülfenoksüatsetaat 7493–74–5 231–335–2 vedelik 0,3 kat-ta kat-ta isopropanool 67–63–0 200–661–7 vedelik 0,3 kat-ta kat-ta 4-metüültiobensaldehüüd 3446–89–7 222–365–7 vedelik 1 2. kat. kat-ta metüülstearaat 112–61–8 203–990–4 tahke 1 kat-ta kat-ta heptüülbutüraat 5870–93–9 227–526–5 vedelik 1,7 kat-ta 3. valikkat. heksüülsalitsülaat 6259–76–3 228–408–6 vedelik 2 kat-ta 3. valikkat. tri-isobutüülfosfaat 126–71–6 204–798–3 vedelik 2 2. kat. 3. valikkat. 1-dekanool 112–30–1 203–956–9 vedelik 2,3 2. kat. 2. kat. 3-p-kumenüül-2-metüülpropioonaldehüüd 103–95–7 203–161–7 vedelik 2,3 2. kat. 2. kat. 1-bromoheksaan 111–25–1 203–850–2 vedelik 2,7 2. kat. 2. kat. 2-klorometüül-3,5-dimetüül-4-metoksüpüridiinvesinikkloriid 86604–75–3 434–680–9 tahke 2,7 2. kat. 2. kat. a-terpineool 98–55–5 202–680–6 vedelik 2,7 2. kat. 2. kat. di-n-propüüldisulfiid 629–19–6 211–079–8 vedelik 3 kat-ta 2. kat. butüülmetakrülaat 97–88–1 202–615–1 vedelik 3 2. kat. 2. kat. 5–(1,1-dimetüületüül)-2-metüülbenseentiool 7340–90–1 438–520–9 vedelik 3,3 2. kat. 2. kat. 1-metüül-3-fenüül-1-piperasiin 5271–27–2 431–180–2 tahke 3,3 2. kat. 2. kat. heptanaal 111–71–7 203–898–4 vedelik 4 2. kat. 2. kat. Tabelis 2 loetletud ainete jaotus ECVAMi nahaärritavuse valideerimise rahvusvahelises uuringus (1) kasutatud 58 aine hulgas on esindav. Nende valimine põhineb järgmistel kriteeriumidel: — ained on müügil; — ained esindavad kogu Draize ärritavusskaalat (mitteärritavatest ainetest kuni tugevat ärritust põhjustavate aineteni); — nende kõigi keemiline ehitus on hästi teada; — nad esindavad valideeritud meetodi reprodutseeritavust ja ennustusvõimet, mis määrati kindlaks ECVAMi valideerimisuuringuga; — nad esindavad samu keemiliste ainete klasse, mida kasutati valideerimisel; — nad ei ole äärmiselt mürgised (näiteks kantserogeensed või viljakust kahjustavad) ja nende kõrvaldamine ei ole seotud ülemääraste kuludega. III. Täpsuse ja usaldusväärsuse kindlaksmääratud väärtused Kavandatud katsemeetodi tulemuslikkuse näitajad (tundlikkus, spetsiifilisus, valenegatiivsete vastuste määr, valepositiivsete vastuste määr ja täpsus) peaksid olema võrreldavad valideeritud standardmeetodi 1 asjaomaste väärtustega (tabel 3), st tundlikkus peaks olema vähemalt (≥) 80 %, spetsiifilisus peaks olema vähemalt (≥) 70 % ja täpsus peaks olema vähemalt (≥) 75 %. Tulemuslikkuse näitajate arvutamisel tuleks kasutada kõiki klassifitseerimistulemusi, mis saadakse nimetatud 20 ainega kõikides osalevates laborites. Iga aine klassifitseerimine igas laboris peaks põhinema eri katsetes (vähemalt kolm kehtivat paralleelkatset) määratud eluvõimelisuse keskväärtusel. Tabel 3 Valideeritud standardmeetodi 1 (2) tulemusnäitajad Katsemeetod Ainete arv Tundlikkus Spetsiifilisus Valenegatiivsete vastuste määr Valepositiivsete vastuste määr Täpsus Valideeritud standardmeetod 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Valideeritud standardmeetod 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Kavandatud katsemeetodi usaldusväärsus peaks olema võrreldav valideeritud katsemeetodite usaldusväärsusega. Laborisisene reprodutseeritavus Laborisisese varieeruvuse hinnang peaks näitama, et klassifitseerimistulemused (2. kategooria või ilma kategooriata), mis on saadud eraldi sõltumatutel määramistel 20 etalonainega ühes laboris, on omavahel kooskõlas vähemalt (≥) 90 % juhtudest. Laboritevaheline reprodutseeritavus Laboritevahelise reprodutseeritavuse hindamine ei ole oluline, kui kavandatud katsemeetodit kavatsetakse kasutada ainult ühes laboris. Kui meetodit tahetakse anda edasi teistesse laboritesse, peaks laboritevahelise varieeruvuse hinnang näitama, et klassifitseerimistulemused (2. kategooria või ilma kategooriata), mis on saadud eraldi sõltumatutel määramistel 20 etalonainega eelistatavalt vähemalt kolmes laboris, on omavahel kooskõlas vähemalt (≥) 80 % juhtudest. KIRJANDUSVIITED 1) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. 2) OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris. 3) ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Allalaaditav dokument, vt http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Kasutatud: 27.10.2008. 4) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. 5) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619. (1) Esitatud 20 etalonaine puhul on tegemist esindava valikuga nende 58 aine hulgast, mida kasutati standardmeetodi 1 (EpiSkin™) algseks valideerimiseks. Uuritavate ainete täielik loetelu ja nende valimise kriteeriumid on esitatud kirjandusviites 5. (2) Tabelis 3 on esitatud valideeritud standardmeetodi 1 tulemusnäitajad, mis kirjeldavad meetodi võimet korrektselt kindlaks määrata ärritavaid aineid (ÜRO GHS-süsteemi 2. kategooria) ja klassifitseerimata aineid (millele ei ole omistatud kategooriat; klassifitseerimata ainete hulka arvestatakse ka 3. valikkategooria ained) vastavalt 58 ja 20 etalonaine puhul (tabel 2). (3) EpiSkin™ (4) Põhinevad 13 GHS-süsteemi 2. kategooria ärritaval ainel. (5) Põhinevad 45 ainel, mis kuuluvad kas GHS-süsteemi 3. kategooria ärritavate ainete või GHS-süsteemi kategooriata ainete hulka.

IV LISA C.3. MAGEVEEVETIKATE JA TSÜANOBAKTERITE KASVU PIDURDAMISE KATSE 1. METOODIKA Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 201 (2006) (1). 1.1. SISSEJUHATUS Metoodikaid on vaja teaduse arengut arvestades korrapäraselt läbi vaadata ja ajakohastada. Metoodika C.3 vajas läbivaatamist, et lisada täiendavaid liike ja viia see vastavusse ohu hindamise nõuetega ning kemikaalide klassifikatsiooniga. Läbivaatamisel võeti aluseks laialdased praktilised kogemused, teaduse edusammud vetikatele toksiliste ainete uurimisel ja asjaomaste õigusaktide laialdane rakendamine pärast esialgse metoodika kasutuselevõttu. 1.2. MÕISTED Käesoleva metoodikaga seoses kasutatakse järgmisi mõisteid ja lühendeid. Biomass on populatsiooni elusaine kuivmass teatava mahuühiku kohta, nt vetikate kuivmass milligrammides ühe liitri katselahuse kohta. Tavaliselt tähendab „biomass” lihtsalt massi, kuid käesoleva metoodika tähenduses on see mass mahuühiku kohta. Käesoleva meetodi kasutamisel mõõdetakse harilikult biomassi asendavaid näitajaid, nagu rakkude arv, fluorestsents jne; sellisel juhul mõistetakse termini „biomass” all ka kõnesolevaid asendusnäitajaid. Variatsioonikordaja on suhteline (mõõtühikuta) näitaja, mis iseloomustab parameetri varieeruvust ja võrdub standardhälbe ja keskväärtuse suhtega. Seda võib väljendada ka protsentides. Paralleelsete kontrollkultuuride kasvu keskmise erikiiruse keskmine variatsioonikordaja arvutatakse järgmiselt: 1. ööpäevade ja/või lõikude kaupa leitud kasvukiiruste põhjal arvutatakse asjaomase paralleelkultuuri kasvu keskmise erikiiruse variatsioonikordaja protsentides; 2. paralleelsete kontrollkultuuride ööpäevade/lõikude kaupa mõõdetud kasvu keskmise erikiiruse keskmise variatsioonikordaja leidmiseks arvutatakse 1. punkti kohaselt leitud väärtuste keskmine. ECx on katsekeskkonnas lahustatud uuritava aine kontsentratsioon, mille puhul katseorganismi kasv pidurdub x % (nt 50 %) võrra, kui see organism puutub ainega kokku kindlaksmääratud ajavahemiku jooksul (kui kokkupuuteaeg erineb täielikust ehk tavaliselt katsetes kasutatavast kokkupuuteajast, tuleb selle pikkus täpselt märkida). Kasvukiiruse järgi ja saagise järgi leitavate EC väärtuste eristamiseks kasutatakse vastavalt tähiseid ErC ja EyC. Sööde on täielik sünteetiline keskkond, milles katsevetikaid kasvatatakse uuritava ainega kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahustatakse uuritav aine katsekeskkonnas. Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus) on biomassi logaritmiline suurenemine kokkupuute ajal. Madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon on madalaim uuritud kontsentratsioon, mille puhul on näidatud, et teatava kokkupuuteaja jooksul pidurdab uuritav aine kontrolliga võrreldes statistiliselt oluliselt (p < 0,05) katseorganismi kasvu. Kõik madalaimast avastatava mõjuga kontsentratsioonist kõrgemad kontsentratsioonid peavad avaldama sama tugevat või tugevamat kahjulikku mõju kui madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon. Kui neid kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleb anda täielik selgitus, kuidas valiti madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon (ja avastatava mõjuta kontsentratsioon). Avastatava mõjuta kontsentratsioon on madalaimast avastatava mõjuga kontsentratsioonist allapoole järgmine uuritud kontsentratsioon. Kostemuutuja on toksilisuse hindamiseks kasutatav muutuja, mis tuletatakse biomassi kajastavast mõõtemuutujast mitmesuguste arvutuste abil. Käesoleva metoodika tähenduses on kostemuutujateks kasvukiirus ja saagis, mis tuletatakse biomassi otsese mõõtmise andmetest või eespool mainitud asendusnäitajate mõõtmisest. Kasvu erikiirus on kostemuutuja, mis määratletakse jagatisena, mille lugejaks on uuritava parameetri (käesoleva metoodika puhul biomassi) väärtuste naturaallogaritmide vahe ja nimetajaks asjaomane ajavahemik. Saagis on kokkupuuteaja lõpus ja alguses leitud mõõdetava muutuja väärtuste vahe, mis väljendab katse jooksul toimunud biomassi kasvu. 1.3. MEETODI RAKENDATAVUS Käesolevat meetodit on kõige lihtsam rakendada vees lahustuvate ainete puhul, mis katsetingimustes tõenäoliselt püsivad vesilahuses. Kui uuritav aine on lenduv, seostub tugevasti pindadega, on värviline või vees vähelahustuv või võib mõjutada söötme toit- või mineraalainete kättesaadavust, siis võib kirjeldatud määramismeetodis olla vaja teha teatavaid muudatusi (nt kasutada suletud süsteemi, valmistada katsenõusid eelnevalt spetsiaalselt ette). Juhendid teatavate vajalike muudatuste tegemiseks on esitatud standardites (2, 3, 4). 1.4. KATSE PÕHIMÕTE Katse eesmärk on määrata uuritava aine mõju magevee-mikrovetikate ja/või tsüanobakterite kasvule. Portskultuuris lastakse eksponentsiaalse kasvu faasis olevatel katseorganismidel uuritava ainega kokku puutuda tavaliselt 72 tunni jooksul. Vaatamata suhteliselt lühikesele katseajale võimaldab see hinnata, millist mõju avaldab uuritava ainega kokkupuutumine mitme põlvkonna vältel. Katsesüsteemi koste on vetikakultuuri seeriate (katseüksused) kasvu pidurdumine kokkupuutumisel uuritava aine mitmesuguste kontsentratsioonidega. Katsesüsteemi koste hindamiseks uuritakse kasvu sõltuvust aine kontsentratsioonist ja võrreldakse seda keskmise kasvuga paralleelsetes kontrollkultuurides, kuhu uuritavat ainet ei ole lisatud. Et süsteemi koste toksilisele mõjule täielikult avalduks (optimaalne tundlikkus), lastakse kultuuridel küllaldase aja jooksul piiramatult eksponentsiaalselt kasvada piisava toitainete sisalduse ja pideva valguse tingimustes, et mõõta kasvu erikiiruse vähenemist. Kasvu ja kasvu pidurdamise kvantitatiivseks iseloomustamiseks mõõdetakse vetikate biomassi sõltuvust ajast. Vetikate biomass on määratletud kuivmassina ruumala kohta, nt milligrammides ühe liitri katselahuse kohta. Kuna kuivmassi on raske mõõta, kasutatakse asendusparameetreid. Asendusparameetritest kasutatakse kõige rohkem rakkude arvu. Asendusparameetriteks võivad olla veel rakkude maht, fluorestsents, optiline tihedus jne. On vaja teada kordajat, mille abil saab mõõdetava asendusparameetri arvutada ümber biomassiks. Katsetulem on kasvu pidurdumine, kusjuures kasvu väljendatakse biomassi logaritmi suurenemisena kokkupuuteaja jooksul (keskmine kasvu erikiirus). Katselahuste seerias määratud keskmistest kasvu erikiirustest leitakse kontsentratsioon, mis vähendab kasvukiirust teatava protsendimäära x võrra (näiteks 50 %); selle kontsentratsiooni tähis on ErCx (nt ErC50). Kui käesolevat meetodit rakendatakse ELi õigusraamistikus, peaksid tulemuste arvutused punktis 2.2 kirjeldatud põhjusi arvestades põhinema kasvu keskmisel erikiirusel. Lisaks kasutatakse käesoleva meetodi korral kostemuutujana veel saagist, mida võib vaja olla teatavates riikides kehtestatud erieeskirjade täitmiseks. Saagis on määratletud kokkupuuteaja lõpus ja alguses olevate biomasside vahena. Katselahuste seerias määratud saagiste põhjal leitakse kontsentratsioon, mis vähendab saagist teatava protsendimäära x võrra (näiteks 50 %); selle tähis on EyCx (nt EyC50). Lisaks sellele võib statistiliselt määrata madalaima avastatava mõjuga kontsentratsiooni ja ka avastatava mõjuta kontsentratsiooni. 1.5. ANDMED UURITAVA AINE KOHTA Katsetingimuste kindlaksmääramiseks võib uuritava aine kohta olla vaja teada järgmisi andmeid: struktuurivalem, puhtusaste, püsivus valguse käes, püsivus katsetingimustes, valguse neeldumisega seotud omadused, pKa ja andmed aine muundumiste kohta, sealhulgas biolagunduvus vees. On vaja teada uuritava aine lahustuvust vees, jaotuskoefitsienti oktanooli-vee süsteemis (Pow) ja aururõhku; katselahuses oleva aine kontsentratsiooni mõõtmiseks peaks olema valideeritud meetod, mille kohta oleksid teada tulemuslikkus ja määramispiir. 1.6. STANDARDAINE Katse teostuse kontrollimiseks võib kasutada rahvusvahelistes võrdluskatsetes (4) kasutatavaid standardaineid, näiteks 3,5-diklorofenooli. Rohevetikate puhul võib standardainena kasutada ka kaaliumdikromaati. Kontrolli standardainega soovitatakse teha vähemalt kaks korda aastas. 1.7. KATSE VASTAVUS NÕUETELE Katse on läbi viidud nõuetekohaselt, kui on täidetud järgmised kriteeriumid. — Kontrollkultuuri biomass peab 72-tunnise katseaja jooksul olema eksponentsiaalselt suurenenud vähemalt 16 korda. See vastab kasvu erikiirusele 0,92 ööpäev–1. Kõige sagedamini kasutatavate liikide puhul on kasvukiirus tavaliselt palju suurem (vt 1. liide). See kriteerium ei pea olema täidetud, kui kasutatakse 1. liites loetletud liikidest aeglasemalt kasvavaid liike. Sellisel juhul tuleb katseaega pikendada, nii et kontrollkultuuri biomass kasvaks vähemalt 16-kordseks, kusjuures kasv peab kogu katse ajal olema eksponentsiaalne. Kui piiramatu eksponentsiaalse kasvu tingimustes saavutatakse biomassi nõutav 16-kordne kasv lühema ajaga, võib katseaega lühendada 48 tunnini. — Lõikude kaupa (72-tunnise katse puhul katsepäevad 0–1, 1–2 ja 2–3) leitud kontrollkultuuride kasvu erikiiruste keskmine variatsioonikordaja (vt punkt 1.2, variatsioonikordaja) ei tohi ületada 35 %. Kontrollkultuuride kasvu erikiiruste lõikude kaupa arvutamise kohta vt punkt 2.2.1, teine lõik. Seda kriteeriumi rakendatakse paralleelsete kontrollkultuuride puhul arvutatud variatsioonikordaja keskmise väärtuse suhtes. — Katsetes Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus’ega ei tohi paralleelsete kontrollkultuuride keskmiste kasvu erikiiruste variatsioonikordaja kogu katseaja jooksul ületada 7 %. Harvemini kasutatavate liikide korral ei tohi see väärtus ületada 10 %. 1.8. MEETODI KIRJELDUS 1.8.1. Seadmed Katselahusega kokku puutuvad katsenõud ja muud seadmed peavad olema tervenisti klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Seadmed peavad olema hoolikalt pestud, et orgaanilised või anorgaanilised lisandid ei mõjutaks vetikate kasvu või katselahuse koostist. Katse viiakse tavaliselt läbi klaaskolvis, mis on piisavalt suur, et katse ajal saaks mõõtmisteks võtta küllaldases mahus kultuuri, ja oleks tagatud piisav CO2 massiülekanne atmosfäärist (vt punkt 1.8.9, teine lõik). Tuleb silmas pidada, et vedeliku maht oleks küllaldane analüüside tegemiseks (vt punkt 1.8.11, viies lõik). Lisaks sellele võib vaja minna järgmisi seadmeid. — Kultiveerimisseade: soovitatav on kasutada kappi või kambrit, milles inkubatsioonitemperatuuri hoitakse täpsusega ±2 °C. — Fotomeetrid: on oluline silmas pidada, et valgustatuse mõõtmise meetod ja eriti vastuvõtja (kollektori) tüüp mõjutavad mõõdetavat väärtust. Mõõtmiseks kasutatakse eelistatavalt sfäärilist (4π) vastuvõtjat (reageerib igast suunast, nii ülalt- kui ka altpoolt mõõtetasapinda saabuvale otsesele ja peegeldunud valgusele) või poolsfäärilist (2π) vastuvõtjat (reageerib igast suunast ülaltpoolt mõõtetasapinda saabuvale valgusele). — Seade vetikate biomassi määramiseks. Rakkude arvu, mis on kõige sagedamini kasutatav vetikate biomassi asendusparameeter, võib määrata elektroonilise osakesteloenduri, loenduskambriga varustatud mikroskoobi või läbivoolutsütomeetri abil. Muid biomassi asendusparameetreid võib mõõta läbivoolutsütomeetri, fluorimeetri, spektrofotomeetri või kolorimeetri abil. On kasulik arvutada ümberarvutustegur üleminekuks rakkude arvult kuivmassile. Kui madalatel biomassi kontsentratsioonidel kasutatakse spektrofotomeetrit, võib kasutuskõlblike mõõtmistulemuste saamiseks olla vaja küvette, mille optilise tee pikkus on vähemalt 4 cm. 1.8.2. Katseorganismid Võib kasutada mitmeid vabalt ujuvate mikrovetikate ja tsüanobakterite liike. On näidatud, et käesolevas metoodikas esitatud määramismeetodi korral sobivad kasutamiseks 1. liites loetletud tüved. Kui kasutatakse muid liike, tuleb märkida kasutatud tüvi ja/või selle päritolu. Tuleb tõendada, et valitud katsevetikate kasv on kasutatavates tingimustes kogu katseaja kestel eksponentsiaalne. 1.8.3. Sööde Soovitatakse kasutada kas OECD või AAP söödet. Nende söötmete koostis on esitatud 2. liites. Tuleb silmas pidada, et nende söötmete pH algväärtused ja puhvermahtuvused (viimane kompenseerib pH