Komisjoni direktiiv 2004/73/EÜ,

29. aprill 2004,

millega kohandatakse kahekümne üheksandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigusnormide ühtlustamise kohta

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigusnormide ühtlustamise kohta, [1] eriti selle artiklit 28,

ning arvestades järgmist:

(1) Direktiivi 67/548/EMÜ I lisa sisaldab ohtlike ainete nimekirja koos iga aine liigitamise ja märgistamise üksikasjadega. Seda nimekirja on vaja ajakohastada, et see sisaldaks teatatud uusi aineid ja muid olemasolevaid aineid, ning kohandada olemasolevaid kirjeid tehnika arenguga, näiteks kehtestades teatavatele ainetele kontsentratsioonipiirid keskkonnas. Sellest tulenevalt on samuti vaja kustutada teatavaid aineid käsitlevad kirjed ja jagada osadeks mõned kirjed, kuna klassifikatsiooni ei kohaldata enam kõikide nendes kirjetes olevate ainete suhtes. Tuleks muuta 1,3-butadieeni sisaldavate ainete märgistamist, võtmaks arvesse seda, et nimetatud aine klassifitseeritakse käesoleva direktiivi kohaselt mutageenina.

(2) Direktiivi 67/548/EMÜ V lisas on sätestatud ainete ja valmististe füüsikalis-keemiliste omaduste, mürgisuse ning ökotoksilisuse määramise meetodid. Vastavalt nõukogu 24. novembri 1986. aasta direktiivile 86/609/EMÜ (katseteks ja muudel teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitsega seotud liikmesriikide õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta) [2] on vaja muuta kõnealust lisa, et vähendada katsetes kasutatavate loomade arvu miinimumini. Peatükkides B.1, B.4, B.5, B.31 ja B.35 toodud subkroonilise suukaudse mürgisuse meetodid tuleks uuesti üle vaadata. Lisaks sellele tuleks lisada V lisasse peatükk B.42, et teha kättesaadavaks subkroonilist suukaudset mürgisust käsitlev täiustatud meetod. Lõpuks lisatakse füüsikalis-keemilisi omadusi käsitlev peatükk A.21, subkroonilist suukaudset mürgisust käsitlev peatükk B.43 ning keskkonnamürgisust käsitlevad peatükid C.21–C.24, et võimaldada kindlaks määrata omadused, mida ei ole juba piisavalt käsitletud V lisa meetodites.

(3) Käesolevas direktiivis sätestatud meetmed on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe tehniliste kaubandustõkete kõrvaldamist käsitlevaid direktiive tehnika arenguga kohandava komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 67/548/EMÜ muudetakse järgmiselt:

1. I lisa muudetakse järgmiselt:

a) eessõna märkus K asendatakse lisa 1A tekstiga;

b) käesoleva direktiivi lisa 1B kirjetele vastavad kirjed asendatakse nimetatud lisa tekstiga;

c) käesoleva direktiivi lisa 1C kirjed lisatakse vastavalt direktiivi 67/548/EMÜ I lisa kirjete järjestusele;

d) jäetakse välja kirjed, mille indeksi numbrid on 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 ja 613-130-00-3;

e) asendatakse kirje, mille indeksi number on 048-002-00-0, käesoleva direktiivi lisa 1D kirjetega, mille indeksi numbrid 048-002-00-0 ja 048-011-00-X;

f) asendatakse kirje, mille indeksi number on 609-006-00-3, käesoleva direktiivi lisa 1D kirjetega, mille indeksi numbrid 609-006-00-3 ja 609-065-00-5;

g) asendatakse kirje, mille indeksi number on 612-039-00-6, lisa 1D kirjetega, mille indeksi numbrid 612-039-00-6 ja 612-207-00-9.

2. V lisa muudetakse järgmiselt:

a) lisatakse käesoleva direktiivi lisa 2A tekst peatükina A.21;

b) peatükk B.1 bis asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2B tekstiga;

c) peatükk B.1 tris asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2C tekstiga;

d) peatükk B.4 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2D tekstiga;

e) peatükk B.5 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2E tekstiga;

f) peatükk B.31 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2F tekstiga;

g) peatükk B.35 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2G tekstiga;

h) lisatakse käesoleva direktiivi lisa 2H tekst peatükkidena B.42 ja B.43;

i) lisatakse käesoleva direktiivi lisa 2I tekst peatükkidena C.21 ja C.24.

Artikkel 2

1. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 31. oktoobriks 2005. Nad edastavad kõnealuste sätete teksti ning kõnealuste sätete ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli viivitamata komisjonile. Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2. Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas vastuvõetavate siseriiklike põhiliste õigusnormide teksti.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 29. aprill 2004

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Margot Wallström

[1] EÜT 196, 16.8.1967, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 807/2003 (ELT L 122, 16.5.2003, lk 36).

[2] EÜT L 358, 18.12.1986, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2003/65/EÜ (ELT L 230, 16.9.2003, lk 32).

--------------------------------------------------

LISA 1A

"Märkus K:

Ainet ei pea liigitama kantserogeenseks ega mutageenseks, kui saab tõendada, et aine sisaldab alla 0,1 massiprotsendi 1,3-butadieeni (EINECSi nr 203-450-8). Kui ainet ei liigitata kantserogeenseks ega mutageenseks, kohaldatakse selle suhtes vähemalt S-lauseid (2-)9-16. Käesolev märkus kehtib ainult teatavate I lisas esitatud komplekssete naftast saadud ainete puhul."

--------------------------------------------------

LISA 2A

A.21. OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)

1. MEETOD

1.1 SISSEJUHATUS

Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et mõõta vedeliku võimet suurendada põleva materjali põlemiskiirust või põlemisintensiivsust või moodustada segu tuleohtliku ainega, mis süttib iseeneslikult juhul, kui need kaks ainet segatakse omavahel põhjalikult. See põhineb oksüdeerivate vedelike (1) ÜRO katsel ja on sellega samaväärne. Kuna käesolev meetod A.21 on algselt ette nähtud vastama direktiivi 67/548 nõuetele, on vaja läbi viia võrdlus üksnes ühe võrdlusainega. Katsete tegemine ja võrdlemine täiendava võrdlusainega võib olla vajalik juhul, kui eeldatakse, et katse tulemusi kasutatakse muudel eesmärkidel. [1]

Käesolevat katset ei ole vaja läbi viia juhul, kui struktuurivalemi uurimine teeb kahtlusteta kindlaks, et aine ei reageeri tuleohtliku materjaliga eksotermiliselt.

On kasulik teada enne katsetamist, kas aine võib plahvatada.

Käesolev katse ei ole kasutatav tahkete ainete, gaaside, plahvatusohtlike või kergestisüttivate ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.

Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui oksüdeerivaid vedelikke (1) käsitlevas ÜRO katses on tulemused uuritava katseaine kohta juba olemas.

1.2 MÕISTED JA ÜHIKUD

Keskmine rõhutõusuaeg – katse käigus manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2070 kPa-le kulunud aegade keskmine.

1.3 VÕRDLUSAINE

Võrdlusainena kasutatakse 65 %-list (massiprotsent) lämmastikhappe vesilahust (analüütiliselt puhas). [2]

Kui katse läbiviija näeb ette, et katse tulemusi võib lõpuks kasutada muudel eesmärkidel, [3] võib soovi korral samuti osutuda vajalikuks katse läbiviimine täiendavate võrdlusainetega. [4]

1.4 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Uuritav vedelik segatakse kiudtselluloosiga massisuhtes 1:1 ja pannakse surveanumasse. Kui segamisel või anuma täitmisel ilmneb isesüttimine, ei ole vaja katsete tegemist jätkata.

Kui isesüttimist ei toimu, viiakse läbi kogu katse. Segu kuumutatakse surveanumas ja määratakse kindlaks keskmine aeg, mis kulub manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2070 kPa-le. Seda võrreldakse sellise keskmise ajaga, mis kulub võrdlusaine(te) ja tselluloosi 1:1-segu korral rõhu suurenemiseks.

1.5 KVALITEEDINÕUDED

Ühe ainega tehtud viiest katsest koosnevas seerias ei tohi ükski tulemus erineda aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 30 %. Tulemused, mis erinevad keskmisest rohkem kui 30 %, jäetakse kõrvale, täiustatakse segamis- ja täitmismenetlust ning korratakse katset.

1.6 MEETODI KIRJELDUS

1.6.1 Ettevalmistus

1.6.1.1 Põlev aine

Põleva ainena kasutatakse kuivatatud kiudtselluloosi, mille kiu pikkus on 50–250 μm ja keskmine läbimõõt on 25 μm. [5] Seda kuivatakse konstantse kaaluni kuni 25 mm paksuses kihis 105 °C juures neli tundi ja hoitakse eksikaatoris koos desikandiga kuni jahtumise ja kasutamiseni. Kuivatatud tselluloosi niiskusesisaldus peaks olema alla 0,5 % kuivmassist. [6] Vajadusel peaks selle tagamiseks kuivatamisaega pikendama. [7] Tselluloosi sama partiid kasutatakse kogu uuringu vältel.

1.6.1.2 Seadmed

1.6.1.2.1 Surveanum

Vaja läheb surveanumat. Anumaks on silindriline terasest anum, mille pikkus on 89 mm ja välisläbimõõt on 60 mm (vt joonis 1). Vastaskülgedel paikneb kaks tasapinnalist süvendit (millega on anuma sisemist vaba ruumi vähendatud 50 mm-ni) süüteküünla ja väljalaskeava korgi paigaldamise hõlbustamiseks. Anumas oleva 20 mm siseläbimõõduga kanali mõlemas otsas on 19 mm astmetaoline laiend, mis on keermestatud vastavalt Briti standardsele 1 "torukeermele (British Standard Pipe (BSP)) või samaväärsele meeterkeermele. Surveanuma kumerasse külgpinda on ühest otsast 35 mm kaugusele kruvitud külgharu, mis paikneb tasapinnaliste süvenditega 90o nurga all ning mis on ette nähtud ühendamiseks rõhuanduriga. Külgharu pesa moodustab 12 mm sügavune puuritud ava, mis on keermestatud vastavalt külgharu otsas oleva 1/2" BSP keermega (või samaväärse meeterkeermega). Vajaduse korral paigaldatakse inertne tihend, mis tagab hermeetilise ühenduskoha. Külgharu ulatub 55 mm surveanuma korpusest väljapoole ja selle on puuritud kanal siseläbimõõduga 6 mm. Külgharu otsas on astmetaoline keermestatud süvend, mis on ette nähtud ühendamiseks membraani tüüpi rõhuanduriga. Kasutada võib mis tahes rõhumõõturit tingimusel, et seda ei mõjuta kuumad gaasid või lagunemissaadused ning et see on võimeline reageerima rõhutõusudele 690-2070 kPA vähem kui 5 ms jooksul.

Surveanuma külgharust kaugemal asuv ots on suletud süüteküünlaga, milles on kaks elektroodi – üks on isoleeritud küünla korpusest ja teine on sellega ühendatud (maandatud). Surveanuma teine ots on suletud puruneva membraaniga (purunemissurve ligikaudu 2200 kPa), mida hoiab paigal 20 mm läbimõõduga puuritud avaga kork. Vajaduse korral kasutatakse ühenduskoha hermeetilisuse tagamiseks inertset tihendit. Tugiraam (joonis 2) hoiab komplekti kasutamise ajal õiges asendis. Tugiraam koosneb tavaliselt pehmest rauast alusplaadist, mille mõõtmed on 235 mm x 184 mm x 6 mm, ja 185 mm pikkusest õõnsusega ruudukujulisest sektsioonist (S.H.S.) mõõtmetega 70 mm x 70 mm x 4 mm.

Õõnsusega ruudukujulise sektsiooni ühe otsa kaks vastaskülge on maha lõigatud selliselt, et moodustub kahest tasapinnalise küljega jalast struktuur, mille otsas paikneb 86 mm pikkune terviklik karbikujuline osa. Nende tasapinnaliste külgedega jalgade otsad on lõigatud horisontaalsuuna suhtes 60o all ning on keevitatud alusplaadi külge. Põhisektsiooni ülaosa ühes küljes paikneb pilu laiusega 22 mm ja sügavusega 46 mm nii, et kui rõhuanuma komplekt lastakse allapoole süüteküünlaga ots ees, siis satub külgharu pilusse. Karbikujulise osa alumise sisepinna külge keevitatakse terasest 30 mm laiune ja 6 mm paksune detail, mis toimib eraldajana. Kaks vastasküljel olevat 7 mm pitskruvi hoiavad surveanumat kindlalt paigal. Kaks 12 mm laiust ja 6 mm paksusest terasriba, mis on keevitatud karbikujulise sektsiooni põhjale toetuvate külgmiste elementide külge, toetavad surveanumat altpoolt.

1.6.1.2.2 Süütesüsteem

Süütesüsteem koosneb 25 cm pikkusest Ni/Cr traadist, mille läbimõõt on 0,6 mm ja takistus on 3,85 oom/m. Traat on keritud spiraalina 5 mm läbimõõduga varda abil ja kinnitatud süüteküünla elektroodide külge. Spiraali kuju peaks vastama joonisel 3 toodule. Anuma põhja ja süütespiraali alakülje vaheline kaugus peaks olema 20 mm. Kui elektroode ei saa reguleerida, tuleks süütespiraali ja anuma põhja vahel olevad traadi otsad isoleerida keraamilise kestaga. Traati kuumutatakse püsivoolutoiteallikaga, mis suudab tagada vähemalt 10 A voolutugevuse.

1.6.2 Katse sooritus [8]

Seade, mis on komplekteeritud rõhuanduri ja kuumutussüsteemiga, kuid kuhu ei ole paigaldatud purunevat membraani, toetub altpoolt süüteküünlale. 2,5 g uuritavat vedelikku segatakse keeduklaasis 2,5 g kuivatatud tselluloosiga, kasutades klaasist segamispulka. [9] Ohutuse tagamiseks on tegija ja segu vahel segamise ajal kaitseekraan. Kui segu süttib segamise või anuma täitmise ajal, ei ole vaja katsetamist jätkata. Segu lisatakse tilkhaaval väikeste portsjonitena surveanumasse, tagades segu paiknemise ümber süütespiraali ja sellega hea kontakti. On oluline, et spiraal ei deformeeru anuma täitmise ajal, kuna see võib põhjustada väärasid tulemusi. [10] Purunev membraan asetatakse kohale ja lukustav kork keeratakse kõvasti kinni. Täidetud anum asetatakse tugiraamile nii, et purunev membraan jääb ülespoole. Tugiraam asetatakse sobivasse armeeritud tõmbekappi või põlemiskambrisse. Toiteallikas ühendatakse süüteküünla välimiste klemmidega ja lülitatakse sisse 10 A vool. Aeg segamise alustamisest kuni voolu sisselülitamiseni ei tohiks ületada 10 minutit.

Rõhuanduri signaal registreeritakse sobiva süsteemi abil, mis võimaldab nii signaali hindamist kui ka rõhu ajalise sõltuvuse pidevat registreerimist (nt graafilise isekirjutiga ühendatud siirdeprotsesside registraator). Segu kuumutatakse kuni puruneva membraani rebestumiseni või vähemalt 60 s. Kui purunev membraan ei rebestu, tuleks lasta segul jahtuda enne seadme hoolikat lahtimonteerimist, vältides seejuures võimalikku hermeetilisuse kadumist. Uuritava aine ja võrdlusaine(te)ga viiakse läbi viis katset. Fikseeritakse aeg, mis kulub manomeeterrõhu tõusuks 690 kPa-lt 2070 kPa-le. Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg.

Mõnedel juhtudel võivad ained tekitada rõhutõusu (liiga suurt või liiga väikest), mille põhjuseks on keemilised reaktsioonid, mis ei ole seotud aine oksüdeerimisvõimega. Neil juhtudel võib osutuda vajalikuks katse kordamine tselluloosi asemel inertse ainega, nt diatomiidiga (kobediatomiit), et selgitada reaktsiooni olemust.

2. TULEMUSED

Rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) puhul.

Rõhutõusuajad inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).

2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINE

Arvutatakse keskmised rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) kohta.

Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud ).

Mõned näited tulemuste kohta on toodud tabelis 1.

Tabel 1

Näiteid tulemustest [14]

Aine [13] | Keskmine rõhutõusuaeg (ms) 1:1 tselluloosisegu puhul |

Ammooniumdikromaat, küllastunud vesilahus | 20800 |

Kaltsiumnitraat, küllastunud vesilahus | 6700 |

Raud(III)nitraat, küllastunud vesilahus | 4133 |

Liitiumperkloraat, küllastunud vesilahus | 1686 |

Magneesiumperkloraat, küllastunud vesilahus | 777 |

Nikkelnitraat, küllastunud vesilahus | 6250 |

Lämmastihape, 65 % | 4767 [11] |

Perkloorhape, 50 % | 121 [11] |

Perkloorhape, 55 % | 59 |

Kaaliumnitraat, 30 % vesilahus | 26690 |

Hõbenitraat, küllastunud vesilahus | — [12] |

Naatriumkloraat, 40 % vesilahus | 2555 [11] |

Naatriumkloraat, 45 % vesilahus | 4133 |

Inertne aine | |

Vesi: tselluloos | — [12] |

3. PROTOKOLL

3.1 KATSEPROTOKOLL

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:

- uuritud aine nimetus, koostis, puhtus jne,

- uuritava aine kontsentratsioon,

- tselluloosi kuivatusmenetlus,

- tselluloosi niiskusesisaldus,

- mõõtetulemused,

- inertse ainega tehtud katsete tulemused, kui need on olemas,

- arvutatud keskmised rõhutõusuajad,

- võimalikud kõrvalekalded nimetatud meetodist ja nende põhjused,

- kogu täiendav teave või märkused, mis on vajalikud tulemuste tõlgendamiseks.

3.2 TULEMUSTE TÕLGENDAMINE [15]

Katsetulemusi hinnatakse:

a) selle põhjal, kas uuritava aine ja tselluloosi segu süttib ise; ja

b) rõhutõusule (690 kPa-lt 2070 kPa-le) kulunud keskmise aja võrdlemisel võrdlusaine(te) korral selleks kulunud ajaga.

Vedelikku käsitatakse oksüdeerijana juhul, kui:

a) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) süttib iseeneslikult; või

b) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral on keskmine rõhutõusuaeg väiksem 65 massiprotsendilise lämmastikhappe (vesilahus) ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral saadud keskmisest rõhutõusuajast või on sellega võrdne.

Valepositiivse tulemuse vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka tulemusi, mis on saadud aine katsetamisel koos inertse materjaliga.

4. VIITED

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3. täiendatud väljaanne. ÜRO väljaanne nr: ST/SG/AC.10/ll/Rev. 3, 1999, lk 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

+++++ TIFF +++++

Surveanum

(A) Surveanuma korpus

(B) Purunevat membraani paigalhoidev kork

(C) Süüteküünal

(D) Pehme tinatihend

(E) Purunev membraan

(F) Külgharu

(G) Rõhuanduri pea

(H) Tihend

(J) Isoleeritud elektrood

(K) Maandatud elektrood

(L) Isolatsioon

(M) Teraskoonus

(N) Tihendit deformeeriv soon

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

(A) Süütespiraal

(B) Isolatsioon

(C) Elektroodid

(D) Süüteküünal

Märkus:

toodud kujunditest võib kasutada emba-kumba.

[1] Näiteks, ÜRO transpordieeskirjade raames.

[2] Hapet tuleks kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks enne katse läbiviimist tiitrida.

[3] Näiteks, ÜRO transpordieeskirjade raames.

[4] Nt 50 % (massiprotsent) perkloorhapet ja 40 % (massiprotsent) naatriumkloraati kasutatakse viites 1.

[5] Nt Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalooginumber 4021 050.

[6] Kinnitatakse (nt) tiitrimisega Karl-Fisheri järgi.

[7] Nimetatud niiskusesisaldust on võimalik saavutada ka (nt) kuumutamisel 105 °C juures vaakumis 24 tunni jooksul.

[8] Oksüdeerijate ja tselluloosi segusid tuleb käsitada plahvatusohtlikena ja käsitsema neid ettevaatlikult.

[9] Praktikas saab seda teha, valmistades 1:1 segu uuritavast vedelikust ja tselluloosist suuremas koguses kui katseks vaja ning pannes 5 ± 0,1 g surveanumasse. Igaks katseks tuleb segu värskelt valmistada.

[10] Eelkõige tuleb vältida spiraali naaberkeerdude vahelist kontakti.

[11] Laboritevaheliste võrdluskatsete keskmine väärtus.

[12] Suurimat rõhku 2070 kPa ei ole saavutatud.

[13] Küllastunud lahused tuleks valmistada 20 °C juures.

[14] Vt viide (1) ÜRO transpordieeskirjade kohase klassifitseerimise kohta.

[15] Vt viide 1, tulemuste tõlgendamine ÜRO transpordieeskirjade kohaselt mitmeid võrdlusaineid kasutades.

--------------------------------------------------

LISA 2B

B.1a. ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR

1. MEETOD

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 420-ga (2001).

1.1 SISSEJUHATUS

Traditsioonilised ägeda mürgisuse hindamise meetodid kasutavad loomade surma lõpetamiskriteeriumina. 1984. aastal soovitas British Toxicology Society uut lähenemist ägeda mürgisuse katsetamisele, mis põhineb aine manustamisel kindla annusemääraga seeriana (1). See lähenemine vältis loomade surma kasutamist lõpetamiskriteeriumina ja tugines selle asemel selgete mürgisuse nähtude vaatlemisele ühel seeriast valitud kindlal annusemääral. Protseduur kiideti katsemeetodina heaks 1992. aastal Ühendkuningriigi (2) ja rahvusvaheliste (3) in vivo valideerimiste põhjal. Seejärel hinnati kindla annuse protseduuri statistilisi omadusi matemaatiliste mudelite abil mitmetes uuringutes (4)(5)(6). In vivo ja mudeluuringud on tõestanud, et protseduur on korratav, et selles kasutatakse vähe loomi ja et see põhjustab vähem kannatusi kui traditsioonilised meetodid ning et selle abil saab klassifitseerida ained sarnaselt muude ägeda mürgisuse katsemeetoditega.

Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katsete juhisdokumendist ("Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing" (8)). Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti täiendavat teavet B.1a katsemeetodi kasutamise ja tõlgendamise kohta.

Meetodi põhimõte on, et põhiuuringus kasutatakse üksnes mõõdukalt mürgiseid annuseid ja et tõenäoliselt surmavate annuste manustamist tuleks vältida. Samuti ei tohiks manustada annuseid, mis teatavasti põhjustavad märkimisväärset valu või kannatusi sööbivate või tõsiselt ärritavate mõjude tõttu. Suremas loomad või loomad, kes ilmselt on valus või kellel on tugeva ja kestva kannatuse tunnused, surmatakse humaanselt ning need võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu loomi, kes surid katse käigus. Eraldi juhisdokumendis (8) on esitatud kriteeriumid, mille põhjal tehakse otsus suremas või raskelt kannatavate loomade surmamiseks, ja juhised prognoositava või ähvardava surma kindlakstegemiseks.

Meetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada ja klassifitseerida ainet ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimiseks vastavalt globaalselt harmoneeritud süsteemile (Globally Harmonised System (GHS) for the classification of chemicals which cause acute toxicity (9)).

Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri; selle füüsikalis-keemilisi omadusi; muude ainega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi; struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.

1.2 MÕISTED

Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.

Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14-päevase jälgimisperioodi jooksul.

Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).

Ilmne mürgisus – üldine mõiste, mis kirjeldab katseaine manustamise järel ilmnenud selgeid mürgisuse tunnuseid (vt näiteks (3)). Suuruselt järgmine kindel annus võib põhjustada enamikul loomadest tõenäoliselt kas tugevat valu ja kestva tugeva kannatuse tunnuseid, surmaeelset seisundit (kriteeriumid on toodud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)) või tõenäoliselt surma.

GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).

Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin. (Vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

LD50 (surmava annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).

Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2000 või 5000 mg/kg).

Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu, näiteks: suutmatus tarbida vett või toitu. (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).

1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Ühesooliste loomade rühmadele annustatakse katseainet järk-järgult 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg kindlate annustena (erandkorras võidakse kasutada 5000 mg/kg kindlat lisaannust, vt punkt 1.6.2). Esialgne annusemäär valitakse eelkatse põhjal annusena, mis eeldatavasti põhjustab mõningaid mürgisuse nähte, kuid ei põhjusta tõsiseid toksilisi mõjusid või suremust. Valu, kannatuse ja ähvardava surmaga seotud kliinilisi tunnuseid ja tingimusi kirjeldatakse üksikasjalikult OECD juhisdokumendis (8). Järgnevatele loomarühmadele võib annustada kaitseaine suuremaid või väiksemaid kindlaid annuseid doose, sõltuvalt sellest, kas neil on olemas või puuduvad märgid mürgisuse või suremuse kohta. Käesolevat protseduuri jätkatakse seni, kuni on kindlaks tehtud tõenäoliselt mürgisust põhjustav annus või surmajuhtum, või kui suurim annus ei avalda mõju või kui väikseim annus põhjustab surma.

1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.1 Loomaliikide valik

Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (7). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui erinevusi on täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (10). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse sooritatakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.

Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8-12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.

1.4.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, kui see peaks olema vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.

1.4.3 Loomade ettevalmistamine

Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.

1.4.4 Annuste valmistamine

Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Mõlemal juhul ei tohi manustamisel ületada annuse suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.

1.5 PROTSEDUUR

1.5.1 Annuste manustamine

Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.

Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseaine. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.

1.5.2 Eelkatse

Eelkatse eesmärk on võimaldada valida põhiuuringu tarbeks sobiv lähteannus. Katseainet manustatakse üksikutele loomadele järk-järgult lisas 1 toodud vooskeemide kohaselt. Eelkatse on lõpetatud siis, kui saab langetada otsuse põhikatse lähteannuse kohta (või kui tuvastatakse surm madalaima kindla annuse puhul).

Eelkatse lähteannus valitakse kindlate annusmäärade 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg hulgast annusena, mis eeldatavasti põhjustab ilmset mürgisust, mis võimaluse korral põhineb sama kemikaali või struktuurselt sarnaste kemikaalidega sooritatud in vivo ja in vitro katsete andmetel. Sellise teabe puudumise korral on lähteannuseks 300 mg/kg.

Iga looma korral on manustamiste vahel vähemalt 24-tunnine vahemik. Kõiki loomi jälgitakse vähemalt 14 päeva.

Maksimaalset kindla annuse määra 5000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt lisa 3). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS-kategooria 5 (2000–5000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmiseks.

Juhul kui loom, kelle peal katsetati madalaimat kindla annuse määra (5 mg/kg), eelkatse käigus sureb, on tavapäraseks toiminguks uuringu peatamine ja aine klassifitseerimine GHS-kategooriasse 1 (nagu on näidatud lisas 1). Kui on siiski nõutav klassifitseerimise täiendav kinnitamine, võib teostada järgmise valikulise lisaprotseduuri. Teisele loomale manustatakse annus 5 mg/kg. Kui teine loom sureb, siis kinnitab see GHS- kategooriat 1 ja katse lõpetatakse kohe. Kui teine loom jääb ellu, siis manustatakse maksimaalselt kolmele täiendavale loomale annus 5 mg/kg. Kuna suremuse risk on kõrge, tuleb manustamist teha kõnealustele loomadele ükshaaval, et tagada nende heaolu. Ajavahemik igale loomale annuse manustamise vahel peab olema piisav selleks, et eelmine loom jääb tõenäoliselt ellu. Kui teine loom sureb, lõpetatakse viivitamata annustamine ja rohkematele loomadele doose ei manustata. Kuna teise surma juhtum (olenemata uuritud loomade arvust katse lõpetamise hetkel) kuulub tulemuse kategooriasse A (2 või enam surma), järgitakse 5 mg/kg fikseeritud annuse puhul lisas 2 toodud klassifitseerimisreeglit (kategooria 1, kui on 2 või enam surmajuhtumit, või kategooria 2, kui on vaid 1 surmajuhtum). Lisaks sellele antakse lisas 4 juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHS-i kasutuselevõttu.

1.5.3 Põhiuuring

1.5.3.1 Loomade arv ja annusemäärad

Lähteannuse tasemel katsete tegemise järel võetavad meetmed on esitatud lisas 2 toodud vooskeemides. Üks kolmest meetmest on nõutav; kas katse peatamine või sobiva ohuklassi määramine, katse sooritamine suurema kindla annusega või väiksema kindla annusega. Loomade kaitsmiseks ei kasutata põhiuuringus uuesti eelkatses surma põhjustanud annusemäära (vt lisa 2). Kogemused on näidanud, et kõige tõenäolisem tulemus läheannuse tasemel on see, et ainet on võimalik klassifitseerida ja täiendavaid katseid ei ole vaja teha.

Igal uuritava annusemäära korral kasutatakse tavaliselt kokku viit ühest soost looma. Nende viie looma hulka kuulub üks loom eelkatsest, kellele manustati valitud annusemäärale vastav annus, ja veel neli looma (v.a harvaesineval juhul, kui põhiuuringus kasutatav annusemäär ei sisaldunud eelkatses).

Annustamiste vaheline ajavahemik iga annusemäära korral määratakse kindlaks mürgisuse tunnuste ilmnemise, kestuse ja ägeduse abil. Järgmise annuse manustamist tuleb edasi lükata, kuni juba doosi saanud loomade ellujäämine on kindel. Vajaduse korral soovitatakse annustamiste vaheliseks ajaks jätta iga annusemäära puhul 3 või 4 päeva, et võimaldada jälgida viivitunud mürgisust. Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.

Kui kasutatakse kõrgeimat kindlat annust 5000 mg/kg, tuleks järgida lisas 3 esitatud protseduuri (vt ka punkt 1.6.2).

1.5.3.2 PiirkatsePiirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus

eksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada sarnaseid uuritud ühendeid või segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.

Käesoleva juhise kohase piirkatsena võidakse tavalist protseduuri kasutades kasutada eelkatset, mille lähteannus on 2000 mg/kg (või erandkorras 5000 mg/kg), mille järel manustatakse veel neljale loomale sama annus.

1.6 VAATLUSED

Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev, kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui need tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või loomad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seega vajadusel pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (11). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.

Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (8). Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

1.6.1 Kehamass

Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.

1.6.2 Patoloogia

Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.

2. TULEMUSED

Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.

3. PROTOKOLL

3.1 KATSEPROTOKOLL

Katseprotokoll peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet:

Katseaine:

- füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine),

- identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.

Kandeaine (vajadusel):

- kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.

Katseloomad:

- kasutatud liigid/tüved,

- loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada,

- loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel),

- päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

- katseaine valmistamise üksikandmed, sh üksikandmed manustatava aine füüsilise oleku kohta,

- katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg,

- üksikasjalikud andmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas),

- põhjendus lähteannuse valikuks.

Tulemused:

- tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgistustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta,

- tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta,

- iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel,

- surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist,

- iga looma korral mürgistusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine,

- iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.

Järeldused.

4. VIITED

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Pariis

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

--------------------------------------------------

LISA 2C

"B.Ib ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD

1. MEETOD

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 423-ga (2001).

1.1 SISSEJUHATUS

Käesolevas katses sätestatud ägeda mürgisusastme meetod (1) on astmeline meetod, mille igal etapil kasutatakse 3 samast soost looma. Olenevalt loomade suremusest ja/või sellest, kas loomad on suremas, on katseaine ägeda mürgisuse hindamiseks vaja keskmiselt 2–4 etappi. Käesolev protseduur on korratav, selles kasutatakse väga vähe loomi. Selle abil võidakse järjestada ained sarnaselt muudele ägeda mürgisuse katsemeetoditele. Ägeda mürgisusastme meetod põhineb biomeetrilistel hindamistel (2)(3)(4)(5), kus kasutatakse kindlaid annuseid, mis on üksteisest piisavalt eraldatud aine klassifitseerimise eesmärgil ja ohu hindamiseks. 1996. aastal vastuvõetud meetodit valideeriti ulatuslikult in vivo, võrreldes kirjandusest saadud LD50- väärtusi käsitlevaid andmeid nii riiklikul (6) kui ka rahvusvahelisel tasandil (7).

Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katseid käsitlevast (8) juhisdokumendist. Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti täiendavat teavet B.lb katsemeetodi läbiviimise ja tõlgendamise kohta.

Katseaineid ei ole vaja manustada annustes, mis teadaolevalt põhjustavad märkimisväärset valu ja kannatusi sööbiva või tugeva ärritava toimete tõttu. Suremas olevad loomad ja loomad, kes kannatavad ilmselgelt valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks surmata humaanselt; need loomad võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu katse käigus surnud loomi. Eraldi juhisdokumendis (9) on esitatud kriteeriumid, mille alusel tehakse otsus suremas olevate või tõsiselt kannatavate loomade surmamise kohta, ning juhised prognoositava või ähvardava surma äratundmiseks.

Meetod kasutab ettemääratletud annuseid ja tulemused võimaldavad aineid järjestada ja klassifitseerida vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale globaalselt harmoneeritud süsteemile (10).

Põhimõtteliselt ei ole meetod ette nähtud võimaldama arvutada täpset LD50-annust, kuid võimaldab kindlaks määrata määratletud kokkupuutevahemikku, kus suremus on eeldatav, kuna käesoleva katse põhipunkt on endiselt see, et osa loomi sureb. Meetod võimaldab kindlaks määrata LD50-väärtuse üksnes siis, kui vähemalt kaks annust põhjustavad suremuse, mis on 0 %-st suurem ja 100 %-st madalam . Tänu ettemääratletud annuste valikule sõltumata katseainest, ja klassifitseerimise selgelt väljendatud seosele erinevas seisundis täheldatud loomade arvuga on laborite aruanded järjepidevamad ja korratavamad.

Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri; selle füüsikalis-keemilisi omadusi; muude ainetega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi; struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.

1.2. MÕISTED

Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast ainet on suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.

Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14-päevase jälgimisperioodi jooksul.

Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).

GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).

Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (Vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

LD50 (surmava suukaudse annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).

Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2000 või 5000 mg/kg).

Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu; näiteks suutmatus tarbida vett või toitu. (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).

1.3 KATSE PÕHIMÕTE

Tuginedes protseduurile, mille kohaselt kasutatakse igal etapil minimaalset arvu loomi, on katse põhimõtteks saada aine klassifitseerimiseks piisavalt teavet katseaine ägeda mürgisuse kohta. Ainet manustatakse katseloomade rühmale suukaudselt ühe kindlaksmääratud doosina. Ainet katsetatakse etapiviisiliselt, igal etapil kasutatakse kolme ühest soost looma (tavaliselt emaslooma). Ühendiga seotud suremuse puudumine või esinemine loomadel, kellele ühel etapil annustati ainet, määrab kindlaks järgmise etapi, s.t:

- lisakatseid ei ole vaja,

- aine sama annus manustatakse kolmele täiendavale loomale,

- ainet manustatakse vastavalt vahetult järgmisele või eelmisele annusemäärale kolmele täiendavale loomale.

Katseprotseduuri üksikasju on kirjeldatud lisas 1. Meetod võimaldab langetada otsuse seoses katseaine klassifitseerimisega ühte mürgisuse kategooriasse, mis on määratletud kindlaksmääratud LD50 piirväärtuse põhjal.

1.4 MEETODI KIRJELDUS

1.4.1 Loomaliikide valik

Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (9). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui on erinevusi täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (11). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutataks neid. Kui katse viiakse läbi isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.

Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8-12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.

1.4.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise aja, kui see peaks olema vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.

1.4.3 Loomade ettevalmistamine

Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise jaoks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.

1.4.4 Annuste valmistamine

Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Mõlemal juhul ei tohi ületada manustamisel annuste suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus järgmine lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.

1.5 PROTSEDUUR

1.5.1 Annuste manustamine

Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.

Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3-4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja katseainet manustatakse. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.

1.5.2 Loomade arv ja annusemäärad

Igal etapil kasutatakse kolme looma. Lähteannusena kasutatav annusemäär valitakse üks neljast kindlast suurusest – 5, 50, 300 ja 2000 mg/kehamassi kg. Lähteannuse määr peaks olema sellise väärtusega, mis kutsub suurima tõenäosusega esile suremust mõnede loomade hulgas, kellele ainet manustati. Lisas 1 toodud vooskeemid kirjeldavad protseduure, mida tuleks järgida iga lähteannuse puhul. Lisaks sellele antakse lisas 4 juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHS-i kasutuselevõttu.

Kui olemasolev teave kinnitab, et suremus on ebatõenäoline suurima algdoosi taseme juures (2000 mg/kg kehamassi kohta, tuleks läbi viia piirkatse. Kui puudub teave uuritava aine kohta, soovitatakse loomade heaolu tagamiseks kasutada algdoosina 300 mg/kg kehamassi kohta.

Katserühmadele annustamiste ajavahemik määratakse kindlaks mürgisustunnuste algushetke, kestuse ja raskuse abil. Järgmise annuse manustamist loomadele tuleb edasi lükata hetkeni, kuni juba annuse saanud loomade ellujäämine on kindel.

Maksimaalset kindla annuse määra 5000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras ja ainult siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt lisa 2). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS-kategooria 5 (2000–5000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmisel.

1.5.3 Piirkatse

Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus eksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada sarnaseid uuritud ühendeid, segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.

Piirkatse võidakse teha ühel annusemääral (2000 mg/kg kehamassi kohta) kuue loomaga (kolm looma igal etapil). Erandkorras võib piirkatse teha ühel annusemääral (5000 mg/kg) kolme loomaga (vt lisa 2). Kui esineb katseainega seotud suremust, võib sooritada lisakatseid aste võrra madalama annusemääraga.

1.6 VAATLUSED

Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või kui nad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seepärast vajadusel pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (12). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.

Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume. Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.

1.6.1 Kehamass

Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.

1.6.2 Patoloogia

Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.

2. TULEMUSED

Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.

3. PROTOKOLL

3.1 Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet:

Katseaine:

- füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);

- identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.

Kandeaine (vajadusel):

- kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.

Katseloomad:

- kasutatud liigid/tüved,

- loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada,

- loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel),

- päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

- katseaine valmistamise üksikasjad, sh üksikasjad manustatava aine füüsilise oleku kohta,

- katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg,

- üksikasjalikud toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas),

- põhjendus lähteannuse valikuks.

Tulemused:

- tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgisustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta,

- tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta,

- iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel,

- surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist,

- iga looma korral mürgisusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine,

- iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.

Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.

Järeldused.

4. VIITED

(1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method - An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http:// webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."

--------------------------------------------------

LISA 2D

Β.4. ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS

1. MEETOD

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 404-ga (2002).

1.1 SISSEJUHATUS

Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse eriliste tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, aine söövitavust ja ärritavust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu. Kui saadaolevad andmed on ebapiisavad, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (1). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele soovitatakse vastavalt olukorrale, et in vivo algkatses kohaldatakse looma suhtes kolme katselappi järjestikku, mitte samaaegselt.

Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava katseaine võimalikku naha söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uurimustest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (2)(3) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemused (4)(5)(5a). Käesolev analüüs peaks vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste ainete suhtes, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta on muudest uurimustest juba piisavalt tõendeid saadud.

Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (6), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsestrateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt harmoneeritud süsteemis (GHS) (7). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsetamisstrateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.

Kui söövitavust või ärritavust ei saa kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt osakaalu analüüsimise abil, tuleks kaaluda in vivo katset (vt lisa).

1.2 MÕISTED

Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine kuni neli tunni jooksul pärast katseaine manustamist.

Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, s.t nähtava marrasknahast pärisnahani ulatuva nekroosi tekkimine kuni nelja tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Tüüpilised söövitusreaktsioonid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase jälgimisperioodi lõpus naha heledaks muutumise tõttu värvimuutus, täielik karvakadu ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogiat.

1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma nahale, katselooma töötlemata kehapinnad toimivad kontrollina. Ärritavuse/söövitavuse astet konstateeritakse ja märgitakse täpsustatud intervallid ning seda astet kirjeldatakse mõjude hindamise täiendamiseks. Uurimus kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.

Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites (8).

1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.1 In vivo katse ettevalmistamine

1.4.1 Loomaliikide valik

Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamist tuleks põhjendada.

1.4.1.2 Loomade ettevalmistamine

Ligikaudu 24 tunni jooksul enne katset lõigatakse loomade seljaosa karvad lühikeseks. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutama peaks üksnes terveid, terve nahaga loomi.

Mõnedel küüliku liinidel esineb tihedaid karvalaike, mis on silmatorkavamad teatavatel aastaaegadel. Selliseid tiheda karvastikuga kehapindasid ei tohiks kasutada katsetamise kohana.

1.4.1.3 Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, mil see on 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.

1.4.2 Katsemenetlus

1.4.2.1 Katseaine manustamine

Katseainet tuleks panna väikesele nahapinnale (ligikaudu 6 cm2) ja see kaetakse marlilapiga, mis kinnitatakse nahka mitteärritava teibiga. Kui ainet ei ole võimalik otse peale kanda (nt vedelikud või mõned pastad), kantakse katseaine esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse õrnalt vastu nahka sobiva, pooltihke sideme abil kogu mõjuaja. Kui katseaine kantakse lapile, tuleks see lapp kinnitada nahale selliselt, et aine puutuks nahaga hästi kokku ja leviks nahal ühtlaselt. Tuleks tõkestada looma ligipääsu lapile ja katseaine allaneelamist või sissehingamist.

Vedalaid katseaineid kasutatakse üldiselt lahjendamata kujul. Tehes katseid tahkete ainetega (mida võib vajadusel pulbristada), tuleks katseainet niisutada väikese koguse veega (või vajadusel muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muid kandeaineid kui vesi, on kandeaine võimalik mõju katseaine põhjustatud nahaärritusele minimaalne või olematu.

Mõjuaja lõpus, mis kestab tavaliselt neli tundi, allesjäänud katseaine eemaldatakse võimaluse korral vee või sobiva lahustiga, muutmata marrasknaha olemasolevat reaktsiooni või puutumatust.

1.4.2.2 Annusmäär

Uuritavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelat või 0,5 g tahket ainet või pastat.

1.4.2.3 Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus/-söövitavuskatse)

On eriti soovitav, et algselt tehtaks in vivo katse ühe loomaga, eriti juhul, kui aine võib tõenäoliselt olla söövitav. See on kooskõlas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga (vt lisa 1).

Kui osakaalu analüüsi põhjal on tõendatud, et aine on söövitav, ei ole vaja loomadega katseid jätkata. Enamike võimalike söövitavate ainete puhul ei ole tavaliselt täiendava in vivo katse tegemine vajalik. Juhul, kui lisateavet peetakse vajalikuks puudulike tõendite tõttu, võidakse sooritada piiratud loomkatse, kasutades järgmist lähenemist: Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui ei täheldata tõsist nahareaktsiooni, asetatakse teine lapp ja eemaldatakse tunni aja pärast. Kui vaatlus antud etapil viitab sellele, et mõjutamist võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse peale kolmas lapp ja see eemaldatakse nelja tunni pärast, misjärel reaktsiooni hinnatakse.

Kui sööbivat mõju vaadeldakse pärast kolme järjestikust mõjutamist, lõpetatakse katse kohe. Kui sööbivat mõju ei vaadelda pärast viimase lapi eemaldamist, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ei teki varem.

Kui katseaine ei tekita söövitust, kuid võib olla ärritav, asetatakse üks lapp ühele loomale neljaks tunniks.

1.4.2.4 Kinnitav katse (in vivo nahaärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)

Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma samaaegselt. Erandkorras, kui algkatset ei ole tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma, ei ole vaja lisakatset teha, kui mõlematel esineb sama reaktsioon. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgeid reaktsioone on vaja hinnata, tehes katseid muude loomadega.

1.4.2.5 Jälgimisperiood

Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused. Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi kuni 14 päeva pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 14 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.

1.4.2.6 Kliinilised vaatlused ja naha reaktsioonide hindamine

Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse nähte, reaktsioone hinnatakse 60 minuti pärast, seejärel 24, 48 ja 72 tundi pärast lapi eemaldamist. Ühe loomaga algkatses uuritakse uuritavat pinda samuti vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioone hinnatakse ja registreeritakse vastavalt allpool tabelis toodud hinnetele. Kui nahal on kahjustus, mida ei suudeta tuvastada ärrituse või söövitusena 72 tunni jooksul, võib vaja minna jälgida kuni 14. päevani, et kindlaks määrata mõjude pöörduvus. Lisaks ärrituse jälgimisele tuleks täielikult kirjeldada ja registreerida kõik paiksed toksilised mõjud nagu naha rasva lahustumine ja mis tahes organismi kahjulikud mõjud (nt mõjud mürgisuse kliinilistele tunnustele ja kehakaalule). Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uurimine.

Naha reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Naha reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabel allpool). Illustreeritud juhis nahaärrituse või muude kahjustuste hindamiseks võib olla abiks (9).

2. TULEMUSED

2.1 TULEMUSTE ESITAMINE

Uurimuse tulemused esitatakse tabeli kujul lõplikus katsearuandes ja peaks hõlmama kõiki punktis 1.3 nimetatud asju.

2.2 TULEMUSTE HINDAMINE

Nahaärrituse määramisi tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks vaadelda kontrollväärtustena üksikuid määramisi, mis vajavad hindamist koos kõikide muude uurimuses tehtud vaatlustega.

Nahakahjustuste pöörduvust tuleb võtta arvesse ärritusreaktsioonide hindamisel. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud pinnal), liigsarvestus, hüperplaasia ja kestendus jätkuvad 14-päevase jälgimisperioodi lõpus, tuleks käsitada katseainet naha ärritajana.

3. PROTOKOLL

3.1 KATSEPROTOKOLL

Katsearuanne peab hõlmama järgmist teavet:

Põhjendus in vivo katse tegemiseks: olemasolevate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:

- varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus,

- katsestrateegia igal etapil saadud andmed,

- in vitro katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused,

- osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.

Katseaine:

- tunnusandmed (nt CASi number; algupära; puhtus; tuntud lisandid; partii number),

- füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus),

- kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad.

Kandeaine:

- nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus,

- kandeaine valiku põhjendamine.

Katseloomad:

- kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks,

- igast soost loomade arv,

- üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus,

- vanus katse alguses,

- päritolu, elamistingimused, toitumine jne.

Katsetingimused:

- lapi asetuskoha ettevalmistamine,

- üksikandmed lapi materjali kohta ning asetustehnika,

- katseaine ettevalmistust, pealekandmist ja eemaldamist käsitlevad üksikasjad.

Tulemused:

- iga looma ärritus-/söövitusreaktsioonide määramised igal mõõtmiskorral tabeli kujul,

- kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldused,

- täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus ja võimalikud histopatoloogilised leiud,

- muude kahjulike paiksete (nt naha rasva lahustumine) ning nahaärritusele ja -söövitusele lisaks kogu organismile suunatud mõjude kirjeldus.

Tulemuste arutelu.

4. VIITED

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.

(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.

(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/ monos.htm).

(9) EPA (1990). Adas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Saadaval taotluse korral OECD sekretariaadist].

TABEL 1: NAHA REAKTSIOONIDE MÄÄRAMINE

Nahapunetuse ja kooriku tekkimine

Nahapunetust ei esine … | 0 |

Väga kerge nahapunetus (vaevumärgatav) … | 1 |

Selgesti nähtav nahapunetus … | 2 |

Mõõdukas kuni tõsine nahapunetus … | 3 |

Tõsine nahapunetus (tugev punetus) – kooriku tekkimine, mis takistab nahapunetusele punktide andmist … | 4 |

Suurim võimalik punktide arv: 4 |

Turse tekkimine

Turset ei esine … | 0 |

Väga kerge turse (vaevumärgatav) … | 1 |

Kerge turse (nahapinna servad on kindlalt üleval) … | 2 |

Mõõdukas turse (ligikaudu 1 mm üleval) … | 3 |

Tugev turse (enam kui 1 mm üleval ja levinud ainega mõjutatud alast kaugemale) … | 4 |

Suurim võimalik punktide arv: 4 |

Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uuring.

--------------------------------------------------

LISA 2E

Β. 5. AGE MURGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS

1. MEETOD

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 405-ga (2002).

1.1 SISSEJUHATUS

Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, silmade ägedat söövitust ja ärritust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu (1). Kui saadaolevad andmed on puudulikud, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (2)(3). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele on soovitav enne in vivo silmade katse tegemist teha silmade söövituse ennustamiseks in vivo nahaärrituse ja -söövituse katse.

Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava, katseaine võimalikku silmade söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uuringutest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (4)(5) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo silmade söövitust ja ärritust uurivate katsete tulemused (6)(6a). Katsed võib teha enne osakaalu analüüsi või selle tulemusena.

Teatavate ainete puhul võib selline analüüs viidata vajadusele teha in vivo katseid aine võimaliku silmade söövitavuse ja ärrituvuse väljaselgitamiseks. Kõikidel sellistel juhtudel on soovitav esmalt enne in vivo silmade katse tegemist teha katse in vivo aine nahakaudsete mõjude väljaselgitamiseks ja hinnata tulemusi vastavalt katsemeetodile B.4 (7). Osakaalu analüüsi tegemine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vähendaksid vajadust in vivo aine võimalikku silmade söövitavust/ärritavust uuriva katse tegemise järele, mille kohta on muudest katsetest saadud juba piisavalt tõendeid. Kui silmade söövitavust või ärritavust ei suudeta kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegiat kasutades, isegi pärast in vivo nahasöövitust ja -ärritust uuriva katse tegemist, võib teha in vivo silmade söövitust/ärritust uuriva katse.

Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (8), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsete tegemise strateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt ühtlustatud süsteemis (GHS) (9). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille naha ja silmade söövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsete tegemise strateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.

1.2 MÕISTED

Silmade ärritus – selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis täielikult pöörduvad 21 päeva jooksul pärast manustamist.

Silmade söövitus – koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemislangus pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöördumatud 21 päeva jooksul pärast aine manustamist.

1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma ühte silma, katselooma töötlemata silm toimib kontrollina. Silmade ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustustele punkte andes teatavate intervallide tagant. Muid mõjusid silmas ja kahjulikke süsteemseid mõjusid kirjeldatakse samuti selleks, et hinnata täielikult mõjusid. Katse kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.

Loomade, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites (10).

1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.4.1 In vivokatse ettevalmistamine

1.4.1 Loomaliikide valik

Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide või liinide kasutamist tuleks põhjendada.

1.4.1.2 Loomade ettevalmistamine

Kummagi katsesse valitud looma mõlemat silma uuritakse 24 tunni jooksul enne katse algust. Tuleks kasutada loomi, kellel esineb silmade ärritust, silmadefekte või varasemaid sarvkestakahjustusi.

1.4.1.3 Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, mil see on 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.

1.4.2 Katsemenetlus

1.4.2.1 Katseaine manustamine

Katseainet manustatakse iga looma ühe silma sidekestakotti, tõmmates alumist laugu õrnalt silmamunast eemale. Seejärel pigistatakse laud umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgumist. Teine silm, mida ei töödelda, toimib kontrollina.

1.4.2.2 Loputamine

Katseloomade silmi ei tohiks pesta vähemalt 24 tundi pärast katseaine manustamist, välja arvatud tahked ained (vt punkt 1.4.2.3.2) ja koheste sööbivate või ärritavate mõjude korral. 24 tunni pärast võib loputada, kui seda peetakse vajalikuks.

Pesemise mõju selgitamiseks ei soovitata kasutada loomade kontrollrühma, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui on vaja kontrollrühma, kasutatakse kahte küülikut. Pesemise tingimused tuleks hoolikalt dokumenteerida, nt pesemisaeg, pesemislahuse koostis ja temperatuur, pesemise kestus, vedeliku kogus ja voolukiirus.

1.4.2.3 Annusmäär

1.4.2.3.1 Vedelike uurimine

Vedelike uurimiseks kasutatakse 0,1 ml annust. Pumppihustist ei tohi ainet otse silma manustada. Vedelikujuga tuleks väljutada ja koguda mahutisse enne 0,1 ml silma manustamist.

1.4.2.3.2 Tahkete ainete uurimine

Tahkete ainete, pastade ja osakeste uurimisel peaks kasutatav kogus olema 0,1 ml või kaaluga kuni 100 mg. Katseaine tuleks jahvatada peeneks tolmuks. Tahke aine kogust tuleks mõõta pärast selle õrnalt tihendamist, nt raputades mõõtemahutit. Kui tahket katseainet ei ole katselooma silmast eemaldatud füsioloogiliste mehhanismide abil esimese vaatluse ajal üks tund pärast käsitlemist, loputatakse silma füsioloogilise soolalahusega või destilleeritud veega.

1.4.2.3.3 Aerosoolide uurimine

Soovitatakse, et kogutakse kõik pumbatavad joad ja aerosoolid enne silma manustamist. Üheks erandiks on survestatud aerosoolmahutites ained, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellistel juhtudel tuleks silm hoida lahti ja katseaine panna silma ligikaudu üks sekund kestva lihtsa purskega 10 cm kauguselt otse silma ees. Nimetatud vahemaa võib muutuda sõltuvalt pihusti survest ja sisaldusest. Tuleks olla ettevaatlik, et pihusti surve ei teeks silmale liiga. Mõnel juhul võib osutuda vajalikuks hinnata pihusti tugevusest silmale põhjustatud võimalikke "mehaanilisi" kahjustusi.

Aerosooliannuse suurust võib hinnata katset järgmiselt simuleerides: ainet pihustatakse kaalupaberile otse paberi ees oleva küüliku silma suuruses avausest. Paberi kaalu suurenemise abil hinnatakse silma pihustatud kogust. Lenduvate ainete puhul võib hinnata annust kogumismahuti kaalumise teel enne ja pärast katseaine eemaldamist.

1.4.2.4 Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus-söövitavuskatse)

Järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt (vt lisa 1) on väga soovitav, et in vivo katse sooritataks algselt ühe loomaga.

Kui nimetatud katse tulemused tõendavad, et aine on kirjeldatud menetlust kasutades silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole silma ärritavuse kindlakstegemiseks vaja teha täiendavaid katseid.

1.4.2.5 Lokaalanesteetikumid

Lokaalanesteetikume võib kasutada igal üksikjuhul. Kui osakaalu analüüs viitab sellele, et aine võib põhjustada valu, või kui algkatsega tõendatakse, et võib toimuda valulik reaktsioon, võib lokaalanesteetikume kasutada enne katseaine manustamist. Lokaalanesteetikumi liik, kontsentratsioon ja annus tuleks valida hoolikalt, et erinevused katseainele reageerides ei tuleneks selle kasutamisest. Kontrollsilma tuleb samamoodi tuimestada.

1.4.2.6 Kinnitav katse (in vivo silmade ärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)

Kui söövitavat toimet ei ole algkatses täheldatud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil. Kui algkatses täheldatakse tugevat ärritavat mõju, mis viitab võimalikule tugevale (pöördumatule) mõjule kinnitava katse tegemisel, on soovitav, et kinnitav katse tehtaks järjestikuselt ühe loomaga korraga, mitte kahte lisalooma üheaegselt mõjutades. Kui teisel loomal esineb söövitavaid või tugevalt ärritavaid mõjusid, siis katset enam ei jätkata. Lisaloomasid võib vaja minna nõrkade või mõõdukate ärritavate reaktsioonide kinnitamiseks.

1.4.2.7 Jälgimisperiood

Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude ulatust ja pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused (9). Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi tavaliselt 21 päeva pärast katseaine manustamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.

1.4.2.7.1 Kliinilised vaatlused ja silma reaktsioonide hindamine

Silmi tuleks jälgida 1, 24, 48 ja 72 tundi pärast katseaine manustamist. Loomi ei uurita pärast seda, kui on saadud lõplikud andmed. Loomad, kellel jätkuvalt esineb tugevat valu või stressi, tuleks viivitamata humaanselt tappa, ning ainet tuleks hinnata vastavalt sellele. Humaanselt tuleks tappa loomad, kellel aine manustamise järel esineb järgmisi silmakahjustusi: sarvkesta perforatsioon või märgatav sarvkesta haavand, kaasa arvatud silmasopislaiend; veri silma eeskambris; hinde 4 sarvkesta läbipaistmatus, mis püsib 48 tunni jooksul; valgusrefleksi puudumine (vikerkesta reaktsioon – hinne 2), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavand; sidekesta või niktatsioonikesta nekroos või armistumine. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud.

Loomad, kellel ei esine silmakahjustusi, võib tappa mitte varem kui kolm päeva pärast manustamist.

Loomi, kellel esinevad kerged või mõõdukad kahjustused, tuleks jälgida seni, kuni kahjustused on selged, või 21 päeva, mil katse lõpetati. Jälgitakse 7, 14 ja 21 päeva, et kindlaks määrata kahjustuse seisund ning nende pöörduvus või pöördamatus.

Silmade reaktsiooni (sidekest, sarvkest ja vikerkest) hinded tuleks registreerida iga kord, kui looma uuritakse (tabel 1). Kõikidest muudest silmakahjustustest (nt silma sarvkestakiht, värvumine) või kahjulikest süsteemsetest mõjudest tuleks samuti teada anda.

Reaktsioonide uurimist võib hõlbustada binokulaarluubi, pilulambi, biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast vaatluste registreerimist 24 tunni jooksul võib silmi edasi uurida fluorestseiini abil.

Silma reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Silma reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabel allpool).

2. TULEMUSED

2.2 TULEMUSTE HINDAMINE

Silmaärrituse punkte tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks käsitleda üksikuid punkte kontrollväärtustena ja need on tähendusrikkad üksnes siis, kui neid on täielikult kirjeldatud ja kõiki vaatlusi on hinnatud.

3. PROTOKOLL

3.1 KATSEPROTOKOLL

Katsearuanne peab hõlmama järgmist teavet:

Põhjendus in vivo katse tegemiseks: varasemate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:

- varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus,

- katsestrateegia igal etapil saadud andmed,

- in vitro testide kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused,

- in vivo nahaärritust/-söövitust uuriva katse, sh saadud tulemuste kirjeldus,

- osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.

Katseaine:

- tunnusandmed (nt CASi number; algupära; puhtus; tuntud lisandid; partii number),

- füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, reaktiivsus veega),

- kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad,

- kui kasutatakse lokaalanesteetikumi, selle nimetus, puhtus, liik, annus ja võimalik koostoime katseainega.

Kandeaine:

- nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus,

- kandeaine valiku põhjendamine.

Katseloomad:

- kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks,

- iga looma vanus katse alguses,

- mõlemast soost loomade arv katse- ja kontrollrühmas (vajaduse korral),

- üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus,

- päritolu, elamistingimused, toitumine jne.

Tulemused:

- igal vaatlusel ärritusele punktide andmisel kasutatava meetodi kirjeldus (nt pilulamp, biomikroskoop, fluorestseiin),

- tabeli kujul andmed iga looma ärritavate/söövitavate reaktsioonide kohta igal vaatlusel kuni katselooma kõrvaldamiseni katsest,

- jälgitud ärrituse või söövituse astme ja laadi kirjeldus,

- muude jälgitud silmakahjustuste kirjeldus (nt vaskularisatsioon, silma sarvkestakihi tekkimine, liited, värvumine),

- mujal kui silmas tuvastatud paiksete või süsteemsete kahjulike mõjude ja histopatoloogiliste leidude kirjeldus.

Tulemuste arutelu.

3.2 TULEMUSTE TÕLGENDAMINE

Katseloomadega tehtud silma ärritust uurivate katsete tulemuste ekstrapolatsioon inimestele on kehtiv üksnes piiratud ulatuses. Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silmaärritajatele või – söövitavatele ainetele tundlikumad kui inimesed.

Tuleks olla ettevaatlik andmete tõlgendamisel, et välistada sekundaarsest nakkusest tingitud ärritust.

4. VIITED

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429.

(2) de Suva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol .35., 159-164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.

(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.

(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm).

(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

TABEL 1: SILMAKAHJUSTUSTE HINDAMINE

Sarvkest

Hägusus: tihedusaste (mõõtmised tuleks teha kõige tihedamas kohas) [1] |

Ei esine haavandeid või hägusust … | 0 |

Hajutatud või hajusad hägususalad (välja arvatud tavapärase läike kerge tuhmumine); vikerkesta selgelt nähtavad detailid … | 1 |

Kergesti märgatav poolläbipaistev ala; vikerkesta kergelt varjatud detailid … | 2 |

Pärlmutrine ala; vikerkesta detailid ei ole nähtavad; pupilli suurus on vaevunähtav … | 3 |

Läbipaistmatu sarvkest; vikerkest ei eristu läbi hägususe … | 4 |

Suurim võimalik punktide arv: 4 |

Vikerkest

Tavaline … | 0 |

Selgesti süvenenud kurrud, verepais, turse, mõõdukas liigveresus sarvkesta ümber; või injektsioon; vikerkest reageerib valgusele (pikaldast reaktsiooni peetakse katseaine mõjuks) … | 1 |

Verejooks, täielikult hävinud vikerkest või ei reageeri valgusele … | 2 |

Suurim võimalik punktide arv: 2 |

Sidekest

Punasus (viitab laugude ja silmamuna sidekestale, v.a sarv- ja vikerkest) |

Tavaline … | 0 |

Mõned hüpereemilised veresooned (injekteeritud) … | 1 |

Hajunud sügavpunane värvus; üksikuid veresooni ei ole kerge eristada … | 2 |

Hajunud tumepunane … | 3 |

Suurim võimalik punktide arv: 3 |

Sidekestaturse

Turse (viitab laugudele ja/või niktatsioonikestale) |

Tavaline … | 0 |

Mõningane tavapärasest suurem turse … | 1 |

Selge turse, laud osaliselt ümberpöördunud … | 2 |

Turse, laud poolsuletud … | 3 |

Turse, laud rohkem kui poolsuletud … | 4 |

Suurim võimalik punktide arv: 4 |

[1] Sarvkesta hägususala tuleks mainida.

--------------------------------------------------

LISA 2F

B.31 SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS

1. MEETOD

Käesolev meetod lähtub juhendist (2001).

1.1 SISSEJUHATUS

Käesolev arenguaegse mürgisuse uurimise meetod on välja töötatud selleks, et pakkuda üldist teavet sünnieelse kokkupuute mõjude kohta tiinetel katseloomadel ja emakas areneval organismil; see võib hõlmata nii emalt pärinevat mõjude kui ka surma, strukturaalsete kõrvalekallete või loote muundunud arengu hindamist. Funktsionaalsed puudujäägid, mis on arengu tähtis osa, ei ole käesoleva testi lahutamatu osa. Neid võib uurida eraldi uurimuses või käesoleva uurimuse täiendusena, kasutades neurotoksilisuse uuringutele suunatud katsemeetodit. Funktsionaalsete puudujääkide ja muude sünnijärgsete mõjude uurimist käsitleva teabe puhul tuleks vajadusel pidada nõu kahe põlvkonna reproduktiivse mürgisuse uuringut ja arengulise neurotoksilisuse uuringut käsitleva katsemeetodi üle.

Käesolev katsemeetod võib eeldada konkreetset kohandamist üksikjuhtudel spetsiaalsete, nt katseaine füüsikalis-keemilisi või toksikoloogilisi omadusi puudutavate teadmiste põhjal. Selline kohandamine on aktsepteeritav, kui on olemas veenvad teaduslikud tõendid, et kohandamise tõttu on katse informatiivsem. Sellisel juhul tuleks hoolikalt dokumenteerida uurimisprotokollis nimetatud teaduslikud tõendid.

1.2 MÕISTED

Arengutoksikoloogia – selliste areneva organismi kahjulike mõjude uuring, mis võivad tuleneda kokkupuutest enne viljastumist, sünnieelse arengu ajal või sünnijärgselt kuni seksuaalse küpsuse eani. Arengutoksikoloogia peamised ilmingud on: 1) organismi surm, 2) strukturaalsed kõrvalekalded, 3) muundunud kasv ja 4) funktsionaalsed puudujäägid. Arengutoksikoloogiale viidati varem sageli kui teratoloogiale.

Kahjulik mõju – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda keskkonnaga. Võttes arvesse arengutoksikoloogiat, oma kõige laiemas tähenduses sisaldab see mis tahes mõju, mis segab viljastamise tulemuse normaalset arengut nii enne kui pärast sündi.

Muundunud areng – järglase organi või keha kaalu või suuruse muutumine.

Muundumised (anomaaliad) – strukturaalsed muundumised, mis hõlmavad nii väärarenguid kui ka muutusi (28).

Väärareng/suur kõrvalekalle – strukturaalne muutus, mida peetakse loomale kahjulikuks (võib olla samuti surmav) ja mida juhtub tavaliselt harva.

Muutus/väike kõrvalekalle – strukturaalne muutus, millel on vähe või ei ole üldse kahjulikku mõju loomadele; võib olla ajutine ja võib esineda suhteliselt sagedasti kontrollpopulatsioonis.

Viljastumise tulemus (conceptus) – viljastunud munaraku derivaatide summa arengu igal etapil viljastumisest kuni sünnini, kaasa arvatud lootevälised kestad ning embrüo või loode.

Implantatsioon (nidatsioon) – lootepõiekese kinnitumine emaka epiteelkoele, kaasa arvatud selle tungimine läbi emakaepiteeli, ning selle kinnitumine emakalimaskestale.

Embrüo – organismi varane või arengustaadium, eelkõige munaraku viljastumise tulemus pärast pikitelje ilmumist ja seni, kuni kõik suuremad struktuurid on olemas.

Embrüotoksilisus – embrüo tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või elujõulisust kahjustav.

Loode – sündimata järglane embrüojärgsel perioodil.

Lootetoksilisus – loote tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või elujõulisust kahjustav.

Abort – viljastumise tulemuse (embrüo või mitteelujõulise loote) enneaegne väljumine emakast.

Resorptsioon – viljastumise tulemus (conceptus), kes pärast emakasse istutamist sureb või on või resorbeerub või on resorbeerunud.

Varajane resorptsioon – tõendid implantatsiooni kohta ilma äratuntava embrüo/looteta

Hiline resorptsioon – surnud embrüo või väliste degeneratiivsete muutustega loode

NOAEL – lühend täheldamata-kahjuliku-mõju taseme kohta ja see on kõrgeim annus- või kokkupuutetase, kus ei ole täheldatud kahjulikke, töötlemisega seotud leide.

1.3 VÕRDLUSAINE

Puudub.

1.4 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

Tavaliselt manustatakse katseainet tiinetele loomadele vähemalt alates implantatsioonist kuni ühe päevani enne ettemääratud tapmist, mis peaks olema niipalju kui võimalik tavalise sünnitustähtaja lähedal, et ei läheks andmed kaduma varase sünnituse tõttu. Katsemeetod ei ole mõeldud vaid uurima organogeneesi perioodi (nt närilistel 5.–15. päev ja küülikutel 6.–18. päev), vaid samuti kogu tiinusperioodi aegseid mõjusid alates enne implantatsiooni ja lõppedes päev enne keisrilõiget. Natuke enne keisrilõiget emasloomad tapetakse, emakasisu uuritakse ning loodetele antakse hinnang väliselt nähtavate anomaaliate kohta ning pehme koe ja skeletimuutuste kohta.

1.5 KATSEMEETODI KIRJELDUS

1.5.1 Loomaliikide valik

On soovitav, et katse tehtaks kõige sobivamate liikidega ja et kasutataks laboriliike ja -liine, mida tavaliselt kasutatakse sünnieelse arengutoksilisuse uurimiseks. Eelistatud näriliste liik on rott ja eelistatud muude kui näriliste liik on küülik. Tuleks põhjendada seda, kui kasutatakse muid liike.

1.5.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimused

Loomade katseruumi temperatuur peaks närilistel olema 22 °C (± 3o) ja küülikutel 18 °C (± 3o). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal peaks see olema 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.

Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kuna paaritunud loomade puhul eelistatakse eraldi hoidmist, on samuti lubatud väikesearvulistes rühmades hoidmine.

1.5.3 Loomade ettevalmistamine

Tuleks kasutada terveid loomi, kes on harjutatud laboritingimustega vähemalt 5 päeva ja keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik olema ühesuguse kaalu ja vanusega. Noori täiskasvanud ja sünnitamata emasloomi tuleks kasutada iga annusmäära juures. Emasloomad tuleks paaritada sama liigi ja liini isasloomadega ning õdede-vendade paaritamist tuleks vältida. Näriliste puhul on tiinuse 0. päev päev, mil tupekorki ja/või spermat jälgiti; küülikute puhul on 0. päev tavaliselt suguühte või kunstliku viljastamise päev, kui kasutatakse sellist tehnikat. Paaritunud loomad määratakse erapooletult kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne tunnusnumber. Paaritunud emasloomad tuleks erapooletult jagada kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse ning kui emasl