6.

VII lisa asendatakse järgmiselt: „VII LISA 2-GLÜTSERÜÜLMONOPALMITAADI PROTSENDILISE SISALDUSE MÄÄRAMINE 1. EESMÄRK JA RAKENDAMISALA Käesoleva meetodiga määratakse triglütseriidide 2. positsioonis oleva palmitiinhappe protsendilist sisaldust 2-glütserüülmonopalmitaadi hindamise abil. Seda meetodit saab kasutada toatemperatuuril (20 °C) vedelate taimeõlide puhul. 2. PÕHIMÕTE Pärast õliproovi ettevalmistamist lastakse proovil reageerida pankrease lipaasiga – toimub triglütseriidi molekuli spetsiifiline osaline hüdrolüüs 1. ja 3. positsioonis, mille tulemusena tekivad 2-monoglütseriidid. 2-glütserüülmonopalmitaadi sisaldus monoglütseriidi fraktsioonis määratakse pärast silaanimist kapillaarkolonn-gaasikromatograafia abil. 3. KASUTATAVAD SEADMED JA MATERJALID 3.1. 25milliliitrine Erlenmeyeri kolb 3.2. 100-, 250- ja 300milliliitrised keeduklaasid 3.3. Klaasist kromatograafiakolonn sisediameetriga 21–23 mm ja pikkusega 400 mm, mis on varustatud klaasfilterketta ja kraaniga 3.4. Gradueeritud 10-, 50-, 100- ja 200milliliitrised mõõtesilindrid 3.5. 100- ja 250milliliitrised ümarkolvid 3.6. Pöördaurusti 3.7. 10milliliitrised lihvkorgiga tsentrifuugitopsid, millel on kooniline põhi 3.8. Tsentrifuug tööks 10- ja 100milliliitriste tsentrifuugitopsidega 3.9. Termostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 40 ± 0,5 °C 3.10. Gradueeritud 1- ja 2milliliitrised pipetid 3.11. 1milliliitrine hüpodermiline süstal 3.12. 100mikroliitrine mikrosüstal 3.13. 1 000 milliliitrine jaotuslehter 3.14. Kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab proovi otse külmalt kolonni süstimist, ja ahjuga, mis hoiab soovitud temperatuuri 1 °C täpsusega 3.15. Külminjektor proovi viimiseks otse kolonni 3.16. Leekionisatsioondetektor ja elektromeeter 3.17. Koos elektromeetriga kasutatav integraatormeerik, mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberi kiirust saab muuta 3.18. Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis sobib tööks kuni 370 °C juures ja mis on seestpoolt kaetud 5 % metüülpolüsiloksaani või fenüül-metüülpolüsiloksaani kihiga, mille paksus on 0,10–0,30 μm 3.19. Vähemalt 7,5 cm pikkune 10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht 4. REAKTIIVID 4.1. Silikageel tera suurusega 0,063–0,200 mm (sõelaava 70–280), mis on ette valmistatud järgmisel viisil. Silikageel pannakse portselankaussi, kuivatatakse kuivatuskapis 160 °C juures 4 tundi, lastakse eksikaatoris jahtuda toatemperatuurini. Lisatakse vett koguses, mis vastab 5 % le silikageeli massist, tehes seda järgmisel viisil: 500milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi kaalutakse 152 g silikageeli ja lisatakse 8 g destilleeritud vett, suletakse korgiga ja segatakse ettevaatlikult, et tagada vee ühtlane jaotumine. Enne kasutamist lastakse seista vähemalt 12 tundi. 4.2. n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks 4.3. Isopropanool 4.4. Isopropanooli vesilahus (mahusuhe 1:1) 4.5. Pankrease lipaas. Kasutatava lipaasi aktiivsus peab olema vahemikus 2,0–10 lipaasiühikut mg kohta (müügilolevate lipaaside aktiivsus on 2–10 ühikut ensüümi mg kohta) 4.6. Puhverlahus: 1 M tris-hüdroksümetüülaminometaani lahuse pH reguleeritakse potentsiomeetriga kontrollides väärtusele 8, lisades selleks kontsentreeritud soolhapet (mahusuhe 1:1) 4.7. Naatriumkolaat, ensüümikvaliteediga, 0,1 % vesilahus (lahus tuleb ära kasutada 15 päeva jooksul pärast valmistamist) 4.8. Kaltsiumkloriid, 22 % vesilahus 4.9. Dietüüleeter, kromatograafias kasutamiseks 4.10. Elueerimislahus: n-heksaani ja dietüüleetri segu (mahusuhe 87:13) 4.11. Naatriumhüdroksiid, 12massiprotsendiline lahus 4.12. Fenoolftaleiin, 1 % lahus etanoolis 4.13. Kandegaas: vesinik või heelium gaasikromatograafias kasutamiseks 4.14. Abigaasid: kuiv vesinik, vähemalt 99 % puhtusega, ei tohi sisaldada orgaanilisi aineid; õhk kromatograafias kasutamiseks, sama puhtusastmega 4.15. Silaanimisreaktiiv: püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segu (mahusuhe 9:3:1). (Müügil on vastavad valmissegud. Kasutada võib ka muid silaanimisreaktiive, näiteks bistrimetüülsilüültrifluoroatsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaani, mis on lahustatud samas koguses veevabas püridiinis.) 4.16. Standardproovid: puhtad monoglütseriidid või proovile sarnaste mahusuhetega monoglütseriidide segud, mille teadaolevad mahusuhted on samad kui proovil. 5. TÖÖ KÄIK 5.1. Proovi ettevalmistamine 5.1.1. Õlisid, milles vabade hapete sisaldus on alla 3 %, ei ole vaja neutraliseerida enne kromatografeerimist silikageelkolonnis. Õlid, mille vabade hapete sisaldus on suurem kui 3 %, tuleb neutraliseerida vastavalt punktile 5.1.1.1. 5.1.1.1. 1 000 milliliitrisesse jaotuslehtrisse (3.13) kallatakse 50 g õli ja 200 ml n-heksaani. Lisatakse 100 ml isopropanooli ja selline kogus 12 % naatriumhüdroksiidi (4.11), mis on 5 % suurem kui vabade hapete kogus õlis. Loksutatakse tugevasti 1 minuti jooksul. Lisatakse 100 ml destilleeritud vett, loksutatakse uuesti ja lastakse seista. Pärast kihistumist eemaldatakse alumine kiht, mis sisaldab seepe. Eemaldatakse ka võimalikud vahepealsed kihid (lima ja mittelahustuvad ained). Neutraliseeritud õli lahust heksaanis pestakse järjestikuste 50–60milliliitriste isopropanooli vesilahuse (mahusuhe 1:1) (4.4) kogustega kuni fenoolftaleiini roosa värvuse kadumiseni. Vaakumdestilleerimisega (näiteks pöördaurusti abil) eemaldatakse suurem osa heksaanist ja õli kantakse üle 100milliliitrisesse ümarkolbi (3.5). Õli kuivatatakse vaakumis kuni lahusti täieliku eemaldamiseni. Selle toimingu tulemusena peab õli happelisus jääma alla 0,5 %. 5.1.2. 1,0 g eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud õli pannakse 25milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) ja lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Enne kromatografeerimist silikageelkolonnis lastakse lahusel vähemalt 15 minutit seista. Kui lahus on hägune, tsentrifuugitakse see, et luua optimaalsed tingimused kromatograafia jaoks. (On lubatud kasutada müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid (500 mg)). 5.1.3. Kromatograafiakolonni valmistamine Kolonni (3.3) kallatakse ligikaudu 30 ml elueerimislahust (4.10), kolonni alumisse otsa viiakse klaaspulga abil vatitükk ja pressitakse seda õhu eemaldamiseks. Keeduklaasis valmistatakse suspensioon 25 g silikageelist (4.1) ja ligikaudu 80 ml elueerimislahusest; suspensioon kallatakse lehtri abil kolonni. Kontrollitakse, et kogu silikageel oleks viidud kolonni, loputatakse seda elueerimislahusega (4.10), avatakse kraan ja lastakse vedelikul voolata, kuni silikageeli kohale jääb ligikaudu 2 mm vedelikku. 5.1.4. Kolonnkromatograafia 25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt 1,0 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Proov lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Lahus kantakse üle punkti 5.1.3 kohaselt valmistatud kromatograafiakolonni. Tuleb vältida kolonnitäidise pinna liigutamist. Avatakse kraan ja proovi lahusel lastakse välja voolata seni, kuni tase jõuab silikageeli tasemeni. Elueeritakse 150 ml elueerimislahusega. Elueerimislahust lisatakse kiirusega 2 ml/min (150 ml lisamine kolonni võtab aega ligikaudu 60–70 min). Eluaat kogutakse eelnevalt kaalutud 250milliliitrisesse ümarkolbi. Lahusti aurustatakse vaakumis, viimased lahusti jäljed eemaldatakse lämmastikuvoolus. Ümarkolb kaalutakse ja arvutatakse eraldatud aine kogus. (Juhul kui kasutatakse müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid, toimitakse järgmiselt: 1 ml lahust (5.1.2) viiakse padrunitesse, mis on eelnevalt ette valmistatud 3 ml n-heksaaniga. Pärast lahuse nõrgumist kolonni elueeritakse 4 ml n-heksaani-dietüüleetri lahusega (mahusuhe 9:1). Eluaat kogutakse 10milliliitrisesse katseklaasi ja aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks. Kuivaine hüdrolüüsitakse pankrease lipaasiga (5.2). Oluline on kontrollida rasvainete sisaldust enne ja pärast SPE-padruni kasutamist). 5.2. Hüdrolüüs pankrease lipaasiga 5.2.1. Tsentrifuugitopsi kaalutakse 0,1 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Lisatakse 2 ml puhverlahust (4.6), 0,5 ml naatriumkolaadi lahust (4.7) ja 0,2 ml kaltsiumkloriidi lahust; pärast iga lahuse lisamist segatakse hoolikalt. Tops suletakse lihvkorgiga ja asetatakse termostaati temperatuuriga 40 + 0,5 °C. 5.2.2. Lisatakse 20 mg lipaasi, segatakse hoolikalt (vältides korgi kokkupuutumist lahusega) ning asetatakse tops täpselt 2 minutiks termostaati, seejärel võetakse see termostaadist välja, loksutatakse tugevasti täpselt ühe minuti jooksul ning lastakse jahtuda. 5.2.3. Lisatakse 1 ml dietüüleetrit, suletakse tops korgiga ja loksutatakse tugevasti, seejärel segu tsentrifuugitakse ning eetrilahus kantakse mikrosüstla abil puhtasse ja kuiva topsi. 5.3. Silaanitud ühendite valmistamine ja gaasikromatograafia 5.3.1. Mikrosüstla abil viiakse 100 μl lahust (5.2.3) 10milliliitrisesse koonilise põhjaga topsi. 5.3.2. Lahusti eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu all, lisatakse 200 μl silaanimisreaktiivi (4.15), tops suletakse korgiga ja lastakse seista 20 minuti jooksul. 5.3.3. 20 minuti pärast lisatakse 1–5 ml n-heksaani (sõltuvalt kromatograafia läbiviimise tingimustest) – saadav lahus on valmis gaasikromatograafia läbiviimiseks. 5.4. Gaasikromatograafia Töö põhitingimused on järgmised: — injektori (on-column-injektor) temperatuur on madalam lahusti keemistemperatuurist (68 °C); — detektori temperatuur: 350 °C; — kolonni temperatuur: ahju temperatuuri muudetakse järgmise programmi kohaselt: 60 °C 1 minuti jooksul, temperatuuri tõstetakse 15 °C minutis kuni temperatuurini 180 °C, seejärel 5 °C minutis kuni temperatuurini 340 °C, 340 °C 13 minuti jooksul; — kandegaas: vesinik või heelium, mille lineaarkiirust reguleeritakse nii, et saada joonisel 1 kujutatud lahutus; triglütseriidi C54 retentsiooniaeg peab olema 40 + 5 minutit (vt joonis 2); (Need töö põhitingimused on ligikaudsed. Töö teostaja peab neid soovitud tulemuste saamiseks kohandama. 2-glütserüülmonopalmitaadi piigi kõrgus peab olema vähemalt 10 % registreerimisseadme skaala ulatusest.); — kolonni süstitava aine kogus on 0,5–1 μl n-heksaani lahust (5 ml) (5.3.3). 5.4.1. Piikide määramine Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimusel analüüsitud monoglütseriidide standardsegude puhul saadud tulemustega. 5.4.2. Kvantitatiivne hindamine Elektroonilise integraatori abil leitakse iga piigi pindala. 6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE Glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus arvutatakse vastava piigi pindala ja monoglütseriidide piikide kogupindala suhtena (vt joonis 2) vastavalt järgmisele valemile: Gycéril monopalmitate (%): kus: Ax = glütserüülmonopalmitaadi piigi pindala; ΣA = monoglütseriidide piikide kogupindala. Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega. 7. ANALÜÜSI PROTOKOLL Analüüsi protokollis tuleb esitada järgmine teave: — viide käesolevale meetodile; — kogu teave, mis on vajalik proovi täielikuks identifitseerimiseks; — analüüsi tulemus; — kõik kõrvalekaldumised käesolevast meetodist, kas asjaomaste poolte kokkuleppe tõttu või muudel põhjustel; — andmed laboratooriumi kohta, analüüsi läbiviimise kuupäev ja analüüsi läbiviimise eest vastutavate isikute allkirjad. Joonis 1 Silaanimisreaktsiooni saaduste kromatogramm (rafineeritud oliiviõlile on lisatud 20 % täielikult esterdatud õli, segu on töödeldud lipaasiga ja reaktsioonisaadused on silaanitud) Joonis 2 Kromatogramm: A) esterdamata oliiviõli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silüülimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem. Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %. Kromatogramm: B) esterdatud õli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silaanimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem. Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %. 8. MÄRKUSED Märkus 1. LIPAASI VALMISTAMINE Müügil on rahuldava aktiivsusega lipaase. Lipaasi saab valmistada ka laboris järgmisel viisil: 5 kg värsket seapankreast jahutatakse temperatuurini 0 °C. Eemaldatakse tahke rasvkude ja seda ümbritsev sidekude ning pankreas peenestatakse lõikenugadega peenestajas kuni ühtlase vedela massi saamiseni. Saadud massi segatakse 4–6 tunni jooksul 2,5 liitri veevaba atsetooniga, seejärel tsentrifuugitakse. Saadud jääki ekstraheeritakse veel kolm korda sama koguse veevaba atsetooniga, seejärel kaks korda sama koguse atsetooni/dietüüleetri seguga (mahusuhe 1:1) ning veel kaks korda dietüüleetriga. Saadud jääki kuivatatakse 48 tunni jooksul vaakumis; tulemusena saadakse stabiilne pulber, mida on võimalik külmkapis kuivas pikemaajaliselt hoida. Märkus 2. LIPAASI AKTIIVSUSE KONTROLLIMINE Valmistatakse oliiviõli emulsioon järgmisel viisil: Mikseris segatakse 10 minuti jooksul järgmist segu: 165 ml kummiaraabiku lahust kontsentratsiooniga 100 g/l, 15 g purustatud jääd ja 20 ml eelnevalt neutraliseeritud oliiviõli. 50milliliitrisesse keeduklaasi viiakse 10 ml saadud emulsiooni, seejärel 0,3 ml naatriumkolaadi lahust kontsentratsiooniga 0,2 g/ml ja 20 ml destilleeritud vett. Keeduklaas asetatakse termostaati temperatuuriga 37 °C, lahusesse viiakse pH-meetri elektroodid ja spiraalsegaja. Büreti abil lisatakse tilkhaaval naatriumhüdroksiidi 0,1 N lahust, kuni pH saavutab väärtuse 8,3. Lisatakse teatav kogus lipaasi suspensiooni vees (0,1 g/ml lipaasi). Kui pH-meeter näitab pH väärtust 8,3, käivitatakse stopper ja hakatakse tilkhaaval lisama naatriumhüdroksiidi lahust sellise kiirusega, et hoida pH-d väärtusel 8,3. Iga minuti möödudes märgitakse üles selleks kulunud lahuse kogus. Andmed kantakse graafikule, võttes abstsissteljeks ajatelje ja kandes ordinaatteljele 0,1 N leelise lahuse kogused milliliitrites, mis on kulunud pH väärtuse hoidmiseks konstantsena. Graafik peab olema lineaarne. Lipaasi aktiivsus, mida väljendatakse lipaasi ühikutes mg kohta, arvutatakse järgmise valemi abil: kus: A aktiivsus lipaasi ühikutes mg kohta; V 0,1 N naatriumhüdroksiidi lahuse kulu milliliitrites minuti kohta (arvutatud graafiku alusel); N naatriumhüdroksiidi lahuse normaalsus; m prooviks võetud lipaasi mass, mg. Lipaasi ühik on määratletud kui ensüümi kogus, mis vabastab 10 mikroekvivalenti hapet ühe minuti jooksul.”