6)

Lisatakse järgmised peatükid C.31–C.46: „ C.31. KATSE MAISMAATAIMEDEGA: TÄRKAMINE JA SEEMIKU KASV SISSEJUHATUS 1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 208 (2006). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut ja kaaluda nende kasutatavust regulatiivsete vajaduste rahuldamiseks. Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi abil hinnatakse kemikaalide võimalikku mõju seemikute tärkamisele ja kasvule. Meetod ei hõlma kroonilist mõju ega mõju paljunemisvõimele (st seemnete valmimisele, õitsemisele, viljade küpsemisele). Et tagada sobiva katsemeetodi kasutamine, tuleb arvesse võtta uuritava kemikaali omadusi ja kokkupuutetingimusi (näiteks tuleks metallide/metalliühendite puhul arvesse võtta nendega seotud vastasioonide ja pH mõju) (1). Käesolev katsemeetod ei hõlma taimede kokkupuudet kemikaaliaurudega. Meetod on kasutatav üldotstarbeliste kemikaalide, biotsiidide ja taimekaitsevahendite (pestitsiidide) mõju hindamiseks. See on välja töötatud olemasolevate meetodite põhjal (2, 3, 4, 5, 6, 7). Samuti võeti arvesse taimedega tehtavaid katseid käsitlevaid muid allikaid (8, 9, 10). Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites. KATSE PÕHIMÕTE 2. Katsega hinnatakse kõrgemate taimede seemikute tärkamisele ja varajasele kasvule avalduvat mõju kokkupuutel mullas (või muus sobiva koostisega pinnases) esineva uuritava kemikaaliga. Seemned viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga töödeldud pinnasega ja neile avalduvat mõju hinnatakse tavaliselt 14–21 päeva jooksul pärast 50 % seemikute tärkamist kontrollrühmas. Katses mõõdetavad näitajad on silmaga hinnatav tärkamine, võrsete kuivmass (või märgmass) ja teatud juhtudel võrsete kõrgus, samuti silmaga hinnatav kahjulik mõju taime eri osadele. Neid mõõtmistulemusi ja vaatlusi võrreldakse kemikaaliga mitte kokku puutunud kontrolltaimede vastavate näitajatega. 3. Olenevalt eeldatavast kokkupuuteviisist viiakse uuritav kemikaal mulda (või kunstlikku pinnasesse) või töödeldakse sellega mullapinda, vastavalt sellele, kumb kemikaaliga kokkupuutumise viis peegeldab võimalikku tegelikku olukorda. Mulda viimise korral töödeldakse kogu mulda korraga. Pärast töötlemist jaotatakse muld pottidesse ja seejärel pannakse asjaomase taimeliigi seemned mulda. Kui kemikaaliga töödeldakse mullapinda, tehakse seda pottides oleva mullaga pärast seemnete muldapanekut. Seejärel tagatakse katseüksustele (kontrollid ja töödeldud muld koos seemnetega) sobivad tingimused seemnete idanemise ja taimede kasvu võimaldamiseks. 4. Katse eesmärgist sõltuvalt võib selle läbi viia koguse ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera saamiseks või piirsisalduskatsena, milles kasutatakse ühte kindlat kontsentratsiooni või koguselist määra. Kui ühel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhineva katse tulemustest nähtub, et mürgisus ületab teatud taseme (nt täheldatakse suuremat mõju kui x %), tehakse mürgisuse ülem- ja alampiiri määramiseks kogusevahemiku leidmise katse ja seejärel mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse koguse ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera koostamiseks. Sobiva statistilise analüüsimeetodiga leitakse kõige tundlikuma(te) vaadeldava(te) näitaja(te) alusel efektiivne kontsentratsioon ECx või efektiivne kogus ERx (nt EC25, ER25, EC50, ER50). Kõnealuse katsega saab kindlaks teha ka täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC) ja vähima täheldatavat toimet avaldava kontsentratsiooni (LOEC). TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA 5. Kemikaaliga kokkupuutumise eeldatava viisi kindlakstegemisel ja katseplaani koostamisel on kasu järgmisest teabest: struktuurivalem, puhtus, lahustuvus vees, lahustuvus orgaanilistes lahustites, jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool/vesi, aururõhk, sorbeeruvus pinnases, keemiline püsivus vees ja valguse käes ning biolagunduvus. KATSE NÕUETEKOHASUS 6. Katse loetakse nõuetekohaseks, kui kontrollrühmas on täidetud järgmised kriteeriumid: — seemikute tärkamine on vähemalt 70 %; — seemikutel ei täheldata nähtavaid fütotoksilisuse ilminguid (nt kloroos, nekroos, närbumine, varre või lehtede moondumine) ning varieeruvus taimede kasvus ja morfoloogias jääb konkreetsele liigile iseloomulikku vahemikku; — tärganud seemikute keskmine ellujäämise määr katse vältel on kontrollrühmas vähemalt 90 %; — keskkonnatingimused on konkreetse liigi puhul ühesugused ning kasvukeskkond sisaldab ühesuguses koguses ja samast allikast pärit mulda, kasvu toetavaid koostisosi või substraati. VÕRDLUSKEMIKAAL 7. Võrdluskemikaali abil võib korrapäraselt kontrollida, kas katsetulemused, konkreetsete katsetaimede reaktsioon ja katsetingimused on aja jooksul üldjoontes samaks jäänud. Teise võimalusena võib kasutada varasemaid kontrolltaimede biomassi- või kasvuandmeid, mis võimaldavad teha laboritevahelist kvaliteedikontrolli ja hinnata katsesüsteemi usaldusväärsust konkreetses laboris. MEETODI KIRJELDUS Looduslik muld ja kunstlik substraat 8. Taimi võib kasvatada pottides, kasutades liivsavimulda või kerget või keskmist saviliivmulda, mis sisaldab kuni 1,5 % orgaanilist süsinikku (umbes 3 % orgaanilist ainet). Võib kasutada ka müügilolevat potimulda või sünteetilist mullasegu, mis sisaldab kuni 1,5 % orgaanilist süsinikku. Savimuldasid ei tohiks kasutada, kui on teada, et uuritava kemikaali afiinsus savi suhtes on suur. Põllumuld tuleks homogeensuse tagamiseks ja suurte osakeste kõrvaldamiseks selliselt läbi sõeluda, et osakeste suurus ei oleks üle 2 mm. Tuleks esitada kasutusvalmis mulla tüüp ja lõimis, orgaanilise süsiniku protsentuaalne sisaldus, pH ja soolasisaldust kajastav elektrijuhtivus. Muld tuleks klassifitseerida vastavalt standardsele klassifitseerimissüsteemile (11). Mulla patogeenide mõju vähendamiseks võib mulla pastöriseerida või seda kuumtöödelda. 9. Loodusliku mulla puhul võib selle füüsikalis-keemiliste omaduste ja mikroobipopulatsioonide varieeruvuse tõttu olla tulemuste varieeruvus suurem ja nende tõlgendamine raskem. Need muutujad mõjutavad omakorda mulla niiskusmahtuvust, kemikaalide sidumise võimet, aereeritust ning toitainete ja mikroelementide sisaldust. Lisaks nimetatud füüsikalistele teguritele varieeruvad ka mulla keemilised omadused, näiteks pH ja redokspotentsiaal, mis võivad mõjutada uuritava kemikaali biokättesaadavust (12, 13, 14). 10. Taimekaitsevahendite mõju hindamisel ei kasutata tavaliselt kunstlikke substraate, kuid neist võib olla kasu üldotstarbeliste kemikaalide mõju hindamisel või juhul, kui soovitakse minimeerida loodusliku mulla varieeruvust ja parandada katsetulemuste võrreldavust. Kasutatavad substraadid peaksid koosnema inertsest materjalist, mille puhul vastasmõju uuritava kemikaali, kasutatava lahusti või mõlemaga on minimaalne. On leitud, et sobivad inertsed materjalid, mis absorbeerivad uuritavat kemikaali minimaalselt ja mille puhul on tagatud kemikaali maksimaalne kättesaadavus seemikule juurte kaudu, on happega pestud kvartsliiv, mineraalvill ja klaashelmed (nt läbimõõduga 0,35–0,85 mm). Sobimatud substraadid on näiteks vermikuliit, perliit ja muud tugevalt absorbeerivad materjalid. Tuleks tagada taimekasvu soodustavate toitainete olemasolu, et taimedel ei tekiks toitainevaegusest tingitud stressi, ning võimaluse korral tuleks selle hindamiseks teha kontrolltaimedele keemiline analüüs või neid visuaalselt hinnata. Katseliigi valimise kriteeriumid 11. Valitavad liigid peaksid esindama piisavalt laia spektrit, näiteks lähtuvalt nende taksonoomilisest kuuluvusest taimeriigis, nende levikust, arvukusest, elutsükliga seotud liigispetsiifilistest omadustest ja looduslikust levialast, et oleks võimalik vaadelda rida eri reaktsioone uuritavale kemikaalile (8, 10, 16, 17, 18, 19, 20). Võimaliku katseliigi valimisel tuleks arvesse võtta järgmisi kriteeriume: — asjaomase liigi seemned on ühetaolised ja usaldusväärsest standardsest seemnepangast hõlpsalt kättesaadavad ning nende puhul on tagatud järjepidev, kindel ja ühtlane seemnete idanemine ja seemikute ühetaoline kasv; — asjaomased taimed sobivad laborikatsetes kasutamiseks ning nendega saadavad tulemused on usaldusväärsed ja nii ühes uurimislaboris kui ka eri laborites reprodutseeritavad; — katseliigi tundlikkus peaks vastama keskkonnas kemikaaliga kokku puutuvate taimede puhul täheldatavale tundlikkusele; — asjaomaseid taimi on teataval määral kasutatud varasemates mürgisuse hindamise katsetes ja nende kasutamisel näiteks herbitsiididega tehtavates biokatsetes, raskmetallide mõju või soolsusest või mineraalainetest tingitud stressi hindamise katsetes või allelopaatiauuringutes on täheldatud tundlikkust paljude stressiallikate suhtes; — käesoleva katsemeetodi puhul kasutatavad kasvutingimused on asjaomastele taimedele sobivad; — asjaomased taimed vastavad katse nõuetekohasuse kriteeriumidele. Mõned varem kõige sagedamini kasutatud katseliigid on loetletud 2. liites ja võimalikud põllumajanduskultuuride hulka mittekuuluvad liigid 3. liites. 12. Katses kasutatavate liikide arv sõltub asjakohastest õiguslikest nõuetest ja seepärast seda käesolevas katsemeetodis ei määratleta. Uuritava kemikaaliga töötlemine 13. Kemikaaliga töötlemiseks tuleks kasutada sobivat kandeainet (nt vesi, atsetoon, etanool, polüetüleenglükool, kummiaraabik, liiv). Katses võib kasutada ka segusid (kindlaksmääratud koostisega tooted või valmistised), mis sisaldavad toimeaineid ja eri abiaineid. Kemikaali viimine mulda või kunstlikku substraati 14. Vees lahustuvad või vees suspensiooni moodustavad kemikaalid võib lisada veele ja seejärel segada saadud lahuse sobiva segamisseadme abil mullaga. Sellist tüüpi katse võib olla sobiv juhul, kui kokkupuude kemikaaliga toimub mulla või mullapoorides oleva vee kaudu ja soovitakse hinnata kemikaali omastamist juurte kaudu. Uuritava kemikaali lisamisel ei tohiks vedeliku kogus ületada mulla veemahutavust. Lisatav veekogus peaks olema iga katses kasutatava kontsentratsiooni puhul sama ning piiratud, et hoida ära mullaosakeste kokkukleepumist. 15. Vees raskesti lahustuvad kemikaalid tuleks lahustada sobivas lenduvas lahustis (nt atsetoon või etanool) ja segada liivaga. Seejärel saab lahusti liivast õhujoa abil kõrvaldada, segades liiva samal ajal pidevalt. Töödeldud liiv segatakse katses kasutatava mullaga. Täiendava kontrollina kasutatakse mulda, millele lisatakse üksnes lahustiga töödeldud liiva. Täiendava kontrolli ja iga kasutatava kontsentratsiooni puhul lisatakse ühesugune kogus liiva, mis on lahustiga segatud ja millest lahusti on kõrvaldatud. Kui uuritav tahke kemikaal on lahustumatu, segatakse see sobiva segamisseadme abil kuiva mullaga. Seejärel viiakse muld pottidesse ja sellesse külvatakse viivitamata seemned. 16. Kui mulla asemel kasutatakse kunstlikku substraati, võib vees lahustuva kemikaali lahustada vahetult enne katse algust toitainelahuses. Kui kemikaal on vees lahustumatu, kuid seda on võimalik lahusti abil vees suspendeerida, tuleks see lisada toitainelahusesse koos lahustiga. Vees lahustumatu kemikaal, mille jaoks ei ole mittemürgist vees lahustuvat lahustit, tuleks lahustada sobivas lenduvas lahustis. Lahus segatakse liiva või klaashelmestega, segu pannakse vaakumpöördaurustisse, lahustil lastakse aurustuda ning selle tulemusena saadakse ühtlaselt kemikaaliga kaetud liiv või helmed. Enne pottide täitmist tuleks kemikaal teatava koguse kaalutud helmeste pinnalt sama orgaanilise lahustiga ekstraheerida ja seda analüüsida. Mullapinna töötlemine 17. Taimekaitsevahendite puhul kasutatakse uuritava kemikaaliga töötlemiseks sageli katselahuse pihustamist mullapinnale. Kõnealuste katsete tegemiseks kasutatavad seadmed, sealhulgas uuritava kemikaali lahuse valmistamiseks ja mullapinnale kandmiseks kasutatavad seadmed, peaksid olema sellise ehituse ja töökindlusega, et nende abil saaks teha täpseid katseid, mille puhul oleks tagatud katvuse reprodutseeritavus. Katvus peaks olema kõikjal mullapinnal ühtlane. Tuleks hoolikalt jälgida, et kemikaal ei adsorbeeruks seadmetele (nt plasttorud, lipofiilsed kemikaalid või terasosad ja -detailid) ega reageeriks nendega. Uuritavat kemikaali pihustatakse mullapinnale viisil, millega jäljendatakse tüüpilist töötlemist pihustusseadme abil. Üldjuhul peaks pihustatavad kogused jääma põllumajanduses tavapäraselt kasutatavasse vahemikku ning asjaomased kogused (vee hulk jne) tuleks märkida katseprotokolli. Tuleks valida sellist tüüpi otsik, mille puhul mullapind saaks ühtlaselt kaetud. Lahusti või kandeaine kasutamise korral tuleks moodustada täiendav rühm kontrolltaimi, mille puhul lisatakse üksnes lahustit/kandeainet. Kindlaksmääratud koostisega taimekaitsevahendite puhul ei ole see vajalik. Uuritava kemikaali sisalduse või koguselise määra kontrollimine 18. Kasutatavaid kontsentratsioone või koguselisi määru tuleb asjakohase analüüsi teel kontrollida. Lahustuva kemikaali puhul võib kõikide katses kasutatavate kontsentratsioonide või koguseliste määrade kontrollimiseks analüüsida suurima kontsentratsiooniga katselahust ja dokumenteerida järgnevad lahjendused ning kasutada kemikaaliga töötlemiseks kaliibritud seadmeid (nt klaasist kaliibritud analüüsinõud, kaliibritud pihustusseadmed). Lahustumatu kemikaali puhul tuleb selle sisalduse tõendamiseks registreerida mullale lisatavad uuritava kemikaali kaalutud kogused. Kui on vaja tõendada homogeensust, võib olla vaja mulda analüüsida. KATSE KÄIK Katseplaan 19. Sama taimeliigi seemned külvatakse pottidesse. Seemnete arv poti kohta sõltub liigist, poti suurusest ja katse kestusest. Taimede arv potis peaks olema selline, et katse vältel oleksid tagatud sobivad kasvutingimused ja taimi ei oleks liiga palju. Maksimaalne tihedus peaks olenevalt seemnete suurusest olema 3–10 seemet 100 cm2 kohta. Näiteks on taimede soovitatav tihedus 15-sentimeetrise läbimõõduga potis maisi, sojaoa, tomati, kurgi ja suhkrupeedi puhul 1–2 taime, rapsi ja herne puhul 3 taime ning sibula, nisu ja muude väikese seemnega taimede puhul 5–10 taime. Seemnete ja paralleelpottide arv (paralleelüksusena käsitatakse potti, seepärast ei ole samas potis kasvavad taimed vaadeldavad paralleelidena) peaks olema optimaalse statistilise analüüsi jaoks piisav (21). Tuleks tähele panna, et katseliikidel, mille puhul kasutatakse väiksemat arvu suuri seemneid poti (paralleelüksuse) kohta, on varieeruvus suurem kui katseliikidel, mille puhul on võimalik kasutada suuremat arvu väikseid seemneid poti kohta. Sellist varieeruvust saab minimeerida igasse potti võrdse arvu seemnete külvamisega. 20. Et veenduda, et täheldatav mõju tuleneb üksnes kokkupuutest uuritava kemikaaliga või on üksnes sellega seotud, kasutatakse kontrollrühmi. Sobiv kontrollrühm peaks olema katserühmaga identne kõiges muus peale uuritava kemikaaliga kokkupuute. Kõik samas katses kasutatavad katsetaimed, sealhulgas kontrolltaimed, peaksid pärinema samast allikast. Ebavõrdse jaotuse ärahoidmiseks tuleb katse- ja kontrollpotid määrata juhuslikult. 21. Tuleks hoiduda insektitsiidi või fungitsiidiga kaetud seemnete (st puhitud seemnete) kasutamisest. Mõni reguleeriv asutus lubab siiski kasutada teatud mittesüsteemseid kontaktfungitsiide (nt kaptaan, tiraam) (22). Kui muret teevad seemnetega levivad patogeenid, võib seemneid hoida lühikest aega lahjas, viieprotsendilises hüpokloriti lahuses ning seejärel neid voolava veega korralikult loputada ja need kuivatada. Töötlemine mõne muu taimekaitsevahendiga ei ole lubatud. Katsetingimused 22. Katsetingimused peaksid üldjoontes vastama tingimustele, mis on vajalikud katses kasutatavatesse liikidesse ja sortidesse kuuluvate taimede tavapäraseks kasvuks (katsetingimuste näited on esitatud 4. liites). Tärkavaid taimi tuleks kasvatada kontrollitava keskkonnaga kambris, fütotronis või kasvuhoones kooskõlas hea aiandustavaga. Taimekasvatuseks ette nähtud ruumi kasutamisel hõlmab see tava harilikult temperatuuri, õhuniiskuse, süsihappegaasi sisalduse, valguse (valgustustiheduse, lainepikkuse, fotosünteesiks sobiva kiirguse), valgustusperioodi, kastmisviisi jmt reguleerimist ja piisavalt sagedast (nt igapäevast) registreerimist, et tagada hea taimekasv, mida hinnatakse asjaomase liigi kontrolltaimede kasvu alusel. Kasvuhoones tuleks temperatuuri reguleerida ventilatsiooni-, kütte- ja/või jahutussüsteemi abil. Kasvuhoones tehtava katse puhul soovitatakse üldjuhul kasutada järgmisi tingimusi: — temperatuur: 22 ± 10 °C; — õhuniiskus: 70 ± 25 %; — valgustusperiood: vähemalt 16 tundi; — valgustustihedus: 350 ± 50 μE m– 2 s– 1. Kui valgustustihedus lainepikkuste vahemikus 400–700 nm langeb alla 200 μE m– 2 s– 1, võib olla vaja kasutada lisavalgustust, välja arvatud teatud liikide puhul, mille valgusevajadus on väiksem. Keskkonnatingimusi tuleks katse vältel jälgida ja need registreerida. Taimi tuleks kasvatada mittepoorsetes plast- või glasuuritud pottides, mille alla on paigutatud kandik või alustass. Potte võib korrapäraselt ümber paigutada, et minimeerida kasvukeskkonna tingimuste erinevustest tulenevat varieeruvust taimede kasvus. Potid peavad olema tavapärase kasvu võimaldamiseks piisava suurusega. 23. Taimede elujõulisuse tagamiseks võib mullale lisada toitaineid. Lisatoitainetega varustamise vajaduse ja sageduse üle saab otsustada kontrolltaimede vaatlemise põhjal. Soovitatakse kasutada katsenõude altkastmist (nt klaaskiudnööri abil). Alguses võib siiski kasutada ülaltkastmist, et aidata kaasa seemnete idanemisele ja hõlbustada mullapinna töötlemise puhul kemikaali kandumist mulda. 24. Konkreetsed kasvutingimused peaksid olema katses kasutatava liigi ja uuritava kemikaali jaoks sobivad. Kontrolltaimi ja kemikaaliga kokku puutuvaid taimi tuleks kasvatada samades keskkonnatingimustes, kuid tuleks võtta asjakohased meetmed, et takistada uuritava kemikaali (nt lenduva kemikaali) ülekandumist ühest katserühmast teise ja katserühmast kontrollrühma. Ühel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse 25. Ühel kemikaali kontsentratsioonil või koguselisel määral põhineva katse (piirsisalduskatse) jaoks sobiva kontsentratsiooni või koguselise määra kindlaksmääramisel tuleb arvesse võtta mitut tegurit. Üldotstarbeliste kemikaalide puhul hõlmab see kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi. Taimekaitsevahendite puhul tuleb arvesse võtta uuritava kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi ja kasutusrežiimi, selle maksimaalset kontsentratsiooni või töötlemisel kasutatavat kogust, töötlemiskordade arvu hooaja kohta ja/või kemikaali püsivust. Et teha kindlaks, kas üldotstarbeline kemikaal on fütotoksiline, võib olla asjakohane teha katse maksimaalsel sisaldusel 1 000 mg kuiva mulla kilogrammi kohta. Kogusevahemiku leidmise katse 26. Vajaduse korral võib teha kogusevahemiku leidmise katse, et leida lõplikus koguse ja mõju vahelise sõltuvuse uuringus kasutamiseks sobivad kontsentratsioonid või koguselised määrad. Kogusevahemiku leidmise katses kasutatavad kontsentratsioonid või koguselised määrad tuleks valida suure intervalliga (nt 0,1, 1,0, 10, 100 ja 1 000 mg kuiva mulla kilogrammi kohta). Taimekaitsevahendite puhul võib kontsentratsioonide või koguseliste määrade valimisel lähtuda soovitatavast või maksimaalsest kontsentratsioonist või töötlemisel kasutatavast kogusest ning kasutada sellest näiteks 1/100, 1/10 ja 1/1. Mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse 27. Mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhineva katse eesmärk on teha kindlaks koguse ja mõju vaheline sõltuvus ja määrata vastavalt reguleerivate asutuste nõuetele ECx või ERx väärtus taimede tärkamise, biomassi ja/või visuaalselt hinnatava mõju puhul, kasutades võrdlusalusena kemikaaliga mitte kokku puutuvaid kontrolltaimi. 28. Kontsentratsioonide või koguste arv ja intervall peaks olema piisav, et võimaldada usaldusväärselt hinnata koguse ja mõju vahelist sõltuvust, koostada regressioonivõrrand ja arvutada hinnanguline ECx või ERx väärtus. Valitud kontsentratsioonid või koguselised määrad peaksid hõlmama määratavaid ECx või ERx väärtusi. Kui on näiteks vaja leida EC50 väärtus, on soovitatav kasutada katses koguseid, mille puhul mõju ulatus on 20–80 %. Selle saavutamiseks soovitatakse kasutada lisaks kemikaaliga töötlemata kontrollile vähemalt viit kontsentratsiooni või koguselist määra geomeetrilises jadas, mille tegur ei ole suurem kui kolm. Paralleelpottide arv igas katse- ja kontrollrühmas peaks olema vähemalt neli ja seemnete üldarv vähemalt 20. Teatud taimede puhul, mille seemnete idanevuse määr on väike või mille kasv tavapäraselt varieerub, võib olla vaja kasutada katse statistilise usaldusväärsuse tõstmiseks suuremat arvu paralleelpotte. Kui katses kasutatakse suuremat arvu kontsentratsioone või koguselisi määru, võib paralleelpottide arvu vähendada. Kui soovitakse leida täheldatavat toimet mitteavaldavat kontsentratsiooni, võib olla vaja kasutada vajaliku statistilise usaldusväärsuse saavutamiseks suuremat arvu paralleelpotte (23). Vaatlused 29. Vaatlusperioodi vältel, st 14–21 päeva jooksul pärast 50 % kontrolltaimede (vajaduse korral ka lahustiga kokku puutuvate kontrolltaimede) tärkamist vaadeldakse taimi sageli (vähemalt kord nädalas ja võimaluse korral iga päev) ning jälgitakse tärkamist, visuaalselt hinnatavaid fütotoksilisuse ilminguid ja suremust. Katse lõpus tuleks registreerida tärganud taimede protsentuaalne osakaal ja ellujäänud taimede biomass, samuti silmaga nähtav kahjulik mõju taime eri osadele. See kahjulik mõju hõlmab tärganud seemikute ebanormaalset välimust, kasvu kängumist, kloroosi, värvusemuutusi, suremist ja mõju taimede arengule. Lõpliku biomassi mõõtmiseks võib kasutada ellujäänud taimede võrse lõplikku keskmist kuivmassi; selleks lõigatakse võrse mullapinna tasandilt ära ja kuivatatakse seda 60 °C juures, kuni selle kaal enam ei muutu. Teise võimalusena võib lõpliku biomassi määramiseks kasutada võrse märgmassi. Kui reguleerivad asutused seda nõuavad, võib mõõdetav näitaja olla ka võrse kõrgus. Vaadeldava toksilise mõju määramiseks tuleks kasutada ühtset silmaga nähtavate kahjustuste hindamise süsteemi. Näited kvalitatiivse ja kvantitatiivse visuaalse hindamise kohta on esitatud allikates 23 ja 24. ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE Statistiline analüüs Ühel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse 30. Iga taimeliigi kohta saadud andmete analüüsimiseks tuleks kasutada sobivat statistilist meetodit (21). Tuleks esitada katses kasutatud kontsentratsiooni või koguselise määra puhul täheldatava toime määr või teave selle kohta, et toime jääb allapoole teatavat määra (nt kontsentratsiooni või koguselise määra y puhul täheldatav mõju on < x %). Mitmel kontsentratsioonil või koguselisel määral põhinev katse 31. Koostatakse koguse ja mõju vahelist sõltuvust väljendav regressioonivõrrand. Võib kasutada eri mudeleid: näiteks võib binaarse muutujana käsitletava tärkamise puhul sobida ECx või ERx (nt EC25, ER25, EC50, ER50) väärtuse ja asjaomaste usalduspiiride leidmiseks logit-, probit-, Weibulli, Spearmani-Kärberi või kohandatud Spearmani-Kärberi meetod. Seemikute kasvu (kaalu ja kõrguse) kui lõppnäitajana hinnatava pideva muutuja puhul võib ECx või ERx väärtuse ja vastavate usalduspiiride määramiseks kasutada sobivat regressioonanalüüsi (nt Bruce'i-Versteegi mittelineaarset regressiooni (25)). Võimaluse korral peaks R2 olema kõige tundlikuma liigi puhul alati 0,7 või suurem ja mõju ulatus katses kasutatavate kontsentratsioonide või koguseliste määrade juures hõlmama vahemikku 20–80 %. Kui soovitakse määrata täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon, tuleks eelistada suure usaldusväärsusega statistilisi mudeleid, mille valimisel tuleks lähtuda andmete jaotusest (21, 26). Katseprotokoll 32. Katseprotokollis tuleks esitada katsetulemused koos katsetingimuste üksikasjaliku kirjelduse, tulemusi käsitleva põhjaliku arutelu, andmeanalüüsi tulemuste ja nende põhjal tehtud järeldustega. Tuleks esitada tulemusi käsitlev kokkuvõtlik tabel ja lühikokkuvõte. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave. Uuritav kemikaal: — uuritava kemikaali identifitseerimisandmed ja asjakohased omadused (nt log Pow, lahustuvus vees, aururõhk ning võimaluse korral säilivus ja käitumine keskkonnas); — üksikasjad katselahuse valmistamise ja punkti 18 kohase kasutatavate kontsentratsioonide kontrollimise kohta. Katseliik: — üksikasjalikud andmed katseorganismi kohta: liik/sort, sugukond, teaduslik nimetus ja tavanimetus, võimalikult üksikasjalik teave seemnete päritolu kohta (st tarnija nimi, idanemise protsentuaalne määr, seemnete suurusklass, partii number, seemnete kogumise aasta või kasvuperiood, idanemise hindamise kuupäev), elujõulisus jne; — katses kasutatud ühe- ja kaheiduleheliste liikide arv; — liikide valimise põhjendus; — seemnete hoiustamise, töötlemise ja säilitamise kirjeldus. Katsetingimused: — katseruum (nt kasvukamber, fütotron või kasvuhoone); — katsesüsteemi kirjeldus (nt poti mõõtmed, poti materjal ja mulla kogus); — mulla omadused (mulla lõimis või tüüp: mullaosakeste jaotus ja liigitus, füüsikalised ja keemilised omadused, sealhulgas orgaanilise aine protsentuaalne sisaldus, orgaanilise süsiniku protsentuaalne sisaldus ja pH); — mulla/substraadi (nt muld, kunstlik pinnas, liiv jm) ettevalmistamine enne katset; — toitainete lisamise korral nende kirjeldus; — uuritava kemikaaliga töötlemine: töötlemismeetodi kirjeldus, seadmete, kokkupuutemäärade ja asjaomaste koguste, sealhulgas kemikaalisisalduse kontrollimise kirjeldus, kaliibrimismeetodi kirjeldus ja töötlemise ajal valitsenud keskkonnatingimuste kirjeldus; — kasvutingimused: valgustustihedus (nt fotosünteesiks sobiva kiirguse puhul), valgustusperiood, maksimaalne ja minimaalne temperatuur, kastmisrežiim ja -meetod, väetamine; — seemnete arv poti kohta, taimede arv kemikaali iga koguse puhul, paralleelpottide arv iga kokkupuutemäära puhul; — kontrollide tüüp ja arv (negatiivsed ja/või positiivsed kontrollid, vajaduse korral lahustiga kontrollid); — katse kestus. Tulemused: — tabel, mis sisaldab kõiki lõppnäitajaid iga paralleelpoti, kasutatud kontsentratsiooni või koguselise määra ja liigi kohta; — tärganud taimede arv ja protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühma näitajaga; — taimede mõõdetud biomassi (võrsete kuivmass või märgmass) protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühma näitajaga; — kui mõõdeti võrsete kõrgust, siis selle protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühma näitajaga; — uuritava kemikaali põhjustatud visuaalselt hinnatavate kahjustuste protsentuaalne määr võrreldes kontrollrühmaga ning selliste kahjustuste kvalitatiivne ja kvantitatiivne kirjeldus (kloroos, nekroos, närbumine, varre või lehtede moondumine, samuti sellise mõju puudumine); — kui visuaalselt hinnatavate kahjustuste puhul kasutatakse hindamisskaalat, siis sellise skaala kirjeldus; — ühel kogusel põhineva katse puhul tuleks märkida kahjustuste protsentuaalne määr; — ECx või ERx (nt EC50, ER50, EC25, ER25) väärtus ja asjaomased usalduspiirid. Regressioonanalüüsi tegemise korral esitatakse regressioonivõrrandiga seotud standardviga ja konkreetsete parameetrite (nt tõus, algordinaat) hinnangulise väärtuse standardviga; — täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (ja vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon), kui see on teada; — kasutatud statistiliste meetodite ja eelduste kirjeldus; — graafik eespool kirjeldatud andmete ning koguse ja mõju vahelise sõltuvuse kohta katses kasutatud liigi puhul. Kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja kõik katse ajal täheldatavad ebatavalised ilmingud. KIRJANDUS (1) Schrader, G., Metge, K., ja Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Appl. Soil Ecol. 7: 189–193. (2) Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1993). ISO 11269-1: Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1995). ISO 11269-2: Soil Quality – Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) USA Materjalide Katsetamise Ühing (ASTM) (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) USA Keskkonnakaitseamet (1982). FIFRA, 40CFR, osa 158.540. Alajaotis J, osad 122-1 ja 123-1. (6) USA Keskkonnakaitseamet (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR X31-201 (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1 (1993). Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K. E., ja Keddy, C. J. (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Technical Report Series No. 145. Canadian Wildlife Service (peakorter), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., ja Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 48. (10) Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K., ja Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada. (11) Mulla lõimise klassifitseerimine (USA põllumajandusministeeriumi ja ÜRO Toidu- ja Põllumajandusorganisatsiooni süsteemid): Weed Sci. 33, Suppl. 1 (1985) ja Soil Sci. Soc. Am. Proc. 26: 305 (1962). (12) Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. Väljaandes: Audus, L. J. (toim.), The Physiology and Biochemistry of Herbicides. London, New York, Academic Press, NY, 5. peatükk, lk 163–206. (13) Beall, M. L., Jr., ja Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil. J. Agro. 61: 571–575. (14) Beetsman, G. D., Kenney, D. R., ja Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties. J. Agro. 61: 247–250. (15) USA Toidu- ja Ravimiamet (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 lk, USA Toidu- ja Ravimiamet, Washington, DC. (16) McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L., ja Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Manag. Sci. 58: 1161–1174. (17) Boutin, C., Elmegaard, N., ja Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology 13: 349–369. (18) Boutin, C., ja Rogers, C. A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology 9: 255–271. (19) Boutin, C., ja Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9: 155–271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T. E., Batchelor, S. P., ja Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2532–2541. (21) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis. (22) Hatzios, K. K., ja Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1: 1–63. (23) Hamill, P. B., Marriage, P. B., ja Friesen, G. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Sci. 25: 386–389. (24) Frans, R. E., ja Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. Väljaandes: Truelove, B. (toim.), Research Methods in Weed Science, 2. väljaanne. Southern Weed Science Society, Auburn, lk 15–23. (25) Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1492. (26) Käesoleva lisa peatükk C.33 „Vihmausside (Eisenia fetida / Eisenia andrei) sigivuse katse”. 1. liide Mõisted Toimeaine – aine, millel on ettenähtud spetsiifiline bioloogiline mõju (nt putukatõrje, taimehaiguste tõrje või umbrohutõrje töödeldaval alal); tuntud ka kui tehnilise puhtusastmega toimeaine. Kemikaal – aine või segu. Taimekaitsevahend või pestitsiid – spetsiifilise bioloogilise mõjuga materjal, mida kasutatakse eesmärgiga kaitsta taimi kahjurite (nt seenhaigused, putukad ja konkureerivad taimed) eest. ECx või ERx (vastavalt kontsentratsioon või kogus, mille puhul mõju ulatus on x %)– kontsentratsioon või kogus, mille juures katse lõppnäitajale avalduva ebasoodsa mõju ulatus on x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest (nt EC25/ER25 ja EC50/ER50 tähistavad kontsentratsiooni või koguselist määra, mille puhul seemikute tärkamise määr, võrsete kaal või ellujäänud taimede lõpparv väheneb või visuaalselt hinnatavate kahjustuste määr suureneb vastavalt 25 % ja 50 % võrra). Tärkamine – koleoptiili või idulehe ilmumine mullapinnale. Valmistis – asjaomast toimeainet sisaldav kaubanduslik valmistoode, tuntud ka kui lõppvalmistis (8) ja tüüpiline lõpptoode. Vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) – uuritava kemikaali väikseim kontsentratsioon, mille juures täheldatakse teatavat mõju. Käesoleva katsemeetodi puhul täheldatakse sellisel kontsentratsioonil teatava kokkupuuteperioodi vältel kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju ning selline kontsentratsioon on suurem kui täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon. Muud kui sihttaimed – taimed, mis paiknevad väljaspool sihttaimede ala. Taimekaitsevahendite puhul tähistatakse selle mõistega tavaliselt taimi, mis paiknevad väljaspool kemikaaliga töötlemise ala. Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) – uuritava kemikaali suurim kontsentratsioon, mille juures ei täheldata mingit mõju. Käesoleva katsemeetodi puhul ei täheldata sellisel kontsentratsioonil teatava kokkupuuteperioodi vältel kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju. Fütotoksilisus – asjaomase kemikaali toimel ilmnevad kahjulikud kõrvalekalded taimede tavapärasest välimusest ja kasvust, mida mõõdetakse ja hinnatakse visuaalselt. Paralleelüksus – kontrollrühma ja/või katserühma esindav katseüksus. Käesoleva katsemeetodi puhul on paralleelüksusena määratletud pott. Visuaalne hindamine – silmaga nähtavate kahjustuste hindamine taimede väliskuju, elujõulisuse, väärarengute, kloroosi, nekroosi ja üldise välimuse põhjal võrdluses kontrolltaimedega. Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil. 2. liide Taimekatsetes varem kasutatud liikide loetelu Sugukond Liik Tavanimetus DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Porgand Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Päevalill Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Aedsalat Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Valge sinep Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Hiina kapsas Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Raps Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Peakapsas Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Naeris Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Salatkress Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Redis Chenopodiaceae Beta vulgaris Suhkrupeet Cucurbitaceae Cucumis sativus Kurk Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Sojauba Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Munguba Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Põõsasuba, lattuba, harilik aeduba Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Hernes Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Põld-lambalääts Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Harilik nõiahammas Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Aasristik Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Vikk Linaceae Linum usitatissimum Lina Polygonaceae Fagopyrum esculentum Harilik tatar Solanaceae Solanum lycopersicon Tomat MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Harilik sibul Poaceae (Gramineae) Avena sativa Harilik kaer Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Harilik oder Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Karjamaa-raihein Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Harilik riis Poaceae (Gramineae) Secale cereale Harilik rukis Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Terasorgo, sudaani sorgo Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Harilik nisu Poaceae (Gramineae) Zea mays Harilik mais 3. liide Põllumajanduskultuuride hulka mittekuuluvate võimalike liikide loetelu Võimalike fütotoksilisuse hindamiseks sobivate liikide OECD loetelu Märkus: allpool esitatud tabel sisaldab teavet 52 põllumajanduskultuuride hulka mittekuuluva liigi kohta (allikaviited on märgitud iga kande puhul sulgudes). Seemikute tärkamise määrad on esitatud avaldatud kirjanduse põhjal ja üksnes üldise ettekujutuse loomiseks. Konkreetsed katsetulemused võivad sõltuvalt seemnete päritolust ja muudest teguritest varieeruda. SUGUKOND Liigi botaaniline nimetus (eestikeelne tavanimetus) Eluiga (9) ja elupaik Seemne kaal (mg) Idanemiseks või kasvuks vajalik valgustusperiood (10) Külvamissügavus (mm) (11) Idanemiseks vajalik aeg (päeva) (12) Eritöötlus (13) Mürgisuse hindamise katse (14) Seemnete tarnijad (15) Muud allikaviited (16) APIACEAE Torilis japonica (jaapani harjasputk) Ü, K; häiritud kooslusega alad, hekid, karjamaad (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) V = P (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) Külmtöötlus (7, 14, 18, 19); küpsemine võib olla vajalik (19); pimedus pärsib idanemist (1, 19); eritöötluseta (5) PÄRAST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (harilik kirikakar) M; rohumaad, haritavad põllud, rohukamar (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) V = P (14) 0 (4) 3 (50 %) (19); 11 (100 %) (18) Kiirgus ei mõjuta idanemist (18, 19); eritöötluseta (4, 14) PÄRAST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (rukkilill) Ü; põllud, teeperved, lagealad (16) 4,1–4,9 (4, 14) V = P (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) Eritöötluseta (2, 4) PÄRAST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (must jumikas) M; põllud, teeperved, lagealad (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 3 (50 %) (19); 4 (97 %) (18) Küpsemine võib olla vajalik (18, 19); pimedus pärsib idanemist (19); eritöötluseta (5, 14, 26) PÄRAST (5, 22, 26) A Inula helenium (aedvaak) M; häiritud kooslusega niisked alad (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) Eritöötluseta (4) PÄRAST (4) A, F Leontodon hispidus (kare seanupp) M; põllud, teeperved, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,85–1,2 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 4 (50 %) (19); 7 (80 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (17, 18, 19); eritöötluseta (5, 23) PÄRAST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (karvane päevakübar) K, M; häiritud kooslusega alad (16) 0,3 (4, 14) V = P (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) Eritöötluseta (4, 14, 33) PÄRAST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (kanada kuldvits) M; karjamaad, lagendikud (16) 0,06–0,08 (4, 14) V = P (11) 0 (4) 14–21 (11) Segatakse võrdse koguse liivaga ja hoitakse 24 tundi giberelliinhappe lahuses kontsentratsiooniga 500 ppm (11); eritöötluseta (4) PÄRAST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (pensilvaania väärtakjas) Ü; põllud, lagealad (16) 25–61 (14, 29) 0 (1); 5 (29) Pimedus võib idanemist pärssida (1); hoitakse 12 tundi soojas vees (29) ENNE ja PÄRAST (31) A Xanthium spinosum (astel-väärtakjas) Ü; lagealad (16) 200 (14) V = P (14); V > P (6) 10 (6) Skarifitseerimine (14); eritöötluseta (6) ENNE ja PÄRAST (6) A Xanthium strumarium (kallas-väärtakjas) Ü; põllud, lagealad (16) 67,4 (14) V = P (14) 10–20 (6, 21) Eritöötluseta (6, 14, 21) ENNE ja PÄRAST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (aas-jürilill) M; põllud, teeperved, rohukamar (16, 19) 0,6 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 5 (50 %) (19); 15 (98 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (18, 19); eritöötluseta (5, 14, 22) PÄRAST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (harilik käokann) M (16) 0,21 (14) V = P (14) < 14 (100 %) (14, 25) Küpsemine võib olla vajalik (18); eritöötluseta (5, 14, 15, 22–26) PÄRAST (5, 15, 22–26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (valge hanemalts) Ü; põlluservad, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) V = P (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) Töötlemisviis sõltub seemnete värvusest (19); puhkeperiood kuivladustamisel (19); pimedus pärsib idanemist (1, 18, 19); külmtöötlus (18); eritöötluseta (14, 34) ENNE ja PÄRAST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (liht-naistepuna) M; põllud, haritavad maad, lagealad (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) V = P (14) 0 (1, 19) 3 (19); 11 (90 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (1, 18, 19); eritöötluseta (5, 14, 15, 25, 27) PÄRAST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (luuderohi-lehtertapp) Ü; teeperved, lagealad, viljapõllud (16) 28,2 (14) V > P (6, 10) 10–20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) Kiirgus ei mõjuta idanemist (1); eritöötluseta (6, 21) ENNE ja PÄRAST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (visa lõikhein) M; haritavad maad, karjamaad, teeperved (16, 30) 0,2 (14) V = P (14) 0 (1); 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) Pimedus pärsib idanemist (1); eritöötluseta (6, 10, 14) ENNE ja PÄRAST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (harilik nõiahammas) M; rohualad, teeperved, lagealad (16, 19) 1–1,67 (14, 19) V = P (14) 1 (50 %) (19) Skarifitseerimine (14, 19); kiirgus ei mõjuta idanemist (18, 19); eritöötluseta (23, 25) PÄRAST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (tömbilehine kassia) Ü; niisked metsad (16) 23–28 (9) V = P (14); V > P (9) 10–20 (6,9) Seemneid hoitakse 24 tundi vees (9); skarifitseerimine (14); seemnete elujõulisus on sõltuvalt värvusest erinev (1); eritöötluseta (6) PÄRAST (6,9) A Sesbania exaltata (koloraado sesbaania) Ü; lammimullad (16) 11–13 (9, 14) V > P (9) 10–20 (9, 21) Seemneid hoitakse 24 tundi vees (9); kiirgus ei mõjuta idanemist (1); eritöötluseta (21) ENNE ja PÄRAST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (aasristik) M; põllud, teeperved, haritavad maad (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) V = P (14) 1 (50 %) (19) Skarifitseerimine (14, 18); küpsemine võib olla vajalik (19); kiirgus ei mõjuta idanemist (1, 19); eritöötluseta (5) PÄRAST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (lääne-südamerohi) M; lagendikud (16) 0,75–1,0 (4, 14) V = P (14) 0 (4) Eritöötluseta (4, 14) PÄRAST (4) F Mentha spicata (rohemünt) M; niisked alad (16) 2,21 (4) 0 (4) Eritöötluseta (4) PÄRAST (4) F Nepeta cataria (harilik naistenõges) M; häiritud kooslusega alad (16) 0,54 (4, 14) V = P (14) 0 (4) Eritöötluseta (2, 4, 14) PÄRAST (2,4) F Prunella vulgaris (harilik käbihein) M; haritavad põllud, rohualad, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,58–1,2 (4, 14, 19) V = P (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19); 7 (91 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (18, 19); suuremate seemnete idanevuse määr on suurem (1); eritöötluseta (4, 14, 22) PÄRAST (4, 22) A, F Stachys officinalis (harilik tõnnike) M; rohumaad, põlluservad (19) 14–18 (14, 19) V = P (14) 7 (50 %) (19) Eritöötluseta (5, 14, 22) PÄRAST (5, 22) F MALVACEAE Abutilon theophrasti (pärn-abuutilon) Ü; põllud, lagealad (16) 8,8 (14) V = P (14) 10–20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) Skarifitseerimine (14); eritöötluseta (5, 10, 21) ENNE ja PÄRAST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (torkav siida) Ü; põllud, teeperved (16) 3,8 (14) V = P (14) 10–20 (6, 21) Skarifitseerimine (14); kiirgus ei mõjuta idanemist (1); eritöötluseta (6, 21) ENNE ja PÄRAST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (kukemagun) Ü; põllud, haritavad maad, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,1–0,3 (4, 14, 19, 29) V = P (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) Külmtöötlus ja skarifitseerimine (1, 19, 32); eritöötluseta (4, 14, 29) PÄRAST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (harilik kastehein) Muru, karjamaad (16) 0,07 (14) V > P (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) Pimedus pärsib idanemist (1, 17–19); eritöötluseta (10) PÄRAST (10) A, E Alopecurus myosuroides (põld-rebasesaba) Ü; põllud, lagealad (16) 0,9–1,6 (29, 34) V = P (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) Skarifitseerimine (14); töötlus KNO3 lahusega, mille kontsentratsioon on 101 mg/l (14); stratifitseerimine soojas (1); pimedus pärsib idanemist (1); eritöötluseta (34) ENNE ja PÄRAST (28, 34) A 32 Avena fatua (tuulekaer) Ü; haritavad alad, lagealad (16) 7–37,5 (14, 30) V = P (14); V > P (6) 10–20 (6, 10) 3 (70 %) (18) Skarifitseerimine (7, 32); pimedus pärsib idanemist (1); külmtöötlus (1, 18); eritöötluseta (6, 10, 14) ENNE ja PÄRAST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (müürluste) Ü; põllud, teeperved, haritavad maad (16) 0,45–2,28 (14, 29) V = P (14) 3 (29) Küpsemisperiood (1, 7, 32); valgus pärsib idanemist (1); eritöötluseta (14) ENNE ja PÄRAST (28, 31) A Cynosurus cristatus (harilik sugapea) M; põllud, teeperved, lagealad (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) V = P (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) Kiirgus ei mõjuta idanemist (19); eritöötluseta (14, 29) PÄRAST (5) A Digitaria sanguinalis (verev paelhirss) Ü; põllud, rohukamar, lagealad (16) 0,52–0,6 (14, 30) V = P (14) 10–20 (21) 7 (75 %), 14 (94 %) (7) Skarifitseerimine, külmtöötlus ja küpsemine (1, 7, 14, 32); töötlus KNO3 lahusega, mille kontsentratsioon on 101 mg/l (14); pimedus pärsib idanemist (1); eritöötluseta (21) ENNE ja PÄRAST (18, 25, 31) A Echinochloa crus-galli (tähk-kukehirss) Ü (16) 1,5 (14) V = P (14); V > P (3) 10–20 (7, 21) Skarifitseerimine (7, 32);; kiirgus ei mõjuta idanemist (1); eritöötluseta (3, 14, 21) ENNE ja PÄRAST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (kanada orashein) M; häiritud kooslusega jõeäärsed alad (16) 4–5 (14, 30) V = P (11) 1 (11) 14–28 (11) Eritöötluseta (2, 11) PÄRAST (2) C, D, E Festuca pratensis (harilik aruhein) M; põllud, niisked alad (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) V = P (14); V > P (10) 20 (10) 9 (74 %) (10); 2 (50 %) (19) Eritöötluseta (10, 19) PÄRAST (10) A 7 Hordeum pusillum (väike oder) Ü; karjamaad, teeperved, lagealad (16) 3,28 (14) Stratifitseerimine soojas (1); kiirgus ei mõjuta idanemist (1) ENNE (31) 7 Phleum pratense (põldtimut) M; karjamaad, haritavad põllud, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,45 (14, 19) V > P (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10); 8 (50 %) (19) Pimedus pärsib idanemist (19); kiirgus ei mõjuta idanemist (17); eritöötluseta (10, 14, 17, 19) PÄRAST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (põld-konnatatar) Ü; lagealad, teeperved (16) 5–8 (4, 14, 29) V = P (20) 0–2 (4, 29) Külmtöötlus 4–8 nädala vältel (1, 2, 4, 20, 29); kiirgus ei mõjuta idanemist (1) ENNE ja PÄRAST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (kahar kirburohi) Ü; niisked mullad (16) 1,8–2,5 (14) V > P (6) 5 (94 %) (18) Kiirgus ei mõjuta idanemist (1); pimedus pärsib idanemist (18); külmtöötlus (1); eritöötluseta (5) ENNE ja PÄRAST (6) A, E Polygonum pensylvanicum (pensilvaania kirburohi) Ü; põllud, lagealad (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) Külmtöötlus 0–5 °C juures 4 nädala vältel (1, 29); pimedus pärsib idanemist (1) ENNE (31) A, E Polygonum persicaria (harilik kirburohi) Ü; häiritud kooslusega alad, haritavad maad (16, 19) 2,1–2,3 (14, 19) V > P (13) 0 (19) < 14 (13); 2 (50 %) (19) Skarifitseerimine, külmtöötlus, töötlus giberelliinhappega (14); külmtöötlus, küpsemine (17–19); pimedus pärsib idanemist (19); eritöötluseta (13) PÄRAST (13) A 32 Rumex crispus (kärnoblikas) M; haritavad põllud, teeperved, lagendikud (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) V = P (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19); 6 (100 %) (33) Pimedus pärsib idanemist (18, 19); küpsemine võib olla vajalik (18); eritöötluseta (4, 14, 33) PÄRAST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (põld-varsapõlv) Ü; haritavad põllud, lagendikud, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) V = P (14) 1 (50 %) (19) Külmtöötlus, töötlus giberelliinhappega (1,14, 18, 19, 32); idanemine nõuab valgust (1); eritöötluseta (2, 4) PÄRAST (2, 4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (kibe tulikas) M; haritavad põllud, teeperved, lagendikud (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) V = P (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) Eritöötluseta (5, 14, 22, 24–26) PÄRAST (5, 22, 24–26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (maamõõl) M; hekid, niisked alad (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 5 (50 %) (19); 16 (79 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (18, 19) stratifitseerimine soojas (1); eritöötluseta (5, 14, 22, 25, 26) PÄRAST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (roomav madar) Ü; haritavad põllud, niisked alad, häiritud kooslusega alad (16, 19) 7–9 (14, 19) V = P (14) 5 (50 %) (19); 6 (100 %) (18) Külmtöötlus (1, 18, 19); kiirgus ei mõjuta idanemist (18, 19); valgus pärsib idanemist (1); eritöötluseta (6, 14) ENNE ja PÄRAST (6, 28) A 32 Galium mollugo (pehme madar) M; hekivallid, lagendikud (8) 7 (29) V = P (14) 2 (29) Eritöötluseta (5, 14, 22, 24, 26, 29) PÄRAST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (verev sõrmkübar) K, M; hekid, lagendikud (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) V = P (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19); 8 (99 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (1, 17–19); eritöötluseta (4, 22–26) PÄRAST (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (pärsia mailane) Ü; haritavad põllud, lagendikud, häiritud kooslusega alad (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 3 (19); 5 (96 %) (18) Pimedus pärsib idanemist (18, 19); külmtöötlus (18); eritöötluseta (14) ENNE ja PÄRAST (28) A 32 Osutatud seemnetarnijad Tarnija tähis Tarnija andmed A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ, INGLISMAA, +44 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771–3948, USA, (727) 344 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0, KANADA, (519) 586 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002, USA, (303) 431 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335, USA, (800) 873 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB, INGLISMAA, +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7, KANADA, (800) 274 7333 www.thompson-morgan.com OSUTATUD KIRJANDUS (1) Baskin, C. C., ja Baskin, J. M. (1998). Seeds. Academic Press, Toronto. (2) Blackburn, L. G., ja Boutin, C. (2003). Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology 12: 271–285. (3) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T., Batchelor, P. S., ja Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2532–2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., ja Kjaer, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology 13: 349–369. (5) Breeze, V., Thomas, G., ja Butler, R. (1992). Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Ann. Appl. Biol. 121: 669–677. (6) Brown, R. A., ja Farmer, D. (1991). Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. Väljaandes: Plants for toxicity assessment, 2. köide. ASTM STP 1115, Gorsuch, J. W., Lower, W. R., Wang, W., ja Lewis, M. A. (toim.), USA Materjalide Katsetamise Ühing, Philadelphia, lk 197–208. (7) Buhler, D. D., ja Hoffman, M. L. (1999). Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, KS. (8) Clapham, A. R., Tutin, T. G., ja Warburg, E. F. (1981). Excursion flora of the British Isles, 3. väljaanne. Cambridge University Press, Cambridge. (9) Clay, P. A., ja Griffin, J. L. (2000). Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Sci. 48: 481–486. (10) Cole, J. F. H., ja Canning, L. (1993). Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds, lk 151–156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds) (2004). Isiklik suhtlus. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J. S., Johnson, F. L., ja McFarlane, J. C. (1990). Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environ. Toxicol. Chem. 9: 769–776. (13) Fletcher, J. S., Pfleeger, T. G., Ratsch, H. C., ja Hayes, R. (1996). Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environ. Toxicol. Chem. 15: 1189–1196. (14) Flynn, S., Turner, R. M., ja Dickie, J. B. (2004). Seed Information Database (versioon 6.0, oktoober 2004). Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid). (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., ja van der Eerden, L. J. M. (2001). Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environ. Pollut. 114: 21–28. (16) Gleason, H. A., ja Cronquist, A. (1991). Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2. väljaane. New York Botanical Garden, Bronx, NY. (17) Grime, J. P. (1981). The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Ann. Appl. Biol. 98: 555–558. (18) Grime, J. P., Mason, G., Curtis, A. V., Rodman, J., Band, S. R., Mowforth, M. A. G., Neal, A. M., ja Shaw, S. (1981). A comparative study of germination characteristics in a local flora. J. Ecol. 69: 1017–1059. (19) Grime, J. P., Hodgson, J. G., ja Hunt, R. (1988). Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London. (20) Kjaer, C. (1994). Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Res. 34: 453–459. (21) Klingaman, T. E., King, C. A., ja Oliver, L. R. (1992). Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Sci. 40: 227–232. (22) Marrs, R. H., Williams, C. T., Frost, A. J., ja Plant, R. A. (1989). Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environ. Pollut. 59: 71–86. (23) Marrs, R. H., Frost, A. J., ja Plant, R. A. (1991). Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environ. Pollut. 69: 223–235. (24) Marrs, R. H., Frost, A. J., ja Plant, R. A. (1991). Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environ. Pollut. 73: 25–42. (25) Marrs, R. H., Frost, A. J., Plant, R. A., ja Lunnis, P. (1993). Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agr. Ecosyst. Environ. 45: 283–293. (26) Marrs, R. H., ja Frost, A. J. (1997). A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. J. Environ. Manage. 50: 369–388. (27) Marshall, E. J. P., ja Bernie, J. E. (1985). Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds, lk 1021–1028. (28) McKelvey, R. A., Wright, J. P., ja Honegger, J. L. (2002). A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Manag. Sci. 58: 1161–1174. (29) Morton, S. (Herbiseed) (2004). Isiklik suhtlus. (http://www.herbiseed.com) (30) USA põllumajandusministeeriumi loodusvarade kaitse amet (NRCS) (2004). The Plants Database, versioon 3.5 (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490, USA. (31) USA Keskkonnakaitseamet (1999). One-Liner Database (USA Keskkonnakaitseamet, pestitsiidiprogrammide büroo, keskkonnas säilivuse ja keskkonnamõju talitus, keskkonnaepidemioloogia üksus). (32) Webster, R. H. (1979). Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L., ja Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada) (2004). Isiklik suhtlus. (34) Zwerger, P., ja Pestemer, W. (2000). Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. Pflanzenk. Pflanzen, Sonderh., 17: 711–718. 4. liide Näited teatavate põllumajanduskultuuride jaoks sobivate kasvutingimuste kohta Allpool esitatud tingimused on leitud olevat sobivad 10 põllumajanduskultuuri jaoks ning neid võib kasutada orientiirina ka kasvukambris teatavate muude liikidega tehtavate katsete puhul. Süsihappegaasi sisaldus: 350 ± 50 ppm. Suhteline õhuniiskus: valgel ajal 70 ± 5 % ja pimedal ajal 90 ± 5 %. Temperatuur: päeval 25 ± 3 °C ja öösel 20 ± 3 °C. Valgustusperiood: 16 tundi valgust ja 8 tundi pimedust, kui keskmine lainepikkus on vahemikus 400–700 nm. Valgustustihedus: 350 ± 50 μE m– 2 s– 1, mõõdetuna lehestiku ülapinna tasandil. Asjaomased põllumajanduskultuurid on järgmised: — tomat (Solanum lycopersicon); — kurk (Cucumis sativus); — aedsalat (Lactuca sativa); — sojauba (Glycine max); — peakapsas (Brassica oleracea var. capitata); — porgand (Daucus carota); — harilik kaer (Avena sativa); — karjamaa-raihein (Lolium perenne); — harilik mais (Zea mays); — harilik sibul (Allium cepa). C.32. VALGELIIMUKLASTE SIGIVUSE KATSE SISSEJUHATUS 1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 220 (2004). See meetod on ette nähtud selleks, et hinnata kemikaalide mõju hariliku valgeliimuka (Enchytraeus albidus Henle, 1873) sigivusele mullas. Meetod põhineb üldjoontes Saksamaa asutuse Umweltbundesamt välja töötatud meetodil (1), mis on võrdlusuuringuga valideeritud (2). Samuti on kaalutud muid meetodeid kemikaalide mürgisuse hindamiseks valgeliimuklastel ja vihmaussidel (3, 4, 5, 6, 7, 8). LÄHTEKAALUTLUSED 2. Perekonda Enchytraeus kuuluvad mullas elavad rõngussid esindavad ökotoksikoloogiliste katsete jaoks sobivaid ökoloogiliselt olulisi liike. Valgeliimuklasi leidub sageli vihmausse sisaldavas mullas, ent samal ajal esineb neid tihti arvukalt ka paljudes muldades, kus vihmaussid puuduvad. Valgeliimuklasi saab kasutada nii laborikatsetes kui ka poolväli- ja välikatsetes. Praktilisest seisukohast on paljud perekonna Enchytraeus liigid hõlpsalt kasutatavad ja kasvatatavad ning nende generatsiooniaeg on oluliselt lühem kui vihmaussidel. Valgeliimuklaste puhul on sigivuskatse kestus üksnes 4–6 nädalat, samas kui vihmausside (Eisenia fetida) puhul on see 8 nädalat. 3. Põhiteave maismaakeskkonnas elavate valgeliimuklaste ökoloogia ja nendega seotud ökotoksikoloogia kohta on esitatud allikates 9, 10, 11 ja 12. KATSE PÕHIMÕTE 4. Täiskasvanud valgeliimukad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on eri kontsentratsioonides segatud kunstliku mullaga. Katse võib jagada kahte etappi: a) kontsentratsioonivahemiku leidmise katse, mis tehakse juhul, kui kättesaadav teave ei ole piisav, ja milles kahenädalase kokkupuuteperioodi järel hinnatav peamine lõppnäitaja on suremus, ning b) lõplik sigivuskatse, milles hinnatakse vanema sigitatud noorloomade koguarvu ja vanemate ellujäämise määra. Lõpliku katse kestus on kuus nädalat. Esimese kolme nädala möödudes eemaldatakse täiskasvanud ussid ja registreeritakse neil esinevad morfoloogilised muutused. Järgmise kolme nädala möödudes loendatakse täiskasvanute moodustatud kookonitest koorunud järglased. Uuritava kemikaaliga kokku puutunud loomade sigivust võrreldakse sigivusega kontrollrühma(de)s, et teha kindlaks: i) täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon ja/või ii) ECx (nt EC10, EC50), kasutades regressioonimudelit sellise hinnangulise kontsentratsiooni leidmiseks, mille puhul sigivus väheneb x % võrra. Katses kasutatav kontsentratsioonivahemik peaks hõlmama ECx (nt EC10, EC50) väärtust, nii et ECx leitakse interpoleerimise, mitte ekstrapoleerimise teel. TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA 5. Soovitatavalt peaks olema teada uuritava kemikaali lahustuvus vees, log Kow, jaotuskoefitsient süsteemis muld/vesi (nt käesoleva lisa peatükk C.18 või C.19) ja aururõhk. Samuti on soovitatav lisateabe olemasolu uuritava kemikaali säilivuse kohta mullas, näiteks kemikaali fotolüüsi ja hüdrolüüsi kiirus. 6. Käesolevat katsemeetodit võib kasutada nii vees lahustuvate kui ka vees lahustumatute kemikaalide puhul. Uuritava kemikaaliga töötlemise viis on neil kahel juhul siiski erinev. Katsemeetodit ei saa kasutada lenduvate kemikaalide puhul, mille Henry konstant või jaotuskoefitsient süsteemis õhk/vesi on suurem kui üks, ega kemikaalide puhul, mille aururõhk 25 °C juures on suurem kui 0,0133 Pa. KATSE NÕUETEKOHASUS 7. Katse vastab nõuetele, kui kontrollrühmas on täidetud järgmised kriteeriumid: — täiskasvanud isendite suremus ei tohiks kontsentratsioonivahemiku leidmise katse lõpus ja sigivuskatse esimese kolme nädala möödudes olla suurem kui 20 %; — kui katset alustatakse 10 täiskasvanud isendiga nõu kohta, peaks katse lõpuks olema igas nõus sigitatud keskmiselt 25 noorlooma; — noorloomade keskmise arvu variatsioonikordaja ei tohiks sigivuskatse lõpus olla suurem kui 50 %. Kui katse ei vasta eespool nimetatud nõuetekohasuse kriteeriumidele, tuleks see lõpetada, välja arvatud juhul, kui katse jätkamist on võimalik põhjendada. Selline põhjendus tuleks esitada katseprotokollis. VÕRDLUSKEMIKAAL 8. Võrdluskemikaali abil tuleks korrapäraselt või võimaluse korral igas katses kontrollida, kas katseorganismide reaktsioon on aja jooksul üldjoontes samaks jäänud. Sobiv võrdluskemikaal on karbendasiim, mis teadaolevalt mõjutab valgeliimuklaste ellujäämise määra ja sigivust (13, 14); võib kasutada ka muid kemikaale, mille mürgisuse andmed on hästi dokumenteeritud. Võrdlusuuringus kasutati karbendasiimi valmistoote kujul, mida tarnib kaubanime Derosal™ all ettevõte AgrEvo Company (Frankfurt, Saksamaa) ja milles toimeaine sisaldus on 360 g/l (32,18 %) (2). Võrdlusuuringus sigivuse kohta määratud EC50 jäi vahemikku 1,2 ± 0,8 mg toimeainet kuivmassi kilogrammi kohta (2). Kui katseseerias kasutatakse positiivse kontrollina mürgist võrdluskemikaali, kasutatakse ühte kontsentratsiooni ning asjaomaste paralleelnõude arv peaks olema sama kui kemikaalita kontrollrühmas. Karbendasiimi puhul soovitatakse teha katse kontsentratsioonil 1,2 mg toimeainet kuivmassi kilogrammi kohta (kui kasutatakse vedelat valmistoodet). KATSEMEETODI KIRJELDUS Seadmed 9. Katsenõud peaksid olema klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Selleks sobivad klaaspurgid (nt mahuga 0,20–0,25 liitrit ja diameetriga umbes 6 cm). Nõudel peaks olema läbipaistev (nt klaasist või polüetüleenist) kaas, mis vähendab vee aurumist ja võimaldab samal ajal gaasivahetust mulla ja atmosfääri vahel. Kaane läbipaistvus on vajalik valguse läbilaskmiseks. 10. On vaja tavapäraseid laboriseadmeid, täpsemalt järgmist: — kuivatuskapp; — stereomikroskoop; — pH-meeter ja fotomeeter; — sobiv täpne kaal; — sobivad temperatuuri reguleerimise seadmed; — sobivad niiskuse reguleerimise seadmed (ei ole hädavajalikud, kui kokkupuutenõu on kaanega); — inkubaator või väike kliimaseadmega ruum; — pintsetid, konksud või aasad; — ilmutusvann. Kunstliku mulla valmistamine 11. Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse kunstlikku mulda (5, 7), mille koostis on järgmine (kuivmassi põhjal pärast kuumutamist 105 °C juures, kuni mass enam ei muutu): — 10 % turbasamblaturvast, mis on õhu käes kuivatatud ja peeneks jahvatatud (osakeste suurus võib olla 2 ± 1 mm); enne katse tegemist soovitatakse kontrollida, kas värskest turbapartiist valmistatud pinnas sobib valgeliimuka kasvatamiseks; — 20 % kaoliinsavi (soovitatav kaoliniidisisaldus üle 30 %); — umbes 0,3–1,0 % kaltsiumkarbonaati (CaCO3, pulbristatud, analüütilise puhtusastmega), et saavutada pH väärtus 6,0 ± 0,5; lisatava kaltsiumkarbonaadi kogus võib sõltuda eelkõige turba kvaliteedist ja omadustest; — umbes 70 % kvartsliiva (sõltuvalt vajalikust CaCO3 kogusest), mis on õhu käes kuivatatud ja koosneb peamiselt peenest liivast, millest üle 50 % moodustavad osakesed suurusega 50–200 mikromeetrit. Enne kunstliku mulla kasutamist lõplikus katses on soovitatav veenduda selle sobivuses valgeliimuka kasvatamiseks ja katse nõuetekohasuse kriteeriumide saavutamiseks. Sellist kontrollimist soovitatakse eelkõige selleks, et oleks võimalik veenduda, et katsetulemused ei halvene, kui orgaanilise süsiniku sisaldus kunstlikus mullas on väiksem, näiteks kui turbasisaldust vähendatakse 4–5 protsendini ja liivasisaldust vastavalt suurendatakse. Orgaanilise süsiniku sisalduse sellise vähendamise tulemusena võib väheneda mulla (orgaanilise süsiniku) võime uuritavat kemikaali adsorbeerida ning kemikaali saadavus ussidele võib suureneda. On tõendatud, et Enchytraeus albidus'e puhul on sigivust käsitlevad nõuetekohasuse kriteeriumid täidetavad, kui katse tehakse põllumullas, milles orgaanilise süsiniku sisaldus on väiksem (näiteks 2,7 %) (15), ning seniste piiratud kogemuste põhjal on võimalik seda saavutada ka kunstlikus mullas, mille turbasisaldus on 5 %. Märkus: kui tehakse lisakatseid (nt kõrgema tasandi katseid) loodusliku mullaga, tuleks tõendada ka sellise mulla sobivust ja katse nõuetekohasuse kriteeriumide täidetavust. 12. Mulla kuivad koostisosad segatakse põhjalikult (nt suure mahutavusega laborisegistis). Seda tuleks teha vähemalt üks nädal enne katse alustamist. Segatud muld tuleks kaheks päevaks seisma jätta, et happesus stabiliseeruks. Mulla pH mõõtmiseks kasutatakse mulla ja 1 M kaaliumkloriidi (KCl) või 0,01 M kaltsiumkloriidi (CaCl2) lahuse segu suhtega 1:5 (vt allikas 16 ja 3. liide). Kui mulla happesus on suurem kui nõutavasse vahemikku jäävad väärtused (vt punkt 11), võib selle reguleerimiseks lisada sobiva koguse CaCO3. Kui muld on liiga leeliseline, võib happesuse suurendamiseks lisada punktis 11 osutatud segu, millest on välja jäetud CaCO3. 13. Kunstliku mulla maksimaalne veemahutavus määratakse vastavalt 2. liites kirjeldatud meetodile. Üks kuni kaks päeva enne katse alustamist eelniisutatakse kuiva kunstlikku mulda piisava koguse deioniseeritud vee lisamise teel, et saavutada veesisaldus, mis on umbes poole väiksem kui lõplik veesisaldus, mis jääb vahemikku 40–60 % maksimaalsest veemahutavusest. Katse alguses jagatakse eelniisutatud muld nii mitmeks osaks, kui palju on kasutatavatele uuritava kemikaali kontsentratsioonidele vastavaid (ja vajaduse korral võrdluskemikaaliga) katserühmi ja kontrollrühmi. Niiskusesisaldus viiakse 40–60 protsendini maksimaalsest veemahutavusest, lisades uuritava kemikaali lahust ja/või destilleeritud või deioniseeritud vett (vt punktid 19–21). Niiskusesisaldus määratakse katse alguses ja lõpus (kuivatades mulda 105 °C juures, kuni selle kaal enam ei muutu) ning see peaks jääma usside ellujäämiseks optimaalsesse vahemikku. Mulla niiskusesisalduse ligikaudseks kontrollimiseks võib mulda õrnalt peos pigistada: sobiva niiskusesisalduse korral peaksid sõrmede vahele ilmuma väikesed veetilgad. Katseloomade valimine ja ettevalmistamine 14. Soovitatav katseliik on sugukonda Enchytraeidae (alamklass Oligochaeta, hõimkond Annelida) kuuluv harilik valgeliimukas (Enchytraeus albidus Henle, 1837). E. albidus on üks suuremaid valgeliimuklaste liike ning selle liigi isendite pikkuseks on mõõdetud kuni 35 mm (17, 18). E. albidus on ülemaailmse levikuga liik, keda leidub nii meres, mageveekogudes kui ka maismaa elupaikades, peamiselt lagunevas orgaanilises aines (merevetikad, kompost) ja harva ka niitudel (9). Selle liigi taluvus eri ökoloogiliste tingimuste suhtes ja teatav morfoloogiline varieeruvus võivad osutada eri liigisiseste rühmade olemasolule. 15. E. albidus on turul kättesaadav kalasöödana. Tuleks kontrollida, kas kultuur on saastunud muude, tavaliselt väiksemate liikidega (1, 19). Saastumise korral tuleks kõiki usse Petri tassis veega pesta. Seejärel tuleks uue kultuuri loomiseks valida stereomikroskoobi abil välja E. albidus'e suured täiskasvanud isendid ja kõik muud ussid kõrvaldada. E. albidus't saab hõlpsalt kasvatada paljudes eri orgaanilistes materjalides (vt 4. liide). E. albidus'e elutsükkel on lühike, kuna suguküpsuse saavutamiseks kulub 33 päeva (18 °C juures) kuni 74 päeva (12 °C juures) (1). Katses kasutatakse üksnes kultuure, mida on kasvatatud laboris probleemideta vähemalt 5 nädalat (ühe põlvkonna vältel). 16. Sobivad ka muud perekonna Enchytraeus liigid, näiteks E. buchholzi (Vejdovský, 1879) või E. crypticus (Westheide & Graefe, 1992) (vt 5. liide). Muude perekonna Enchytraeus liikide kasutamise korral tuleb selgelt märkida asjaomane liik ja esitada selle valimise põhjendus. 17. Katses kasutatakse täiskasvanud usse. Neil peaksid olema vöö piirkonnas näha munad (valged laigud) ja nad peaksid olema umbes ühesuurused (ligikaudu 1 cm pikkused). Kasvatatava kultuuri sünkroonimine ei ole vajalik. 18. Kui valgeliimuklasi ei kasvatata sama tüüpi mullas ja samades tingimustes (sh söötmistingimused), mida kasutatakse lõplikus katses, tuleb neil lasta kohaneda vähemalt 24 tundi ja kuni kolm päeva. Algselt tuleks lasta kohaneda suuremal arvul täiskasvanud isenditel, kui on vaja katse tegemiseks, et luua varu vigastatud või muul põhjusel sobimatute isendite kõrvaldamiseks. Kohanemisperioodi lõpus valitakse katse jaoks välja üksnes munadega ussid, kelle käitumises ei täheldata kõrvalekaldeid (nt püüdu mullast lahkuda). Ussid eemaldatakse ettevaatlikult juveliiripintsettide, konksu või aasa abil ja viiakse Petri tassi, mis sisaldab väikeses koguses magedat vett. Soovitatakse kasutada käesoleva lisa peatükis C.20 („Hiidkiivriku (Daphnia magna) sigivuse katse”) osutatud taastatud magedat vett, kuna deioniseeritud, demineraliseeritud või kraanivesi võib olla ussidele kahjulik. Usse kontrollitakse stereomikroskoobi all ja kõik munadeta ussid kõrvaldatakse. Jälgitakse hoolikalt, et kõik kultuuri nakatada võivad lestad ja hooghännalised saaksid eemaldatud ja kõrvaldatud. Terved ussid, keda katses ei kasutata, viiakse tagasi tüvikultuuri. Katsekontsentratsiooniga segude valmistamine Vees lahustuv uuritav kemikaal 19. Uuritava kemikaali lahus valmistatakse deioniseeritud vee sellises koguses, millest piisab kõikidele ühe katsekontsentratsiooni puhul kasutatavatele paralleelkultuuridele. Soovitatakse kasutada sobivas koguses vett, et saavutada nõutav niiskusesisaldus, st 40–60 % maksimaalsest veemahutavusest (vt punkt 13). Enne katsenõusse viimist segatakse uuritava kemikaali iga lahus põhjalikult ühe partii eelniisutatud mullaga. Vees lahustumatu uuritav kemikaal 20. Vees lahustumatu, kuid orgaanilises lahustis lahustuva kemikaali võib lahustada võimalikult väikeses koguses sobivas kandeaines (nt atsetoonis). Tuleks kasutada üksnes lenduvaid lahusteid. Kandeaine pihustatakse väikesele kogusele, näiteks 2,5 grammile peenele kvartsliivale või segatakse sellega. Kandeaine kõrvaldatakse vähemalt üks tund kestva tõmbekapis aurustamise teel. Kvartsliiva ja uuritava kemikaali segu lisatakse eelniisutatud mullale ja pärast nõutava niiskusesisalduse saavutamiseks vajaliku koguse deioniseeritud vee lisamist segatakse saadav segu põhjalikult läbi. Lõplik segu viiakse katsenõudesse. 21. Vees ja orgaanilistes lahustites raskesti lahustuva kemikaali puhul segatakse soovitava katsekontsentratsiooni saavutamiseks vajalik kogus uuritavat kemikaali sellise koguse peeneks jahvatatud kvartsliivaga, mis vastab 2,5 grammile katsenõu kohta. Kõnealune kvartsliiva ja uuritava kemikaali segu lisatakse eelniisutatud mullale ja pärast nõutava niiskusesisalduse saavutamiseks vajaliku koguse deioniseeritud vee lisamist segatakse saadav segu põhjalikult läbi. Lõplik segu jaotatakse katsenõudesse. Kirjeldatud toiminguid korratakse iga katsekontsentratsiooni puhul ning valmistatakse ka sobiv kontrollsegu. 22. Kemikaale ei tohiks üldjuhul testida suuremal kontsentratsioonil kui 1 000 mg mulla kuivmassi kilogrammi kohta. Mõne konkreetse katse eesmärkide saavutamiseks võib suurema kontsentratsiooni kasutamine siiski vajalik olla. KATSE KÄIK Katse- ja kontrollrühmad 23. Iga katses kasutatava kontsentratsiooni puhul viiakse katsenõusse 20 grammile kuivmassile vastav kogus katsemulda (vt punktid 19–21). Valmistatakse ka uuritava kemikaalita kontrollsegud. Igasse nõusse lisatakse sööt punktis 29 kirjeldatud viisil. Igasse katsenõusse viiakse juhuvaliku alusel 10 ussi. Ussid pannakse näiteks juveliiripintsette, konksu või aasa kasutades ettevaatlikult igasse katsenõusse mullapinnale. Paralleelnõude arv iga katses kasutatava kontsentratsiooni puhul ja kontrollrühmades sõltub kasutatavast katseplaanist (vt punkt 34). Katsenõud paigutatakse inkubaatorisse juhuslikult ja nende paigutust muudetakse juhuslikkuse alusel igal nädalal. 24. Kui uuritava kemikaaliga töötlemiseks kasutatakse kandeainet, tuleks moodustada lisaks katserühmadele üks kontrollrühm, kus kasutatakse kvartsliiva, millega on segatud või millele on pihustatud lahustit. Asjaomase lahusti või dispergeeriva aine kontsentratsioon peaks olema sama kui uuritavat kemikaali sisaldavates katsenõudes. Kemikaalide puhul, millega töötlemisel on vaja järgida punktis 21 kirjeldatud korda, tuleks moodustada kontrollrühm, kus kasutatakse täiendavalt kvartsliiva (2,5 g nõu kohta). Katsetingimused 25. Katsetemperatuur on 20 ± 2 °C. Et hoida ära usside põgenemist mullast, kasutatakse katses kontrollitavat valgustusrežiimi (soovitatavalt 16 tundi valgust ja 8 tundi pimedust) ja katsenõude inkubeerimisalal valgustustihedus 400–800 luksi. 26. Mulla niiskusesisalduse kontrollimiseks kaalutakse katsenõusid katse alguses ja seejärel kord nädalas. Kaalu vähenemist kompenseeritakse sobiva koguse deioniseeritud vee lisamisega. Tuleks tähele panna, et veekadu on võimalik vähendada, hoides inkubaatoris kõrget õhuniiskuse taset (> 80 %). 27. Niiskusesisaldust ja pH-d tuleks mõõta nii kontsentratsioonivahemiku leidmise katse kui ka lõpliku katse alguses ja lõpus. Mõõtmiste tegemiseks tuleks kasutada kemikaaliga igal kontsentratsioonil töödeldud mullaproove ja kontrollproove, mis on valmistatud ja mida inkubeeritakse samal viisil kui katsekultuure, kuid mis ei sisalda usse. Nendesse mullaproovidesse tuleks sööta lisada üksnes katse alguses, et soodustada mikroobide elutegevust. Lisatava sööda kogus peaks olema sama kui katsekultuuridesse lisatav kogus. Nendesse nõudesse ei ole vaja katse vältel enam sööta juurde lisada. Söötmine 28. Võib kasutada sööta, mille puhul on tagatud valgeliimuklaste populatsiooni säilimine. On kindlaks tehtud, et söödamaterjalina on sobiv kasutada valtsitud kaera, mis on soovitatav mikroobidega saastumise ärahoidmiseks enne kasutamist autoklaavida (sobib ka kuumutamine). 29. Sööda esmakordseks lisamiseks segatakse 50 mg jahvatatud valtsitud kaera igas nõus mullaga enne usside lisamist. Seejärel lisatakse sööta igal nädalal kuni 21. katsepäevani. Sööta ei lisata 28. katsepäeval, kuna selleks ajaks on täiskasvanud ussid juba eemaldatud ja noored ussid vajavad pärast seda suhteliselt vähe lisatoitu. Katse ajal lisatakse söödana 25 mg jahvatatud valtsitud kaera nõu kohta, pannes need ettevaatlikult mullapinnale, et usse mitte vigastada. Seente kasvu pärssimiseks tuleks kaerahelbed mulla sisse viia, kattes need väikese koguse mullaga. Kui sööt jäetakse söömata, tuleks söödakogust vähendada. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katse plaan 30. Vajaduse korral tehakse kontsentratsioonivahemiku leidmise katse, milles kasutatakse näiteks viit uuritava kemikaali kontsentratsiooni: 0,1, 1,0, 10, 100 ja 1 000 mg mulla kuivmassi kilogrammi kohta. Iga katserühma ja kontrollrühma puhul piisab ühest nõust. 31. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katse kestus on kaks nädalat. Katse lõpus hinnatakse usside suremust. Uss loetakse surnuks, kui ta ei reageeri esiotsa mehaanilisele ärritamisele. Lõplikus katses kasutamiseks sobiva kontsentratsioonivahemiku kindlaksmääramiseks võib olla kasu ka muust teabest peale suremuse. Seepärast tuleks registreerida ka muutused täiskasvanud isendite käitumises (nt võimetus mulda kaevuda või katsenõu klaasseina vastas liikumatult lamamine) ja morfoloogias (nt lahtiste haavade esinemine), samuti noorloomade esinemine. Viimaste kindlakstegemiseks võib kasutada 6. liites kirjeldatud värvimismeetodit. 32. LC50 ligikaudseks määramiseks võib arvutada suremuse määra geomeetrilise keskväärtuse. Lõplikus katses kasutatava kontsentratsioonivahemiku kindlaksmääramisel eeldatakse, et mõju sigivusele avaldub kuni 10 korda väiksemal kontsentratsioonil kui LC50. See suhe on siiski katseliselt leitud ja võib igal konkreetsel juhul olla erinev. Lõplikus katses kasutatavat uuritava kemikaali kontsentratsioonide vahemikku võivad aidata kindlaks määrata ka muud kontsentratsioonivahemiku leidmise katses tehtud tähelepanekud, näiteks noorloomade esinemine. 33. LC50 täpseks määramiseks soovitatakse kasutada katses vähemalt nelja paralleelnõu uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni kohta ja piisavat arvu eri kontsentratsioone, et saada vähemalt neli statistiliselt oluliselt erinevat vastuse keskväärtust. Vajaduse korral kasutatakse kontrollrühmade puhul sarnast arvu kontsentratsioone ja paralleelnõusid. Lõpliku sigivuskatse plaan 34. Võrdlusuuringu (2) alusel välja töötatud soovitustest lähtuvalt pakutakse välja kolm katseplaani. — Täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni määramiseks tuleks kasutada vähemalt viit kontsentratsiooni geomeetrilises jadas. Soovitatakse kasutada nelja paralleelnõu kontsentratsiooni kohta ja lisaks kaheksat kontrollnõu. Kontsentratsioonide jada tegur ei tohiks olla suurem kui 1,8. — ECx (nt EC10, EC50) määramiseks tuleks katses kasutada vähemalt viit kontsentratsiooni ja kasutatav kontsentratsioonivahemik peaks hõlmama ECx väärtust, et võimaldada määrata ECx interpoleerimise, mitte ekstrapoleerimise teel. Soovitatakse kasutada vähemalt nelja paralleelnõu kontsentratsiooni kohta ja nelja paralleelnõu kontrollrühmas. Kontsentratsioonide jada tegur võib varieeruda, st olla eeldatavas mõju avaldumise vahemikus 1,8 või väiksem ning sellest vahemikust väljaspool olevate suuremate ja väiksemate kontsentratsioonide puhul üle 1,8. — Kombineeritud lähenemisviis võimaldab määrata nii täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni kui ka ECx. Tuleks kasutada kaheksat uuritava kemikaali kontsentratsiooni geomeetrilises jadas. Soovitatakse kasutada nelja paralleelnõu kontsentratsiooni kohta ja lisaks kaheksat kontrollnõu. Kontsentratsioonide jada tegur ei tohiks olla suurem kui 1,8. 35. Tuleks kasutada 10 täiskasvanud ussi katsenõu kohta (vt punkt 23). Sööta lisatakse katsenõudesse katse alguses ja seejärel kord nädalas (vt punkt 29) kuni 21. katsepäeva lõpuni. Kahekümne esimesel katsepäeval vaadatakse mullaproovid käsitsi hoolikalt läbi ning elusad täiskasvanud ussid loendatakse, neid vaadeldakse ja registreeritakse muutused nende käitumises (nt võimetus mulda kaevuda või katsenõu klaasseina vastas liikumatult lamamine) ja morfoloogias (nt lahtiste haavade esinemine). Seejärel eemaldatakse kõik täiskasvanud ussid katsenõudest ja katsemullast. Katsemulda koos kõikide selles sisalduvate moodustatud kookonitega inkubeeritakse veel kolm nädalat samades katsetingimustes; ainsa erinevusena lisatakse sööta (st 25 mg jahvatatud valtsitud kaera nõu kohta) üksnes 35. katsepäeval. 36. Kuue nädala möödudes loendatakse katse vältel koorunud ussid. Soovitatakse kasutada bengali punasega värvimisel põhinevat meetodit (vt 6. liide), kuid sobivaks on osutunud ka muud vedelikuga (kuid mitte kuumusega) ekstraheerimise ja vedelikupinnale toomise meetodid (vt 6. liide) (4, 10, 11, 20). Bengali punasega värvimist soovitatakse kasutada seepärast, et mullasubstraadist vedelikuga ekstraheerimise puhul võib segavaks teguriks olla suspendeeritud saviosakeste põhjustatud hägusus. Piirsisalduskatse 37. Kui kontsentratsioonivahemiku leidmise katses ei täheldata suurimal kasutatud kontsentratsioonil (nt kontsentratsioonil 1 000 mg/kg) mingit mõju, võib sigivuskatse teha piirsisalduskatsena, kasutades kontsentratsiooni 1 000 mg/kg, et tõendada, et täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon on sigivuse puhul sellest väärtusest suurem. Katse lühikirjeldus ja ajakava 38. Katse etapid võib kokku võtta järgmiselt. Aeg Kontsentratsioonivahemiku leidmise katse Lõplik katse 7 päeva enne katset või varem — Valmistatakse kunstlik muld (segatakse kokku kuivad koostisosad) — Valmistatakse kunstlik muld (segatakse kokku kuivad koostisosad) 5 päeva enne katset — Kontrollitakse kunstliku mulla pH-d — Mõõdetakse mulla maksimaalne veemahutavus — Kontrollitakse kunstliku mulla pH-d — Mõõdetakse mulla maksimaalne veemahutavus 5 kuni 3 päeva enne katset — Valitakse välja ussid katsetingimustega kohandamiseks — Valitakse välja ussid katsetingimustega kohandamiseks 3 kuni 0 päeva enne katset — Ussidel lastakse vähemalt 24 tundi kohaneda — Ussidel lastakse vähemalt 24 tundi kohaneda 1 päev enne katset — Kunstlik muld eelniisutatakse ja jagatakse partiideks — Kunstlik muld eelniisutatakse ja jagatakse partiideks Katse alustamise päev (0-päev) — Valmistatakse põhilahused — Töödeldakse uuritava kemikaaliga — Kaalutud kogus katsesubstraati viiakse katsenõudesse — Lisatakse sööt — Lisatakse ussid — Mõõdetakse mulla pH ja niiskusesisaldus — Valmistatakse põhilahused — Töödeldakse uuritava kemikaaliga — Kaalutud kogus katsesubstraati viiakse katsenõudesse — Lisatakse sööt — Lisatakse ussid — Mõõdetakse mulla pH ja niiskusesisaldus 7. päev — Kontrollitakse mulla niiskusesisaldust — Kontrollitakse mulla niiskusesisaldust — Lisatakse sööta 14. päev — Määratakse täiskasvanud usside suremus — Määratakse noorloomade hinnanguline arv — Mõõdetakse mulla pH ja niiskusesisaldus — Kontrollitakse mulla niiskusesisaldust — Lisatakse sööta 21. päev — Jälgitakse täiskasvanud usside käitumist — Eemaldatakse täiskasvanud ussid — Määratakse täiskasvanud usside suremus — Kontrollitakse mulla niiskusesisaldust — Lisatakse sööta 28. päev — Kontrollitakse mulla niiskusesisaldust — Sööta ei lisata 35. päev — Kontrollitakse mulla niiskusesisaldust — Lisatakse sööta 42. päev — Loendatakse noorloomad — Mõõdetakse mulla pH ja niiskusesisaldus ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE Andmete töötlemine 39. Käesolevas katsemeetodis ei anta lõplikke juhiseid katsetulemuste statistilise analüüsi kohta; 7. liites on siiski esitatud asjakohane ülevaade. 40. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katses on peamine lõppnäitaja suremus. Siiski tuleks registreerida ka muutused täiskasvanud isendite käitumises (nt võimetus mulda kaevuda või katsenõu klaasseina vastas liikumatult lamamine) ja morfoloogias (nt lahtiste haavade esinemine), samuti noorloomade esinemine. Üldjuhul tuleks kasutada LC50 leidmiseks probitanalüüsi (21) või logistilist regressiooni. Selle analüüsimeetodi sobimatuse korral (nt kui andmed hõlmavad vähem kui kolme kontsentratsiooni, mille puhul täheldatakse osalist suremust) võib kasutada mõnda alternatiivset meetodit. Kõnealuse meetodina võib muu hulgas kasutada libiseva keskmise meetodit (22), kohandatud Spearmani-Kärberi meetodit (23) või lihtsat interpoleerimist (nt LC0 ja LC100 geomeetrilist keskmist, mis on saadud LC0 ja LC100 korrutisest ruutjuure võtmise teel). 41. Lõplikus katses on lõppnäitaja sigivus (st sigitatud noorloomade arv). Sarnaselt kontsentratsioonivahemiku leidmise katsele tuleks lõpp-protokolli siiski märkida ka kõik muud kahjuliku mõju ilmingud. Statistilise analüüsi käigus on vaja arvutada sigivuse aritmeetiline keskmine ja standardhälve igas katse- ja kontrollrühmas. 42. Dispersioonanalüüsi tegemise korral võib standardhälbe s ja selle vabadusastmete arvu df asendada vastavalt dispersioonianalüüsi (ANOVA) tulemusena leitud hajuvuse hinnangulise koondmäära ja selle vabadusastmete arvuga, eeldusel, et hajuvus ei sõltu kontsentratsioonist. Sellisel juhul kasutatakse kontroll- ja katserühmade puhul ühte hajuvuse väärtust. Kõnealused väärtused arvutatakse tavaliselt müügiloleva statistilise analüüsi programmi abil, kasutades paralleelidena igas eraldi nõus saadud tulemusi. Kui ilmneb, et negatiivse kontrolli ja lahustiga kontrolli andmete koondamine on mõistlikum kui võrdlemine ühe nimetatud kontrolliga, tuleks veenduda, et asjaomased andmed ei ole oluliselt erinevad (selleks sobivatele meetoditele osutatakse punktis 45 ja 7. liites). 43. Edasine statistiline analüüs ja järeldused sõltuvad sellest, kas paralleelnõudes saadud väärtused on normaaljaotusega ja kas nende hajuvus on homogeenne. Täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni (NOEC) hindamine 44. Soovitatavalt tuleks kasutada suure võimsusega meetodit. Et hinnata andmete jaotuse ligikaudset vastavust normaaljaotusele, tuleks kasutada varasemal kogemusel, näiteks võrdlusuuringu andmetel või muudel varasematel andmetel põhinevat teavet. Hajuvuse homogeensus (homoskedastiivsus) on suurema tähtsusega. Kogemusest nähtub, et hajuvus suureneb sageli keskväärtuse suurenedes. Sellisel juhul võib homoskedastiivsuse saavutamiseks olla kasu andmete teisendamisest. Kõnealuse teisendamise puhul tuleks siiski lähtuda varasematel andmetel põhinevast kogemusest, mitte analüüsitavatest andmetest. Homogeensete andmete puhul tuleks kasutada mitmest t-testi, näiteks Williamsi testi (α = 0,05; ühepoolne) (24, 25) või teatavatel juhtudel Dunnetti testi (26, 27). Tuleks tähele panna, et paralleelnõude andmete ebavõrdse hajuvuse korral tuleb tabelis esitatud t-väärtusi Dunnetti ja Williamsi kirjeldatud viisil korrigeerida. Mõnikord ei suurene/vähene saadud väärtused suurest varieeruvusest tingituna korrapäraselt. Sellise suure monotoonsusest kõrvalekaldumise puhul on asjakohasem kasutada Dunnetti testi. Homoskedastiivsusest kõrvalekaldumise puhul võib olla mõistlik hinnata võimalikku mõju hajuvusele lähemalt, et oleks võimalik otsustada, kas asjaomaseid t-teste saab kasutada võimsust oluliselt kaotamata (28). Teise võimalusena võib kasutada mitmest U-testi, näiteks Bonferroni U-testi vastavalt Holmile (29), või heteroskedastiivsete andmete puhul, mis muidu vastavad üldisele monotoonsele kontsentratsioonist sõltuvusele, mõnda muud mitteparameetrilist (nt Jonckheere'i-Terpstra (30, 31) või Shirley (32, 33)) testi; sellist testi tuleks üldjuhul eelistada ebavõrdse hajuvuse suhtes kohandatud t-testile (vt ka skeem, 7. liide). 45. Kui on tehtud piirsisalduskatse ja parameetrilise testi eeldused (normaaljaotus, homogeensus) on täidetud, võib kasutada paariviisilist Studenti t-testi või ka Manni-Whitney U-testi (29). ECx leidmine 46. Mis tahes ECx väärtuse arvutamiseks regressioonanalüüsi (lineaarse või mittelineaarse regressiooni) teel kasutatakse katserühmade andmete keskväärtusi, mille alusel leitakse kontsentratsiooni ja mõju vahelist sõltuvust kirjeldav sobiv funktsioon. Pideva tunnusena vaadeldava usside kasvu puhul võib ECx väärtuste leidmiseks kasutada sobivat regressioonanalüüsi (35). Binaarsete andmete (suremus/elulemus) ja sigitatud järglaste arvu puhul sobivad funktsioonid on muu hulgas normaaljaotuse sigmoidfunktsioon, logistiline funktsioon ja Weibulli funktsioon, mis hõlmavad kahte kuni nelja parameetrit ja millest mõni sobib ka hormeetilise mõju modelleerimiseks. Kui kontsentratsiooni ja mõju vahelist sõltuvust väljendava funktsiooni leidmiseks kasutatakse lineaarset regressiooni, tuleks enne ECx määramist veenduda regressioonanalüüsi teel r2 (määratusekordaja) ja/või tõusu väärtuse olulisuses; ECx arvutamiseks sisestatakse regressioonanalüüsi tulemusena saadud võrrandisse väärtus, mis vastab x protsendile kontrollrühma keskväärtusest. Usalduspiirid usaldusnivool 95 % arvutatakse vastavalt Fiellerile (viidanud Finney (21)) või mõne muu sobiva kaasaegse meetodi abil. 47. Teise võimalusena väljendatakse mõju protsentuaalse või lihtosakaaluna mudeli parameetrina käsitatavast kontrollrühma näitaja keskväärtusest. Sellisel juhul on normaaljaotusele vastava (logistilise, Weibulli) sigmoidse kõvera lähendamiseks andmetele sageli võimalik hõlpsalt kasutada probitanalüüsil põhinevat regressioonimeetodit (21). Kõnealusel juhul tuleb kaalufunktsiooni kohandada arvulise tunnuse analüüsimiseks, nagu on kirjeldanud Christensen (36). Hormeesi ilmnemisel tuleks probitanalüüsi asemel siiski rakendada neljaparameetrilist logistilist või Weibulli funktsiooni, kasutades lähendamiseks mittelineaarset regressiooni (36). Kui kontsentratsiooni ja mõju vahelist sõltuvust väljendava sobiva funktsiooni lähendamine andmetele ei ole võimalik, võib ECx hinnangulise väärtuse ja asjaomaste usalduspiiride määramiseks kasutada muud meetodit, näiteks libiseva keskmise meetodit vastavalt Thompsonile (22) või kohandatud Spearmani-Kärberi meetodit (23). KATSEPROTOKOLL 48. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave. Uuritav kemikaal: — füüsikaline iseloomustus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (nt lahustuvus vees, aururõhk); — uuritava kemikaali identifitseerimisandmed vastavalt IUPACi nomenklatuurile, kemikaali CASi number, partii, struktuurivalem ja puhtus; — proovi kõlblikkusaja lõppkuupäev. Katseliik: — kasutatud katseloomad: liik, teaduslik nimetus, organismide päritolu ja kasvatustingimused. Katsetingimused: — kunstliku mulla koostisosad ja valmistamine; — uuritava kemikaaliga töötlemise meetod; — katsetingimuste kirjeldus, sealhulgas temperatuur, niiskusesisaldus, pH jne; — katseplaani ja katse läbiviimise täielik kirjeldus. Katsetulemused: — täiskasvanud usside suremus kaks nädalat pärast kontsentratsioonivahemiku leidmise katse alustamist ja noorloomade arv katse lõpus; — täiskasvanud usside suremus kolm nädalat pärast lõpliku katse alustamist ja täielikud andmed noorloomade kohta katse lõpus; — katseorganismidel täheldatavad mis tahes füüsilised või patoloogilised sümptomid ja käitumuslikud muutused; — vastavalt vajadusele LC50, sigivuse puhul määratud täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon ja/või ECx (nt EC50, EC10) koos usaldusvahemikuga ning graafik asjaomase näitaja arvutamiseks kasutatud lähendatud kõveraga, samuti kõik tulemuste tõlgendamist hõlbustavad andmed ja tähelepanekud. Kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja kõik katse ajal täheldatavad ebatavalised ilmingud. KIRJANDUS (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J., ja Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 lk. (3) Westheide, W., ja Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results. Väljaandes: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Toim. Esser, G., ja Overdieck, D., lk 497–508. Elsevier, Amsterdam. (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., ja Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 lk. (5) Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”. (6) Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate, No. 11268-1. Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon, Genf. (7) Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon, Genf. (8) Rundgren, S., ja Augustsson, A. K. (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovský, 1877). Väljaandes: Løkke, H., ja Van Gestel, C. A. M., Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, lk 73–94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7: 246–249. (11) Dunger, W., ja Fiedler, H. J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W. A. M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2–29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3: 19–24. (14) Römbke, J., ja Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests. Newsletter on Enchytraeidae No. 4, lk 79–96. (15) Römbke, J., Riepert, F., ja Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen. Väljaandes: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W., ja Eisentraeger, A. (toim.). Spektrum Verl., Heidelberg. Lk 59–81. (16) Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon, Genf. (17) Bell, A. W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, lk 1–13. (18) Nielsen, C. O., ja Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8–9, lk 1–160. (19) Bouguenec, V., ja Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23: 9–22. (20) Korinkova, J., ja Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting. Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, lk 300–305. (21) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3. väljaanne), lk 19–76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M. A., Russo, R. C., ja Thurston, R. V. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11: 714–719; parandus: Environ. Sci. Technol. 12 (1978): 417. (24) Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117. (25) Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531. (26) Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50: 1096–1121. (27) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. (28) van der Hoeven, N. (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355–361. (29) Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Stat. 6: 65–70. (30) Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika 41: 133–145. (31) Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking. Indagat. Math. 14: 327–333. (32) Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies. Appl. Stat. 28: 144–151. (33) Williams, D. A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control. Biometrics 42: 183–186. (34) Sokal, R. R., ja Rohlf, F. J. (1981). Biometry. The Principles and Practice of Statistics in Biological Research. 2. väljaanne. W. H. Freeman and Company, New York. (35) Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Res. 18: 213–221. (36) Van Ewijk, P. H., ja Hoekstra, J. A. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox. Environ. Safe. 25: 25–32. 1. liide Mõisted Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse järgmisi mõisteid. Kemikaal – aine või segu. ECx (kontsentratsioon, mille puhul mõju ulatus on x %)– kontsentratsioon, mille juures teatava kokkupuuteperioodi vältel katseorganismidele avalduva mõju ulatus on x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest. Käesoleva katsemeetodi puhul väljendatakse sellist kontsentratsiooni uuritava kemikaali massina katsemulla kuivmassi ühiku kohta. LC0 (kontsentratsioon, mille puhul surmav mõju puudub)– kontsentratsioon, mille juures uuritav kemikaal ei surma teatava aja jooksul ühtki kemikaaliga kokku puutunud katseorganismi. Käesoleva katsemeetodi puhul väljendatakse sellist kontsentratsiooni uuritava kemikaali massina katsemulla kuivmassi ühiku kohta. LC50 (kontsentratsioon, mille puhul sureb pool katseorganismidest)– kontsentratsioon, mille juures uuritav kemikaal surmab teatava aja jooksul 50 % kemikaaliga kokku puutunud katseorganismidest. Käesoleva katsemeetodi puhul väljendatakse LC50 uuritava kemikaali massina katsemulla kuivmassi ühiku kohta. LC100 (kontsentratsioon, mille puhul surevad kõik katseorganismid)– kontsentratsioon, mille juures uuritav kemikaal surmab teatava aja jooksul 100 % kemikaaliga kokku puutunud katseorganismidest. Käesoleva katsemeetodi puhul väljendatakse LC100 uuritava kemikaali massina katsemulla kuivmassi ühiku kohta. Vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) – uuritava kemikaali väikseim kontsentratsioon, mille juures täheldatakse statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju. Käesoleva katsemeetodi puhul väljendatakse sellist kontsentratsiooni uuritava kemikaali massina katsemulla kuivmassi ühiku kohta. Kõikidel sellisest kontsentratsioonist suurematel katsekontsentratsioonidel peaks üldjuhul täheldatama kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist mõju. Kõnealuse kontsentratsiooni määramisega seotud mis tahes kõrvalekaldeid eespool esitatud määratlusest tuleb katseprotokollis põhjendada. Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) – uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures ei täheldata mingit mõju ja mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool vähimat täheldatavat toimet avaldavat kontsentratsiooni. Käesoleva katsemeetodi puhul ei täheldata sellisel kontsentratsioonil teatava kokkupuuteperioodi vältel kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju. Sigivuse määr – katseperioodi jooksul sigitatud noorloomade keskmine arv teatava arvu täiskasvanud usside kohta. Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil. 2. liide Maksimaalse veemahutavuse määramine Kunstliku mulla veemahutavuse määramine On leitud, et veemahutavuse määramiseks sobib järgmine meetod. Seda kirjeldatakse standardi ISO/DIS 11268-2 C lisas. Sobiva seadme (puuriga toru vmt) abil kogutakse kindlaksmääratud kogus (nt 5 g) katsemulda. Toru alumine ots kaetakse filterpaberi tükiga ja pärast veega täitmist pannakse toru resti peale veevanni. Toru tuleks vette lasta vähehaaval, kuni veetase on mullapinnast kõrgemal. Seejärel tuleks toru umbes kolmeks tunniks vette jätta. Kuna muld ei suuda hoida kogu kapillaaridesse absorbeerunud vett, tuleks mullaproovil lasta kahe tunni vältel nõrguda, asetades toru väga märja peeneks jahvatatud kvartsliiva kihile, mis paikneb kuivamise ärahoidmiseks suletud nõus. Seejärel tuleks proov kaaluda ning kuivatada seda 105 °C juures, kuni selle kaal enam ei muutu. Veemahutavuse saab seejärel arvutada järgmise valemiga: , kus: S on veega küllastunud substraadi mass + toru mass + filterpaberi mass; T on tühimass (toru mass + filterpaberi mass); D on substraadi kuivmass. VIIDE Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon, Genf. 3. liide Mulla pH määramine Allpool kirjeldatud meetod mullaproovi pH määramiseks põhineb standardis ISO 10390 („Soil Quality – Determination of pH”) esitatud kirjeldusel. Kindlaksmääratud mullakogusel lastakse toatemperatuuril vähemalt 12 tundi kuivada. Seejärel valmistatakse vähemalt 5 grammi mulda sisaldav suspensioon, kasutades 1 M analüütilise puhtusastmega kaaliumkloriidi (KCl) või 0,01 M analüütilise puhtusastmega kaltsiumkloriidi (