Euroopa Liidu Teataja L 178 , 28/07/1995 Lk 0020 - 0035



Kuues komisjoni direktiiv 95/32/EÜ, 7. juuli 1995, mis käsitleb kosmeetikatoodete koostise kontrolliks vajalikke analüüsimeetodeid (EMPs kohaldatav tekst) EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 27. juuli 1976. aasta direktiivi 76/768/EMÜ liikmesriikides kosmeetikatoodete kohta vastuvõetud õigusaktide ühtlustamise kohta, [1] viimati muudetud komisjoni direktiiviga 94/32/EÜ, [2] eriti selle artikli 8 lõiget 1, ning arvestades, et: direktiiviga 76/768/EMÜ on ette nähtud kosmeetikatoodete ametlik katsetamine, et tagada kosmeetikatoodete koostist käsitlevate ühenduse õigusnormidega ettenähtud tingimuste täitmine; kõik vajalikud analüüsimeetodid tuleks sätestada niipea kui võimalik; teatavad meetodid on juba vastu võetud komisjoni direktiiviga 80/1335/EMÜ [3] (muudetud direktiiviga 87/143/EMÜ [4]), direktiiviga 82/434/EMÜ [5] (muudetud direktiiviga 90/207/EMÜ [6]) ning direktiividega 83/514/EMÜ, [7] 85/490/EMÜ [8] ja 93/73/EMÜ; [9] kuuendaks sammuks on bensoehappe, 4-hüdroksübensoehappe, sorbhappe, salitsüülhappe ja propioonhappe identifitseerimine ja määramine kosmeetikatoodetes ning hüdrokinooni, hüdrokinoonmonometüüleetri, hüdrokinoonmonoetüüleetri ja hüdrokinoonmonobensüüleetri identifitseerimine ja määramine kosmeetikatoodetes; käesolevas direktiivis sätestatud meetmed on kooskõlas direktiivi 76/768/EMÜ kohandamist tehnika arenguga käsitleva komitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI: Artikkel 1 Liikmesriigid võtavad kõik vajalikud meetmed tagamaks, et kosmeetikatoodete ametliku katsetamise käigus: - bensoehappe, 4-hüdroksübensoehappe, sorbhappe, salitsüülhappe ja propioonhappe identifitseerimine ja määramine, - hüdrokinooni, hüdrokinoonmonometüüleetri, hüdrokinoonmonoetüüleetri ja hüdrokinoonmonobensüüleetri identifitseerimine ja määramine viiakse läbi kooskõlas lisas kirjeldatud meetoditega. Artikkel 2 1. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 30. septembril 1996. Liikmesriigid teatavad nendest viivitamata komisjonile. Kui liikmesriigid kõnealused õigusaktid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid. 2. Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastu võetud siseriiklike õigusnormide teksti. Artikkel 3 Käesolev direktiiv jõustub 20. päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas. Artikkel 4 Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele. Brüssel, 7. juuli 1995 Komisjoni nimel komisjoni liige Emma Bonino [1] EÜT L 262, 27.9.1976, lk 169. [2] EÜT L 181, 15.7.1994, lk 31. [3] EÜT L 383, 31.12.1980, lk 27. [4] EÜT L 57, 27.2.1987, lk 56. [5] EÜT L 185, 30.6.1982, lk 1. [6] EÜT L 108, 28.4.1990, lk 92. [7] EÜT L 291, 24.10.1983, lk 9. [8] EÜT L 295, 7.11.1985, lk 30. [9] EÜT L 231, 14.9.1993, lk 34. -------------------------------------------------- LISA I. BENSOEHAPPE, 4-HÜDROKSÜBENSOEHAPPE, SORBHAPPE, SALITSÜÜLHAPPE JA PROPIOONHAPPE IDENTIFITSEERIMINE JA MÄÄRAMINE KOSMEETIKATOODETES 1. Rakendatavus ja rakendusala Meetodit kohaldatakse bensoehappe, 4-hüdroksübensoehappe, sorbhappe, salitsüülhappe ja propioonhappe identifitseerimisel ja määramisel kosmeetikatoodetes. Eraldi on kirjeldatud kõnealuste säilitusainete identifitseerimise, propioonhappe määramise ning 4-hüdroksübensoehappe, salitsüülhappe, sorbhappe ja bensoehappe määramise meetodeid. 2. Määratlus Käesoleva meetodiga määratud bensoehappe, 4-hüdroksübensoehappe, salitsüülhappe, sorbhappe ja propioonhappe sisaldust väljendatakse vabade hapete massiprotsendina. A. IDENTIFITSEERIMINE 1. Põhimõte Pärast säilitusainete happelist/aluselist ekstraheerimist analüüsitakse ekstrakti õhekihikromatograafia (ÕKK) abil, kasutades on-plate derivatsiooni. Sõltuvalt tulemustest toimub täiendav identifitseerimine kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) või propioonhappe puhul gaasikromatograafia abil. 2. Reaktiivid 2.1. Üldnõuded Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett. 2.2. Atsetoon 2.3. Dietüüleeter 2.4. Atsetonitriil 2.5. Tolueen 2.6. n-heksaan 2.7. Vedel parafiin 2.8. Soolhape, 4 M. 2.9. Kaaliumhüdroksiidi vesilahus, 4 M 2.10. Kaltsiumkloriid, CaCl2·2H2O 2.11. Liitiumkarbonaat, Li2CO3 2.12. 2-bromo-2’-atsetonaftoon 2.13. 4-hüdroksübensoehape 2.14. Salitsüülhape 2.15. Bensoehape 2.16. Sorbhape 2.17. Propioonhape 2.18. Võrdluslahused Valmistatakse kõigi viie säilitusaine (2.13–2.17) 0,1(massi/mahu)protsendilised lahused (100 mg/100 ml) dietüüleetris. 2.19. Derivatiseerimisreaktiiv 2-bromo-2’-atsetonaftooni (2.12) 0,5(massi/mahu)protsendiline lahus atsetonitriilis (2.4) (50 mg/10 ml). Kõnealust lahust tuleb valmistada iga nädal uuesti ja säilitada külmikus. 2.20. Katalüsaatori lahus Liitiumkarbonaadi (2.11) 0,3(massi/mahu)protsendiline vesilahus (300 mg/100 ml). Kõnealune lahus peab olema värskelt valmistatud. 2.21. Eluent Tolueen (2.5)/atsetoon (2.2) (mahuvahekorras 20:0,5). 2.22. Vedel parafiin (2.7)/n-heksaan (2.6) (mahuvahekorras 1:2). 3. Seadmed Tavalised laboriseadmed 3.1. Veevann, võimalik säilitada temperatuuri 60 °C 3.2. Kromatograafiakamber 3.3. UV-valgusallikas, lainepikkusega 254 ja 366 nm 3.4. ÕKK-plaadid, Kieselgel 60, fluorestsentsindikaatorita, 20 × 20 cm, kihi paksus 0,25 mm, kontsentreerimistsoon 2,5 × 20 cm (Merck 11845 või samaväärne) 3.5. Mikrosüstal, 10 μl 3.6. Mikrosüstal, 25 μl 3.7. Kuivatusahi, võimalik säilitada temperatuuri kuni 105 °C 3.8. 50 ml keeratavate korkidega katseklaasid 3.9. Filterpaber, läbimõõt 90 mm, Schleicher and Schull, Weissband nr 5892 või samaväärne 3.10. Universaalne pH-indikaatorpaber, pH 1–11 3.11. 5 ml klaaspudelid 3.12. Filter-pöördaurusti (Rotavapor või samaväärne) 3.13. Kuumutusplaat 4. Analüüsi käik 4.1. Proovi ettevalmistamine Ligikaudu 1 g proovi kaalutakse 50 ml keeratava korgiga katseklaasi (3.8). Lisatakse neli tilka 4 M soolhapet (2.8) ja 40 ml atsetooni (2.2). Tugevalt aluseliste toodete, näiteks tualettseebi puhul tuleks lisada 20 tilka 4 M soolhapet (2.8). Kontrollitakse indikaatorpaberiga (3.10), et pH oleks ligikaudu 2. Suletakse katseklaas ja loksutatakse tugevasti üks minut. Kui on vaja hõlbustada säilitusainete ekstraheerimist atsetoonifaasiks, kuumutatakse segu kergelt kuni temperatuurini 60 °C, et vedelfaas sulaks. Lahus jahutatakse toatemperatuurini ja filtreeritakse läbi filterpaberi (3.9) koonilisse kolbi. 20 ml filtraati viiakse 200 ml koonilisse kolbi, lisatakse 20 ml vett ja segatakse. Segu pH viiakse 4 M kaaliumhüdroksiidiga (2.9) umbes 10ni, kasutades pH mõõtmiseks indikaatorpaberit (3.10). Lisatakse 1 g kaltsiumkloriidi (2.10) ja loksutatakse tugevasti. Filtreeritakse läbi filterpaberi (3.9) 25 ml jaotuslehtrisse, milles on 75 ml dietüüleetrit (2.3) ja loksutatakse tugevasti üks minut. Lastakse kihistuda ja valatakse veekiht 250 ml koonilisse kolbi. Eetrikiht visatakse ära. Indikaatorpaberiga (3.10) viiakse vesilahuse pH 4 M soolhappega (2.8) umbes kaheni. Lisatakse 10 ml dietüüleetrit (2.3), suletakse kolb ja loksutatakse tugevasti üks minut. Lastakse kihistuda ja viiakse eetrikiht filter-pöördaurustisse (3.12). Veekiht visatakse ära. Eetrikiht aurutatakse peaaegu kuivaks ja jääk lahustatakse uuesti 1 ml dietüüleetris (2.3). Lahus viiakse klaaspudelisse (3.11). 4.2. Õhekihikromatograafia Iga kromatografeeritava võrdluslahuse ja proovi kohta kantakse ligikaudu 3 μl liitiumkarbonaadi lahust (2.20) süstlaga (3.5) võrdsete vahedega ÕKK-plaadi (3.4) kontsentratsioonitsooni stardijoonele ja kuivatatakse külma õhu joaga. ÕKK-plaat pannakse temperatuurini 40 °C soojendatud kuumutusplaadile (3.13), et hoida laigud võimalikult väiksed. Mikrosüstlaga (3.5) kantakse 10 μl kõiki võrdluslahuseid (2.18) ja proovilahust (4.1) plaadi stardijoonele täpselt samadele kohtadele, kuhu on kantud liitiumkarbonaadi lahust. Lõpuks kantakse ligikaudu 15 μl derivatiseerimisreaktiivi (2.19) (2-bromo-2’-atsetonaftooni lahus) samuti täpselt nendele kohtadele, kuhu on kantud võrdlus- ja proovilahuseid ning liitiumkarbonaadi lahust. ÕKK-plaati kuumutatakse kuivatusahjus (3.7) temperatuuril 80 °C 45 minutit. Pärast jahutamist elueeritakse kromatograafiakambris (3.2), mida on tasakaalustatud 15 minutit (ilma filterpabervooderdiseta), kasutades punktis 2.21 nimetatud eluenti (tolueen/atsetoon), kuni lahusti piir on tõusnud 15 cm kõrgusele (selleks võib kuluda ligikaudu 80 minutit). Plaat kuivatatakse külma õhu joas ja tekkinud laike vaadeldakse UV-valguses (3.3). Nõrkade laikude fluorestseerumise suurendamiseks võib ÕKK-plaadi kasta vedela parafiini ja n-heksaani segusse (2.22). 5. Identifitseerimine Arvutatakse iga laigu Rf. Võrreldakse proovi ja võrdluslahuste puhul saadud Rf väärtusi ning nende laikude käitumist UV-valguses. Tehakse esialgne järeldus selle kohta, missuguseid säilitusaineid toode sisaldab. Tehakse B osaosas kirjeldatud vedelikkromatograafiline analüüs või kui ilmneb propioonhappe olemasolu, siis tehakse C osas kirjeldatud gaasikromatograafiline analüüs. Saadud retentsiooniaegu võrreldakse võrdluslahuste retentsiooniaegadega. Ühendatakse õhekihikromatografeerimise, kõrgefektiivse vedelikkromatografeerimise ja gaasikromatografeerimise tulemused ning koondtulemuste põhjal identifitseeritakse lõplikult proovis sisalduvad säilitusained. B. BENSOEHAPPE, 4-HÜDROKSÜBENSOEHAPPE, SORBHAPPE JA SALITSÜÜLHAPPE MÄÄRAMINE 1. Põhimõte Pärast hapestamist ekstraheeritakse proovi etanooli ja vee seguga. Pärast filtreerimist määratakse säilitusained kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil. 2. Reaktiivid 2.1. Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad ja vajaduse korral sobivad kõrgefektiivse vedelikkromatograafia jaoks. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett. 2.2. Absoluutne etanool 2.3. 4-hüdroksübensoehape 2.4. Salitsüülhape 2.5. Bensoehape 2.6. Sorbhape 2.7. Naatriumatsetaat, CH3COONa·3H2O) 2.8. Äädikhape (α)420 = 1,05 g/ml 2.9. Atsetonitriil 2.10. Väävelhape, 2 M 2.11. Kaaliumhüdroksiidi vesilahus, 0,2 M 2.12. 2-metoksübensoehape 2.13. Etanooli ja vee segu Segatakse üheksa mahuosa etanooli (2.2) ja üks mahuosa vett (2:1). 2.14. Sisestandardi lahus Valmistatakse lahus, mis sisaldab ligikaudu 1 g 2-metoksübensoehapet (2.12) 500 milliliitris etanooli ja vee segus (2.13). 2.15. HPLC liikuv faas 2.15.1. Atsetaatpuhver: ühele liitrile veele lisatakse 6,35 g naatriumatsetaati (2.7) ja 20,0 ml äädikhapet (2.8) ning segatakse. 2.15.2. Valmistatakse liikuv faas, segades üheksa mahuosa atsetaatpuhvrit (2.15.1) ja üks mahuosa atsetonitriili (2.9). 2.16. Säilitusaine põhilahus 50 ml mõõtekolbi kaalutakse hoolikalt ligikaudu 0,05 g 4-hüdroksübensoehapet (2.3), 0,2 g salitsüülhapet (2.4), 0,2 g bensoehapet (2.5) ja 0,05 g sorbhapet (2.6) ning täiendatakse märgini etanooli ja vee seguga (2.13). Kõnealust lahust säilitatakse külmikus. Lahus säilib üks nädal. 2.17. Säilitusainete standardlahused 20-ml mõõtekolbidesse viiakse vastavalt 8,00 ml, 4,00 ml, 2,00 ml, 1,00 ml ja 0,50 ml põhilahust (2.16). Igasse kolbi lisatakse 10,00 ml sisestandardi lahust (2.14) ja 0,5 ml 2 M väävelhapet (2.10). Täiendatakse märgini etanooli ja vee seguga (2.13). Kõnealused lahused peavad olema värskelt valmistatud. 3. Seadmed Mujal määratlemata tavapärased laboriseadmed ja järgmised seadmed: 3.1. Veevann, reguleeritud temperatuurile 60 °C 3.2. Kõrgefektiivne vedelikkromatograaf muudetava lainepikkusega UV-detektoriga ja 10 μl sissesüstimissilmusega. 3.3. Analüütiline kolonn Roostevabast terasest, pikkus 12,5–25 cm, siseläbimõõt 4,6 mm, täidiseks Nucleosil 5C18 või samaväärne. 3.4. Filterpaber, läbimõõt 90 mm, Schleicher and Schull, Weissband nr 5892 või samaväärne 3.5. 50 ml keeratavate korkidega katseklaasid 3.6. 5 ml klaaspudelid 3.7. Karborundist keedukivikesed, suurusega 2–4 mm või samaväärsed 4. Analüüsi käik 4.1. Proovi ettevalmistamine 4.1.1. Proovi ettevalmistamine ilma sisestandardit lisamata 1 g proovi kaalutakse 50 ml keeratava korgiga katseklaasi (3.5). Katseklaasi pipeteeritakse 1,00 ml 2 M väävelhapet (2.10) ning 40,0 ml etanooli ja vee segu (2.13). Lisatakse ligikaudu 1 g keedukivikesi (3.7), suletakse katseklaas ja loksutatakse tugevasti vähemalt üks minut, kuni saadakse homogeenne suspensioon. Et hõlbustada säilitusainete ekstraheerimist etanoolifaasiks, asetatakse katseklaas täpselt viieks minutiks veevanni (3.1) temperatuurile 60 °C. Katseklaas jahutatakse kohe jooksvas külmas vees ja ekstrakti hoitakse üks tund temperatuuril 5 °C. Ekstrakt filtreeritakse läbi filterpaberi (3.4). Ligikaudu 2 ml ekstrakti viiakse klaaspudelisse (3.6). Ekstrakti säilitatakse temperatuuril 5 °C ja kõrgefektiivne vedelikkromatograafiline määramine viiakse läbi 24 tunni jooksul pärast valmistamist. 4.1.2. Proovi ettevalmistamine sisestandardit lisades Kolme kümnendkoha täpsusega kaalutakse 1 ± 0,1 g (a grammi) proovi 50 ml keeratava korgiga katseklaasi (3.5). Pipeteerides lisatakse 1,00 ml 2 M väävelhapet (2.10) ning 30,0 ml etanooli ja vee segu (2.13). Lisatakse ligikaudu 1 g keedukivikesi (3.7) ja 10,00 ml sisestandardi lahust (2.14). Katseklaas suletakse ja loksutatakse tugevasti vähemalt üks minut, kuni saadakse homogeenne suspensioon. Et hõlbustada säilitusainete ekstraheerimist etanoolifaasiks, asetatakse katseklaas täpselt viieks minutiks veevanni (3.1) temperatuurile 60 °C. Katseklaas jahutatakse kohe jooksvas külmas vees ja ekstrakti hoitakse üks tund temperatuuril 5 °C. Ekstrakt filtreeritakse läbi filterpaberi (3.4). Ligikaudu 2 ml filtraati viiakse klaaspudelisse (3.6). Filtraati säilitatakse temperatuuril 5 °C ja kõrgefektiivne vedelikkromatograafiline määramine viiakse läbi 24 tunni jooksul pärast valmistamist. 4.2. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia Liikuv faas: atsetonitriil/atsetaatpuhver (2.15) Liikuva faasi voolukiiruseks kolonnis reguleeritakse 2,0 ± 0,5 ml/min. Detektor reguleeritakse lainepikkusele 240 nm. 4.2.1. Kalibreerimine Vedelikkromatograafi (3.2) süstitakse 10 μl kõiki säilitusainete standardlahuseid (2.17). Iga lahuse kohta määratakse kromatogrammi järgi uuritavate säilitusainete piikide kõrguste ja sisestandardi piigi kõrguse suhe. Iga säilitusaine kohta joonestatakse graafik piikide kõrguste suhte ja iga standardlahuse kontsentratsiooni alusel. Veendutakse, et standardlahuste kohta saadud kalibreerimistulemus on lineaarne. 4.2.2. Määramine Vedelikkromatograafi (3.2) süstitakse 10 μl prooviekstrakti (4.1.1) ja registreeritakse kromatogramm. Süstitakse 10 μl säilitusainete standardlahust (2.17) ja registreeritakse kromatogramm. Võrreldakse saadud kromatogramme. Kui prooviekstrakti (4.1.1) kromatogrammil ei ole piike, mille retentsiooniaeg oleks ligilähedane 2-metoksübensoehappe (soovitatud sisestandard) retentsiooniajale, süstitakse vedelikkromatograafi 10 μl prooviekstrakti, millele on lisatud sisestandardit (4.1.2) ning registreeritakse kromatogramm. Kui prooviekstrakti (4.1.1) kromatogrammil täheldatakse segavat piiki, mille retentsiooniaeg on analoogne 2-metoksübensoehappe retentsiooniajaga, tuleks valida mõni muu sobiv sisestandard. Kui kromatogrammilt puudub mõni uuritav säilitusaine, võib sisestandardina kasutada kõnealust ainet. Veendutakse, kas standardlahuse ja proovilahuse kohta saadud kromatogrammid vastavad järgmistele nõuetele: - piikide eraldatus ei tohi kõige halvemini eraldatud paari puhul olla väiksem kui 0,90. (Piikide eraldatus on määratletud joonisel 1). +++++ TIFF +++++ Joonis 1: Piikide eraldatus Kui vajalik eraldatus puudub, tuleks kas kasutada tõhusamat kolonni või reguleerida liikuva faasi koostist, kuni nõue on täidetud. - Kõikide piikide asümmeetriategur As peaks jääma vahemikku 0,9–1,5. (Piikide asümmeetriategur on määratletud joonisel 2). Kromatogrammi registreerimisel asümmeetriateguri määramiseks on isekirjuti lindi soovitatav liikumiskiirus vähemalt 2 cm/min. +++++ TIFF +++++ Joonis 2: Piikide asümmeetriategur - Lähtejoon peab olema püsiv. 5. Arvutamine Proovilahuse happeliste säilitusainete sisalduse arvutamiseks kasutatakse uuritavate säilitusainete piikide kõrguste ja 2-metoksübensoehappe piigi kõrguse suhet ning kalibreerimisgraafikut. Proovi bensoehappe-, 4-hüdroksübensoehappe-, sorbhappe- või salitsüülhappesisaldus massiprotsentides (xi) arvutatakse järgmise valemi alusel: x % = 10 · a = b500 · a kus: a = katsekoguse (4.1.2) mass grammides, b = säilitusaine sisaldus (μg/ml) prooviekstraktis (4.1.2) vastavalt kalibreerimisgraafikule. 6. Korratavus [1] Kui 4-hüdroksübensoehappe sisaldus on 0,40 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,035 %. Kui bensoehappe sisaldus on 0,50 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,050 %. Kui salitsüülhappe sisaldus on 0,50 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,045 %. Kui sorbhappe sisaldus on 0,60 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,035 %. 7. Märkused 7.1. Meetodi suhtes läbiviidud püsivustesti tulemused on näidanud, et proovist hapete ekstraheerimiseks lisatud väävelhappe kogus on oluline ja et töödeldava proovi koguse puhul tuleks järgida ettenähtud piirnorme. 7.2. Soovi korral võib kasutada sobivat eelkolonni. C. PROPIOONHAPPE MÄÄRAMINE 1. Rakendatavus ja rakendusala Käesolev meetod sobib maksimaalselt 2massiprotsendilise propioonhappesisalduse määramiseks kosmeetikatoodetes. 2. Määratlus Käesoleva meetodiga mõõdetud propioonhappesisaldust tootes väljendatakse massiprotsendina. 3. Põhimõte Pärast propioonhappe ekstraheerimist tootest määratakse see gaasikromatograafiliselt, kasutades sisestandardina 2-metüülpropioonhapet. 4. Reaktiivid Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad; kasutama peab destilleeritud või samaväärse puhtusastmega vett. 4.1. Etanool, 96mahuprotsendiline 4.2. Propioonhape 4.3. 2-metüülpropioonhape 4.4. Ortofosforhape, 10(massi/mahu)protsendiline 4.5. Propioonhappe lahus 50 ml mõõtekolbi kaalutakse ligikaudu 1,00 g (p grammi) propioonhapet ja kolb täidetakse märgini etanooliga (4.1). 4.6. Sisestandardi lahus 50 ml mõõtekolbi kaalutakse ligikaudu 1,00 g (e grammi) 2-metüülpropioonhapet ja kolb täidetakse märgini etanooliga (4.1). 5. Seadmed 5.1. Tavalised laboriseadmed 5.2. Leekionisatsioonidetektoriga gaasikromatograaf 5.3. Keeratava korgiga katseklaas (20 × 150 mm) 5.4. Veevann, temperatuuril 60 °C 5.5. 10 ml klaassüstal membraanfiltriga (pooride läbimõõt: 0,45 μm). 6. Analüüsi käik 6.1. Proovi ettevalmistamine 6.1.1. Proovi ettevalmistamine sisestandardit lisamata Katseklaasi (5.3) kaalutakse ligikaudu 1 g proovi. Lisatakse 0,5 ml fosforhapet (4.4) ja 9,5 ml etanooli (4.1). Katseklaas suletakse ja loksutatakse tugevasti. Vajaduse korral pannakse katseklaas viieks minutiks temperatuurini 60 °C kuumutatud veevanni (5.4), et lipiidfaas lahustuks täielikult. Jahutatakse kiiresti voolava vee all. Osa lahusest filtreeritakse läbi membraanfiltri (5.5). Filtraat kromatografeeritakse samal päeval. 6.1.2. Proovi ettevalmistamine sisestandardit lisades Kolme kümnendkoha täpsusega kaalutakse 1 ± 0,1 g (a grammi) proovi katseklaasi (5.3). Lisatakse 0,5 ml fosforhapet (4.4), 0,50 ml sisestandardi lahust (4.6) ja 9 ml etanooli (4.1). Katseklaas suletakse ja loksutatakse tugevasti. Vajaduse korral pannakse katseklaas viieks minutiks temperatuurile 60 °C kuumutatud veevanni (5.4), et lipiidfaas lahustuks. Jahutatakse kiiresti voolava vee all. Osa lahusest filtreeritakse läbi membraanfiltri (5.5). Filtraat kromatografeeritakse samal päeval. 6.2. Gaasikromatograafia tingimused Soovitatakse järgmisi töötingimusi: Kolonn Tüüp | Roostevabast terasest | Pikkus | 2 m | Läbimõõt | 1/8'' | Kolonni täidis | 10 % SPTM 1000 (või samaväärne) + 1 % H3PO4Chromosorb WAW’l 100–120 mešši | Temperatuur Aurusti | 200 °C | Kolonn | 120 °C | Detektor | 200 °C | Kandegaas | Lämmastik | Voolukiirus | 25 ml/min | 6.3. Kromatograafia 6.3.1. Kalibreerimine 20-ml mõõtekolbidesse pipeteeritakse vastavalt 0,25 ml, 0,50 ml, 1,00 ml, 2,00 ml ja 4,00 ml propioonhappe lahust (4.5). Igasse mõõtekolbi pipeteeritakse 1,00 ml sisestandardi lahust (4.6); täiendatakse etanooliga (4.1) märgini ja segatakse. Sel viisil valmistatud lahused sisaldavad sisestandardina e mg/ml 2-metüülpropioonhapet (kui e = 1000, siis 1 mg/ml) ning p/4, p/2, p, 2p ja 4p mg/ml propioonhapet (kui p = 1000, siis 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml, 1,00 mg/ml, 2,00 mg/ml ja 4,00 mg/ml). Süstitakse 1 μl kõnealuseid lahuseid ja joonestatakse kalibreerimiskõver, kandes x-teljele propioonhappe ja 2-metüülpropioonhappe masside suhte ning y-teljele vastavate piikide pindalade suhte. Kõiki lahuseid süstitakse kolm korda ja arvutatakse keskmine piikide pindalade suhe. 6.3.2. Määramine Süstitakse 1 μl proovi filtraati (6.1.1). Kromatogrammi võrreldakse standardlahuste (6.3.1) kromatogrammiga. Kui piigi retentsiooniaeg on ligilähedane 2-metüülpropioonhappe retentsiooniajaga, vahetatakse sisestandardit. Kui segavaid tegureid ei täheldata, süstitakse 1 μl proovi filtraati (6.1.2) ning mõõdetakse propioonhappe ja sisestandardi piikide pindalad. Kõiki lahuseid süstitakse kolm korda ja arvutatakse keskmine piikide pindalade suhe. 7. Arvutamine 7.1. Punkti 6.3.1 kohaselt saadud kalibreerimiskõveralt saadakse masside suhe (K), mis vastab punkti 6.3.2 kohaselt arvutatud piikide pindalade suhtele. 7.2. Sel viisil saadud masside suhte alusel arvutatakse proovi propioonhappesisaldus (X) massiprotsentides järgmise valemi abil: x % = K = K ea kus: K = punkti 7.1 kohaselt arvutatud suhe, e = punktis 4.6 kasutatud sisestandardi mass grammides, a = punktis 6.1.2 kasutatud proovi mass grammides. Tulemused ümardatakse esimese kümnendkohani. 8. Korratavus [2] Kui propioonhappesisaldus on 2 massiprotsenti, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe ületada 0,12 %. II. HÜDROKINOONI, HÜDROKINOONMONOMETÜÜLEETRI, HÜDROKINOONMONOETÜÜLEETRI JA HÜDROKINOONMONOBENSÜÜLEETRI IDENTIFITSEERIMINE JA MÄÄRAMINE KOSMEETIKATOODETES A. IDENTIFITSEERIMINE 1. Rakendatavus ja rakendusala Meetod kirjeldab hüdrokinooni, hüdrokinoonmonometüüleetri, hüdrokinoonmonoetüüleetri ja hüdrokinoonmonobensüüleetri (monobensoon) kindlaksmääramist ja identifitseerimist naha pleegitamiseks ettenähtud kosmeetikatoodetes. 2. Põhimõte Hüdrokinoon ja selle eetrid identifitseeritakse õhekihikromatograafia (ÕKK) abil. 3. Reaktiivid Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. 3.1. Etanool, 96mahuprotsendiline 3.2. Kloroform 3.3. Dietüüleeter 3.4. Eluent: kloroform/dietüüleeter (mahuvahekorras 66:33) 3.5. Ammoniaak, 25massiprotsendiline (d420 = 0,91 g/ml) 3.6. Askorbiinhape 3.7. Hüdrokinoon 3.8. Hüdrokinoonmonometüüleeter 3.9. Hüdrokinoonmonoetüüleeter 3.10. Hüdrokinoonmonobensüüleeter (monobensoon) 3.11. Võrdluslahused Järgmised võrdluslahused peavad olema värskelt valmistatud ja säilivad muutumatuna ühe päeva. 3.11.1. 0,05 g hüdrokinooni (3.7) kaalutakse 10 ml büretti. Lisatakse 0,250 g askorbiinhapet (3.6) ja 5 ml etanooli (3.1). Lisatakse ammoniaaki (3.5), kuni pH on 10 ja täiendatakse etanooliga (3.1) 10 milliliitrini. 3.11.2. 0,05 g hüdrokinoonmonometüüleetrit (3.8) kaalutakse 10 ml büretti. Lisatakse 0,250 g askorbiinhapet (3.6) ja 5 ml etanooli (3.1). Lisatakse ammoniaaki (3.5), kuni pH on 10 ja täiendatakse etanooliga (3.1) 10 milliliitrini. 3.11.3. 0,05 g hüdrokinoonmonoetüüleetrit (3.9) kaalutakse 10 ml büretti. Lisatakse 0,250 g askorbiinhapet (3.6) ja 5 ml etanooli (3.1). Lisatakse ammoniaaki (3.5), kuni pH on 10 ja täiendatakse etanooliga (3.1) 10 milliliitrini. 3.11.4. 0,05 g hüdrokinoonmonobensüüleetrit (3.10) kaalutakse 10 ml büretti. Lisatakse 0,250 g askorbiinhapet (3.6) ja 5 ml etanooli (3.1). Lisatakse ammoniaaki (3.5), kuni pH on 10 ja täiendatakse etanooliga (3.1) 10 milliliitrini. 3.12. Hõbenitraat 3.13. 12-molübdofosforhape 3.14. Kaaliumraud(III)tsüaniidheksahüdraat 3.15. Raud(III)kloriidheksahüdraat 3.16. Ilmutamisreaktiivid 3.16.1. 5(massi/mahu)protsendilisele hõbenitraadi vesilahusele (3.12) lisatakse ammoniaaki (3.5), kuni moodustunud sade lahustub. Hoiatus: lahus muutub seistes plahvatusohtlikuks ja tuleb pärast kasutamist ära visata. 3.16.2. 12-molübdofosforhappe (3.13) 10-massi/mahu% lahus etanoolis (3.1). 3.16.3. Valmistatakse kaalium(III)raudtsüaniidi (3.14) (3.14) 1(massi/mahu)protsendiline vesilahus ja raud(III)kloriidi (3.15) 2(massi/mahu)protsendiline vesilahus. Lahused segatakse võrdses koguses vahetult enne kasutamist. 4. Seadmed Tavalised laboriseadmed ja 4.1. Tavalised ÕKK-seadmed 4.2. ÕKK-plaadid, kasutusvalmis: silikageel GHR/UV254; 20 × 20 cm (Machery, Nagel või samaväärsed). Kihi paksus 0,25 mm. 4.3. Ultrahelivann 4.4. Tsentrifuug 4.5. UV-lamp, 254 nm 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine 3,0 g proovi kaalutakse 10 ml büretti. Lisatakse 0,250 g askorbiinhapet (3.6) ja 5 ml etanooli (3.1). Lahuse pH viiakse ammoniaagiga (3.5) 10ni. Täiendatakse etanooliga (3.1) 10 milliliitrini. Bürett suletakse korgiga ja homogeniseeritakse ultrahelivannis 10 minutit. Filtreeritakse läbi filterpaberi või tsentrifuugitakse kiirusel 3000 pööret minutis. 5.2. ÕKK 5.2.1. Kromatograafiakamber küllastatakse eluendiga (3.4). 5.2.2. Plaadile kantakse 2 μl vordluslahuseid (3.11) ja 2 μl proovilahust (5.1). Elueeritakse pimedas toatemperatuuril, kuni lahusti piir on tõusnud lähtejoonest 15 cm kõrgusele. 5.2.3. Plaat võetakse kambrist välja ja lastakse kuivada toatemperatuuril. 5.3. Määramine 5.3.1. Plaati vaadeldakse UV-valguses lainepikkusel 254 nm ja tähistatakse laikude asukoht. 5.3.2. Plaadile pihustatakse: - hõbenitraadi reaktiivi (3.16.1) või - 12-molübdofosforhappe reaktiivi (3.16.2); kuumutatakse temperatuurini umbes 120 °C, või - kaaliumraud(III)tsüaniidi lahust ja raud(III)kloriidi lahust (3.16.3). 6. Identifitseerimine Arvutatakse iga laigu Rf väärtus. Võrreldakse proovilahuse ja võrdluslahuste kohta saadud laike, võttes arvesse järgmisi asjaolusid: Rf väärtused, laikude värvus UV-valguses ning laikude värvus pärast ilmutamisreaktiiviga ilmutamist. Tehakse järgmises osas (B) kirjeldatud kõrgefektiivne vedelikkromatograafiline (HPLC) analüüs ning võrreldakse proovilahuse ja võrdluslahuste piikide retentsiooniaegu. Hüdrokinooni ja/või selle eetrite olemasolu identifitseerimiseks ühendatakse ÕKK ja HPLC analüüsi tulemused. 7. Märkused Kirjeldatud tingimustel on saadud järgmised Rf väärtused: hüdrokinoon: | 0,32 | hüdrokinoonmonometüüleeter: | 0,53 | hüdrokinoonmonoetüüleeter: | 0,55 | hüdrokinoonmonobensüüleeter: | 0,58 | B. MÄÄRAMINE 1. Rakendatavus ja rakendusala Käesolevas meetodis on määratletud hüdrokinooni, hüdrokinoonmonometüüleetri, hüdrokinoonmonoetüüleetri ja hüdrokinoonmonobensüüleetri määramise tingimused naha pleegitamiseks ettenähtud kosmeetikatoodetes. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse vee ja metanooli seguga, kuumutades seda kergelt, et sulatada lipiidid. Saadud lahuses määratakse uuritavad ained pöördfaasilise vedelikkromatograafia abil, kasutades UV-detektorit. 3. Reaktiivid 3.1. Kõik reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Kasutada tuleb destilleeritud või vähemalt samaväärse puhtusastmega vett. 3.2. Metanool 3.3. Hüdrokinoon 3.4. Hüdrokinoonmonometüüleeter 3.5. Hüdrokinoonmonoetüüleeter 3.6. Hüdrokinoonmonobensüüleeter (monobensoon) 3.7. Tetrahüdrofuraan, puhas HPLC jaoks. 3.8. Vee ja metanooli segu (mahuvahekorras 1:1). Segatakse üks mahuosa vett ja üks mahuosa metanooli (3.2). 3.9. Liikuv faas: tetrahüdrofuraani ja vee segu (mahuvahekorras 45:55). Segatakse 45 mahuosa tetrahüdrofuraani (3.7) ja 55 mahuosa vett. 3.10. Võrdluslahus 50 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,06 g hüdrokinooni (3.3), 0,08 g hüdrokinoonmonometüüleetrit (3.4), 0,10 g hüdrokinoonmonoetüüleetrit (3.5) ja 0,12 g hüdrokinoonmonobensüüleetrit (3.6). Lahustatakse ja täiendatakse märgini metanooliga (3.2). Valmistatakse võrdluslahus, lahjendades 10,00 ml kõnealust lahust 50,00 milliliitrini vee ja metanooli seguga (3.8). Kõnealused lahused peavad olema värskelt valmistatud. 4. Seadmed Tavalised laboriseadmed ja: 4.1. Veevann, võimalik säilitada temperatuuri 60 °C. 4.2. Kõrgefektiivne vedelikkromatograaf muudetava lainepikkusega UV-detektoriga ja 10 μl sissesustimissilmusega. 4.3. Analüütiline kolonn: roostevabast terasest kromatograafiakolonn, pikkus 250 mm, siseläbimõõt 4,6 mm, täidiseks Zorbax fenüül (keemiliselt seotud fenetüülsilaan Zorbax SIL’l, deaktiveeritud trimetüülkloorsilaaniga), osakeste suurus 6 μm, või samaväärne. Eelkolonni ei kasutata, v.a fenüülkaitse või samaväärne. 4.4. Filterpaber, läbimõõt 90 mm, Schleicher and Schull, Weissband nr 5892 või samaväärne. 5. Analüüsi käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Kolme kümnendkoha täpsusega kaalutakse 1 ± 0,1 g (a grammi) proovi 50 ml mõõtekolbi. Proov dispergeeritakse 25 milliliitris vee ja metanooli segus (3.8). Kolb suletakse ja seda loksutatakse tugevasti, kuni saadakse homogeenne suspensioon. Loksutatakse vähemalt üks minut. Kolb pannakse veevanni (4.1) temperatuurile 60 °C, et tõhustada ekstraheerimist. Kolb jahutatakse ja täidetakse märgini vee ja metanooli seguga (3.8). Ekstrakt filtreeritakse läbi filterpaberi (4.4). Kõrgefektiivne vedelikkromatograafiline analüüs tehakse 24 tunni jooksul pärast ekstrakti valmistamist. 5.2. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia 5.2.1. Liikuva faasi (3.9) voolukiiruseks reguleeritakse 1,0 ml/min ja detektori lainepikkuseks 295 nm. 5.2.2. Süstitakse 10 μl punkti 5.1 kohaselt saadud proovilahust ja registreeritakse kromatogramm. Mõõdetakse piikide pindalad. Kalibreeritakse punktis 5.2.3 kirjeldatud viisil. Võrreldakse proovilahuse ja standardlahuste kohta saadud kromatogramme. Uuritavate ainete sisalduse arvutamisel proovilahuses kasutatakse piikide pindalasid ja punkti 5.2.3 kohaselt leitud kalibreerimistegureid (RF). 5.2.3. Kalibreerimine Süstitakse 10 μl võrdluslahust (3.10) ja registreeritakse kromatogramm. Süstitakse mitu korda, kuni saadakse püsiva pindalaga piik. Määratakse kalibreerimistegur RFi: RF = p c i kus: pi = hüdrokinooni, hüdrokinoonmonometüüleetri, hüdrokinoonmonoetüüleetri või hüdrokinoonmonobensüüleetri piigi pindala, ci = hüdrokinooni, hüdrokinoonmonometüüleetri, hüdrokinoonmonoetüüleetri või hüdrokinoonmonobensüüleetri sisaldus (g/50 ml) võrkdluslahuses (3.10). Veendutakse, kas standardlahuse ja proovilahuse kohta saadud kromatogrammid vastavad järgmistele nõuetele: - piikide eraldatus ei tohi kõige halvemini eraldatud paari puhul olla väiksem kui 0,90. (Piikide eraldatus on määratletud joonisel 1). +++++ TIFF +++++ Joonis 1: Piikide eraldatus Kui vajalik eraldatus puudub, tuleks kas kasutada tõhusamat kolonni või reguleerida liikuva faasi koostist, kuni nõue on täidetud. - piikide asümmeetriategur AS peaks jääma vahemikku 0,9–1,5. (Piikide asümmeetriategur on määratletud joonisel 2). Kromatogrammi registreerimisel asümmeetriateguri määramiseks on isekirjuti lindi soovitatav liikumiskiirus vähemalt 2 cm/min. +++++ TIFF +++++ Joonis 2: Piikide asümmeetriategur - Lähtejoon peab olema püsiv. 6. Arvutamine Analüüsitava(te) aine(te) sisalduse arvutamiseks proovis kasutatakse nimetatud aine või ainete piikide pindalasid. Analüüsitava aine sisaldus proovis massiprotsentides (xi) arvutatakse järgmise valemi alusel: x % = b · 100 RF · a kus: a = proovi mass grammides, bi = proovis analüüsitava aine piigi pindala. 7. Korratavus [3] 7.1. Kui hüdrokinoonisisaldus on 2,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,13 %. 7.2. Kui hüdrokinoonmonometüüleetri sisaldus on 1,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,1 %. 7.3. Kui hüdrokinoonmonoetüüleetri sisaldus on 1,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,11 %. 7.4. Kui hüdrokinoonmonobensüüleetri sisaldus on 1,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist samaaegselt tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,11 %. 8. Reprodutseeritavus [4] 8.1. Kui hüdrokinoonisisaldus on 2,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist eri tingimustel (eri laborid, eri analüüsijad, eri seadmed ja/või eri aeg) tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,37 %. 8.2. Kui hüdrokinoonmonometüüleetri sisaldus on 1,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist eri tingimustel (eri laborid, eri analüüsijad, eri seadmed ja/või eri aeg) tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,21 %. 8.3. Kui hüdrokinoonmonoetüüleetri sisaldus on 1,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist eri tingimustel (eri laborid, eri analüüsijad, eri seadmed ja/või eri aeg) tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,19 %. 8.4. Kui hüdrokinoonmonobensüüleetri sisaldus on 1,0 %, ei tohiks ühest ja samast proovist eri tingimustel (eri laborid, eri analüüsijad, eri seadmed ja/või eri aeg) tehtud kahe määramise tulemuste vahe absoluutväärtuses ületada 0,11 %. 9. Märkused 9.1. Kui leitakse, et hüdrokinoonisisaldus on märgatavalt suurem kui 2 % ja sisaldus on vaja täpselt määrata, tuleb prooviekstrakti (5.1) lahjendada nii palju, et hüdrokinoonisisaldus vastaks 2protsendilise proovi sisaldusele ning määramist korrata. (Mõne seadme puhul võib detektori neelduvus jääda suure hüdrokinoonisisalduse korral väljapoole lineaarset ala.) 9.2. Segavad tegurid Eespool kirjeldatud meetod võimaldab määrata hüdrokinooni ja selle eetreid ühe isokraatse analüüsiga. Fenüülkolonni kasutamine tagab hüdrokinooni piisava retentsiooni, mida ei ole võimalik tagada, kui kirjeldatud liikuva faasiga kasutatakse C18 kolonni. Kuid käesolev meetod on vastuvõtlik segavatele teguritele, mida võivad põhjustada mitmed parabeenid. Sellistel juhtudel tuleks korrata määramist teistsuguse liikuva/statsionaarse faasiga. Sobivaid meetodeid võib leida viidetest 1 ja 2, täpsemalt: Kolonn: Zorbax ODS, 4,6 mm × 25 mm, või samaväärne: temperatuur: 36 °C, voolukiirus: 1,5 ml/min, liikuv faas: hüdrokinooni puhul: metanool/vesi (mahuvahekorras 5:95), hüdrokinoonmonometüüleetri puhul: metanool/vesi (mahuvahekorras 30:70), hüdrokinoonmonobensüüleetri puhul: metanool/vesi (mahuvahekorras 80:20). [5] Kolonn: Spherisorb S5-ODS või samaväärne: liikuv faas: vesi/metanool (mahuvahekorras 90:10), voolukiirus: 1,5 ml/min. Kõnealused tingimused sobivad hüdrokinooni puhul. [6] [1] Standard ISO 5725. [2] Standard ISO 5725. [3] Standard ISO 5725. [4] Standard ISO 5725. [5] M. Herpol-Borremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l’hydroquinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. j. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986). [6] J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129. --------------------------------------------------