ET Euroopa Liidu Teataja L 54/1

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009,

27. jaanuar 2009,

milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 29. aprilli 2004. aasta määrust (EÜ) nr 882/2004 ametlike kontrollide kohta, mida tehakse sööda- ja toidualaste õigusnormide ning loomatervishoidu ja loomade heaolu käsitlevate eeskirjade täitmise kontrollimise tagamiseks, (1) eriti selle artikli 11 lõike 4 punkte a, b ja c,

ning arvestades järgmist:

(1) Direktiivi 70/373/EMÜ rakendamiseks on võetud vastu järgmised õigusaktid, mis jäävad jõusse kooskõlas määruse (EÜ) nr 882/2004 artikli 61 lõikega 2: — komisjoni 15. juuni 1971. aasta esimene direktiiv 71/250/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (2); — komisjoni 18. novembri 1971. aasta teine direktiiv 71/393/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (3); — komisjoni 27. aprilli 1972. aasta kolmas direktiiv 72/199/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (4); — komisjoni 5. detsembri 1972. aasta neljas direktiiv 73/46/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (5); — komisjoni 1. märtsi 1976. aasta esimene direktiiv 76/371/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse proovivõtumeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (6); — komisjoni 1. märtsi 1976. aasta seitsmes direktiiv 76/372/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (7); — komisjoni 15. juuni 1978. aasta kaheksas direktiiv 78/633/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (8); — komisjoni 31. juuli 1981. aasta üheksas direktiiv 81/715/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (9); — komisjoni 25. juuli 1984. aasta kümnes direktiiv 84/425/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (10); — komisjoni 9. aprilli 1986. aasta direktiiv 86/174/EMÜ, millega määratakse kindlaks kodulindude segasööda energiasisalduse arvutamise meetod (11); — komisjoni 28. juuli 1993. aasta üheteistkümnes direktiiv 93/70/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (12); — komisjoni 17. detsembri 1993. aasta kaheteistkümnes direktiiv 93/117/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (13); — komisjoni 3. septembri 1998. aasta direktiiv 98/64/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid aminohapete, toorõli ja -rasva ja olakvindoksi määramiseks söödas ning muudetakse direktiivi 71/393/EMÜ (14); — komisjoni 20. aprilli 1999. aasta direktiiv 1999/27/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid amprooliumi, diklasuriili ja karbadoksi määramiseks söötades ning muudetakse direktiive 71/250/EMÜ ja 73/46/EMÜ ja tunnistatakse kehtetuks direktiiv 74/203/EMÜ (15); — komisjoni 23. juuli 1999. aasta direktiiv 1999/76/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetod naatriumlasalotsiidi määramiseks söötades (16); — komisjoni 6. juuli 2000. aasta direktiiv 2000/45/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid A-vitamiini, E-vitamiini ja trüptofaani sisalduse määramiseks loomasöödas (17); — komisjoni 26. juuli 2002. aasta direktiiv 2002/70/EÜ, millega kehtestatakse nõuded dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde taseme määramiseks söödas (18); — komisjoni 23. detsembri 2003. aasta direktiiv 2003/126/EÜ loomse päritoluga osiste määramise analüüsimeetodi kohta söötade ametlikul kontrollimisel (19).

(2) Et direktiiv 70/373/EMÜ asendati määrusega (EÜ) nr 882/2004, on asjakohane asendada kõnealuse direktiivi rakendusaktid ühe määrusega. Samas tuleks ka kohandada meetodeid, võttes arvesse arenguid teadus- ja tehnikaalaste teadmiste vallas. Kavandatud eesmärkide saavutamiseks enam mitte sobivad meetodid tuleks välja jätta. Proovivõtu sätteid kavatsetakse õigeaegselt ajakohastada, et võtta arvesse viimaseid arenguid sööda tootmise, ladustamise, transportimise ja turustamise vallas, kuid siiski on asjakohane jätta seniks jõusse kehtivad proovivõtu sätted.

(3) Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tuleks seetõttu kehtetuks tunnistada.

(4) Käesoleva määrusega ette nähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

Artikkel 1

Sööda ametlikul kontrollimisel võetakse proovid sööda komponentide ja lisandite ning soovimatute ainete, välja arvatud pestitsiidijääkide ja mikroorganismide määramiseks kooskõlas I lisas sätestatud meetoditega.

Artikkel 2

Proovide analüüsiks ettevalmistamine ja tulemuste esitamine toimub kooskõlas II lisas sätestatud meetoditega.

Artikkel 3

Analüüse sööda ametlikuks kontrolliks tehakse vastavalt III lisas (Analüüsimeetodid söödatooraine ja segajõusööda koostise kontrollimiseks), IV lisas (Analüüsimeetodid lubatud söödalisandite taseme kontrollimiseks söödas), V lisas (Analüüsimeetodid soovimatute ainete sisalduse kontrollimiseks söödas) ja VI lisas (Analüüsimeetodid loomse päritoluga komponentide määramiseks sööda ametlikul kontrollimisel) sätestatud meetoditele.

Artikkel 4

Kodulindude segasööda energiasisaldus arvutatakse vastavalt VII lisale.

Artikkel 5

Analüüsimeetodeid selliste VIII lisas sätestatud lisandite ebaseadusliku sisalduse kontrollimiseks, mida ei ole enam lubatud söödas kasutada, kasutatakse kinnituse saamiseks.

Artikkel 6

Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tunnistatakse kehtetuks.

Viiteid kehtetuks tunnistatud direktiividele käsitatakse viidetena käesolevale määrusele ja loetakse vastavalt XI lisa vastavustabelitele.

Artikkel 7

Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolevat määrust kohaldatakse alates 26. augustist 2009.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides. Brüssel, 27. jaanuar 2009 Komisjoni nimel komisjoni liige Androulla VASSILIOU

(1) ELT L 165, 30.4.2004, lk 1. Parandatud väljaandes ELT L 191, 28.5.2004, lk 1.

(2) EÜT L 155, 12.7.1971, lk 13.

(3) EÜT L 279, 20.12.1971, lk 7.

(4) EÜT L 123, 29.5.1972, lk 6.

(5) EÜT L 83, 30.3.1973, lk 21.

(6) EÜT L 102, 15.4.1976, lk 1.

(7) EÜT L 102, 15.4.1976, lk 8.

(8) EÜT L 206, 29.7.1978, lk 43.

(9) EÜT L 257, 10.9.1981, lk 38.

(10) EÜT L 238, 6.9.1984, lk 34.

(11) EÜT L 130, 16.5.1986, lk 53.

(12) EÜT L 234, 17.9.1993, lk 17.

(13) EÜT L 329, 30.12.1993, lk 54.

(14) EÜT L 257, 19.9.1998, lk 14.

(15) EÜT L 118, 6.5.1999, lk 36.

(16) EÜT L 207, 6.8.1999, lk 13.

(17) EÜT L 174, 13.7.2000, lk 32.

(18) EÜT L 209, 6.8.2002, lk 15.

(19) ELT L 339, 24.12.2003, lk 78.

I LISA PROOVIVÕTUMEETODID 1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA Sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud proovid võetakse allpool kirjeldatud meetodite kohaselt. Selliselt saadud proovi käsitatakse representatiivsena proovipartii suhtes. 2. PROOVIVÕTU PERSONAL Proove võtavad liikmesriikide poolt selleks volitatud isikud. 3. MÕISTED Proovipartii: toote kogus, mida käsitatakse tervikuna ning mille omadusi võib pidada ühtseteks. Osaproov: partii ühest punktist võetud kogus. Koondproov: samast proovipartiist võetud osaproovide kogum. Vähendatud proovid: koondproovi representatiivne osa, mis on saadud vähendamise teel. Lõpp-proov: vähendatud proovi või homogeenitud koondproovi osa. 4. SEADMED 4.1. Proovivõtuseadmed peavad olema materjalist, mis ei saasta tooteid, millest proove võetakse. Liikmesriigid võivad proovivõtuseadmed ametlikult heaks kiita. 4.2. Soovitatavad seadmed proovide võtmiseks tahkest söödast 4.2.1. Käsitsi proovivõtmine 4.2.1.1. Lamedapõhjaline vertikaalsete äärtega kühvel. 4.2.1.2. Proovivõtupuur pika lõhe või lahtritega. Proovivõtupuuri mõõtmed peavad vastama proovipartii omadustele (mahuti sügavus, koti mõõtmed jms) ja söödajahu osakeste suurusele. 4.2.2. Mehaaniline proovivõtmine Ümberlaaditavast söödast proovide võtmiseks võib kasutada heakskiidetud mehaanilisi proovivõtuseadmeid. 4.2.3. Jagaja Osaproovide võtmisel ning vähendatud proovide ja lõpp-proovide ettevalmistamisel võib kasutada seadet, mis on mõeldud proovi jagamiseks ligikaudu võrdseteks osadeks. 5. KVANTITATIIVSED NÕUDED 5.A. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimisel 5.A.1. Proovipartii Proovipartii suurus peab olema selline, et proove oleks võimalik võtta kõikidest proovipartii osadest. 5.A.2. Osaproovid 5.A.2.1. Lahtine sööt: Minimaalne osaproovide arv: 5.A.2.1.1. proovipartiid massiga kuni 2,5 tonni seitse 5.A.2.1.2. proovipartiid massiga üle 2,5 tonni √ 20 korda proovipartii moodustavate tonnide arv (1), maksimaalselt 40 osaproovi 5.A.2.2. Pakendatud sööt: Minimaalne pakendite arv proovivõtuks (2): 5.A.2.2.1. Pakendid massiga üle ühe kilo: 5.A.2.2.1.1. ühest kuni neljast pakendist koosnevad proovipartiid kõik pakendid 5.A.2.2.1.2. viiest kuni kuueteistkümnest pakendist koosnevad proovipartiid neli 5.A.2.2.1.3. rohkem kui kuueteistkümnest pakendist koosnevad proovipartiid √ proovipartii moodustavate pakendite arv (1), maksimaalselt 20 pakendit 5.A.2.2.2. pakendid massiga kuni 1 kg neli 5.A.2.3. Vedel või poolvedel sööt: Minimaalne pakendite arv proovivõtuks (2): 5.A.2.3.1. mahutid mahuga üle ühe liitri: 5.A.2.3.1.1. ühest kuni neljast mahutist koosnevad proovipartiid kõik mahutid 5.A.2.3.1.2. viiest kuni kuueteistkümnest mahutist koosnevad proovipartiid neli 5.A.2.3.1.3. rohkem kui kuueteistkümnest mahutist koosnevad proovipartiid √ proovipartii moodustavate mahutite arv (1), maksimaalselt 20 mahutit 5.A.2.3.2. Kuni üheliitrised mahutid neli 5.A.2.4. Söödabriketid ja lakukivid Minimaalne brikettide või kivide arv proovivõtuks (2): üks brikett või kivi 25 ühikust koosneva proovipartii kohta, maksimaalselt neli briketti või kivi 5.A.3. Koondproov Nõutav on üks koondproov proovipartii kohta. Koondproovi moodustavate osaproovide üldkogus ei tohi olla väiksem järgmistest kogustest: 5.A.3.1. Lahtine sööt 4 kg 5.A.3.2. Pakendatud sööt: 5.A.3.2.1. pakendid massiga üle 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. pakendid massiga kuni 1 kg nelja originaalpakendi sisu kaal 5.A.3.3. Vedel või poolvedel sööt: 5.A.3.3.1. mahutid mahuga üle ühe liitri: neli liitrit 5.A.3.3.2. kuni üheliitrised mahutid nelja originaalmahuti sisu maht 5.A.3.4. Söödabriketid või lakukivid: 5.A.3.4.1. igaüks kaaluga üle 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. igaüks kaaluga kuni 1 kg nelja originaalbriketi või -kivi kaal 5.A.4. Lõpp-proovid Lõpp-proovid saadakse vajaduse korral koondproovi vähendamise teel. Nõutav on vähemalt ühe lõpp-proovi analüüs. Analüüsitavas lõpp-proovis sisalduv kogus ei tohi olla väiksem järgmistest näitajatest: tahke sööt 500 g Vedel või poolvedel sööt: 500 ml 5.B. söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud soovimatute ainete või toodete, näiteks aflatoksiinide, hariliku tungaltera, riitsinuse ja krotalaaria kontrollimisel söödatooraines (3) 5.B.1. Proovipartii: vt 5.A.1. 5.B.2. Osaproovid 5.B.2.1. Lahtine sööt: vt 5.A.2.1. 5.B.2.2. Pakendatud sööt: Minimaalne pakendite arv proovivõtuks: 5.B.2.2.1. ühest kuni neljast pakendist koosnevad proovipartiid kõik pakendid 5.B.2.2.2. viiest kuni kuueteistkümnest pakendist koosnevad proovipartiid neli 5.B.2.2.3. rohkem kui kuueteistkümnest pakendist koosnevad proovipartiid √ proovipartii moodustavate pakendite arv (1), maksimaalselt 40 pakendit 5.B.3. Koondproovid Koondproovide arv varieerub vastavalt proovipartii suurusele. Koondproovide minimaalne arv proovipartii kohta on esitatud allpool. Koondproovi moodustavate osaproovide kogukaal ei tohi olla alla 4 kg. 5.B.3.1. Lahtine sööt Proovipartii kaal tonnides: Koondproovide minimaalne arv proovipartii kohta: kuni 1 1 rohkem kui 1 ja kuni 10 2 rohkem kui 10 ja kuni 40 3 rohkem kui 40 4 5.B.3.2. Pakendatud sööt Proovipartii suurus pakendite arvuna: Koondproovide minimaalne arv proovipartii kohta: 1 kuni 16 1 17 kuni 200 2 201 kuni 800 3 rohkem kui 800 4 5.B.4. Lõpp-proovid Lõpp-proovid saadakse koondproovi vähendamise teel. Nõutav on vähemalt ühe lõpp-proovi analüüs koondproovi kohta. Analüüsitava lõpp-proovi kaal ei tohi olla alla 500 g. 6. PROOVIDE VÕTMISE, ETTEVALMISTAMISE JA PAKENDAMISE JUHISED 6.1. Üldsätted Proovid tuleb võtta ja ette valmistada võimalikult kiiresti, võttes vajalikud ettevaatusabinõud toote muutumise ja saastumise vältimiseks. Töövahendid ja tööpinnad ning proovide hoidmiseks ettenähtud anumad peavad olema puhtad ja kuivad. 6.2. Osaproovid 6.2.A. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimisel Osaproovid võetakse juhuvaliku abil kogu proovipartii ulatuses ja need peavad olema ligikaudu võrdse suurusega. 6.2.A.1. Lahtine sööt Proovipartii jagatakse mõtteliselt teatavaks arvuks ligikaudu võrdseteks osadeks. Osade arv, mis vastab punkti 5.A.2 kohaselt nõutud osapartiide arvule, valitakse juhuslikult ning igast asjaomasest osast võetakse vähemalt üks proov. Vajaduse korral võib proove võtta partii liikumise (laadimise või mahalaadimise) ajal. 6.2.A.2. Pakendatud sööt Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5.A.2 kohaselt vajalik arv pakendeid välja valitud, võetakse puuri või kühvli abil osa iga pakendi sisust. Vajaduse korral võetakse proovid pärast seda, kui pakendid on ükshaaval tühjendatud. Kõik klombid purustatakse (vajaduse korral võetakse need proovist välja ja pannakse pärast purustamist tagasi) igas koondproovis eraldi. 6.2.A.3. Homogeenne või homogeenitav vedel või poolvedel sööt Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5.A.2 kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, homogeenitakse vajaduse korral nende sisu ja võetakse osa igast mahutist. Osaproove võib võtta mahutite tühjendamise ajal. 6.2.A.4. Mittehomogeenitav vedel või poolvedel sööt Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5.A.2 kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, võetakse proovid eri tasanditelt. Proove võib võtta ka mahutite tühjendamise ajal, kuid mitte esimestest kihtidest. Mõlemal juhul peab võetav kogus olema vähemalt 10 liitrit. 6.2.A.5. Söödabriketid ja lakukivid Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5.A.2 kohaselt vajalik arv brikette või kive välja valitud, võetakse osa igast briketist või kivist. 6.2.B. Söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud soovimatute ainete või toodete, näiteks aflatoksiinide, hariliku tungaltera, riitsinuse ja krotalaaria kontrollimisel söödatooraines Partii jagatakse mõtteliselt ligikaudu võrdseteks osadeks vastavalt punktis 5.B.3 ette nähtud koondpartiide arvule. Kui see arv on suurem kui üks, jaotatakse punktis 5.B.2 ette nähtud osapartiide koguarv ligikaudu võrdselt erinevate osade vahel. Seejärel võetakse ligikaudu võrdse suurusega proovid, (4) nii et igast osast võetud proovide koguhulk ei oleks väiksem kui iga koondproovi jaoks nõutud 4 kg. Eri osadest võetud osapartiisid ei koondata ühte koondproovi. 6.3. Koondproovide ettevalmistamine 6.3.A. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimisel Ühtne koondproov saadakse osaproovide kokkusegamise abil. 6.3.B. Söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud soovimatute ainete või toodete, näiteks aflatoksiinide, hariliku tungaltera, riitsinuse ja krotalaaria kontrollimisel söödatooraines Partii igast osast võetud osaproovid segatakse ja valmistatakse punktis 5.B.3 osutatud arv koondproove, märkides hoolikalt üles iga koondproovi päritolu. 6.4. Lõpp-proovide ettevalmistamine Iga koondproovi materjal segatakse hoolikalt, et moodustuks homogeenne proov (5). Vajaduse korral vähendatakse koondproov esmalt vähemalt 2 kg või 2 liitrini (vähendatud proov), kasutades mehaanilist või automaatset jagajat või kvarteerimismeetodit. Valmistatakse ette vähemalt kolm ligikaudu ühesuurust lõpp-proovi, mis vastavad punktis 5.A.4 või 5.B.4 esitatud kvantitatiivsetele nõuetele. Iga proov pannakse sobivasse mahutisse. Vältimaks muutusi proovi koostises, saastumist või võltsimist, mis võivad tekkida veo või ladustamise ajal, võetakse kõik vajalikud ettevaatusabinõud. 6.5. Lõpp-proovide pakendamine Mahutid või pakendid pitseeritakse ja märgistatakse (kogu etikett peab olema pitseri sees) selliselt, et neid ei oleks võimalik avada pitserit rikkumata. 7. PROOVIVÕTUPROTOKOLL Iga proovivõtmise kohta tuleb täita protokoll, mis võimaldab iga proovipartiid üheselt identifitseerida. 8. PROOVIDE SIHTKOHT Iga koondproovi kohta saadetakse vähemalt üks lõpp-proov ning analüüsiks vajalik teave võimalikult kiiresti volitatud analüüsilaborisse. (1) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see järgmise täisarvuni. (2) Pakendite või konteinerite puhul, mille sisu ei ületa 1 kilo või 1 liitrit, ja brikettide või kivide puhul, mis kaaluvad kuni 1 kilo tükk, loetakse osapartiiks ühe originaalpakendi või -konteineri sisu, üks brikett või üks kivi. (3) Punktis 5.A ette nähtud meetodeid kasutatakse aflatoksiinide, hariliku tungaltera, riitsinuse ja krotalaaria kontrollimisel täis- ja täiendsöödas. (4) Pakendatud sööda puhul võetakse osa proovivõtmiseks mõeldud pakendite sisust puuri või kühvliga pärast seda, kui pakendid on vajaduse korral ükshaaval tühjendatud. (5) Kõik klombid purustatakse (vajaduse korral võetakse need proovist välja ja pannakse pärast purustamist tagasi) igas koondproovis eraldi.

II LISA SÖÖDA ANALÜÜSIMEETODITE ÜLDSÄTTED A. PROOVIDE ETTEVALMISTAMINE ANALÜÜSIKS 1. Eesmärk Allpool kirjeldatud protseduurid käsitlevad kontroll-laboratooriumidesse saadetud lõpp-proovide ettevalmistamist analüüsiks pärast proovi võtmist vastavalt I lisa sätetele. Kõnealused proovid tuleb ette valmistada nii, et analüüsimeetodites sätestatud viisil kaalutud kogused oleksid ühtlased ja vastaksid lõpp-proovidele. 2. Ettevaatusabinõud Rakendatav proovi ettevalmistamise protseduur sõltub kasutatavast analüüsimeetodist. Seepärast on väga oluline tagada, et rakendatav proovi ettevalmistamise protseduur sobiks kasutatava analüüsimeetodiga. Kõik vajalikud toimingud tuleb läbi viia nii, et vältida proovi saastumist ja selle koostise muutumist. Jahvatamine, segamine ja sõelumine tuleb teostada nii kiiresti kui võimalik, et proovi kokkupuude õhu ja valgusega oleks minimaalne. Kasutada ei tohi veskeid ja jahvatajaid, mis proovi märgatavalt kuumendavad. Kuumuse suhtes eriti tundliku sööda puhul soovitatakse kasutada käsitsijahvatamist. Samuti tuleb tagada, et aparaat ise ei oleks mikroelementide saastumise allikas. Kui ettevalmistamine ilma oluliste muutusteta proovi niiskusesisalduses ei ole võimalik, määratakse niiskusesisaldus enne ja pärast ettevalmistamist vastavalt III lisa A osas sätestatud meetodile. 3. Töö käik Proov jaotatakse analüüsiks ja standardprooviks sobivateks alamproovideks, kasutades sobivaid jaotustehnikaid, näiteks vahelduv kühveldamine, statsionaarne või pöördrihveldamine. Koonilist valamist ja neljaks jaotamist ei soovitata, sest sellega võib kaasneda suur veaosakaal alamproovide jaotuses. Standardproovi hoitakse sobivas puhtas ja kuivas õhukindlalt suletavas mahutis ja analüüsitavad alamproovid, vähemalt 100 g, valmistatakse ette järgmiselt. 3.1. Sööt, mida saab kohe jahvatada Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti kindlaks määratud, sõelutakse kogu proov pärast jahvatamist vajaduse korral läbi 1 mm kandiliste avadega sõela (vastavalt soovitusele ISO R565). Vältida liigset jahvatamist. Sõelutud proov segatakse ja kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindlalt suletavasse nõusse. Vahetult enne analüüsiks vajaliku koguse kaalumist segatakse proovi uuesti. 3.2. Sööt, mida saab jahvatada pärast kuivatamist Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti kindlaks määratud, kuivatatakse proovi vastavalt III lisa A osas nimetatud niiskuse määramise meetodi punktis 4.3 kirjeldatud esialgsele kuivatamisviisile niiskusesisalduseni 8–12 %. Jätkatakse punktis 3.1 osutatud viisil. 3.3. Vedel või poolvedel sööt Proov kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindlalt suletavasse nõusse. Vahetult enne analüüsiks vajaliku koguse kaalumist segatakse proovi hoolikalt. 3.4. Muu sööt Selliseid proove, mida ei saa ette valmistada mõnel eespool nimetatud viisil, tuleb töödelda mis tahes muul viisil, mis tagab analüüsiks kaalutud koguste homogeensuse ja vastavuse lõpp-proovidele. 4. Proovide hoidmine Proove tuleb hoida temperatuuril, mis ei muuda nende koostist. Vitamiinide või eriti valgustundlike ainete analüüsiks ettenähtud proove tuleb hoida tumedast klaasist nõudes. B. SÄTTED ANALÜÜSIMEETODITES KASUTATAVATE REAKTIIVIDE JA SEADMETE KOHTA 1. Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti kindlaks määratud, peavad kõik analüütilised reaktiivid olema analüütiliselt puhtad. Mikroelementide määramisel tuleb reaktiivide puhtust kontrollida pimekatsega. Sõltuvalt saadud tulemustest võib olla vaja reaktiive täiendavalt puhastada. 2. Iga lahuste valmistamist, lahjendamist, loputamist või pesemist hõlmav toiming, mida on analüüsimeetodites nimetatud ilma kasutatud lahusti või lahjendi laadile viitamata, eeldab vee kasutamist. Üldjuhul peab vesi olema demineraliseeritud või destilleeritud. Teatavatel juhtudel, millele analüüsimeetodites viidatakse, tuleb veega läbi viia erilised puhastusprotseduurid. 3. Kontroll-laboratooriumides tavaliselt leiduvaid seadmeid silmas pidades viidatakse analüüsimeetodites ainult nendele instrumentidele ja vahenditele, mis on erilised või nõuavad konkreetset kasutamisviisi. Need seadmed peavad olema puhtad, eriti väga väikeste ainekoguste määramisel. C. ANALÜÜSIMEETODITE RAKENDAMINE JA TULEMUSTE VÄLJENDAMINE 1. Ekstraktsioonimenetlus Mitmete meetodite puhul on määratud konkreetne ekstraktsioonimenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi ekstraktsioonimenetlusi rakendada juhul, kui on tõestatud, et kasutatav ekstraktsioonimenetlus on põhiaine analüüsiks sama tõhus kui meetodis mainitud menetlus. 2. Puhastusmenetlus Mitmete meetodite puhul on määratud konkreetne puhastusmenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi puhastusmenetlusi rakendada juhul, kui on tõestatud, et kasutataval puhastusmenetlusel on põhiaine analüüsiks meetodis mainitud menetlusega samaväärsed analüütilised tulemused. 3. Kasutatavast analüüsimeetodist teavitamine Tavaliselt kehtestatakse iga söödas esineva aine määramiseks üks analüüsimeetod. Kui esitatud on mitu meetodit, tuleb analüüsiaruandesse märkida kontroll-laboratooriumi kasutatud meetod. 4. Määramiste arv Analüüsiaruandes esitatud tulemus on keskmine väärtus, mis on saadud vähemalt kahe proovi erinevate osade ja rahuldava korratavusega läbiviidud määramisega. Kui soovimatute ainete analüüsil on esimese määramise tulemus oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitav spetsifikatsioon, ei ole siiski vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui rakendatakse sobivat kvaliteedimenetlust. Kui aine või koostisosa deklareeritud sisalduse kontrollimisel kinnitab esimese määramise tulemus deklareeritud sisaldust, s.t analüütiline tulemus jääb deklareeritud sisalduse lubatud hälbe piiresse, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui rakendatakse sobivat kvaliteedimenetlust. Mõnel juhul on lubatud hälve sätestatud õigusaktides, näiteks nõukogu direktiivis 79/373/EMÜ (1). 5. Aruandlus analüüsitulemuste kohta Analüüsitulemus väljendatakse analüüsimeetodis kehtestatud viisil sobiva arvu tüvenumbritega ja vajaduse korral korrigeeritakse seda vastavalt lõpp-proovi niiskusesisaldusele enne ettevalmistamist. 6. Mõõtemääramatus ja saagise määr soovimatute ainete analüüsil Soovimatute ainete puhul Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivi 2002/32/EÜ tähenduses, kaasa arvatud dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde puhul, ei vasta loomatoiduks ettenähtud tooted kehtestatud piirnormile, kui analüüsitulemust loetakse piirnormi ületavaks, võttes arvesse laiendatud mõõtemääramatust ja saagise korrektsiooni. Vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsitud kontsentratsiooni, mida on korrigeeritud saagise suhtes ja millest on maha arvatud laiendatud mõõtemääramatus. Seda menetlust võib kohaldada vaid juhtudel, kus analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagise parandust (nt pole võimalik mikroskoopilise analüüsi puhul). Analüüsitulemus esitatakse järgmiselt (niivõrd kui kasutatud analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagise määra): a) saagise korrektsiooniga, saagise määr peab olema märgitud. Saagise korrektsioon ei ole vajalik juhul, kui saagise määr jääb vahemikku 90–110 %. b) kujul „x +/- U”, kus x on analüüsitulemus ja U on laiendatud mõõtemääramatus, kusjuures kasutatakse kattuvuskoefitsienti 2, mis annab usaldusväärsuse taseme ligikaudu 95 %. Kui analüüsi tulemus on oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitav spetsifikatsioon ja kui rakendatakse sobivat kvaliteedimenetlust ning analüüsi eesmärk on vaid kontrollida vastavust õigusnormidele, ei ole analüüsitulemuses siiski vaja esitada saagise korrektsiooni ning saagise määra ja mõõtemääramatuse võib nendel juhtudel ära jätta. (1) EÜT L 86, 6.4.1979, lk 30.

III LISA SÖÖDATOORAINE JA SEGAJÕUSÖÖDA KOOSTISE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID A. NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata sööda niiskusesisaldust. Lenduvaid aineid, näiteks orgaanilisi happeid sisaldava sööda puhul tuleb jälgida, et koos niiskusesisaldusega määrataks ka oluline osa lenduvatest ainetest. See ei hõlma piimatoodete kui söödatooraine analüüsi, mineraalainete ja peamiselt mineraalainetest koosnevate segude analüüsi, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide analüüsi ega õliseemnete ja õliviljade analüüsi. 2. Põhimõte Proov kuivatatakse kindlaksmääratud tingimustel, mis varieeruvad sõltuvalt sööda laadist. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahket sööta tuleb eelnevalt kuivatada. 3. Seadmed 3.1. Niiskust mitteneelavast materjalist purusti, mis vastab punktides 4.1.1 ja 4.1.2 sätestatud nõuetele, mida on lihtne puhastada ning millega on võimalik kiiresti ja ühtlaselt purustada nii, et ei tekiks märgatavat kuumenemist ja et proov puutuks võimalikult vähe kokku väliskeskkonnaga (nt vasarpurustaja või vesijahutusega mikropurustaja, kokkupandav koonusveski, aeglustatud liikumisega purustaja või hammasratastega purustaja). 3.2. Analüütilised kaalud täpsusega 1 mg. 3.3. Õhukindlalt suletavad roostevabast metallist või klaasist kuivad anumad põhjaga, millele saab analüüsitavat proovi laotada tihedusega 0,3 g/cm2. 3.4. Reguleeritava temperatuuriga (± 2 oC) elektriline kuivatuskapp, mis on nõuetekohaselt ventileeritav ja võimaldab temperatuuri kiiresti reguleerida (1). 3.5. Reguleeritava temperatuuriga elektriline vaakumkuivatuskapp, mis on varustatud õlipumbaga ning kuhu saab juhtida kuuma ja kuiva õhku või kuhu pannakse kuivatusainet (nt kaltsiumoksiidi). 3.6. Eksikaator, millel on paks avadega metall- või portselanalus ning mis sisaldab tõhusat kuivatusainet. 4. Töö käik NB ! Käesolevas punktis kirjeldatud toimingud tuleb teha kohe pärast proovi sisaldavate pakendite avamist. Tuleb teha vähemalt kaks analüüsi. 4.1. Ettevalmistus 4.1.1. Muu sööt kui punktides 4.1.2 ja 4.1.3 nimetatud sööt Võetakse vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral proov purustatakse või tehakse tükkideks, et vältida niiskusesisalduse kõikumist (vt punkt 6). 4.1.2. Teravili ja tangud Võetakse vähemalt 50 g proovi. Proov jahvatatakse osakesteks, millest vähemalt 50 % pudeneb läbi sõela, mille avade suurus on 0,5 mm, ja sõelale, mille ümmarguste avade suurus on 1 mm, ei jää rohkem kui 10 %. 4.1.3. Vedel või pastataoline sööt, peamiselt õlidest ja rasvadest koosnev sööt Võetakse umbes 25 g proovi, kaalutakse see 10 mg täpsusega, lisatakse vajalik kogus 10 mg täpsusega kaalutud veevaba liiva ja segatakse kuni ühtlase toote saamiseni. 4.2. Kuivatamine 4.2.1. Muu sööt kui punktides 4.2.2 ja 4.2.3 nimetatud sööt Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 1 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 103 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada neli tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 103 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Peamiselt õlidest ja rasvadest koosneva sööda puhul kuivatatakse proovi kuivatuskapis temperatuuril 130 oC täiendavalt 30 minutit. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust. 4.2.2. Teravili, jahu, tangud ja manna Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g peenestatud proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 130 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada kaks tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 130 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega. 4.2.3. Segajõusööt, mis sisaldab üle 4 % sahharoosi või laktoosi: söödatooraine, nt jaanikaunad, hüdrolüüsitud teraviljasaadused, linnaseseemned, kuivatatud peediliistakud, kalast ja suhkrust valmistatud lahustuvsööt; segajõusööt, mis sisaldab rohkem kui 25 % mineraalsooli, sh kristallisatsioonivesi. Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 80–85 oC kuumutatud vaakumkuivatuskappi (3.5). Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Rõhk tõstetakse 100 torrini ja proovil lastakse sellise rõhu all kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta) umbes neli tundi kuivada. Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump pärast ettenähtud rõhu saavutamist lahti. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 80–85 oC. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80–85 oC ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust. 4.3. Eelkuivatamine 4.3.1. Muu sööt kui punktis 4.3.2 nimetatud sööt Tahket sööta, mille purustamist suur niiskusesisaldus raskendab, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada: 50 g purustamata proovi (pressitud või aglomeeritud sööda võib vajaduse korral tükkideks teha) kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse kuivatuskapis temperatuuril 60–70 oC kuivada, kuni niiskusesisaldus on 8–12 %. Anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis üks tund ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Purustatakse viivitamata punkti 4.1.1 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.1 või 4.2.3 kohaselt vastavalt sööda laadile. 4.3.2. Teravili Terasid, mille niiskusesisaldus on üle 17 %, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada: 50 g jahvatamata teri kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse 5–7 minutit kuivatuskapis temperatuuril 130 oC kuivada. Võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis kaks tundi ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Jahvatatakse viivitamata punkti 4.1.2 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.2 kohaselt. 5. Tulemuste arvutamine Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmiste valemite abil. 5.1. Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta kus: m = analüüsitava proovi esialgne mass grammides, m0 = kuiva analüüsitava proovi mass grammides. 5.2. Kuivatamine koos eelkuivatamisega kus: m = analüüsitava proovi esialgne mass grammides, m1 = analüüsitava proovi mass grammides pärast eelkuivatamist, m2 = analüüsitava proovi mass grammides pärast purustamist või jahvatamist, m0 = kuiva analüüsitava proovi mass grammides. 5.3. Korratavus Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 % niiskuse absoluutväärtusest. 6. Tähelepanek Kui purustamine osutub vajalikuks ja kui sellega muutub toote niiskusesisaldus, tuleb sööda koostisosade analüüside tulemusi korrigeerida esialgsel kujul proovi niiskusesisalduse põhjal. B. LOOMSETE JA TAIMSETE RASVADE JA ÕLIDE NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide veesisaldust ja lenduvate ainete sisaldust. 2. Põhimõte Proov kuivatatakse temperatuuril 103 oC püsimassini (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). Massikadu määratakse kaalumise teel. 3. Seadmed 3.1. Korrosioonikindlast materjalist lamedapõhjaline anum, mille diameeter on 8–9 cm ja kõrgus umbes 3 cm. 3.2. Tugevdatud kolviga termomeeter, mille ülaosas on paisumistoru, mis on gradueeritud vahemikus umbes 80 oC kuni vähemalt 110 oC ja mis on umbes 10 cm pikkune. 3.3. Liivavann või elektriline kuumutusplaat. 3.4. Tõhusat kuivatusainet sisaldav eksikaator. 3.5. Analüütilised kaalud. 4. Töö käik 1 mg täpsusega kaalutud umbes 20 g homogeenitud proovi pannakse kuiva kaalutud anumasse (3.1), milles on termomeeter (3.2). Kuumutatakse liivavannil või kuumutusplaadil (3.3) termomeetriga pidevalt segades, nii et temperatuur tõuseb umbes 7 minutiga 90 oC-ni. Kuumust vähendatakse, jälgides anuma põhjast kerkivate mullide sagedust. Temperatuur ei tohi tõusta üle 105 oC. Segamist jätkatakse anuma põhja kaapides, kuni mullide tekkimine lõpeb. Niiskuse täielikuks kõrvaldamiseks kuumutatakse proovi mitu korda temperatuurini 103 ± 2 oC, jahutades kuumutamiste vahel proovi temperatuurini 93 oC. Lastakse jahtuda eksikaatoris (3.4) toatemperatuurini ja kaalutakse. Protseduuri korratakse, kuni massikadu kahel järjestikusel kaalumisel ei ole üle 2 mg. NB ! Proovi massi suurenemine pärast korduvat kuumutamist viitab rasva oksüdeerumisele, sel juhul arvutatakse tulemus enne massi suurenemist tehtud kaalumisel. 5. Tulemuste arvutamine Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil: kus: m = analüüsitava proovi mass grammides; m1 = anuma ja selle sisu mass grammides enne kuumutamist; m2 = anuma ja selle sisu mass grammides pärast kuumutamist. Tulemused, mis on väiksemad kui 0,05 %, tuleb registreerida kujul „alla 0,05 %”. Korratavus Sama prooviga tehtud kahel paralleelsel määramisel saadud niiskusesisalduste erinevus ei tohi ületada absoluutväärtuses 0,05 %. C. TOORVALGUSISALDUSE MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söödas lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga. 2. Põhimõte Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega. Teise võimalusena destilleeritakse vabanenud ammoniaak boorhappe lahuse ülejääki, millele järgneb tiitrimine soolhappe või väävelhappe lahusega. 3. Reaktiivid 3.1. Kaaliumsulfaat. 3.2. Katalüsaator: vask(II)oksiid CuO või vask(II)sulfaatpentahüdraat CuSO4 5H2O. 3.3. Granuleeritud tsink. 3.4. Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Metüülpunane indikaator: 300 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis, σ = 95–96 % (v/v). 3.9. Naatriumhüdroksiidi lahus (võib kasutada tehnilise puhtusega reaktiivi) β = 40 g / 100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Soolhappes pestud ja läbikuumutatud pimsskivigraanulid. 3.13. Atseetaniliid (sulamistemperatuur = 114 oC; N = 10,36 %). 3.14. Sahharoos (lämmastikuvaba). 3.15. Boorhape (H3BO3). 3.16. Metüülpunase indikaatorlahus: 100 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis. 3.17. Bromokresoolrohelise lahus: 100 mg bromokresoolrohelist lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis. 3.18. Boorhappe lahus (10 g/l kuni 40 g/l olenevalt kasutatavatest vahenditest). Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, tuleb metüülpunase ja bromokresoolrohelise indikaatorid lisada boorhappe lahustesse. Kui 1 liiter boorhappe lahust on ette valmistatud, tuleb enne vajaliku mahuni korrigeerimist lisada 7 ml metüülpunase indikaatorlahust (3.16) ja 10 ml bromokresoolrohelise lahust (3.17). Olenevalt sellest, millist vett kasutatakse, võib boorhappe lahuse pH-tase olla eri partiides erinev. Sageli on positiivse tulemuse saamiseks vaja korrigeerida väikse leelisekogusega. MÄRKUS : umbes 3–4 ml NaOH (3.11) lisamine 1 liitrisse 10 g/l boorhappesse annab tavaliselt häid tulemusi. Lahust tuleb hoida toatemperatuuril ja kaitsta valguse ning ammoniaagiaurude eest. 3.19. Soolhape, standardne tiitrimislahus c(HCl) = 0,10 mol/l. MÄRKUS : kasutada võib ka teisi tiitrimislahuste (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, ja 3.19) kontsentratsioone, kui arvutustes tehakse vastavad parandused. Kontsentratsioonid tuleb alati esitada nelja kümnendkoha täpsusega. 4. Seadmed Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks. 5. Töö käik 5.1. Lagundamine 1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (3.2) (0,3–0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9–1,2 g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (3.4) ja vajadusel mõned pimsskivigraanulid (3.12) ning segatakse. Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele. Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jahutatakse. 5.2. Destilleerimine Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse vajadusel mõned graanulid tsinki (3.3). Edasi toimida vastavalt punktile 5.2.1 või 5.2.2. 5.2.1. Destilleerimine väävelhappeks Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (3.5) või (3.7), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (3.8). Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt tähelepanek 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.9), vältides ammoniaagi kadu (vt tähelepanek 8.1). Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud. 5.2.2. Destilleerimine boorhappeks Kui destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimine toimub käsitsi, siis rakendatakse allpool nimetatud menetlust. Kui destilleerimisseade on täisautomaatne ning hõlmab ka destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimist, siis järgitakse tootja koostatud destilleerimisseadme kasutusjuhendit. Kogumiskolb, mis sisaldab 25–30 ml boorhappe lahust (3.18), pannakse jahuti väljalaskeava alla selliselt, et sissevoolutoru jääb allapoole boorhappe lahuse ülejäägi pinda. Destilleerimisseade korrigeeritakse 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (3.9) väljastamiseks. Destilleerimisseadet kasutatakse vastavalt tootja kasutusjuhendile ja destilleeritakse naatriumhüdroksiidi lahuse lisamisel vabanenud ammoniaak välja. Destillaat kogutakse boorhappe vastuvõtulahusesse. Destillaadi kogus (veeaurdestillatsiooni aeg) sõltub proovis sisalduva lämmastiku hulgast. Järgitakse tootja kasutusjuhendit. MÄRKUS : poolautomaatses destilleerimisseadmes toimuvad naatriumhüdroksiidi ülejäägi lisamine ja veeaurdestillatsioon automaatselt. 5.3. Tiitrimine Toimida vastavalt punktile 5.3.1 või 5.3.2. 5.3.1. Väävelhape Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (3.10 või 3.11), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt. 5.3.2. Boorhape Kogumiskolvi sisu tiitritakse soolhappe standardse tiitrimislahusega (3.19) või väävelhappe standardse tiitrimislahusega (3.6), kasutades büretti, ning loetakse kokku kasutatud titrandi kogus. Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, on lõpp-punkt saavutatud, kui ainesse ilmuvad esimesed roosa värvi jäljed. Büreti näitu hinnatakse 0,05 ml täpsusega. Lõpp-punkti nähtavust võib parandada valgustatud magnetseguri plaadi või valgusmõõturi abil. Seda võib teha automaatselt, kasutades automaatselt tiitrivat veeaurdestillaatorit. Eri destillaatori või destillaatori/titraatori kasutamisel järgitakse tootja kasutusjuhendeid. MÄRKUS : kui kasutatakse automaatset tiitrimissüsteemi, algab tiitrimine vahetult pärast destilleerimise algust ja kasutatakse 1 % boorhappe lahust (3.18). Kui kasutatakse täisautomaatset destilleerimisseadet, võib ammoniaagi automaatset tiitrimist läbi viia ka lõpp-punkti määramisega, kasutades potentsiomeetrilist pH-süsteemi. Sel juhul kasutatakse pH mõõtjaga automaatset titraatorit. PH-meeter tuleb korralikult kalibreerida vahemikus pH 4 kuni pH 7, järgides tavapärast laboratoorset pH kalibreerimise menetlust. Tiitrimise pH lõpp-punkt saavutatakse pH 4,6 juures, mis on titreerimiskõvera kõige järsem punkt (murdepunkt). 5.4. Pimekatse Et kontrollida, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (3.14). 6. Tulemuste arvutamine Arvutused tehakse vastavalt punktile 6.1 või 6.2. 6.1. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.1 Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi: kus: Vo = pimekatses kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml), V1 = proovi tiitrimisel kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml), c = naatriumhüdroksiidi (3.10 või 3.11) kontsentratsioon (mol/l), m = proovi mass (g). 6.2. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.2 6.2.1. Tiitrimine soolhappega Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi: kus: m = kaalutise mass grammides, c = soolhappe (3.19) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l), V0 = pimekatses kasutatud soolhappe maht (ml), V1 = kaalutises kasutatud soolhappe maht (ml). 6.2.2. Tiitrimine väävelhappega Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi: kus: m = kaalutise mass grammides, c = väävelhappe (3.6) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l), V0 = pimekatses kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml), V1 = kaalutises kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml). 7. Meetodi kontrollimine 7.1. Korratavus Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: — absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui toorvalgusisaldus on väiksem kui 20 %; — 1,0 % suuremast väärtusest, kui toorvalgusisaldus on 20–40 %; — absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorvalgusisaldus on suurem kui 40 %. 7.2. Täpsus Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) viiakse läbi 1,5–2,0 g atseetaniliidiga (3.13) 1 g sahharoosi (3.14) manulusel; 1 g atseetaniliidi tarbib 14,80 ml väävelhapet (3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %. 8. Tähelepanekud 8.1. Seade võib olla manuaalset, poolautomaatset või automaatset tüüpi. Kui seade nõuab proovi ülekandmist lagundamise ja destilleerimise vahel, tuleb see ülekandmine teostada ilma kadudeta. Kui destillatsiooniaparaadi kolb ei ole varustatud tilklehtriga, lisatakse naatriumhüdroksiid vahetult enne kolvi ühendamist jahutiga, valades vedelikku aeglaselt mööda kolvi külge. 8.2. Kui proov lagundamisel tahkestub, alustatakse määramist uuesti, kasutades eespool näidatust suuremat kogust väävelhapet (3.4). 8.3. Väikese lämmastikusisaldusega toodete puhul võib kogumiskolbi viidava väävelhappe (3.7) mahtu vajadusel vähendada 10–15 ml-ni ja täiendada veega 25 ml-ni. 8.4. Tavapäraste analüüside käigus võib toorvalgu määramiseks kasutada alternatiivseid analüüsimeetodeid, kuid standardmeetodiks on käesoleva lisa C osas kirjeldatud Kjeldahli meetod. Alternatiivmeetodi (nt DUMAS) abil saadud tulemuste samaväärsust standardmeetodiga võrreldes tuleb tõestada iga põhiaine kohta eraldi. Et alternatiivmeetodiga saadud tulemused võivad isegi pärast samaväärsuse kontrolli veidi erineda standardmeetodiga saadud tulemustest, tuleb analüüsiaruandes märkida, millist analüüsimeetodit on toorvalgu määramiseks kasutatud. D. KARBAMIIDI MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata karbamiidi taset söödas. 2. Põhimõte Proov suspendeeritakse vees selitava ainega. Suspensioon filtreeritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (4-DMAB) lisamist optilise tiheduse mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm. 3. Reaktiivid 3.1. 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahus: 1,6 g 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahustatakse 100 ml 96 % etanoolis ja lisatakse 10 ml soolhapet (ρ20 = 1,19 g/ml). See reaktiiv säilib maksimaalselt kaks nädalat. 3.2. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini. 3.3. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini. 3.4. Karbamiidi mitte absorbeeriv aktiivsüsi (kontrollida). 3.5. Karbamiidi 0,1 % lahus (w/v). 4. Seadmed 4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min. 4.2. Lihvkorgiga katseklaasid: 160 × 16 mm. 4.3. Spektrofotomeeter. 5. Töö käik 5.1. Proovi analüüs 1 mg täpsusega kaalutud 2 g proovi pannakse 1 g aktiivsöega (3.4) 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett ja 5 ml Carrezi lahust I (3.2), segatakse umbes 30 sekundit ja lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3). Segatakse trumlis 30 minutit. Täidetakse veega kuni märgini, loksutatakse ja filtreeritakse. Eemaldatakse 5 ml läbipaistvat värvitut filtraati, pannakse see lihvkorgiga katseklaasidesse, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1) ja segatakse. Katseklaasid asetatakse 20 oC (+/- 4 oC) veetemperatuuriga veevanni. Viieteistkümne minuti pärast mõõdetakse proovilahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 420 nm. Võrreldakse reaktiivide kontroll-lahustega. 5.2. Kalibreerimiskõver Võetakse 1, 2, 4, 5 ja 10 ml kogused karbamiidilahust (3.5), pannakse 100 ml mõõtekolbidesse ja täidetakse veega kuni märgini. Igast lahusest võetakse ära 5 ml, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1), homogeenitakse ja mõõdetakse eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus võrrelduna kontroll-lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB lahust ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostatakse kalibreerimiskõver. 6. Tulemuste arvutamine Proovis sisalduv karbamiidikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist. 7. Tähelepanekud 7.1. Üle 3 % karbamiidisisalduse puhul vähendatakse proovi 1 grammini või lahjendatakse esialgset lahust, nii et 500 ml-s ei oleks karbamiidi üle 50 mg. 7.2. Väikese karbamiidisisalduse puhul võetakse suurem proov, tingimusel et filtraat jääb läbipaistvaks ja värvituks. 7.3. Kui proov sisaldab lihtsaid lämmastikuühendeid, nagu näiteks aminohappeid, tuleb optilist tihedust mõõta lainepikkusel 435 nm. E. LENDUVATE LÄMMASTIKALUSTE MÄÄRAMINE I. MIKRODIFUSIOON 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust söödas. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse kaaliumkarbonaadi lahust kasutades mikrodifusiooni abil, kogutakse boorhappe lahusesse ja tiitritakse väävelhappega. 3. Reaktiivid 3.1. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v). 3.2. Indikaator: 33 mg bromokresoolrohelist ja 65 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml 95–96 % etanoolis (v/v). 3.3. Boorhappe lahus: üheliitrises mõõtekolvis lahustatakse 200 ml 95–96 % etanoolis (v/v) ja 700 ml vees 10 g boorhapet. Lisatakse 10 ml indikaatorit (3.2). Segatakse ja vajaduse korral muudetakse lahuse värv helepunaseks, lisades naatriumhüdroksiidi lahust. 1 ml lahust seob kuni 300 μg NH3. 3.4. Kaaliumkarbonaadi küllastunud lahus: 100 g kaaliumkarbonaati lahustatakse 100 ml keevas vees. Lastakse jahtuda, filtreeritakse. 3.5. Väävelhape, 0,01 mol/l 4. Seadmed 4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min. 4.2. Klaasist või plastist Conway anumad (vt joonis). 4.3. 1/100 ml gradeeritud mikrobüretid. 5. Töö käik 10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri. Pipetti kasutades viiakse 1 ml boorhappe lahust (3.3) Conway anuma keskmisse ossa ja 1 ml filtraati anuma välimisse ossa. Kaetakse osaliselt rasvatatud kaanega. Välimisse osasse tilgutatakse kiiresti 1 ml kaaliumkarbonaadi küllastunud lahust (3.4) ja kaas suletakse õhukindlalt. Anumat pööratakse hoolikalt horisontaaltasandis nii, et kaks reaktiivi segunevad. Lastakse haududa kas vähemalt neli tundi toatemperatuuril või üks tund temperatuuril 40 oC. Mikrobüretti (4.3) kasutades tiitritakse lenduvad lämmastikalused boorhappe lahuses väävelhappe (3.5) abil. Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita. 6. Tulemuste arvutamine 1 ml H2SO40,01 mol/l vastab 0,34 mg ammoniaagile. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist. Korratavus Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: — suhtelise väärtusena väljendatult 10 % ammoniaagisisalduse puhul, mis on väiksem kui 1,0 %; — absoluutväärtusena väljendatult 0,1 % ammoniaagisisalduse puhul, mis on vähemalt 1,0 %. 7. Tähelepanek Kui proovi ammoniaagisisaldus on suurem kui 0,6 %, lahjendatakse esialgset lahust. CONWAY CELL Scale 1/1 II. DESTILLEERIMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust peaaegu karbamiidivabas kalajahus. Meetodit kohaldatakse üksnes juhul, kui ammoniaagisisaldus on väiksem kui 0,25 %. 2. Põhimõte Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse keemistemperatuuril magneesiumoksiidi lisamise teel ja kogutakse teatava koguse väävelhappega, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi lahuse abil tagasi. 3. Reaktiivid 3.1. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v) 3.2. Magneesiumoksiid 3.3. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon) 3.4. Väävelhape, 0,05 mol/l 3.5. Naatriumhüdroksiidi lahus, 0,1 mol/l 3.6. Metüülpunase 0,3 % lahus 95–96 % etanoolis (v/v) 4. Seadmed 4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min 4.2. Kjeldahli destilleerimisaparaat 5. Töö käik 10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri. Vastavalt lenduvate lämmastikaluste eeldatavale sisaldusele võetakse vajalik kogus selget filtraati (tavaliselt 100 ml). Lahjendatakse 200 milliliitrini ning lisatakse 2 g magneesiumoksiidi (3.2) ja mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni (3.3). Lahus peaks olema lakmuspaberi abil määratuna aluseline, vastasel korral lisatakse veidi magneesiumoksiidi (3.2). Edasi toimitakse vastavalt toorvalgu sisalduse määramise analüüsi meetodi punktidele 5.2 ja 5.3 (käesoleva lisa C osa). Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita. 6. Tulemuste arvutamine 1 ml H2SO40,05 mol/l vastab 1,7 mg ammoniaagile. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist. Korratavus Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 10 % ammoniaagi massist suhtelise väärtusena väljendatult. F. AMINOHAPETE (VÄLJA ARVATUD TRIPTOFAANI) MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala See meetod võimaldab aminohappeanalüsaatoriga määrata söödas vabu aminohappeid (sünteetilisi ja looduslikke) ning üldaminohappeid (peptiidsidemetega ja vabu). Meetodit saab kasutada järgmiste aminohapete puhul: tsüst(e)iin, metioniin, lüsiin, treoniin, alaniin, arginiin, asparagiinhape, glutamiinhape, glütsiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, fenüülalaniin, proliin, seriin, türosiin ja valiin. Meetod ei erista aminohapete sooli ega aminohapete D- ja L-vorme. See ei sobi trüptofaani ega aminohapete hüdroksüanaloogide määramiseks. 2. Põhimõte 2.1. Vabad aminohapped Vabad aminohapped ekstraheeritakse lahjendatud soolhappega. Kaasa ekstraheerunud lämmastikku sisaldavad makromolekulid sadestatakse sulfosalitsüülhappega ning eemaldatakse filtreerides. Filtreeritud lahuse pH korrigeeritakse 2,20-le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetrilise määramise teel reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm. 2.2. Üldaminohapped Valitav protseduur sõltub uuritavatest aminohapetest. Tsüst(e)iin ja metioniin tuleb enne hüdrolüüsi oksüdeerida vastavalt tsüsteiinhappeks ja metioniinsulfooniks. Türosiin tuleb määrata oksüdeerimata proovide hüdrolüsaatides. Kõiki teisi punktis 1 osutatud aminohappeid saab määrata kas oksüdeeritud või oksüdeerimata proovides. Oksüdeerimine viiakse läbi persipelghappe ja fenooli seguga 0 oC juures. Ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse naatriumdisulfitiga. Oksüdeeritud või oksüdeerimata proovi hüdrolüüsitakse soolhappega (3.20) 23 tundi. Hüdrolüsaadi pH korrigeeritakse 2,20-le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetriliselt reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm (proliini puhul 440 nm). 3. Reaktiivid Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS). 3.1. Vesinikperoksiid, w (w/w) = 30 % 3.2. Äädikhape, w (w/w) = 98–100 % 3.3. Fenool 3.4. Naatriumdisulfit 3.5. Naatriumhüdroksiid 3.6. 5-sulfosalitsüülhappe dihüdraat 3.7. Soolhape (tihedus umbes 1,18 g/ml) 3.8. Trinaatriumtsitraadi dihüdraat 3.9. 2,2'- tiodietanool (tiodiglükool) 3.10. Naatriumkloriid 3.11. Ninhüdriin 3.12. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC 3.13. Norleutsiin või muu sisestandardina kasutamiseks sobiv ühend 3.14. Gaasiline lämmastik (< 10 ppm hapnikku) 3.15. 1-oktanool 3.16. Aminohapped: 3.16.1. Punktis 1 loetletud standardained. Kristallisatsioonivett mitte sisaldavad puhtad ühendid. Kuivatakse vaakumis P2O5 või H2SO4 kohal ühe nädala jooksul enne kasutamist. 3.16.2. Tsüsteiinhape 3.16.3. Metioniinsulfoon 3.17. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.18. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.19. Sipelghappe-fenoolilahus: 889 g sipelghapet (3.2) segatakse 111 g veega ja lisatakse 4,73 g fenooli (3.3). 3.20. Hüdrolüüsisegu, c = 6 mol HCl/l, mis sisaldab 1 g fenooli/l: 1 g fenooli (3.3) lisatakse 492 milliliitrile HCl-le (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.21. Ekstraheerimissegu, c = 0,1 mol HCl/l, mis sisaldab 2 % tiodiglükooli. Võetakse 8,2 ml HCl (3.,7), lahjendatakse umbes 900 ml veega, lisatakse 20 ml tiodiglükooli (3.9) ja täidetakse veega 1 liitrini (3.7 ja 3.9 mitte segada otse omavahel). 3.22. 5-sulfosalitsüülhape, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalitsüülhapet (3.6) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.23. Oksüdatsioonisegu (persipelghape – fenool): 0,5 ml vesinikperoksiidi (3.1) segatakse 4,5 ml sipelghappe ja fenooli lahusega (3.19) väikses keeduklaasis. Inkubeeritakse 20–30 oC juures ühe tunni jooksul, et moodustuks persipelghape, seejärel jahutatakse jääveevanni kohal (15 min) enne proovile lisamist. Ettevaatust: vältida kokkupuudet nahaga ja kanda kaitserõivaid. 3.24. Tsitraatpuhver, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: 19,61 g naatriumtsitraati (3.8), 5 ml tiodiglükooli (3.9), 1 g fenooli (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) lahustatakse umbes 800 ml vees. pH korrigeeritakse 2,20-le. Täidetakse veega 1 liitrini. 3.25. Elutsioonipuhvrid, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (4.9). 3.26. Ninhüdriini reaktiiv, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (4.9). 3.27. Aminohapete standardlahused. Neid lahuseid tuleks hoida temperatuuril alla 5 oC. 3.27.1. Aminohapete põhistandardlahus (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml iga lahuse kohta soolhappes. On võimalik osta. 3.27.2. Tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahus, c = 1,25 μmol/ml. 0,2115 g tsüsteiinhapet (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinsulfooni (3.16.3) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) üheliitrises mõõtekolbis ning täidetakse kolb tsitraatpuhvriga märgini. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 12 kuu. Seda lahust ei kasutata, kui põhistandardlahus (3.27.1) sisaldab tsüsteiinhapet ja metioniinsulfooni. 3.27.3. Sisetandardi põhistandardlahus, nt norleutsiin, c = 20 μmol/ml. 0,6560 g norleutsiini (3.13) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) mõõtekolbis ning kolb täidetakse tsitraatpuhvriga 250 ml-ni. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle kuue kuu. 3.27.4. Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks hüdrolüsaatidega, tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni c = 5 nmol/50 μl ja teiste aminohapete c = 10 nmol/50 μl. 2,2 g naatriumkloriidi (3.10) lahustatakse 100 ml keeduklaasis 30 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Lisatakse 4,00 ml aminohapete põhistandardlahust (3.27.1), 4,00 ml tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahust (3.27.2) ja 0,50 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), kui seda kasutatakse. Naatriumhüdroksiidi (3.18) abil korrigeeritakse pH 2,20-le. Kallatakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) kuni märgini ja segatakse. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu. Vaata ka punkti 9.1 tähelepanekut. 3.27.5. Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks vastavalt punktile 5.3.3.1 valmistatud hüdrolüsaatidega ja ekstraktidega (5.2). Kalibreerimislahus valmistatakse vastavalt punktile 3.27.4, jättes välja naatriumkloriidi. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu. 4. Seadmed 4.1. 100 või 250 ml ümarapõhjaline püstjahutiga varustatud kolb 4.2. 100 ml boorsilikaatklaasist pudel kummist/teflonist tihendiga keermestatud korgiga (nt Duran, Schott) kuivatuskapis kasutamiseks 4.3. Sundventilatsiooniga ja termoregulaatoriga kuivatuskapp, mille täpsus on parem kui ± 2 oC 4.4. pH-meeter (kolme kümnendkoha täpsusega) 4.5. Membraanfilter (0,22 μm) 4.6. Tsentrifuug 4.7. Vaakumpöördaurusti 4.8. Mehaaniline loksuti või magnetsegur 4.9. Aminohappe analüsaator või HPLC-seade ioonvahetuskolonni, ninhüdriini kolonnijärgse derivatiseerimise seadme ja valgusmõõturiga. Kolonn täidetakse sulfoneeritud polüstüreenvaikudega, mis on võimelised eraldama aminohappeid üksteisest ja teistest ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Puhvri ja ninhüdriini jadas tekitatakse vool pumpadega, mille vooluühtlus on ±0,5 % nii standardkalibreerimise kui proovi analüüsi ajal. Mõnede aminohapete analüsaatoritega võib kasutada hüdrolüüsimenetlusi, mille puhul on hüdrolüsaadi naatriumikontsentratsioon c = 0,8 mol/l ja mis sisaldab oksüdatsioonietapi kõiki sipelghappe jääke. Teised analüsaatorid ei võimalda teatavaid aminohappeid rahuldaval määral eraldada, kui hüdrolüsaat sisaldab liigselt sipelghapet ja/või kui naatriumioonide kontsentratsioon on kõrge. Sellisel juhul vähendatakse pärast hüdrolüüsi ja enne pH korrigeerimist happe mahtu aurustamisega kuni umbes 5 milliliitrini. Aurustamine peab toimuma vaakumitingimustes temperatuuril kuni 40 oC. 5. Töö käik 5.1. Proovi ettevalmistamine Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.12). 5.2. Vabade aminohapete määramine söödas ja eelsegudes Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 0,2 mg täpsusega koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml ekstraheerimissegu (3.21). Segu raputatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.8). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle 100 ml keeduklaasi. Lisatakse loksutades 5,0 ml sulfosalitsüülhappe lahust (3.22) ning jätkatakse loksutamist 5 min vältel, kasutades magnetsegurit. Supernatant filtreeritakse või tsentrifuugitakse sademe eemaldamiseks. 10,0 ml saadud lahust pannakse 100 ml keeduklaasi ja korrigeeritakse pH-taset 2,20-ni, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.18), sobiv kogus valatakse tsitraatpuhvri (3.24) abil mõõtekolbi ja kolb täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini. Kui kasutatakse sisestandardit, lisatakse 1,00 ml sisestandardit (3.27.3) igasse 100 ml valmis lahusesse ja täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini. Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4. Kui ekstrakte ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC. 5.3. Üldaminohapete määramine 5.3.1. Oksüdeerimine 0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1): — 100 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) lahtise hüdrolüüsi (5.3.2.3) puhul või — 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1), kui on nõutav madal naatriumikontsentratsioon (5.3.3.1), või — 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) (suletud hüdrolüüsi 5.3.2.4 puhul). Kaalutud proovi lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg ja niiskusesisaldus kuni 100 mg. Kolb/pudel asetatakse jääveevanni ja jahutatakse kuni temperatuurini 0 oC, lisatakse 5 ml oksüdatsiooniegu (3.23) ning segatakse painutatud otsaga klaasspaatli abil. Spaatlit sisaldav kolb/pudel pitseeritakse õhukindla kilega, pitseeritud nõud sisaldav jääveevann asetatakse 16 tunniks külmikusse temperatuuril 0 oC. 16 tunni möödudes võetakse see külmikust välja ja ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse, lisades 0,84 g naatriumdisulfitit (3.4). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.1. 5.3.2. Hüdrolüüs 5.3.2.1. Oksüdeeritud proovide hüdrolüüs Vastavalt punktile 5.3.1 valmistatud oksüdeeritud proovile lisatakse 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20), pestes hoolikalt maha anuma ja spaatli külge kleepunud proovijäägid. Olenevalt sellest, millist hüdrolüüsimenetlust kasutatakse, jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4. 5.3.2.2. Oksüdeerimata proovide hüdrolüüs 100 ml või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) või 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) kaalutakse 0,2 mg täpsusega 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse hoolikalt 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20) ja segatakse prooviga. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4. 5.3.2.3. Lahtine hüdrolüüs Kolbis olevale segule (mis on valmistatud vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2) lisatakse 3 klaashelmest ja keedetakse püstjahutiga kolvis 23 tundi pideval mullidega keemisel. Pärast hüdrolüüsi teostamist pestakse jahuti maha 5 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Kolb võetakse lahti ja jahutatakse jäävannis. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3. 5.3.2.4. Kinnine hüdrolüüs Vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2 valmistatud segu sisaldav pudel asetatakse kuivatuskappi (4.3) temperatuuril 110 oC. Et vältida rõhu suurenemist (gaasiliste ainete tekkimise tõttu) ja ära hoida plahvatust, asetatakse esimeseks tunniks surveanuma peale keermestatud kork. Surveanumat ei tohi korgiga sulgeda. Ühe tunni möödudes suletakse surveanum korgiga ja jäetakse 23 tunniks kuivatuskappi (4.3). Pärast hüdrolüüsi lõpuleviimist võetakse pudel kuivatuskapist välja, avatakse ettevaatlikult pudelikork ja asetatakse pudel jääveevanni. Jahutatakse. Olenevalt sellest, millist pH korrigeerimise menetlust (5.3.3) kasutatakse, valatakse pudeli sisu kvantitatiivselt 250 ml keeduklaasi või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi, kasutades tsitraatpuhvrit (3.24). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3. 5.3.3. pH korrigeerimine Olenevalt aminohappe analüsaatori (4.9) naatriumitaluvusest toimitakse pH korrigeerimisel vastavalt punktile 5.3.3.1 või 5.3.3.2. 5.3.3.1. Kromatograafilised süsteemid (4.9), mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus Soovitatav on kasutada sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), juhul kui kasutatakse aminohappe analüsaatorit, mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus (kui happe kogust tuleb vähendada). Sellisel juhul lisatakse enne aurustamist hüdrolüsaadile 2,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3). Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadile lisatakse 2 tilka 1-oktanooli (3.15). Hüdrolüsaadi kogust vähendatakse vaakumpöördaurusti (4.7) abil 5–10 milliliitrini vaakumitingimustes temperatuuril 40 oC. Kui kogust vähendatakse kogemata vähem kui 5 milliliitrini, tuleb hüdrolüsaat välja praakida ja analüüsi tuleb uuesti alustada. pH-taset korrigeeritakse 2,20-ni naatriumhüdroksiidi lahusega (3.18) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4. 5.3.3.2. Kõik teised aminohappe analüsaatorid (4.9) Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadid neutraliseeritakse osaliselt, lisades hoolikalt loksutades 17 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.17), jälgides, et temperatuur püsiks allpool 40 oC. pH korrigeeritakse 2,20-ni toatemperatuuril, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.17) ja lõpuks naatriumhüdroksiidi lahust (3.18). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4. 5.3.4. Proovilahus kromatograafia jaoks Korrigeeritud pH-tasemega hüdrolüsaat (5.3.3.1 või 5.3.3.2) kallatakse kvantitatiivselt koos tsitraatpuhvriga (3.24) 200 ml mõõtekolbi ja täidetakse puhvriga (3.24) märgini. Kui sisestandardit ei ole veel kasutatud, lisatakse 2,00 ml sisestandardit (3.27.3) ja täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) märgini. Segatakse hoolikalt. Seejärel alustatakse kromotograafiat (5.4). Kui proovilahuseid ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC. 5.4. Kromatograafia Enne kromotograafiat viiakse ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3.4) toatemperatuurile. Segu loksutatakse ja filtreeritakse sobiv kogus läbi 0,22 μm membraanfiltri (4.5). Saadud selge lahusega tehakse ioonvahetuskromatograafia, kasutades aminohappe analüsaatorit (4.9). Sissesüstimist võib teostada käsitsi või automaatselt. On oluline, et standardite ja proovide analüüsiks lisataks kolonni sama kogus lahust ±0,5 %, välja arvatud sisestandardi kasutamisel, ning et naatriumi ja aminohapete vahekord standard- ja proovilahustes oleks võimalikult sarnane. Üldiselt sõltub kalibreerimiskatsete sagedus ninhüdriini reaktiivi stabiilsusest ja analüütilisest süsteemist. Standard või proov lahjendatakse tsitraapuhvriga (3.24), et saavutada standardi piigipindalaks 30–200 % proovi aminohappe piigipindalast. Aminohapete kromatograafia varieerub kergelt vastavalt sellele, millist tüüpi analüsaatorit ja millist vaiku kasutatakse. Valitud süsteem peab suutma eraldada aminohapped üksteisest ja ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma lineaarselt kolonni lisatud aminohapete muutustest. Kromatograafia etapil kehtivad (määratavate aminohapete) ekvimolaarlahuse analüüsimisel allpool esitatud miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekorrad. Ekvimolaarlahus peab sisaldama vähemalt 30 % iga aminohappe maksimumkogusest, mida on võimalik täpselt mõõta aminohappe analüüsisüsteemi (4.9) abil. Treoniini-seriini eraldamiseks ei tohi kahest kattuvast aminohappest madalama aminohappe miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekord kromatogrammil ületada suhet 2:10. (Kui määratakse vaid tsüst(e)iini, metioniini, treoniini ja lüsiini, kahjustab nende määramist ebapiisav eraldamine külgnevatest piikidest.). Kõigi teiste aminohapete puhul peab eraldatus olema parem kui suhe 1:10. Süsteem peab tagama lüsiini eraldamise „lüsiini artefaktidest” ja ornitiinist. 6. Tulemuste arvutamine Proovi ja standardi piikide pindala mõõdetakse iga üksiku aminohappe kohta ning arvutatakse kogus (X) ühes grammis aminohappes proovi kilo kohta. Kui kasutatakse sisestandardit, korrutatakse tulemus liikmega A = piigipindala, hüdrolüsaat või ekstrakt B = piigipindala, kalibreerimisstandardlahus C = piigipindala, sisestandard hüdrolüsaadis või ekstraktis D = piigipindala, sisestandard, kalibreerimisstandardlahus M = määratava aminohappe molaarmass c = standardi kontsentratsioon μmol/ml m = proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud) V = hüdrolüsaat (5.3.4) kokku milliliitrites või ekstrakti (6.1) lahjenduse koguruumala milliliitrites Tsüstiin ja tsüsteiin määratakse mõlemad tsüsteiinhappena oksüdeeritud proovide hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse tsüstiiniks (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), kasutades M väärtust 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metioniin määratakse metioniinsulfoonina oksüdeeritud proovi hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse metioniinina, kasutades metioniini M väärtust: 149,21 g/mol. Lisatud vaba metioniin määratakse pärast ekstraheerimist metioniinina, arvutamisel kasutatakse sama M väärtust. 6.1. Ekstraktide lahjenduse koguruumala (F) vabade aminohapete (5.2) määramiseks arvutatakse järgmiselt: V = lõppekstrakti ruumala 7. Meetodi hindamine Meetodit on katsetatud rahvusvahelises võrdluskatses 1990. aastal, kasutades nelja erinevat sööta (sigade segasööt, broilerite segasööt, valgukontsentraat, eelsegu). Tulemuste keskväärtused ja standardhälbed pärast võõrväärtuste elimineerimist on esitatud käesoleva punkti tabelis. Keskväärtused g/kg Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 N = 17 9,55 n = 13 Broilerite segasööt 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 N = 18 13,93 n = 16 Valgukontsentraat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 N = 17 47,74 n = 15 Eelsegu 58,42 n = 16 — 90,21 N = 16 98,03 n = 16 n = osalenud laborite arv 7.1. Korratavus Eespool nimetatud võrdluskatse korratavus on väljendatud laborisisese standardhälbena ja esitatud järgmistes tabelites. Laborisisesed standardhälbed (Sr) g/kg Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Broilerite segasööt 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Valgukontsentraat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Eelsegu 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = osalenud laborite arv

Laborisisese standardhälbe (Sr) variatsioonikordaja (%) Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Broilerite segasööt 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Valgukontsentraat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Eelsegu 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = osalenud laborite arv 7.2. Reprodutseeritavus Eespool nimetatud võrdluskatse laboritevahelise standardhälbe tulemused on esitatud järgmises tabelis: Laboritevaheline standardhälve (SR) g/kg Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Broilerite segasööt 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Valgukontsentraat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Eelsegu 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = osalenud laborite arv

Laboritevahelise standardhälbe (SR) variatsioonikordaja (%) Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Broilerite segasööt 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Valgukontsentraat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Eelsegu 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = osalenud laborite arv 8. Etalonainete kasutamine Meetodi õige rakendamise kontrollimiseks tehakse korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega, kui need ained on kättesaadavad. Soovitatav on kalibreerida aminohapete sertifitseeritud kalibreerimislahusega. 9. Tähelepanekud 9.1. Aminohappeanalüsaatorite erinevustest tingituna tuleb standardaminohapete kalibreerimislahuste (vt 3.27.4 ja 3.27.5) ja hüdrolüsaadi (vt 5.3.4) lõppkontsentratsioone vaadelda suunistena. Kõigi aminohapete puhul tuleb kontrollida aparatuuri lineaarse ala vahemikku. Standardlahus lahjendatakse tsitraatpuhvriga, et piigialad oleksid vahemiku keskel. 9.2. Kui hüdrolüsaatide analüüsiks kasutatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia aparatuuri, tuleb katsetingimused optimeerida vastavalt tootja soovitustele. 9.3. Meetodi rakendamisel sööda suhtes, mille kloriidisisaldus on suurem kui 1 % (kontsentraadid, mineraalsöödad, täiendsöödad), võib analüüs näidata tegelikust väiksemat metioniinisisaldust ning tuleb kasutada erimeetodit. G. TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata trüptofaani üldsisaldust ja vaba trüptofaani sisaldust söödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi. 2. Põhimõte Trüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 oC juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard. Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul. Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil. 3. Reaktiivid 3.1. Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS/cm). 3.2. Standardaine: trüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal. 3.3. Sisestandardaine: α-metüültrüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal. 3.4. Baariumhüdroksiidi oktahüdraat (vältida Ba(OH)2 .8 H2O ülemäärast kontakti õhuga, kuna see võib viia BaCO3 moodustumiseni, mis võib määramist segada) (vt tähelepanek 9.3). 3.5. Naatriumhüdroksiid 3.6. Ortofosforhape, w (w/w) = 85 % 3.7. Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Metanool, samaväärne kui HPLC-puhas. 3.9. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC 3.10. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini. 3.11. Soolhape, c = 6 mol/l: Võetakse 492 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.12. Soolhape, c = 1 mol/l: Võetakse 82 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.13. Soolhape, c = 0,1 mol/l: Võetakse 8,2 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini. 3.14. Ortofosforhape, c = 0,5 mol/l: Võetakse 34 ml ortofosforhapet (3.6) ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini. 3.15. Trüptofaani (3.2) kontsentreeritud lahus, c = 2,50μmol/ml: 500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2553 g trüptofaani (3.2) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat. 3.16. Sisestandardi kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml: 500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2728 g α-metüültrüptofaani (3.3) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat. 3.17. Trüptofaani ja sisestandardi kalibreerimisstandardlahus: Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Lahjendatakse veega (3.1) ja metanooliga (3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist. Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust. 3.18. Äädikhape 3.19. 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanool 3.20. Etanoolamiin w (w/w) > 98 % 3.21. 1 grammi 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahus 100 ml metanoolis (3.8). 3.22. HPLC liikuv faas: 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust (3.21) 1g/100 ml metanoolis (3.8). Etanoolamiini (3.20) abil korrigeeritakse pH 5,00-le. Täidetakse veega (3.1) 1 000 ml-ni. 4. Seadmed 4.1. HPLC-seadmed spektrofluorimeetrilise detektoriga 4.2. Vedelikkromatograafia kolonn, 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm, või samaväärne 4.3. pH-meeter 4.4. Laia kaela ja keeratava korgiga polüpropüleenkolb, maht 125 ml 4.5. Membraanfilter (0,45 μm) 4.6. Autoklaav, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1) bar 4.7. Mehaaniline loksuti või magnetsegur 4.8. Pöörissegaja 5. Töö käik 5.1. Proovide ettevalmistamine Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.9). 5.2. Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt) Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet (3.13), c = 0,1 mol/l, ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Naatriumhüdroksiidi (3.10) abil korrigeeritakse pH 3-le. Lisatakse piisavalt metanooli (3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kalibreerimisstandardlahusel (3.17)). Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4. Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva. 5.3. Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat). 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1) kaalutakse 0,2 mg täpsusega polüropüleenkolbi (4.4). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse 8,4 g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (4.8) või magnetseguriga (4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse autoklaavi (4.6) ja kuumutatakse keevas vees ja aurus 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (±2) oC juures. Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 oC kraadi. Ba(OH)2 .8 H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit. Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga (3.11) ning pH korrigeeritakse 3,0-ni HCl (3.12) abil. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 %ni. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist. Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4. Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva. 5.4. HPLC määramine Soovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest. Muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused (vt ka tähelepanekuid 9.1 ja 9.2): Vedelikkromatograafia kolonn (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne Kolonni temperatuur: Ruumitemperatuur Liikuv faas (3.22): 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust metanoolis (3.8) (1g/100ml). pH korrigeeritakse 5,00-le etanoolamiini (3.20) abil. Täidetakse veega (3.1) 1 000 ml-ni. Voolukiirus: 1 ml/min Summaarne voolutamisaeg: umbes 34 min Avastamise lainepikkus: ergastamine: 280 nm, emissioon: 356 nm. Sissesüstitav ruumala 20 μl 6. Tulemuste arvutamine Arvutatakse trüptofaani (X) kogus grammides 100 g proovi kohta. A = sisestandardi piipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17) B = trüptofaani piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3) V1 = kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kogus milliliitrites (2 ml) c = kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kontsentratsioon, μmol/ml (= 2,50) V2 = kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites, mis on lisatud ekstraheerimisel (5.2) (= 5,00 ml) või hüdrolüsaadile (5.3) (= 2,00 ml) C = sisestandardi piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3) D = trüptofaani piigipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17) V3 = kalibreerimisstandardlahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites (= 2,00 ml) m = proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud) M = trüptofaani molaarmass (= 204,23 g/mol) 7. Korratavus Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % suuremast tulemusest. 8. Ühisuuringu tulemused Korraldati ühendusesisene ühisuurimine (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis: Proov 1 Seasööt Proov 2 L-trüptofaaniga rikastatud seasööt Proov 3 Seasöödakontsentraat L 12 12 12 n 50 55 50 Keskmine g/kg 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2 L = tulemused esitanud laborite arv n = üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel) sr = korratavust iseloomustav standardhälve SR = reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve r = korratavus R = reprodutseeritavus CVr = korratavuse variatsioonikordaja, % CVR = reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % Teise ühendusesisese ühisuurimise (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis: Proov 4 Nisu ja soja segu Proov 5 Nisu ja soja segu (= proov 4), millele on lisatud trüptofaani (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Keskväärtus g/kg 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11 L = tulemused esitanud laborite arv n = üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel) sr = korratavust iseloomustav standardhälve SR = reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve r = korratavus R = reprodutseeritavus CVr = korratavuse variatsioonikordaja, % CVR = reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % Veel ühe ühendusesisese võrdlusuuringu käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Proov 1 Sigade söödasegu (CRM 117) Proov 2 Väikese rasvasisaldusega kalajahu (CRM 118) Proov 3 Sojajahu (CRM 119) Proov 4 Lõssipulber (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Keskväärtus g/kg 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = tulemused esitanud laborite arv n = üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel) sr = korratavust iseloomustav standardhälve SR = reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve r = korratavus R = reprodutseeritavus CVr = korratavuse variatsioonikordaja, % CVR = reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, % 9. Tähelepanekud 9.1. Järgmised kromatograafia eritingimused võivad tagada trüptofaani ja α-metüültrüptofaani parema eraldumise teineteisest. Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni gradientpuhastus: Vedelikkromatograafia kolonn: 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne Kolonni temperatuur: 32 oC Liikuv faas: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanool, 95+5 (V+V). B: Metanool Gradientprogramm: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Voolukiirus: 1,2 ml/min Summaarne voolutamisaeg: umbes 33 min 9.2. Kromatograafiline määramine oleneb HPLC tüübist ja kasutatavast kolonnitäidisest. Valitud süsteem peab tagama trüptofaani ja sisestandardi piikide täieliku eraldumise (kuni alusjooneni). Lisaks sellele on oluline, et lagunemisproduktid eralduksid hästi trüptofaanist ja sisestandardist. Kolonni tuleb süstida hüdrolüsaate ilma sisestandardita, kontrollimaks, et sisestandardi piigi kohal ei moonutaks alusjoont lisandite väljumine. On oluline, et voolutamisaeg oleks piisavalt pikk kõigi lagunemisproduktide elueerimiseks, vastasel juhul võivad hiljem elueeruvad piigid segada järgnevaid kromatograafilisi määramisi. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma kontsentratsioonist lineaarselt. Tulemuste lineaarsust tuleks kontrollida sisestandardi konstantsel (normaalsel) kontsentratsioonil erinevate trüptofaani kontsentratsioonidega. On oluline, et nii trüptofaani kui ka sisestandardi piigid oleksid HPLC-/fluorestsentssüsteemi lineaarses alas. Kui trüptofaani või sisestandardi piigid on liiga väikesed või liiga suured, siis tuleks analüüsi korrata teistsuguse proovi suurusega ja/või teistsuguse lõppruumalaga. 9.3. Baariumhüdroksiid Baariumhüdroksiidi lahustamine raskeneb baariumhüdroksiidi vananemisel. Selle tulemusel saadakse HPLC-ga määramiseks hägune lahus, mis võib vähendada trüptofaani määramisel saadavaid tulemusi. H. TOORÕLI JA -RASVA MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala See meetod võimaldab määrata toorõli ja -rasva sisaldust söödas. See ei hõlma õliseemnete ja õliviljade analüüsi. Allpool kirjeldatud kahe meetodi kasutamine sõltub sööda laadist ja koostisest ning analüüsi tegemise põhjusest. 1.1. Meetod A – otse ekstraheeritav toorõli ja -rasv Seda meetodit kohaldatakse taimsete söödatoorainete puhul, välja arvatud meetodiga B hõlmatud ainete puhul. 1.2. Meetod B – kogu toorõli ja -rasv Seda meetodit kohaldatakse loomsete söödatoorainete ja kõigi segajõusöötade puhul. Seda kasutatakse kõigi ainete puhul, millest ei ole ilma eelneva hüdrolüüsita võimalik õli ja rasva ekstraheerida (nt gluteenid, pärm, kartulivalgud ning tooted, mille puhul kasutatakse muu hulgas pressimist, helvestamist või kuumutamist). 1.3. Tulemuste tõlgendamine Kõigil juhtudel, kui meetodiga B saadakse suurem tulemus kui meetodiga A, loetakse meetodiga B saadud tulemus õigeks väärtuseks. 2. Põhimõte 2.1. Meetod A Proov ekstraheeritakse petrooleetriga. Solvent destilleeritakse välja ning jääk kuivatatakse ja kaalutakse. 2.2. Meetod B Proovi töödeldakse kuumalt soolhappega. Segu jahutatakse ja filtreeritakse. Jääk pestakse, kuivatatakse ja määratakse vastavalt meetodile A. 3. Reaktiivid 3.1. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC. Broomiarv peab olema väiksem kui 1 ja aurustamise jääk alla 2 mg/100 ml. 3.2. Veevaba naatriumsulfaat. 3.3. Soolhape, c = 3 mol/l 3.4. Filteraine, nt Kieselguhr, Hyflo-supercel. 4. Seadmed 4.1. Ekstraheerimisaparaat. Kui see on varustatud sifooniga (Soxhleti aparaat), siis peab tagasivoolu kiirus olema selline, et tekiks umbes 10 tsüklit tunnis; kui aparaat on ilma sifoonita, siis peab tagasivoolu kiirus olema ligikaudu 10 ml minutis. 4.2. Ekstraheerimishülsid, milles ei ole petrooleetris lahustuvaid aineid ning mille poorsus vastab punkti 4.1 nõuetele. 4.3. Kuivatuskapp: kas vaakumkuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 75 ± 3 oC, või õhkkuivatuskapp, mis on seatud temperatuurile 100 ± 3 oC. 5. Töö käik 5.1. Meetod A (vt punkt 8.1) 5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga. Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) kuus tundi. Petrooleetri ekstrakt kogutakse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid (2). Solvent destilleeritakse välja. Jääk koos kolviga asetatakse poolteiseks tunniks kuivatuskappi (4.3) kuivama. Lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Kuivatatakse veel 30 minutit, et veenduda, et õli ja rasva mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). 5.2. Meetod B 2,5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega (vt punkt 8.2), pannakse 400 ml keeduklaasi või 300 ml Erlenmeyeri kolbi ning lisatakse 100 ml soolhapet (3.3) ja pimsskivitükke. Keeduklaas kaetakse kellaklaasiga või pannakse Erlenmeyeri kolbi külge püstjahuti. Segu kuumutatakse madala leegi või kuumutusplaadi kohal keemiseni ja keedetakse nõrgalt tund aega. Tuleb vältida toote sadestumist nõu seinte külge. Jahutatakse ja lisatakse selline kogus filterainet (3.4), mis on piisav õli- ja rasvakao vältimiseks filtreerimisel. Lahus filtreeritakse läbi niisutatud rasvavaba kahekordse filterpaberi. Jääki pestakse külmas vees kuni filtraadi neutraalse reaktsioonini. Kontrollitakse, et filtraat ei sisalda õli ega rasva. Kui filtraat sisaldab õli või rasva, tuleb proov enne hüdrolüüsi petrooleetriga ekstraheerida, kasutades meetodit A. Kahekordne filterpaber koos jäägiga asetatakse kellaklaasile ja kuivatatakse poolteist tundi ventileeritavas kuivatuskapis (4.3) 100 ± 3 oC juures. Kahekordne filterpaber koos kuivjäägiga asetatakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga. Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule. 6. Tulemuste väljendamine Jäägi mass väljendatakse protsendimäärana proovist. 7. Korratavus Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: — absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui õli ja rasva üldsisaldus on alla 5 %; — 4,0 % suuremast tulemusest, kui toorõli ja -rasva sisaldus on 5–10 %; — absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorõli ja -rasva sisaldus on üle 10 %. 8. Tähelepanekud 8.1. Suure õli- ja rasvasisaldusega toodete puhul, mida on keeruline peenestada või millest ei saa võtta homogeenset vähendatud proovi, toimitakse järgmiselt. 20 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja segatakse vähemalt 10 g veevaba naatriumsulfaadiga (3.2). Segu ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) vastavalt punktile 5.1. Saadud ekstrakti täidetakse petrooleetriga (3.1) 500 ml-ni ja segatakse. 50 ml lahust pannakse väiksesse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid (1). Solvent destilleeritakse välja, segu kuivatatakse ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 viimasele lõigule. Hülssi jäänud ekstraheerimisjäägist eemaldatakse solvent, peenestatakse jääk 1 mm osakesteks, pannakse see tagasi ekstraheerimishülssi (ilma naatriumsulfaati lisamata) ning jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule. Õli- ja rasvasisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil: (10m1 + m2) × 5 kus: m1 = jäägi mass grammides pärast esimest ekstraheerimist (alikvootne osa ekstraktist), m2 = jäägi mass grammides pärast teist ekstraheerimist. 8.2. Väikese õli- ja rasvasisaldusega toodete puhul võib uuritava proovi massi suurendada 5 grammini. 8.3. Suure veesisaldusega lemmikloomatoite võib olla vaja segada veevaba naatriumsulfaadiga enne hüdrolüüsi ja ekstraheerimist vastavalt meetodile B. 8.4. Punktis 5.2 võib olla tõhusam kasutada jäägi pesemiseks pärast filtreerimist külma vee asemel sooja vett. 8.5. Mõne sööda puhul võib olla vaja pikendada 1,5tunnist kuivamisaega. Tuleb vältida liigset kuivatamist, kuna see võib põhjustada madalaid tulemusi. Kasutada võib ka mikrolaineahju. 8.6. Kui toorõli ja -rasva sisaldus on üle 15 %, on soovitatav proov enne hüdrolüüsi ekstraheerida meetodi A järgi ning uuesti ekstraheerida meetodi B järgi. Mingil määral sõltub see sööda ja selles leiduva õli ning rasva laadist. I. KOGUKIU MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata söödas happelises ja leeliselises keskkonnas lahustumatuid rasvavabu orgaanilisi aineid, mida harilikult nimetatakse kogukiuks. 2. Põhimõte Proovi, mis on vajaduse korral rasvatustatud, töödeldakse mitu korda järjest teatava kontsentratsiooniga väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi keevate lahustega. Jääk eraldatakse filtreerimise abil paagutatud klaasfiltril ning pestakse, kuivatatakse, kaalutakse ja tuhastatakse temperatuuril vahemikus 475–500 oC. Tuhastamisest tulenev massikadu vastab uuritavas proovis sisalduvale kogukiule. 3. Reaktiivid 3.1. Väävelhape, c = 0,13 mol/l 3.2. Vahutamisvastane aine (nt n-oktanool) 3.3. Filteraine (Celite 545 või samaväärne toode), mida soojendatakse temperatuuril 500 oC neli tundi (8.6) 3.4. Atsetoon 3.5. Petrooleeter, keemistemperatuur 40–60 oC 3.6. Soolhape, c = 0,5 mol/l 3.7. Kaaliumhüdroksiidi lahus, c = 0,23 mol/l 4. Seadmed 4.1. Väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi lahusega lagundamiseks mõeldud kuumutusseade, mis on varustatud filtertiigli (4.2) toe ja äravoolutoruga, millel on klapp vedeliku väljavoolu peatamiseks ja võimaluse korral suruõhuga tekitatud vaakum. Iga päev eelkuumutatakse seadet enne kasutamist keeva veega viis minutit. 4.2. Paagutatud kvartsklaasist filterplaadiga klaasist filtertiigel, poori suurus 40–90 μm. Enne esimest kasutamist kuumutatakse mõni minut kuni temperatuurini 500 oC ja jahutatakse (8.6). 4.3. Püstjahutiga vähemalt 270 ml silinder, mis sobib keetmiseks. 4.4. Termostaadiga kuivatuskapp. 4.5. Termostaadiga muhvelahi. 4.6. Ekstraheerimisseade, mis koosneb filtertiigli (4.2) tugiplaadist ja väljalasketorust, millel on klapp vaakumi ja vedeliku väljavoolu peatamiseks. 4.7. Ühendusrõngad kuumutusseadme (4.1), tiigli (4.2) ja silindri (4.3) ühendamiseks ning külmekstraheerimisseadme (4.6) ja tiigli ühendamiseks. 5. Töö käik 1 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse see tiiglisse (4.2) (vt tähelepanekud 8.1, 8.2 ja 8.3) ning lisatakse 1 g filterainet (3.3). Kuumutusseade (4.1) ja filtertiigel (4.2) ühendatakse ning seejärel kinnitatakse silinder (4.3) tiigli külge. 150 ml keevat väävelhapet (3.1) valatakse ühendatud silindrisse ja tiiglisse ning vajadusel lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2). Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit. Väljalasketoru (4.1) klapp avatakse, väävelhape filtreeritakse vaakumitingimustel läbi filtertiigli ning jääki pestakse kolm korda järjest 30 ml keeva veega, tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks. Äravooluklapp suletakse ning ühendatud silindrisse ja tiiglisse valatakse 150 ml keevat kaaliumhüdroksiidi lahust (3.7) ning lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2). Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit. Filtreeritakse ja korratakse pesemisprotseduuri, mida kasutati väävelhappe juures. Pärast lõplikku pesemist ja kuivatamist ühendatakse tiigel ja selle sisu lahti ning ühendatakse see külmekstraheerimisseadmega (4.6). Jääki pestakse tiiglis vaakumitingimustel kolm korda järjest 25 ml atsetooniga (3.4), tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks. Tiigel kuivatakse püsikaaluni kuivatuskapis temperatuuril 130 oC. Pärast iga kuivatamist jahutatakse tiiglit eksikaatoris ja kaalutakse kiiresti. Tiigel asetatakse muhvelahju ja tuhastatakse püsikaaluni (massikadu peab kahe järjestikuse kaalumise vahel olema 2 mg või alla selle) temperatuuril 475 oC kuni 500 oC vähemalt 30 minutit. Pärast iga kuumutamist jahutatakse tiiglit enne kaalumist kõigepealt ahjus ja seejärel eksikaatoris. Teostatakse ilma proovita pimekatse. Tuhastamisest tingitud massikadu ei tohi olla üle 4 mg. 6. Tulemuste arvutamine Kogu kiu sisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil: kus: m = proovi mass grammides; m0 = massikadu pärast tuhastamist määramise ajal, grammides; m1 = massikadu pärast tuhastamist pimekatse ajal, grammides. 7. Korratavus Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: — absoluutväärtuses väljendatult 0,6 %, kui kogukiu sisaldus on alla 10 %; — 6 % suuremast tulemusest, kui kogukiu sisaldus on 10 % või suurem. 8. Tähelepanekud 8.1. Sööt, mis sisaldab üle 10 % rasva, tuleb enne analüüsimist petrooleetriga (3.5) rasvatustada. Filtertiigel (4.2) ja selle sisu ühendatakse külmekstraheerimisseadmega (4.6) ja pestakse jääki vaakumitingimustel kolm korda järjest 30 ml petrooleetriga, tagades, et jääk oleks kuiv. Tiigel ja selle sisu ühendatakse kuumutusseadmega (4.1) ja jätkatakse vastavalt punktile 5. 8.2. Sööt, mis sisaldab rasva ja mida ei saa ekstraheerida petrooleetriga (3.5) otse, tuleb rasvatustada vastavalt punktile 8.1 ja rasvatustada veel üks kord pärast happega keetmist. Pärast happega keetmist ja järgnevat pesemist ühendatakse tiigel ja selle sisu külmekstraheerimisseadmega (4.6) ja pestakse jääki kolm korda järjest 30 ml atsetooniga ning seejärel veel kolm korda 30 ml petrooleetriga. Filtreeritakse vaakumitingimustel kuivaks ja jätkatakse analüüsi vastavalt punktile 5, alustades töötlemisest kaaliumhüdroksiidiga. 8.3. Kui sööt sisaldab üle 5 % karbonaati, mis on väljendatud kaltsiumkarbonaadina, ühendatakse tiigel (4.2) kaalutud prooviga kuumutusseadme (4.1) külge. Proovi pestakse kolm korda 30 ml soolhappega (3.6). Pärast iga lisamist lastakse proovil seista umbes üks minut enne filtreerimist. Pestakse üks kord 30 ml veega ja jätkatakse seejärel vastavalt punktile 5. 8.4. Kui kasutatakse statiivitaolist seadet (mitu tiiglit on kinnitatud sama kuumutusseadme külge), ei või sama analüüsitava proovi suhtes teostada kahte üksikut määramist samas sarjas. 8.5. Kui pärast keetmist on raske filtreerida happelisi ja aluselisi lahuseid, kasutatakse kuumutusseadme väljalasketoru kaudu lastavat suruõhku ja jätkatakse seejärel filtreerimist. 8.6. Tuhastamistemperatuur ei tohi olla üle 500 oC, et pikendada klaasfiltertiiglite eluaega. Tuleb jälgida, et kuumutus- ja jahutustsüklite ajal ei tekiks liigset termolööki. J. SUHKRU MÄÄRAMINE 1. Eesmärk ja rakendusala Selle meetodiga on võimalik määrata redutseerivate suhkrute hulka ja pärast inversiooni üldsuhkru hulka, väljendatuna glükoosina või sõltuvalt olukorrast sahharoosina, kasutades ümberarvestustegurit 0,95. Seda meetodit kasutatakse segajõusöötade puhul. Muude söötade puhul on sätestatud erimeetodid. Vajaduse korral tuleb laktoosi hulk mõõta eraldi ja tulemuste arvutamisel seda arvesse võtta. 2. Põhimõte Suhkrud ekstraheeritakse lahjendatud etanoolis; lahus selitatakse Carrezi lahustega I ja II. Pärast etanooli eemaldamist määratakse kogused enne ja pärast inversiooni Luff-Schoorli meetodi abil. 3. Reaktiivid 3.1. 40 % etanoolilahuse (v/v) tihedus: 0,948 g/ml 20 oC juures, fenoolftaleiini suhtes neutraalne 3.2. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn (CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini