Komisjoni otsus,

13. juuni 2003,

lõhelaste nakkava kehvveresuse (ISA) esinemise kahtluse või kinnitamise korral tsoonideks jaotamise ja ametliku järelevalve kriteeriumite kehtestamise kohta

(teatavaks tehtud numbri K(2003) 1831 all)

(EMPs kohaldatav tekst)

(2003/466/EÜ)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 28. jaanuari 1991. aasta direktiivi 91/67/EMÜ akvakultuurloomade ja -toodete turuleviimist reguleerivate loomatervishoiunõuete kohta, [1] viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 806/2003, [2] eriti selle artiklit 15,

võttes arvesse nõukogu 24. juuni 1993. aasta direktiivi 93/53/EÜ kalahaiguste minimaalsete ühenduse tõrjemeetmete kehtestamise kohta, [3] viimati muudetud komisjoni otsusega 2001/288/EÜ, [4] eriti selle artikli 5 lõiget 2 ja artiklit 6,

ning arvestades järgmist:

(1) Direktiivi 93/53/EMÜ kohaselt teostatakse proovide võtmist ja laboratoorset kontrolli direktiivi 91/67/EMÜ A lisas olevate I ja II loetelu haiguste esinemise avastamiseks vastavalt direktiivi 91/67/EMÜ artiklile 15 kehtestatud meetodeid kasutades.

(2) Proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid II loetelu kalahaiguste, viirusliku hemorraagilise septitseemia (VHS) ja nakkusliku vereloomenekroosi (IHN) avastamiseks ja nende esinemise kinnitamiseks on sätestatud komisjoni otsuses 2001/183/EÜ. [5]

(3) Vastavalt direktiivi 93/53/EMÜ artikli 5 lõikele 2 ja artiklile 6 on kõik lõhelaste nakkava aneemia (ISA-viiruse) nakkuse kahtlusega või kinnitusega kasvandustega samal valglal või rannikualal olevad kasvandused ametliku järelevalve all. Kehtestatakse tsoonideks jaotamise ja ametliku järelevalve kriteeriumid.

(4) Proovivõtuplaanide ja diagnostikameetodite kindlaks määramiseks ISA avastamiseks ja kinnitamiseks ning tsoonideks jaotamise ja ametliku järelevalve kriteeriumite kindlaks määramiseks ISA kahtluse või selle esinemise kinnitamise korral konsulteeritakse kalatervise- ja laboratooriumite ekspertidega. Lisaks sellele peab arvesse võtma rahvusvahelise episootiaameti (OIE) akvakultuuri haiguste diagnostika käsiraamatu kehtivas versioonis esitatud ISA diagnoosimise suuniseid.

(5) Nende uute nõuete rakendamiseks tuleks ette näha piisav ajavahemik.

(6) Käesoleva otsusega ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise toiduahela ja loomatervishoiu komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA OTSUSE:

Artikkel 1

Käesoleva otsuse lisas lõhelaste nakkava kehvveresuse (ISA) avastamiseks ja kinnitamiseks kehtestatakse proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid ning ka tsoonideks jaotamise ja ametliku seire kriteeriumid ISA kahtluse või selle esinemise kinnitamise korral.

Artikkel 2

Käesolevat otsust kohaldatakse alates 23. oktoobrist 2003.

Artikkel 3

Käesolev otsus on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 13. juuni 2003

Komisjoni nimel

komisjoni liige

David Byrne

[1] EÜT L 46, 19.2.1991, lk 1.

[2] EÜT L 122, 16.5.2003, lk 1.

[3] EÜT L 175, 19.7.1993, lk 23.

[4] EÜT L 99, 10.4.2001, lk 11.

[5] EÜT L 67, 9.3.2001, lk 65.

--------------------------------------------------

LISA

Lõhelaste nakkava kehvveresuse (ISA) avastamiseks ja kinnitamiseks kehtestatud proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid ning tsoonideks jaotamise ja ametliku seire kriteeriumid ISA kahtluse või kinnitamise korral

SISSEJUHATUS JA MÄÄRATLUSED

Käesolev lisa:

a) sätestab suunised ja miinimumnõuded ISA avastamiseks ja selle esinemise kinnitamiseks mõeldud proovivõtuplaanidele ja diagnostikameetoditele;

b) sisaldab direktiivis 91/67/EMÜ ja direktiivis 93/53/EMÜ kehtestatud sätteid ja määratlusi;

c) kehtestab sätted, mille eesmärgiks on ISA õige diagnoosimine, tõrje ja järelevalve ISA kahtluse või kinnituse korral;

d) on suunatud ISA tõrje eest vastutavatele ametiasutustele ning selle haiguse suhtes analüüse tegevatele laboritöötajatele. Rõhk on proovivõtumeetoditel, laborikatsete põhimõtetel ja otstarvetel ning tulemuste hindamisel, samuti üksikasjalikel analüüsimeetoditel. Vajaduse korral võivad laborid siiski kasutada käesolevas lisas kirjeldatud katsete teisendeid või muid katseid, tingimusel, et saab tõendada samaväärset või suuremat tundlikkust ja spetsiifilisust. Lisaks sellele on kehtestatud tsoonide jaotamise või ametliku järelevalve kriteeriumid ISA kahtluse või kinnituse korral.

Käesolevas lisas kasutatakse järgmisi mõisteid.

Valgla – kogu valgla veeteede algallikast lehtersuudmesse või osa valgla veeteede allikast looduslike või tehislike tõketeni, mis takistavad kalade liikumist üle tõkke.

Rannikuala – ranniku, merevee või lehtersuudme osa, millel on täpsed geograafilised piirid ja mis hõlmavad homogeenset hüdrodünaamilist süsteemi või selliste süsteemide seeriat.

I osa sätestab ISA diagnoosimise ja kinnitamise üldpõhimõtted ja kriteeriumid ning ISA kahtluse või kinnituse korral tehtava tsoonideks jaotamise ja ametliku järelevalve kriteeriumid.

II osa sätestab ISA avastamiseks tehtavad kontrollid ja proovide võtmised.

III osa sätestab viroloogilisel uuringul kasutatavad meetodid.

IV osa kirjeldab proovide analüüsimisel kasutavat RT-PCR meetodit ISA avastamiseks.

V osa kirjeldab IFAT-meetodil (immunofluorestsentskatse viiruse antikehade määramiseks) kasutatavat neeruproovide uurimismeetodit ISA avastamiseks.

VI osa sisaldab histoloogilisi meetodeid.

VII osa loetleb kasutatud akronüümid ja lühendid.

I. ISA diagnoosimise ning tsoonide loomise, teatavate tõrjemeetmete ja ametliku järelevalve kriteeriumid.

I.1. ISA diagnoosimise üldpõhimõtted

Käesoleva lisa I.2 osas on kirjeldatud need põhjused, mille põhjal on alust kahtlustada, et kala on nakatunud ISA viirusega. Liikmesriigid tagavad, et kalade ISA viiruse kahtluse korral tehakse kasvanduses võimalikult kiiresti ametlik kontroll, mis haiguse esinemist kinnitab või välistab, kohaldades käesoleva lisa III–VI osas sätestatud kontrolle ja kliinilisi läbivaatusi ning ka proovide kogumist ja valimist ning laboratoorse läbivaatuse meetodeid. ISA esinemise ametlikuks kinnitamiseks tuleb täita üks kolmest käesoleva lisa I.3 osas sätestatud kriteeriumitest.

I.2. ISA nakkuse kahtlus

I.2.1. ISA esinemist kahtlustatakse, kui esineb vähemalt üks järgmistest kriteeriumitest:

a) ISAle omased lahkamistulemused, kliiniliste haigustunnustega või ilma. Lahkamistulemused ja kliinilised haigustunnused peavad vastama rahvusvahelise episootiaameti akvakultuuri haiguste diagnostika käsiraamatu kehtivas versioonis kirjeldatule;

b) ISA-viiruse isoleerimine ja identifitseerimine III osas kirjeldatud viisil rakukultuuris üksikproovist, mis on pärit mistahes kasvanduses olevast kalast;

c) kahe sõltumatu laboratooriumi katsete põhjal, nt RT-PCR-meetodil (IV osa) ja IFAT-meetodil (V osa) saadud ISA-viiruse esinemise tõendus;

d) eluskalade ümberpaigutamine kasvandusse ajal, mil on alust kahtlustada ISA esinemist;

e) kui uurimise käigus ilmnevad olulised epidemioloogilised seosed ISA-kahtlaste või kinnitustega kasvandustega.

I.2.2. ISA kahtlust saab välistada, kui vähemalt korra kuus kuuekuulise perioodi vältel tehtava kliinilise uuringu käigus ei ilmne ISA esinemise kohta selget tõestust.

I.3. ISA kinnitus

ISA esinemist peetakse kinnitatuks, kui punktide a, b või c all toodud kriteeriumid on täidetud:

a) vaadeldakse rahvusvahelise episootiaameti akvakultuuride haiguste diagnostika käsiraamatu kehtivale versioonile vastavaid ISAle omaseid kliinilisi tunnuseid ja lahkamistulemusi, sh surnud, nõrkasid või ebanormaalselt käituvaid kalu, aneemiatunnuseid, muid lahkamistulemusi ja patoloogilisi muutusi ning avastatakse ISA-viirus ühe või mitme järgneva meetodi abil:

i) ISA-viiruse isolatsioon või identifitseerimine III osas kirjeldatud viisil rakukultuuris vähemalt ühest proovist, mis on pärit mis tahes kasvanduses olevast kalast;

ii) ISA-viiruse avastamine RT-PCR meetodi abil, kasutades IV osas kirjeldatud meetodeid,

iii) ISA-viiruse avastamine kudedes ja koepreparaatides ISA-viirusele omaste antikehade abil (nt V osas kirjeldatud IFAT-meetod neeruproovide suhtes);

b) ISA-viiruse isolatsioon ja identifitseerimine kahest proovis, mis on võetud III osas kirjeldatud meetodi kohaselt erineval proovivõtukorral ühelt või mitmelt kasvanduses olevalt kalalt;

c) ISA-viiruse isolatsioon ja identifitseerimine vähemalt ühest proovis, mis on võetud III osas kirjeldatud meetodi kohaselt kasvanduse mistahes kalalt, kinnitades RT-PCR-meetodil (IV osa) või IFAT-meetodil (V osa) ISA-viiruse esinemist kasvanduse mistahes kalast pärit koepreparaatides.

I.4. Kontrolltsoonide ja ametliku järelevalve tsoonide loomise ja tühistamise kriteeriumid ISA kahtluse või kinnituse korral

I.4.1. Riskipõhise ametliku järelevalve programmi kehtestamiseks peavad liikmesriigid rajama asjaomased kontroll- ja järelevalvetsoonid selliste kasvanduste lähedusse, milles ametlikult kahtlustatakse või kinnitatakse ISA-viirust.

I.4.2. Loodavad tsoonid määratletakse iga üksikjuhtumi puhul taudi edasise leviku riskide põhjal. Episotoloogilistele olukordadele vastavalt kõnealune valgla või rannikuala:

- määratletakse kontrolltsoonina, või

- võib jagada kontrolltsoonideks ja järelevalvetsoonideks, kui valgla või rannikuala on lai ja kui ISA leviku takistamine ei ole ohustatud.

Lisaks sellele võib vajaduse korral luua täiendavaid järelevalvetsoone väljaspool valglat või rannikuala.

I.4.3. Eespool mainitud tsoonide loomisel võetakse arvesse peamiseid faktoreid, mis suurendavad taudi leviku riske tehistingimustes peetavatele ja looduslikele kaladele: kalade suremuste määr, osa ja jagunemine ISA-viiruse kahtlusega või kinnitusega kasvanduses; suremuse põhjused kõnealuses kasvanduses; kaugus lähimast kasvandusest ja nende kasvanduste tihedus; kasvandused, mis on kokkupuutes olnud; kasvanduses olevad liigid; nakatunud kasvandustes ja nende lähedal asuvates kasvandustes rakendatavad haldamistoimingud; hüdrodünaamilised tingimused ja muud epidemioloogilise tähtsusega faktorid, mida identifitseeritakse direktiivi 93/53/EMÜ artikli 5 lõike 2 ja artikli 8 kohaselt teostatud episootilise uuringu raames.

I.4.4. Tsoonide loomist käsitlevad järgmised miinimumnõuded.

I.4.4.1. Liikmesriigid peavad looma kontrolltsooni, mis asub ISA-viirusega nakatumise kinnitusega kasvanduse vahetus läheduses järgmiselt:

- rannikualadel: ühe loodete ulatuse või vähemalt 5 km läbimõõduga ringi sisse jääv ala, mille keskpunktiks on ISA-viirusega nakatunuks kinnitatud kasvandus või sellele vastav ala, mis on kindlaksmääratud asjaomase hüdrodünaamilise või epidemioloogilise teabe põhjal, või

- siseveealadel: kogu ISA-viirusega nakatunuks kinnitatud kasvanduse valgla; kui tegu on laia valglaga, võib liikmesriik piirata tsooni laienemist valgla osadesse, eeldusel, et ISA leviku takistamine ei ole ohus.

I.4.4.2. Ajutine kontrolltsoon luuakse ISA kahtluse korral kontrolltsooni kohta käivate kriteeriumite põhjal.

I.4.4.3. Liikmesriik loob vajaduse korral järelevalvetsooni sellistel väljaspool kontrolltsooni asuvatel aladel, kus piisab vähem intensiivsest järelevalvest ja mis vastab:

- rannikualadel: kontrolltsooni ümbritsevale alale, mis kattub loodete ulatustega, kontrolltsooni ümbritsevale alale, mis jääb kontrolltsooni keskelt mõõdetuna 10 km raadiusega ringi sisse või samaväärsele alale, mis on kindlaks määratud asjaomastele hüdrodünaamilistele ja epidemioloogilistele andmetele vastavalt, või

- siseveealadel: vajaduse korral väljapoole kontrolltsooni loodud alale.

I.5. Kehtestatud tsoonide kasutamata jätmine ja tühistamine

I.5.1. Liikmesriigi pädev asutus võib tagada, et kõikides kontrolltsooni kuuluvates kasvandustes kehtestatakse asjaomane periood kasvanduse kasutamata jätmiseks pärast seda, kui kasvandus on kaladest tühjendatud ja vajaduse korral desinfitseeritud. ISA-viirusega nakatunuks kinnitatud kasvandus jäetakse kasutamata vähemalt kuueks kuuks. Teiste kontrolltsoonis olevate kasvanduste kasutamata jätmise perioodi pikkuse määrab kindlaks pädev ametiasutus iga üksikjuhtumi riski hindamise põhjal. Kui kõik kontrolltsoonis olevad kasvandused on kaladest tühjendatud, hoitakse kasvandusi samaaegselt vähemalt kuus kuud kasutamata.

Lisaks sellele võib pädev ametiasutus otsustada kehtestatud järelevalvetsoonides asuvate kasvanduste kasutamajätmise.

I.5.2. Loodud kontrolltsoone ei või tühistada ega uuesti asustada seni, kuni kõik tsoonide lähedal asuvad kasvandused on kaladest tühjendatud, vajaduse korral desinfitseeritud ja jäetud kasutamata vastavalt I.5.1-le. Kui tsoonid tuuakse uusi kalu, muudetakse kontrolltsoonid järelevalvetsoonideks, nagu on sätestatud 1.4.4.3.

I.5.3. Ajutisi kontrolltsoone ei või tühistada enne, kui ISA kahtlust on välistatud I.2.2 osale vastavalt. ISA kinnitamiseks vastavalt I.3 osale muudetakse ajutine kontrolltsoon kontrolltsooniks.

I.5.4. Järelevalvetsoone ei või tühistada enne kahe aasta möödumist kontrolltsooni tühistamisest.

I.6. Ametlik järelevalve ISA kahtlustamiseks või kinnitamiseks

I.6.1. Kui kasvanduses kahtlustatakse või kinnitatakse lõhelaste nakkavat aneemiat, peavad pädevad asutused või nendega konsulteerivad või nende kontrolli all olevad tunnustatud kalatervise teenistused ellu viima riskipõhise ametliku järelevalve kava kõikides loodud tsoonides asuvates kasvandustes direktiivi 93/53/EMÜ artikli 5 lõike 2 ja artikli 6 kohaselt ISA levimuse ja arengu määramiseks.

I.6.2. Kõnealuse ametliku järelevalve kava kohandamise eesmärgil peab pädev asutus, vajaduse korral kohapealse kontrolli kaudu, identifitseerima kõik loodud tsoonides asuvad kasvandused ja ametlikult loendama kõiki kasvanduses peetavaid kalaliike, vanusegruppe ja kalade arvu, sh suremusnäitajaid.

I.6.3. Ajutises kontrolltsoonis asuvates kasvandustes peetav lõhe (Salmo salar) või mis tahes muu liik, millele on viidatud rahvusvahelise episootiaameti veeloomade tervishoiu eeskirja kõige hilisemas väljaandes ja mida kahtlustatakse või mis on võimalik ISA kandja, peab edastama pädevale asutusele suremusnäitajad iga 14 päeva järel esialgse ametliku loenduse järel. Suurenenud suremusest teavitatakse päeva ja sumba kohta. Pädev asutus uurib iga märkimisväärselt suurenenud suremust kasvanduses.

Kui kahtlust kinnitatakse, peavad kõik loodud kontrolltsoonis asuvad kasvandused edastama pädevale asutusele iga nädal suremusnäitajad sumba ja päeva kohta.

Järelevalvetsoonis asuvad kasvandused peavad edastama pädevale asutusele suremusnäitajad iga 14 päeva järel.

Loodud tsoonides teostatakse lisaks korrapäraseid kontrolle kogu aasta jooksul ja tabelis 1 kirjeldatud sagedusel. Kui selliseid kontrolle on mingil ajal aastas siiski võimatu teostada kliimatingimuste tõttu, võivad liikmesriigid sätestada muud kontrollisagedused situatsioonplaanis.

Tabel 1

Ametliku järelevalve programm

Kasvanduse asukoht | Kliiniliste kontrollide miinimumarv aastas | Kontrollide miinimumarv aastas pärast kontrolltsooni tühistamist |

Kontrolltsoon | 12 | |

Järelevalvetsoon | 6 | 6 |

Ajutine kontrolltsoon | 6 | |

Järelevalveprogrammi jätkatakse kuni tsoonide tühistamiseni.

I.6.4. Kontrollid ning ka proovide valik, kogumine, ettevalmistamine ja vedu vastavalt II.1–II.4 osades kirjeldatule. Proovide uuringud on kooskõlas III–VI osaga.

II. Kontroll ja proovide võtmine

II.1. Kontroll, proovide valimine ja kogumine ISA esinemiskahtlusega kasvanduses

II.1.1. I.6 osas kirjeldatud ametliku järelevalve kava raames tehtavatel regulaarsetel kontrollimistel ja ISA nakkuskahtlusega farmides kontrollitakse kõikides kasvanduse rajatistes (sumpades, basseinides või tiikides) surnud, nõrkade või ebaloomulikult käituvate kalade olemasolu. Võimaluse korral peab uurima rahvusvahelise episootiaameti akvakultuuride haiguste diagnostika käsiraamatu viimases väljaandes kirjeldatud ISA kliiniliste tunnuste või tapajärgsete leidude suhtes hiljuti surnud (mitte lagunenud) ja nõrku või ebaloomulikult käituvaid kalu.

II.1.2. Kui vaadeldakse värskeid kliinilisi tunnuseid, mis sobivad kokku ISAga, või kui inspektoril või veterinaararstil on mis tahes muu põhjus kaladel nakkuse kahtlustamiseks, uuritakse vähem kui 10 kala. Proov koostatakse võimaluse korral hiljuti surnud ja nõrkadest või ebaloomulikult käituvatest kaladest. Kui kliiniliselt haigeid kalu proovis on ebapiisav hulk, täiendatakse proovi tervete kaladega, kes on valitud sumpadest, basseinidest või tiikidest, kus suremuste arv on suurim või esineb kliiniliste haigustunnustega kalu.

II.1.3. Kui vaadeldakse hiljuti surnud või nõrku või ebaloomulikult käituvaid kalu, kuid kliinilised tunnused ja tapajärgsed leiud ei sobi kokku ISAga, pole proovivõtt kohustuslik, kuigi sellised proovid, mis on eristusdiagnoosi teostamiseks vajalikud, võidakse võtta inspektori või veterinaararsti äranägemisel.

II.1.4. Kui looduslikel kaladel kahtlustatakse ISA nakkust, peavad liikmesriigid tagama, et kaladelt võetakse asjaomased proovid ja neid uuritakse II–VI osas esitatud asjaomaste kliiniliste ja laboratoorsete meetodite abil ISA nakkuse esinemise välistamiseks või kinnitamiseks ja hindamaks, kas haiguse esinemine põhjustab tehistingimustes peetavale kalale märkimisväärset ohtu.

II.2. Kaladelt võetud proovide ettevalmistamine

II.2.1. Proovid histoloogiliseks uuringuks võetakse üksnes värskelt tapetud kaladelt, kellel on haigusele sobivad kliinilised tunnused või tapajärgsed leiud. Kõikidelt välistelt või sisemistelt kahjustustelt võetakse proovid ja maksast, neeru keskosast, südamest või põrnast võetud proovid eemaldatakse (skalpelli abil) üksikutelt kaladelt ja asetatakse 8–10 mahuprotsendilisse puhverdatud formooli keedusoolalahusesse. Kinnisti ja koematerjali suhe peab olema vähemalt 20: 1, et koed säiliksid rahuldavalt hästi.

II.2.2. Koed viroloogiliseks uuringuks võetakse kõikidelt uuritavatelt kaladelt. Kordusproovid võetakse tulemuste kinnitamise eesmärgil. Maksa, neeru esiosa, südame ja põrna tükid eemaldatakse kaladelt steriilse instrumendi abil ja asetatakse plasttorudesse, mis sisaldavad 9 ml transpordilahust, nt antibiootikumidega rakukultuurikeskkond. 12,5 μg/ml fungisooni, 200 IU/ml polümiksiin B ja 200 μg/ml kanamütsiini ühend on sobiv, kuid võib kasutada ka muid tõestatud tõhususega ühendeid. Ühte transpordilahust sisaldavasse torusse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koeproovid, mis moodustavad liitproovi. Kummaski proovis oleva koe kaal peab olema 1,0 ± 0,5 g.

II.2.3. IFAT-uuringuks kogutavad neeruproovid võetakse üksnes värskelt tapetud kaladelt, nt kahe tunni jooksul pärast surma. Neeru keskosa tükk eemaldatakse kalalt steriilse instrumendi abil. Üleliigse vere eemaldamiseks kuivatatakse kude imava paberi peal, mille järel kudet pressitakse korduvalt vastu polü-L-lüsiiniga kaetud objektiklaasi. Pideva ühtse rakukihi saamiseks külgnevad üksikud jäljendid üksteisega, kuid ei kattu. Veri ka koevedelik ei ole kõnealuseks testiks sobivad materjalid. Rakuproovi ei saa pikaks ajaks jätta imavale paberile kuivama, kuna see võib viia vere hüübimiseni ja suurte seerumvalkude hulkade sadenemisele objektiklaasile. Neeruproove kuivatatakse õhus, seejärel hoitakse jahedas ja kuivas, kuna nad ei kinnitu koheselt. Neeruproovid kinnituvad 72 tunni jooksul proovide võtmisest. Teise võimalusena võib neeruproovid külmutada õhus kuivatamise järel ja säilitada enne kinnitamist kuni üks kuu temperatuuril –20 °C.

II.2.4. Aneemia tunnustega kalu võidakse tuimastada ja võtta neilt kohe hepariniseeritud vereproovid hematoloogiliseks uuringuks, nt hematokriti mõõtmiseks.

II.2.5. Koed RT-PCR-meetodi analüüsiks võetakse kõikidelt uuritavatelt kaladelt. Neeru esi- ja keskosatükid eemaldatakse kaladelt steriilse instrumendi abil ja asetatakse mikrofuugtorusse, milles on 1 ml tõestatud efektiivsusega RNA säilituslahust. Ühte säilituslahust sisaldavasse torusse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koeproovid, mis moodustavad liitproovi. Kummaski proovis on koe kaal ligikaudu 0,5 g. Kui kalad on liiga väikesed vajaliku kaaluga proovi võtmiseks, võidakse võtta neeru, südame, põrna, maksa või umbsoole tükid (sellises eelistusjärjestuses), et saada kuni 0,5 g kaaluv proov.

II.3. Kaladelt võetud proovide vedu

II.3.1. Vereproovid ja kalakudesid sisaldavad torud viroloogiliseks uuringuks või RT-PCR-analüüsiks tuleks asetada isoleeritud mahutitesse (nt paksu seinaga polüstüreenkastidesse) piisava koguse jää või jahutusplokkidega, et tagada proovide jahutus laborisse transportimise ajal. Tuleks vältida proovide külmutamist ning transpordikastis on vastuvõtukohas veel jääd või üks või mitu jahutusblokki peavad olema endiselt osaliselt või täielikult jäätunud. Erijuhtudel võib RT-PCR proovid ja proovid viroloogiliseks uuringuks kiiresti külmutada ja transportida laborisse temperatuuril –20 °C või alla selle.

II.3.2. Objektiklaasid IFATi jaoks veetakse objektiklaasi hoidikutes ning neile lisatakse piisavalt kuivatusainet, et neeruproovid oleksid kuivad ja jahutatud, nagu eespool oli kirjeldatud.

II.3.3. Kui kala koed veetakse histoloogiliseks uuringuks kinnitusaines, veetakse neid lekkekindlates torudes löögikindlates mahutites, nt paksuseinalistes polüstüreenkastides.

II.3.4. Kuna proove ei külmutata, tuleks viroloogilise uuringuga alustada niipea kui võimalik, kuid mitte hiljem kui 72 tundi pärast proovide võtmist. Tulemuste kinnitamiseks võetavad proovid säilitatakse temperatuuril –20 °C või alla selle nende jõudmisel laborisse.

II.3.5. Laborisse võib saata terveid kalu, kui transpordi ajal on täidetud temperatuurinõuded, nagu on kirjeldatud II.3.1. Terve kala pakitakse imavasse paberisse ja veetakse plastikkotis jahutatuna.

II.3.6. Võib vedada ka eluskalu, aga üksnes ametliku teenistuse järelevalve all.

II.3.7. RNAlater’is säilitatud kudede RT-PCR-analüüsi jaoks peab esktraheerima RNA aja jooksul, mis on määratud proovide erinevatel temperatuuril säilitamiseks. Ajad olid järgmised:

—37 °C | 1 päev |

—25 °C | üks nädal |

—4 °C | üks kuu |

—20 °C | ei määrata |

II.3.8. Saadetised tuleb pakkida ja märgistada vastavate kehtivate riiklike ja rahvusvaheliste transpordialaste õigusnormide kohaselt.

II.4. Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Vastavalt kokkuleppele asjaomase diagnostikalaboriga võib täiendavateks uuringuteks koguda ja ette valmistada muid kalakudesid.

III. Viroloogiline uuring

III.1. Proovide ettevalmistamine

III.1.1. Kui tekivad praktilised raskused, mistõttu ei ole võimalik rakke nakatada 72 tunni jooksul pärast koeproovide kogumist, võib koe külmutada temperatuurini –80 °C kuni 28 päevaks. Kude tuleb enne uuringut külmutada ja üles sulatada ainult ühe korra.

III.1.2. Kumbagi proovi (liitproov transpordilahuses) homogeniseeritakse täielikult stomahheri, segisti, uhmri või uhmrinuia abil, tsentrifuugitakse kiirusel 2000–4000 × g 15 minutit temperatuuril 0–6 °C, supernatant filtreeritakse (0,45 μm) ja inkubeeritakse sama koguse sobivalt lahjendatud IPN-viiruse algupäraste serotüüpide antiseerumite liitprooviga. Antiseerumi tiiter 50 % plaagi neutralisatsiooni testis peab olema vähemalt 1/2000. Segu tuleb inkubeerida üks tund 15 °C juures. Sel moel saadakse inokulaat.

Kõikide inokulaatide IPN-viiruse antiseerumiga töötlemise eesmärk on vältida IPN-viirusest tuleneva tsütopaatilise efekti arengut nakatatud rakukultuuris (IPN-viirust esineb mõnes Euroopa osas 50 % kalaproovides). See vähendab viroloogiliste uuringute kestust ja nende juhtude arvu, mille puhul tsütopaatilise efekti ilmnemist saab pidada ISA-viiruse võimalikuks tundemärgiks.

Kui proovid on pärit tootmisüksustest, mis on IPNist vabad, võib inokulaatide töötlemise IPN-viiruse antiseerumiga ära jätta.

III.2. Rakukultuuride nakatamine

III.2.1. SHK-1-rakke (passaaž 80 või väiksem) või TO-rakke kasvatatakse 12- või 24augulisel söötmeplaadil L-15-söötmel, mis sisaldab 5 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli. Muid tõestatud efektiivsuse ja tundlikkusega rakuliine võib kasutada ISA-viiruse isoleerimisel, võttes arvesse tüvede vaheldust ja erinevate tüvede võimet paljuneda erinevates rakuliinides. Antiseerumiga töödeldud elundite suspensiooniga nakatatakse noored aktiivses kasvueas rakukultuurid selleks, et lõplik koematerjali lahjendus kasvukeskkonnas oleks 1: 1000. Kummalegi elundite suspensioonile lisatakse 40 μl inokulaati ühte auku, mis sisaldab 2 ml kasvukeskkonda. Ristsaastumise riski vähendamiseks on soovitatav, et kasutatakse erinevaid 12- või 24augulisi plaate erinevatest kasvanduskohtadest pärit kalade proovide puhul.

III.2.2. Üks negatiivset kontrollseerumit sisaldav plaat jäetakse nakatamata. Positiivset kontrollseerumit sisaldav teine plaat nakatatakse ISA-viiruse võrdlusisolaadiga järgmiselt. Sada μl ISA-viiruse põhilahusega (miinimumtiiter 107 TCID50 ml–1) nakatatakse esimene auk ja segatakse hoolega. Kõnealuse aine maht asetatakse esimesest august teise auku, et saada 1: 10 lahjendus, ja segatakse hoolega. Seda korratakse kogu plaadi ulatuses, et saada kuus 10kordset lahjendust. ISA-viiruse varu säilitatakse –80 °C juures vähemalt kaks aastat, kuid pärast ülessulatamist tuleb kasutada kolme päeva jooksul. Märkus: tuleb pöörata tähelepanu katsealuste positiivsete kontrollseerumitega ristsaastumise vältimiseks. Selle riski vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollseerumid ja käsitletakse neid katsealustest eraldi.

III.2.3. Proove inkubeeritakse 14 ± 2 °C juures kuni 15 päeva.

III.3. Mikroskoopia

Mikroskoobi abil uuritakse rakukultuure kaks korda tsütopaatilise efekti suhtes, viienda kuni seitsmenda ja 12 kuni 14 päeva vahel peale nakatamist. Kui mis tahes liitproovis esineb tsütopaatiline efekt, algatatakse koheselt viiruse identifitseerimise menetlus (III.6). Kui tsütopaatilist efekti pole 14 päeva jooksul täheldatud, tehakse hemadsorptsioontest (III.4).

III.4. Hemadsorptsioon

ISA-viiruse replikatsioon rakukultuurides ei vii alati tsütopaatilise efektini. Seetõttu igale augule tehakse eespool kirjeldatud hemadsorptsioontest või teise võimalusena tehakse igale augule III.6.1 kirjeldatud IF-test.

III.4.1. Igast august, mis sisaldavad positiivseid ja negatiivseid kontrollseerumeid, eemaldatakse rakukultuuri kasvukeskkond ja asetatakse märgistatud steriilsetesse katseklaasidesse. Igasse auku lisatakse viissada μl 0,2 mahuprotsenti küüliku või hobuse pestud erutrotsüüte sisaldavat suspensiooni või 0,05 mahuprotsenti teraspea-lõhe või lõhe pestud erütrotsüüte sisaldavat suspensiooni ja inkubeeritakse toatemperatuuril 45 minutit. Erütrotsüüdid eemaldatakse ja igat auku pestakse kaks korda L-15-söötmega. Igat auku uuritakse mikroskoobi all.

III.4.2. Kui SHK-1- või TO-rakkude pinnale kinnitunud erütrotsüütide kogumid, peetakse seda eeldatavasti ortomüksoviiruse nakkuseks. Kui hemadsorptsioontest on positiivne, tehakse koheselt viiruse identifitseerimise test (III.6).

III.5. Subkultuuride valmistamine või passaaž

III.5.1. Subkultuure valmistatakse 13–15. päeval. Värskeid aktiivses kasvueas olevaid SHK-1-rakke sisaldavatesse aukudesse 12augulisel plaadil lisatakse kakssada ja kakskümmend viis μl rakukultuuri supernatanti ja inkubeeritakse temperatuuril 14 ± 2 °C kuni 18 päeva. Mikroskoobi abil uuritakse rakukultuure kaks korda tsütopaatilise efekti suhtes, viienda kuni seitsmenda ja 14 kuni 18 päeva vahel peale nakatamist. Kui mis tahes liitproovis esineb tsütopaatiline efekt, algatatakse koheselt viiruse identifitseerimise menetlus (III.6). Kui tsütopaatilist efekti pole 14–18 päeva jooksul täheldatud, tehakse hemadsorptsioontest (III.4).

III.5.2. Kui tsütotoksilisus ilmneb inkubeerimise esimese seitsme päeva jooksul, võib valmistada subkultuurid sellel etapil, kuid rakke tuleb sel juhul inkubeerida 14–18 päeva ning valmistada uued subkultuurid ja inkubeerida veel 14–18 päeva. Kui tsütotoksilisus ilmneb pärast 7 päeva, valmistatakse subkultuurid ühel korral ja rakke inkubeeritakse seni, kuni esimesest nakatamisest on möödas kokku 28–36 päeva.

III.5.3. Kui algkultuuris ilmneb bakteriaalne saastatus, alustatakse testi uuesti, kasutades –80 °C juures säilitatud koehomogenaati. Enne nakatamist tsentrifuugitakse koehomogenaati 4000 × g 30 minutit temperatuuril 0–6 °C ja supernatanti filtreeritakse 0,22 μm filtri abil. Kui bakteriaalne saastatus ilmneb subkultuuride valmistamise ajal, filtreeritakse supernatanti 0,22 μm filtri abil, nakatatakse värskeid rakke ja inkubeeritakse veel 14–18 päeva.

III.6. Viiruse identifitseerimise testid

Kui täheldatakse tsütopaatilist efekti või kui hemadsorptsioontest on positiivne, tehakse viiruse idenfitseerimine. ISA-viiruse identifiseerimise esmased meetodid on IF (III.6.1) ja RT-PCR (IV osa). Kui proovis kahtlustatakse muid viirus, on soovitatav teha täiendavaid viiruse identifitseerimise teste. Kui ühe nädala jooksul ei ole testidega suudetud viirust kindlalt identifitseerida, tuleb viirus üle viia riiklikku kalahaiguste tugilaborisse või ühenduse kalahaiguste tugilaborisse koheseks identifitseerimiseks.

III.6.1. Immunofluorestsents (IF)

III.6.1.1. SHK-1-rakke (passaaž 80 või väiksem) või TO-rakke kasvatatakse 96- või 24augulisel söötmeplaadil L-15-söötmel, mis sisaldab 5 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli ja kasutatakse kui rakud katavad vähemalt 50 % kasvukeskkonnast. Võib kasutada muid tõestatud efektiivsusega rakuliine või kasvukeskkondasid. Kahte auku lisatakse 225 μl oletatavat viirust sisaldavat supernatanti, segatakse ja 225 μl asetatakse järgmisesse kahte auku (nt lahjendus 1: 5). Kaks täiendavat auku jäetakse nakatamata ja neid kasutatakse kontrollidena. Erinevate kalakasvanduste proove ja viiruse kontrollproove käsitletakse erinevatel plaatidel. Viiruskontrolliks kasutatakse ISA-viiruse võrdlusisolaati.

III.6.1.2. Plaate inkubeeritakse 14 ± 2 °C juures ja uuritakse mikroskoobi all kuni 7 päeva. Kui täheldatakse varajast tsütopaatilist efekti või kui tsütopaatilist efekti ei täheldata seitsme päeva jooksul, proovid kinnitatakse. Augud pestakse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega (PBS) ja kinnitatakse 80 % atsetooniga inkubeerimise teel toatemperatuuril 20 minutit. Plaadid kuivatatakse õhu käes ja värvitakse koheselt või säilitatakse 0–6 °C juures enne värvimist kuni 24 tundi.

III.6.1.3. Paralleelsed augud värvitakse ISA-viiruse monoklonaalse antikehaga 3H6F8 või muu tõestatud efektiivsuse ja spetsiifilisusega monoklonaalse antikehaga, mida lahjendatakse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega ja inkubeeritakse 37 ± 4 °C juures 30 minutit. Monoklonaalne antikeha eemaldatakse ja plaate pestakse kolm korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega, millele on lisatud 0,05 % Tween 20t. Igasse auku lisatakse fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega lahjendatud hiirevastast IgG-FITC-konjugaati ja inkubeeritakse 37 ± 4 °C juures 30 minutit. Märkus: monoklonaalse antikeha ja FITC-konjugaadi erinevate partiide lahjendusi tuleb igas laboris optimeerida. Antikeha eemaldatakse ja plaate pestakse kolm korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahusega, millele on lisatud 0,05 % Tween 20t.

III.6.1.4. Auke kontrollitakse kohe pööratud fluorestsentsmikroskoobi all, mis on varustatud FITC-ergastuseks sobiva filtriga. Testi tulemust peetakse positiivseks, kui täheldatakse fluorestseerivaid rakke. Selleks, et test oleks kehtiv, peavad positiivsed kontrollid olema positiivsed ja negatiivsed kontrollid peavad olema negatiivsed.

IV. Proovide uurimine RT-PCR abil

IV.1. Selles osas kirjeldatakse menetlusi, mida kasutatakse kalakudedest või ISA-viirusega kultuuridest tehtava ISA-viiruse genoomi segmendi 8 osa PCR-paljunduseks.

IV.1.1. RNA eraldamine

a) Igast proovist eemaldatakse RNAlater. Igasse katseklaasi lisatakse 1 ml DEPC-töödeldud dH2Od ja katseklaase tsentrifuugitakse kiirusel 13000 p/min 5 minutit 0–6 °C juures.

b) Igast proovist eemaldatakse supernatant ja 800 μl TRIzol-i (Invitrogen) voi muud sama tõhusat või tõhusamat reaktiivi lisatakse igasse proovi ja kontrolltorusse, mis sisaldab sobivat kontrollmaterjali (400 μl dH2O või neeruhomogenaati, mis on pärit haigusetekitajast vabaks tunnistatud kalast). Vajaduse korral hajutatakse koed korduvalt pipetiga tilgutades. Katseklaase inkubeeritakse toatemperatuuril 5 minutit. Igasse katseklaasi lisatakse 160 μl kloroformi ja katseklaase loksutatakse energiliselt 3 minutit, siis tsentrifuugitakse kiirusel 13000 p/min 15 minutit 0–6 °C juures.

c) Ülemine vesikiht asetatakse sildiga varustatud 1,5 ml mikrofuugtorusse, mis sisaldab 500 μl isopropanooli ja torusid inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril, siis tsentrifuugitakse kiirusel 6500 p/min 15 minutit 0–6 °C juures.

d) Supernatant eemaldatakse ja lisatakse 1 ml 75 %list etanooli RNA-graanulisse. Seejärel torusid tsentrifuugitakse kiirusel 6500 p/min viie minuti jooksul temperatuuril 0–6 °C.

e) Supernatant eemaldatakse ja katseklaasid jäetakse avatuks ligikaudu kolmeks minutiks, et allesjäänud etanool saaks aurustuda. Graanuli uuesti suspendeerimiseks lisatakse 15 μl DEPC-töödeldud dH2O-d ja vajaduse korral segatakse lühikest aega.

f) RNA kontsentratsiooni ja proovide puhtuse arvutamiseks kasutatakse spektrofotomeetrit. Optilised tihedused mõõdetakse lainepikkusel 260 ja 280 nm.

g) RNAd, mida ei kasutata koheselt (samal päeval), saab ajutiselt säilitada temperatuuril 0–6 °C. Hiljem kasutatavat RNAd säilitatakse temperatuuril –80 °C.

IV.1.2. RT

a) 2 μg RNAd lahjendatakse DEPC-töödeldud dH2Oga 1,5 ml mikrofuugtorudes. Kui proovi RNA-kontsentratsioon on nii väike, et 2 μg-ga ei saada RT-reaktsiooni, siis kasutatakse suurimat võimalikku RNA määra. Lahjendatud RNAd inkubeeritakse 55–60 °C juures 10 minutit.

b) Torud, mis sisaldavad RNAd, asetatakse jää sisse ja lisatakse RT-reaktiivid, mille lõplikuks kontsentratsiooniks on 1 × puhver, 1 mM desoksünukleotiidtrifosfaati (dNTP), 100 ng juhuslikku heksameeri, 20 U Rnaasi inhibiitorit ja 200 U MMLV-RT 20 μl kogumahus.

c) Torusid inkubeeritakse temperatuuril 37 °C üks tund.

d) cDNA säilitatakse temperatuuril 0–6 °C, kuni vaja, ja kasutatakse PCR-meetodil võimalikult kiiresti.

IV.1.3. PCR

a) Lisatakse 45 μl PCR-segule 5 μl cDNA-d, et lõplikuks kontsentratsiooniks oleks 1 × puhver, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM iga dNTP-d, 25 pmol iga praimerit ja 1 U Taq-polümeraasi. Praimerid on ISA+ (5’-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3’) (päripidine praimer) ja ISA– (5’-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3’) (äraspidine praimer). Ekstraheerimis-, RT- ja PCR-etappidel on negatiivsed kontrollid.

b) Katseklaasid asetatakse termotsüklerisse, mis on seadistatud 94 °C-le viieks minutiks, seejärel 35 tsükli ajaks 94 °C-le üheks minutiks, 55 °C-le üheks minutiks ja 72 °C-le üheks minutiks ja lõplikuks inkubeerimiseks 72 °C-le viieks minutiks.

c) PCRi tulemusi hinnatakse etiidiumbromiidiga värvitud 2 % agaroosgeeli elektroforeesi järel ja proovide kõrvale pipeteeritakse külgmarkerid ja RT- ja PCR-etappide negatiivsed kontrollid. Kui saaduseks on üks 155 bp PCR-saadus, peetakse seda ISA-viiruse RNA esinemise viiteks. Proovid, mis sisaldavad samuti üht 310 bp täiendavat saadust, sisaldavad ka ISA-viiruse RNAd. Proovid, millelt saadakse mitmeid PCR-saaduseid, sh vähemalt üht ligikaudu 155 bp saadust, võivad sisaldada ISA-viiruse RNAd. Neile saab hiljem teha lisauuringuid DNA-proovide või nukleotiidjärjestuse abil.

IV.1.4. PCR kinnitus ISA-viiruse isolatsiooni kohta koekultuuris

Kui koeproovide viroloogilises uuringus täheldatakse täielikku tsütopaatilist efekti SHK-1-rakus, august eemaldatakse 400 μl supernatanti ja asetatakse steriilsesse 1,5 ml katseklaasi. RNA ekstraheeritakse kõnealustest proovidest III.1 osas kirjeldatud viisil ja tehakse RT-PCR Kui kasutatakse kultuure, millel puudub täielik tsütopaatiline efekt, eemaldatakse supernatant, rakud kaabitakse augu või katseklaasi seintelt ja asetatakse steriilsesse 1,5 ml katseklaasi RNA ekstraheerimiseks ja RT-PCR-meetodi jaoks.

IV.1.5. PCR-saaduste kinnitamine DNA-proovi abil

a) 155 bp sisaldava PCR-saaduse spetsiifilisust saab hinnata kasutades proove oligonukleotiidist, mis hübridiseerub praimerite vahelise PCR-saaduse piirkonnaga. PCR-saadustele tehakse elektroforees 1 % agaroosgeelis külgmarkerite, positiivse kontrolli ning RT- ja PCR-etappide negatiivsete kontrollide kõrval.

b) DNA määritakse membraanile Southern blot-menetluse abil ja märgistatud oligonukleotiidi (5’-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3’) inkubeeritakse membraaniga asjaomaste prehübridisatsiooni etappide järel.

c) Sidumata või mittespetsiifiliselt seotud proovid pestakse membraanilt ja seotud proovid visualiseeritakse.

d) 155 bp fragmendiga (ja 310 bp fragmendiga, kui see on olemas) seotud proovid on tõestuseks PCRi spetsiifilisusele ja näitavad, et ISA-viiruse RNA on proovis olemas.

IV.1.6. PCR saaduste nukleotiidjärjestus

PCRi spetsiifilisust saab hinnata 155 bp PCR-saaduse nukleotiijärjestust uurides.

a) PCR-saadus puhastatakse agaroosgeelist või lahusest.

b) Fragment järjestatakse kasutades samu praimereid, mida kasutati PCR-meetodil, või vektorpraimereid, kui fragment kloonitakse vektori külge enne järjestamist.

c) Nukleotiidjärjestust võrreldakse ISA-viirussegmendi 8 nukleotiidjärjestusega, mis on kättesaadavad EMBL nukleotiidjärjestuse andmebaasis (registreerimisnumbrid Y10404, AJ012285, AJ242016).

d) ISA-viirussegmendi 8 järjestusele vastava järjestuse olemasolu tõestab, et proov sisaldab ISA-viiruse RNA-d.

V. Neeruproovide kontroll IFAT-meetodi abil

V.1. IFAT-meetodil tehtavale neeruproovide uuringule koostatakse järgmine protokoll.

V.2. Neeruproovide ettevalmistamine ja värvimine

V.2.1. Objektiklaasid kinnitatakse atsetoonis või metanooli ja atsetooni segus (1: 1) kolm minutit ja kuivatatakse õhus. Enne värvimist uuritakse iga objektiklaasi ja piiratakse asjaomased objektiklaasi alad ImmEdgeTM pliiatsiga (või sarnasega) ja lastakse õhu käes kuivada. Seejärel asetatakse objektiklaasid blokeerivasse lahusesse (6 %line lõss fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, mis sisaldab 0,2 % Tween 20) ja inkubeeritakse õrnalt, segades 30 minutit toatemperatuuril. Objektiklaasid nõrutatakse ja asetatakse horisontaalselt objektiklaasikarpi, mis sisaldab märga paberrätikut niiske atmosfääri säilitamiseks.

V.2.2. Kõik proovid kaetakse ISA-viiruse monoklonaalse antikeha 3H6F8 (või muu tõestatud spetsiifilisuse ja efektiivsusega antikeha) lahusega ja objektiklaasikarp suletakse ja inkubeeritakse segades 60 minutit toatemperatuuril. Tavaliselt lahjendatakse antikeha 1: 10 kuni 1: 100 1 %lises lõssis, aga tegelik lahjendus tuleb määrata iga partii kohta. Objektiklaase pestakse kolm korda kahe minuti jooksul fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, mis sisaldab 0,1 %list Tween 20. Iga proov kaetakse lahusega, mis sisaldab kitse hiirevastast FITC-konjugaati, mida lahjendatakse suhtes 1: 1000 1 %lises lõssis ja inkubeeritakse niiskes keskkonnas 60 minutit toatemperatuuril. Objektiklaase pestakse kolm korda kahe minuti jooksul fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, mis sisaldab 0,1 %list Tween 20. Iga objektiklaas kaetakse CITIFLUORTM lahusega (500 μl CITIFLUORTM segatakse 1,5 ml 0,1 mahuprotsendilise Tween 20ga fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses) või muu asjaomase peitsimisvahendiga 10 minutiks. Objektiklaase pestakse kolm korda fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, mis sisaldab 0,1 %list Tween 20. Kui on vaja vastuvärvimist, võib katta iga proovi propiidiumjodiidiga (0,01 mg/ml) fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, mis sisaldab 0,1 %list Tween 20, ja inkubeeritakse kolm minutit toatemperatuuril. Objektiklaase pestakse kolm korda kahe minuti jooksul fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses, mis sisaldab 0,1 %list Tween 20. Objektiklaasid nõrutatakse ja peitsitakse CITIFLUORTM-ga või muu asjaomase peitsimisvahendiga. Objektiklaase hoitakse pimedas temperatuuril 4 °C enne mikroskoopilist uuringut.

V.3. Fluorestsentsmikroskoopiauuring

Iga objektiklaasi uuritakse epifluorestsentsmikroskoobi all, kasutades fluorestseiinisotiotsüanaadile sobivat filtrit, mis annab iseloomuliku rohelise fluorestsentsi. Kõik ImmEdgeTM pliiatsiga määratletud alasid uuritakse 10- ja 20kordse objektiiviga ning kahtlased alad (mis annavad rohelise fluorestsentsi) uuritakse põhjalikumalt 40kordse objektiiviga ja faasikontrasti/fluorestseeruva valgustusega tagamaks, et fluorestseeruv värvimine on rakkudega seotud. Kahtlaste alade kohakoordinaadid märgitakse üles, et fluorestsentsi olemust võiks hiljem kinnitada teise uurija poolt. Esimese lugeja teostatud uuringu järel positiivseid või kahtlaseid objektiklaase uuritakse teise lugeja poolt uuesti ja kinnitatakse tulemused.

V.4. Kontrollid

V.4.1. Igas IFAT-meetodi tarbeks värvitud objektiklaaside partii suhtes peab tegema järgmised kontrollid:

- nakatumata lõhe neeruproov (negatiivne kontroll),

- nakatumata SHK-1-rakukultuur või muud vastuvõtlikud rakukultuurid (negatiivne kontroll),

- ISA-viirusega nakatunud SHK-1-rakukultuur või muu vastuvõtlik rakukultuur (positiivne kontroll).

V.4.2. Vajaduse korral soovitatakse kasutada ISA-viirusega nakatunud lõhe neeruproovi teise positiivse kontrollina.

V.4.3. Kui positiivne tulemus saadakse negatiivsete kontrollide abil, siis on test kehtetu kõikide kõnealuse partii objektiklaaside osas. Kui kõik partii objektiklaasid, sh positiivsed kontrollid, on negatiivsed, on test kehtetu kõikide kõnealuse partii objektiklaaside osas. Kui kontrollide ebaõnnestumine muudab objektiklaaside partii kehtetuks, objektiklaasid hävitatakse ja test tehakse uuesti kasutades kordusproove.

V.5. Muude kudede uurimine

Kõnealust tehnikat saab kohaldada muude kalakudede puhul, näiteks maksa, põrna ja südame puhul, tagades, et endoteelirakkude, leukotsüütide või lümfotsüütide piisav kogust saab ladustada objektiklaasil. Värvimismenetlus on iga koe puhul sama, kuigi mõnede kudede puhul on soovitatav ära jätta propiidiumjodiidiga värvimine ja kasutada proovides rakutüüpide kindlaksmääramiseks faasikontrasti valgustust.

VI. HISTOLOOGILISED MEETODID

Parafiinilõigud lõigatakse 5 μm paksused ning värvitakse hematoksüliini ja eosiini abil. ISAga seotud histoloogilisi muutusi kirjeldatakse OIE akvakultuuride haiguste diagnostikakäsiraamatu kehtivas väljaandes.

VII. Akronüümid ja lühendid

cDNA | komplementaarne desoksüribonukleiinhape |

CPE | tsütopaatiline efekt |

DEPC | dietüülpürokarbonaat |

dNTP | desoksünukleotiidtrifosfaat |

FITC | fluorestseiinisotiotsüanaat |

IF | immunofluorestsents |

IFAT | immunofluorestsentskatse viiruse antikehade määramiseks |

OIE | Rahvusvaheline episootiaamet |

IPN(V) | nakkuslik pankreasenekroos (viirus) |

ISA(V) | lõhelaste nakkav kehvveresus (viirus) |

PBS | fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus |

RNA | ribonukleiinhape |

RT-PCR | reverstranskriptaas-polümeraasi ahelreaktsioon |

SHK-1 | lõhe neeru esiosa rakud |

TCID50 | koekultuuri nakatav annus 50 % lõpp-punktis |

--------------------------------------------------