Komisjoni direktiiv, 18. november 1987, millega üheksandat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta



Euroopa Liidu Teataja L 133 , 30/05/1988 Lk 0001 - 0127

Soomekeelne eriväljaanne: Peatükk 15 Köide 14 Lk 0003

Rootsikeelne eriväljaanne: Peatükk 15 Köide 14 Lk 0003

CS.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

ET.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

HU.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

LT.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

LV.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

MT.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

PL.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

SK.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216

SL.ES Peatükk 13 Köide 009 Lk 90 - 216



Komisjoni direktiiv, 18. november 1987, millega üheksandat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (88/302/EMÜ) EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta, [1] viimati muudetud kuuendat korda direktiiviga 79/831/EMÜ, [2] eriti selle artiklit 19, ning arvestades, et: direktiivi 67/548/EMÜ artikli 3 lõikes 1 sätestatakse, et ainete ja valmististe füüsikalis-keemilised omadused, mürgisus ja keskkonnamürgisus määratakse vastavalt V lisas määratletud meetoditele; direktiivi 67/548/EMÜ artikli 3 lõikes 2 sätestatakse, et aine või valmistise reaalset või potentsiaalset keskkonnaohtu hinnatakse vastavalt VII ja VIII lisas esitatud tunnustele; komisjoni direktiiviga 84/449/EMÜ [3] kehtestatud versiooni V lisa sisaldab praegu ainult neid katsetamismeetodeid, mis vastavad VII lisas määratletud tunnustele ja on vaja muuta kättesaadavaks katsetamismeetodid, mis vastavad VIII lisas määratletud tunnustele; arvestades, et käesoleva direktiivi sätted on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe kaubanduses tehniliste tõkete kõrvaldamist käsitlevate direktiivide tehnika arengule kohandamise komitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI: Artikkel 1 Käesoleva direktiivi lisa tekst lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ V lisale. Artikkel 2 Liikmesriigid võtavad enne 31. detsembrit 1988 vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud sätted ning teatavad sellest viivitamata komisjonile. Liikmesriigid kohaldavad neid sätteid hiljemalt alates 30. juunist 1989. Artikkel 3 Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele. Brüssel, 18. november 1987 Komisjoni nimel komisjoni liige Stanley clinton davis [1] EÜT L 251, 19.9.1984, lk 1. [2] EÜT 196, 16.8.1967, lk 1/67. [3] EÜT L 259, 15.10.1979, lk 10. -------------------------------------------------- LISA Järgnevas tekstis kirjeldatud uuringumeetodid on mõeldud osade nõukogu direktiivi 79/831/EEC VIII lisas toodud toksikoloogiliste ja ökotoksikoloogiliste omaduste kindlaks tegemiseks. Käsitletud on VIII lisa 1. ja 2. tasemele vastavaid uuringumeetodid, kuid teste pole jaotatud erinevate tasemete funktsioonina. SISUKORD | Lk | B OSA: Toksilisuse kindlaksmääramise meetodid … | 93 | Üldine sissejuhatus: B osa … | 93 | Subkroonilise toksilisuse test suukaudsel manustamisel: 90päevane korduvannuste suukaudse manustamise uuring näriliste liikidel … | 97 | Subkroonilise toksilisuse test suukaudsel manustamisel: 90päevane korduvannuste suukaudse manustamise uuring mittenäriliste liikidel… | 101 | Subkroonilise toksilisuse test nahakaudsel manustamisel: 90päevane korduvannuste nahakaudse manustamise uuring näriliste liikidel… | 105 | Subkroonilise toksilisuse test inhaleerimisel: 90päevane korduvannuste inhalatsiooniuuring näriliste liikidel… | 109 | Teratogeensuse uuring närilistel ja mittenärilistel… | 113 | Kroonilise toksilisuse uuring… | 116 | Kartsinogeensuse uuring… | 121 | Kombineeritud kroonilise toksilisuse/kartsinogeensuse uuring… | 126 | Ühe põlvkonna reproduktsioonitoksilisuse uuring… | 132 | Kahe põlvkonna reproduktsioonitoksilisuse uuring… | 136 | Toksikokineetika… | 140 | Mutageensuseja kartsinogeensuse uuring:… | 144 | —Geenmutatsioon – Saccharomyces cerevisiae… | 144 | —Mitootiline rekombinatsioon – Saccharomyces cerevisiae… | 147 | —In vitro geenmutatsiooni uurimine imetajarakul… | 150 | —DNA kahjustamine ja parandamine – plaaniväline DNA süntees – imetajate rakkudel in vitro… | 153 | —Õdekromatiidi vahetuse in vitro analüüs… | 157 | —Suguliitelise retsessiivse letaalsuse test äädikakärbsel Drosophila melanogaster… | 160 | —Imetajaraku transformatsioonitestid in vitro… | 162 | —Näriliste dominantse letaalsuse test… | 165 | —In vivo imetajate idurakkude tsütogeneetika… | 168 | —Hiire laikude test… | 171 | —Hiire pärilik translokatsioon… | 174 | C OSA: Ökotoksilisuse määramise meetodid… | 177 | Üldsissejuhatus: C osa… | 177 | Vetikate inhibeerimise test… | 178 | Toksilisus vihmaussidele: Tehismulla test… | 184 | Biodegradatsioon: Zahn-Wellensi test… | 188 | Biodegradatsioon: Aktiivmuda simulatsioonitestid… | 195 | Biodegradatsioon: Aktiivmuda repiratsiooni pärssimise test… | 207 | Biodegradatsioon: Modifitseeritud SCAS test… | 212 | B OSA: TOKSILISUSE KINDLAKSMÄÄRAMISE MEETODID ÜLDINE SISSEJUHATUS: B OSA PIKAAJALISED UURINGUD Subkroonilised, kroonilised ja kartsinogeensuse uuringud Uuritava aine ja töötlemislahuse omadused Enne kõikide toksilisuse uuringute läbiviimist peab olema teada uuritava aine koostis, sealhulgas põhilised lisaained ja füüsikalis-keemilised omadused (sh stabiilsus). Uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused annavad olulist teavet manustamistee, subkrooniliste, krooniliste ja kartsinogeensuse uuringute ülesehituse ning uuritava aine käsitsemise ja säilitamise kohta. Informatsioon keemilise struktuuri ja füüsikalis-keemiliste omaduste kohta võib samuti anda viiteid imendumise kohta plaanitava manustamistee kasutamisel ning lisada andmeid biotransformatsiooni ning kudedesse jaotumise kohta. Informatsiooni toksikokineetiliste näitajate kohta võib saada varem teostatud toksilisuse uuringutest ja toksikokineetilistest uuringutest. Enne uuringu alustamist peaks olema kindlaks tehtud sobiv analüüsimeetod uuritava aine (ja võimaluse korral põhiliste lisaainete) kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks määramiseks annustamiskeskkonnas ja bioloogilises materjalis. Katseloomad: loomaliikide ja -liinide valik Kuna loomi tuleb ravida praktiliselt kogu nende eluea vältel, peab uuringutesse kaasatud loomade pidamine olema lihtne ning nende eluiga suhteliselt lühike. Äärmiselt soovitatav on teada iseeneslikult tekkinud haiguste ja kasvajate esinemise sagedust kasutatavate loomaliinide seas, kui nende pidamistingimused on sarnased. Loomaliinide omadused peaksid olema hästi kirjeldatavad ja neil ei tohiks esineda kaasasündinud väärarenguid. Sisearetusliinide F1 hübriidide kasutamisel on selles mõttes teatud eelised. Kui aga välisaretusliinide (kinnistest liinidest pärit loomad) kohta peaks olema taustaandmeid piisavalt, on ka need aktsepteeritavad. Loomade hooldamine, toitmine ja jootmine Loomkatseid ja -uuringuid tuleb läbi viia kohalike regulatsioonidega kooskõlas, arvestades humaanseid põhimõtteid ja rahvusvahelisi arenguid loomakaitse alal. Järeldusi teha võimaldavate tulemuste puhul on kohustuslik range keskkonnatingimuste ja õige loomapidamisviisi kontroll. Mõjutegurid, nagu pidamistingimused, kaasuvad haigused, medikamentoosne ravi, lisaained toidus, õhus, vees ja magamisasemel ning loomapidamisvahendid üldiselt võivad märkimisväärselt mõjutada korduvannustega teostatud uuringute tulemusi. Üldiselt peaks kasutatavate keemiliste steriliseerimisvahendite mõju uuringule olema eelnevalt teada. Toit peab täielikult vastama uuritava liigi toitainelistele vajadustele ega tohi sisaldada lisaaineid, mis võiksid uuringu tulemusi mõjutada. Närilisi tuleb söögi ja joogiga varustada nõudlusest lähtuvalt, uuendades toitu vähemalt üks kord nädalas. Hetkel on kasutusel kolme tüüpi loomatoite: tavaline, sünteetiline ja erinevad teada koostisega loomatoidud. Valitud dieedist olenemata peavad varustajad kindlate ajavahemike järel kontrollima põhidieedi toiteväärtust ja saasteainete sisaldust ning edastama saadud informatsiooni laborile koos iga toidupartiiga. Äärmiselt soovitatav on, et toidurežiimi mõju ainevahetusele ning samuti kasvaja tekkesse ning looma eluea pikkusele oleks teada. Lisaks võib teostada põhitoidu kontrollanalüüse, uurides laboratoorselt nii toidu koostisosasid kui ka võimalike saasteainete (näiteks kartsinogeenid) sisaldust. Kui see on tehtud, tuleks analüüside tulemused registreerida ja lisada iga uuritava aine lõpp-protokolli. Teadaolevalt kartsinogeneesi mõjutavaid toidu koostisosade (näiteks antioksüdandid, küllastumata rasvhapped, seleen) sisaldus ei tohiks olla mõju avaldavas kontsentratsioonis. Kuna mitmed levinud saasteained avaldavad mõju kartsinogeensuse uuringutele, tuleb erilist tähelepanu pöörata pestitsiidijääkide, kloori orgaaniliste ühendite, polütsükliliste aromaatsete süsivesinike, östrogeenide, raskemetallide, nitroosamiinide ja mükotoksiinide sisaldusele toidus. Kui uuritavat ainet manustatakse vee või toiduga, tuleb eelnevalt teostada stabiilsustestid. Korduvannustega läbiviidud uuringutele eelnevalt teostatud stabiilsus- ja homogeensuse teste tuleks kasutada selleks, et määrata kindlaks toidu valmistamise ja jälgimise sagedus. Kui toitu steriliseeritakse, peaks selliste protseduuride mõju uuritavale ainele olema teada. Teostada tuleb kõik vajalikud kohandamised. Kartsinogeensustestide puhul peaksid uurijad olema teadlikud võimalike saasteainete sisaldusest kasutatavas vees. Inimestele joogikõlbulik vesi on üldiselt sobilik ja informatsioon selle koostisest peab olema kättesaadav. Uuritava aine kontsentratsiooni dieedis tuleb kohandada vastavalt loomade kasvule, et uuritava aine omastamine kehakaalu kohta oleks võimalikult konstantne. Kontroll- ja uuritava dieedi toitaineline väärtus peaks olema võimalikult lähedane. Seega tuleks arvestada toidusse segatud uuritava aine toitainelist väärtust. Kogemuste põhjal ei muutu dieedi toitaineline väärtus olulisel määral, kui mitte-toitaineliste uuritavate ainete sisaldus on alla 5 %. 1. Inhalatsiooniuuringud Piirtesti ei ole täpselt määratud, kuna ühekordse inhalatsiooni piirväärtuse defineerimine pole osutunud võimalikuks. 2. Teratogeensuse uuring Uuringumeetod on põhiliselt suunatud suukaudsele manustamisele. Alternatiivina võib kasutada teisi manustamisteid, lähtudes uuritava aine füüsikalistest omadustest või võimalikust manustamisteest inimesele manustamisel. Sellistel juhtudel peaks uuringumeetod olema asjakohaselt kohandatud 28päevase uuringu nõuetele. 3. Toksikokineetika Toksikokineetilised uuringud aitavad toksilisuse andmeid interpreteerida ja jälgida. Nende uuringute eesmärk on selgitada välja uuritava kemikaali toksilisuse teatud kindlaid aspekte ja saadud tulemused võivad olla abiks edasiste toksilisuse uuringute väljatöötamisel. Kõikidel juhtudel ei ole vaja kõiki näitajaid kindlaks teha. Vaid üksikjuhtudel on vajalik teostada täielik toksiliste uuringute seeria (imendumine, eritumine, jaotumine ja metabolism). Teatud koostisosade puhul on soovitatav seda järjestust muuta või piisab ka uuringu läbiviimisest ühekordse annusega. Definitsioonid Toksikokineetika: | uuritavate ainete imendumise, jaotumise, ainevahetuse ja eritumise uuring; | Imendumine: | protsess(id), mille tulemusena jõuab manustatud aine organismi; | Eritumine: | protsess(id), millega manustatud aine ja/või selle metaboliidid eritatakse organismist; | Jaotumine: | protsess(id), millega imendunud aine ja/või selle metaboliidid jaotuvad organismis; | Metabolism: | protsess(id), mille käigus toimuvad manustatud aine strukturaalsed muutused organismis kas ensümaatiliste või mitte-ensümaatiliste reaktsioonide teel. | 4. Äge ja alaäge uuring sekundaarsete liikidega Sekundaarsetel liikidel läbiviidud uuringu eesmärgiks on täiendada esimesest uuringust tehtud järeldusi. Sekundaarsetel liikidel läbiviidud uuringute puhul võib kasutada juba kirjeldatud uuringumeetodeid või kohandada seda väiksemale arvule loomadele. 5. Viljakuse uuringud Kui on vajalik reproduktsiooni uuring kolme põlvkonna kohta, võib kahe põlvkonna reproduktsiooni uuringu pikendada kolmanda põlvkonnani. 6. Mutageensuse uuringud Täiendavad mutageensuse uuringud, muu hulgas kartsinogeensuse skriiningtestid Direktiivi VIII lisas on ära toodud täiendavad uuringud mutageensuse edasiseks uurimiseks või kartsinogeensuse preskriinimiseks. Selles lõigus väljatoodud uuringuid võib üldiselt kasutada mõlemal juhul. Sissejuhatus Ainete mutageense toime esialgne hindamine koosneb geeni (punkt)mutatsioonide uurimisest bakteritel ja tsütogeenetilise kahjustuse uuringutel imetajarakkudel (in vitro või in vivo); sobivad meetodid nendeks baasuuringuteks on kirjeldatud eespool. Käesolev lõik puudutab täiendavaid uuringuid, mis sobivad baasuuringu tulemuste kinnitamiseks ja/või täiendamiseks ja mida saab kasutada mitmel erineval eesmärgil: 1. baasuuringust saadud tulemuste kinnitamiseks; 2. baasuuringus mittekäsitletud tulemusnäitajate uurimiseks; 3. in vivo uuringute alustamiseks või täiendamiseks. Nimetatud eesmärkidel sisaldab rida kirjeldatud teste nii in vitro kui ka in vivo eukarüootilisi süsteeme ja laiendatud valikut bioloogilistest tulemusnäitajatest. Nendest uuringutest saab informatsiooni punktmutatsioonidest, mis leiavad aset baasuuringutes kasutatud bakteritest keerukamates organismides ja saadakse lisainformatsiooni aine potentsiaali kohta põhjustada kromosoomide aberratsioone. Kirjeldatud on ka testid, millega uurida punktmutatsioonidele ja kromosomaalsetele aberratsioonidele lisaks teisi tulemusnäitajaid. Nendest testidest on võimalik saada täiendavat informatsiooni ja neid saab sobivuse korral lisada uuringuskeemidesse. Kui plaanitakse edasist mutageensusuuringute programmi, peaks see üldise põhimõtte järgi olema ülesehitatud nii, et saada olulist lisainformatsiooni uuritava aine võimaliku mutageensuse ja/või kartsinogeensuse kohta. Spetsiifilisel juhul vajalikud uuringud sõltuvad paljudest faktoritest, muuhulgas aine keemilised ja füüsikalised omadused, esialgsete bakteriaalsete ja tsütogeneetiliste testide tulemused, aine metaboolne profiil, teiste toksilisusuuringute tulemused ja aine teada kasutusalad. Seetõttu ei sobi testide kindlalt ettemääratud valik, kuna arvesse tuleb võtta mitmeid erinevaid mõjutegureid. Juhinduda võib teatud üldpõhimõtetest. Kui testi tulemus oli baasuuringus positiivne, peaksid täiendavad uuringud sisaldama vähemalt ühte testi, millega oleks võimalik kindlaks teha sama geneetilist tulemusnäitajat. Kui mõlemad testid olid baasuuringus negatiivsed, tuleks tavajuhul testid geenimutatsioonide ja samuti kromosomaalsete aberratsioonide uurimiseks viia läbi täiendavate uuringutena. Asjakohane võib olla ka lisaandmete saamine indikaatortestidest (nagu loetletud allpool). Allpool on ära toodud sellisteks uuringuteks tehtavate meetodite grupiline alajaotus, kus lähtutakse nende peamisest geneetilisest tulemusnäitajast. Uuringud geen(punkt)mutatsioonide kindlaks tegemiseks Aine võimaliku geeni(punkt)mutatsioone tekitava toime edasiseks uurimiseks võivad olla vajalikud üks või enam järgnevatest testidest: a) Otse- või pöördmutatsiooni uuringud eukarüootsetel mikroorganismidel (Saccharomyces cerevisiae). b) In vitro test otsemutatsioonide uurimiseks imetajarakkudel. c) Sooga seotud retsessiivne letaalsuse uuring Drosophila melanogaster kärbsega. d) In vivo keharaku mutatsiooni uuring: hiire üksikkatse. Kromosoomi aberatsiooni testid Uurimaks täiendavalt aine potentsiaalset toimet tekitada kromosoomi aberratsioone sobivad üks või mitu järgnevatest testidest: a) in vivo tsütogeneetilised uuringud imetajatel. Kaaluda tuleks in vivo luuüdirakkude metafaasi analüüsi läbiviimist, kui seda ei ole kaasatud esialgsesse uuringusse (baasuuringud). Lisaks võib läbi viia in vivo tüviraku tsütogeenetilise uuringu; b) in vitro tsütogeneetilised uuringud imetajarakkudel, kui neid pole algsesse uuringukompleksi kaasatud; c) dominantse letaalsuse uuring närilistel; d) päriliku translokatsiooni test hiirtel. DNA-d mõjutava toime indikaatortestid Kasutusel on meetodid, mille abil saadakse viiteid osadele DNA mõjudele, kuid millel puudub mutageenne toime kui “tulemusnäitaja”. Need uuringud võivad anda täiendavat informatsiooni mutageensusuuringutele, mis võib olla kasulik selliste uuringute interpreteerimisel. Kui sellised uuringud on vajalikud, võivad sobida üks või enam järgnevatest meetoditest, mis viiakse läbi mikroorganismidega või imetajarakkudel: a) mitootiline rekombinatsioon Saccharomyces cerevisiae’s; b) DNA kahjustamine ja parandamine – plaaniväline DNA süntees – imetajarakud (in vitro); c) õdekromatiidi väljavahetamine imetajarakkudes (in vitro). Teised kartsinogeensuse indikaatortestid Kasutusel on imetajaraku transformatsiooni testid, millega hinnatakse aine võimet kutsuda rakukultuuris esile morfoloogilisi ja käitumuslikke muutusi, mida seostatakse pahaloomulisuse kujunemisega in vivo. Kasutada võib palju erinevaid rakutüüpe ja transformatsioonikriteeriume. Imetajatel pärilikkuse mõjutamise riski hindamine Kasutusel on meetodid, mille abil hinnata pärilikkuse mõjutamist kõikidel imetajatel, kui põhjuseks on geen(punkt)mutatsioonid (hiire-spetsiifiline lookuse test [1]) või kromosoomide aberratsioonid (hiire pärilik translokatsiooni test). Neid meetodeid saab kasutada, kui hinnatakse aine võimalikke geneetilisi riske inimesele. Kuna nende testide läbiviimine on väga keerukas ja vajalik loomade arv väga suur (eriti spetsiifilise lookuse testi jaoks), peab nende testide läbiviimine on rangelt õigustatud. SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST SUUKAUDSEL MANUSTAMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE SUUKAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE LIIKIDEL 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavat ainet manustatakse iga päev suu kaudu gradueeritud annustes mitmele katseloomade rühmale, iga uuringurühm saab eri suurusega annuse. Uuringu kestus on 90 päeva. Ravimi manustamise perioodil jälgitakse loomi iga päev, et tuvastada mürgistusnähtude ilmnemist. Katse ajal surnud loomad lahatakse, katse lõppedes surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Ettevalmistused Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühmadesse. Uuritavat ainet võib manustada toiduga, sondi abil, kapslitena või joogiveega. Kõigile loomadele tuleb uuritavat ainet manustada samal viisil kogu uurimisperioodi vältel. Kui ennustamiseks kasutatakse vehiiklit või muid lisaaineid, peab olema tõestatud, et neil ei ole toksilist toimet. Kui see on sobilik, võib kasutada varasemaid andmeid. Katsetingimused Katseloomad Vastunäidustuste puudumisel eelistatakse katseloomana rotti. Kasutada tuleks tavapärastest laboris kasvatatavatest loomaliinidest pärit noori terveid loomi, ideaalselt peaks annustamist alustama enne, kui rott saab kuuenädalaseks, kindlasti ei sobi loomad vanusega üle kaheksa nädala. Uuringu alguses ei tohiks loomade kaal erineda keskmisest rohkem kui ±20 %. Kui subkroonilise suukaudse manustamise uuring viiakse läbi pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada samu loomaliike ja liine. Arv ja sugu Igasse annuserühma peaks kuuluma vähemalt 20 looma (10 isast ja 10 emast). Emasloomad tohi olla poeginud ega tiined. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleb katsealuste algarvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade arvu võrra. Peale selle võib moodustada satelliitrühma 20 loomast (10 looma kummastki soost), keda ravida suurte annustega 90 päeva ja jälgida toksiliste toimete pöörduvust, püsivust ja hilinenud avaldumist 28 päeva pärast ravi lõppu. Annused Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte kontrollrühma. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda sarnaselt katserühma loomadega (v.a uuritava ravimi manustamine). Kui annustamiseks kasutatakse vehiiklit, tuleks kontrollrühmale manustada vehiiklit samal viisil nagu ravirühmale ja nad peaksid seda saama võrdses koguses suurimat annust saava rühmaga. Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, kuid surmajuhte ei tohiks olla või tekib neid vähe. Väikseim annus ei peaks põhjustama mingeid toksilisuse nähte. Kui saadaval on andmed inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Ideaalselt peaks keskmine annus põhjustama minimaalselt tuvastatavat toksilisust. Kui kasutatakse enam kui ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas peaks surmajuhte olema vähe, et tulemustest saaks teha tähenduslikke järeldusi. Kui uuritavat ainet manustatakse koos toiduga, võib kasutada nii püsivat sisaldust toidus (ppm või mg kilogrammi toidu kohta) või püsivat annuse taset looma kehamassi kohta. Alternatiivsed kasutamisviisid tuleb täpsustada. Kui kasutatakse sondi, siis tuleb ainet manustada iga päev samadel kellaaegadel. Annuseid tuleb kohandada kindlate ajavahemike järel (üks või kaks korda nädalas), et säilitada püsiv tase looma kehamassi kohta. Piirtest Kui 90päevane uuring viiakse läbi eespool üksikasjalikult kirjeldatud meetodil annusega 1000 mg/kg kehakaalu kohta päevas või kui on teada, et suurem annus ei ole inimesel põhjustanud toksilisi toimeid, pole edasine uuring vajalik. Vähese toksilisusega ainete puhul on tähtis kindlaks teha, et toiduga koos manustamisel ei mõjutaks kogused ja muud omadused normaalseid toitainete vajadusi. Jälgimisaeg Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja kõik toksilisuse ilmingud registreerida, märkides ära nende algusaja, ulatuse ja kestuse. Registreerida tuleb samuti surmaaeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või kaovad. Protseduur Loomadele manustatakse uuritavat ainet ideaalsel juhul seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul. Satelliitrühmadesse kuuluvaid loomi hoitakse jälgimise eesmärgil ilma ravita järgmised 28 päeva, et tuvastada toksilise toime möödumist või püsimist. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist (ja vedelikutarbimist, kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega) ja loomi kaaluda. Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Katseperioodi lõpus lahatakse kõik mitte-satelliit ravirühma kuulunud loomad. Surnud loomad tuleb eemaldada ja lahata, kui nad leitakse. Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi kuuluvatel) järgmised uuringud: a) Oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva samaväärse vahendi abil enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi. b) Katse lõpus tuleks uurida hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid, nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg või trombotsüütide arv. c) Kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata uuringu lõpus. Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovitatavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodiga), seerumi glutamaatpüruvaadi transaminaas, [2] seerumi glutamaatoksaloatsetaadi transaminaas, [3] ornitiini dekarboksülaas, gammaglutamüül-transpeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindamiseks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse. d) Uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu. Kui teadaolevad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne annustamise algust. Lahang Kõikidele loomadele tuleb teostada lahang. See hõlmab keha välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: kõik silmaganähtavad lesioonid ajukude (sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju koore lõigud), ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, (süljenäärmed), maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas (lisasugunäärmed), (nahk), söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, põis, näidis-lümfisõlmed, (emasloomal piimanäärmed), reiepiirkonna lihased, perifeerne närv, rinnak koos luuüdiga, (silmad), (reieluu, sealhulgas liigespind), (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, lumbaarosa) ja (ekstraorbitaalsed pisaranäärmed). Kudesid, mida on mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidustatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu. Histopatoloogiline uuring a) Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha nende loomade organitest ja kudedest, kes kuulusid kontrollrühma või said suuri annuseid. b) Uurida tuleb kõiki suuri lesioone. c) Teiste annustega rühmades tuleb uurida sihtorganeid. d) Väikese ja keskmise annuse rühmadesse kuuluvatel loomadel tuleks teostada kopsude histopatoloogilised uuringud infektsioonitunnuste suhtes, sest sel viisil on mugav hinnata loomade tervislikku seisundit. Neisse rühmadesse kuuluvatel loomadel tuleks kaaluda ka maksa ja neerude histopatoloogilise uuringu läbiviimist. Edasisi histopatoloogilisi uuringuid ei pruugi nendesse rühmadesse kuuluvatel loomadel rutiinselt vaja olla, kuid need tuleb igal juhul teostada organitel, kus suurte annuste kasutamisel täheldati lesioonide teket. e) Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogilised uuringud teha nendel organitel, mis ravi saanutel kahjustusid. 2. ANDMED Andmed tuleks võtta kokku tabelivormis, näidates iga katsegrupi puhul ära loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes lesioone ja iga lesiooni tüübiga loomade protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit. 3. ARUANNE 3.1. Uuringu raport Uuringu raport peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid: - loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet, - katsetingimused, - annused (sealhulgas vehiikel, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid, - toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa, - toime puudumise tase, kui see on võimalik, - surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni, - toksiliste või muude toimete kirjeldus, - iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg, - andmed toidu ja kehakaalu kohta, - oftalmoloogilised leiud, - kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused, - kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused), - lahanguleiud, - histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus, - tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik, - tulemuste arutelu, - tulemuste interpretatsioon. 3.2. Hinnang ja interpretatsioon Vt üldtutvustus B osa. 4. VIITED Vt üldtutvustus B osa. SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST SUUKAUDSEL MANUSTAMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE SUUKAUDSE MANUSTAMISE UURING MITTENÄRILISTE LIIKIDEL 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavat ainet manustatakse iga päev suu kaudu gradueeritud annustes mitmele katseloomade (mittenärilised) rühmale, iga uuringurühm saab eri suurusega annuse. Uuringu kestus on 90 päeva. Ravimi manustamise perioodil jälgitakse loomi iga päev, et tuvastada mürgistusnähtude ilmnemist. Katse ajal surnud loomad lahatakse, katse lõppedes surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Ettevalmistused Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühmadesse. Uuritavat ainet võib manustada toiduga; mõnel juhul võib osutuda mugavamaks kapslitena manustamine. Kõigile loomadele tuleb uuritavat ainet manustada samal viisil kogu uurimisperioodi vältel. Kui annustamisel kasutatakse vehiiklit või muid lisaaineid, peab olema tõestatud, et neil ei ole toksilist toimet. Kui see on sobilik, võib kasutada varasemaid andmeid. Katsetingimused Katseloomad Tüüpiliselt kasutataks mittenärilise liigina koera, eelistatavalt kindlast tõust. Kasutada võib ka teisi mittenäriliste liike. Kasutada tuleks noori terveid loomi, koera puhul peaks manustamist alustama nelja kuni kuue kuu vanuses ja mitte hiljem kui üheksa kuu vanuses. Kui subkroonilise suukaudse manustamise uuring viiakse läbi pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada samu loomaliike/tõugusid. Arv ja sugu Igasse annuse tasemel peaks kasutama vähemalt kaheksat looma (4 isast ja 4 emast). Loomade arv uuringu lõpetamisel peaks olema piisav, et võimaldada toksiliste toimete tähendusrikast hindamist. Annused Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte kontrollrühma. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda sarnaselt katserühma loomadega (v.a uuritava ravimi manustamine). Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, kuid surmajuhte ei tohiks olla. Väikseim annus ei peaks põhjustama mingeid toksilisuse nähte.Kui saadaval on andmed inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Ideaalselt peaks keskmine annus põhjustama minimaalselt tuvastatavat toksilisust. Kui kasutatakse enam kui ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas ei tohiks surmajuhte olla. Vähetoksiliste ainete puhul on oluline kindlustada, et kasutatav uuritava aine hulk ei häiriks normaalset toitumist. Kui uuritavat ainet manustatakse koos toiduga, võib kasutada nii püsivat sisaldust toidus (ppm või mg kilogrammi toidu kohta) kui ka püsivat annuse taset looma kehamassi kohta; alternatiivsed kasutamisviisid tuleb täpsustada. Kui annus manustatakse otseselt, näiteks kapsli abil, siis tuleb ainet manustada iga päev samadel kellaaegadel. Vajadusel annuseid tuleb annust kohandada nädalase intervalliga, et säilitada aine püsiv tase looma kehamassi kohta. Kui subkroonilise manustamise uuring viiakse läbi pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada sarnast dieeti. Piirtest Kui 90päevane uuring viiakse läbi eespool üksikasjalikult kirjeldatud meetodil annusega 1000 mg/kg kehakaalu kohta päevas või kui on teada, et suurem annus ei ole inimesel põhjustanud toksilisi toimeid, pole edasine uuring vajalik. Vähese toksilisusega ainete puhul on tähtis kindlaks teha, et toiduga koos manustamisel ei mõjutaks kogused ja muud omadused normaalseid toitainete vajadusi. Jälgimisaeg Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja registreerida kõik toksilisuse ilmingud märkides ära nende algusaja, ulatuse ja kestuse. Registreerida tuleb samuti surmaaeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või kaovad. Protseduur Loomadele manustatakse uuritavat ainet ideaalsel juhul seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul. Siiski on juhtudel, kui ravimit manustatakse muul viisil kui toidu hulka segatult, põhiliselt praktilistest kaalutlustest lähtuvalt aktsepteeritav ka viis päeva nädalas manustamine. Vaatlus peaks hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringesüsteemi ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist (ja vedelikutarbimist, kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega) ja loomi kaaluda. Loomade hoolikas kliiniline jälgimine peab olema igapäevane ja vajadusel tuleb võtte tarvitusele sobivaid abinõusid, et vältida loomade uuringust väljalangemist. Katseperioodi lõpus kõik ellujäänud loomad lahatakse. Surevad loomad tuleb eemaldada, surmata ja lahata kohe kui nad leitakse. Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi kuuluvatel) järgmised uuringud: a) Oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva samaväärse vahendi abil enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi. b) Hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg või trombotsüütide arv tuleks uurida katse alguses, seejärel kuuste intervallidega või katseaja esimese poole möödudes ja viimaks uuringu lõpus. c) Kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata tuleks uurida katse alguses, seejärel kuuste intervallidega või katseaja esimese poole möödudes ja viimaks uuringu lõpus. Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovitatavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodiga), seerumi glutamaatpüruvaattransaminaas, [4] seerumi glutamaatoksaloatsetaattransaminaas, [5] ornitiini dekarboksülaas, gammaglutamüül-transpeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindamiseks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse. Mittenäriliste puhul tuleb loomi enne vereanalüüside võtmist teatud aja näljas hoidma (mitte kauem kui 24 tundi). d) Uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu. Lahang Kõikidele loomadele tuleb teostada lahang. See hõlmab keha välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: kõik silmaganähtavad lesioonid, ajukude – sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud, ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, (trahhea) ja kopsud, süda, aort, süljenäärmed, maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas (lisasugunäärmed), (nahk), sapipõis, söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, kusepõis, näidis-lümfisõlmed, (emasloomal piimanäärmed), (reiepiirkonna lihased), perifeerne närv, (silmad), rinnak koos luuüdiga, (reieluu, sealhulgas liigespind) ja (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, lumbaarosa). Kudesid, mida on mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidustatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu. Histopatoloogiline uuring Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha nende loomade organitest ja kudedest, kes kuulusid kontrollrühma või suuri annuseid saanud rühma. Edasised histopatoloogilised uuringud tuleb teha organitel, milles ilmnevad lesioonid suuri annuseid saavas rühmas või mille puhul see on näidustatud kliiniliste vaatluste põhjal. 2. ANDMED Andmed tuleks võtta kokku tabelivormis, näidates iga katsegrupi puhul ära loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes lesioone, lesioonide tüübid ja iga tüübi protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit. 3. ARUANNE 3.1. Uuringu raport Uuringu raport peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid: - loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet, - katsetingimused, - annused (sealhulgas vehiikel, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid, - toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa, - toime puudumise tase, kui see on võimalik, - surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni, - toksiliste või muude toimete kirjeldus, - iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg, - andmed toidu ja kehakaalu kohta, - oftalmoloogilised leiud, - kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused, - kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused), - lahanguleiud, - histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus, - tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik, - tulemuste arutelu, - tulemuste interpretatsioon. 3.2. Hinnang ja interpretatsioon Vt üldtutvustus B osa. 4. VIITED Vt üldtutvustus B osa. SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST NAHAKAUDSEL MANUSTAMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE NAHAKAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE LIIKIDEL 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavat ainet manustatakse 90 päeva jooksul iga päev suu kaudu gradueeritud annustes mitmele katseloomade rühmale, iga uuringurühm saab eri suurusega annuse. Ravimi manustamise perioodil jälgitakse loomi iga päev, et tuvastada toksilisuse nähtude ilmnemist. Katse ajal surnud loomad lahatakse, katse lõppedes surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Ettevalmistused Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühmadesse. Vahetult enne uuringut pügatakse katseloomade karv kehatüvelt selja piirkonnast. Kasutada võib raseerimist, kuid seda tuleb teha umbes 24 tundi enne uuringu algust. Korduvat pügamist või raseerimist on tavaliselt vaja rakendada nädalaste intervallidega. Karva lõigates või raseerides tuleb olla ettevaatlik, et mitte nahka kriimustada. Uuritava aine manustamiseks peaks olema paljastatud vähemalt 10 % nahapinnast. Paljastamist vajava nahapinna suuruse ja katmise dimensioonide otsustamisel tuleb arvesse võtta looma kaalu. Tahkete ainete manustamisel pulverisaatoriga, kui see on sobilik, tuleb uuritavat ainet piisavalt niisutada veega või vajadusel sobiva kandeainega, et kindlustada head kontakti nahaga. Vedelaid aineid kasutatakse tavaliselt ilma lahjendamata. Kasutatakse igapäevast manustamist viiest kuni seitsme päevani nädalas. Katsetingimused Katseloomad Kasutada tuleks täiskasvanud rotte, küülikuid või merisigu. Teisi liike võib kasutada, kuid selline otsus peab olema põhjendatud. Uuringu alguses ei tohiks loomade kaal erineda keskmisest rohkem kui ±20 %. Kui subkroonilise nahakaudse manustamise uuring viiakse läbi pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada samu loomaliike ja liine. Arv ja sugu Igasse annuserühma peaks kuuluma vähemalt 20 terve nahaga looma (10 isast ja 10 emast). Emasloomad tohi olla poeginud ega tiined. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleb katsealuste algarvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade arvu võrra. Peale selle võib moodustada satelliitrühma 20 loomast (10 looma kummastki soost), keda ravida suurte annustega 90 päeva ja jälgida toksiliste toimete pöörduvust, püsivust ja hilinenud avaldumist 28 päeva pärast ravi lõppu. Annused Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte kontrollrühma või vehiikli kontrollrühma, kui kasutatakse vehiiklit. Uuritavat ainet tuleks manustada iga päev samal ajal ja annuseid tuleb kohandada kindlate ajavahemike järel (üks või kaks korda nädalas), et säilitada püsiv tase looma kehamassi kohta. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda sarnaselt katserühma loomadega (v.a uuritava ravimi manustamine). Kui annustamiseks kasutatakse vehiiklit, tuleks kontrollrühmale manustada vehiiklit samal viisil nagu ravirühmale ja nad peaksid seda saama võrdses koguses suurimat annust saava rühmaga. Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, kuid surmajuhte ei tohiks olla või tekib neid vähe. Väikseim annus ei peaks põhjustama mingeid toksilisuse nähte. Kui saadaval on andmeid inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Ideaalselt peaks keskmine annus põhjustama minimaalset tuvastatavat toksilisust. Kui kasutatakse enam kui ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas peaks surmajuhte olema vähe, et tulemustest saaks teha tähenduslikke järeldusi. Kui uuritava aine manustamine põhjustab tõsist nahaärritust, tuleb kontsentratsiooni vähendada. See võib kaasa tuua toksiliste toimete vähenemise või puudumise suure annuse rühmas. Kui nahk on raskelt kahjustunud, võib osutuda vajalikuks uuring lõpetada ja alustada uut uuringut madalamate kontsentratsioonidega. Piirtest Kui eelnev uuring annusega 1000 mg/kg kehakaalu kohta päevas või teadaolev inimese ekspositsioon sellest suuremale annusele ei ole põhjustanud toksilisi toimeid, pole edasine uuring vajalik. Jälgimisaeg Katseloomi tuleb iga päev jälgida toksilisuse ilmingute suhtes. Registreerida tuleb surma aeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või kaovad. Protseduur Loomad peavad olema kambrites ühekaupa. Loomadele manustatakse uuritavat ainet ideaalsel juhul seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul. Satelliitrühmadesse kuuluvaid loomi hoitakse jälgimiseks ilma ravita järgmised 28 päeva, et tuvastada toksilise toime möödumist või püsimist. Ekspositsiooni aeg peab olema kuus tundi päevas. Uuritavat ainet tuleb manustada ühtlaselt nahapiirkonnale suurusega umbes 10 % kehapinnast. Väga toksiliste ainete puhul võib kasutada väiksemat nahapinda, kui üldiselt tuleks katta nii suur ala kui võimalik võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga. Ekspositsiooniaja jooksul hoitakse uuritavat ainet nahaga kontaktis poorse marlisideme ja mitteärritava teibiga. Manustamiskohta tuleb katta sobival viisil, et hoida side ja uuritav aine paigal ja kindlustada, et loomad ei saaks uuritavat ainet alla neelata. Uuritava aine allaneelamise vältimiseks võib kasutada piiravaid vahendeid, kui täielik immobilisatsioon ei ole soovitatav meetod. Ekspositsiooniaja lõpus tuleb uuritava aine jäägid nahalt kõrvaldada, kui see on rakendatav. Puhastamiseks kasutatakse vett või mõnda muud sobivat nahapuhastamise meetodit. Kõiki loomi tuleb jälgida iga päev ja registreerida toksilisuse ilmingud, sealhulgas algusaeg, ulatus ja kestus. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist ja loomi kaaluda. Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Katseperioodi lõpus lahatakse kõik mitte-satelliit ravirühma kuulunud loomad. Surevad loomad tuleb eemaldada, surmata ja lahata, kui nad leitakse. Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi kuuluvatel) järgmised uuringud: a) Oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva samaväärse vahendi abil enne kokkupuudet uuritava ainega ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi. b) Katse lõpus tuleks uurida hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid, nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg või trombotsüütide arv. c) Kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata uuringuperioodi lõpus. Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovitatavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodiga), seerumi glutamaatpüruvaadi transaminaas, [6] seerumi glutamaatoksaloatsetaadi transaminaas, [7] ornitiini dekarboksülaas, gammaglutamüül-transpeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreatiniin, üldbilirubiin ja üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindamiseks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, hape-alus tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse. d) Uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu. Kui teadaolevad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne annustamise algust. Lahang Kõikidele loomadele tuleb teostada täielik lahang, mis hõlmab keha välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude, sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud, ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, süljenäärmed, maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas lisasugunäärmed, sapipõis (kui see on olemas), söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, põis, näidis-lümfisõlmed, (emasloomal piimanäärmed), (reiepiirkonna lihaskond), perifeerne närv, (silmad), rinnak koos luuüdiga, (reieluu, sealhulgas liigespind), (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, lumbaarosa) ja (ekstraorbitaalsed pisaranäärmed). Kudesid, mida on mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidustatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu. Histopatoloogiline uuring a) Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kontrollrühma või suuri annuseid saanud rühma kuulunud loomade normaalsest ja ravitud nahast ja organitest ja kudedest. b) Uurida tuleb kõiki silmaganähtavaid lesioone. c) Teiste annustega rühmades tuleb uurida sihtorganeid. d) Kui kasutatakse rotte, tuleks väikese ja keskmise annuse rühmadesse kuuluvatel loomadel teostada kopsude histopatoloogilised uuringud infektsioonitunnuste suhtes, sest sel viisil on mugav hinnata loomade tervislikku seisundit. Edasisi histopatoloogilisi uuringuid ei pruugi nendesse rühmadesse kuuluvatel loomadel rutiinselt vaja olla, kuid need tuleb igal juhul teostada organitel, kus suurte annuste kasutamisel täheldati lesioonide teket. e) Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogilised uuringud teha nendel organitel, mis ravi saanutel kahjustusid. 2. ANDMED Andmed tuleks võtta kokku tabelivormis, näidates iga katsegrupi puhul ära loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes lesioone ja lesioonide tüübid ja iga tüübi protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit. 3. ARUANNE 3.1. Uuringu raport Uuringu raport peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid: - loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet, - katsetingimused, - annused (sealhulgas vehiikel, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid, - toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa, - toime puudumise tase, kui see on võimalik, - surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni, - toksiliste või muude toimete kirjeldus, - iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg, - andmed toidu ja kehakaalu kohta, - oftalmoloogilised leiud, - kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused, - kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused), - lahanguleiud, - histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus, - tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik, - tulemuste arutelu, - tulemuste interpretatsioon. 3.2. Hinnang ja interpretatsioon Vt üldtutvustus B osa. 4. VIITED Vt üldtutvustus B osa. SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST INHALEERIMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE INHALATSIOONIUURING NÄRILISTE LIIKIDEL 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavale ainele gradueeritud kontsentratsioonides eksponeeritakse iga päev kindlal ajavahemikul mitut katseloomade rühma. Iga kontsentratsiooni kasutatakse ühel uuringurühmal. Uuringu kestus on 90 päeva. Kui kasutatakse vehiiklit, et aidata kaasa vajaliku kontsentratsiooni saavutamisele atmosfääris, tuleks kasutada veel vehiikli kontrollrühma. Ravimi manustamise perioodil jälgitakse loomi iga päev, et tuvastada mürgistusnähtude ilmnemist. Katse ajal surnud loomad lahatakse; katse lõppedes surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Ettevalmistused Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühmadesse. Vajadusel võib uuritavale ainele lisada vehiikli, mis aitab tekitada uuritava aine sobilikku kontsentratsiooni õhus. Kui annustamiseks kasutatakse vehiiklit või teisi lisaaineid, peab olema teada, et neil ainetel ei ole toksilist toimet. Kui see on sobilik, võib kasutada varasemaid andmeid. Katsetingimused Katseloomad Vastunäidustuste puudumisel eelistatakse katseloomana rotti. Kasutada tuleks tavapärastest laboris kasvatatavatest loomaliinidest pärit noori terveid loomi. Uuringu alguses ei tohiks loomade kaal erineda keskmisest rohkem kui ±20 %. Kui subkrooniline inhalatsiooniuuring viiakse läbi pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada samu loomaliike ja liine. Arv ja sugu Igasse annuserühma peaks kuuluma vähemalt 20 looma (10 isast ja 10 emast). Emasloomad tohi olla poeginud ega tiined. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleb katsealuste algarvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade arvu võrra. Peale selle võib moodustada satelliitrühma 20 loomast (10 looma kummastki soost), keda ravitakse suurte annustega 90 päeva ja jälgitakse toksiliste toimete pöörduvust, püsivust ja hilinenud avaldumist 28 päeva pärast ravi lõppu. Annused Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte kontrollrühma või vehiikli kontrollrühma, kui kasutatakse vehiiklit (kontsentratsioon peab vastama vehiikli kontsentratsioonile suurima annuse grupis). Kontrollrühma loomi tuleks kohelda sarnaselt katserühma loomadega (v.a uuritava ravimi manustamine). Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, kuid surmajuhte ei tohiks olla või tekib neid vähe. Kui saadaval on andmed inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Kui kasutatakse enam kui ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas peaks surmajuhte olema vähe, et tulemustest saaks teha tähenduslikke järeldusi. Ekspositsiooni aeg Igapäevane ekspositsioon peaks kestma kuus tundi pärast tasakaalukontsentratsiooni saabumist kambris. Teisi ekspositsiooni kestusi võib kasutada, kui seda nõuavad erivajadused. Varustus Katseloomad peavad olema inhalatsiooniruumides, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamiliselt vähemalt 12 õhuvahetust tunnis, et kindlustada piisav hapnikusisaldus ja uuritava aine ühtlane jaotus. Kui kasutatakse kambreid, tuleks need kavandada nii, et võimalikult vältida loomade tunglemist ja maksimeerida nende ekspositsiooni uuritavale ainele. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri atmosfääri stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust. Kasutada või oronasaalset, ainult pead haaravat või individuaalset kogukehakambrit kasutavat ekspositsiooni; esimesed kaks viisi minimiseerivad aine teisi teid pidi organismi sattumise. Jälgimisaeg Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja kõik toksilisuse ilmingud registreerida, märkides üles nende algusaja, ulatuse ja kestuse. Registreerida tuleb samuti surmaaeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või kaovad. Protseduur Loomi eksponeeritakse uuritavale ainele viis kuni seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul. Satelliitrühmadesse kuuluvaid loomi hoitakse jälgimise eesmärgil ilma ravita järgmised 28 päeva, et tuvastada toksilise toime möödumist või püsimist. Uuringu ajal tuleks säilitada temperatuuri 22±3 °C. Ideaaljuhul peaks õhuniiskus olema vahemikus 30 kuni 70 %, kuid teatud juhtudel (näiteks aerosoolide uuringud), ei pruugi see olla rakendatav. Ekspositsiooni ajal ei anta loomadele süüa ega juua. Kasutatakse dünaamilist inhalatsioonisüsteemi, et saavutada sobivad analüütilised kontsentratsioonid. Sobilike ekspositsioonikontsentratsioonide leidmiseks on soovitatav läbi viia prooviuuring. Õhuvoolu tuleb kohandada nii, et tingimused kogu ekspositsioonikambris oleksid homogeensed. Süsteem peaks kindlustama, et stabiilsed ekspositsiooni tingimused saavutatakse nii ruttu kui võimalik. Jälgida ja mõõta on vaja järgmisi parameetreid: a) õhuvoolu kiirus (pidevalt); b) uuritava aine tegelik kontsentratsioon hingatavas piirkonnas. Katseaine sisaldus igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ±15 %. Siiski võib tolmude ja aerosoolide puhul osutuda võimatuks sellise kontrollitaseme saavutamine, sellisel juhul on aktsepteeritav laiem kõikumine. Uuringu kestel tuleb hoida päevast päeva aine kontsentratsioon võimalikult ühtlasena. Generaatorsüsteemi arendamisel tuleb viia läbi osakeste suuruse analüüsid, et selgitada aerosooli stabiilsust. Ekspositsiooniperioodil tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata partiklisuuruste jaotuvuse ühtlust. c) temperatuur ja niiskus; d) ekspositsiooni ajal ja järel teostada süstemaatilisi vaatlusi ja registreerida tulemused; iga looma kohta peetakse eraldi dokumentatsiooni. Kõiki loomi tuleb jälgida iga päev ja märkida ära toksilisuse sümptomid (sh nende algusaeg, ulatus ja kestus). Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist ja loomi kaaluda. Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Katseperioodi lõpus lahatakse kõik mitte-satelliit ravirühma kuulunud loomad. Surnud loomad tuleb eemaldada ja lahata, kui nad leitakse. Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi kuuluvatel) järgmised uuringud: a) oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva samaväärse vahendi abil enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi; b) katse lõpus tuleks uurida hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid, nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg või trombotsüütide arv; c) kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata uuringu lõpus. Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovitatavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodiga), seerumi glutamaatpüruvaadi transaminaas, [8] seerumi glutamaatoksaloatsetaadi transaminaas, [9] ornitiini dekarboksülaas, gammaglutamüül-transpeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindamiseks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse; d) uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu. Kui teadaolevad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne annustamise algust. Lahang Kõikidele loomadele tuleb teostada lahang. See hõlmab keha välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: kõik suured lesioonid, kopsud – tuleb eemaldada tervelt, kaaluda ja töödelda sobiva fiksaatoriga, et kindlustada kopsustruktuuri säilimine (perfusiooni fiksaatoriga peetakse efektiivseks protseduuriks), ninaneelu kude, ajukude – sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud, ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, (süljenäärmed), maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas (lisasugunäärmed), (nahk), sapipõis (kui see on olemas), söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, põis, näidis-lümfisõlmed, (emasloomal piimanäärmed), (reiepiirkonna lihased), perifeerne närv, rinnak koos luuüdiga, (silmad), (reieluu, sealhulgas liigespind), (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, lumbaarosa) ja (ekstraorbitaalsed pisaranäärmed). Kudesid, mida on mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidustatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu. Histopatoloogiline uuring a) Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kontrollrühma või suuri annuseid saanud rühma kuulunud loomade hingamiselundkonnast ja teistest organitest. b) Uurida tuleb kõiki suuri lesioone. c) Teiste annustega rühmades tuleb uurida sihtorganeid. d) Väikese ja keskmise annuse rühmadesse kuuluvatel loomadel tuleks teostada kopsude histopatoloogilised uuringud infektsioonitunnuste suhtes, sest sel viisil on mugav hinnata loomade tervislikku seisundit. Edasisi histopatoloogilisi uuringuid ei pruugi nendesse rühmadesse kuuluvatel loomadel rutiinselt vaja olla, kuid need tuleb igal juhul teostada organitel, kus suurte annuste kasutamisel täheldati lesioonide teket. e) Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogilised uuringud teha nendel organitel, mis ravi saanutel kahjustusid. 2. ANDMED Andmed tuleks võtta kokku tabelivormis, näidates iga katsegrupi puhul ära loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes lesioone ja lesioonide tüübid ja iga tüübi protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit. 3. ARUANNE 3.1. Uuringu raport Uuringu raport peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid: - loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet, - katsetingimused: Uuringuaparatuuri kirjeldus: sealhulgas kavand, tüüp, mõõtmed, õhuallikas, partiklite ja aerosooli tekitamise süsteem, õhu konditsioneerimise meetod, väljuva õhu töötlemine ja loomade kambritesse paigutamise metoodika, kui seda kasutatakse. Kirjeldada tuleb metoodikat, mida kasutatakse temperatuuri, niiskuse ja aerosooli partiklite suuruse või kontsentratsiooni stabiilsuse määramiseks, kui seda kasutatakse. Ekspositsiooni andmed: need tuleks tuua tabelites ja esitada keskmiste väärtustena ja variaabluse näitajatega (nt standarddeviatsioon). Andmete hulgas tuleb registreerida: a) õhuvoolu kiirused inhalatsiooniseadeldises; b) õhu temperatuuri ja niiskuse; c) kontsentratsioonid nominaalväärtustes (katseaine kogumaht, mis sisestatakse inhalatsiooniseadeldisse, jagatud õhu mahuga); d) vehiikli olemus, kui seda kasutatakse; e) tegelikud kontsentratsioonid katseajal loomade hingamise tsoonides; f) keskmine osakeste suurus (vajadusel), - toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa, - toime puudumise tase, kui see on võimalik, - surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni, - toksiliste või muude toimete kirjeldus, - iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg, - andmed toidu ja kehakaalu kohta, - oftalmoloogilised leiud, - kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused, - kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused), - lahanguleiud, - histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus, - tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik, - tulemuste arutelu, - tulemuste interpretatsioon. 3.2. Hinnang ja interpretatsioon Vt üldtutvustus B osa. 4. VIITED Vt üldtutvustus B osa. TERATOGEENSUSE UURING NÄRILISTEL JA MITTENÄRILISTEL 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavat ainet manustatakse gradueeritud annustes või kontsentratsioonides mitmele tiinete katseloomade rühmale vähemalt selle tiinusperioodi vältel, mil leiab aset organogenees. Ühes grupis kasutatakse ühte annust. Vahetult enne oodatavat poegimispäeva emasloom hukatakse, eemaldatakse emakas ja uuritakse selle sisu. See uurimismeetod sobib embrüo- ja fetotoksilisuse hindamiseks. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Ettevalmistused Varem paaritamata, sarnase suuruse ja vanusega terved noored täiskasvanud emasloomad aklimatiseeritakse labortingimustega vähemalt viiepäevase perioodi vältel enne uuringu algust, seejärel nad paaritatakse tõestatud viljakusega isastega. Seemendatud emasloomad jagatakse juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Paaritus võib olla loomulik või kunstliku seemendamise teel. Uuritavat ainet manustatakse emasloomadele iga päev, alustades kohe pärast implantatsiooni ja manustamist jätkatakse kuni organogeneesi perioodi lõpuni. Päev enne oodatavat poegimist teostatakse hüsterektoomia ning looteid uuritakse siseelundite ja skeleti patoloogiate suhtes, sealhulgas kasvupeetus, hilinenud luustumine ja seedetrakti verejooksud. Katsetingimused Katseloomad Tavaliselt kasutatavateks liikideks on rott, hiir, hamster ja küülik. Eelistatud liikideks on rott ja küülik. Kasutada tuleks tavaliselt kasutatavaid laborliine. Liinid ei tohiks olla madala viljakusega ja peaks demonstreerima iseloomulikku vastust teratogeenidele. Loomad peaksid olema puurides ühekaupa. Arv ja sugu Igal annusetasemel tuleb kasutada vähemalt 20 tiinet rotti, hiirt või hamstrit või vähemalt 12 tiinet küülikut. Eesmärgiks on kindlustada küllaldane pesakondade ja poegade arv, et võimaldada aine teratogeensuse hindamist. Annused Tuleks kasutada vähemalt kolme erinevat annust ja kontrollrühma. Kui uuritavat ainet manustatakse koos vehiikliga, tuleks kasutada ka vehiikli kontrollrühma. Vehiikli kasutamisel peavad selle toksikoloogilised omadused olema tead ning see ei tohiks olla teratogeenne ega mõjutada paljunemist. Kontrollrühma(de) loomi tuleks kohelda täpselt sama moodi, kui katserühmade loomi, v.a uuritava aine manustamine. Kui uuritava aine füüsikalised, keemilised või bioloogilised omadused seda ei piira, peaks kõrgeim annus ideaalsel juhul põhjustama emasloomal ka teatud ulatuses süsteemse toksilisuse nähte, nagu näiteks kerge kehakaalu langus, kuid ei tohiks põhjustada rohkem kui 10 % emasloomade surma. Madalaim annus ei tohiks katseloomal esile kutsuda ainespetsiifiliste muutuste ilmnemist. Vahepealsed annused tuleks kõrgeima ja madalaima annuse vahel jaotada geomeetriliselt. Piirtest Madala toksilisusega ainete puhul ei pruugi uuringud teiste annustega osutuda vajalikuks, kui vähemalt 1000 mg/kg annuse juures ei ilmne mingeid embrüotoksilisuse või teratogeensuse nähte. Manustamise kestus Uuringu 0-päevaks loetakse päeva, mil (kui võimalik) täheldatakse tupekorki ja/või spermat. Manustamisperiood peaks hõlmama enamuse organogeneesi perioodi. Selleks võib lugeda roti ja hiire puhul 6.–15. päeva, hamstril 6.–14. päeva või küüliku puhul 6.–18. päeva. Kui 0-päevaks loetakse päeva, mil toimus paaritus või kunstlik seemendamine, tuleks eelnevalt märgitud perioodidele lisada üks päev. Alternatiiviks on manustamisperioodi pikendamine kuni oodatava poegimise eelse päevani. Jälgimisaeg Üks kord päevas tuleks läbi viia põhjalik kliiniline läbivaatus. Lisaks tuleks loomi iga päev jälgida ja vajadusel võtta tarvitusele sobivad abinõud katseloomade väljalangemise minimeerimiseks. Protseduur Uuritavat ainet manustatakse suukaudselt sondi teel. Uuritavat ainet tuleks manustada iga päev umbes samal kellaajal. Emastele katseloomadele manustatakse uuritavat ainet ettenähtud manustamisperioodi vältel iga päev. Annus võib põhineda emasloomade kehamassil aine manustamise alustamisel või teise võimalusena, võttes arvesse kehamassi kiiret suurenemist tiinuse jooksul, võib loomi perioodiliselt kaaluda ja arvestada annus vastavalt kõige viimasele kehamassi näidule. Toksilisuse ilmingud tuleks registreerida nende täheldamisel, märkides sealhulgas üles ilmnemise alguse, raskusastme ja kestuse. Emasloomad, kellel esinevad abordile või enneaegsele poegimisele viitavad sümptomid, tuleks hukata ja viia läbi nende hoolikas makroskoopiline uurimine. Manustamisperioodi järgne jälgimisaeg peaks kestma kuni umbes ühe päevani enne poegimist; eesmärgiks on hõlmata võimalikult suures ulatuses kogu tiinusperiood, kuid hoiduda katsetulemuste tõlgendamise raskustest, mis võivad esineda loomuliku poegimise korral. Puuri kõrval tehtud tähelepanekud peaksid muu hulgas sisaldama naha, karvastiku, silmade ja limaskestade muutusi, samuti hingamisteede, vereringe, autonoomse ja kesknärvisüsteemi muutusi, somatomotoorse tegevuse ja käitumismustri jälgimist. Tarbitud söödakogust tuleks mõõta kord nädalas. Loomi tuleks kaaluda üks kord nädalas. Lahang Uuringu jooksul või selle lõpus surnud/hukatud loomi tuleks uurida makroskoopiliselt, et tuvastada kõrvalekaldeid kehaehituses või patoloogilisi muutusi, mis oleksid võinud tiinust mõjutada. Kohe surmajärgselt tuleks eemaldada emakas ja uurida selle sisu, et teha kindlaks embrüode või loodete hukkumine ja elusate loodete arv. Emakasisese surma korral on tavaliselt võimalik selle tekkeaega kindlaks määrata. Rottide ja küülikute puhul on võimalik teha kindlaks kollakehade arv. Loodete puhul tuleks määrata nende sugu ja kaaluda neid eraldi ning arvutada kehamasside põhjal loote keskmine kehamass. Eemaldamise järgselt tuleks iga loodet väliselt uurida. Rottide, hiirte ja hamstrite puhul tuleks üks kolmandik kuni pool pesakonnast prepareerida ja uurida skeleti anomaaliate tuvastamiseks, ülejäänud osa pesakonnast tuleks prepareerida ja uurida sobivate meetodite abil pehmete kudede anomaaliate suhtes. Küülikute puhul tuleks iga loodet hoolika lahkamise käigus uurida siseorganite kõrvalekallete ja ka skeleti anomaaliate suhtes. 2. ANDMED Andmed tuleks esitada tabeli vormis, näidates iga katserühma kohta loomade arvu uuringu alguses, tiinestunud loomade arvu, elusate loodete arvu ja suhtarvu ning skeleti või pehmete kudede anomaaliatega loodete arvu ja suhtarvu ning nende kuulumist pesakondade kaupa. Tulemuste hindamiseks tuleks kasutada sobivat statistilist meetodit. Kasutada võib kõiki tunnustatud statistilisi meetodeid. 3. ARUANNE 3.1. Uuringu raport Uuringu raport peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid: - loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, söödaratsioon, - katsetingimused, - annused (sealhulgas vehiikel, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid, - toksilise vastusreaktsiooni andmed annuste järgi, - toimeta kontsentratsioone (kus võimalik), - surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni, - toksiliste või muude toimete kirjeldus, - iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg, - sööda ja kehamassi andmed, - tiinuse kestus ja andmed pesakondade kohta (sealhulgas anamneesiandmed), - looteandmed (elus/surnud, sugu, pehmete kudede ja skeleti defektid), - pesakondade andmed (elus/surnud, sugu, pehmete kudede ja skeleti defektid iga peaskonna kohta), - tulemuste statistiline analüüs - tulemuste arutelu, - tulemuste interpretatsioon. 3.2. Hinnang ja interpretatsioon Vt üldtutvustus B osa. 4. VIITED Vt üldtutvustus B osa. KROONILISE TOKSILISUSE UURING 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavat ainet antakse tavaliselt seitse päeva nädalas sobival manustamisviisil mitmele katseloomade rühmale. Igale rühmale ordineeritakse kindel uuritava aine annus ja seda manustatakse suurem osa nende loomade elueast. Aine manustamise ajal ja järgselt jälgitakse katseloomi iga päev, et sedastada toksiliste mõjude tunnuseid. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Ettevalmistused Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elamis- ja toitumistingimustes vähemalt 5 päeva enne uuringut. Enne uuringu algust terved noored loomad randomiseeritakse ja määratakse uuritavat ainet saavatesse ning kontrollrühmadesse. Katsetingimused Katseloomad Eelistatud liigiks on rott. Võttes arvesse eelnevalt läbiviidud uuringute tulemusi, võib kasutada eelmistest katsetest erinevaid loomaliike (närilisi või mitte-närilisi). Kasutada tuleb tavapäraste laboriloomade liinide noori terveid isendeid ja uuritava aine manustamine peaks algama võimalikult vara peale võõrutamist. Uuringu alguses ei tohi katseloomade kaal erineda keskmisest kaalust enam kui ±20 %. Kui pikaajalisele uuringule eelneb subkroonilise suukaudse manustamise test, tuleb mõlemal juhul kasutada sama loomaliiki/tõugu ja -liini. Arv ja sugu Näriliste korral peab igas eri annust saavas rühmas ja samuti kontrollrühmas olema vähemalt 40 isendit (20 emast ja 20 isast). Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavatsetakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist. Mittenäriliste puhul on aktsepteeritavad väiksemad rühmas, kuid mitte alla 4 isendi kummastki soost ühes grupis. Annused ja ekspositsiooni sagedus Lisaks kontrollgrupile peab kasutama vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma. Kõige suurem annus peab esile kutsuma selgeid toksilisuse ilminguid, põhjustamata sealjuures liigselt surmajuhte. Madalaim annus ei tohi tekitada vähimalgi määral toksilisi mõjusid. Vahepealne annus või annused tuleb valida suure ja väikse annuse väärtuste vahemiku keskelt. Annuste valimisel tuleb arvesse võtta eelmiste toksilisuse katsete ja uuringute andmeid. Ekspositsioon uuritavale ainele peaks normaalselt toimuma iga päev. Kui kemikaali manustatakse joogiveega või toidu hulka segatult, peavad need olema pidevalt kättesaadavad. Kontrollrühm Kasutada tuleb kontrollrühma, mis on igas suhtes identne katserühmaga, erinevus on vaid kokkupuutes katseainega. Teatud tingimustel, näiteks inhalatsiooniuuringute korral, mille puhul kasutatakse aerosoole, või suukaudse manustamise uuringute puhul, kui kasutatakse iseloomustamata bioloogilise aktiivsusega emulgaatorit, peab kasutama lisaks negatiivset kontrollrühma. Negatiivsesse kontrollrühma kuuluvaid loomi koheldakse sarnaselt katserühma loomadega väljaarvatud asjaolu, et loomad ei puutu kokku uuritava ainega ega vehiikliga. Manustamisviis Kolm peamist manustamisviisi on suukaudne, nahakaudne ja inhalatsioon. Valik sõltub katseaine füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning aine võimalikust manustamisviisist inimestel. Nahakaudse manustamistee rakendamine hõlmab olulisi praktilisi probleeme. Nahakaudse imendumise tagajärjel tekkinud kroonilise süsteemse toksilisuse saab normaalsel juhul tuletada/üle kanda teiste suukaudsete uuringute tulemustest ja varasematest nahakaudse toksilisuse testide põhjal saadud nahakaudse imendumise ulatuse andmetest. Suukaudse manustamise uuringud Kui uuritav aine imendub mao-sooletraktist ja kui allaneelamine on üks võimalikest inimese ekspositsiooni viisidest, eelistatakse vastunäidustuste puudumisel suukaudset manustamist. Loomad võivad saada uuritavat ainet toiduga, lahustatuna joogivees või kapsliga. Ideaaltingimustes annustatakse uuritavat ainet iga päev seitse korda nädalas, sest viiepäevane manustamine võib lubada looma paranemist või toksiliste nähtude taandumist perioodil, kui uuritavat ainet ei manustata. See võib mõjutada tulemusi koos järgneva hinnanguga. Siiski, peamiselt praktilistel kaalutlustel peetakse ka viis päeva nädalas manustamist vastuvõetavaks. Inhalatsiooniuuringud Et inhalatsiooniuuringud kätkevad endas teiste manustamisviisidega võrreldes mitmeid keerukaid tehnilisi probleeme, on siin toodud detailsemad juhtnöörid selle meetodi kohta. Peab ka märkima, et intratrahheaalne tilgutamine võib olla üks arvestatavaid alternatiivseid meetodeid, et teatud olukordades ainet manustada. Pikemaajaline ekspositsioon on tavaliselt kavandatud, et jäljendada ekspositsiooni inimesel. Loomade ekspositsioon uuritavale ainega korraldatakse kas kuus tundi päevas viiel päeval nädalas pärast kambri kontsentratsioonide tasakaalustamist (seda nimetatakse vahelduvaks kokkupuuteks) või kasutatakse sarnaselt pidevale keskkonnamõjurile kokkupuute aega 22 kuni 24 tundi seitsmel päeval nädalas (katkematu kokkupuude). Viimasel juhul jääb üks tund päevas loomade söötmiseks, mis peaks toimuma samadel kellaaegadel, ja kambrite korrashoiuks. Mõlema skeemi korral eksponeeritakse loomi ettenähtud ainele kindlatel kontsentratsioonidel. Suurim erinevus vahelduva ja katkematu inhalatsiooniuuringu vahel on see, et esimesel jääb 17- või 18tunnine periood, mil loomad võivad taastuda kokkupuute mõjust ja nädalavahetuseti on taastumisperiood veelgi pikem. Vahelduva või katkematu ekspositsiooni valik sõltub uuringu eesmärkidest ning inimesel kasutatavast manustamisviisist, mida tahetakse jäljendada. Siiski tuleb arvestada teatud tehnilisi raskusi. Näiteks katkematu kokkupuute eelised keskkonna tingimuste jäljendamiseks võivad saada vastulöögi tehniliste raskuste tõttu, sealhulgas söötmise ja jootmise vajadus ekspositsiooni ajal ning keerukamate (ja usaldusväärsemate) aerosool- ja aurugeneraatorite ning jälgimistehnika vajadus. Ekspositsioonikambrid Katseloomad peavad olema inhalatsioonikambrites, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamilist õhuvoolu vähemalt 12 õhuvahetust tunnis, selleks et kindlustada piisava hapniku ja ühtlaselt jaotunud katseaine sisalduse. Kontrollrühmale ja katserühmale mõeldud kambrid peavad olema ehituslikult ja disainilt samasugused, et tagada kõikides aspektides võrreldavad mõjustustingimused, välja arvatud katseainega kokkupuutumise faktoris. Kambris hoitakse vähene negatiivne rõhk, mis takistab katseaine väljaimbumist ümbritsevasse õhku. Katseloomade tunglemine kambrites peaks olema viidud miinimumini. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri õhkkonna stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust. Kambrites tuleb teostada järgnevaid mõõtmisi või kontrolle: i) õhuvool: eelistatult tuleb õhuvoolu kiirust kambrites jälgida pidevalt; ii) kontsentratsioon: igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi uuritava aine kontsentratsioon erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ±15 %; iii) temperatuur ja niiskus: näriliste jaoks tuleb temperatuur hoida 22±2 °C ja niiskus kambrites peab olema 30 kuni 70 %, välja arvatud juhul, kui eksponeeritava aine viimiseks kambri atmosfääri kasutatakse vett. Soovitatavalt peaks mõlemat faktorit jälgima pidevalt; iv) osakeste suuruse mõõtmised: osakeste suuruse jaotumust tuleb kambrite atmosfääris määrata nii vedelates kui tahketes aerosoolides. Aerosoolpartiklid peavad olema katseloomadele sissehingamiseks sobiva suurusega. Kambri õhu analüüsid peavad olema võetud aladelt, kus loomad hingavad. Õhu analüüsid peavad iseloomustama nende osakeste jaotumust, millele katseloomi eksponeeritakse, ja neid tuleb aerosoolheljumites gravimeetriliselt analüüsida, isegi kui suur osa aerosoolist ei ole võimalik sisse hingata. Generaatorsüsteemi väljatöötamisel tuleb sagedasti teha osakeste suuruse analüüse, et selgitada aerosooli stabiilsust. Edaspidi tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata adekvaatselt loomadele kokkupuuteks vajaliku aine partiklite jaotuvuse ühtlust. Uuringu kestus Manustamisperioodi kestus peaks olema vähemalt 12 kuud. Protseduur Vaatlused Hoolikas kliiniline uurimine tuleb teostada vähemalt üks kord päevas. Igapäevased lisavaatlused koos asjakohase sekkumisega on vajalikud, et minimiseerida loomade uuringust väljalangemist, näiteks tuleb surnud loomad lahata või külmutada, nõrgad või suremas loomad surmata või isoleerida. Hoolikaid vaatlusi tuleb teha toksiliste nähtude ilmnemise ja progresseerumise kindlakstegemiseks, aga ka haiguse, autolüüsi või kannibalismi tõttu tekkivate kadude vältimiseks. Kõikide loomade kliinilised andmed tuleb registreerida, sealhulgas neuroloogilised ja silmas toimuvad muutused, aga ka suremus. Toksilise seisundi tekke ja progresseerumise aeg, samuti kasvajakahtlus tuleb registreerida. Iga looma kehakaal tuleb registreerida eraldi korra nädalas katseperioodi esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel vähemalt korra nelja nädala jooksul. Toidu tarbimist hinnatakse igal nädalal uuringu esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel ligikaudu 3kuuliste intervallidega, kui loomade tervislik seisund või kehakaalu muutused ei nõua teisiti. Hematoloogiline uuring Hematoloogiline uuring (näiteks hemoglobiini sisaldus, leukotsüütide absoluutarv, trombotsüütide arv või teised vere hüübimisvõimet peegeldavad näitajad) tuleks teostada kolme kuu järel, kuue kuu järel ja seejärel umbes kuuekuuliste intervallidega ning uuringu lõpetamisel kõikidel loomadel mittenäriliste liikide puhul ja rottide puhul kümnel loomal kummaski soost igas rühmas. Kui võimalik, tuleks kõikidel ajamomentidel võtta analüüsid samadelt rottidelt. Lisaks tuleks mittenärilistel võtta ka uuringueelne vereanalüüs. Kui kliiniliste vaatluste käigus ilmneb loomade tervisliku seisundi halvenemine, tuleks nendel loomadel teha vereanalüüs rakkude valemi loendamisega. Verevalem loendatakse suure annuse rühma ja kontrollrühma kuuluvate loomade vereanalüüsist. Järgmises madalama annusega grupis tuleb valem loendada ainult juhtudel, kui suure annuse rühma ja kontrollrühma vahel ilmnes oluline lahknemine või kui see on näidustatud patoloogiliste leidude tõttu. Uriinianalüüs Uriinianalüüsid võetakse mittenäriliste puhul kõikidelt loomadelt ja rottide puhul iga rühma kohta kümnelt loomalt kummaski soost. Võimaluse korral tuleks analüüsid koguda samadelt rottidelt samade intervallidega nagu hematoloogiliseks uuringuks. Järgmised näitajad määratakse kas kõikidel loomadel eraldi või kokkusegatud proovist/soo/uuringurühma kohta: - välimus: maht ja tihedus igal loomal eraldi, - valk, glükoos, ketoonid, peiteveri (poolkvantitatiivselt), - sademe mikroskoopia (poolkvantitatiivselt). Kliiniline keemia Vereanalüüse kliinilise keemia uuringuteks võetakse umbes kuuekuulise intervalliga ja uuringu lõpetamisel kõikidelt loomadelt mittenäriliste liikide puhul ja kümnelt rotilt kummastki soost kõikides rühmades; võimaluse korral tuleks igal ajahetkel võtta analüüs samadelt loomadelt. Lisaks kogutakse mittenäriliste liikidel uuringu eelsed analüüsid. Proovidest eraldatakse plasma ja tehakse järgmised määramised: - valgu kontsentratsioon, - albumiini kontsentratsioon, - maksafunktsiooni näitajad (nagu alkaalse fosfataasi aktiivsus, glutamaadi püruvaattransaminaasi [10] aktiivsus, glutamaadi oksaloatsetaattransaminaasi [11] aktiivsus), gammaglutamüüli transpeptidaas, ornitiini dekarboksülaas, - süsivesikute metabolism, nagu näiteks tühja kõhu glükoos, - neerufunktsiooni näitajad, nagu vere uurea lämmastik. Lahang Lahang teostatakse kõikidele loomadele, kaasa arvatud nendele, kes surid katseajal või surmati, kuna leiti suremas. Enne surmamist tuleb vererakkude valemi loendamiseks koguda vereproovid kõikidelt loomadelt. Säilitada tuleb kõik makroskoopiliselt nähtavad lesioonid, kasvajad või kasvaja kahtlased lesioonid. Tuleks püüda leida korrelatsiooni makroskoopiliste mikroskoopiliste leidude vahel. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude [12] (piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteks), ajuripats, kilpnääre (sealhulgas kõrvalkilpnääre), harknääre, kopsud (koos trahheaga), süda, aort, süljenäärmed, maks, [13] põrn, neerud, [14] neerupealised, [15] söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärasool, emakas, kusepõis, lümfisõlmed, kõhunääre, suguorganid, [16] lisasugunäärmed, nahk, emasloomadel piimanäärmed, lihaskond, perifeerne närv, selja-aju kolmel tasandil (kaelaosa, keskmine rinnaosa ja nimmeosa), rinnak koos luuüdiga, reieluu koos liigesega ja silmad. Kopsude ja kusepõie parimaks säilitamiseks tuleb nad puhuda fikseerivat ainet täis; täispuhutud kopsud on inhalatsioonikatsete korral olulise tähtsusega õigeks histopatoloogiliseks analüüsiks. Inhalatsiooniuuringute korral peab säilitama kogu hingamiselundkonna, sealhulgas ninaõõne, neelu ja kõri. Kui teostatakse teisi kliinilisi uuringud, peaks neist saadav informatsioon olema kättesaadav enne mikroskoopilisi uuringuid, sest need võivad anda patoloogile väärtuslikke juhtnööre. Histopatoloogiline uuring Kõiki silmaga nähtavaid muutusi, eriti kasvajaid ja muid lesioone, mis leitakse ükskõik millisest organist, tuleks uurida mikroskoopiliselt. Lisaks on soovitatav teostada järgmised uuringud: a) Kõigi säilitatud organite ja kudede mikroskoopiline uuring koos leitud lesioonide täieliku kirjeldusega: 1. kõigil loomadel, kes surid või surmati uuringu kestel; 2. kõigil suure annuse rühma ja kontrollrühma loomadel; b) organeid ja kudesid, milles ilmneb muutusi, mis on põhjustatud või mis võivad olla põhjustatud uuritava aine mõjust, tuleb uurida ka väikesi annuseid saanud rühmades; c) kui uuringu tulemustes ilmneb loomade normaalse elukestuse oluline vähenemine või tekivad mõjustused, mis võivad muuta toksilist vastust, tuleks eelkirjeldatud viisil uurida järgmise väiksema annuse rühma kuuluvaid loomi; d) informatsioon vastaval loomaliinil normaalselt tekkivate lesioonide sageduse kohta sarnastel laboritingimustel, st ajaloolised kontrollandmed, on asendamatud ravitud loomadel leitud muutuste olulisuse korrektseks hindamiseks. 2. ANDMED Andmed tuleb esitada kokkuvõtliku tabelina, näidates iga katsegrupi puhul loomade arvu katse alguses; isendite arvu, kellel ilmneb katseaja jooksul lesioone ja iga lesiooni protsentuaalne esinemissagedus loomadel. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodiga. Kasutada võib iga tunnustatud statistilist meetodit. 3. ARUANNE 3.1. Uuringu raport Uuringu raport peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid: - loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet, - katsetingimused: Ekspositsiooniseadeldise kirjeldus: Tuleb märkida seadeldise disain, tüüp, mõõtmed, õhu lähteallikas, osakesi ja aerosoole tootev süsteem, õhu konditsioneerimise meetod, heitõhu töötlemine, loomade majutamise korraldus testkambrites, kui neid kasutatakse. Kirjeldada tuleb temperatuuri ja niiskuse mõõtmise vahendeid ning vajadusel aerosooli kontsentratsiooni stabiilsust ja osaksete suurust. Andmed ekspositsiooni kohta: Andmed tuleb esitada tabelina ja esitada keskmiste väärtustena ja variaabluse näitajatega (nt standarddeviatsioon). Andmete hulgas tuleb registreerida: a) õhuvoolu kiirused inhalatsiooniseadeldises; b) õhu temperatuur ja niiskus; c) kontsentratsioonid nominaalväärtustes (katseaine kogumaht, mis sisestatakse inhalatsiooniseadeldisse jagatud õhu mahuga); d) vehiikli olemus, kui seda kasutatakse; e) tegelikud kontsentratsioonid katseajal loomade hingamise tsoonides; f) keskmine osakeste suurus (vajadusel), - annused (sealhulgas vehiikli annused, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid, - toime puudumise tase, kui see on võimalik, - surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni, - toksiliste või muude toimete kirjeldus, - iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg, - andmed toidu ja kehakaalu kohta, - oftalmoloogilised leiud, - kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused, - kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused), - lahanguleiud, - histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus, - tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik, - tulemuste arutelu, - tulemuste interpretatsioon. 3.2. Hinnang ja tõlgendamine Vt üldtutvustus B osa. 4. VIITED Vt üldtutvustus B osa. KARTSINOGEENSUSE UURING 1. MEETOD 1.1. Sissejuhatus Vt üldtutvustus B osa. 1.2. Definitsioonid Vt üldtutvustus B osa. 1.3. Võrdlusained Puuduvad. 1.4. Uuringumeetodi põhimõte Uuritavat ainet antakse tavaliselt seitse päeva nädalas sobival manustamisviisil mitmele katseloomade rühmale. Igale rühmale ordineeritakse kindel uuritava aine annus ja seda manustatakse suurem osa nende loomade elueast. Aine manustamise ajal ja järgselt jälgitakse katseloomi iga päev, et sedastada toksiliste mõjude tunnuseid, eriti tuumorite arenemist. 1.5. Kvaliteedikriteeriumid Puuduvad. 1.6. Uuringumeetodi kirjeldus Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elamis- ja toitumistingimustes vähemalt 5 päeva enne uuringut. Enne testi terved noored loomad randomiseeritakse ja määratakse uuritavat ainet saavatesse ning kontrollrühmadesse. Katseloomad Võttes arvesse eelnevalt läbiviidud uuringute tulemusi, võib kasutada eelmistest katsetest erinevaid loomaliike (närilisi või mitte-närilisi). Kasutada tuleb tavapäraseid laboriloomade liinide noori terveid isendeid ja uuritava aine manustamine peab algama võimalikult vara peale imetamisperioodi. Uuringu alguses ei tohi katseloomade kaal erineda keskmisest kaalust enam kui ±20 %. Kui pikaajalisele uuringule eelneb subkroonilise suukaudse manustamise test, tuleb mõlemal juhul kasutada sama loomaliiki/tõugu ja -liini. Arv ja sugu Näriliste korral peab igas eri annust saavas rühmas ja samuti kontrollrühmas olema vähemalt 100 isendit (50 emast ja 50 isast). Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavatsetakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist. Annused ja kokkupuute sagedus Kaasnevale kontrollgrupile lisaks peab kasutama vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma. Kõige kõrgem annus peab esile kutsuma minimaalseid toksilisi mõjusid, näiteks kehakaalu juurdekasvu vähene pidurdumine (vähem kui 10 %), ilma et normaalset elukestust mõjutaks teised toimed peale kasvajate. Madalaim annus ei tohi häirida looma normaalset kasvu, arengut ja pikaealisust või tekitada vähimalgi määral toksilisi mõjusid. Tavaliselt ei tohi madalaim annus olla vähem kui 10 % suurest doosist. Vahepealne annus või annused tuleb valida suure ja väikse annuse väärtuste vahemiku keskelt. Annuste valimisel tuleb arvesse võtta eelmiste toksilisuse katsete ja uuringute andmeid. Ekspositsioon uuritavale ainele peaks reeglipäraselt toimuma iga päev. Kui kemikaali manustatakse joogiveega või toidu hulka segatult, peavad need olema pidevalt kättesaadavad. Kontrollrühm Kasutada tuleb kontrollrühma, mis on igas suhtes identne katserühmaga, erinevus on vaid kokkupuutes katseainega. Teatud tingimustel, näiteks inhalatsiooniuuringute korral, mille puhul kasutatakse aerosoole, või suukaudse manustamise uuringute puhul, kui kasutatakse iseloomustamata bioloogilise aktiivsusega emulgaatorit, peab kasutama lisaks kontrollrühma, kus loomad ei puutu kokku ülekandeainega. Manustamisviis Kolm peamist manustamisviisi on suukaudne, nahakaudne ja inhalatsioon. Valik sõltub katseaine füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning aine võimalikust manustamisviisist inimestel. Suukaudse manustamise uuringud Kui uuritav aine imendub mao-sooletraktist ja kui allaneelamine on üks võimalikest inimese ekspositsiooni viisidest, eelistatakse vastunäidustuste puudumisel suukaudset manustamist. Loomad võivad saada uuritavat ainet toiduga, lahustatuna joogivees või kapsliga. Ideaaltingimustes annustatakse uuritavat ainet iga päev seitse korda nädalas, sest viie korra puhul võib loom paraneda või toksilised nähud taanduda perioodil, kui uuritavat ainet ei manustata. See võib mõjutada tulemusi koos järgneva hinnanguga. Siiski, peamiselt praktilistel kaalutlustel peetakse ka viis päeva nädalas manustamist vastuvõetavaks. Nahakaudse manustamise uuringud Nahakaudne manustamine, aine määrimine nahapinnale sobib juhul, kui soovitakse jäljendada selle aine peamist manustamisviisi inimesele ja koostatakse mudel järelduste tegemiseks nahakahjustuste kohta. Inhalatsiooniuuringud Et inhalatsiooniuuringud kätkevad endas teiste manustamisviisidega võrreldes mitmeid keerukamaid tehnilisi probleeme, antakse siin selle meetodi kohta detailsemaid juhtnööre. Peab märkima, et intratrahheaalne tilgutamine võib olla üks arvestatavaid alternatiivseid meetodeid, et teatud olukordades ainet manustada. Pikemaajaline ekspositsioon on tavaliselt kavandatud nii, et see jäljendaks inimese ekspositsiooni. Loomade kokkupuude uuritava ainega korraldatakse kas kuus tundi päevas viiel päeval nädalas pärast kambri kontsentratsioonide tasakaalustamist (seda nimetatakse vahelduvaks kokkupuuteks) või kasutatakse sarnaselt pidevale keskkonnamõjurile kokkupuute aega 22 kuni 24 tundi seitsmel päeval nädalas (katkematu kokkupuude). Viimasel juhul jääb üks tund päevas loomade söötmiseks, mis peaks toimuma samadel kellaaegadel, ja kambrite korrashoiuks. Mõlema skeemi korral eksponeeritakse loomi ettenähtud ainele kindlatel kontsentratsioonidel. Suurim erinevus vahelduva ja katkematu inhalatsiooniuuringu vahel on see, et esimesel jääb 17- või 18tunnine periood, mil loomad võivad taastuda kokkupuute mõjust ja nädalavahetuseti on taastumisperiood veelgi pikem. Vahelduva või katkematu kokkupuute valik sõltub uuringu eesmärkidest ning inimesel rakendatavast manustamisviisist, mida tahetakse jäljendada. Siiski tuleb arvestada teatud tehnilisi raskusi. Näiteks katkematu kokkupuute eelised keskkonna tingimuste jäljendamiseks võivad saada vastulöögi tehniliste raskuste tõttu, sealhulgas söötmise ja jootmise vajadus ekspositsiooni ajal ning keerukamate (ja usaldusväärsemate) aerosool- ja aurugeneraatorite ning jälgimistehnika vajadus. Ekspositsioonikambrid Katseloomad peavad olema inhalatsioonikambrites, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamiliselt vähemalt 12 õhuvahetust tunnis, selleks et kindlustada piisava hapniku ja ühtlaselt jaotunud katseaine sisalduse. Kontrollgrupile ja katsegrupile mõeldud kambrid peavad olema ehituslikult ja disainilt samasugused, et tagada võrreldavad mõjustustingimused kõikides aspektides, välja arvatud katseainega kokkupuutumise faktoris. Kambris hoitakse vähene negatiivne rõhk, mis takistab katseaine väljaimbumist ümbritsevasse õhku. Katseloomade tunglemine kambrites peaks olema viidud miinimumini. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri õhkkonna stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust. Kambrites tuleb teostada järgnevaid mõõtmisi või kontrolle: i) õhuvool: eelistatult tuleb õhuvoolu kiirust kambrites jälgida pidevalt; ii) kontsentratsioon: igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi katseaine sisaldus erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ±15 %. Uuringu kestel tuleb aine kontsentratsioon hoida päevade lõikes võimalikult ühtlasena; iii) temperatuur ja niiskus: näriliste jaoks tuleb temperatuur hoida 22±2 °C ja niiskus peab olema kambrites 30 kuni 70 %, välja arvatud juhul, kui eksponeeritava aine viimiseks kambri atmosfääri kasutatakse vett. Soovitatavalt peaks mõlemat faktorit jälgima pidevalt; iv) osakeste suuruse mõõtmised: osakeste suuruse jaotumus peab olema kambrite atmosfääris määratud nii vedelates kui tahketes aerosoolides. Aerosoolpartiklid peavad olema katseloomadele sissehingamiseks sobiva suurusega. Kambri õhu analüüsid peavad olema võetud aladelt, kus loomad hingavad. Õhu analüüsid peavad iseloomustama nende osakeste jaotumust, millele katseloomi eksponeeritakse, ja neid tuleb aerosoolheljumites gravimeetriliselt analüüsida, isegi kui suur osa aerosoolist ei ole võimalik sisse hingata. Generaatorsüsteemi väljatöötamisel tuleb sagedasti teha osakeste suuruse analüüse, et selgitada aerosooli stabiilsust. Edaspidi tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata adekvaatselt loomadele kokkupuuteks vajaliku aine partiklite jaotuvuse ühtlust. Uuringu kestus Kartsinogeensuse uuringu kestus hõlmab tavaliselt suurema osa katseloomade elueast. Uuring peaks lõppema hiirtel ja hamstritel 18 kuu järel ja rottidel 24 kuu järel. Siiski, teatud pikemaealistel ja/või kasvaja madala spontaanse tekkimise kiirusega liinidel peaks uuring lõppema hiirtel ja hamstritel 24. kuul ja rottidel 30. kuul. Teine võimalus on lõpetada selline laiaulatuslik uuring juhul, kui ellujäänute arv madalaimat annust saanud loomarühmas või kontrollrühmas ulatub 25 %. Kui katset lõpetades ilmneb elusolevatel isendite hulgas väljendunud sooline erinevus, peab iga sugu analüüsima eraldi. Kui loomad surevad enneaegselt selgelt sedastatavate toksiliste nähtude tõttu ainult kõrge annusega uuringugrupis ja need toksilised mõjud ei põhjusta probleeme teistes gruppides, ei pruugi seetõttu uuringut lõpetada. Negatiivne uurimustulemus on vastuvõetav, kui mitte üheski grupis ei kaotatud katseajal üle 10 % isenditest autolüüsi, kannibalismi või hooldamise probleemide tõttu ja ühegi grupi elulemus ei ole vähem kui 50 % 18. kuul hiirte ja hamstrite kasutamisel ning 24. kuul rottide korral. Protseduur Vaatlused Igapäevased vaatlused kambrites peavad hõlmama naha- ja karvkatte, silmade ja limaskesta muutusi, lisaks tuleb hinnata hingamis-, vereringeelundkonda, autonoomset ja kesknärvisüsteemi, somatosensoorset aktiivsust ja käitumismudelit. Loomade regulaarsed vaatlused on vajalikud selleks, et mitte kaotada isendeid uuringu ajal selliste põhjuste tõttu nagu kannibalism, kudede autolüüs või looma vale paigutuse. Surnud loomad tuleb koheselt eemaldada, surmata ja lahata. Kõikide loomade kliinilised andmed ja suremus peavad olema registreeritud. Eriline tähelepanu tuleb pöörata kasvajate tekkimisele: iga nähtava või palpeeritava tuumori puhul tuleb märkida märkamisaeg, lokalisatsioon, mõõtmed, väline kuju ja levik. Toidu tarbimist (ja joogi tarbimist, kui katseaine manustatakse joogivee kaudu) hinnatakse igal nädalal uuringu esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel ligikaudu 3kuuliste intervallidega, kui loomade tervislik seisund või kehakaalu muutused ei nõua teisiti. Iga looma kehakaal tuleb registreerida eraldi korra nädalas katseperioodi esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel vähemalt korra nelja nädala jooksul. Kliinilised analüüsid Hematoloogia Kui katseloomade kliinilised vaatlused kinnitavad loomade tervisliku seisundi muutust katseperioodil, tuleb nendel loomade määrata vereanalüüs koos verevalemiga. Vere äigepreparaadid võetakse 12. ja 18. kuul ja enne lahangut. Vererakud loendatakse kõrge annuse saanud loomadel ja kontrollrühmal. Kui need andmed, eelkõige enne lahkamist võetud analüüsid, või patoloogilised andmed kinnitavad vajadust, loendatakse valem järgmisel madalama annusega rühmal või rühmadel. Lahang Lahang teostatakse kõikidele loomadele, kaasa arvatud nendele, kes surid katseajal või surmati, kuna leiti suremas. Säilitada tuleb kõik makroskoopiliselt nähtavad tuumorid või kahjustused või tuumori kahtlased lesioonid. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude (sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud), ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, süljenäärmed, maks, põrn, neerud, neerupealised, kõhunääre, suguorganid, emakas, lisasugunäärmed, nahk, söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärasool, kusepõis, iseloomulik lümfisõlm, emasloomadel piimanäärmed, reie lihaskond, perifeerne närv, rinnak koos luuüdiga, reieluu koos liigesega, seljaaju kolmel tasandil (kaelaosa, keskmine rinnaosa ja nimmeosa) ja silmad. Kopsude ja kusepõie parimaks säilitamiseks tuleb nad täis puhuda fikseeriva ainega; täispuhutud kopsud on inhalatsioonikatsete korral olulise tähtsusega õigeks histopatoloogiliseks analüüsiks. Inhalatsiooniuuringute korral peab säilitama kogu hingamiselundkonna, sealhulgas ninaõõne, neelu ja kõri. Histopatoloogiline uuring a) Täielik histopatoloogiline uuring tuleb viia läbi kõikide uuringuperioodil surnud või surmatud loomade organitel ja kudedel ja kõikidel kontrollrühma ja suurt annust saanud rühma kuulunud loomadel. b) Kõik selgelt nähtavad kasvajad või kasvajakahtlased kahjustused tuleb kõikides rühmades kontrollida mikroskoopiliselt. c) Neoplastiliste kahjustuste olulise erinevuse korral kõrge annusega rühmas ja kontrollrühmas tuleb teistes rühmades teostada vastava organi või koe histopatoloogiline uuring. d) Kui suure annuse rühmas on elulemus märkimisväärselt madalam kui kontrollgrupil, tuleb täielik uuring teostada madalama annuse rühmast järgmise grupi isenditele. e) Kui esineb tõendeid, et kõrge annusega rühma loomadel on toksilisi või teisi nähtusid, mis võivad mõjutada neoplastilist reaktsiooni, tuleb täielik uuring teostada madalama annusega rühmast järgmise rühma isenditele. 2. ANDMED Andmed tuleb esitad