KOMISJONI RAKENDUSOTSUS (EL) 2015/1554,

11. september 2015,

millega rakendatakse direktiivi 2006/88/EÜ seoses seire- ja diagnostikameetodite suhtes kohaldatavate nõuetega

(teatavaks tehtud numbri C(2015) 6188 all)

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Liidu toimimise lepingut,

võttes arvesse nõukogu 24. oktoobri 2006. aasta direktiivi 2006/88/EÜ vesiviljelusloomade ja vesiviljelustoodete loomatervishoiunõuete ning teatavate veeloomadel esinevate taudide ennetamise ja tõrje kohta, (1) eriti selle artikli 49 lõiget 3, artikli 50 lõiget 4, artikli 57 punkti b ja artikli 61 lõiget 3,

ning arvestades järgmist:

Direktiivis 2006/88/EÜ on sätestatud selle direktiivi IV lisas loetletud taudide (edaspidi „loetletud taudid”) seireks ja varaseks tuvastamiseks võetavad minimaalsed ennetusmeetmed ja loetletud taudi kahtluse või puhangu korral kohaldatavad tõrjemeetmed. Selles on sätestatud ka nõuded, mida tuleb liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale taudivaba staatuse saamiseks järgida.

Maailma Loomatervise Organisatsiooni (OIE) veeloomade tervishoiu eeskirjas (edaspidi „veeloomade tervishoiu eeskiri”) on esitatud standardid, mille eesmärk on veeloomade tervise ja kasvatatavate kalade heaolu parandamine kogu maailmas, sh veeloomade ja veeloomatoodete turvalise rahvusvahelise kaubanduse standardid. Veeloomade tervishoiu eeskirja mitmes peatükis on esitatud soovitusi teatavate diagnostikameetodite kasutamise kohta. Kõnealused OIE ette nähtud meetodid on esitatud OIE diagnostikameetodite käsiraamatus veeloomade kohta (edaspidi „diagnostikameetodite käsiraamat”). Selleks et tagada veeloomade taudide diagnostikat käsitlevate liidu nõuete kooskõla rahvusvaheliste standarditega, peaks käesoleva otsuse nõuete puhul arvesse võtma veeloomade tervishoiu eeskirja standardeid ja soovitusi.

Veeloomade tervishoiu eeskirjas on mitme loetletud taudi puhul esitatud mitu laboriuuringute jaoks kasutatavat meetodit ja nende kohaldamise kord. Selleks et liidu tasandil ühtlustada loetletud taudide puhul kasutatavate diagnostikameetodite teaduslik alus, on OIE soovitatud diagnostikameetodite ja nende kohaldamise korra hulgast vaja valida need, mis peaksid olema kohustuslikud, kui seireprogrammide rakendamiseks ja loetletud taudi kahtluse ümberlükkamiseks või sellise taudi esinemise kinnitamiseks tehakse laboriuuringuid. Kuna teatavatel juhtudel peaks olema võimalik kasutada ka muid meetodeid ja nende kohaldamise korda, tuleks esitada selliste muude meetodite kirjeldus ning teaduslik selgitus selle kohta, millal ja kuidas neid kohaldada. See on eriti vajalik üksikasjalikuma korra alusel kohaldatavate diagnostikameetodite puhul.

Selleks et saada täpsed ja korratavad diagnostilised tulemused, on oluline, et kasutatavad meetodid ja nende kohaldamise kord oleksid valideeritud kooskõlas asjaomaste direktiivi 2006/88/EÜ VI lisa I osas osutatud kvaliteedistandarditega. Mitme käesolevas otsuses sätestatud diagnostikameetodi puhul näeb meetodi kohaldamise kord ette turul kättesaadavate katsekomplektide kasutamist ja Euroopa Liidu referentlaborid on need katsekomplektid asjaomaste taudide jaoks valideerinud akrediteeritud katsetega. Õiguskindluse huvides tuleks käesolevas otsuses osutada selliste turul kättesaadavate valideeritud katsekomplektide kaubanduslikele nimedele.

Komisjoni otsuses 2001/183/EÜ (2) on sätestatud proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid loetletud taudide nakkusliku vereloomenekroosi ja viirusliku hemorraagilise septitseemia tuvastamiseks ja nende esinemise kinnitamiseks. Komisjoni otsuses 2003/466/EÜ (3) on sätestatud proovivõtukavad ja diagnostikameetodid lõhede infektsioosse aneemia tuvastamiseks ning kriteeriumid, mida järgida selle taudi kahtluse või kinnitatud esinemise korral tsoonide loomise ja ametliku seire puhul. Komisjoni otsuses 2002/878/EÜ (4) on sätestatud proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid molluskihaiguste bonamioosi ja marteilioosi tuvastamiseks ja nende esinemise kinnitamiseks. Selleks et neid nõudeid ajakohastada, tuleks nimetatud kolm otsust asendada käesoleva otsusega. Otsused 2001/183/EÜ, 2002/878/EÜ ja 2003/466/EÜ tuleks seepärast kehtetuks tunnistada.

Kuna on liikmesriike, kellel on vaja aega riiklike referentlaborite ajakohastamiseks, et tagada nende vastavus käesolevas otsuses sätestatud nõuetele, tuleks käesolevat otsust kohaldada alates 1. aprillist 2016.

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA OTSUSE:

Artikkel 1

Reguleerimisese

Käesolevas otsuses sätestatakse eeskirjad, mis käsitlevad järgmist:

Artikkel 2

Mõisted

Käesolevas otsuses kasutatakse järgmisi mõisteid:

a) viiruslik hemorraagiline septitseemia (VHS)– taud, mille tekitaja on viirusliku hemorraagilise septitseemia viirus, mis kuulub sugukonna Rhabdoviridae perekonda Novirhabdovirus ning mida nimetatakse ka Egtvedi viiruseks;

b) nakkuslik vereloomenekroos (IHN)– taud, mille tekitaja on nakkusliku vereloomenekroosi viirus, mis kuulub sugukonna Rhabdoviridae perekonda Novirhabdovirus;

c) karpkalade herpesviirus– taud, mille tekitaja on karpkalade herpesviirus (KHV), mis kuulub sugukonda Alloherpesviridae. Selle viiruse teaduslik nimetus on karpkalade herpesviirus 3 (CyHV-3);

d) lõhede infektsioosne aneemia (ISA)– taud, mille tekitaja on sugukonna Orthomyxoviridae perekonda Isavirus kuuluv lõhede aneemia viirus, mille genoomi tugevalt polümorfses piirkonnas (HPR) esineb deletsioon;

e) Marteilia refringens'i nakkus– taud, mille tekitaja on hõimkonna Paramyxea ainurakne Marteilia refringens;

f) Bonamia ostreae'i nakkus– taud, mille tekitaja on hõimkonna Haplosporidia ainurakne Bonamia ostreae;

g) viiruslik valgelaiksus– taud, mille tekitaja on valgelaiksuse viirus, mis on sugukonna Nimaviridae perekonda Whispovirus kuuluv kaheahelalise DNAga viirus.

Artikkel 3

Likvideerimis- ja seireprogramme käsitlevad miinimumnõuded

Liikmesriigid tagavad, et kui liikmesriigile või selle tsoonile või piirkonnale antakse ühe või mitme loetletud taudi suhtes taudivaba staatus või selline staatus tühistatakse või taastatakse, järgitakse likvideerimis- ja seireprogramme, puhvertsoone ning proovivõtu- ja diagnostikameetodeid käsitlevaid I lisas sätestatud eeskirju ning II lisas sätestatud diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise üksikasjalikku korda.

Artikkel 4

Diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise üksikasjalikku korda käsitlevad miinimumnõuded

Liikmesriigid tagavad, et kui loetletud taudi kahtluse ümberlükkamiseks või taudi esinemise kinnitamiseks tehakse laboriuuringuid, järgitakse I lisas sätestatud tõrjemeetodeid ja II lisas sätestatud konkreetseid diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise üksikasjalikku korda.

Artikkel 5

Minimaalsed tõrjemeetmed loetletud taudi isoleerimisel ja miinimumnõuded isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamiseks liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas, mida ei ole tunnistatud loetletud taudist vabaks

Liikmesriigid tagavad, et kui võetakse tõrjemeetmeid ja lõpetatakse ühe või mitme loetletud taudi suhtes kehtivate isoleerimismeetmete kohaldamine liikmesriigis või selle tsoonis või piirkonnas, mida ei ole tunnistatud asjaomasest loetletud taudist vabaks, järgitakse I lisas sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid ja isoleerimismeetmete kohaldamise lõpetamise suhtes kehtivaid miinimumnõudeid.

Artikkel 6

Kehtetuks tunnistamine

Otsused 2001/183/EÜ, 2002/878/EÜ ja 2003/466/EÜ tunnistatakse kehtetuks.

Artikkel 7

Kohaldamiskuupäev

Käesolevat otsust kohaldatakse alates 1. aprillist 2016.

Artikkel 8

Adressaadid

Käesolev otsus on adresseeritud liikmesriikidele.

(1) ELT L 328, 24.11.2006, lk 14.

(2) Komisjoni otsus 2001/183/EÜ, 22. veebruar 2001, milles sätestatakse proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid teatavate kalahaiguste avastamiseks ja nende esinemise kinnitamiseks ning millega tunnistatakse kehtetuks komisjoni otsus 92/532/EMÜ (EÜT L 67, 9.3.2001, lk 65).

(3) Komisjoni otsus 2003/466/EÜ, 13. juuni 2003, lõhelaste nakkava kehvveresuse (ISA) esinemise kahtluse või kinnitamise korral tsoonideks jaotamise ja ametliku järelevalve kriteeriumide kehtestamise kohta (ELT L 156, 25.6.2003, lk 61).

(4) Komisjoni otsus 2002/878/EÜ, 6. november 2002, millega sätestatakse proovivõtuplaanid ja diagnostikameetodid limusehaiguste bonamioos (Bonamia ostreae) ja marteilioos (Marteilia refringens) avastamiseks ja nende esinemise kinnitamiseks (EÜT L 305, 7.11.2002, lk 57).

Kaheetapilise PCRi positiivsete tulemuste korral viiakse enne direktiivi 2006/88/EÜ artiklis 28 sätestatud esmaste tõrjemeetmete rakendamist läbi tulemuste kinnitamiseks vajalik amplikoni sekveneerimine ja kui see on praktilistes tingimustes teostatav, siis valitud vastuvõtlikel peremeesorganismidel esinevate patognoomsete viirusliku valgelaiksuse sümptomite tuvastamine histoloogilise analüüsi ja transmissioonelektronmikroskoopia abil.

taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused ja muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse valgelaiksust tekitava viiruse hävimine kasvanduses;

viirusliku valgelaiksusega nakatunud kasvandus on taasasustatud koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

viirusliku valgelaiksusega nakatunud kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

Maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust kasvandust, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses kõnealuse loetletud taudiga ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ning mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib I kategooria tervisealase staatuse taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud, et asjaomane kasvandus vastab järgmistele tingimustele:

koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus, või

kõik ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandused tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus nädalat. Kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste tühjendamise järel peab nende tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt kolme nädala vältel. Käesolevat lõiku kohaldatakse ka uute kasvanduste suhtes, mis on likvideerimisprogrammi rakendamise käigus ametlikult nakatunuks tunnistatud.

üks tervisekontroll; kasvandustes, kus jaotises i osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus perioodi vältel, mil veetemperatuur saavutab eeldatavalt aasta kõrgeima taseme, kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

merealal: kaitsetsooni ümbritsevale alale, mis hõlmab kattuvaid loodete horisontaalse ulatuse tsoone, või kaitsetsooni ümbritsevale sellise ringi sees olevale alale, mille raadius kaitsetsooni keskpunktist on 10 km, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; või

mageveekogude puhul: kogu valgalale, millel paikneb ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast, kui sellega ei ohustata viirusliku valgelaiksuse leviku tõkestamist;

mere- ja suudmealal: sellise ringi sees olevale alale, mille raadius on vähemalt üks loodete horisontaalne ulatus või vähemalt viis kilomeetrit (olenevalt sellest, kumb on suurem) ja mille keskpunktis on ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandus, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest; või

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 4. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning ametlikult viirusliku valgelaiksusega nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e ümber on loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

kasvandus on taasasustatud koorikloomadega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

tegemist on maismaakasvandusega, mille tervisealane staatus seoses viirusliku valgelaiksusega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude tervisealasest staatusest seoses kõnealuse loetletud taudiga, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3;

Asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades on tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 6.A.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on viirusliku valgelaiksuse suhtes kehtiv direktiivi 2006/88/EÜ III lisa B osa kohane III kategooria tervisealane staatus, võib kõnealuse loetletud taudi suhtes anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad selle direktiivi V lisas sätestatud asjakohastele nõuetele ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud punkti kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud järgmist kaheaastast seireprogrammi, mis hõlmab tervisekontrolle ja analüüsimiseks proovide võtmist.

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad ühtlasi olema representatiivsed taudile vastuvõtlike liikide looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide, st asjaomaste mereökosüsteemide, suudmealade, jõgikondade ja järvistute suhtes.

alapunktides a, b ja c osutatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole Bonamia ostreae nakkuse esinemine ühelgi korral kinnitust leidnud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

punkti I.2.2 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse Bonamia ostreae hävimine kasvanduses;

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes kohaldatakse katkestusperioodi, taasasustatakse molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus. Taasasustamine toimub üksnes pärast kõikide ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste punkti I.2.2 alapunkti c kohast tühjendamist, puhastamist ja desinfitseerimist ning nende suhtes kehtestatud katkestusperioodi lõppemist;

kõik ametlikult Bonamia ostreae'ga nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad tühjendatakse, sealne tegevus katkestatakse ning võimaluse korral need puhastatakse ja desinfitseeritakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus kuud.

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 3. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning eelkõige on ametlikult Bonamia ostreae'ga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e või molluskikasvatusala(de) ümber loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes või kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Bonamia ostreae nakkuse suhtes kehtiv III kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist seireprogrammi, mis hõlmab tervisekontrolle ja analüüsimiseks proovide kogumist.

alapunktides a, b ja c osutatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole Marteilia refringens'i nakkuse esinemine ühelgi korral kinnitust leidnud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

punkti I.2.2 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse Marteilia refringens'i hävimine kasvanduses;

kõik asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja molluskikasvatusalad ning kõik muud kasvandused ja molluskikasvatusalad, mille suhtes kohaldatakse katkestusperioodi, taasasustatakse molluskitega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

kaks kuud kasvanduste ja molluskikasvatusalade puhul, mille ühendus ümbritsevate veekogudega ei ole piiratud, kui taudile vastuvõtliku liigi nakatunud molluskid ja nakatunud kasvanduse või molluskikasvatusalaga epidemioloogiliselt seotud molluskid taudile vastuvõtlikust liigist on ära korjatud või eemaldatud enne aasta seda perioodi, mil Marteilia refringens'i levimus on teadaolevalt suurim, või kui see periood ei ole teada, siis enne perioodi, mil veetemperatuur tõuseb üle 17 °C;

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 3. jaos sätestatud meetmeid on tõhusalt kohaldatud ning eelkõige on ametlikult Marteilia refringens'iga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e või molluskikasvatusala(de) ümber loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes või kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on Marteilia refringens'i nakkuse suhtes kehtiv III kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes ja kõikidel molluskikasvatusaladel, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist seireprogrammi, mis hõlmab tervisekontrolle ja analüüsimiseks proovide kogumist.

kui proove võetakse molluskikasvatusalalt, võetakse valimisse molluskeid piisavast arvust proovivõtukohtadest, nii et valimis oleksid proportsionaalselt esindatud molluskikasvatusala kõik osad. Selliste proovivõtukohtade valimisel võetakse peamiste teguritena arvesse seda, millistes varasemates proovivõtukohtades on tuvastatud Marteilia refringens'it, samuti asustustihedust, veevoolu, vastuvõtlike liikide ja vektorliikide esinemist, batümeetrilisi andmeid ja kasvatustavasid. Proove võetakse ka looduslikest kasvukohtadest.

Tervisekontrollid ja vajaduse korral proovivõtmised laborianalüüsi jaoks viiakse läbi aasta sel perioodil, mil kõnealuse parasiidi levimus liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas on teadaolevalt suurim. Kui sellised andmed ei ole kättesaadavad, viiakse proovivõtmine läbi vahetult pärast seda, kui veetemperatuur on tõusnud üle 17 °C.

ISA viiruse tuvastamine RT-qPCR abil, sealhulgas HE geeni sekveneerimine, et kinnitada deletsiooni esinemist HPRis, ning

ISA viiruse tuvastamine RT-qPCR abil, sealhulgas HE geeni sekveneerimine, et kinnitada deletsiooni esinemist HPRis, ning ISA viiruse tuvastamine koepreparaatides ISA viiruse vastaste spetsiifiliste antikehade abil (st fikseeritud koelõikude immunohistokeemiline analüüs või koejäljendite kaudne immunofluorestsentsanalüüs)

proovide sõelanalüüs RT-qPCR abil, sealhulgas hemaglutiniini esteraasi (HE) geeni sekveneerimine, et kinnitada deletsiooni esinemist HPRis,

alapunktides a, b ja c osutatud meetmete kohaldamise lõpetamisele järgneva kaheaastase perioodi jooksul ei ole HPRis oleva deletsiooniga ISA viiruse esinemine ühelgi korral kinnitust leidnud ja sellekohased kahtlused on nimetatud perioodi jooksul punktis II.3 sätestatud korra kohaselt ümber lükatud.

taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid;

kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on ISA suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse ISA viiruse hävimine kasvanduses;

kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on ISA suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

Maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust kasvandust, millel on ISA suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ning mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib nimetatud staatuse taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud, et asjaomane kasvandus vastab järgmistele tingimustele:

kõik kasvandused, mis on ametlikult tunnistatud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega nakatunuks või kus ISA esinemine on ametlikult kinnitatud, ja kõik muud asjaomases kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad kasvandused, mille suhtes kohaldatakse katkestusperioodi, taasasustatakse kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on ISA suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

kõik kasvandused, mis on ametlikult tunnistatud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega nakatunuks või kus ISA esinemine on ametlikult kinnitatud, tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse vähemalt kolmeks kuuks. Kaitse- ja seiretsooni võib tühistada, kui kõik kaitsetsoonis olevad kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende tegevus on olnud üheaegselt katkestatud vähemalt kuue nädala vältel.

üks tervisekontroll; kasvandustes, kus jaotises i osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus, kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

rannikul: kaitsetsooni ümbritsevale alale, mis hõlmab kattuvaid loodete horisontaalse ulatuse tsoone, või kaitsetsooni ümbritsevale sellise ringi sees olevale alale, mille raadius kaitsetsooni keskpunktist on 10 km, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest;

sisemaal: kogu valgalale, millel paikneb ametlikult ISAga nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast, kui sellega ei ohustata ISA leviku tõkestamist;

rannikul: sellise ringi sees olevale alale, mille raadius on vähemalt üks loodete horisontaalne ulatus või vähemalt viis kilomeetrit (olenevalt sellest, kumb on suurem) ja mille keskpunktis on ametlikult ISAga nakatunuks tunnistatud kasvandus, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest;

Sellise isoleeritud ala kindlaksmääramisel peab olema lähtutud konkreetse juhu analüüsist ning võetud seejuures muu hulgas arvesse järgmisi riskitegureid, mis mõjutavad ISA levimist kasvatatavatele või looduslikele kaladele: surnud kalade arv, osakaal ja jaotus kasvandus(t)es, mis on nakatunud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega või milles ISA esinemine on kinnitust leidnud; naabruses asuvate kasvanduste kaugus ja arv; tapamajade lähedus; nakkusega kokkupuutunud kasvandused; kasvandus(t)es olevad liigid; nakatunud kasvandus(t)es ja naabruses asuvates kasvandustes kohaldatavad kasvatustavad; hüdrodünaamilised tingimused ja muud tuvastatud epidemioloogiliselt olulised tegurid.

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 3. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning eelkõige on sellis(t)e kasvandus(t)e ümber, mis on ametlikult tunnistatud HPRis oleva deletsiooniga ISA viirusega nakatunuks või milles ISA esinemine on ametlikult kinnitatud, loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on ISA suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud likvideerimisprogrammi, mis vastab alapunktide a–e nõuetele:

asjaomastes kasvandustes ja proovivõtukohtades on tervisekontrolle tehtud ja proove võetud vähemalt kahe järjestikuse aasta vältel, nagu on sätestatud II jao tabelis 3.A;

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on ISA suhtes kehtiv direktiivi 2006/88/EÜ III lisa B osa kohane III kategooria tervisealane staatus, võib kõnealuse loetletud taudi suhtes anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad selle direktiivi V lisas sätestatud asjakohastele nõuetele ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral kõnealuse V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud punkti kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud järgmist seireprogrammi:

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad ühtlasi olema representatiivsed taudile vastuvõtlike looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide suhtes.

Seirekava KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse säilitamiseks liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas, kus kasvanduste arv on piiratud ja nende suunatud seire ei võimalda saada piisaval hulgal epidemioloogilisi andmeid, nagu on osutatud punktis I.3

taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid.

kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse KHV hävimine kasvanduses;

Sellises maismaapiirkonnas, kus KHV nakkuse suhtes on kehtestatud I kategooria tervisealane staatus ja mis hõlmab ühte või mitut kasvandust, mille tervisealane staatus seoses KHV nakkusega sõltub ümbritsevate looduslike veekogude tervisealasest staatusest seoses selle loetletud taudiga, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 2, tehakse tervisekontrolli sagedusega, mis vastab eespool nimetatud tabelis 2.C kõrge ohutaseme jaoks sätestatud kontrollide arvule.

kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on I kategooria tervisealane staatus, või piirkonnast, kus KHV nakkuse tuvastamiseks rakendatakse II kategooria tervisealase staatuse kohast heakskiidetud seireprogrammi.

kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

Maismaapiirkonnas, mis hõlmab ühtainust kasvandust, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses KHV nakkusega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ning mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib I kategooria tervisealase staatuse seoses KHV nakkusega taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud, et asjaomane kasvandus vastab järgmistele tingimustele:

kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus, või

kõik ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandused tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus nädalat. Kõikide samas kaitsetsoonis asuvate ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste tühjendamise järel peab nende tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt kolme nädala vältel. Käesolevat lõiku kohaldatakse ka uute kasvanduste suhtes, mis on likvideerimisprogrammi rakendamise käigus ametlikult nakatunuks tunnistatud.

üks tervisekontroll; kasvandustes, kus punktis III.2 osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus ajavahemiku vältel, mil veetemperatuur on eeldatavalt > 15 °C, kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

kaitsetsoon kehtestatakse ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvanduse vahetus läheduses ja see vastab kogu valgalale, millel paikneb ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast, kui sellega ei ohustata KHV nakkuse leviku tõkestamist;

direktiivi 2006/88/EÜ V peatüki 4. jaos sätestatud minimaalseid tõrjemeetmeid on tõhusalt kohaldatud ning ametlikult KHVga nakatunuks tunnistatud kasvandus(t)e ümber on loodud kõnealuse direktiivi artikli 32 punktis b osutatud isoleeritud ala, mis hõlmab kaitsetsooni ja seiretsooni.

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv V kategooria tervisealane staatus, võib seoses kõnealuse loetletud taudiga anda I kategooria tervisealase staatuse, kui asjaomase liikmesriigi, tsooni või piirkonna kõikides kasvandustes, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, on rakendatud vähemalt järgmist likvideerimisprogrammi:

kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

tegemist on maismaakasvandusega, mille tervisealane staatus seoses KHV nakkusega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude veeloomapopulatsioonide tervisealasest staatusest seoses kõnealuse loetletud taudiga, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3;

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on KHV nakkuse suhtes kehtiv III kategooria tervisealane staatus, võib anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse direktiivi 2006/88/EÜ IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad taudivaba staatuse saamise nõuetele, mis on sätestatud selle direktiivi V lisas, ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral kõnealuse lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud osa kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud ühte järgmistest seireprogrammidest:

Võimaluse korral tuleks proovid võtta kaladelt, keda on pikemat aega – kaks kuni kolm nädalat – hoitud viirusega nakatumist võimaldavas temperatuurivahemikus 15–26 °C. Siiski on vastuvõetav ka järgmine lähenemisviis:

Kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad ühtlasi olema representatiivsed taudile vastuvõtlike looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide, st asjaomaste jõgikondade ja järvede suhtes.

taasasustamine on toimunud alles pärast seda, kui kõik ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning nende suhtes on kohaldatud katkestusperioodi või alapunkti a kohaseid muid meetmeid.

kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandused ja muud kasvandused, mille tegevus on katkestatud või kus on kohaldatud alapunkti a kohaseid muid meetmeid, on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv I, II või III kategooria tervisealane staatus;

punkti I.2.2.1 alapunktides a, b ja c sätestatud nõuded on täidetud. Kui tegevuse katkestamine ei ole tehniliselt võimalik, kohaldatakse asjaomaste kasvanduste suhtes mõnda muud meedet, millega peaaegu samal määral tagatakse IHNi ja/või VHSi viiruste hävimine kasvanduses;

Sellises maismaapiirkonnas, kus VHSi ja/või IHNi suhtes on kehtestatud I kategooria tervisealane staatus ja mille tervisealane staatus seoses VHSi ja/või IHNiga sõltub ümbritsevate looduslike veekogude veeloomapopulatsioonide tervisealasest staatusest, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 2, tuleb tervisekontrolli sageduse kindlaksmääramisel pidada VHSi ja/või IHNiga nakatumise riski suureks.

asjaomane ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus on taasasustatud kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

asjaomane ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

Ühtainust varem IHNi- ja/või VHSi-vabaks tunnistatud kasvandust hõlmavas maismaapiirkonnas, mille tervisealane staatus seoses kõnealuste loetletud taudidega ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude omast, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3, ja mille I kategooria tervisealane staatus on tühistatud kooskõlas nimetatud direktiivi artikli 53 lõikega 3, võib I kategooria tervisealase staatuse taastada kohe pärast seda, kui pädev asutus on kinnitanud vastavust järgmistele tingimustele:

kõik ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandused ja alapunktis c osutatud kõik kehtestatud kaitse- või seiretsoonis asuvad muud kasvandused, mille tegevus katkestatakse, taasasustatakse kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv taudivaba (I kategooria) staatus.

kõik ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandused tühjendatakse, puhastatakse ja desinfitseeritakse ning nende tegevus katkestatakse. Katkestusperioodi kestus on vähemalt kuus nädalat. Kõikide samas kaitsetsoonis asuvate ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvanduste tühjendamise järel peab nende tegevus olema üheaegselt katkestatud vähemalt kolme nädala vältel. Käesolevat lõiku kohaldatakse ka uute kasvanduste suhtes, mis on likvideerimisprogrammi rakendamise käigus ametlikult nakatunuks tunnistatud.

üks tervisekontroll; kasvandustes, kus jaotises i osutatud analüüside tulemused on negatiivsed, jätkatakse tervisekontrolli tegemist kord kuus ajavahemiku vältel, mil veetemperatuur on alla 14 °C (välja arvatud ajal, mil kalatiigid või sumbad on jääga kaetud), kuni kaitsetsoon vastavalt punkti I.2.2.1 alapunktile c tühistatakse;

rannikul: kaitsetsooni ümbritsevale alale, mis hõlmab kattuvaid loodete horisontaalse ulatuse tsoone, või kaitsetsooni ümbritsevale sellise ringi sees olevale alale, mille raadius kaitsetsooni keskpunktist on 10 km, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest;

sisemaal: kogu valgalale, millel paikneb ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus; pädev asutus võib vähendada tsooni ulatust nii, et see hõlmaks osa valgalast või kasvanduse ala, kui sellega ei ohustata VHSi ja/või IHNi leviku tõkestamist;

rannikul: sellise ringi sees olevale alale, mille raadius on vähemalt üks loodete horisontaalne ulatus või vähemalt viis kilomeetrit (olenevalt sellest, kumb on suurem) ja mille keskpunktis on ametlikult VHSi ja/või IHNiga nakatunuks tunnistatud kasvandus, või samaväärsele alale, mis on piiritletud lähtuvalt asjakohastest hüdrodünaamilistest või epidemioloogilistest andmetest;

kasvandus taasasustatakse kaladega, kes on pärit liikmesriigist, tsoonist või piirkonnast, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv I kategooria tervisealane staatus.

kasvandus on tühjendatud, puhastatud ja desinfitseeritud ning selle suhtes on kohaldatud katkestusperioodi, mille kestus on vähemalt kuus nädalat;

tegemist on maismaakasvandusega, mille tervisealane staatus seoses VHSi ja/või IHNiga ei sõltu ümbritsevate looduslike veekogude veeloomapopulatsioonide tervisealasest staatusest seoses kõnealuste loetletud taudidega, nagu on sätestatud direktiivi 2006/88/EÜ V lisa II osa punktis 3;

Liikmesriigile, tsoonile või piirkonnale, millel on VHSi ja/või IHNi suhtes kehtiv direktiivi 2006/88/EÜ III lisa B osas osutatud III kategooria tervisealane staatus, võib kõnealuste loetletud taudide suhtes anda I kategooria tervisealase staatuse, kui kõik asjaomases liikmesriigis, tsoonis või piirkonnas asuvad kasvandused, kus kasvatatakse nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud vastuvõtlikke liike, vastavad selle direktiivi V lisas sätestatud nõuetele ning kui kõikides sellistes kasvandustes ja vajaduse korral kõnealuse direktiivi V lisa I osa punkti 2 teise lõigu kohaselt nõutavates ja nimetatud osa kohaselt looduslikes populatsioonides valitud proovivõtukohtades on rakendatud ühte järgmistest seireprogrammidest:

kui vastavalt direktiivi 2006/88/EÜ V lisa I osa punkti 2 teisele lõigule on nõutav looduslike populatsioonide suunatud seire, määratakse proovivõtukohtade arv ja geograafiline jaotus kindlaks nii, et saavutataks liikmesriigi, tsooni või piirkonna piisav kaetus. Proovivõtukohad peavad olema taudile vastuvõtlike liikide looduslike populatsioonide elupaigaks olevate eri ökosüsteemide suhtes representatiivsed;

tervisekontroll ja vajaduse korral proovivõtmine viiakse läbi perioodil, mil veetemperatuur on alla 14 °C või mil see saavutab eeldatavalt aasta madalaima taseme;

e) nakkusega kokkupuutunud kasvandus– veeloomakasvandus, mille kohta on tõendeid või mille puhul on tõsine kahtlus, et see on saastunud ametlikult nakatunuks tunnistatud kasvandusest pärit nakkusohtliku materjaliga.

c) maismaatsoon– ühe või mitme liikmesriigi maismaaosas asuv geograafiliselt täpselt piiritletud ala homogeense hüdroloogilise süsteemiga, mis koosneb valgala osadest alates allika(te)st kuni loodusliku või kunstliku tõkkeni, mis takistab veeloomade rännet valgala allavoolu jäävatest lõikudest ülesvoolu, või tervest valgalast alates selle allika(te)st kuni suudmeni või mitmest valgalast koos nende suudmetega, kui valgalad on suudme kaudu epidemioloogiliselt seotud.

II LISA

ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I. Sissejuhatus

Käesolevas lisas nähakse ette üksikasjalik kord selliste diagnostikameetodite kohaldamiseks, mida tuleb kasutada käesoleva rakendusotsuse I lisas sätestatud likvideerimis- ja seireprogrammide raames tehtavates laboriuuringutes, et direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaselt kinnitada nimetatud direktiivi IV lisa II osas loetletud järgmiste mitteeksootiliste taudide (edaspidi „loetletud taudid”) esinemise kahtlust või sellist kahtlust ümber lükata:

1. viiruslik hemorraagiline septitseemia (VHS) 1. osa 2. nakkuslik vereloomenekroos (IHN) 1. osa 3. karpkalade herpesviirus (KHV) 2. osa 4. lõhede infektsioosne aneemia (ISA) 3. osa 5. Marteilia refringens'i nakkus 4. osa 6. Bonamia ostreae nakkus 5. osa 7. viiruslik valgelaiksus 6. osa.

II. Mõisted

Käesolevas lisas kasutatakse järgmist mõistet:

transpordisööde– rakukultuurisööde, mis sisaldab 10 % vasikaseerumit ning 200 RÜ penitsilliini, 200 μg streptomütsiini ja 200 μg kanamütsiini milliliitri kohta või muid tõendatud tõhususega antibiootikume.

1. OSA

IHNi JA VHSi SEIREKS JA NENDE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I. VHSi ja IHNi seireks kasutatavad diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 1. osa punktides II.1 ja II.2 sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 1. osa I jao kohaseks IHNi või VHSi suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks järgmisi punktides I.1–I.6 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1. Kaladelt proovide võtmine ja proovide saatmine

I.1.1. Koed viroloogiliseks analüüsiks rakukultuuris

Enne laborisse saatmist või edastamist eemaldatakse steriilsete lahkamisriistade abil kaladelt uuritavate elundite tükid ja pannakse need transpordisöödet sisaldavasse steriilsesse plastkatsutisse.

Rakukultuuris tehtavaks viroloogiliseks analüüsiks ja RT-qPCRi jaoks võetava materjali kogus sõltub kala suurusest. Kogutavad koed on vastsete puhul (kehapikkus < 4 cm) terve vastne, 4–6 cm pikkuste kalade puhul sisikond koos neerudega ning suuremate kalade puhul neerud, põrn, süda ja/või peaaju ja kudemisajal sugukalade ovariaalvedelik.

Ühte steriilsesse katsutisse, mis sisaldab vähemalt 4 ml transpordisöödet, võib koguda kuni 10 kala ovariaal- või seemnevedeliku või elunditükid, mis moodustavad ühe koondproovi. Koe mass igas proovis on vähemalt 0,5 grammi.

Viroloogilist analüüsi rakukultuuris alustatakse niipea kui võimalik ning hiljemalt 48 tundi pärast proovide kogumist. Erandjuhul võib viroloogilist analüüsi alustada hiljemalt 72 tundi pärast materjali kogumist, kui uuritavat materjali kaitseb transpordisööde ja transpordi ajal on võimalik järgida asjaomaseid temperatuurinõudeid.

I.1.2. Proovid pöördtranskriptsiooniga polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR või RT-qPCR) abil analüüsimiseks

Kaladelt võetakse proovid steriilse instrumendiga vastavalt punktis I.1.1 kirjeldatud korrale ja pannakse transpordisöödet sisaldavasse steriilsesse plastkatsutisse. Ühte katsutisse võib koguda 10 kalalt võetud koeproovid, mis moodustavad ühe koondproovi. Kui inokulumi maht on väike, võib siiski koondada vaid kuni viielt kalalt võetud koeproovid. Teise võimalusena võib proovid koguda RNAd stabiliseerivasse lahusesse nii, et koematerjali sisaldus lahuses oleks tootja soovituse kohaselt 0,2 g/ml; sel juhul käideldakse iga kala koematerjali eraldi ja eri kalade kudesid ei koondata, kuna eraldamiseks kasutatava materjali kogus on väike.

Laborisse võib saata ka terveid kalu.

I.2. Kaladelt võetud proovide saatmine

Transpordisöötmega katsutid, mis sisaldavad rakukultuuris või RT-PCRi või RT-qPCRi abil analüüsimiseks ette nähtud kalakudesid, pannakse soojusisolatsiooniga konteinerisse, näiteks paksuseinalisse polüstüreenkasti koos piisava koguse jääga või muu sarnase jahutava toimega jahutusainega, et tagada laborisse transportimise ajal proovi püsimine jahutatuna. Samas on vaja ära hoida proovi külmumist. Proovi temperatuur ei tohi transpordi ajal hetkekski tõusta üle 10 °C ning saadetise vastuvõtmise ajal peab transpordikastis veel jääd olema või peab vähemalt üks jahutusplokk olema vähemalt osaliselt külmunud.

Laborisse võib saata terveid kalu, kui transpordi ajal on võimalik järgida esimeses lõigus osutatud temperatuurinõudeid. Terved kalad mähitakse imavasse paberisse ning need saadetakse teele plastkotis. Võib saata ka elusaid kalu.

I.3. Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Asjaomase diagnostikalabori heakskiidul võib täiendavateks uuringuteks koguda ja ette valmistada ka muid kalakudesid.

I.4. Proovide ettevalmistamine rakukultuuris analüüsimiseks ja RT-qPCRi jaoks

I.4.1. Külmutamine erandjuhul

Praktiliste raskuste korral, mis teevad proovi käitlemise kalakudede kogumisele järgneva 48 tunni jooksul võimatuks, võib olla vastuvõetav külmutada koeproov transpordisöötmes – 20 °C juures või madalamal temperatuuril ning teha viroloogiline analüüs 14 päeva jooksul. Kalakude külmutatakse ja sulatatakse enne analüüsimist vaid korra. Kalade koeproovide iga külmutamine registreeritakse koos sellekohase üksikasjaliku põhjendusega.

I.4.2. Elundite homogeniseerimine

Katsutis olev kude homogeniseeritakse laboris täielikult stomahheri, segisti või uhmri, nuia ja steriilse liivaga ning suspendeeritakse seejärel algses transpordisöötmes.

Kui proov koosneb alla 4 cm pikkustest tervetest kaladest, tükeldatakse need steriilsete kääride või skalpelliga pärast seda, kui pärakust tahapoole jääv keha osa on eemaldatud. Kui proov koosneb tervetest kaladest pikkusega 4–6 cm, kogutakse sisikond koos neerudega. Kui proov koosneb üle 6 cm pikkustest tervetest kaladest, kogutakse koematerjal punktis I.1 kirjeldatud viisil. Koematerjal tükeldatakse steriilsete kääride või skalpelliga, homogeniseeritakse käesoleva punkti esimeses lõigus kirjeldatud viisil ja suspendeeritakse transpordisöötmes.

Koematerjali ja transpordisöötme vahekorda reguleeritakse laboris nii, et nende lõplik suhe oleks 1:10.

I.4.3. Homogenaadi tsentrifuugimine

Homogenaati tsentrifuugitakse 15 minutit jahutatud tsentrifuugis temperatuuril 2–5 °C kiirendusel 2 000–4 000 g, kogutakse supernatant ja töödeldakse seda vajaduse korral antibiootikumidega neli tundi temperatuuril 15 °C või öö läbi temperatuuril 4–8 °C. Kui proovi transporditakse transpordisöötmes, võib supernatandi töötlemise antibiootikumidega ära jätta.

Kui ilmnevad praktilised raskused, näiteks inkubaatoririke või probleemid rakukultuuridega, mistõttu rakkude nakatamine 48 tunni jooksul pärast kaladelt koeproovide kogumist ei ole võimalik, võib supernatandi külmutada temperatuuril – 80 °C ning teha viroloogilise analüüsi 14 päeva jooksul.

Kui kogutud supernatant külmutatakse 48 tunni jooksul pärast proovivõtmist temperatuuril – 80 °C, võib seda viroloogiliseks analüüsiks uuesti kasutada vaid ühe korra.

Enne rakkude nakatamist segatakse supernatant võrdse osa nakkusliku pankrease nekroosi (IPN) viiruse kohalike serotüüpide vastaste antiseerumite sobivalt lahjendatud koondprooviga ning segu inkubeeritakse vähemalt tund aega 15 °C juures või maksimaalselt 18 tundi 4 °C juures. Antiseerumi tiiter peab 50 % plaagide neutraliseerimise katse kohaselt olema vähemalt 1/2 000.

Kõiki inokulume töödeldakse IPNi viiruse vastase antiseerumiga selleks, et hoida ära IPNi viirusest põhjustatud tsütopaatilise efekti ilmnemist inokulumiga nakatatud rakukultuurides. Sellega lühendatakse viroloogilise analüüsi kestust ja vähendatakse nende juhtude arvu, mille puhul tsütopaatilise efekti ilmnemist tuleb pidada VHSi või IHNi viiruse võimaliku esinemise märgiks.

Kui proovid on pärit tootmisüksusest, mida peetakse IPNi-vabaks, võib inokulumide töötlemise IPNi viiruse vastase antiseerumiga ära jätta.

I.4.4. Proovide ettevalmistamine RT-PCRil või RT-qPCRil põhinevate seireprogrammide puhul

Kui proovid on kogutud transpordisöötmesse, viiakse läbi punktides I.4.2 ja I.4.3 ette nähtud toimingud. Pärast tsentrifuugimist kogutakse supernatant ja eraldatakse RNA. Kui edasine analüüs ei toimu kohe pärast tsentrifuugimist, külmutatakse proovid viivitamata – 20 °C juures või madalamal temperatuuril.

RNAd stabiliseerivas lahuses olevate kalakudede analüüsimisel tehakse edasised toimingud proovide säilitustemperatuurist olenevalt järgmise ajavahemiku jooksul:

37 °C juures säilitatavad proovid: ühe päeva jooksul;

25 °C juures säilitatavad proovid: ühe nädala jooksul;

4 °C juures säilitatavad proovid: ühe kuu jooksul;

– 20 °C juures säilitatavad proovid: mis tahes ajal.

RNAd stabiliseerivas lahuses olevat koondproovi käsitatakse kui RNAd stabiliseerivas lahuses olevat üksikproovi. RNAd stabiliseerivas lahuses oleva koondproovi maht ei tohi ületada RNA eraldamise komplekti tootja, näiteks RNeasy Mini komplekti tootja (Qiagen) soovituse kohast mahtu. Suurema mahuga proovide koondamisel tuleb kasutatava eraldamiskomplekti või -meetodi puhul arvesse võtta koondproovi mahtu.

RNAd stabiliseerivasse lahusesse kogutud proove ei kasutata rakukultuuris.

I.4.5. Proovide koondamine RT-qPCRi jaoks

Kuna esitatud RT-qPCRi meetodite tundlikkus on rakukultuuri meetoditega võrreldes sarnane või suurem, võib olla vastuvõetav kasutada PCRi jaoks kuni 10 kalalt võetud elundite koondproovist pärit homogeniseeritud koematerjalist saadud supernatanti. Kuna PCRi jaoks kasutatav inokulum on rakukultuuris kasutatavaga võrreldes palju väiksem, tuleb kõik kalakoed enne eraldamiseks võetava materjali koondamist hoolikalt homogeniseerida.

Seda põhimõtet kohaldatakse ka RNAd stabiliseerivasse lahusesse kogutavate proovide suhtes. Sel juhul on sageli siiski raske koguda kuni 10 kalalt võetud representatiivne koematerjal ühte katsutisse ja seepärast vähendatakse koondproovis esindatud kalade arvu 2–5 kalani.

I.5. Viroloogiline analüüs rakukultuuris

I.5.1. Rakukultuurid ja söötmed

Päikeseahvena Lepomis macrochirus vastsete rakuliini BF-2 ja vikerforelli sugunäärmerakkude liini RTG-2 ning rakuliini Epithelioma papulosum cyprini (EPC) või pakspea-lepamaimu rakuliini FHM kasvatatakse 20–30 °C juures sobivas söötmes, täpsemalt Eagle'i minimaalsöötmes (MEM) või selle modifikatsioonis, kuhu on lisatud 10 % veiselooteseerumit ja tavapärases kontsentratsioonis antibiootikume.

Kui rakke kasvatatakse suletud pudelites, puhverdatakse söödet vesinikkarbonaadiga. Lahtistes nõudes rakkude kasvatamiseks kasutatavat söödet võib puhverdada tris(hüdroksümetüül)aminometaanvesinikkloriidi (Tris-HCl) (23 mM) ja naatriumvesinikkarbonaadiga (6 mM). Söötme pH peab olema 7,6 ± 0,2.

Kaladelt saadud koematerjaliga nakatamiseks kasutatav rakukultuur peab võimaluse korral olema noor, üldjuhul ühe päeva vanune ühekihiline kultuur; vastuvõetav kultuuri vanus võib siiski olla 4–48 tundi. Rakud peavad nakatamise ajal aktiivselt kasvama.

I.5.2. Rakukultuuride nakatamine

Rakukultuuride nakatamisel antibiootikumidega töödeldud elundisuspensiooniga kasutatakse homoloogilise interferentsi ärahoidmiseks kahte lahjendusastet: esmast lahjendust ja selle 1:10 lahjendamisel saadud täiendavat lahjendust, nii et koematerjali lõpplahjendus rakukultuurisöötmes on vastavalt 1:100 ja 1:1 000. Nakatamiseks kasutatakse vähemalt kahte punktis I.5.1 osutatud rakuliini. Inokulumi mahu ja rakukultuurisöötme ruumala suhe peab olema umbes 1:10.

Iga lahjenduse ja iga rakuliini kohta kasutatakse vähemalt 2 cm2 suurust rakkudega kaetud ala, mis vastab 24-kannulise rakukultuuriplaadi ühe kannu põhjapindalale. Võimaluse korral kasutatakse rakukultuuriplaate.

I.5.3. Rakukultuuride inkubeerimine

Nakatatud rakukultuure inkubeeritakse 7–10 päeva 15 °C juures. Kui rakukultuurisöötme värv muutub punasest kollaseks, mis on märk söötme hapestumisest, reguleeritakse pH-d steriilse vesinikkarbonaadi lahusega või samaväärse ainega, et tagada rakkude vastuvõtlikkus viirusnakkusele.

Vähemalt iga kuue kuu järel või kui kahtlustatakse rakkude vastuvõtlikkuse vähenemist, kontrollitakse rakukultuuride vastuvõtlikkust nakkusele VHSi ja IHNi viiruse külmutatud põhilahuse tiitrimise teel. Võimaluse korral kohaldatakse III jaos sätestatud korda.

I.5.4. Mikroskoopia

Nakatatud rakukultuure kontrollitakse korrapäraselt vähemalt kolm korda nädalas tsütopaatilise efekti esinemise suhtes 40- kuni 150-kordsel suurendusel. Kui täheldatakse ilmset tsütopaatilist efekti, alustatakse viivitamata viiruse tuvastamist vastavalt punktile I.6.

I.5.5. Subkultuuride loomine

Kui 7–10 päeva kestnud esimese inkubeerimise järel ei ole ilmnenud tsütopaatilist efekti, luuakse subkultuurid värsketest rakukultuuridest, mida kasvatatakse primaarkultuuri kasvupinnaga sarnase suurusega alal.

Kõikides primaarkultuuri sisaldavates kultuurides või kannudes olevatest söötme (supernatandi) alikvootidest moodustatakse 7–10 päeva pärast nakatamist iga rakuliini puhul koondproov. Saadud koondprooviga nakatatakse homoloogilisi rakukultuure proovi eelnevalt lahjendamata ja 1:10 lahjendatuna (supernatandi lõpplahjendus vastavalt 1:10 ja 1:100), nagu on kirjeldatud punktis I.5.2. Teise võimalusena viiakse primaarkultuuri söötme 10 % suurune alikvoot otse värsket rakukultuuri sisaldavasse kannu (subkultuuri loomine kannust kannu tõstmisega). Enne nakatamist võib lahuseid eelnevalt inkubeerida IPNi viiruse vastase sobivalt lahjendatud antiseerumiga, nagu on kirjeldatud punktis I.4.3.

Seejärel inkubeeritakse nakatatud kultuure 7–10 päeva 15 °C juures ja neid jälgitakse punkti I.5.4 kohaselt.

Kui toksiline tsütopaatiline efekt ilmneb inkubeerimise esimese kolme päeva jooksul, luuakse subkultuur juba sel ajal, kuid sellisel juhul inkubeeritakse rakke seitse päeva ja pärast seda luuakse uus subkultuur, mida inkubeeritakse veel seitse päeva. Kui toksiline tsütopaatiline efekt ilmneb pärast kolme päeva möödumist, vahetatakse rakke ühe korra ja inkubeerimine kestab esimesest nakatamisest alates kokku 14 päeva. Inkubeerimise viimase seitsme päeva jooksul ei tohi toksilisust ilmneda.

Kui kultuur saastub bakteritega antibiootikumidega töötlemisest hoolimata, tsentrifuugitakse supernatanti enne subkultuuri loomist 15–30 minutit 2 000–4 000 g juures temperatuuril 2–5 °C ja/või filtritakse see läbi 0,45 μm suuruste pooridega filtri, mille membraan seob vähe valke. Peale selle järgitakse subkultuuri loomisel käesoleva punkti neljandas lõigus seoses toksilise tsütopaatilise efektiga kirjeldatud korda.

Kui tsütopaatilist efekti ei täheldata, võib katsetulemuse lugeda negatiivseks.

I.6. Viiruse tuvastamine

Kui rakukultuuris täheldatakse tsütopaatilist efekti, kogutakse sööde (supernatant) kokku ja selle analüüsimiseks kasutatakse ühte või mitut järgmistest meetoditest: ensüümimmuunsorptsioonanalüüs (ELISA), immunofluorestsentsanalüüs, neutraliseerimine, RT-PCR ja RT-qPCR. Kui kõnealuste meetoditega ei ole ühe nädala jooksul suudetud viirust kindlalt tuvastada, saadetakse supernatant viiruse koheseks tuvastamiseks kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.

I.6.1. ELISA

Viiruse isolaadi tuvastamiseks tehakse kihttehnikal põhinev kahe antikehaga ELISA. Mikrotiiterplaadi pind kaetakse IHNi või VHSi viiruse vastasest küüliku antiseerumist proteiin A abil puhastatud tõendatud kvaliteediga immunoglobuliinidega, mis on lahjendatud naatriumasiidi kontsentratsioonis 15 mM sisaldavas karbonaatpuhvris (pH 9,6) nii, et igasse kannu lisatakse 0,9 pg antikehi 50 μl lahuses, ning plaati inkubeeritakse 4 °C juures 18 tundi kuni 2 nädalat.

Igast proovist, mis sisaldab 1 % Triton X-100, ja positiivsetest kontrollidest tehakse lahjendusplaadil puhverlahuses PBS-T-BSA (fosfaadiga puhverdatud soolalahus (PBS), mis sisaldab 1 % veise seerumi albumiini (BSA)) neljakordsed lahjendused: lahjendamata, 1:4, 1:16 ja 1:64. ELISA plaati pestakse PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween-20 (PBS-T), ning antikehadega kaetud ja pestud ELISA plaadile kantakse lahjendusplaadilt igast lahjendusest 50 μl.

ELISA plaati inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures. Seejärel plaati pestakse ja seda inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 °C spetsiifilise monoklonaalse antikehaga (VHSi viiruse tuvastamiseks monoklonaalse antikehaga IP5B11 ja IHNi viiruse tuvastamiseks Hyb 136–3). ELISA plaadile kantakse 50 μl hiire antikehade vastaste mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud küüliku antikehade lahust, mis on valmistatud PBS-T-BSAs lahjendusel 1:1 000.

Lõpuks lisatakse pärast uuesti pesemist värvusreaktsiooni esilekutsumiseks 50 μl o-fenüleendiamiini (OPD) lahust kannu kohta. ELISA plaati inkubeeritakse 20 minutit pimedas toatemperatuuril ja reaktsiooni peatamiseks lisatakse 100 μl 0,5 M H2SO4 kannu kohta.

Neeldumist mõõdetakse ELISA plaadilugejas lainepikkustel 492 ja 620 nm. Proov loetakse positiivseks või negatiivseks pärast katsetulemuste võrdlemist positiivse ja negatiivse kontrolli neeldumisnäitajatega. Proov, mille lahjendamata materjali puhul on summaarne neelduvus (A) < 0,5, loetakse üldjuhul negatiivseks, proov, mille puhul A on vahemikus 0,5–1,0, loetakse kahtlustäratavaks ning proov, mille puhul A > 1,0, loetakse positiivseks.

Käesolevas punktis kirjeldatud meetodi asemel võib kasutada mõnda muud tõendatud tõhususega ELISA meetodit.

I.6.2. Immunofluorestsentsanalüüs

Loetletud patogeenide hulka kuuluvate VHSi viiruse ja IHNi viiruse tuvastamiseks nakatatakse musta värvi 96-kannulisel plaadil, tavalisel 24-kannulisel plaadil või 24-kannulisse plaati asetatud katteklaasil kasvatatavaid rakke. Kui IHNi viiruse ja/või VHSi viiruse tuvastamiseks nakatatakse rakke katteklaasil, kohaldatakse järgmist meetodit:

a) katteklaasile viiakse selline kogus rakke, et pärast 24 tunni pikkust kultiveerimist oleks rakukiht 60–90 % ulatuses konfluentne. Selleks otstarbeks kasutatakse võimaluse korral EPC rakke, sest need kinnituvad tugevalt klaaspinnale, kuid võib kasutada ka mõnda muud rakuliini, näiteks BF-2, RTG-2 või FHMi. Ühe päeva vanuse ühekihilise rakukultuuri nakatamiseks lisatakse kahe paralleelproovina 150 μl rakukultuuri supernatanti kahes eri lahjenduses (1:10 ja 1:1 000) ning rakke inkubeeritakse 24 tundi 15 °C juures;

b) seejärel eemaldatakse rakukultuurisööde ja nakatatud ühekihilise kultuuri rakud fikseeritakse 0,5 ml jääkülma atsetooni vesilahusega (80-mahuprotsendiline). Fikseerimine toimub tõmbekapis toatemperatuuril 15 minuti vältel; seejärel atsetoonilahus eemaldatakse ja katteklaasil lastakse vähemalt 30 minutit õhu käes kuivada. Selle etapi järel jätkatakse kohe rakkude töötlemist või külmutatakse need – 20 °C juures hilisemaks analüüsimiseks;

c) spetsiifiline monoklonaalne antikeha (VHSi viiruse tuvastamisel IP5B11 ja IHNi viiruse tuvastamisel Hyb 136–3) lahjendatakse 0,01 M PBSis, mis sisaldab 0,05 % Tween-20 (PBS-T) ja mille pH on 7,2; seejuures kasutatakse asjaomase antikeha tarnija soovitatavat lahjendust. Fikseeritud ühekihilisele kultuurile lisatakse 50–100 μl antikehalahust ja plaati inkubeeritakse niiskes kambris tund aega 37 °C juures;

d) katteklaasi pestakse ettevaatlikult kolm korda PBS-T-ga ja pärast viimast loputamist eemaldatakse puhverlahus täielikult. Seejärel inkubeeritakse rakke tund aega temperatuuril 37 °C primaarse antikehana kasutatud hiire immunoglobuliini vastase, tarnija juhiste kohaselt lahjendatud antikehaga, mis on konjugeeritud fluorestseiinisotiotsüanaadi (FITC) või tetrametüülrodamiin-5-(ja 6-)isotiotsüanaadiga (TRITC), ning rakke pestakse taas PBS-T-ga ja neil lastakse kuivada. Sel viisil värvitud kultuur asetatakse glütserooli sisaldava soolalahuse abil alusklaasile ja seda analüüsitakse kaldnurga all saabuvas ultraviolettkiirguses. Kasutatakse 10- või 12-kordse suurendusega okulaare ja 25- või 40-kordse suurendusega objektiivi, mille numbriline apertuur on vastavalt > 0,7 või > 1,3.

Eespool kirjeldatu asemel võib rakukultuuride, fikseerimise ja standardkvaliteediga antikehadega seoses kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega immunofluorestsentsanalüüsi meetodit.

I.6.3. Neutraliseerimine

Kogutud supernatandist eraldatakse rakud tsentrifuugimise teel (2 000–4 000 g) või filtrimisega läbi membraani (0,45 μm), mis seob vähe valke, ning supernatandist tehakse rakukultuurisöötmes lahjendused 1:100 ja 1:10 000.

Supernatandi vähemalt kahe lahjenduse alikvoot segatakse eraldi võrdse osa allpool loetletud reaktiividega ja segu inkubeeritakse 60 minutit 15 °C juures:

a) ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud seerum, mis sisaldab rühmaspetsiifilist VHSi viiruse vastast antikeha;

b) ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud seerum, mis sisaldab rühmaspetsiifilist IHNi viiruse vastast antikeha;

c) ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud segu IPNi viiruse kohalike serotüüpide vastastest antiseerumitest;

d) ainult sööde (positiivne kontroll).

Viirust sisaldava supernatandi ja seerumi iga seguga nakatatakse vähemalt kaks rakukultuuri igale kultuurile 50 μl segu lisamise teel ning kultuure inkubeeritakse 15 °C juures. Tsütopaatilise efekti ilmnemist kontrollitakse punktis I.5.4 kirjeldatud viisil.

Sellised VHSi viiruse tüved ja isolaadid, mis neutraliseerimiskatses antikehaga ei reageeri, tuvastatakse immunofluorestsentsanalüüsi või ELISA abil.

Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega neutraliseerimismeetodit.

I.6.4. RT-PCR ja RT-qPCR

I.6.4.1. Viiruse RNA eraldamine

Kõik toimingud RNA eraldamiseks tehakse jääl ja kinnastega.

RNA eraldamiseks kasutatakse fenooli ja kloroformiga ekstraheerimise meetodit või tsentrifuugitavat RNA afiinsuskolonni vastavalt tootja juhistele. Võib kasutada turul kättesaadavat RNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne RNA, mida on võimalik kasutada allpool olevates punktides kirjeldatud RT-PCRi meetodite puhul.

Eraldatud RNA lahustatakse ribonukleaasivabas destilleeritud vees (täpsemalt 0,1 % dietüülpürokarbonaadiga töödeldud vees) või sobivas elueerimispuhvris.

I.6.4.2. RT-PCR

IHNi viiruse tuvastamiseks kasutatakse järgmisi praimereid:

päripidine praimer: 5′-AGAGATCCCTACACCAGAGAC-3′;

äraspidine praimer: 5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAA-3′.

Kasutatakse järgmisi tsükleid (üheetapiline RT-PCR): 1 tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures; 30 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures, 30 sekundit 50 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; 1 tsükkel: 7 minutit 72 °C juures ja jahutamine temperatuurini 4 °C.

VHSi viiruse tuvastamiseks kasutatakse järgmisi praimereid:

päripidine praimer: 5′-ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG-3′;

äraspidine praimer: 5′-GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC-3′.

Kasutatakse järgmisi tsükleid (üheetapiline RT-PCR): 30 minutit 50 °C juures; 15 minutit 95 °C juures; 35 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 68 °C juures. Seejärel inkubeeritakse reaktsioonisegu 7 minutit 68 °C juures.

RT-PCRi spetsiifilisuse ja reaktsioonisaaduse koguse hindamiseks kasutatakse geelelektroforeesi etiidiumbromiidi sisaldavas 1,5 % agaroosgeelis, mida analüüsitakse läbivas ultraviolettkiirguses. IHNi viiruse puhul võib täheldada 693 aluspaari (bp) pikkuse PCRi amplikoni esinemist. VHSi viiruse puhul on amplikoni pikkus 505 bp.

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Seepärast tuleb mis tahes kahtluste ärahoidmiseks kasutada asjakohaseid positiivseid ja negatiivseid kontrolle ja amplikone. VHSi viiruse jaoks ette nähtud praimerite puhul tuleb BF-2 rakkude kasutamisel olla eriti ettevaatlik, sest need praimerid võivad seonduda selle rakuliini DNAga/RNAga ja anda sarnase pikkusega amplikonide tekkimise tõttu valepositiivseid tulemusi. BF-2 rakkude kultuurist saadud supernatandi analüüsimisel sekveneeritakse kõik PCRi käigus amplifitseeritud fragmendid.

I.6.4.3. VHSi viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR

VHSi viiruse puhul kasutatakse amplifitseerimiseks järgmisi praimereid ja sondi:

päripidine praimer: 5′-AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCC-3′;

äraspidine praimer: 5′-TCTGCGATCTCAGTCAGGATGAA-3′;

sond: 5′-FAM-TAGAGGGCCTTGGTGATCTTCTG-BHQ1-3′.

Üheetapiline RT-qPCR

Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Tsükleerimistingimused: 30 minutit 50 °C juures; 15 minutit 95 °C juures; 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures, 40 sekundit 60 °C juures ja 20 sekundit 72 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

I.6.4.4. IHNi viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR

IHNi viiruse puhul kasutatakse amplifitseerimiseks järgmisi praimereid ja sondi:

päripidine praimer: 5′-AGAGCCAAGGCACTGTGCG-3′;

äraspidine praimer: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′;

sond: 5′-6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB-3′.

Kaheetapiline RT-qPCR

Kuna allpool kirjeldatud meetod põhineb kaheetapilisel amplifitseerimisel, tuleb olla eriti hoolikas, et hoida ära saastumist katsutite käsitsemisel ühelt reaktsioonilt teisele üleminekul.

Tsükleerimistingimused (pärast RT-etappi): 2 minutit 50 °C juures; 10 minutit 95 °C juures; seejärel 40 tsüklit: 15 sekundit 95 °C juures ja 1 minut 60 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse.

Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

II. Üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord VHSi ja/või IHNi kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks haiguspuhangu kahtluse korral

Kui IHNi ja/või VHSi esinemise või puudumise kinnitamiseks on vaja teha direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohane laborianalüüs, mille puhul kasutatakse I lisa 1. osa punktis II.3 sätestatud diagnostikameetodeid, järgitakse järgmisi üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda:

a) tavapärane viiruse eraldamine ja sellele järgnev viiruse immunokeemiline, molekulaarne või seerumiga neutraliseerimise teel tuvastamine;

b) viiruse tuvastamine RT-PCRi või RT-qPCRi abil;

c) muu diagnostikameetod, näiteks kaudne immunofluorestsentsanalüüs, ELISA, RT-PCR või immunohistokeemiline analüüs.

II.1. Tavapärane viiruse eraldamine ja sellele järgnev viiruse tuvastamine

II.1.1. Valimi moodustamine

Analüüsimiseks valitakse vähemalt 10 kala, kellel täheldatakse tüüpilisi IHNi või VHSi sümptomeid.

II.1.2. Kaladelt võetud proovide ettevalmistamine ja proovide saatmine

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse proovide ettevalmistamisel ja saatmisel punktis I.2 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.3. Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse täiendava diagnostilise materjali kogumisel punktis I.3 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.4. Proovide ettevalmistamine rakukultuuris analüüsimiseks

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse rakukultuuris analüüsimiseks ette nähtud proovide ettevalmistamisel punktis I.4 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.5. Viroloogiline analüüs rakukultuuris

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse viroloogilise analüüsi tegemisel punktis I.5 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1.6. Viiruse tuvastamine

Viiruse tavapärase eraldamise puhul järgitakse viiruse tuvastamisel punktis I.6 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2. Viiruse tuvastamine RT-qPCRi abil

II.2.1. Proovide võtmine

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse proovide võtmisel punktis I.1.2 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.2. Kaladelt võetud proovide ettevalmistamine ja proovide saatmine

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse proovide ettevalmistamisel ja saatmisel punktis I.2 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.3. Täiendava diagnostilise materjali kogumine

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse täiendava diagnostilise materjali kogumisel punktis I.3 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.4. Proovide ettevalmistamine RT-qPCRi jaoks

RT-qPCRi abil viiruse tuvastamise puhul järgitakse proovide ettevalmistamisel punktis I.6.4.1 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.2.5. RT-qPCR

Viiruse tuvastamisel RT-qPCRi abil järgitakse punktides I.6.4.1, I.6.4.3 ja I.6.4.4 sätestatud meetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.3. Muud diagnostikameetodid

Punktis I.4.3 kirjeldatud viisil saadud supernatanti võib kooskõlas punktidega I.6.1, I.6.2 ja I.6.4 kasutada vastavalt ELISA, kaudse immunofluorestsentsanalüüsi või RT-PCRi jaoks. Koematerjali puhul võib kasutada muid diagnostikameetodeid, näiteks külmutatud koe lõikude kaudset immunofluorestsentsanalüüsi või formaliinis fikseeritud koematerjali immunohistokeemilist analüüsi. Lisaks kõnealustele kiirmeetoditele tuleb 48 tunni jooksul pärast proovide võtmist teha viroloogiline analüüs kooskõlas II jao alapunktiga a või b, kui:

a) saadakse negatiivne tulemus või

b) saadakse positiivne tulemus materjaliga, mille puhul on tegu IHNi või VHSi esmajuhuga.

III. Tiitrimismeetod rakukultuuride nakkusele vastuvõtlikkuse kontrollimiseks

Punktis I.5.3 osutatud tiitrimise puhul, millega kontrollitakse rakukultuuride vastuvõtlikkust nakkusele, järgitakse käesoleva jao allpool esitatud lõikudes sätestatud korda.

Kasutatakse vähemalt kahte VHSi viiruse isolaati ja ühte IHNi viiruse isolaati. Isolaadid peavad esindama peamisi Euroopa Liidus levinud viiruserühmi: VHSi viiruse puhul kasutatakse ühte vikerforellist eraldatud magevees levivat patogeenset isolaati ja ühte harilikust kammeljast eraldatud meres levivat patogeenset isolaati ning IHNi viiruse puhul ühte Euroopa Liidus vikerforellil esinevat patogeenset tüve. Kasutatakse liikmesriikides põhjalikult kirjeldatud isolaate. Viirusepartiisid kasvatatakse rakukultuuripudelites väikese passaažide arvuga rakukultuurides: VHSi viiruse puhul kasutatakse BF-2 või RTG-2 rakke ja IHNi viiruse puhul EPC või FHMi rakke. Kasutatakse rakukultuurisöödet, mille seerumisisaldus on vähemalt 10 %. Nakatamisel kasutatakse väikest nakatamiskordajat (MOI < 1).

Viiruse kogumiseks pärast täieulatusliku tsütopaatilise efekti ilmnemist tsentrifuugitakse rakukultuuri supernatanti 15 minutit 2 000 g juures, filtritakse see steriliseerimiseks läbi 0,45 μm suuruste pooridega membraanfiltri ja jaotatakse märgistatud krüokatsutitesse. Viirust säilitatakse – 80 °C juures.

Üks nädal pärast külmutamist sulatatakse külma vee all kolm iga viiruse paralleelproovi ja tiitritakse neid sobiva rakuliini kultuuris. Vähemalt iga kuue kuu järel või kui kahtlustatakse konkreetse rakuliini vastuvõtlikkuse vähenemist, sulatatakse iga viirusisolaat ja tiitritakse seda.

Tiitrimismeetodit tuleb üksikasjalikult kirjeldada ja iga kord tuleb kasutada sama meetodit.

Kui tiitrimine lõpp-punkti määramiseks toimub lahjendamise teel, kasutatakse igal lahjendusastmel vähemalt kuut paralleeli. Tiitreid võrreldakse varem saadud tiitritega. Kui kolmest viirusisolaadist ükskõik millise tiiter langeb algtiitriga võrreldes 2 suurusjärgu võrra või rohkem, ei kasutata asjaomast rakuliini enam seire tegemisel.

Kui laboris kasvatatakse eri rakuliine, analüüsitakse iga rakuliini eraldi.

Andmeid säilitatakse vähemalt 10 aastat.

2. OSA

KHV NAKKUSE SEIREKS JA NAKKUSE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I. KHV nakkuse kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Kui KHV esinemise või puudumise kinnitamiseks on vaja teha direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohane laborianalüüs, mille puhul kasutatakse I lisa 2. osa III jaos sätestatud diagnostikameetodeid, järgitakse käesoleva osa punktides I.1–I.2 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1. Kaladelt proovide võtmine

Diagnostiliseks analüüsiks võib PCRil või qPCRil põhinevate tavapäraste meetoditega analüüsimiseks kasutada kas kalu (mis on saadetud elusana või surmatuna, aga sel juhul eraldi aseptilisse suletud nõusse pakitult) või külmutatud elundeid või elunditükke, mida säilitatakse 80 %lises kuni absoluutses etanoolis või viiruste transportimise söötmes (neid tuleb analüüsida 48 tunni jooksul pärast proovide kogumist).

KHV tuvastamiseks kogutakse lõpused ja neerud; peale selle võib eraldi proovina koguda põrna, peaaju ja soole. Ägeda haiguspuhangu korral võib koondada kuni viielt kalalt saadud koematerjali.

Peale selle võib teatud juhtudel kasutada proove, mille võtmiseks kalu ei surmata, näiteks verd, lõpusekaabet, lõpusebiopsiat või limakaabet (KHV esinemise kahtlus võib hõlmata väga väärtuslikke kalu).

I.1.1. DNA eraldamine

DNA eraldamiseks kasutatakse standardmeetodit.

Võib kasutada turul kättesaadavat DNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne DNA, mida on võimalik kasutada punktis I.2 osutatud PCRi meetodite puhul.

I.2. Haigusetekitaja tuvastamine ja määramine polümeraasi ahelreaktsioonil (PCR) põhinevate meetoditega

I.2.1. KHV tuvastamiseks kasutatav qPCR

KHV tuvastamiseks qPCRi abil kasutatakse järgmist qPCRi meetodit.

Päripidine praimer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;

äraspidine praimer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′;

sond (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; seejärel 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega qPCRi meetodit.

I.2.2. KHV tuvastamiseks kasutatav tavapärane PCR

Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit, mille puhul sihtjärjestus on KHV tümidiini kinaasi (TK) geen. Kirjeldatud meetodi asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tundlikkuse ja spetsiifilisusega PCRi meetodit.

Päripidine praimer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′;

äraspidine praimer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 5 minutit 95 °C juures; seejärel 35 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures, 30 sekundit 52 °C juures ja 1 minut 72 °C juures; üks tsükkel: 10 minutit 72 °C juures. Saadava fragmendi eeldatav pikkus on 409 bp.

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega PCRi meetodit.

Konkreetses piirkonnas esmajuhu tuvastamise korral tehakse tulemuste kinnitamiseks sekveneerimine või saadetakse proovid kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.

II. KHV nakkuse seireks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Proovivõtmisel ja laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 2. osa II või III jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 2. osa I jao kohaseks KHV nakkuse suhtes taudivaba staatuse saamiseks või säilitamiseks järgmisi käesoleva osa punktides II.1 ja II.2 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1. Kaladelt proovide võtmine

Võimaluse korral tuleks proovid võtta kaladelt, keda on pikemat aega – kaks kuni kolm nädalat – hoitud viirusega nakatumist võimaldavas temperatuurivahemikus 15–26 °C. KHV tuvastamise tõenäosuse suurendamiseks kogutakse proovid võimaluse korral 24 tundi, kuid mitte hiljem kui 72 tundi pärast käitlemistoimingut, millega võib kaasneda viiruse taasaktiveerumine viirusekandja staatusega kalades, näiteks pärast võrguga väljapüüdmist või transporti.

KHV nakkuse seireks võib PCRil põhinevate meetoditega analüüsimiseks kasutada kas kalu (mis on saadetud elusana või surmatuna, aga sel juhul eraldi aseptilisse suletud nõusse pakitult) või külmutatud elundeid või elunditükke, mida säilitatakse 80–100 % alkoholis või viiruste transportimise söötmes (neid tuleb analüüsida 48 tunni jooksul pärast proovide kogumist). KHV nakkuse seireks kogutakse lõpuse- ja neerukude.

KHV nakkuse seire puhul hoidutakse võimaluse korral proovide koondamisest. Kui koondproovi moodustamine on vajalik, võib ühte koondada kuni kahelt kalalt saadud koematerjali. Suuremad proovid homogeniseeritakse uhmri ja nuia või stomahheri abil ning enne homogenaadi selgimist võetakse neist osaproovid DNA eraldamiseks. Teise võimalusena võib osaproovina koguda iga proovis sisalduva koe ja panna selle lüüsimiseks ette nähtud katsutisse.

II.1.1. DNA eraldamine

DNA eraldamiseks kasutatakse standardmeetodit. Võib kasutada turul kättesaadavat DNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne DNA, mida on võimalik kasutada punktis II.2 sätestatud PCRi meetodite puhul.

Vastuvõetav koe massi ja söötme mahu suhe on 1:9. Analüüsiks võetakse 20–25 mg koematerjali.

II.2. KHV nakkuse seire PCRil põhinevate meetoditega

KHV nakkuse seireks kasutatakse qPCRi. Kui piirkonnas, kus varem ei ole saadud nakkust kinnitavat positiivset tulemust, leitakse positiivne proov, kinnitatakse katsetulemusi ühel viisil järgmistest:

a) proovist amplifitseeritud PCRi või mitmeetapilise PCRi saadus sekveneeritakse. Saadud lõplik konsensusjärjestus peab kattuma olemasolevate võrdlusjärjestustega vähemalt 98 % ulatuses;

b) proov saadetakse tulemuste kinnitamiseks riiklikku referentlaborisse.

II.2.1. KHV tuvastamiseks kasutatav qPCR

Kasutatakse järgmist qPCRi meetodit.

Päripidine praimer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;

äraspidine praimer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′;

sond (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; seejärel 50 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures.

Kõnealuse qPCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega qPCRi meetodit.

II.2.2. KHV tuvastamiseks kasutatav tavapärane PCR

KHV nakkuse kinnitamiseks kasutatakse allpool tabelis 2.1 kirjeldatud üldkasutatavat mitmeetapilist PCRi ja sellele järgnevat amplifitseeritud fragmendi sekveneerimist.

Tabel 2.1

Karpkalalaste kõikide herpesviiruste (CyHV-1, CyHV-2 ja CyHV-3) tuvastamiseks ette nähtud mitmeetapilise PCRi puhul kasutatavad praimerid ja tingimused

Praimeri nimi Järjestus Tsükleerimistingimused Amplikoni pikkus CyHVpol-päripidine 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ PCRi esimene etapp 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures 40 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures 30 sekundit 55 °C juures 45 sekundit 72 °C juures 1 tsükkel: 10 minutit 72 °C juures 362 bp CyHVpol-äraspidine 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-sisemine-päripidine 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ PCRi teine etapp 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures 40 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures 30 sekundit 55 °C juures 45 sekundit 72 °C juures 1 tsükkel: 10 minutit 72 °C juures 339 bp CyHVpol-sisemine-äraspidine 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega PCRi meetodit.

Sekveneerimine võib toimuda asjaomases laboris või sekveneerimisele spetsialiseerunud välises ettevõttes. Sekveneerimistulemuste analüüsimiseks võrreldakse saadud järjestusi teadaolevate KHV võrdlusjärjestustega, mis vastavad GenBanki registreerimisnumbritele AP008984, DQ657948 ja DQ177346. Saadud lõplik konsensusjärjestus peab kattuma kõnealuste võrdlusjärjestustega vähemalt 98 % ulatuses.

3. OSA

LÕHEDE INFEKTSIOOSSE ANEEMIA (ISA) SEIREKS JA SELLE TAUDI ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD

I. ISA seireks ja tõrjeks kasutatavad proovivõtumeetodid

Proovide võtmisel ja laborianalüüside tegemisel I lisa 3. osas sätestatud seire- ja likvideerimisprogrammide kohaldamiseks või selleks, et kinnitada direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaselt ISA esinemist või puudumist, järgitakse käesoleva jao punktides I.1, I.2 ja I.3 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

I.1. Kaladelt proovide võtmine

ISA esinemise kontrollimiseks tehtava laborianalüüsi jaoks võetavaid kalaproove võimaluse korral ühte ei koondata. ISA seire puhul on siiski vastuvõetav 2–5 kala proovide koondamine.

Kõikidelt proovivõtmiseks valitud kaladelt võetakse proovid pöördtranskriptsiooniga polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) abil analüüsimiseks. Kalalt eemaldatakse steriilse instrumendiga neeru keskosa tükk ja pannakse mikrokatsutisse, mis sisaldab 1 ml tõendatud tõhususega RNA säilituslahust. Ühte transpordilahusega katsutisse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koed, mis moodustavad ühe koondproovi. Koematerjali kaal ühes proovis peab olema 0,5 g. Kui kalad on vajaliku kaaluga proovi saamiseks liiga väikesed, võib proovi kaalu viimiseks 0,5 grammini eemaldada kalalt neeru, südame, põrna, maksa või umbsoole tükid nimetatud eelistusjärjekorras.

Histoloogiliseks analüüsiks kasutatav kude võetakse üksnes äsja surmatud tavapärase välimusega kaladelt, kellel täheldatakse ISA esinemisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid. Proov võetakse kõikidest välistest ja sisemistest kahjustatud kudedest ning igalt kalalt võetakse skalpelli abil eraldi proov neeru keskosast, südamest, maksast, kõhunäärmest, soolestikust, lõpustest ja põrnast ning pannakse 8–10 mahuprotsenti formaldehüüdi sisaldavasse puhverdatud soolalahusesse. Kudede rahuldava säilimise tagamiseks peab fikseerimislahuse ja koematerjali suhe olema vähemalt 20:1. Immunohistokeemiliseks analüüsiks võetakse proov neeru keskosast ja südamest.

Kõikidelt proovivõtmiseks valitud kaladelt võetakse koed viroloogiliseks analüüsiks rakukultuuris. Kalalt eemaldatakse steriilse instrumendiga maksa, neeru esi- või keskosa, südame ja põrna tükid ning pannakse plastkatsutisse, mis sisaldab 9 ml transpordisöödet. Ühte transpordilahusega katsutisse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koed, mis moodustavad ühe koondproovi. Koematerjali kaal ühes proovis peab olema 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Kaladelt võetud proovide saatmine

Laborisse võib saata terveid kalu, kui transpordi ajal on võimalik järgida käesoleva punkti kolmandas lõigus kirjeldatud temperatuurinõudeid. Terved kalad mähitakse imavasse paberisse ning saadetakse teele plastkotis ja nimetatud lõigu kohaselt jahutatuna.

Võib saata ka elusaid kalu, kuid üksnes kalahaiguste riikliku referentlabori järelevalve all ja juhul, kui võetakse arvesse elusate kalade transportimisega seotud täiendavaid desinfitseerimise ja bioturvalisuse küsimusi.

Vereproovid ja viroloogiliseks analüüsiks või RT-PCRi abil analüüsimiseks ette nähtud kalakudesid sisaldavad katsutid pannakse soojusisolatsiooniga konteinerisse, näiteks paksuseinalisse polüstüreenkasti koos piisava koguse jää või piisava arvu jahutusplokkidega, et tagada laborisse transportimise ajal proovi püsimine jahutatuna. Tuleb vältida proovi külmumist ning saadetise vastuvõtmise ajal peab transpordikastis veel jääd olema või peab vähemalt üks jahutusplokk olema vähemalt osaliselt külmunud. Erandjuhul võib RT-PCRi jaoks või viroloogiliseks analüüsiks ette nähtud proovi kiirkülmutada ja transportida selle laborisse – 20 °C juures või madalamal temperatuuril.

Lahuses RNAlater säilitatavate kudede analüüsimisel RT-PCRi abil toimub RNA eraldamine proovide säilitustemperatuurist olenevalt järgmise ajavahemiku jooksul:

37 °C juures säilitatavad proovid: ühe päeva jooksul;

25 °C juures säilitatavad proovid: ühe nädala jooksul;

4 °C juures säilitatavad proovid: ühe kuu jooksul;

– 20 °C juures säilitatavad proovid: mis tahes ajal.

Kui kalakudesid transporditakse histoloogilise analüüsi jaoks fikseerimislahuses, kasutatakse nende saatmiseks lekkekindlat katsutit, mis paigutatakse löögikindlasse konteinerisse. Tuleb ära hoida selliste proovide külmumist.

Viroloogilist analüüsi rakukultuuris alustatakse niipea kui võimalik ning hiljemalt 48 tundi pärast proovide kogumist. Erandjuhul võib viroloogilist analüüsi alustada hiljemalt 72 tundi pärast materjali kogumist, kui uuritavat materjali kaitseb transpordisööde ja transpordi ajal on võimalik järgida asjaomaseid temperatuurinõudeid.

I.3. Täiendava diagnostilise materjali kogumine

Asjaomase diagnostikalabori heakskiidul võib täiendavateks uuringuteks koguda ja ette valmistada ka punktis I.1 nimetamata kalakudesid.

II. ISA kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks ja ISA seireks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord

Laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 3. osa II jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 1. osa I jao kohaseks ISA suhtes teatud kindla staatuse saamiseks või säilitamiseks ja direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaseks ISA kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks järgmisi allpool punktides II.1–II.5 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.

II.1. Proovide analüüsimine RT-PCRi abil

ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav diagnostikameetod on RT-qPCR. Kuna RT-qPCRi tulemused võivad kasutatud reaktsioonitingimustest sõltuvalt varieeruda, kasutatakse mis tahes kahtluste ärahoidmiseks sobivaid positiivseid ja negatiivseid kontrolle ja amplikone.

II.1.1. Kogu RNA eraldamine

Kõik toimingud RNA eraldamiseks tehakse jääl ja kinnastega.

Kogu RNA eraldamiseks kasutatakse fenooli ja kloroformiga ekstraheerimise meetodit või tsentrifuugitavat RNA afiinsuskolonni vastavalt tootja juhistele.

Eraldatud RNA lahustatakse ribonukleaasivabas destilleeritud vees (täpsemalt 0,1 % dietüülpürokarbonaadiga töödeldud vees).

Eraldatud RNA kontsentratsiooni ja puhtuse hindamiseks kasutatakse optilise tiheduse mõõtmist lainepikkustel 260 ja 280 nm. Teise võimalusena võib kasutada viiruse genoomis leiduvale sihtjärjestusele vastavat sisemist kontrolli, nagu on märgitud punktis II.1.3.

II.1.2. ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-PCR

ISA viiruse genoomi amplifitseerimiseks võib kasutada mitut RT-PCRi meetodit. Võib kasutada kaheetapilist RT-PCRi, mille puhul RT ja PCRi etapid viiakse läbi kahes eri katsutis. Võib järgida ka üheetapilist meetodit, mille puhul kõnealused kaks reaktsiooni viiakse läbi samas katsutis. Võimaluse korral kasutatakse üheetapilist meetodit, sest katse läbiviimisega ühes katsutis vähendatakse ristsaastumise ohtu, kuna katsuti sisu ei pea teise katsutisse üle viima, ning selle meetodi tundlikkust peetakse võrdseks kaheetapilise meetodi tundlikkusega.

Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit ning praimeritest ILA1 ja ILA2 koosnevat praimeripaari, mille sihtjärjestus asub 8. segmendis ja mis on leitud olevat sobiv ISA viiruse tuvastamiseks taudipuhangute ja viirusekandjate kalade puhul. Äraspidine praimer ILA2 ei seondu Põhja-Ameerikas esinevate isolaatidega ning sellisel juhul kasutatakse mõnda muud praimeripaari.

Päripidine praimer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

äraspidine praimer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 94 °C juures; 40 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; üks tsükkel: 5 minutit 72 °C juures. Fragmendi pikkus on 155 bp.

PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida. Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused. Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi meetodit.

II.1.3. ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR

RT-qPCRi kasutamine võib suurendada spetsiifilisust ja suurendab tõenäoliselt ka tundlikkust. See meetod võimaldab saada tulemused kiiremini, kuna elektroforeesietapp ei ole vajalik, samuti väheneb ristsaastumise oht, sest viiruse genoomse RNA kogust on võimalik hinnata proovi sisaldavas katsutis. RT-qPCRi meetodi ühe puudusena ei ole sageli võimalik amplifitseeritud fragmenti sekveneerida. Kui tekib kahtlus fragmendi amplifitseerimise spetsiifilisuse suhtes, tuleb tulemuste kontrollimiseks viia läbi mõni muu ISA viiruse spetsiifilise tuvastamise katse.

Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit, mille puhul sihtjärjestus asub 8. segmendis. Kõnealuse meetodiga tuvastatakse Euroopa Liidus, Euroopa Vabakaubanduse Assotsiatsiooni liikmesriikides ja Põhja-Ameerikas esinevaid isolaate. Võimaluse korral kasutatakse üheetapilist meetodit, kuna ühes katsutis toimuva katse puhul on ristsaastumise oht minimeeritud.

Päripidine praimer: 5′-CTACACAGCAGGATGCAGATGT-3′;

äraspidine praimer: 5′-CAGGATGCCGGAAGTCGAT-3′;

sond: 5′-FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC-MGBNFQ-3′.

Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

II.1.4. PCRi amplifitseerimissaaduste sekveneerimine

Päripidine praimer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA-3′;

äraspidine praimer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA-3′.

Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle. Tsükleerimistingimused (üheetapiline RT-PCR): üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 94 °C juures; 40 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; üks tsükkel: 5 minutit 72 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse. Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.

Teise võimalusena võib kasutada järgmist meetodit 6. segmendis paikneva HPRi sekveneerimiseks:

päripidine praimer: 5′-GACCAGACAAGCTTAGGTAACACAGA-3′;

äraspidine praimer: 5′-GATGGTGGAATTCTACCTCTAGACTTGTA-3′.

Fragmendi pikkus: variandi HPR0 puhul 304 nukleotiidi.

Käesolevas punktis kirjeldatud meetodi asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tundlikkuse ja spetsiifilisusega RT-PCRi meetodit.

RT-PCRi amplifitseerimissaaduse puhtust kontrollitakse enne sekveneerimist geelelektroforeesi teel. Üheainsa puhta fragmendi esinemise korral puhastatakse see otse PCRi segust. Mitme amplifitseeritud fragmendi olemasolu korral puhastatakse huvipakkuv fragment geelelektroforeesi abil. PCRi fragmentide puhastamiseks lahusest või agaroosgeelist kasutatakse tsentrifuugitavaid PCRi fragmentide afiinsuskolonne vastavalt tootja juhistele.

Sekveneerimiseks kasutatakse amplifitseerimispraimereid ja see toimub sekveneerimisele spetsialiseerunud välises ettevõttes. Sekveneerimistulemusi analüüsitakse programmi BLAST abil ja nukleotiidijärjestusi võrreldakse USA riikliku biotehnoloogiateabe keskuse (NCBI) nukleotiidijärjestuste andmebaasis olevate teiste teadaolevate järjestustega.

Sekveneerimistulemus peab olema selline, mille puhul ei jää mingit kahtlust RT-PCRi saaduse amplifitseerimise spetsiifilisuse suhtes.

II.2. ISA viiruse eraldamine rakukultuuris kasutamiseks

II.2.1. Proovide ettevalmistamine

Koematerjali võib säilitada – 80 °C juures. See külmutatakse ja sulatatakse enne analüüsimist vaid korra. Seire ja tõrje tegemisel viiakse analüüs läbi nii kiiresti kui võimalik.

Iga proov (kudede koondproov transpordisöötmes) homogeniseeritakse valideeritud homogenisaatoriga täielikult, proovi tsentrifuugitakse 15 minutit 2 000–4 000 g juures temperatuuril 0–6 °C, supernatant filtritakse (0,45 μm) ja seda inkubeeritakse võrdse osa IPNi viiruse kohalike serotüüpide vastaste antiseerumite sobivalt lahjendatud koondprooviga. Antiseerumi tiiter peab 50 % plaagide neutraliseerimise katse kohaselt olema vähemalt 1/2 000. Segu inkubeeritakse üks tund 15 °C juures. Saadakse inokulum.

Mõnes Euroopa osas 50 % kalaproovides esineva IPNi viiruse vastase antiseerumiga töödeldakse kõiki inokulume selleks, et hoida ära IPNi viirusest põhjustatud tsütopaatilise efekti ilmnemist inokulumiga nakatatud rakukultuurides. Kõnealuse töötluse võib läbi viia selleks, et lühendada viroloogilise analüüsi kestust ja vähendada nende juhtude arvu, mille puhul tsütopaatilise efekti ilmnemist tuleb pidada ISA viiruse võimaliku esinemise märgiks. Kui proovid on pärit tootmisüksusest, mida peetakse IPNi-vabaks, võib inokulumide töötlemise IPNi viiruse vastase antiseerumiga ära jätta.

II.2.2. Rakukultuuride nakatamine

ISA viiruse algseks eraldamiseks kasutatakse atlandi lõhe neeru (ASK) rakke. Võib kasutada ka muid rakuliine, mille puhul ISA viiruse eraldamise tõhusus ja rakuliini tundlikkus on tõendatud; seejuures võetakse arvesse tüvede varieeruvust ja eri tüvede võimet eri rakuliinides paljuneda. Näib, et ASK rakud võimaldavad eraldada ja kasvatada praeguseks teada olevaid viirusisolaate, juhul kui kasutatakse väikese passaažide arvuga kultuuri. ASK rakkude puhul võib tsütopaatiline efekt väljenduda selgemini kui muude vastuvõtlike rakuliinide, näiteks SHK-1 (Salmon head kidney-1) puhul.

ASK rakke (passaažide arv kuni 65) kasvatatakse mitmekannulisel plaadil söötmes L-15, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli. Noor aktiivselt kasvav rakukultuur nakatatakse antiseerumiga töödeldud elundisuspensiooniga nii, et koematerjali lõpplahjendus rakukultuurisöötmes oleks 1:1 000. Iga elundisuspensiooni puhul lisatakse ühte kannu, mis sisaldab 2 ml rakukultuurisöödet, 40 μl inokulumi. Ristsaastumise ohu minimeerimiseks kasutatakse kalakasvanduse eri kohtadest pärit proovide jaoks eri 12- või 24-kannulisi plaate.

Üks negatiivse kontrollina kasutatav plaat jäetakse nakatamata. Üks positiivse kontrollina kasutatav eraldi plaat nakatatakse ISA viiruse võrdlusisolaadiga järgmiselt. Esimesse kannu lisatakse 100 μl ISA viiruse põhilahust, mille tiiter on vähemalt 107 TCID50 (viiruse hulk, mille puhul tsütopaatilise efekti ulatus nakatatud koekultuuris on 50 %) milliliitri kohta, ning segatakse söötmega. Osa saadud segust viiakse esimesest kannust teise nii, et saadakse lahjendus 1:10, ning segatakse söötmega. Seda toimingut korratakse kogu plaadi ulatuses, et saada kuus 10-kordset lahjendust. ISA viiruse põhilahust võib säilitada – 80 °C juures vähemalt kaks aastat, kuid pärast sulatamist tuleb see kolme päeva jooksul ära kasutada. Tuleb olla ettevaatlik, et hoida ära proovi sisaldavate plaatide ristsaastumist positiivse kontrolli materjaliga. Sellise ohu ärahoidmiseks toimub positiivse kontrolli ettevalmistamine ja käsitsemine proovi sisaldavatest p